PL196531B1 - Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym z naturalnego surowca przez enzymatyczną hydrolizę białka - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym z naturalnego surowca przez enzymatyczną hydrolizę białka, znamienny tym, że bielmo nasion ostropestu plamistego (Silybum rnarianum) poddaje się hydrolizie przez 4-12 godzin, w temperaturze 30-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 7,4-8,3, z zastosowaniem jako katalizatora pankreatyny lub mieszaniny enzymów zawierającej trypsynę i chymotrypsynę, po czym z hydrolizatu wydziela się frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 1000 do 2500, zawierającą peptydy posiadające od 6 do 25 reszt aminokwasowych w cząsteczce.

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 196531 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 347652 ^{(51) Int.Cl.}

A61K 36/28 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01) C07K 1/12 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 21.05.2001

Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym z naturalnego surowca przez enzymatyczną hydrolizę białka

	(73) Uprawniony z patentu: Instytut Chemii Przemysłowej im. Prof. Ignacego Mościckiego,Warszawa,PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.12.2002 BUP 25/02	(72) Twórca(y) wynalazku:
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	Bożenna Baranowska,Warszawa,PL Andrzej W. Lipkowski,Warszawa,PL Aleksandra Szczucińska,Warszawa,PL Halina Niziołek,Warszawa,PL
31.01.2008 WUP 01/08	(74) Pełnomocnik: Anna Królikowska, Instytut Chemii Przemysłowej, im.Prof Ignacego Mościckiego

(57) 1. Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym z naturalnego surowca przez enzymatyczną hydrolizę białka, znamienny tym, że bielmo nasion ostropestu plamistego (Silybum rnarianum) poddaje się hydrolizie przez 4-12 godzin, w temperaturze 30-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 7,4-8,3, z zastosowaniem jako katalizatora pankreatyny lub mieszaniny enzymów zawierającej trypsynę i chymotrypsynę, po czym z hydrolizatu wydziela się frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 1000 do 2500, zawierającą peptydy posiadające od 6 do 25 reszt aminokwasowych w cząsteczce.

PL 196 531 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania, z surowca naturalnego, peptydowego preparatu o działaniu przeciwbakteryjnym, hamującego rozwój bakterii Gram dodatnich i Gram ujemnych.

W ostatnich latach otrzymano wiele peptydów antybakteryjnych z róż nych tkanek organizmów żywych, głównie zwierzęcych. Znane są peptydy lub grupy peptydów posiadające działanie biobójcze, a uzyskane:

- z białek skorupiaków i mięczaków (opis patentowy WO 0104294)

- ze skóry ż ab (magaininy) (Nature 404,565 (2000))

- ze skóry ż ab żyjących w Ameryce Północnej (Rana luteiventris, Rana berlandieri, Rana pipiens) (J.Eur.Biochem. (267(3);894-900(2000))

- z ludzkiej skóry (Nature 387 (6606);861(1997)

- z hemoglobiny wołowej (J.Biol.Chem 274(36);25330-4(1999)

- z leukocytów owiec i kóz (Infect.Immunol. 67(8);4106-11(1999)

- z koziej serwatki (Prep.Biochem.Biotechnol., 29(2),189-202(1999)

Występujące w świecie roślinnym peptydy nie są jeszcze dobrze poznane, choć prawdopodobnie odgrywają znaczną rolę fizjologiczną. Peptydy jako takie rzadko znajdowano w tkankach roślinnych. Wiadomo jednak o peptydach przeciwbakteryjnych otrzymanych z białek kukurydzy (opis patentowy US 5905187).

Znany jest sposób hydrolizy surowców białkowych pochodzenia zwierzęcego przy użyciu pankreatyny. Polega on na traktowaniu substratu wodnym roztworem enzymów pankreatynowych (mieszanina trypsyny i chymotrypsyny), przy czym optymalne rezultaty dla znanych procesów (hydroliza kazeiny, żelatyny, hemoglobiny) otrzymuje się przy pH 8,5 - 9,0 w temperaturze 30 - 40°C. Można użyć tychże enzymów przy pH 7,5 w temperaturze 45 - 50°C powodując hydrolizę białka, lecz z nie zadowalającymi rezultatami (Ed.W.Gerhartz „Enzymes in Industry” Weinheim 1990, 86).

