NO832107L - Fremgangsmaate ved fremstilling av dynorfinderivater - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt dynorfin og m=re spesielt dynorfinanaloger som er nyttige som narkotika-analgetika såsom opiatalkaloider og peptidanalgetika såsom e.nkefaliner og |6-endorf inanaloger.

En av hypofysepeptidene som nylig er oppdaget inneholderj

17 aminosyrer og omtales generelt som dynorfin. Det er funnet

at dynorfin utviser potente agonistiske egenskaper i marsvir-ileum og mus vas deferens. Både dynorfin(1-13) og dynorfin(1-17) er rekkebestemt og syntetisert. Det syntetiske dynorfin (1-13) produkt er funnet å være like potent i bioåssays Jsom det naturlig forekommende peptid men er funnet å være rela-tivt svakt med hensyn til å produsere analgesia ved stud;ium av mus.

Det er rapportert at dynorfin (1-13), men ikke det korte<i>re fragment, dynorf in (1-9)., har betydelige effekter på opiat oci^-endorfin-indusert analgesia i naturlige dyr. Disse studieij-har indikert at dynorfin(1-13) kan samvirke med andre anal-j getiske opioider. Det er således nylig vist at dynorfin(1-13) synes å samvirke med morfin for i en betydelig grad å modi- ! fisere eller inhibere analgesia forårsaket av morfin i naturlige dyr.

i Det er funnet at aminanaloger av dynorfin med minst 10 aminosyrer, men mindre enn 13., og spesielt dynorfin (1-10) amid ikke antagoniserer narkotisk analgesia i naturlige dyr slik

i

som dynorfin, dynorfin(1-13) og dynorfin(1-13)-amid. Ytterligere er det funnet at dynorfin-amidanaloger potensierer den analgetiske effekt i tolerante verter. I tillegg blir dynorfin(1-10) amid og visse amidanaloger derav mindre raskt metabolisert av verten og således kan mindre doser enn f! or i! dynorfin(1-13) administreres ved terapeutiske anvendelser.

i Terapeutisk anvendelse av dynorfin(1-10)-amider innebefatter administrering til en vert som er tolerant for en narkotisk analgesia. Lavere doser av narkotiske analgesia, eksempelvis et opiatalkaloid såsom morfin kan anvendes for pasienterj som krever kronisk behandling med narkotika for å dempe |

smerte, såsom siste stadiums kreftpasienter, eller lavereI doser for et narkotikum såsom metadon kan anvendes ved be-

I

handling av narkotikaavhengige. Som følge derav kan de forskjellige kjente sideeffekter såsom pustedepresjon og kpn-stipasjon, som følger av kronisk behandling med høyere doser åv narkotika, kan dempes. Ytterligere kan dynorf inamidanalo--gene anvendes ved behandling av "narcotic withdrawal". j

FIIorbindelsene som fremstilles i henhold til oppfinnelsen har formelen<!> hvori og R~er hydrogen, alkyl, allyl, formyl eller ace-AhtA yydl2 r, oogg Re1An 1 A oe3 g lelr Rer 1g2 il Cye Ur si^n jh- y, d, ArA ohgv4 oenr er , n=aflel nkyyelll aleelar lnlei2nr , , AaAAlA "l'' y5elr e, r ^tylr-eouRcsg iinner jJ<->6 7 8

AA og AA er arginin, AA er isoleucin, tyrosin eller lysin,

AA 9 er arginin eller prolin og AA lnu er prolin.

Foreliggende oppfinnelse er nyttig for i det vesentlige

a, lle nar, kotiske analgesia. Eksempelvis er foreliggende qipp-finnelse nyttig med forskjellige alkaloider av opium såsom morfin, morfinsalter (såsom morfinhydrobromid, morfin-hydroklorid, morfinklorid, morfinoleat, morfin N-oksyd og morf insulf at) og morf inanaloger såsom normorfin, diacety^l-dihydromorfin, diacetylmorfinhydroklorid, kodein og diace-tylmorfin (heroin). Andre meget brukte narkotiske analgesia

i

med hvilke foreliggende oppfinnelse kan anvendes innebefatter ålfatrodin, metadon, meperidin, levertanol, propoksyfen,; fen-tanyl, oksymorfon, anileridin og metopon. Anvendelser kan også omfatte peptidanalgesia såsom enkefaliner og £-endorfin-analoger .

