PL193672B1 - Sposób wytwarzania zawiesiny fosfolipidów - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania zawiesiny fosfolipidów, znamienny tym, ze: (1) wytwarza sie mieszanine lipidów sposobem polegajacym na tym, ze (a) co najmniej dwa lipidy kontaktuje sie z pierwszym niewodnym rozpuszczalnikiem; (b) otrzymany roztwór zateza sie do gestego zelu; (c) gesty zel kontaktuje sie z drugim niewodnym rozpuszczalnikiem; oraz (d) zbiera sie otrzymana substancje stala; (2) wytworzona mieszanine lipidów kontaktuje sie z trzecim niewodnym rozpuszczalnikiem, przy czym mieszanina lipidów rozpuszcza sie w trzecim niewodnym rozpuszczalniku; oraz (3) roztwór z etapu (2) kontaktuje sie z roztworem wodnym, z wytworzeniem zawiesiny lipidów. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zawiesiny fosfolipidów. Zawiesina ta jest użyteczna jako ultrasonograficzny środek kontrastujący.

Wytwarzanie fosfolipidowego środka kontrastującego można podzielić na następujące etapy:

(1) wytwarzanie mieszaniny lipidów; (2) sporządzanie roztworu podstawowego, obejmujące hydratację i dyspergowanie mieszaniny lipidów w zasadniczo wodnym roztworze, z wytworzeniem zawiesiny lipidów; (3) filtrację roztworu podstawowego przez filtr(y) sterylizujący(e), aby usunąć z zawiesiny zanieczyszczenia bakteryjne; (4) przeniesienie jałowej zawiesiny do poszczególnych fiolek w kontrolowanym środowisku aseptycznym; (5) umieszczenie przygotowanych fiolek w komorze liofilizacyjnej w celu zastąpienia gazu nad zawiesiną we fiolkach gazowym perfluoropropanem (PFP); (6) przeniesienie zamkniętych fiolek po wymianie gazu do autoklawu w celu końcowej sterylizacji. W tym procesie pojawiają się następujące główne problemy: (1) jednorodność mieszaniny lipidów; (2) hydratacja mieszaniny lipidów; (3) jednorodność i wielkość cząsteczek zawiesiny; oraz (4) sterylizacja przez filtrację przez filtr(y) sterylizujący(e).

Mieszaniny fosfolipidów zazwyczaj wytwarza się przez rozpuszczenie lub zawieszenie wymaganych fosfolipidów w odpowiednim układzie rozpuszczalników wodnych lub niewodnych, a następnie zmniejszenie ich objętości przez liofilizację lub destylację. W idealnej sytuacji takim sposobem wytwarza się mieszaniny substancji stałych o wysokiej jednorodności i czystości. Jednakże podczas gdy takie podejście dobrze sprawdza się w pracy na małą skalę laboratoryjną, często stwarza ono problemy przy zwiększaniu skali do ilości wytwarzanych w skali przemysłowej. Problemy obejmują:

(1) utrzymanie jednorodności podczas etapu usuwania rozpuszczalnika (ze względu na różnice w rozpuszczalności); (2) utrzymanie czystości (częsty problem przy stosowaniu wody ze względu na hydrolityczne reakcje uboczne); (3) podwyższanie czystości; (4)zmniejszanieobjętości rozpuszczalnika oraz (5) odzyskanie końcowej substancji stałej (np. nie jest praktyczne zdrapywanie substancji stałej z dużego reaktora).

Po wytworzeniu mieszaniny lipidów końcowa operacja zazwyczaj obejmuje wprowadzenie mieszaniny do roztworu wodnego. Fosfolipidy są hydrofobowe i nie rozpuszczają się łatwo w wodzie, toteż dodanie fosfolipidów lub mieszaniny lipidów bezpośrednio do roztworu wodnego powoduje, że proszek lipidowy ulega agregacji tworząc skupiska, które bardzo trudno jest rozproszyć. Zatem proces hydratacji nie może być kontrolowany w rozsądnym okresie czasu. Bezpośrednia hydratacja fosfolipidów lub mieszaniny lipidów w roztworze wodnym powoduje powstanie mętnej zawiesiny o wielkości cząstek 0,6 mm - 100 mm. Ze względu na stosunkowo duży rozrzut wielkości cząstek zawiesiny nie można jej filtrować w temperaturze otoczenia, gdy temperatura roztworu zawiesiny jest niższa od temperatury przejścia lipidów z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną. Lipidy będą gromadzić się w filtrach, co spowoduje ograniczenie szybkości przepływu, a w większości przypadków filtry zostaną wkrótce potem całkowicie zablokowane. Zmniejszenia wielkości cząstek zawiesiny nie można osiągnąć z zastosowaniem znanych sposobów periodycznych, nawet po wydłużonym mieszaniu (np. 6 godzin) w podwyższonej temperaturze (np. 40°C - 80°C) z użyciem typowego mieszadła śmigłowego.

Choć możliwa jest filtracja w podwyższonej temperaturze, to jest w temperaturze powyżej temperatury przejścia fazowego lipidów, nadal będzie eliminowana znaczna ilość większych cząstek lipidowych przy filtracji pod normalnym ciśnieniem. Ponadto jałowy filtrat po zatężeniu będzie miałz partii na partię zmienną zawartość lipidów, zależnie od tego, jak lipidy były początkowo hydratowane, co z kolei zależy od właściwości fizycznych, np. morfologii, materiałów wyjściowych.

Trudne i kosztowne może być zwiększenie skali procesu bezpośredniej hydratacji lipidów lub mieszaniny lipidów w celu wytworzenia jednorodnej zawiesiny oraz filtracji zawiesiny przez filtr(y) sterylizujący(e), do skali przemysłowej, np. > 20 litrów.

W publikacji WO 95/32006 ujawniono napełnione gazem mikrosfery jako środki kontrastujące do obrazowania w tomografii komputerowej oraz sposób ich wytwarzania z gazu i/lub prekursora gazowego oraz jednego lub większej liczby związków stabilizujących. W publikacji tej ujawniono ponadto sposób diagnozowania chorej tkanki, sposób obrazowania obszaru wewnętrznego u pacjenta oraz sposób wytwarzania in situw tkance pacjenta kontrastu do tomografii komputerowej.

