PL177324B1

PL177324B1 - Sposób wytwarzania wzbogaconego w izomer (S)kwasu (S)-2-(3-benzoilofenylo) propionowego z mieszaniny enancjomerów

Info

Publication number: PL177324B1
Application number: PL94310434A
Authority: PL
Inventors: Julie B.H. Warneck; Richard A. Wisdom
Original assignee: Menarini Lab
Priority date: 1993-03-03
Filing date: 1994-03-03
Publication date: 1999-10-29
Also published as: GR3024853T3; WO1994020633A1; HU218409B; GR960300037T1; DK0693134T3; AU6208194A; SK104395A3; HUT73381A; DE69403960D1; FI954079A0; FI104327B1; ES2087046T1; DE69403960T2; CA2157369A1; SK280049B6; EP0693134A1; EP0693134B1; RU2129615C1; FI104327B; GB9304256D0

Abstract

1. Sposób wytwarzania wzbogaconego w izomer (S) kwasu (S)-2-(3-benzoilofeny- lo)propionowego z mieszaniny enancjomerów estru alkilowego kwasu 2-(3-benzoilofeny- lo)propionowego przy uzyciu biokatalizatora selektywnie hydrolizujacego enancjomer (S) znamienny tym, ze jako biokatalizator stosuje sie drobnoustrój z grupy Ophiostoma lub Ce- ratocystis lub material posiadajacy pochodzaca z niego aktywnosc. P L 177324 B 1 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wzbogaconego w izomer (S) kwasu (S)-2-(3-benzoilofenylo)propionowego (Ketoprofenu) z mieszaniny enancjomerów.

Szereg kwasów 2-arylopropionowych znanych jest jako czynniki przeciwzapalne. Przykładami są ibuprofen, naproksen i ketoprofen. Związki te mają budowę chiralną i dobrze wiadomo, że główna aktywność terapeutyczna pochodzi od enancjomeru (S).

Znanychjest kilka metod otrzymywania (S) - enancjomeru wolnego od domieszki (R)-enancjomerem. Metodami takimi sąasymetryczna synteza chemiczna oraz rozdział chemicznyjak np. stechiometryczna krystalizacja diastereoizomerycznych soli utworzonych z różnymi chiralnymi aminami.

W innym biokatalitycznym podejściu wykorzystuje się biokatalizator, który selektywnie hydrolizuje ester kwasu 2-arylopropionowego. Stosując biokatalizator z właściwą, dającą się zidentyfikować, stereospecyficznościąmożna otrzymać mieszaninę reakcyjnązawierającąnieprzereagowany esterjednego enancjomeru oraz produkt hydrolizy - kwas drugiego enancjomeru. Oddzielenie i odzyskanie produktu jest względnie łatwe. Nieprzereagowany ester można racemizować i ponownie użyć do dalszej reakcji zapewniając w ten sposób prawie całkowite przeprowadzenie racemicznego substratu w żądany pojedyńczy enancjomer produktu.

W opisie patentowym EP-A-0227078 opisano zastosowanie do takich biokatalitycznych rozdziałów kilku pozakomórkowych, handlowo dostępnych bakteryjnych lipaz. Ogólnie biorąc ilość enzymu niezbędna do przeprowadzenia reakcji byłajednak bardzo duża i reakcja trwała 2-6 dni. Zastosowanie takich reakcji byłoby bardzo kosztowne. Najlepszym zidentyfikowanym proszkiem enzymatycznym był preparat z Candida cylindracea (znany również jako Candida rugosa); aczkolwiek w patencie EP-A-0407033 pokazano, że preparat ten oprócz tego, że ma niską aktywność, zawiera więcej niż jeden enzym z aktywnością esterazy. Co więcej, okazało się, że aby otrzymać ketoprofen z wysoką wartością ee nadmiaru enancjomerycznego konieczne jest oczyszczanie tego preparatu.

