PL184731B1

PL184731B1 - Pochodne rapamycyny, zastosowanie pochodnych rapamycyny i kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL184731B1
Application number: PL96323310A
Authority: PL
Inventors: Sylvain Cottens; Richard Sedrani
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2002-12-31
Also published as: NZ311647A; RU2158267C2; ATE228135T1; KR19990022780A; PT833828E; EP0833828B1; MX9709555A; DK0833828T3; KR100400620B1; JP2000510815A; SK284529B6; TW410226B; ES2187660T3; DE69624921T2; TR199701567T1; PE4598A1; SK168297A3; HU228234B1; CZ292233B6; WO1996041807A1

Abstract

1. Pochodne rapamycyny o ogólnym wzorze 1 , w którym R1 oznacza C3 -1 0 alkinyl lub C3 -1 0hydro- ksyalkinyl, R2 oznacza reszta o wzorze 2, w którym R 3 jest wybrany sposród H, C1 -6 alkilu, C 1 -6 hydroksyalkilu lub alkoksyC1 -6 alkilu, R4 oznacza H lub metyl, Y oznacza O, zas X oznacza OH. 2. Pochodne rapamycyny o ogólnym wzorze 1 , w którym R1 oznacza C1 -1 0 alkil, C3 -1 0 alkinyl lub C3 -10hydroksyalkinyl, R 2 oznacza reszte o wzorze 2, w którym R3 jest wybrany sposród H, C1-6alkilu, C 1 - 6hydroksyalkilu lub C1-6alkoksyC1 -6 alkilu, R4 oznacza H lub metyl, Y oznacza O, zas X oznacza H. Wzór 1 PL PL PL

Description

Przedmiot wynalazku dotyczy pochodnych rapamycyny, zastosowania pochodnych rapamycyny i kompozycji farmaceutycznej zawierającej te pochodne.

Rapamycyna jest znanym antybiotykiem makrolidowym, wytwarzanym przez Streptomyces hygroscopicus, wykazującym strukturę, którą opisuje wzór A; Patrz np. McAlpine, J.B. i in., J. Antibiotics (1991) 44: 668; Schreiber, S.L. i in., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433; patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 929 992. (Istnieją różne sposoby numeracji atomów w cząsteczce, proponowane dla cząsteczki rapamycyny. W dalszym tekście, dla uniknięcia pomyłek nadaje się nazwy poszczególnym pochodnym rapamycyny z zastosowaniem numeracji według wzoru A).

(A)

Rapamycyna jest silnym środkiem immunosupresyjnym, a ponadto środkiem działającym przeciwnowotworowo i przeciwgrzybiczo.

Zastosowanie rapamycyny jako środka farmaceutycznego jest jednak ograniczone z uwagi na jej bardzo słabą i zmienną dostępność biologiczną. Rapamycyna jest nierozpuszczalna i nietrwała, co utrudnia sporządzanie z niej trwałych kompozycji galenowych.

Trwają poszukiwania pochodnych rapamycyny o korzystniejszych własnościach niż rapamycyna i w wyniku tych poszukiwań otrzymano np. 40-O-podstawione pochodne rapamycyny ujawnione w patentach Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 258 389 i WO 94/09010 (pochodne O-alkilowe); WO 92/05179 (estry kwasów karboksylowych), Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 118 677 (estry amidów), Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 118 678 (karbaminiany), Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 100 883 (fluorowane estry), Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 151 413 (acetale) i Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 120 842 (etery sililowe).

Nieoczekiwanie stwierdzono, że pochodne rapamycyny według wynalazku wykazują lepszy profil farmakologiczny niż jej znane pochodne oraz większą trwałość.

Pochodne rapamycyny według wynalazku są związkami o ogólnym wzorze 1, w którym

IR oznacza C₃_₁₍₎alkmyl lub C₃₁₍₎hydroksyalkinyl,

R₂ oznacza resztę o wzorze 2, w którym

R₃jest wybrany spośród H, C^alkilu, C_W)hydroksyalkilu lub alkoksyC^^alkilu,

R₄ oznacza H lub metyl,

Y oznacza O, zaś X oznacza OH.

Pochodne rapamycyny według wynalazku są również związkami o ogólnym wzorze 1, w którym

IR oznacza C.^alkiR ^-d_t)i^ll<^inyl lbb ^₃0₀yyr^roł^sj^i^]^l^in^;/l,

R2 oznacza resztę o wzorze 2, w którym

R₃jest wybrany spośród H, C^alkilu, C(_3hydroOsyalOilu lub C(_3alko0syC(_3-alkilu,

R4 oznacza H lub metyl,

Y oznacza O, zaś X oznacza H.

W szczególności pochodne rapamycyny według wynalazku są związkami o ogólnym wzorze 1 a, w którym

R1 oznacza C3__lθal032-innl lub C3_3_θhnyrrksnal0323innli

184 731

R., oznacza resztę o wzorze 2, w którym

R₃ jest wybrany spośród H, C_t^alkilu, C^hydroksyalkilu lub alkoksyC₁₍₎alkilu,

R₄ oznacza H lub metyl, zaś Y oznacza O.

W szczególności pochodne rapamycyny według wynalazku są również związkami o wzorze 1b, w którym

R_t oznacza Ci_₁₀alkil, C₃_₁₀alk-2-inyl lbb C₃__loyddroksyalk-2-inyl,

R, oznacza resztę o wzorze 2, w którym

Rc jest wybrany spośród H, C^alkilu, Ci_₆hydroksyalkilu lub C^alkoksyC^alkilu,

R4 oznacza H albo metyl, zaś Y oznacza O.

Korzystnymi pochodnymi rapamycyny, według wynalazku jest 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dwuwodoro-rapamycyna albo 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dwuwodoro-40-O-(2-hydroksyetslo)-rapamycynai a także 32-dezoksorapamycyna albo 16-pept-2-ypyloksy-32-decokscrapamycyna.

Zgodnie z wynalazkiem wymienione wyżej pochodne rapamycyny według wynalazku są stosowane jako farmaceutyki, a w szczególności w połączeniach z lekami stanowiącymi środki immunosupresyjne lub leki immunomodulacyjne albo środki przeciwzapalne lub środki przeciwzakaźne.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają terapeutycznie skuteczne ilości wymienionych wyżej pochodnych rapamycyny według wynalazku wraz farmaceutycznie tolerowanymi rozcieńczalnikami lub nośnikami.

Związki o wzorze 1 wykazują izomerię i w związku z tym występują w różnych postaciach izomerycznych. Należy więc rozumieć, że niniejszy wynalazek obejmuje poszczególne izomery związków o wzorze 1, a także mieszaniny tych izomerów, przy czym wyodrębnianie izomerów przeprowadza się znanymi sposobami.

Również znanymi sposobami otrzymywane są poszczególne pochodne rapamycyny według wynalazku, a w szczególności:

a) w celu wytwarzania związków o ogólnym wzorze 1, w których X oznacza H, przez redukcyjne usuwanie karbonylu w położeniu 32 w związkach o ogólnym wzorze 4a, w którym Rj, R- oraz Y oznaczają to samo, co określono wyżej, w postaci osłanianej lub nieosłanianej, oraz - w razie potrzeby - przez usuwanie występujących grup osłonowych; albo

b) w celu wytwarzania związków o ogólnym wzorze 1, w których X oznacza OH, przez stereoselektywną redukcję karbonylu w położeniu 32, w związkach o wyżej określonym ogólnym wzorze 4a, albo

c) w celu wytworzenia związków o ogólnym wzorze 1, w których R, jest różny od alkilu, przez przekształcanie związków o ogólnym wzorze 1, w którym R_] oznacza alkil.

W sposobie określonym jako a) związki o ogólnym wzorze 4a korzystnie występują w postaci osłanianej, tj. mogą zawierać grupy osłonowe na grupach funkcyjnych, nie biorących udziału w reakcji, np. OH w położeniu 28 i ewentualnie w położeniu 40, jeśli Roznacza resztę o wzorze 2 lub w położeniu 39, jeśli R- oznacza resztę o wzorze 3.

