NO322013B3 - Farmasøytisk enhetsdoseringsblanding, samt anvendelse derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk enhetsdoseringsblanding, samt anvendelse derav.

Den foreliggende oppfinnelse dreier seg om en meget selektiv inhibitor av enzymet fosfodiesterase (PDE), og om denne inhibitors anvendelse i en farmasøytisk enhetsdoseringsform. Spesielt dreier den foreliggende oppfinnelse seg om en potent inhibitor av syklisk guanosin 3',5'-monofosfat-spesifikk fosfodiesterase type 5 (PDE5), som, når den inkorporeres i et farmasøytisk produkt, er hensiktsmessig for å behandle seksuell svikt. Enhetsdoseringsformen som beskrives her erkarakterisert veden selektiv PDE5 inhibisjon, og frembringer tilsvarende en fordel i terapeutiske områder der inhibisjon av PDE5 er ønsket, med minimale eller ingen uønskete bivirkninger som resulterer fra inhibisjon av andre fosfodiesterase enzymer.

De biokjemiske, fysiologiske og kliniske effekter av syklisk guanosin 3',5'-monofosfat-spesifikk fosfodiesterase (cGMP-spesifikke PDE) inhibitorer antyder at de kan anvendes i en rekke sykdomstilstander der modulering av glatt muskel, nyre, hemostase, inflammasjon og/eller endokrin funksjon er ønsket. Type 5 cGMP-spesifikk fosfodiesterase (PDE5) er det viktigste cGMP-hydrolyserende enzym i glatt muskel i blodårer, og dette enzyms ekspresjon i svamplegemet i penis har blitt beskrevet (Taher et al., J. Uroi. 149, 285 (1993)). PDE5 er derfor et tiltrekkende mål for å behandle seksuell svikt (Murray, DN& P 6( 3), pp. 150-56

(1993)).

Et farmasøytisk produkt som frembringer en PDE5 inhibitor er for tiden tilgjengelig, og markedsføres under navnet Viagra®. Den aktive bestanddel i Viagra® er sildenafil. Produktet blir solgt som et fremstilt produkt som består av 25, 50 og 100 mmg tabletter med sildenafil og et innlegg i pakken. Pakkeinnlegget fremsier at sildenafil er en mer potent inhibitor av PDE5 enn andre kjente fosfodiesterase inhibitorer (mer enn 80 ganger for PDE1 inhibisjon, mer enn 1000 ganger for PDE2, PDE3 og PDE4 inhibisjon). ICso-verdiene for sildenafil overfor PDE5 har blitt rapportert å være 3 nM { Drugs of the Future, 22( 2), pp. 138-143

(1997)) og som 3,9 nM (Boolel et a\., lnt. J. oflmpotence, 8, pp. 47-52 (1996)). Sildenafil beskrives å ha en 4000 gangers selektivitet for PDE5 sammenlignet med PDE3, men bare en 10 gangers selektivitet for PDE5 sammenlignet med PDE6. Den relative mangel på selektivitet overfor PDE6 blir antatt å være årsak til unormale opplevelser med fargesynet.

Mens sildenafil har oppnådd betydelig kommersiell suksess har medikamentet sviktet p.g.a. dets betydelige bivirkninger, deriblant ansiktsrødme (10% hyppighetsrate). Ubehagelige bivirkninger begrenser anvendelsen av sildenafil hos pasienter som lider av synsforstyrrelser, høyt blodtrykk, og, mest alvorlig, av individer som anvender organiske nitrater (Welds et al., Amer. J. of Cardiol. 83( 5A), pp. 21(C)-28(C) (1999)).

Anvendelse av sildenafil hos pasienter som tar organiske nitrater fremkaller et klinisk betydningsfullt fall i blodtrykk som kan tenkes å medføre risiko for pasienten. Derfor angir merkingen på sildenafils pakker strenge kontraindikasjoner mot anvendelse av medikamentet i kombinasjon med organiske nitrater (for eksempel nitroglyserin, isosorbid mononitrat, isosorbid nitrat, erytrityl tetranitrat) og andre donorer av nitrogen monoksyd i enhver form, enten regelmessig eller uregelmessig, siden sildenafil forsterker den blodtrykkssenkende effekt av nitrater. Se CR. Conti et al., Amer. J. Cardiol. 83 ( 5A), pp. 29C-34C (1999). Selv med sildenafil tilgjengelig er det således et behov for å identifisere forbedrete farmasøytiske produkter som er hensiktsmessige for å behandle seksuell svikt.

Daugan, US patent nr. 5 859 006, beskriver visse tetrasykliske derivater som er sterke inhibitorer av cGMP-spesifikk PDE (eller PDE5). ICso til de forbindelser som beskrives i US patent nr. 5 859 006 blir rapportert å ligge i området 1nM til 10 uM. Den orale dose for slike forbindelser er for en gjennomsnitt voksen pasient (70 kg) 0,58 mg daglig. Således blir enhetsdoseringsformer

(tabletter og kapsler) som inneholder 0,2 til 400 mg aktiv ingrediens rapportert. Signifikante uønskete bivirkninger som tilskrives forbindelsene beskrevet i US patent nr. 5 859 006 blir ikke beskrevet.

De herværende søkere har oppdaget et slikt tetrasyklisk derivat, benevnt: (6R,12aR) -2,3,6,7,12,12a-heksahydro-2-metyl-6-(3,4-metylendioksyfenyl)-pyrazino[2', 1 ':6,1 ]pyrido[3,4-b]indol-1,4-dion, alternativt benevnt: (6R-trans)-6-(1,3-benzodioksol-5-yl)-2,3,6,7,12,12a-heksahydro-2-metylpyrazino-[1',2': 1,6]pyrido[3,4-b]indol-1,4-dion, og her gitt navnet Forbindelse (I), som kan tilføres i enhetsdoseringer som gir en effektiv behandling uten de bivirkninger som knyttes til sildenafil, den for tiden markedsførte PDE5 inhibitor. Før den foreliggende oppfinnelse ble gjort var slike bivirkninger antatt å være et uunngåelig resultat av PDE5 inhibisjon.

