PL176174B1

PL176174B1 - O-alkilowane pochodne rapamycyny

Info

Publication number: PL176174B1
Application number: PL93308268A
Authority: PL
Inventors: Sylvain Cottens; Richard Sedrani
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1995-03-23
Publication date: 1999-04-30
Also published as: SK46595A3; ATE272063T1; HUT71232A; FR04C0012I2; RU95110053A; ES2124793T3; CZ283333B6; JP3568800B2; CY2005010I1; EP0663916A1; GB9221220D0; FI109540B; CY2125B1; CZ89995A3; FI20001943A7; BR1100353A; AU4819293A; SK286054B6; JPH08502266A; NO951312D0

Abstract

1. O-alkilowane pochodne rapamycyny o wzo- rze 2, w których X oznacza (H, H) lub O; Y oznacza (H, OH) lub O, R1 oznacza H, alkil, aryloalkil, hydroksyalkil, dihydroksyalkil, hydroksyalkiloaryloalkil, di-hydro- ksyalkiloaryloalkil, acyloksyalkil, aminoalkil, alkilo- aminoalkil, alkoksykarbonyloaminoalkil, acyloamino- alkil, arylosulfonamidoalkil, allil, dihydroksyalkiloal- lil, dioksolanyloallil i hydroksyalkoksyalkil, przy czym w powyzszych grupach “alk” lub “alkil” ozna- czaja grupy C1 - 1 6 alkilowe proste lub rozgalezione; R2 oznacza H lub C1 -6 alkil; zas R4 oznacza metyl lub R4 i R1 razem oznaczaja C2-6alkilen; pod warunkiem, ze R1 i R2 nie oznaczaja jednoczesnie H. WZÓR 1 P L 176174 B 1 PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sąnowe O-alkilowane pochodne rapamycyny mające zastosowanie farmaceutyczne.

Rapamycyna jest znanym makrolidem antybiotycznym produkowanym przez Streptomyces hygroscopicus, o strukturze przedstawionej wzorem 1, wskazanej przykładowo przez McAlpine, J.B. i wsp., J. Antibiotics (1991) 44:688; Schreiber, S. L., i wsp., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113:7433; opis US nr 3 929 992.

Rapamycynajest bardzo silnym środkiem immunosupresyjnym, znanym ze swojej aktywności przeciwnowotwOrowej oraz przeciwgrzybiczej. Jednak zastosowanie jej jako środka farmaceutycznego jest ograniczone z uwagi na bardzo niską i zmiennąbiodostępność oraz z powodu wysokiej toksyczności. Ponadto, rapamycyna jest wysoce nierozpuszczalna i trudne jest sporządzanie z niej kompozycji galenowych.

Obecnie nieoczekiwanie odkryto, że pewne nowe pochodne rapamycyny (dalej nazywane nowymi związkami) mają poprawiony profil farmakologiczny w stosunku do rapamycyny, wykazują lepszą stabilność i biodostępność oraz pozwalają na dużo łatwiejsze wytwarzanie preparatów galenowych. Te nowe związki są O-alkilowanymi pochodnymi rapamycyny o strukturze przedstawionej wzorem 2, w których

X oznacza (H, H) lub O;

Y oznaaza (H, OJH lub O;

R¹ oznacza H, alkil, aryloalkil, hydroksyalkil, dihydrzksyalkil, hydroksyalkiloarylzalkil, di-hydroksyalkiloaryk)alkil, acyloksyalkil, aminoalkil, alkiloaminoalkil, alkoksykarbonyloami^oalkil, acylzaminoalkil, arylosulfonamidoalkil, allil, dihydroksyaikilżallil, dizkszlaayloallil i hydroksyaikoksyalkii, przy czym w powyższych grupach “alk” lub “alkil” zz.aazzajjągrupy C₁.₆aikiiowe proste lub rozgałęzione;

R2 oznacza H lub C^alkil; zaś

R4 oznaczamety l lub R4 i R¹ razem oznaczaaąC2.₆aikilea; pod warunkiem, że R¹ i R2 nie oznazzająjedazcześaie H.

Do korzystnych nowych pochodnych rapamycyny należą następujące związki:

1. 40-O-beaaylo-rapamyzyaa;

2. 40-O-(4'-hydrzksymetylo)beazylo-rapamyzyna

3. 40-O-[4'-(1,2-dii hy drok sy etydo)] benxy] o-rapamy c y na

4. 40-O-aiiiio-rapamycyaa

5. 40-O-[3'-(2,2-dimetylo-1,3-dizksolan-4(S)-ylo)-prop-2'-en-1 '^σΙ^ρΜ^ cyna

6. (2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihydrzksypeat-2'-en-Γ-yio)-rapamyzyna

7. 40-O-(2-hydroksy)etzksykarbonylzmetylo-rapamycyna

8. 40-O-(2-hydroksy)etylo-rapamyzyaa

9. 40-O-(3-hydroksy)propylo-rapamycyaa

10. 40-O-(6-hydroksy)heksylo-rapamyzyaa

11. 40-O-[-2-(2-hydroksy)etoksy]etylo-rapamycyaa

12. 40-O-[(3S)-2,2-dimetylodioksolaa-3-ylo]metylo-rapamycyna

13. 40-O-[(2S)-2,3-dihydroksyprop-1-ylo]-rapamycyna

14. 40-O-(2-azetoksy)etylo-rapamyzyna

15. 40-O-(2-aikotynzilzksy)etylo-rapamyzyna

16. 40-O-[2-(N-morfoliaz)azetoksy]etylo-rapamycyaa

17. 40-O-(2-N-imidazoliloacetoksy)etyio-rapamyzyaa

18. 40-O-[2-(N-metylo-N'piperazyaylo)azetoksy]etylo-rapamyzyna

19. 39-O-desmetylz-39-40-O,O-etyleaz-rapamycyaa

20. (26R)-26-hydrz-40-O-(2-hydroksy)etyio-rapamycyaa

21. 28-O-metyio-rapamycyaa

22. 40-O-(2-amiazetylo)-rapamyzyna

23. 40-O-(2-azetamiazetylo)-rapamycyaa

24. 40-O-(2-nikotyaoamidoetyio)-rapamyzyna

25. 40-O-(2-(N-metylzimidaz-2'-ylokarboetoksyamido)etylo-rapamyzyna

176 174

26. 40-O-(2-etoksykarbonyloaminoetylo)-rapamycyna

27. 40-O-(2-tolilosulfonamidoetylo)-rapamycyna

40-O-[2-(4',5'-dikarboetoksy-r,2',3'-triazol-1'-ilo)etylo]-rapamycyna

Korzystnymi nowymi związkami do zastosowań immunosupresyjnych są

40-O-podstawione rapamycyny, w których oba X i Y oznaczaj ą O, R² oznacza H, R4 oznacza metyl aRi jest inne niż H; najkorzystniej, gdy Ri dobrane jest spośród hydroksyalkilu, hydroksyalkoksyalkilu, acyloaminoalkilu i aminoalkilu; zwłaszcza 40-O-(2-hydroksy)-etylo-rapamycyna, 40-O-(3-hydroksy)propylo-rapamycyna, 40-O-[2-(2-hydroksy)etoksy]etylo-rapamycyna i 40-O-(2-acetaminoetylo)-rapamycyna.

Korzystnie, O-podstawianie przy C20 lub O,O-dwupodstawianie przy C28 i C40 przeprowadza się zgodnie z następującym ogólnym sposobem: rapamycynę (lub hydro lub dezoksorapamycynę) poddaje się reakcji z rodnikiem organicznym przyłączonym do grupy opuszczającej (np. RX, w której R oznacza rodnik organiczny np. grupę alkilową, allilową lub benzylową, pożądanąjako O-podstawnik a X oznacza grupę opuszczającą np. CCbC(NH)O lub CF₃SO3), w odpowiednich warunkach reakcji, korzystnie w warunkach kwaśnych lub obojętnych, np. w obecności kwasu takiego jak kwas trifluorometanosulfonowy, kwas kamfosulfonowy, kwas p-toluenosulfonowy lub ich odpowiednie sole pirydyniowe lub podstawione pirydyniowe, gdy X oznacza CCl₃C(NH)O lub w obecności zasady takiej jak pirydyna, podstawiona pirydyna, diizopropyloetyloamina lub pentametylopiperydyna, gdy X oznacza CF₃SO₃. O-podstawianie przy C28 przeprowadza się w ten sposób, ale z uprzedniąochronąprzy C40. Możliwe są dalsze modyfikacje. Na przykład, gdy podstawnikiem jest allil, wyodrębnione, monopodstawione podwójne wiązanie grupy allilowej jest wysoce podatne na dalszą modyfikację.

Pochodne 9-dezokso-rapamycynowe (X oznacza H, H) korzystnie wytwarza się przez redukcję (odtlenienie) rapamycyny za pomocą siarkowodoru, przez poddanie rapamycyny reakcji z difenylodiselenkiem i tributylo-fosfiną lub za pomocą innej odpowiedniej reakcji redukcji.

Pochodne 26-hydrorapamycyny (Y oznacza OH, H) korzystnie wytwarza się przez uwodornienie grupy ketonowej, przy C26 rapamycyny lub 9-dezoksorapamycyny, do grupy hydroksylowej za pomocą reakcji łagodnej redukcji, takiej jak reakcja redukcji borowodorkiem.

Nowe związki są szczególnie użyteczne w następujących stanach:

a. Leczenie lub zapobieganie odrzutom przeszczepianych organów lub tkanek np. leczenie biorców z przeszczepem serca, płuca, połączonego płuco-serca, wątroby, nerki, trzustki, skóry lub rogówki. Wskazane są one również w zapobieganiu chorobom związanym z reakcją przeszczepu przeciw gospodarzowi, takim jakie następują po przeszczepie szpiku kostnego.

b. Leczenie i zapobieganie chorobom samoodpomościowym i stanom zapalnym, w szczególności stanom zapalnym o etiologii obejmującej składnik samoodpomościowy, takim jak zapalenie stawu lub stawów (na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekłe postępujące zapalenie stawów i deformujące zapalenie stawów) oraz choroby reumatyczne. Poszczególnymi chorobami samoodpomościowymi, do których można stosować związki według wynalazku są samoodpomościowe zaburzenia hematologiczne (łącznie z anemią hemolityczną, anemią aplastyczną, czystą anemią czerwonych krwinek i małopłytkowością pierwotną), układowy toczeń rumieniowaty, zapalenie wielochrząstkowe, stwardnienie skóry, ziarnistość (granulamatosis) Wegenera, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekłe aktywne zapalenie wątroby, poważne osłabienie mięśni, łuszczyca, zespół Stevena-Johnsoną psyloza pierwotna choroba samoodpomościowego zapalenia jelita (łącznie z zapaleniem okrężnicy i chorobą Crohna), wewnątrzwydzielnicza oftalmopatia, choroba Gravesa, sarkbidoza, stwardnienie rozsiane, pierwotna żółciowa marskość wątroby, cukrzyca młodzieńcza (cukrzyca typu I), zapalenie błony naczyniowej oka (przedniego i tylnego odcinka), suche zapalenie spojówki i rogówki i wiosenne zapalenie spojówki i rogówki, śródmiąższowe zwłóknienie płuca, artropatia łuszczycowa, zapalenie kłębuszków nerkowych (z i bez zespołu nerczycowego np. łącznie z pierwotnym zespołem nerczycowym lub minimalnymi zmianami chorobowymi nerek) oraz młodzieńcze zapalenie skórno-mięśniowe.

c. Leczenie i zapobieganie astmie.

d. Leczenie oporności wielo-lekowej (MDR - multi-drug resistance). Nowe związki tłumią P-glikoproteiny (Pgp), które są cząsteczkami transportowymi przez błonę związanymi z MDR. MDR stwarza szczególne problemy u pacjentów z rakiem i pacjentów z AIDS, którzy nie reagują na- tradycyjną chemioterapię, ponieważ lek pompowany jest na zewnątrz komórki przez Pgp. Nowe związki są zatem przydatne dla zwiększania skuteczności innych środków chemioterapeutycznych w leczeniu i zwalczaniu stanów opornościowych takich jak oporność wielolekowa przy raku lub oporność wielolekowa przy AIDS.

e. Leczenie zaburzeń rozrostowych np. guzów, zaburzenia hiperrozrostowego skóry i podobnych.

f. Leczenie infekcji grzybiczych.

g. Leczenie i zapobieganie zapaleniu, zwłaszcza przez wzmacnianie działania sterydów.

h. Leczenie i zapobieganie infekcji, zwłaszcza infekcji wywołanej organizmami chorobotwórczymi mającymi czynnik Mip lub Mip-podobny.

i. Leczenie przedawkowań FK-506, rapamycyny, immunosupresyjnym nowym związkiem i innymi wiążącymi makrofilinę środkami immunosupresyjnymi.