Redukcję w sposobie a) do 32-dezokso związków o ogólnym wzorze 1 można korzystnie prowadzić w dwóch etapach:

1) przez reakcj ę związków o ogólnym wzorze 4o, korzy stnie w postaci c^ss^anionej, z p·-) dorkiem, np. wodorkiem dwuicobutylnglinowym lub korzystnie z wodorkiem litowo-tęóą-teęt-butnksyglipnwym, w celu wytworzenia odpowiednich 32-dwuwodorocΛviąc.kć)w. Inne sposoby oraz reagenty, znane fachowcom w dziedzinie do redukcji ketonów, można stosować w celu wytwarzania 32-dwuwodnrozwiązków z odpowiednich ketonów. Obejmują one np. uwodornianie, redukcję metalami, redukcję wodorkami metali, jak to opisano w Comprehensive Organic Transformations (Ogólne przekształcenia organiczne), R.C. Larock, VCH Publishers Inc., Nowy Jork, 1989, strony 527-535, rozdziały 7.1.1-7.1.4, oraz sposoby asymetrycznej redukcji ketonów, np. przedstawione w Cnmrrehepsive Organie Trapsfoęmatinns, R.C. Larock, VCH Publishers Inc., Nowy Jork, 1989, strony 540-547, rozdział 7.1.15. Po etapie redukcji 1) następuje

184 731

2) przekształcenie np. 32-d\\3iwodorozwiązków w odpowiednie 32-chlorowcopochodnc np. Orobromodochoene lub (korzystnie) O2-jo2opocho2ne, które następnie redukuje się np. wodorkiem 2o żądanych Oro2ekoksodohho2nyhh i w reaie potrzeby usuwa się grupy osłonowe a otrzymanych związków. Do re2ukcji hhlorowhodohho2nyhh możne też stosować inne reagenty używane w tym celu, jak np. metale o niskiej wartościowości (tj. lit, só2, magnez i cynk) oraz wo2orki metali (wo2orki glinu, wo2orki boru, silany, wo2orki mie2zi) (patrz Comprehensive Organic Transformations, R.C. Larock, VCH Publishers Inc., Nowy Jork, 1989, strony 18-20, rnz2kieły 1.5.1 i 1.5.2). Alternatywnie re2ukcję chlnrnwncopocho2nych można uzyskać przez, zastosowanie wo2oru lub źró2eł wo2oru (np. kwasu mrówkowego lub jego soli) w obecności o2dowie2mch katalizatorów metalicznych (tj. niklu Raneya, metalicznego palla2u lub kompleksów paCla2u, kompleksów ro2u lub rutenu) (patrz Comprehensive Organic Transformations, R.C. Larock, VCH Publishers Inc., Nowy Jork, 1989, strony 20-24, roz2ział 1.5.O). Pona2to można również stosować znane sposoby, używane 2o przekształcania alkoholi w o2powie2nie 2eknksykwiąkki. Sposoby te obejmują np. bezpośre2nią re2ukcję lub re2ukcję dośre2nich związków fosforu, sulfonianów, tiowęglanów, tiokarbammianów lub ksaningenianOw i opisano je np. w Comprehensive Organic Transformations, R.C. Larock, VCH Publishers Inc., Nowy Jork, 1989, strony 27-O1, rnk2kiały 1.9.1-1.9.4.

O2powie2nie grupy osłonowe hy2roksylu oraz sposoby ich tworzenia i usuwania są również rozwiązaniami znanymi ze stanu techniki, np. z Protective Groups in Organic Synthesis (Grupy osłonowe w syntezie organicznej), 2rugie wy2anie, T.W. Greene i PG.M. Wuts, John Wiley & Sons, Nowy Jork, 1991, roz2ział 2, oraz o2nośniki literaturowe. Korzystnymi grupami osłonowymi OH są np. grupy trójorganosilylowe, takie jak ^(^_₆)^1^1^ϊ^1 (np. trójmetylosilyl, trójetylosilyl), trójizodrodylosilyl, iknpropyCn2wumeiylnsilyl, iert-butyln2wumetylosilyl, irOjarylnsilyl (np. trÓjfenylosilyC) lub irOjarylnalkClnsilyl (np. irOjbenkylosilyl). Usuwanie tych grup można drowa2zić w umiarkowanie kwaśnych warunkach.

Etap re2ukcji 1) można korzystnie realizować w niskiej temperaturze, np. o2 -10 2o -80°C.

W etapie 2) O2-2wuwo2orozwiązki, ewentualnie w postaci osłanianej, korzystnie O2(R)-2iasierenizomery, przekształca się w estry, korzystnie sulfoniany, np. mesylan, tosylan, nosylan lub trójfCan, a następnie po2stawia je o2powie2nim halogenkiem, np., jo2kiem lub bromkiem so2owym, jo2kiem lub bromkiem hziernbuiylnamnninwym, korzystnie w obecności zesa2y, np. aminy. O2(R)-2iastereoizomery można wy2zielać z mieszaniny znanymi meto2ami roz2zielczymi, np. przez chromatografię.

Wo2orki na2ające się 2o re2ukcji O2-chlorowcopocho2nych obejmują np. wo2orki ro2nikowe, takie jak wo2orek trójbutylocynowy lub trOj(trOjmeiylnsilylo)osilan. Re2ukcję można dona2in drowa2zić w nieobecności lub w obecności inicjatorów ro2ników, np. nitrylu kwasu r,2'-eznewuiznmesłnwegn lub korzystnie E^B, zwłaszcza w temperaturze o2 0°C 2o 80°C.

W razie potrzeby, po etapie re2ukcji w 1) lub 2), korzystnie można 2o2awać utleniacze, takie jak octan mie2ziowy, w celu wybiórczego powtórnego utlenienia 2o karbonylu w niedożą2anych miejscach re2ukcji, które mogą występować np. w położeniu 9.

Alternatywnie pocho2ne O2-2wuwo2orowe można bezpośre2nio przekształcać w chlorowcodocho2ne znanymi sposobami, np. stosując trójfenylofosfinę w połączeniu z imi2em kwasu N-bromo-bursztynowego lub N-jn2o-bursktynowegn, czterobromkiem węgla lub czierojn2kiem węgla, 1,2-2wubromnczterochloroeianem, 2,4,5-tr0jbrnmnimi2akolem lub 2,4,5-ir0jjo2oimi2ekolem, jo2em, 1,2-2wujo2oetanem, albo stosując bromek tionylu lub jo2ek metylotrój fenoksyfosfoniowy.

Re2ukcję karbonylu w położeniu O2 2o Or-2eknksopnhho2nej można też drowa2zić przez utworzenie iosylohy2raznnu, a następnie po22anie go reakcji z borowo2orem, np. katechinoborowo2orem, albo przez utworzenie 2wusiarckku 2wuetylenu, a następnie o2powie2nią re2ukcję, np. z u2ziałem niklu Raneya lub wo2orku, np. wo2orku trójbutylocynowego.

184 731

Można stosować również inne znane sposoby przekształcania ketonów w odpowiadające im alkany; takie sposoby obejmują np. bezpośrednią redukcję (patrz Comprehensive Organic Transformations, R.C. Larock, VCH Publishers Inc., Nowy Jork, 1989, strony 35-37, rozdział 1.12.1), albo redukcją przez hydrazony (Comprehensive Organic Transformations, R.C. Larock, VCH Publishers Ltd., Nowy Jork, 1989, strony 37-38, rozdział 1.12.2.) oraz przez pochodne siarki i selenu (Comprehensive Organic Transformations, R.C. Larock, VCH Publishers Ltd., Nowy Jork, 1989, strony 34-35, rozdziały 1.10 i 1.11).

Etap redukcji b) do 32(S)-dwuwodorozwiązków o ogólnym wzorze 1 prowadzi się w określonych warunkach. Korzystnie stosuje się środek redukujący, który w znacznym stopniu sprzyja redukcji do 32(S), np. trójetyloborowodorek sodowy. Redukcję tę korzystnie można prowadzić w niskiej temperaturze, np. od -50 do -80°C, w obojętnym rozpuszczalniku, np. w THF, eterze dwuetylowym, metoksyetanie lub dwumetoksyetanie albo w eterze metylo-tert-butylowym. 32(S)-dwuwodorozwiązki można oddzielać od małych ilości 32(R)-dwuwodorozwiązków wytworzonych znanymi sposobami, np. przez chromatografię kolumnową lub chromatografię z odwróconymi fazami.

W razie potrzeby grupy hydroksylowe w położeniu 28 i ewentualnie w położeniu 40 można osłaniać przed redukcją i później usuwać grupy osłonowe, jak to np. przedstawiono wyżej. Etap redukcji b) korzystnie prowadzi się bez osłaniania OH.

Etap przekształcania c) prowadzi się również znanymi sposobami. Przykładowo: związki o ogólnym wzorze 1, w których R] oznacza alkil, korzystnie metyl, można poddawać reakcji ze związkami o wzorze R_x-OH, w których R_x oznacza alkinyl lub hydroksyalkinyl, w celu otrzymania związków o ogólnym wzorze 1, w których Rj oznacza alkinyl lub hydroksyalkinyl. Reakcję tę korzystnie można prowadzić w rozpuszczalniku aprotonowym, np. w dwuchlorometanie, toluenie, acetonilu lub THF w kwaśnych warunkach.

Redukcję w położeniu 32, a zwłaszcza etap redukcji b), korzystnie prowadzi się z użyciem związków o ogólnym wzorze 4a, w których R1 już ma właściwe oznaczenie, np. R1 oznacza alkinyl, dzięki czemu unika się późniejszego przekształcenia po redukcji. Związki o ogólnym wzorze 4a, w których R₁ oznacza alkinyl lub hydroksyalkinyl, stosowane jako substancje wyjściowe, można wytwarzać wykorzystując wyżej przedstawione związki R-^OH.

Sposobami analogicznymi do sposobów znanych i stosowanych, np. ujawnionych w patentach Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 258 389, WO 94/09010, WO 95/16691, Stanów Zjednoczonych Ameryki 5 120 842, itd. można wytwarzać związki będące związkami wyjściowymi dla pochodnych rapamycyny według wynalazku.

W niżej podanych przykładach temperatury określono w °C i zastosowano następujące skróty: THF - czterowodorofuran; TES - trójetylosilyl.