Niniejszy wynalazek dotyczy otrzymywania peptydów z białek nasion ostropestu plamistego.

Ostropest plamisty (Silybum marianum) jest cennym surowcem zielarskim, a wyciągi z tej rośliny znane są z działania przeciwzapalnego, antydepresyjnego, przeciwwirusowego, detoksykacyjnego i w związku z tym chroniącego narządy miąższowe takie jak wątroba i nerki przed uszkodzeniem powodowanym przez kontakt z substancjami trującymi. Badania dotyczące białek z ostropestu plamistego oraz peptydów, jakie można z tych białek otrzymać nie są znane.

W trakcie badań prowadzonych nad hydrolizą białek nasion ostropestu plamistego stosowano różne enzymy proteolityczne. Stwierdzono, że tylko niektóre frakcje peptydowe uzyskane w wyniku hydrolizy z zastosowaniem pankreatyny hamują wzrost bakterii Gram dodatniej - gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) oraz bakterii Gram ujemnej - pałeczki okrężnicy (Escherichia coli). Peptydy i frakcje peptydowe otrzymane z tego samego surowca z zastosowaniem innych enzymów nie wykazywały działania przeciwbakteryjnego. W postępowaniu według wynalazku istotne są zarówno warunki hydrolizy protein prowadzonej w celu otrzymania określonych peptydów biobójczych jak i wydzielenie frakcji peptydów posiadających właściwości biobójcze.

Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym, według wynalazku polega na tym, że bielmo nasion ostropestu plamistego poddaje się hydrolizie przez 4-12 godzin, w temperaturze 30-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 7,4-8,3, z zastosowaniem pankreatyny lub mieszaniny enzymów zawierającej trypsynę i chymotrypsynę jako katalizatora, po czym z hydrolizatu wydziela się frakcję peptydową o przeciętnym ciężarze cząsteczkowym od 1000 do 2500 Da, zawierającą peptydy posiadające od 6 do 25 reszt aminokwasowych w cząsteczce

Stwierdzono, że korzystnie jest prowadzić hydrolizę przez 6-10 godzin, w temperaturze 35-40°C.

Korzystnie jest jeśli stosunek wagowy woda : bielmo nasion ostropestu plamistego wynosi odpowiednio 5-12 : 1.

Frakcję peptydową o działaniu przeciwbakteryjnym korzystnie wydziela się przez frakcjonowanie hydrolizatu z zastosowaniem żywic stanowiących sita molekularne.

Jako sito molekularne stosuje się Sephadex LH20.

Korzystnie z hydrolizatu otrzymanego sposobem według wynalazku wydziela się frakcję peptydową zawierającą peptydy posiadające od 6 do 15 grup aminokwasowych w cząsteczce.

Stwierdzono, że preparat peptydowy otrzymany sposobem według wynalazku stanowi frakcjapeptydów zawierająca zwłaszcza reszty aminokwasowe asparginy, glutaminy, seryny, argininy, waliny, tryptofanu, lizyny, leucyny i izoleucyny.

PL 196 531 B1

Frakcja peptydowa o podanej wyżej charakterystyce stanowi produkt finalny procesu prowadzonego sposobem według wynalazku. Jej roztwór wodny o stężeniu nie niższym niż 0,01% powoduje zahamowanie rozwoju bakterii zarówno Gram ujemnych, jak i Gram dodatnich.

Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym przedstawiono w przykł adach, które ilustrują korzystne formy realizacji wynalazku.

P r z y k ł a d I.

Do 64 g odtłuszczonego, mielonego bielma z nasion ostropestu plamistego dodano 386 g wody i mieszają c doprowadzono pH zawiesiny do warto ś ci 7,5 stosują c do tego celu 3n roztwór wodorotlenku sodowego. Doprowadzono temperaturę masy reakcyjnej do 37,5°C, po czym dodano 0,2 g pankreatyny. Reakcję prowadzono przez 8 godzin utrzymując powyższe warunki. Następnie dokonano dezaktywacji enzymu przez ogrzanie mieszaniny reakcyjnej do 90°C, hydrolizat odsączono i zliofilizowano. Liofilizat rozdzielono na frakcje na kolumnie wypełnionej żywicą do filtracji żelowej marki Sephadex LH 20, nanosząc na wierzchołek kolumny metanolowy roztwór hydrolizatu. Pierwsza otrzymana z kolumny frakcja, po usunię ciu metanolu na wyparce obrotowej, charakteryzował a się przecię tnym ciężarem cząsteczkowym 1980 zawierała średnio 15 grup aminokwasowych w cząsteczce peptydu i posiadał a skł ad aminokwasowy przedstawiony w tabeli.