Av betydning er at søkernes kliniske studier også viser at et effektivt produkt, som har en redusert tendens til å fremkalle rødming i påvirkelige individer, kan frembringes. Mest uventet var at produktet også kan tilføres med klinisk minimale bivirkninger knyttet til de kombinerte virkninger av en PDE5 inhibitor og et organisk nitrat. Således er derfor advarselen mot å anvende et produkt som inneholdt en PDE5 inhibitor ikke lenger nødvendig dersom Forbindelse (I) blir tilført som en enhetsdosering på 1 til 5 mg, som beskrevet her. Den farmasøytiske enhetsdoseringsblanding ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en effektiv behandling av seksuell funksjonssvikt hos individer som tidligere ikke kunne behandles og som led av uakseptable bivirkninger, deriblant individer som hadde hjerte- og/eller karsykdommer, som for eksempel pasienter som hadde behov for nitrat-terapi, som hadde gjennomgått hjerteinfarkt mer enn tre måneder før begynnelse av terapi for seksuell svikt, og som led av klasse 1 stuvnings-hjertesvikt, eller hos individer som led av synsforstyrrelser.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer Forbindelse I i en enhetsdoseringsform. Det betyr at den foreliggende oppfinnelse frembringer en farmasøytisk enhetsdoseringsform som er passende for oral tilførsel, og som inneholder 1 til 5 mg Forbindelse I.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer en farmasøytisk enhetsdoseringsblanding som omfatter 1 til 5 mg av en forbindelse som har den strukturelle formel:

der nevnte enhetsdoseringsform er egnet for oral tilførsel. Den foreliggende oppfinnelse frembringer videre anvendelse av en enhetsdosering som inneholder 1 til 5 mg av en forbindelse med strukturen

til fremstilling av et medikament for tilførsel opp til en maksimal totaldose på 5 mg av nevnte forbindelse per dag for å behandle seksuell svikt hos en pasient som har behov for dette. Den orale doseringsformen inneholder 1 til 5 mg av en selektiv PDE5 inhibitor, som nødvendig kan administreres til en pasient som har behov for dette, opp til en maksimal totaldose på 5 mg pr dag.

Spesifikke tilstander som kan behandles med enhetsdoseringsblanding ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til, erektil svikt hos menn, seksuell svikt hos kvinner, spesielt kvinnelig opphisselsessvikt, også kjent som kvinnelig seksuell opphisselsessvikt.

Med henblikk på den foreliggende oppfinnelse, som klargjort og beskrevet her, blir de følgende ord, begrep og forkortelser definert som følger: Ordet "beholder" betyr enhver beholder og låsanordning som kan anvendes til å lagre, sende, fordele og/eller behandle et farmasøytisk produkt.

Begrepet "ICso" er målet for evnen som en forbindelse har til å hemme et spesielt PDE-enzym (for eksempel PDE1c, PDE5 eller PDE6). ICso er konsentrasjonen av en forbindelse som gir 50% enzyminhibisjon i et enkelt dose-respons eksperiment. Bestemmelse av ICso-verdien for en forbindelse er lett utført ved hjelp av en kjent in vitro fremgangsmåte, som generelt er beskrevet av Y. Cheng et al., Biochem. Pharmacol. 22, pp. 3099-3108 (1973).

Begrepet „pakkeinnlegg" betyr informasjon som følger produktet, som gir en beskrivelse av hvorledes produktet skal tilføres, sammen med data om sikkerhet og effektivitet som kreves for at legen, farmasøyten eller pasienten kan ta en fornuftig beslutning vedrørende anvendelse av produktet. Pakkeinnlegget blir vanligvis ansett å representere "merket" til et farmasøytisk produkt.

Begrepet "oral doseformulering" blir anvendt på en generell måte for å beskrive farmasøytiske produkter som tilføres gjennom munnen. Orale doseringsformer blir kjent av dem som er øvet i faget til å inkludere slike former som flytende formuleringer, tabletter, kapsler og gelekapsler.

Ordet "synsforstyrrelser" betyr unormalt syn, som kjennetegnes av blågrønt syn og som antaes fremkalt av PDE6-inhibisjon.

Ordet "rødming" betyr en episodisk rødme i ansikt og nakke, forårsaket av utvidelse av blodårer som er fremkalt av inntak av et medikament, vanligvis fulgt av en varmefølelse over ansikt og nakke og noen ganger fulgt av svette.

Begrepet "fritt medikament" betyr faste medikamentpartikler som ikke er tett innebygget i et polymert kopresipitat.

Den herværende doseform som det kreves patent for blir fortrinnsvis pakket som en artikkel som er fremstilt for anvendelse hos mennesker, og som omfatter et pakkeinnlegg, en beholder og en doseringsform som inneholder 1 til 5 mg Forbindelse I.

Pakkeinnlegget frembringer en beskrivelse av hvorledes et farmasøytisk produkt tilføres, sammen med data om sikkerhet og effektivitet som tillater legen, farmasøyten og pasienten å ta en fornuftig beslutning vedrørende anvendelse av produktet. Pakkeinnlegget blir vanligvis sett på som det farmasøytiske produkts merke. Pakkeinnlegget vedlagt den fremstilte artikkel indikerer at Forbindelse (I) er hensiktsmessig for å behandle tilstandene der inhibisjon av PDE5 blir ønsket. Pakkeinnlegget gir også informasjon om å tilføre en eller flere doseringsformer med 1 til 5 mg medikament etter behov, opp til en maksimal totaldose på 5 mg pr dag.

Foretrukne tilstander som skal behandles inkluderer seksuell svikt (deriblant erektil svikt hos menn, og seksuell svikt hos kvinner, og mer foretrukket opphisselsessvikt hos kvinner (FAD)). Den foretrukne tilstand som skal behandles er erektil svikt hos menn.

