PL204073B1 - Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający ten polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca ten polipeptyd, zastosowanie tej kompozycji w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom paciorkowcem, sposób diagnozowania zakażenia paciorkowcem, sposób wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca, sposób wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej - Google Patents

Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający ten polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca ten polipeptyd, zastosowanie tej kompozycji w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom paciorkowcem, sposób diagnozowania zakażenia paciorkowcem, sposób wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca, sposób wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej

Info

Publication number
PL204073B1
PL204073B1 PL382438A PL38243899A PL204073B1 PL 204073 B1 PL204073 B1 PL 204073B1 PL 382438 A PL382438 A PL 382438A PL 38243899 A PL38243899 A PL 38243899A PL 204073 B1 PL204073 B1 PL 204073B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
bvh
polypeptide
streptococcus
amino acid
isolated
Prior art date
Application number
PL382438A
Other languages
English (en)
Inventor
Joseé Hamel
Bernard R. Brodeur
Isabelle Pineau
Denis Martin
Clément Rioux
Nathalie Charland
Original Assignee
Id Biomedical Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22351610&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL204073(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Id Biomedical Corp filed Critical Id Biomedical Corp
Publication of PL204073B1 publication Critical patent/PL204073B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3156—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci from Streptococcus pneumoniae (Pneumococcus)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy antygenów, a dokładniej białkowych patogennych antygenów paciorkowca zapalenia płuc, które są stosowane do leczenia i/lub profilaktyki, jako składniki szczepionek. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy izolowanego polinukleotydu, wektora zawierającego izolowany polinukleotyd, komórki gospodarza transfekowanej lub transformowanej za pomocą wektora, sposobu wytwarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowanego polipeptydu, kompozycji do szczepionek i jej zastosowania w leczeniu zakażenia paciorkowcem, sposobu diagnozowania zakażenia paciorkowcem, sposobu wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca, sposobu wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej oraz zastosowania przeciwciała.
S. pneumoniae jest ważnym czynnikiem chorobotwórczym u człowieka, zwłaszcza u niemowląt, ludzi starszych i osób mających obniżoną odporność. Jest to bakteria często izolowana od pacjentów cierpiących na choroby inwazyjne o wysokiej chorobowości i śmiertelności na całym świecie, takie jak: bakteriemia/posocznica, zapalenie płuc, zapalenie opon. Nawet przy odpowiedniej terapii antybiotykowej, zakażenia paciorkowcami nadal prowadzą do wielu zgonów. Pomimo, że pojawienie się leków przeciwko drobnoustrojom zmniejszył ogólną śmiertelność w wyniku chorób wywołanych przez paciorkowce, obecność odpornych organizmów paciorkowców stała się obecnie głównym problemem na świecie. Skuteczne szczepionki przeciwko paciorkowcom mogą mieć ogromny wpływ na zachorowalność i śmiertelność związaną z chorobami wywołanymi przez S. pneumoniae. Szczepionki takie mogłyby być również stosowane do zapobiegania zapaleniom ucha środkowego u niemowląt i małych dzieci.
Wysiłki skierowane na opracowanie szczepionki przeciwko paciorkowcom koncentrowały się na tworzeniu odpowiedzi immunologicznej na pneumokokowy polisacharyd otoczkowy. Na podstawie różnic antygenowych zidentyfikowano ponad 80 serotypów pneumokokowych polisacharydów otoczkowych. Dostępne obecnie szczepionki pneumokokowe, zawierające 23 polisacharydy otoczkowe, które najczęściej powodują choroby, mają znaczącą wadę związaną przede wszystkim ze słabą immunogennością niektórych polisacharydów otoczkowych, różnorodnością serotypów i różnic w rozmieszczeniu serotypów w czasie, obszarach geograficznych i grupach wiekowych. W szczególności zawodność w zabezpieczaniu młodych dzieci przeciwko wszystkim serotypom istniejących szczepionek i szczepionek zawierających koniugaty otoczkowe, które są obecnie intensywnie badane zachęca do badania przydatności innych składników S. pneumoniae. Pomimo, że immunogenność polisacharydów otoczkowych może być poprawiona, specyficzność serotypowa nadal jest głównym ograniczeniem szczepionek opartych na polisacharydach. Zastosowanie antygenowo konserwowanych immunogennych pneumokokowych antygenów białkowych zarówno samych, jak i w połączeniu z dodatkowymi składnikami, stwarza możliwość do stworzenia szczepionek pneumokokowych opartych na białkach.
W dokumencie WO 98/18930 opublikowanym 7 maja 1998 zatytuł owanym „Streptococcus Pneumoniae antigenes and vaccines” opisano pewne polipeptydy, którym przypisano działanie antygenowe. Jednakże, nie stwierdzono żadnej aktywności biologicznej tych polipeptydów.
Dlatego nadal istnieje niezaspokojona potrzeba opracowania antygenów paciorkowców, które mogłyby być używane jako składniki szczepionki w profilaktyce i/lub leczeniu zakażeń paciorkowcami.
Przedmiotem wynalazku jest izolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 80% z sekwencją aminokwasów nr 6, lub polinukleotyd komplementarny do niego.
W jednym z korzystnych wariantów realizacji izolowanego polinukleotydu według wynalazku kodowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 90% z sekwencją aminokwasów nr 6.
W innym korzystnym wariancie realizacji izolowanego polinukleotydu wedł ug wynalazku kodowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 95% z sekwencją aminokwasów nr 6.
W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji izolowanego polinukleotydu według wynalazku kodowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów nr 6.
W nastę pnym korzystnym wariancie realizacji izolowanego polinukleotydu wedł ug wynalazku kodowany polipeptyd jest zdolny do wytwarzania przeciwciał wykazujących specyficzność wiązania wobec polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasów nr 6, oraz ten kodowany polipeptyd jest zdolny do wywoływania u osobnika reakcji immunologicznej na paciorkowce.
PL 204 073 B1
Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 80% z sekwencją nukleotydów nr 5 lub polinukleotyd komplementarny do niego. W jednym z korzystnych wariantów realizacji izolowany polinukleotyd według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 90% z sekwencją nukleotydów nr 5. W innym korzystnym wariancie realizacji izolowany polinukleotyd według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 95% z sekwencją nukleotydów nr 5. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji izolowany polinukleotyd według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydów nr 5.
W jednym z korzystnych wariantów realizacji przedmiotowego wynalazku izolowany polinukleotyd ma postać DNA.
W innym korzystnym wariancie realizacji przedmiotowego wynalazku izolowany polinukleotyd ma postać RNA.
Przedmiotem wynalazku jest również wektor zawierający izolowany polinukleotyd według wynalazku, który to wektor jest funkcjonalnie połączony z regionem kontroli ekspresji.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą wektora według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd według wynalazku, obejmujący hodowlę komórek gospodarza według wynalazku w warunkach odpowiednich do uzyskania ekspresji tego polipeptydu. W jednym z korzystnych wariantów realizacji sposób według wynalazku obejmuje ponadto izolowanie polipeptydu z hodowli komórek gospodarza. W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku polipeptyd jest polipeptydem rekombinowanym.
