NO973996L - Fremgangsmåte ved bestemmelse av virusinaktivering - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører et virusinaktivert blodprodukt, en fremgangsmåte ved fremstilling av dette, samt en fremgangsmåte ved bestemmelsen av virus-inaktiveringskapasiteten av en inaktiveringsbehandling.

Med blodprodukt skal det forstås produkter av humant eller animalsk blod hhv. plasma til terapeutisk, profylaktisk eller diagnostisk bruk. Slike produkter kan inneholde enzymer, proenzymer samt koaguleringsfaktorer, enzymkofak-torer, enzyminhibitorer, immunglobuliner, albumin, plas-minogen, fibrinogen, fibronektin eller plasma.

Administrasjonen av blodprodukter innebærer en infeksjonsrisiko på grunn av de i giverplasma eventuelt foreliggende infeksjonsfremkallende agenser såsom hepatitt- eller AIDS-virus. Selv om det utelukkende brukes plasma som er testet på at det er fritt for infeksjonsfremkallende agenser, kan det ikke utelukkes en infeksjonsfare hos pasienten på grunn av testmetodens begrensede sensitivitet. Ved fremstilling av blodprodukter er man således tvunget til å inaktivere eventuelt foreliggende infeksjonsfremkallende agenser ved hjelp av forskjellige forholdsregler.

Det foreligger en omfangsrik litteratur vedrørende inaktivering av sykdomskilder i blodprodukter.

De forskjellige fremgangsmåter omfatter:

Oppvarmning av blodproduktene i vandig oppløs- ning, eventuelt ved tilsetning av virucide substanser,

oppvarmning av blodproduktene i vandig oppløsing

i nærvær av stabilisatorer,

behandling av blodproduktene med organiske opp-løsnigsmidler og/eller detergenter,

oppvarmning av blodproduktene i tørr og i våt

tilstand,

kombinert behandling av blodproduktene med et

organisk oppløsningsmiddel/detergent og oppvarmning av blodproduktene i tørr tilstand.

Formålet med alle disse inaktiveringsfremgangsmåter går ut på å oppheve preparasjonenes potensielle infektivitet, men å opprettholde mest mulig deres biologiske aktivitet. Dette mål kunne hittil bare oppnås ved albuminpreparasjo-ner, nemlig ved oppvarmning av vandige albuminoppløsninger ved en temperatur på 60°C i 10 timer, fordi albumin er vesentlig mer stabil overfor varmepåvirkning enn alle andre blodproteiner.

Når det gjelder teknikkens stand skal det anføres eksempel-vis følgende publikasjoner: DE-A - 2 9 16 711 beskriver en fremgangsmåte ved behandling av preparasjoner som inneholder koaguleringsfaktorer i vandig oppløsning under anvendelse av en temperatur på 3 0 til 100°C, idet det til oppløsningen av koaguleringsfaktorene tilsettes en aminosyre og en mono-, oligosakkarid eller sukkeralkohol.

EP-A2-0 053 338 beskriver en fremgangsmåte ved inaktivering av hepatittvirus i preparasjoner som inneholder faktor IX og X, idet det foretas en oppvarmning av den vandige oppløsning av et blodpreparat i nærvær av kalsiumioner og eventuelt en aminosyre og/eller et sakkarid eller en sukkeralkohol ved temperaturer på inntil 100°C.

I EP-A2-0 035 204 beskrives en fremgangsmåte ved inaktivering av vandige proteinoppløsninger som kan inneholde faktor VIII, fibronektin, globulin, fibrinogen og andre proteiner, idet komposisjonen blandes med en polyol og blandingen oppvarmes til en temperatur på 60 til 75°C.

I EP-A2-0 052 827 er det beskrevet en fremgangsmåte ved inaktivering av hepatittvirus i en vandig oppløsning som inneholder faktor II og VII, i nærvær av en chelatdanner og eventuelt en aminosyre og/eller et sakkarid eller en sukkeralkohol.