: I

Som det vil være velkjent vil fortsatt bruk av disse narkotiske analgesia føre til tilvend.ing eller avhengighet og anvend-

else av en kan føre til kryss-toleranse overfor andre. '

i Imidlertid, til tross for deres potensielle ulemper har i disse narkotiske analgesia terapeutiske anvendelser, eksempél-

i

vis for pasienter som krever kronisk behandling for å lette smerte. j

Selv ved slike terapeutiske anvendelser vil pasientene ut- j vikle en stigende toleranse mot disse narkotiske analgesia '

i i slik at stadig større kraftige doser er nødvendig for å oppnå smertestillende effekt. Uønskede sideeffekter har da en tendens til å utvikles mot de store kroniske doser av j dnaarnknoentdie ske egaennasklgapeesr iaa. v Agnanorksotitsikse ke vairnkanlginegseia r okg an avvhærene goig gheetrs--

studert i forskjellige pattedyr ved siden av mennesker ford:).

i praktiske og offisielle bestemmelser ofte krever at disse Studier først utføres på små gnagere og/eller aper før de

jii|mahsnøeankr aelnmges osepktrefå ir simknefe lunignnegnneeeesknnt deskå e ra. vpeTgæerr eine l fsmoknoar å prdhef ar e inr fhloaiimgrs mnidpaenalsødteytre ttedi iid ysmkr aee nblopnlrree otsmdksueeekdrtt ti, esor fig nruaer nect..esorm -

jantall analgetiske bestemmelser er utviklet for dyr og som

! l.hia:! mr eonpnpensåkded r. omTefraatpteeundte isgk odaknvjeenndneellsse e afv or de å nf"oye rutfosri beigndenelsksaelprenei<!>kan være sammen med narkotiske analgesier og mere foretrukket med opiatalkaloider. Hvis intet annet er angitt er betegnelsen i"dynorfin" alene ment å bety naturlig forekommende eller syn-tetisk sekvenserte heptadekapeptid og anvendelsen av betegnelsen "dynorfin" med indikeringer såsom (1-10) eller (1-13)

betyr de polypeptider som har en sekvens av 10 aminosyrer av

det naturlig forekommende heptadekapeptid (eksempelvis dynorfin (1-10)) éller de tretten aminosyrer som naturlig ! forekommer i heptadekapeptidet.

De første tretten aminosyrer i dynorfin eller dynorfin(1-13)

har sekvensen:

N-terminalenden inneholder Leu-enkefalin (de aminosyrer som er nummerert 1-5), etterfulgt av C-terminalforlengelsen (de! aminosyrer som er nummerert 6-13). Innebefattelsen av Leu-enkefalin er antatt nødvendig som en biologisk "målsøkende i '■ i anordning" for aktiviteten og lengden av forlengelsen forbi leukoenkefalin er antatt å være kritisk for dets potens.: ! I Nye dynorfinpolypeptidamidanaloger er syntetisert og inneholder minst 10 aminosyrer (men mindre enn :13) som adskiller seg fra dynorfin og dynorfin(1-13) ved at de verken potensierer eller antagoniserer narkotiske analgesia i naturlige verti er.j I tolerante verter er disse analoger mere potente og selek- j tive enn dynorfin (1-13) ved potensiering av narkotiske analgesia.

Forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen inneholder minst ti aminosyrer forbundet i rekkefølge av péptidbindii ngeIr ,med fem aminosyrer (eller strukturelt tilsvarende grupper, såsom d- eller 1-dopa i stilling 1) fra N-terminalenden ér de samme som eller ligner Leu-enkefalin, mens aminosyrene 6fl0 i det vesentlige utgjør en hoveddel av molekylet (med basiske, eller basiske og nøytrale grupper).. Dynorfinamid-analogene fremstilt i henhold til oppfinnelsen med aminorj syrer nummerert utgående fra N-terminalenden eller amino-j-ji gr:uppen er generelt vist i den etterfølgende figur I.