Av betydning er at pakkeinnlegget støtter anvendelse av produktet i behandling av seksuell svikt hos pasienter med sykdom i netthinnen, for eksempel diabetisk netthinnesykdom, eller retinitis pigmentosa, eller hos pasienter som anvender organiske nitrater. Pakkeinnlegget inneholder således ikke de kontraindikasjoner som vanligvis knyttes til disse tilstander, og gir spesielt klart uttrykkfor at doseringsformen kan gies sammen med organiske nitrater. Mer fordelaktig er også at pakkeinnlegget ikke inneholder advarsler knyttet til netthinnesykdommer, spesielt retinitis pigmentosa, og ikke er knyttet til individer som har tendens til synsforstyrrelser. Fortrinnsvis rapporterer pakkeinnlegget også om at hyppighet av rødming er under 2%, fortrinnsvis under 1% og mer fordelaktig under 0,5% hos pasienter som tilføres doseringsformen. Hyppigheten av episoder med rødming viser betydelig forbedring sammenlignet med tidligere farmasøytiske produkter som inneholder en PFDE5-inhibitor.

Beholderen anvendt i det fremstilte produkt er vanlig og kjent i de farmasøytiske fag. Generelt er beholderen en 'blemme-pakke', foliepakke, glass eller plastikkflake og tilhørende kork eller lukkeanordning, eller en annen slik artikkel som passer til anvendelse av pasienten eller farmasøyten. Fortrinnsvis er beholderen dimensjonert for å kunne ta imot 1-1000 faste doseringsformer, fortrinnsvis 1 til 500 faste doseringsformer, og mest fordelaktig 5 til 30 faste doseringsformer.

Orale doseringsformer forståes av dem som er øvet i faget å inkludere for eksempel slike former som flytende formuleringer, tabletter, kapsler og gelkapsler. Fortrinnsvis er doseringsformene faste doseringsformer, spesielt tabletter som inneholder 1 til 5 mg Forbindelse (I). Enhver farmasøytisk akseptabel eksipient til oral anvendelse kan benyttes for å fremstille slike doseringsformer. Passende farmasøytiske doseringsformer inkluderer kopresipiterte former, for eksempel beskrevet i Butler, US patent nr. 5 985 326, som det herved refereres til. I foretrukne utførelser er enhetsdoseringsformen i den herværende oppfinnelse en fast substans uten kopresipiterte former av Forbindelse (I), men som heller innholder fast Forbindelse (I) som et fritt medikament.

Fortrinnsvis omfatter tablettene farmasøytiske eksipienter som anses som sikre, som for eksempel laktose, mikrokrystallinsk cellulose, stivelse, kalsium karbonat, magnesiumstearat, stearinsyre, talk, og kolloidalt silikondioksyd, og som fremstilles med standard farmasøytiske fremstillingsteknikker som beskrevet i Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th. Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Slike teknikker inkluderer for eksempel våt granulering etterfulgt av tørking, maling, og kompresjon til tabletter med eller uten dekking av en film; tørr granulering etterfulgt av maling, og kompresjon til tabletter med eller uten dekking med film; tørr blanding etterfulgt av kompresjon til tabletter, med eller uten dekking med film; våt granulering, tørking og fylling i gelatin kapsler; tørrblanding fylt i gelatin kapsler; eller suspendering og løsning fylt i gelatin kapsler. Generelt har de faste doseringsformer identifiserende merker som blir skåret inn i eller trykket på overflaten.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på detaljerte eksperimenter, kliniske undersøkelser, og på de uventete observasjoner at bivirkninger som tidligere ble antatt å være indikasjon på PDE5-inhibisjon kan reduseres til klinisk ubetydelige nivåer ved seleksjon av en forbindelse og doseringsform. Denne uventete observasjon tillot utvikling av en enhetsdoseringsform som inkorporerte Forbindelse (I) i 1 til 5 mg pr. enhetsdoseringsformer, som, når de ble tilført oralt, minimaliserte uønskete bivirkninger som tidligere var antatt å være uunngåelige. Disse bivirkninger inkluderer ansiktsrødming, synsforstyrrelser og et betydelig fall i blodtrykk når Forbindelse (I) blir tilført alene eller sammen med et organisk nitrat. Den minimale virkning som Forbindelse (I) har på PDE6, tilført i 1 til 5 mg enhetsdoseringsformer, tillot også tilførsel av en selektiv PDE5 inhibitor til pasienter som lider av netthinnesykdommer, som diabetisk netthinnesykdom eller retinitis pigmentosa.

Forbindelse (I) har den følgende strukturelle formel:

Forbindelsen med den strukturelle formel (I) ble i kliniske studier på mennesker vist å ha en minimal effekt på systolisk blodtrykk når forbindelsen ble tilført sammen med organiske nitrater. Dette er ulikt sildenafil, som fremviser et fire gangers større fall i systolisk blodtrykk sammenlignet med placebo, noe som fører til at Viagra® pakkeinnlegget inneholder kontraindikasjoner, og at visse pasienter blir advart.

Det følgende viser ICso-verdiene for inhibisjon av PDE5 og PDE6 med forbindelsen med formel (I), bestemt ved fremgangsmåtene som beskrives her.

I tillegg viser forbindelsen med den strukturelle formel (I) en ICso mot PDE1c på 10000, og en ratio mellom PDE1c/PDE5 på 4000.

FREMSTILLINGER

Fremstilling av human PDE5

Rekombinant fremstilling av human PDE5 ble utført i hovedsak som beskrevet i eksempel 7 av US patent nr. 5 702 936, som herved inkorporeres som referanse, med unntak av at transformasjonsvektoren for gjær som ble anvendt, som er avledet fra det basale ADH2-plasmid beskrevet av V. Price et al., Methods in Enzymology, 1985, pp. 308-318 (1990), inneholdt gjær ADH2 promoter- og terminatorsekvenser, og at Saccharomyces cerevisiae vertstypen var den BJ2-54 (protease-manglende) stamme som er deponert i American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, under tilgangsnummeret ATCC 74465. Transformerte vertsceller ble dyrket i 2x SC-leu medium (pH 6,2) med spormetaller og vitaminer. Etter 24 timer ble YEP medium som inneholdt glyserol tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 2x YEP/3% glyserol. Omtrent 24 timer senere ble cellene høstet, vasket og lagret ved -70°C.