I US-A-4,379,085 er det beskrevet en fremgangsmåte ved varmeinaktivering av et plasmaprotein, såsom C\-inhibitor eller faktor IX, i en vandig oppløsning i nærvær av kalium-eller ammoniumcitrat.

I EP-A2-0 077 870 er det beskrevet en inaktiveringsfrem-gangsmåte hvor det oppvarmes en vandig oppløsning som inneholder faktor VIII, med aminosyrer, monosakkarider, oligosakkarider, sukkeralkoholer og hydrokarbon- eller hydroksyhydrokarbon-karboksylsyrer med 3 til 10 karbonato-mer til en temperatur på 50 til 80°C.

I PCT-ansøkning WO 83/04371 er det beskrevet en fremgangsmåte ved inaktivering av hepatittvirus, idet det behandles en preparasjon som inneholder viruset, ved en temperatur på 4 til 40°C med et halogenhydrokarbon, spesielt kloroform.

EP-Bl-0 015 055 beskriver en fremgangsmåte ved behandling av et blodprodukt, idet produktet utsettes i vannfritt tilstand for en mikrobølgebestråling for å inaktivere foreliggende mikroorganismer.

Rosenberg et al. beskriver i en avhandling av XII. Inter-national Congress on Blood Transfusion, Abstracts, "MIR" Publishers, Moscow 1969, pp. 473-475 en fremgangsmåte ved inaktivering av albuminholdige preparasjoner og fibrogen i tørr tilstand ved 10 timers oppvarmning til 60°C.

EP-A2-0 094 611 beskriver en fremgangsmåte ved behandling av en komposisjon som inneholder faktor VIII, i tørr, f.eks. lyofilisert tilstand, under anvendelse av en temperatur på minst 60°C for å inaktivere foreliggende hepatitt-virus .

Den offentliggjorte PCT-ansøkning WO82/03 871 beskriver en fremgangsmåte ved behandling av tilberedelser som inneholder blodkoaguleringsenzymer, idet disse oppvarmes i tørr tilstand for å inaktivere foreliggende infeksjonsfremkallende virus; i tørr tilstand defineres denne med mindre enn 5 vekt% (0,05) vann.

Det har vist seg at metoden med tørroppvarmning av lyofilisert faktor III-konsentrat i 10 timer ved 60°C riktignok bevirker en viss virusinaktivering, men ved administrasjon av tørroppvarmede produkter overføres hepatitt- og også AIDS-virus (Eur. J. Epidemiol. 3, 103-118 (1987)). For å øke tørroppvarmningens virkningsgrad, foreslås det i PCT-ansøkningen WO 88/08710 en følge av varmebehandlinger.

Likeledes underkastes ifølge EP-A-0 378 208 proteinholdige komposisjoner en behandling med trialkylfosfat i kombina-sjon med en tørroppvarmningsbehandling.

Fremgangsmåten i EP-B - 0 159 311 går ut på en behandling av blodprodukter i fast, våt tilstand. Det innstilles et innhold av vann, metanol eller etanol på mere enn 0,05 (5 vekt%) og mindre enn 0,70 (70 vekt%) og oppvarmes i en lukket beholder ved en temperatur mellom 50 og 121°C.

I EP-B - 0 050 061 er det beskrevet en fremgangsmåte som omfatter behandlingen av biologiske og farmasøytiske produkter med 0,25 til 10 vekt% av en ikke denaturerende amphifil (detergent). I EP-B - 0 131 740 vises imidlertid at behandlingen med en detergent alene med hensyn til virusinaktivering er relativt uvirksom. For en effektiv behandling foreslås det i denne publikasjon en blanding av en detergent og et di- eller trialkylfosfat. Her utgjorde konsentrasjonen av detergenten 1 % og av oppløsningsmid-delet 0,1 %.

En kombinert behandling med et organisk oppløsnings- middel/detergent og med varme, hvor blodproduktet oppvarmes i tørr tilstand, er likeledes beskrevet i litteraturen (American Journal of Hematology 35, 142 (1990)).