Przedmiotem wynalazku jest również izolowany polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 80% z sekwencją aminokwasów nr 6. W jednym z korzystnych wariantów realizacji izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 90% z sekwencją aminokwasów nr 6. W innym korzystnym wariancie realizacji izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 95% z sekwencją aminokwasów nr 6. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji izolowany polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasów nr 6. W następnym korzystnym wariancie realizacji izolowanego polipeptydu według wynalazku z sekwencji nr 6 jest usunięta N-terminalna reszta metioninowa. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji izolowanego polipeptydu według wynalazku z sekwencji nr 6 jest usunięta wydzielnicza sekwencja aminokwasów. W dalszym korzystnym wariancie realizacji izolowany polipeptyd według wynalazku jest przyłączony do sacharydu. W następnym korzystnym wariancie realizacji izolowany polipeptyd według wynalazku jest zdolny do wytwarzania przeciwciał wykazujących specyficzność wiązania wobec polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasów nr 6. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji izolowany polipeptyd według wynalazku jest zdolny do wywoływania u osobnika reakcji immunologicznej na paciorkowce. W dalszym korzystnym wariancie realizacji izolowanego polipeptydu według wynalazku paciorkowiec jest wybrany spośród Streptococcus pneumoniae, grupy A Streptococcus (Streptococcus pyogenes), grupy B Streptococcus (Streptococcus agalactiae), Streptococcus dysgalactiae, lub Streptococcus uberis. W szczególnie korzystnym wariancie realizacji izolowany polipeptyd według wynalazku paciorkowcem jest Streptococcus pneumoniae.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do szczepionek zawierająca skuteczną profilaktycznie lub terapeutycznie ilość polipeptydu według wynalazku, oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik. W jednym z korzystnych wariantów realizacji kompozycja do szczepionek według wynalazku zawiera ponadto farmaceutycznie akceptowalny adjuwant.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zakażeniu osobnika paciorkowcem. W jednym z korzystnych wariantów realizacji zastosowania według wynalazku zakażenie paciorkowcem obejmuje zapalenie opon, zapalenie ucha środkowego, bakteriemię lub zapalenie płuc. W innym korzystnym wariancie realizacji zastosowania według wynalazku osobnikiem jest ssak, a w szczególności człowiek. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji zastosowania według wynalazku zakażenie paciorkowcem jest wywołane przez Streptococcus pneumoniae, grupę A Streptococcus (Streptococcus pyogenes), grupę B Streptococcus (Streptococcus agalactiae), Streptococcus dysgalactiae lub Streptococcus uberis. W dalszym korzystnym wariancie realizacji zastosowania według wynalazku zakażenie paciorkowcem jest wywołane przez Streptococcus pneumoniae.
PL 204 073 B1
Przedmiotem wynalazku jest także sposób diagnozowania zakażenia paciorkowcem, obejmujący:
(a) inkubację przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, z próbką biologiczną od pacjenta do utworzenia mieszaniny, przy czym przeciwciało lub jego fragment wykazuje specyficzność wiązania wobec polipeptydu według wynalazku; oraz (b) wykrywanie specyficznie związanego przeciwciała, lub jego fragmentu wiążącego antygen, w mieszaninie, co wskazuje na obecność paciorkowca.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca w próbce biologicznej, obejmujący:
(a) inkubację polipeptydu według wynalazku lub jego fragmentu, z próbką biologiczną od pacjenta do utworzenia mieszaniny; oraz (b) wykrywanie specyficznie związanego peptydu lub jego fragmentu w mieszaninie, co wskazuje na obecność przeciwciała, które wykazuje specyficzność wiązania wobec antygenów paciorkowców.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej, obejmujący:
(a) inkubację próbki DNA zawierającej izolowany polinukleotyd według wynalazku lub jego fragment, z próbką biologiczną od pacjenta do uzyskania mieszaniny; oraz (b) wykrywanie specyficznie związanej próbki DNA w mieszaninie, co wskazuje na obecność paciorkowca.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, które to przeciwciało lub jego fragment wykazują specyficzność wiązania z polipeptydem według wynalazku, do wytwarzania preparatu do wykrywania u pacjenta zakażenia paciorkowcem, przy czym przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest znakowany w sposób wykrywalny.
Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym:
fig. 1 przedstawia sekwencję DNA genu BVH-3; Sekwencja nr 1.
fig. 2 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-3; Sekwencja nr 2.
fig. 3 przedstawia sekwencję DNA genu BVH-11; Sekwencja nr 3.
fig. 4 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-11; Sekwencja nr 4.
fig. 5 przedstawia sekwencję DNA genu BVH-28; Sekwencja nr 5.
fig. 6 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-28; Sekwencja nr 6.
fig. 7 przedstawia sekwencję DNA genu BVH-3A który odpowiada terminalnemu końcowi 5'
BVH-3, Sekwencja nr 7.
fig. 8 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-3A; Sekwencja nr 8.
fig. 9 przedstawia sekwencję DNA genu BVH-3B który odpowiada terminalnemu końcu 3'
BVH-3; Sekwencja nr 9.
fig. 10 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-3B; Sekwencja nr 10.
fig. 11 przedstawia porównanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej otwartych ramek odczytu BVH-3 ze szczepów S. pneumoniae WU2, RX1, JNR.7/87, SP64, P4241 i A66 stosując program Clustal W z oprogramowania do analizy sekwencyjnej MacVector (wersja 6.5). Poniżej wersów zawierających sekwencje, znajduje się wiersz określający zgodność, gdzie symbole * i . oznaczają odpowiednio identyczne i podobne reszty aminokwasowe.
fig. 12 przedstawia porównanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej otwartych ramek odczytu BVH-11 ze szczepów S. pneumoniae WU2, Rx1, JNR.7/87, SP64, P4241, A66 i SP63 stosując program Clustal W z oprogramowania do analizy sekwencyjnej MacVector (wersja 6.5). Poniżej wersów zawierających sekwencje, znajduje się wiersz określający zgodność, gdzie symbole* i . oznaczają odpowiednio identyczne i podobne reszty aminokwasowe.
fig. 13 przedstawia porównanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej białek BVH-11 z różnych szczepów S. pneumoniae. Stopień identyczności (I) i podobieństwa (S) wyznaczono stosując program Clustal W z oprogramowania do analizy sekwencyjnej MacVector (wersja 6.5).
fig. 14 przedstawia sekwencję DNA zawierającą cały gen BVH-3 (otwarta ramka odczytu ORF zlokalizowana od nukleotydu 1777 do 4896); Sekwencja nr 11.
fig. 15 przedstawia sekwencję DNA zawierającą cały gen BVH-11 (ORF zlokalizowana od nukleotydu 45 do 2567); Sekwencja nr 12.
fig. 16 przedstawia sekwencję DNA zawierającą cały gen BVH-11-2 (ORF zlokalizowana od nukleotydu 114 do 2630); Sekwencja nr 13.
fig. 17 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-11-2; Sekwencja nr 14. fig. 18 przedstawia sekwencję DNA genu SP63 BVH-3; Sekwencja nr 15.
