PT1419789E

PT1419789E - Preparação de uma mistura de lípidos e de uma suspensão de fosfolípidos contendo a mistura de lípidos, e agentes de contraste baseados nestas

Info

Publication number: PT1419789E
Application number: PT04075388T
Authority: PT
Inventors: John E Bishop; Poh K Hui; Eleodoro S Madrigal Jr
Original assignee: Lantheus Medical Imaging Inc
Priority date: 1998-01-14
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 2010-02-17
Also published as: BR9907066A; CN1288373A; US20170312375A1; US20040057991A1; MY137255A; ZA99247B; US20120027688A1; EE200000422A; WO1999036104A3; US20010003580A1; HK1064301A1; EP1419789A2; CN1191822C; HUP0100206A2; HRP990012A2; IL137018A0; HUP0100206A3; NZ505082A; ATE447976T1; US8685441B2

Description

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DESCRIÇÃO "PREPARAÇÃO DE DMA MISTURA DE LÍPIDOS E DE UMA SUSPENSÃO DE FOSFOLÍPIDOS CONTENDO A MISTURA DE LÍPIDOS, E AGENTES DE CONTRASTE BASEADOS NESTAS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se geralmente a processos para a preparação de uma mistura de lipidos e uma suspensão de fosfolipidos uniforme e filtrável contendo a mistura de lipidos, sendo que esta suspensão é útil como agente de contraste para ultra-sonografia.

Antecedentes da Invenção 0 fabrico de um agente de contraste fosfolipidico pode ser dividido nos seguintes passos: (1) preparação da mistura de lipidos; (2) composição da solução primária, o que envolve a hidratação e dispersão da mistura de lipidos num meio essencialmente aquoso para produzir uma suspensão de lipidos; (3) filtração da solução primária através de um ou mais filtros de esterilização para tornar a suspensão livre de contaminantes microbiológicos; (4) distribuição da suspensão estéril em frascos individuais numa área asséptica controlada; (5) colocação dos frascos onde a suspensão foi distribuída numa câmara de liofilização, para substituir o gás do espaço de cabeça do frasco pelo gás perfluoropropano (PFP); (6) transferência dos frascos selados após a troca de gases para um autoclave para esterilização final. Existem três obstáculos principais neste processo: (1) uniformidade da mistura de lipidos; (2) hidratação da mistura de lipidos; (3) uniformidade e tamanho das partículas da suspensão; e (4) filtração 2 estéril da suspensão através de um ou mais filtros de esterilização.

Misturas de fosfolipidos são produzidas tipicamente através da dissolução ou suspensão dos lipidos necessários num sistema de solvente aquoso ou não aquoso apropriado, e depois reduzindo o volume por liofilização ou por destilação. Idealmente, este processo produz sólidos misturados, com elevada uniformidade e pureza do conteúdo. Contudo, apesar de funcionar bem em escala pequena, de laboratório, esta abordagem simples é frequentemente problemática após o scale-up para quantidades de tamanho de produção. As dificuldades incluem: (1) a manutenção de uniformidade do conteúdo durante o passo de remoção do solvente (devido a diferentes solubilidades); (2) a manutenção da pureza (frequentemente um problema quando é usada água, devido a reacções hidrolíticas secundárias); (3) a melhoria da pureza; (4) a minimização do volume de solvente; e (5) a recuperação dos sólidos finais (por exemplo, não é prático raspar sólidos de um reactor de grandes dimensões).

Processos para a preparação de misturas de lipidos são descritos em WO 96/91196 e WO 97/40858.

Após o fabrico de uma mistura de lipidos, a composição final envolve, tipicamente, a introdução da mistura num meio aquoso. Uma vez que os fosfolipidos são hidrofóbicos e não são facilmente solúveis em água, a adição de uma mistura de fosfolipidos ou lipidos directamente a uma solução aquosa leva à agregação do pó de lipidos, formando-se grumos que são muito difíceis de dispersar. Por conseguinte, o processo de hidratação não pode ser 3 controlado dentro de um tempo de processo razoável. A hidratação directa de uma mistura de fosfolípidos ou de lípidos num meio aquoso produz uma suspensão turva com partículas entre 0,6 pm e 100 pm. Devido a uma distribuição do tamanho de partículas relativamente grande, a suspensão não pode ser filtrada à temperatura ambiente quando a temperatura da solução de suspensão se encontra abaixo das temperaturas de transição de fase de gel a cristalina líquida dos lípidos. Os lípidos seriam acumulados nos filtros, levando a uma restrição na velocidade do fluxo, e na maioria dos casos, os filtros estariam completamente bloqueados pouco tempo depois. Uma redução adicional do tamanho das partículas da suspensão não pode ser conseguida através de um processo em etapas convencional, mesmo após mistura prolongada (por exemplo, 6 horas) a temperaturas elevadas (por exemplo, 40°C a 80°C) com uma hélice marinha geralmente utilizada.

Apesar da filtração a temperaturas elevadas, ou seja, a temperaturas acima da fase de transição dos lipidos, ser possível, uma quantidade significativa de partículas maiores de lípidos seria ainda excluída quando uma pressão de filtração normal é usada. Por sua vez, concentrações do filtrado estéril teriam um conteúdo em lípidos variável de lote para lote dependendo de como os lípidos são inicialmente hidratados, o que por sua vez é determinado pelas características físicas, por exemplo, morfologia, dos materiais iniciais. O processo de hidratação directa dos lípidos ou da mistura de lípidos para produzir uma suspensão uniforme e filtração da suspensão através de um ou mais filtros de esterilização 4 pode ser difícil e dispendiosa para ser ampliada para uma qualquer escala comercial razoável, por exemplo, > 20 L.

Assim, os processos presentemente reivindicados para o fabrico de uma mistura de lípidos e a suspensão de fosfolípidos subsequente têm como objectivo solucionar os pontos acima mencionados, fornecendo um processo prático que pode ser facilmente escalonado e adoptado em inúmeras instalações de produção sem modificação extensiva ou optimização de equipamento existente.

Sumário da Invenção

Assim, um objectivo da presente invenção é fornecer um processo novo para a preparação de uma mistura de lípidos. Outro objectivo da presente invenção é fornecer um processo novo para a preparação de uma suspensão de fosfolípidos a partir da mistura de lípidos.

