PL164434B1

PL164434B1 - Sposób wytwarzania srodka farmaceutycznego do terapii w chorobach dróg oddechowych PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL164434B1
Application number: PL90285904A
Authority: PL
Inventors: Bernd Disse; Eberhard Weller; Robert Becker
Original assignee: Thomae Gmbh Dr K
Priority date: 1989-07-04
Filing date: 1990-07-02
Publication date: 1994-07-29
Also published as: PH30232A; EP0406732A3; IE68448B1; CA2020209C; ES2072940T3; JPH0344332A; PT94574A; NZ242869A; IL94961A0; DE59009113D1; NO180620C; JP3103582B2; UA26313A; FI95655C; AU623538B2; DD297916A5; DE3921954A1; RU2077880C1; ZA905182B; PT94574B

Abstract

1. Sposób wytwarzania srodka farmaceutycznego do terapii w chorobach dróg odde- chowych, polegajacy na wymywaniu pluc bydlecych roztworem chlorku sodu, znamienny tym, ze do otrzymanego ekstraktu dodaje sie jony wapnia tak, aby ich zawartosc wynosila 3 do 6 mmoli/l potem produkt odwirowuje sie z powyzszego roztworu, który zawiera 6 - 12 mmoli/l jonów wapnia, nastepnie pierwsze oczyszczanie prowadzi sie przez odwirowanie z glukozowym gradientem gestosci w obecnosci 3 - 8 mmoli/l jonów wapnia, a drugie oczysz- czanie prowadzi sie przez ekstrakcje ukladem chloroform-alkohol-woda przy zastosowaniu wodnej fazy, zawierajacej 3 - 8 mmoli/l jonów wapnia, nastepnie usuwa sie faze organiczna i pozostalosc suszy oraz rozdrabnia i tak otrzymane suche lipidy zawiesza sie w roztworze wodnym zawierajacym co najmniej 1 mmol/l jonów wapnia oraz co najmniej 33 mmol/l chlorku sodu. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zawiesin środka powierzchniowo czynnego o niskiej lepkości i wysokim stężeniu do terapii przy schorzeniach dróg oddechowych.

W przypadku środka powierzchniowo czynnego chodzi o powierzchniowo czynny zespół złożony z fosfolipidów, obojętnych lipidów oraz zasocjowanych ze środkien powierzchniowo czynnym hydrofobowych białek, uzyskany z wyodrębnionego, naturalnego płucnego środka powierzchniowo czynnego. Ale środek powierzchniowo czynny może pochodzić również z syntetycznych źródeł, i wtedy składa się on z syntetycznych lipidów i odpowiednio rekombinowanych białek.

Brak płucnego środka powierzchniowo czynnego rozpoznano jako pierwotną przyczynę syndromu duszności niedojrzałych wcześniaków /Avery ME, Mead J. Surface properties in relation to atelectasis and hyaline membrane disease. Amer J Dis Child 97: 517-523 /1959//. Z doświadczalnych i klinicznych studiów znane jest stosowanie terapii zastąpienia go naturalnym środkiem powierzchniowo czynnym /Van Golde, LMG, Batenburg JJ, Robertson B, The pulmonary surfactant system: biochemical aspects and functional significance. Physiol Rev 68: 374-455/1988/, Robertson B, Lachmann B. Experimental evaluation of surfactants for replacement therapy. Experimental Lung Research 14: 279-310 /1988 //. Zależnie od aktywności zastosowanego środka powierzchniowo czynnego albo od oceny autorów wkraplano wewnątrz164 434 tchawiczo dawki indywidualne wynoszące 50-200 mg/kg. Syndrom duszności dorosłych pacjentów posiada pewne podobieństwa do syndromu duszności niedojrzałych wcześniaków. Według zdania licznych naukowców zastąpienie środkiem powierzchniowo czynnym przy tym obrazie klinicznym choroby o dużej śmiertelności stanowi terapeutyczną szansę /Lachmann B, Surfactant replacement in acute respiratory failure: Animal studies and first clinical trials, in B. Lachmann ed.: Surfactant replacement therapy in neonatad and adult resp iratory distress syndrome. Springer-Verlag, Berlin 1988, 212-223/. W tym celu proponuje się wysokie dawki do 400 mg/kg/Lachmann B, Surfactant replacement in acute respiratory failure; Animal studies and first clinical trials, in B Lachmann ed. : SurfacUnt repleceme nt therapy in oeonatd and adult respiratory distress syndrome. Springer^e!^-^, Berlin 1988, 212-223; Spragg RG, Richmann P, GRlard N, Merritt TA. The future for surfactant therapy of the adult respiratory distress syndrome, in B. Lachmann ed.: Sarfactont heplacement therapy in neonatol and adult respiratory distress syndrome. Spriegeh-Verlag, Berlin 1988,203-211/.