hvor i

i og R2er hydrogen, alkyl, allyl eller acyl, (såsom formyl eller acetyl), R^og R12er hydrogen, alkyl, en benzylgruppei (substituert eller usubstituert) , en eller flere av R^ og R^2kan være en nitrogeninneholdende gruppe såsom hydrazid og de; andre hydrogen, eller en av R ^ og R^2kan være basiske eller nøytrale aminosyrer eller et basiskt eller nøytralt dipeptid< og andre hydrogen eller en alkylgruppe, R -Rn er hydrogen eller en alkylgruppe inneholdende ikke mere enn fire karbon-j atomer og som kan være forgrenet eller uforgrenet, fortrinnsvis metyl eller etyl og aminosyrerekkefølgen er som angitt i ' j det følgende.

i AA"'' kan være tyrosin, m-tyrosin eller 1-dopa, fortrinnsvi1s tyrosin. j I| 2 3 1 AA og AA kan være glysin eller andre nøytrale.aminosyrer ,enten i d- eller 1-formen (eksempelvis serin, treonin, cys-tein, tyrosin, aspargin, metionin og glutamin) eller<-amino-i■ siosmørsyre (AIB), fortrinnsvis glycin.

i

AA '4 kan være fenylalanin,©^-alkylert fenylalanin (såsom^c-métylfenylalanin), p-hålogen-fenylalanin eller tyrosin, i fortrinnsvis fenylalanin.

j

"5 i AA kan være leucin, isoleucin eller valin, fortrinnsvis] leucin. ! i I

i

'67'

AA og AA kan være en basisk aminosyre i enten d- eller!1-i formen (eksempelvis arginin, lysin eller histidin), homoargi-inin eller ornitin, fortrinnsvis arginin.

i I

i IaA ' 8 kan være nøytrale eller basiske aminosyrer i d- eller! jlrformen, leucin eller isoleucin, fortrinnsvis tyrosin, i 1isoleucin eller lysin. li . i i jAA 9kan være en basisk aminosyre i enten d- eller 1-formen, jhomoarginin, ornitin eller prolin, fortrinnsvis arginin eller

•prolin. li'i i i ! jAA1^ kan være en basisk aminosyre enten i d- eller 1-formen,'

i Iprolin eller en prolinanalog (såsom tioprolin, 3,4-dehydro-'prolin, 4-hydroksyprolin eller pipekolinsyre), fortrinnsvis i

'prolin eller lysin. '

' ' i Spesielt foretrukket er:

i

hvor karbonylkarbonet i prolinenden er amidert (enkelte j iI ganger omtalt i det etterfølgende som "dynorfin(1-10 amid"),i|

I

hvor karbonylkarbonet i prolinenden er amidert (enkelte ganger

I

j il det etterfølgende betegnet som "formel 1 analog");

hv<i>or karbonylgruppen i prolinenden er amidert (enkelte ganger i det etterfølgende betegnet som "formel II analog"). i

i

Fremstillingen er vist i det etterfølgende eksempel.

i

Eksempel 1 I Dynorf in (1-10 ).-NH2 ble fremstilt på en fast bærer av Bocjpro-BHA (benzyhydrylamin). harpiks (2mM/4,5 g harpiks). Med frem-gangsmåtene modifisert av Merrified med den "Merrified procedure on a Peninsula manual" fastfasepeptid syntesizer ble de tilsvarende Boc-beskyttede aminosyrer tilsatt henholdsvis Då Boc-Pro-BHA harpiksen: Arg(Tos), Ile, Arg(Tos), Arg (T1 os), Leu, Phe, Gly, Gly og Tyr(o-Br-Z). Et 5,0 molart'i overskudd av hver beskyttet aminosyre ble anvendt. Koblihgs-re! aksjonen ble fulgt ved hjelp av en semikvantitativ nin-ji-hydrinbestemmelse. De følgende trinn ble anvendt for å koble!den Boc-beskyttede aminosyre på Boc-Pro-BHA harpiksen:

I

jl; Vasking med CH2C12(3x100 ml)

I<2>. Forvask med 33% TFA i CH2C12med 1% indol. (1x100 ml).

I

!3. Avbeskyttelse med 33% TFA i CH9C1„ med 1% indol. (lxlOOml), I i 20 min.

! i

.; j

! 4 L Vasking med CH,.C1~(1x100 ml).

i

'5. Vasking med EtOH (1x100 ml).

i ■ i :6. Vasking med CII^Cl- (2xl00ml) .