Nowe związki, będące przedmiotem wynalazku, są stosowane do leczenia i zapobiegania wyżej opisanym zaburzeniom, przez podawanie ich pacjentowi, w skutecznej ilości. Ponadto, nadają się jako produkty pośrednie do wytwarzania związków wykazujących aktywność farmakologiczną, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych zawierających nowy związek w kombinacji lub w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem albo nośnikiem.

Większość opisanych nowych związkówjest wysoce immunosupresyjna, zwłaszcza nowe pochodne O-alkilowane przy C40, które są szczególnie przydatne we wskazaniach a i b, lecz nie we wskazaniach i. Natomiast te z nowych związków, które są mniej immunosupresyjne, zwłaszcza O-alkilowane tylko w pozycji C28, są szczególnie przydatne we wskazaniach h oraz i, ale mniej korzystne we wskazaniach a lub b.

Nowe związki stosuje się przez podawanie pacjentowi, gdy zachodzi potrzeba takiego leczenia, farmaceutycznie skutecznej dawki w farmaceutycznie dopuszczalnej postaci. Odpowiednie dawkowanie nowych związków będzie oczywiście różne w zależności od leczonego stanu (na przykład typu choroby lub natury oporności), pożądanego skutku i sposobu podawania.

Na ogół jednak zadawalające wyniki otrzymuje się przy podawaniu doustnym w dawkach rzędu od 0,05 do 5 lub aż do 10 mg/kg/dzień np. rzędu od 0,1 do 2 lub az do 7,5 mg/kg/dzień przy podawaniu raz dziennie lub w podzielonych dawkach 2 do 4 razy dziennie, lub przy podawaniu pozajelitowym np. dożylnym, na przykład drogą i. v. kroplówki lub infuzji w dawkach rzędu od 0,01 do 2,5 aż do 5 mg/kg/dzień np. rzędu 0,05 do 0,1 aż do 1,0 mg/kg/dzień. Odpowiednie sązatemdawkowania dzienne dla pacjentów rzędu 500 mg p.o. np. rzędu od 5 do 100 mg p.o. lub rzędu od.0,5 do 125 aż do 250 mg i.v. np. rzędu od 2,5 do 50 mg i.v.

Alternatywnie lub nawet korzystnie, dawkowanie ustala się w sposób specyficzny dla każdego pacjenta, aby zapewnić z góry ustalone progowe poziomy we krwi np. określone techniką RIA. Zatem dawkowanie u pacjenta można dostosować tak, aby osiągnąć regularne dochodzenie do poziomów progowych we krwi według pomiaru RIA na poziomie od 50 do 150 aż do 500 lub 1000 ng/ml np. analogicznie do metod dawkowania równolegle stosowanej immunosupresyjnej terapii cyklosporyną.

Nowe związki można podawać jako jedyny składnik aktywny lub razem z innymi lekami. Na przykład, w zastosowaniach immunosupresyjnych takich jak zapobieganie i leczenie reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzut przeszczepu lub choroba samoodpomościowa. Nowe związki mogą być stosowane w połączeniu z cyklosporyną, FK-506 lub ich immunosupresyjnymi pochodnymi, kortikosterydami, azatioprenem, monoklonalnymi przeciwciałami immunosupresyjnymi np. monoklonalnymi przeciwciałami do CD3, CD4, CD25, CD28 lub CD45 i 7 lub innymi związkami immunomodulatorami. Przy zastosowaniach przeciwzapalnych, nowe związki mogą być stosowane razem ze środkami przeciwzapalnymi np. kortikosterydami.

176 174

Przy zastosowaniach przeciwzakaźnych, nowe związki mogą być stosowane w kombinacji z innymi środkami przeciwzakaźnymi np. lekami przeciwwirusowymi lub antybiotykami.

Nowe związki podaje się dowolną drogą tradycyjną, zwłaszcza dojelitowo, np. doustnie, na przykład w postaci roztworów do picia, tabletek lub kapsułek lub pozaj elitowo, na przykład w postaci roztworów lub zawiesin do iniekcji. Odpowiednia postać pojedynczej dawki do podawania doustnego zawiera np. od 1 do 50 mg związku według wynalazku, zwykle 1 do 10 mg. Kompozycje farmaceutyczne zawierające nowe związki mogą być sporządzane znanym sposobem, analogicznie do kompozycji farmaceutycznych zawierających rapamycynę np. jak opisano w EPA 0 041 795. '

Działanie farmakologiczne nowych związków wykazano np. w następujących testach:

1. Reakcja mieszanych limfocytów (MRL)

Reakcję mieszanych limfocytów pierwotnie opracowano w związku z aloprzeszczepami, w celu oceny zgodności tkankowej pomiędzy potencjalnymi dawcami i biorcami organów i stanowi jeden z najlepiej ustalonych modeli reakcji immunologicznej in vitro. Dla wykazania immunosupresyjnego działania nowych związków zastosowano model mysi MLR np. opisany przez T. Meo w “Immunological Methods”, L.Lefkovits i B. Peris, wyd. Academic Press, N.Y. str. 227-239 (1979). Komórki śledziony (0,5 x 10⁶) z myszy Balb/c (samica, 8-10 tygodni) inkubowano wspólnie przez 5 dni z 0,5x106 napromienionych (2000 radów) łub traktowanych mitomycynąC komórek śledziony z myszy CBA (samica, 8-10 tygodni). Napromienione komórki alogeniczne wzbudzają reakcję rozrostową w komórkach śledziony Balb/c, która może być mierzona zapomocąznakowanego prekursora wprowadzonego do DNA. Ponieważ komórki stymulatora są napromienione (lub traktowane mitomycyną C) nie reagują one z komórkami Balb/c rozrostem, ale zatrzymują swoją antygeniczność. Przeciwrozrostowe działanie nowych związków na komórki Balb/c mierzono w różnych rozcieńczeniach i stężeniach i obliczono, że powodują 50% inhibicję rozrostu komórek (IC₅₀). Wydajność inhibitująca badanej próbki może być porównana z rapamycynąj wyrażonajako IC₅₀ względne (np. IC₅0 badanej próbki/ IC₅0 rapamycyny).

2. Rozrost, w którym pośredniczy IL-6

Zdolność nowych związków do przeszkadzania czynnikowi wzrostu związana ze szlakiem sygnalizacji oceniana jest przy użyciu linii komórkowej hybridoma myszy zależnej od interleukiny-6. Ocenę przeprowadzono na płytkach do mikromiareczkowania z 96 wgłębieniami. 5000 komórek/wgłębienie hodowano w pożywce wolnej od surowicy (jak opisali M.H. Schreiter i R. Tess w Immunological Methods, I. Lefkovits i B. Pemis, wyd. Academic Press-1981, tom II, str. 263-275), uzupełnionym 1ng rekombinanta IL-6/ml. Po 66 godzinach inkubowania pod nieobecność lub w obecności badanej próbki, komórki poddano pulsacji za pomocą 1 μ Ci (3-H)-tymidyny/ wgłębienie przez następne 6 godzin, zebrano i policzono za pomocą scyntylacji w cieczy. Włączenie (3-H)-tymidyny do DNA skorelowane jest ze wzrostem liczby komórek,- a zatem jest miarą rozrostu komórek. Szereg rozcieńczeń badanej próbki pozwala na obliczenie stężenia powodującego 50% inhibicję rozrostu komórek (IC50). Wydajność inhibitująca badanej próbki może być porównana z rapamyeynąi wyrażonajako IC50 względne (np. IC50 badanej próbki/IC50 rapamycyny).

3. Oznaczenie wiązania makrofiliny

Oba, rapamycyna i strukturalnie pokrewny środek immunosupresyjny, FK-506, znane sąz wiązania in vivo makrofiliny 12 (znanej również jako proteina wiążąca FK-506 lub FKBP-12) i przypuszcza się, że to wiązanie związane jest z immunosupresyjną aktywnością tych związków. Nowe związki również silnie wiążąmakrofilinę-12 co wykazano w konkurencyjnym oznaczeniu wiązania.

W oznaczeniu tym, FK-506 sprzężone z BSA stosowano do pokrycia wgłębień płytki do mikromiareczkowania. Pozwolono, aby biotynylowany rekombinant ludzkiej makrofiliny-12 (biot-MAP) związał się w obecności lub pod nieobecność badanej próbki z unieruchomionym FK-506. Po przemyciu (w celu usunięcia niespecyficznie związanej makrofiliny), oceniano wiązanie biot-MAP przez inkubację z koniugatem streptawidyna - alkaliczna fosfataza, po czym

16174 przemyto i z kolei dodano jako substrat fosforan p-nitrofenylu. Odczytem było OD przy 405 nm. Wiązanie badanej próbki z biot-MAP powoduje zmniejszenie ilości biot-MAP związanego z FK-506 a zatem zmniejszenie OD405. Szereg rozcieńczeń badanej próbki pozwala na oznaczenie stężenia powodującego 50% inhibicję wiązania biot-MAP z unieruchomionym FK-506 (IC50). Wydajność inhibitującąbadanej próbki porównano z IC50 wolnego FK-506 jako standardu i wyrażono jako IC50 względne (np. IC₅0 badanej próbki/ IC₅0 wolnego FK-506).

4. Umiejscowiona reakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi (GvH)

Skuteczność nowych związków in vivo dowiedziono na odpowiednim modelu zwierzęcym jak opisał np. Ford i wsp., Transplantation 10 (1970) 258. Komórki śledziony (1x10⁶) z 6 tygodniowych samic szczurów Wistar/Furth podskórnie wstrzyknięto dnia 0 do lewej tylnej łapy samic (F344 x WF)F j szczurów o wadze około 100 g. Zwierzęta traktowano przez 4 kolejne dni, po czym 7 dnia usunięto i zważono węzły chłonne mięśnia podkolanowego. Różnicę w wadze pomiędzy dwoma węzłami chłonnymi wzięto jako parametr do oceny reakcji.