PL 204 073 B1 fig. 19 przedstawia sekwencję aminokwasową białka SP63 BVH-3; Sekwencja nr 16. fig. 20 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-3M; Sekwencja nr 55. fig. 21 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-3 AD; Sekwencja nr 56. fig. 22 przedstawia sekwencję aminokwasową białka L-BVH-3-AD; Sekwencja nr 57. fig. 23 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW12; Sekwencja nr 58. fig. 24 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-3C; Sekwencja nr 59. fig. 25 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-11M; Sekwencja nr 60. fig. 26 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-11A; Sekwencja nr 61. fig. 27 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-11B (zwanego również New13);
Sekwencja nr 62.
fig. 28 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-11C; Sekwencja nr 63. fig. 29 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW1; Sekwencja nr 64. fig. 30 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW2; Sekwencja nr 65. fig. 31 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW3; Sekwencja nr 66. fig. 32 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW4; Sekwencja nr 67. fig. 33 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW5; Sekwencja nr 68. fig. 34 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW6; Sekwencja nr 69. fig. 35 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW7; Sekwencja nr 70. fig. 36 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW8; Sekwencja nr 71. fig. 37 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW9; Sekwencja nr 72. fig. 38 przedstawia sekwencję aminokwasową białka BVH-11-2M; Sekwencja nr 73. fig. 39 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW 10; Sekwencja nr 74. fig. 40 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW11; Sekwencja nr 75. fig. 41 przedstawia sekwencję DNA genu NEW12; Sekwencja nr 76.
fig. 42 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW14; Sekwencja nr 77. fig. 43 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW15; Sekwencja nr 78. fig. 44 przedstawia sekwencję aminokwasową białka NEW16; Sekwencja nr 79. fig. 45 przedstawia sekwencję DNA genu GBS BVH-71; Sekwencja nr 80.
fig. 46 przedstawia sekwencję aminokwasową białka GBS BVH-71; Sekwencja nr 81.
fig. 47 przedstawia sekwencję DNA genu GAS BVH-71; Sekwencja nr 82.
fig. 48 przedstawia sekwencję aminokwasową białka GAS BVH-71; Sekwencja nr 83.
Przeciwciało, które „ma specyficzność wiązania jest to przeciwciało, które rozpoznaje i wiąże się z wybranym polipeptydem, ale które zasadniczo nie rozpoznaje i nie wiąże się z innymi cząsteczkami w próbce, np. próbce biologicznej, która z natury swojej zawiera wybrany peptyd. Specyficzne wiązanie może być mierzone stosując test ELISA, w którym wybrany polipeptyd jest stosowany jako antygen.
Jeśli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie techniczne i naukowe określenia stosowane w niniejszym opisie mają takie samo znaczenie jak ogólnie zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek. Wszystkie publikacje, zgłoszenia patentowe, patenty i inne odnośniki wymienione w opisie są zawarte w całości jako literatura. W przypadku niezgodności niniejszy opis wynalazku włącznie z definicjami będzie wiążący. Ponadto materiały, sposoby i przykłady stanowią jedynie ilustrację i nie mają ograniczać zakresu wynalazku.
Zgodnie z niniejszym opisem, „fragmenty, „analogi lub „pochodne polipeptydów według wynalazku obejmują te polipeptydy, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest podstawiona konserwowanymi lub nie-konserwowanymi resztami aminokwasowymi (korzystnie konserwowanymi) i które mogą być naturalne lub nie będące pochodzenia naturalnego. W jednym rozwiązaniu, pochodne i analogi polipeptydów według wynalazku mają około 70% identyczności z tymi sekwencjami, które przedstawiono na rysunku lub fragmenty tych sekwencji. To jest, 70% reszt jest taka sama. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, polipeptydy mają więcej niż 75% homologii. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, polipeptydy mają więcej niż 80% homologii. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, polipeptydy mają więcej niż 85% homologii. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, polipeptydy mają więcej niż 90% homologii. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, polipeptydy mają więcej niż 95% homologii. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, polipeptydy mają więcej niż 99% homologii. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, pochodne i analogi polipeptydów według wynalazku mają mniej niż około 20 podstawień, modyfikacji lub delecji reszt aminokwasowych i korzystniej mniej ni ż 10. Korzystnymi podstawieniami są te, które są znane specjalistom w dziedzinie
PL 204 073 B1 jako konserwowane to jest podstawione reszty wykazują takie same fizyczne lub chemiczne właściwości takie jak hydrofobowość, wielkość, ładunek lub grupy funkcyjne.
Według niniejszego wynalazku, polipeptydy według wynalazku obejmują zarówno polipeptydy jak i chimeryczne polipeptydy.
Wynalazkiem objęte są również polipeptydy które zostały połączone z innymi związkami, które zmieniają biologiczne lub farmakologiczne właściwości polipeptydów to jest glikolem polietylenowym (PEG), w celu zwiększenia półokresu trwania; aminokwasowymi sekwencjami liderowymi lub wydzielniczymi, w celu ułatwienia oczyszczania, i sekwencjami prepro- i pro-; i (poli)sacharydami.
Ponadto, w tych sytuacjach, w których jak stwierdzono, regiony aminokwasowe są polimorficzne, może być pożądana zmiana jednego lub więcej poszczególnego aminokwasu, w celu zwiększenia skuteczności naśladowania różnych epitopów różnych szczepów paciorkowców.
Ponadto, polipeptydy według niniejszego wynalazku mogą być modyfikowane poprzez acylowanie końca -NH2 (np. przez acetylowanie, lub amidowanie kwasem tioglikolowym, amidowanie końca karboksylowego, np. amoniakiem lub metyloaminą) w celu zapewnienia stabilności, zwiększenia hydrofobowości w wiązaniu lub połączeniu z podłożem lub z inną cząsteczką.
Wynalazek dotyczy również polipeptydowych hetero- i homomultimerów fragmentów polipeptydowych, analogu i pochodnych. Te polimeryczne postacie obejmują, na przykład, jeden lub więcej polipeptydy, które zostały usieciowane z cząsteczkami sieciującymi, takimi jak awidyna/biotyna, gluteraldehyd lub dimetylo-superimidan. Takie polimeryczne postacie obejmują również polipeptydy zawierają dwa lub więcej tandemowe lub odwrócone przylegające sekwencje, otrzymane z multicistronowych mRNA wytworzonych technikami rekombinacyjnego DNA.
Korzystnie fragment, analog lub pochodna polipeptydu według wynalazku zawiera przynajmniej jeden obszar antygenowy to jest przynajmniej jeden epitop.
W celu uzyskania tworzenia się polimerów antygenowych (to jest multimerów syntetycznych), mogą być wykorzystane polipeptydy mające grupy bishalogenoacetylowe, nitroarylohaloidki, i tym podobne, w których odczynniki są specyficzne dla grup tiolowych. Dlatego połączenie pomiędzy dwoma grupami merkaptolowymi różnych peptydów może być wiązaniem pojedynczym lub może być złożone z grupy wiążącej złożonej zazwyczaj z co najmniej czterech, a nie więcej niż 16, ale zazwyczaj nie więcej niż 14 atomów węgla.
W szczególnym rozwią zaniu, fragmenty polipeptydowe, analogi i pochodne według wynalazku nie zawierają zaczynającej reszty metioninowej (Met). Korzystnie, polipeptydy nie będą zawierały sekwencji liderowej lub wydzielniczej (sekwencji sygnałowej). Część sygnałowa polipeptydu według wynalazku może być określona według ustalonych technik biologii molekularnej. Ogólnie, polipeptyd według wynalazku, może być izolowany z hodowli paciorkowców, a następnie sekwencjonowany w celu określenia reszty początkowej dojrzałego białka i w wyniku tego sekwencji dojrzałego polipeptydu.