Virusinaktiveringsfremgangsmåter betegnes idag som virksom-me, når det efter anvendelsen av fremgangsmåten på en blodprodukt-prøve som er blitt blandet med en høy dose av et testvirus (f.eks. tilsvarende en maksimal titer på ca. 10<5>i en koaguleringsfaktor-preparasjon), ikke lengre kan påvises virus i prøven, og virustiteren således er redusert til under påvisningsgrensen.

Som målestokk for inaktivering er den såkalte reduksjonsfaktor kjent, som beregnes efter en engangs tilsetning av testvirus fra den dekadiske logaritme av kvotienten fra start- og sluttvirustiter. Fra retningslinjen EC III/8115/89-EN fra Kommission der Europåischen Gemeinschaf-ten er den såkalte total-reduksjonsfaktor kjent. Den beregnes fra summen av reduksjonsfaktorene av enkelte subsekvente inaktiveringsforholdsregler.

I den moderne medisin er det nødvendig å administrere mange blodprodukter over lang tid - i mange tilfeller også som permanent behandling - i store mengder, også for profy-lakse. Dette fører tvangsmessig til en kumulasjon av infeksjonsfremkallende partikler og således til en vesentlig øket infeksjonsrisiko, selv ved administrasjon av allerede virusinaktiverte preparater.

Reduksjonsfaktorer må sammenlignes med den såkalte "worst case situation" for en viruskontaminasjon av den totale plasmamengde. Fra tidsskriftet for Allgemeine Medizin 65, 429-433 (1989) er det kjent at det til tross for bear-beidelse av testet og HIV-negativt plasma er mulig et HIV-innhold på IO<5>ID/ml (infeksjonsfremkallende enheter pr. milliliter) i plasmaderivater. Ved å anta at en pasient i løpet av sitt liv inntar totalt ca. 100 1 av et faktor VIII-preparat, må således en fremgangsmåte ved virusinaktivering av plasmaderivater tillate en virustiterreduk-sjon på minst IO<10>for å unngå en infeksjon av en pasient med AIDS-virus.

Oppfinnelsens oppgave består i å tilveiebringe et virus-sikkert blodprodukt, unntatt albumin, fra hvilket det kan forventes at overføring av infeksjonsfremkallende agenser er utelukket selv ved administrasjon av store mengder blodprodukt, og som allikevel har en høy biologisk aktivitet.

Denne oppgave løses ifølge oppfinnelsen ved hjelp av et i forhold til inf eksjonsfremkallende agenser inaktivert blodprodukt, unntatt albumin, hvilket blodprodukt tilsvarer en total-virus-reduksjonsfaktor på minst 40, med en biologisk aktivitet på minst 50 % i forhold til aktiviteten før gjennomføringen av inaktiveringen av de infeksjonsfremkallende agenser, som kan oppnås ved en inaktiveringsbehandling hvor a) blodproduktet behandles i en vandig oppløsning som inneholder minst 2 %, fortrinnsvis minst 5 % detergent, og derefter oppvarmes i fast tilstand, eller b) blodproduktet oppvarmes i fast tilstand og behandles derefter i en vandig oppløsning som inneholder minst

2 %, fortrinnsvis minst 5 % detergent.

Oppfinnelsen består fortrinnsvis i et i forhold til infeksjonsfremkallende agenser inaktivert blodprodukt, idet blodproduktet bahandles i en vandig oppløsning som inneholder mere enn 10 % detergent, og oppvarmes i fast tilstand.

En andre utførelsesform består i et i forhold til infeksjonsfremkallende agenser inaktivert blodprodukt, unntatt albumin, hvilket blodprodukt tilsvarer en total-virus-faktor på minst 40, med en biologisk aktivitet på minst 50 % i forhold til aktiviteten før gjennomføring av inaktiveringen av de infeksjonsfremkallende agenser, som kan oppnås ved en inaktiveringsbehandling som omfatter to eller flere forskjellige inaktiveringsmetoder, hvorved minst én metode består av en varmebehandling av blodproduktet i fast eller fuktig tilstand med et vanninnhold på 0,05 til 0,70. Ved denne utførelsesform skal fortrinnsvis minst én metode være behandling med en vandig detergentoppløsning.