Celleklumper (29 g) ble tint på is med et tilsvarende volum oppløsningsbuffer (25 mM TrisCI (pH 8), 5 mM MgCl2, 0,25 mM dithiothreitol, 1 mM benzamidin og 10 uM ZnS04). Celler ble knust i en mikroknuser med N2ved 20 000 psi. Lysatet ble sentrifugert og filtrert gjennom 0,45 um engangsfilter. Filtratet ble applisert på en 150 ml Sepharose Fast Flow Q søyle (Pharmacia). Søylen ble vasket med 1,5 volumer buffer A (20 mM Bis-Tris Propan (pH 6,8), 1 mM MgCl2, 0,25 mM dithiothreitol og 10 uM ZnSCM), og eluert med en trinnvis gradient av 125 mM NaCI i buffer A, etterfulgt av en lineær gradient av 125 - 1000 mM NaCI i buffer A.

Aktive fraksjoner fra den lineære gradient ble applisert på en 180 ml keramisk hydroksylapatittsøyle i buffer B (20 mM Bis-Tris Propan (pH 6,8), 1 mM MgCl2, 0,25 mM dithiothreitol, 10 uM ZnSCMog 250 mM KCI). Etter applikasjon ble søylen vasket med to volumer buffer B og eluert med en lineær gradient av 0-125 mM kaliumfosfat i buffer B. Aktive fraksjoner ble slått sammen, utfelt med 60% ammonium sulfat, og resuspendert i buffer C (20 mM Bis-Tris Propan (pH 6,8), 125 mM NaCI, 0,5 mM dithiothreitol og 10 uM ZnSCM). Prøven ble applisert på en 140 ml Sephacryl S-300 søyle og eluert med buffer C. Aktive fraksjoner ble fortynnet til 50% glyserol og lagret ved -20°C. De resulterende preparater var omtrent 85% rene, bedømt med SDS-PAGE.

Analyse av PDE aktivitet

Aktivitet av PDE5 kan måles med standard fremgangsmåter i faget. For eksempel kan aktivitet til enhver type PDE bli bestemt som følger. PDE analyser som anvender en fremgangsmåte for separasjon med aktivt kull ble utført i hovedsak som beskrevet av Loughney et al., (1996), The Journal of Biological Chemistry, 271:796- 806. I denne analyse overfører PDE5-aktivitet [<32>P]cGMP til [<32>P]5'-GMP proporsjonalt med mengden av PDE5-aktivitet som er tilstede. Det resulterende [<32>P]5'-GMP blir deretter ved hjelp av slangegift 5'-nukleotidase kvantitativt overført til fritt [<32>P] fosfat og umerket adenosin. Dette gjør at mengde av [<32>P] fosfat som frigjøres er proporsjonal med enzymaktivitet. Analysen blir utført ved 30°C i en 100 ul reaksjonsblanding som inneholder (sluttkonsentrasjoner) 40 mM Tris-CI (pH 8,0), 1 uM ZnSCM, 5 mM MgCl2og 1 mg/ml bovint serum albumin. PDE5 er tilstede i mengder som gir <30% total hydrolyse av substrat (lineære reaksjonsbetingelser). Analysen blir startet ved at substrat tilsettes (1mM [<32>P]cGMP), og blandingen blir inkubert i 12 minutter. 75 ug Crotalus atrox slangegift blir så tilsatt, og inkuberingen fortsetter i 3 minutter (totalt 15 minutter). Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av 200 ml aktivt kull (25 mg/ml suspensjon i 0,1 M NahbPCM, pH 4). Etter sentrifugering (750 x g i 3 minutter) for

å sedimentere kullet blir en prøve fra supernatanten, som inneholder<32>P-fosfat, tatt ut for å måle radioaktiviteten i en scintillasjonsteller, og PDE5 aktivitet blir kalkulert. Preparatene hadde spesifikke aktiviteter på omtrent 3 umol cGMP hydrolysert pr. minutt pr. milligram protein.

Fremstilling av Bovin PDE6

Bovin PDE6 ble stilt til rådighet av Dr. N. Virmaux, INSERM U338, Strasbourg. Bovine netthinner ble fremstilt som beskrevet av Virmaux et al., FEBS Lett. 12( 6), pp 325-328 (1971), se også A. Sitaramayya et al., Exp. Eye Res., 25, pp. 163-169 (1977). I korthet ble, om intet annet er angitt, alle operasjoner foretatt i kulde i svakt rødt lys. Øyne ble oppbevart kaldt og mørkt i opp til 4 timer etter slakting.

Fremstilling av ytre segmenter (ROS) fra bovine netthinner fulgte generelt fremgangsmåter beskrevet av Schichi et al., J. Biol. Chem. 224:529 (1969). I et typisk eksperiment ble 35 bovine netthinner knust i en skål med 35 ml 0,066 M fosfat buffer (pH 7,0 , tilsatt sukrose til 40%), fulgt av homogenisering i en Potter-Elvehjem homogenisator (20 slag opp og ned). Suspensjonen ble sentrifugert i 20 minutter ved 25 000 x g, og bunnfallet ble rehomogenisert i 7,5 ml 0,006 M fosfat buffer (med 40% sukrose) og forsiktig applisert under 7,5 ml fosfatbuffer (uten sukrose). Sentrifugering ble utført i en "sving-ut" rotor i 20 minutter ved 45 000 x g, og ga et sortbunnfall på bunnen og et rødt bånd i interfasen mellom 0,066 M fosfat-40% sukrose/0,066 M fosfat (grov ROS). Det røde materiale fra interfasen ble samlet, fortynnet med fosfatbuffer, sentrifugert ned til et bunnfall, og refordelt i bufret 40% sukrose som beskrevet over. Denne prosedyre ble gjentatt 2 eller 3 ganger til bunnfallet var borte. De rensete ROS-fraksjoner ble vasket i fosfatbuffer og til slutt sentrifugert i 20 minutter ved 25 000 x g til et bunnfall. Alle materialer ble så lagret i frossen tilstand til de ble anvendt.