Jak wspomniano powyżej, wynalazek dotyczy m.in. kompozycji do szczepionek zawierających co najmniej polipeptyd według wynalazku w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub adjuwantem. Odpowiednie adjuwanty obejmują oleje takie ja pełny i częściowy adjuwant Freunda; sole to AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4)2, krzemiany, kaolin, polinukleotydy węglowe to poli IC i poli AU. Korzystne adjuwanty obejmują QuilA i Alhydrogel. Szczepionki według wynalazku mogą być podawane pozajelitowo przez injekcje, szybki wlew, absorpcję nosowogardłową absorpcję skórną, lub policzkową lub doustną. Nośniki dopuszczalne farmakologicznie obejmują również anatoksynę tężca.
Kompozycje do szczepionek według wynalazku są stosowane do leczenia lub profilaktyki zakażeń paciorkowcami i/lub chorób i zespołów, w których uczestniczy zakażenie paciorkowcami jak opisano w P.R. Murray (Ed, in chief), EJ. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover i R.H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. szóste wyd., 1995, str. 1482, które są zamieszczone jako odnoś niki. W szczególnym rozwiązaniu, szczepionki są podawane tym osobnikom, u których występuje ryzyko zakażenia paciorkowcami, takim, jak niemowlęta, osoby starsze i osoby o osłabionej odporności.
Zgodnie z niniejszym opisem określenie osobnik obejmuje ssaki, w tym ludzi.
Kompozycje do szczepionek są korzystnie w dawce jednostkowej od około 0,001 do 100 μg/kg (antygen/masę ciała) i korzystniej 0,01 do 10 μg/kg i najkorzystniej 0,1 do 1 μg/kg 1 do 3 razy z przerwami około 1 do 6 tygodni pomiędzy immunizacjami.
W jednym rozwiązaniu, polinukleotydy zostały przestawione w Sekwencji nr: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 15, 76, 80, 82, które obejmują otwarte ramki odczytu (ORF), kodujące polipeptydy według
PL 204 073 B1 wynalazku. Będzie zrozumiałe, że sekwencje polinukleotydowe przedstawione na rysunku mogą być zmienione przez zdegenerowane kodony, jednak nadal kodując polipeptydy według wynalazku. Tym samym wynalazek obejmuje również polinukleotyd, który hybrydyzuje z sekwencjami polinukleotydami jak opisano powyżej (lub całkowitymi sekwencjami tych polinuklelotydów) mający 50% identyczności pomiędzy sekwencjami. W jednym rozwiązaniu, co najmniej 70% identyczności pomiędzy sekwencjami. W jednym rozwiązaniu, co najmniej 75% identyczności pomiędzy sekwencjami. W jednym rozwiązaniu, co najmniej 80% identyczności pomiędzy sekwencjami. W jednym rozwiązaniu, co najmniej 85% identyczności pomiędzy sekwencjami. W jednym rozwiązaniu, co najmniej 90% identyczności pomiędzy sekwencjami. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, polinukleotydy mogą ulegać hybrydyzacji w surowych warunkach to jest wykazujący przynajmniej 95% identyczności. W kolejnym rozwiązaniu według wynalazku, więcej niż 97% identyczności.
Niniejszy wynalazek obejmuje również polinukleotydy kodujące polipeptydy według wynalazku, lub fragmenty, analogi lub pochodne tych polipeptydów, które mogą być stosowane w immunizacji DNA, tj. mogą one być włączone do wektora, który ulega replikacji i ekspresji po injekcji i przez to powoduje produkcję antygenowego polipeptydu in vivo. Na przykład polinukleotydy mogą być włączone do wektora plazmidowego pod kontrolą promotora CMV, który jest funkcjonalny w komórkach eukariotycznych. Korzystnie wektor jest wprowadzany zastrzykiem domięśniowym.
Jak wspomniano powyżej wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania polipeptydu według wynalazku technikami rekombinacyjnymi w wyniku ekspresji polinukleotydu kodującego ten polipeptyd w komórce gospodarza i odzyskiwania produktu polipeptydowego uzyskanego w wyniku ekspresji. W innym rozwiązaniu, polipeptydy mogą być otrzymywane zgodnie z ustalonymi technikami syntezy chemicznej to jest synteza oligopeptydów w fazie płynnej lub stałej, które są ligowane w celu otrzymania całego polipeptydu (ligacja blokowa).
Ogólnie sposoby otrzymywania i oceny polinukleotydów i polipeptydów są opisane w następujących odnośnikach: Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, II wyd., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Edited by Ausubel F.M. i wsp., John Wiley and Sons, Inc. New York; PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering, Edited by White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, strona 490; Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, III wyd., 1993, strona 380; Current Protocols in Immunology, Edited by Coligan J.E. i wsp., John Wiley & Sons Inc., New York, które są zamieszczone jako odnośniki literaturowe.
Do produkcji w wyniku rekombinacji, komórki gospodarza są transfekowane wektorami, które kodują polipeptyd, a następnie są one hodowlane w pożywce pokarmowej zmodyfikowanej odpowiednio do aktywacji promotorów, selekcji transformantów lub amplifikacji genów. Odpowiednie wektory, które żywotne i ulegają replikacji w wybranym gospodarzu i obejmują chromosomalnie, niechromosomalne i syntetyczne sekwencje DNA np. plazmidy bakteryjne, fagi DNA, bakulowirusy, plazmidy drożdżowe, wektory pochodzące z połączeń plazmidów i fagów DNA. Sekwencje polipeptydowe mogą być włączane do wektora w odpowiednim miejscu stosując enzymy restrykcyjne w taki sposób, że jest on funkcjonalnie połączony z regionem kontroli ekspresji zawierającym promotor, miejsce wiązania rybosomu (region zgodności lub sekwencja Shine-Dalgarno), i ewentualnie operator (element kontroli). Możliwe jest wybranie poszczególnych składników regionu kontroli ekspresji, które są odpowiednie dla danego gospodarza i wektora według ustalonych zasad biologii molekularnej (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. II, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Edited by Ausubel F.M. i wsp.., John Wiley & Sons, Inc. New York załączone w niniejszym opisie jako odnośnik). Odpowiednie promotory obejmują między innymi promotory LTR lub SV40, E.coli lac, tac lub trp i promotory faga lambda PL. Wektory korzystnie zawierają początek replikacji jak i markery selekcyjne to jest gen odporności na ampicylinę. Odpowiednie wektory bakteryjne obejmują pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10 phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 i wektory eukariotyczne pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG i pSVL. Komórki gospodarza mogą być bakteryjne to jest E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; grzybowe to jest Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; drożdżowe to jest Saccharomyces lub eukariotyczne to jest CHO, COS.
W wyniku ekspresji polipeptydu w hodowli, komórki są zazwyczaj zbierane przez wirowanie następnie rozerwanie środkami fizycznymi lub chemicznymi (jeśli ekspresja polipeptydu prowadzi do otrzymania peptydu, który nie jest wydzielany do pożywki) i otrzymuje się surowy ekstrakt zatrzymany do przeprowadzenia wyodrębnienia żądanego polipeptydu. Oczyszczanie polipeptydu z pożywki ho8
PL 204 073 B1 dowlanej lub lizatu może być uzyskany znanymi technikami w zależności od właściwości polipeptydu to jest stosując strącanie siarczanem amonowym lub etanolem, ekstrakcję kwasem, chromatografię anionowo- lub kationowo- wymienną, chromatografii na złożu fosfocelulozowym, chromatografii oddziaływań hydrofobowych, chromatografię na hydroksyloapatycie i chromatografii lecytynowej. Końcowe oczyszczanie może być uzyskane stosując HPLC.
