PL148434B1 - Method of obtaining polypeptide of ifn-alpha type - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydu typu IFN-a nadajacego sie do stosowania w srodkach przeciwwirusowych i przeciwnowotworowych uzytecznych w leczeniu chorób wirusowych, nowotworowych i rakowych.W opisie stosuje sie nomenklature interferonów opublikowana w Nature, 286, strona 2421 (10 lipca 1980). Nomenklatura ta zastepuje nomenklature stosowana we wczesniejszych opisach paten¬ towych, z których wynika pierwszenstwo niniejszego zgloszenia. Przykladowo, zamiast symbolu IF stosuje sie obecnie symbol IF, a interferon leukocytowy oznacza sie obecnie symbolem IFN-a.Znane sa dwie klasy interferonów („IFN"). Interferony klasyI sa malymi, trwalymi w srodowi¬ sku kwasnym glikoproteinami uodparniajacymi komórki na zakazenia wirusowe /A. Isaacs, J. Lindenmann, „VirusInterference I. The Interferon", Proc. Royal Soc. Ser. B., 147, strony 256-67 (1957) oraz W.E. Stewart, II, The Interferon System, Springer-Verlag(1979) (dalej „TheInterferon System")/. Choc w pewnym stopniu specyficzne dla komórki (The Interfern System, strony 135-145), IFN nie sa specyficzne dla wirusa, chroniac komórki przeciw szerokiemu spektrum wirusów.Interferony ludzkie („HuIFN") sklasyfikowano w trzech grupach, a, /3 i y.HuIFN-a (interfe¬ ron Leukocytowy) jest wytwarzany w komórkach leukocytów czlowieka i lacznie z mala iloscia HuIFN-/? (interferon fibroblastowy) w komórkach limfoblastów. HuIFN-a zostal oczyszczony do jednorodnosci i scharakteryzowany /np. M. Rubenstein i inni, „Human Leukocyte Interferon: Production, Purification And Initial Characterization", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, strony 640-44 (1979)/. Jest on heterogeniczny w sensie wielkosci, glównie z powodu czesci weglowodano¬ wej. Opisano dwa skladniki, jeden o ciezarze czasteczkowym 21000 do 22000 i drugi o ciezarze czasteczkowym 15 000 do 18 000.Skladnik o nizszym ciezarze czasteczkowym ma postac nie glikolizowana. Zachowuje on wiekszosc lub calosc czynnosci HuIFN-a /W.E. Stewart, II i inni, „Effect Of Glycosylation Inhibitors On The Production And Properties Of Human Leukocyte Interferon", Virology, 97, strony 473-76 (1979)/. Czesc sekwencji aminokwasów HuIFN-a z komórek limfoblastów zostala okreslona /K.C. Zoon i inni, „Amino Terminal Seauence Of The2 148 434 Major Component Of Human Lymphoblastoid Interferon", Science, 207, strony 527-28 (1980)/ oraz M. Hunkapiller i L. Hood, informacja osobista (1980).Doniesiono równiez, ze HuIFN-cr istnieje w kilku róznych postaciach (np. opis brytyjskiego zgloszenia patentowego nr 2 037 296 A). Postacie te róznia sie miedzy soba strukturalnie i fizjologi¬ cznie. Brak akceptowanych nazw tych postaci HuIFN-a. W niniejszym opisie bedzie sieje oznaczac numerem po ogólnym symbolu HuIFN-cr.HuIFN-cr moze byc, jak wiele bialek ludzkich, polimorficzny. Dlatego komórki poszczegól¬ nych osobników moga wytwarzacjednostki HuIFN-cr w zakresie ogólniejszej grupy HuIFN-a lub formy w zakresie grupy, które sa fizjologicznie podobne, lecz strukturalnie nieco rózne niz grupa lub forma, której czesc te jednostki stanowia. Takwiec choc struktura bialka HuIFN-a moze byc ogólnie dobrze zdefiniowana, poszczególni osobnicy moga produkowac HuIFN-cr bedacy jego nieznacznym wariantem. Tealleliczne warianty przypuszczalnie róznia sie miedzy soba mniej niz rózne formy HuIFN-cr.HuIFN w normalnych, zdrowych komórkach jest zwykle niewykrywalny (The Interferon System, strony 55-57). Bialko to jest produkowane w wyniku eksponowania komórki na dzialanie czynnika indukujacego IFN. Czynnikami indukujacymi IFN sa zwykle wirusy lecz moga one miec równiez niewirusowy charakter, jak naturalne lub syntetyczne dwuniciowe RNA, mikroby wew¬ natrzkomórkowe, produkty mikrobiologiczne i rózne czynniki chemiczne. Czyniono liczne próby wykorzystania tych niewirusowych czynników indukujacych do uodparniania komórek ludzkich na infekcje wirusowa /S. Baron i F.Dianzani, wydawcy, TexasReports On Biology And Medicine, 35 („TexasReports"), strony 528-40 (1977)/. Próby te nie daly dobrych wyników. Obecnie woli sie stosowac egzogenny HuIFN.Interferonowa terapie chorób wirusowych i nowotworowych prowadzi sie przy róznym rezi¬ mie dawkowania i przy róznym sposobie podawania (The Interferon System, strony 305-321).Przykladowo, efektywne jest podawanie interferonu doustnie, przez inokulacje - dozylna, domies¬ niowa, donozdrzowa, sródskórna i podskórna - oraz w postaci kropli doocznych, masci i aerozoli.Zwykle podaje sie go 1-3 razy dziennie, w dawce 104 do 107jednostek. Zakres terapii jest zalezny od pacjenta i kondycji. Przykladowo, infekcje wirusowe traktuje sie dawkami podawanymi jeden lub dwa razy dziennie w ciagu od kilku dni do dwóch tygodni, natomiast nowotwory traktuje sie dawkami podawanymi raz lub kilka razy dziennie w ciagu kilku miesiecy lub kilku lat. Terapia najskuteczniejsza dla danego pacjenta musi byc oczywiscie okreslona przez nadzorujacego lekarza, który uwzgledniajac takie czynniki, jak przebieg choroby, poprzednia terapia i reakcja pacjenta na interferon dobierze sposób podawania i rezim dawkowania.Jako czynnik przeciwwirusowy HuIFN stosuje sie w leczeniu zakazen dróg oddechowych (Texas Reports, strony 486-96); herpes simplex keratitis (TexasReports, strony 497-500); ostrego krwotocznego zapalenia spojówek (TexasReports, strony 501-10); varicella zoster (TexasReports, strony 511-15); infekcji cytomegalowirusowej (Texas Reports, strony 523-27); i hepatitis B (Texas Reporst, strony 516-22). Patrz równiez The Interferon System, strony 307-19. Jednakze stosowanie na duza skale IFN jako czynnika przeciwwirusowego wymaga wiekszych ilosci IFN niz dotychczas dostepne.Oprócz czynnosci przeciwwirusowej, HuIFN przejawia równiez inne dzialania. Przykladowo, antagonizuje efekt czynnika stymulujacego kolonie, inhibituje wzrost kolonii komórekkrwiotwór¬ czych i zaklóca normalne róznicowanie prekursorówgranulocytów i makrofagów (TexasReports, strony 343-49). Inhibituje równiez róznicowanie erytroidów w traktowanych DMSO komórkach bialaczki Frienda (Texas Reports, strony 420-28). HuIFN moze takze odgrywac role w regulacji odpowiedzi immunologicznej. W zaleznosci od dawki i czasu stosowania w stosunku do antygenu, HuIFN-cr moze oddzialywac zarówno immunopotencyjnie jak i immunosupresyjnie in vivo i in vitro (Texas Reports, strony 357-69).Ponadto zaobserwowano, ze specyficznie sensytyzowane limfocyty produkuja HuIFN-cr po kontakcie z antygenem. Taki indukowany antygenem HuIFN-cr móglby wiec byc regulatorem odpowiedzi immunologicznej, oddzialujac zarówno na poziom antygenu,jak i na ekspresje odpor¬ nosci komórkowej (TexasReports, strony 370-74). HuIFN zwieksza aktywnosc limfocytów zabija¬ jacych i zalezna od przeciwcial cytotoksycznosc komórkowa (R.R. Heberman i inni, „Augmenta- tion By Interferon Of Human Natural And Antibody Depandent Cell-Mediated Cytotoxicity",148 434 3 Nature, 277, strony 221-23 (1979); P.Beverley i D. Knight, „Killing Comes Naturally", Nature, 278, strony 119-20 (1979); Texas Reports, strony 375-80). Prawdopodobnie oba te mechanizmy biora udzial w immunologicznym ataku na komórki nowotworowe. Tak wiec bedac uzyteczny jako czynnik przeciwwirusowy u ludzi, HuIFN ma potencjalne zastosowanie w terapii przeciwnowot- worowej i przeciwrakowej (The Interferon System, strony 319-21). Obecnie wiadomo, ze IFN oddzialuja na wzrost wielu klas nowotworów u wielu zwierzat (The Interferon System, strony 292-304). Podobnie jak inne czynniki przeciwnowotworowe, wydaja sie one byc najbardziej efek¬ tywne przy nakierowaniu przeciw malym nowotworom. Czynnosc nowotworowa zwierzecych IFN jest zalezna od dawki i czasu, lecz zostala wykazana w stezeniach ponizej poziomu toksycznego.Prowadzi sie liczne badania i próby kliniczne przeciwnowotworowych i przeciwrakowych wlasci¬ wosci IFN. Obejmuja one terapie szeregu chorób zlosliwych, jak miesak kostny, ostra bialaczka szpikowa, szpiczak mnogi i choroba Hodgkina (Texas Reports, strony 429-35).Ponadto ostatnio wykazano, ze HuIFN powoduje regresje lokalnego nowotworu przy pod¬ skórnej injekcji w guzki nowotworowe u pacjentów z czerniakiem i rakiem piersi/T.Nemoto i inni, „Human Interferons And Intralesional Therapy Of Melanoma And Breast Carcinoma", Amer.Assoc. For. Cancer Research, Abs. nr 994, strona 246 (1979)/. Wprawdzie wyniki tych badan klinicznych sa zachecajace, jednakze przeciwnowotworowe i przeciwrakowe stosowanie IFN jest powaznie utrudnione brakiem odpowiednich ilosci oczyszczonego IFN.Obecnie HuIFN-a produkuje sie przez kmórki ludzkie hodowane w hodowli komórkowej lub przez leukocyty ludzkie pobierane od dawców krwi. Z 800 litrów hodowli komórek Namalva otrzymuje sie 2,6* 109 jednostek surowego HuIFN-cr (P.J.Bridgen i inni, supra). W bardzo duzych osrodkach krwi, np. w osrodku Finskiego Czerwonego Krzyza w Helsinkach, roczna zdolnosc produkcyjna surowego HuIFN-a wynosi 1011 jednostek. Poniewaz dawka typowa jest 3 • 106 jednostek na pacjenta dziennie, te zródla nie sa wystarczajace dla pokrycia handlowego zapotrze¬ bowania na HuIFN-a. Takwiec pozadane jest wytwarzanie HuIFN-a przez innych producentów.Poniewaz aktywnosc wlasciwa IFN-a jest wysoka, rzedu 4,0* 108 jednostek/mg, ilosc HuIFN-cr wymaganego w stosowaniach handlowych jest niska. Przykladowo, 100 g czystego HuIFN-a odpowiadaloby 3 do 30 milionom dawek.Ostatnie postepy w biologii molekularnej umozliwily wprowadzanie DNA kodujacego specy¬ ficzne niebakteryjne eukariotyczne bialka do komórek bakteryjnych. Ogólnie, w przypadku DNA innego niz wytworzone w drodze syntezy chemicznej konstrukcja takich czasteczek rekombinan- tów DNA obejmuje etapy wytworzenia jednoniciowej kopii DNA oczyszczonego messenger RNA (mRNA) odwzorcowujacego zadane bialko; konwersji cDNA w dwuniciowy DNA; przylaczenia DNA w odpowiednie miejsce nosnika klonujacego, z wytworzeniem czasteczki rekombinantu DNA. Taka transformacja moze umozliwic zywicielowi wytworzenie zadanego bialka.Technologiarekombinatów DNA otrzymano szereg niebakteryjnych bialek i genów u E. coli.Nalezy do nich bialko o czynnosci antygenowej determinanty proinsulinowej u szczura /„A Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, strony 3727-31 (1978)/, hormon wzrostu szczura /P.H. Seeburg i inni, „Synthesis Of Growth Hormone By Bacteria", Nature, 276, strony 795-98 (1978)/, reduktaza dihydrofolanowa myszy /A.C.Y.Chang i inni, „Phenotypic Expression In E. coli Of A DNA Seauence Coding For Mouse Dihydrofolate Reduc- tase", Nature, 275, strony 617-24 (1978)/, somatostatyna ludzka/K. Itakurai inni, „Expression In Escherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormone Somatostatin", Science, 198, strony 1056-63 (1977)/; Europejskie zgloszenie patentowe nrOOOl 929, 0001 930 i 0001 931 i pokrewne zgloszenia w innych krajach), polipeptydowe lancuchy A i B insuliny ludzkiej (D.V.Goeddel i inni, „Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesised Genes For Human Insulin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, strony 106-10 (1979) i europejskie i pokrewne opisy patentowe jak wyzej), antygeny wirusa ludzkiego hepatitis B (C.J. Burrelli inni, „Expression In Escherichia coli: Of Hepatitis B Virus DNA Seauences Cloned In Plasmid pBR322", Nature, 279, strony 43-7 (1979) i M. Pasek i inni, „Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E. coli", Nature, 282, strony 575-79 (1979), ludzki hormon wzrostu (D.V.Goeddel i inni, „Direct Expression In Escherichia coli Of A DNA Seauence Coding For Human Growth Hormone", Nature, 281, strony 544-51 (1979), antygen SV401 /T.M. Roberts i inni, „Synthesis Of Simian Virus 401 Antigen In Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, strony 5596-5600 (1979)/ oraz interferon4 148 434 fibroblastu ludzkiego (H11IFN-/J) (T.Taniguchi i inni, „Construction And Identification Of A Bacterial Plasmid Containing The Human Fibroblast Interferon Gene Seauence", Proc. Japan Acad., 55, Ser. B, strony 464-69 (1979) lacznie z informacja osobista 1980).Zaden z powyzszych procesów stosujacych rekombinantyDNA nie jest ukierunkowany, jak to ma miejsce w wynalazku, na synteze HuIFN-a. Synteza ta jest problemem, którym wynalazek sie zajmuje. Rozwiazanie tego problemu niejest ulatwione,jak w przypadku wyzej opisanych schema¬ tów rekombinantów DNA, dostepnoscia informacji o sekwencji, wymaganej do wytworzenia syntetycznego genu (np. genu somatostatyny) lub typu komórki lub wirusa bogatego w dana sekwencje DNA (np. antygenu wirusa hepatitis) lub mRNA (np. insuliny szczura) umozliwiajacych wytworzenie i identyfikacje klonów bakteryjnych zawierajacych zadany hybrydowy DNA lub ukladu umozliwiajacego selekcje zywicieli - E. coli wyrazajacych zadane bialko (np. reduktaze dihydrofolanowa myszy). Nie jest ono równiez ulatwione doniesieniem o plazmidzie zawierajacym sekwencje DNA hybrydyzujaca do mRNA z poli(A) RNA, który to mRNA produkowalby aktywny HuIFN-/3 w oocytach (np. interferon fibroblastowy). Rozwiazanie wynalazku nie jest równiez skierowne, jak sugeruje to Research Disclosure No. 18309, strony 361-62 (1979) na wytwarzanie czystego lub prawie czystego HuIFN-amRNA przed klonowaniem genu HuIFN-a.Nalezy wreszcie zwrócic uwage, ze dobór sekwencji DNA lub konstrukcji czasteczki rekombi- nantu DNA, który hybrydyzuje do mRNA z poli A RNA, który to mRNA produkuje aktywny HuIFN w oocytach, nie jest wystarczajacy do wykazania, ze sekwencja DNA lub hybrydowy insert czasteczki rekombinantu DNA odpowiadaja HuIFN. Jedynie produkcja polipeptydu wykazuja¬ cego immunologiczna lub biologiczna czynnosc HuIFN moga wykazac, ze dobrana sekwencja DNA lub skonstruowana czasteczka rekombinatu DNA odpowiadaja HuIFN. Co istotniejsze, dopiero po wykazaniu czynnosci HuIFN mozna stosowac sekwencje DNA, zrekombinowana czasteczke DNA lub odpowiadajace im sekwencje do selekcji innych sekwencji kodujacych HuIFN.Z powyzszego wynika, ze problem wytwarzania HuIFN-a przy zastosowaniu technologii rekombinowania DNA znacznie rózni sie od procesów wyzej opisanych. Sekwencje DNA o nieznanej strukturze, kodujace ekspresje HuIFN-a, którymi stransformowano odpowiedniego gospodarza, hodowanego sposobem wedlug wynalazku, zostaly znalezione i wydzielone z wysoce zlozonej mieszaniny sekwencji DNA. Identyfikacja i wydzielenie zadanych sekwencji bylo utrud¬ nione z uwagi na niezwykle niskie stezenie zadanej sekwencji oraz brak skutecznych sposobów szybkiego analizowania wielu sekwencji DNA w mieszaninie.Rozwiazanie wedlug wynalazku umozliwia otrzymanie polipeptydu/ów/ o immunologicznej lub biologicznej aktywnosci HuIFN-a w ilosciach i sposobem dotychczas nieosiagalnym.Wedlug wynalazku sposób wytwarzania polipeptydu typu IFN-a polega na tym, ze prowadzi sie hodowle organizmu gospodarza stransformowanego zrekombinowana czasteczka DNA zawie¬ rajaca sekwencja DNA wybrana z: a) insertów DNA nastepujacych zrekombinowanych czasteczek: Z-pBR322 (Pst) /HcIF-2h [DSM 1700], Z-pBR322 (Pst) /HcIF-SN35 [DSM 1701], Z-pBR322 (Pst) /HcIF-SN42[DSM 1702] i Z-pKT287 (Pst) /HcIF-2h-AH6 [DSM 1703], b) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wyzej podanymi insertami i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz c) sekwencji DNA, które sa zdegenerowane w wyniku degeneracji kodu genetycznego i odpowiadaja insertom DNA i sekwencjom DNA okreslonym w a) i b) i które koduja polipeptyd typu IFN-a, polaczona z sekwencja kontrolujaca ekspresje, przy czym hodowle prowadzi sie w srodowisku i w warunkach odpowiednich dla danego gospodarza, po czym zbiera sie wytworzony w srodowisku hodowli polipeptyd. Korzystnie sekwencja DNA okreslona powyzej w b) wybrana jest z: d) insertów DNA zrekombinowanych czasteczek Z-pBR322 (Pst) /HcIF-II-206 [ATCC 31633] i Z-pBR322 (Pst) /HcIF-SN35-AHL6 [ATCC 31634], e) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wymienionymi insertami i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz f) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degeneracji kodu genetycznego i odpowiadaja¬ cych insertom i sekwencjom okreslonym w d) i e) i kodujacych polipeptyd typu IFN-a. Korzystna sekwencja DNA okreslona powyzej w b) lub e) wybrana jest sposród:148 434 5 g) Hindlll fragmentu Hif-chr3 [DSM1914], EcoRI fragmentu Hif-chrl2[DSM1915], Hindlll fragmentu Hif-chrl2 [DSM 1916], EcoRI fragmentu Hif-chrl3 [DSM 1917], EcoRI fragmentu Hif-chr23 [DSM 1918], Hindlll fragmentu Hif-chr23 [DSM 1919], EcoRI fragmentu Hif-chr26 [DSM 1920], Hindlll fragmentu Hif-chr26 [DSM 1921], Hindlll-BamHI fragmentu Hif-chr35 [DSM 1922], BamHI fragmentu Hif-chr35 [DSM 1923], Tac-Tacfragmentu Hif-chr23 [ATCC 31760], Bglll-Bglll fragmentu Hif-chrlO I [ATCC31761], Hindlll-Hindlll fragmentu Hif-chrlOr [ATCC 31762], Bglll-Bglll fragmentu Hif-chr26 [ATCC31763], Hindlll-Hindlll fragmentu Hif- chr30 [ATCC 31764], Bglll-Tacfragmentu Hif-chrl3 [ATCC31765] i Bglll-Tacfragmentu Hif- chrl6 I [ATCC31766] h) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wyzej wymienionymi sekwencjami DNA i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz i) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degeneracji kodu genetycznego i odpowiadaja¬ cych insertom i sekwencjom DNA okreslonym w g) i h) i kodujacych polipeptyd typu IFN-a, j) hybrydyzujacych czesci chromosomowych sekwencji DNA Hif-chrl9 i Hif-chr27, k) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wyzej wymienionymi sekwencjami DNA i koduja polipeptyd typu IFN-a i 1) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degeneracji kodu genetycznego odpowiadaja¬ cych insertom i sekwencjom DNA okreslonym w g) i h) i kodujacych polipeptyd typu IFN-a.Korzystna sekwencja DNA wchodzaca w sklad zrekombinowanej czasteczki DNA, która jest stransformowany gospodarz hodowany sposobem wedlug wynalazku, wybrana jest sposród sek¬ wencji DNA o wzorach: ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGCAAGTGAAGCTGCT CTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCAGAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTGATGCTCCT GGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGATTT CCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATG AGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGA GGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGT GTGATGCAGGAGGAGAGGGTGCGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGCCTG TGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCC TGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCAAGAAAG ATTAAGGAGGAAGGAA, TGTGATCTCCCTGAGACCCACACCCTGGATAACAGGAGGACCTT GATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACT TTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTC CTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTC ATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCT GAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAA TGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGA GAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTC TTTATCAACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA, TTACTGGTGGCCCTCCT GGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCT GGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTG CTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAA GGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCAC AAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTA CCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCC CCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTAT CTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGA TCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA,TGTGATCTGC CTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAAT CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGC AACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCA ATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTA CACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTG6 148 434 ACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAA TCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGA AATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA, ATGGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGGCCGTGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCATCTGTT CTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGACCTTGATACTCCT GCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGATTTCGGATTC CCCGAGGAGGAGTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGA GATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAG AGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTG TGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGT GAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCC TGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAAAAAA GATTAAGGAGGAAGGATi TGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGAC CTTGATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACAT GATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAGACTCAAGCCATCT CTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGC TGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATGAC CTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACT CCATCCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATA CAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACA AACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGAT..Jako uklad kontrolujacy ekspresje w zrekombinowanej czasteczce DNA korzystnie wykorzy¬ stany jest uklad lac, uklad /Mac, uklad trp, znaczne regiony operatora i promotora faga A, region kontrolny bialka otoczki fd i inne sekwencje, które kontroluja ekspresje genów w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych i ich wirusach.Korzystnie gospodarz hodowany sposobem wedlug wynalazku stransformowany jest zre- kombinowana czasteczka DNA wybrana sposród C8-IFN-al, C8-IFN-cr2, LAC-AUG(cr2) i /3-lac-AUG(a2).Na zalaczonych rysunkach fig. 1 przedstawia schemat wytwarzania mieszaniny czasteczek zrekombinowanych DNA, z których niektóre charakteryzuja sie insertowanymi sekwencjami DNA kodujacymi polipeptydy typu IFN-a, fig. 2 przedstawia sposób wstepnego skriningu klonu, fig.3 przedstawia schemat jednego z wykonan skriningu klonu, fig. 4 przedstawia mape restryk¬ cyjna klonów wedlug wynalazku /nie oznaczono absolutnej pozycji wszystkich punktów restrykcji w tym klonie, bardziej absolutne punkty restrykcji sa przedstawione na fig. 8-10/, fig. 5 przedstawia schemat procesu okreslania orientacji insertu DNA w jednej ze zrekombinowanych czasteczek DNA, transformujacych gospodarza hodowanego sposobem wedlug wynalazku, fig. 6 przedstawia czesciowa sekwencje nukleotydów kilku nosników klonujacych uzytecznych w sposobie wedlug wynalazku, fig. 7 przedstawia wyniki frakcjonowania na nosniku Sephadex C-100 supernantantu otrzymanego z hodowli bakteryjnej prowadzonej sposobem wedlug wynalazku, fig. 8-10 przedsta¬ wiaja sekwencje nukleotydów insertu DNA w czasteczce zrekombinowanej DNA transformujacej gospodarza hodowanego sposobem wedlug wynalazku (sekwencje sa numerowane od nukleotydu nastepujacego po „ogonie" polyC 5' do nukleotydu przed resztami polyA i ogonami polyC 3'.Nukleotydy 57-125 reprezentuja sekwencje sygnalna, a nukleotydy 126-626 reprezentuja „dojrzaly" interferon i kodon stopujacy. Sekwencje aminokwasowe sekwencji sygnalnej i sekwencji „dojrza¬ lego" interferonu przedstawiono nad odpowiednimi sekwencjami nukleotydowymi. Na fig. 8-10 przedstawiono równiez miejsca w genach rozpoznawane przez rózne endonukleazy restrykcyjne.Punkty te sa umiejscowione dokladniej niz przedstawione na fig. 4.Figura 11 przedstawia schematyczne porównanie map restrykcyjnych dwóch insertów DNA zrekombinowanych czasteczek DNA transformujacych gospodarza hodowanego sposobem wed¬ lug wynalazku, a fig. 12-16 przedstawiaja sekwencje nukleotydów insertów DNA zrekombinowa¬ nych czasteczek DNA. Sekwencje sa numerowane od nukleotydu nastepujacego po ogonie polyC 5' do nukleotydu poprzedzajacego reszty polyA i ogony poly 3'. Sekwencje aminokwasowa kazdego z tych insertów przedstawiono powyzej sekwencji nukleotydów, odcinek odpowiadajacy sekwencji sygnalnej malymi literami, a odcinek odpowiadajacy sekwencji „dojrzalego" interferonu literami duzymi.148 434 7 Figura 17 przedstawia czesciowa mape restrykcyjna Z-pBR322-Pst /HcIF-II-206 i strategie sekwencjonowania przyjeta dla oznaczania sekwencji nukleotydów fragmentu Hif-II-206 przed¬ stawionego na fig. 12-16, fig. 18 przedstawia czesciowe mapy restrykcyjne serii hybrydowych fagów hybrydyzujacych do fragmentu Hif-2h, fig. 19 przedstawia czesciowa mape restrykcyjna hybrydo¬ wego insertu Z-pBR322Pst/HchrIF-35HB i strategie sekwencjonowania przyjeta dla okreslenia jego sekwencji nukleotydów, fig. 20-23 przedstawiaja sekwencje nukleotydów fragmentu HchrlF- 35HBa i pochodzaca od niej sekwencje aminokwasowa, fig. 24 przedstawia czesciowe mapy polaczen genów HuIFN-cr (Strzalki ukazuja