Przykład I: 32-dezoksorapamycyna (R1 = CH₃; R₂ = wzór 2, w którym R₃ = H, a R₄ = CH3 X = H; Y = O)

Do ochłodzonego (-78°) roztworu 26,1 g (22,85 mmol) 28,40-dwu-O-TES-rapamycyny w 260 cm³ THF dodaje się podczas mieszania 50,3 cm³ (50,3 mmol) 1 M roztworu wodorku litowo-trój-tert-butoksyglinowego w THF. Otrzymanej mieszaninie pozwala się ogrzać do -15° w ciągu 2 godzin. Następnie łaźnię chłodzącą zamienia się na łaźnię lodową, podnosząc temperaturę do 0° i w tej temperaturze dalej prowadzi się mieszanie przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną wlewa się do rozdzielacza, zawierającego 750 cm3 octanu etylowego i 400 cm3 ochłodzonego lodem 2 n wodnego roztworu kwasu cytrynowego, i krótko wstrząsa. Oddziela się wodną fazę i dwukrotnie ekstrahuje zimnym octanem etylowym. Połączone roztwory organiczne przemywa się ochłodzonym lodem 2 n wodnym roztworem kwasu cytrynowego, wodą nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodowego i dwukrotnie nasyconym roztworem soli, a następnie suszy nad bezwodnym węglanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość, zawierającą mieszaninę 32(R)-dwuwodoro-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny i 32(R)-9,32-dwu-dwuwodoro-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny, rozpuszcza się bez dalszego oczyszczania w 260 cm3 metanolu. Roztwór ten chłodzi się do 0° i zadaje 6,85 g (34,31 mmol) octanu miedziowego. Po wymieszaniu przez godzinę

184 731 rozcieńcza się otrzymaną zawiesinę eterem metylo-tert-butylowym i dwukrotnie przemywa wodą oraz dwukrotnie nasyconym roztworem soli. Wodne fazy reekstrahuje się eterem metylo-tert-butylowym. Połączone roztwory organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię na żelu krzemionkowym (60:40 heksan/eter metylo-tert-butylowy) w celu uzyskania 32(R)-dwuwodoro-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny w postaci białego ciała stałego.

'H NMR (CDCl₃) mieszanina rotamerów (konformerów) 4:1, chemiczne przesunięcia w nawiasach odnoszą się do mniej reprezentowanego rotameru δ 0,72 (1H, dd, H-38ax), 1,63 (1,60) (3H, s, CI7-CH3), 1,66 (1,69) (3H, s, C29-CH3), 1,77 i 1,81 (H-33), 2,46 (1H, m, H-31), 2,82 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, H-39), 3,13 (3H, s, C16-OCH3), 3,26 (3H, s, C27-OCH3), 3,41 (1H, m, H-40), 3,43 (3H, s, C39-OCH3), 3,62 (1H, m, H-32), 3,75 (3,57) (1H, d, H-27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,81 (1H, szerokie s, C10-OH), 5,05 (1H, d, H-34), 5,27 (1H, d, H-30), 5,36 (1H, d, H-2), 5,69 (1H, dd, H-22), 6,03 (5,96) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20), 6,40(1H, dd, H-19).

MS (FAB, macierz LiJ) m/z 1150 ([M + Li]+) (względna intensywność 100).

Do ochłodzonego (-15°) roztworu 20,69 g (18,10 mmol) 32(R)-dwuwodoro-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny i 7,55 g (54,27 mmol) trój etyloaminy w 200 cm³ chlorku metylenu dodaje się podczas mieszania 2,10 cm³ (27,02 mmol) chlorku metanosulfonylu. Mieszaninę tę miesza się przez 20 minut, a następnie rozcieńcza octanem etylowym i dodaje nasycony wodny roztwór kwaśnego węglanu sodowego. Warstwy rozdziela się i wodną warstwę trzykrotnie ekstrahuje się octanem etylowym. Połączone fazy organiczne przemywa się nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodowego oraz roztworem soli, suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość można oczyszczać przez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym (80:20 heksan/octan etylowy) otrzymując czystą 32(R)-dwuwodoro-32-O-mesylo-28,40-dwu-O-TES-rapamycynę w postaci białego ciała stałego, ale zwykle w dalszych etapach stosuje się surowy produkt bez dodatkowego oczyszczania.

Ή NMR (CDCl₃) δ 0,77 (1H, dd, H-38ax), 1,67 (3H, s, C17-CH₃), 1,72 (3H, s, C29-CH3), 2,77 (1H, M, H-25), 2,92 (1H, m, H-39), 3,03 (3H, s, C16-OCH3), 3,17 (3H, s, C27-OCH3), 3,21 (3H, s, C39-OCH3), 3,42 (1H, m, H-40), 3,45 (3H, s, CH3SO3), 3,91 (1H, d, H-27), 4,10 (1H, d, H-28), 4,72 (1H, m, H-32), 4,94 (1H, s, C10-OH), 5,12 (1H, m, H-34), 5,25 (1H, d, H-30), 5,43 (1H, d, H-2), 5,88 (1H, dd, H-22), 6,03 (1H, d, H-18), 6,18 (1H, dd. H-21), 6,37 (1H, dd, H-20), 6,44 (1H, dd, H-19).

MS (FAB, macierz LiJ) m/z 1228 ([M + Li]+) (względna intensywność 68), 1132 ([M + CH3SO3H + Li]+) (względna intensywność 100).

Mieszaninę 22,35 g (18,30 mmol) 32(R)-dwuwodoro-32-O-mesylo-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny, 27,50 g (183,33 mmol) jodku sodowego i 6,3 cm3 (36,68 mmol) dwuizopropyloetyloaminy w 400 cm3 THF ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną przez 6 godzin, a następnie pozostawia do ochłodzenia do pokojowej temperatury. Otrzymaną mieszaninę rozcieńcza się octanem etylowym i zadaje 38,4% wodnym roztworem kwaśnego siarczynu sodowego. Warstwy rozdziela się. Organiczną fazę trzykrotnie przemywa się nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodowego i raz nasyconym roztworem soli, a następnie suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym (83:17 heksan/octan etylowy) w celu uzyskania czystej 32(S)-dezokso-32-jodo-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny.

’H NMR (CDG3) mieszanina rotamerów 1,5:1, chemiczne przesunięcia w nawiasach odnoszą się do mniej reprezentowanego rotameru δ 0,73 (1H, dd, H-38ax), 1,68 (1,66) (6H, s, C17-CH₃ i C29-CH3), 2,72 (1H, m, H-25), 2,91 (2H, m, H-32 i H-39), 3,15 (3H, s, C16-OCH3), 3,30 (3,31) (3H, s, C27-OCH3), 3,43 (3,41) (3H, s, C39-OCH₃), 3,77 (3,91) (1H, d, H-27), 4,21 (4,25) (1H, d, H-28), 4,51 (1H, s, C10-OH), 5,45 (5,48) (1H, d, H-30), 5,60 (5,79) (1H, dd, H-22), 6,02 (5,85) (1H, d, H-18).

MS (FAB, macierz LiJ) m/z 1260 ([M + Li]+) (względna intensywność 100).

184 731

Do ochłodzonego (0°) roztworu 16,79 g (13,19 mmol) 32(S)-dezokso-32-jodo-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny w 190 cm³ toluenu dodaje się podczas mieszania 7 cm³(26,38 mmol) wodorku trójbutylocynowego, a następnie 1,3 cm3 (1,30 mmol) 1 M roztworu trójetyloborowodoru w heksanie. Mieszaninę tę ogrzewa się przez 30 minut i zatrzymuje reakcję nasyconym wodnym roztworem chlorku amonowego. Rozdziela się warstwy i wodną warstwę dwukrotnie ekstrahuje się octanem etylowym. Połączone warstwy organiczne przemywa się wodą nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodowego, wodą i trzykrotnie nasyconym roztworem soli, następnie zaś suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym (75:25 heksan/eter metylo-tert-butylowy) w celu uzyskania czystej 32-dezokso-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny w postaci białego ciała stałego.

^!H NMR (CDCl₃) mieszanina rotamerów 2,5:1, chemiczne przesunięcia w nawiasach odnoszą się do mniej reprezentowanego rotameru δ 0,73 (1H, dd, H-38ax), 1,62 (1,57) (3H, s, C17-CH3), 1,68 (1,72) (3H, s, C39-CH3), 2,77 (2,91) (1H, m, H-25), 2,91 (1H, m, H-39), 3,15 (3H, s, C16-OCH3), 3,27 (3,25 (3H, s, C27-OCH3), 3,43 (3,45) (3H, s, C39-OCH3), 3,70 (3,67) (1H, d, H-27), 4,11 (4,07) (1H, d, H-28), 4,57 (1H, szerokie s, C10-OH), 4,87 (4,67) (1H, d, H-34), 5,19 (5,08) (1H, d, H-30), 5,32 (1H, d, H-2), 5,60 (5,66) (1H, dd, H-22), 6,01 (5,92), (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19).

MS (FAB, macierz LiJ) m/z 1134 ([M + Li]+) (względna intensywność 100).

Do ochłodzonego (-15°) roztworu 10,73 g (9,52 mmol) 32-dezokso-28,40-dwu-O-TES-rapamycyny w 85 cm3 metanolu dodaje się kroplami podczas mieszania 9,5 cm3 2 n wodnego roztworu kwasu siarkowego. Po zakończeniu dodawania ogrzewa się mieszaninę reakcyjną do 0° i miesza przez 1,5 godziny, a następnie rozcieńcza octanem etylowym i zatrzymuje reakcję nasyconym roztworem kwaśnego węglanu sodowego. Rozdziela się warstwy i wodną warstwę ekstrahuje się trzema porcjami octanu etylowego. Połączone fazy organiczne trzykrotnie przemywa się nasyconym roztworem kwaśnego węglanu sodowego oraz roztworem soli, a następnie suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszcza się w eterze dwuetylowym, następnie zaś krystalizuje żądana 32-dezokso-rapamycyna (bezbarwne kryształy).