Polipeptyd może ulegać ekspresji z lub bez sekwencji liderowej lub wydzielniczej. W poprzednim przypadku, lider może być usuwany w trakcie obróbki post-translacyjnej (patrz opisy patentowe US 4,431,739; US 4,425,437; i US 4,338,397 załączone w niniejszym opisie jako odnośnik) lub może być usuwany chemicznie po oczyszczeniu polipeptydu uzyskanego w wyniku ekspresji.
Polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane w testach diagnostycznych w infekcjach paciorkowcami, w szczególności w infekcjach S. pneumoniae. Możliwe jest zastosowanie kilku sposobów diagnostycznych, na przykład wykrywanie organizmów paciorkowców w próbce biologicznej, poniżej opisana procedura może być wykorzystana:
a) uzyskiwanie próbki biologicznej od pacjenta;
b) inkubacja przeciwciała lub jego fragmentu reagującego z polipeptydem paciorkowców według wynalazku z próbką biologiczną, aby utworzyć mieszaninę; i
c) wykrywanie przeciwciała specyficznie związanego lub związanego fragmentu w mieszaninie co wskazuje na obecność paciorkowców.
W innym rozwiązaniu, sposób wykrywania przeciwciała specyficznego względem antygenu paciorkowców w próbce biologicznej, w której jak się przypuszcza lub zakłada się obecność tego przeciwciała, może być przeprowadzony następująco:
a) uzyskiwanie próbki biologicznej od pacjenta;
b) inkubacja jednego lub większej liczny polipeptydu paciorkowców według wynalazku lub jego fragmentów z próbką biologiczną, aby utworzyć mieszaninę; i
c) wykrywanie specyficznie związanego antygenu lub związanego fragmentu w mieszaninie co wskazuje na obecność przeciwciała specyficznego względem paciorkowców.
Specjalista w dziedzinie zrozumie, że te diagnostyczne testy mogą mieć kilka postaci, włącznie z testami immunologicznymi, takimi jak test immunoabsorpcji enzymozależ nej (ELISA), test radioimmunologiczny (przy użyciu radioaktywnie znakowanych przeciwciał) lub test aglutynacji lateksowej, zasadniczo do określania czy specyficzne przeciwciała przeciwko białkom są obecne w organizmie.
Sekwencje DNA kodujące polipeptydy według wynalazku mogą również być stosowane do projektowania sond DNA do stosowania w wykrywaniu obecności paciorkowców w próbce biologicznej, które jak się przypuszcza zawierają takie bakterie. Sposób wykrywania obejmuje:
a) uzyskiwanie próbki biologicznej od pacjenta;
b) inkubacja jednej lub większą liczbę sond DNA mającej sekwencję DNA kodującą polipeptyd według wynalazku lub jego fragmentów z próbką biologiczną, aby utworzyć mieszaninę; i
c) wykrywanie specyficznie związanej sondy DNA w mieszaninie co wskazuje na obecność bakterii paciorkowców.
Sondy DNA mogą również być stosowane do wykrywania krążących paciorkowców to jest kwasów nukleinowych S. pneumoniae w próbce, na przykład stosując reakcję łańcuchową polimerazy, jako sposobu diagnozowania infekcji paciorkowcami. Sonda może być syntetyzowana stosując tradycyjne techniki i może być unieruchomiona na stałym podłożu, lub może być znakowana znacznikiem, który może być wykryty. Korzystną sondą DNA w niniejszym zgłoszeniu jest oligomer mający sekwencję komplementarną do co najmniej około 6 sąsiadujących nukleotydów kodujących polipeptydy paciorkowców zapalenia płuc według wynalazku.
Inny sposób diagnostyczny wykrywania paciorkowców u pacjenta obejmuje:
a) znakowanie przeciwciała reagujące z polipeptydem według wynalazku lub jego fragmentem znacznikiem możliwym do wykrywania;
b) podawanie znakowanego przeciwciała lub znakowanego fragmentu pacjentowi; i
c) wykrywanie specyficznie związanego znakowanego przeciwciała lub znakowanego fragmentu u pacjenta co wskazuje na obecność paciorkowców.
Kolejny aspekt wynalazku stanowi zastosowanie polipeptydów paciorkowców według wynalazku jako immunogenów do otrzymywania specyficznych przeciwciał do diagnostyki i w szczególności do leczenia infekcji paciorkowcami. Odpowiednie przeciwciała mogą być określanie przy użyciu odpowiednich sposobów przeszukiwania, na przykład przez pomiar zdolności poszczególnego przeciwciała do biernej ochrony przeciwko infekcjom paciorkowcami w modelach testowych. Jednym przykładem
PL 204 073 B1 modelu zwierzęcego jest model mysi opisany w poniższych przykładach. Przeciwciało może być całym przeciwciałem lub jego fragmentem wiążącym antygen i może należeć do dowolnej klasy immunoglobulin. Przeciwciało lub jego fragment może pochodzić od zwierzęcia, specyficznie od ssaka a bardziej szczegółowo od myszy, szczura lub człowieka. Może to być naturalne przeciwciało lub jego fragment, lub jeśli jest to pożądane, zrekombinowane przeciwciało lub fragment przeciwciała. Określenie zrekombinowane przeciwciało lub fragment przeciwciała oznacza przeciwciało lub fragment przeciwciała, który otrzymano w wyniku zastosowania technik biologii molekularnej. Przeciwciało lub fragment przeciwciała może być poliklonalne, lub korzystnie monoklonalne. Może one być specyficzne ze względu na ilość epitopów związanych z polipeptydami paciorkowców zapalenia płuc, ale korzystnie są one specyficzne względem jednego epitopu.
Nie ograniczając zakresu, przedmiotem niniejszego wynalazku są nowe antygeny oznaczone jako BVH-28, obcięte polipeptydy zawierające fragmenty nowych antygenów oznaczonych jako BVH28, oraz chimeryczne polipeptydy zawierające fragmenty nowych antygenów oznaczonych jako BVH-28.
P r z y k ł a d 1
Niniejszy przykład przedstawia klonowanie genów S. pneumoniae.