177 324

W opisie patentowym EP-A-0233656 opisano wyizolowanie i klonowanie genu esterazy z Bacillus thai. Pokazano, że enzym ten hydrolizuje selektywnie estry metylowe i etylowe naproksenu i ibuprofenu do odpowiednich (S)-kwasów Pokazano również, że klonowanie enzymu prowadzi w rezultacie do produktu z wyższą wartością ee wzbogacenia enancjomerycznego co jest spowodowane zminimalizowaniem innych ubocznych aktywności enzymu.

W opisie patentowym WO-A-9323547 opisano szereg szczepów bakteryjnych, które również produkują esterazę selektywnie hydrolizującąestry naproksenu. Najlepszym szczepem okazał się Zopfiella latipes, z którego klonowano esterazę.

Opis patentowy WO-A-9304189 opisuje organizm Trichosporon sp, który potrafi selektywnie hydrolizować (S)-enancjomer estru etylowego ketoprofenu dając jako produkt (S)-kwas o wysokiej wartości nadmiaru enancjomerycznego ee >90%. Enzym przeprowadzający tę biotransformację jest pochodzenia wewnątrzkomórkowego. Tak jak trudno jest otrzymać wolne od komórek preparaty, trudnojest też zwiększyć aktywności biokatalityczne przez klonowanie genu lub klasyczną mutagenezę.

Przedmiotem nie wchodzącym w zakres niniejszego wynalazku, jest otrzymanie biokatalizatora z dobrą aktywnością hydrolizowania różnych estrów ketoprofenu, prowadzącą do uzyskania ketoprofenu kwasu z dobrą wartością, ee, i który nadawałby się do klonowania i hiperekspresji np. w E. coli co zredukowałoby koszty biokatalizatora do minimum.

Przebadanie dużej ilości mikroorganizmów z różnych źródeł pokazało niespodziewanie, że ascomycete Ophiostoma novo-ulmi (znany również jako Ceratocystis ulmi) wytwarza wewnątrzkomórkowy enzym hydrolityczny, który może przeprowadzać żądaną reakcję. Dalsze testy pokazały, że przeciwnie do szczepu ujawnionego w WO-A-9304189, tutaj można uzyskać trwałą aktywność w materiale nie zawierającąkomórek i dlatego całość nadaje się do klonowania i potencjalnego zastosowania w nie zawierających komórek biotransformacjach. Ophiostoma novo-ulmi jest patogenem roślinnym znanymjako czynnik wywołujący ostrą chorobę wiązu holenderskiego (Dutch Elm). Jest on ściśle spokrewniony z mniej zjadliwymi szczepami Ophiostoma ulmi i również z O. piceae.

Kontynuując badania, po tym pierwszym podkreślającym niniejszy wynalazek odkryciu, stwierdzono, że aktywność typu esterazy występuje w innych szczepach Ophiostoma novo-ulmi, w Ophiostoma ulmi (zwanym czasami również jako Ceratocystis ulmi) i Ophiostoma piceae (zwanym czasami jako Caratocystis piceae) i z materiałów zbieranych w różnych miejscach w USA, Europie i na Środkowym Wschodzie oraz Uzbekistanie. Ponadto otrzymano z IMI, Egham, Surrey, UK inne szczepy Ceratocystis sp. i przebadanoje na aktywność. Odkryto, że aktywność tę posiadają również szczepy C. coronata (np. IMI 176533), C. ips (np. IMI 212114), C. tetropii (np. iMI 212117), C. cainii (np. IMI 176523), C. arborea (np. IMI 176529) i C. stenoceras (np. IMI 268494). Wynika więc, że aktywność ta jest szeroko rozpowszechniona w całym przedziale różnych szczepów Ceratocystis zebranych w różnych miejscach na świecie.