5. Reakcja aloprzeszczepu nerki u szczura

Jedną nerkę z samicy szczura fisher 344 przeszczepiono do naczynia nerkowego szczura WF biorcy z jednobocznie (strona lewa) usuniętą nerką stosując anastomozę koniec do końca. Również dla moczowodów stosowano anastomozę koniec do końca. Traktowanie rozpoczęto w dniu transplantacji i kontynuowano przez 14 dni. Wycięcie nerki ze strony przeciwnej przeprowadzono siedem dni po transplantacji, pozostawiając biorcę zależnym od zachowania nerki donora. Przeżycie biorcy przeszczepu przyjęto jak parametr funkcjonowania przeszczepu.

6. Eksperymentalnie wywołane uczuleniowe zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) u szczurów

Mierzono skuteczność nowych związków w EAE np. za pomocą procedury opisanej u Levine & Wenka, Amer J Path 47 (1965) 61; McFarlin i wsp., J. Immunol 113 (1974) 712; Borel, Transplant & Clin. Immunol 13(1981) 3. EAE jest szeroko akceptowanym modelem dla stwardnienia rozsianego. Samcom szczurów Wistar wstrzyknięto do tylnych łap bydlęcy rdzeń kręgowy i kompletny środek wspomagający Freunda. Objawy choroby (paraliż ogona i obu tylnych łap) zwykle rozwijają się w ciągu 16 dni. Zarejestrowano liczbę zwierząt chorych jest również czas wystąpienia choroby.

7. Zapalenie stawów wywołane środkiem wspomagającym Freunda

Przedstawiono skuteczność przeciw eksperymentalnie wywołanemu zapaleniu stawów stosując procedurę opisanąnp. Wintera & Nussa, Arthritis & Rheumatism 9 (1966) 394, Billinghama & Daviesa, Handbook ofExperimental Pharmacol (Vane & Ferreira Wyd. Springer-Verlag, Berlin 50/11(1979) 108-144). Szczurom OFA i Wistar (samce lub samice, waga ciała 150 g) wstrzyknięto i.e. przy nasadzie ogona lub w tylną łapę 0,1 ml oleju mineralnego zawierającego 0,6 mg liofilizowanych zabitych działaniem ciepła Mycobacterium smegmatis. W rozwiniętym modelu zapalenia stawów, rozpoczęo leczenie tuż po wstrzyknięciu substancji pomocniczej (dni 1-18); W ustalonym modelu zapalenia stawów leczenie rozpoczęto 14 dnia, gdy dobrze rozwinęło się zapalenie wtórne (dni 14-20). Pod koniec eksperymentu zmierzono napuchnięte stawy za pomocą mikrocyrkla. ED50 oznacza dawkę doustną w mg/kg, która redukuje opuchnięcie (pierwotne lub wtórne) do połowy opuchlizny z próby kontrolnej.

8. Działanie przeciwnowotworowe i MDR

Działanie przeciwnowotworowe nowych związków i ich zdolność do wzmacniania zachowań środków przeciwrakowych poprzez łagodzenie oporności wielolekowej wykazano np. przez stosowanie środka przeciwrakowego np. kolchicyny lub etopozydu do komórek opornych wielolekowo i komórek wrażliwych na leki in vitro lub do zwierząt opornych wielolekowo lub wrażliwych na leki lub do wrażliwych na leki nowotworów lub infekcj i, z lub bez współ-podawania badanych nowych związków i przez podawanie samych nowych związków.

Takie badanie in vitro przeprowadzono stosując dowolną odpowiednią linię komórkową oporną na leki i kontrolną (rodzicielską) linię komórkową, wytworzoną np. tak jak opisał Ling i wsp., J. Cell. Physiol., 83, 103-116 (1974)„oraz Bech-Hansen i wsp. J. Cell. Physiol, 88, 23-32 (1976). Wybrano poszczególne klony oporne wielolekowo (np. oporne na kolchicynę) linii CHR (subklon C553.2) i rodzicielską wrażliwą linię AUX' B1 (subklon AB1 S11).

176 174

Przeciwrakowe i przeciw-MDR działanie in vivo pokazano np. na myszach, którym wstrzyknięto komórki raka oporne wielolekowo i wrażliwe na leki. Rak puchliny brzusznej Ehrlicha (EA) sub-linii opornych na substancję lekową DR, VC, AM, ET, TE lub CC rozwinięto przez kolejne przenoszenie komórek EA do kolejnych generacji myszy gospodarza BAlb/c zgodnie z metodą opisaną przez Slatera i wsp. J. Clin. Invest, 70, 1131 1982).

Równoważne wyniki można otrzymać przez zastosowanie porównywalnie zaprojektowanych modeli testowych nowych związków np. in vitro lub stosując zwierzęta doświadczalne zainfekowane szczepami wirusa opornego na leki i wrażliwego na leki, szczepami bakterii opornych i wrażliwych na antybiotyki (np. penicylinę), szczepami grzybów przeciwgrzybiczo opornych i wrażliwych jak również szczepami pierwotniaków opornych na leki np. szczepami Plasmodial, na przykład naturalnie występującymi sub-szczepami Plasmodium falciparum wykazującymi nabytą chemioterapeutyczną, antymalaryczną oporność na leki.

9. Wiązanie FKBP

Niektóre nowe związki nie sąimmunosupresyjne, zwłaszcza te, które sąO-podstawione tylko przy C28, takie jak 28-O-metylorapamycyna. Można to wykazać w standardowych próbach in vitro w porównaniu z FK506 i rapamycyną. FK506, na przykład, znane jest jako silny inhibitor transkrypcji IL-2, jak można wykazać w próbie IL-2 z genu reportera. Rapamycyna, mimo, że nieaktywna w próbie IL-2 genu reportera, silnie inhibituje rozrost komórek T zależnych od IL-6. Oba związki są bardzo silnymi inhibitorami reakcji mieszanych limfocytów. Nieimmunosupresyjność może również być wykazana in vivo na powyższych modelach 1 -7. Jednak, nawet te nowe związki, które nie sąimmunosupresyjne, wiąźąmakrofilinę, przez co nadają się do pewnych zastosowań, w których nieimmunosupresyjność jest zaletą.

Te owe związki, które silnie wiążą makrofilinę i same nie sąimmunosupresyjne, mogą być stosowane w leczeniu przedawkowania środków immunosupresyjnych wiążących makrofilinę, takich jak FK506, rapamycyna i immunosupresyjne nowe związki.

10. Zwiększenie siły działania sterydów

Aktywność nowych związków wiążąca makrofilinę powoduje także, że są one przydatne do wzmagania lub zwiększania działania kortykosterydów. Łączne leczenie związkami według wynalazku i kortykosterydem takim jak deksametazon, powoduje znaczne wzmocnienie aktywności sterydowej. Może to być wykazane np. w oznaczeniu acetylotransferazy wirus - chloramfenikol (MMTV-CAT) genu reportera na guzie sutka myszy np. jak opisał Ning i wsp. w J. Biol. Chem., (1993) 268 6073. To działanie synergistyczne pozwałana obniżenie dawek kortykosterydów, redukując tym samym, w niektórych przypadkach, ryzyko działania ubocznego.

11. Czynnik inhibicji Mip i Mip podobny

Ponadto, nowe związki przyłączają się do i blokują różne czynniki Mip (czynniki zwiększające infektywność makrofagów) i Mip podobne, które są strukturalnie podobne do makrofiliny. Czynniki Mip i Mip podobne są czynnikami wirulencyjnymi produkowanymi przez wiele różnych organizmów chorobotwórczych, łącznie z rodzajami Chlamidia, np. Chlamidia trachomatis; Neisseria, np. Neisseria meningitidis i Legionella np. Legionella pneumophilia a także pierwotniaki zdolne do życia tylko w jednym środowisku należące do rzędu Rickettsiales. Czynniki te odgrywają rolę krytyczną w infekcjach międzykomórkowych. Skuteczność nowych związków w odniesieniu do redukowania infektywności organizmów chorobotwórczych, które produkujączynniki Mip lub Mip-podobne, może być wykazana przez porównanie infektywności organizmów chorobotwórczych w hodowlach komórkowych w obecności i pod nieobecność makrolidów np. z zastosowaniem metod opisanych u Lundemose i wsp. Mol. Microbiol. (1993) 7·777. Nieimmunosupresyjne związki według wynalazku są korzystne w zastosowaniu do tych wskazań z tego powodu, że nie są one immunosupresyjne a zatem nie ma potrzeby kompromisu pomiędzy naturalną obroną odpornościową, ciała przeciw organizmom chorobotwórczym.

Nowe związki są również przydatne do oznaczeń w celu wykrycia obecności lub ilości związków wiążących makrofilinę np. w konkurencyjnych oznaczeniach w celach diagnostycznych lub skriningowych. Zatem, związki według wynalazku nadają się do stosowaniajako narzędzia skriningowe do oznaczania obecności związków wiążących makrofilinę w badanym

176 174 roztworze np. w poddawanej skriningowi krwi, osoczu krwi lub badanej pożywce. Korzystnie, nowe związki unieruchamia się we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania a następnie pozostawia do wiązania w obecności lub pod nieobecność badanego roztworu ze znakowaną makrofiliną-12 (FKBP-12). Alternatywnie, FKBP-12 unieruchomione we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania pozostawia się w obecności i pod nieobecność badanego roztworu do związania z nowym związkiem, który został oznakowany np. fluoro-, enzymatycznie lub radio-znakowany np. nowy związek, który został O-podstawiony przy C40 i/lub C28 grupąznakującą. Płytki przemywa się i mierzy się ilość związanego znakowanego związku. Ilość substancji wiążącej makrofilinę w badanym roztworze jest z grubsza odwrotnie proporcjonalna do ilości związanego oznakowanego związku. Dla analizy ilościowej sporządza się standardową krzywą wiązania przy użyciu znanych stężeń związku wiążącego makrofilinę.

W następujących przykładach podano charakterystyczne dane spektroskopowe dla ułatwienia identyfikacji. Nie podano pików, które nie różnią się znacznie od rapamycyny. Dane biologiczne wyrażono jako IC50 względne w porównaniu z rapamycyną w przypadku oznaczeń reakcji mieszanych limfocytów (MLR) i rozrostu zależnego od IL-6 (IL-6 dep.prol.) oraz FK-506 w oznaczeniu wiązania makrofiliny (MBA). Wyższe IC₅₀ odpowiada niższemu powinowactwu wiązania.

Przykład I. 40-O-benzylo-rapamycyna

Do mieszanego roztworu 183 mg (0,200 mmola) rapamycyny w 2,1 ml 2:1 cykloheksanu chlorku metylenu dodano 75 pl (0,402 mmola) benzylo-trichloroacetimidanu a następnie 2,6 pl (29 pmola 15% molowych) kwasu trifluorometanosulfonowego, po czym mieszanina natychmiast zżółkła. Po 30 godzinach mieszaninę rozcieńczono octanem etylu i zalano 10% wodnym wodorowęglanem sodu. Warstwy rozdzielono i warstwę wodnądwukrotnie wyekstrahowano octanem etylu. Połączone roztwory organiczne przemyto 10% wodnym wodorowęglanem sodu, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (50:50 heksan - octan etylu) otrzymując 40-O-benzylo-rapamycynę w postaci białego bezpostaciowego ciała stałego. ’HNMR (CDCla) δ 0,73 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (4H, s i m), 3,33 (3H, s), 3,49 (3H, s), 4,15 (1H, szeroki d), 4,65 (1H, d), 4,71 (1H,' d), 7,22-7,38 (5H, m); MS (FAB) m/z 1026 ([M+Na]+), 972([M-OCH₃]⁺), 954 ([M-(OCH₃ + H₂O)]⁺).