Region kodujący genu S. pneumoniae BVH-3 (Sekwencja nr 1) i region kodujący genu
S. pneumoniae BVH-28 (Sekwencja nr 5) amplifikowano metodą PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) z genomowego DNA z grupy surowiczej 6 Szczepu S. pneumoniae SP64 stosując oligonukleotydy, które zawierały końcówki nici odpowiednie do dodania miejsc restrykcyjnych BglII (AGATCT) i Xbal (TCTAGA). Produkty PCR oczyszczano z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA), trawiono BglII-XbaI (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe, Kanada), ekstrahowano fenolem : chloroformem i wytrącano etanolem. Wektor Superlinker pSL301 (Invitrogen, San Diego, CA) trawiono BglII i Xbal i oczyszczano z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA). Fragmenty BglII-XbaI genomowego DNA ligowano z Bglll-Xbal wektora pSL301. Zligowanymi produktami transformowano szczep DH5a E. coli [f80 lacZ DM15 koniec A1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1l- gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według metody opisanej przez Simanis (Hanahan, D. DNA cloning, 1985, D.M. Glover (wyd), str. 109-135). Zrekombinowane plazmidy pSL301 (rpSL301) zawierające gen BVH-3 lub BVH-28 oczyszczano stosując zestaw QIAgen (Chatsworth, CA) i Inserty DNA potwierdzono przeprowadzając analizę sekwencji nukleotydów (zestaw do sekwencjonowania Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). Zrekombinowane rpSL301 (rpSL301) trawiono enzymami restrykcyjnymi BglII (AGATCT) i XhoI (CTCGAG). Fragmenty DNA BglII-XhoI oczyszczano stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA). Wektor ekspresyjny pET-32c(+) (Novagen, Madison, WI) zawierający sekwencję tioredoksyno-HisTag trawiono BamHI (GGATCC) i XhoI i ekstrahowano z żelu stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA). Fragmenty BglII-XhoI DNA ligowano z BamHI-XhoI wektora pET-32c(+) aby utworzyć sekwencję kodującą dla białka fuzyjnego tioredoksyno-His-Tag-BVH-3 lub tioredoksyno-HisTag-BVH-28. Zligowanymi produktami transformowano szczep DH5a E. coli [f80 lacZ DM15 koniec A1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1l- gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według metody opisanej przez Simanis (Hanahan, D. DNA Klonowanie, 1985, D.M. Glover (ed), str. 109-135). Zrekombinowane plazmidy pET-32c(+)oczyszczano stosując zestaw QIAgen (Chatsworth, CA) i sekwencje nukleotydowe w miejscach łączenia tioredoksyno-HisTag i insertu DNA sprawdzano przez sekwencjonowanie DNA (zestaw do sekwencjonowania Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA).
P r z y k ł a d 2
Niniejszy przykład przedstawia klonowanie genów kodujących białka S. pneumoniae w plazmidzie CMV pCMV-GH.
Region DNA kodujący białka S. pneumoniae wprowadzono do genu kodującego ludzki hormon wzrostu (hGH) w fazie downstream, przy czym gen był pod kontrolą transkrypcyjną promotora cytomegalowirusa (CMV) w wektorze plazmidowym pCMV-GH (Tang i wsp.., Nature, 1992, 356:152). Promotor (CMV) jest nie funkcjonalnym plazmidem w komórkach E. coli, ale aktyny po podaniu plazmidu do komórek eukariotycznych. Wektor również obejmuje gen oporności na ampicylinę.
Region kodujący genu BVH-3 (Sekwencja nr 1) i BVH-28 (Sekwencja nr 5) otrzymano z rpSL301 (patrz przykład 1) stosując enzymy restrykcyjne BglII (AGATCT) i Xbal (TCTAGA). Produkty trawienia oczyszczano z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QlAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA). Wektor pCMV-GH (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry,
PL 204 073 B1
The University of Texas, Dallas, Texas) zawierający gen kodujący ludzki hormonu wzrostu aby utworzyć białka fuzyjne trawiono BglII i XbaI i oczyszczano z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA). Fragmenty BglII-XbaI DNA ligowano z BglIIXbaI wektora pCMV-GH, aby utworzyć białko fuzyjne hGH-BVH-3 lub hGH-BVH-28 pod kontrolą promotora CMV. Zligowanymi produktami transformowano komórki szczepu E. coli DH5a[f80 lacZ DM15 koniecA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1l- gyrA96 relA1 D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według metody opisanej przez Simanis (Hanahan, D. DNA Klonowanie, 1985, D.M. Glover (ed), str. 109-135). Zrekombinowane plazmidy pCMV oczyszczano stosując zestaw QlAgen (QIAgen, Chatsworth, CA).
Region kodujący genu BVH-11 (Sekwencja nr 3) amplifikowano metodą PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) z genomowego DNA z grupy surowiczej 6 szczepu S. pneumoniae SP64 stosując oligonukleotydy, które zawierały końcówki nici odpowiednie do dodania miejsc restrykcyjnych BgIII (AGATCT) i HindIII (AAGCTT). Produkt PCR oczyszczano z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA), trawiono enzymami restrykcyjnymi (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe, Kanada), ekstrahowano fenolem : chloroformem i wytrącano etanolem. Wektor pCMV-GH (Laboratorium Dr. Stephena A. Johnstona, Departament Biochemii, The University of Texas, Dallas, Texas) trawiono Bglii i Hindlll i oczyszczano z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA). Fragment BgIII-Hindlll DNA ligowano z Bglll-Hindlll wektora pCMV-GH, aby utworzyć białko fuzyjne hGHBVH-11 pod kontrolą promotora CMV. Zligowanymi produktami transformowano komórki szczepu E. coli DH5a[f80 lacZ DM15 koniecA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1I-gyrA96 relA1 D(lacZYAargF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według metody opisanej przez Simanis (Hanahan, D. DNA Klonowanie, 1985, D.M. Glover (ed), str. 109-135). Zrekombinowany plazmid pCMV oczyszczano stosując zestaw QIAgen (Chatsworth, CA) i sekwencję nukleotydową wstawki DNA was sprawdzano przez sekwencjonowanie DNA.
P r z y k ł a d 3
Niniejszy przykład przedstawia zastosowanie DNA do wywołania odpowiedzi immunologicznej na antygeny S. pneumoniae.
Grupy 8 samic myszy BALB/c (Charles River, St-Constant, Quebec, Kanada) immunizowano przez domięśniowy zastrzyk 50 μΐ trzy razy w dwu lub trzytygodniowych odstępach 100 μg zrekombinowanego pCMV-GH kodującego gen BVH-3, BVH-11 lub BVH-28 w obecności 50 μg czynnika stymulującego kolonię granulocytów-makrofagów (GM-CSF)- prowadzącego ekspresję plazmidu pCMVGH-GM-CSF (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas). Jako kontrolę, grupie myszy wstrzykiwano 100 μg pCMV-GH w obecności 50 μg pCMV-GH-GM-CSF. Próbki krwi zbierano z oczodołu przed każdą immunizacją i siedem dni po trzecim zastrzyku i odpowiedzi przeciwciał w surowicy wyznaczono testem ELISA stosując białko fuzyjne tioredoksyno-His^Tag-S. pneumoniae jako antygen pokrywający. Immunizacja DNA zrekombinowanym plazmidem pCMV-GH kodującym białko S. pneumoniae BVH-3, BVH-11 lub BVH-28 indukowała przeciwciało reagujące przeciwko odpowiedniemu zrekombinowanemu białku. Miana wzajemnych przeciwciał, zdefiniowane jako najwyższe rozcieńczenie surowicy przy którym wartość absorbancji wynosi 0,1 ponad wartości tła, wynosiło powyżej 4x103.
P r z y k ł a d 4
Niniejszy przykład przedstawia otrzymywanie i oczyszczanie zrekombinowanych białek S. pneumoniae.