Den biologiske aktivitet bestemmes som enzymatisk aktivitet (f.eks. av blodkoaguleringsenzymer og kofaktoren), som aviditet (av immunglobuliner) eller som antigen aktivitet -

eventuelt ved anvendelse av aktivitets- hhv. antigenmar-kør.

Blodproduktet ifølge oppfinnelsen kan fremstilles av konvensjonelle blodprodukter, idet inaktiveringsbehandlin-gen gjennomføres under en tidsperiode som er tilstrekkelig til å oppnå en total-virus-reduksjonsfaktor på minst 40. Denne tidsperiode kan bestemmes eksperimentelt på en blodprodukt-prøve, idet det under behandlingen tilsettes gjentatte ganger bestemte mengder testvirus, idet hver gjentagelse foretas først når virustiteren er sunket til en bestemt verdi, fortrinnsvis under påvisningsgrensen. Total-virus-reduksjonsf aktoren fremkommer av summen av de enkelte reduksjonsfaktorer.

Når det således under en behandling for virusinaktivering tilsettes testvirus i utvalgte tidsintervaller gjentatte ganger til et biologisk produkt, kan det efter bestemmelse av start- og sluttvirustiter multipliseres den dekadiske logaritme av virustiter-forholdene med antallet av inter-vallene, og reduksjonsfaktorene adderes til en total-virus-reduksjonsf aktor . Denne beregning forutsetter at virus-titerreduksjonen efter den siste testvirustilsetning ikke er større enn den forutgående titerreduksjon, noe som også har vist seg.

Som test-virus kan f.eks. AIDS-virus eller Sindbis-virus (som modellvirus for hepatitt-virus) være aktuelt.

Oppfinnelsen beror på den erkjennelse at en behandling med "Tween" eller detergent ifølge teknikkens stand, som foretas ved detergent-konsentrasjoner under 10 %, ikke fører til noe tilfredsstillende resultat, når blodproduktet ikke underkastes noen ytterligere metode for virusinaktivering. Dette kan føres tilbake til en beskyttelseseffekt av proteiner for virus mot inaktiverende agenser, f.eks. detergenter. Denne beskyttelseseffekt kan imidlertid fjernes ved en høyere "Tween-" hhv. detergentkonsentrasjon, uten at proteinenes biologiske aktivitet blir påvirket vesentlig. En slik fremgangsmåte muliggjør å gi avkall på tilsetningen av ytterligere substanser, såsom f.eks. oppløsningsmidler hvis toksiske virkning er kjent.

Det har vist seg som fordelaktig å gjennomføre behandlingen med "Tween" hhv. detergenten ved en konsentrasjon på mere enn 10 % og mindre enn 25 % masse, i løpet av mellom 1 min. og 30 min., spesielt ved en pH-verdi mellom 5,5 og 8, ved temperaturer mellom 0°C og 56°C, fortrinnsvis mellom 15°C og 3 7°C og eventuelt ved en elektrisk ledningsevne på 7 til 20 mS.

En foretrukket fremgangsmåte ved fremstilling av inak-tiverte blodprodukter ifølge oppfinnelsen består i at blodproduktet før eller efter behandlingen med den vandige detergentoppløsning behandles med varm damp, idet blodproduktet innstilles i fast tilstand på et innhold av vann, metanol eller etanol på mere enn 0,05 (5 % masse) og mindre enn 0,70 (70 % masse), fortrinnsvis mindre enn 0,40 (40 % masse), og behandles i en lukket beholder ved en temperatur på mellom 50 og 121°C.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte ved bestemmelsen av virus-inaktiveringskapasiteten ved en inaktiverings behandling, som omfatter minst en inaktiveringsmetode, idet reduksjonsfaktoren bestemmes ved hjelp av et testvirus,karakterisert vedat testviruset tilsettes gjentatte ganger under minst én inaktiveringsmetode, og de enkelte reduksjonsfaktorene av den minst ene inaktiveringsmetode eventuelt med reduksjonsfaktorene av ytterligere inaktiveringsmetoder adderes til en total-virus-reduksjonsfaktor.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av de etter-følgende eksempler.