Estes, e outros objectivos, que ficarão evidentes durante a descrição detalhada que se segue, foram atingidos pela descoberta dos inventores de que dissolver uma mistura de lípidos num solvente não aquoso adequado antes da introdução de uma solução aquosa permite que se produza uma suspensão de fosfolípidos.

Descrição Detalhada da Invenção 1. Assim, numa primeira forma de realização, a presente invenção fornece um processo novo para a preparação de uma suspensão de fosfolípidos, compreendendo: 5 (1) colocar em contacto uma mistura de lípidos de acordo com a presente invenção com um solvente não aquoso, em que a mistura de lípidos se dissolve substancialmente no solvente não aquoso; e (2) colocar em contacto a solução do passo (1) com uma solução aquosa para formar uma suspensão de lípidos. 2. Numa forma de realização preferida, o solvente não aquoso é seleccionado de propilenoglicol, etilenoglicol e polietilenoglicol 300. 3. Numa forma de realização privilegiada, o solvente não aquoso é propilenoglicol. 4. Na presente invenção, a mistura de lípidos compreende: (a) 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina; (b) sal monossódico de ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico; e, (c) sal monossódico de N-(metoxipolietilenoglicol 5000 carbamoil)-1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfatidiletanolamina. 5. Numa outra forma de realização preferida, no passo (1), o solvente não aquoso é aquecido a uma temperatura de 30 a 70°C, antes de ser posto em contacto com a mistura de lípidos. 6. Numa outra forma de realização mais preferida, o solvente não aquoso é aquecido a uma temperatura de 50 a 6 55°C, antes de ser posto em contacto com a mistura de lípidos. 7. Numa outra forma de realização preferida, a razão de mistura de lipidos para solvente não aquoso é de 5 mg de mistura de lipidos por mL de solvente não aquoso a 15 mg/mL. 8. Numa outra forma de realização mais preferida, a razão de mistura de lipidos para solvente não aquoso é de cerca de 10 mg/mL. 9. Numa outra forma de realização preferida, no passo (2) a solução aquosa é seleccionada de água, solução salina, uma mistura de solução salina/glicerina, e uma mistura de solução salina/glicerina/solvente não aquoso. 10. Numa outra forma de realização mais preferida, a solução aquosa é uma mistura de solução salina e glicerina. 11. Numa outra forma de realização mais preferida, a solução aquosa é uma mistura de solução salina, glicerina, e propilenoglicol. 12. Numa outra forma de realização mais preferida, 6,8 mg/mL de cloreto de sódio estão presentes, 0,1 mL/mL de glicerina estão presentes, 0,1 mL/mL de propilenoglicol estão presentes, e 0,75 a 1,0 mg/mL da mistura de lípidos estão presentes. 13. Numa forma de realização ainda mais preferida, 0,75 mg/mL de mistura de lípidos estão presentes. 7 14. Numa forma de realização ainda mais preferida, 1,0 mg/mL de mistura de lipidos estão presentes. 15. Numa forma de realização preferida, a solução aquosa no passo (2) é aquecida a uma temperatura de 45 a 60°C, antes de ser posta em contacto com a solução do passo (1). 16. Numa forma de realização mais preferida, a solução aquosa é aquecida a uma temperatura de 50 a 55°C, antes de ser posta em contacto com a solução do passo (1). 17. Numa forma de realização preferida, o processo compreende ainda: (3) aquecer a suspensão de lipidos do passo (2) até uma temperatura mais ou menos igual ou superior à temperatura máxima de transição de fase de gel para cristalina liquida dos lipidos presentes na suspensão. 18. Numa forma de realização preferida, a suspensão de lipidos no passo (3) é aquecida até uma temperatura de pelo menos cerca de 67°C. 19. Numa outra forma de realização mais preferida, o processo compreende ainda: (4) filtrar a suspensão de lipidos através de um filtro de esterilização. 20. Numa outra forma de realização ainda mais preferida, a filtração do passo (4) é realizada usando dois cartuchos de filtros de esterilização. 8 21. Numa outra forma de realização também preferida, os cartuchos de filtros de esterilização do passo (4) encontram-se a uma temperatura de 70 a 80°C. 22. Numa outra forma de realização também preferida, são usados filtros hidrofilicos com 0,2 pm no passo (4). 23. Numa outra forma de realização ainda mais preferida, o processo compreende ainda: (5) colocar a solução filtrada no passo (4) num frasco. 24. Numa outra forma de realização também preferida, o processo compreende ainda: (6) substituir o gás do espaço de cabeça do frasco obtido no passo (5) por um gás perfluorocarbono. 25. Numa outra forma de realização ainda mais preferida, o gás perfluorocarbono é perfluoropropano. 26. Numa outra forma de realização também preferida, a substituição do gás do espaço de cabeça é realizada usando uma câmara de liofilização. 27. Numa outra forma de realização também preferida, o processo compreende ainda: (7) esterilizar o frasco obtido no passo (6). 28. Numa forma de realização ainda mais preferida, o frasco é esterilizado no passo (7) a 126-130°C durante 1 a 10 minutos. 9 29. A presente invenção fornece um processo novo para a preparação de uma mistura de lipidos, compreendendo: (a) colocar os lipidos em contacto com um primeiro solvente não aquoso; (b) concentrar a solução até obter um gel espesso; (c) colocar o gel espesso em contacto com um segundo solvente não aquoso; e, (d) coleccionar os sólidos resultantes, em que os lipidos no passo (a) são: (i) 1,2-dipalmitoil-s.n-glicero-3-f osf atidilcolina; (ii) sal monossódico de ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico; e, (iii) sal monossódico de N-(metoxipolietilenoglicol 5000 carbamoil) -1,2-dipalmitoil-s.n-glicero-3- fosfatidiletanolamina. 31. Numa outra forma de realização preferida, o primeiro solvente não aquoso no passo (a) é uma mistura de metanol e tolueno. 32. Numa outra forma de realização preferida, o segundo solvente não aquoso no passo (c) é um metil t-butil éter. 33. Numa outra forma de realização preferida, no passo (a), a solução é aquecida até uma temperatura suficiente para completar a dissolução dos lipidos no solvente. 10 34. Numa outra forma de realização mais preferida, no passo (a), a solução é aquecida a 25 a 75°C. 35. Numa outra forma de realização preferida, no passo (d), os sólidos recolhidos são lavados com metil t-butil éter e secos ín vacuo. 36. Numa terceira forma de realização, a presente invenção fornece uma suspensão de fosfolípidos nova, compreendendo: (a) uma mistura de lipidos numa quantidade de 0,75 -1,0 mg/mL de suspensão; (b) cloreto de sódio numa quantidade de cerca de 6,8 mg/mL de suspensão; (c) glicerina numa quantidade de cerca de 0,1 mL/mL de suspensão; (d) propilenoglicol numa quantidade de cerca de 0,1 mL/mL de suspensão; e, (e) água; em que a suspensão é preparada pelo processo compreendendo: (1) colocar em contacto uma mistura de lipidos com um solvente não aquoso, em que a mistura de lipidos se dissolve substancialmente no solvente não aquoso; (2) colocar a solução obtida no passo (1) em contacto com uma solução aquosa para formar uma suspensão de lipidos; 11 (3) aquecer a suspensão de lípidos obtida no passo (2) até uma temperatura mais ou menos igual ou superior à temperatura mais alta de transição de fase de gel para cristalina liquida dos lipidos presentes na suspensão; e, (4) filtrar a suspensão de lipidos através de um filtro de esterilização. 37. A mistura de lipidos compreende: (a) 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina; (b) sal monossódico de ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico; e, (c) sal monossódico de N-(metoxipolietilenoglicol 5000 carbamoil)-1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfatidiletanolamina. 38. Numa outra forma de realização mais preferida, o solvente não aquoso é aquecido até uma temperatura de 50 a 55°C antes de ser colocado em contacto com a mistura de lipidos. 39. Numa outra forma de realização mais preferida, a razão de mistura de lipidos para o solvente não aquoso é de cerca de 10 mg/mL. 40. Numa outra forma de realização mais preferida, a solução aquosa é uma mistura de solução salina, glicerina e propilenoglicol. 12 41. Numa forma de realização ainda mais preferida, estão presentes 0,75 mg/mL de mistura de lipidos. 42. Numa outra forma de realização mais preferida, a solução aquosa é aquecida até uma temperatura de 50 a 55°C antes de ser colocada em contacto com a solução obtida no passo (1). 43. Numa outra forma de realização mais preferida, a suspensão de lipidos é aquecida no passo (3) até uma temperatura de pelo menos cerca de 67°C. 44. Numa outra forma de realização ainda mais preferida, são usados dois filtros hidrofílicos com 0,2 pm no passo (4) .