W publikacji WO 96/31196 ujawniono kompozycje zawierające w wodnym nośniku lipid i materiał zdolny do stabilizowania tych kompozycji, zasocjowany niekowalencyjne z lipidem i obecny w ilości wystarczającej do utworzenia powłoki wokół lipidu ale nie takiej aby zwiększyć lepkość kompozycji.

PL 193 672 B1

Kompozycje te znajdują zastosowanie zwłaszcza w diagnostyce, w tym do ultradźwięków, przy czym mogą one mieć postać miceli i liposomów.

W publikacji EP 349429 ujawniono sposób wytwarzania dyspergowalnych układów koloidalnych lipidów amfifilowych w postaci submikronowych liposomów.

Zatem celem wynalazku było opracowanie sposobu wytwarzania zawiesiny fosfolipidów z mieszaniny lipidów, umożliwiającego rozwiązanie powyższych problemów dzięki dostarczeniu praktycznego sposobu, który można łatwo realizować w większej skali i dostosować do różnych warunków produkcji bez znacznej modyfikacji lub dostosowywania istniejącego wyposażenia.

Cel ten osiągnięto dzięki odkryciu, że poprzez rozpuszczenie mieszaniny lipidów w odpowiednim niewodnym rozpuszczalniku przed wprowadzeniem do roztworu wodnego można wytwarzać zawiesiny fosfolipidów.

Zatem wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania zawiesiny fosfolipidów, polegającego na tym, że (1) wytwarza się mieszaninę lipidów sposobem polegającym na tym, że (a) co najmniej dwa lipidy kontaktuje się z pierwszym niewodnym rozpuszczalnikiem;

(b) otrzymany roztwór zatęża się do gęstego żelu;

(c) gęsty żel kontaktuje się z drugim niewodnym rozpuszczalnikiem; oraz (d) zbiera się otrzymaną substancję stałą;

(2) wytworzoną mieszaninę lipidów kontaktuje się z trzecim niewodnym rozpuszczalnikiem, przy czym mieszanina lipidów rozpuszcza się w trzecim niewodnym rozpuszczalniku; oraz (3) roztwór z etapu (2) kontaktuje się z roztworem wodnym, z wytworzeniem zawiesiny lipidów. W korzystnej postaci w etapie (a) jako lipidy stosuje się:

(i) 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholinę;

(ii) sól monosodową kwasu 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydowego; oraz (iii) sól monosodową N-(metoksypolioksyetyleno(5000)karbamoilo)-1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloaminy.

W innej korzystnej postaci w etapie (a) pierwszy niewodny rozpuszczalnik stanowi mieszanina metanolu i toluenu.

W jeszcze innej korzystnej postaci w etapie (c) drugi niewodny rozpuszczalnik stanowi eter metylowo-t-butylowy.

W jeszcze innej korzystnej postaci w etapie (a) roztwór ogrzewa się do temperatury wystarczającej do całkowitego rozpuszczenia się lipidów w rozpuszczalniku, korzystniej do temperatury około 25-75°C.

W jeszcze innej korzystnej postaci w etapie (d) substancję stałą przemywa się eterem metylowo-t-butyowym i suszy pod próżnią.

W korzystnej postaci trzeci niewodny rozpuszczalnik jest wybrany z grupy obejmującej glikol propylenowy, glikol etylenowy i glikol polietylenowy 300, korzystniej trzeci niewodny rozpuszczalnik stanowi glikol propylenowy.

W jeszcze innej korzystnej postaci trzeci niewodny rozpuszczalnik ogrzewa się do temperatury około 30-70°C przed kontaktowaniem z mieszaniną lipidów, korzystniej do temperatury około 50-55°C.

W innej korzystnej postaci, stosunek mieszaniny lipidów do trzeciego niewodnego rozpuszczalnika wynosi od około 5 mg mieszaniny lipidów na ml niewodnego rozpuszczalnika do około 15 mg/ml, korzystniej około 10 mg/ml.

W innej korzystnej postaci w etapie (2) roztwór wodny jest wybrany z grupy obejmującej wodę, roztwór soli fizjologicznej, mieszaninę roztwór soli fizjologicznej/gliceryna oraz mieszaninę roztwór soli/gliceryna/niewodny rozpuszczalnik, korzystniej wodny roztwór stanowi mieszanina roztworu soli fizjologicznej i gliceryny lub mieszanina roztworu soli fizjologicznej, gliceryny i glikolu propylenowego.

W innej korzystniejszej postaci, stężenie chlorku sodu wynosi 6,8 mg/ml, gliceryny 0,1 ml/ml, glikolu propylenowego 0,1 ml/ml, a mieszaniny lipidów około 0,75 do 1,0 mg/ml, korzystniej stężenie mieszaniny lipidów wynosi 0,75 mg/ml lub 1,0 mg/ml.

W jeszcze innej korzystnej postaci w etapie (2) roztwór wodny ogrzewa się do temperatury około 45-60°C przed kontaktowaniem z mieszaniną z etapu (1), korzystniej do temperatury około 50-55°C.

W korzystnej postaci sposób ponadto polega na tym, że (3) zawiesinę lipidów z etapu (2) ogrzewa się do temperatury w przybliżeniu równej lub wyższej niż najwyższa temperatura przejścia lipidów obecnych w zawiesinie z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną, korzystniej w etapie (3) zawiesinę lipidów ogrzewa się do temperatury co najmniej około 67°C.

PL 193 672 B1

W innej korzystniejszej postaci sposób ponadto polega na tym, że (4) zawiesinę lipidów filtruje się przez filtr sterylizujący.

W innej korzystniejszej postaci w etapie (4) filtrację prowadzi się z użyciem dwóch sterylizujących wkładów filtrujących, jeszcze korzystniej w etapie (4) sterylizujące wkłady filtrujące są w temperaturze od około 70 do 80°C.

W innej kolejnej korzystnej postaci w etapie (4) stosuje się 0,2 mm filtry hydrofilowe.

W innej jeszcze korzystniejszej postaci sposób ponadto polega na tym, że (5) przefiltrowaną zawiesinę z etapu (4) przenosi się do fiolki.

W innej kolejnej korzystnej postaci sposób ponadto polega na tym, że (6) wymienia się gaz nad zawiesiną we fiolce z etapu (5) na gazowy związek perfluorowęglowodorowy.

W innej jeszcze korzystniejszej postaci jako gazowy związek perfluorowęglowodorowy stosuje się gazowy perfluoropropan.

