NO320067B1 - In vitro fremgangsmate for registrering av prosessering av beta-amyloid forloper proteinet (betaAPP) i celler og opploselig fragment av beta-amyloid forloper protein i renset og isolert form. - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

1. Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår generelt in vitro fremgangsmåte for registrering av prosessering av 6-amyloid forløper proteinet (fiAPP) i celler og oppløselig fragment av B-amyloid forløper protein i renset og isolert form.

Palmert et al., 1989, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 86:6338-6342 beskriver deteksjon

av et fragment av PAPP ved dets karboksyl-terminale ende. WO 980051 beskriver deteksjon av spaltede PAPP former som ble gjenkjent av en antistoff-preparering som bindes til aminosyrene 45 til 62 av PAPP. WO 9200521 beskriver metoder for prognose og diagnonse av Alzheimers sykdom. Det antydes deri at spaltingen av P AAP kan skje nær den aminoterminale gruppen i PAP, men spaltingen blir ikke bevist eller diskutert. Verken Palmert et al., WO 980051 eller WO 9200521 beskriver den spesifikke spesifikasjon av

ATF-PAPP.

Alzheimers sykdom er karakterisert ved et nærvær av tallrike amyloide plaque og neurofibrilære nøster (sterkt uoppløselige proteinaggregater) som er tilstede i hjernen hos de pasienter som har sykdommen, da spesielt i de hjerneområder som angår hukommelse og gjenkjennelse. Skjønt det tidligere har vært noe omstridt hvorvidt nevnte plaque og nøster er årsaken til eller bare et resultat av Alzheimers sykdom, synes nyere oppdagelser å antyde at nevnte amyloidplaque er en utløsende forløper-faktor eller årsak. Mer spesielt har man oppdaget at produksjonen av 6-amyloid peptid, en vesentlig bestanddel av nevnte amyloidplaque, kan være et resultat av mutasjoner i det gen som koder for det amyloide forløperproteinet, et protein som under normal bearbeiding ikke vil frembringe nevnte 6-amyloide peptid. Identifikasjonen av mutasjoner i det amyloide forløperproteingenet i de familier hvor man har en tidlig utvikling av Alzheimers sykdom, er det sterkeste bevis på at den amyloide metabolismen er en sentral begivenhet i den patogene prosess som frembringer og ligger under sykdommen. Fire angitte sykdomsfrembringende mutasjoner innbefatter med hensyn til 770-isoformen, valin<717> til iso-

leucin (Goate et al. (1991) Naturee 349:704-706), valin<717> til glycin (Chartier Harlan et al.

(1991) Nature 353:844-846, valin<717> til fenylalanin (Murrell et al. (1991) Science 254:97-99)

og med hensyn til 695-isoformen, en dobbeltmutasjon som forandrer lycin<595->methionin596 til asparagin5<95->leucin<596> (Mullan et al. (1992) Nature Genet 1:345-347). Videre er 8-amyloid-

peptid toksisk overfor hjerneneuroner, og neuronal celledød er forbundet med sykdommen.

asparagin5<95->leucin<596> (Mullan et al. (1992) Nature Genet 1:345-347). Videre er 6-amyloidpeptid toksisk overfor hjerneneuroner, og neuronal celledød er forbundet med sykdommen.

Kunne man således ha evnen eller muligheten til å styre eller kontrollere den cellulære bearbeiding av det amyloide forløperproteinet, ville dette være av betydelig verdi for diagnose, prognose og terapeutisk behandling av Alzheimers sykdom. Mer spesielt ville det være ønskelig å kunne identifisere ved hjelp av minimale inngrep og å kunne undersøke og bedømme påvisbare diagnostiske markører i prøver som er lett å oppnå fra pasientene, f.eks. serum, den hjernespinale væsken (CSF) og lignende.

En rekke potensielle diagnostiske markører for Alzheimers sykdom er blitt foreslått. Av spesiell interesse i foreliggende oppfinnelse er visse fragmenter av det amyloide forlø-perproteinet, og heri inngår karboksy-terminale fragmenter (f.eks. selve det 6-amyloide peptidet eller fragmenter av dette), og amino-terminale fragmenter (f.eks. 25kD, 105 kD, og 125 kD fragmenter). Hittil har imidlertid ingen av de fore-slåtte markører vist seg å være helt definitive for en ante mortem diagnose eller kontroll av Alzheimers sykdom.

Det vil således være ønskelig å kunne identifisere ytter-ligere eller alternative diagnostiske markører for Alzheimers sykdom. Slike markører bør kunne brukes som sådanne og/eller i kombinasjon med andre diagnostiske markører og fremgangsmåter. Det vil være ønskelig at de diagnostiske markører kan la seg påvise i kroppsvæsker, f.eks. CSF, blod, plasma, serum, urin, vev og lignende, slik at man kan bruke diagnostiske fremgangsmåter med minimale inngrep i pasienten.

Av videre interesse i foreliggende oppfinnelse er in vitro systemer og fremgangsmåter for å undersøke mulige medisiner for evne til å hemme eller hindre produksjonen av 6-amyloide plaque. Det vil være ønskelig å kunne tilveiebringe fremgangsmåter og systemer for å undersøke prøveforbindelser for deres evne til å hemme eller hindre omdannelsen av amyloid forløperprotein til 6-amyloid peptid. Mer spesielt vil det være ønskelig å basere slike fremgangsmåter og systemer på metaboliske veier eller kilder som har vist seg å inngå i en slik omdannelse, og hvor prøveforbindelsen vil være istand til å avbryte eller påvirke den metaboliske nedbrytningen eller utviklingen som fører til omdannelsen. Slike fremgangsmåter og systemer ville være raske, økonomiske og egnede for å undersøke et stort antall prøveforbindelser.

2. Beskrivelse av tidligere kjente fremgangsmåter og blandinger.

6-amyloid peptid (også betegnet som A4,6 AP, A8, eller A6P; se US .patent nr. 4.666.829 og Glenner og Wong (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:1121-1135) er avledet av 6-amyloid forløperprotein 6APP), som er uttrykt i forskjellige spleisede former av 695,751 og 770 aminosyrer. Se Kang et al. (1987) Nature 325:773-776; Ponte et al. (1988) Nature 331:525-527; og Kitaguchi et al. (1988) Nature 331:530-532.

Normal bearbeiding av amyloid forløperprotein innbefatter en proteolytisk spaltning i en posisjon mellom restene Lys<16> og Leu<17> (nummerert som for 6AP området hvor Asp<597> er rest 1 i Kang et al. (1987)), supra, nær det transmembrane området, som resulterer i en grunnleggende utskillelse av et ekstracellulært område som beholder den gjenværende delen av 6-amyloid-peptidsekvensen (Esch et al. (1990) Science 248:1122-1124). Denne metaboliske veien er sterkt konservert hos mange arter og er tilstede i mange celletyper. (Se Weideman et al. (1989) Cell 57:115-126 og Oltersdorf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:4492-4497. Denne normale nedbrytnings veien spalter for-løperproteinet i det området som tilsvarer det 6-amyloide peptidet, og synes således å utelukke dets dannelse. En annen grunnleggende utskilt form av 6APP er også blitt observert

(Robakis et al. Soc. Neurosci. 26. oktober 1993, Abstract Nr. 15.4, Anaheim, CA.) som inneholder mer av den 6AP sekvens-karboksyterminale enden, enn den form som er beskrevet av Esch et al. supra.