obszary, które tworza petle R z wprowadzonym leukocytowym poli(A) RNA. Pasmo zakreskowane wskazuje sekwencje, która zostala wywie¬ dziona nie z kartografii petli R, lecz z blotingu).Figura 26 przedstawia schemat konstrukcji plazmidu LAC-AUG(a2), fig. 27 przedstawia rekonstrukcje kodonu inicjacyjnego AUG i kodonu inicjalnego CYS w konstrukcji LAC- AUG(a2), fig. 28 przedstawia schemat konstrukcji plazmidu C8-IFN-a2 i hybrydowe czasteczki I, II, III i IV, a fig. 29-32 przedstawiaja sekwencje nukleotydowa i kodowana przez nia sekwencje aminokwasowa IFN-a4b i jego sekwencji sygnalowej.W nizej przedstawionym, szczególowym opisie wynalazku uzyto nastepujacych terminów: Nukleotyd - monomeryczna jednostka DNA lub RNA, skladajaca sie z jednostki cukrowej (pentozy), fosforanu i heterocyklicznej zasady azotowej. Zasada jest polaczona z jednostka cuk¬ rowa przez glikozydowy atom wegla (atom wegla 1' pentozy). Te kombinacje zasady i cukru nazywa sie nukleozydem. Kazdy nukleotyd charakteryzuje sie swa zasada. Czterema zasadami DAN sa adenina („A"), guanina („G"), cytozyna („C")i tymina („T").Czterema zasadami RNA sa A, G, C i uracyl („U").Sekwencja DNA - liniowy szereg nukleotydów polaczonych ze soba wiazaniami fosfodwues- trowymi miedzy atomami wegla 3' i 5' przyleglych pentoz.Kodon - sekwencja DNA trzech nukleotydów (triplet) kodujaca poprzez mRNA aminokwas, sygnal rozpoczecia translacji lub sygnal zakonczenia translacji. Przykladowo, triplety nukleoty- dowe TTA,TTG, CTT, CTC, CTA i CTG koduja aminokwas leucyne („Leu"), TAG,TAAi TGA sa sygnalami stop translacji, a ATG jest sygnalem startu translacji.Porzadek odczytu - zgrupowanie kodonów w trakcie translacji mRNA w sekwencje amino- kwasowe. W trakcie translacji musi byc zachowany odpowiedni porzadek odczytu. Przykladowo, sekwencja GCTGGTTGTAAGmoze byc translatowana w trzy porzadki odczytu, z których kazdy daje inna sekwencje aminokwasowa, mianowicie: GCT GGT TGT AAG — Ala—Gly-Cys-Lys; G CTG GTT GTAAG — Leu-Val-Val;GC TGG TTG TAA G — Trp-Leu-(STOP).Polipeptyd - liniowy lancuch aminokwasów polaczonych ze soba wiazaniami peptydowymi miedzy grupami cr-aminowa i karboksylowa przyleglych aminokwasów.Genom - calosc DNA komórki lub wirusa. Obejmuje miedzy innymi geny strukturalne kodujace polipeptydy substancji, jak równiez sekwencje operatora, promotora i wiazania i interak¬ cji rybosomów, w tym równiez sekwencje takie, jak sekwencje Shine-Dalgarno.Gen strukturalny - sekwencja DNA kodujaca poprzez swój mRNA sekwencje aminokwasów charakterystyczna dla okreslonego polipeptydu.Transkrypcja- proces produkcji mRNA z genu strukturalnego.Translacja - proces produkcji polipeptydu z mRNA.Ekspresja - proces, jakiemu ulega gen strukturalny dla wytworzenia polipeptydu. Jest to polaczenie transkrypcji i translacji.Plazmid - niechromosomalna dwuniciowa sekwencja DNA, obejmujaca nienaruszony „repli- kon", umozliwiajacy replikacje plazmidu w komórce zywiciela. Gdy plazmid zostaje umiejsco¬ wiony w organizmie jednokomórkowym, charaktrystyka tego organizmu moze ulec zmianie lub transformacji pod wplywem DNA plazmidu. Przykladowo, plazmid niosacy gen opornosci na tetracykline (TetR) transformuje komórke wrazliwa na tetracykline w komórke oporna na nia.Komórka transformowana przez plazmid jest nazywana „transformantem".Fag lub baktriofag - wirus bakteryjny, z których liczne skladaja sie z sekwencjami DNA w otoczce bialkowej („kapsydzie").Nosnik klonujacy - plazmid, DNA faga lub inne sekwencje DNA zdolne do replikacji w komórce zywiciela, charakteryzujace sie punktami rozpoznawania endonukleazy, w których takie8 148 434 sekwencje DNA moga byc ciete w mozliwy do okreslenia sposób, bez towarzyszacej temu utraty istotnej funkcji biologicznej DNA, np. replikacji, produkcji bialek otoczki lub utraty punktów promotorowych lub wiazacych i które zawieraja marker odpowiedni do uzycia w identyfikacji transformowawnych komórek, np. opornych na tetracykline lub ampicyline. Nosnik klonujacy czesto nazywa sie wektorem.Klonowanie - proces otrzymywania populacji organizmów lub sekwencji DNA pochodzacych z jednego z takich organizmów lub sekwencji w drodze reprodukcji bezplciowej.Czasteczka rekombinantuDNA lub hybrydowy DNA - czasteczka skladajaca sie z segmentów DNA z róznych genomów, polaczonych koniec - z - koncem poza zywymi komórkami, majaca zdolnosc infekowania pewnych komórek zywiciela i pozostawania w nich.Sekwencja kontroli ekspresji - sekwencja nukleotydów kontrolujaca i regulujaca ekspresje genów strukturalnych po operatywnym przylaczeniu do tych genów. Naleza do nich system lac, system trp, duze obszary operatora i promotora faga A, region kontrolny bialka otoczki fd i inne sekwencje kontrolujace ekspresje genów komórek prokariotycznych lub eukariotycznych i ich wirusów.Na figurze 1 przedstawiono schemat jednego z wykonan sposobu wytwarzania mieszaniny czasteczek rekombinantu DNA, z których pewne charakteryzuja sie wprowadzonymi sekwencjami DNA kodujacego polipeptydy o immunologicznej lub biologicznej czynnosci ludzkiego interfe¬ ronu leukocytowego.Wytwarzanie poli(A) RNA zawierajacego mRNA ludzkiego interferonu (IFN-amRNA).Leukocytyludzkie indukowano w ciagu 5 godzin w 37°C wirusem Sendai i esktrahowano, otrzymu¬ jac mieszanine poli(A)RNA zawierajaca mRNA interferonu leukocytowego („HuIFN-amRNA").Indukcje prowadzono wedlug procedury Cantella (The Interferon System, strony 130-31 i cyto¬ wane tam odnosniki). Mieszanina poli(A) RNA jest przedstawiona, bez uwzglednienia rzeczywi¬ stych proporcji, na fig. 1. Indukowane leukocyty zebrano i 10 komórek ponownie przeprowa¬ dzono w zawiesine w 1 litrze roztworu zawierajacego 8 g NaCl, 0,2 g KC1,1,15 g Na2HPC4 • 2H2O i 0,2 g KH2PO4 rozpuszczonych w 1 litrze wody („PBS"), a zawiesine powoli, przy energicznym mieszaniu, dodano do 17 litrów 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), ImM EDTA („bufor TE"), 2% dodecylosiarczanu sodu („SDS") w 50 litrowym rozdzielaczu. Dodano samostrawionej Pronazy (Calbiochem), w ilosci odpowiadajacej 200//g/ml i mieszano roztwór w temperaturze pokojowej w ciagu godziny. Jako marker dla odzyskiwania poli(A) RNA i kontroli degradacji mRNA w nastepnych etapach dodano 125J-globinamRNA, w ilosci 106 impulsów/minuta („cpm"). Dodano 2M Tris-HCl (pH 9), w ilosci równej 1/20 objetosci sumarycznej („1/20 vol") i przy energicznym mieszaniu, w ciagu 10 minut ekstrahowano mieszanine 15 litrami redestylowanego fenolu. Dodano 1 litr chloroformu i mieszano mieszanine w ciagu 5 minut. Po 30 minutach rozdzialu faz odlaczono faze -wodna i ponownie ekstrahowano ja fenolem i chloroformem. Otrzymana faze wodna, w sumarycznej objetosci 19,1 litra, zmieszano z 60 g SDS. Kwasy nukleinowe wytracono z fazy wodnej za pomoca 1/10 objetosci 3M octanu sodu (pH 5,5) i 2 objetosci etanolu.Po przechowywaniu w ciagu nocy w -20°C, wytracony wlóknisty osad kwasów nukleinowych usunieto przez saczenie przez plastikowe sitko do herbaty. Ten material mieszano nastepnie z 200 ml TNE (50 mM Tris-HCl(pH 7,5), lOOmM NaCl, 5 mM EDTA)zawierajacymi 0,5% SDS. Po dodaniu dalszych 350 ml tego roztworu material rozpuscil sie. Niewlóknisty osad zebrano przez wirowanie w 1 litrowych butlach Sorvall, w wirówce Sorvall RC-3, w ciagu 15 minut z szybkoscia 5 000 obrotów na minute i rozpuszczono w 350 ml TNE zawierajacych 0,3% SDS. Oba roztwory TNE polaczono i ekstrahowano trzykrotnie 1 objetoscia fenolu, trzykrotnie 1/2 objetosci eteru i trzykrotnie 1 objetoscia eteru. W sumie odzyskano z fazy wodnej 775 mg RNA, z pomiaru przy 260 nm.Izolacje mieszaniny poli(A) RNA uzyskano przez powtarzana adsorpcje partiami na oligo (dT)celulozie (typ 7. Biochemicals, Inc.). 2,7 g oligo (dT) celulozy dodano do 500 ml, tj. okolo polowy wyzej opisanego roztworu zawierajacego RNA. Po mieszaniu w ciagu godziny w tempera¬ turze pokojowej, dla wywolania adsorpcji poli(A) RNA na oligo (dT) celulozie, celuloze i miesza¬ nine zwiazanych na niej mRNA odwirowano i przemyto wpierw 50 ml TNA, a nastepnie 15 ml TNE. Zwiazany poli(A) RNA eluowano piecioma kolejnymi przemyciami 2 ml H2O. Wydajnosc wyniosla 860//g poli(A) RNA, z pomiaru gestosci optycznej (preparat A). Supernatantowy roztwór148 434 9 RNA z pierwszej adsorpcji poddano dwóm dalszym cyklom adsorpcji, dokladnie jak wyzej opi¬ sano. Druga i trzecia adsorpcja daly odpowiednio 600/ig i 170//g RNA. Materialy te polaczono (preparat B).RNA zbadano na zawartosc HuIFN-crmRNA przez injekcje do oocytów Xenopus laevis (The Interferon System, strony 93-95): RNA rozpuszczono w 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 88 mM NaCl („bufor TNK"), otrzymujac stezenie okolo 1 mg/ml. 50 ni powyzszego roztworu wstrzyknieto do 50 oocytów. Oocyty inkubowano w ciagu nocy w temperaturze pokojowej w pozywce Bartha /Gur- don, J. Embryol and Exper. Morph., 20, strony 401-414 (1968) i Barth, J. Embryol and Exper.Morph., 7, strony 210-222 (1959)/. Inkubowane oocyty przeplukano i homogenizowano za pomoca pipety Pasteura w probówce wirowniczej Eppendorfa, w 0,5 ml 52 mM buforu Tris-glicyna (pH 8,9). Mieszanine wirowano w ciagu 2 minut w wirówce Eppendorfa, a supernatant zebrano i zamrozono w -20°C, do badan. Aktywnosc IFN-cr oznaczono metoda redukcji plytek, opisana przez H. Strandera i K. Cantella, „ProductionOf Interferon By Human Leukocytes In Vitro", Ann.Med. exp. Fenn., 44, strony 255-73 (1966). Jednajednostka IFN-cr redukujeplytki wirusowe o 50%.Moc preparatu INF-cr wyraza sie w odniesieniu do ludzkiego odnosnika HuIFN-cr 69/19 (Interna¬ tional Symposium on Standarization of Interferon and Interferon Inducers, 1969).Alternatywnie, próba bazuje na zmniejszeniu efektu cytopatycznego, a przeprowadza sieja zasadniczo jak opisali W.E. Stewart, II i S.E. Sulkin, „Interferon Production In Hamsters Experi- mentally Infected With Rabies Virus", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 123, strony 650-3 (1966) z tym, ze stosuje sie komórki ludzkie CCL-23, a zakazenia dokonuje wirusem Mengo. Ekstrakt oocytów mial aktywnosc 300 jednostek miedzynarodowych (IU) IFN-cr na fjg wstrzyknietego RNA. W dalszych próbach inkubacje oocytów z wstrzyknietym roztworem RNA prowadzono w ciagu 48 godzin i badano jedynie pozywke inkubacyjna, poniewaz wiekszosc interferonu jest wydalana przez oocyty /A. Colman i J. Morser, „Export Of Proteins From Oocytes Of Xenopus Laevis", Celi, 17, strony 517-26 (1979)/. W celu dalszego oczyszczenia poli(A) RNA, do preparatu A poli(A) RNA dodano 0,5 M kwasu etylenodwuaminoczterooctowego („EDTA"), w takiej ilosci, by jego stezenie wynioslo 5 mM. Otrzymany roztwór dwukrotnie ekstrahowano fenolem nasyconym TNE i pieciokrotnie eterem, stosujac czynnik ekstrahujacy w kazdym przypadku w objetosci równej objetosci ekstrahowanego roztworu.Nastepnie roztwór przepuszczono przez kolumne 0,1 ml Chelex-100 Bio-Rad, ogrzewano w ciagu 90 sekund w 100°C i nawarstwiono na 13 ml gradientu 5-23% sacharozy, zawierajacego 50 mM Tris-HCl(pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl. Jako markery wielkosci dodano 10 000 cpm 5'-terminalnie 32P-oznaczonych fragmentów DNA otrzymanych przez równoczesne trawienie pBR322 enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Pstl (New England Biolabs). Wirowanie prowadzono w ciagu 16 godzin w rotorze SW40 w 10°C, przy 35 000 obrotach na minute. Zbierano frakcje 0,6 ml za pomoca kolektora gradientowego ISCO, z szybkoscia 1 ml/min. Frakcje badano na HuIFN- amRNA, jak opisano powyzej i odnotowywano ich polozenie wzgledem markerów32P-DNA, dla odniesienia w przyszlosci. W nastepnych wirowaniach frakcje zawierajace HuIFN-crmRNA identy¬ fikowano w stosunku do markerów. Frakcje z aktywnoscia HuIFN-crmRNA zawieraly 80/jg poli(A) RNA. Zmieszano je z dwiema objetosciami TNE zawierajacymi 0,5% SDS i 0,02% siarczanu poliwinylu (w pózniejszych preparatach siarczan poliwinylu pominieto) i naniesiono na kolumne 50fjl oligo(dT)celulozy. Po przemyciu kolumny, jak wyzej opisano, eluowano 40//g mieszaniny RNA czterema przemyciami po 0,6 ml sterylnej wody destylowanej. Po wytraceniu etanolem RNA rozpuszczono w 0,5 mM EDTA, do stezenia 1 mg/ml.Na czesci wytraconego poli(A) RNA przeprowadzono, w wyzej opisany sposób, oznaczenie aktywnosci HuIFN-crmRNA. Mial on aktywnosc wlasciwa 3 600 Ul interferonu///g wstrzyknie¬ tego RNA. Takwiec gradient sacharozy wzbogacil poli(A) RNA okolo 10-krotnie w stosunku do HuIFN-cr mRNA. W nastepnym, podobnym preparacie uzyskano okolo 40-krotnie wzbogacenie.Preparat B oczyszczono podobnie, a poniewaz mial on aktywnosc wlasciwa podobna jak preparat A, oba te preparaty polaczono. W tym momencie nalezy zauwazyc, ze nawet produkt poli(A) RNA otrzymany z gradientu sacharozy zawiera bardzo duza liczbe róznych mRNA. Oprócz mRNA specyficznego dla IFN-cr, pozostale mRNA sa niepozadanymi zanieczyszczeniami (fig. 1). Niestety, w pozostalych etapach procesu klonowania wedlug wynalazku te zanieczyszczajace RNA zacho¬ wuja sie podobnie jak HuIFN-crmRNA. Tak wiec ich obecnosc w poli(A) RNA powoduje10 148 434 obecnosc w koncowym preparacie duzej liczby niepozadanych klonów bakteryjnych, które zawie¬ raja geny kodujace polipeptydy inne niz IFN-a. Te zanieczyszczenia stwarzaja skomplikowane problemy skriningu w izolacji zadanych klonów hybrydowych IFN-a.W przypadku IFN-a problem skriningu dalej komplikuje brak odpowiednio oczyszczonej próbki HuIFN-amRNA lub DNA lub ich czesci, które moglyby stanowic próbnik skriningowy do identyfikacji zadanych klonów, W zwiazku z tym proces skriningu klonów IFN-a jest bardzo czasochlonny i trudny. Dalej, poniewaz mozna oczekiwac, ze jedynie bardzo maly procent klonów IFN-a bedzie dawac IFN-a w postaci biologicznie lub immunologicznie czynnej, izolacja aktyw¬ nego klonu jest procesem skriningowym „poszukiwania igly w stogu siana".Korzystnie, do uzyskiwania oczyszczonej próbki HuIFN-amRNA lub cDNA lub ich czesci mozna zastosowac technologie rekombinantu DNA. Oczyszczony mRNA lub cDNA moze byc uzyty do szybkiego skriningu bardzo duzej liczby klonów bakteryjnych i przez to znacznego zwiekszenia proawdopodobienstwa izolacji klonu wytwarzajacego IFN-a w postaci aktywnej.Synteza mieszaniny cDNA zawierajacej HuIFN-acDNA. Poli(A) RNA wzbogacony w IFN- amRNA (preparaty A+B) uzyto jako wzorzec do sporzadzenia jednoniciowego, komplementar¬ nego DNA (cDNA) (fig. 1) (patrz A. Efstratiadis i inni, „Fuli Lenght And Discrete Partial Reverse Transcripts Of Globin And Chorion mRNAs", Celi, 4, strony 367-78 (1975) i cytowane tamze odnosniki). 800 fil mieszaniny reakcyjnej zawieralo 40 mM Tris-HCl(pH 7,5), 30 mM NaCl, 5 mM MgCl2,0,5 mM DTT (Cal-Biochem), 20//g/ml oligo dT7 12-18 (P&L Biochemicals), 5 mM dGTP (Schwarz), dCTP (Laevosan) i dTTP (Sigma), 5mM 32P-dATP (NEN, aktywnosc wlasciwa 100 000 cpm/nmol), 60//g/ml poli(A) RNA i 280jednostek odwrotnej traskryptazy wirusa ptasiego myeloblastosis (AMV) (dar Life Sciences, Inc., St. Petersburg, Florida). Po inkubacji w ciagu godziny w 37°C dodano 0,5 m EDTA i 20% SDS (rekrystalizowanego), do 10 mM EDTA i 0,1% SDS. Mieszanine ekstrahowano 1 objetoscia fenolu (destylowanego).Faze fenolowa przemyto 200//l 200 mM Tris-HCl(pH 7,5), 1 mM EDTA i 0,1% SDS, a fazy wodne polaczono. Poddanoje ekstrakcji taka sama objetoscia eteru (Fluka, pro anal.) i chromato- grafowano na kolumnie z 5 ml nosnika Sephadex G-100 w TNE. Z szybkoscia 0,3 ml/minuta odbierano frakcje 0,1 ml. Frakcje przejawiajace radioaktywnosc (z pomiaru promieniowania Cze- renkowa) polaczono i dodano 3 M octanu sodu, do 0,3 M. 2,5 objetosciami etanolu wytracono kwasy nukleinowe. Po przechowywaniu w ciagu nocy w -20°C próbki odwirowano, odrzucajac supernatant. Osad rozpuszczono w 180//l destylowanej wody i przeniesiono do silikonizowanej probówki Eppendorfa. Dodano 20//l 5M NaOH i w ciagu 40 minut utrzymywano mieszanine w temperaturze pokojowej. Dodano 20//l 5M octanu sodu, 100//l destylowanej wody i 500//l etanolu.Po utrzymywaniu w ciagu nocy w -20°C wytracony osad odwirowano z sila równowazna 10 000-krotnej sile grawitacji (10 000 g), w ciagu 20 minut w 0°C. Wydajnosc jednoniciowego cDNA wyniosla 10//g.Ponownie, nalezy zdac sobie sprawe, ze powyzszy jednonicieniowy cDNA jest w rzeczywi¬ stosci zlozona mieszanina duzej liczby róznych cDNA transkrybowanych z odpowiednich mRNA obecnych w mieszaninie RNA (fig. 1). Jedynie bardzo nieliczne sposród tych cDNA sa skorelowane z IFN-a, tj. sa HuIFN-acDNA. Inny czynnik równiez komplikuje mieszanine cDNA - kazdy z mRNA mieszaniny poli(A) RNA zwykle nie jest transkrybowany calkowicie. Dla kazdego mRNA proces transkrypcji moze byc zatrzymany przed osiagnieciem konca mRNA. Tak wiec z kazdego mRNA moze byc wytworzona duza liczba róznych cDNA (czego nie ukazano na fig. 1). Kazdy z nich bedzie sie zachowywal mniej wiecej podobnie w nastepnym procesie klonowania, w wyniku czego beda produkowane klony bakteryjne zawierajace czasteczki rekombinantu DNA majace jedynie fragment genu danego bialka. Obecnosc tych zawierajacych fragmenty klonów dalej komplikuje proces skriningu klonu finalnego.Wielkosc róznych jednonicieniowych cDNA oznaczono w drodze elektroforezy malej próbki na zasadowym zelu zawierajacym 2% agarozy, stosujac jako elektrolit 30 mM NaOH, 2 mM EDTA /M.W. McDonell i inni, „Analysis Of Restriction Fragments Of T7 DNA And Determination Of Molecular Weights By Electrophoresis In Neutral And Alkaline Gels", J. Mol. Biol., 110, strony 119-46 (1977)/. 32P-cDNA mial dlugosc 600-1000 nukleotydów, w odniesieniu do jednoniciowego cDNA globiny i znakowanych P fragmentów DNA, uzytych jako markery wielkosci.148 434 11 Wytwarzanie dwuniciowego cDNA. Jednoniciowy cDNA mozna przeprowadzic w dwunicie- niowy, dzialajac DNA polimeraza I /T. Maniatis i inni, „Amplification And Characterization OfA /3-Globin Gene Synthesised In Vitro",Celi, 8, strony 163-82 (1976)/. Wytracony jak wyzej jednoni¬ ciowy cDNA rozpuszczono w 200 /jl H2O, ogrzewano w 100°C w ciagu 2 minut i inkubowano w 500//l 0,1 M denaturowanego cieplem buforu fosforanowego (pH 6,9), 10 mM MgCb, 10 mM DTT (Calbiochem), 1 mM dATP (Merck), ImM dGTP (Schwarz) i 1 mM dCTP (Laevosan), 1 mM 3H-dTTP (NEN, aktywnosc wlasciwa 100 000 cpm/nmol) oraz 150jednostek/ml DNA polimerazy I E. coli (Boehringer-Mannheim). Po 6,5 godzinach w 15°C dodano 0,5 M EDTA i 20% SDS, do 10 mM EDTA i 0,1% SDS. Nastepnie mieszanine ekstrahowano 500//l fenolu, a faze fenolowa ekstrahowano zwrotnie 250jul 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5mM EDTA („bufor TE"). Obie fazy wodne polaczono i chromatografowano na 5 ml kolumnie Sephadex G-100, w wyzej opisanych warunkach. Dodano octanu sodu (3M) do 0,3 M i zmieszano z 2,5 objetosciami etanolu, wytracajac DNA. Uzyskano sumarycznie 13//g DNA.Otrzymany DNA potraktowano nukleaza Si, sporzadzona metoda R.C. Wieganda i innych, „Specifity OfThe Si Nuclease From Aspergillus oryzal", J.Biol.Chem., 250, strony 8848-55 (1975).Wytracony DNA rozpuszczono w 250/ii buforu Si (0,2 M NaCl, 50 mM octanu sodu (pH 4,5), 10 mM siarczanu cynku) i w ciagu 30 minut ogrzewano w 37°C. Dodano 1,5//l enzymu Si (11 jednostek//A) i w ciagu 30 minut inkubowano mieszanine w 37°C, dodano SDS i EDTA do 0,1% SDS i 5mM EDTA, po czym ekstrahowano mieszanine 250//l fenolu. Faze fenolowa przemyto 100 jj\ buforu TE. Fazy wodne polaczono i chromatografowano na kolumnie Sephadex G-100 (Pharmacia) w TNE; zbierano 0,1 ml farakcje z szybkoscia 0,3 ml/min., oznaczajac dla kazdej frakcji promieniowanie Czerenkowa. Po wytraceniu etanolem i octanem sodu, jak wyzej, uzyskano 8//g dwuniciowego cDNA.Ponownie nalezy zwrócic uwage, ze otrzymany powyzej dwuniciowy cDNA jest mieszanina duzej liczby cDNA i ich fragmentów, z których jedynie nieliczne sa HuFIN-cr lub ich fragmentami (fig- 1).Klonowanie dwuniciowego DNA. Do klonowania dwuniciowego cDNA, otrzymanego jak wyzej opisano, mozna uzyc wielu róznych kombinacji zywiciel/nosnik klonujacy. Przykladowo, uzyteczne nosniki klonujace moga skladac sie z segmentów chromosomalnych, nie-chromoso- malnych i syntetycznych sekwencji DNA, takich jak rózne znane plazmidy bakteryjne, np. plaz¬ midy z E. coli, w tym col El, pCRL, pBR322 i ich pochodne, plazmidy szerszego zakresu zywicieli, np. RP4, DNA fagu, np. liczne pochodne faga ^, np. NM 989 i wektory pochodzace z kombinacji plazmidów i fagowych DNA, takich jak plazmidy zmodyfikowane do stosowania DNA fagowego lub inne sekwencje kontroli ekspresji lub plazmidy drozdzy, jak plamid 2/j lub jego pochodne.Uzytecznymi zywicielami moga byc zywiciele bakteryjne,jak szczepy E. coli, np. E. coli HB 101, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli MRCI i szczepy Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus i inne laseczki, drozdze i inne grzyby, zywiciele zwierzecy lub roslinni, jak komórki zwierzece (równiez ludzkie) lub roslinne w hodowli lub inni zywiciele. Oczywiscie, nie wszystkie kombinacje zywiciel/wektor moga byc jednakowo wydajne. Odpowiedniego doboru kombinacji zywiciel/nosnik klonujacy moze dokonac fachowiec po rozwazeniu wyzej przedsta¬ wionych zasad, nie odchodzac od zakresu wynalazku.W kazdym specyficznym nosniku klonujacym mozna wybrac rózne punkty do insercji dwuni¬ ciowego DNA. Te punkty sa zwykle wyznaczone endonukleaza restrykcyjna, która je tnie. Przy¬ kladowo, w pBR322 punkt Pstl jest umiejscowiony w genie /3-laktamazy, miedzy trypletami nukleotydów kodujacymi aminokwasy 181 i 182 tego bialka. Punkt ten stosowali Villa-Komaroffi inni, supra, w syntezie bialka o czynnosci antygenicznej determinanty proinsuliny szczura. Jeden z dwóch punktów rozpoznawania endonukleazy Hindll znajduje sie miedzy tripletami kodujacymi aminokwasy 101 i 102, a jeden z kilku punktów Taq przy triplecie kodujacym aminokwas 45/3- laktamazy w pBR322. Podobnie, punkty EcoRI i PvuII w tym plazmidzie leza poza obszarem kodujacym; punkt EcoRIjest umiejscowiony miedzy genami kodujacymi opornosc na tetracykline i ampicyline. Punkt ten stosowal Itakura i inni oraz Goeddel i inni w ich schematach syntezy rekombinantów,patrz wyzej. Punkty te sa dobrze znane fachowcom. Nalezy oczywiscie rozumiec, ze nosnik klonujacy uzyteczny w wynalazku do insercji wybranego fragmentu DNA nie musi miec12 148 434 punktu endonukleazy restrykcyjnej. Nosnik moze byc przylaczony do fragmentu sposobami alternatywnymi.Wektor lub nosnik klonujacy, a zwlaszcza punkt wybrany w nim do przylaczenia wybranego fragmentu DNA, dla uformowania czasteczki rekombinantuDNA,jest okreslony róznymi czynni¬ kami, np. liczba punktów podatnych na dzialanie okreslonego enzymu restrykcyjnego, wielkoscia bialka do ekspresji, podatnoscia zadanego bialka na proteolityczna degradacje enzymami komór¬ kowymi zywiciela, zanieczyszczeniami bialka trudnymi do usuniecia w procesie oczyszczania bialkami komórki zywiciela, charakterystyka ekspresji,jak umiejscowienie kodonów startujacego i stopujacego w stosunku do sekwencji wektora i innymi czynnikami wiadomymi fachowcom.Wybór wektora i punktu insercji dla danego genu jest okreslony wypadkowa tych czynników, przy czym nie wszystkie dobory sa równie efektywne w danym przypadku.Wprawdzie znanych jest szereg sposobów insercji obcego DNA do nosnika klonujacego lub wektora, z wytworzeniem czasteczki rekombinantuDNA, lecz sposobem korzystnym dla pierwszej konstrukcji wedlug wynalazku jest opisany przez Villa-Komaroffai innych, patrz wyzej i przedsta¬ wiony na fig. 1. Sposób ten charakteryzuje sie trawieniem plazmidu (zwlaszcza pBR322) enzymem restrykcyjnym specyficznym dla punktu przewidzianego do insercji (zwlaszcza Pstl) i dodaniem ogonów do terminali, przy uzyciu transferazy terminalnej. Ogony dGMP dodaje sie do terminali 5' pocietego plazmidu, regenerujac punkt Pstl i umozliwiajac przylaczenie do fragmentu cDNA niosacego ogony komplementarne. W podobny sposób, dwuniciowy cDNA przedluza sie doda¬ niem ogonów dCMP do terminali 3', dla umozliwienia przylaczenia do plazmidu z ogonami.Plazmid z ogonami i cDNA odpreza sie, dla wprowadzenia cDNA w odpowiednie punkty plazmidu i rozprowadzenia hybrydowego DNA, przy czym komplementarny charakter ogonów umozliwia ich kohezje (fig. 1). Otrzymana czasteczka rekombinantu DNA niesie teraz gen w wybranym punkcie restrykcji (fig. 1).Oczywiscie, inne znane sposoby insercji sekwencji DNA do nosników klonujacych, dla wyt¬ worzenia czasteczek rekombinantuDNA, sa równie uzyteczne w wynalazku. Takimisposobami sa np. bezposrednia ligacja, syntetyczne linkery, reakcje reperacji zwiazane z egzonukleaza i polime- raza z nastepna ligacja lub przedluzenie nici DNA za pomoca polimerazy DNA i odpowiedniego jednoniciowego wzornika, z nastepna ligacja.Nalezy oczywiscie rozumiec, ze sekwencje nukleotydowe lub fragmenty cDNA doczepione w wybranych punktach nosnika klonujacego moga obejmowac nukleotydy, które nie sa czescia rzeczywistego genu strukturalnego zadanego polipeptydu lub moga zawierac jedynie fragment kompletnego genu strukturalnego zadanego bialka. Wymagane jest jedynie, by obojetnie jaka doczepiona sekwencja DNA transformowala zywiciela w takim kierunku, by produkowal on biologiczna lub immunologiczna aktywnosc HuIFN-cr,lub by sama ta sekwencja DNA byla uzytecznajako próbnik hybrydyzacji do selekcji klonów zawierajacych sekwencje DNA/izyteczne w produkcji polipeptydów majacych immunologiczna lub biologiczna czynnosc HuIFN-a.Nosnik klonujacy lub wektor zawierajacy obcy gen stosuje sie do transformacji zywiciela, umozliwiajacej zywicielowi ekspresje bialka lub jego czesci kodowanej przez hybrydowy DNA.Dobór odpowiedniego zywiciela równiez jest kontrolowany szeregiem czynników, uznanych w tej dziedzinie. Naleza do nich przykladowo zdolnosc laczenia sia z wybranym wektorem, toksycznosc bialek kodowanych hybrydowym plazmidem, latwosc odzyskiwania zadanego bialka, charaktery¬ styka ekspresji, bezpieczenstwo biologiczne i koszty. Czynniki te musza byc wywazone, przy zrozumieniu, ze nie wszystkie zywiciele moga byc równie efektywne dla ekspresji danej czasteczki rekombinantu DNA.W syntezie wedlug wynalazku korzystnym pierwotnym nosnikiem klonujacym jest plazmid bakteryjny pBR322, a korzystnym pierwotnym punktem endonukleazy restrykcyjnej w tym plaz¬ midzie punkt Pstl (fig. 1). Plazmidem jest maly (ciezar czasteczkowy okolo 2,6 megadaltonów) plazmid niosacy geny opornosci na antybiotyki ampicyline (Amp) i tetracykline (Tet).Plazmid ten zostal w pelni scharakteryzowany /F.Bolivar i inni, „Construction And Characterization Of New Cloning VehiclesII. A MultnPurpose Cloning System", Gene, strony95-113 (1977); J.G. Sutcliffe, „pBR322 Restriction Map Derived FromThe DNA Seauence: Accurate DNA Size Markers Up to 4361 Nucleotide Pairs Long", Nucleic Acids Research, 5 strony 2721-28 (1978)/. Insercja produktu DNA w tym punkcie daje duza liczbe klonów bakteryjnych, z których kazdy zawierajeden z genów148 434 13 DNA lub jego fragmentów, obecnych w uprzednio otrzymanym produkcie DNA. Ponownie, jedynie bardzo nieliczne z tych klonów beda zawierac gen IFN-a lub jego fragmentów (fig. 1).Korzystnym zywicielem dla pierwszego klonowania wedlug wynalazku jest E. coli HB 101. Inne próby prowadzono z E. coli X1776, zywicielem przedstawionym w brytyjskim opisie patentowym nr 1 516458, zdeponowanym w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, gdzie oznaczono go symbolem ATCCNo.31 244. 