W innej jeszcze korzystniejszej postaci wymianę gazu przeprowadza się w komorze liofilizacyjnej.

W innej jeszcze korzystniejszej postaci sposób ponadto polega na tym, że (7) sterylizuje się fiolkę z etapu (6), korzystniej w około 126-130°C przez 1-10 minut.

Wynalazek można realizować co najmniej w skali wielu gramów, kilogramów, wielu kilogramów lub w skali przemysłowej. Stosowane tutaj określenie skala wielu gramów oznacza korzystnie skalę, w której co najmniej jeden materiał wyjściowy stosuje się w ilości 10 g lub więcej, korzystniej co najmniej 50 g lub więcej, jeszcze korzystniej w ilości co najmniej 100 g lub więcej. Stosowane tutaj określenie skala wielu kilogramów oznacza skalę, w której stosuje się więcej niż 1 kilogram co najmniej jednego materiału wyjściowego. Stosowane tutaj określenie skala przemysłowa oznacza skalę inną niż laboratoryjna, wystarczającą do dostarczenia produktu w ilości wystarczającej do testów klinicznych albo rozprowadzania wśród użytkowników.

Stosowane tutaj określenia mieszanina lipidów lub mieszanina fosfolipidów oznaczają, że zostały zmieszane dwa lub większa liczba lipidów. Mieszanina lipidów jest zazwyczaj w postaci proszku. Korzystnie co najmniej jeden z lipidów jest fosfolipidem. Korzystnie mieszanina lipidów zawiera 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholinę (DPPC), sól monosodową kwasu 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydowego (DPPA) i sól monosodową N-(metoksypolioksyetyleno(5000)karbamoilo)-1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloaminy (MPEG5000-DPPE). Ilość każdego z lipidów obecna w mieszaninie będzie zależeć od żądanego produktu końcowego. Korzystne udziały każdego z lipidów podano w części z przykładami. W sposobie według wynalazku można także stosować wiele różnych innych lipidów, takich jak opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5469854 (Unger i inni), którego treść przytoczono tutaj jako odnośnik.

Stosowane tutaj określenie fosfolipid oznacza substancję tłuszczową zawierającą jeden lub większą liczbę olejowych (hydrofobowych) łańcuchów węglowodorowych z polarnymi (hydrofilowmi) fosforanowymi grupami końcowymi. Fosfolipidy są amfifilowe. Samorzutnie tworzą one granice i zamknięte pęcherzyki w roztworach wodnych. Fosfolipidy stanowią około 50% masy zwierzęcej błony komórkowej.

Wytwarzanie mieszaniny lipidów.

Mieszaninę lipidów można wytworzyć z użyciem wody w operacji suspendowania-liofilizacji albo w rozpuszczalniku organicznym w operacji rozpuszczania-wytrącania z użyciem rozpuszczalników organicznych. W operacji suspendowania-liofilizacji z użyciem wody żądane lipidy przeprowadza się w stan zawiesiny w wodzie w podwyższonej temperaturze, a następnie zawiesinę zatęża przez liofilizację. Korzystnie stosuje się operację rozpuszczania.

Etap (a)

Operacja rozpuszczania-wytrącania w rozpuszczalnikach organicznych polega na kontaktowaniu żądanych lipidów (np. DPPA, DPPC i MPEG5000 DPPE) z pierwszym układem niewodnych rozpuszczalników. Układ ten zazwyczaj stanowi mieszaninę rozpuszczalników, np. CHCl3/MeOH, CH2Cl2/MeOH oraz toluen/MeOH. Korzystnie pierwszy niewodny rozpuszczalnik stanowi mieszanina toluenu i metanolu. Celowe może być ogrzanie roztworu lipidów do temperatury wymaganej do osiągnięcia całkowitego rozpuszczenia. Taka temperatura korzystnie wynosi około 25-75°C, korzystniej około 35-65°C.

Po rozpuszczeniu celowe może być usunięcie nierozpuszczonej obcej substancji przez filtrację na gorąco lub ochłodzenie do temperatury otoczenia, a następnie filtrację. Można stosować znane sposoby filtracji (np. filtrację grawitacyjną, filtrację próżniową lub filtrację ciśnieniową).

PL 193 672 B1

Etap (b)

Następnie roztwór zatęża się do gęstego żelu/substancji półstałej. Zatężanie korzystnie prowadzi się drogą destylacji i próżniowej. Można także stosować inne sposoby zatężania roztworu, np. z użyciem wyparki obrotowej. Temperatura w tym etapie korzystnie wynosi około 20-60°C, korzystniej 30-50°C.

Etap (c)

Następnie gęsty żel/substancję półstałą rozpuszcza się w drugim niewodnym rozpuszczalniku. Mieszaninę korzystnie przeprowadza się w zawiesinę w temperaturze otoczenia (np. 15-30°C). Użytecznymi drugimi niewodnymi rozpuszczalnikami są takie, które powodują wytrącanie lipidów z przefiltrowanego roztworu. Korzystnym drugim niewodnym rozpuszczalnikiem jest eter metylowo-t-butylowy (MTBE). Można także stosować inne etery lub alkohole.

Etap (d)

Następnie zbiera się substancję stałą powstałą po dodaniu drugiego niewodnego rozpuszczalnika. Korzystnie zebraną substancję stałą przemywa się nową porcją drugiego niewodnego rozpuszczalnika (np. MTBE). Substancję tę można zbierać drogą filtracji próżniowej lub odwirowania, korzystnie w temperaturze otoczenia. Po zebraniu korzystnie substancję stałą suszy się pod próżnią w temperaturze około 20-60°C.

Z następujących względów operacja rozpuszczania-wytrącania w rozpuszczalniku organicznym jest korzystniejsza od operacji suspendowania/liofilizacji z użyciem wody.

(1) Ze względu na to, że lipidy są całkowicie rozpuszczalne w toluenie/metanolu, objętość rozpuszczalnika jest znacznie mniejsza (w porównaniu z operacją z użyciem wody).

(2) Ze względu natę zwiększoną rozpuszczalność temperatura w tej operacji jest także niższa w porównaniu z operacją z użyciem wody, co zapobiega nietrwałości hydrolitycznej estrów kwasów tłuszczowych.

(3) Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej roztwór toluenowo/metanolowy lipidów pozostaje jednorodny, co umożliwia filtrację w temperaturze pokojowej w celu usunięcia obcej substancji stałej.