^!H NMR (CDC0) mieszanina rotamerów 3:1, chemiczne przesunięcia w nawiasach odnoszą się do mniej reprezentowanego rotameru δ 0,70 (1H, dd, H-38ax), 1,14 i 1,32 (H-32), 1,56 (H-33), 1,65 (1,62) (3H, s, C17-CH3), 1,68 (1,70) (3H, s, C29-CH3), 2,31 (2H, m, H-23 i H-31), 2,82 (2,95) (1H, m, H-25), 2,95 (1H, m, H-39), 3,14 (3H, s, C16-OCH3), 3,32 (3H, s, C27-OCH₃), 3,38 (1H, m, H-40), 3,43 (3,41) (3H, s, C39-OCH3), 3,61 (1H, d, H-27), 4,12 (1H, d, H-28), 4,80 (4,71) (1H, d, H-34), 5,22 (1H, d, H-30), 5,31 (1H, d, H-2), 5,56 (1H, dd, H-22), 5,95 (5,87) (1H, d, H-18), 6,16 (1H, dd, H-21), 6,36 (1H, dd, H-20), 6,41 (1H, dd, H-19).

MS (FAB, macierz LiJ) m/z 906 ([M + LiJ]+) (względna intensywność 100).

Przykład II: 16-pent-2-jyiyloksy-32(S)-dwuwodoro-rapamycyna (R_t = pent-2-ynyl; R₂ = wzór 2, w którym R₃ = H, a R₄ = CH₃; X = OH; Y = O)

Do ochłodzonego (0°) roztworu 970 mg (1,06 mmol) 32(S)-dwuwodororapamycyny i 1,39 cm³ (15,00 mmol) 2-pentyn-1-olu w 20 cm³ chlorku metylenu dodaje się podczas mieszania 0,50 cm3 (6,50 mmol) kwasu trójfluorooctowego. Mieszaninę tę miesza się w 0° przez 3 godziny i zatrzymuje reakcję nasyconym wodnym roztworem kwaśnego węglanu sodowego. Rozdziela się warstwy i wodną warstwę ekstrahuje się trzema porcjami octanu etylowego. Połączone roztwory organiczne przemywa się nasyconym roztworem soli, suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Surową mieszaninę oczyszcza się przez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym (20:80 heksan/octan etylowy), a następnie przez HPLC z odwróconymi fazami (RP 18, metanol-woda 81:19) w celu uzyskania tytułowego związku w postaci białego bezpostaciowego ciała stałego.

184 731

Ή NMR (CDClj) mieszanina rotamerów 2,5:1, chemiczne przesunięcia w nawiasach odnoszą się do mniej reprezentowanego rotameru δ0,71 (1H, ddH-C8ax), 1,1C (1,05) (CH, t, CRCRCCCRO), 1,67 (CH, s, 17-CH ₃), 1,69 (CH, s, 29-CR), 2,21 (2H, qt, CHcCH₂CCCH₂O), 2,96 (1H, m, H-C9), C,CC (C,C7) (CH, s, 27-OCHA C,41 (C,C9), (CH, s, C9-OCHc), C,78 (1H, dt, CRCRCCCHF/O), 5,52 (5,71) (1H, dd, H-22), 5,98 (5,8C) (1H, d, H-18), 6,15 (1H, m, H-21); 6,C0 (1H, dd, H-20), 6,40 (1H, dd, H-19).

MS (FAB) m/z 974 ([M + LiJ]+).

Przykład III: 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dwuwoyoro-rapamycnna (sposób alternatywny)

Rapamycynę poddaje się reakcji z 2-pentyn-1-olem sposobem postępowania analogicznym jak w przykładzie II, aby uzyskać 16-pent-2-nnnloksn-rapamycnnę.

Do ochłodzonego (-77°) roztworu 17,5 g (18,1 mmol) 16-demetoksy-16-pent-2-ynyloksy-rapamycyny w 180 cm³ THF dodaje się podczas mieszania 21,7 cm³ (21,7 mmol) 1 M roztworu trójetyloborowodorku sodowego w THF. Po przetrzymywaniu w -11° przez 1 godzinę zatrzymuje się reakcję i zobojętnia 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego. Następnie mieszaninę reakcyjną pozostawia się, aby osiągnęła pokojową temperaturę, i usuwa większość THF przez odparowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany roztwór dwukrotnie ekstrahuje się octanem etylowym, a organiczne fazy łączy się i suszy nad siarczanem sodowym. Po odparowaniu rozpuszczalnika surowy produkt reakcji poddaje się chromatografii na żelu krzemionkowym, eluując go mieszaniną heksan/aceton 7/C. Ostateczne oczyszczenie uzyskuje się na drodze preparatywnej HPLC (RP-18, 76:24 metanol:woda), otrzymując tytułowy związek w postaci białego, bezpostaciowego ciała stałego.

Dane widmowe są identyczne, jak dla produktu otrzymanego innym sposobem.

Przykład IV: C2(S)-dwuwoyoro-40-O-(2-metoksy)etylorapamncyna (R = CR; R = wzór 2, w którym R = i-metoksy-etyl, a R = CR; X = OH; Y = O)

Do ochłodzonego (0°) roztworu 2,17 g (2,00 mmol) 40-O-(2-metoksn)etnlo-28-O-TES-rapamycnnn w 20 cmC THF dodaje się kroplami podczas mieszania 4,4 cmC (4,4 mmol) 1 M roztworu L-Selectride® w THF. Otrzymany żółty roztwór miesza się przez trzy godziny w 0° i likwiduje nadmiar odczynnika wodorkowego przez dodanie 2 cmC MeOH. Roztwór rozcieńcza się eterem metylo-tert-butylownm i dodaje nasycony wodny roztwór soli Rochelle'a. Mieszaninę tę pozostawia się do ogrzania do pokojowej temperatury i kontynuuje mieszanie przez 15 minut. Rozdziela się warstwy i organiczny roztwór przemywa się zimnym 1 n HCl, nasyconym roztworem soli, 1 n roztworem kwaśnego węglanu sodowego i ponownie roztworem soli. Wodne popłuczyny reekstrahuje się eterem metylo-tert-butylowym. Połączone warstwy organiczne suszy się nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem w celu otrzymania surowej mieszaniny izomerów C2S i c2r C2-dwuwoyoro-40-O-(2-metokss')ctylo-28-O-TES-rapamycnnn.

Otrzymany wyżej surowy produkt rozpuszcza się w 20 cmC acetonitrylu i chłodzi do 0°. Do utworzonego roztworu dodaje się 2 cmC kompleksu HF-pirydyna. Mieszanie prowadzi się dalej przez godzinę i dodaje 1 n roztwór kwaśnego węglanu sodowego. Mieszaninę tę trzykrotnie ekstrahuje się eterem metylo-tert-butylowym. Połączone roztwory organiczne przemywa się 1 n roztworem kwaśnego węglanu sodowego i nasyconym roztworem soli, suszy nad bezwodnym siarczanem sodowym, przesącza i zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem. Oczyszczanie prowadzi się przez HPLC z odwróconymi fazami (RP 18,5 pm, acetonitryl-woda od 50:50 do 100:0 przez 60 minut), otrzymując 32(S)-dwuwodoro-40-O-(2-metokky)etylo-rapamy^nę oraz, jako produkt uboczny, C2(R)-dwuwodoro-40-O-(2-metokkn)etnlo-rapamncnnę.

C2(S)-dwuwodoro-40-O-(2-metoksy)etylo-rapamncyna: ‘H NMR (CDCR mieszanina rotamerów 2:1, chemiczne przesunięcia w nawiasach odnoszą się do mniej reprezentowanego rotameru δ 0,77 (1H, dd, H-C8ax), 1,67 (6H, S, C17-CR i C29-CR), 2,50 (1H, m, H-C1), C,01 (1H, m, H-25), C,12 (2H, m, H-C9 i H-40), C,14 R15) (CH, s, OCR), C,28 (1H, m, H-C2), C,C6 (C,C4) (CH, s, OCR), C,C9 (C,C8) (CH, s, OCR), C,48 (C,46) (CH, s, OCR), C,55 i C,75 (4H, 2m, OCRCRO), C,84 (1H, m, H-14), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 4,7C (1H, s, C10-OH), 5,0C (1H, m, H-C4).

MS (FAB) m/z 980 ([M + Li]+).

184 731

Przykład V: 32(S)-ywuwodoro3403O-(2-hydroOsn)etylo-rapamycnna R = CH3; R, = wzór 2, w którym R = -CRCROH, a R₄ = CR; X = OH; Y = O)

Tytułowy związek otrzymuje się według sposobu postępowania z przykładu IV, ale stosując odpowiednią substancję wyjściową..