1. Wytwarzanie rozszczepionego w Pstl, przedluzonego o dGMP pBR322. Plazmid pBR322 trawiono 21 jednostkami endonukleazy Pstl (MRE Porton Downs lub New England Biolabs) w 150//110 mM Tris-HCl(pH 7,5), 6 mM MgCl2,50 mM NaCl, 6 mM 2-merkaptoetanolu, 200 mg///l albuminy osocza bydlecego („BSA") (Calbiochem). Po 2 godzinach w 37°C mieszanine ekstraho¬ wano 1 objetoscia mieszaniny fenol-chloroform (1:1) i 1 objetoscia eteru i wytraconego etanolem.Dodanie homopolimerycznych ogonów dGMP (fig. 1) za pomoca terminalnej transferazy deoksynukleotydylowej (TdT)/oczyszczonej wedlugF.J.Bollum, „DeoxynucleotidePolymerizing Enzymes From Calf Thymus Gland", w Methods in Enzymology (L. Grossman i K. Moldave, wydawcy), Academic Press, New York, 128, strony 591-611 (1968)/przeprowadzono w objetosci reakcyjnej 328//l, zawierajacej 100 mM kakodylanusodu (pH 7,2), 10 mM NaH2P04,5 mM MgCb, 1 mM dGTP, 50//g/^fl BSA i 3-6jednostek TdT (oczyszczonego jak wyzej) na/yg DNA. Inkubacje prowadzono w ciagu 20 minut w 37°C. Dodano EDTA do 10 mM, po czym mieszanine ekstraho¬ wano jak wyzej i dializowano w ciagu 2 dni wobec buforu TNE. 2. Wytwarzanie DNA przedluzonego o dCMP. Standardowymi procedurami (np. Villa- Komaroff i inni, patrz wyzej) przedluzono dwuniciowy DNA resztami dCMP. 150 ng wyzej opisanego dwuniciowego cDNA inkubowano w 8//l 100 mM kakodylanu sodu (pH 7,2), 2,5 mM C0CI2,50/ig/fjl BSA, 0,1 mM dCTP zawierajacego 3-6 jednostek oczyszczonego TdT na//g DNA, w ciagu 8 minut w 27°C, a nastepnie zamrozono do -20°C. Jak poprzednio, DNA przedluzony o dCMP jest mieszanina róznych jednostek, z których tylko bardzo nieliczne sa skorelowane z IFN (fig. i). 3. Wytwarzanie E. coli X1776 traktowanych Ca++. Pojedyncza kolonie E. coli X1776 inokulo- wano do 100 ml pozywki tryptonowej (C. Weissmann i W. Boli, „Reduction Of Possible Hazards In The Preparation Of Recombinant Plasmid DNA", Nature, 261, strony 428-29 (1976), uzupelnionej, w ilosci 100//g/ml, kwasem dwuaminopimelinowym (Koch-Light Laboratories), 10/yg/ml kwasu nalidiksowego (Calbiochem) i 10/ig/ml tetracykliny (AchromycinR, American Cyanamid).Hodowle prowadzono w 37°C do pozornej gestosci optycznej 0,6 przy 650 nm (OD650) (pomiar w spektrofotometrze Beckman DB) i w ciagu 30 minut ziebiono w lodzie. Z kolei hodowle sedymen- towano przy 4000 obrotów na minute, w wirówce Sorvall H4, komórki przemyto 50 ml 10 mM NaCl, odwirowano i ponownie zawieszono w 20 ml 100 mM CaCl2. Zawiesine ziebiono w lodzie w ciagu 30 minut, odiwrowano i ponownie zawieszono w 4 ml 100 mM CaCb i przed uzyciem utrzymywano w ciagu nocy w lodzie. E. coli HB101 do transformacji sporzadzono sposobem wedlug M. Mandel i A. Higa, „Calcium-Dependent Bacteriophage DNA Infection", J. Mol. Biol., 53, strony 159-62 (1970). Próbki (0,5 ml) zamrozone do -70°C utrzymywaly aktywnosc w ciagu co najmniej 3 miesiecy. 4. Odprezanie pBR322 przedluzonego o dGMP i DNA przedluzonego o dCMP. Odprezanie rozszczepionego w Pstl pBR322 z ogonami i cDNA z ogonami opisuja J. Van der Berg i inni, „Comparison Of Cloned Rabbit And Mouse /3-globin Genes Showing Strong Evolutionary Dive- rgence Of Two Homologous Pairs Of Introns", Nature, 276, strony 37-44 (1978). 8 ng produktu DNA przedluzonego o dCMP zmieszano z 22 ng rozszczepionego w Pstl i przedluzonego dGMP pBR322 w 50//1 buforu TNE. Inkubacje prowadzono kolejno w 65°C, 46°C, 37°C i 20°C, utrzymu¬ jac mieszanine w kazdej z tych temperatur w ciagu godziny. Dodano 20fjl 100 mM Tris-HCl(pH 7,5), 100 mM CaCfe, 100 mM MgCb i 50/A buforu TNE, po czym mieszanine ziebiono w lodzie w ciagu 20 minut.Produkt jest oczywiscie zlozona mieszanina róznych czasteczek rekombinantów DNA i nos¬ ników klonujacych bez insertów sekwencji DNA. Jednakze kazda czasteczka rekombinantu DNA zawiera segment cDNA w punkcie Pstl. Kazdy taki segment cDNA moze zawierac gen lub jego fragment. Jedynie bardzo niewiele z tych segmentów cDNA koduje IFN lub jego czesc (fig. 1).14 148 434 Znakomita wiekszosc koduje inne bialka lub ich czesci, których mRNA stanowily czesc poli(A) RNA uzytego w procesie wedlug wynalazku (fig. 1). 5. Transfekcja E. coli X1776 odprezonymi plazmidami hybrydowymi. Transfekcje E. coli X1776 mieszanina czasteczek rekombinantów DNA opisuja J. Van den Berg i inni, patrz wyzej. W procesie transfekcji i nastepnych operacjach z transformowanymi bakteriami uzyto urzadzen zestawu P3. Odprezone czasteczki rekombinantów pBR322-DNA dodano do 100//l uprzednio sporzadzonych E. coli X1776 potraktowanych Ca++. Mieszanine oziebiano w ciagu 20 minut w lodzie, w ciagu 10 minut ogrzewano w 20°C i dodano 0,6 ml pozywki tryptonowej. Mieszanine naniesiono na dwie plyty z pozywka agarowa uzupelniona jak wyzej. Wydajnosc transfekcji wyniosla 3,3 • 104 kolonii na^g odprezonego pBR322 z transfekujacym DNA; natywny pBR322 dal 3 • 106 kolonii na /mg.Poniewaz plazmid pBR322 zawiera gen opornosci na tetracykline, zywiciele E. coli transfor¬ mowane plazmidem majacym ten gen nienaruszony beda rosnac w pozywkach zawierajacych tetracykline, natomiast bakterie nie poddane takiej transformacji zostana wyeliminowane. Tak wiec hodowla w pozywce zawierajacej tetracykline umozliwia selekcje zywicieli transformowanych czasteczka rekombinantu DNA lub recyklizowanym wektorem. Po 48 godzinach w 37°C zebrano indywidualne kolonie i zawieszono je w 100//l pozywki tryptonowej (uzupelnionej jak wyzej), w zaglebieniach plytek do mikromiareczkowania (Dynatech). Po inkubacji w ciagu nocy w 37°C do kazdego z zaglebien dodano 100//l 40% gliceryny. Plytki przechowywano w -20°C i sporzadzono zbiór 100000 indywidualnych klonów transformowanych E. coli X1776.Powyzsze 100 000 klonów zawiera róznorodne czasteczki rekombinantów DNA reprezentu¬ jace pelne lub czesciowe kopie mieszaniny mRNA preparatu poli(A) RNA z leukocytów produku¬ jacych IFN (fig. 2). Wiekszosc z nich bedzie zawierac jedynie pojedyncza czastke rekombinantu DNA. Jedynie bardzo nieliczne sposród tych czasteczek rekombinantów DNA bedzie skorelowane z IFN. Takwiec klony musza byc poddane skriningowi, dla wydzielenia klonów skorelowanych z IFN z innych klonów.Skrining klonu zawierajacego HuIFN-acDNA. Istnieje kilka sposobów skriningu dla wydzie¬ lenia klonów zawierajacych cDNA ludzkiego interferonu leukocytowego („HuIFN-acDNA"). Sa to przykladowo, hybrydyzacja selekcjonujaca RNA (Alwine i inni, patrz nizej), hybrydyzacja róznicujaca (T.P.St.John i R.W.Davis, „Isolation Of Galactose-Inducible DNA Seauences From Saccharomyces Cerevisiae By Differential Plaaue Filter Hybridization", Celi, 16, strony 443-452 (1979); Hoeijmakers i inni, patrz nizej), hybrydyzacja za pomoca syntetycznego próbnika (B. Noyes i inni, „Detection And Partial Seauence Analysis Of Gastrin mRNA By Using An 01igodeoxynuc- leotide Probe", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, strony 1770-1774 (1979) lub skrining klonów produkujacych zadane bialko na podstawie prób immunologicznych (L. Villa-Komaroff i inni, patrz wyzej) lub biologicznych (A.C.Y.Chang i inni, patrz wyzej). W niniejszych badaniach przyjeto hybrydyzacje selekcjonujaca RNA, jako najdogodniejsza i obiecujaca metode pierwszego skriningu klonów zawierajacych IFN-acDNA.A. Hybrydyzacja selekcjonujaca RNA. 1. Próba wstepna. W nawiazaniu do fig. 2, rekombinant DNA izolowano z hodowli miesza¬ niny 512 klonów z powyzszego zbioru klonów (dwie mieszaniny 2 klonów przedstawione na fig. 2) (Etap A). Przyczyna wyboru tej wielkosci partiijest wyjasniona ponizej. Czasteczki rekombinantu DNA pocieto, denaturowano i hybrydyzowano do leukocytowego poli(A) RNA zawierajacego IFN-amRNA, sporzadzonego jak powyzej (etap B). Wszystkie hybrydy czasteczki rekombinantu DNA-poli(A) RNA oddzielono od niehybrydyzowanego poli(A) RNA (etap C). Poli(A) RNA odzyskano z hybryd i oczyszczono (etap D). Odzyskany RNA zbadano na aktywnosc IFN- amRNA, jak wyzej (etap E). Jezeli i tylko jezeli mieszanina czasteczek rekombinantów DNA zawiera czasteczke rekombinantu DNA majaca insertowana sekwencje nukleotydowa zdolna do hybrydyzacji do IFNmRNA w poli(A) RNA w warunkach hybrydyzacji, mRNA uwolniony z tej hybrydy spowoduje wytworzenie IFN-a w oocytach, poniewaz mRNA uwolniony z innych hybryd czasteczki rekombinantu DNA-poli(A) RNA nie bedzie skorelowana z IFN-a. Gdy grupa 512 klonów dala odpowiedz dodatnia, klony przegrupowywano na 8 partii po 64, a kazda z partii poddano badaniom jak poprzednio. Proces powtarzano do identyfikacji pojedynczego klonu dajacego dodatnia odpowiedz w tej próbie.148 434 15 Nie ma pewnosci, ze czasteczki rekombinantów DNA i transformowane nimi klony bakte¬ ryjne, zidentyfikowane w powyzszy sposób, zawieraja kompletna sekwencje IFN-a lub nawet, ze sekwencja DNA rzeczywiscie kodujeIFN-a. Jednakze na pewno czasteczki rekombinantówDNA beda zawierac duze sekwencje nukleotydowe komplementarne w stosunku do sekwencji koduja¬ cych IFN-amRNA. Tak wicc,czasteczka rekombinantu DNA moze byc stosowana co najmniej jako zródlo próbnika do szybkiego skriningu innych czasteczek rekombinantówDNA i transfor¬ mowanych nimi klonów, w celu identyfikacji dalszych grup klonów, które moga zawierac autenty¬ czne i kompletne sekwencje nukleotydowe kodujace IFN-a. 2. Rozwazania teoretyczne. Krytyczne sa warunki hybrydyzacji (etap B). Absolutne stezenia i stosunek czasteczki rekombinantu DNA i poli(A) RNA musza byc dobrane tak, by uwzglednic szybkosc reakcji i stechiometrie. Wlasciwy dobór jest trudny, poniewaz nie jest znany udzial IFN-amRNA w poli(A) RNA. Dla zapewnienia kontrolowanej i odpowiedniej kinetyki, hybrydy¬ zacje przeprowadzano w warunkach stezenia sekwencji DNA z czasteczek rekombinantówDNA nadmiarowego w stosunku do oszacowanego stezenia IFN-a-mRNA. W mieszaninie 512 mozli¬ wych róznych czasteczek rekombinantówDNA sekwencja DNA skorelowana z IFN-a („IFN-aR DNA"), badz to nie bedzie w ogóle wystepowac (dajac próbe ujemna), badz bedzie stanowic co najmniej okolo 1/512 czasteczek rekombinantów DNA. Stezenie mieszaniny czasteczki rekombi¬ nantu DNA, a wiec stezenie IFN-aR DNA,jezeli taki jest obecny, mozna wiec w etapie hybrydyza¬ cji dobrac tak, by zapewnic odpowiednia szybkosc hybrydyzacji. Ponadto, ilosc IFN-aR DNA w mieszaninie reakcyjnej musi byc wystarczajaca do zwiazania IFN-amRNA z poli(A) RNA w takiej ilosci, by mozliwa byla detekcja IFN-a po injekcji do oocytów mRNA odzyskanego z hybrydy czasteczki rekombinantu DNA-poli(A) RNA.Dla wykrycia IFN-a dostepnymi testami, jego stezenie winno wynosic 100 IU/ml lub wiecej.Poniewaz do replikowanych oznaczen wymagane sa próbki 0,5 ml, nalezy generowac w oocytach 50IU. Poli(A) RNA z indukowanych leukocytów, stosowany powyzej, po injekcji do oocytów w ilosci l//g generuje okolo 500 IU IFN-a. Tak wiec, dla generacji potrzebnych 50 IU nalezy wstrzyknac co najmniej 0,1 /Jg poli(^) RNA. Próby modelowe z klonami mRNA globiny królikai cDNA /J-globiny królika wykazaly, ze sumaryczny odzysk mRNA 125J-globiny w oocytach w stosunku do mRNA 125J-globiny dodanego do mieszaniny hybrydyzacji wyniósl okolo 10%, a odzysk aktywnosci mRNA okolo 5%. Takwiec, w próbie hybrydyzacji nalezy stosowac co najmniej 0,1/0,05 = 2/jg leukocytowego poli(A) RNA. Dla zapewnienia odpowiedniego marginesu bezpie¬ czenstwa, stosowano 12/jg poli(A) RNA na próbe.Dla obliczenia ile DNA z czasteczek rokombinantu DNA jest potrzebne do zwiazania IFN- amRNA w 12/ig poli(A) RNA, oszacowano zawartosc IFN-amRNA w poli(A) RNA. 1 /jg poli(A) RNA generuje 500 IU IF. Aktywnosc wlasciwa IFN-a wynosi od 2 • 10 do 109 IU/mg bialka. A wiec 500 IU IFN-a odpowiada od 500/2-108 = 2,5-10"6 mg (2,5 ng) do 500/109 = 5 • 10"7 mg (0,5 ng) interferonu.Zaleznosc miedzy iloscia IFN-amRNA wstrzyknietego do oocytu, a iloscia wyprodukowa¬ nego IFN-a jest nieznana. W przypadku mRNA /J-globiny, w ciagu godziny produkowane jest okolo 30 czasteczek bialka na czasteczke mRNA. Wartosc ta wynosi okolo 6 w przypadku /J-globiny (J.B. Gurdon i inni, „Message stability In Injected FrogOocytes: Long Life OfMamma- lian And/3-Globin Messages", J.Mol. Biol., 80 strony 539-51 (1973). Przyjmujac przecietna wartosc 20 dla IFN-a, ciezar czasteczkowy IFN-a 18000 i ciezar czasteczkowy IFN-amRNA 330000, w ciagu 24 godzin na 1 mg wstrzyknietego IFN-amRNA winno byc produkowane 26 mg (18000/330000-20-24) IFN-a. Jezeli aktywnosc wlasciwa IFN-a wynosi 2-108/mg (2-102 IU/ng), to 1 ng IFN-amRNA bedzie dawac 26-2-102 = 5,2-103 IU IFN-a. Jezeli aktywnosc wlasciwa wynosi 109/mg, to ilosc produkowanego IFN-a bedzie wynosic 2,6-10 IU. Poniewaz 1 /jg leukocytowego poli(A) RNA daje 500 IU IFN-a, w wyzej przyjetych warunakch, stezenie IFN-amRNA w l//g poli(A) RNA spadnie do wartosci miedzy 0,1 ng, a 0,02 ng, a udzial IFN- amRNA w leukocytowym poli(A) RNA bedzie wynosic od 1:10000 do 1:50000. Takwiec, 10/jg poli(A) RN/Tzawiera okolo 1,2 ng do 0,2 ng IFN-amRNA.Jezeli stosunek translacji IFN-amRNA w oocytach bedzie ojeden rzad wielkosci mniejszy niz przecietny dla mRNA globiny, to zawartosc IFN-amRNA w poli(A) RNA bedzie dziesieciokrotnie wyzsza niz wyzej wyliczono, tj. od okolo 1:10000 do 1:5000. 12//g poli(A) RNA bedzie zawierac okolo 12 ng do 2 ng IFN-amRNA. Jezeli natomiast stosunek translacji IFN-a w oocytach bedzie o16 148 434 rzad wielkosci wyzszy od przecietnej dla mRNA globiny, to zawartosc IFN-ormRNA w poli(A) RNA bedzie dziesieciokrotnie nizsza od wyzej wyliczonej, tj. okolo 1:100000 do 1:500000. W tym przypadku 12/ig poli(A) RNA bedzie zawierac 0,1 ng do 0,02 ng IFN-amRNA.Plazmid pBR322 ma 4361 b.p. Przy formowaniu pBR322-IFN-crcDNA kompletny cDNA IFN-amRNA wprowadzi 800-1000 b.p., z czego wynika sumaryczna wartosc okolo 5200-5400 b.p.Ciezar czasteczkowypBR322-IFN-acDNA bedzie wiec okolo 12-krotnie (2 • 5200/800) wiekszy od ciezaru czasteczkowego samego IFN-a mRNA. Tak wiec, dla zwiazania wyzej obliczonej ilosci IFN-aRNA obecnej w 12/yg poli(A) RNA, wymaganej w próbie, wymagana bedzie ilosc czasteczek rekombinantówDNA dwunastokrotnie wieksza od ilosci IFN-amRNA (ilosc stechiometryczna).Poniewaz zawartosc IFN-amRNA w poli(A) RNA uzytym do sporzadzenia czasteczek rekombinantówDNA zostala zwiekszona 10 do 40-krotnie w stosunku do zawartosci w surowym poli(A) RNA, grupa 512 klonów winna zawierac 10 do 40 razy wiecej klonów majacych zadany IFN-amRNA niz wyliczono z powyzszego.Jezeli IFN-amRNA stanowi 1 czesc na 1000 czesci surowego poli(A) RNA, to 12/jg poli(A) RNA zawiera 12 ng IFN-amRNA, a stechiometryczna ilosc IFN-acDNA plazmidu wynosi 144 ng.Poniewaz grupa 512 klonów bedzie zawierac co najmniej 5 z insertami IFN-acDNA, wymagana ilosc hybryd plazmidowych DNA wynosi 14,8//g (144 -512/5-10~3). Jezeli IFN-amRNA stanowi 1 czesc na 10000, to 12//g poli(A) RNA zawiera 1,2 ng IFN-aRNA, a wymagana ilosc plazmidu IFN-acDNA wynosi 14,4, ng. Grupa 512 klonów bedzie zawierac 0 lub 1 insert IFN-acDNA, tak wiec wymagana ilosc pelnych hybryd plazmidowych DNA wynosi 7,4//g (14,4-512-10~3). Jezeli IFN-amRNA stanowi 1 czesc na 100 000, to wymagana ilosc pelnych hybryd plazmidowych DNA wynosi 0,74 /jg (1,44-512-10"3). W celu zapewnienia przebiegu reakcji w warunkach nadmiaru DNA (tj. nadmiaru rekombinantu DNA w stosunku do poli(A) RNA), w próbach stosowano 20 fig mieszaniny (nadmiar okolo 1,4 do 30-krotny).Hybrydyzacja musi byc prowadzona w warunkach zapewniajacych (a) odzysk hybrydyzowa- nej czesci poli(A) RNA w postaci nietknietej i biologicznie czynnej, (b) zapobiezenie niespecyficznej asocjacji DNA-mRNA i (c) co najmniej 75% przebieg reakcji hybrydyzacji. Takie warunki sa najbardziej prawdopodobne przy hybrydyzacji w 80% formamidzie, 0,4 M NaCl /J. Casey i N. Da- vidson, „Rates Of Formation And Thermal Stability Of RNA: DNA And DNA:DNA Dupelexes At High Concentrations Of Formamide", Nucleic Acids Res., 4, strony 1539-52 (1977)/. W tym roztworze hybrydyzacje mozna prowadzic w okolo 40°C (w nieobecnosci formamidu wymagana temperatura jest 60-70°C). Korzytna, dla minimalizacji uszkodzenia poli(A) RNA, jest tempera¬ tura nizsza. Wybrano temperature hybrydyzacji 56°C. Jest to okolo 3° ponizej Ti/2i (J. Casey i N.Davidson, patrz wyzej) i okolo 10-13° ponizej T^d (Hamaguchi i Geidushek, J. Amer.Cem.Soc, 84, strona 1329). Tatemperatura winna uniemozliwic hybrydyzacje sekwencji o homologii ponizej okolo 87%, poniewaz 1% niedopasowania obniza Ti/2d o 1° /T.F.Bonner i inni, „Reduction In The Rate Of DNA Reassociation By Seauence Divergence", J.Mol. Biol., 81, strony 123-35 (1973)/.W obecnej hybrydyzacji samohybrydyzacja DNA nie jest duzym problemem, poniewaz sto¬ sowana mieszanina DNA sklada sie z jednostek o tym samym wektorze (pBR322) z róznymi insertami cDNA. Tak wiec wiekszosc sekwencji bedzie heterodupleksami, w którym inserty sa dostepne do hybrydyzacji do poli(A) RNA. Z powodu ograniczen topologicznych, jest bardzo nieprawdopodobne, by inserty komplementarnych cDNA, stanowiace czesci róznych dupleksów, reagowaly ze soba. W kazdym przypadku reasocjacja DNA:DNA jest w zastosowanych warun¬ kach reakcji zminimalizowana (J. Casey i N. Davidson, patrz wyzej).Dla obliczenia czasu hybrydyzacji wymaganego do zapewnienia co najmniej 75% przebiegu reakcji^astosowano równanie szybkosci drugiego rzedu: Co-Ro + Ro(l- JL ) (1-JL)Co t— —3,9 godzin kR (Co - Ro)148 434 17 gdzie: R = molowe stezenie nukleotydów hybrydyzowanego RNA; Co = molowe stezenie nukleotydów poczatkowego DNA poddawanego hybrydyzacji; Ro= molowe stezenie nukleoty¬ dów poczatkowego RNA poddawanego hybrydyzacji; kR = stala szybkosci hybrydyzacji RNA- DNA; t = czas (sekund) R a: =0,75 (75% przebieg reakcji) Ro kR = 472 (kR = 1/12 kd (J. Casey i N. Davidson, patrz wyzej) gdzie: kd = stala szybkosci drugiego rzedu dla DNA w wybranych warunkach hybrydyzacji; a: kd = 1,7 • 105 • L1/2 • N"1 /J.R. Hutton i J.G. Wetmur, „Renaturation Of Bacteriophage & X174 DNA-RNA Hybrid: RNA Length Effect And Nucleation Rate Constant", J.Mol.Biol., 77, strony 495-500 (1973)/; L = 900 (dlugosc lancucha w b.p.; okolo 900 jest obecnych w pelnym insercie IFN-crcDNA; N = 900 (komplikacja w b.p. lancucha hybrydy; tutaj komplikacja wynosi 900, poniewaz 900 nukleotydów IFN-amRNA laczy sie z 900 komplementarnymi nukleo- tydami IFN-a cDNA - insertu; Co = 2,5* 10~7 (Przyjeto 40fjl roztworu zawierajacego uprzednio oznaczone 20/jg czasteczek rekombinantuDNA stosowanych w próbie i ponownie przyjmujac, ze insert IFN-a cDNA stanowi 1/12 czasteczki rekombinantu DNA i ze wystepuje w co najmniej jednym z 512 klonów i przyjmujac 662 jako przecietny ciezar czasteczkowy jednej pary zasad DNA); Ro = 8,7 • 10~8 (Przyjeto 40/ii roztworu zawierajacego uprzednio oznaczone 20//g czaste¬ czek rekombinantu DNA stosowanych w próbie i ponownie przyjmujac, ze poli(A) RNA zawiera 1:10 000 czesci IFN-amRNA (przy duzym nadmiarze DNA inny stosunek bedzie miec maly wplyw na szybkosc hybrydyzacji) i przyjmujac 343 jako przecietny ciezar czasteczkowy rybonukleotydu RNA) 3. Przeprowadzenie próby wstepnej.Etap A - Sporzadzenie i rozszczepienie mieszaniny czasteczek rekombinantów DNA. Zadana liczbe klonów bakteryjnych inokulo^/ano na plytach z agarem tryptonowym, uzupelnionym jak wyzej, przenoszac na nie próbke z zaglebien plytki do mikromiareczkowania, za pomoca urzadze¬ nia mechanicznego. Po inkubacji w 37°C kazdy z klonów rozrósl sie do kolonii o srednicy kilku mm. Koloniesplukano z plyt(y) i polaczono, otrzymujac inokulum do zaszczepienia 1 litra pozywki tryptonowej uzupelnionej jak wyzej, w kolbie Erlenmayera o pojemnosci 2 litry.Hodowle wstrza¬ sano w 37°C do pozornej wartosci OD650 okolo 0,8 (ocena wizualna). Do hodowli dodano jedna objetosc pozywki tryptonowej z dodatkami i chloramfenikol do 170//g/ml i dalej wstrzasano ja w 37°C w ciagu 16 godzin. Dodano 20 ml chloroformu i ponownie wstrzasano w 37°C w ciagu 10 minut, dla zabicia bakterii (C. Weissmann i W.Boli, patrz wyzej). Hodowle zdekantowano znad chloroformu i odwirowano komórki (Sorvall GS3). Wirowanie prowadzono w ciagu 15 minut w 4°C, z szybkoscia 6000 obrotów na minute. Z jednolitrowego preparatu uzyskiwano okolo 1-2 g komórek. Komórki zawieszono w 30 ml 20 mM Tris-HCl(pH 7,5), wirowano w ciagu 20 minut w 4°C z szybkoscia 5000 obrotów na minute (Rotor Sorvall SW) i ponownie zawieszono w 30 ml 50 mM Tris-HCl(pH 7,5). Dodano 0,25 objetosci roztworu lizozymu (10 mg/ml w 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) i po ziebieniu w ciagu 10 minut w 0°C 0,33 objetosci (w odniesieniu do objetosci zawiesiny hodowli i 50 mM Tris-HCl) 0,5 M EDTA (pH 8,0).Drugie dodanie wykonano przy lagodnym mieszaniu, bez wstrzasania. Po 10 minutach w 0°C dodano 1/16 objetosci (w stosunku do objetosci poczatkowej) 2% Tritonu X-100. Po 60 minutach próbke wirowano w ciagu 60 minut w 0°C, z szybkoscia 10000 obrotów na minute, w rotorze Sorvall SW. Supernatant przeniesiono do zlewki z mieszadlem magnetycznym i przy mieszaniu doprowadzono do pH 12,5, za pomoca 3M NaOH. Pomiaru pH dokonano w 20°C, stosujac elektrode szklana i pH-metr Orion Research model 601, a jako standard Beckman pH 10 Carbo- nate Buffer Standard (No. 3505). Po mieszaniu w ciagu 10 minut w 20°C doprowadzono pH do wartosci 8,5. Po dalszych 3 minutach mieszania dodano 1/9 objetosci 5 M Na Cl i 1 objetosc fenolu (destylowanego i zrównowazonego z 9,5 M NaCl) i w ciagu 5 minut kontynuowano energiczne mieszanie. Przez wirowanie w 0°C, w ciagu 10 minut, z szybkoscia 10 000 obrotów na minute(Rotor GSA Sorvall) rozdzielono fazy. Supernatant zawierajacy forme I DNA (kolowy, dwuniciowy DNA) starannie usunieto z interfazy (która zawiera jednoniciowy DNA) i trzykrotnie eksraho- wano chloroformem (w tym etapie fenol musi byc w duzym stopniu usuniety). Frakcja formy I18 148 434 DNA bedzie zawierac te czastki rekombinantów DNA (pBR322-insert cDNA), które byly stoso¬ wane w transformacji komórek zywiciela stanowiacych czesc 512 klonów wybranych do prób.Do formyI DNA dodano pankreatynowej RNAazy A (5 mg/ml, ogrzewanej w ciagu 10 minut w 85°C) do stezenia 20/yg/ml i inkubowano mieszanine w ciagu 60 minut w 37°C. Dodano 1/5 objetosci 5 M NaCl i za pomoca 30% glikolu polietylenowego 6000 (Union Carbide, autoklawo- wany w ciagu 20 minut w 120°C) doprowadzono mieszanine do koncowego stezenia PEG 7,5%. Po 2-16 godzinach w -10°C osad zebrano w wirówce (Sorvall SW Rotor,wirowanie w ciagu 20 minut w 0°C z szybkoscia 8 000 obrotów na minute), rozpuszczono w 0,075 M NaCl, 0,0075 M cytrynianie Na do absorbancji 20 przy 260 nm i doprowadzono do 