W przypadku wszystkich zastosowań problemem jest obciążenie płuc pacjenta wysokimi ilościami cieczy. Enhorning leczył swych przedwcześnie urodzonych pacjentów środkiem powierzchniowo czynnym stosując go w ilości 100 mg/kg w postaci zawiesiny o stężeniu 25 mg/ml. Oznacza to w każdym razie dawkę 4 ml cieczy na kg ciężaru ciała /Enhoming G. Sheneae A, Possmayer F, Dunn M, Chen CP, Milligan J. Prevention of neonetol respiratory distress syndrome by trecheal instilletion of suhfectoet: A raedomizea clieical trial. Pediatrics 76: 145-153 /1985//. Robertson stosował dawki indywidualne 200 mg/kg zawiesiny o względnie wysokim stężeniu 80 mg/ml /Noack G, Bergren P, Cursted T, Grossmann G, Herin P, Mortensson W, Nilsson R, Robertson B, Severe neonetol respiratory distress syndrome theeted with the isolated phospholipid fraction of natural suhfectoet. Acta Paedietr Scend 76: 697-705 /1987//. Oznacza to dawkę 2,5 ml/kg. Najwyższe stężenia stosował Morley z syntetycznym środkiem powierzchniowo czynnym /Ten centre study group. Ten centre trial of οιΤϊΠοϊοΙ surfecteet /oreificiel lung expanaieg compound^ in very phematahe bebies. British Med J 294: 991-996 /1987//. Stosował 100 mg/kg w postaci krystalicznej zawiesiny o stężeniu 100 mg/ml. W istocie potrzebne było podanie do 400 mg/kg w ciągu 24 godzin. Względnie korzystne stosunki osiągnięto w przypadku środka powierzchniowo czynnego z powierzchniowo czynnego zespołu złożonego z fosfolipidów, obojętnych lipidów i zesocjowanych ze środkiem powierzchniowo czynnym hydrofobowych protein, uzyskanego z wyodrębnionego, naturalnego środka powierzchniowo czynnego z płuc bydlęcych, określonego dalej SF-RI 1. Podawano 50 mg/kg jako zawiesinę o stężeniu 40 mg/ml. Oznacza to obciążenie pacjentów objętością 1,2 ml/kg.

Jeżeli odniesie się te wyniki na leczenie dorosłego osobnika, wówczas dawko wynoszące 200 mg/kg, podano jako zawiesina o stężeniu 40 mg/ml, mogłoby w każdym razie oznaczać, że pacjentowi o ciężarze ciało 70 kg musianoby wkroplić wewnątrztchawiczo 350 ml. To obliczenie wykazuje, że pożądane jest dobierać możliwie najwyższe stężenia środka powierzchniowo czynnego. To dążenie jest ograniczone wysoką lepkością zawiesin środka powierzchniowo czynnego o stężeniu powyżej 60 mg/ml. Wysoka lepkość stwarza problem przy podawaniu i rozprowadzeniu środka powierzchniowo czynnego oraz prowadzi do wzrostu oporu dróg oddechowych. Robertson osiągnął stężenie 80 mg/ml w ten sposób, że z uzyskanego z płuc wieprzowych środka powierzchniowo czynnego oddzielił obojętne lipidy /Noeck G, Bergren P, Curstedt T, Grossmenn G, Herin P, Mortensson W, Nilsson R, Robertson B, Severe eeoeetel respiratory distress syndrome treated with the isoleted phospholipia frachon of notural surfdctaet. Acta Peeaieth Scend 76:697-705/1987//. Morley stosował krystaliczną zawiesinę syntetycznych lipidów o stężeniu 100 mg/ml /British Med J 294: 991-996 /1987//. Kupił on wysokie stężenie koniecznością stosowania środka rozpraszającego oziębionego lodem.

Obecnie stwierdzono niespodziewanie, że również w przypadku środka powierzchniowo czynnego powyżej 60 mg/ml i składowania w temperaturze pokojowej przez godziny lepkość zawiesin pozostaje poniżej 30 mPas, o ile d zastosowany preparat środka powierzchniowo czynnego lipidy/ proteiny zawiera związane jony wapnia i/olbo magnezu w ilości większej niż 25 mmoli/mol, zwłaszcza większej niż 40 mmoli/mol dających się ekstrahować organicznie fosfolipidów,

164 434 b/ środek rozpraszający zawiera co najmniej 1 mmol/l, zwłaszcza 2,5-3,5 mmoli/l jonów wapnia i/albo magnezu, i c/ środek rozpraszający zawiera jednocześnie co najmniej 33 mmoli/l, zwłaszcza 60-150 mmoli/l chlorku sodu.