'• 1' .Forvask med 10%-ig Et^N i CH2C12(lxlOOml). i

8. Nøytralisering med 10% Et3N i CH2C12(lxlOOml), 10 min.

t<;>i

9. Vasking med CH2C12(3xl00ml).

1 : I 10. Beskyttet aminosyre (5,0 molart overskudd) i DMF (lOiml) jog CH2C12(50 ml) ble tilsatt.

i ;11. DCC i CH2C12(0,5M, 20 ml) ble tilsatt og omsetningstidén var opptil tre timer.

I l'i2. Vasking medCH2Cl2 (3x100 ml)..........1

I I

I Den resulterende, beskyttede Boc-Tyr (O-Br-Z ) -Gly-Gly-Pher-ILeu-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Ile-Arg(Tos)-Pro-BHA harpiks ble vasket omhyggelig med henholdsvis 33%-ig TFA i CH2C12, CH2C12

og MeOH. Etter tørking under vakuum over natten ble peptidet spaltet med HF (30 ml/g harpiks) i nærvær av anisol (3 ml/ g| i harpiks) i en time ved 0 o C. Reaksjonsblandingen ble vas•ke<t>

i<1>under vakuum og vasket med vannfri eter. Det ønskede peptid ble oppløst i 10%-ig HOAc og harpiksen filtrert fra. Filtratet !ble lyofilisert til å gi urene dynorfin(1-10)-NH2. Dette !ppptid ble renset under anvendelse av fordelingskromatografi I under anvendelse av n-BuOH:pyridirt:H20 (11:5:3) som eluerings-i! oppløsningsmiddel og CM ion•' ebytterkromatografi ga det renie dynorfin(1-10)-NH„.

! i A!dministrering av en dose av fremstilte dynorfin(1-10)amider I eller en av de oppfinneriske' analoger derav til en vert i fcr-;bindelse med administrering av en dose av et narkotisk

<1>'i ;analgesium, hvor administrasjon av dynorfin(1-10)amidet ell^r janalog derav skjer minst innen 30 min. etter administrasjon lav den narkotiske analgetiske dose. Fortrinnsvis skjer admirii-I streringen med en enkelt blandet dose hvor det narkotiske ,analgesikum er morfin, en morfinanalog eller et morfinsalt I eller annet peptidanalgesia. I

Når administreringen av narkotisk analgesikum som er morfin

og skjer til en naturlig pasient vil en normal dose være

av størrelsesorden 5 mg i.v. under antagelse av en kroppsvekt på ca. 70 kg. Det er antatt at en passende dose av dynorfin(1-10) amid eller et analog derav, administrert sammen med analgesikumet ligger i området 60-200 ,ug/kg kroppsvekt. Selv om dynorfin(1-10) amidet eller analoge'derav ikke potensierer det narkotiske analgesikum i en opp-rinnelig normal vert (heller ikke antagoniserer det) så vil i mengden, når pasienten fortsetter en omfattende behandling ; med narkotika for å dempe smerte av narkotika nødvendig for å gi et tilstrekkelig smertestillende nivå over behandlings-perioden være mindre ved anvendelse av dynorfin(1-10)amid I ! .nealrlkeor tainkaumlo. g Sodmer'aev n efønn lgue tden erai v fokran bidnde elfosre smkejd eldleigt e aunvønensdktedee.

\ • f ■ r '

<I>sideeffekter av gjentatte høye doser narkotikum dempes.

I i

i i

i i

Dosen for tilvendte pasienter kan bestemmes som følger. En første eller tilstrekkelig dose av det narkotiske smerte-sti illende middel bestemmes som vil t. ilveiebringe en tilst:rek-kelig smertestillende effekt i verten. Imidlertid istedenfor å iadministrere denne tilstrekkelige dose administreres en ! foirhåndsbestemt dose av det narkotiske smertestillende middel.

i I Denne forbestemte eller andre dose inneholder mindre av det i na: rkotisk smertestillende middel enn det som ville være tIil-

i ■. ! strekkelig for å gi analgesia i verten. Den aktuelle admini-strerte dose av det narkotiske smertestillende middel supple--menteres med d<y>norfin (1-10)amid eller analog derav. Denne i supplementering er fortrinnsvis tilstrekkelig til å gi et smertestillende nivå hos verten som i det vesentlige er ekvivalent med det smertestillende nivå som ble oppnådd når kun det narkotiske smertestillende middel ble administrerlt. Det vil forstås at den første eller tilstrekkelige dose, ! den mindre, andre dose og den supplementerende dose vil variere avhengig av den enkelte pasients toleransenivå overfor det narkotiske smertestillende middel og vil normalt bestemmes av' den behandlende lege. ! i i