Golde et al. (1992) Science 255:728-830, fremstilte en serie såkalte deleteringsmutanter av amyloidforløper-protein, og kunne observere en enkel spaltningsposisjon inne i 6-amyloidpeptidområdet. Basert på denne observasjonen ble det foreslått at B-amyloidpeptid-dannelsen ikke innbefatter en sekretorisk metabolisk nedbrytningsvei. Estus et al. (1992) Science 255:726-728, beskriver at de to største karboksy-terminale proteolytiske fragmentene av amyloid-forløperproteih finnes i hjerneceller som inneholder hele det 6-amyloide peptid-området.

PCT-søknad WO 92/00521 beskriver fremgangsmåter for å bedømme Alzheimers sykdom basert på måling av mengden av visse 25 kD, 105 kD og 125 kD løselige derivater av amyloidforløper-protein i en pasients hjernespinalvæske. Figur 3 i nevnte søknad WO 92/00521 antyder at spaltningen av amyloid forløperprotein kan skje nær den aminoavsluttende gruppen i det 6-amyloide peptidet, slik at man får fremstilt et løselig amino-terminalt fragment, men det er i nevnte søknad ikke gitt noe bevis på åt en slik spaltning finner sted, ei heller er den diskutert. Kennedy et al. (1992) Neurodegeneration 1:59-64, presenterer data for en form for utskilt 6APP, som er karakterisert ved sin reaktivitet med antistoff til aminosyregruppene 527-540 i BAPP og mangel på reaktivitet med antistoff til de første 15 aminosyregruppene i BAP. Det er ikke tilveiebragt noe direkte bevis som

antyder spaltningsposisjonen eller identiteten på den nevnte karboksyterminale gruppen i BAPP-formen. PCT søknad WO 91/16628 beskriver fremgangsmåter for diagnostisering av sykdommen basert på en påvisning av amyloid forløperproteiner og fragmenter av disse, hvor man bruker antistoffer for protease neksin-2 eller amyloid forløperprotein.

Nylige rapporter viser at oppløselig B-amyloid peptid fremstilles av friske celler i kulturmedia (Haass et al. (1992) Nature 359:322-325) og i humant og animalsk CSF (Seubert et al. (1992) Nature 359:325-327).

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter og blandinger for å påvise og kontrollere et utskilt aminoterminalt fragment av B-amyloid forløperprotein (BAPP) i biologiske prøver, hvor fragmentet er oppstått ved en spaltnig ved eller nær den aminoavsluttende gruppen i B-amyloidpeptid (BAP)-området. Mer spesielt kan det nevnes at for aminosyresekvensen på BAPP slik den er beskrevet av Kang et al. supra (dvs. den "normale" sekvensen), kan dette avkuttede, utskilte frag-mentet av BAPP gjenkjennes av antistoffer som reagerer mot peptider som inneholder visse karboksy-terminale restgrupper av det utskilte fragmentet med en eksponert metioningruppe ved sin karboksyterminus. Alternativt kan naturlig forekommende eller manipulerte variantsekvenser av BAPP, slik som den dobbeltmutering som forandrer lysin <595->metionin<596> til asparagin<595->leucin<596> som er angitt av Mullan et (1992) Nature Genet 1:345-347, innføres i en ny sekvens i dette området. Et bindende stoff som er spesifikt for de C-terminale rest-gruppene av denne BAPP-sekvensen vil være en foretrukket anordning for påvisning av slike sekvenser.

De utskilte fragmentene vil inneholde en i alt vesentlig intakt amino-terminal sekvens av BAPP som er avsluttet innenfor 5 aminosyrer av den karboksy-terminale restgruppen (metionin i det tilfellet man har en normal sekvens),, som ligger inntil BAP området i intakt BAPP. Mer spesielt kan de utskilte fragmenter i alt vesentlig bestå av sekvenser som er avsluttet i metionin<596> og lysin<595> i 695 aminosyre-isoformen av BAPP, noe som tilsvarer nummereringen for andre isoformer og tilsvarende aminosyrer i de mutante BAPP-formene, f.eks. LYS<595->MET<596> til ASN<595>'LEU<596> (den "svenske" formen).

I et første aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse in vitro fremgangsmåte for registrering av prosessering av B-amyloid forløper proteinet (PAPP) i celler, kjennetegnet ved at den omfatter spesifikk detektering av et oppløselig aminoterminalt PAPP fragment (ATF-PAPP) utskilt fra nevnte celler, og en substans som spesifikt bindes til nevnte oppløselige PAPP fragment, og hvori amino-syreekvensen til nevnte PAPP fragment utgår fra den aminoterminale enden av PAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid (PAP), hvori ATF-PAPP er forskjellig fra andre spaltede former av PAPP som kan være tilstede.

I et annet aspekt omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte ifølge krav 1, kjennetegnet ved at detektering av ATF-PAPP fragmentet omfatter, eksponering av nevnte ATF-PAPP fragment for en substans som bindes spesifikt til en C-terminal region på det utskilte fragmentet som er blitt eksponert ved spaltning av P-amyloid peptid fra PAPP; og detektering av bindingen mellom substansen og det utskilte fragmentet.

Forhøyede ATF-BAPP nivåer eller forhold kan være forbundet med utvikling og progresjon av sykdommen, og kan reduseres med en behandling av sykdommen.

I et tredje aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, kjennetegnet ved at det C-terminale residiet er metionin<596> , lysin<595> , eller leucin596.

I et fjerde aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, kjennetegnet ved at nevnte ATF-PAPP fragment blir eksponert for antistoff spesifikt for det C-terminale residiet eksponert ved spalting av P-amyloid peptid fra PAPP.

I et femte aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte ifølge krav 4, kjennetegnet ved at antistoffet er blitt dannet mot et peptid omfattende residiene 591-596 av PAPP hvor residiet 596 er eksponert. ATF- PAPP kan fremstilles ved å isolere og rense ATF-BAPP fra en naturlig eller en rekombinant kilde, f.eks. CSF, et behandlet media fra én egnet cellekultur eller lignende.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre in vitro fremgangmåte ifølge krav 1 for diagnostisering eller registrering av en P-amyloid beslektet sykdom i en pasient, kjennetegnet ved at den omfatter at mengden av et utskilt fragment av P-amyloid forløperprotein (pAPP) måles i en pasient-prøve, ved eksponering for en substans som spesifikt bindes til nevnte PAPP fragment, vori aminosyresekvensen til nevnte PAPP fragment utgår fra den aminoterminale enden av PAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid (PAP), og sammenligning av mengden av nevnte PAPP fragment med en mengde karakteristisk for normale pasient-prøver, hvori en forhøyet mengde er en indikator på Alzheimers sykdom.

Det er videre beskrevet in vitro fremgangsmåte for screening av forbindelser for å identifisere P-amyloid produksjonsinhibitorer, kjennetegnet ved at den omfatter: a) dyrking av celler under betingelser som resulterer i sekresjon av et oppløselig amino-terminalt fragment av P-amyloid forløper protein (ATF-PAPP), hvori aminosyresekvensen til det oppløselige ATF-PAPP utgår fra den aminoterminale enden av PAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid;

b) eksponering av de dyrkede cellene for en testforbindelse; og

c) detektering av en mengde av oppløselig ATF-pAPP; hvorved en reduksjon i mengden

av oppløselig ATF-PAPP sammenlignet med mengden av oppløselig ATF-PAPP fra celler

ikke eksponert for forbindelsen indikerer at forbindelsen er en P-amyloid produksjonsinhibitor.