Jako środek rozpraszający stosuje się na ogół wodę. Jeżeli brakuje tylko jednego z tych czynników albo jeżeli tylko jeden z tych czynników występuje w za małym stężeniu, wówczas lepkość tak otrzymanych zawiesin wzrasta drastycznie w temperaturze pokojowej. W przypadku przestrzegania wszystkich trzech czynników można nawet z liofilizatu pęcherzykowego wytworzyć wykazujący niską lepkość środek powierzchniowo czynny o wysokim stężeniu, który również w temperaturze pokojowej jest trwały przez więcej niż 12 godzin. Tego rodzaju zawiesina środka powierzchniowo czynnego, również przy bardzo wysokiej zawartości środka powierzchniowo czynnego, nie wykazuje będącego niebezpiecznym wzrostu oporności dróg oddechowych i nadaje się jak najlepiej do zastosowania w terapii w przypadku schorzeń dróg oddechowych. Taka zawiesina środka powierzchniowo czynnego pozwala na wewnątrztchawicze doprowadzenie środka powierzchniowo czynnego w wysokich dawkach, bez przeciążenia płuc wodą albo doznawania innych negatywnych uszczerbków, np. przez wzrost lepkości.

Dotychczas znane zawiesiny środka powierzchniowo czynnego już od 60 mg środka powierzchniowo czynnego na ml są bardzo lepkie, natomiast obecnie dzięki sposobowi według wynalazku możliwe jest sporządzenie zawiesin o stężeniach wynoszących 200 mg/ml. Do celów terapeutycznych bardzo odpowiednie są stężenia środka powierzchniowo czynnego wynoszące np. około 150 mg/ml zawiesiny. Zawiesiny środka powierzchniowo czynnego o mniejszej lepkości można, otrzymać łatwo w ten sposób, że zawiesiny otrzymane sposobem według wynalazku rozcieńcza się według uznania stosowanymi w wynalazku środkami rozpraszającymi.

Dające się organicznie ekstrahować fosfolipidy, po ich wyodrębnieniu z ekstraktu płucnego, na przykład płuc bydlęcych albo wieprzowych, obciąża się jonami wapnia i/albo magnezu w ten sposób, że przy ekstrakcji wodnej fazy, np. chloroformem, wodną fazę zaopatruje się w nadmiar jonów wapnia względnie magnezu. W zależności od rodzaju obróbki górna granica jonów wapnia względnie magnezu wynosi około 70 mmoli Ca²⁺ względnie Mg²7mol fosfolipidów. Jeżeli mieszanina fosfolipidów albo mieszanina fosfolipidy-proteiny posiada za małe obciążenie jonami wapnia względnie magnezu, jak np. 13 mmoli Ca^2ł/mol mieszaniny osfolipidy-proteiny w preparacie B /tablica/, wówczas ten preparat można dodatkowo obciążyć w organicznych roztworach brakujących jonami wapnia względnie magnezu. Przeprowadza się to np. przez dodanie chlorku wapnia rozpuszczonego w metanolu. Ogólnie można powiedzieć, że wszystkie znane suche lipidy można obciążyć jonami wapnia i/lub magnezu, i przerabiać na zawiesiny o małej lepkości.

Jony wapnia i magnezu wprowadza się w postaci rozpuszczalnych soli wapnia i magnezu. Stosuje się tu przeważnie chlorek wapnia względnie chlorek magnezu, ale można stosować również inne fizjologicznie tolerowane, rozpuszczalne w wodzie sole wapnia i/lub magnezu, tak np. siarczan wapnia albo magnezu, azotan wapnia, mleczan wapnia, sól wapniową kwasu sorbowego, askorbinian wapnia, glukonian wapnia, laktoglukonian wapnia, wodorocytrynian magnezu, diwodoroglutaminian magnezu, cytrynian magnezu.