32(S)3ywuwrdoro340-O-(2-hydroOsn)etylo3rapamncnna: Ή NMR (CDCR) mieszanina rotamerów 1,7:1, chemiczne przesunięcia w nawiasach odnoszą się do mniej reprezentowanego rotameru δ 0,76 (1H, dd, H-38ax), 2,50 (1H, m, H-31), 3,10 (1H, m, H-39), 3,13 (3,14) (3H, s, C16-OCR), 3,20 (1H, m, H-40), 3,28 (1H, m, H-32), 3,36 (3,38) (3H, C27-OCR), 3,45 (3,43) (3,41) (3H, s, C39-OCR), 3,50 (1H, d, H-27), 3,58 i 3,70 (4H, m, OCH₂CH₂OH), 4,12 (4,16) (1H, d, H-28), 5,06 (1H, m, H-34), 5,60 (1H, dd, H-22), 5,99 (1H, d, H-18), 6,17 (1H, dd, H-21), 6,33 (1H, dd, H-20), 6,42(1 H, dd, H-19).

MS (FAB, macierz LiJ) m/z 966 ([M + Li]+) (względna intensywność 100).

Przykład VI: 16-pent323nnylo0sy-32-dezokso-rapamncnna (^1 = pent32-ynyl; R2 = wzór 2, w którym R₃ = H, a R4 = CR; X = H; Y = O)

Tytułowy związek otrzymuje się według sposobów postępowania z przykładów I, II lub III, ale stosując odpowiednie substancje wyjściowe.

Ή NMR (CDCR) δ 0,70 (1H, dd, H-38ax), 1,23 (3H, t, CRCRCCCRO), 2,21 (2H, ddq, CRCRCCCRO), 2,78 (1H, m, H-25), 2,94 (1H, m, H-39), 3,31 (3H, s, C27-OCR), 3,42 (3H, s, C39-OCR), 3,62 (1H, d, H-27), 3,78 (1H, ddd, CRCRCCCRO), 4,02 (1H, ddd, CRCRCCCRO), 4,12 (1H, d, H-28), 4,79 (1H, m, H-34), 5,20 (1H, d, H-30), 5,28 (1H, szerokie d, H-2), 5,50 (1H, dd, H-22), 5,97 (1H, d, H-18), 6,14 (1H, dd, H-21), 6,30 (1H, dd, H-20), 6,38 (1H, dd, H-19).

MS (FAB, macierz LiJ) m/z 958 ([M + Li]+) (względna intensywność 100).

Związki o ogólnym wzorze 1 wykazują działanie farmaceutyczne, są więc użyteczne jako środki farmaceutyczne.

W szczególności związki o ogólnym wzorze 1 wykazują działanie immunosupresyjne i przeciwrrzrostowei jak to wykazuje się następującymi metodami testowymi in vitro oraz in vivo\

I. Odczyn mieszanych limfocytów (MLR)

Odczyn mieszanych limfocytów pierwotnie opracowano w związku z aloprzeszczepami w celu oceny zgodności tkanki między potencjalnym dawcą organu oraz biorcami i jest on jednym z najlepiej uznanych modeli odczynu odpornościowego in vitro. Do przedstawienia skutków immunosupresyjnego działania związków o ogólnym wzorze 1 stosuje się np. mysi model MLR, opisany przez T. Meo w „Immunological Methods”, L. Le^o^s i B. Pernis, Eds., Academic Press, Nowy Jork, strony 227-239 (1979). Komórki śledziony (2 x 10⁵ na wgłębienie) z myszy Balb/c (żeńskich osobników w wieku 8-10 tygodni) inkubuje się na płytkach do mlkromiareczOowania przez 5 dni wraz z 0,5 x 10⁶ napromienionych (2000 rad) lub potraktowanych mitomycyną C komórek śledziony z myszy CBA (żeńskich osobników w wieku 8-10 tygodni). Napromienione komórki alogeniczne wywołują rozrostową reakcję w komórkach śledziony Balb/c, którą można mierzyć przez wprowadzenie znakowanego prekursora do DNA. Komórki stymulatora są napromienione (albo potraktowane mitrmncnną C), toteż nie reagują rozrostem na komórki Balb/c, natomiast zachowują swoją antygenowość. Skutek przeciwrozrostowego działania związków o ogólnym wzorze 1 mierzy się dla różnych rozcieńczeń i oblicza stężenie, wywołujące 50% powstrzymanie rozrostu komórek (IC₅₀). Tę zdolność powstrzymującą badanych próbek można porównywać z rapamycyną i wyrażać w postaci względnego (tj. jako stosunek IC5 badanej próbki do IC5₀ rapamncnnn). Stwierdzono, że związki z przykładów I i II wykazują w tej próbie wartości względnego 1C50 odpowiednio 0,3 i 0,08.

II. Rozrost za pośrednictwem IL-6 (IL-6- PROL)

Zdolność związków o ogólnym wzorze 1 do obniżania czynnika wzrostu, związanego z drogami objawowymi, ocenia się z wykorzystaniem linii komórek hybrydoma myszy zależnych od mterleukin^ (IL-6). Ocenę przeprowadza się na płytkach do miOrrmiarecz0rwania

184 731 z 96 wgłębieniami. Na pożywce pozbawionej surowicy krwi ho2uje się po 5000 komórek na wgłębienie (jak to prze2stawiają M.H. Schreier i R. Tees w Immunological Metho2s, I. Lefkovits i B. Pernis, E2s., Aca2emic Press, 1981, tom 2, strony 26O-275) z 2o2atkiem 1 ng rekombinanta IL-6 na 1 cmO. Po okresie inkubacji, trwającym 66 gn2kin w nieobecności lub w obecności ba2anych próbek, komórki te za2aje się impulsowo 1 pCi (O-H)-tymi2yny na każ2e wgłębienie na 2aCsze 6 go2zin, zbiera i mierzy ciekłym scyntylatorem. Stopień wbu2owania (O-H)-tymi2yny 2o DNA o2powia2a wzrostowi liczby komórek, jest więc miernikiem rozrostu komórek. Serie rozcieńczeń ba2anych próbek umożliwiają obliczanie stężeń, powo2ujących 50% powstrzymywanie rozrostu komórek (IC₅₀). Z2oCność powstrzymującą ba2anych próbek można porównywać z rapamycynąi wyrażać w postaci wzglę2nego IC₅₀ (tj. jako stosunek IC^ ba2anej próbki 2o IC^ rapamycyny). Stwier2zono, że związki z przykła2ów I i II wykazują w tej próbie wartości wkglę2negn Ιί^ n2dnwie2nin 0,2 i 0,09.

III. Próba wiązania makrofiliny (MBA)

Wia2omo, że rapamycyna i strukturalnie pokrewny śro2ek immunosupresyjny FK-506 wiążą się in vitro z makrnfilinąo12 (znaną także jako białko wiążące FK-506 lub FKBP-12) oraz uważa się, że takie wiązanie jest wynikiem immunosupresyjnego 2ziałania tych związków. Związki o ogólnym wzorze 1 również silnie wiążą się z makrofiliną-12, jak to prke2stawie się w porównawczych próbach tego wiązania. W próbach tych 2o pokrywania wgłębień 2o mikromiarehkknwanie stosuje się FR-506 sprzężony z BSA. W obecności lub w nieobecności ba2anych próbek umożliwia się wiązanie Cu2zkiej makrofiliny-12 (biot-MAP) biotynylowanego rekombinanta z unieruchomionym FK-506. Po przemyciu (w celu usunięcia niespecyficznie związanej makrofiliny) ocenia się związanie biot-MAP przez inkubację ze sprzężonymi sireptawi2ynn-kasa2owych fosfataz, następnie przemycie, a potem 2o2anie fosforanu p-nitrofenylowego jako po2łoża. Gęstość optyczną (OD) o2czytuje się przy 405 nm. Wiązanie ba2anych próbek z biot-MAP powo2uje zmniejszenie ilości biot-MAP związanych z FK-506, a przez to obniżenie gęstości optycznej przy 405 nm (OD405). Serie rozcieńczeń ba2anych próbek umożliwiają określenie stężenia, powo2ującego 50% powstrzymywanie wiązania biot-MAP z unieruchomionym FK-506 (IC50). Z2olność powstrzymującą ba2anych próbek porównuje się z wolnego FK-506 jako wzorca i wyraża w postaci wzglę2nego ^0 (tj. stosunku IC500 ba2anej próbki 2o IC^ wolnego FK-506). W próbach tych stwier2zono, że związki z przykła2ów I, II i V wykazują wartości wzglę2nego IC50 o2powie2nio 1, 2,8 i 2,5.

IV. Miejscowa reakcja przeszczepu przeciw komórkom biorcy (GvH)

Skuteczność 2kiełanie związków o ogólnym wzorze 1 in vivo wykazuje się na o2powie2nich mo2elach zwierzęcych, jak to opisują np. For2 i in., Transplantation 10 (1970) 258. Komórki śle2ziony (1 x 10⁷), pobrane o2 żeńskich osobników szczurów Wistar/Furth (WF) w wieku 6 tygo2ni wstrzykuje się po2skórnie w 2niu 0 2o lewych tylnych łap żeńskich osobników szczurów (FO44 x WF)F_p ważących około 100 g. Zwierzęta leczy się przez 4 kolejne 2ni i usuwa dn2knlennwe węzły chłonne oraz waży w 2niu 7. Różnice mię2zy masami 2wóch węzłów chłonnych przyjmuje się jako parametr oceniający reakcję.