Formulação E previsto que a presente invenção seja praticada numa escala de pelo menos multigramas, escala de quilogramas, escala de multiquilogramas, ou escala industrial. Escala de multigramas, tal como aqui utilizado, é preferencialmente a escala em que pelo menos uma das matérias-primas está presente numa quantidade de 10 gramas ou mais, mais preferencialmente de pelo menos 50 gramas ou mais, até mais preferencialmente de pelo menos 100 gramas ou mais. A escala de multiquilogramas, tal como aqui utilizada, deve significar a escala em que se utiliza mais do que um quilograma de pelo menos uma das matérias-primas. A escala industrial, tal como aqui utilizado, deve significar uma escala que é outra que não a escala de laboratório, e a qual é suficiente para fornecer produto suficiente para testes clínicos ou distribuição a consumidores. 13

Mistura de lípidos ou mistura de fosfolipidos, tal como utilizado aqui, deve representar dois ou mais lípidos, os quais foram misturados. A mistura de lípidos é geralmente em forma de pó. A mistura de lípidos contém 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC), sal monossódico de ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico (dppa) e sal monossódico de N-(metoxipolietilenoglicol 5000 carbamoil)-1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (MPEG5000-DPPE). A quantidade de cada lípido presente na mistura irá depender do produto final desejado. As proporções de cada lípido preferidas são descritas na secção de Exemplos. Uma vasta variedade de outros lípidos, como aqueles descritos em Unger et al., Patente U.S. N°. 5,469,854 pode ser usada no presente processo.

Fosfolípido, tal como aqui utilizado, é uma substância gorda contendo uma ou mais cadeias de hidrocarbonetos gordos (hidrofóbicos) com um grupo de cabeça polar (hidrofílico) fosfórico. Os fosfolipidos são anfifílicos. Formam espontaneamente limites e vesículas fechadas em meio aquoso. Os fosfolípidos constituem cerca de 50% da massa da membrana plasmática das células animais.

Preparação da mistura de lípidos A mistura de lípidos pode ser preparada através de um processo de liofilização em suspensão aquosa ou um processo de dissolução-precipitação de solvente orgânico, usando solventes orgânicos. No processo de liofilização em suspensão aquosa, os lípidos desejados são suspensos em água a uma temperatura elevada e depois concentrados por 14 liofilização. Utiliza-se preferencialmente um processo de dissolução.

Passo (a): 0 processo de dissolução-precipitação de solvente orgânico envolve o contacto dos lipidos desejados (por exemplo, DPPA, DPPC, e MPEG5000DPPE) com um primeiro sistema de solvente não aquoso. Este sistema é tipicamente uma combinação de solventes, como por exemplo CHCl3/MeOH, CH2Cl2/MeOH, e tolueno/MeOH. Preferencialmente, o primeiro solvente não aquoso é uma mistura de tolueno e metanol. Pode ser vantajoso aquecer a solução de lipidos a uma temperatura suficiente para atingir a dissolução completa. Tal temperatura é, de preferência, 25 a 75°C, mais preferencialmente 35 a 65°C.

Após a dissolução, pode-se desejar remover matéria estranha não dissolvida através de filtração a quente ou arrefecendo à temperatura ambiente e filtrando depois. Métodos de filtração conhecidos podem ser utilizados (por exemplo, filtração por gravidade, filtração a vácuo, ou filtração a pressão).