Wytwarzanie środka powierzchniowo czynnego jako produktu wyjściowego dla otrzymania wykazującego niską lepkość środka farmaceutycznego do terapii w chorobach dróg oddechowych odbywa się w oparciu o metodę opisaną przez YU i współpracowników /Lipids 18:522-529/1983//. Istotną modyfikacją tej metody jest stosowanie podczas całego procesu rozpuszczalników albo środków rozpraszających zawierających jony wapnia względnie magnezu. Płuca bydlęce wymywa się roztworem chlorku sodu, do otrzymanego ekstraktu dodaje się jony wapnia tak, aby ich zawartość wynosiła 3-6 mmole/l, potem środek powierzchniowo czynny odwirowuje się z roztworu, który zawiera 6-12 moli/l jonów wapnia, następnie pierwsze oczyszczanie prowadzi się przez odwirowanie z glukozowym gradientem gęstości przy gęstości 105-1,15 g/ml w obecności 3-8 mmoli/l jonów wapnia, a drugie oczyszczanie prowadzi się przez ekstrakcję układem chloroform-alkohol-woda według Bligh’a i Dyer'a /porównaj Can. J. Biochem Physiol. 37: 911-917 /1959// przy zastosowaniu wodnej fazy z 3-8 mmolami/l jonów wapnia, zwłaszcza 6 mmolami/l, następnie usuwa się organiczną fazę, np. zatęża się przy

164 434 temperaturze pokojowej pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość suszy i rozdrabnia. Alternatywnie można fazę organiczną również poddać liofilizacji. W każdym przypadku uzyskany produktjest trwały przy składowaniu przez dłuższy czas /co najmniej 3 lata w temperaturze szafy chłodniczej/. Tak otrzymane subtelnie sproszkowane suche lipidy rozprasza się w wodnym roztworze, który zawiera zgodne z wynalazkiem ilości chlorku sodu oraz soli wapnia i/albo magnezu, przez energiczne wytrząsanie aż do osiągnięcia pożądanego stężenia lipidów. Tak wytworzona zawiesina jest również odpowiednia do składowania przez kilka dni w temperaturach szafy chłodniczej i można ją w razie potrzeby stosować wewnątrztchawiczo.

Środek rozpraszający powinien zawierać więcej niż 1 mmol/l, zwłaszcza 2,5 - 3,5 mmoli/l jonów wapnia i/albo magnezu oraz więcej niż 33 mmoli/l, zwłaszcza 75 ramoli/l, najwyżej 150 mmoli/l, chlorku sodu.

Niżej przedstawiono badania lepkości różnych preparatów środka powierzchniowo czynnego.

Materiał i metody. Jako materiał wyjściowy do następujących badań zastosowano środek powierzchniowo czynny wyekstrahowany z wyciągu z płuc bydlęcych, zwany dalej SF-RI 1. Sposób stanowi w głównych zarysach modyfikację i optymalizację sposobu opisanego przez Yu i współpracowników /Yu S, Harding PGR, Schmith N, Possmayer F, Bovine pulmonary surfactant: chemical composition and physical properties. Lipids 18:522-529/1983//. Istotnymi modyfikacjami tej pracy było stosowanie podczas całego procesu rozpuszczalników zawierających jony wapnia: i tak, wymywanie bydlęcych płuc przeprowadzano roztworem chlorku sodu, ekstrakt ustawiono za pomocą chlorku wapnia na zawartość jonów wapnia wynoszącą 6 mmoli/l. Odwirowanie środka powierzchniowo czynnego prowadzono z roztworu, który zawierał 9 mmoli jonów wapnia na litr. Oczyszczanie przez glukozowy gradient gęstości prowadzono w obecności 6 mmoli/l jonów wapnia. Najważniejsze było oczyszczanie przez podział w układzie chloroform-metanol-woda według Bligh’a i Dyer'a /Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-913 /1959// również przy zastosowaniu wodnej fazy zawierającej chlorek wapnia w ilości 6 mmoli/l.

Po rozdzieleniu faz organiczną fazę zatężono w wyparce obrotowej w temperaturze pokojowej do sucha i potem wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Zawartość wody według Karl Fischer’a powinna wynosić jak najbardziej poniżej 3%. Materiał rozdrobniono przez przesianie na cząstki o wielkości około 160 μm.

Dla badań subtelnie sproszkowane lipidy suche rozproszono przez energiczne wytrząsanie w wodnych roztworach o różnych zawartościach chlorku wapnia i chlorku sodu w wodzie do ampułek. Stężenie zawiesin wynosiło 60-250 mg/l.

Lepkość tych zawiesin oznaczono po składowaniu w temperaturze pokojowej w oznaczonych okresach czasu za pomocą lepkościomierza kapilarnego. Przy tym chodzi o zmodyfikowany sposób pomiaru kapilarnym lepkościomierzem, opisany przez Weller’a i współpracowników w Wiener Medizinische Wochenschrift suppl 33; 7- 12 /1975/ oraz przez Weller’a w Viskosimetrie inhomogener Flussigkeiten. Distri Verlag Monachium, strony 21-42.