Oppfinnelsen vedrører også oppløselig fragment av B-amyloid forløper protein (PAPP) i renset og isolert form, kjennetegnet ved at aminosyresekvensen til nevnte PAPP fragment utgår fra den aminoterminale enden av PAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid (PAP), idet nevnte pAPP fragment har et C-terminal metionin eller leucin som er et resultat av spaltning av P-amyloid peptidet fra intakt PAPP.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figurene IA og IB illustrerer de forskjellige isoformene av normal BAPP og de tilsvarende isoformene av ATF-BAPP, henholdsvis. Figurene 2A, 2B og 2C er kjemiluminiscerende gelmønstre av materialer som er fremstilt fra det behandlede mediet av en human føtal hjernecellekultur. Kolonnene 1,2 og 3 i hver gel representerer et ubehandlet kondisjonert medium, det kondisjonerte medium utttømt ved en reaksjon med et antistoff som gjenkjenner en epitop innenfor de B-amyloide peptidgruppene 1-16, og materialet fjernet ved hjelp av dette antistoff hen-holdsvis. Platene A, B og C representerer de følgende prober, anti-5-antistoff (som gjenkjenner posisjoner på BAPP amino-terminal i B-amyloid peptidområdet), antistoff 92 (som ble gjort reaktivt mot et syntetisk peptid som avslutter i den C-terminale metioningruppen som er eksponert ved spaltingen av BAP fra BAPP), og antistoff 10D5 (et monoklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop av BAP innenfor aminosyregruppene lr 16) henholdsvis. Figur 3 er en chemiluminiscert gel oppnådd ved å under-søke humant lumbar CSF. CSF ble probet med 92 antistoff enten alene (kolonne 1) eller preinkubert med forskjellige peptider som representerer variasjoner med hensyn til C-terminus-gruppen i ATF-BAPP. Man kunne observere en signifikant konkurranse (reduksjon i bindingen) med peptider som var avsluttet i den C-terminale metioningruppen (kolonne 3,4,6 og 7). Peptidene var som følger: Kolonne 1: uten tilsetning av kon-kurrerende peptid; Kolonne 2: GSGLTNIKTEEISEVK; Kolonne 3: YSGLTNIKTEEISEVKM; Kolonne 4: ISEVKM; Kolonne 5: EISEVKMD; Kolonne 6: CISECKM; Kolonne 7: YISEVKM. MW = molekylmasse-markører (angitt i kilodalton). Figur 4 er et autoradiogram som representerer elektro-foresegelmønsteret som ble oppnådd ved en immunoutfelling av kondisjonert medium fra forskjellige cellelinjer. Det materialet som ble utskilt av de humane føtale hjernekulturene og immunoutfelt ved hjelp av antistoff 92 (kolonne 11 ved pilen)

er åpenbart mindre enn det materialet som ble utfelt ved hjelp av antistoff 6C6 (Kolonne 10 ved pilen). Antistoff 6C6 gjen-kjenner en epitop innenfor gruppene 1-16 i BAP.

Figur 5 er et autoradiogram som representerer elektro-foresegelmønsteret oppnådd ved en immunoutfelling av kondi-sjonert medium fra humane 293 cellelinjer transfektert med cDNA som koder både normalt og svensk BAPP. Mengden av AFT-BAPP materialet som ble utskilt ved hjelp av de svenske trans-fekterte cellene (kolonne 11 og 12) er kvalitativt større enn det som ble fremstilt av normale BAPP transfektanter (Kolonne 9 og 10).

BESKRIVELSE AV SPESIFIKKE UTFØRELSER

Foreliggende oppfinnelse er et resultat av identifikasjonen av et nytt utskilt fragment av B-amyloid forløperprotein (BAPP) som er oppstått ved en spalting fra et intakt B-amyloid peptid (BAP) område fra forløperproteinet. De nye, utskilte fragmentene utgjør den amino-terminale delen av BAPP som blir igjen etter en slik spaltning, og vil i det etterfølgende bli betegnet som den amino-terminale fragmentformen av BAPP (ATF-BAPP). Man antar at ATF-BAPP er produktet av en alternativ sekretorisk bearbeidingvei-for BAPP, og at denne nedbrytnings-veien er tilstede selv i normale (ikke-sykdoms) celler. Man antar videre imidlertid at den alternative sekretoriske ned-brytningsveien kan være ansvarlig for en viktig begivenhet ved produksjonen av BAP i sykdomsceller hos pasienter, og at en unormal produksjon av ATF-BAPP kan inngå i sykdommer som angår BAP-plaque, da spesielt Alzheimers sykdom og Downs syndrom.

Således angår foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter og blandinger for kontroll og måling

av cellulær bearbeiding av BAPP basert på påvisning og måling av ATF-BAPP i biologiske prøver.

ATF-BAP blir identifisert og gjenkjent ved hjelp av en spesifikk binding til antistoffer som er gjort reaktive mot peptider som inneholder visse aminosyregrupper i BAPP som ligger umiddelbart inntil BAP området og som for normal BAPP innbefatter karboksyterminalt metionin (nummerert som metionin i 695 isoformen, som angitt i det etterfølgende). Peptidene vil vanligvis innbefatte minst fem sammenhengende aminosyregrupper opp til og innbefattende aminosyrerest 596. Oppfinnelsen angår videre spesifikke fremgangsmåter for fremstilling av slike antistoffer slik dette er angitt i det følgende.

Idet man refererer til Figurene IA og IB, har man funnet at BAPP forekommer i tre isoformer som inneholder 695,751 og 770 aminosyrer henholdsvis. 695 isoformen er den mest vanlige i neuronale celler, mens 751 og 770 isoformene er oppstått ved innsettinger ved gruppe 298 i 695 isoformen (all nummerering av 695 isoformen vil være som beskrevet av

Kang et al. (1987), Nature 325:733-736). ATF-BAPP er åpenbart et resultat av en proteolytisk spalting av de forskjellige BAPP isoformene ved eller innenfor de fem aminosyregruppene som befinner seg på den aminoterminale siden av anuno-terminus i B-

amyloid peptid BAP området, som er plassert mellom aminosyrene 596 og 597. i 695

isoformen. En slik spalting vil resultere i en eksponering av en C-terminal gruppe, og denne vil vanligvis være metionin596, lysin595 eller leucin<596>, mest vanlig metionin<596>, vist som

MET5<96> og LYS<595> på Figur IB. Det er imidlertid under-forstått at de C-terminale gruppene

vil ha en annen nummerering når ATF-BAPP er avledet fra en annen BAPP isoform. Mer spesielt kan man angi at den C-terminale metioningruppen vil være MET<652> og MET<671>, mens den C-terminale lysingruppen vil være LYS6<51> og LYS<670> i 751 og 770 BAPP isoformene henholdsvis. Som brukt i det etterfølgende og i kravene, vil metionin596, lysin595 og leucin596 generelt referere seg til de tilsvarende aminosyre-grupper i alle andre isoformer eller varianter av BAPP. Man antar for tiden at den N-terminale gruppen i ATF-BAPP er LEU<18> i alle isoformene (basert på bearbeiding av den amino-terminale enden i BAPP i utskilte former som er spaltet innenfor BAP området).