(4) Wytrącanie z użyciem MTBE pozwala na szybkie i łatwe wyodrębnienie mieszaniny lipidów w postaci substancji stałej. Natomiast w operacji z użyciem wody do wyodrębniania materiału stosuje się czasochłonny proces liofilizacji.

(5) Wytrącanie z użyciem MTBE pozwala także usunąć wszystkie zanieczyszczenia rozpuszczalne w MTBE, które przechodzą podczas filtracji do odpadowego strumienia filtratu. Ta możliwość usunięcia zanieczyszczeń nie jest wykorzystywana, gdy roztwór bezpośrednio zatęża się lub liofilizuje do substancji stałej.

(6) Niniejszy sposób dostarcza jednorodnych substancji stałych.

Wytwarzanie zawiesiny lipidów

Etap (1)

W etapie pierwszym mieszaninę lipidów kontaktuje się z niewodnym rozpuszczalnikiem, przy czym mieszanina lipidów zasadniczo rozpuszcza się w niewodnym rozpuszczalniku. Alternatywnie poszczególne lipidy można kolejno kontaktować z niewodnym rozpuszczalnikiem, w następującej kolejności: DPPC, DPPA i MPEG5000-DPPE; DPPC, MPEG5000-DPPE i DPPA; MPEG5000-DPPE, DPPA i DPPC; albo MPEG5000-DPPE, DPPC i DPPA. DPPA, która jest występującym w największej ilości oraz najsłabiej rozpuszczalnym z lipidów, nie dodaje się jako pierwszej. Dodanie jednego z innych lipidów przed lub równocześnie z DPPA ułatwia rozpuszczanie DPPA. Ponadto poszczególne lipidy można połączyć jako substancje stałe i mieszaninę substancji stałych kontaktować z niewodnym rozpuszczalnikiem.

Oznaką zasadniczego rozpuszczenia jest to, że mieszanina mieszaniny lipidów i niewodnego rozpuszczalnika staje się przejrzysta. Jak wspomniano powyżej, fosfolipidy ogólnie nie są rozpuszczalne w wodzie. Tak więc bezpośrednie wprowadzenie mieszaniny fosfolipidów do środowiska wodnego powoduje, że mieszanina lipidów ulega agregacji tworząc skupiska, które bardzo trudno jest rozproszyć. Wynalazek pozwala obejść to ograniczenie poprzez rozpuszczanie mieszaniny lipidów w niewodnym rozpuszczalniku przed wprowadzeniem jej do roztworu wodnego. Pozwala to równomiernie rozproszyć mieszaninę lipidów w cieczy. Dyspersję w cieczy można następnie wprowadzić do środowiska wodnego.

Niewodny lub niewodna oznacza odpowiednio rozpuszczalnik lub mieszaninę rozpuszczalników, w których ilość obecnej wody jest na tyle niska, że nie utrudnia ona rozpuszczania mieszaniny lipidów. Ilość wymaganego niewodnego rozpuszczalnika będzie zależeć od rozpuszczalności miesza6

PL 193 672 B1 niny lipidów oraz od wymaganego stężenia końcowego każdego ze składników. Dla fachowca jest zrozumiałe, że ilość wody obecnej w niewodnym rozpuszczalniku, którą można tolerować, będzie różnić się w zależności od rozpuszczalności w wodzie poszczególnych lipidów w mieszaninie lipidów. Im lepiej rozpuszczalne w wodzie są poszczególne fosfolipidy, tym większa ilość wody może być obecna w etapie (1). Korzystnie jako niewodny rozpuszczalnik stosuje się glikol propylenowy. Jednakże można stosować także inne rozpuszczalniki z grupy polioli, takie jak glikol etylenowy i glikol polietylenowy 300.

Dla osiągnięcia całkowitego rozpuszczenia może być konieczne mechaniczne mieszanie mieszaniny lipidów z niewodnym rozpuszczalnikiem. Fachowiec weźmie pod uwagę, że dostępnych jest wiele sposobów mieszania. Korzystne jest użycie homogenizatora o intensywnym ścinaniu.

Fachowiec weźmie pod uwagę, że podwyższenie temperatury rozpuszczalnika powinno sprzyjać rozpuszczaniu mieszaniny lipidów. Temperatura, w której można przeprowadzać etap (1), może być w zakresie od temperatury otoczenia do temperatury wrzenia wybranego rozpuszczalnika. Korzystnie temperatura wynosi od około 30 do około 70°C, korzystniej około 45 do około 60°C, jeszcze korzystniej około 50, 51, 52, 53, 54 lub 55°C. Gdy stosuje się glikol etylenowy lub glikol polietylenowy 300, korzystne jest aby temperatura wynosiła od około 50 do około 60°C, korzystniej około 55°C. Utrzymywanie roztworu w podwyższonej temperaturze powinno zmniejszyć lepkość roztworu oraz ułatwić formułowanie preparatu.

Korzystna jest następująca procedura rozpuszczania mieszaniny lipidów: (a) Dodaje się glikolu propylenowego do odpowiedniego naczynia wagowego, (b) Ogrzewa się glikol propylenowy do około 40-80°C w łaźni grzejnej. (c) Odważa się mieszaninę lipidów w osobnym naczyniu. (d) Przenosi się roztwór do pojemnika zawierającego mieszaninę lipidów, gdy glikol propylenowy osiągnie temperaturę w wymaganym zakresie. (e) Umieszcza się pojemnik z powrotem w łaźni grzejnej do czasu gdy roztwór będzie przejrzysty. (f) Mechanicznie miesza się roztwór mieszanina lipidów/glikol propylenowy, aby dalej zapewnić całkowite rozpuszczenie oraz jednorodne rozproszenie mieszaniny lipidów.

Stosunek mieszaniny lipidów do niewodnego rozpuszczalnika będzie oczywiście ograniczony przez rozpuszczalność mieszaniny lipidów. Na ten stosunek także będzie wpływać wymagana ilość mieszaniny lipidów w końcowym preparacie. Korzystnie stosunek ten wynosi od około 1 mg mieszaniny lipidów na ml rozpuszczalnika (mg/ml) do około 100 mg/ml. Korzystniej mieszanina lipidów jest obecna w ilości około 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 lub 15 mg/ml. Jeszcze korzystniej mieszanina lipidów jest obecna w ilości 10 mg/ml.