Eksempel 1

Fra humanplasma ble det fremstilt en kryopresipitatoppløs-ning, inneholdende koaguleringsfaktor VIII efter en fremgangsmåte beskrevet i AT-B 391 808. Oppløsningen ble innstilt på 8 % "Tween 80" og blandet med en HIV-1 virussuspensjon 7 ganger i 2 min. intervaller. Efter en inkuba-sjonstid på 14 min. ved 25°C ble viruset sentrifugert og titeren bestemt. Kontrollverdien av satsen uten "Tween"-tilsetning var på IO<5,1>. Virustiteren efter "Tween"-behandlingen lå under påvisningsgrensen på IO<0,5>og kunne på grunn av den negative test av reversen transkriptase betegnes med 0. Dette gav en virus-reduksjonsfaktor på 7 x 5,1 = 35,7.

Oppløsningen som var fri for "Tween", ble igjen blandet med HIV-1 virussuspensjon, lyofilisert og oppvarmet med et vanninnhold på 8 % i 10 timer ved 60°C ifølge fremgangsmåten som angitt i EP-A-0 159 311. Virustiteren ble senkes fra IO<6>'<2>til 0.

Begge inaktiveringstrinn gav således en total-virus-reduksjonsf aktor på 41,9. Således er det påvist at en faktor Vlll-preparasjon som under de ovenfor angitte betingelser underkastes detergent- og varmebehandlingen, tilsvarer en total-virus-reduksjonsfaktor på 41,9 og må ansees som virussikker.

Bestemmelsen av restaktiviteten av faktor VIII ble gjen-nomført ved hjelp av tromboplastin-dannelsestest (2-trinn-test) .

Faktor Vlll-restaktiviteten ble beregnet ved dannelse av kvotienten fra faktor Vlll-aktiviteten av den oppvarmede prøve og faktor Vlll-aktiviteten av utgangsmaterialet før"Tween"-behandlingen, og utgjorde 80 %.

Eksempel 2

En preparasjon som inneholder koaguleringsfaktorene II, IX og X (partial protrombinkompleks, PPK) ble dannet efter den i Vox. Sang. 33., 37-50 (1977) beskrevne metode fra humanplasma ved adsorpsjon på "DEAE-Sephadex", vaskning av ioneutbytteren og eluering av komplekset.

PPK ble i en 22 % Tween 80-holdig oppløsning blandet med HIV-1 virus og inkubert ved 25°C. Virussuspensjonen ble tilsatt 15 ganger i 20 sek. intervaller. Virustiteren i kontrollen uten Tween-tilsetning var på IO<5,7>. Derav beregnes en total-virus-reduksjonsf aktor på minst 15 x 5,2 = 78. En PPK-preparasjon som underkastes den ovenfor angitte

"Tween"-behandling, tilsvarer således en total-virus-reduksjonsf aktor på 78 og må betraktes som virussikker.

Aktiviteten av koaguleringsfaktorene ble bestemt på eksem-pelet for faktor I over tilsetningen av prøven som skal testes, til et faktor IX-mangelplasma og bestemmelsen av den aktiverte partiale tromboplastintid (1-trinn-test), og den ble neppe påvirket av behandlingen med "Tween". Forholdet mellom aktiviteten av den behandlede prøve og aktiviteten av faktor IX i ubehandlet PPK lå tilærmet på 100 %.