ATF-BAPP kan påvises og/eller måles i en rekke forskjellige biologiske prøver, og

heri inngår in vitro prøver, f.eks. et kondisjonert medium fra dyrkede celler, og in vivo pasient-prøver, typisk CSF, blod, serum, plasma, urin, vev og lignende. Påvisning og måling kan utføres ved hjelp av enhver teknikk som er istand til å skille ATF-BAPP fra andre BAPP fragmenter som måtte forekomme i prøven. Hensiktsmessig kan man bruke immunologiske påvisnings-metoder som anvender antistoffer, antistoff-fragmenter eller andre ekvivalente spesifikke bindende stoffer, og som binder seg til en C-terminal gruppe i ATF-BAPP som er eksponert ved spalting av BAP-området, f.eks. metionin<596>, leucin<596> eller lysin<595>. Man har funnet at slike C-terminale-spesifikke stoffer er istand til å diskriminere mellom ATF-BAPP og nærstående BAPP fragmenter. Alternativt kan man bruke immunologisk påvisningsteknikk som er basert på isolert og renset ATF-BAPP hvor man bruker vanlig kjent teknikk. Fremstillingen av både C-terminale gruppe-spesifikke antistoffer og renset og isolert ATF-BAPP er beskrevet i det etterfølgende. Spesielt egnet påvisningsteknikk innbefatter ELISA, Western blotting, radio-immunologiske prøver o.l.

Man kan også bruke andre typer teknikk for påvisning av ATF-BAPP som ikke krever bruk at ATF-BAPP spesifikke antistoffer og/eller konkurrerende antigen. Man kan f.eks. bruke todimensjonal gelelektroforese for å skille nærstående løselige fragmenter av BAPP. Man kan så bruke antistoffer som er tverr-reaktive med mange eller alle fragmenter for å probe gelene, og hvor et nærvær av ATF-BAPP kan identifiseres basert på deres presise plassering på gelen. Man kan også anvende andre typer teknikk for påvisning av ATF-BAPP som er velkjente innenfor genteknikken. For eksempel kan utskilte BAPP fragmenter som inneholder det amino-terminale området at BAP immunologisk fjernes fra en prøve for å isolere ATF-BAPP (se Figur 2A, kolonne 2 og Figur 5, kolonne 11 og 12), som deretter kan påvises ved enhver av de fremgangsmåter som er nevnt ovenfor.

Antistoffer som er spesifikke for ATF-BAPP kan fremstilles mot et egnet antigen eller hapten som innbefatter den C-terminale ATF-BAPP sekvensen, og heri inngår metioningruppen.

Hensiktsmessig kan syntetiske peptider fremstilles ved vanlig fastfase-teknikk, kobles til et egnet immunogen og brukes for å fremstille antisera eller monoklonale antistoffer på vanlig kjent måte. Et egnet syntetisk peptid består av 6 aminosyrer av ATF-BAPP (ISEVKM) som er plassert umiddelbart inntil den amino-terminale siden av BAP og som kan kobles til et immuno-gen og deretter brukes for å fremstille spesifikke antistoffer som beskrevet detaljert i den eksperimentelle delen. Andre egnede peptidhaptener vil vanligvis innbefatte minst 5 sammen-hengende aminosyregrupper innen BAPP umiddelbart inntil den amino-terminale siden av BAP, og kan innbefatte mer enn 6 grupper (skjønt man fant at et peptid som innbefattet 16 amino-terminale grupper ga antisera som var mindre spesifikt). De 25 karboksyterminale aminosyregruppene i normalt ATF-BAPP er som angitt nedenfor (idet man bruker enkle bokstaver for å betegne aminosyrene).

Syntetiske polypeptidhaptener kan fremstilles ved hjelp av den kjente Merrifield fastfase-synteseteknikk hvor amino-syrer sekvensmessig adderes til en voksende kjede (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156). Aminosyresekvensene kan være basert på den amiriosyrekvens i ATF-BAPP som er angitt ovenfor, eller man kan bruke naturlig forekommende eller manipulerte mutantsekvenser. Således vil f.eks. den svenske mutanten ha asparagin<595->leucin<596> istedetfor lysin<595->metionin<596>, og andre substitusjoner kan innbefatte bare leucin<596> substitusjonen istedetfor metionin596.

Så snart man har oppnådd en tilstrekkelig mengde av poly-peptidhaptenet, kan dette konjugeres til en egnet immunogen bærer, f.eks. serumalbumin, såkalt "keyhole limpet" hemocyanin, eller andre egnede proteinbærere, slik disse f.eks. er beskrevet i Hudson og Hay, Practical Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, kapittel 1.3,1980, og hvor

denne publikasjonen inngår her som en referanse.

Så snart man har oppnådd en tilstrekkelig mengde av immunogenet, vil antistoffer

som er spesifikke for den C-terminale gruppen eksponeres ved spaltning av BAP til ATF-

BAPP, og dette kan gjøres in vitro eller ved hjelp av en in vivo teknikk. In vitro teknikken innbefatter bl.a. en eksponering av lymfocytter overfor immunogener, mens en in vivo teknikk krever at man injiserer immunogenene i en egnet patte-dyrvert. Egnede pattedyrverter er ikke-humane verter, og innbefatter mus, rotter, kaniner, sau, geit o.l. Immunogenene injiseres i dyret etter en forutbestemt plan, og dyrene tappes periodevis for blod hvor de suksessive tapningene vil ha bedret titer og spesifisitet. Injeksjonene kan gjøres intra-muskulært, intra-peritonalt, subkutant eller lignende, og man vil bruke et fortynningsmiddel, f.eks. et ufullstendig Freund's medium.

Hvis det er ønskelig, kan monoklonale antistoffer oppnås ved å fremstille immortaliserte cellelinjer som er istand til å fremstille antistoffer med den ønskede spesifitet. Slike immortaliserte cellelinjer kan fremstilles på en rekke forskjellige måter. Hensiktsmessig kan mindre pattedyr, f.eks. en mus, hyperimmuniseres med det ønskede immunogen ved hjelp av den fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor. Pattedyret blir så drept, vanligvis flere dager etter den avsluttende immuniseringen, hvoretter miltcellene fjernes og immortaliseres. Den type immortalisering man bruker er ikke kritisk. Den mest vanlige kjente teknikk idag er en fusjon med en myeloma cellefusjonspartner, slik det er beskrevet av Kohler og Milstein (1975) Nature 256:495-497. Andre teknikker innbefatter EBV transformering, transformering med rent DNA, f.eks. onkogener, retrovirus, etc, eller enhver annen fremgangsmåte som gir en stabil opprettholdelse av cellelinjen og produksjon av monoklonale antistoffer. Spesifikk teknikk for fremstilling av monoklonale antistoffer er beskrevet i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Låne, red:, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, som her inngår som en referanse.

I tillegg til monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer (antisera), kan påvisningsteknikkene også kunne bruke antistoff-fragmenter, f.eks. F(ab), Fv, Vl, Vh og andre fragmenter. Det er også mulig å bruke rekombinant fremstilte antistoffer (immuno-globuliner) og variasjoner av disse, slik det er beskrevet både i patentlitteraturen og den vitenskapelige litteratur. Se f.eks. EPO 8430268.0; EPO 85102665.8; EPO 85305604.2; PCT/GB85/00392; EPO 85115311.4; PCT/US86/002269; og japansk patentsøknad 85239543. Det vil også være mulig å fremstille andre rekombinante proteiner som vil kunne etterligne den bindende spesifiteten på de antistoffer fremstilt som beskrevet ovenfor.