Passo (b): A solução é então concentrada até se obter um gel ou semi-sólido espesso. A concentração faz-se de preferência por destilação a vácuo. Também podem ser utilizados outros métodos para concentrar a solução, tais como evaporação rotativa. A temperatura deste passo é, de preferência, 20 a 60°C, mais preferencialmente 30 a 50°C. 15

Passo (c): 0 gel/semi-sólido espesso é então disperso num segundo solvente não aquoso. A mistura é suspensa, preferencialmente à temperatura ambiente (por exemplo, 15 -30°C). Segundos solventes não aquosos úteis são aqueles que levam à precipitação dos lipidos da solução filtrada. 0 segundo solvente não aquoso é, preferencialmente, metil t-butil éter (MTBE). Outros éteres e álcoois podem também ser usados.

Passo (d):

Os sólidos produzidos após a adição do segundo solvente não aquoso são então recolhidos. Preferencialmente, os sólidos recolhidos são lavados com outra fracção do segundo solvente não aquoso (por exemplo, MTBE). A recolha pode ser realizada através de filtração a vácuo ou centrifugação, de preferência à temperatura ambiente. Após a recolha, é preferido que os sólidos sejam secos in vacuo a uma temperatura de 20-60°C. 0 processo de dissolução-precipitação por solvente orgânico é preferido em detrimento do processo de liofilização em suspensão aquosa, pelas seguintes razões: (1) Uma vez que os lipidos são bastante solúveis em tolueno/metanol, os volumes de solvente são significativamente reduzidos (em relação ao procedimento em suspensão aquosa). (2) Devido a esta solubilidade aumentada, a temperatura de processo também é mais baixa em relação ao 16 procedimento em suspensão aquosa, evitando-se assim a instabilidade hidrolitica de ésteres de ácidos gordos. (3) Quando arrefecida até atingir de novo a temperatura ambiente, a solução de lípidos de tolueno/metanol permanece homogénea, permitindo a remoção de matéria estranha sólida por filtração à temperatura ambiente. (4) A precipitação do MTBE permite o isolamento rápido e fácil de sólidos de mistura de lipidos. Com o processo aquoso, é usado um processo de liofilização demorado para isolar o material. (5) A precipitação do MTBE também permite a remoção de quaisquer impurezas solúveis em MTBE, que vão para o fluxo de residuos do filtrado. Este potencial de remoção de impurezas não é possível quando uma solução é directamente concentrada ou liofilizada a sólido. (6) 0 presente processo proporciona sólidos uniformes. Preparação da suspensão de lípidos

Passo (1):

No passo 1, uma mistura de lípidos é colocada em contacto com um solvente não aquoso, em que a mistura de lípidos é dissolvida substancialmente no solvente não aquoso. Em alternativa, os lípidos podem ser colocados em contacto com o solvente não aquoso individualmente, e sequencialmente na ordem: DPPC, DPPA, e MPEG5000-DPPE; DPPC, MPEG5000-DPPE, e DPPA; MPEG5000-DPPE, DPPA, e DPPC; ou MPEG5000-DPPE, DPPC, e DPPA. 0 DPPA; sendo o menos solúvel e menos abundante dos 17 lípidos, não é adicionado primeiro. Adicionar um dos outros lipidos antes de ou concomitantemente à adição do DPPA facilita a dissolução do DPPA. Numa outra alternativa, os lipidos individuais podem ser combinados nas suas formas sólidas e a combinação dos sólidos colocada em contacto com o solvente não aquoso. A dissolução substancial é geralmente indicada quando a mistura da composição de lipidos e solvente não aquoso se torna límpida. Tal como notado previamente, os fosfolipidos não são geralmente solúveis em água. Por conseguinte, a introdução directa de uma mistura de fosfolipidos num ambiente aquoso leva à agregação da mistura de lipidos e à formação de grumos que são muito difíceis de dispersar. A presente invenção ultrapassa esta limitação através da dissolução da mistura de lípidos num solvente não aquoso antes da introdução da solução aquosa. Isto permite que seja possível dispersar de forma homogénea a mistura de lípidos num líquido. A dispersão líquida pode então ser introduzida no desejado ambiente aquoso. Não aquoso deve significar um solvente ou mistura de solventes em que a quantidade de água presente é suficientemente baixa para não impedir a dissolução da mistura de lípidos. A quantidade de solvente não aquoso necessária vai depender da solubilidade da mistura de lípidos e também da concentração final de cada componente desejada. Como alguém com competências normais avaliaria, o nível de água presente no solvente não aquoso que pode ser tolerado, vai variar, com base nas solubilidades aquosas dos lípidos individuais presentes na mistura de lípidos. Quanto mais solúveis em água são os fosfolipidos 18 individuais, maior é a quantidade de água que pode estar presente no passo (1).

Preferencialmente, o propilenoglicol é usado como solvente não aquoso. Contudo, outros membros da família poliól, tais como etilenoglicol e polietilenoglicol 300 também podem ser utilizados.

Pode ser necessária a agitação mecânica da mistura de lípidos com o solvente não aquoso para atingir a dissolução completa. Qualquer pessoa com competências normais na especialidade reconheceria que há uma variedade de formas para agitar. A utilização de um homogeneizador de alto cisalhamento é preferida.

Qualquer pessoa com competências normais na especialidade reconheceria que o aumento da temperatura do solvente auxiliaria a dissolução da mistura de lípidos. A temperatura a que o passo (1) pode ser realizado pode variar entre a temperatura ambiente e o ponto de ebulição do solvente escolhido. De preferência, a temperatura varia entre 30 e 70°C, mais preferencialmente entre 45 e 60°C, e ainda mais preferencialmente é cerca de 50, 51, 52, 53, 54, ou 55°C. Quando se utiliza etilenoglicol ou polietilenoglicol 300, é preferível que a temperatura seja de 50 a 60°C e mais preferível cerca de 55°C. Mantendo a solução a uma temperatura elevada deve reduzir a viscosidade e facilitar a preparação da formulação.