Przebadany, pochodzący z oryginalnego materiału, szczep opisany tutaj jako AJ3, złożony był w IMI 15 lutego 1993 roku, z numerem dostępu (accession number) IMI 356050 zgodnie z umową z Budapesztu (Budapest Treaty). Szczep ten jest dobrym przykładem aktywności; niemniej jednak znając szerokie rozpowszechnienie tej aktywności w rozmaitych pokrewnych szczepach należy zaznaczyć, że zakres niniejszego wynalazku nie ogranicza się do tego jednego szczególnego organizmu. Wynalazek rozciąga się również na sposoby z użyciem aktywności enzymatycznej izolowanej z tych organizmów każdą odpowiednią techniką.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem mikroorganizmy z klasy Ophiostoma i ich aktywność enzymatyczna mogą być użyte do stereoselektywnej hydrolizy racemicznych estrów alkilowych ketoprofenu prowadzącej do otrzymania kwasu istotnie wzbogaconego w (S)-enancjomer, np. uzyskania 93-96% lub wyższego nadmiaru enancjomerycznego, i pozostawienie nieprzereagowanego estru wzbogaconego w (R)-enancjomer. Reakcję można przeprowadzać z dowolną mieszaniną enancjomerów chociaż zazwyczaj prowadzi się ją z racematem. Korzystne jest jeśli grupa alkilowa estru zawiera od 1do 3 atomów węgla. Reakcję prowadzi się przy pH 8-11, bar4

177 324 dziej korzystnie przy pH 9.5-10.5, anajlepiej przy pH około 10. Jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się zazwyczaj cykloheksan.

Aby oddzielić produkt będący kwasem od estru można stosować standardowe procedury chemiczne. Jeśli jest to konieczne można poprawić czystość optycznąproduktu stosując chiralną aminę jak np. (R)-α-metylobenzyloaminę. Ester, który pozostaje nieprzereagowany, można zracemizować i użyć powtórnie.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

Przykład 1. Biotransformacja estru etylowego Ketoprofenu przy użyciu AJ3

Wzrost organizmu przeprowadzono na następującej pożywce:

(NH₄)₂SO4(g/l) 0.5

MgSO₄ -7H₂O (g/1) 0.25

CaCl₂ -5H₂O )g/1) 0.1

KH₂PO4 (g/1) 8.0

Ekstrakt drożdży (g/l) 10.0

Glukoza (g/l) 5.5

Roztwór z pierwiastkami śladowymi (pl/1) 100 pH (z NaOH) 6.5

Roztwór z pierwiastkami śladowymi:

CaCl2-5H₂O (g/1) 3.57

ZnO (g/1) 2.5

CuCl₂-5H₂O (g/1) 0.55

Na2MoO4 -2H₂O (g/1) 4.8

MnCl4 •4H₂O(g/0 2.0

FeCl₃ -5H₂O(g/1) 5.4

H₃B04(g/1) 03

CoCl4-5H2O (g/1) '2A

HCl (ml/1) 255^0

Komórki AJ3 wyhodowano na płytce agarowej zawierającej ekstrakt maltozy i zaszczepiono na 30 ml podłożu wzrostowym w kolbie (ang. baffled fiask) poj. 250 ml. Kolbę wytrząsano przez 30 godzin w 53°C i następnie 5.5 ml przeniesiono do drugiej kolby 550 ml zawierającej 30 ml pożywki. Namnażanie kontynuowano przez 40 godzin w 53°C z wytrząsaniem, po czym do brzeczki dodano racemiczny ester etylowy ketoprofenu do uzyskania stężenia 20 g/l. Proces biotransformacji pozostawiono na 120 godzin; analiza HPLC pokazała, że hydroliza dodanego estru zaszła w 18.2%. Stwierdzono, że enancjomeryczny nadmiar ketoprofenu kwasu wynosił 95% na korzyść (S) - enancjomeru.