Etap (2)

Drugi etap polega na kontaktowaniu roztworu z etapu (1) z roztworem wodnym, z wytworzeniem zawiesiny lipidów. Roztworem wodnym może być woda, roztwór soli, mieszanina roztwór soli/gliceryna lub mieszanina roztwór soli/gliceryna/niewodny rozpuszczalnik. Niewodnym rozpuszczalnikiem jest, jak to określono powyżej, korzystnie glikol propylenowy. Stosowane tu określenie zawiesina oznacza dyspersję, w której nierozpuszczalne cząstki są rozproszone w ciekłym ośrodku.

Po osiągnięciu całkowitego rozpuszczenia mieszaniny lipidów (etap (1)), powstały roztwór można wprowadzić do roztworu wodnego. Roztwór wodny może zawierać jeden lub większą liczbę składników wybranych z grupy obejmującej chlorek sodu, glicerynę i niewodny rozpuszczalnik. Korzystnie roztwór wodny zawiera glicerynę i chlorek sodu. Korzystnie roztwór wodny przed dodaniem roztworu z etapu 1 zawiera wystarczającą ilość glikolu propylenowego, aby osiągnąć końcowe wymagane stężenie glikolu propylenowego.

Nie uważa się, aby kolejność dodawania wymaganych składników w znaczący sposób wpływała na powstałą zawiesinę lipidów. Jednakże korzystne jest, aby roztwór mieszaniny lipidów dodawać do wody, która może już zawierać wymienione powyżej dodatkowe składniki. Następnie można wprowadzić dodatkowe wymagane składniki. Korzystniej jest, aby roztwór mieszaniny lipidów dodawać do roztworu wody i chlorku sodu (czyli do roztworu soli). Jeszcze korzystniejsze jest, aby roztwór mieszaniny lipidów dodawać do roztworu wody, chlorku sodu i gliceryny. Jeszcze korzystniejsze jest, aby roztwór mieszaniny lipidów dodawać do roztworu wody, chlorku sodu, gliceryny i glikolu propylenowego.

Korzystnie stężenie NaCl wynosi 6,8 mg/ml preparatu. Korzystnie stężenie gliceryny wynosi 0,1 ml/ml preparatu. Korzystnie końcowe stężenie glikolu propylenowego wynosi 0,1 ml/ml preparatu.

Korzystne końcowe pH preparatu powinno wynosić około 5,5-7,0. Mieszanina lipidów korzystnie obecna jest w ilości 0,75-1,0 mg/ml preparatu.

Korzystna temperatura roztworu wodnego może wynosić od temperatury otoczenia do 70°C. Korzystnie temperatura wynosi 45 do 60°C, przy czym jeszcze korzystniejsza jest temperatura 50, 51,

PL 193 672 B1

52, 53, 54 lub 55°C. W celu osiągnięcia całkowitego rozpuszczenia konieczne może być mieszanie mieszaniny, korzystnie z użyciem mieszadła. Ponadto konieczne może być nastawienie pH mieszaniny, w zależności od żądanego końcowego preparatu. Aby osiągnąć takie nastawienie, można dodać kwasu (np. HCl) lub zasady (np. NaOH).

Zawiesina lipidów będzie zawierać ciekłe cząstki o różnej wielkości. Jedną z zalet wynalazku jest możliwość niezmiennego uzyskania małych cząstek o prawie jednakowej wielkości. Tak więc korzystne jest, aby większość uzyskanych cząstek miała średnicę mniejszą niż 100 nm, korzystniej mniejszą niż 50 nm.

Korzystna procedura rozpuszczania mieszaniny lipidów jest następująca: (a) Dodać wody do iniekcji (WFI) do naczynia do mieszania. (b) Rozpocząć mieszanie i ustalić temperaturę w zakresie 50-55°C. (c) Dodać chlorku sodu do naczynia do mieszania. Odczekać przed przejściem do następnego etapu do czasu całkowitego rozpuszczenia substancji stałej. (d) Dodać gliceryny do naczynia do mieszania. Pozostawić na czas wystarczający do całkowitego wymieszania. (e) Dodać resztę glikolu propylenowego, który nie jest w roztworze mieszaniny lipidów z glikolem propylenowym. Pozostawić na czas wystarczający do dokładnego wymieszania. (f) Zmniejszyć intensywność mieszania, aby ograniczyć turbulencję w naczyniu do mieszania. (g) Dodać do naczynia do mieszania roztworu mieszaniny lipidów z glikolem propylenowym. (h) Ponownie doprowadzić intensywność mieszania do poziomu wyjściowego. (i) Wprowadzić dodatkową ilość WFI, w razie potrzeby. (j) Kontynuować mieszanie przez około 25 minut dla zapewnienia całkowitego wymieszania. (k) Sprawdzić i nastawić docelową wartość pH w roztworze.

Etap (3)

Etap trzeci polega na ogrzewaniu zawiesiny lipidów uzyskanej w etapie (2) do temperatury w przybliżeniu równej lub wyższej od najwyższej temperatury przejścia lipidów obecnych w roztworze z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną.

Jednym z celów tego etapu jest dostarczenie dającej się filtrować zawiesiny. Roztwór/zawiesinę uważa się za dające się filtrować, gdy nie występuje znaczące obniżenie szybkości przepływu w normalnym procesie oraz nie zwiększa się znacząco spadek ciśnienia w układzie filtracyjnym.

Dane doświadczalne wskazują, że lipidy w preparacie powinny być w temperaturze wyższej od temperatury przejścia z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną, aby ułatwić sterylizację przez filtrację. Gdy lipidy mają temperaturę niższą niż temperatura przejścia z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną, cząstki zawiesiny są sztywne. Jednakże gdy lipidy mają temperaturę wyższą od temperatury swojego przejścia z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną, tworzą luźniej zorganizowaną strukturę, a zatem można je łatwiej odfiltrować.

DPPC i DPPA wykazują przejście fazowe odpowiednio w temperaturze 41°C i 67°C. MPEG5000-DPPE jest rozpuszczalna w wodzie, a zatem nie wykazuje przejścia z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną, które jest charakterystyczne dla większości zawiesin uwodnionych lipidów. Ze względu na to, że lipidy w korzystnym preparacie wykazują różną temperaturę przejścia z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną, korzystnie filtrację roztworu prowadzi się w najwyższej temperaturze przejścia fazowego, w 67°C. Przy utrzymywaniu temperatury 67°C lub wyższej, wszystkie lipidy będą powyżej ich odpowiedniej granicy przejścia fazowego, co zapewnia luźną strukturę przy przepływie przez filtry.