Islolert og renset ATF-BAPP er vanligvis fremstilt i en i alt vesentlig reii form. Med begrepet "i alt vesentlig ren" forstås minst 50% (vekt/vekt) eller høyere renhet med en vesentlig frihet for påvirkende proteiner og forurensninger. Fortrinnsvis vil nevnte ATF-BAPP bli isolert og syntetisert i en renhet som er høyere enn 50 vekt%, fortrinnsvis 80 vekt% eller høyere. ATF-BAPP kan renses fra en naturlig kilde ved hjelp av vanlig kjent proteinrensningsteknikk, og hvor homogene blandinger med en renhet på minst 50 vekt% blir renset ved hjelp av de anti-stoffer som er fremstilt som beskrevet ovenfor, idet man bruker vanlig immunoaffinitets-separasjonsteknikk. Egnede naturlige utgangsmaterialer innbefatter kondisjonert medium fra ATF-BAPP-produserende cellelinjer, såsom føtale hjernecellekulturer o.l. Alternativt kan ATF-BAPP isoleres fra biologiske prøver som er oppnådd fra en pasient, f.eks. CSF, serum o.l. Egnede proteinrensningsteknikker er beskrevet i Methods in Enzymology, Vol. 182, Deutcher, red., Academic Press, Inc., San Diego, 1990.

Antistoffer og renset ATF-BAPP fremstilt som beskrevet ovenfor, kan brukes i

forskjellige typer vanlig kjente immunologisk kjente teknikker for påvisning av ATF-BAPP i biologiske prøver, da spesielt in vivo pasient-prøver for kontroll og måling av B-amyloid beslektede sykdommer og i kondisjonert media fra cellekulturer for å kontrollere den intracellulære bearbeidingen av BAPP. Egnet immunologisk teknikk innbefatter immunoprøver såsom ELISA, Western Blot-analyser o.l. Tall-rike spesifikke immunolgiske påvisningsteknikker er beskrevet i Harlow og Lane, ovenfor.

En in vivo påvisning av ATF-BAPP i pasientprøver kan brukes for diagnose og

kontroll av Alzheimers sykdom og andre sykdommer som står i forbindelse med B-amyloid plaque-avsetning, f.eks. Downs syndrom. Egnede pasientprøver innbefatter CSF, blod,

serum, plasma, urin, vev o.l. Nærvær av sykdommen vil vanligvis være forbundet med forhøyede nivåer av ATF-BAPP, eller forhøyede forhold med hensyn til mengden av ATF-

BAPP til mengden av andre utskilte BAPP fragmenter (f.eks. de BAPP-fragméhter som spaltes

inne i eller ved den karboksyterminale gruppen til BAP-området) sammenlignet med de verdier man finner i friske pasienter, dvs. pasienter som ikke lider av Alzheimers sykdom eller andre B-amyloid-beslektede sykdommer. Mengden av ATF-BAPP kan sammenlignes med mengden av andre forbindelser av APP, enten en isoform (f.eks. 695,751 eller 770)

og/eller en form som ytterligere er definert ved sin karboksy-terminus (f.eks. former kuttet ved og/eller karboksy-terminal til den posisjon som er beskrevet av Esch et al.). I tillegg til en første diagnostisk fremgangsmåte, kan nivåene av ATF-BAPP kontrolleres for å følge utviklingen av sykdommen, og eventuelt følge eller påvise effektiviteten av behandling.

Det er underforstått at nivåene at ATF-BAPP vil synke med en effektiv behandling.

En in vitro kontroll av ATF-BAPP-nivåene av dyrknings-media fra egnede

cellekulturer kan brukes for undersøkelse av virksomme medikamenter. Ved å dyrke celler under betingelser som resulterer i en utskillelse av ATF-BAPP i kulturmediet, hvoretter man eksponeres disse celler overfor prøveforbindelsene, kan gjøre at man kan observere effekten

av disse prøveforbindelsene på ATF-BAPP utskillelsen. Det er å vente at prøveforbindelser

som er istand til å senke mengden av ATF-BAPP, vil være mulige forbindelser for utprøving som inhibitorer av BAP dannelse. Egnede cellelinjer innbefatter humane og animalske cellelinjer, f.eks. 293 human nyrecellelinje, humane neurogliomacellelinjer, humane HeLa

celler, primære endoteliske celler, (f.eks. HUVEC celler), primære humane fibroblaster eller lymfoblaster (heri inngår endogene celler avledet fra pasienter med BAPP mutasjoner),

primære humane blandede hjerneceller (heri inngår neuroner, astrocyter og neuroglia),

kinesiske hamsterovarie- (CHO) celler o.l. Cellelinjer som preferensielt øker nivået eller forholdet med hensyn til ATF-BAPP vil være spesielt fordelaktige for bruk i foreliggende fremgangsmåter.

På lignende måte vil en in vitro kontroll av ATF-BAPP i dyremodeller med hensyn til Alzheimers sykdom, f.eks. den muse-modellen som er beskrevet i WO91/19810, og hvor

denne søknad inngår som en referanse, kan også brukes for å sikte prøveforbindelser for terapeutisk effektivitet (vanligvis for å prøve forbindelser som på forhånd er blitt identifisert i en in vitro undersøkelse). Prøveforbindelsen(e) tilføres et dyr, og man observerer nivået av ATF-BAPP eller forholdet mellom ATF-BAPP og andre BAPP fragmenter. De forbindelser som vil redusere nivået av ATF-BAPP eller senke forholdet mellom ATF-BAPP og andre

BAPP fragmenter, vil være mulige kandidater for videre bedømmelse.

Prøveforbindelsene kan være ethvert molekyl, forbindelse eller annet stoff som kan tilsettes cellekulturen uten at man i vesentlig grad påvirker cellenes levedyktighet. Egnede prøveforbindelser kan være små molekyler, biologiske polymerer såsom polypeptider, polysakkarider, polynukleotider o.l. Prøveforbindelsene vil vanligvis tilsettes kulturmediet i en konsentrasjon som varierer fra 1 nM til 1 mM, vanligvis fra

ca; 10 um til 1 mM.

Prøveforbindelser som er istand til å hemme utskillelsen av ATF-BAPP vil være å

anse som kandidater for ytterligere bestemmelse med hensyn til evnen til å blokkere B-

amyloid produksjon i patogene celler. En hemming at utskilllelsen indikerer at spaltingen av BAPP i aminoterminus-gruppen i BAP sannsynligvis i det minste delvis, er blokkert, noe som reduserer mengden av et bearbeidende mellomprodukt som er til-gjengelig for omdannelse til et B-amyloid peptid.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

EKSPERIMENTELT

Materialer og metoder

1. Antistoff og affinitetsmatrisefremstilling.

Monoklonalt antistoff 6C6 ble fremstilt og undersøkt på samme måte som antistoff 10D5 (Hyman et al. (1992). J. Neuropath. Exp. Neurol. 51:76) ved å bruke et syntetisk peptid inneholdende BAP restgruppene 1-28 konjugert til kaninserum-albumin som immunogenet. Både 10D5 og 6C6 gjenkjenner en epitop innenfor de første 16 aminosyrene i nevnte BAP sekvens. 6C6 var mer effektiv enn 10D5 ved immunoutfelling, og ble brukt som innfangningsantistoff. For å fremstille 6C6 harpiks, ble 4 ml Affigel©10 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) vasket med kaldt vann og blandet med 3 ml 6C6 (12,5 mg/ml i PBS, 2,7 mmol KC1,1,5 mmol KH2P04, 8,1 mmol Na2HP04,137 mmol NaCl, pH 7,5) 0,5

mol NaCl. Koplingen skjedde over natten ved 4°C under forsiktig risting. 400 ul 1 molar Tris, pH 8,0 ble så tilsatt, og risting fortsatt i 40 min. Harpiksen ble så vasket med TTBS

(137 mmol NaCl, 5 mmol KC1,25 mmol Tris, 0,5% Tween©20, pH 7,5) flere ganger før bruk. Antistoff 7H5 er også beskrevet i Hyman et al. (1992) ovenfor.