MBA (względne IC₅₀ 1,8

IL-6 dep.prol. (względne IC₅₀) 10

MLR (względne IC50) 110

Przykład II. 40-O-(4'-hydroksymetylo)benzylo-rapamycyna

a) 40-O-[4'-(t-butylodimetylosilil)oksymetylo]benzylo-rapamycyna

Do mieszanego, oziębionego (-78°C) roztworu 345 pl (2,0 mmola) bezwodnika triflowego w 5 ml chlorku metylenu dodano roztwór 504 mg (2,0 mmola) alkoholu 4-(t-butylodimetylosilil)oksymetylobenzylowego i 820 mg (4,0 mmola) 2,6-di-t-butylo-4-metylopirydyny w 5 ml chlorku metylenu. Otrzymaną mieszaninę ogrzano do temperatury -20°C i mieszanie kontynuowano w tej temperaturze przez 0,5 godziny. Następnie mieszaninę ponownie ochłodzono do temperatury -78°C i dodano roztwór 914 mg (1,0 mmola) rapamycyny w 5 ml chlorku metylenu. Mieszaninę pozostawiono na noc do ogrzania się do temperatury pokojowej a następnie zalano 10% wodnym wodorowęglanem sodu. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu. Połączony roztwór organiczny przemyto nasyconą solanką, osuszono nad siarczanem sodu, przesączono pod obniżonym ciśnieniem i zatężono. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (50:50 heksan - octan etylu) otrzymując 40-O-[4'-(t-butylodimetylosihl)oksymetylo]benzylo-rapamycynę w postaci białej pianki:

MS (FAB) m/z 1170 ([M+Na]+),1098 ([M-(OCH₃ + H2O)]+).

b) a) 40-O-[4'-hydroksymetylo)benzylo-rapamycyna

Do mieszanego, ochłodzonego (0°C) roztworu 98 mg (0,093 mmola) związku otrzymanego w przykładzie II w 2 ml acetonitrylu dodano 0,2 ml HF-pirydyny. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 2 godziny i zalano wodnym wodorowęglanem sodu, po czym wyekstrahowano

176 174 octanem' etylu. Roztwór organiczny przemyto solanką, osuszono nad siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (20:80 heksan - octan etylu) otrzymując - tytułowy związek w postaci białej pianki ^lH NMR (CDCl3) δ 0,73 (1H,dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,22 (1H,m), 4,67 (4H,m), 7,35 (4H, m); MS (FAB) m/z 1056 ([M+Na]+), 1002 ([M-OCH3]⁺), 984 ([M-(OCH3 + H₂O)]⁺), 966 ([M-(OCH3 + 2H2O)]⁺), 934 ([M-(OCH3 + CH₃OH + 2H2O)]+)

MBA (względne IC50 2,7

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 3,9

MLR (względne IC50) 3

Przykład III.

40-O-[4'-(1,2-dihydroksyetylo)]benzylo-rapamycyna

a) 40-O-[4'-(2,2-dimetyło-1,3-dioksołan-4-ylo)]benzylo-rapamycyna

W10 ml 1:1 cykloheksanu '- chlorku metylenu rozpuszczono 452 mg (1,24 mmola) trichloroacetimidu 4-(2,2-dimetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)benzylu a następnie 0,14 ml (0,64 mmola) 2,6-di-t-butylopirydyny i 56 μ! (0,64 mmola) kwasu trifluorometanosulfonowego. Do mieszaniny tej dodano roztwór 587 mg (0,64 mmola) rapamycyny w 2 ml chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej i zalano wodnym wodorowęglanem sodu. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną dwukrotnie wyekstrahowano octanem etylu. Połączony roztwór organiczny przemyto nasyconą solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (50:50) otrzymując 40-O-[4'-(2,2-dhnetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)]benzylo-rapamycynę w postaci białego bezpostaciowego ciała stałego: *H NMR (CDCl₃) δ 0,73 (1H, dd), 1,48(3H,s), 1,55 (3H, s), 1,65(3H,s), 1,74(3H,s),3,67(3H,m),4,28(1H,dd),4,62(1H,d), 4,69 (1H, d) 5,06 (1H, dd), 7,33 (4H, m); MS (FAB) m/z 1126 ([M+Na]+), 1072 ([M-OCH3]⁴), 1054 ([M-(OCH3 + H2O)]+), 1014 ([M-(OCH3 + C^COC^F), 996 ([M-(OCH3 4 H2O+CH3COCH3)]⁺), 978 ([M-(OCH3 + 2H2O + C^COC^yF).

b) 40-O-[4'-(l,2-dihydroksyetylo)]benzy!o-rapamycyna

Do roztworu 90,7 mg (0,08 mmola) 40-O-[4-(2,2-dimetylo-1,3-dioksolan-4-ylo)]benzylo-rapamycyny w 4 ml metanolu dodano 1ml 1 n wodnego HCl. Po 2 godzinach mieszaninę zalano wodnym wodorowęglanem sodu i wyekstrahowano dwukrotnie octanem etylu. Roztwór organiczny przemyto solanką osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (octan etylu) i otrzymano związek tytułowy w postaci białej pianki: ¹HNMR(CDCl3)ó 0,73 (1H,dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,70 (4H, m), 4,63 (1H, d), 4,69 (1H, d) 4,80 (1H, dd), 7,33 (4B, m); MS (FAB) m/z 1086 ([M+Na]+), 1032 ([M-OCH3]⁺), 1014 ([M-(OCH3 + H2O)]⁺), 966 ([M-(OCH₃ 4 2H2O)]+).

MBA (względne IC50 0,92

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 10,5

MLR (względne IC50) 22

Przykład IV. 40-O-Allilo-rapamycyna

Do mieszanego, oziębionego (-78°C) roztworu 0,33 ml (2,01 mmola) bezwodnika triflowego w 10 ml chlorku metylenu powoli dodano roztwór 0,14 ml (2,06 mmola) alkoholu allilowego i 0,42 g (2,04 mmola) 2,6-di-t-butylo-4-metylo-pirydyny w 5 ml chlorku metylenu. Otrzymany zielonkawy roztwór mieszano przez 1,5 godziny i dodano 915 mg (1,00 mola) rapamycyny i 0,42 g (2,04 mmola) 2,6-di-t-butylo-4-metylo-pirydyny w 5 ml chlorku metylenu. Mieszanie kontynuowano przez 0,5 godziny w'temperaturze -78°C, po czym mieszaninę ogrzano do temperatury pokojowej. Po jednej więcej godzinie mieszaninę zalano wodnym wodorowęglanem sodu i warstwy rozdzielono. Warstwę wodną wyekstrahowano dwukrotnie octanem etylu . Połączony roztwór organiczny przemyto wodnym wodorowęglanem sodu i solanką osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Otrzymany zielony olej oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (60:40 heksan - octan etylu) otrzy mując związek tytułowy w postaci bezbarwnego bezpostaciowego ciała stałego: ¹H NMR

Υ16 174 (CDCl₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,05 (1H, m), 4,13 QH, szeroki d), 5,14 (2H, m) 5,27 (2H, m), 92 (2H, m); MS (FAB) m/z 976 ([M+Na]+), 922 ([M-OCH₃]⁺), 904 ([M-(OCH3 + H2O)]⁺), 886 ([M-(OCH3 + 2H₂O)]⁺), 872 ([M-(2CH3OH + OH)]+), 854 ([M-(OCH +CH3OH + 2H^O)]⁺)

MBA (względne IC₅q 1

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 8

MLR (względne IC50) 266

Przykład V. 40-O-[3'-(2,2-dimetylo-1,3-dioksokin-4(S)-ylo)]-prop-2'- en-1'-ylo]rapamycyna

Do mieszanego, oziębionego (-78°C) roztworu 0,64 g (4,00 mmola) E-(4S)-4,5-O,O-izopropylideno-pent-2-eno-1,4,5-triolu i 1,26 g (6,00 mmola) '^-di-t-butyloU-metylopirydyny w 20 ml chlorku metylenu dodano 0,82 ml (5,00 mmola) bezwodnika triflowego. Otrzymaną mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez 2 godziny i dodano roztwór 1,82 g (2,00 mmola) rapamycyny i 1,26 g (6,00 mmola) 2,6-di-t-butylo-4-metylopirydyny w 5 ml chlorku metylenu. Mieszaninę pozostawiono na noc do stopniowego ogrzania się do temperatury pokojowej, po czym zalano wodnym wodorowęglanem sodu. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano trzykrotnie octanem etylu . Roztwór organizzny przemyto wodnym wOdorowęgkinem sodu i solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, pr^zsączmn i aniżono;). Pctał^otalość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (40:60 heksan - octan etylu) otrzymując tytułowy związek w postaci białego ciała stałego: ¹H NMR (CDG3) δ 0,72 (1H, dd), 1,38 (3H, s), 1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,58 (2H, m), 4,08 (1H, dd), 4,15 (2H, m), 4,52 (1H, szeroki dd) 5,72 (1H, m), 5,88 (1H, m); MS (FAB) m/z 1076 ([M+Na]+), 1022 ([M-OCH3D, 1004 ([M-(OCH3 + H'O)]⁺), 964 ([M-(OCH₃ + C^COC^)]*), 946 ([M-(OCH3 + H2O + CH3COCH3)]+), 946 ([M-(OCH3 + 'HO + C^COC^)]*).

MBA (względne IC5₀ 0,64

IL-6 dep.prol. (względne IC50) U

MLR (względne IC50) 8

Przykład VI. (2%, 4'S)-40-O-(4', 5'-dihydroksnpent-2'-en-1'-ylo)-rapamycyaa

Warunki opisane w przykładzie III, etap b), zastosowano do związku otrzymanego w poprzednim przykładzie, po czym oczyszczano na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (95:5 octan etylu - metanol) otrzymując tytułowy związek w postaci białej pianki : Ή NMR (CDCl₃) δ 0,68 (1H, dd), 3,04 (1H, - m), 4,18 (5H, m), 5,75 (1H, dd), 5,88 (1H, m); MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]+) 1013 (M+), 995 ([M-H2O]+), 982 ((M-OCH₃)]⁺), 964 ([M-OCH3 + H2O)]⁺), 846 ([M-(OCH3 + 2H2O)]⁺), 832 ([M-(2CH3OH + OH)]+), 914 ([M-(OCH3 + CH₃OH + 2H2O)]⁺)

MBA (względne IC50) 1 β

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 128

MLR (względne IC50) 3,5

Przykład VII. 40-O-(2-hydroksy)etoksykarbonylomstylo-rapamyzyaa

a) 40-O-[(t-butylodimstylosilil)oksy]stoksykarbonylometylo-rapamncyaa Do mieszanego roztworu 2,74 (3,00 mmola) rapamycyny i 30 mg (0,06 mmola) dwuwodziaautstraoztanu dwurodowego w 30 ml chlorku metylenu dodano roztwór 0,38 ml (3,60 mmo la) diazppztaau 6-(t-butylodimztylosilil)oksyetnlu w ,10 ml chlorku metylenu w przeciągu ponad 5 godzin. Po zakończeniu dodawania mieszanie kontynuowano przez jedną więcej godzinę, po czym mieszaninę reakcyjną zalano 1n wodnym HCl. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wy ekstrahowano octanem etylu. Połączony roztwór organiczny przemyto wodnym wodorowęglanem sodu i solanką osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficzasj na żelu krzemionkowym (40:60 heksan - octan etylu) otrzymując 40-O-[2-(t-butylpdimetylosiliΓ)oksy]etoksykarbonylomstylo-rapamnzyaę: Ή NMR (CDCl₃) δ 0,06 (1H, dd), 0,68 (1H, dd), 0,88 (9H, s), 1,64 (3H, s), 1,73 (3H, s), 3,12 (5H, s i m), 3,81 (2H, dd), 4,19 (2H, dd), 4,3' (2H, s); MS (FAB) m/z 1152 ([M+Na]+), 1080 [M-(OCH3 + H2O)]⁺),