T a b e l a

Skład aminokwasowy preparatu.

Lp	Związek	Stężenie (mmol/gr próbki)	Stężenie (% wag.)
1	Asp	0,686	9,13
2	Glu	0,405	5,96
3	Ser	0,367	3,54
4	His	0,104	1,61
5	Gly	0,315	2,36
6	Thr	0,455	5,42
7	Ala	0,428	3,81
8	Arg	0,394	6,86
9	Tyr	0,007	1,29
10	Val	0,447	5,24
11	Met	0,0178	2,66
12	Trp	0,350	7,15
13	Ile	0,337	4,42
14	Phe	0,129	2,13
15	Leu	0,354	4,64
16	Lyz	0,423	6,18

Preparat o powyższym składzie badano metodą rozcieńczeniową. Stwierdzono, że jego roztwór wodny o stężeniu 0,03% wagowych hamował wzrost drobnoustrojów testowych (Staphyloccocus aureus i Escherichia coli).

P r z y k ł a d II.

g odtłuszczonego bielma z nasion ostropestu plamistego hydrolizowano przy użyciu 0,05% wagowych pankreatyny w stosunku do białka zawartego w bielmie nasion ostropestu, stosując następujące parametry procesu: pH - 8,0, temperatura 40°C, proporcja wagowa woda : bielmo ostropestu = 6:1, czas hydrolizy 6 godzin. Po dezaktywacji enzymu przez ogrzanie mieszaniny reakcyjnej do 90°C, odwirowaniu i wysuszeniu hydrolizatu przeprowadzono rozdział peptydów na frakcje w sposób opisany w przykładzie 1. Preparat biobójczy wyodrębniono z kolumny jako pierwszą frakcję peptydów o przeciętnej zawartości 8 reszt aminokwasowych w cząsteczce.

Preparat biobójczy, otrzymany w powyższy sposóbj stanowiła frakcja hydrolizatu peptydowego posiadająca średni ciężar cząsteczkowy 1055 Da, o przeciętnej zawartości reszt aminokwasowych

PL 196 531 B1 w cząsteczce peptydu wynoszącej 8 i zawierająca w składzie aminokwasowym znaczne ilości asparginy, glutaminy, seryny, argininy, waliny, tryptofanu, lizyny oraz leucyny.

Produkt ten badany metodą rozcieńczeniową hamował wzrost drobnoustrojów testowych (Staphylococcus aureus i Escherichia coli) w roztworze wodnym o stężeniu 0,06% wagowych.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania preparatu peptydowego o działaniu przeciwbakteryjnym z naturalnego surowca przez enzymatyczną hydrolizę białka, znamienny tym, że bielmo nasion ostropestu plamistego (Silybum rnarianum) poddaje się hydrolizie przez 4-12 godzin, w temperaturze 30-50°C, przy pH roztworu wynoszącym 7,4-8,3, z zastosowaniem jako katalizatora pankreatyny lub mieszaniny enzymów zawierającej trypsynę i chymotrypsynę, po czym z hydrolizatu wydziela się frakcję peptydową o przecię tnym ciężarze czą steczkowym od 1000 do 2500, zawierając ą peptydy posiadają ce od 6 do 25 reszt aminokwasowych w cząsteczce.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że z hydrolizatu wydziela się frakcję peptydową zawierającą peptydy posiadające od 6 do 15 grup aminokwasowych w cząsteczce.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się przez 6-10 godzin. w temperaturze 35-40°C.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, stosunek wagowy woda : bielmo nasion ostropestu plamistego wynosi odpowiednio 5-12 : 1.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że frakcję peptydową o działaniu przeciwbakteryjnym wydziela się przez frakcjonowanie hydrolizatu z zastosowaniem sit molekularnych.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako sito molekularne stosuje się Sephadex LH20.

   Departament Wydawnictw UP RP