Przykład 5. Wpływ rozpuszczalnika organicznego

Surowy roztwór enzymu przygotowano stosując tę samą pożywkę wzrostową jak w przykładzie 1 (bez glukozy) przy pH 5.0. Komórki AJ3 pobrano i przeniesiono (inokulowano) do 100 ml pożywki do 1 litrowej kolby do wytrząsania. Kultura wzrastała podczas wytrząsania w 30°C przez 48 godzin. 10 ml przeniesiono następnie do 90 ml świeżej pożywki do 11 kolby do wytrząsania i wzrost kontynuowano przez dalszych 8 godzin wytrząsając w 30°C. Zawartość kolby inokulowano do laboratoryjnego fermentora o poj. 5.8 l zawierającego 1.5 l pożywki i 5g/1 glukozy oraz 0.5 ml/l środka przeciwpieniącego (antifoam, XF0371, Ivanhoe Chemicals, I11, U SA). F ermentor ten pracował przez 4 8 godzin z mieszaniem i napowietrzaniem tak kontrolowanym aby nasycenie powietrzem było utrzymywane przy wartości DOT>50%, w temperaturze 30°C i przy pH 5.0.

Po zakończeniu fermentacji komórki zebrano przez wirowanie i z osadu po wirowaniu (zbitki) sporządzono 10%o wag./obj. zawiesinę (licząc na ciężar wilgotnych komórek) w buforze powodującym lizę komórek tj. w 0.1 M węglanie sodu w wodnym 5% roztworze Trytonu Χ-100. Lizę prowadzono w temp. 8°C przez noc, z wytrząsaniem po czym roztwór po lizie wykazujący aktywność enzymatyczną oddzielono od pozostałości komórkowych przez wirowanie.

177 324

Racemiczny ester etylowy ketoprofenu rozpuszczono w czterech rozpuszczalnikach organicznych: toluenie, cykloheksanie, metanolu i MTBE (eterze metylowo-t-butylowym) aby uzyskać stężenie 20g/1. 2 ml każdego z tych roztworów dodano do 5 ml próbki roztworu enzymu umieszczonej w szklanej probówce. Kontrolnąbiotransformację w roztworze wodnym przeprowadzono również w szklanej probówce zawierającej 5 ml surowego roztworu enzymu, 400 pl 50% racemicznego estru etylowego ketoprofenu, 0.5% w/v gotowego roztworu Tween 80 i 2.5% w/v roztworu Tritonu Χ-100. Reakcję we wszystkich próbkach prowadzono wytrząsając probówki przez 48 godzin w 25°C. Wyniki analizy dla fazy wodnej dla każdej mieszaniny reakcyjnej zebrano w tabeli 1.

Tabela 1

Hydroliza racemicznego estru etylowego ketoprofenu w biotransformacji 2-fazowej

Rozpuszczalnik	Otrzymany kwas (mg/ml)	Stopień przemiany %
Woda	2.3	6.2
Toluen	0.1	1.3
Cykloheksan	1.1	14.1
Metanol	0.4	4.6
MTBE	0.7	8.3

Zaobserwowano, że biotransformacja przebiega w pewnym stopniu w MTBE jako rozpuszczalniku w obecności cykloheksanu; jest ona silnie hamowana w tych warunkach przez toluen.

Przykład 3. Wpływ grupy alkilowej

Różne estry racemicznego ketoprofenu rozpuszczono w cykloheksanie do stężenia 20 g/1. Były to estry: metylowy, etylowy, n-propylowy, n-butylowy, n-pentylowy, n-heksylowy. W przypadku estru metylowego otrzymano zawiesinę z uwagi na niską rozpuszczalność estru w cykloheksanie.

Do 5 ml próbki roztworu surowego enzymu w szklanej probówce dodano 2 ml każdego z sześciu przygotowanych roztworów racemicznych estrów ketoprofenu. Kontrolną biotransformację w roztworze wodnym przeprowadzono również w szklanej probówce zawierającej 5 ml surowego roztworu enzymu, 200 pl 50% racemicznego estru etylowego ketoprofenu, 0.5% w/v gotowego roztworu Tween 80 i 2,5% w/v roztworu Tritonu Χ-100. Reakcję przeprowadzono wytrząsając przez 24 godziny w temperaturze 25°C. Wyniki analizy metodą HPLC fazy wodnej dla każdej biotransformacji przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Hydroliza racemicznych estrów ketoprofenu w biotransformacji 2-fazowej