17(5174 • b) 40-O-(2-hydrzksy)etoksykalrbzmylometylo-rapamyzyaa

Do mieszanego, ochłodzonego (0°C) roztworu 81 mg (0,07 mmola) 40-O-[2-(t-butylodimetylosiiil)zksy]etoksykarbonylometylo-rapamycyay w 1,5 ml acetornitrylu dodano 0,15 ml HF-pirydyny. Po 2 godzinach mieszaninę reakcyjną zalano wodnym wodorowęglanem sodu. Mieszaninę wyekstrahowano octanem etylu. Roztwór organiczny przemyto solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono za pomocą PTLC (octan etylu) otrzymując związek tytułowy w postaci białego ciała stałego: Ii NMR (CDClajd 0,70 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,13 (5H, s i m), 3,85 (3H, m), 4,25'(5H, m), MS (FAB) m/z 1038 ([M+Na]+), 984 ([M-OCH₃]⁺), 966 ((M-(OCH3 + H2O)]⁺), 948 ([M-(OCH3 + 2H^O)]⁺),

MBA (względne IC₅₀ 4

IL-6 dep.prol. (względne IC₅0) 9,7

MLR (względne IC₅0) 2,1

Przykład VIII. 40-O-(2-hydroksy)etylz-rapamycyna

a) 40-O-[2-(t-butyiodimetylzsiiil)oksy]etylz-rapamycyna

Roztwór 9,14 g (10 mmola) rapamycyny i 4,70 ml (40 mmoli) 2,6-lutydyny w 30 ml toluenu ogrzano do temperatury 60°C i dodano roztwór 6,17 g (20 mmoli) tnilanianu 2-(t-butylodimetylosilil)oksyetyiu i 2,35 ml (20 mmoli) 2,6-lutydyny w 20 ml toluenu. Mieszaninę tę mieszano przez 1,5 godziny. Następnie w przedziałach 1,5 godzinnych dodano dwie porcje 3,08 g (10 mmoli) tridanianu i 1,2 ml (10 mmoli) 2,6 lutydyny w 10 ml toluenu. Po dodaniu ostatniej porcji kontynuowano mieszanie w temperaturze 60°C przez 2 godziny i przesączono otrzymaną brązową zawiesinę. Przesącz rozcieńczono octanem etylu i przemyto wodnym wodorowęglanem sodu i solanką. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono! i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie zhromatografizzaej na żelu krzemionkowym (40:60 heksan-octan etylu) otrzymując 40-O-[2-(t-butylodimetylosilil)zksy]etylz-rapamyzyaę w postaci białego ciała stałego: *H NMR (CDCl₃) δ 0,06 (6H, s), 0,72 (1H, dd), 0,90 (9H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,63 (3H, m), 3,72 (3H, m), MS (FAB) m/z 1094 ([M+Na]+), 1022 ([M-(OCH₃ + H₂O)]⁺),

b) 40-O-(2-hydroksy)etyio-rapamycyaa

Do mieszanego, ochłodzonego (0°C) roztworu 4,5 g (4,2 mmola) 40-O-[2-(t-butylodimetyiosilil)oksy]etyio-rapamycyay w 20 ml metanolu dodano 2 ml 1 n HO . Roztwór ten miezzano przez 2 godziny i zobojętniono wodnym wodorowęglanem sodu. Mieszaninę wyekstrahowano trzema porcjami octanu etylu. Roztwór organiczny przemyto wodnym wodorowęglanem sodu i solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Oczyszczenie na kolumnie zhromatograiicaatj na żelu krzemionkowym (octan etylu) dało tytułowy związek w postaci białego ciała stałego: ‘HNMRCDO,^ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H,s),3,13 (5H, s i m), 3,52-3,91 (8H, m); MS (FAB) m/z 980 ([M+Na]+), 926 ([M-OCH₃]+), 908 ([M-(OCH3 + H2O)]⁺), 890 ([M-(OCH3 + 2H2O)]⁺), 876 ([M-(2CH3OH + OH)]+), 858 ([M-(OCH₃ + CH3OH + 2H₂O)]⁺).

MBA (względne IC50) 2,12

IL-6 dep^ml. (względne IC50) 2,8

MLR (względne IC₅0) 3,4

Przykład IX. 40-O-(3-hydroksy)-propylz-rapamycyna

a) 40-O-[3-(t-butylodimttyiosilil)oksy]przpyiz-rapamycyaa

Takie samo postępowanie jak opisane w przykładzie VIII, etap a) przy użyciu trrAanianu

3-(t-butylzdimetylosilil)oksyprop-1-ylu dało 40-O-['3-(t-butylodimetylosilii)zksy]przpyiz-rapamycynę: *HNMR (CDCl₃)60,0 5 (6H,s),0,7211H,dd),0,00(9H,s),1,0 5 (3Έ^,£^)₉,744(31,^,(3),

1,77 (2H, m), 3,03 (1H, m), 3,52-3,73 (7H, m); MS (FAB) m/z 1108 ([M+Na]⁺), 1036 [M-(OCH₃+ HO)])),

b) 40-O-(3 -hydroksy)propylo-rapamyzyaa

Traktowanie związku otrzymanego w etapie a) w warunkach opisanych w przykładzie VIII etapb) dało związek tytułowy: ^IHNMR(CDO3)ó0,72(1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 1,80

17(5 174 (2H, m), 3,05 (1H, m), 3,55-3,91 (8H, m), MS (FAB) m/z 994 ([M+Na]+), 940 ((M-OCH₃)]+), 922 ([M-OCH3 + H₂O)]⁺), 904 ([M-(OCH3 + 2H2O)]⁺), 872 ([M-(OCH3 + CH₃OH + 2H₂O)]⁺)

MBA (względne IC₅₀) 1,6

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 2,,7

MLR (względne IC50) 11

Przykład X. 40-O-(6-hydroksy)heksylo-rapamycyna a) 40-O- [6-(t-butylodimetylosilil)oksy]heksylo-rapamycyna Takie samo postępowanie jak opisane w przykładzie VIII etap

a) przy użyciu triflanianu 6-(t-butylodimetylosilil)oksyheks-1-ylu dało 40-O-[6-(t-butylodimetylosilil)oksy]heksylo-rapamycynę: MS (FAB) m/z 1150 ([M+Na]+).

b) 40-O-(6-hydroksy)heksylo-rapamycyna

Traktowanie związku otrzymanego w etapie a) w warunkach opisanych w przykładzie VIII etap b) dało związek tytułowy: ¹HNMR(CDCl3) δ 0,72(1H, dd), 1,38 (2H,m), 1,57 (4H,m), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,02 (1H, m), 3,49-3,72 (8H, m), MS (FAB) m/z 1036 ([M+Na]+), 982 ([M-OCH3)]+), 964 ([M-OCH3 + H2O)]+), 964 ([M-(OCH3 + 2H2O)]⁺), 914 ([M-(OCH3 + CH₃OH +2H₂O)]⁺)

MBA (względne IC50) 0,8

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 8,5

MLR (względne IC₅0) 18

Przykład XI. 40-O-[2-(2-hydroksy)etoksy]etylo-rapamycyna

a) 40-O-[2-(t-butylodimetylosilil)oksyetoksy]etylo-rapamycyna

Takie samo postępowanie jak opisane w przykładzie VIII etap a) przy użyciu triflanianu 2-[(t-butylodimetylosilil)oksyetoksy]etylu dało 40-O-[2-(t-butylodimctylosilil)oksyetoksy]etylo-rapamycynę: Ή NMR(CDCl3)500)0((3l^,s),0,71 (1H,dd),0,8(9H,s), 1,65(3H,s), 1,74(3H, s), 3,07 (1H, m), 3,51-3,79 (7H, m); MS (FAB) m/z 1138 ([M+Na]⁺), 1115 (M+),1097 ([M-H2O]⁺), 1084 ([M-(OCH₃)]+), 1066 ([M-(OCH₃ + H^O)]+), 1048 ([M-(OCH₃ + 2H^O)]+), 1034 ([M-(2CH₃OH + OH)]+), 1016 ([M-(OCH₃ + CH₃OH + H2O)]+),

b) 40-O-[2-(2-hydroksy)etoksy]etylo-rapamycyna

Traktowanie związku otrzymanego w etapie a) w warunkach opisanych w przykładzie VIII etap b) dało związek tytułowy: Ή NMR (CDCl₃) 50,72(1 H, dd), 1,65 (3H,s), 1,74 (3H, s), 3,05 (1H, m), 3,51-3,77 (11H, m), MS (FAB) m/z 1024 ([M+Na]+), 1115 (M+), 983 <[M-H^O)]⁺), 970 <[M-OCH₃)]+), 952 ([M-(OCH₃ + H^O)]+), 934 ([M-(OCH₃ + 2H^O)]+) 920 ([M-(2CH₃OH + OH)]+), 902 ([M-(OCH₃ + CH₃OH + 2H^O)]+).

MBA (względne IC50) 112

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 3,2^

MLR (względne IC50) 2

Przykład XII. 40-O-[(3S)-2,2-dimetylodioksołan-3-ylo]metylo-rapamycyna

Takie samo postępowanie jak opisane w przykładzie VIII etap a) przy użyciu triflanianu acetonidu gliceryny dało związek tytułowy: ^NMRąCDCl^ 0,72 (1H, dd), 1,36(3H, s), 1,42 (3H, s), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,06 (1H, m), 3,55 (2H, m), 3,69 (3H, m), 4,06 (1H, dd), 4,26 (1H, m); MS (FAB) m/z 1050 ([M+Na]+), 996 ([M-OCH₃)]+), 978 ([M-(OCH₃ + H2O)]+), 960 ([M-(OCH₃ + 2H2O)]+).

MBA (względne IC₅0) 0,,9

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 8

MLR (względne IC50) 290

Przykład XIII. 40-O-[(2S)-2,3-dihydroksyprop-1-ylo]-rapamycyna

Traktowanie związku otrzymanego w poprzednim przykładzie w warunkach opisanych w przykładzie III dało związek tytułowy: Ή NMR (CDCl₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,68 (8H, m); MS (FAB) m/z 1010 ([M+Naaf), 956 ([M-OCH₃)]+), 938 ([M-(OCH₃ + H2O)]+), 920 ([M-(OCH₃ + 2^)]+), 888 ([M-(OCH₃ + CH3OH + 2H^O)J^).