Hypotone ekstrakter ble fremstilt ved å suspendere isolerte ROS i 10 mM Tris-CI (pH 7,5), 1 mM EDTA og 1 mM dithioerythritol, etterfulgt av sentrifugering i 30 minutter ved 100 000 x g.

Det fremstilte preparat ble rapportert å ha en spesifikk aktivitet på omtrent

35 nmol cGMP hydrolysert pr. minutt pr. milligram protein.

Fremstilling av PDE1c fra Spodoptera fugiperda celler (Sf9)

Celleklumper (5g) ble tint på is med 20 ml celleknusningsbuffer (50 mM MOPS (pH 7,4), 10 uM ZnS04, 0,1 mM CaCI2, 1 mM DTT, 2 mM benzamidin HCI og 5 ug/ml av hver av pepstatin, leupeptin, og aprotonin). Celler ble knust ved passasje gjennom en fransk presse (SLM-Aminco) med temperatur holdt under 10oC. Det resulterende homogenat av celler ble sentrifugert (45 minutter, 4°C) ved 36 000 x g i en Beckman ultrasentrifuge med en Ti45 rotor. Supernatanten ble kastet mens det resulterende bunnfall ble resuspendert i 40 ml oppløsningsbuffer (knusningsbuffer tilsatt 1 M NaCI, 0,1 M MgCb, 1 mM CaCb, 20 ug/ml calmodulin, og 1% sulfobetain SB12 (Z3-12)) ved sonikering med en VibraCell Tuner med en mikrospiss i 3 x 30 sekunder. Dette ble utført i et bad med en salt/isblanding for å kjøle ned preparatet. Etter sonikering ble blandingen langsomt mikset i 30 minutter ved 4°C for å avslutte ekstraksjonen av membranbundete proteiner. Denne blanding ble sentrifugert (45 minutter, 4°C) ved 36 000 x g i en Beckman ultrasentrifuge med en Ti45 rotor. Supernatanten ble fortynnet med oppløsningsbuffer som inneholdt 10 ug/ml calpain inhibitor I og II. Det utfelte protein ble sentrifugert (20 minutter, 9 000 rpm) i en Beckman JA-10 rotor, og den fremstilte supernatant ble separert med "Mimetic Blue AP Agarose" kromatografi.

For å kjøre Mimetic Blue AP Agarose-søylen ble dette resin først beskyttet ved å applisere 10 resinvolumer av 1% polyvinylpyrrolidin (PVP-40, med molekylvekt på 40 000) for å blokkere uspesifikke bindingsseter. Det løst bundne PVP-40 ble så fjernet med vask med 10 resinvolumer av 2M NaCI, 10 mM natriumsitrat, pH 3,4. Like før tilsetning av den oppløste PDE1c3 prøve ble søylen ekvilibrert med 5 volumer Søylebuffer A (50 mM MOPS (pH 7,4), 10 uM ZnS04, 5 mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2, 1 mM DTT, 2 mM benzamidin-HCI).

Den oppløste prøve ble så applisert på søylen med en hastighet på 2 ml/min, med resyklering, slik at den totale prøve ble applisert 4-5 ganger i løpet av 12 timer. Etter avsluttet applikasjon ble søylen vasket med 10 søylevolumer av søylebuffer A, etterfulgt av 5 søylevolumer med søylebuffer B (søylebuffer A med

20 mM 5'-AMP), og fulgt av 5 søylevolumer med søylebuffer C (50 mM MOPS (pH 7,4), 10 uM ZnS04, 0,1 mM CaCb, 1 mM dithiothreitol, og 2 mM benzamidin-HCI). Enzymet ble eluert i tre etter hverandre følgende prøver. Den første bestod av enzym fra en 5 resinvolum vask med søylebuffer C som inneholdt 1 mm cAMP. Den andre inneholdt enzym fra en 10 resinvolum vask med søylebuffer C som inneholdt 1 M NaCI. Den siste inneholdt enzym fra en 5 resinvolum vask med søylebuffer C som inneholdt 1 M NaCI og 20 mM cAMP.

De fraksjoner der enzymaktivitet ble funnet ble slått sammen, og det sykliske nukleotid ble fjernet via vanlig gelfiltrering eller med kromatografi på hydroksylapatitt-søyler. Etter at sykliske nukleotider var fjernet ble enzymprøvene dialysert mot dialysebuffer som inneholdt 25 mM MOPS (pH 7,4), 10 uM ZnS04, 500 mM NaCI, 1 M CaCb, 1 mM ditiotreitol, 1 mM benzamidin-HCI, etterfulgt av dialyse mot dialysebuffer som inneholdt 50% glyserol. Enzymet ble så raskt frosset på tørris og lagret ved -70°C.

De resulterende preparater var omtrent >90% rene vurdert med SDS-PAGE. Disse preparater hadde spesifikke aktiviteter på omtrent 0,1 til 1,0 umol cAMP hydrolysert pr. minutt pr. milligram protein.

Bestemmelse av IC50

Den viktigste variabel når styrken til en kompetitiv inhibitor av PDE5 og/eller PDE1c og PDE6 skal evalueres er inhibisjonkonstanten, dvs. Ki. Denne variabel kan tilnærmet bestemmes ved å måle ICso, som er den konsentrasjon av inhibitor som gir 50% inhibisjon av enzymet i et enkelt dose-respons eksperiment under de følgende betingelser: Konsentrasjonen av inhibitor skal alltid være mye større enn enzymkonsentrasjonen, slik at fri inhibitor konsentrasjon (som er ukjent) blir tilnærmet lik den totale inhibitor konsentrasjon (som er kjent).