Ester ketoprofenu	Powstający kwas (mg/ml)	Stopień przemiany (%)	EE (%) (S) -enancjomer
kontrola-woda	4.6	22.9	90
metylowy	1.7	42.3	90
etylowy	1.1	27.5	100
n-propylowy	1.0	25.6	86
n-butylowy	0.3	8.0	N/D
n-pentylowy	0.18	4.4	N/D
n-heksylowy	0.09	2.3	N/D

N/D nie określono z uwagi na małą ilość powstałego kwasu

177 324

Przykład 4. Przygotowanie roztworu AJ3 po lizie

Wzrost komórek AJ3 i przygotowaniejego roztworu po lizie w skali 5001 przeprowadzono stosując następującą metodologię.

AJ3 inokulowano do 100 ml pożywki (jak w przykładzie 1) do 11 kolby (ang. point baffled fiask). Po namnażaniu przez 48 godzin w 25°C z wytrząsaniem orbitalnym (300 rpm, przesunięcie 25 mm), po czym przeniesiono po 1 ml do trzech 11 kolb (baffled) zawierających po 100 ml pożywki. Kultury wzrastały przez dalszych 48 godzin w podobnych warunkach po czym je połączono i inokulowano do 750 l fermentora zawierającego 500 l pożywki.

Zastosowano następującą pożywkę:

MgSO₄ -7H₂O 0.4 4/1

CaCl₂ -2H₂O 0.1 g/1

KH₂PO4 8.0 gd

Ekstrakt drożdży 30.0 gd

Roztwór ze śladami pierwiastków 200 pl/1 (jak w przykładzie 1)

Środek przeciwpieniący (XFO-371) 0.5 /md pH (z NaOH) 6.0

Pożywkę tę wyjałowiano w 121°C przez 50 minut po czym dodano 15150% w/v sterylnego roztworu glukozy.

Warunkami kontrolnymi były: temperatura 25°C, pH 6.0 uzyskane przez dodawanie kwasu fosforowego lub wodorotlenku sodu, nasycenie powietrzem DOT>50% uzyskane przez mieszanie i napowietrzanie.

Po 64 godzinach wzrostu komórki zabijano in situ i powodowano lizę. Osiągano to obniżając temperaturę do 15°C i dodając wodorotlenek sodu do pH 10. Po 50 minutach pH brzeczki doprowadzono do 7 za pomocą kwasu fosforowego i komórki zbierano przez ciągłe wirowanie. Zebrane komórki rozdzielono do różnych poj emników i przechowywano w temperaturze - 20°C.

Zamrożone komórki rozmrożono i sporządzono z nich 25% wag./obj. zawiesinę (licząc na ciężar wilgotnych komórek) w 50 mM KH₂PO4, pH 6.5. Po 30 minutach mieszania komórki zebrano przez wirowanie, i ponownie zawieszono w 25% wag./obj. (licząc na ciężar wilgotnych komórek) w buforze powodującym lizę tj. 0.3 M Na₂CO₃, pH 10.5. Lizę przeprowadzano mieszając przez noc w temperaturze 4°C, po czym lizat poddano wirowaniu aby oddzielić klarowny roztwór enzymu od pozostałości komórkowych. Roztwór enzymu (supematant po lizie) badano na aktywność w standardowych warunkach biotransformacji tj. biorąc 1 ml roztworu enzymu odpowiednio rozcieńczony 0.1 MNa2CO₃, pH 10.0,40 pl 50% racemicznego estru etylowego ketoprofenu, 0-5% gotowego roztworu Tween 80, 2.5% wag./obj. Triton Χ-100. Biotransformację prowadzono w zatopionej szklanej 20 ml ampułce wytrząsając ją przez 1 godzinę w 25°C. Aktywność wyrażono w U/ml gdzie 1 jednostka (U) oznacza powstanie 1 mg kwasu ketoprofenu w ciągu 1 godziny w 25°C. Roztwory enzymu uznawano za odpowiednio rozcieńczonejeśli badana aktywności mieściła się w przedziale od 1 do 5 U/ml.