Um procedimento preferido para dissolver a mistura de lípidos é o seguinte: (a) Adicionar propilenoglicol a um recipiente de pesagem apropriado. (b) Aquecer o propilenoglicol a cerca de 40-80°C num banho de 19 aquecimento, (c) Pesar a mistura de lípidos num recipiente separado, (d) Quando o propilenoglicol atingir a gama de temperaturas desejada, transferir a solução para o recipiente contendo a mistura de lipidos. (e) Colocar o recipiente de volta no banho de aquecimento até que a solução se torne límpida. (f) agitar mecanicamente a solução de mistura de lipidos/propilenoglicol para assegurar a dissolução completa e dispersão uniforme da mistura de lipidos. A razão de mistura de lipidos para solvente não aquoso será, obviamente, limitada pela solubilidade da mistura de lipidos. Esta razão também vai ser influenciada pela quantidade desejada de mistura de lipidos na formulação final. Preferencialmente, a razão é de 1 mg de mistura de lipidos por mL de solvente (mg/mL) até 100 mg/mL. Mais preferencialmente, a mistura de lipidos está presente numa quantidade de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 mg/mL. Ainda mais preferencialmente, a mistura de lipidos está presente a cerca delO mg/mL.

Passo (2): O segundo passo envolve colocar a solução obtida no passo (1) em contacto com uma solução aquosa para formar uma suspensão de lipidos. A solução aquosa pode ser água, solução salina, uma mistura de solução salina/glicerina ou uma mistura de solução salina/glicerina/solvente não aquoso. O solvente não aquoso é, tal como definido anteriormente, preferencialmente propilenoglicol. Suspensão, tal como aqui utilizado, deve indicar uma dispersão na qual partículas insolúveis são dispersas num meio líquido. 20

Uma vez atingida a dissolução completa da mistura de lipidos (passo(l)), a solução resultante pode ser então introduzida numa solução aquosa. A solução aquosa pode conter um ou mais componentes seleccionados de cloreto de sódio, glicerina, e um solvente não aquoso. Preferencialmente, a solução aquosa contém glicerina e cloreto de sódio. De preferência, uma quantidade suficiente de propilenoglicol está presente na solução aquosa, antes da adição da solução obtida no passo 1, de forma a atingir a concentração final de propilenoglicol desejada. Não é esperado que a ordem de adição dos componentes desejados influencie seriamente a suspensão de lipidos resultante. Contudo, é preferível que a solução de mistura de lipidos seja adicionada à água, que pode já conter os componentes adicionais mencionados anteriormente. Componentes adicionais desejados podem então ser adicionados. É mais preferível que a solução de mistura de lipidos seja adicionada a uma solução de água e cloreto de sódio (ou seja, solução salina). É também preferível que a solução de mistura de lipidos seja adicionada a uma solução de água, cloreto de sódio, e glicerina. É ainda mais preferível que a solução de mistura de lipidos seja adicionada a uma solução de água, cloreto de sódio, glicerina e propilenoglicol. É preferido que estejam presentes 6,8 mg de NaCl por mL de formulação. Preferencialmente, estão presentes 0,1 mL de glicerina por mL de formulação. Uma concentração final de 0,1 mL de propilenoglicol por mL de formulação é preferida. O pH final da formulação é preferencialmente igual a 5,5 - 21 7,0. A mistura de lípidos está presente, preferencialmente, numa quantidade de 0,75-1,0 mg/mL de formulação. A temperatura da solução aquosa pode variar entre a temperatura ambiente e 70°C. De preferência, a temperatura é de 45 a 60°C, sendo que 50, 51, 52, 53, 54, e 55°C é ainda mais preferido. Para se obter a dissolução completa, a mistura terá de ser agitada, preferencialmente misturada. Também pode ser necessário ajustar o pH da solução, dependendo da formulação final desejada. Ácido (por exemplo, HC1) ou base (NaOH) podem ser adicionados para fazer um tal ajuste. A suspensão de lipidos irá conter partículas líquidas de tamanhos variados. Um dos benefícios da presente invenção é a possibilidade de obter pequenas partículas de tamanho quase uniforme. Assim, é preferido que a maioria das partículas obtidas apresente um diâmetro menor do que 100 nm, mais preferencialmente menor do que 50 nm.

Um procedimento preferido para a dissolução da mistura de lípidos é o seguinte: (a) Adicionar água para injecção (WFI) a um recipiente de composição, (b) Começar a misturar e garantir que a temperatura se encontra na gama de 50-55°C. (c) Adicionar cloreto de sódio ao recipiente de composição. Esperar até que o sólido se tenha dissolvido completamente antes de prosseguir para o passo seguinte, (d) Adicionar glicerina ao recipiente de composição. Deixar tempo suficiente para a mistura ser completa, (e) Adicionar o restante propilenoglicol que não está na solução de mistura de lípidos/propilenoglicol. Deixar tempo suficiente para a mistura ser completa, (f) Reduzir a velocidade de mistura para reduzir a turbulência no recipiente de 22 composição. (g) Adicionar a solução de mistura de lipidos/propilenoglicol ao recipiente de composição, (h) Reajustar a velocidade de mistura para a original, (i) Adicionar mais WFI se necessário, (j) Continuar a misturar durante aproximadamente 25 minutos e assegurar a mistura completa, (k) Verificar e ajustar a solução para o pH desejado.

Passo (3): 0 passo três envolve o aquecimento da suspensão de lipidos obtida no passo (2) até uma temperatura mais ou menos igual ou superior à temperatura máxima de transição de fase de gel para cristalina liquida dos lipidos presentes na solução.

Um dos objectivos deste passo é fornecer uma suspensão filtrável. Uma solução/suspensão é considerada filtrável se não houver redução significativa da taxa de fluxo dentro de um processo normal, e se não houver aumento significativo da queda de pressão no sistema de filtração.

Dados experimentais indicam que os lipidos na formulação devem estar acima da transição de fase de gel para cristalina liquida, para ser possível simplificar a filtração estéril. Quando os lipidos estão abaixo da temperatura de transição de fase, as partículas da suspensão são rigidas. Contudo, quando eles estão acima da respectiva temperatura de transição de fase de gel a cristalina liquida, estão numa configuração organizada de forma mais solta e por isso, são filtrados mais facilmente. 23 DPPC e DPPA apresentam transições de fase de 41°C e 67°C, respectivamente. 0 MPEG5000-DPPE é solúvel em água, e por isso não exibe uma transição de fase de gel a cristalina liquida caracteristica da maioria das suspensões de lipidos hidratadas. Uma vez que os todos os lipidos na formulação preferida exibem transições de fase de gel para cristalina liquida diferentes, a temperatura de transição mais elevada, 67°C, é preferencialmente utilizada para filtrar a solução. Mantendo a temperatura a, ou acima de 67°C, todos os lipidos estão acima das suas respectivas transições de fase, garantindo a configuração solta enquanto passam pelos filtros. 0 aquecimento pode ser atingido envolvendo o recipiente de composição com uma serpentina de permuta de calor. Água/corrente quente de uma fonte controlada, por exemplo, de um banho de água quente, forneceria calor suficiente para manter a solução de composição a uma temperatura determinada. Outras fontes de calor conhecidas dos peritos na especialidade também poderiam ser utilizadas.