0,5% SDS. Roztwórinkubowano w ciagu 30 minut w 37°C z Pronaza (0,5 mg/ml, samotrawiona w stezeniu 20 mg/ml, 2 godziny w 37°C) i ekstrahowano trzykrotnie 1 objetoscia destylowanego fenolu i dwukrotnie 1 objetoscia chloro¬ formu. Próbka (do 2 ml roztworu DNA 1 mg/ml) wirowano przez gradient sacharozy 5 do 23% w 50 mM Tris-HCl(pH 7,5), 1 mM EDTA, w ciagu 15 godzin w 15°C, z szybkoscia 21000 obrotów na minute, stosujac SW 27 Beckman Rotor. Zbierano frakcje oznaczajac ich OF260. Frakcje zawiera¬ jace DNA polaczono i za pomoca octanu sodu i etanolu wytracono z nich DNA. W drodze wirowania odzyskiwano 20 do 100//g formy I mieszaniny DNA. 20fjg oczyszczonej formy I DNA trawiono w 150 //l 10 mM Tris-HCl(pH 7,5), 6 mM MaCk, 50 mM NaCl, 6 mM 2-merkaptoetanolu, 200//g/ml BSA lub zelatyny i 200jednostek Hindlll (New England Biolabs). Enzym restrykcyjny Hindlll rozcina forme I DNA w punkcie w jednostce pBR322 (nieprawdopodobne jest rozciecie równiez jednostki cDNA, lecz gdyby to nastapilo, nie mialoby to istonego wplywu na próbe). Po 2 godzinach w 37°C próbke (1%) poddano analizie elektroforetycznej przez 1% zel agarozowy w 50 mM Tris-octanie (pH 7,8), 2 mM EDTA, w ciagu godziny przy 50 mA, w celu stwierdzenia, czy trawienie bylo kompletne. Jezeli trawienie nie bylo kompletne, dodawano dalszej ilosci Hindlll i kontynuowano inkubacje w ciagu 2 godzin. Gdy forma I DAN zostala w pelni konwertowana do czasteczek liniowych, dodano Pronazy (Calbio- chem), EDTA i SDS do stezenia odpowiednio 0,5 mg/ml, 10 mM i 0,5%. Po 30 minutach w 37°C roztwór ekstrahowano 30 /A mieszaniny fenol-chloroform (1:1). Organiczna faze przemyto 50/jI 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, a polaczone fazy wodne trzykrotnie ekstrahowano eterem, przesaczono przez 0,1 ml kolumne Chelex, zebrano w probówce ze szkla PyrexR wygoto¬ wanej z EDTA i wytracono 1/10 objetosci 3M octanu sodu i 2,5 objetosci etanolu. Po utrzymywa¬ niu w ciagu nocy w spoczynku w -20°C zebrano DNA przez odwirowanie.Etap B. Hybrydyzacja DNA z poli(A) RNA. Sporzadzono dwie mieszaniny hybrydyzacyjne.Mieszanina I zawierala 4/j\ 10-krotnie zatezonego buforu hybrydyzacji (4M NaCl, 0,1 PIPES (pH 6,4, kwas 1,4-piperazynodwuetanosulfonowy, Sigma), 50 mM EDTA, 0,5 jA (okolo 5ng) mRNA 125J-globiny (5000 cpm) i 6//l indukowanego leukocytowego poli(A) RNA (2/yg///l), ilosc wystar¬ czajaca do generacji 6000 IU IFN przy injekcji do oocytów. Mieszanina II zawierala 10/yg formy I DNA trawionej Hindlll, otrzymanej jak wyzej i 0,1 fjg Pstl-trawionego Z-pBR322(H3)/Rc /3G- 4,13 (pochodna pBR322 majaca sekwencje /J-globiny w punkcie Hindlll) /Mantei i inni, „Rabbit /3-globin mRNA Production In Mouse L. Cells Transformed With Cloned Rabbit /}-globin Chro- mosomal DNA", Nature, 281, strony 40-46 (1979)/. mRNA 125J-globiny w mieszaninie I i DNA /J-globiny w mieszaninie II sluza jako pozytywne kontrole wewnetrzne w próbie hybrydyzacji. Obie mieszaniny wysuszono w strumieniu azotu. Do pozostalosci mieszaniny II dodano 40//1 80% formamidu, a roztwór denaturowano w ciagu 10 minut w 100°C i szybko oziebiono w lodzie.Zdenaturowany roztwór uzyto do rozpuszczenia pozostalosci mieszaniny I, a otrzymany roztwór inkubowano w 56°C w ciagu 4 godzin.Etap C. Oddzielenie hybrydyzowanego poli(A) RNA-DNA od nie hybrydyzowanego poli(A) RNA. Po rozcienczeniu do 1 ml zimnym 0,9 M NaCl, 0,09 M cytrynianem Na i formamidem (100%) do 4% (objetosciowo), roztwór przesaczono z szybkoscia 0,5 ml/min przez filtr Millipore (wiel¬ kosc porów 0,45 fjm). Filtr byl badany na zdolnosc zatrzymywania hybryd RNA-DNA, poniewaz nie wszystkie filtry otrzymane od wytwórcy byly jednakowo sprawne.Etap D. Oczyszczanie hybrydyzowanego poli(A) RNA. Powyzszy filtr z hybrydami poli(A) RNA zanurzono w 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynianie Na, 0,5% SDS, na 10 minut, w 37°C, przemyto 50 mM Tris-HCl(pH 7,5), 10 mM MgCb, 2 mM CaCb i umieszczono w 0,6 ml swiezego buforu. Po dodaniu 5/jl DNAazy traktowanej jednooctanem (5 mg/ml) /S.B. Zimmermann i G. Sandeen, Anal. Biochem., 14, strona 269 (1966); P.A.Proce i inni, „Alkylation Of A Histidine148 434 19 Residue At The Active Site Of Bovine Pancreatic Deoxyribonuclease", J. Biol. Chem., 244, strony 924-32 (1969)/ filtr inkubowano w ciagu 10 minut w 37°C.Z kolei filtr usunieto, a roztwór ekstrahowano 1 objetoscia fenolu i 1 objetoscia eteru i przepuszczono przez kolumne 0,1-ml Chelex. Do roztworu dodano 5/jg nosnika RNA (oczy¬ szczony RNA drozdzy) i wytracono RNA octanem sodu i etanolem. Osad zebrano przez wirowanie przy 10000xg, rozpuszczono w 100lA 1 mM EDTA, ogrzewano w ciagu 90 sekund w 100°C i dodano TNE i SDS do 2 • TNE i 0,5% SDS. RNA adsorbowano na 100//l kolumnie z oligo(dT)celu- loza eluowano czterema przemyciami po 0,3 ml destylowanej wody i wytracono octanem sodu i etanolem. Po 16 godzinach w -20°C wytracony RNA oddzielono przez wirowanie i rozpuszczono w 2//1 buforu TNK.Etap E. Oznaczenie aktywnosci IFN-crmRNa. Roztwór poli(A) RNA z powyzszego wstrzy¬ knieto do 40 oocytów (okolo 50 ni na oocyt). Oocyty inkubowano w ciagu 24-48 godzin w 23°C, homogenizowano i wirowano (lub odzyskiwano srodowisko inkubacji) i analizowano, jak wyzej opisano, na IFN-cr. 4. Dalsza próba - hybrydyzacja na DNA zwiazanym na filtrze. Wiekszosc nastepnych prób z czasteczka rekombinantu DNA z pojedynczego klonu przeprowadzono z DNA zwiazanym na bibule DBM lub DPT, poniewaz warunki próby nie byly juz krytyczne, a próbajest dogodniejsza.Bibula DPT dawala nizsze tlo i chetniej byla stosowana. Bibule DBM sporzadzono wedlug opisu /J.C. Alwine i inni, „Method For Detection Of Specific RNAs In Agarose Gels By Transfer To Diazobenzyl Oxymethyl-Papere And Hybridization with DNA Probes", Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 14, strony 5350-54 (1977)/. Bibule APT sporzadzano procedura, której autorem jest B. Seed (informacja osobista): Arkusze bibuly Whatman 540 (20 g) mieszano w ciagu 16 godzin w 20°C z mieszanina 70 ml 0,5 M NaOH, 2 mg/ml NaBFU i 30 ml eteru dwuglicydylowego 1,4-butanodiolu.Z kolei bibule przeniesiono do roztworu 10 ml 2-aminotiofenolu w 40 ml acetonu i mieszano w ciagu 10 godzin. Bibule wyczerpujaco przemyto acetonem, 0,1 N HC1, H2O, 0,1 N HC1, H2O i wysuszono. Bibule APT dwuazowano jak opisano dla konwersji bibuly ABM w bibule DBM (Alwine i inni, patrz wyzej).DNA (do 15/ig) wiazano na 50 mm2 dwuazowanej bibuly ABM (DBM) lub APT (DPT), jak opisuja J.H.J. Hoeijmakers i inni, „The Isolation Of Plasmids Containing DNA Complementary ToMessenger RNA For Variant Surface Glycoproteins Of TrypanosomaBrucei", Gene, w druku, (1980) i przedstawiono ponizej.Hybryde plazmidowa DNA trawiono endonukleaza Pstl, traktowano 500//g Pronazy na ml, 0,5% SDS i 10 mM EDTA, w ciagu 30 minut w 37°C, ekstrahowano fenolem i eterem, przepu¬ szczono przez 0,1 ml kolumne Chelex i wytracono etanolem. Denaturowany cieplem DNA (do 5/jg, z mala iloscia 32P-DNA dodanegojako wykrywacz) inkubowano w ciagu nocy w 0°C na 1 cm2 bibuly DBM lub DPT w 200/ii 25 mM buforu fosforanu potasu (pH 6,5). Filtry przemyto trzykrotnie w ciagu 5 minut w temperaturze pokojowej 50 mM buforu fosforanu potasu (pH 6,5), 1% glicyny i trzykrotnie 99% rekrystalizowanym formamidem. Po dalszej inkubacji 99% formami¬ dem, w ciagu 2 minut w 68°C, trzykrotnie przemyto 50 mM buforem fosforanu potasu (pH 6,5) w 20°C i dwukrotnie 0,4 M NaOH w 37°C, w ciagu 10 minut. Okolo 40-60% radioaktywnosci zostalo zatrzymane na filtrach. Filtry inkubowano w ciagu 3 godzin w 38°C w srodowisku A do pre- hybrydyzacji, uzupelnionym 1% glicyny i stosowanym w objetosci 330/ii na filtr. Sklad tego srodowiska jest nastepujacy: 50% formamidu, 5 • SSC, 0,04% poliwinylopirolidonu, 0,04% Ficoll (Pharmacia), 0,1% SDS, 25/jg poli(A) (P&L) i 100 fjg RNA drozdzy (BDH, szesciokrotnie ekstra¬ howany fenolem i wytracony etanolem).Filtry dwukrotnie przemyto srodowiskiem A i hybrydyzowano w ciagu 16 godzin w 38°C z poli(A) RNA, jak wskazano (zwykle 5-8 fig) w srodowisku A pod olejem parafinowym. RNA dodanojak nastepuje: jeden wilgotny filtr DNA odcisnieto i polozono na sterylnej plytce Petri'ego, napipetowano na filtr 20-40//g roztworu RNA, nalozona na niego drugi filtr DNA (duplikat lub kontrole), a calosc pokryto sterylnym olejem parafinowym. Po hybrydyzacji filtry przemyto kolejno w srodowisku A (dwukrotnie), w roztworze zawierajacym 1 • SSC, 0,2% SDS, 1 mM EDTA (trzykrotnie, po 10 minut w 20°C), w srodowisku A (2 godziny w 38°C) i w 50% formamidzie, 5 • SSC, 0,1% SDS (trzykrotnie, 10 minut w 20°C). Hybrydyzowany RNA eluowano przez ogrze¬ wanie w ciagu minuty w 100°C w 200//l 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA i 0,1% SDS.20 148 434 Operacjej elucji powtórzono dwukrotnie, eluaty polaczono i wytracono RNA etanolem, po dodaniu 2/ig RNA drozdzy (oczyszczonego jak wyzej). Przemyty material wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem, rozpuszczono w 3//l H2O i wstrzyknieto do oocytów. Aktywnosc IFN-a oznaczono jak wyzej. 5. Wyniki hybrydyzacyjnej próby selekcji RNA. Dla 8 grup po 512 klonów (tj. grup T, Y,j, •, 0, € i it) wynik byl ujemny.Dla 4 grup po 512 klonów (tj. grup I, 6, N i A) wynik byl dodatni, choc niejednoznacznie. Próby dodatnie sa przedstawione w nastepujacym formacie: IU/ml IFN-a produkowanego przez RNA uwolniony z hybrydy poli(A) RNA-DNA (próba z kontroli hybrydy¬ zacji z uzyciem Z-pBR322(H3)/Rc/3 G-4.13, patrz wyzej); próby, w których wyniki doswiadczalne byly wyzsze od tla kontroli podkreslono.Grupa IU/ml I <60 (<60); 110 (<20); < 110 (< 110); < 110 (< 110); <35(<35) 6 20(<20) N 35 (<20); < 110 (< 110); 200 (< 110) A 60 (< 60); 60 (< 20); < 110 (< 110); < 110 (< 110) Grupe X podzielono na 8 podgrup po 64 klony i hybrydyzowano i analizowano jak poprzed¬ nio. Podgrupy daly nastepujace wyniki, przedstawione w formacie jak wyzej: Podgrupa X-l a-II A-III ^-IV ;\-v ^-VI ^-VII A-VIII IU/ml < 35 (< 35); < 35 (< 35) 130(<30);<45(<45) 225 (< 35); 35 (< 30); 35 (< 30); 600 (< 30); <20(<20) 85(<35);<25(<25) <35(<35) <35(<35) < 35(< 35) <35(<35) Podgrupe ^-III podzielono na 8 zestawów po 8 klonów, które hybrydyzowano i analizowano: Zestaw y^-III-1 ;\-m-2 ^-111-3 a-III-4 A-III-5 A-III-6 A-III-7 A-III-8 IU/ml < 20 (< 20); < 20 (60); 35 (< 30) <35 (<35); <30 (<30); 150 (<20); 600 (<35); 110(60) <25«25);<30(<30) 30 (< 30); < 20 (< 20); < 20 (60) 30(?) (<35); <20 (<20); <35 (60) <30(<30);<20(<20) <30(<20) <30(<20) Poniewaz pierwszy dodatni wynik uzyskano z zetawem -A-III-4, zhybrydyzowano i zanalizo¬ wano indywidualne kolonie tego zestawu (oznaczone symbolami A do H): a-III-4-B < 35x (< 35); < 20 (60) A-III-4-C 35 (60); 60" (<35); lllx (< 11); 11" (< 11); 20(<20) * W próbie zastosowano metode bibuly DBM Tak wiec klon ^-III-4-C zawiera czasteczke rekombinantu DNA zdolna do hybrydyzacji IFN-crmRNA.Czastecze rekombinantu w tym klonie oznaczono symbolem Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C („Hif- 4C"), a zawierajacy ja szczep symbolem E. coli X1776 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C) („E. coli Hif- 4CU).148 434 21 Nomenklatura wskazuje, ze czasteczka rekombinantu DNA powstala w Zurychu (Z) i jest plazmi- dem pBR322 zawierajacym w punkcie Pstl jednostke IFN-acDNA („HcIF"); przy czym dana czasteczka rekombinantu DNA pochodzi z klonu ^-III-4-C („4C").Reklonowanie i charakteryzacja Z-pBR322(Pst)/HcIF-4C. Poniewaz pierwotne klony trans¬ formowanych komórek czasami zawieraja wiecej niz jeden rodzaj czastek rekombinantów DNA /Efstratiadis i inni: „The primary Structure Of Rabbit /J-globin mRNA As Determined From Cloned DNA", Celi, 10, strony 571-85 (1977)/, z klonów E. coli X1776 (Hif-4C) izolowano Hif-4Ci oczyszczono,jak wyzej opisano. Próbki Hif-4Ci pBR322 trawiono Pstl i analizowano elektrofore- tycznie na zelu z 1% agarozy.Hif-4C dal dwa pasma, jeden o mobilnosci pBR322 rozcietego Pst i drugi o mobilnosci odpowiadajacej okolo 320 b.p.Izolowanym Hif-4C transformowano E. coli HB101, jak wyzej opisano. Pobrano 6 klonów opornych na tetracykline, transformowanych bakterii i oczyszczono forme I DNA i analizowano elektroforeza na zelu agarozwoym, jak poprzednio. Wszystkie próbki wykazaly obraz ciecia taki, jak Hif-4C. Jedna z reklonowanych czasteczek rekombinantu DNA oznaczono symbolem Z- pBR322/(Pst)HcIF-4c (,,Hif-4c) i uzyto jej w dalszych próbach. Male „c" oznacza reklonowana czasteczke DNA.W celu oznaczenia zdolnosci Hif-4c i jej insertu cDNA do hybrydyzacji do IFN-amRNA, Hif-4c (115/ig) trawiono do zakonczenia 125 jednostkami Pstl, ekstrahowano fenolem i chloro¬ formem i wytracono etanolem, jak wyzej opisano. Próbke (lO^fg) oznaczono 5'-terminalnie (do wykorzystaniajako wskaznika w nastepnych etapach), przez rozpuszczenie w 100//l 50 mM Tris- HC1 (pH 7,5), przepuszczenie przez 0,1 ml kolumne Chelex 100 i potraktowanie 0,6 jednostkami zasadowej fosfatazy bakteryjnej, w ciagu godziny w 65°C. Dodano dziesieciokrotnie zatezonego TNE (40//l) i ekstrahowano roztwór trzykrotnie 1 objetoscia fenolu i trzykrotniejedna objetoscia chloroformu. Dwiema objetosciami etanolu wytracono DNA, w ciagu nocy utrzymywano w -20°C i odwirowano. Dla dalszego oczyszczenia, próbke w 0,5 ml TNA adsorbowano na 0,25 ml celulozy DEAE (Whatman DE52, wstepnie przemyto 2 m 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH 7,5), 2 mM EDTA („NET-buffer"), przemyto 2 ml NET, eluowano 0,4 ml 1,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl(pH 7,5), 2mM EDTA i wytracono etanolem, jak wyzej. DNA inkubowano z y-32P-ATP(aktywnosc wlasciwa okolo 5000 Ci/mmol) i kinaza polinukleotydowa /A.M. Maxam i W. Gilbert, „A New Method For Seauencing DNA"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, strony 560-64 (1977)/ i oczy¬ szczono przez chromatografie na 3 ml kolumnie Sephadex-G50 w TNE. Eluowano frakcje pola¬ czono i wytracono 32P-DNA etanolem, jak wyzej; wydajnosc: okolo 107dpm.Nie oznaczony, Pstl rozciety Hif-4c DNA (90//g) zmieszano z 6 • 105 dpm oznaczonego 32P Pst rozcietgo Hif-4c DNA, otrzymanego jak wyzej i poddano elektroforozie przez 10 • 20 • 0,7 cm 2% horyzontalny zel agarozowy w 50 mM buforu Tris-octanowego (pH 7,8) 2,5 cm szczeline. Zel eksponowano na filmie rentegowskim i oznaczono polozenia fragmentu 320 bp. Pasmo zelu zawierajace radioaktywne pasmo (1,3- 105dpm) wycieto, rozkruszono przez przetloczenie przez 2 ml strzykawke plastikowai w ciagu nocy ekstrahowano w 4°C, przez mieszanie z buforemNET, w objetosci równej 10 objetosciom zelu. DNA absorbowano na 0,1 ml kolumnie hydroksyapatytu (wstepnie przemytej 1 ml buforu NET). Kolumne przemyto 1 ml 0,1 M buforu fosforanu K (pH 7,5) i eluowano DNA za pomoca 0,2 ml 1 M buforu fosforanu K (pH 7,5). Eluat rozcienczono dziesie¬ ciokrotnie sterylna woda destylowana i adsorbowano DNA i eluowano go z DEAE i wytracono etanolem, jak wyzej opisano. Ten DNA nazwano „fragmentem Hif-4c".Fragment Hif-4c (120 ng) zwiazano na bibule DPT (0,5-0,5 cm), jak wyzej opisano. Jako kontrole wycieto 120 ng fragmentu cDNA /3-globiny z hybrydy plazmidu Z-pBR322(H3)Rc/JG- 4,13, za pomoca Hindlll (F.Meyer i inni, „TranspositionOf AT-linked,Cloned DNA From One Vector ToAnother", Experimentia, 35, strona 972 (1979); N. Mantei i inni, patrz wyzej) i przero¬ biono podobnie. Hybrydyzacje duplikatów filtrów do pli (A) RNA (w 20//l), przemycie filtrów i odzysk RNA z filtrów przeprowadzono jak wyzej opisano. Po injekcji do oocytów wykryto nastepujace aktywnosci IFN-a:22 148 434 Fragment DNA Hif-4c cDNA /J-globiny Hif-4c cDNA /J-globiny Hif-4c cDNA /8-globiny Ilosc leukocytowego poli(A) RNA"(//g) 2,5 2,5 7,5 7,5 7,5 7,5 Czas hybrydyzacji 16h 16h 16h 16h 5h 5h Aktywnosc IFN- (IU/ml)xx (2 oznaczenia) 250; 100 4;1 3000; 1000 4; 30 1000; 1000 i;i x 1 vg tego RNA dal 4600 IU/ml ™ Supernatantoocytowy po 48 godzinach inkubami, badanypróbaredukcji efektucytopatycznego (W.E.Stewart, II i S.E. Sulkin, patrz wyzej) Takwiec Hif-4c zawiera insert zdolny do hybrydyzacji do IFN-amRNA.Indentyfikacja klonów E. coli zawierajacych czasteczki rekombinantów DNA hybrydujace krzyzowo do insertu w Hif-4c.Poniewaz insert cDNA w czasteczce rekombinantu DNA Hif-4c mial wielkosc jedynie okolo 320 b.p., tj. 1/3 szacowanej wielkosci IFN-amRNA, wyzej opisany oczyszczony fragment Hif-4c uzyto jako próbnik w skriningu za klonami bakteryjnymi zawierajacymi czasteczki rekombinan¬ tów DNA majacych skorelowane hybrydowe inserty DNA (fig. 3). 64 klony bakteryjne stanowiace podgrupe A-III, wyzej opisana, napunktowano na membrane Millipore (srednica 8 cm), która umieszczono na plycie agarowej (agar z dodatkiem kwasu dwu- aminopimelinowego, kwasu nalidoksowego i tetracykliny, jak wyzej) i inkubowano w ciagu 24 godzin w 37°C. Filtrumieszczono na 0,75 ml kropli 0,5 M NaOH i po 2-3 minutach przeniesiono na bibule, dla usuniecia nadmiaru cieczy; nastepnie powtórzono operacje. Bibule zobojetniono za pomoca IM Tris-HCl (pH 7,5), przemyto 1,5M NaCl - 0,5M Tris-HCl (pH 7,4), w sposób podobny jak wyzej i wysuszono na powietrzu. Z koleifiltr zanurzono w 0,3 M NaCl, wysuszono na powietrzu i w ciagu 2 godzin ogrzewano w 80°C, pod zmniejszonym cisnieniem.Fragment Hif-4c Pst (30 ng) oznaczono 32P, translacja krzyzowa /A.J. Jeffreys i R.A. Flavell, „The Rabbit /3-Globin Gene Contains A Large Insert In The Coding Seauence", Celi, 12, strony 1097-1108 (1977)/, stosujac /3-32P dATP i a-32P dCTP (aktywnosc wlasciwa 40 Ci/mmol, w obu przypadkach). Filtr z koloniami ^-III przehybrydyzowano w 4 • SET (SET = 0,15 M NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA), 0,1% Ficoll, 0,1% poliwinylopirolidon, 0,1% BSA, 0,5% SDS i 200//g/ml denaturowanego, fragmentowanego DNA spermy lososia, w ciagu 7 godzin w 68°C i hybrydyzowano z 2-105 cpm znaczonego 32P fragmentu Hif-4c w 4-SET, 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidonu, 0,02% BSA, 0,5% SDS i 200//g/ml denaturowanego DNA spermy lososia, w 68°C, w ciagu 16 godzin. Filtr przemyto SET-0,5% SDS, w temperaturze pokojowej, przemyto 2-SET-0,5% SDS, w ciagu 5 godzin w 68°C, jednokrotnie wymieniajac roztwór i 3mM zasada Trizma w temperaturze pokojowej, w ciagu 4 godzin, jednokrotnie wymieniajac roztwór. Po wysuszeniu filtra eksponowano go na filmie rentgenowskim, w ciagu 80 godzin, stosujac ekran.Silnie dodatnia odpowiedz daly 3 kolonie, mianowicie ^-III-7D, ^-III-2H i ^-IH-4c, a 2 kolonie, mianowicie ^-III-1E i ^-III-3D daly odpowiedz slabo dodatnia.Z klonów skorelowanych z Hif-4c sporzadzono male hodowle. Forme I DNA oczyszczono, rozcieto Pstl i analizowano elektroforeza na zelu agarozowym, jak wyzej opisano. Ze wszystkich form I DNA uzyskano fragment duzy (jednostka plazmidu pBR322) i fragment maly (insert hybrydowy). Z czasteczki rekombinantu DNA z klonu ^-HI-2H otrzymano najwiekszy insert, okolo 900 b.p. Te czasteczke rekombinantu DNA oznaczono symbolem Z-pBR322(Pst)/HcIF-2H („Hif-2H"), a jej insert symbolem „fragment Hif-2H".Zbadano zdolnosc Hif-2H do wiazania IFN-amRNA przez zwiazanie go na bibule DPT (4//g/100 mm2) i hybrydyzacje do poli(A) RNA (0,3//g///l), jak wyzej opisano, w ciagu 16 godzin i oznaczenie aktywnosci IFN-amRNA:148434 23 PróbkaDNA Aktywnosc IFN-cr (IU/ml)x Hif-2H 250+50 (srednia z 4 ozna¬ czen) Z-pBR322(H3)/Rcj3G-4.13 30 (srednia z 2 oznaczen) pBR322 20 x Oznaczenie próba redukcji efektu cytopatycznego Hif-2H reklonowano jak opisano dla Hif-4c i oznaczono symbolem Hif-2h.W dalszej próbie sporzadzono inny zestaw klonów E. coli zawierajacych czasteczki rekombi- nantu DNA i zidentyfikowano kolonie hybrydyzujace do oznaczonego fragmentu Hif-4c. Dla zapewnienia wysokiej wydajnosci plazmidów z dlugimi insertami cDNA, czesc dwuniciowego, oznaczonego 32P leukocytowego cDNA, otrzymanego enzymatycznie z leukocytowego poli(A) RNA (preparat cDNA jak wyzej opisany) frakcjonowano wedlug wielkosci, przez wirowanie w gradiencie gestosci sacharozy, stosujac procedure opisana dla wirowania poli(A) RNA. Frakcje zawierajace cDNA o szybkosci sedymentacji odpowiadajacej 600 b.p. lub powyzej,polaczono i odzyskano z nich cDNA po wytraceniu etanolem. cDNA przedluzono resztami dCMP, hybrydy- zowano do przedluzonego dGMP Pstl rozcietego pBR322, a hybrydowy DNA uzyto do trasforma- cji E. coli, jak poprzednio, z tym ze uzyto szczepu E. coli HB101. Bakterie rozdzielono na filtrach Millipore o srednicy 8 cm, umieszczono na plytach z pozywka - agarem tryptonowym (zawieraja¬ cym 10/ig/ml tetracykliny) i prowadzono hodowle do pojawienia sie malych kolonii.Sporzadzono repliki, przez odcisniecie na filtrze z koloniami swiezego, wilgotnego filtru Millipore, oddzielenie, umieszczenie powierzchnia na plycie agarowej zawierajacej 4,4% gliceryny i inkubacje do pojawienia sie malych kolonii. Ten filtr z koloniami przykryto dalszym filtrem Millipore, zamrozono do -55°C i w tych warunkach przechowywano (D. Hanahan i M. Meselson, „A Protocol For High Density Plasmid Screening, Sept. 1978, informacja osobista). Sporzadzono 18 filtrów niosacych w sumie okolo 5000 kolonii. Po jednej replice z kazdego filtru uzyto do hybrydyzacji do oznaczonego 32P, wycietego Pstl fragmentu DNA Hif-4c, dokladnie jak wyzej opisano. Na autoradiogramie zidentyfikowano okolo 185 dodatnich kolonii, które reklonowano na filtrach Millipore i ponownie identyfikowano przez hybrydyzacje. 95 klonów dajacych najsil¬ niejsza odpowiedz hybrydyzacyjna oznaczono symbolami Z-pBR322(Pst)/HcIF-SNl do SN95 i stosowano w dalszych badaniach.Poniewaz Hif-2h wykazuje zdolnosc produkowania polipeptydu o immunologicznej lub bio¬ logicznej czynnosci HuIFN (patrz nizej), zarówno Hif-2hjak i inne skorelowane z nim sekwencje DNA, np. Hif-4c moga byc w tej metodzie z równym powodzeniem stosowane do skriningu innych klonów zawierajacych sekwencje DNA pochodzace z technologii rekombinacji DNA, syntezy, zródel naturalnych lub ich kombinacji lub klonów zawierajacych sekwencje DNA skorelowane z powyzszymi sekwencjami DNA w drodze mutacji, obejmujacej jedno lub wielokrotne substytucje zasad, insercje, inwersje lub delecje, w celu selekcji innych sekwencji DNA i klonów, które równiez koduja HuIFN. Dlatego takie sekwencje i ich identyfikacja równiez wchodza w zakres niniejszej pracy (np. patrz nizej). Nalezy równiez rozumiec, ze obejmuje ona sekwencje DNA, które nie sa skriningowane powyzszymi sekwencjami DNA, lecz które dzieki ich sekwencji nukleotydowej koduja ekspresje polipeptydów kodowanych powyzszymi sekwencjami DNA.Dalsza charakteryzacja insertu DNA Hif-2h. Jak wyzej opisano, czasteczka rekombinantu DNA Hif-2h zawiera insert o okolo 900 b.p. i hybrydyzuje do mRNA ludzkiego interferonu leukocytowego. Okreslono nastepujaca dodatkowa charakterystyke. 1. Translacjastopowana hybryda. Gdy mRNA jest hybrydyzowany do klonowanego, kom¬ plementarnego cDNA, translacja mRNAjest inhibitowana, jednakze denaturacja hybrydy cieplem wyzwala mRNA ulegajacy translacji /B.M. Paterson i inni: „Structural Gene Identification And Mapping By DNA-mRNA Hybrid-Arrested Cell-Free Translation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, strony 4370-74 (1977)/. 2,2//g Pstl-rozcietego Hif-2h i jako kontrole 2//g Hindlll-rozcietego Z-pBR322-(H3)/Rc/3G-4,13 („Rc/3G") denaturowano w 10//1 80% (objetosc/objetosc) zdejonizo- wanego formamidu - 20 mM buforu PIPES (pH 6,4), w ciagu 10 minut w 80°C. Roztwór wprowa¬ dzono do probówki Eppendorfa, w której wysuszono leukocytowy poli(A) RNA (5/ig), NaCl (4//mole) i EDTA (lOnmoli). Mieszanine ogrzewano w ciagu 7 godzin w 48°C, pod warstwa oleju24 148 434 parafinowego, po czym oziebiono i rozcienczono 200/A H2O. Obie próbki podzielono na równe czesci i po jednej z nich ogrzewano w ciagu 30 sekund w 100°C. Etanolem wytracono kwasy nukleinowe, rozpuszczono je w 3//1 H2O i zbadano na aktywnosc IFj^-amRNA w oocytach, jak wyzei: DNA Hif-2h(l,ljig) Hif-2h(l,l/ig) Rc/JG(1/Yg) Rc/8G(l//g) Hif-2h (0,5 yug) Wsad Le poli(A) RNA 2,5/ig 2,5jug 2,5 m 2,5yug lAfg lA«g Obróbka hybrydyzowany hybrydyzowany i denaturowany hybrydyzowany hybrydyzowany i denaturowany bez bez bez IFN-a (IU/ml)x 400 2000 3000 3000 2000 3000 2000 Tak wiec Hif-2h hybrydyzowany z poli(A) RNA inhibituje translacje IFN-amRNA w poli(A)RNA; po denaturacji hybrydy IFN-amRNA ponownie podlegal translacji. Próba potwier¬ dza, ze Hif-2h zawiera sekwencje komplementarne do IFN-amRNA. 