Zrekombinowanymi plazmidami pET zawierającymi gen BVH-3, BVH-11 lub BVH-28 odpowiadającymi odpowiednio sekwencjom: Sekwencja nr 1, Sekwencja nr 3 lub Sekwencja nr 5 transformowano przez elektroporację (Gene Pulser II apparatus, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada) komórki szczepu E. coli AD494 (DE3) (Dara-leu7697 DlacX74 DphoA Pvull phoR DmalF3 F'[lac+(lacIq) pro] trxB::Kan) (Novagen, Madison, WI). W tym szczepie E. coli, promotor T7 kontrolujący ekspresję białka fuzyjnego jest specyficznie rozpoznawany przez polimerazę T7 RNA (obecną w profagu IDE3), której gen jest pod kontrolą promotora lac, który jest indukowany przez izopropylo-e-d-tiogalaktopyranozyd (IPTG). Transformanty AD494(DE3)/rpET hodowano w temp. 37°C z wytrząsaniem przy 250 rpm w pożywce bulionowej LB (pepton 10 g/L, ekstrakt z drożdży 5g/L, NaCl 10 g/L) zawierającej 100 μg ampicyliny(Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Kanada) na ml do momentu, gdy A600 osiągnęło wartość 0,6. W celu zaindukowania produkcji białka fuzyjnego tioredoksyno-HisTag-BVH-3, tioredoksyno-HisTag-BVH-11 lub tioredoksyno-His-TagBVH-28, komórki inkubowano przez 2 dodatPL 204 073 B1 kowe godziny w obecności IPTG o stężeniu końcowym 1 mM. Zaindukowane komórki z hodowli 100 ml osadzano przez wirowanie i zamrażano w temp. -70°C.
Oczyszczanie białek fuzyjnych z rozpuszczalnej frakcji cytoplazmatycznej indukowanego IPTG AD494(DE3)/rpET prowadzono stosując chromatografię powinowactwa opartą na właściwości sekwencji His-Tag (6 kolejnych reszt histydynowych) aby związać kationy dwuwartościowe (Ni2+) unieruchomione na żywicy chelatującej metale HisBind. Pokrótce, osadzone komórki otrzymane z hodowli 100 mL indukowane IPTG ponownie zawieszono w buforze fosforanowym (PBS):500 mM
NaCl pH7.1, sonikowano i wirowano przy 20,000 X g przez 20 min aby usunąć rozpadnięte szczątki.
Supernatant odfiltrowano (błona o rozmiarze oczek 0,22 μm) i naniesiono na kolumnę HiTrap® 1mL chelatującą, wcześniej upakowaną gotową do użycia (Pharmacia Biotech, Baie d'Urfe, Kanada). Białko fuzyjne tioredoksyno-HisTag-S. pneumoniae wymywano roztworem: 1M imidazol-500mM NaCl-PBS pH 7,1. Usunięcie soli i imidazolu z próbki prowadzono przez dializę w PBS w temp. 4°C. Ilości białka fuzyjnego otrzymanego z frakcji rozpuszczalnej E. coli oszacowano stosując MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).
P r z y k ł a d 5
Niniejszy przykład przedstawia ochronę myszy przeciwko śmiertelnemu zakażeniu paciorkowcami przez immunizację.
Grupy 8 samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowano podskórnie trzy razy z trzytygodniowymi przerwami stosując 25 μg oczyszczone przez powinowactwo tioredoksyno-His^Tag-BVH-3 białko fuzyjne w obecności 15 μg adjuwanta QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Kanada) lub, jako kontrolę, tylko z samym adjuwantem QuilA w PBS. Próbki krwi zbierano z zatoki oczodołowej dnia 1, 22 i 43 przed każdą immunizacją i siedem dni (dnia 50) po trzecim zastrzyku. Tydzień później myszy prowokowano stosując około 106 CFU typu 3 Szczepu S. pneumoniae WU2. Próbki inokulum
S. pneumoniae do prowokacji umieszczono na czekoladowych szalkach agarowych do określania CFU i do sprawdzania dawki do prowokacji. Przypadki śmiertelne zliczano przez 14 dni i 14 dnia po prowokacji, myszy, które przeżyły uśmiercano i próbki krwi badano pod kątem obecności S. pneumoniae. Dane określające przeżywalność przedstawiono w tabeli 1.
Próbki surowicy krwi przed prowokacją analizowano pod kątem obecności przeciwciał reagujących z S. pneumoniae standardowymi testami immunologicznymi. Analizy Elisa i immunoblot wykazały, że immunizacją zrekombinowanym białkiem S. pneumoniae otrzymany w komórkach E. coli wywoływane przeciwciała reagujące zarówno ze zrekombinowanym jak i natywnym białkiem paciorkowców.
T a b e l a 1. Ochrona uzyskana w wyniku zastosowania zrekombinowanego białka BVH-3
Immunogen Ilość myszy żywych : ilość myszy martwych 14 dnia po teście prowokacji Średni dzień śmierci
BVH-3 8 : 0 >14
żaden 0 : 8 1
Wszystkie myszy immunizowane zrekombinowanym białkiem BVH-3 przeżyły zakażenie podczas gdy żadna z kontrolnych myszy którym podano sam adjuwant przeżyło. Stwierdzono znaczącą różnicę przeżywalności pomiędzy tymi dwoma grupami myszy (P<0.0001, logarytmiczna analiza rangowa w analizie nieparametrycznej krzywych przeżycia; P=0.0002, Test dokładności Fishera). Wszystkie posiewy krwi pobrane od myszy, które przeżyły były negatywne dnia 14 po prowokacji.
P r z y k ł a d 6
Niniejszy przykład opisuje klonowanie genów BVH-3 i BVH-11 z różnych szczepów S. pneumoniae i konserwacje molekularną tych genów.
Analiza molekularna chromosomowego DNA z różnych izolatów S. pneumoniae sondami DNA obejmującymi różne regiony BVH-3 lub BVH-11 ujawniła obecność jednej kopii genu BVH-3 i dwóch kopii genu BVH-11. Dwie kopie genu BVH-11 nie są identyczne i geny zostały dowolnie oznaczone jako BVH-11 (Sekwencja nr 12; ORF zlokalizowana od nukleotydu 45 do 2567) i BVH-11-2 (Sekwencja nr 13; ORF zlokalizowana od nukleotydu 114 do 2630).