Passo (4) : 0 passo quatro é realizado através da filtração da suspensão de lipidos através de um filtro de esterilização. 0 objectivo deste passo é fornecer uma suspensão substancialmente livre de bactérias. Um filtrado é considerado substancialmente livre de bactérias quando a probabilidade do filtrado conter pelo menos um microorganismo capaz de formar colónias é menos de 10~6. A filtração é realizada preferencialmente usando cartuchos de filtros de esterilização. Uma forma de forçar a solução 24 através dos filtros pode também ser necessária (por exemplo, com a utilização de bombas ou pressão). Uma vez que a solução que é filtrada precisa de ser mantida a uma temperatura igual ou superior à temperatura máxima de transição de fase de gel para cristalina liquida dos lipidos presentes na solução, a filtração deve ser realizada a uma temperatura equivalente. Para atingir esta condição, o filtro (por exemplo cartuchos de filtros de esterilização) são incluídos preferencialmente em carcaças de filtros revestidas que são continuamente aquecidas, por exemplo, através de uma corrente de água quente de um banho de água de temperatura controlada, para garantir que a suspensão está acima das temperaturas de transição de fase dos lipidos. A temperatura do filtro de esterilização é preferencialmente de 50 a 100°C, mais preferencialmente de 60 a 90°C, e ainda mais preferencialmente 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80°C.

Um ou mais filtros de esterilização podem ser utilizados para filtrar a suspensão. O número necessário será baseado na sua eficácia para remover bactérias. De preferência usam-se dois filtros. O tamanho dos poros dos filtros será limitado pela necessidade de fornecer uma suspensão livre de bactérias. De preferência, filtros hidrofílicos de 0,2 pm são usados.

Uma solução primária da formulação preferida foi filtrada continuamente através de dois filtros hidrofílicos com 0,2 pm durante no máximo 3 horas a uma velocidade de aproximadamente 1 litro por minuto (1 L/min), ou seja, passando um total de 180 litros da solução de suspensão através dos filtros. Os resultados experimentais mostram que não há bloqueio aparente dos filtros. Ensaios de 25 lípidos indicam que não há perda mensurável durante o processo de filtração (devido a acumulação no meio de filtro) .

Uma solução primária da formulação preferida foi preparada a 40-80°C, e a suspensão foi arrefecida à temperatura ambiente antes de se proceder à filtração estéril. Não se observou nenhum entupimento aparente dos filtros, indicando que a distribuição do tamanho das partículas da solução está bem abaixo dos 0,2 pm do tamanho dos poros do filtro. É desejável usar calor durante a filtração para garantir uma recuperação máxima da mistura de lípidos no filtrado estéril (isto é, para minimizar a potencial retenção de partículas de lípidos no meio de filtro).

Um procedimento preferido para filtrar a suspensão de lípidos é o seguinte: (a) Garantir que todos os filtros revestidos se encontram a 70°C - 80°C. (b) Garantir que todas as válvulas na unidade de filtração estão fechadas, (c) Ligar o tubo de entrada da filtração à saída do recipiente de composição. (d) Abrir as válvulas para permitir que a solução passe através dos filtros. (e)

Descarregar 3 litros de solução através dos filtros antes de recolher o filtrado, (f) Continuar a filtração até estar completa.

Passo (5):

Distribuir a solução filtrada num frasco completa o passo cinco. Este passo é realizado preferencialmente numa área asséptica controlada. Alguém com competências normais na especialidade reconheceria que o frasco seleccionado e a quantidade de suspensão colocada no frasco dependeriam da 26 utilização final pretendida para a suspensão de lipidos. A distribuição pode ser feita através de uma variedade de métodos, incluindo pipetas, equipamento de distribuição de líquidos manuais tipo serinqa (por exemplo, máquina de distribuição de líquidos com seringa Filamatic®), ou máquinas de distribuição de líquidos industriais ou automáticas (por exemplo máquinas de enchimento automático Cozzoli ou TL).

Passo (6): 0 passo seis é realizado procedendo à troca do gás do espaço de cabeça dos frascos obtidos no passo cinco, com um gás de perfluorocarbono. Um método preferido para a troca é carregar os frascos onde a suspensão foi colocada numa câmara de liofilização e substituir o gás do espaço de cabeça do frasco com um gás perfluorocarbono. Um gás preferido é perfluoropropano (PFP) . Outros métodos de troca do gás do espaço de cabeça conhecidos do perito na especialidade, podem ser empregues.

Os frascos são fechados no final do ciclo de troca do gás do espaço de cabeça do frasco. Quando a pressão da câmara do liofilização voltar a ser igual à pressão atmosférica, introduzindo na câmara PFP. As tampas dos frascos são colocadas para selar os frascos .

Passo (7) : 0 passo sete envolve a esterilização terminal dos frascos após o passo seis. Um método de esterilização terminal é através do uso de um autoclave. Os frascos fechados também podem ser sujeitos a esterilização terminal num 27 esterilizador de vapor para aumentar a garantia de esterilidade do produto. Devem ser tomados cuidados durante o processo de esterilização uma vez que pode ser observada alguma degradação dos lipidos como resultado da autoclavagem. Preferencialmente, o frasco é esterilizado a 126-130°C durante 1 a 10 minutos.

Outras caracteristicas da invenção serão evidentes no decurso das seguintes descrições de exemplos de formas de realização, os quais são fornecidos para ilustrar a invenção e não devem ser limitativos.