Et passende område med inhibitorkonsentrasjoner blir valgt (dvs. at inhibitorkonsentrasjoner minst flere ganger høyere og flere ganger lavere enn Ki må være tilstede i eksperimentet). Det er vanlig at inhibitorkonsentrasjoner ligger i området fra 10 nM til 10 uM.

Konsentrasjonene av enzym og substrat blir valgt slik at mindre enn 20% av substrat blir brukt opp i fravær av inhibitor (noe som for eksempel gir maksimum substrat hydrolyse på fra 10 til 15%), slik at enzymaktivitet er tilnærmet konstant under hele analysen.

Konsentrasjonen av substrat skal være mindre enn 1/10 av Michaelis konstanten (Km). Under disse betingelser vil ICso være nær Ki, dette p.g.a. Cheng-Prusoff ligningen som relaterer disse to parametre: ICso=Ki(1+S/Km), der (1+S/Km) blir tilnærmet 1 når S/Kmer liten.

ICso-verdien blir estimert fra datapunktene ved å tilpasse resultatene til en passende modell for enzym-inhibitor interaksjonen. Dersom denne interaksjon vites å dreie seg om enkel konkurranse mellom inhibitor og substratet kan en to-parameter modell bli anvendt:

y=A/(1+x/B),

der y er enzymaktiviteten målt ved en inhibitor konsentrasjon på x, A er aktiviteten i fravær av inhibitor og B er ICso. Se Y. Cheng et al., Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108(1973).

Effekter av inhibitorer fra den foreliggende oppfinnelse på den enzymatiske aktivitet til PDE5 og PDE6 preparater, fremstilt som beskrevet, ble studert i to analyser som hovedsakelig skilte seg fra hverandre i skala og som stort sett ga de samme resultater hva angår ICso-verdier. Begge analyser dreiet seg om modifikasjoner av fremgangsmåten til Wells et al., Biochim. Biophys. Acta 384:430

(1975). Den første av analysene ble utført i et totalt volum på 200 ul og inneholdt 50 mM Tris (pH 7,5), 3 mM Mg-acetat, 1 mM EDTA, 50 ug/ml slangegift nukleotidase og 50 nM [<3>H]-cGMP (Amersham). Oppfinnelsens forbindelser ble løst i DMSO (sluttkons. i analysen 2%). Inkubasjonsblandingen ble inkubert ved 30°C i 30 minutter, og reaksjonen stoppet med tilsetning av 800 ul 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM EDTA, 10 mM theofyllin, 0,1 mM adenosin og 0,1 mM guanosin. Blandingene ble applisert på 0,5 ml QAE Sephadex søyler, og eluert med 2 ml 0,1 M format (pH 7,4). Den eluerte radioaktivitet ble målt med scintillasjonstelling i en Optiphase Hisafe 3.

En annen, mikroplatebasert PDE analyse ble utviklet med Multiscreen plater og et vakuumsug. Analysen (100 ul) inneholdt 50 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Mg-acetat, 1 mM EDTA og 250 ug/ml slangegift nukleotidase. De andre komponenter av reaksjonsblandingen var de samme som beskrevet over. Etter avslutning av inkubasjonen ble hele reaksjonsblandingen applisert på en QAE-Sephadex mikrosøyleplate ved filtrering. Fri radioaktivitet ble eluert med 200 ul vann. Av dette ble 50 ul ble tatt ut og analysert med scintillasjonstelling som beskrevet over.

De følgende eksempler blir presentert for videre å illustrere fremstillingen av den herværende oppfinnelse.

Eksempel 1

Forbindelse (I) ble fremstilt som beskrevet i US patent 5 859 006 og formulert i tabletter med anvendelse av våt granulering. Povidon ble løst opp i vann for å gi en 10% løsning. Den aktive forbindelse, samt mikrokrystallinsk cellulose, natriumcroscarmellose og natriumlaurylsulfat ble tilsatt en høygradig skjæremikser og blandet i 2 minutter. Pulverne ble våtgranulert med povidonløsningen, med ekstra vann tilført ved behov for å fullføre granuleringen. Den resulterende blanding ble tørket i en 'våtseng-tørker-<5>med innstrømmingsluft på 70°C + 5°C, inntil tapet fra tørking var under 2,5%. Kornene ble sendt gjennom en Comil med en passende sikt og tilsatt en passende mikser. De ekstragranulære forbindelser natriumcroscarmellose og natriumlaurylsulfat, samt det kolloidale vannfrie silisiumdioksyd ble sendt gjennom en passende sikt (f. eks. 500 mikron), tilført mikseren og blandet i 2 minutter. Blandingen ble komprimert til et kompresjon/vekt mål på 250 mg, med anvendelse av 9 mm rundt normalt konkavt utstyr.

Kjernetablettene ble dekket med en vandig suspensjon av Opadry OY-S-7322 med hjelp av en Accelacota (eller lignende dekkende panne) med bruk av innkommende luft på 50°C + 70°C, til tablettvekten var øket med tilnærmet 8 mg. Opadry OY-S-7322, som inneholder metylhydroksypropylcellulose Ph. Eur., titaniumoksyd Ph. Eur., Triacetin USP, øker vekten av hver tablett til omtrent 258 mg. Mengde av laget som dekker hver tablett kan være mindre enn dette, avhengig av prosessens effektivitet.

Tabletten ble fylt i foliepakker, og fulgt av pakkeinnlegg som beskriver forbindelsens sikkerhet og effektivitet.

Eksempel 2

Den følgende formulering blir anvendt for å fremstille den avsluttende doseringsform som inneholder 10 mg av Forbindelse (I).