Dalej krótko jest objaśniony ten sposób. Znajdującą się w strzykawce iniekcyjnej próbkę przeciska się z określoną stałą szybkością przez kapilarę pomiarową. Można również ustalić niejednorodność. Szybkość ścianania jest znana i stała. Kalibrowanie prowadzi się wzorcowym olejem. Ciśnienie przed kapilarą jest miarą lepkości i pisak rejestruje je bieżąco.

Pod koniec badania niektóre zawiesiny przekształcono również w zawiesiny pęcherzykowe przez wprowadzenie energii ultradźwiękowej /przyrząd ultradźwiękowy Branson’a końcówka mikro, 20 watów, 2 min/ml, chłodzenie lodowatą wodą/.

Badano również zawiesiny, które wytworzono przez wytrząsanie liofilizowanych roztworów albo dyspersji pęcherzykowych. W tym celu środek powierzchniowo czynny dyspergowano, przez wprowadzenie energii ultradźwiękowej, w wodzie do ampułek w stężeniach około 40 mg/ml albo rozpuszczano w innych odpowiednich rozpuszczalnikach, jak np. tert-butanolu, w stężeniach około 40- 250 mg/ml. Zawiesiny względnie roztwory następnie liofilizowano. Utworzony placek rozbijano i otrzymany proszek przerabiano dalej.

164 434

Do badań włączono również warianty procesu wytwarzania SF-RI 1. Serię B środka powierzchniowo czynnego /patrz tablica/ wytworzono bez dodawania chlorku wapnia do płynów użytych do wymywania i oczyszczania.

Oznaczanie wapnia prowadzono drogą atomowej fotometrii absorpcyjnej po spaleniu odpowiednich rozcieńczonych zawiesin środka powierzchniowo czynnego w płomieniu acetylenowym w temperaturze około 3000°C /Zeiss FL6/. W tych temperaturach zostaje uwolniony i właściwie uchwycony również wapń związany w strukturze proteinowej'.

Oznaczanie względnej skuteczności zawiesin środka powierzchniowo czynnego u niedojrzałych płodów królików prowadzono przez porównanie z wzorcem odniesienia. Przy tym dla badanej serii i dla wzorca odniesienia opracowano po jednej krzywej dawka- działanie z 3 zastosowanych dawek /porównaj fig. 2/. Za pomocą ogólnie znanych kryteriów statystycznych /analiza kowariancji/ wykazano, że zgodna z wynalazkiem posiadającą wysokie stężenie zawiesina z jonami wapnia nie była znacząco różna w swym działaniu od posiadającej niskie stężenie dyspersji pęcherzykowej przy jednakowym dozowaniu.

Uzyskane wyniki przedstawione są w tablicy, a następnie omówiono je. W tablicy podana jest zawartość wapnia reprezentacyjnych preparatów SF-RI 1.

Tabela

Lepkość zawiesiny zawierającej 150 mg środka powierzchniowo czynnego na ml zawiesiny

Prepa rat	Zawar tość Ca²⁺/mmoli/mol	Środowisko rozpraszające	Składowanie w temperaturze pokojowej do /między przygotowaniem zawiesiny i pomiarem lepkości/
CaCl2 mmoli/l/	NaCl /mmoli/l/	5 min.	10 min.	15 min.	30 min.	45 mm. /mPas/	60 min.	90 min.	120 mm.	16 h
A	48	3	0		304		295
A	48	0	75	11	20	20	34	37	118	148
A	48	1	75	9		15	22		113
A	48	3	75	7	7	8	9		13
A'	58	3	75		21	22	24			22	24
B	13	3	75		40	56	160		177		176
B	13	12	75		13		25		40		60
C	42	0	75		181	184			202	219
C	42	3	75	6	8		9	14	16			21
C	42	3	75
					lepkość po działaniu ultradźwięków 2 imn/mJ,	aparat
				ultradźwiękowy Branson^ 20 watów z końcówką mikro: 222 mPas

A : Sproszkowmiy śrcdlek powierzchniowo czynny , wielkość cząstek 160 |mi,wytwarzanie, jak ojiisi^tKi w tek ście przez modyfikację sposobu Yu i współpracowników, Lipids 18, 522-528 /1983/,

A' : spiorzOowany roodkk ρowiarzchniowo zyn^ny , nee okreśoona wedoość zząsekk; wstwarJantej ji2 w A B : spoozkoowany rrodek ^λ'ίοΓ'χΗη^ο czynny, me okecśoona weekoość cząseek wytwarzante,Jkk w A , jednak bez dodatku Ca²⁺ podczas sposobu przerobu,

C : io^Ciiizc^^^y śre^ek Jo^wterzchniowo czynny ; wylM/amc miczzanaly iSpidysproreinyJak w A.