EXEMPLOS

Tabela 1: Composição alvo da mistura de lipidos

Nome do Lípido Nome Comum % em peso % molar DPPA Sal monossódico de ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidico 6,0 10 DPPC 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina 53,5 82 MPEG5000 DPPE Sal monossódico de N-(metoxipolietilenoglicol 5000 carbamoil)-1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina 40,5 8 28

Procedimento de produção de mistura de lipidos

Um frasco é carregado com tolueno (3,3 L), metanol (1,2 L), DPPA (59,6 g), DPPC (535 g), e MPEG5000 DPPE (405 g) . Após limpar as superfícies em contacto com os sólidos com 0,9 L de metanol, a mistura é aquecida a 45-55°C até a dissolução ser completa. A solução é filtrada e depois concentrada in vacuo a 35-45°C até atingir a forma de gel espesso. Metil t-butil éter (MTBE, 5,4 L) é adicionado e a mistura é suspensa a 15-30°C. Os sólidos brancos são recolhidos por centrifugação ou filtração a vácuo, e lavados com MTBE (0,9 L) . Os sólidos são então colocados num forno a vácuo e secos a 40-50°C até atingirem um peso constante. A mistura de lipidos seca é transferida para um frasco e armazenada a uma temperatura de -15 a -25°C.

Numa outra forma de realização do processo de fabrico da mistura de lipidos da presente invenção, também pode ser usado o seguinte procedimento. 29

Procedimento alternativo para o fabrico de mistura de lípidos

As quantidades de fosfolípidos foram ajustadas para a pureza com base num valor de "utilização como" dos certificados de análise. 0 tamanho do lote (peso combinado dos fosfolípidos) desta experiência foi 2 Kg.

Um frasco de evaporação rotativa é carregado sequencialmente com tolueno (3.300 mL), metanol (1.200 mL), DPPA (122,9 g; corrigido para pureza de "utilização como" de 97,0%), DPPC (1.098,5 g totais; 500,8 g de um lote com 98,4% de pureza de "utilização como" e 597, 7 g de um lote com 96,7% de pureza de "utilização como"), e MPEG5000 DPPE (815,7 g; corrigido para pureza de "utilização como" de 99,3%). Depois de limpar sólidos residuais do frasco com metanol (900 mL), o frasco foi colocado num evaporador rotativo (sem vácuo) e a mistura foi aquecida até entre 45 30 e 55°C (externa) . Após a dissolução estar completa, a temperatura externa é reduzida para entre 35 e 45°C, vácuo é aplicado, e a solução é concentrada até um semi-sólido branco ser obtido. O frasco é removido do evaporador e os sólidos são partidos com uma espátula. O frasco é novamente colocado no evaporador e a concentração é continuada. Depois de atingir o ponto final (pressão de vácuo final2 20 mbar; sólido branco, granular, espesso), MTBE (5.400 mL) é adicionado através do tubo de adição do evaporador rotativo, o vácuo é descontinuado, e a mistura é suspensa durante 15 a 45 minutos, a 15 a 30°C. Os sólidos são isolados através de centrifugação ou filtração a vácuo, enxaguados com MTBE (3.800 mL), e secos até atingirem peso constante num forno a vácuo (40 a 50°C). Antes da transferência para frascos de polietileno com tampas de polipropileno, os sólidos são desagregados através de um crivo (malha com 0,079 inch), resultando em 1.966,7 g (98%) de mistura de lipidos (SG896) na forma de sólido branco. A suspensão de lipidos preferida contém:

Sal monossódico de ácido de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico (DPPA); 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC),

Sal monossódico de N-(metoxipolietilenoglicol 5000 carbamoil)-1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (MPEG5000-DPPE);

Propilenoglicol, USP;

Glicerina, USP; 31

Cloreto de sódio, USP; e, Água para injecção, USP.

Tabela 2: Formulações preferidas de agente de contraste

Componente A* B* NaCl, USP 6,8 mg/mL 6,8 mg/mL Glicerina, USP 0,1 mL/mL 0,1 mL/mL Propilenoglicol, USP 0,1 mL/mL 0,1 mL/mL Mistura de lipidos** 1 mg/mL 0,75 mg/mL Perfluoropropano > 65% > 65% pH Oh O 1 >« o 6,0 - 7,0 * A formulação A tem 1 mg/mL de mistura de lipidos. A formulação B tem uma concentração de mistura de lipidos de 0,75 mg/mL. ** A mistura de lipidos consiste em 53,5% em peso de DPPC, 6,0% em peso de DPPA e 40,5% em peso de MPEG5000-DPPE.

Tabela 3: Recipiente e forma de fecho preferidos

Componente Tipo Frasco Frasco de silex Wheaton 2802, B33BA, 2cc, 13mm, Tído I Tampa Tampas de borracha butilica cinza lio, com silicone West V50 4416/50, 13mm Selo Selos de alumínio West 3766, branco 13mm, flip-off 0 volume de enchimento do produto acabado pode ser de 1,0-2,0 mL/frasco.

Na preparação da formulação preferida, quando a mistura de lipidos é directamente hidratada com uma solução matriz 32 aquosa contendo água para injecção, cloreto de sódio, glicerina e propilenoglicol, os filtrados têm menos lípidos em comparação com a solução primária pré-filtração. A perda de lipidos varia entre 12% e 48%. Estes resultados demonstram que o processo de filtração estéril não é eficazmente controlado, e por isso, o conteúdo em lipidos do produto final é altamente variável.

Em contraste, usando o processo presentemente descrito, os resultados de ensaios ao conteúdo de lípidos demonstram a recuperação completa de lípidos durante o processo de filtração. A variabilidade dos resultados dos ensaios à volta dos alvos teóricos está dentro da variabilidade normal do método de ensaio. A distribuição do tamanho das partículas em número, volume e intensidade reflectiva de uma suspensão preparada solubilizando primeiro a mistura de lípidos em propilenoglicol indica que a maioria das partículas tem menos do que 50 nm na solução pré-filtração a 55°C assim como a 70°C. O perfil de distribuição das partículas não se altera após filtração.

SECÇÃO DE UTILIDADE O processo presentemente reivindicado é útil para a preparação de agentes de contraste para ultra-sonografia. Estes agentes devem ser úteis para uma variedade de aplicações de imagiologia, incluindo contraste aumentado em imagens de ultra-sonografia radiológica e ecocardiográfica.