176 174

MBA (względne IC50) 0,67

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 9

MLR (względne IC₅0) 10

Przykład XIV. 40-O-(2-acetoksy)etylo-rapamycyna

Do mieszanego, ochłodzonego (0°C) roztworu 53 mg (0,055 mmola) 40-0)-hydroksyetylo-rapamycyny w 2 ml chlorku metylenu dodano 0,2 ml pirydyny a następnie 0,02 ml (0,281 mmola) chlorku acetylu. Mieszaninę mieszano przez 3 godziny i rozcieńczono octanem etylu, po czym przemyto wodnym wodorowęglanem sodu, zimnym 1n HCl i ponownie wodnym wodorowęglanem sodu. Roztwór organiczny osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (30:70 heksan - octan etylu) otrzymując tytułowy związek w postaci białego ciała stałego; 'HNMR (CDCl₃) δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 2,08 (3H, s), 3,07(1H, m), 3,78 (2H, dd), 4,20 (2H, dd); MS (FAB) m/z 1022 ([M+Na]+), 999 (M+), 982 |M-OH]+), 968([M-OCH₃)]⁺), 950 ([M-(OCH3 + H2O)]⁺), 932 ([M-(OCH3 + 2H₂0)]⁺), 918 ([M-(2CH₃OH + OH)]+), 900 ([M-(OCH₃ + CH3OH +2H₂O)]⁺).

MBA (względne IC50) 2

IL-6 dep.prol. (względne IC₅0) 7fi

MLR (względne IC₅₀) 3,6

Przykład XV. 40-O-(2-nikotynoiloksy)etylo-rapamycyna

Stosowano takie samo postępowanie jak opisano w poprzednim przykładzie stosując chlorowodorek chlorku nikotynoilu i otrzymano związek tytułowy: 1H NMR (CDCy δ 0,72 (1H, dd), 1,65 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,07 (1H, m), 3,94 (2H, dd), 4,49 (2H, t), 7,39 (1H, dd), 8,31 (1H, ddd),

8,78 (1H, ddd), 9,24 (1H, dd); MS (FAB) m/z 1085 ([M+Na]+), 1063 ([M+H]+), 4 045 ([M-OH]+), 1031 ([M-OCH₃)]⁺), 1013 [M-(OCH3 + H₂O)]⁺).

MBA (względne IC50) 1,1

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 6,9

MLR (względne IC50) 5

Przykład XVI. 40-O-[2-N-morfolino)acetoksy]etyło-rapamycyna

a) 40-O-(2-bromoacetoksy)etylo-rapamycyna

Postępowano tak samo jak opisano w przykładzie XIV stosując chlorek bromoacetylu i otrzymano 40-O-(2-bromoacetoksy)etylo-rapamycynę: Ή NMR (CDCl,) δ 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,76 (3H, s), 3,03(1H, m), 3,82 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,31 (2H, m); MS (FAB) m/z 1100, 1102 ([M+Na]+), 1077 (M+), 1061 ([M+H20)]+), 1046, 1048 ([M-(OCH3)]⁺), 1028, 1030 ([M-(OCH3 + H2O)]+), 1012 ([M-(OCH₃ + 2H2O)]+), 996 ((M-(2CH₃ + OH)]+), 980 ([M-(OCH3 + CH3OH + H2O)]+).

b) 40-O-[2-(N-morfblino)acetoksy]etylo-rapamycyna

Do mieszanego, oziębionego (-45°C) roztworu 54 mg (0,05 mmola) 40-O-(brbmoacetoksy)etylo-rapamycyny w 0,5 ml DMF dodano roztwór 0,022 ml (0,25 mmola) morfoliny w 0,2 ml DMF i otrzymanąmieszaninę mieszano wtej temperaturze przez 1 godzinę, po czym zadano wodnym wodorowęglanem sodu. Mieszaninę tę wyekstrahowano trzykrotnie octanem etylu. Roztwór organiczny przemyto solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (95:5 octan etylu - metanol) otrzymując tytułowy związek w postaci bezpostaciowego ciała stałego; Ή NMR (CDC^) δ 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,76 (3H,s), 2,60 (3H,m),3,07(1H,m), 3,24 (2H, s), 3,78 (8H, m), 4,27 (2H, t); MS (FAB) m/z 1107 ([[^^H^ajf) 1085 (M+H]⁺), U^^'7 ([M-OH)]+), 1053 ([M-(OCH3]+), 1035 ([M-(OCH₃ + H₂O))⁺).

MBA (względne IC5₀) 1,3

IL-6 dep.prol: (względne IC50) 4

MLR (względne IC5₀)- 3,5

Przy kład XVII. 40-O-(2-N-imidazblilbacetoksy)etylb-rapamycyna

Takie samo postępowanie jak opisane w przykładzie XVI etap b) przy użyciu imidazolu dało związek tytułowy: ¹HNMR(CDCl₃^ 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,78 (3H, s), 3,06 (1H, m),

17() 174

3,80 (2H, m), 4,73 (2H, s), 6,97 (1H, dd), 7,09 (1H, dd), 7,52 (1H, dd); MS (FAB) m/z 1066 ([M+Hf), 1048 ([M-OH)]+), 1034 ([M-(OCH₃]), 1016 ([M-(OCH₃ + HO)]+).

MBA (względne iC₅₀) 1

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 7,6

MLR (względne IC50) 3,4

Przykład XVIII. 40-O-[2-(N-metylo-N'-piperazynylo)acetoksy]etylo-rapamycyna

Takie samo postępowanie jak opisane w przykładzie XVI etap b) przy użyciu N-metylopiperazyny dało związek tytułowy: 1H NMR (CDC^ó 0,72 (1H, dd), 1,67 (3H, s), 1,75 (3H, s),

2,78 (44^, s i m), 3,00 (4H, szeroki s), 3,00 (1H, m), 5,52 (TH, 3X3,80 (2H, dd), 4,22 (2H, t); MS (FAB) m/z 1085 ([M+Na]+), 1098 ([M+H)]+), 106 ([M-(OCH3]+),

MBA (względne IC50) 2,6

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 10,3

MLR (względne IC50) 5

Przykład XIX. 39-O-drsmetylo-39,40-O,O-etylenk-rapamycyna

Do mieszanego, oziębionego (-20°) roztworu 48 mg (0,05 mmola) 40)-0-hydroksyrtylorapamycyny i 0,023 ml (0,20 mmola) 2,6-lutydyny w 0,5 ml chlorkumetylenu dodano 0,008 ml (0,05 mmola) bezwodnika triilowego. Mieszaninę mieszano w tej temperaturze przez 2 godziny, po czym pozostawiono do ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano przez jedną więcej godzinę. Mieszaninę reakcyjną zalano wodnym wodorowęglanem sodu i otrzymaną mieszaninę wyekstrahowano trzema porcjami octanu etylu. Fazę organiczną przemyto solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (30:70 heksan - octan etylu) otrzymując tytułowy związek w postaci białego ciała stałego: Ή NMR (CDCl₃) δ 1,66 (3H, s), 1,75 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,76 (4H, s); MS (FAB) m/z 948 ([M+Na]⁺), 925 (M+), 908 ([M-OH]+), 894 1[M-(OCH3)]⁺), 876 ([M-(OCH3 + HO)]*), 858 ([M-(OCH3 + 2H2O)]⁺), 844 ([M-^CHjOH + OH)l⁺),826 ([M-(OCH3 + CH3OH + 2H2O)]⁺).

mBa (względne IC50) 1,6

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 22,9

MLR (względne IC50) 16

Przykład XX. (26R)-26-hydro-40-O-(2-hydrkksy)rtylo-rapamycyna

a) (26R)-26-hydro-40-O-[2-t-butylodimrtylosililoksy)]-rtylo-rapjmycyna

W 4,5 ml 2:1 acetonitrylu - kwasu octowego rozpuszczono 315 mg (1,2 mmola) związku trtramrtylkamknikwego - triacrtkksyborkwodkrku. Otrzymany roztwór mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i oziębiono do temperatury -35°C, po czym dodano 161 mg (0,15 mmola) 40-00-[2-(t-butylodimetylosilil)oksy]ety’lo-rapamyc.yny. Otrzymaną mieszaninę mieszano w tej samej temperaturze przez noc i reakcję przerwano przez zalanie wodnym wodorowęglanem sodu. Mieszaninę wyekstrahowano trzema porcjami octanu etylu. Roztwór organiczny przemyto wodnym wodorowęglanem sodu, dwoma porcjami 30% wodnej soli Rochelle’a i solanką, osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu, przesączono i zątężonk. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (40:60 heksan,- octan etylu) otrzymując tytułowy związek w postaci białego ciała stałego: *H NMR 1CDCl3) δ 0,66 (6H, s), 0,73 (1H, ddd 0,99 09H, s), 1 ,66 43H, s), 1 ,66 7 3H, sS, 3,02 (1H, m), 3,15 (1H, m), 3,64 (3H, m), 3,71 (2, dd), 3,91 (1H, sS, MS (FAB) m/z 1996 ([M+Na]⁺), 1041 ([M-(OCH3)]⁺), 1024 ([M-(OCH3 + H2O)]+), 1006 ([M-(OCH₃ + 2H₂O)]+), 974 ([[-(OCH, + CH₃OH + 2H₂O)]+).

b) 126R)-26-hydro-40-O-12-hydroksy)rtylk-rapamycyna

Traktowanie związku otrzymanego w etapie a) w warunkach opisanych w przykładzie VII etap b) dało związek tytułowy: ’H NMR^DCl,) δ 0,75 (1H, dd), 1,66 (3H, s), 1,70 (3H, s),,,^ (1H, m), 3,52-3,84 (7H, m); MS (FAB) m/z 982 (PM+Na]+), 928 ([M-(OCH3)]+), 910 ([M-(OCH₃+ H2O)]+), 892 ([[-(OCH, + 2H₂O)]+).

MBA (względne IC50)

IL-6 dep.prol. (względne IC50) MLR (względne IC50)

3,9

176 174

Przykład XXI. 28-O-metylo-rapamycyna

Do mieszanego roztworu 103 mg (0,1 mmola) 40-O-TBS-rapamycyny (otrzymanej przez sililowanie rapamycyny 1 równoważnikiem triflanianu TBS w chlorku metylenu w obecności 2 równoważników 2,6-lutydyny w temperaturze 0°C) w 0,5 ml chlorku metylenu dodano 85,8 mg (0,40 mmola) gąbki protonowej a następnie 44 mg (0,30 mmola) tetrafluoroboranu trimetylooksoniowego. Otrzymaną brązową heterogenicznąmieszaninę mieszano przez noc, zalano wodnym wodorowęglanem sodu i wyekstrahowano octanem etylu. Roztwór organiczny przemyto 1n HCl, wodnym wodorowęglanem sodu i solanką, następnie osuszono nad bezwodnym- siarczanem sodu, przesączono i zatężono. Pozostałość oczyszczono na kolumnie chromatograficznej na żelu krzemionkowym (60:40 heksan - octan etylu) otrzymując 40-O-t-butylodimetylosililo-28-O-metylo-rapamycynę. Związek ten przedestylowano w warunkach opisanych w przykładzie X etap b) otrzymując po PTLC (octan etylu) związek tytułowy w postaci białego ciała stałego: Ή NMR (CDCl₃) δ 0,70 (1H, dd), 1,68 (6H, 2s), 2,95 (1H, m), 3,13 (3H, s), 3,14 (3H, s), 3,28 (3H, s), 3,41 (3H, s); MS (FAB) m/z 950 ([M+Na]+), 927 (M⁺), 909 ([M+^Of), 896 ([M-(OCH3)]⁺), 878 ([M-(OCH3 + H^O)]+), 864 ([M-(OCH₃ + CH₃OH)]+), 846 ([M-(2CH₃OH + OH)]+), 832 ([M-(OCH3 + 2CH₃OH)]+), 814 ([M-(3CH3OH + OH)]+).