2. Analiza przez rozcinanie enzymem restrykcyjnym i okreslanie sekwencji nukleotydo- wych/aminokwasowych i map restrykcyjnych. Przeprowadzono trawienie Hif-2h róznymi enzy¬ mami restrykcyjnymi (New England Biolab), a otrzymane produkty analizowano elektroforeza na zelu agarozowym. Fragmenty podkreslone nie sa wspólne dla pBR322 i Hif-2h: Enzym restrykcyjny Pstl EcoRI BgUI EcoRI + BgUI EcoRI + Pstl Bspl MboII Wielkosci fragmentów Hif-2hxx 885±20,4361 1426, 3820 5246 336,4960 209, 676,748 3611 921, 587, 540, 504 457,434,2-231 + 14 fragmentów 200 bp 1616, 884 i inne pBR322xxx 4361 4361 nie rozciety 4361 748,3611 587, 540, 504,457, 234 + 14 fragmentów 200 bp nie robiono "Medium oocytowe badano po 48 godzinach metoda inhibicji efektu cyto- patycznego xx Choc wewnetrznie tu zgodna, absolutna wielkosc tych fragmentów najlepiej jest wskazana w odniesieniu do fig. 8-10 *** Z Sutcliffe (patrz wyzej) Ponadto, 5'-terminalnie oznaczony 32P, Pstl rozciety Hif-2h rozcieto kilkoma enzymami restrykcyjnymi i okreslono wielkosci radioaktywnych fragmentów pochodzacych z insertów cDNA w czasteczce rekombinantu DNA: Enzym restrykcyjny Fragmenty 32PX EcoRI HindUI Bspl Hpall Hhal BamHI Hinf BgUI 676,209 brak rozciecia 799,86 brak rozciecia brak rozciecia brak rozciecia 210, 62 545, 340 x Choc wewnetrznie tu zgodna, absolutna wielkosc tych fragmentów najlepiejjest wskazanaw odniesieniu do fig. 8-10148 434 25 Z powyzszych danych wykreslano mape restrykcyjna (fig. 4). Mapa nie jest definitywna w sensie absolutnego umiejscowienia punktów i moze byc niekompletna w odniesieniu do punktów MboII w zakresie insertu. W zakresie jednostki pBR322 podano jedynie punkty najblizsze insertu.Strzalka wskazuje orientacje nici kodujacej IFN-crcDNA.Wprawdzie rzeczywista struktura fragmentu Hif-2h lub innych insertów w klonach wedlug wynalazku,jak równiez sekwencja aminokwasowa lub struktura kodowanych polipeptydów nie sa informacjami koniecznymi do stosowania wynalazku,jednakze powyzsze dane i mape restrykcyjna dolaczono do pierwotnego zgloszenia, jako najlepsza dostepna informacje o strukturze fragmentu w momencie skladania pierwotnego zgloszenia. Od tego czasu, jak oczekiwano /patrz wyzej, strona 9, wiersze 27-29) powyzsze dane i mapa restrykcyjna fragmentu Hif-2h zostaly uscislone, przy zastosowaniu ogólnie znanych technik sekwencjonowania nukleotydów i analizy restrykcyjnej.Np. A.M. Maxam i W. Gilbert, „A New Method For Seauencing DNA", Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 74, strony 560-64 (1977)/. Plazmid DNA sporzadzono metoda B /N.M.Wilkie i inni, „Hybrid Plasmids Containing An Active Thymidine Kinase Gene Of Herpex Simplex Virus 1", Nucleic Acids Research, 7, strony 859-77 (1979)/ i restrykcjonowano rozmaitymi enzymami restrykcyjnymi, zasadniczo jak rekomenduje dostawca, z tym ze w buforach enzymów albumine osocza bydlecego zastapiono 200//g/ml zelatyny.(EcoRI byl darem W.Boli, Bspl darem A. Kiss, a pozostale enzymy otrzymano z New England Biolabs).Poddany restrykcji DNA (20//g) ekstrahowano fenolem, wytracono etanolem, rozpuszczono w 0,05 M Tris-HCl (pH 8) i przepuszczono przez mala kolumne z Chelex-100. Fragmenty z bocznikami lub koncówkami wychodzacymi poza 5' defosforylowano przez obróbke 0,2 jednost¬ kami alkalicznej fosfatazy z jelita cielecego (Boehringer) na pmol koncówek DNA 5', w 200//l 0,05 M Tris-HCl(pH 8), w ciagu 60 minut w 37°C. Enzym inaktywowano przez ogrzewnie w ciagu 60 minut w 65°C. W przypadku fragmentów DNA z koncami poza 3' stosowano alkaliczna fosfataze bakteryjna (Worthington),jak opisano (A.M. Maxam i W. Gilbert, patrz wyzej), z tym ze inkubacje prowadzono w 65°C, w ciagu 30 minut. Defosforylowany DNA oczyszczono przez adsorpcje i elucje z celulozy DEAE (W. Muller i inni „Site-Directed Mutagenesis In DNA: Genera- tion Of Point Mutations In Cloned tf-Globin Complementary DNA At The Positions Correspon- ding ToAmino Acids 121-123", J. Mol. Biol., 124, strony 343-58 (1978) lub poddawany elektrofo¬ rezie na zelu poliakrylamidowym, gdy bylo to konieczne (patrz nizej). Fragfmenty odzyskane z zelu poliakrylamidowego (lub agarozowego) w 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl (pH 8) adsorbowano na 0,1 ml kolumnie z hydforoksyapatytem (Biorad HTP), przemyto czterokrotnie 1 ml 0,1 M buforu fosforanu potasu (pH 7) i eluowano 0,3 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH 7). Roztwór rozcien¬ czono dziesieciokrotnie i adsorbowano DNA na celulozie DEAE i odzyskano jak opisano (W. Mul¬ ler i inni, patrz wyzej).Po wytraceniu etanolem DNA oznaczono 5'-terminalnie za pomoca /y-32P/ATP (12-34//Ci na pmol koncówek DNA 5') i poddano dzialaniu kinazy polinukleotydowej (New England Biolabs lub P-L Biochemicals Inc.), zasadniczo jak opisuja A.M. Maxam i W. Gilbert, patrz wyzej, z tym, ze przed reakcja z kinaza DNA nie byl denaturowany. Uzyskano aktywnosc wlasciwa l-l,5//Ci/32P/fosforanu na pmol koncówek DNA 5'.W celu sekwencjonowania, oznaczone fragmenty rozcieto drugim enzymem restrykcyjnym, a produkty rozdzielono elektroforeza na 5% zelu poliakrylamidowym w buforze- tris-boran-EDTA.Zadane fragmenty ekstrahowano z zelu i oczyszczono (Muller i inni, patrz wyzej). Rózne fragmenty do sekwencjonowania sporzadzono jak nastepuje (liczba wskazuje nominalna dlugosc lancucha fragmentu w parach zasad, punkt znaczenia jest wskazany gwiazdka): (1) rozciecie Hif-2h za pomoca Bspl, izolacja BspI-BspI-232 i BspI-BspI-949 elektroforeza na 5% zelu poliakrylamidowym w buforze Loeninga /U.E. Loening, „TheFraction Of High Molecu- lar Weight Ribonucleic Acid by Polyacrylamide Gel Elekctrophoreses", J. Biochem., strona 102, (1967)/; (2) rozciecie Hif-2h za pomoca Bspl, oznaczenie, rozciecie za pomoca Pstl, izolacja Bsplx-Pstl- 83 i BspIx-PstI-827; (3) rozciecie Hif-2h za pomoca BgUI, oznaczenie, rozciecie za pomoca Pspl, izolacja BgIIIx- PstI-336 i BgIIx-PstI-570;26 148 434 (4) rozciecie Hif-2h za pomoca MboII, oznaczenie, trawienie za pomoca Pstl i Hin dli (dla odciecia przeszkadzajacego fragmentu 350 bp pBR322), izolacja MboIIx-PstI-519 i MboIIx- PstI-351; (5) rozciecie Hif-2h za pomoca Ecol, oznaczenie, rozciecie za pomoca Pstl, izolacja EcoRIx- PstI-708 i Ecox-PstI-198; (6) rozciecie Hif-2h za pomoca Pstl, oznaczenie, rozciecie za pomoca BgUI, izolacja Pstlx- BglII-570 i PstIx-BglII-336; (7) rozciecie Hif-2h za pomoca AvaII, oznaczenie, rozciecie za pomoca Pstl, i Bglll, izolacja AvaIIx-PstI-186 i AvaIIx-BglII-147; (8) rozciecie Hif-2h za pomoca PvuII, oznaczenie, rozciecie za pomoca Pstl i Bglll, izolacja PvuIIx-PstI-486.Fragmenty degradowano sposobem A.M.Maxama i W.Gilberta, patrz wyzej, z modyfika¬ cjami opisanymi w protokolachtych samych autorów z wrzesnia 1978. Produkty frakcjonowano na zelach poliakrylamidowych 12% (akrylamid/bisakrylamid = 18/1) o wymiarach 0,1x25x36 cm w 50 mM tris-boranie, 1 mM EDTA (pH 8,3), prowadzac elektroforeze w ciagu 2, 8, 18 i 26 godzin przy 900 V po elektroforezie wstepnej w ciagu 6 godzin przy 700 V. Najlepsze wyniki uzyskiwano, gdy zel przed uzyciem utrzymywano w ciagu 2-3 dni w temperaturze pokojowej.Kazdy odcinek insertu cDNA sekwencjonowano z obu nici, a kazdy punkt restrykcji sluzacy jako oznaczony terminal sekwencjonowano stosujac pasujacy fragment. Takotrzymana sekwencja nukleotydowa jest przedstawiona na fig. 8-10. Jak nalezalo oczekiwac, punkty restrykcji w tym insercie sa umiejscowione bardziej absolutnie niz oznaczone samym rozcinaniem enzymami res¬ trykcyjnymi (fig. 4).Nawiazujac do fig. 8-10, heteropolimeryczna czesc insertu jest flankowana resztami 23G na terminalu 5' i resztami 7 A (prawdopodobnie odzwierciedlajacymi trminal poli(A) mRNA) i resztami 15C na terminalu 3'. Dla odniesienia, insert jest numerowany od pierwszego nukleotydu nastepujacego po ogonie dG do ostatniego nukleotydu przed resztami poliA. Tryplet inicjujacy ATG w polozeniu 57-59 i triplet stopujacy TAA w polozeniu 624-626 okreslaja szablon odczytu nie przerwany kodonami nonsensowymi. Oba pozostale szablony odczytu w tym obszarze insertu zawieraja odpowiednio 18 i 12 kodonów nonsensowych. Jedyne inne sekwencje, tj. w innych szablonach odczytu, flankowane przez ATG lub GTG i sygnalem stopujacym, które koduja polipeptyd z 25 lub wiecej aminokwasów, sa umiejscowione odpowiednio miedzy nukleotydami 226 i 304,640 i 778 oraz 683 i 743. Takwiec najprawdopodobniej obszar miedzy nukleotydami 57 i 626 obejmuje sekwencje nukleotydowa fragmentu Hif-2h kodujacego polipeptyd o biologicznej lub immunologicznej IFN-a, wedlug wynalazku.Nelezy oczywiscie rozumiec, ze cDNA klonowany z poli(A) RNA zwyklymi sposobami (A. Efstratiadis i inni, patrz wyzej) nie ma nukleotydów 5' teminalnych i nawet moze zawierac sekwencje artefaktowe /R.I. Richards i inni, „Molecular Cloning And Seauence Analysis Of Adult Chicken B-Globin cDNA", Nucleic Acids Research, 7, strony 1137-46 (1979)/. Tak wiec nie jest pewne, ze ATG umiejscowiony przy nukleotydach 57-59 jest rzeczywiscie pierwszym ATGrzeczy¬ wistego mRNA. Jednakze dla celów ponizszego opisu przyjmuje sie, ze ATG przy nukleotydach 57-59 jest pierwszym ATG rzeczywistego mRNA.Z porównania polipeptydu kodowanego tym obszarem insertu z sekwencja 35 aminokwasów aminoterminalnych autentycznego ludzkiego interferonu limfoblastoidowego - SerAspLeuPro- GlnThrHisSerLeuGlyAsnArgArgAlaLeuIleuLeuAlaGlnMetGlyArglleSerLeuPheSerCysLeuLys AspArgHisAsp - okreslonej przez K.C. Zoona i innych, patrz wyzej oraz M. Hunkapillera i L. Hooda, patrz wyzej, wynika, ze wybrany szablon odczytu jest prawidlowy i ze nukleotydy 57-124 moga kodowac sekwencje sygnalowa, która poprzedza sekwencje nukleotydowa kodujaca „doj¬ rzaly" polipeptyd, poniewaz zbieznosc publikowanej sekwencji z sekwencja oznaczona (poczawszy od 2 aminokwasu) jest bardzo duza (26 z 35 aminokwasów).W eukariotycznych mRNA pierwszy triplet AUG od terminalu 5' jest zwykle punktem zapoczatkowania syntezy bialka /M. Kozak, „How Do Eukaryotic Ribosomes Select Initiation Regions In Messenger RNA", Celi, 15, strony 1109-25 (1978)/. Kodon we fragmencie Hif-2h odpowiadajacy pierwszemu aminokwasowi interferonu limfoblastoidowego jest 22 kodonem od pierwszego AUG (i 14 kodonem od drugiego AUG), co wskazuje, ze sekwencja kodujaca interferon148 434 27 moze byc poprzedzona sekwencja okreslajaca peptyd sygnalowy z 23 (lub mniej prawdopodobnie 15) aminokwasów. Dluzsza z przypuszczalnych sekwencji sygnalowych zawiera nie przerwana serie 11 hydrofobowych aminokwasów (i serie krótsza 6 hydrofobowych aminokwasów). Taakumula¬ cja hydrofobowych reszt jest charakterystyczna dla sekwencji sygnalowych (patrz B.D. Davis i P.C.Tai „TheMechanism Of Protein Secretion Across Membranes", Nature, 283, strony 433-38 (1980).Sekwencja nukleotydowa odpowiadajaca „dojrzalemu" polipeptydowi IFN-cr obejmuje 498 nukleotydów, które koduja 166 aminokwasów. Przyjmujac, ze nie ma obróbki karboksyterminal- nej, ciezar czasteczkowy interferonowego polipeptydu wynosi 19 388.50% zasad sekwencji koduja¬ cej stanowia GC. Stosowanie kodonów w sekwencji kodujacej interferonujest w dobrej zgodnosci z ogólnie obserwowana dla mRNA ssaków /R. Grantham i inni, „Codon Catalog Usage And The Genome Hypothesis", Nucleic Acids Research, 8, strony 49-62 (1989)/. Obserwowane odchylenia mozna przypisac malym liczbom.Struktura polipeptydu przedstawiona na fig. 8-10 dla fragmentu Hif-2h nie bierze oczywiscie pod uwage modyfikacji polipeptydu spowodowanych interakcja z enzymami in vivo (np. glikoliza- cji). Takwiec nalezy rozumiec, ze ta struktura moze nie byc identyczna z IFN-a produkowanym in vivo, lecz ma bardzo podobne, jezeli nie identyczne, wlasciwosci biologiczne i immunologiczne.Sruktura ta nie wyklucza równiez prawdopodobienstwa, ze inne modyfikacje, takiejak mutacje, w tym pojedyncze lub wielokrotne zamiany zasad, delecje, insercje lub inwersje lub chemiczne derywatyzacje powyzszej struktury beda dawac zwiazki równiez przejawiajace aktywnosc IFN-a. 3. Okreslenie pasma plus insertowanego IFN-acDNA. Pasmo DNA majace te sama sekwencje co mRNA jest okreslone jako pasmo plus, ajego dopelnieniejako pasmo minus. Pasmo plus insertu IFN-acDNA zidentyfikowano jak przedstawiono na fig. 5. Hif-2h rozcieto enzymem restrykcyj¬ nym Bglll, terminale oznaczono 32P-fosforanem (jak opisano powyzej dla terminali po rozcieciu za pomoca Pstl) i poddano DNA trawieniu Pstl, otrzymujac dluzszy (545 b.p. (570 b.p. z oznaczenia wyzej podana, doskonalsza analiza) i krótszy (340 b.p. (336 b.p. z oznaczenia wyzej podana, doskonalsza analiza) fragment r-jioaktywny. Fragmenty denaturowano i hybrydyzowano do poli(A) RNA z indukowanych leukocytów, w 80% formamidzie, 0,4 M NaCl, tj. w warunkach, w których nie wystepuje reasocjacjaDNA-DNA, patrz wyzej. Kwasy nukleinowe trawiono nukleaza SI, która degraduje wszystkie jednoniciowe kwasy nukleinowe, zwlaszcza nie hybrydyzowany P-DNA, po czym produkty rozdzielono na zelu poliakrylamidowym /R.F.Weaver i C. Weiss- mann, „Mapping Of RNA By A Modyfication Of The Berk-Sharp Procedure", Nucleic Acid Research, 7, strony 1175-93 (1979)/. Autoradiogram wykazal, ze jedynie krótszy fragment nukleo- tydowy zostal hybrydyzowany i ochroniony przez poli(A) RNA, co identyfikuje 5'-oznaczony krótszy odcinek nukleotydowy, jako pasmo minus. Orientacja pasma plus jest wiec jak podano na fig. 4 i 5 (prawostronna). 4. Wykazanie, ze poli(A) RNA z nie indukowanych leukocytów ludzkich nie hybrydyzuje do DNA Hif-2h. Przeprowadzono próbe identyczna z opisana wyzej, jednakze poli(A) RNA pocho¬ dzil z nie indukowanych lekocytów ludzkich, otrzymanych tak samo, jak w przypadku leukocytów indukowanych wirusem Sendai. Oznaczony DNA nie zostal ochroniony w wykrywalnej ilosci. Z porównania z wynikami poprzednimi, poli(A) RNA z nie indukowanych komórek zawiera mniej niz okolo 1/20 ilosci mRNA hybrydyzujacego do Hif-2hcharaktryzujacej poli(A) RNA z komórek indukowanych.Synteza polipeptydu o aktywnosci interferonu przez E. coli zawierajacy czasteczki rekombi- nantu DNA skorelowane z Z-pBR322-(Pst)/HcIF-4c. Punkt Pstl pBR322 znajduje sie w genie /3-laktamazy (penicylinazy). Tak wiec, gdy kodujacy segment DNA (tj. cDNA zawierajacy calosc lub czesc genu)jest przylaczany w tej pozycji w odpowiedniej orientacji i w odpowiednim szablonie odczytu, moze powstac bialko laczone. Bialko moze skladac sie z amino-terminalnej czesci fi- laktamazy, po której nastepuje aminokwasowa sekwencja, która koduje sekwencja DNA insertu (L. Villa-Komaroff i inni, patrz wyzej). Jezeli segment DNA insertu zawiera sekwencje DNA obejmujaca jej wlasny sygnal poczatkujacy oraz poprzedzajaca go sekwencje z sygnalem stopuja¬ cym w fazie z sekwencja /J-laktamazy, to stopowanie i ponowny start moga nastepowac na drugi sygnal start i moze powstac nie laczone, aktywne bialko (A.C.Y.Chang i inni, patrz wyzej). Dla zapewnienia, by insert DNA skorelowany z Hif-4c byl wprowadzony w odpowiedni szablon28 148 434 odczytu dla ekspresji w zakresie genu /J-laktamazy, zastosowano zestaw pochodnych pB&322, mianowicie pKT279, pKT280 i pKT287 (konstrukcja K. Talmadge, informacja osobista, 1979).Kazda z tych pochodnych ma punkt Pstl umiejscowiony tak, ze przylaczony w tym punkcie insert DNA bedzie w innym szablonie odczytu niz insert w punkcie Pstl innej pochodnej zestawu (fig. 6).Takwiec zestaw umozliwia insercje DNA do genu /J-laktamazy we wszystkich trzech szablonach odczytu.Insert wyciety z Hif-2hza pomoca Pstl otrzymano jak opiano dla fragmentu Hif-4c. Fragment Hif-2h Pst (10 ng) zmieszano z Pstl-rozcietym pBR322, pKT279, pKT280lub pKT287 (w kazdym przypadku lOng) w 20jjI lOmM Tris-HCl (pH 7,5), 6mM MgCl2, lOOmM NaCl, 6mM fi- mcrkaptoetanolu, 200A/g/ml zelatyny i 0,1 mMATPi inkubowano z 0,1 jednostka T4 ligazy DNA (New England Biolabs), w ciagu 16 godzin, w 10°C. Otrzymane czasteczki rekombinantów DNA oznaczono symbolami Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h, Z-pKT279(Pst)HcIF-2h, Z-pKT280(Pst)/HcIF- 2h i Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h. Kazda z tych czasteczek rekombinantów DNA transformowano E. coli HB101, a transformowane kolonie selekcjonowano na plytach agaru z tetracyklina,jak wyzej opisano. Poniewaz oporne na tetracykline klony transformowanych bakterii moga równiez zawie¬ rac recyklizowany wektor, kolonie bakteryjne z kazdego zestawu hodowano na filtrach Millipore, a kolonie hybrydyzujace do fragmentów Hif-4c oznaczonych 32P identyfikowano i selekcjonowano, jak wyzej opisano. Szczepy oznaczono jak nastepuje: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h- AH1) do (-AH3); E. coli HB101 (Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AHl) do (-AH8); E. coli HB101 (Z- pKT280(Pst)/HcIF-2h-AHl) do (-AH8); E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AHl) do (-AH8).Ekstrakty z niektórych z powyzszych szczepów, jak równiez z niektórych ze szczepów Z- pBR322(Pst)/HcIF-SNl do 95 zbadano na aktywnosc IFN-cr. Bakterie hodowano w pozywce tryptonowej do fazy stacjonarnej, zbierano, przemywano 1/20 objetosci (w odniesieniu do obje¬ tosci hodowli) 50 mM Tris-HCl (pH 8), 30 mM NaCl i zamrazano. Po odmrozeniu komórki ponownie zawieszano w nizej podanej ilosci tego samego buforu i dodawano lizozymu do 1 mg/ml.Po 60 mintuach w 0°C zawiesiny zamrazano (w kapieli etanol-suchy lód) i odmrazano (w 37°C), powtarzajac zabieg 5-krotnie, po czym w ciagu 10 minut wirowano z szybkoscia 12 000 obrotów na minute w rotorze GSA Sorvall. W niektórych przypadkach supernatant (S30) dalej wirowano przy 100 000xg w rotorze Type 65 Spinco, odzyskujac supernatanty (S100). Takiesupernatanty podda¬ wano skriningowi na aktywnosc IFN-cr, stosujac próba redukcji efektu cytopatycznego (doswiad¬ czenie 1). Kolonie wykazujace dodatnia odpowiedz w doswiadczeniu 1 badano ponownie, jak równiez 49 klonów z zestawu Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-l do SN-95 opisanego powyzej, w nizszym rozcienczeniu (doswiadczenie 2).Zródlo ekstraktu: E. coli HB 101 transformowany przez: doswiadczenie lx Preparat Aktywnosc IFN-cr (IU/ml) Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h-AH-l do 3 Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH-l do 7 Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH-8 Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AH-2,6,7 Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AH-l,3,4,5 Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-l,2,3,4,5,8 Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-6,7 S30 S30 S30 S30 S30 S30 S30 S30 ? ? ? dodatnia ? dodatnia ? dodatnia x doswiadczenie 1: ekstrakty badane w stezeniu koncowym 1:150148 434 29 Zródlo ekstraktu: E. coli HB 101 transformowany przez: doswiadczenie 2X Preparat Aktywnosc IFN-cr (IU/ml) Z-pKT279/HcIF-2h-AH-8 Z-pKT280/HcIF-2h-AH-l,3,4,5 Z-pKT287/HcIF-2h-AH-6 i 7 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-4,5,7,9,10,ll,13 do 16 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-18 do 22, 24, 25, 27, 30 do 34 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-38 do 41,43 do 48 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-l do 3, 6, 8, 12, 17, 23, 26 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-28, 29, 36, 37,49 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN-35, 42 S30 i S100 S30 i S100 S30iS100 S30 S30 S30 S30 S30 S30 300 300 300 ujemna (< 10) ujemna (< 10) ujemna (< 10) 10 10 200 x doswiadczenie 2: ekstrakty badane w stezeniu koncowym 1:6 xx Hodowle mozna prowadzic w objetosci 3000 litrów lub wickszej.bez utraty aktywnosci IFN Niektóre sposród aktywniejszych producentów zbadano szczególowiej. Hodowle prowa¬ dzono do póznej fazy logarytmicznej (pozorne OD650 okolo 0,9)xx, a komórki poddawano liziejak wyzej, w 1/50 objetosci hodowli. Znaleziono nastepujace aktywnosci, stosujac Z-pBR322 (Pst)/HcIF-SN32 jako kontrole ujemna: Zródlo ekstraktu: E. coli HB 101 transformowany przez: Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h-AH8 Z-pKT280(Pst)/HcIF-2h-AH3 Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42 Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32 Preparat S30, S100 S30, S100 S30, S100 S30, S100 S30, S100 S30, S100 Aktywnosc IFN-orxx (IU/ml) podwójne próby 100; 300 1000; 1000 200; 200 1000; 1000 300; 100 0; 0 x Nalezy rozumiec, ze powyzsza ekspresja moze odzwierciedlacprodukcje interferonu przez geny pod kontrola sekwencji kontrolujacej ekspresje penicylinazy Nalezy rozumiec, ze rzeczywiste bialko produkowane przez te szczepy nie bylo analizowane strukturalnie, dla okreslenia, czy jest ono produkowane zlaczone z aminokwasami nie skorelowa¬ nymi z IFN lub z caloscia lub czescia sekwencji sygnalowej. Jednakze jakieby badz bialko bylo produkowane, przejawia ono immunologiczna lub biologiczna aktywnosc IFN. Takwiec bialko w wytwarzanej postaci jest uzyteczne. Co najwazniejsze, aktywnosc bialka wykazuje, ze kodujaca je sekwencja DNA jest sekwencja skorelowana z HuIFN-a. Takwiec w zakresie wiedzy fachowej lezy stosowanie przedstawionej w niniejszymjsekwencji DNA do selekcji innych podobnych sekwencji DNA skorelowanych z HuIFN-cr, dajacej baze dla innych konstrukcji do ekspresji dojrzalego interferonu lub innych jego wariantów lub zwiekszajacych wydajnosc danego bialka.Poziom produkcji bialka jest sterowany dwoma glównymi czynnikami: liczba kopii jego genu w komórce i wydajnoscia, zjaka te geny sa transkrybowane i translatowane. Wydajnosc transkryp¬ cji i translacji (które lacznie stanowia ekspresje)jest z kolei zalezna od sekwencji nukleotydowych, normalnie usytuowanych przed zadana sekwencja kodujaca. Te sekwencje nukleotydowe lub sekwencje kontrolujace ekspresje okreslaja, miedzy innymi punkt, w którym reaguje polimeraza RNA inicjujac transkrypcje (sekwencja promotorowa), i w którym rybosomy wiaza sie i reaguja z mRNA (produktem transkrypcji) inicjujac translacje. Nie wszystkie takie sekwencje kontrolujace30 148 434 ekspresje funkcjonuja z jednakowa wydajnoscia. Korzystne jest wiec wydzielenie sekwencji kodu¬ jacych zadane bialko z towarzyszacych sekwencji nukleotydowych i przylaczenie ich do innych znanych sekwencji kontrolujacych ekspresje, co faworyzuje wyzszy poziom ekspresji. Po osiagnie¬ ciu tego, nowo skonstruowane fragmenty DNA moga byc insertowane do wielokopiujacego plazmidu lub pochodnej bakteriofagu, w celu zwiekszenia kopii genu w komórce i przez to dalszego zwiekszenia wydajnosci produkcji bialka.W wyzej opisany sposób mozna stosowac szereg sekwencji kontroli ekspresji, takich jak sekwencje wiazania i interakcji operatora, promotora i robosomu (w tym sekwencje takie, jak sekwencja Shine-Dalgarno) operonu laktozowego E. coli („system lac"), odpowiednie sekwencje ukladu syntetazy tryptofanowej E. coli („system trp"), glówne obszary operatora i promotora fagu X (OlPl i OrPr), obszar kontrolnybialka otoczki fagu fd lub inne sekwencje kontrolujace ekspresje genów komórekprokariotycznych lub eukariotycznych i ich wirusów. Dlatego, w celu polepszenia produkcji danego polipeptydu u danego zywiciela, gen kodujacy ten polipeptyd moze byc wytwo¬ rzony,jak poprzednio i usuniety z zawierajacej go czasteczki rekombinantuDNA i umiejscowiony w czasteczce rekombinantu DNA blizszej jej poprzedniej sekwencji kontroli ekspresji lub pod kontrola jednej z powyzszych sekwencji kontroli ekspresji. Takiemetody sa znane.Dalszy wzrost wydajnosci komórkowej zadanego produktu zalezy od zwiekszenia liczby genów, które moga byc stosowane w komórce. Osiaga sie to, dla celów ilustracyjnych, przez insercje czasteczek DNA skonstruowanych wyzej opisanym sposobem do bakteriofagu X (NM989), najprosciej przez trawienie plazmidu enzymem restrykcyjnym, dla uzyskania liniowej czasteczki, która nastepnie miesza sie z nosnikiem klonujacym faga X poddanego restrykcji (tj. przykladowo typu opisanego przez N.E. Murray'a i innych, „Lambdoid Phages That Simplify The Recovery Of In Vitro Recombinants", Molec. gen. Genet. 