Det er også antatt at forbindelsene fremstilt i henhold til foreliggende fremgangsmåte også kan være nyttige ved andre terapeutiske behandlinger, såsom ved behandling av narkotika--

i avhengige for å forhindre abstinenssymptomer. j

i :

<!><!>Oppfinnelsen skal i det etterfølgende belyses under henvisning til de etterfølgende eksempler. i j

' r

i Raserene han-ICR mus (Gilroy, CA) med en vekt på 20-25 g

ble innestengt i minst et døgn før forsøkene og anvendt i løpet av 5 døgn. Hver mus ble anvendt kun en gang. Analgesia ble bestemt i henhold til halesprettmetoden i henhold til D'Amour og Smith, J.Pharmac.Exp.Ther., 72, sidene 74-79 (1941) modifisert i henhold til Tulunay og Takemori, J.Pharmac. i<:>Exp.Ther., 190, sidene 395-400 (1974). I

! 'Foi r bestemmelse av EDd CA u (det vil si den effekti.ve ..dose .f.oir

50% av prøvegruppen) ble dyrenes respons kvantifisert ved å etablere sluttpunktet som representerte en signifikant for-økning i reaksjonstiden. Sluttpunktet var en forøkning i jreak-.sjonstiden for et enkelt dyr større enn 3 SD (dvs. standard-avvik) fra kontrollens midlere reaksjonstid for alle dyrene som ble anvendt ved bestemmelsen. Den vanlige kontroll midlere reaksjonstid var 3,1+0,05 s. Ikke-reagerende dyr ble fjernet fra varmestimulusen når reaksjonstiden oversteg 10 s for å

unngå halebeskadigelse.

Medisinene ble injisert 30 min. før bestemmelse hvis intet

annet er angitt. Morfin ble injisert subkutant (s.c.) mens polypeptidene ble injisert intracerebroventrikulært (i.cv.)

114 ml såltoppløsning.

i i Dyrene ble delt i to grupper.- Den ene gruppe var morf intolerante i (dvs. tilvendte) mens den andre gruppe var naturlige (dvs. ikke tilvendte). Toleranse ble etablert for hver vert i hver gruppe ved implantering av morfintabletter (7 5 mg base, subkutant ved fremgangsmåten i henhold til Way et al, J.Pharmac. Exp.Ther., 167, sidene 1-8 (1969)). Pelletsene ble fjernet 7 2' h etter implantering og musene ble undersøkt med hensyn til morfintoleranse 6 h senere.

i

Det ble anvendt minst 30 dyr fra både den morfintolerante gruppe og fra den andre naturlige gruppe for å bestemme i hver doses responskurve og ED^g verdier for hver behandling. EDj-q verdiene, deres 95% konfidensgrenser og signifikans [

av potensieringsforholdet mellom de to ED^-q verdier ble bestemt ved fremgangsmåten i henhold til Litchfield og Wilcoxon, J.Pharmac.Exp.Ther., 96:99-113 (1949),

De anvendte medisiner ved disse forsøk var morfinsulfat (Mallinckrodt Chemical Works, St. Louis, MO") og /3-endorfin

;(en gave fra Dr. N. Ling, Salk Institute, San Diego, CA).<;>

!

De etterfølgende eksemplér 2 og 3 viser effekten av dynorfin(1-13) Isammen med henholdsvis morfin og (3-endorfinindusert analgesiå li Idyr fra den morfintolerante gruppen. Eksempel 4 er beskrevet for sammenligning med eksempléne 2 og 3. i

<!>

jSelv om dynorf in (1-13 ) ble administrert i.cv. i eksemplene 2-j-4, ga intravenøs (i.v.) eller s.c. administrasjon tilsvarende resultater ved sammenlignbare doser.

ii

■ Eksempel 2 jOver 9 0 morf intolerante dyr ble behandlet med forskjellige i •mengder morfinsulfat s.c, ente• n alene eller i nærvær av |i jf or sk j ellige mengder dynorf in (1-13 ) i.cv. og deretter juiidersøkt med hensyn til analgesia. Resultatene av disse 'b-, e' stemmelser er vist i de etterfølgende data tatt fra tre1 doseresponskurver, som hver ble bestemt fra minst 30 dyr,!

i hvorav en uten administrering av dynorfin (1-13) og to hvor 'l dyinorfin (1-13) ble administrert sammen med morfin.