MBA (względne IC50) 1,58

IL-6 dep.prol. (względne IC50) 1240

MLR (względne IC50) 1300

Przykład XXII. 40-O-(2-aminoetylo)-rapamycyna

a) 40-O-(2-bromoetylo)-rapamycyna

Roztwór 914 mg rapamycyny w 5 ml toluenu zawierający 0,64 ml 2,6-lutydyny i 1,28 g triflanianu 2-bromoetylu ogrzewano w temperaturze 60°C przez 18 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono następnie do temperatury pokojowej, przelano do 20 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu i wyekstrahowano 3 x 20 ml octanu etylu. Fazy organiczne osuszono nad węglanem sodu i rozpuszczalnik usunięto pod obniżonym ciśnieniem w wyparce obrotowej. Pozostałość chromatografowano na 100 g żelu krzemionkowego eluując heksanem/octanem etylu 3/2 do otrzymania 40-O-(2-bromoetylo)-rapamycyny w postaci bezpostaciowego ciała stałego: MS (FAB) m/z 1044 i 1042 (100%, M+Na); 972 i 970 (55%, M-(MeOH + H2O).

H-NMR(CDCl3) d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz); 3,13 (3H, s), 3,45 (3H, s); 3,9 (H, m); 4,78 (1H, s).

b) 40-O-(2-azydoetylo)-rapamycyna

Roztwór 2,4 g 40-O-(2-bromoetylo)-rapamycyny w 40 ml DMF zadano 0,19 g azydku sodu w temperaturze pokojowej. Po 2 godzinach mieszaninę przelano do 100 ml nasyconego wodorowęglanu sodu i wyekstrahowano 3 x 100 ml octanu etylu. Fazy organiczne połączono, osuszono nad siarczanem sodu i rozpuszczalnik usunięto pod obniżonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono chromatograficznie na żelu krzemionkowym eluując heksanem/octanem etylu i otrzymując 40-O-(2-azydoetylo-rapamycynę: MS (FAB) m/z 1005 (100%, M+Na); 951 (24%, M-MeOH); 933 (57%, M-(MeOH + H2O).

c) 40-O-(2-aminoetylo)-rapamycyna

Do roztworu 230 mg 40-O-(azydoetylo)-rapamycyny w 3 ml THF/wody 5/1 w temperaturze pokoj owej dodano 307 g trifenylofbsfiny. Mieszanina reakcyjna zżółkła. Po 7 godzinach mieszaninę załadowano na x g żelu krzemionkowego i chromatografowano octanem etylu/ metanolem/ kwasem octowym 50/50/0,5 otrzymując tytułowy produkt w postaci jego octanu: MS (FAB) m/z 979 (45%, M+Na); 957 (100%, MH); 925 (63%, M-MeOH); 907 (25%, M-(MeOH + H2O).

MBA (względne IC₅0) 0,7

IL-6 dep.prol. (IC₅₀ względne) 10

Przykład XXIII. 40-O-(2-acetaminoetylb)-rapamycyna

Do roztworu 101 mg octanu 40-0/)-(2-aminoetylo))-rapamycyny· w 2 ml THF dodano 0,02 ml pirydyny i 0,07 ml chlorku acetylu. Mieszaninę reakcyjną utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 18 godzin, a następnie przelano do 7 ml nasyconego wodorowęglanu sodu. Fazę wodnąwyekstrahowano 3 x 5 ml octanu etylu, fazy organiczne połączono i osuszono nad siarczaY7 174 nem sodu. Rozpuszczalnik odparowano i pozostałość chromatografowano na 10 g żelu krzemionkowego eluując najpierw octanem etylu a następnie octanem etylu/metanolem/kwasem octowym 50/50/0,5 i otrzymano produkt tytułowy: Ms (FAB) m/z 1021 (20%, M+Na); 967 (28%, M-MeOH); 949 (100%, M-MeOH + HO). HNMR (CDCl₃)d: 0,71 (1H, q, J=12 Hz), 1,98 (3H, s), 3,13 (3H, s), 3,34 (3H, s), 3,44 (3H, s), 4,75 (1H, s),

MBA (względne IC50) 111

IL-6 dep.prol. (IC₅₀ względne) 2,3

Przykład XXIV. 40-O-(2-nikotynoamidoetylo)-rapamycyna

101 mg octanu 40-O-(2-aminoetylo)-rapamyoyny rozpuszczono w 5 ml octanu etylu i wyekstrahowano 2 x nasyconym wodorowęglanem sodu. Fazę organiczną osuszono nad siarczanem sodu i rozpuszczalnik odparowano. Pozostałość rozpuszczono w 2 ml THF i zadano 22 mg DCC i 15 mg kwasu nikotynowego. Po 15 godzinach w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną odparowano i pozostałość chromatografowano na żelu krzemionkowym eluując octanem etylu, a następnie octanem etylu/metanolem 9/1 i otrzymano produkt tytułowy: MS (FAB) m/z 1084 (80%, M+Na); 1064 (40%, MH); 1038 (100%, M-MeOH); 1012 (50%, M-(MeOH + H2O);

H-NMR(CDCl₃)d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz), 3,13 (3H, s), 3,33 (3H, s), 3,37 (3H, s), 7,39 (1H, dd, J=6 Hz, J=8 Hz), 8,19 (1H, d, J=8 Hz); 8,75 (1H, d, J=6 Hz), 9,04 (1H, szeroki s)

MBA (względne IC^j) 1

IL-6 dep.prol. (IC₅₀ względne) 2,8

Przykład XXV. 40-O-(2-(N-metyloimidazo-2'-ilokarboksy-amido)etylo-rapamyoyna Do roztworu 30 mg kwasu N-metyloimidazo-2-karboksylowego w 1 ml DMF dodano mg DCC 1,3-dicykloheksylokarbodiimid i 58 mg HOBT 1-hydroksybenzotriazol. Po 2 godzianch dodano 150 mg 40-O-(2-aminoetylo)-rapamyoyny i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godzin w temperaturze pokojowej. Zawiesinę przesączono, przesącz rozcieńczono 5 ml octanu etylu i przemyto 2 x 2 ml nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu. Fazę organiczną osuszono nad siarczanem sodu i rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość chromatografowano na 10 żelu krzemionkowego eluując heksanem/octanem etylu 14, a następnie octanem etylu i otrzymano produkt tytułowy:

MS (FAB) m/z 1087 (36%, M+Na); 1065 (57%, MH); 1033 (100%, M-MeOH); 1015 (46%, M-(MeOH + HO)).

H-NMR (CDCl₃) d: 0,72 (1H, q, J=12 Hz), 3,13 (3H, s), 3,33 (3H, s), 3,46 (3H, s), 4,03 (3H, s), 6,93 (1H, szeroki s), 6,98 (1H, szeroki ś), 7,78 (1H, M)

MBA (IC₅₀ względne) 11

IL-6 dep.prol. (IC₅₀ względne) 7

Przykład XXVI. 40-O-(2-etoksykarbonyloaminoety!o)-rapamyoyna

Roztwór 200 mg (40-O-(2-azydoetylo)-rapamycyny w 3 ml THF/wody 5/1 zadano 267 mg trifenylofosfmy na 7 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie dodano 0,4 ml pirydyny, po czym 194 (l ohloromrówczanu etylu. Po 2 godzianch, mieszaninę reakcyjną przemyto kolejno 10 ml nasyconego wodorowęglanu sodu, 5 ml wody i 5 ml 10% kwasu cytrynowego. Fazę organiczną osuszono nad siarczanem sodu i odparowano rozpuszczalnik. Pozostałość chromatografowano na 20 g żelu krzemionkowego, eluując octanem etylu a następnie octanem etylu/metanolem 9/1 i otrzymano produkt tytułowy: MS (FAB) m/z 1051 (35%, M+Na); 997 (30%, M-Me); 979 (100%, M-(MeOH + H^O)

H-NMR (CDCl₃) d: 0,7! (1H, q, J-12 Hz), 1,24 (3H, t, J=8 Hz); 3,13 (3H, s), 3,34 (3H, s), 3,43 (3H, s), 4,10 (2H, q, J=8 Hz), 5,48 (1H, m)

MBA (IC50 względne) 11,

IL-6 dep.prol. (IC₅0 względne) 117

Przykład XXVII. 40-O-(2-tolilosulfonamidoety!o)-rapamyoyna

Roztwór 200 mg 40-O-(2-aminoety!o)-rapamycyny w 3 ml THF zadano 0,4 ml pirydyny i

390 mg chlorku tosylu i mieszaninę reakcyjnąmieszano przez 12 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór przelano do 5 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu i fazę wodnąwyekstrahowano 2 x 5 ml octanu etylu. Połączone fazy organiczne przemyto 5 ml 10% kwasu

17(5174 cytrynowego i 5 ml wody. Po wysuszeniu nad siarczanem sodu rozpuszczalnik odparowano i pozostałość chromatografowano na 20 g żelu krzemionkowego eluując heksanem/ octanem etylu 1/1 i otrzymano produkt tytułowy w postaci białej piany:'MS (FAB) m/z 1133 (100%, M+Na), 1078 (25%, M-MeOH); 1061 (85%, M-(MeOH + H2O)).

H-NMR (CDCl₃) d: 0,68 (1H, q, J=12 Hz), 2,43 (3H, s); 3,13 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,41 (3H, s), 4,76 (1H, s); 5,85 (1H, t, J=6 Hz), 7,30 (2H, d, J=8 Hz); 7,75 (2H, d, J=8 Hz);

MBA (IC₅₀ względne) 15,9

IL-6 dep.prol. (IC₅₀ względne) 14

Przykład XXVIII. 40-O-[2-(4', 5'-dikarboetoksy-1', 2', 3'- triazol- 1'-ilo)etylo-rapamycyna mg 40-O-(2-azyaoetylb)-rapamycyny i 32 mg dikarboksylanu dietyloacetylenu zawieszono w 0,5 ml toluenu i ogrzewano w temperaturze 65°C przez 5 godzin. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono następnie do temperatury pokojowej, załadowano na 10 g żelu krzemionkowego i eluowano heksanem/octanem etylu 1/1 otrzymując produkt tytułowy: MS (FAB) m/z 1175 (20%, M+Na); 1121 (15%, M-MeOH); 1103 (60%, M-(MeOH + H2O)).

H-NMR (CDO3) d: 0,62 (1H, q, J=12 Hz), 1,40 (3H, t, J= 8Hz), 1,42 (3H, t, J = 8 Hz), 3,13 (3H, s), 3,25 (3H, s), 3,33 (3H, s)

MBA (IC₅₀ względne) 2,7

IL-6 dep.prol. (IC₅₀ względne) 12

Pochodne O-alkilowe takich związków jak 9-dezoksorapamycyna, 26-hyarorapamycyna lub 9-dezokso-26-hydrorapamycyna, można wytworzyć przez alkilowanie odpowiednich związków wyj ściowych, otrzymanych w wyniku odtlenienia pozycj i 9 rapamycyny -i/lub uwodornienia pozycji 26. Alternatywnie, i korzystnie, jak opisano np. w przykładzie XX, można alkilowe pochodne rapamycyny odtlenić (dla otrzymania pochodnych 9-aezoksbrapamycyny) lub uwodornić (dla otrzymania 26-hyarbrapamycyny), stosując, gdzie jest to konieczne, odpowiednie grupy ochronne.

Przykłady XXIX oraz XXX ilustrują nowe sposoby odtlenienia grupy keto w pozycji C9 lub wodorowania grupy keto w pozycji C26, dla wytworzenia związków pośrednich, z których przez alkilowanie zilustrowane w wyżej podanych przykładach, są otrzymywane związki o wzorze 2.