Uzyskane wyniki wykazują, że wszystkie preparaty odpowiadające przedstawionemu sposobowi wytwarzania zawierają wapń związany w ilości większej niż 40 mmoli/mol dającego się ekstrahować lipidami fosforanu. Natomiast przerabiany bez dodatku wapnia preparat /B/ zawiera tylko 13 mmoli/mol. Zawartość ta leży zatem w obrębie opublikowanych wartości dla zawartości wapnia w ekstrahowanym płucnym środku powierzchniowo czynnym, które nie przebaczają 16 mmoli/mol /Weber MJ, Possmayer F, Calcium interactirns in pulmonary surfactant. Biochim Biophys Acta 796: 83-91 /1984//. Jak dalej okazuje się, te wysokie zawartości związanego wapnia są bardzo ważne dla właściwości SF-RI1.

Tablica oraz fig. 1 zawierają również wyniki badań lepkości świeżo wytworzonych zawiesin środka powierzchniowo czynnego w przebiegu czasu. Gdy rozpraszano ubogi w wapń, a wiec znany z literatury środek powierzchniowo czynny /B/, w roztworze zawierającym 75 mmoli/l chlorku sodu i 3 mmole/l chlorku wapnia, wówczas w temperaturze pokojowej lepkość wzrastała szybko i już po 30 minutach przekroczyła 150 mPas. Oznacza to, że zawiesina środka powierzchniowo czynnego przybrała konsystencję śmietany.

Taka zawiesina nie nadaje się do klinicznego zastosowania dla wewnątrztchawiczych wkraplań.

Gdy rozpraszano środek powierzchniowo czynny o wysokiej zawartości związanego wapnia /A, A’ i C/ w roztworze zawierającym 3 mmole/l chlorku wapnia, wówczas lepkość wzrastała również bardzo szybko. Również gdy rozpraszano w roztworze chlorku sodu o stężeniu 75 mmoli/l, to po 90-minutowym składowaniu w temperaturze pokojowej lepkość osiągała w przybliżeniu 150 mPas. Rozpraszanie w roztworze 75 mmoli/l chlorku sodu plus 1 mmola/l chlorku wapnia prowadziło do powolnego i mniejszego wzrostu lepkości.

Bardzo zadowalające wyniki osiągnięto przez rozproszenie bogatego w wapń środka powierzchniowo czynnego w roztworze 75 mmoli/l chlorku sodu plus 3 mmoli/l chlorku wapnia; tu, również po długim składowaniu, lepkość nie przekroczyła 25 mPas. Porównywalne wyniki uzyskano przez rozproszenie bogatych w wapń liofilizatów środka powierzchniowo czynnego w roztworze 75 mmoli/l chlorku sodu plus 3 mmoli/l chlorku wapnia /wsad C/. Także tu, nawet po długim składowaniu w temperaturze pokojowej, lepkość za 16 godzin nie przekroczyła 25 mPas. Dopiero po wprowadzeniu energii ultradźwiękowej lepkość wzrosła na 220 mPas.

Rozproszenie ubogich w wapń lipidów /B/ w roztworze o niefizjologicznie wysokim stężeniu wapnia wynoszącym 12 mmoli/l plus 75 mmoli/l chlorku sodu powodowało powolne i zmniejszone zwiększanie się lepkości. Jednakże po 120 minutach osiągano wciąż jeszcze wartość 60 mPas. Stężenie 12 mmoli/l obliczano tak, że ustawione stężenie końcowe /suma zawartości jonów wapnia w środku rozpraszającym i w lipidach/ dochodzi do tej samej wartości, jak przy rozpraszaniu A, A’ albo C w roztworze zawierającym 3 mmole/l wapnia. Ten wariant, przewidujący wysoką zawartość wapnia w środku rozpraszającym, posiada mniej korzystny wynik i nie można go stosować w przypadku przewidywanego aplikowania in vivo, ponieważ stosowanie niefizjologicznie wysokich stężeń wapnia w środku rozpraszającym może wywołać zwężenie oskrzeli.