Gotowy 50% roztwór racemicznego estru etylowego ketoprofenu przyrządzano w sposób następujący: 25 g racemicznego estru etylowego ketoprofenu i 0.25 g Tween 80 dodawano do 10 ml wody destylowanej i mieszaninę tę poddawano sonifikacji (działaniu ultradźwięków) przez 5 minut (amplituda 15 pm, cykl 10 sekund włączenie/10 sekund przerwa). Objętość uzupełniano wówczas do 50 ml wodą destylowaną, gotowy roztwór wyjaławiano w autoklawie i przechowywano dłuższy czas.

Typowa aktywność lizatu wynosiła 1.5 U/mg.

Przykład 5. Izolowanie i oczyszczanie materiału o aktywności hydrolitycznej

Klarowny roztwór lizatu (przykład 4) poddano ultrafiltracji do wody destylowanej (stosując przyrząd Amicon DC z wyposażeniem „hollow fibre cartridges“ odcinającym substancje o ciężarze cząsteczkowym 30 000) aż do uzyskania przewodnictwa odpowiadającego 20 mM Na₂CO3, Buforowi A o pH 9.2. Roztwór był następnie zatężony 4-5 krotnie i w zwykły sposób otrzymano początkową aktywność >90%. Aktywność enzymatyczną roztworu związano ze

177 324 zrównoważoną uprzednio żywicąjonowymienną amonitem QA52 (Pharmacia); wynosiła ona 7-10 U na ml wilgotnej żywicy QA52. Żel z „załadowaną aktywnością nałożono na kolumnę przy liniowej szybkości przepływu 200 mm/godzinę. Chromatografię przeprowadzono w temperaturze 4°C. Kolumnę wymywano Buforem A aż do uzyskania linii podstawowej. Do elucji zużyto 10 objętości kolumny stosując gradient 0-05 M NaCl w Buforze A. Zebrano frakcje odpowiadające 1/35 objętości gradientu. Profil elucji przedstawia tabela 3.

Tabela 3

Pierwsza chromatografia na kolumnie QA52. Profil elucji.

Frakcja	Całkowita aktywność (U.)	Odzysk (%)
Materiał nałożony	99	-
Przepływ przez kolumnę	0	0
Wymywanie	0	0
1	0	0
5	0.3	0.3
6	2.0	2.0
7	6.6	6.7
8	19.5	19.7
9	22.2	22.4
10	10.0	10.1
11	2.5	2.5
13	1.0	1.0
17	0.3	0.3

Materiał aktywny eluowano roztworem NaCl o stężeniu z przedziału 0.12-0.18 M. Frakcje 7-10 połączono razem otrzymując:

odzysk aktywności w połączonych frakcjach = 63.5% odzysk białka w połączonych frakcjach = 15.8%o.

Połączone frakcje aktywne zatężono metodąultrafiltracji przy użyciu membrany YM30 w mieszanej celi w przyrządzie (AMICON), i dializując do buforu A aż o uzyskania przewodnictwa 3.2-3.6 mS. Taki materiał poddano kolejnej chromatografii na żywicy QA52, a wyniki zebrano w tabeli 4.

Tabela 4

Druga chromatografia na kolumnie QA52. Profil elucji.

Frakcja	Całkowita aktywność (U.)	Odzysk(%)
1	2	3
Materiał nałożony	3111	-
Przepływ przez kolumnę	0	0
Wymywanie	0	0
13	60	1.9

177 324 cd. tabeli 4

1	2	3
14	193	6.2
15	407	13.1
16	828	26.6
17	890	28.6
18	445	14.3
19	152	4.9
20	81	2.6

Podczas drugiej chromatografii aktywne frakcje wymywano roztworem NaCl o stężeniu 0.2-0.25 M NaCl. Frakcje 15-17 połączono razem i próbkę zbadano na aktywność i zawartość białka.