Lisboa, 10 de Fevereiro de 2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para preparar uma mistura de lípidos, compreendendo: (a) colocar lípidos em contacto com um primeiro solvente não aquoso; (b) concentrar a solução até obter um gel espesso; (c) colocar o gel espesso em contacto com um segundo solvente não aquoso; e, (d) recolher os sólidos resultantes, em que os lípidos no passo (a) são: (i) 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina; (ii) sal monossódico de ácido 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatídico; e, (iii) sal monossódico de N-(metoxipolietilenoglicol 5000 carbamoil)-1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3- fosfatidiletanolamina.

2. Um processo de acordo com a reivindicação 1 em que, no passo (a), o primeiro solvente não aquoso é uma mistura de tolueno e metanol.

3. Um processo de acordo com a reivindicação 1 em que, no passo (c), o segundo solvente não aquoso é um metil t-butil éter. 2

4. Um processo de acordo com a reivindicação 1 em que, no passo (a), a solução é aquecida a uma temperatura suficiente para completar a dissolução dos lípidos no solvente.

5. Um processo de acordo com a reivindicação 4 em que, no passo (a), a solução é aquecida a uma temperatura de 25 a 75°C.

6. Um processo de acordo com a reivindicação 1 em que, no passo (d), os sólidos recolhidos são lavados com metil t-butil éter e secos em vácuo.

7. Um processo para a preparação de uma suspensão de fosfolípidos, compreendendo: (1) colocar em contacto uma mistura de lípidos preparada de acordo com o processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 6 com um solvente não aquoso, em que a mistura de lípidos se dissolve substancialmente no solvente não aquoso; e (2) colocar em contacto a solução obtida no passo (1) com uma solução aquosa para formar uma suspensão de lípidos.

8. Um processo de acordo com a reivindicação 7, em que o solvente não aquoso é seleccionado de propilenoglicol, etilenoglicol, e polietilenoglicol 300.

9. Um processo de acordo com a reivindicação 8, em que o solvente não aquoso é propilenoglicol. 3

10. Um processo de acordo com a reivindicação 8, em que o solvente não aquoso é aquecido a uma temperatura de 30 a 70°C antes de ser colocado em contacto com a mistura de lipidos.

11. Um processo de acordo com a reivindicação 10, em que o solvente não aquoso é aquecido a uma temperatura de 50 a 55°C antes de ser colocado em contacto com a mistura de lipidos.

12. Um processo de acordo com a reivindicação 8, em que a razão de mistura de lipidos para solvente não aquoso é de 5 mg de mistura de lipidos por mL de solvente não aquoso até 15 mg/mL.

13. Um processo de acordo com a reivindicação 12, em que a razão de mistura de lipidos para solvente não aquoso é de cerca de 10 mg/mL.

14. Um processo de acordo com a reivindicação 8, em que, no passo (2), a solução aquosa é seleccionada de água, solução salina, uma mistura de solução salina/glicerina, e uma mistura de solução salina/glicerina/solvente não aquoso.

15. Um processo de acordo com a reivindicação 14, em que a solução aquosa é uma mistura de solução salina e glicerina.

16. Um processo de acordo com a reivindicação 14, em que a solução aquosa é uma mistura de solução salina, glicerina e propilenoglicol.

17. Um processo de acordo com a reivindicação 16, em que 6,8 mg/mL de cloreto de sódio estão presentes, 0,1 mL/mL de 4 glicerina estão presentes, 0,1 mL/mL de propilenoglicol estão presentes, e 0,75 a 1,0 mg/mL de mistura de lipidos estão presentes.

18. Um processo de acordo com a reivindicação 12, em que 0,75 mg/mL de mistura de lipidos estão presentes.

19. Um processo de acordo com a reivindicação 17, em que 1,0 mg/mL de mistura de lipidos estão presentes.

20. Um processo de acordo com a reivindicação 8 ou 10, em que, no passo (2), a solução aquosa é aquecida a uma temperatura de 45 a 60°C antes de ser colocada em contacto com a solução obtida no passo (1).

21. Um processo de acordo com a reivindicação 20, em que a solução aquosa é aquecida a uma temperatura de 50 a 55°C antes de ser colocada em contacto com a solução obtida no passo (1).

22. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7, 10 e 12, em que o processo compreende ainda: (3) aquecer a suspensão de lipidos obtida no passo (2) a uma temperatura igual ou superior à temperatura máxima de transição de fase de gel a cristalina liquida dos lipidos presentes na suspensão.

23. Um processo de acordo com a reivindicação 22, em que, no passo (3), a suspensão de lipidos é aquecida a uma temperatura de pelo menos cerca de 67°C. 5

24. Um processo de acordo com a reivindicação 22, em que o processo compreende ainda: (4) filtrar a suspensão de lipidos através de um filtro de esterilização.

25. Um processo de acordo com a reivindicação 24, em que, no passo (4), a filtração é realizada usando dois cartuchos de filtros de esterilização.

26. Um processo de acordo com a reivindicação 25, em que, no passo (4), os cartuchos de filtros de esterilização se encontram a uma temperatura de 70 a 80°C.

27. Um processo de acordo com a reivindicação 26, em que, no passo (4), são utilizados filtros hidrofílicos com 0,2 pm.

28. Um processo de acordo com a reivindicação 24, em que o processo compreende ainda: (5) colocar a solução filtrada no passo (4) num frasco.

29. Um processo de acordo com a reivindicação 28, em que o processo compreende ainda: (6) substituir o gás do espaço de cabeça do frasco do passo (5) por um gás perfluorocarbono.

30. Um processo de acordo com a reivindicação 29, em que o gás perfluorocarbono é perfluoropropano. 6

31. Um processo de acordo com a reivindicação 30, em que a substituição do gás do espaço de cabeça é realizada usando uma câmara de liofilização.

32. Um processo de acordo com a reivindicação 29, em que o processo compreende ainda: (7) esterilizar o frasco obtido no passo (6).

33. Um processo de acordo com a reivindicação 32, em que, no passo (7), o frasco é esterilizado a 126-130°C durante 1 a 10 minutos. Lisboa, 10 de Fevereiro de 2010