V. Reakcja aloprzeszczepu nerek u szczurów

Je2ną nerkę o2 szczurzego 2awcy DA (RT1^a) lub Brown-Norway (BN) (RT1^a) przeszczepia się 2o naczynia nerkowego szczurzego biorcy (Lewis RT1'), mającego je2nosti^onnie (lewostronnie) wycięta nerkę, stosując zespolenie „koniec 2o końca”. Zespolenie moczowo2owe jest również „koniec 2o końca”. Leczenie rozpoczyna się w 2niu przeszczepienia i prowa2zi się przez 14 2ni. Po upływie sie2miu 2ni o2 przeszczepienia wykonuje się przeciwstronne wycięcie nerki, pozostawiając biorcę z2anego na 2ziałanie nerki 2awcy. Przeżycie biorcy przeszczepu przyjmuje się jako parametr czynnościowego przeszczepu.

VI. Doświa2czalnie wywołane alergiczne zapalenie mózgu i r2zenia (EAE) u szczurów

Skuteczność 2ziałania związków o ogólnym wzorze 1 w EAE mierzy się np. stosując sposób postępowania prze2stawiony w pracach Levine & Wenk, Amer. J. Path 47 (1965) 61; McFarlin i in., J. Immunol. 11O (1974) 712; Borel, Transplant. & Clin. Immunol. 1O (1981) O.

184 731

EAE jest szeroko przyjętym modelem dla stwardnienia rozsianego. Męskim osobnikom szczurów Wistar wstrzykuje się do tylnych łap mieszaninę wołowego rdzenia kręgowego i kompletny środek wspomagający Freunda. Objawy choroby (porażenie ogona i obydwu tylnych nóg) zwykle rozwijają się w ciągu 16 dni. Odnotowuje się liczbę chorych zwierząt oraz czas początku choroby.

VII. Zapalenie stawów wywołane środkiem wspomagającym Freunda

Skuteczność działania przeciw doświadczalnie wywołanemu zapaleniu stawów wykazuje się, stosując sposób postępowania przedstawiony np. w pracach: Winter & Nuss, Artritis & Rheumatism 9 (1966) 394; Billingham & Davies, Handbook of Experimental Pharmacol. (Vane & Ferreira Eds., Springer-Verlag, Berlin) 50/11 (1979) 108-144. Szczurom OFA i Wistar (osobnikom męskim lub żeńskim o masie ciała 150 g) wstrzykuje się śródskórnie u podstawy ogona lub do tylnej nogi 0,1 cm3 oleju mineralnego, zawierającego 0,6 mg liofilizowanych, uśmierconych ciepłem prątków mastki (Mycobacterium smegmatis) W rozwijającym się modelu zapalenia stawów leczenie rozpoczyna się zaraz po wstrzyknięciu środka wspomagającego (prowadząc je w dniach 1-18); w ustalonym modelu zapalenia stawów leczenie rozpoczyna się w dniu 14, gdy dobrze rozwinęło się wtórne zapalenie (prowadząc je w dniach 14-20). Pod koniec doświadczenia mierzy się opuchnięcie stawów przy pomocy mikrocyrkla. ED₅₀ oznacza doustną dawkę w mg/kg, która zmniejsza opuchnięcie (pierwotne lub wtórne) do połowy w odniesieniu do prób kontrolnych.

VIII. Działanie przeciwnowotworowe i MDR

Przeciwnowotworowe działanie związków o ogólnym wzorze 1 i ich zdolność do wzmagania działania środków przeciwnowotworowych przez zmniejszanie wielolekooporności wykazuje się, na przykład przez podawanie środka przeciwrakowego, np. kolchicyny lub etopozydu, do wielolekoopornych komórek oraz do komórek wrażliwych na leki in vitro lub zwierzętom posiadającym nowotwory łub zakażenia wielolekooporne lub wrażliwe na leki, z jednoczesnym podawaniem (lub bez niego) związków o ogólnym wzorze 1, które mają być badane, oraz przez podawanie samych związków o ogólnym wzorze 1.

Takie próby in vitro przeprowadza się z zastosowaniem odpowiedniej linii komórek kontrolnych (macierzystych), wytwarzanych np. tak, jak to opisują Ling i in., J. Cell. Physiol. 83, 103-116 (1974) oraz Bech-Hansen i in., J. Cell. Physiol. 88, 23-32 (1976). Specjalnie wybranymi klonami są: wielolekooporna (np. oporna na kolchicynę) linia CHR (podklon C5S3.2) oraz macierzysta, wrażliwa linia AUXB1 (podklon AB1 S11).

In vivo działanie przeciwnowotworowe i przeciw-MDR wykazuje się np. u myszy, którym wstrzykuje się komórki rakowe wielolekooporne oraz wrażliwe na leki. Podlinie rakowe puchliny brzusznej (Ehrlich ascites carcinoma, EA), oporne na substancje lekowe DR, VC, AM, ET, TE lub CC, rozwija się przez kolejne przenoszenie komórek EA do następujących po sobie pokoleń myszy gospodarzy BALB/c sposobami, przedstawionymi przez Slatera i in., J. Clin. Invest. 70, 1131 (1982).

Równoważne wyniki można uzyskać, stosując związki o ogólnym wzorze 1 w modelach testowych o porównywalnym modelu, np. in vitro, albo używając zwierzęta testowe zakażone szczepami wirusowymi lekoopornymi i wrażliwymi na leki, szczepami bakteryjnymi opornymi na antybiotyki (np. penicylinę) i wrażliwymi na nie, szczepami grzybów opornych na środki przeciwgrzybicze i wrażliwymi na nie, a także lekoopornymi szczepami pierwotniakowymi, np. szczepami zarodźcowymi, np. naturalnie występującymi podszczepami Plasmodium felciparum (zarodźca sierpowatego), wykazującymi nabytą oporność na chemioterapeutyczne leki przeciwmalaryczne.

IX. Powstrrymywanie ccynnika Mip i ccyyników podobnnch do Mip

Ponadto związki o ogólnym wzorze 1 wiążą i blokują różne czynniki Mip (czynnik wzmagający zakażalność makrofagami) i podobne do Mip, które są strukturalnie podobne do mnórofilinc. Czynniki Mip i podobne do Mip są wir^lentnymi czynnikami, wytwarzanymi przez różnorodne czynniki chorobotwórcze, w tym z rodzaju Chlamydia, np. Chlamydia trachomatis (zarazki jaglicy); Neisseria (dwoinki gramoujemne), np. Neisseria meningitidis

184 731 (dwoinki zapalenia opon); oraz Legionella, np. Legionella pneumophilia (zarazki powodujące zapalenie płuc); a także przez pasożyty bezwarunkowe z rzędu Rickettsia (riketsje). Ccyppiki te odgrywają decydującą rolę w ustanawianiu zakażeń wewnątrzkomórkowych. Skuteczność działania związków o ogólnym wzorze 1 w zmniejszaniu zakażalpości czyppików chorobotwórczych, które wytwarzają czyppiki Mip lub podobne do Mip, można wykazać przez porównanie zakażalności czyppików chorobotwórczych w hodowli komórkowej w obecności i w nieobecności makrclidów, np. stosując sposoby opisane przez Lundemose i in., Mol. Microbiol. (1993) 7: 777.

X. Przewlekłe odrzucenie alnprzeszccepu

Nerki męskich osobników szczurów DA (RTU) przeszczepia się ortotopowo do męskich osobników biorców Lewis (RT1¹). Ogółem dokonuje się przeszczepów u 24 zwierząt. Wszystkie zwierzęta leczy się cyklosporyną A doustnie dawką 7,5 mg/kg/dzień przez 14 dni, caccynająe od dnia, w którym dokonano przeszczepu, aby zapobiec ostremu odrzuceniu komórkowemu. Nie dokonuje się przeeiwstroppego wycinania nerek. Każda grupa doświadczalna, leczona różnymi dawkami danego związku o ogólnym wzorze 1 lub środkiem piedciałąjąeym (placebo), składa się z sześciu zwierząt. Zaczynając od dnia 53-64 po dokonaniu pioescczeru leczy się zwierzęta będące biorcami doustnie przez dalsze 69-72 dni związkami o ogólnym wzorze 1 lub otrzymują one placebo. W dniu 14 po dokonaniu przeszczepu zwierzęta poddaje się ocenie przeszczepów przez uzyskiwanie obrazów metodą rezonansu magnetycznego (MRI) z pomiarami perfuzji nerek (porównując przeszczepione nerki z własnymi nerkami rrzeciwstronpymi). Powtarza się to w dniach 53-64 po dokonaniu przeszczepu oraz na zakończenie doświadczeń. Następnie dokonuje się sekcji zwłok zwierząt. Oznacza się i analizuje statystycznie parametry odrzutu, takie jak punktacja MRI, względna prędkość perfuzji przeszczepionych nerek oraz punktacja histologiczna alopęcescezerów nerek pod względem odrzutu komórkowego i zmian naczyniowych. Podawanie związków o ogólnym wzorze 1, np. związków z przykładu I lub II, w dawkach od 0,5 do 2,5 mg/kg, powoduje w tym modelu alopęcescccerów nerek szczurzych obniżenie wartości wszystkich wyżej wymienionych parametrów odrzutu.