Ogrzanie można osiągnąć przez zastosowanie wokół naczynia do mieszania płaszcza w postaci spirali jako wymiennika ciepła. Gorąca woda/para wodna z kontrolowanego źródła, np. łaźnia z gorącą wodą lub podgrzewacz wody, zapewnią wystarczającą ilość ciepła do utrzymania mieszanego roztworu w nastawionej temperaturze. Można także stosować inne źródła ciepła znane fachowcom.

Etap (4)

W etapie czwartym prowadzi się filtrację zawiesiny lipidów przez filtr sterylizujący. Celem tego etapu jest uzyskanie zawiesiny zasadniczo wolnej od bakterii. Filtrat uważa się za zasadniczo wolny od bakterii, gdy prawdopodobieństwo, że filtrat zawiera co najmniej jeden mikroorganizm tworzący kolonie, jest mniejsze niż 10^-6.

Filtrację korzystnie prowadzi się z użyciem sterylizujących wkładów filtracyjnych. Mogą być także wymagane środki do przetłaczania roztworu przez filtry (np. pompowanie lub stosowanie ciśnienia). Ze względu na to, że filtrowany roztwór powinien być utrzymywany w temperaturze powyżej temperatury przejścia z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną lipidów obecnych w roztworze, filtrację należy prowadzić w przybliżeniu w tej samej temperaturze. Aby to osiągnąć, filtry (np. sterylizujące wkłady filtracyjne) korzystnie są zamknięte w obudowach otaczających filtry, ogrzewanych w sposób ciągły, np.

PL 193 672 B1 strumieniem gorącej wody z łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze, co zapewnia, że zawiesina jest w temperaturze powyżej przejścia fazowego lipidów. Temperatura filtrów sterylizujących korzystnie wynosi 50 - 100°C, korzystniej 60 - 90°C, jeszcze korzystniej 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 lub 80°C.

Do filtrowania zawiesiny można stosować jeden lub większą liczbę filtrów sterylizujących. Wymagana liczba będzie zależna od ich skuteczności w usuwaniu bakterii. Korzystnie stosuje się dwa filtry. Wielkość porów filtrów będzie ograniczona koniecznością zapewnienia zawiesiny wolnej od bakterii. Korzystnie stosuje się hydrofilowe filtry 0,2 mm.

Roztwór podstawowy korzystnego preparatu filtrowano w sposób ciągły przez dwa hydrofilowe filtry 0,2 mm, przez okres do 3 godzin, z szybkością około 1litr na minutę (1 l/min), tak że przez filtry przefiltrowano 180 litrów roztworu zawiesiny. Wyniki doświadczalne wykazały, że nie wystąpiło żadne widoczne zablokowanie filtrów. Testy lipidowe wskazują, że nie wystąpiły dające się zmierzyć straty podczas procesu filtracji (ze względu na nagromadzenie w ośrodku filtracyjnym).

Roztwór podstawowy korzystnego preparatu mieszano w temperaturze 40°C - 80°C, a następnie zawiesinę ochłodzono do temperatury otoczenia przed sterylizacją drogą filtracji. Nie stwierdzono wyraźnego zatkania filtrów, co wskazuje, że wielkość cząstek była znacznie poniżej wielkości porów, wynoszącej 0,2 mm. Podczas filtracji pożądane jest stosowanie ogrzewania, aby zapewnić maksymalne odzyskanie mieszaniny lipidów w sterylnym filtracie (to jest ograniczyć do minimum potencjalne zatrzymanie cząstek lipidów w ośrodku filtracyjnym).

Korzystna operacja filtrowania zawiesiny lipidów jest następująca: (a) Upewnić się, czy wszystkie z płaszczem mają temperaturę 70°C - 80°C. (b) Upewnić się, czy wszystkie zawory jednostki filtracyjnej są zamknięte. (c) Połączyć wężem wlot do filtra z wylotem z naczynia do mieszania. (d) Otworzyć zawory, aby roztwór mógł płynąć przez filtry. (e) Przepuścić 3 litry roztworu przez filtry przed rozpoczęciem zbierania filtratu. (f) Kontynuować filtrację do zakończenia.

Etap (5)

Etap piąty obejmuje przeniesienie przefiltrowanego roztworu do poszczególnych fiolek. Korzystnie etap ten przeprowadza się w kontrolowanym obszarze aseptycznym. Fachowiec będzie wiedział, że wybrana fiolka oraz ilość zawiesiny przeniesionej do fiolki będzie zależeć od końcowego zastosowania przewidywanego dla zawiesiny lipidów. Roztwór można przenosić do fiolek różnymi sposobami, np. z użyciem pipety, ręcznej strzykawki automatycznej (np. strzykawkowego aparatu dozującego Filamatic®) lub przemysłowego aparatu do automatycznego dozowania (np. automatycznego aparatu napełniającego Cozzoli lub TL).

Etap (6)

Etap szósty obejmuje zastąpienie gazu nad zawiesiną we fiolkach z etapu piątego gazowym związkiem perfluorowęglowodorowym. Korzystnym sposobem wymiany jest umieszczenie przygotowanych fiolek w komorze liofilizacyjnej i zastąpienie gazu we fiolkach gazowym związkiem perfluorowęglowodorowym. Korzystnym gazem jest perfluoropropan (PFP). Można stosować inne sposoby wymiany gazu znane fachowcom.

Po zakończeniu cyklu wymiany gazu fiolki szczelnie zamyka się. Kiedy ciśnienie w komorze liofilizatora z powrotem osiągnie wartość ciśnienia atmosferycznego przez doprowadzenie PFP do komory, fiolki zamyka się korkami aby je uszczelnić.

Etap (7)

Etap siódmy obejmuje końcową sterylizację fiolek po etapie szóstym. W jednym ze sposobów końcowej sterylizacji stosuje się autoklaw. Ponadto szczelnie zamknięte fiolki można na koniec wyjałowić w sterylizatorze parowym, aby jeszcze bardziej zwiększyć pewność sterylności produktu. Podczas procesu sterylizacji należy zachować ostrożność, gdyż w wyniku autoklawowania może nastąpić w jakimś stopniu rozkład lipidów. Korzystnie fiolki sterylizuje się w temperaturze około 126-130°C przez 1-10 minut.