Przykład XXIX. Usuwanie grupy keto przy C9

Strumień siarkowodoru przepuszczano w temperaturze pokojowej przez mieszany roztwór 3,2 g (3,5 mmola) rapamycyny w. 50 ml pirydyny i 2,5 ml DMF. Roztwór z bezbarwnego stał się żółty. Po dwóch godzinach zatrzymano wprowadzanie siarkowodoru i mieszanie kontynuowano przez 5 dni, podczas których roztwór przeszedł stopniowo w kolor pomarańczowy. Analizy TLC i HPLC potwierdziły całkowite zużycia materiału wyjściowego i obecność pojedynczego nowego związku. Roztwór przepłukiwano azotem przezjedną godzinę i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozprowadzono w octanie etylu, przemyto zimnym 1n roztworem HCl (3x), nasyconym roztworem wodorowęglanu i nasyconą solanką. Warstwę organiczną osuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i przesączono oraz zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość rozprowadzono w eterze i wytraconą siarkę odsączono. Zatężenie roztworu eterowego i następna chromatografia kolumnowa na żelu krzemionkowym (10:4:1 C^C^/i-PtyO/MeOH) dały O-dezoksorapamycynę w postaci bezbarwnej piany. Identyczność produktu została potwierdzona za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), spektroskopii masowej (MS) i/lub spektroskopii w podczerwieni (IR). Stwierdzono, że 9-dezoksorapamycyna wykazuje następujące dane charakterystyczne: *H NmR (CDO3) δ 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C-17-CH3), 1-76 (3H, d, J=1,2 Hz, C-29-CH3), 2,42 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 2,74 (1H, d, J=14,5 Hz, H-9), 3,13 (3H, s, C16-OCH3), 3,5 (3H, s, C27-OCH3), 3,40 (3H, s, C39-OCH3), 5,40 (1H, d, J=9 Hz, H-30), 5,57 (1H, dd, J1=8,6 Hz, J2=15 Hz, H-22), 5,96 (1H, d, J=9 Hz, H-18), 6,09 (1H, d, J=1,7 Hz, 10-OH), 6,15 (1H, dd, Jj=10 Hz, J2=15 Hz, H-21), 6,37 (1H, dd, J,=1,5 Hz, J2=5 Hz, H-19), 6,38 (1H, d, J=9,5 Hz, H-20), 1³C NMR (CDCl·,) δ 38,5 (C-9), 98 (C-10), 170,7 (C-1), 173,0 (C-8), 208,8 (C-32), 216,9 (C-26).

176 174

MS (FAB) m/z 92' ([M+Na]+), 899 (M+), 881 ([M-H^f), 868 ([M-OCH3]+), 850 ([M-HO + OCH3)]+).

IR (większe piki) (cm’¹) 987, 1086, 1193, 1453, 1616, 1717, 1739, 3443.

MBA (IC50 względne) 1

MLR (IC5 0 względne) 11

IL-6 dep.prol. (IC50 względne) 9

Przykład XXX. Hydrogsaazja grupy keto przy C26

Do mieszanego roztworu 421 mg (1,6 mmola) triacetoksyborowodorku tetrametyloamoniowego w 2 ml acstoaitrnlu dodano 2 ml kwasu octowego. Otrzymaną mieszaninę mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej i ochłodzono do temperatury -35°C. W tej temperaturze dodano roztwór 180 mg (0,2 mmola) 9-dezoksp-rapamyzyay w 1 ml azetonitrylu i uzyskaną mieszaninę odstawiono do mieszania na '4 godziny. Mieszaninę zalano nasyconym roztworem winianu sodowo potasowego i pozwolono na ogrzanie się do temperatury pokoj owej. Mieszanie kontynuowano do czasu, aż obie warstwy stały się klarowne i dodano octanu etylu. Warstwy rozdzielono i warstwę wodną wyekstrahowano dwukrotnie octanem etylu. Otrzymany roztwór organiczny przemyto jeden raz 10% roztworem wodorowęglanu sodu i dwa razy nasyconą solanką, po czym osuszono nad bezbarwnym siarczanem sodu, przesączono i zatężono pod obniżonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszczono na kolumnie zhromatografizzaej na żelu krzemionkowym (90:10 AzOEZ-heksan). Ponieważ materiałem wyjściowym w tym przypadku była 9-dszoksprapamycyna, związkiem finalnym jest 9-derpkso-'6-hydro-rapamyzyaa wytworzona w postaci bezbarwnej piany, o następujących danych spektroskopowych: 11 NMR (CDG3) (główny izomer) δ 9 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH3), 0,93 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH3), 1,00 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH3), 1,07 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH3), 1,17 (3H, d, J=6,9 Hz, CHCH3), 1,61 (3H, d, J=1 Hz, C17-CH3), 1,73 (3H, d, J=1,2 Hz, C29-CH3), 2,43 (1H, dd, J=4,1 i 16,0 Hz, H-33), ',46 (1H, d, J=13,8 Hz, H-9), 2,58 (1H, m, H-25), ',77 (1H, d, J=13,8 Hz, H-9), ',82 (1H, dd, J=8,3 i 16,0 Hz, H-33), 3,17 (1H, dd, J=4,1 i 9,2 Hz, H-'7), 3,61 (2H, m, H-14 i H28), 5,19 (1H, ddd, J=4,1,4,6 i 8,3 Hz, H-34), 5,49 (1H, szeroki d, J=5,0 Hz, H-'), 5,56 (1H, d, J=9,1 Hz, H-30), 5,75 (1H, dd, J=6,9 i 14,7 Hz, H-22), 5,76 (1H, s, 10-OH), 5,99 (1H, szeroki, d, J=9,2 Hz, H-10), 6,10 (1H, m, H-21), 6,36 (2H, m, H-19 i H-'0);

MS (FAB) m/z 924 ([M+Na]+), 850 ([M-H'O + OCH₃)]⁺).

MBA (IC5₀ względne) 147

MLR (IC50 względne) 134

IL-6 dep^rol. (IC50 względne) 718

26-hydrorapamycynę sporządza się w ten sam sposób stosując rapamycynę w miejsce 9-dszoksprapamycyay. Produkt ten ma następujące dane spektroskopowe: ¹³C-NM.R (CDCy (izomer główny) d= '08,3 (C-3'), 194,0 (C-9), 166,6 (C-8), 140,9 (C-''), 136,2 (C-17), 133,5 (C-'0), 129,1 (C-21), 128,7 (C-18), 126,1 (C-30), 125,3 (C-19), 98,6 (C-10), 84,4 (C-39), 83,9 (C-16), 81,6 (C-27), 75,4 (C-34), 74,3 (C-'8), 73,9 (C-40), 7',9 (C-26), 67,4 (C-14), 59,1 (27-OCH3), 56,6 (39-OCH3), 55,9 (16-OCH3), 51,3 (C-'), 46,8 (C-31), 44,3 (C-6), 40,4 (C-33),

40,4 (C-25), 39,5 (C-'4), 38,8 (C-15), 38,0 (C-36), 34,3 (C-'3), 34,2 (C-38), 33,5 (C-11), 33,3 (C-37), 33,' (C-35), 31,5 (C-42), 31,3 (C-41), 30,9 (C-13), 27,0 (C-3), '5,2 (C-5), '1,4 (23-CH3), 20,7 (C-4), 17,3 (11-CH3), 16,1 (31-CH3), 15,9 (35-£H₃), 14,4 (25-CH₃), 14,2 ('9-CH3), 10,3 (17-CH3).

MS (FAB) m/z: 884 (M-OCH3, 35%), 866 (M^OCH+HJ, 100%; 848 (M4OCH3 + 'H2O], 40%).

MBA (IC5₀ względne) 1,7

MLR (IC50 względne) 1

IL-6 dep^rol. (IC50 względne) 7,5

176 174

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. O-alkilowane pochodne rapamycyny o wzorze 2, w których

X oznacza (H, H) lub O;

Y oznacza (h, OH) lub O;

R¹ oznacza H, alkil, aryloalkil, hydroksyalkil, dihydroksyalkil, hydroksyalkiloaryloalkil, di-hydroksyalkiloaryloalkil, acyloksyalkil, aminoalkil, alkiloaminoalkil, alkoksykarbonyloaminoalkil, acyloaminoalkil, arylosulfonamidoalkil, allil, dihydroksyalkiloallil, dioksolanyloallil i hydroksyalkoksyalkil, przy czym w powyższych grupach “alk” lub “alkil” oznaczajągrupy C ^'alkilowe proste lub rozgałęzione;

R² oznacza H lub Ci-alkil; zaś

R⁴ oznacza metyl lub R⁴ i Ri razem oznac:zy;ąC2.₆alkilen; pod warunkiem, że Ri i R2 nie oznaczająjednocześnie H.
2. Pochodne według zastrz. 1 dobrane spośród następujących:,

40-O-benzylo-rapamycyna;

40-O-(4'-hydroksym.etylo)bcnzylo-rapamycyna;

40-O-[4'-( 1,2-dihydroksyetylo)]benzylo-rapamycyna;

40-O-allilo-rapamycyna;

40-O-[3'-(2,2-dimetyló-1,3-dioksolan-4(S)-ylo)-prop-2'-en-r-ylo]-rapamycyna;

(2'E,4'S)-40-O-(4',5'-dihydroksypent-2'-en-r-ylo)-rapamycyna;

40-O-(2-hydroksy)etoksykjrbonylometylo-rapamycyna;

40-O-(3-hydroksy)propylo-rapamycyna;

40-O-(6-hydroksy)heksylo-rapamycyna;

40-O-[2-(2-hydroksy)etoksy]etylo-rapamycyna;

40-O-[(3S)-2,2-dimetylodioksoljn-3-ylo]metylo-rapamycyna;

40-O-[(2S)-2,3-dihydroksyprop-1-ylo]-rapamycyna;

40-O-(2-acetoksy)etylo-rapamycyna;

40-O-(2-nikotynoiloksy)etylo-rapjmycyna;

40-O-[2-(N-morfolino)acetoksy]etylo-rapamycyna;

40-O-(2-N-imidjzoliloacetoksy)etylo-rapamycyna;

40-O-[2-(N-metylo-N'piperazynylo)acetoksy]etylo-rapamycyna;
3 9-O-desmetylo-39-40-O,O-etyleno-rapamycyna;

(26R)-26-hydro-40-O-(2-hydroksy)etylo-rapamycy'na;

28-O-metylo-rapamycyna;

40-O-(2-aminoetylo)-rapamycyna;

40-O-(2-acetaminoetylo)-rapjmycyna;

40-O-(2-nikotynojmidoetylo)-rapjmycyna;

40-O-(2-(N-metyloimidazo-2'-ilokarboksyamido)etylo)-rapamycyna;

40-O-(2-etoksykarbonyloaminoetylo)-rapjmycyna;

40-O-(2-tolilosulfonamidoetylo)-rapamycyna;

40-O-[2-(4',5'-dikarboetoksy-i,2',3'-triazol-1'-ilo)etylo]-rapamycyna;

3. Pochodna według zastrz. 1, w której oba X i Y oznaczają O, R2 oznacza H, R4 oznacza metyl, a Ri ma znaczenie podane wyżej oprócz H.
4. Pochodna według zastrz. 1, którąjest 40-O-(2-hydroksy)etylo-rapamycyna;

* * *

176 174