150, strony 53-61 (1977) i N.E. Murray'a i innych „Molecular Cloning OfThe DNA Ligase Gene From Bacteriophage T4",J. Mol. Biol., 132, strony 493-505 (1979) i czasteczka rekombinantu DNA wyprodukowana przez inkubacja z ligaza DNA. Zadany fag rekombinantowy selekecjonuje sie^jak poprzednio i stosuje do lizogenizowania szczepu zywiciela E. coli.Szczególnie uzyteczne nosniki klonujace X zawieraja wrazliwa na temperature mutacje w genie represyjnym cl i poddajace sie supresji mutacje w genie S, produkt których jest konieczny do lizy komórki zywiciela oraz gen E, którego produkt jest glównym bialkiem otoczki wirusa. Z tym ukladem lizogeniczne komórki hoduje sie w 32°C, a nastepnie ogrzewa w 45°C, dla indukcji odciecia profagu. Przedluzona hodowla w 37°C prowadzi do wysokiego poziomu produkcji bialka, którejest zatrzymywane w komórkach,poniewaz te nie ulegaja lizie pod wplywem produktów genu faga w normalny sposób i poniewaz insert genu faga niejest objety otoczka i pozostaje dostepny do dalszej transkrypcji. Sztuczna liza komórek uwalnia zadany produkt z wysoka wydajnoscia.We wstepnej próbie zwiekszenia wydajnosci polipeptydu o biologicznej lub immunologicznej czynnosci ludzkiego interferonu, produkowanego z zywicieli transformowanych przez Z-pBR322- (Pst)/HcIF-SN35, wyzej opisanym sposobem, okreslono mape restrykcyjna insertu DNA w hybrydzie. Z mapy tej wynika, ze w porównaniu z Hif-2h Hif-SN35 nie ma punktu Pstl flankuja¬ cego terminal 3' sekwencji, czesci sekwencji sygnalowej (do kodonu 7 i wlacznie z nim), a punkt AvaII w sekwencji sygnalowej zostal zastapiony punktem BspII. Tak wiec Hif-SN35jest prawdo¬ podobnie polimorficznym lub allelicznym wariantem Hif-2h.Plazmid Hif-SN35 otwarto za pomoca Pstl, a otrzymany odcinek DNA poddano trawieniu z obu konców, stosujac standardowe metody, po czym wprowadzono do plazmidu fragment LAC- Alu (patrz nizej) i zamknieto plazmid. Okreslono strukture zmodyfikowanego plazmidu, oznaczo¬ nego symbolem Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6,jak równiez sekwencje aminokwasowa i ami- noterminalny koniec bialka produkowanegou E. coli. Nukleotydowa sekwencja tej konstrukcji ma fragment LAC-Alu przylaczony w punkcie odleglym o jeden aminokwas od pierwszego amino¬ kwasu IFN-al (SN35). Sekwencja aminokwasowa aminoterminalnej czesci bialka produkowanego w E. coli wykazuje, ze produkowanejest bialko majace 6 aminokwasów przylaczonych do sekwen¬ cji IFN-al (SN35). Jednakze zywiciele transformowane zmodyfikowanym plazmidem produkuja okolo 100 razy wiecej polipeptydu o biologicznej lub immunologicznej czynnosci ludzkiego interfe¬ ronu leukocytowego niz zywiciele transformowane nie zmodyfikowanym Z-pBR322(Pst)/- HcIF-SN35.148 434 31 Na figurze 25 przedstawiono inna próbe zwiekszenia wydajnosci polipeptydu o immunologi¬ cznej lub biologicznej czynnosci ludzkiego interferonu leukocytowego, produkowanego przez zywicieli transformowanych za pomoca Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 (SN35 na fig. 25). Hybrydowy plazmid rozcieto, standardowymi sposobami, za pomoca Bspl (dar dr Kissa). Po inaktywacji cieplem (65°C, 30 minut) enzymu restrykcyjnego mieszanine doprowadzono do 50 mM Tris-HCl (pH 8) i ogrzewano (37°C, 30 minut). Po ekstrakcji fenolem i eterem izolowano fragment najwie¬ kszy, alcDNA, na agarozie zelujacej w niskiej temperaturze (0,8%) i przylaczono linkery HindllT.Zmodyfikowany fragment przylaczono do rozcietego za pomoca Hindlll plazmidu HS-pBR322- (Eco)/lacUV5-150 („LAC-150")X (dar H. Schallera), przez stopienie odcinków zelu zawierajacych ten fragment (kazdy po okolo 20^1) w 65°C, oziebienie do 37°C i dodanie 20jednostek na fA ligazy DNA T4. Po 16 godzinach w 15°C nastapila ligacja w zestalonym zelu (H. Lehrach, informacja osobista, 1980). Do próbki dodano 1/10 objetosci 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2, 100 mM MgCb, ogrzewano ja w ciagu 5 minut w 65°C i oziebiono do 37°C. Próbki uzyto do transformacji E. coli HB101 traktowanego Ca+2, przez inkubacje w ciagu 20 minut w 0°C, ogrzewanie w ciagu minuty w 42°C i w ciagu 10 minut w 20°C. Po dodaniu 1 mola pozywki tryptonowej próbkijinkubowano w ciagu 60 minut w 37°C i rozlano na plyty z agarem zawieraja¬ cym ampicyline. Z powyzszych hodowli wydzielono plazmid DNA, jak poprzednio i analiza restrykcyjna zidentyfikowano hybrydowy plazmid zawierajacy insert IFN-al z przylaczonym w punkcie 5' fragmentem LAC. Plazmid rozcieto za pomoca EcoRI, konwencjonalnym sposobem i trawiono egzonukleaza BAL-31 (0,06 U/ml, 2-4 minut w 30°C), dla usuniecia ogona EcoRI fragmentu LAC i skrócenia segmentu kodujacego /J-galaktozydaze.Dla zapewnienia, by traktowany plazmid zawieral kompletna sekwencje kodujaca IFN-al, plazmid rozcieto za pomoca Bglll, konwencjonalnym sposobem, przerobionojak poprzednio i na zelu agarozowym (0,8%) wydzielono najwiekszy fragment. Tenfragment polaczono zfragmentem Bsp-BgHI z Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35, a otrzymany plazmid hybrydowy uzyto do transformacji E. coli HB101,jak poprzednio. Transformowanekolonie poddano skriningowi na aktywnosc IFN, jak poprzednio, selekcjonujac klon o najwyzszym poziomie tej aktywnosci. Klon ten oznaczono symbolem E. coli HB101 (C8-IFN~al), a jego hybrydowy plazmid symbolem C8-IFN-al.Analiza sekwencji DNA plazmidu C8-IFN-al wykazala, ze sekwencja kodujaca po triplecie inicjujacym okresla pierwszych siedem aminokwasów /J-galaktozydazy, reszte Pro generowana przez fuzje, aminokwasy 16 do 23 sekwencji sygnalowej IFN-al i sekwencje IFN-al (SN35). Szczepy E. coli minicell (DS410) transformowane hybrydowym plazmidem C8-IFN-al produkuja okolo 50 milionów jednostek IFN na litr lub okolo 2500 razy wiecej polipeptydu o immunologicznej lub biologicznej czynnosci HuIFN niz szczepy trasformowane nie zmodyfikowanym plazmidem Z- pBR322(Pst)/Hif-SN35. Sekwencjonowanie aminokwasów polipeptydu produkowanego przez plazmid C8-IFN-al potwierdza, ze produktjest bialkiem laczonym zawierajacym 7 aminokwasów z /J-galaktozydazy, 1 aminokwas generowany z fuzji i aminokwasy 16-23 sekwencji sygnalowej IFN-al przylaczonej do IFN-al.Ponizej omówiono przyklady róznych konstrukcji wedlug wynalazku zwiekszajacych wydaj¬ nosc bialka, w zwiazku z innymi formami IFN-a.Wlasciwosci aktywnosci interferonowej produkowanej przez E. coli transformowane plazmi¬ dami hybrydowymi. 1. Wrazliwosc aktywnosci IFN-a na trypsyne. 50/ii próbki autentycznego HuIFN-a (aktyw¬ nosc wlasciwa 1,2 • 106 U/mg; 50U) i wyzej opisane ekstrakty E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF- 2H-AH6) ekstrakty („Hif-287-6") (200 U/ml, 10 U) i E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35) („ekstrakty Hif-35") (1000 U/ml; 50 U) inkubowano z róznymi ilosciami trypsyny, jak nizej podano, w ciagu 30 minut w 37°C. Poniewaz ekstrakty S100 maja wysoka zawartosc bialka, natomiast zawartosc bialka HuIFN-a jest niska, mieszanine HuIFN-a i kontrolnego ekstraktu S100 Hif-32 badano równolegle: x Plazmid zawiera fragment HaeIII-202 bp -promotor lac (W. Gilbert i inni, „Lactose Operator Seauen- ces And The Action Of Lac Repressor" w Protein Ligand Interactions, H. Sund i G. Blauer, wydawcy (Berlin, Walter de Gruyter), strony 193-206 oraz K. Backman i inni, „Maximizing Gene Expression On A Plazmid Using Recombination In Vitro", Celi, 13, strony 65-71 (1978), flankowany przez linkerEcoRI na terminalu 3'.32 148 434 Preparat IFN-a Trypsyna 0 0,1 1 10 50 0 0,1 1 10 50 Aktywnosc IFN-a (jednostek) 50 50 50 5 0 15 15 5 1 0 HuIFN-a (50 jednostek w 50//1 ekstraktu S100 Hif-32) Ekstrakt S100 Hif-287-6 (10 jednostek) Takwiec INF-aekstraktów jest wrazliwy na trypsyne, a wiec jest bialkiem Preparat IFN-a Ekstrakt S100 Hif-35 (50 jednostek) Trypsyna tog) 0 0,1 i 10 50 Aktywnosc IFN-a (jednostek) 30 20 20 2 0 2. Zachowanie w chromatografii na Sephadex G-100. Ekstrakt Hif-35 (1 ml) i ekstrakt S100 E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN32) („ekstrakty Hif-32") poddano chromatografii na 32-ml kolumnie G-100 w 4°C, w 50 mM buforze fosforanu K (pH 7,4). Jako wewnetrzny marker dodano cytochromu C (0,2 mg). Szybkosc przeplywu wynosila 2 ml/godzina, zbierano frakcje 1,0 ml.Oznaczano absorbancje przy 280 nm i 405 nm (cytochrom C) i aktywnosc IFN-a. Jak przedsta¬ wiono na fig. 7, aktywnosc IFN-a ekstraktów Hif-35 byla eluowana przed cytochromem C, przy wartosci ko okolo 0,45. Takwiec pozorny ciezar czasteczkowy substancji wynosi od okolo 20 000 do 30000x; we frakcjach kontrolnego ekstraktu Hif-32 nie wykryto aktywnosci. 3. Inhibitowanie aktywnosci interferonowej Hif-35 i Hif-287-6 przez przeciwcialo ludzkiego interferonu leukocytowego. HuIFN-a (aktywnosc wlasciwa 1,2 • 106 IU/mg) i ekstrakty S100 Hif-35/Hif-287-6 inkubowano z róznymi rozcienczeniami surowicy owczej zawierajacej przeciw¬ ciala HuIFN-a (preparatK. Cantella, 24 lutego 1976, aktywnosc wlasciwa 450 000 jednostek/ml) w 100iA Modified Eagles Medium (MEM) z 10% osocza cielecego, w ciagu 30 minut w 37°C, a 45[A badano na aktywnosc IFN-a metoda redukcji efektu cytopatycznego (samo przeciwcialo nie wywoluje efektu cytopatycznego): Preparat IFN-a (jednostek) IFN- (10) ekstrakt Hif-35 (25) Przeciwcialo interferonu leukocytowego (jednostek) 0 0,18 9 450 0 0,18 450 Szczatkowa aktywnosc IFN-a (IU) 5 -0,5 <0,1 <0,1 15 15 <0,1148 434 ekstraktHif-287-6 O 15 (25) 0,18 15 9 <0,1 450 <0,1 Bez O <0,1 450 <(U "Ciezar czasteczkowy okreslony sekwencjonowaniem nukleotydów, bez obróbki karboksyterminalnej, wynosi 19388.W celu wykazania, ze dzialanie przeciwciala nie bylo wywolane efektem niespecyficznym, takimjak degradacja proteolityczna, podobna próbe przeprowadzono z ukladem interferonowym myszy.Przeciwcialo Aktywnosc IFN-a Preparat IFN-a interferonu leukocytowego ukladu myszy (jednostek) (jednostek/ml) (jednostek/ml) Preparat myszy 4500 100 (100 jednostek) 90 100 18 100 Takwiec przeciwciala skierowane przeciw HuIFN-a specyficznie inhibituja aktywnosc IFN-a polipeptydu produkowanego u E. coli transformowanego pewnymi czasteczkami rekombinantów DNA zawierajacymi sekwencje HcIF-2h DNA. Widocznie nizsze powinowactwo przeciwciala IFN-a produkowanego u E. coli moze odzwierciedlac róznice miedzy tym ostatnim a naturalnym HuIFN-a, np. nieobecnosc jednostki weglowodanowej, obecnosc sekwencji sygnalowej lub fuzje do czesci sekwencji /J-laktamazowej. 4. Zmniejszona aktywnosc ekstraktów Hif-35 i Hif-287-6 na komórkach myszy. Komórki ludzkie CCL23 lub komórki myszy L929 traktowano ekstraktami E. coli, HuIFN-a (preparat K. Cantella, aktywnosc wlasciwa 1,2-106 jednostek/mg) lub mysim IF (standard N.I.H.), zaka¬ zono wirusem (wirus Mengo w przypadku komórek ludzkich i wirus VsV w przypadku komórek mysich) i próba redukcji efektu cytopatycznego oznaczono aktywnosc IFN-a: AHH Aktywnosc IFN (jednostek/ml) uklad ludzki uklad mysi Interferon mysi (120 jednostek/ml) Ekstrakty Hif-35 Ekstrakty Hif-287-6 HuIFN-a (100 jednostek/ml) HuIFN-cr (1000 jednostek/ml) - 100 1000 30 300 100 1000 120 13 120 4 40 4 40 Powyzsze wyniki wykazuja, ze ekstrakty Hif-35 i Hif-287-6 wywieraja dzialanie ochronne wobec komórek ludzkich i jedynie slabe dzialanie (—10%) wobec komórek mysich, co jest typowe dla interferonu ludzkiego. 5. Wplyw na pewne funkcje komórkowe. Porównanodzialanie na pewne funkcje komórkowe ekstraktów z E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/Hif-SN35-AHL6)i autentycznego IFN. E. coli IFN-a wykazywal nastepujace wlasciwosci naturalnego IFN-a: (1) zwiekszal naturalna aktywnosc zabija¬ nia limfocytów ludzkich, (2) zwiekszal zalezna od przeciwcial cytotoksycznosc komórkowa, (3) zmniejszal indukowana antygenem i mitogenem inhibicje migracji leukocytów oraz (4) inhibitowal34 148 434 wzrost wrazliwych na IFN komórek chloniaka Burkita, T wlasciwosci sa wskazówka, ze E. coli syntetyzowal aktywnosc IFN-a przeciw ludzkim nowotworom i rakom. 6. Aktywnosc IFN-a bez sekwencji aminoterminalnych. Wykazano, ze E. coli produkuje równiez IFN-a bez sekwencji aminoterminalnych, który wykazuje aktywnosc pokrywajaca sie z aktywnoscia IFN.W celu skonstruowania odpowiedniej czasteczki rekombinantu DNA, plazmid Hif-2h (patrz wyzej) poddano czesciowemu trawieniu przez EcoRI i BmtHI i na zelu agarozowym wydzielono fragment zawierajacy sekwencje kodujaca IFN-al, która polaczono z sekwencja nie kodujaca IFN-al, otrzymana w drodze restrykcji EcoRI/BamHI plazmidu Hif-SN35 nie majacego punktu Pstl przyleglego do terminalu 3' insertu hybrydy, w porównaniu z Hif-2h. Otrzymany plazmid poddano restrykcji za pomoca Pstl/Bgll, dla usuniecia fragmentu aminoterminalnej czesci sek¬ wencji kodujacej IFN-al. W to miejsce wprowadzono szereg fragmentów IFN-al otrzymanych przez trawienie plazmidu Hif-2h za pomoca PvuII, obróbke egzonukleaza Bal, przylaczenie linke- rów Pstl i restrykcje za pomoca Bglll. Otrzymane plazmidy zawieraly szereg sekwencji kodujacych IFN-al, w których brakowalo róznych czesci ich sekwencji aminoterminalnych. Jeden z nich (plazmid 2H-M8) poddano trawieniu za pomoca Pstl i okreslono jego sekwencje nukleotydowa.Sekwencjonowanie wykazalo, ze plazmid 2H-M8 zawiera kilka nukleotydów miedzy punktem PSt a pierwszym kodonem (CYS) IFN-al. Pstl-trawiony plazmid 2H-M8 potraktowano polinukleaza T4/dATP, egzonukleaza SI i trawiono za pomoca Sali. Procedura ta dala serie fragmentów, które w sekwencjach kodujacych IFN-al nie mialy czesci konców aminoterminalnych. Fragmenty te poddano kontroliLAC, przez operatywne przylaczenie ich do fragmentu GUA-LAC otrzymanego z plazmidu Lac3V8 przez trawienie za pomoca EcoRI, traktowanie egzonukleaza SI i trawienie za pomoca Sali. W sekwencjach kodujacych IFN-al otrzymanej serii plazmidów brakowalo róznych czesci ich aminokwasowych konców przylaczonych w kierunku przeciwnym obrotowi wskazówek zegara, poprzez AUG, do fragmentu zawierajacego promotor LAC.Niektóre z tych plazmidów poddano sekwencjonowaniu. Jeden z nich rozpoczyna sie przy piatym aminokwasie IFN-al, a drugi przy dziesiatym aminokwasie IFN-al. U E. coli minicells (DS410) oba te plazmidy produkuja polipeptydy o aktywnosci IFN. Tak wiec nie cale bialko IFN-al jest wymagane do aktywnosci IFN.Identyfikacja klonów E. coli, zawierajacych czasteczki rekombinnatówDNA, których inserty DNA slabo krzyzowo hybrydyzuja do insertów Hif-4c i maja inna mape restrykcyjna niz fragmenty Hif-2h. Porównanie pierwszych 35 aminokwasów autentycznego interferonu limfoblastoidowego (Zoon i inni, patrz wyzej oraz M. Hunkapiller i L. Hood, patrz wyzej) z sekwencja wydedukowana z framentu Hif-2h wykazuje 9 róznic. We wszystkich przypadkach kodony rózniacych sie aminok¬ wasów moglyby byc wzajemnie w siebie przeprowadzone przez zmiane jednej zasady. Sklady aminokwasowe autentycznego interferonu limfoblastoidowego i wydedukowanego z sekwencji fragmentu Hif-2h, w pierwszym przypadku okreslony bezposrednio, równiez wykazuja uderzajace róznice w odniesieniu do zawartosci Gly, Pro, Cys i Met. Róznice te sa zbyt duze, by mozna je bylo wyjasnic polimorfizmem. Najprawdopodobniej odzwierciedlaja one obecnosc co najmniej dwóch nie-allelicznych genów, poniewaz stopien róznicy miedzy tymi dwoma bialkami (26% niedopaso¬ wania) jest podobnyjak w przypadku B-globiny ludzkiej i owczej (23% niedopasowania). Takwiec zbadano klony wykazujace slaba hybrydyzacje do fragmentu Hif-4c, okreslone uprzednio (patrz wyzej) i wyselekcjonowano klon E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/Hc-II-206).Hybrydowy plazmid Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 („HcIF-II-206") tego klonu i jego insert DNA fragment „Hif-II-206" slabo hybrydyzuja do fragmentów Hif-4c i Hif-2h. E. coli transfor¬ mowany plazmidem Hif-II-206produkuje polipeptydy o biologicznej lub immunologicznej czyn¬ nosci HuIFN-a. Fragment Hif-II-206 ma mape restrykcyjna wyraznie rózna od okreslonej dla fragmentu Hif-2h. Porównanieobu tych map restrykcyjnych jest przedstawione na fig. 11. Równiez w tym przypadku absolutne umiejscownienie punktów restrykcji we fragmencie Hif-II-206 nie jest okreslone sama tylko mapa restrykcyjna. Jednakze sekwencjonowanie sekwencji nukleotydowej tego insertu, przeprowadzone wyzej opisanymi, standardowymi sposobami, umozliwia bardziej absolutne okreslenie tych lokacji. Z róznic w mapach restrykcyjnych fragmentów Hif-II-206 i Hif-2H wynika, ze geny interferonu tych dwóch insertów maja rózne sekwencje nukleotydowe.148 434 35 Nawiazujac do fig. 12-16, przedstawiono na nich sekwencje nukleotydowe insertowanych sekwencji DNA - fragmentu Hif-II-206 z kultury HcIF-G i insertowanej sekwencji DNA - frag¬ mentu Hif-2h z kultury HcIF—E (patrz nizej), uprzednio oznaczone i odpowiednie sekwencje aminokwasowe kodowanych przez te sekwencje nukleotydowe bialek. Sekwencje nujleotydowa fragmentu Hif-II-206, czyli fragmentu Pstl (790 bp) plazmidu DNA izolowanego sposobem B N.M. Wilkie'go i innych, Nuci. Acids Res., 7, strony 859-77 (1979) z hodowli HcIF-G okreslono standardowym sposobem wedlug A.M. Maxama i W. Gilberta, patrz wyzej. Zastosowano strategie sekwencjonowania przedstawiono na fig. 17.Poddany restrykcji DNA (zwykle okolo 10//g) oznaczano 5'-terminalnie, jak opisuja N. Man- tei i inni, Gene, 10, strony 1-10 (1980). Oznaczone fragmenty rozcinano drugim enzymem restryk¬ cyjnym, a produkty rozdzielano elektroforetycznie na 5% zelu poliakrylamidowym w buforze Tris-boran-EDTA(A.C. Peacocki C.W. Dingman, Bioch., 6, strony 1818-27 (1967), ekstrahowano z zelu i oczyszczano, jak opisuja W. Muller i inni, J. Mol. Biol., 124, strony 343-58 (1978).Nawiazujac z kolei do fig. 17, poszczególne fragmenty do sekwencjonowania przygotowy- wanojak nastepuje: 25 i 26 - rozciecie Hif-II-206 za pomoca Pstl, oznaczenie, rozciecie za pomoca Bglll, izolacja fragmentu PstT-BgIII (257bp) („25") i fragment PstIx-BglII (279bp) („26"); 21, 22 i 23 - rozciecie Hif-II-206 za pomoca PvuII, oznaczenie, rozciecie za pomoca Bglll, izolacja fragmentu PvuHx-BglII (88bp) („21"), fragmentu PvuIIx-BglII (L76bp) („22") i fragmentu PvuIx-BglII (214bp) („23"); 11, 12, 13 i 14 - rozciecie Hif-II-206 za pomoca Bglll, oznaczenie, rozciecie za pomoca Pstl, izolacja fragmentu BglIIx-PstI (279bp) („14") i wedrujacej wspólnie mieszaniny fragmentów BgllT- Pstl i BglHx-BglHx. Rozcinanie mieszaniny za pomoca PvuII i izolacja fragmentu BglIIx-PstI (257bp) („13"), fragmentu BglIIx-PvuII (176bp) („12") i fragmentu BglIIx-PvuII (88bp) („11"). 27L, 27U, 41,43,44 i 45 - rozciecie Hif-II-206 za pomoca HinfT, oznaczenie, izolacja fragmen¬ tów prekursora: HifnIx-HinfT (113bp) („27P"), HinfT-HinfT (146bp) (28P), HinfT-HinfT (159bp) („30P"), HinfT-HinfT (397bp) („31P") i Hinnx-HinfT(1522bp)(„32"). Rozciecie 28P za pomoca MboII i izolacja fragmentu HinfT-MboII (112bp) („41"). Rozciecie 30P za pomoca MboII i izolacje fragmentu HinfT-MboII (126bp) („43"). Rozciecie 31P za pomoca Pstl i izolacja fragmentu HinfT-Pstl (151bp) („44"). Rozciecie 32P za pomoca Pstl i izolacja fragmentu HinfT-Pstl (139bp) („45"). Separacja pasmowa 27P do uzyskania dwóch pasm („27U") i („27L").Wszystkie segmenty, poza 27U i 27L, sekwencjonowano na obu odcinkach i wzdluz punktów restrykcji, sluzacych jako punkty odniesienia do sekwencjonowania, z wyjatkiem punktu Bglll w pozycji 185.Z porównania sekwencji aminokwasowej kodowanej przez te dwa inserty wynika, ze fragment Hif-II-206 koduje bialko interferono-podobne majace o jeden aminokwas mniej niz fragment Hif-2h (aminokwas 44 (Asp) obecny w Hif-2h nie wystepuje w Hif-II-206). Ponadto, 10% pozycji nukleotydowych i 17% pochodnych reszt aminokwasowych tych dwóch fragmentów sa rózne.Ponadto, w porównaniu z 35 aminokwasami ozanczonymi dla terminalu aminowego interfe¬ ronu limfoblastoidowego /K.C. Zoon i inni, Science, 207, strony 527-28 (1980)/, insert Hif-II-206 koduje bialko rózniace sie 5 sposród 35 reszt aminokwasowych oznaczonych przez Zoona i innych, patrz wyzej. Takwiec musza istniec co najmniej trzy rózne geny IFN typu leukocytowego (typ a) -fragment Hif-2h, fragment Hif-II-206 i gen otoczki IFN Zoona. Zgodnie z nowo zaproponowana nomenklatura interferonów, bialkom kodowanym przez te geny nadaje sie nastepujace symbole: Zródlo genuIFN Bialko Hif-2h IFN-crl Hif-II-206 IFN-cr2 IFN z komórek limfoblastoidowych (Zoon i inni, patrz wyzej) IFN-a336 148 434 Róznice miedzy IFN-al i IFN-a2 odzwierciedlaja sie miedzy innymi w róznym oddzialywaniu na komórki ludzkie CCL23 i komórki nerek zarodka krowiego (BEK): Wzgledna aktywnosc IFNX Ekstrakt CCL23 BEK Stosunek Hif-II-206(IFN-a2) 1,7 1,0 1,7:1 Hif-SN35XX(IFN-al) 0,05 1,0 1:20 x£. coliHB101 zhybrydowymplazmidemhodowano wpozywcetryptonowej,przy wstrzasaniu,do ODesookolo 1-2. Zebrane komórki odwazono, ponownie zawieszono w 1/100 lub 1/20 poczatkowej objetosci hodowli i poddawano lizie metoda lizozym-zamrazanie- odmrazanie (S.Nagata i inni, Nature, 284, strony 316-20 (1980). Supernatanty S-30 badano próba redukcji CPE na plytkach do mikromiareczkowania. Ekstrakty zkomórek kontrolnych bylyujemne (< 1 IU/ml). Komórki ludzkie CCL23 i komórki nerkizarodka krowiego (BEK)(FLOW)hodowanowMEM-10% osoczeplodukrowiego.EkspozycjanaekstraktyzawierajaceIFN trwala 24godziny.Komórki zakazano odpowiednim rozcienczeniem wirusa Mengo i po 24 godzinach badano mirkoskopowo. Wartosci oceniano wizualnie w stosunku do czesciowo oczyszczonego IFN leukocytowego (preparat PIF, dar K.Cantella)o nieznanym mianie. Preparat byl okolo 3 x aktywniejszy na komórkach ludzkich niz krowich."Porównanie map restrykcyjnych Hif-SN35 i Hif-2h sugeruje, ze sa one swymi wariantami polimorficznymi (patrz wyzej).Tak wiec IFN-al jest okolo 30 razy mniej aktywny wobec komórek ludzkich niz IFN-a2.Jednakze oba one sa mniej wiecej aktywne wobec komórek krowich. Tak wiec IFN moga byc uzyteczne nie tylko jako przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe lub przeciwrakowe czynniki ij ludzi, lecz równiez w leczeniu tych chorób u bydla. Przykladowo, preparaty IFN-a moglyby byc stosowane, standardowym sposobem, (patrz wyzej) w leczeniu FMDV lub innych dobrze znanych wirusowych infekcji bydla. Jest to jeszcze sluszniejsze w przypadku IFN-al, poniewaz jego czyn¬ nosc w komórkach bydlecych jest okolo 20 razy wieksza od czynnosci w komórkach ludzkich.Z powodu zwiekszonej wydajnosci uzyskanej w przypadku IFN-al z konstrukcja C8 (patrz wyzej), sporzadzono podobna konstrukcje dla IFN-a2. Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206 poddano cal¬ kowitemu rozcieciu za pomoca Bspl i czesciowemu za pomoca PvuII (w PI) (fig. 28) i z 6% zelu poliakryloamidowego izolowano fragment 867 bp. Ten fragment przylaczono do 2590 bp frag¬ mentu Pyul C8-IFN-alx. Otrzymany hybrydowy plazmid uzyto do transformacji E. coli HB101, a klony poddano skriningowi na aktywnosc IFN. Wyselekcjonowano jeden klon o wysokiej aktyw¬ nosci, który oznaczono symbolem E. coli HB101 (C8-IFN-a2).Sekwencjonowanie DNA hybrydowego plazmidu C8-IFN-a2 wykazalo, ze podobnie jak C8-IFN-al ma on sekwencje kodujaca po triplecie inicjujacym, która okresla pierwszych 7 ami¬ nokwasów /J-galaktozydazy, reszte Pro generowana przez fuzje i aminokwasy 16 do 23 sekwencji sygnalowej IFN-a2. Takwiec i w tym przypadku prawdopodobnajest ekspresja bialka zlaczonego, zawierajacego IFN-a2.Szczepy Minicell transformowane tym plazmidem daly 100-200 milionówjednostek na 1 IFN, czyli 20000 do 40000 razy wieksza wydajnosc IFN-a2 niz transformowane nie modyfikowanym Z-pBR322(Pst)/Hif-II-206.Porównanie wzglednej wydajnosci C8-IFN-al (-50 • 106 jednostek/litr) i C8-IFN-a2 (-100- 200 milionów jednostek na litr) jest w pierwszej chwili zaskakujace, poniewaz jak wykazano, IFN-a2 jest w komórkach ludzkich okolo 30 razy aktywniejszy (patrz wyzej). Jednakze ilosciowa analiza obu bialek wytwarzanych przez szczepy transformowane tymi plazmidami C8 wykazuje, ze w C8-IFN-al zostalo wytworzone okolo 5 do 6 razy wiecej bialka niz w C8-IFN-a2. Takwiec wydajnosci mierzone na podstawie aktywnosci IFN sa w znacznej mierze wyrównywane znacznie wieksza iloscia bialka wytwarzanego w przypadku C8-IFN-al.Nawiazujac do fig. 26, opisano inna konstrukcje zmierzajaca do zwiekszenia wydajnosci IFN-a2. Wpierw sporzadzono plazmid ekspresji zawierajacy fragment LAC Alu, przez restrykcje znanego promotora lac za pomoca Alul i przedluzenie fragmentu, jak pokazano (dla jednego terminalu) na fig. 27, linkerami EcoRI (sporzadzonymi w badaniach wspólpracujacych). Przedlu¬ zony fragment insertowano do pBR322 w punkcie EcoRI, a z konstrukcji odszczepiono maly * C8-IFN-crl ma trzy punkty restrykcji PvuII (fig. 28). Fragment 2590 jest miedzy Pi a P3.148 434 37 fragment EcoRI-EeoRI. Otrzymany plazmid, oznaczony numerem 404 na fig. 26, rozcieto za pomoca Hindlll i PvnII, dla insercji fragmentu zawierajacego IFN-or2. Fragment IFN-a2 otrzy¬ mano przez czesciowa restrykcje za pomoca Sau3A plazmidu Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 („206" na fig. 26), przedluzenie fragmentu Sau3A linkerami Hindlll (fig. 27) i rozciecie za pomoca Bspl. Po insercji tego fragmentu do HindIII-PvuII-rozcietego plazmidu 404, otrzymany plazmid poddano restrykcji za pomoca Hindlll i EcoRI,potraktowano nukleaza S1, dla zblizenia promotoraLAC do genu IFN-cr2 i religowano. Konstrukcja ta, identyfikowana jako plazmid LAC-AUG(a2) ma sekwencje DNA IFN-a2 pod kontrolapromotoraLAC. Sekwencja IFN-a2 nastepuje natychmiast po inicjujacym kodonie AUG tego promotora (patrz fig. 27). Tak wiec co najmniej czesc IFN produkowanego przez te plazmidy bedzie dojrzalym IFN, np. IFN bez aminokwasów z sekwencji sygnalowej. W szczepach Minicell wydajnosc IFN-cr2 otrzymanego za pomoca plazmidu LAC- AUG(cr2) wynosila 5-10 milionów jednostek na litr.Sporzadzono równiez inna konstrukcje IFN-a2 bazujaca na podobnych zasadach laczenia.Tutajsekwencje kontrolujaca ekspresje penicylinazy plazmidu pBR322 polaczono poprzez kodon inicjatora AUG z genem IFN-a2 z Hif-II-206x. Tenplazmid, oznaczony symbolem a-lac-AUG(a2) stosowany do transformacji komórki zywiciela powoduje produkcje IFN-a2 bez przylaczenia do innych sekwencji bialka. U szczepów Minicell obserwowano wydajnosci 50*100 milionów jedno¬ stek na litr. Tenplazmid jest plazmidem najkorzystniejszym do uzycia wedlug wynalazku. Jest on równiez korzystny do uzycia z innymi opisanymi tu genami IFN-a. Korzystnym zywicielem wedlug wynalazku jest E. coli DS410 (ara azide TonAlac y Tsxmin a min b gal X xyl step R). Szczep ten zostal zdeponowany lacznie z