Inne cechy wynalazku staną się jasne po zapoznaniu się z następującym opisem przykładowych zastosowań, podanym celem zilustrowania wynalazku bez ograniczania jego zakresu.

PL 193 672 B1

Przykłady

T ab el a 1. Skład docelowej mieszaniny lipidów

Nazwa lipidu	Nazwa zwyczajowa	% wagowe	% molowe
DPPA	sól monosodowa kwasu 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydowego	6,0	10
DPPC	1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholina	53,5	82
MPEG5000 DPPE	sól monosodowa N-(metoksypolioksyetyleno(5000)karbamoilo)-1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloaminy	40,5	8

Procedura wytwarzania mieszaniny lipidów

W naczyniu umieszczono toluen (3,3 litra), metanol (1,2 litra), DPPA (59,6 g), DPPC (535 g) i MPEG5000 DPPE (405 g).

Po przemyciu powierzchni kontaktu substancji stałych 0,9 litra metanolu, zawiesinę ogrzano do 45-55°C, do całkowitego rozpuszczenia.

Roztwór przefiltrowano i zatężono pod próżnią w 35-45°C i otrzymano gęsty żel. Dodano eteru metylowo-t-butylowego (MTBE, 5,4 litra) i mieszaninę przeprowadzono w stan zawiesiny w 15-30°C. Biała substancję stałą zebrano przez odwirowanie lub filtrację próżniową i przemyto MTBE (0,9 litra). Substancję stałą umieszczono w suszarce próżniowej i wysuszono do stałej masy w 40-50°C. Wysuszoną mieszaninę lipidów przeniesiono do butelki i przechowywano w temperaturze od -15 do -25°C.

W innej postaci sposobu wytwarzania mieszaniny lipidów można zastosować następującą procedurę.

Alternatywna procedura wytwarzania mieszaniny lipidów

PL 193 672 B1

Ilości fosfolipidów dostosowywano z uwzględnieniem czystości opartej na wartości „stosować jako” ze świadectwa analizy. Wielkość partii (łącznej masy fosfolipidów) w doświadczeniu wynosiła 2 kg.

Kolbę wyparki obrotowej kolejno napełniono toluenem (3300 ml), metanolem (1200 ml), DPPA (122,9 g; z poprawką na czystość „stosować jako 97,0%), DPPC (razem 1098,5 g; 500,8 g z partii o czystości „stosować jako 98,4% i 597,7 g z partii o czystości „stosować jako 96,7%) oraz MPEG5000 DPPE (815,7 g; z poprawką na czystość „stosować jako 99,3%). Po przemyciu substancji stałych w naczyniu metanolem (900 ml), naczynie umieszczono w wyparce obrotowej (bez próżni) i zawiesinę ogrzano do temperatury 45-55°C (zewnętrznie). Po zakończeniu rozpuszczania temperaturę zewnętrzną obniżono do 35-45°C, przyłożono próżnię i roztwór zatężano do otrzymania białej substancji półstałej. Naczynie usunięto z wyparki i substancję stałą rozbito przy pomocy łopatki. Do naczynia ponownie przyłożono próżnię i kontynuowano zatężanie. Po osiągnięciu punktu końcowego (końcowe ciśnienie 20 mbarów; biała, ziarnista, zwarta substancja stała) dodano MTBE (5400 ml) przez rurkę do wyparki obrotowej, odłączono próżnię i mieszaninę dyspergowano przez 15-45 min w 15-30°C. Substancję stałą oddzielono przez odwirowanie lub filtrację pod próżnią, przemyto MTBE (3800 ml) i wysuszono do stałej masy w suszarce próżniowej (40-50°C). Przed przeniesieniem do butelek polietylenowych z nakrętkami polipropylenowymi substancję stałą przesiano w celu usunięcia grudek (0,079 calowe sito) i otrzymano 1966,7 g (98%) mieszaniny lipidów (SG896) w postaci białej substancji stałej.

Korzystna zawiesina lipidów zawiera:

sól monosodową kwasu 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydowego (DPPA);

1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholinę (DPPC);

sól monosodową N-(metoksypolioksyetyleno(5000)karbamoilo)-1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloaminy (MPEG5000-DPPE); glikol propylenowy, USP; glicerynę, USP;

chlorek sodu, USP; oraz wodę do iniekcji, USP.

Tabela 2. Korzystne preparaty środków kontrastujących

Składnik	A*	B*
NaCl, USP	6,8 mg/ml	6,8 mg/ml
Gliceryna, USP	0,1 ml/ml	0,1 ml/ml
Glikol propylenowy, USP	0,1 ml/ml	0,1 ml/ml
Mieszanina lipidów**	1 mg/ml	0,75 mg/ml
Perfluoropropan	> 65%	> 65%
PH	6,0-7,0	6,0-7,0

* Preparat A zawiera 1 mg/ml mieszaniny lipidów. Preparat B zawiera mieszaninę lipidów w stężeniu 0,75 mg/ml.

** Mieszanina lipidów składa się z 53,5% wagowych DPPC, 6,0% wagowych DPPA i 40,5% wagowych MPEG5000-DPPE.

Tabela 3. Korzystne pojemniki i zamknięcia

Składnik	Typ
Fiolka	Wheaton 2802, B33BA, 2 cm3; 13 mm, typ I, fiolka ze szkła flintowego
Korek	West V50 4416/50, 13 mm, korki z szarego liofilizowanego kauczuku butylowego, silikonizowane
Zamknięcie	West 3766, białe kapsle aluminiowe 13 mm

Objętość wypełnienia produktem końcowym może wynosić od 1,0-2,0 ml/fiolkę.

W procesie wytwarzania korzystnego preparatu, gdy mieszaninę lipidów hydratyzuje się bezpośrednio roztworem w fazie wodnej zawierającym wodę do iniekcji, chlorek sodu, glicerynę i glikol propylenowy, filtrat zawiera mniej lipidów w porównaniu z roztworem podstawowym przed filtracją. Strata

PL 193 672 B1 lipidów wynosi od 12% do 48%. Wyniki te wykazują, że proces sterylizacji przez filtrację nie jest skutecznie kontrolowany, a zatem zawartość lipidów w produkcie końcowym jest bardzo zmienna.