Aktywność = 27.8 U./ml

Całkowita aktywność = 2599 U

Całkowity odzysk aktywności = 83.5%

Białko (metodą biuretową) = 1.34 mg/ml

Białko całkowite - 125 mg

Całkowity odzysk białka = 5.5%

Połączone frakcje dalej oczyszczano metodą chromatografii na kolumnie Pharmacia MONO P HR 5/5 zapakowanej anionitem jonowymiennym HPLC. Warunki były następujące:

bufor o niskiej zawartości soli = 20 mM etanoloamina-HCl pH 9.0;

bufor o wysokiej zawartości soli = 20 mM etanoloamina-HCl + 0.3M NaCl pH 9.0;

Szybkość przepływu = 1 ml/min.

Profil gradientu

Czas	Stężenie NaCl
0-5 min.	0M
5-7 min.	0-01 M
7-20 min.	0.1-0.3M
20-22 min.	0.3 M
22-23 min.	0.3-0 M
23-25 min.	0M

Objętość próbki = 1 ml Objętość frakcji = 1 ml

Połączone frakcje z drugiej chromatografii po kolumnie QA52 zatężono 10-krotnie poprzez ultrafiltrację przez błonę odcinającąmateriał o ciężarze molowym 30 000, a następnie koncentrat odsolono do buforu o niskiej zawartości soli do HPLC wykorzystując kolumnę Pharmacia G-25 PD 10 do filtracj i żelowej. Około 5 mg finalnego białka załadowano na kolumnę HPLC. Uzyskany profil elucji wyglądał następująco (tabela 5).

Tabela 5

Profil elucji z kolumny HPLC jonowymiennej na anionicie MONO P

Frakcja (minuty)	Aktywność (U./ml)	Odzysk (%)
1	2	3
Materiał nałożony	104.0	-
8	5.7	5.5
9	63.8	61.3
10	28.3	27.2

177 324 cd. tabeli 5

1	2	3
11	7.5	7.2
12	1.9	1.8
13	0.0	0.0

Frakcje 9 i 10 połączono uzyskując 88.5% odzysku całkowitej aktywności. Materiał ten poddano dalszemu oczyszczaniu metodąekskluzyjnej (molekularnej) chromatografii HPLC. Do rozdzielania zastosowano kolumnę do ekskluzyjnej (molekularnej) chromatografii HPLC Analgel-TSK G3000 SWXL o rozmiarach 30 cm x 7.8 mm; chromatografię prowadzono w następujących warunkach:

bufor 0.1 M K₂HPO4 + 20 mM Na₂EDTA pH 7.0 szybkość przepływu = 0.4 ml/min. objętość próbki = 200 pl objętość frakcji = 400 pl

Połączone frakcje z HPLC chromatografii jonowymiennej na wypełnieniu MONO P zatężono 1.5-krotnie poprzez ultrafiltrację przez błonę odcinającą materiał o ciężarze molowym 10 000, a następnie zatężoną próbkę odsolono do buforu do chromatografii ekskluzyjnej HPLC wykorzystując kolumnę Pharmacia G-25 PD 10. Otrzymano następujący profil elucji (tabela 6).

Tabela 6

Profil elucji w chromatografii ekskluzyjnej HPLC (size exclusion HPLC)

Frakcja (minuty)	Aktywność (U./ml)	Odzysk (%)
Materiał nałożony	131.0	-
17.5	0.0	0
18.5	0.0	0
19.5	1.5	2.3
20.5	13.3	20.3
21.5	7.5	11.5
22.5	2.6	4.0
23.5	0.8	1.2