Antistoffer (betegnet antistoff 92) ble aktivert mot et syntetisk peptid som inneholdt gruppene 591-596 i BAPP (nummerering som i Kang et al, (1987) ovenfor). Peptidet (N-acetyl-CISEVKM) ble konjugert til kaninserumalbumin som var aktivert med sulfo-maleimido-benzoyl-N-hydroksysuksinimid-ester, slik at man fikk dannet et immunogen. Antisera ble aktivert mot immunogenet i kaniner ved hjelp av standardmetoder. Under hver inokulering mottok kaninene 5 ug immunogen i 0,1 ml injeksjoner subkutant på ca. 10 steder (50 ug/sprøyte). Det samme peptidet ble koplet til Sulfo-link™ gel (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) for affinitetsrensingen av antistoffer fra IgG fraksjonen.

Det er i det etterfølgende gitt en mer detaljert beskrivelse av fremstillingen av

antistoffet 92. Kaninserumalbumin (12,3 mg) ble inkubert med 13 mg sulfo-maleimido-benzoyl-N-hydroksysuksinimid-ester i 1,25 ml 0,05 molar HK2PO4, pH 7,0, i 20 minutter ved 0°C. Blandingen ble så umiddelbart underkastet gelfiltrering på en 1 x 75 cm kolonne, pav Sephadex G-10 ekvilibrert med fosfatbufferen. De proteinholdige fraksjonene ble slått sammen og umiddelbart blandet med 30 mg N-acetyl-CISEVKM peptid som var syntetisert ved hjelp av standard automatiserte fastfase-metoder. Koplingsreaksjonen med et volum på 20 ml, skjedde over natten og ble så sendt til et kommersielt anlegg for antistoff-utvikling. Injeksjons-protokollen var å emulgere antigenet i et tilsvarende volum av Freunds

fullstendige medium og subkutant injisere totalt 50 ug antigen i 0,1 ml porsjoner på 10 steder.

Hver 3. uke deretter ble en forsterkende injeksjon gitt ved hjelp av samme protokoll, bortsett

fra at man som emulgeringsmiddel brukte Freunds ufullstendige medium. Kaninene ble tappet for blod 1 uke etter hver injeksjon, og serumet undersøkt for titrerings-verdi ved en reaksjon med peptidet i ELISA. IgG ble renset fra positivt reagerende sera ved utfelling med 50% (NH4)2S04, (2 ganger) og dialysen mot PBS. N-acetyl-CISEVKM peptidet ble konjugert til Sulfo-link™ gelen (Pierce Chemical Co., Rockford, EL) idet man brukte fabrikantens anbefalinger for å utvikle en affinitetsharpiks som kan brukes for å rense peptid-spesifikke antistoffer. IgG fraksjonen ble påsatt kolonnen, og etter omfattende vasking for å fjerne ikke-spesifikt bundet materiale med PBS, ble antistoffene eluert med 0,1 molar glycin

pH 2,5,0,5 molar NaCl og deretter dialysen mot PBS før frysing.

2. Human føtal hjernecellekultur.

Føtale neurale vevsprøver ble oppnådd fra 12-14 uker gamle aborterte fostre. Prøver

av hjernebarken ble vasket 2 ganger med Hanks balanserte saltløsning (HBSS). Hjernebark-

vev (2-3 g) ble plassert i 10 ml kald HBSS som var tilsatt 1 mg DNase (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO D3427). Den behandlede suspensjonen ble filtrert gjennom Nitex nylon sikter

på 210 um og 130 um, som beskrevet av Pulliam et al. (1984) J: Virol. Met. 9:301.

Cellene ble innhøstet ved sentrifugering og igjen sus-pendert i neuronalt medium

(NEM forsterket med 10% føtalt storfeserum, 1% glukose, lmmol NaPyruat, 1 mmol

glutamin, 20 mmol KC1). Polyetyleniminbelagte 100 ml. skåler ble så tilsatt 1,5 x 10<7> celler i

8 ml neuralt medium. Mediet ble skiftet 2 ganger i uken. Alle kulturer i denne undersøkelsen ble dyrket in vitro i minst 30 dager. For serumfrie vekstbetingelser ble kulturene flyttet over i et definert medium (DMEM supplementert med 5 ug/ml bovint insulin; 0,1 mg/ml humant

transferrin; 0,1 mg/ml BSA fraksjon V; 0,062 ug/ml progesteron; 1,6 ug/ml putrescin; 0,039

ug/ml natriumselenitt, 0,042 ug/ml tyroksin, og 0,033 ug/ml trijod-L-tyroriin), og etter 3

dager ble super-natanten samlet.

Kondisjonert medium fra cellene (10 ml) ble så samlet inn. EDTA(5 mmol),

leupeptin (10 ug/ml) og Tris-HCl (20 mmol, pH 8,0) ble tilsatt hver 10 ml prøve ved den

angitte sluttkonsentrasjon, og prøvene ble sentrifugert ved 30.000 x g i 20 minutter ved 4°C.

Den resulterende supernatanten ble delt i 2 like porsjoner, 6C6 harpiks ble tilsatt den ene av porsjonene (200 ul harpiks hvor det var bundet ca. 5mg/ml av 6C6). Begge porsjonene ble forsiktig blandet i 6 timer ved 4°C, hvoretter harpiksen ble pelletert, og én ytterligere porsjon på 200 ul av harpiksen ble så tilsatt. Prøvene ble ytterligere blandet ved 4°C over natten. De samlede harpikser ble vasket to ganger med TTBS, deretter kortvarig ekstrahert 2 ganger med en ml porsjoner av 0,1 mol glycin, 0,1 mol NaCl, pH 2,8.

Det materialet som var ekstrahert fra harpiksen, dvs. medium som var uttømt ved hjelp av harpiksen, og utgangs-mediet ble individuelt utfelt med 10% TCA (trikloreddiksyre) ved 0°C i 1 time, og pellets ble deretter vasket med aceton og resuspendert i 150 ul SDS-PAGE prøvebuffer under reduserende betingelser og så kokt. Hver prøve (25 ul) ble underkastet SDS-PAGE ved å bruke 10-20% tricingeler (Novex). Proteinene ble overført til ProBlot PVDF membraner over natten ved 40V. For å visualisere de immunoreaktive proteinene, brukte man TROPIX kjemiluminescens-systemet slik dette er angitt av fabrikanten for AMPPD subtratet. Primære antistoffkonsentra-sjoner som ble brukt var følgende: anti-5,0,1 ug/ml; 92,2 ug/ml; 10D5,2 ug/ml.