XI. Plastyka naczynia

W dniu 0 wykonuje się cewnikowanie z balonikiem, w zasadzie tak, jak to opisują Powell i in. (1989). W stanie znieczulenia ioofluorapem wprowadza się cewnik Pogardy 2F do lewej tętnicy szyjnej wspólnej przez zewnętrzną tętnicę szyjną i nadyma (rozdęcie wynosi około 0,01 cm3 ^O). Nadęty balonik wycofuje się wzdłuż długości wspólnej tętnicy szyjnej trzykrotnie, przy czym dwa ostatnie razy ostrożnie obracając w celu uzyskania jednorodnego usunięcia śródnabłonka (deendotelialioaeąi). Następnie cewnik usuwa się, umieszcza podwiązkę wokół zewnętrznej tętnicy szyjnej, aby zapobiec krwawieniu i pozwala zwierzętom wyzdrowieć.

Do badań używa się 2 grupy po 12 szczurów RoRo (masa ciała 400 g, w wieku około 24 tygodni); jedna z nich stanowi grupę kontrolną a drugiej podaje się badany związek. Szczury dobiera się całkowicie losowo podczas manipulacji, postępowania doświadczalnego i analizy.

Związki, które mają być badane, podaje się doustnie (odżywianie przez zgłębnik), zaczynając 3 dni przed uszkodzeniem wywołanym balonikiem (dzień -3), aż do końca badań, 14 dni po uszkodzeniu wywołanym balonikiem (dzień +14). Szczury przetrzymuje się w osobnych klatkach i pozwala im żerować i pić wodę do woli. Następnie szczury te znieczula się icofluorapem, wprowadza cewnik do perfuzji przez lewą komorę i zamocowuje w łuku aorty oraz wprowadza kaniulę do zasysania do prawej komory. Zwierzęta poddaje się perfuzji pod ciśnieniem perfuzji, wynoszącym 150 mmHg, najpierw w ciągu 1 min 0,1 M roztworem soli buforowanym fosforanem (PBS, pH 7,4), a następnie w ciągu 15 min 2% aldehydem glutarowym w buforowym roztworze fosforanowym (pH 7,4). Ciśnienie perfuzji wynosi 150 mmHg na końcu kaniuli (około 100 mmHg w tętnicy szyjnej, ozpaecope we wstępnych doświadczeniach przez wprowadzanie kaniuli, przyłączonej do przetwornika ciśnienia, do zewnętrznej

184 731 tętnicy szyjnej). Następnie tętnice szyjne wycina się, oddziela od otaczającej ją tkanki i zanurza w 0,1 M kakodylanowym roztworze buforowym (pH 7,4), zawierającym 7% sacharozy, inkubuje przez noc w 4°C. Następnego dnia te tętnice szyjne zanurza się w 0,05% KMnO₄w 0,1 M kakodylanie i wstrząsa przez 1 godz. w pokojowej temperaturze. Następnie tkanki te odwadnia się w stopniowej serii etanolowej: 2x10 min w 75%, 2x10 min w 85%, 3x10 min w 95% i 3 x 10 min w 100% etanolu. Odwodnione tętnice osadza się następnie w Technovit 7100 według zaleceń wytwórcy. Osadzające podłoże pozostawia się na noc do polimeryzacji w eksykatorze w atmosferze argonu, ponieważ stwierdzono, że tlen powstrzymuje odpowiednie twardnienie bloków.

Ze środkowej części każdej tętnicy szyjnej wycina się skrawki o grubości 1-2 pm przy użyciu twardego noża metalowego zamontowanego na obrotowym mikrotomie i barwi przez min barwnikiem Giemsy. W ten sposób przygotowuje się około 5 skrawków z każdej tętnicy szyjnej i oszacowuje się morfometrycznie powierzchnię przekroju podłoża, nowej błony wewnętrznej i światła tętnicy z wykorzystaniem układu analizy obrazów (MCID, Toronto, Kanada). W próbie tej związki o ogólnym wzorze 1, np. związki z przykładu I lub II, powstrzymują rozrost mięśniowej błony wewnętrznej, jeśli podaje się je doustnie w dziennych dawkach od 0,5 do 2,5 mg/kg.

Związki o ogólnym wzorze 1 są również użyteczne w próbach wykrywania obecności lub określania ilości związków wiążących makrofilinę, np. w porównawczych próbach dla celów diagnostycznych lub badań przesiewowych. Dzięki temu w innym rozwiązaniu niniejszy wynalazek umożliwia zastosowanie związków o ogólnym wzorze 1 jako narzędzia przesiewowego do określania obecności związków wiążących makrofilinę w badanych roztworach, np. we krwi, surowicy krwi, albo bulionach testowych, które mają być poddawane badaniom przesiewowym. Korzystnie związki o ogólnym wzorze 1 unieruchamia się we wgłębieniach płytek do mikromiareczkowania, a następnie umożliwia wiązanie ze znakowaną makrofiliną-12 (FKBP-12) w obecności i w nieobecności badanych roztworów. Alternatywnie unieruchamia się FKBP-12 we wgłębieniach płytek do mikromiareczkowania i umożliwia wiązanie, w obecności i w nieobecności badanych roztworów, ze związkami o ogólnym wzorze 1, które są znakowane fluroscencyjnie, enzymatycznie lub radioznacznikiem, np. związkami o ogólnym wzorze 1, w których R_J zawiera grupy znakujące. Płytki przemywa się i mierzy ilość związanego związku znakowanego. Ilość substancji wiążącej makrofilinę w badanym roztworze jest zgrubsza odwrotnie proporcjonalna do ilości związanego związku znakowanego. Dla celów analizy ilościowej sporządza się wzorcowe krzywe związania, stosując znane stężenia związków wiążących makrofilinę.

Związki o ogólnym wzorze 1 są więc użyteczne w następujących okolicznościach:

a) Leczenie i zapobieganie w przypadku ostrego lub przewlekłego odrzutu przeszczepu organu lub tkanki, np. w leczeniu biorców przeszczepów np. serca, płuc, połączeń płucoserce, wątroby, nerek, trzustki, skóry lub rogówki. Są one także wskazane do zapobiegania reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, jak np. w następstwie przeszczepu szpiku kostnego.

b) Leczenie i zapobieganie w przypadku chorób naczyniowych, np. miażdżycy tętnic.

c) Leczenie i zapobieganie w przypadku rozrostu i migracji komórek mięśni gładkich, prowadzących do zgrubienia błon wewnętrznych naczyń, zatkania naczyń krwionośnych, zatykającej wieńcowej miażdżycy tętnic, nawrotów zwężenia.

d) Leczenie i zapobieganie w przypadku choroby autoagresyjnej i stanów zapalnych, zwłaszcza stanów zapalnych z etiologią obejmującą składniki autoimmunizacyjne, takich jak zapalenie stawów (np. reumatoidalne zapalenie stawów, przewlekły postępujący gościec stawowy i zapalenie stawów zniekształcające) oraz ostry gościec stawowy. Specyficzne choroby autoagresyjne, w przypadku których można stosować związki o ogólnym wzorze 1, obejmują autoimmunizacyjne zaburzenia hematologiczne (w tym np. niedokrwistość hemolityczną, niedokrwistość aplastyczną, anemię czystych krwinek czerwonych i małopłytkowość samoistną), liszaj rumieniowaty układowy, zapalenie wielochrząstkowe, stwardnienie tkanki (obrzęk twardzinowy), ziarniniak Wegenera, zapalenie skórno-mięśniowe, przewlekłe aktywne zapalenie

184 731 wątroby, ciężkie osłabienie mięśni, łuszczycę, zespół Stevena-Johnsona, psylozę samoistną, autoimmunizacyjne choroby zapalne jelit (w tym np. zapalenie okrężnicy wrzodziejące i chorobę Crohna), wytrzeszcz w chorobie Basedowa, chorobę Gravesa, sarkoidozę, stwardnienie rozsiane, marskość wątroby zastoinową, cukrzycę młodzieńczą (cukrzycę typu I), zapalenie błony naczyniowej oka (przedniego odcinka i tylnego odcinka oka), zapalenie rogówki i spojówki suche oraz wiosenne zapalenie rogówki i spojówki, śródmiąższowe zwłóknienie płuc, atropatię łuszczycową, zapalenie kłębuszków nerkowych (z zespołem nerczycowym lub bez niego, np. obejmujące samoistny zespół nerczycowy lub nefropatię z minimalnymi zmianami) oraz młodzieńcze zapalenie skórno-mięśniowe.

e) Leczenie i zapobieganie w przypadku astmy.

f) Leczenie oporności wielolekowej (MDR). Związki o ogólnym wzorze 1 powstrzymują P-glikoproteidy (Pgp), które stanowią cząsteczki transportu przez błonę, związane z MDR. MDR stanowi szczególny problem u pacjentów z rakiem i u pacjentów chorych na AIDS, którzy nie będą reagowali na powszechnie stosowaną chemioterapię, gdyż leki są wypompowywane z komórek przez Pgp. Związki o ogólnym wzorze 1 nadają się więc do podwyższania skuteczności działania innych środków chemioterapeutycznych w leczeniu i zwalczaniu stanów oporności wielolekowej, takich jak oporny wielolekowo rak lub oporny wielolekowo AIDS.

g) Leczenie zaburzeń rozrostowych, np. nowotworów, nadrozrostowych zaburzeń skóry itp.

h) Leczenie zakażeń grzybiczych.

i) Leczenie i zapobieganie w przypadku zapaleń, zwłaszcza przez wzmaganie działania steroidów.

j) Leczenie i zapobieganie w przypadku zakażeń, zwłaszcza zakażeń wywołanych czynnikami chorobotwórczymi, zawierającymi czynniki Mip lub podobne do Mip.