<!>Det kan sies fra disse forsøksresultat at dynorfin(1-13) potensierer morfineffekten i tolerante dyr. Således vil ED^q verdien for morfin forskyves fra ca. 60 (mg/kg) til ca. 29

i

i nærvær av 10 .ug dynorf in (1-13) og fra ca. 60 (mg/kg) til ca.

18 i i nærvær av 20 p. q d, ynorf in (1-13 ) .

i

. EksempBl 3 i lOver 90 morfinolerante dyr ble behandlet med forskjellige I mengder/3-endor f in i.cv., enten alene eller i nærvær av forskjellige mengder dynorfin(1-13) i.cv. og deretter under-søkt med hensyn til analg<esia. Resultatene av disse bestemmelser er angitt'i de etterfølgende data at fra 3 doserespons-

kurver (hver basert på basis av minst 30 dyr) hvorav den ene iuten administrering av dynorfin (1-13) og de to andre hver jdynorfin(1-13) ble administrert sammen med morfin. i I

1

i i Som det kan sees fra de viste forsøksresultater vil dynorfinj (1-13). potensiere ( i -endorfinef fekten. Således ble ED,-n for /3-endorfin forskjøvet fra ca. 2,25 ,ug/mus i.cv. til Jcu a.|j l,oji og til ca. 0,55 i nærvær av henholdsvis 10-20 p. g dynorfin (1-12). i

7 < i For sammenligning viser det etterfølgende eksempel 4 effekteh av dynorfin(1-13) sammen med morfinindusert analgesia i dyr ' fra den naturlige, ikke tilvendte gruppen. iI

i i 1 i Eksempel 4

i

Over 90 dyr ble behandlet med morfinsulfat s.c, enten alenej eller i nærvær av forskjellige mengder dynorf in (1-13) i.cv.', og så undersøkt med hensyn til analgesia. Resultatene avjdisse bestemmelser er angitt i de etterfølgende data at fra 3 doser responskurver (hver basert på basis av minst 30 dyr) hvorav 1 den ene uten administrering av dynorfin (1-13) og de to I andre hvor dynorf in (1-13) ble administrert sammen med morfin;.

i

- I

Som det kan sees fra de viste resultater vil dynorfin(1-13)

iI betydelig grad inhibere morfinindusert analgesia på en'

doserelatert måte og forskyve morfinresponskurven til høyre.

.Såldes EDj-q for morfinadministrert s.c. ble forskjøvet fra ca. 4,9 mg/kg til ca. 3,4 mg/kg og til ca. 14,5 mg/kg i

i nærvær av henholdsvis 10 p. g og 20 ug dynorf in (1-13) .

En tilsvarende effekt ble observert for analgesia indusert av i .c . v . ( Z -endorf in. Imidlertid var dynorf in (1-9) opptil 40 ;ug eller dynorfin -(6-13) opptil 80 p. g inaktive med hensyn til å inhibere morfininudsert analgesia i tilsvarende forsøk.

Som det kan sees ved en sammenligning av de data som er gitt i eksempel 4 med de vist i eksemplene 2 og 3 så vil i stedet for å inhibere morfinindusert analgesia (slik som fant sted for de naturlige dyr i eksempel 4), administrering av dynorfin til morfintolerante dyr potensiere morfineffekten. Denne!

forskyvning av morfin ED^q kunne ikke tilskrives dynorfins

egen effekt da dynorfin i en mengde på opptil 50 pg/ mus [

fremdeles ikke viste noen analgetisk effekt. Tilsvarende! ■resultater ble holdt med p -endorfinindusert analgesia. Både j f br morfin og ( i> -endorf intilfellene var potensieringen dose-

' relatert. j

I det etterfølgende eksempel 5 vises effekten av dynorf in (1-'10% amid sammen med morfinindusert analgesia i naturlige ikke-avhengige dyr.

i Eksempel 5

i

En gruppe på minst 30 naturlige dyr ble behandlet med moirfin-sulfat s.c, enten alene eller i nærvær av forskjellige mi engder dynorfin(1-10) amid eller dynorfin (1-13) amid.