Natomiast z zastosowaniem opisanego sposobu, wyniki testów lipidowych wykazują całkowite odzyskanie lipidów podczas procesu filtracji. Zmienność wyników testu wokół teoretycznych docelowych wartości leży w granicach normalnej zmienności metody testowej. Rozkład wielkości cząstek, liczbowy, objętościowy oraz względem intensywności odbicia, w zawiesinie wytworzonej przez wstępne rozpuszczanie w glikolu propylenowym wskazuje, że większość cząstek ma wielkość poniżej 50 nm w roztworze podstawowym przed filtracją w 55°C, jak i w 70°C. Profil rozkładu wielkości cząstek nie zmienia się po filtracji.

Użyteczność

Sposób według wynalazku znajduje zastosowanie do wytwarzania ultrasonograficznych środków kontrastujących. Takie środki powinny być użyteczne w różnych zastosowaniach obrazowania, w tym jako kontrast wzmacniający w ultrasonograficznym obrazowaniu echokardiograficznym i radiologicznym.

Oczywiście możliwych jest wiele modyfikacji i odmian wynalazku w odniesieniu do powyższych technik. Należy zatem rozumieć, że w zakresie załączonych zastrzeżeń, wynalazek można realizować w inny sposób niż konkretnie opisany.

Claims (7)

1. Sposób wytwarzania zawiesiny fosfolipidów, znamienny tym, że:

(1) wytwarza się mieszaninę lipidów sposobem polegającym na tym, że (a) co najmniej dwa lipidy kontaktuje się z pierwszym niewodnym rozpuszczalnikiem;

(b) otrzymany roztwór zatęża się do gęstego żelu;

(c) gęsty żel kontaktuje się z drugim niewodnym rozpuszczalnikiem; oraz (d) zbiera się otrzymaną substancję stałą;

(2) wytworzoną mieszaninę lipidów kontaktuje się z trzecim niewodnym rozpuszczalnikiem, przy czym mieszanina lipidów rozpuszcza się w trzecim niewodnym rozpuszczalniku; oraz

(3) roztwór z etapu (2) kontaktuje się z roztworem wodnym, z wytworzeniem zawiesiny lipidów.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) jako lipidy stosuje się:

(i) 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholinę;

(ii) sól monosodową kwasu 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydowego; oraz (iii) sól monosodową N-(metoksypolioksyetyleno(5000)karbamoilo)-1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfatydyloetanoloaminy.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (a) pierwszy niewodny rozpuszczalnik stanowi mieszanina metanolu i toluenu.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (c) drugi niewodny rozpuszczalnik stanowi eter metylowo-t-butylowy.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (a) roztwór ogrzewa się do temperatury wystarczającej do całkowitego rozpuszczenia się lipidów w rozpuszczalniku.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w etapie (a) roztwór ogrzewa się do temperatury około 25-75°C.

7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w etapie (d) substancję stałą przemywa się eterem metylowo-t-butylowym i suszy pod próżnią.

8. Sposób według zastrz. 1-7, znamienny tym, że trzeci niewodny rozpuszczalnik jest wybrany z grupy obejmującej glikol propylenowy, glikol etylenowy i glikol polietylenowy 300.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że trzeci niewodny rozpuszczalnik stanowi glikol propylenowy.

10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że trzeci niewodny rozpuszczalnik ogrzewa się do temperatury około 30-70°C przed kontaktowaniem z mieszaniną lipidów.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że trzeci niewodny rozpuszczalnik ogrzewa się do temperatury około 50-55°C przed kontaktowaniem z mieszaniną lipidów.

12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosunek mieszaniny lipidów do trzeciego niewodnego rozpuszczalnika wynosi od około 5 mg mieszaniny lipidów na ml niewodnego rozpuszczalnika do około 15 mg/ml.

PL 193 672 B1

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosunek mieszaniny lipidów do trzeciego niewodnego rozpuszczalnika wynosi około 10 mg/ml.

14. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (2) roztwór wodny jest wybrany z grupy obejmującej wodę, roztwór soli fizjologicznej, mieszaninę roztwór soli fizjologicznej/gliceryna oraz mieszaninę roztwór soli/gliceryna/niewodny rozpuszczalnik.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wodny roztwór stanowi mieszanina roztworu soli fizjologicznej i gliceryny.

16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wodny roztwór stanowi mieszanina roztworu soli fizjologicznej, gliceryny i glikolu propylenowego.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że stężenie chlorku sodu wynosi 6,8 mg/ml, gliceryny 0,1 ml/ml, glikolu propylenowego 0,1 ml/ml, a mieszaniny lipidów około 0,75 do 1,0 mg/ml.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stężenie mieszaniny lipidów wynosi 0,75 mg/ml.

19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że stężenie mieszaniny lipidów wynosi 1,0 mg/ml.

20. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (2) roztwór wodny ogrzewa się do temperatury około 45-60°C przed kontaktowaniem z mieszaniną z etapu (1).

21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że roztwór wodny ogrzewa się do temperatury około 50-55°C przed kontaktowaniem z mieszaniną z etapu (1).

22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto (3) zawiesinę lipidów z etapu (2) ogrzewa się do temperatury w przybliżeniu równej lub wyższej niż najwyższa temperatura przejścia lipidów obecnych w zawiesinie z fazy żelu w fazę ciekłokrystaliczną.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że w etapie (3) zawiesinę lipidów ogrzewa się do temperatury co najmniej około 67°C.

24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że ponadto

(4) zawiesinę lipidów filtruje się przez filtr sterylizujący.

25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że w etapie (4) filtrację prowadzi się z użyciem dwóch sterylizujących wkładów filtrujących.

26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że w etapie (4) sterylizujące wkłady filtrujące są w temperaturze od około 70 do 80°C.

27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że w etapie (4) stosuje się 0,2 mm filtry hydrofilowe.

28. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że ponadto:

(5) przefiltrowaną zawiesinę z etapu (4) przenosi się do fiolki.

29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że ponadto:

(6) wymienia się gaz nad zawiesiną we fiolce z etapu (5) na gazowy związek perfluorowęglowodorowy.

30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że jako gazowy związek perfluorowęglowodorowy stosuje się gazowy perfluoropropan.

31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że wymianę gazu przeprowadza się w komorze liofilizacyjnej.

32. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że ponadto:

(7) sterylizuje się fiolkę z etapu (6).

33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że w etapie (7) fiolkę sterylizuje się w około 126-130°C przez 1-10 minut .