Eksempel 3

En i eksempel 2 beskreven PPK-preparasjon ble inkubert med 12 % dimetyloktylamin-N-oksyd i nærvær av modellvirus (Sindbis hhv. vesikulært stomatitt virus = VSV) ved 25°C. Tilsetningen av virussuspensjon ble foretatt 10 ganger i 5 min. intervaller. Efter behandlingen med detergent lå virustiteren under påvisningsgrensen på IO<1,5>. Kontrollver-diene uten detergenttilsetning lå ved IO<6,4>hhv. IO6,1.Derav beregnes en total-virus-reduksjonsfaktor på minst 10 x 4,9 = 49 hhv. 10 x 4,6 = 46.

Den biologiske aktivitet ble neppe påvirket av detergentbe-handlingen og utgjorde tilnærmet 100 %.

Eksempel 4

Plasma ble efter "Cohn" fraksjonert, og COHN I-fraksjonen som inneholder fibrinogen ble blandet med modellvirus (Sindbis hhv. VSV). Efter lyofilisasjon ble konsentratet med et vanninnhold på 8 % oppvarmet efter fremgangsmåten ifølge ET-A-0 159 311 i 10 timer ved 60°C og derefter i 3 timer ved 80°C. Virustiteren ble fra IO<5,5>hhv.10<6>senket ved lyof ilisas jon til IO<4,9>hhv. IO<5,5>og dessuten på grunn av behandlingen ved 60°C til under påvisningsgrensen på IO<0,5.>

Inaktiveringskapasiteten i det andre behandlingstrinn ved 80°C ble bestemt i parallellsatsen: På grunn av lyofilisa-sjonen ble virustiteren igjen redusert fra IO<5,5>hhv. IO<6,0>til IO<4,9>hhv. IO<5,5>, og i den videre følge på grunn av behandlingen ved 80°C til under påvisningsgrensen.

Reduksjonsfaktoren beregner seg fra to ganger reduksjon med 5 hhv. 5,5 log-trinn minus 0,6 hhv. 0,5 log-trinn, da fibrinogen-preparasjonen under totrinns behandlingsfrem-gangsmåten ble underkastet bare en eneste lyofilisasjon.

Reduksjonsfaktoren var således 9,4 hhv. 10,5.

Pulveret ble derefter oppløst i et 5 % oktylglukosid-holdig medium og blandes i intervaller på 5 min. 9 ganger med "Sindbis" hhv. VSV. Efter inkubasjon (totalt 45 min. ved 25°C) ble virustiteren bestemt. Behandlingen med detergent reduserte virustiteren til en verdi på under påvisningsgrensen på IO<0,5>. Kontrollverdien av en sats uten detergenttilsetning var IO<6,9>hhv. IO<6,0>. Derav beregnet en virus-reduksjonsfaktor på minst 57,6 hhv. 49,5. Total-virus-reduksjonsf aktoren var således minst 67,0 hhv. 60,0. En fibrinogen-preparasjon som underkastes varme- og deter-gentbehandlingen under de ovenfor angitte betingelser, tilsvarer en total-virus-reduksjonsfaktor på minst 60,0 og må betraktes som virussikker.

Fibrinogenets biologiske aktivitet ble bestemt i det med 8 % etylalkohol utfelte bunnfall fra den oktylglukosid-holdige fraksjon med en fornetningstest av fibrin-a-kjedene (T. Seelich, H. Redl "Theoretische Grundlagen des Fibrin-klebers" i K. Schimpf "Fibrinogen, Fibrin und Fibrinkle-ber", F.K. Schattauer Verlag, Stuttgart-New York, 199-208, 1980) og ved hjelp av trombelastografi (H. Hartert i "Thrombosis and Bleeding Disorders", (N.U. Bang et al., eds.) Georg Thieme Verlag Stuttgart, Acad. Press New York London, 70-76, 1971), hver ved tilsetning av koaguleringsfaktor XIII.

Den biologiske aktivitet av det behandlede fibrinogen i forhold til den biologiske aktivitet av COHN I-fraksjonen, var 87 % målt på fornetningen og 56 % målt i trombe-lastogrammet.