przykladem korzystnego plazmidu /5-lac AUG(a2) jako HcIF-K.Podobnymi sposobami i wedlug podobnych zasad mozna otrzymywac inne konstrukcje, stosujac rózne sekwencje promotora, punkty wiazania rybosomu, sekwencje Shine-Dalgarno i rózne opisane tu geny IFN-a. Konstrukcje te sa oczywiscie objete wynalazkem i wchodza w jego zakres.Hybrydowe czasteczki IFN-a 1 i IFN-a2. Skonstruowano szereg hybrydowych czasteczek IFN-al i IFN-a2. Nieoczekiwanie, te hybrydowe konstrukcje majajakosciowo rózne wlasciwosci i aktywnosci w porównaniu z macierzystymi- IFN-al lub IFN-a2.Na figurze 28 przedstawiono schemat czterech sposród tych czasteczek hybrydowych. Dla wygody, te hybrydowe czasteczki oznaczono symbolami plazmid I, II, III i IV.W tych konstruk¬ cjach trawienie enzymami restrykcyjnymi (otrzymanymi z Biolabs, poza Bspl, darem dr Kissa) przeprowadzono zasadniczo jak zalecaja wytwórcy. Czesciowe ciecia DNA przeprowadzano z malejacymi ilosciami enzymu. Po inaktywacji enzymu restrykcyjnego cieplem (65°C, 30 minut), próbki doprowadzano do 50 mM Tris-HCl(pH 8) ijezeli to bylo potrzebne, dodawano alkalicznej fosfatazy z jelita cielecego (Boehringen) (1 objetosc na /ig DNA). Po 30 minutach w 37°C próbki ekstrahowano fenolem i eterem. W wiekszosci przypadków fragmenty DNA wydzielono na agaro- zie o niskiej temperaturze zelowania (0,8%). W celu ligacji, kawalki zelu zawierajace fragmenty (po okolo 20/ii) stapiano w 65°C, oziebiano do 37°C i dodawano ligazy DNA T4 w ilosci 20 U na /A.Mieszanine utrzymywano w ciagu 16 godzin w 15°C. Ligacja nastepowala w zestalonym zelu /H. Lehrach, informacja osobista (1980)/,Dodawano 1/10 objetosci 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM CaCb i 100 mM MgCfe, po czym ogrzewano próbke w ciagu 5 minut w 65°C i oziebiano do 37°C. Z kolei próbki dodawano do szczepów potraktowanych Ca+2, inkubowano w ciagu minuty w 42°C i w ciagu 10 minut w 20°C i dodawano 1 ml pozywki tryptonowej. Po inkubacji w ciagu 60 minut w 37°C hodowle rozlewano na plytach z agarem zawierajacym odpowiedni antybiotyk.Wszystkie plazmidy scharakteryzowano analiza sekwencji nukleotydowej wzdluz laczenia w sek¬ wencji IFN.Czasteczke hybrydowa I, hybryde a-l(PvuII)cr-2 skonstruowano przez czesciowerozszczepie¬ nie C8-IFN-al (patrz wyzej) (C8-al na fig. 28) za pomoca PvuII, defosforylowano, rozcinano za ^a konstrukcja najefektywniej moglaby byc wytworzona praez csesciowe trawienie pBR322 za pomoca MboII, traktowanie SI, przylaczenie linkerów jak poprzednio i ponowne insertowanie fragmentu w punkcie EcoRI pBR322 i delecje jednego punktu EcoRI.Otrzymany plazmid („plazmid 0-lac-AUG") móglby byc nastepnie polaczony z wyzej opisanym fragmentem 206 Sl-traktowany «^(lagodnie)-HindIII-linkerBspI. Po rozcieciu za pomoca EcoRI i potraktowaniu SI i fosfataza, izoluje sie plazmid ekspresji 0-lac- AUG(or2). Konstrukcje z innymi genami mozna wykonac w podobny sposób, stosujac jedynie skonstuowany plazmid /Mac-AUG do insercji innych genów lub konstrukcjiphib korzystniej, stosujac sam punkt Sau3A w plazmidzie 0-lac-AUG(cr2).38 148 434 pomoca Pstl i izolowano fragment PstI-PvuII(P2) 1346 bp. Fragment ten przylaczono do frag¬ mentu 2135 bp PstI(a)-PvuII(P2), sporzadzonego przez totalne rozciecie C8-IFN-a2 (patrz wyzej) (C8-a2 na fig. 28) za pomoca PvuII i czesciowe rozszczepienie za pomoca Pstl.Czasteczke hybrydowa II, hybryde al(BglII)a-2, skonstruowano przez rozciecie czasteczki hybrydowej I za pomoca Bglll. Po defosforylacji izolowano duzy fragment Bglll i ligowano do malego fragmentu C8-IFN-a2. Po klonowaniu hybrydowy plazmid majacy maly fragment Bglll w prawidlowej orientacji zidentyfikowano analiza restrykcyjna.Czasteczke III, hybryde a-2(PvuII)a-l skonstruowano przez czesciowe rozszczepienie C8- IFN-al za pomoca PvuII, defosforylacje, rozszczepienie za pomoca Aval i izolacje fragmentów 1686 bp PvuII(P2)-AvaI i 3233 bp PvuII(Pi)-AvaI. Fragmenty te ligowano nastepnie do HcIF-II- 206 (patrz wyzej) (SN206 na fig. 28), a badajac transformowane szczepy E. coli na aktywnosc IFN-a zidentyfikowano maly fragment PvuII.Czasteczke IV, hybryde a-2(BglII)a-l, skonstruowano przez rozszczepienie C8-IFN-al za pomoca Bglll i Avali izolowano fragment 1776 bp. Fragmentten ligowano nastepnie do fragmentu 3543 bp BglII-AvaI czasteczki hybrydowej III.Oznaczono równiez wzgledna aktywnosc bilogiczna poszczególnych interferonów. Hodowle szczepu DS410 transformowane róznymi plazmidami odwirowywano, przemywano PBS, zawie¬ szano w PBS (okolo 1/20 objetosci poczatkowej) inkubowano w ciagu 60 minutw 0°C z 1 mg/ml lizozymu, 10 mM EDTA, czterokrotnie zamrazano i rozmrazano, rozcierano przez pieciokrotne przepuszczenie przez strzykawke i rozszczepiano przez wirowanie.Uzyskano nastepujace wartosci aktywnosci wobec komórek ludzkich, swinki morskiej, mysich i bydlecych: Wzgledna aktywnosc IFN Zródlo bialka ludzkie bydlece mysie (L) swinki (FS4) (BEK) morskiej C8-IFN-cr2 C8-IFN-crl hybryda I hybryda II hybryda III hybryda IV 1 1 0,03 1 0,001 1 0,001 1 1 1 0,1 1 l 0,01 l 0,3 [ 0,003-0,008 l 0,001 l 1 l 2 0,03 0,03 0,003-0,01 0,01 0,3 0,1-0,005 ujemna kontrola Nieoczekiwanie, wszystkie interferony mialy mniej wiecej taka sama aktywnosc na komór¬ kach bydlecych, natomiast IFN-al i dwie hybrydy FN (I i II), majace aminoterminalna jednostke IFN-al, mialy okolo 10 do 1000-krotnie nizsza aktywnosc na komórkach ludzkich niz IFN-a2 i dwie hybrydy IFN (III i IV) majace aminoterminalna jednostke IFN-22. Jeszcze bardziej uderza¬ jace jest to, ze dwie hybrydy (I i II) z aminoterminalna czescia IFN-al mialy ponad 10-krotnie mniejsza aktywnosc na komórkach ludzkich niz sam IFN-al. Jednakze jedna z hybryd (III) z aminoterminalna czescia IFN-a2 ma w przyblizeniu taka sama aktywnosc na komórkach ludzkiej jak IFN-a2.Identyfikacja genów chromosomalnych IFN-a. Kolekcje hybrydowych fagów wyprowadzo¬ nych z fragmentów chromosomalnego DNA ludzkiego, generowanych przez czesciowe rozciecie za pomoca HaelH i Alul i przylaczenie linkerami EcoRI do ramion A Charon 4A otrzymano, jak opisuja R.M. Lawn i inni, Celi, 15, strony 1157-74 (1978). Tenbank genów poddano skriningowi procedura „in situ" (W.D. Benton i R.W.Davis, Science, 196, strony 180-82 (1977); T. Maniatis i inni, Celi, 15, strony 687,701 (1978), stosujac jako próbnik oznaczony 32P IFN-alcDNA, insert wyciety z pBR322(Pst)/Hif-2h. Z 240000 kolonii metoda wielokrotnej puryfikacji (T. Maniatis i inni, patrz wyzej) wyizolowano 16 klonów fagów o pozytywnej hybrydyzacji. 10 z powyzszych preparatów hybrydowego fagu poddano rozcinaniu za pomoca HindlH, TacI, Hhal, BamHI, EcoRI i Bglll, a wydzielone droga elektroforezy fragmenty (elektroforeza na zelu agarozowym)148 434 39 przeniesiono na membrane Millipore (E.M. Southern, J. Mol. Biol., 98, strony 503-17 (1975) 1 hybrydyzowano z oznaczonym 32Pinsertem Hif-2hcDNA. Fig. 18 podsumowuje wyniki, w postaci czesciowych map restrykcyjnych i róznych tablic. Jak przedstawiono tam, dla kazdego preparatu DNA hybrydowego fagu ustalono co najmniej kilka charakterystycznych punktów restrykcji i obszar(y) hybrydyzujace do próbnika - genu IFN-al (czarna strzalka)\ Nawiazujac do fig. 18 i 24, mozna zauwazyc, ze klony chr-3 i chr-26 moga reprezentowac segmenty DNA zachodzace na siebie na znacznej dlugosci, poniewaz maja wspólnych szereg fragmentów EcoRI i Hindlll. Ponadto, hybrydyzujaca czesc chr-1 ijedna z hybrydyzujacych czesci chr-10 moga byc identyczne, poniewaz fragmenty Hindlll-HindlH i EcoRI-EcoRI, które hybrydy- zuja z próbnikiem Hif-2h, maja te sama dlugosc (odpowiednio 3,2 kb i 0,95 kb). Okazuje sie równiez, ze „prawostronna" hybrydyzujaca czesc chr-16 (oznaczona jako „r" na fig. 18) moze byc identyczna z hybrydyzujaca czescia chr-35, choc zorientowana w przeciwnym kierunku, gdyz kazdy z tych klonów daje fragment 1,4 kb Bglll-BgIII i fragment 2kb EcoRI-EcoIRI, które hybrydyzuja z próbnikiem - cDNA Hif-2h. Takwiec najprawdopodobniej inserty chr-16 i chr-35 zachodza na siebie.Takwiec 13 hybrydyzujacych czesci 11 hybrydowych chromosomalnychDNA nalezy do nie mniej niz 10 odrebnych klas - chr-1, ch-3, chr-12, chr-13, chr-16 (lewa strona, symbol „1" na fig. (18).Na figurze 24 przedstawiono wzajemne zachodzenie na siebie chr-1, chr-3,chr-10 i chr-26oraz chr-16 i chr-35.Powyzsze dane sugeruja, ze genomen indywidualnego czlowieka zawiera nie mniej niz 10 róznych sekwencji DNA krzyzowo hybrydyzujacych do Hif-2h. Konkluzje te wzmacnia fakt, ze udzial wykrytych w banku klonów sekwencji skorelowanych z Hif-2h wynosi okolo 1:16000.Przyjmujac wartosc 3 • 109bp dla haploidowego genomu ludzkiego, oczekiwana wartosc dla poje¬ dynczej kopii genu o przecietnej wielkosci fragmentu DNA 16 kb (wartosc przecietna dla badanych klonów) wynosi okolo 1:190000. Takwiec czestotliwosc fragmentów skorelowanych z Hif-2hjest okolo 12 razy wieksza niz oczekiwana dla pojedynczego genu.Dla porównania, gdy Lawn i inni (patrz wyzej) poddali skriningowi 300000 klonów z tego samego banku genów, stosujac jako próbnik cDNA/J-globiny, zidentyfikowali jedynie 2 dodatnie klony, przy oczekiwanej wartosci 1,6:300000. Tak wiec w genomenie ludzkim moze byc 10-15 odrebnych segmentów chromosomalnego DNA krzyzowo hybrydyzujacych do fragmentu Hif-2h lub IFN-alcDNA.Dalsza charakteryzacja Hif-chr35. Dla celówjedynie ilustracyjnych, dalej scharakteryzowano sekwencje hybrydyzujaca chr-35 („Hif-chr-35"). Nalezy rozumiec, ze hybrydyzujace czesci wyzej opisanych chromosomalnych fagów hybrydowych mozna podobnie charakteryzowac i przerabiac, mieszczac sie w zakresie wynalazku.Hybrydyzujaca czesc chr-35 („Hif-chr-35")(i prawostronny segment Hif-chr-16, z którymjest ona najprawdopodobniej identyczny, patrz wyzej) jest jedyna czescia chromosomalnego DNA ulegajacego hybrydyzacji majaca punkt Bglll. Poniewaz IFN-al i IFN-a2 maja odpowiednio 1 i 2 punkty Bglll w swych sekwencjach kodujacych, wydaje sie, ze Hif-chr-35jest czescia uzupelniajaca do jednego z dwóch uprzednio klonowanych genów interferonowych. Silna hybrydyzacja Hif-ch~ 35 do terminalu 3' fragmentu cDNA Hif-2h (zawierajacego jedynie obszar nie kodujacy 3'), w porównaniu ze slabsza hybrydyzacja do tego próbnika innych chromosomalnychDNA odpowiada prawdopodobnej odpowiedzialnosci Hif-chr-35 i Hif-2h /F.Kafatos i inni, Proc. Natl, Aca. Sci.USA, 74, strony 5618-22(1977)/.Dla dalszego zanalizowania fragmentu Hif-chr-35,wycieto z chr-35fragment Hindlll-BamHL Fragment ten (3,4 kb) zawiera hybrydyzujaca czesc („Hif-ch-35")chr-35. Fragmentsubklonowano w punkt Pstl pBR322, stosujac dobrze znana procedure ogonowania dC-dG (L. Villa-Komaroff i inni, patrz wyzej), a otrzymana czasteczka rekombinantu DNA transformowano E. coli HB101, stosujac dobrze znane procedury /(np. S. Nagata i inni, Nature, 284, strony 316-20 (1980)/."Zacieniony obszar chr-16 na fig. 18 i 24 reprezentuje sekwencje slabo hybrydyzujaca do cDNA Hi&h, nie przejawiajaca R-looping.40 148 434 Klony tych transforpantów poddano skriningowi przez hybrydyzacje kolonii in situ /D. Hanahan i M. MeSlson, Gene, 10, strony 63-67 (1980)/ za pomoca oznaczonego 32P fragmentu Hif-2h (patrz wyzej) i wydzielono plazmid DNA - Z-pBR322(Pst)/HchrIF-35HB („HchrlF- 35HB") z klonów dodatnich /N.M. Wilkie i inni, Nucleic Acids Res., 7, strony 859-77 (1979)/; metoda B). Orientacje insertu hybrydy „fragment HchrIF-35HB" w plazmidzie w stosunku do genu /J4aktamazy pBR322 okreslono przez rozciecie EcoRI i rozdzielenie otrzymanych fragmentów wedlug ich wielkosci. Insert zachodzacy na sekwencje kodujaca/3-laktamaze oznaczono symbolem a, a insert o orientacji przeciwnej symbolem fi.Dodatnie klony hodowano do OD650 — 0,8, a zebrane bakterie poddano lizie metoda lizozym- zamrazanie-odmrazanie (S. Nagata i inni, patrz wyzej). 7 sposród 10 badanych klonów wykazalo aktywnosc IFN-a 75 do 500 jednostek/g komórek (próba redukcji efektu cytopatycznego).Insert DNA jednego z powyzszych siedmiu klonów produkujacych IFN - E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HchIF-35HBa) - scharakteryzowano dalej analiza restrykcyjna i oznaczeniem sekwencji nukleotydowej. Z klonu otrzymano plazmidowy DNA (HchrIF-35HBcr), jak wyzej opisano i metoda Smith-Birnstiel /H.O. Smith i M.L. Birnstiel, Nuci. Acids Res., 3, strony 2387-98 (1976)/ oznaczono punkty restrykcji: HchrIF—35HBor trawiono za pomoca EcoRI, oznaczono w terminalu 5' i trawiono za pomoca BglH (oraz za pomoca Pstl, dla odciecia niepozadanego fragmentu o okolo 1 kb). Fragmenty 1,04 kb EcoRI-BgIII (3' proksymalny) i 0,96 kb EcoRI-BgIII (5' proksymalny) wyizolowano elektroforeza na zelu agarozowym, jak opisuja A.C. Peacock i C.W. Dingman, Biochemistry, 6, strony 1818-27 (1967). Oba fragmenty czesciowo rozcieto, odpo¬ wiednio za pomoca Hinfl, Bspl i Mbol, a produkty rozdzielono na zelu agarozowym w buforze Tris-octanowym (pH 7,8) zawierajacym lyug/ml bromku etidiowego. Po oznaczeniu, radioak¬ tywne pasma uwidoczniono autoradiograficznie. Podobnie oznaczono punkty BstNI i HgiAI fragmentu 1,04 kb (3' proksymalnego). Wyniki analizy przedstawiono na fig. 19.W celu okreslenia sekwencji nukleotydowej, HchrIF-35HBa rozcieto enzymami restrykcyj¬ nymi, a produkty rozdzielono elektroforeza na 5% zelu poliakrylamidowym w buforze Tris-boran- EDTA (A.C. Peacock i C.W. Dingman, patrz wyzej), ekstrahowano na zelu i oczyszczono, jak opisuja W. Muller i inni, J. Mol. Biol., 124, strony 343-58 (1978).Zastosowana strategia sekwencjonowania jest przedstawiona na fig. 19 i opisana jak nastepuje: 1 i 2 - rozciecie HchrIF-35HBcr za pomoca BglH, oznaczenie, rozciecie za pomoca EcoRI i Pstl i izolacja fragmentów BglIx-EcoRI (940 bp) („1") i BglIIx~EcoRI (360 bp) („2"); 3 i 4 - rozciecie HchrIF-35HBa za pomoca EcoRI, oznaczenie, rozciecie za pomoca Bspl i izolacja fragmentów EcoRf-BspI (680 bp) („3") i EcoRIx-BspI (880 bp) („4"); 5, 6, 7 i 8 - rozciecie HchrIF-35HBcr za pomoca PvuII, oznaczenie, rozciecie za pomoca BglH i EcoRI i izolacja fragmentów PvuIIx-EcoRI (780 bp) („5"), PvuIIx-BglII (215 bp) („6"), PvuIIx- Bglll (90 bp) („7") i PvuIIx-EcoRI (290 bp) („8"); 9 i 10 - rozciecie HchrIF-35HBa za pomoca EcoRI, izolacja elektroforeza na 1% zelu agarozowym w buforze Tris-boran-EDTAfragmentu 1300 bp EcoRI-EcoRI, dalsze rozciecie za pomoca Hinfl i izolacja fragmentu Hinfl-Hinfl (180 bp). Oznaczenie wiekszego fragmentu Hinfl- Hinfl i rozciecie za pomoca MboII umozliwilo izolacje HinfT-Mbofll (190 bp) („9"). Oznaczenie krótszego fragmentu Hinfl-Hinfl i rozciecie za pomoca AvaII umozliwilo izolacje HinfIx-AvaII (150 bp) („10"); 11- rozciecie HchrIf-35HBcr za pomoca MboII, oznaczenie, rozciecie za pomoca BglH i izolacja fragmentu MboIIx-BglII (465 bp) („11"); 12, 13 i 14 - rozciecie HchrIF-35HBcr za pomoca Bspl i BglH, izolacja elektroforeza na zelu agarozowym, jak wyzej, fragmentu 1200 bp BspI-BgHI i (a) rozciecie za pomoca HgiAI, oznacze¬ nie, rozciecie za pomoca MboII i izolacja fragmentu HgiAIx-MboII (300 bp) („12") i fragmentu HgiAIx-MboII (360 bp) („13") lub (b) rozciecie za pomoca BstNI, oznaczenie, rozciecie za pomoca EcoRI i izolacja fragmentu BstNIx-EcoRI (380 bp) („14").Poszczególne fragmenty sekwencjonowano procedura Maxama-Gilberta (patrz wyzej).Wszystkie fragmenty sekwencjonowano na obu odcinkach i wzdluz punktów restrykcji, które sluzyly jako punkty odniesienia w sekwencjonowaniu.148 434 41 Porównanie sekwencji nukleotydowych regionów kodujacych HchrIF-35HBa i Hif-2h (fig 8-10 i fig. 20-23) wykazuje, ze nie sa one identyczne. Nieoczekiwane jest zwlaszcza to, ze b*ak wskazan obecnosci intronów w sekwencji kodujacej fragmentu HchrIF-35HBcr, tj. miedzy punk¬ tem Hinfl w nie kodujacym obszarze 5' apunktem EcoRI w nie kodujacym obszarze 3'. Takwiec nic wykryto intronów w sekwencji chromosomalnej odpowiadajacej dojrzalemu IFN-crmRNA.Dalsza charakteryzacja Hif-chr-26i Hif-chr-3. Zawierajace gen sekwencje chr-3 i chr-26, które sa identyczne w analizie heterodupleksowej lecz róznia sie w co najmniej jednym punkcie restrykcji Bglll, zbadano w drodze sekwencjonowania nukleotydów. Znaleziono 5 róznic nukleotydowych w 725 parach zasad, w tym jedynie dwie w sekwencjach kodujacych. Poniewaz nie tylko geny, lecz co najmniej 3,5 Kbp i 6,0 Kbp odpowiednio przed i za nimi tworza doskonaly heterodupleks i poniewaz róznice sekwencji sa stosunkowo male, obejmujac zmiane jedynie 2 aminokwasów, okazuje sie, ze Hif-chr3 i Hif-chr26 sa allelicznymi formami tego samego genu. Oznaczono je symbolami IFN-cr4a (Hif-chr3) i IFN-cr4b (Hif-chr26). Sekwencje nukleotydowa i odpowiednia sekwencje aminokwasowa IFN-cr4b oznaczono konwencjonalnymi technikami sekwencjonowa¬ nia, wyzej opisanymi i przedstawiono na fig. 29-32.Z porównania fig. 29-32 z fig. 8-10, 12-16 i 20-23 wynika, ze bialka kodowane tymi sekwen¬ cjami róznia sie miedzy soba okolo 15% reszt. Takaróznica jest typowa dla genów nie-allelicznych, które zróznicowaly sie przed 20-90 milionami lat.Ekspresja Hif-chr35 w komórkach myszy. Plazmid Z-pBR322(Pst)/HchrIF-35HB a (patrz wyzej) uzytojako zródlo fragmentu Hif-chr35 do ekspresji w komórkachmyszy.Plazmid poddano restrykcji za pomoca Pstl i poddano dzialaniu 5' egzonukleazy, dla usuniecia ogonów 5' dG.Fragment ten insertowano nastepnie do 5' dG-ogonowanego fragmentu KpnI plazmidu otrzyma¬ nego przez polaczenie fragmentów BamHI-BamHI pBR322 i DNA polynoma. Powstaly wektor uzyto do transformacji komórekmyszy 3T3, stosujac technike fosforanu wapnia /N. Mantei i inni, Nature, 281, strony 40-46 (1979)/. Transformowanekomórki oznaczono, dla wygody, symbolem Mouse 3T3 (polynoma-Hif-chr35). Po 20-40 godzinach próby wykazaly aktywnosc 300 jedno¬ stek/ml na komórkach ludzkich i okolo 3000 jednostek/ml na komórkach bydlecych.Nalezy oczywiscie rozumiec, ze sekwencje nukleotydowe przedstawione na fig. 8-10, 12-16, 20-23 i 29-32 nie biora pod uwage zadnych modyfikacji sekwencji nukleotydowych,jak mutacje, w tym jedno- lub wielokrotne substytucje zasad, insercje, inwersje lub delecje, które badz to mialy miejsce, badz tez moga byc stosowane nastepnie. Ponadto, sekwencja nie bierze takze pod uwage mozliwej substytucji innych kodonów kodujacych te same aminokwasy co kodon przedstawiony na figurach. Takwiec nalezy rozumiec, ze takie zmodyfikowane sekwencje kodujace polipeptydy o immunologicznej lub biologicznej aktywnosci IFN-a równiez objete sa wynalazkiem.Nalezy ponadto rozumeic, ze sekwencje aminokwasowe przedstawione na fig. 8-10, 12-16, 20-23 i 29-32 nie biora pod uwage modyfikacji polipeptydów spowodowanych ich interakcja in vivo in vitro z róznymi czynnikami, jak np. enzymami glikolizacji. Tak wiec nalezy rozumiec, ze fragmenty i pochodne tych polipeptydów, które wykazuja immunologiczna lub biologiczna aktywnosc IFN-a równiez stanowia czesc wynalazku.Produkcja polipeptydów przejawiajacych immunologiczna lub biologiczna czynnosc interfe¬ ronu u zywicieli bakteryjnych. Poniewaz próba redukcji efektu cytopatycznego /W.E. Stewart II i S.E. Sulkin, S. E. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 123, strony 650-53 (1966)/ mozna wykryc sladowe ilosci IFN - mniej nizjedna aktywna czasteczke na komórke bakteryjna - na obecnosc IFN zbadano lizyty E. coli HB101 zainfekowanych 10 hybrydowymi fagami A. 1 sposród 11 fagów wszystkie (oprócz chr-10, chr-12, chr-19 i chr-27) daly lizaty zawierajace aktywnosc IFN wielkosci 3 do 50 jednostek/ml. W przypadku chr-10i chr-12hybrydyzacja (do Hif-2h)fragmentów Hindlll-Hindlll lub EcoRI-EcoRI, subklonowanych w punktach Pstl pBR322, jak wyzej opisano, powodowala pojawienie sie aktywnosci u E. coli. Poniewaz,jak sie przyjmuje, E. coli nie sa zdolne do laczenia mRNA /O. Mercereau-Puijalon i P.Kourilsky, Nature, 279, strony 647-49 (1979)/, te chromoso- malne geny IFN-a najprawdopodobniej nie zawieraja intronów w obszarze kodowania.Wnioski koncowe. Wyizolowano zestaw czasteczek rekombinantów DNA zawierajacych cDNA sporzadzony z poli(A) RNA leukocytów ludzkich traktowanych (indukowanych) wirusem Sendai, których reprezentanci maja nastepujace wlasciwosci: (1) hybrydyzuja do poli(A) RNA z indukowanych leukocytów ludzkich, lecz nie do poli(A) RNA z leukocytów nie indukowanych42 148 434 (2) hybrydyzuja do IFN-amRNA, jak wykazano ich zdolnoscia selekcji tego RNA z meisza- niny róznychRNA i ich zdolnoscia do inhibitowania (odwracalnie) translacji interferonu mRNA w próbie translacaji stopowanej hybryda (3) E. coli zawierajace pewne czlony tego zestawu produkuja zwiazek o nastepujacych wlasciwosciach: (a) jest wrazliwy na trypsyne (b) wykazuje aktywnosc IFN-a w ukladzie komórek ludzkich i jedynie slaba aktywnosc w ukladzie komórek mysich (c) ma ciezar czasteczkowy miedzy 20 000 a 30 000 (19 388 na podstawie sekwencji nukleoty- dowej z fig. 8-10) (d) aktywnosc IFN-a tego zwiazku jest specyficznie inhibitowana przeciwcialem ludzkiego interferonu leukocytowego (4) inserty hybrydowych plazmidów wedlug wynalazku oprócz zdolnosci selekcjonowania IFN-amRNA z mieszaniny róznych RNA wykazuja zdolnosc selekcjonowania IFN-aDNA z róznych zródel, równiez z cDNA i z mieszanin chromosomalnych DNA z banków genów fagów hybrydowych (5) istnieje szereg róznych chromosomalnych genów IFN-a; nieoczekiwanie, geny te nie maja intronów i umozliwiaja bezposrednia ekspresja interferonu i interferono-podobnych polipeptydów u odpowiednich zywicieli (6) co najmniej trzy sekwencje nukleotydowe insertów DNA tych czasteczek rekombinantów DNA sa rózne, co sugeruje istnienie co najmniej trzech nie-allelicznych genów IFN-a (7) bialka kodowane przez te trzy sekwencje nukleotydowe róznia sie od sekwencji 35 ami¬ nokwasów oznaczonej dla autentycznego interferonu limfoblastoidowego (8) hybrydowe bialka produkowane przez rózne kombinacje segmentów genu IFN-a wyka¬ zuja wlasciwosci jakosciowo rózne i rózniace sie od wlasciwosci bialek macierzystych, a bialka z dodatkowymi aminokwasami przylaczonymi do IFN-a lub bialka zawierajace IFN-a bez czesci ich sekwencji amino-terminalnej wykazuja aktywnosc IFN.Z powyzszych wlasciwosci wynika, ze opisane czasteczki rekombinantów DNA zawieraja co najmniej czesc sekwencji kodujacej ludzki interferon leukocytowy i ze pewne z tych plazmidów prowadza do ekspresji u E. coli polipeptydu o immunologicznej lub biologicznej czynnosci leuko¬ cytowego interferonu ludzkiego. Winno byc równiez oczywiste, ze w zakresie wynalazku miesci sie fragmentowanie, modyfikowanie i derywatyzowanie opisanych polipeptydów, ogólnie znanymi sposobami.Mikroorganizmami i czasteczkami rekombinantów DNA wytwarzanymi opisanymi w niniej¬ szych sposobach sa przykladowo szczepy zlozone w zbiorze szczepów Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Gottingen, RFN, dnia 7 stycznia 1980 i oznaczone symbolami HcIF-A do E: A: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-4c); B: E, coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-2h); C: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35); D: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN42); E: E. coli HB101 (Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6).Szczepy te maja w zbiorze numery odpowiednio DSM 1699-1703.Ponadto, przykladami mikroorganizmów i czasteczek rekombinantów DNA wytwarzanych opisanymi sposobami sa szczepy zlozone w zbiorze szczepów American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, 27 marca 1980, oznaczone symbolami HcIF-G do H, majace w ATCC numery odpowiednio 31633 i 31634: G: E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206); H: E. coli HB101(Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35-AHL6).Dalszymi przykladami mikroorganizmów wytworzonych opisanymi sposobami sa szczepy zdeponowane w zbiorze szczepów Dutsche Sammlung von Mikroorganizmen, Gottingen, RFN dnia 1 pazdziernika 1980, oznaczone symbolami HchrIF—A doJ, majace w zbiorze numery DSM 1914-1923: A. subklonowany Hindlll fragment chr-3 u E. coli HB101; B. subklonowany EcoRI fragment chr-12 u E. coli HB101; C. subklonowany Hindlll fragment chr-12 u E. coli HB101; D. subklonowany EcoRI fragment chr-13 u E. coli HB101; E. subklonowany EcoRI fragment chr-23 u E. coli HB101; F. subklonowany Hindlll fragment chr-23 u E. coli HB101; G. subklonowany EcoRI fragment chr-26 u E. coli HB101; H. subklonowany Hindlll fragment chr-26 u E. coli14*434 43 HB101; I. subklonowany Hindlll/BamHI fragment chr-35 u E. coli HB101; J. subklonowany BamHI fragment chr-35 u E. coli HB101.Kolejnymi przykladami mikroorganizmów wytworzonych opisanymi sposobami sa szczepy zlozone w American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, grudzien 1980, oznaczone symbolami HchrIF—K do HchrIF-Q i HcIFF-I do HcIF-K i numerami ATCC 31760-31766.Sa to: K. subklonowany Tac-Tac fragment chr-23 u E. coli HB101; L. subklonowany Bglll- Bglll fragment chr-101 u E. coli HB101; M. subklonowany Hindll-Hindlll fragment chr-lOr u E. coli HB101; N. subklonowany Bglll-Bglll fragment chr-26 u E. coli HB101; O. subklonowany Hindlll-Hindlll fragment chr-30u E. coli HB101; P.subklonowany Bglll-Tacfragmentchr-13 u E. coli HB101; Q. subklonowany Bglll-Tacfragment chr-16 1 u E. coli HB101; HcIF-I: E. coli DS410 (C8-IFN-a2); HcIF-J: E. coli DS410 (LAC-AUG(a2)), HcIF-K: E. coli DS410 (/J-Lac-AUG(a2)).W opisie przedstawiono szereg wykonan wynalazku. Jest oczywiste, ze opracowana konstruk¬ cja podstawowa moze byc zmieniana, dla uzyskania innych wykonan, stosujacych sposoby i kompozycje wedlug wynalazku. Wynalazek jest okreslony zastrzezeniami, a nie przykladami wykonan, które zostaly przedstawione jedynie w celu zilustrowania wynalazku.