Renset vann (USP) blir anvendt i fremstillingen av tablettene. Vannet blir fjernet under prosesseringen slik at minimale nivåer blir igjen i sluttproduktet.

Tablettene blir fremstilt med bruk av en våt granuleringsprosess. En trinnvis beskrivelse av prosessen er som følger: Medisinen og eksipientene som skal granuleres blir sikkerhetssiktet. Den selektive PDE5 inhibitor blir tørrblandet med laktosemonohydrat (dusj-tørket), hydroksypropylcellulose, natriumcroscarmellose og laktosemonohydrat. Den resulterende pulverblanding blir granulert med en vandig løsning av hydroksypropylcellulose og natriumlaurylsulfat ved anvendelse

av en Powrex eller annen passende høyskjærings-granulator. Ytterligere vann kan tilsettes for å nå det ønskete resultat. En kvern kan anvendes for å bli kvitt klumper i den våte granulering og lette tørkingen. Med en gang materialet er tørt kan det bli inndelt etter størrelse for å eliminere alle klumper. Mikrokrystallinsk cellulose,

natriumcroscarmellose og magnesiumstearat blir sikkerhetssiktet og tilsatt de tørre målte granula. Disse eksipienter og den tørre granulering blir blandet med hjelp av en ristebeholder, båndmikser eller et annet passende blandingsutstyr.

Blandingsprosessen kan deles i to faser. Mikrokrystallinsk cellulose, natriumcroscarmellose og den tørkete granulering blir tilsatt mikseren og blandet i løpet av den første fase, etterfulgt av tilsetting av magnesiumstearat til denne granulering og en ny blandingsfase.

Den blandete granulering blir så sammenpresset til tabletter med bruk av en roterende kompresjonsmaskin. Kjernetablettene blir dekket med en tynt lag vandig suspensjon av en passende fargemikstur, ved hjelp av en dekkende panne (f. eks. Accela Cota). De dekkete tabletter kan også bli lett tildekket med talkum for å

gjøre det lettere å håndtere tablettene.

Tablettene fylles i plastikkbeholdere (30 tabletter/beholder) og får med seg et pakkeinnlegg som beskriver forbindelsens sikkerhet og effektivitet.

Eksempel 3

Den følgende formulering blir anvendt ved fremstilling av en avsluttet doseringsform som inneholder 5 mg av Forbindelse (I).

Doseringsformen i Eksempel 3 ble fremstilt på samme måte som doseringsformen i Eksempel 2.

Eksempel 4

Løsningskapsel

Gelatinkapslene blir nøyaktig fylt med å pumpe et nøyaktig fylningsvolum av løst formulering inn i et delvis lukket kapselhulrom. Umiddelbart etter injeksjon av medikamentløsningsformuleringen blir kapselen totalt varmelukket.

Kapslene blir fylt i plastikkbeholdere, og følges av et pakkeinnlegg.

Eksempel 5

Denne studie var en klinisk farmakologisk interaksjonsstudie utført som en randomisert, dobbeltblind og placebokontrollert to-veis kryss-over studie, som evaluerte de hemodynamiske effekter av samtidig tilførsel av en selektiv PDE5-inhibitor (dvs. Forbindelse (I)) og kortvirkende nitrater på friske mannlige frivillige. I denne studie mottok deltagerne i løpet av syv dager en daglig dose av enten Forbindelse (I) i en mengde på 10 mg, eller en placebo. På den sjette eller syvende dagen mottok deltagerne nitroglyserin (0,4 mg, under tungen) mens de lå på ryggen på et vippebord. Nitroglyserinen ble tilført tre timer etter Forbindelse (I), og alle individer beholdt nitroglyserin tabletten under tungen til den var helt oppløst. Deltagerne ble så vippet opp til 70° med hodet opp hvert 5. minutt i en halv time, med samtidige målinger av blodtrykk og hjertefrekvens. Ingen av de 22 friske mannlige deltagere (alder 19 til 60 år) som var med avbrøt studien.

I en preliminær analyse av denne studie ble Forbindelse (I) tolerert bra, og det var ingen alvorlige problemer. Det ble ikke funnet noen endringer i laboratorie-sikkerhetsvurderinger eller i 12-avlednings EKG. De mest vanlige bivirkninger var hodepine, dyspepsi og ryggsmerter. Forbindelse (I) hadde minimal, om noen, virkning på systolisk blodtrykk, og heller ikke på gjennomsnitts maksimal nitroglyserin-indusert nedgang i systolisk blodtrykk.

Eksempel 6

I to randomiserte, dobbelt-blind og placebokontrollerte studier ble Forbindelse (I) tilført pasienter som hadde behov for denne forbindelse i varierende mengder, både som daglig tilførsel og som 'ved behov' terapi, i sammenheng med seksuelle opplevelser og samleie i hjemmet. Doser fra 5 til 20 mg Forbindelse (I), som var effektive, viste mindre enn 1% rødmeanfall, og ingen synsforstyrrelser ble rapportert. Det ble funnet at en 10 mg dose av Forbindelse (I) var fullt effektiv og ga minimale bivirkninger.

Forbedret erektil funksjon ble bestemt med "International Index of Erectile Function" (IIEF) (Rosen et al., Urology, 49, s. 822-830 (1997)), dagboksførte lister over seksuelle forsøk, og spørsmål om total tilfredshet. Forbindelse (I) forbedret i betydelig grad prosentdelen av vellykkete samleieforsøk, deriblant evnen til å oppnå og vedlikeholde en ereksjon, både "ved behov" terapi og ved daglig tilførsel.

Eksempel 7

En tredje klinisk studie var en randomisert, dobbelt blind, placebokontrollert studie av Forbindelse (I) tilført "ved behov" til pasienter med mannlig erektil svikt. Forbindelse (I) ble tilført i løpet av en periode på 8 uker for å behandle mannlig erektil svikt (ED). Erektil svikt blir her definert som vedvarende manglende evne til å oppnå og/eller vedlikeholde en ereksjon som er tilstrekkelig for å gjennomføre en tilfredstillende seksuell handling. "Ved behov" tilførsel av doser blir definert som intermitterende tilførsel av Forbindelse (I) før forventet seksuell aktivitet.