Dawki wymagane przy powyższych wskazaniach będą się oczywiście różniły, np. w zależności od stanu, który ma być leczony (np. od rodzaju choroby i charakteru oporności), pożądanego skutku i sposobu podawania. Zazwyczaj jednak zadowalające wyniki uzyskuje się przy podawaniu doustnym w dawkach rzędu od 0,05 do 5 lub do 10 mg/kg/dzień, np. od 0,1 do 2 lub do 7,5 mg/kg/dzień, podawanych jednorazowo lub w dawkach podzielonych od 2 do 4 razy dziennie, albo przy podawaniu pozajelitowym, np. dożylnym, np. przez dożylne wkraplanie lub wlew dożylny, w dawkach rzędu od 0,01 do 2,5 lub do 5 mg/kg/dzień, np. rzędu od 0,05 lub 0,1 do 1,0 mg/kg/dzień. Odpowiednie dzienne dawki dla pacjentów są więc rzędu do 500 mg przy podawaniu doustnym, np. rzędu od 5 do 100 mg podawanych doustnie, albo rzędu od 0,5 do 125 lub do 250 mg przy podawaniu dożylnym, np. rzędu od 2,5 do 50 mg podawanych dożylnie.

Alternatywnie i nawet korzystniej dawkowanie ustala się w specjalny sposób dla pacjenta, aby zapewnić z góry określone dolne poziomy we krwi, np. określa się je metodą RIA. Dawkowanie można dopasować do pacjenta w ten sposób, aby uzyskiwać regularne początkowe poziomy we krwi, mierzone metodą RIA, przynajmniej rzędu od 50 do 150, aż do 500 lub 1000 ng/cm3, tj. analogicznie jak w sposobach dozowania w obecnie stosowanym leczeniu immunologicznym cyklosporynami.

Związki o ogólnym wzorze 1 można podawać jako samodzielne czynne składniki, albo razem z innymi lekami. Na przykład w zastosowaniach immunosupresyjnych, takich jak zapobieganie i leczenie w przypadku reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi, odrzutu przeszczepu albo choroby autoimmunizacyjnej, związki o ogólnym wzorze 1 można stosować w połączeniu z cyklosporynami lub askomycynami, albo ich immunosupresyjnymi analogami, np. cyklosporyną A, cyklosporyną G, FK-506 itd.; z kortykosteroidami; z cyklofosfamidem; z azatiopiryną; z metotreksatem; z brekwinarem; z leflunomidem; z mizorybiną; z kwasem mykofenolowym; z mykofenolanem mofetilu; z immunosupresyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi, np. monoklonalnymi przeciwciałami przeciw receptorom leukocytów, np. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, CTLA4, B7, CD45 lub CD58 albo ich ligandami; bądź też z innymi związkami immunosupresyjnymi.

184 731

W zastosowaniach przeciwzapalnych związki o ogólnym wzorze 1 można stosować wraz ze środkami przeciwzapalnymi, np. kortykosteroidami. W zastosowaniach przeciwzakaźnych związki o ogólnym wzorze 1 można stosować w połączeniu z innymi środkami przeciwzakaźnymi, np. lekami przeciwwirusowymi lub antybiotykami.

Związki o ogólnym wzorze 1 podaje się dowolnym powszechnie stosowanym sposobem, zwłaszcza dojelitowo, np. doustnie, np. w postaci roztworów do picia, tabletek lub kapsułek, albo pozajelitowo, np. w postaci roztworów lub zawiesin do wstrzykiwania. Odpowiednie postacie dawek jednostkowych do podawania doustnego zawierają np. od 1 do 50 mg związku o wzorze 1, zwykle od 1 do 10 mg. Farmaceutyczne kompozycje, zawierające związki o ogólnym wzorze 1, można wytwarzać powszechnie stosowanymi sposobami, np. analogicznie jak farmaceutyczne kompozycje zawierające rapamycynę, jak to opisano np. w EPA 0 041 795.

Farmaceutyczne kompozycje korzystnie zawierają związki o ogólnym wzorze 1 i podłoże nośnikowe, które zawiera fazę hydrofitową fazę lipofilną i środek powierzchniowo czynny. Mogą one występować w postaci pierwotnych koncentratów emulsji lub mikroemulsji. Takie pierwotne koncentraty emulsji lub mikroemulsji ujawniono np. w zgłoszeniu patentowym Wielkiej Brytanii 2 278 780A. Faza lipofilną korzystnie zawiera od 10 do 85% wagowych podłoża nośnikowego; środek powierzchniowo czynny korzystnie zawiera od 5 do 80% wagowych podłoża nośnikowego; faza hydrofitowa korzystnie zawiera od 10 do 50% wagowych podłoża nośnikowego. Związki o ogólnym wzorze 1 korzystnie występują w ilościach od 2 do 15% wagowych.

Szczególnie korzystne kompozycje farmaceutyczne zawierają podłoża nośnikowe pierwotnych koncentratów mikroemulsji, zawierające

1) produkt reakcji oleju rycynowego i tlenku etylenu,

2) produkt transektryfikacji oleju roślinnego i glicernnni zawierający głównie jedno-, dwu- i trójglicerydy kwasu linolowego lub kwasu oleinowego, albo polioksyalkilowann olej roślinny,

C) glikol 1,2-propylenowy i

4) etanol.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że związki o ogólnym wzorze 1, w których X oznacza OH, tj. 32(S)-dwuwoyorozwiązki, wykazują wzmożone działanie, w tym również w wyżej przedstawionych próbach oraz, że są bardziej trwałe od odpowiadających im enancjomerów, tj. 32(R)-ywuwoyorozwiązków. Stwierdzono to, np. w następującej próbie:

Związki podlegające badaniu inkubowano w szczurzej surowicy krwi i następnie, w próbie MBA po różnych okresach inkubacji, mierzono powinowactwo do wiązania FKPB12. Zmniejszeniu powinowactwa, towarzyszy wzrost nominalnej wartości IC₅₀. Obniżenie więc powinowactwa wskazuje na nietrwałość danego związku w szczurzej surowicy krwi.

Claims

1. Pochodne rapamycyny o ogólnym wzorze 1, w którym

R, oznacza C₃__)Oalkinyl lub C^^hydroksyalkinyl,

R oznacza resztą o wzorze 2, w którym

R jest wybrany spośród H, C,_-alkilu, C,_₆hydroksyalkilu lub alkoksyC,_₆alkilu,

R₄ oznacza H lub metyl,

Y oznacza O, zaś X oznacza OH.

2. Pochodne rapamycyny o ogólnym wzorze 1, w którym

R, oznacza R^alki!, Ci₁₍₎alkinyllub C₃__K)hydiOksyalkinyl,

R2 oznacza resztę o wzorze 2, w którym

R₃jest wybrany spośród H, C^alkilu, C^hydroksyalkilu lubC^alkoksyC^alkilu,

R4 oznacza H lub metyl,

Y oznacza O, zaś X oznacza H.

C. Pochodne rapamycyny o ogólnym wzorze la, w którym

R, oznacza Cc_₁₍₎alk-2-inyl lub C₃__lθhnyroksnalk-2-innl,

R oznacza resztą o wzorze 2, w którym

R jest wybrany spośród H, C^alkilu, C,_6hydroksyalkilu lub alkoksyC,-.alkilu,

R4 oznacza H lub metyl, zaś Y oznacza O.

4. Pochodne rapamycyny o wzorze lb, w którym

R, oznacza C,_,_oalkil, Cc_lθalk-2-innl lub Cc_lθhndroksnalk-2-innl,

R oznacza resztę o wzorze 2, w którym

R3 jest wybrany spośród H, ^.alkilu, C^hydroksydkilu lub R-alkoksyC,-alkilu,

R4 oznacza H albo metyl, zaś Y oznacza O.

5. Pochodna rapamycynn, którąjest 16-pent-2-ynyloksy-32(S)-dwuwodororapamncnna albo 16-pent-2-ynyloksy-C2(S)-dwuwoyoro-40-O-(2-hnyroksnetylo)-rapamncn'na.

6. Pochodna rapamncynn, którą jest C2-yezoksorapamycyna albo ló-pent^-ynyloksy-C2-dezoksorapamycyna.

7. Zastosowanie pochodnych rapamncnnn określonych w zastrz. 1, Ci 6 jako farmaceutyków.

8. Zastosowanie pochodnych rapamncnnn określonych w zastrz. 2, 4 i 5 jako farmaceutyków.

9. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość związku określonego w zastrz. 1, C i 6 wraz z farmaceutycznie tolerowanymi rozcieńczalnikami lub nośnikami.

10. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera terapeutycznie skuteczną ilość związku określonego w zastrz. 2, 4 i 5 wraz z farmaceutycznie tolerowanymi rozcieńczalnikami lub nośnikami.

11. Zastosowanie związków określonych w zastrz. 1, C i 6 do połączeń z lekami stanowiącymi środki immunosupresyjne lub immunomodulacyjne albo środki przeciwzapalne lub przeciwzakaźne.

12. Zastosowanie związków określonych w zastrz. 2, 4 i 5 do połączeń z lekami stanowiącymi środki immunosupresyjne lub immunomodulacyjne albo środki przeciwzapalne lub przeciwzakaźne.