Oszacowania ciężaru cząsteczkowego naszego enzymu AJ3 - esterazy racemicznego estru etylowego ketoprofenu dokonano metodą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate Polyacrylamide Gel Elektrophoresis). Wcześniej przygotowany 12%o homogeniczny SDS-PAGE mini żel (firmy BDH) użyto w rozwinięciu wcześniej wybarwionych standardowych białkowych markerów ciężarów cząsteczkowych (BISC). Użytym buforem był: Electrograd Buffer TTS (BDH). Elektroforezę przeprowadzono przy stałym napięciu (200 V) i ograniczonym natężeniu (40 mA na żel) do chwili aż front niebieskiego barwnika przewędrował do końca przez żel. Białka wywoływano wybarwiaczem Coomassi Blue. Pasmo białkowe odpowiadające esterazie zidentyfikowano przez porównanie pasm białek próbek aktywnych i nieaktywnych. Porównanie względnych długości migracji aktywnego białka i białek standardowych wskazuje, że nowe oczyszczone zdenaturowane białko ma ciężar cząsteczkowy nieco wyższy niż 32.500 Da marker.

Przykład 6. Wpływ pH na aktywność hydrolityczną.

Zależność biotransformacji od pH przetestowano na opisanym wyżej połączonym materiale przechowywanym przez 4 miesiąc w -20°C. Próbkę rozmrożono w temperaturze otoczenia i 10-krotnie rozcieńczono wodą destylowanąrozcieńczony roztwór enzymu). Sporządzono 1.1 M

177 324 roztwory buforowe o wymienionych wartościach pH z następujących soli (jeśli to było konieczne pH doprowadzano do odpowiedniej wartości dodając wodorotlenek sodu lub kwas solny):

pH 6.0 : NaH₂PO4 pH 7.0 : NaH2PO4 pH 8.0 : NaH2PO4 pH 9.0 : Glicyna - HCL pH 10.0 : Glicyna-HCl pH 11.0 :Na2HPO₄

Reakcje biotransformacji prowadzono w zatopionych szklanych probówkach w sposób następujący:

ml rozcieńczonego roztworu enzymu

100 pl 1.1M roztworu buforu o odpowiednim pH pl 50% gotowego roztworu racemicznego estru etylowego

2.5% w/v roztworu Tritonu Χ-100

Przy przeprowadzaniu biotransformacji w pH 12.0 do mieszaniny reakcyjnej o pH 11.0 dodawano bezpośrednio 1M roztwór NaOH do osiągnięcia właściwego pH. Wszystkie reakcje biotransformacji powtarzano dwukrotnie i przeprowadzono je w ciągu 1 godziny z wytrząsaniem w temperaturze 25°C. Główne wyniki przedstawiono w tabeli 7. Stwierdzono, że maksimum aktywności osiąga się przy pH 10.

Tabela 7

Zależność biotransformacji przy użyciu AJ3 od pH

Biotransformacja pH	Aktywność (U./ml)	Znormalizowany odzysk (%)
6	1.32	27.6
7	1.97	41.2
8	2.47	51.7
9	2.95	61.7
10	4.78	100.0
11	2.35	49.2
12	0.36	7.5

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania wzbogaconego w izomer (S) kwasu (S)-2-(3-benzoilofenylo)propionowego z mieszaniny enancjomerów estru alkilowego kwasu 2-(3-benzoilofenylo)propionowego przy użyciu biokatalizatora selektywnie hydrolizującego enancjomer (S) znamienny tym, że jako biokatalizator stosuje się drobnoustrój z grupy Ophiostoma lub Ceratocystis lub materiał posiadający pochodzącą z niego aktywność.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako biokatalizator wykorzystuje się drobnoustrój Ophiostoma novoulmi, IMI 356050.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się w nim ester alkilowy zawierający od 1 do 3 atomów węgla.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, żejako ester alkilowy stosuje się ester etylowy.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję przeprowadza się przy pH od 8 do 11.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że reakcję przeprowadza się przy pH od 8 do 11.

7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że reakcję przeprowadza się przy pH od 9,5 do 10,5.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że reakcję przeprowadza się przy pH od 9,5 do 10,5.