Uzyskane wyniki wykazują, że niespodziewanie dla otrzymania zawiesin środka powierzchniowo czynnego o wysokim stężeniu i pomimo tego o małej lepkości niezbędne są trzy czynniki: stosowany preparat środka powierzchniowo czynnego lipidy/ proteiny musi wykazywać wysoką zawartość związanego wapnia, zwłaszcza więcej niż 25 mmol/mol dających się ekstrahować organicznie fosfolipidów. Dalej środek rozpraszający musi zawierać rozpuszczony zarówno chlorek sodu jak też chlorek wapnia, zwłaszcza w stężeniu 75 mmoli/l względnie 3 mmole/l. Badania przedstawione w tablicy wykazują, że w przypadku braku tylko jednego z tych czynników lepkość zawiesin w temperaturze pokojowej wzrasta drastycznie po krótkim czasie. Jednak w przypadku przestrzegania wszystkich trzech czynników można było nawet z liofilizatu pęcherzykowego wytworzyć środek powierzchniowo czynny o niskiej lepkości i wysokim stężeniu, który również w temperaturze pokojowej był trwały przez więcej niż 12 godzin. Ten rodzaj zawiesiny środka powierzchniowo czynnego jest odpowiedni do terapeutycznych zastosowali. Fig. 1 okazuje jeszcze raz przebieg lepkości zawiesiny, zawierającej 150 mg środka powierzchniowo czynnego na ml, w zależności od stężenia jonów wapnia związanych ze środkiem powierzchniowo czynnym i rozpuszczonych w środku rozpraszającym z dodatkiem i bez dodatku chlorku sodu.

Oddechowo-fizjologiczną skuteczność środka powierzchniowo czynnego można zbadać na niedojrzałych płodach królików /Robertson B, Lachmann B. Experimental evaluation of surfactants for replacement therapy. Experimental Lung Research 14: 279-310/1988//. Tylko po podstawieniu powierzchniowo czynnego tym zwierzętom o niedojrzałych płucach można stosować sztuczne oddychanie. Przez bezpośrednie porównanie dwu grup zwierząt tego samego s

164 434 miotu oznacza się względną potencję, to znaczy ilość, która posiada taką samą skuteczność. W tym modelu doświadczalnym na zwierzętach okazało się, że dodatek wapnia w zakresie stężenie 3 mmole/1 do środka rozpraszającego nie miał żadnego wpływu na skuteczność/fig. 2/. Względna potencja nie zmieniła się.

Na fig 1. poszczególne krzywe pokazują przebieg zmiany lepkości /mPas/ w czasie podanym w minutach. Przy tym poszczególne krzywe należą do następujących szeregów badań:

-B- wysokie stężenie związanego Ca²⁺; środek rozpraszający zawiera 3 mmole Ca²⁺, jednak nie zawiera NaCl

-Δ— wysokie stężenie związanego Ca²⁺; środek rozpraszający zawiera 75 mmoli NaCl, jednak nie zawiera Ca²⁺ —wysokie stężenie związanego Ca²⁺, środek rozpraszający zawiera 1 mmol Ca²⁺i 75 mmoli NaCl —❖— wysokie stężenie związanego Ca²⁺; środek rozpraszający zawiera 3 mmole Ca²⁺ i 75 mmoli NaCl niskie stężenie związanego Ca²⁺; środek rozpraszający zawiera 3 mmole Ca²⁺i 75 mmoli NaCl —t— niskie stężenie związanego Ca²⁺; środek rozpraszający zawiera 12 mmoli Ca²⁺i 75 mmoli NaCl

Figura 2 pokazuje, że dodatek wapnia w zakresie stężenia 3 mmole/1 w środku rozpraszającym nie ma wpływu na skuteczność u niedojrzałych płodów królików. Prosta ciągła podaje stosunki w przypadku nieobecności chlorku wapnia, a prosta przerywana w przypadku obecności 3 mmoli jonów wapnia/jako CaCk/ na litr; naniesiono zmierzoną potencję jako objętość wdechu, osiąganą przy ciśnieniu sztucznego oddychania 3 KPa w zależności od logarytmu dawki.

Poniższe przykłady objaśniają sposób wytwarzania niektórych zawiesin według wynalazku.

Przykład I. Wytwarzanie, wyodrębnianie oraz przerób substancji powierzchniowo czynnych prowadzi się w oparciu o metodę opisaną w Lipids 18; 522-529 /1983/ przez ekstrakcję z płuc bydlęcych, przy dodatkowym doprowadzeniu jonów wapnia. Przy czym przez dodanie CaCk ustawia się zawartość Ca²⁺ na 3 do 6 mmoli/1.

Można zawartość wapnia jeszcze dodatkowo skorygować w pożądanym zakresie, na przykład przez dodanie obliczonej ilości chlorku wapnia rozpuszczonego w metanolu do środka powierzchniowo czynnego rozpuszczonego w rozpuszczalniku organicznym, na przykład w chloroformie.