Eksempel 5

Selektert plasma ble fraksjoner efter "Cohn". COHN III-fraksjonen, inneholdende anti-tetanus-toxoid-gamma-glubu-lin, ble blandet i nærvær av 15 % "Triton X-100" med HIV-1 hhv. "Sindbis"-virus og inkubert ved 25°C. Virustilsetnin- gen ble foretatt 30 ganger i minutt-avstander. Efter inkubasjonstiden på totalt 30 min., lå virustiteren under påvisningsgrensen på IO<2,5>hhv. IO<1,5>. Satsens kontrollverdi uten detergenttilsetning var på IO5,7hhv. IO<7,5>. Derav beregnes en total-virus-reduksjonsfaktor på minst 30 x 3,2 = 96 hhv. 30 x 6 = 180. En gamma-globulin-preparasjon som underkastes den ovenfor angitte detergentbehandling, tilsvarer en total-virus-reduksjonsfaktor på minst 96 og må anses som virussikker.

Den biologiske aktivitet ble bestemt med en aviditets-test. Til dette ble en tetanus-toxoid adsorbert på en mikrotiter-plate, tildekket med gelatin og vasket. Derefter ble gamma-globulinet som skal testes, påført i flere fortynninger på de preparerte mikrotiterplater, og ikke adsorbert immun-globulin ble vasket bort. Gamma-globulinet som er bundet til tetanus-toxoidet, ble bestemt ved adsorpsjon av et anti human-IgG-peroksidase konjugat på Fc-delen av immunglobuli-net og dessuten ved farvereaksjon av peroksidasen med diaminobenzidin og H202og derefter ekstinksjonsmåling.

Aviditeten av gamma-globulinet for tetanus-toxoidet ble neppe påvirket av behandlingen med detergent. Det ble ikke iakttatt noen siginfikante aviditets-forskjeller før og efter behandlingen.

Eksempel 6

0,95 ml av en oppløsning inneholdende C-L-esterase-inhibitor (fremstilt efter Vogelaar E F et al (1973) Vox Sang 26, 118-127 "Contributions to the Optimal Use of Human Blood") ble blandet med 20 mg "Triton X-100" og inkubert ved 25°C. For bestemmelse av virusinaktiveringskapasiteten ble det tilsatt VSV-virus (10/il) gjentatte ganger med 2 min. avstand. Efter 5-gangers virustilsetning lå virustiteren under påvisningsgrensen på IO<0,5>. Kontrollverdien av satsen uten detergenttilsetning var på IO<7,5>. Derav beregnes en

virus-reduksjonsfaktor på minst 5 x 7 = 35.

C^-esterase-inhibitoren ble adsorbert på DEAE-Sephadex og vasket med 8,89 g/l NaCl-oppløsning til den er fri for detergent. Efter inhibitorens desorpsjon med 59 g/l NaCl-oppløsning ble det dialysert mot en buffer som inneholder 1,0 g/l natriumcitrat og 0,4 g/l NaCl (pH 6,8). Til denne oppløsning ble det tilsatt på nytt VSV-virus før den ble lyofilisert. Preparatet ble tørt oppvarmet i 24 timer ved 72°C. Under lyofiliseringen og den påfølgende varmebehandling ble virustiteren redusert fra IO<7>'<2>til under påvisningsgrensen på IO<0,5.>Virus-reduks jonsf aktoren utgjorde således minst 6,7.

Fra virus-reduksjonsfaktorene av detergent- og varmebehandlingen beregnes en total-virus-reduksjonsfaktor på minst41,7. Inhibitorens biologiske aktivitet ble neppe påvirket av inaktiveringen av VSV-virus og utgjorde tilnærmet 100%.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av virus-inaktiveringskapasiteten av en inaktiveringsbehandling som omfatter minst én inaktiveringsmetode, idet reduksjonsfaktoren bestemmes ved hjelp av et testvirum, karakterisert ved at testviruset tilsettes flere ganger under minst én inaktiveringsmetode, og at de enkelte reduksjonsfaktorer av den minst ene inaktiveringsmetode adderes eventuelt med reduksjonsfaktorene av ytterligere inaktiveringsmetoder til en total virus-reduksjonsfaktor.