Populasjonen som ble studert besto av 21 menn, misnt 18 år gamle, emd svak til alvorlig erektil svikt. Forbindelse (I) ble tilført oralt som tabletter av kopresipitat, fremstilt ifølge Butler, US patent nr. 5 985 326. Forbindelse (I) ble tilført i mengder på 2 mg, 5 mg, 10 mg og 25 mg doser, "ved behov" og ikke oftere enn hver 24. time. Behandling med alle typer nitrater, soppmidler av azoltype (dvs. ketoconazol, itroconazol), Warfarin, erytromycin eller antiandrogener var forbudt gjennom hele studien. Ingen andre aksepterte eller eksperimentelle medikasjoner, behandlinger eller utstyr som anvendes for å behandle erektil svikt var tillatt. 41 individer ble tilført placebo.

De to primære effektivitetsvariabler var individets evne til å innføre penis i skjeden hos hans partner, og hans evne til å vedlikeholde en ereksjon under samleiet, som målt av "International Index of Erectile Function" (IIEF). Spørreskjemaet til IIEF består av 15 spørsmål, og gir et raskt, pålitelig mål på erektil funksjon. Se R.C. Rosen et al., Urology, 49, s. 822-830 (1997).

Sekundære effektivitetsvariable var IIEF resultater som fremkom i områdene erektil funksjon, orgasmefunksjon, seksualdrift, tilfredshet ved samleie og total tilfredshet, pasientens evne til å oppnå ereksjon, evne til å innføre penis i partnerens skjede, avslutning av hans samleie med ejakulasjon, tilfredshet med ereksjonens hårdhet, og total tilfredshet, alle slik de måles med "Sexual Encounter Profile (SEP)" dagboken, og et spørsmål om en total vurdering som ble stillet ved avslutning av behandlingsperioden. SEP er et opplegg der pasienten i en dagbok dokumenterer hvert seksuelt møte vedkommende har i løpet av studieperioden.

Sikkerhetsaspektet i studien inkluderte alle deltagerne, og ble vurdert ved å evaluere alle rapporterte bivirkninger, samt endringer i kliniske laboratorieprøver, vitale tegn, fysikalsk undersøkelse av status presens, og resultater av EKG.

Ved sluttpunktet var pasienter som graderte deres innføringsevne (IIEF Spørsmål 3) som "nesten alltid eller alltid" fordelt som følger: 17.5% av placebogruppen, 38,1% av 2 mg gruppen, 48,8% av 5 mg gruppen, 51,2% av 10 mg gruppen, og 83,7% av 25 mg gruppen. Sammenlignende analyser viste statistisk signifikante forskjeller i endring av innføringsevne mellom placebo og alle dosenivåer av Forbindelse (I).

Ved sluttpunktet var pasienter som graderte deres evne til å vedlikeholde en ereksjon (IIEF Spørsmål 4) under samleie som "nesten alltid eller alltid" fordelt som følger: 10,0% av placebogruppen, 19,5% av 2 mg gruppen, 32,6% av 5 mg gruppen, 39,0% av 10 mg gruppen, og 69,0% av 25 mg gruppen. Sammenlignende analyser viste statistisk signifikante forskjeller i endring av innføringsevne mellom placebo og de tre høyere dosenivåer av Forbindelse (I).

Denne studie besto også av en sikkerhetsevaluering. En behandlingsrelatert bivirkning blir definert som en tilstand som ikke var tilstede ved utgangspunktet og som opptrådte etter dette, eller en tilstand som var tilstede ved utgangspunktet og som øket i alvor etter dette. De mest vanlige behandlingsrelaterte bivirkninger som ble rapportert var hodepine, dyspepsi, og ryggsmerter. Hyppigheten av behandlingsrelaterte bivirkninger var doseavhengig.

Totalt sett viste denne studie at alle fire doser av Forbindelse (I), nemlig 2 mg, 5 mg, 10 mg og 25 mg tilført "ved behov", ga signifikant forbedring sammenlignet med placebo, i den seksuelle evne til menn med erektil svikt, vurdert med IIEF, med pasientenes dagbøker som vurderte hyppighet av vellykkete samleier og tilfredshet med samleier, og med en total vurdering.

De sammenlagte resultater fra kliniske studier viste at tilførsel av Forbindelse (I) effektiv behandler mannlig erektil svikt, som illustrert i den følgende tabell.

IIEF EREKTILT FUNKSJONSOMRÅDE

(endring fra utgangspunkt)

n er antall deltagere, SD er standard avvik.

Det ble imidlertid også observert, basert på de sammenslåtte kliniske studier, at prosentdelen av behandlingsrelaterte bivirkninger øket med en økende enhetsdosering av Forbindelse (I), som illustrert i den følgende tabell:

Behandlingsrelaterte Bivirkninger (5%) Enhetsdosering av Forbindelse (I) (mg)

Den ovenfor viste tabell viser en økning i bivirkninger fra 25 til 100 mg enhetsdoser. Selv om en økning av effekt i behandling av ED ble observert ved 25 til 100 mg doser må disse bivirkninger som ble rapportert fra 25 til 100 mg doser også vurderes.

I overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse vil tilførsel av en enhetsdosering av Forbindelse (I) på 1 til 5 mg, opptil maksimalt 5mg pr. 24-timers periode, både gi effektiv behandling av ED og minimalisere eller eliminere forekomst av bivirkninger. I tillegg til behandling av ED med 1 til 5 mg enhetsdosering av Forbindelse (I) med minimale bivirkninger ble det, overraskende nok, også funnet at individer som ble behandlet med nitrater kunne bli behandlet for ED med den foreliggende oppfinnelses fremgangsmåter og forbindelser.