Środek powierzchniowo czynny otrzymany z płuc bydlęcych przez ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi składa się z około 88% fosfolipidów, 4% cholesterolu, 1% zasocjowanych ze środkiem powierzchniowo czynnym hydrofobowych protein, 0,6% wolnych kwasów tłuszczowych oraz triglicerydów i związanego wapnia. Średnia względna masa cząsteczkowa fosfolipidów wynosi w zaokrągleniu 760 D. Substancja jest żółtym bezpostaciowym proszkiem nierozpuszczalnym w wodzie, dobrze rozpuszczalnym w nicpolamych rozpuszczalnikach, jak w chloroformie; można ją łatwo rozproszyć w wodzie przez wytrząsanie albo wprowadzenie energii ultradźwiękowej. Od stężenia wynoszącego 5% wagowych zawiesiny stają się widocznie lepkie.

Do 1,5 g opisanego uprzednio subtelnie sproszkowanego przesianego środka powierzchniowo czynnego albo substancji uzyskanej przez liofilizację rozpuszczonego w tert-butanolu ałbo cykloheksanie środka powierzchniowo czynnego dodaje się 8,5 ml środka rozpraszającego, zwłaszcza roztworu chlorku sodu, zawierającego 75 mmoli/1 chlorku sodu i 3 mmole/1 chlorku wapnia, najlepiej w butelce iniekcyjnej. Następnie butelkę iniekcyjną wstrząsa się i przez to rozprasza środek powierzchniowo czynny. Za pomocą igły iniekcyjnej o wielkości 1 /20 G/ przeciąga się zawiesinę do strzykawki iniekcyjnej i potem wtryskuje z powrotem do butelki iniekcyjnej przez igłę o wielkości 18 /26 G/. Powrotne wtrzyknięcie do butelki iniekcyjnej przez cienką igłę prowadzi sie tylko aby mieć pewność, że zawiesina jest wolna od grudek. Zawiesinę stosuje się na przykład poprzez cewnik żylny pępkowy do wziernika tchawiczego pacjenta, któremu stosuje się sztuczne oddychanie.

Przykład II.

Do 2,5 g subtelnie sproszkowanego przesianego środka powierzchniowo czynnego dodaje się 7,5 ml środka rozpraszającego /roztwór chlorku sodu/, który zawiera 150 mmoli/l chlorku sodu i 3,5 mmol/l chlorku wapnia. Dalszy przerób prowadzi się w sposób opisany w przykładzie I.

cn fO u

cn

E

FIG. 2

o o

Osi

FIG. 1

Dcpaitament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego do terapii w chorobach dróg oddechowych, polegający na wymywaniu płuc bydlęcych roztworem chlorku sodu, znamienny tym, że do otrzymanego ekstraktu dodaje się jony wapnia tak, aby ich zawartość wynosiła 3 do 6 mmoli/l potem produkt odwirowuje się z powyższego roztworu, który zawiera 6 - 12 mmoli/l jonów wapnia, następnie pierwsze oczyszczanie prowadzi się przez odwirowanie z glukozowym gradientem gęstości w obecności 3- 8 mmoli/l jonów wapnia, a drugie oczyszczanie prowadzi się przez ekstrakcję układem chloroform-alkohol-woda przy zastosowaniu wodnej fazy, zawierającej 3 - 8 mmoli/l jonów wapnia, następnie usuwa się fazę organiczną i pozostałość suszy oraz rozdrabnia i tak otrzymane suche lipidy zawiesza się w roztworze wodnym zawierającym co najmniej 1 mmol/l jonów wapnia oraz co najmniej 33 mmol/l chlorku sodu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakcję prowadzi się w układzie chloroform-metanol-woda, a subtelnie sproszkowane suche lipidy rozprasza się w wodnym roztworze, który zawiera 2,5- 3,5 mmoli/l jonów wapnia oraz 60-150 mmoli/l chlorku sodu.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oddziela się fazę organiczną i wysuszoną pozostałość, zawierającą sproszkowane suche lipidy i związane z nimi jony wapnia w ilości większej niż 25 mmoli/l dających się ekstrahować organicznie fosfolipidów, rozprasza się w wodnym roztworze, który zawiera co najmniej 1 mmol/I jonów wapnia i co najmniej 33 mmole/l chlorku sodu.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, że obciążony jonami wapnia środek powierzchniowo czynny liofilizuje się z ograniczonego rozpuszczalnika.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesiny środka powierzchniowo czynnego o małej lepkości otrzymuje się przez rozcieńczenie zawiesin o wysokiej lepkości środkiem rozpraszającym.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w środku powierzchniowo czynnym koryguje się jeszcze dodatkowo zawartość jonów wapnia przez dodanie jego soli w alkoholowym roztworze.