Behandlingen ble gjentatt med en annen gruppe på minst 30

naturlige dyr og et enkelt blindforsøk ble også utført for

å underbygge resultatene.

i

Si o'' m det kan sees av de ovenfor viste forsøksresultater vi'l dynorfin(1-10) amid ikke forskyve morfinresponskurven og det var således ingen antagonisme eller potensiering hos naturlige, ikke-tilvendte dyr. Dette er i motsetning til effekten av, dynorf in (1-13). amid med naturlige, ikke-tilvendte dyr.

i i

I det etterfølgende eksempel 6 vises effekten av dynorfin

(1-10) amid, formel 1 analogen, formel 2 analogen og amidert dynorfin(1-13) med morfinindusert analgesia i tolerante dyr.

i i

Eksempel 6 \ En gruppe på minst 30 tolerante dyr ble behandlet med morfinsulfat s.c, enten alene eller i nærvær av de fremstilte dynorfinamidanaloger. I tillegg ble dynorfin(1-13) amid fremstilt og undersøkt for sammenligning. j Behandlingen ble-gjentatt med en annen gruppe på minst 30| tolerante dyr og et enkelt blindforsøk ble også utført for å -underbygge resultatene.

<!>I

I

Som det kan sees fra forsøksresultatene vil dynorfin(1-10) amid i betydelig grad potensiere den morfinindusérte analgesia (dvs. forflytte morfinresponskurven til venstre) i tolerante eller tilvendte dyr, og hvor formel 1 og 2 analogene pgså tilveiebringer en potensiering, men i mindre grad. I i toilerante verter vil dynorf in (1-13 ). amid også potensiere j anIalgesia.

I .andre forsøk ble dynorfin(1-10) amid vist å være mere potent enn dynorfin(1-13) med hensyn til å inhibere vridning av sædledere hos mus ( IC^ q for dynorfin(1-10) amid = 0,24 nM og j ICj-Q for dynorf in (1-13). = 3,9 nM) . Bindingsanalyse indikerte at to opioidpeptider har tilsvarende profiler ved at de fjor-sterker dihydromorfin (DHM) bindingen i pikomolare konsenitra-sjoner men forskyver DHM bindingen i nanomolare konsentra-sjoner (IC50for dynorf in (1-10) amid •= 5 nM) . I musesprette-bestemmelsen imidlertid utviser dynorfin(1-10) amid en mere selektiv virkning på morfinindusert analgesia.

i i Selv om dynorfin(l-10) amid utviser noen signifikant anali ge■-tisk aktivitet i seg selv (hvis det ikke gis i store doser hvor det har en tendens til å fremkalle brekninger o.1. opp-

i førsel) så adskiller det seg fra dynorfin(1-13) ved verken i aipotensiere eller antagonisere morfin i ikke-tilvendte dyr. ;I ;tilvendte dyr vil derimot dynorf in (1-10) amid synes å Være en ii mere potent og selektiv analog enn dynorfin(1-13).

Claims (1)

1. I i1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en terapeutisk dynorfin-' IanIalog med "den følg"ej. ncle formel - ■...

   hvori R-^ og R2 er hydrogen, alkyl, allyl, formyl eller acetyl, R1;L og <R> 12 er hydrogen, alkyl eller allyl, R3-R0. er jh<y> dj rogen eller -fCH9 }- , hvor n=l eller 2, AA1 er tyrosin, j 2 3 4 5 AA og AA er glysin, AA er fenylalanin, AA er leucin, 6 7 8 AA og AA er arginin, AA er isoleucin, tyrosin eller lysin, AA^ er arginin eller prolin og AA ^ er prolin, J karakterisert ved i rekkefølge å addere de følgende beskyttede aminosyrer, nemlig Arg(Tos), Ile, Arg(Tos), Arg(Tos), Leu, Phe, Gly, Gly og Tyr(o-Br-Z) og deretter p.å i og for seg kjent måte avspalte det erholdte peptid fra harpiksen og rense det erholdte dynorfin(1-10)-NH2. ^^- A ■ _l 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert v ie d at et polypeptid med sekvensen TYR-GLY-GLY-P!1E-LEU-ARG-ARG-AA <8-> ARG-PR0 I 3 jhvori AA er tyrosin, isoleucin eller lysin amideres til å gi-