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania polipeptydu typu IFN-a, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle organizmu gospodarza stransformowanego zrekombinowana czasteczka DNA zawierajaca sek¬ wencje DNA wybrana z a) insertów DNA nastepujacych zrekombinowanych czasteczek: Z- PBR322(Pst)/HcIF-2h [DSM 1700], Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 [DSM 1701], Z-pBR322(Pst)/ HcIF-SN42 [DSM 1702] i Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6[DSM 1703], b) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wyzej podanymi insertami i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz c) sekwencji DNA, które sa zdegenerowane w wyniku degeneracji kodu genetycznego i odpowiadaja insertom DNA i sekwencjom DNA okreslonym w a) i b) i które koduja polipeptyd typu IFN-a, polaczona z sekwencja kontrolujaca ekspresje, przy czym hodowle prowadzi sie w srodowisku i w warunkach odpowiednich dla danego gospodarza, po czym zbiera sie wytworzony w srodowisku hodowli polipeptyd. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencja b), która hybrydyzuje z wyzej podanymi insertami a) i która koduje polipeptyd typu IFN-a jest wybrana z: d) insertów DNA zrekombinowanych czasteczek Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 [ATCC 31633] i Z-pBR322(Pst) /HcIF-SN35-AHL6[ATCC31634], e) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wymienionymi inser¬ tami i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz f) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degene¬ racji kodu genetycznego i odpowiadajacych insertom i sekwencjom okreslonym w d) i e) i koduja¬ cych polipeptyd typu IFN-a. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze sekwencja DNA okreslona powyzej w b) lub e), która hybrydyzuje z insertami a) lub d), wybranajest sposród g) Hindlll fragmentu Hif-chr3 [DSM 1914], EcoRI fragmentu Hif-chrl2 [DSM 1915], Hindlll fragmentu Hif-chrl2 [DSM 1916], EcoRI fragmentu Hif-chrl3 [DSM 1917], EcoRI fragmentu Hif-chr23 [DSM 1918], Hindlll frag¬ mentu Hif-chr23 [DSM 1919], EcoRI fragmentu Hif-chr26 [DSM 1920], Hindlll fragmentu Hif- chr26 [DSM 1921], Hindlll-BamHI fragmentu Hif-chr35 [DSM 1922], BamHI fragmentu Hif- chr35 [DSM 1923], Tac-Tac fragmentu Hif-chr23 [ATCC31760], Bglll-Bglll fragmentu Hif-chr10 5[ATCC 31761], Hindlll-Hindlll fragmentu Hif-chrlOr [ATCC 31762], Bglll-Bglll fragmentu Hif-chr26 [ATCC 31763], Hindlll-Hindlll fragmentu Hif-chr30 [ATCC 31764], Bglll-Tacfrag¬ mentu Hif-chrl3 [ATCC 31765] i Bglll-Tacfragmentu Hif-chrl6 I[ATCC 31766], h)sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wyzej wymienionymi sekwencjami DNA i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz i) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degeneracji kodu genetycznego i odpowiadajacych insertom i sekwencjom DNA okreslonym w g) i h) i kodujacych polipeptyd typu IFN-a. 4. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze sekwencja DNA okreslona powyzej wb) ltib e), która hybrydyzuje z wymienionymi insertami DNA a) lub d) jest wybrana sposród j)44 148 434 hybrydyzujacych czesci chromosomowych sekwencji DNA Hif-chrl9 i Hif-chr27, k) sekwencji DNA, które hybrydyzuja w wyzej wymienionymi sekwencjami DNA i koduja polipeptyd typu IFN-a i 1) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degeneracji kodu genetycznego odpowiada¬ jacych insertom i sekwencjom DNA okreslonym w g) i h) i kodujacych plipeptyd typu IFN-or. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca sekwencje DNA wybrana z sekwencji o wzorach: ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCT CTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCAGAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTGATGCTCCT GGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGATTT CCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATG AGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGA GGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGT GTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGCCTG TGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCC TGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCAAGAAAG ATTAAGGAGGAAGGAA, i TGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACC TTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACT TTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTC CTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTC ATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCT GAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAA TGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGA GAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTC TTTATCAACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca sekwencje DNA wybrana z sekwencji DNA o wzorze: TTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTG- ATCTGCCTCAAACCCACAGCCT GGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTC- TCCTG CTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTC- CAAAA GGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCA- GCAC AAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAA- CTCTA CCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGGTGGATACAGGGGGTGGGGGTGACAG- ACACTCC CCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACT- CTCTAT CTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATC- ATGAGA TCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA i TGTGAT- CTGC CTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGA- GGAGAAT CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGT- TTGGC AACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGA- TCTTCA ATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAA- ATTCTA CACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGT- GGGGGTG148434 45 ACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCC- AAAGAA TCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAG- AGCAGA AATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAG- GAA, 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca sekwencje DNA wybrana z sekwencji DNA o wzorze: ATGGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGGCCGTGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCAT- CTGTT CTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGAC- CTTGATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGAC- AGACATGATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAG- ACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAG- CACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACT- GAACTTTACCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTG TGATACAGGAGGTTGG- GGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAAT- ACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTG- GGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAA- AAAA GATTAAGGAGGAAGGAT i TGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTA- ATAGGAGGACCTTGATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTG- CCTGAAGGACAGACATGATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCA- GTTCCAGAAGACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTC- AATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAA- AATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATGAC CTGGAAGCATGTGTGATAC- AGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTG- TGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCC- TTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACA AACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGAT. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca jako sekwencje kontrolujaca ekspresje sekwencje wybrana sposród nastepujacych: uklad lac, uklad /Mac, uklad trp, znaczne regiony operatora i promotora faga ^, region kontrolny bialka otoczki fd i inne sekwencje, które kontroluja ekspresje genów w komór¬ kach prokariotycznych i eukariotycznych i ich wirusach. 9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany zrekombinowana czasteczka DNA wybrana sposród C8-IFN-al, C8-IFN-a2, LAC-AUG (al) i /3-lac-AUG(a2). 10. Sposób wedlug zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, ze hodowany gospodarz wybrany jest sposród szczepów E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, drozdzy, innych grzybów, myszy i innych gospodarzy zwierzecych, gospodarzy roslinnych i komórek tkanek ludzkich.148434 LUDZKIE LEUKOCYTY I WIRUS I SEA/DAl INDUKOWANE LUDZKIE LEUKOCYTY FIG. I I EKSTRAKCJA l^o^CELUUDZY EsgRl ZmKNA YmftNA ZC DNA ,* YcDNA,*'* POLY (A) RNA ""^IFmRNA [ODWROTNA ?TRAN SKRYPTAZA \ HcONA • \ |o*»FOLIMERAZA I „^/TERMINALNA TRANSFERAZA ? DEZOKSTNUKLEOTYDf- ** * -LOWA 51 NUKLEAZA ^' W^ A*p* Tei* Amp* sW- CCc" dcrP/TERMINALNA TRANSFERAZA DEZOKSYNUKLEOTY DYLDWA ,o ' ..•c i! ,cC P§t I Amp Tet* pBR3ZZZcDNA pB322-YcDMA pB322-IfcDHA pB32Z-Kc DA/A1484* FIG. 2 O E. coli a 1776 f6A322-XcDHA pB*3U - Yc DNA fBA *L2 - Ze DNA I f8* S22-irc DNA }312YcDNA ^ ^rPbRhlllcDNA p6R322-IFc ONA rAmf \ rA«,* *!' QXcM* ^ YcDN* ET/\ P A rAmpR 7 ff X Amp* -£7'- i ' rArnpt + —di B ZcDNA 7.IFcDHA ETAP o ^.r.:^ ; ^ Amff ¦*»*"* ^ YmRNA + POLY(A)RHA 'imRNA \fmRNA +POLY(A)RNA ETAP C \ ETAP o "\ \ ETAP £ "X % PRÓBA UJEMNA PRÓBA DODATNIA148434 FIG. 3 pBR322-XcONA 32 P-H,f-4cest FRAGMENT EKSPOZYCJA NA PROMIENIE l RENTGENOWSKIE REAKCJA UJEMNA pBR322-IFcD*A 32 PHif-tcPsL FRAGMENT 32p-nif.4c rat FRAGMENT EKSPOZYCJA NA PROMIENIE RENTGENOWSKIE REAKCJA DODATNIA FIG. 4 acs *r (o) B^l E (41fi).Afc2 1(3*0. £to*I C3620) Atl(36t() Bjj I (3469) *4h?H(2M-9)148434 FIG. 5 Hind m &l ^Poznaczenie co %ki j'POZNACZENIE CO & DENATUROWANY ?(tolfr* RNA S' -At*r-IFmRNA Cttl Psi I 0) Pak l 9) DENATUROWANY (S IFm RNA 3' ¦sw^-lFmRNA NIE ZNALEZIONO ZNALEZIONO148434 10 10 n«t$#rllf*JoHl*^l*A»-iV«lAl«L«uIl«FroPrl«Ph«Al»AUP^Cy«L«vProV«l^fAl#«t»^ro61«|Thr pBR522 At 20 1«1 L«uV«l Pr«Al«Al«*«t CTG6T6''-COGCMCMTG--- 24 PKTZ79 ATGMTAnCMCAmCKTGTCGacnAncaTTmTGCGGUTTTT^ p»t 25 HwMltPMAriV«lAUL»uIUProPh»PHtAI«Al»Ph»Cy»LttfPr9V|Ph«Al pKT2S0 ATGAGTATTCAACATTTeCGtGTCGCCCnATTCCCTTTm6CG6CATmKCnCCT6TTm6CT«CCCGa6CA6CMT6* • • p»t 2? h«tS«rIliClnHliPh«Ar|V«lAlaL«uIl«ProPh«Ph«AlaAlaPhaCytL«uPreV«lPh«Al«HliPr»GluThr pKT287 ATGtfTATTCAAttTTTCCGTGTCGC^^ AUAl»AUN»t GCTGCAGCAAT6"' p«t FIG 6 FIG.7 FRAKCJOWANIE EKSTRAKTU S-tD AKTYWNOSC INTERFERONU od 409 (cytgenuom c) NUMER FRAKCJI -ix 1 i 3 to O CC LU tn o i - i- <148434 SI SIO 1 10 20 30 40 50 (O 70 10 HETALASERPKOPHEALACEULEUHETVALLEU 623CTCTA66TT(^T(#C(*TCT(mAAGCCCA^ Hinf Bsrl , EcoRII AvaII S20 1 10 90 100 110 120 130 140 150 1(0 170 VAtVALLEUSMCYSLY$$ERSeRCYS$ERLEU6LYCYSASPLCUrM6LUTNftH ISSEIH.EUASPASI4AR4AH6THKIEUMETLEULEU 6T66T6a^T3CAttTC0l6CT^ U^j PvuII AluI feol DdcI EcoPI EcoRII AvaII Sfa*I EcoRII AluI 20 30 40 100 1*0 200 210 220 230 240 250 2*0 ALA6LW1£T$ERAR6ILESERPI»0SERSERCYSLEU«ETASPAR6HISASPPHE6LyPHEPR06LNGLU6LUPHEASPGLyASNGLNPHE GCA(^TGAGa^TCTCTCCnCCTCCT6TC^ Hinf EcoRII FIG. 8 50 60 70 270 2*0 290 300 310 320 330 340 3S0 6LHLYSALAPR0ALAILESERVALLEUH1SGLULEUILEGLNGLNILEPHEASNLEUPHETHRTHRLYSASPSERSERALAALATRPASP CA6AAG6CTCCAGCCATCTCT6TCCTCCATGACCT6ATCCA6CA6ATCTTC/^CTCTTTACCACAAAA6ATTCATCT6CTGCTTG66AT AluHboI / BglII Hinf EcoP15 ^^~' HboI feoll 80 90 100 3(0 370 380 390 400 410 420 430 440 6LUASPLEULEUASPLYSPHCCYSTHRGLULEUTYRGLNGLNLEUASNASPLEUGLUALACYSVALMETGLHGLUGLUARGVALGLYGLU 6AG6Ai:CTCCTA6AaMTTCT6CACC&AACTCT«M6CAGCT6AATGACTT66AAGCCTGT6TGAT6CA6GAG(JAGA66GTGGuAGAA Ava11 EcoP15 Pvulj SfaNI AluI 110 120 130 4S0 4*0 470 490 490 SOO 510 520 530 TIMPMLEUnETA»MLAASPSERILELEUALAVALLYSLYSTYRPHEARGARGILETHKLEUTYRLEUTHRGLULYSLYSTYRSERPRO ACTCCCCT(aT6AAT6CG6ACT(^TCTTG6^ Hinf fcoll HmII fcoll Hinf FIG.O148434 l« 150 160 166 540 550 560 570 580 590 600 610 620 CYSAtATRP6LUVALVALARGAtA6LUILEMETAR6SERLEUSERLEUSERTM«ASNLEUGLNGLUARGLEUARGAR6LYSGLU T6TG£CT(ffiAGGTTGTCAGAGCA(^ EcoRII feol 630 640 650 660 670 600 690 700 710 CT£GKCAACATGAAAAeMn™^ AvaII Hinf EcoRII EcoRI Hinf Hph 710 710 769 750 760 770 7»0 790 800 TAACTATl^CATGCTGATAAACTGAmATCTATTTAAATATTTAmAACTATTCATAAMTTTAW^ 010 §20 810 840 OSO MO 065 aT§T6CAgTTTtfAa^^ AccI FIG.10 FIG. II Hif-2h 9W bp -140 fOO ZOO 300 400 500 600 700 600 900 2441 h-—cm: EcoRt (pORS22) Pst Bsp fVu Ava I I M II f—4-M- i i Bgl Am P*u Mbo Am Eco II U II IL H Rl yl *_J P*t Hif-ihzoe ~ 350 bp. f*( Sap fal )r50^ 1T6-- 270— tyt P*ul W± BeiM ~t$o- 270- Pst ~300-148434 -se -to »(11) Sxjjl^T^TGjPCOfK hm liuwlalitou -20 ¦•t ala s»r pio pto tU itu lei ntt val Uu 2hU 62}aCT^nCAGA6T^CCA1tTCMCMKCCA^ -120 -110 -100 -90 -00 -70 -00 -10 -40 J* -!• -lf l V * * * * tevi Im ttrqr» lys mt wrq» mr«*1 gl/OS** IfllMtajIMMSSRIfU CUT SBM6 «61* LHJ MTISU IHI •10 -11 10 v«lv*l taiMrcjo lys tmmrepwm Iw*r GIS AST IM MDOH Ul MS SR IBIASPMM MIG MB MIHJICT UU LBJ 2h(I) $Ta^Qrej6 -39 -lt -10 1 li 20 50 OS 10 FIG. 12 00 70 00 90 100 110 120 150 140 20MII) fUflliflyupW MA OM WTMCAUGILE SER LBJ HC SER OfS IHI LYS ASP MC HIS ASP RS GUT ME MD GLN GUJ GU)M - GUT AW GIM M 20 50 40 AUQ*ICTSnAICIl£raP»SER»CYSLaJferASPAKHISASPR£(^ 2* pC^^T^GO^TCTCTCCTTCCTCCTG 40 70 *00* * 00 100 HO 120 150 140* 110 100 170 100 190 200 210 220 250 206(11) pMV«Cfct«VCCATCf CT.GTCfTCpTjy^T^ GIN LW ALA GLU HR ILE PRO VAL LEU HIS GUJ hET ILE GLH GLN ILE IlC ASY LEU FlC SER Il* LTS ASP SBI 9ER ALA ALA 1RP ASP 10 00 70 10 00 70 (Ul US ALA MD AU ILE SER WL l£U IIS GLU LBJ ILE ON ON ILE l« ASN LEU RE IHI V« LYS ASP Slft SM ALA ALA 1RP ASP 110 llo llo 100 ilo 200 210 220 250 FIG.13148434 240 250 260 270 280 290 300 310 320 206( 11) .GAC/KCJCTCp/^(^JTCJAQ£^ OllWRI«l£UASPLYSiremi«(LUlJW1Y*a*ia*USUASN^ •o to ioo •O 90 100 ODASPLEULElJASPtfSFHEttSIHRGLULaiTYRaWC^ 240 2S0 240 270 290 290 190 319 sio W9 149 3S0 MO 979 999 399 499 410 206(11) A^Cró*T9tA$/^ I9i no lbj »cr urs oju asp sat ile bu ma wlauc as rm m goi ttefUYfttffmijumGtuMSKSTttSBtMD 129 129 139 2*1) 119 129 139 MtmiA)»CT*N4U*r»IUIlJUi^VALLrcLBTnM iajCC£T^T^T6C^ 339 349 399 399 179 lfe 999 499 4I9 FIG.14 429 430 440 4S0 449 479 440 490 S00 206CII) J61^6fi^nj;T(^ a$AUTIF^V4LWLAKMAaiJIl£»CTAJCSan€S»WW?lft^ 149 ISO 149 14S 149 ISO 149 144 CteAWTiraUVALVAL*£AiAaJJILE^A«SERL 2n(I) J6TGCCT(^^n6^ 429 439 440 4S9 440 474 490 499 s6o SIO S29 S30 S40 SS9 S40 S70 340 206CII) CT66TTCAACAT66AAAT6ATTTTCATT6ATTC6TAT6CCA6CTCACCT TTTTATGA-TCTGCCATTTCAAAGACTttTGTTTCTGCTA 2k( I) CTGGTCCAAttTGAAMCAAm sio sio sio S40 sio S40 slo sio sio FIG.15148434 SfO 400 »10 **0 »30 •*• OSO 060 670 t»C 206(11) T6ACCAT6ACAC6ATTTAAATCTTTTCAAAT GTTTTTA66A6TATTAATCAACATT6TATTCA6CTCnAAG6CACTA6TCCCTTACA6A<5 2h(I) TWWT6ACCATaT6ATAJWCTWmATCTAnTAMTATTTATnAWTAnCAT/tt«TnM»nATnn6TTCATATAAC6TC 6«0 010 «20 «30 U tlo *so tio oto MO 206(11) GACCAT6CTGAC„ 2n( I) AT(T^CmACACT6TttTTAeT6TMTAAAACAT6nCCTTATAmACTCAAAAAAAC oio m ?i« 72* 7M 740 1S FIG. 16 t HinT f Atr T/W6»f /¦/ -Mf O W0200X04C0300600 700$009QO*X0 2441 I I I I l I I I I I I I I •2^ ^w_, ,*', « ^fe— /J // tg M 1—»< » » *5 * »* f « i H ,w148434 F/G.18 CZESCIOWE MAPY RESTRYKCYJNE KLONOWANYCH SEGMENTÓW CHROMOSOMALNEGO DNA SKORELOWA NEGO Z IFN~ E E E T E E ct*r«1 15.1 kb „ - » - H EE Bg Bg E E E chr-3 15 6kb __^ t, . i • . H M M H H M chr-26 15.5 kb * E »' ? T "• * IM» IHI (Ml chf-10 13.0 kb chr-13 15.5 kb cHr-16 17.0 kb cKf-35 15 5kb chr-30 18.0 kb chr-12 16.5 kb chf-19 13.0 kb chr-27 19.0kb ¦s M T f Ba *9 E E M 4 BgT B«BaE *« Bg E E E H H r E TTBf M M A- (HMHi B9E BgE BgBa E H r 1B9) (Ml * CE) -^ ¦ -"+ M E ¦LUmI!.^ i IHI AN H H (Bg) (M) T(E) ^i— E ^¦^F Ba tHI (HI T * (H) (H) 5 W 15 kb E : EcoRI, Ba : BamHI. Bg : Bglll, H : Hinoiil, T : TacI148434 O 1 2 3 4. 5 e 7 8 9 W 11 12 13 /4 13 i i j- *'*'•'*«* kb Xl li Wy ii ^^J"1 'l I-x?-- *ttIit i {iii u * v * 10 tt n M- UHLU FIG. 19 ****»*"*i^»*,iAt'iA*<*L- 6.0 €.5 70 75 A0 AA *

Claims (10)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania polipeptydu typu IFN-a, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle organizmu gospodarza stransformowanego zrekombinowana czasteczka DNA zawierajaca sek¬ wencje DNA wybrana z a) insertów DNA nastepujacych zrekombinowanych czasteczek: Z- PBR322(Pst)/HcIF-2h [DSM 1700], Z-pBR322(Pst)/HcIF-SN35 [DSM 1701], Z-pBR322(Pst)/ HcIF-SN42 [DSM 1702] i Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH6[DSM 1703], b) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wyzej podanymi insertami i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz c) sekwencji DNA, które sa zdegenerowane w wyniku degeneracji kodu genetycznego i odpowiadaja insertom DNA i sekwencjom DNA okreslonym w a) i b) i które koduja polipeptyd typu IFN-a, polaczona z sekwencja kontrolujaca ekspresje, przy czym hodowle prowadzi sie w srodowisku i w warunkach odpowiednich dla danego gospodarza, po czym zbiera sie wytworzony w srodowisku hodowli polipeptyd.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sekwencja b), która hybrydyzuje z wyzej podanymi insertami a) i która koduje polipeptyd typu IFN-a jest wybrana z: d) insertów DNA zrekombinowanych czasteczek Z-pBR322(Pst)/HcIF-II-206 [ATCC 31633] i Z-pBR322(Pst) /HcIF-SN35-AHL6[ATCC31634], e) sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wymienionymi inser¬ tami i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz f) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degene¬ racji kodu genetycznego i odpowiadajacych insertom i sekwencjom okreslonym w d) i e) i koduja¬ cych polipeptyd typu IFN-a.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze sekwencja DNA okreslona powyzej w b) lub e), która hybrydyzuje z insertami a) lub d), wybranajest sposród g) Hindlll fragmentu Hif-chr3 [DSM 1914], EcoRI fragmentu Hif-chrl2 [DSM 1915], Hindlll fragmentu Hif-chrl2 [DSM 1916], EcoRI fragmentu Hif-chrl3 [DSM 1917], EcoRI fragmentu Hif-chr23 [DSM 1918], Hindlll frag¬ mentu Hif-chr23 [DSM 1919], EcoRI fragmentu Hif-chr26 [DSM 1920], Hindlll fragmentu Hif- chr26 [DSM 1921], Hindlll-BamHI fragmentu Hif-chr35 [DSM 1922], BamHI fragmentu Hif- chr35 [DSM 1923], Tac-Tac fragmentu Hif-chr23 [ATCC31760], Bglll-Bglll fragmentu Hif-chr10 5[ATCC 31761], Hindlll-Hindlll fragmentu Hif-chrlOr [ATCC 31762], Bglll-Bglll fragmentu Hif-chr26 [ATCC 31763], Hindlll-Hindlll fragmentu Hif-chr30 [ATCC 31764], Bglll-Tacfrag¬ mentu Hif-chrl3 [ATCC 31765] i Bglll-Tacfragmentu Hif-chrl6 I[ATCC 31766], h)sekwencji DNA, które hybrydyzuja z wyzej wymienionymi sekwencjami DNA i koduja polipeptyd typu IFN-a oraz i) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degeneracji kodu genetycznego i odpowiadajacych insertom i sekwencjom DNA okreslonym w g) i h) i kodujacych polipeptyd typu IFN-a.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze sekwencja DNA okreslona powyzej wb) ltib e), która hybrydyzuje z wymienionymi insertami DNA a) lub d) jest wybrana sposród j)44 148 434 hybrydyzujacych czesci chromosomowych sekwencji DNA Hif-chrl9 i Hif-chr27, k) sekwencji DNA, które hybrydyzuja w wyzej wymienionymi sekwencjami DNA i koduja polipeptyd typu IFN-a i 1) sekwencji DNA zdegenerowanych w wyniku degeneracji kodu genetycznego odpowiada¬ jacych insertom i sekwencjom DNA okreslonym w g) i h) i kodujacych plipeptyd typu IFN-or.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca sekwencje DNA wybrana z sekwencji o wzorach: ATGGCCTCGCCCTTTGCTTTACTGATGGTCCTGGTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCT CTCTGGGCTGTGATCTCCCTGAGACCCAGAGCCTGGATAACAGGAGGACCTTGATGCTCCT GGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGATTT CCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCTCCATG AGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCATCTGCTGCTTGGGATGA GGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACTTGGAAGCCTGT GTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAATGCGGACTCCATCTTGCCTG TGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCC TGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCTTTATCAACAAACTTGCAAGAAAG ATTAAGGAGGAAGGAA, i TGTGATCTCCCTGAGACCCACAGCCTGGATAACAGGAGGACC TTGATGCTCCTGGCACAAATGAGCAGAATCTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACT TTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTC CTCCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTC ATCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTACCAGCAGCT GAATGACTTGGAAGCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAACTCCCCTGATGAA TGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATACTTCCGAAGAATCACTCTCTATCTGACAGA GAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTC TTTATCAACAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAA.
6. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca sekwencje DNA wybrana z sekwencji DNA o wzorze: TTACTGGTGGCCCTCCTGGTGCTCAGCTGCAAGTCAAGCTGCTCTGTGGGCTGTG- ATCTGCCTCAAACCCACAGCCT GGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTC- TCCTG CTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTC- CAAAA GGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCA- GCAC AAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAA- CTCTA CCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGGTGGATACAGGGGGTGGGGGTGACAG- ACACTCC CCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACT- CTCTAT CTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATC- ATGAGA TCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA i TGTGAT- CTGC CTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGA- GGAGAAT CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGT- TTGGC AACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGA- TCTTCA ATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAA- ATTCTA CACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGT- GGGGGTG148434 45 ACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCC- AAAGAA TCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAG- AGCAGA AATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAG- GAA,
7. 7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca sekwencje DNA wybrana z sekwencji DNA o wzorze: ATGGCCCTGTCCTTTTCTTTACTGATGGCCGTGCTGGTGCTCAGCTACAAATCCAT- CTGTT CTCTGGGCTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAATAGGAGGAC- CTTGATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTGCCTGAAGGAC- AGACATGATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCAGTTCCAGAAG- ACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAG- CACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACT- GAACTTTACCAGCAACTGAATGACCTGGAAGCATGTG TGATACAGGAGGTTGG- GGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAAT- ACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTG- GGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACAAACTTGCAA- AAAA GATTAAGGAGGAAGGAT i TGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTA- ATAGGAGGACCTTGATACTCCTGCAACAAATGGGAAGAATCTCTCATTTCTCCTG- CCTGAAGGACAGACATGATTTCGGATTCCCCGAGGAGGAGTTTGATGGCCACCA- GTTCCAGAAGACTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTC- AATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAA- AATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATGAC CTGGAAGCATGTGTGATAC- AGGAGGTTGGGGTGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTG- TGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAACAGAGAAGAAATACAGCCC- TTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCCCTCTCGTTTTCAACA AACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGAT.
8. 8. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany czasteczka DNA zawierajaca jako sekwencje kontrolujaca ekspresje sekwencje wybrana sposród nastepujacych: uklad lac, uklad /Mac, uklad trp, znaczne regiony operatora i promotora faga ^, region kontrolny bialka otoczki fd i inne sekwencje, które kontroluja ekspresje genów w komór¬ kach prokariotycznych i eukariotycznych i ich wirusach.
9. 9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze hodowany gospodarz jest stransformowany zrekombinowana czasteczka DNA wybrana sposród C8-IFN-al, C8-IFN-a2, LAC-AUG (al) i /3-lac-AUG(a2).
10. 10. Sposób wedlug zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, ze hodowany gospodarz wybrany jest sposród szczepów E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, drozdzy, innych grzybów, myszy i innych gospodarzy zwierzecych, gospodarzy roslinnych i komórek tkanek ludzkich.148434 LUDZKIE LEUKOCYTY I WIRUS I SEA/DAl INDUKOWANE LUDZKIE LEUKOCYTY FIG. I I EKSTRAKCJA l^o^CELUUDZY EsgRl ZmKNA YmftNA ZC DNA ,* YcDNA,*'* POLY (A) RNA ""^IFmRNA [ODWROTNA ?TRAN SKRYPTAZA \ HcONA • \ |o*»FOLIMERAZA I „^/TERMINALNA TRANSFERAZA ? DEZOKSTNUKLEOTYDf- PL