3. Dyrking av humane 293 celler.

Humane 293 celler (ATCC Nr. CRL-1573) ble modifisert til overekspress APP (Selkoe et al. (1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:7341). Cellene ble dyrket i 10 cm skåler til de ble halvflytende før bruk. Metabolisk merking og immunoutfelling ble utført som i alt vesentlig beskrevet tidligere av Oltersdorf et al. (1989) Nature 341:144 og (1990) J. Biol. Chem. 265:4492. Kort forklart, ble merkingen utført i 10 cm skåler. Cellene ble vasket i metioninfritt medium, inkubert i 20 min. i 2 ml metioninfritt medium supplert med 0,5 mCi 35 -metionin, vasket i fullverdig medium, og deretter ristet i 2 timer i 3 ml med fullt medium. Kondisjonert medium ble opp-samlet og renset ved 3.000 x g i 10 min., fulgt av en for-absprbsjon med protein A Sepharose© (Pharmacia, Piscataway, NJ). Immunoutfelling ble utført med 1,5 mg protein A Sepharose© pr. prøve, antistoff anti-5 ble brukt i en konsentrasjon på 2 jig pr. prøve; 6C6,7H5 og 92 ble brukt i en konsentrasjon på 10 ug pr. prøve. Man brukte 5 mg kanin-antimus IgG sammen med 6C6 og 7H5 såvel som i kontrollprøvene. De utfelte fraksjonene ble vasket 4 ganger i TBS (137 mmol NaCl, 5 mmol KC1,25 mmol Tris, pH 7,5), 0,1% NP40,5 mmol EDTA, 1 mmol PMSF, 10 ug/ml leupeptin. SDS-PAGE ble utført på 5% Laemmli geler. 4. Dyrking av humane 293 celler transfektert med svensk mutasjon.

Duplikatbrønner i et 6 brønns trau med humane nyre 293 celler ble midlertidig transfektert med plasmidvektorer som uttrykker enten normalt humant BAPP eller den svenske muta-sjonsvarianten BAPP hvor man brukte en DOT AP styrt transfek-sjonsmetode slik dette er beskrevet av fabrikanten (Boehringer Mannheim). 40 timer senere ble cellene plassert i et metioninfritt DME medium inneholdende 10% føtalt kalveserum, og 20 min.

senere ble de merket i 35 min. med 200 uCi/ml <35>S-metionin. Cellene ble deretter ført tilbake til normalt DME medium inneholdende 10% føtalt kalveserum, og inkubert i ytterligere 2,5

time. Mediet ble så oppsamlet fra cellene og sentrifugert 1000 x g i 15 min. for å fjerne alle celler. Supernatantene ble delt i 2, og halvparten ble immunoutfelt med anti-5 antistoff ved hjelp av standardmetoder. Den andre halvparten ble inkubert over natten med agarose-koblet 6C6 antistoff, og materialet bundet til 6C6 agarosen ble utskilt ved sentrifugering. Det gjenværende materialet ble så immuno-utfelt med anti-5 antistoff. De totale anti-5

immunoutfelte fraksjoner (a5+), 6C6 bundete utfelte fraksjoner (6C6+) og 6C6 ikke-reaktive, anti-5 reaktive immunoutfelte fraksjoner . (6C6-,a5+) ble kjørt på en 5% Laemmli gel, og immunoreaktive proteiner ble visualisert ved autoradiografi.

Beskrivelse av de eksperimentelle figurene

Fig. 2: Påvisning av avkuttet BAPP i kondisjonert medium fra

humane blandede-hjernecelle-kulturer.

Prøve 1 er det kondisjonerte medium fra kulturen; prøve 2 er mediet uttømt av 6C6-reaktivt BAPP; og prøve 3 er materialet ekstrahert fra 6C6 harpiksen. Plate A ble probet med anti-5 antistoffer som var aktivert mot BAPP sekvensen 444-592 (Oltersdorf et.al.,

(1989) ovenfor, og (1990) ovenfor.

Plate B ble probet med antistoff 92 slik dette er beskrevet i seksjonen for materialer og metoder. Plate C ble probet med 10D5, et monoklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop innen BAP gruppene 1-16, som beskrevet i foregående avsnitt. De lavmolekylære bånd som ble observert i C2 og C3 ble ikke sett i C1, og er avledet av 6C6 harpiksen og er gjenkjent av et geite-anti-mus IgG alkalist fosfatasekonjugat som er uav-hengig av et primært antistoff,

(data ikke vist).

Fig. 3: Spesifitet for 92 Antistoffer.

1 ml av en human lumbar CSF prøve fra en 75 år gammel mannlig pasient ble utfelt med 10% TC A for å få en 10 gangers økning i konsentrasjonen, og så bearbeidet som beskrevet i forbindelse med Fig. 2, bortsett fra at gelbrønnen var en 4 cm spalte. 92

antistoffet ble fortynnet til 6,7 ug/ml i 0,5 ml TTBS i nærvær av forskjellige mulige konkurrerende peptider, hvert i en omtrentlig konsentrasjon på 60 um i 10 timer ved 4°C

under forsiktig røring. Antistoffet ble så fortynnet 8 ganger i 1% gelatin/TTBS før inkubering med striper av blottet av det CSF-avledete materialet, og deretter bearbeidet som beskrevet i Fig. 2. De konkurrerende peptider var som følger: Kolonne 1: intet konkurrerende peptid tilsatt, Kolonne 2: GSGLTNIKTEEISEVK; Kolonne 3: YSGLTNKTEEISEVKM; Kolonne 4: ISEVKM; Kolonne 5: EISEVKMD; Kolonne 6: CISEVKM; Kolonne 7: YISEVKM. MW = molekylmasse-markører (angitt i kilodalton). Fig. 4: Molekylær masseheterogenitet i utskilte former av APP i immunoutfellinger påvist ved antistoffer

mot forskjellige C-termini i cellelinjer og primære

humane føtale hjernekulturer.

Antistoffer: anti-5; Kolonnene 3,6,9; 6C6 (rettet mot BAP peptid-gruppene 1-16): Kolonne 4,7,10; antistoff 92 (mot APP aminosyrene 591 til 596): Kolonne 5,8,11;

7H5 (mot APP-KPI): Kolonne 12. Celler: venstre plate (kolonne 1 og 3-5): 293 celler stabilt transfektert med APP 695; midtre plate (kolonne 2 og 6-8): 293 celler stabilt transfektert med . APP 751; høyre plate (kolonne 9-13): humane føtale hjernekulturer. Kontroller: Kolonne 1, 2 og 13: kanin anti-mus IgG antistoff. Piler: et eksempel på molekylmasse-forskjeller mellom utskilte former av APP gjenkjent a antistoffene 6C6 og 92. SDS-PAGE ble utført på en 5% Laemmli gel.

MW = molekylmassemarkører (angitt i kilodalton).

Fig. 5: Påvisning av avkappet BAPP i kondisjonert medium

fra humane 293 celler transfektert med svensk mu tant

Fig. 5 viser resultatene av doble transfeksjoner for både normale og svenske former. Kolonne 1-4 er a5+; kolonne 5-8 er 6C6+; og kolonne 9-12 er 6C6-, a5+ prøver. Kolonne 1,2,5,6,9 og 10 er fra normalt BAPP, kolonne 3,4,7,8,11 og 12 er fra svensk BAPP. Den svenske mutanten resulterer i produksjon av øket AFT-aAPP, ettersom

kolonnene 11 og 12 inne-holder mer ATF-BAPP materiale enn kolonnene 9 og 10.

Resultater

Monoklonalt antistoff 6C6 som gjenkjenner en epitop av BAP innenfor gruppene 1-16 ble brukt for å irnmunouttømme visse BAPP fragmenter fra forskjellige prøver. Det monoklonale antistoffet 6C6 ble koplet til harpiksen (som beskrevet ovenfor), og inkubert med kondisjonert medium fra humane føtale hjernecellekulturer som beskrevet ovenfor. Det frem-går av Fig. 2, kolonne C2 at denne harpiksen effektivt fjerner det BAPP som inneholder BAP 1-6 fra det kondisjonerte medium i cellekulturen. Vesentlige mengder BAPP immunoreaktivitet ble imidlertid ikke innfanget av harpiksen slik dette kan påvises ved anti-5 antistoff som er rettet inn mot en epitop N-terminal to BAP området (Fig. 2, kolonne A2).

For å karakterisere denne tilsynelatende nye formen av BAPP, aktiverte man

antistoffer mot et syntetisk peptid som innbefattet BAPP gruppene 591-596 (som beskrevet ovenfor). Dette antistoffet (med betegnelsen 92) ble funnet å gjenkjenne de typer av BAPP som ikke var innfanget av harpiksen (Fig.2, kolonne B2), men overraskende ikke reagerte med den utskilte formen av BAPP som inneholdt BAP 1-16 sekvensen (Kolonne B3).

Forklaringen på denne mangel på tverr-reaktivitet synes å være at 92 antistoffet gjenkjenner enn epitop i BAPP som inn-befatter den karboksyterminale metioningruppen,

som tilvarer restgruppe 596. Man undersøkte følgelig forskjellige syntetiske peptiders evne til å blokkere den immunoreaktivitet som var utviklet med 92. Det fremgår av Fig. 3 at BAPP sekvens-baserte peptider som ender med ekvivalenten til metionin 596, i alt vesentlig blokkerer reaksjonen med 92, mens peptider som er en aminosyre lenger eller kortere i sin karboksy-teminale gruppe, er i alt vesentlig ineffektive med hensyn til konkurranse. Det samme konkurransemønsteret med hensyn til peptider kunne observeres i cellekultur supernatanter (data ikke vist) og i CSF. En serie såkalte puls^eksperimenter viste at påvisbare mengder av antistoff 92-immunoutfelt materiale ble fremstilt av 293 celler som overuttrykte enten 695 eller 751 isoformene av BAPP (Fig. 4, kolonne 5 og 8). Lignende eks-perimenter med humane føtale hjernecellekulturer viste at 92 immunoutfelt materiale kan skilles fra 6C6 reaktivt BAPP med lavprosentvis (5%) SDS-PAGE (Fig. 4, kolonne 9-11). I de føtale hjernecellekulturene var den alternative bearbeidingen av BAPP former som inneholder Kunitz proteasehemmende områder (KP1) mindre fremtredende, skjønt man kunne observere svake samyandrende bånd med antistoff 92 og anti-KPI-antistoff 7H5 immunoutfelt materiale (kolonne 11 og 12).

Evnen til å skille antistoff 92 og 6C6 utfelt materiale i blandede hjernekulturer skyldes

i det minste delvis de nesten like mengder av de respektive former som fremstilles sammenlignet med situasjonen i 293 celler. Estus et al (1992), ovenfor, observerte at sammenlignet med andre typer vev, inne-holdt humane hjerneceller en relativt høyere mengde av det potensielt amyloide karboksy-terminale fragmentet som basert på størrelse, synes å begynne ved eller nær den amino-terminale gruppen i BAP.

Det temporale sammentreff av utseende med hensyn til antistoff 92 og 6C6 utfelt BAPP materiale er et argument mot sannsynligheten for at det skjer en annenn proteolytisk spalting etter utskillelsen, spesielt fordi lengre reaksjonstider ikke resulterer i en påvisbar endring i forholdet mellom de 92 og 6C6 reaktive fragmentene (data ikke vist).

Oppløsningen av de utskilte former ved hjelp av SDS-PAGE koplet med den full-stendige mangelen på immunologisk tverr-reaktivitet i disse fragmentene, viser videre at det eksisterer en alternativ sekretorisk vei. Den alternative spaltningsposisjonen ble betegnet som B-sekretase posisjonen for å understreke at spaltingen skjer aminoterminalt til BAP, noe som skiller seg klart fra den spalting som er beskrevet av Esch et al. (1990) ovenfor, som skjer innenfor BAP.

Claims (9)

1. In vitro fremgangsmåte for registrering av prosessering av P-amyloid forløper proteinet (PAPP) i celler, karakterisert ved at den omfatter spesifikk detektering av et oppløselig aminoterminalt PAPP fragment (ATF-PAPP) utskilt fra nevnte celler, og en substans som spesifikt bindes til nevnte oppløselige PAPP fragment, og hvori amino-syreekvensen til nevnte PAPP fragment utgår fra den aminoterminale enden av PAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid (PAP), hvori ATF-pAPP er forskjellig fra andre spaltede former av pAPP som kan være tilstede. .

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at detektering av ATF-PAPP fragmentet omfatter, eksponering av nevnte ATF-PAPP fragment for en substans som bindes spesifikt til én C-terminal region på det utskilte fragmentet som er blitt eksponert ved spaltning av P-amyloid peptid fra PAPP; og detektering av bindingen mellom substansen og det utskilte fragmentet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det C-terminale residiet er metionin<596> , lysin595 , eller leucin596.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte ATF-PAPP fragment blir eksponert for antistoff spesifikt for det C-terminale residiet eksponert ved spalting av P-amyloid peptid fra PAPP.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at antistoffet er blitt dannet mot et peptid omfattende residiehe 591-596 av pAPP hvor residiet 596 er eksponert.

6. In vitro fremgangmåte ifølge krav 1 for diagnostisering eller registrering av en P-amyloid beslektet sykdom i en pasient, karakterisert ved at den omfatter at mengden av et utskilt fragment av P-amyloid forløperprotein (PAPP) måles i en pasient-prøve, ved eksponering for en substans som spesifikt bindes til nevnte PAPP fragment, vori aminosyresekvensen til nevnte PAPP fragment utgår fra den aminoterminale enden av pAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid (PAP), og sammenligning av mengden av nevnte PAPP fragment med en mengde karakteristisk for normale pasient-prøver, hvori en forhøyet mengde er en indikator på Alzheimers sykdom.

7. In vitro fremgangsmåte for screening av forbindelser for å identifisere P-amyloid produksjonsinhibitorer, karakterisert ved at den omfatter a) dyrking av celler under betingelser som resulterer i sekresjon av et oppløselig amino-terminalt fragment av P-amyloid forløper protein (ATF-PAPP), hvori aminosyresekvensen til det oppløselige ATF-PAPP utgår fra den aminoterminale enden av PAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid; b) eksponering av de dyrkede cellene for en testforbindelse; og c) detektering av en mengde av oppløselig ATF-PAPP; hvorved en reduksjon i mengden av oppløselig ATF-PAPP sammenlignet med mengden av oppløselig ATF-PAPP fra celler ikke eksponert for forbindelsen indikerer at forbindelsen er en P-amyloid produksjonsinhibitor.

8. Oppløselig fragment av P-amyloid forløper protein (PAPP) i renset og isolert form, karakterisert ved at aminosyresekvensen til nevnte PAPP fragment utgår fra den aminoterminale enden av PAPP til den aminoterminale enden av P-amyloid peptid (PAP), idet nevnte PAPP fragment har et C-terminal metionin eller leucin som er et resultat av spaltning av P-amyloid peptidet fra intakt PAPP.

9. Oppløselig fragment ifølge krav 8, karakterisert ved at det består av residiene 18-596 til PAPP isoform 695, residiene 18-612 av <p>APP isoform 751, eller residiene 18-671 av pAPP isoform 770.