Pierwsze aminokwasy BVH-3 i BVH-11 regionu kodującego mają charakterystykę sekwencji liderowych również znane jako peptydy sygnałowe. Miejsce cięcia peptydazy sygnału zdolności L-X-X-C lipobiałkowego miejsc modifikacji/obróbki było obecne w tych sekwencjach. Dojrzałe białka BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 z S. pneumoniae SP64 mają odpowiednio 1019, 821 i 819 aminokwasów. Regiony genów S. pneumoniae kodujące dojrzałe BVH-3, zakończone BVH-3M, (nukleotydy 1837 - 4896;
PL 204 073 B1
Sekw.nr. NO: 11), BVH-11M (nukleotydy 102-2567; Sekw.nr. NO: 12) i BVH-11-2M (nukleotydy 1712630; Sekw.nr. NO: 13), amplifikowano metodą PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR system 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) z genomowego DNA 6 lub 7 szczepu S. pneumoniae. Kliniczne izolaty z grup surowiczych 6 S. pneumoniae SP64 i grup surowiczych 9 SP63 zostały dostarczone przez laboratorium - laboratoire de la sante publique du Quebec, Sainte-Anne-de-Bellevue; serotype 4 szczep JNR.7/87 został dostarczony przez Andrew Camilli, Tufts University School of Medicine, Boston; Rx1 szczep, nieotorbiona pochodna typu 2 szczepu D39 i typu 3 szczepów A66 i WU2 zostały dostarczone przez Davida E. Brilesa z University of Alabama, Birmingham i izolat kliniczny typu 3 P4241 został dostarczony przez centrum badawcze - centre de recherche en infectiologie du centre hospitalier de l'universite Laval, Sainte-Foy. Zestawy starterów oligonukleotydowych OCRR479OCRR480; HAMJ160-OCRR488 i HAMJ160-HAMJ186, które zawierały końcówki nici odpowiednie do dodania miejsc restrykcyjnych zastosowano do amplifikacji genu odpowiednio, BVH-3, BVH-11 i BVH11-2, z wyjątkiem genu BVH-11 ze szczepu SP64, który amplifikowano stosując zestaw starterów zawierający HAMJ487 i OCRR488. Sekwencje starterów zostały wymienione poniżej (Tabela 2). Produkty PCR oczyszczano z żelu agarozowego stosując zestaw do ekstrakcji z żelu QIAquick z firmy QIAgen (Chatsworth, CA) i trawiono BglII-XbaI lub BgllI-Hindlll (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfe, Canada). Produkty po trawieniu oczyszczano stosując zestaw do oczyszczania QIAquick PCR z firmy QIAgen (Chatsworth, CA). Produkty PCR ligowano z BglII-XbaI lub BgIII-Hindlll wektora pSL301. Zligowanymi produktami transformowano komórki szczepu E. coli DH5^ [φ80 lacL ΔΜ15 koniecAl recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-D. gyrA96 relA1 Δ(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) według metody opisanej przez Simanis (Hanahan, D. DNA Klonowanie, 1985, D.M. Glover (ed), str. 109-135). Zrekombinowane plazmidy pSL301 (rpSL301) zawierające BVH-3, BVH-11 lub BVH11-2 oczyszczano stosując zestaw QIAgen (Chatsworth, CA) i inserty DNA sekwencjonowano (zestaw do sekwencjonowania Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). Fig. 11 i 12 przedstawiają sekwencję zgodności ustaloną na podstawie wyznaczonych sekwencji aminokwasowych, odpowiednio BVH-3, i BVH-11. Porównanie sekwencji białkowych BVH-3 ujawniło 99 do 100% identyczności sekwencji dla wszystkich szczepów z wyjątkiem BVH-3 z grupy surowiczej 9 szczepu SP63 (Sekw.nr. NO: 15 i Sekw.nr. NO: 16) który utracił ciąg 177 aminokwasów odpowiadającym resztom 244 do 420 w sekwencji białkowej BVH-3 S. pneumoniae SP64. Analiza sekwencji dodatkowej grupy surowiczej 9 szczepu ujawniło cząsteczkę BVH-3 mającą taką samą delecję w 3 z 4 szczepów, co sugeruje, że 3 szczepy należą do klonu grupy surowiczej 9 S. pneumoniae.
Porównując 13 BVH-11 sekwencji nukleotydowych otrzymano z 7 szczepów S. pneumoniae, ujawniło że sekwencje nukleotydowe są bardzo podobne. Analiza komputerowa (MacVector, Clustal W 1.4) z wykorzystaniem wielokrotnego przypisania przewidywanych sekwencji białkowych BVH-11 ujawniła, że te sekwencje są w 75% identyczne i 82% homologiczne na długości 834 aminokwasów. Przypisywanie przez parowanie ujawniło 80 do 100% identyczności (fig. 13). Sekwencje wykazały ogromne podobieństwo w całościowej organizacji. Różnorodność pierwszorzędowych sekwencji tych białek jest prawie ograniczone do ostatnich 125 aminokwasów w części C-końcowej białek. Region ten tworzy domenę. Bliższe badanie tej domeny dwie grupy sekwencje, pierwsze 9 sekwencji z fig. 13 należą do jednej grupy, podczas gdy ostatnie 4 sekwencje należą do innej grupy. Wartość 39% identyczności otrzymano jeśli zostały porównane sekwencje domen 13 białek (MacVector, Clustal W 1.4). Wartość identyczności zwiększa się do powyżej 92% jeśli porównywane są sekwencje należące do tej samej grupy.
P r z y k ł a d 7
Niniejszy przykład przedstawia homologii części genów BVH-3 i BVH-11.
Analiza molekularna sondami DNA pochodzącymi z genów BVH-3 i BVH-11 wykazała, że BVH-3 i BVH-11 są spokrewnione. W badaniach hybrydyzacji dot blot, sonda DNA zawierająca bądź BVH-3 bądź BVH-11, sekwencja genowa hybrydyzowała z oboma genami, BVH-3 i BVH-11, co wskazuje że geny BVH-3 i BVH-11 mają sekwencje homologiczne. Porównanie sekwencje ujawniło, że otwarte ramki odczytu ORF i białka były odpowiednio, w 43 i 33% identyczne. Dokładniejsze badanie ujawniło, że region odpowiadający aminokwasom od 1 do 225 w genie BVH-3 i 1 do 228 w genie BVH-11 wykazywał odpowiednio 73 i 75% identyczności na poziomie DNA i białka. Przeciwnie, regiony 3' odpowiadające aminokwasom od 226 do 1039 z BVH-3 i aminokwasom 229-840 z BVH-11 wykazywały jedynie odpowiednio 34 i 22% identyczności na poziomie DNA i białka. Zatem końce 5' genów BVH-3 i BVH-11 wydają się zawierać wysoce konserwowane sekwencje, podczas gdy pozostałe części genów bardzo się różnią. Wyniki te sugerują, że BVH-3 i BYH-11 mogą mieć podobne funkcje w których
PL 204 073 B1 pośredniczą sekwencje obecne w regionie konserwowanym, podczas gdy specyficzne funkcje BVH-3i BVH-11 mogą być wynikiem sekwencji w regionie zróżnicowanym.
P r z y k ł a d 8
Niniejszy przykład opisuje klonowanie obciętych genów BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 w wyniku reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i ekspresja obciętych cząsteczek BVH-3 i BVH-11.
Fragmenty genowe amplifikowano metodą PCR stosując pary oligonukleotydów zaprojektowane do prowadzenia amplifikacji fragmentów obejmujących gen BVH-3 (Sekwencja nr 1 i Sekwencja nr 11), BVH-11 (Sekwencja nr 3 i Sekwencja nr 12) lub BVH-11-2 (Sekwencja nr 13) ze szczepu SP64
S. pneumoniae. Każdy ze starterów ma miejsce cięcia konieconukleazy na końcu 5', co umożliwia bezpośrednie wklonowanie w ramce amplifikowanego produktu do trawionego wektora plasmidowego (Tabele 2 i 3). Produkty otrzymane w wyniku amplifikacji PCR trawiono konieconukleazami restrykcyjnymi i ligowano z bądź linearyzowanym plazmidem pSL301 (patrz przykład 1), pCMV-GH (patrz przykład 2) lub pET (Novagen, Madison, WI) wektorem ekspresyjnym trawionym podobnie lub trawionym enzymami, które produkują kompatybilne lepkie końce. Zrekombinowane plazmidy pSL301 i zrekombinowane pCMV-GH trawiono enzymami restrykcyjnymi w celu klonowania w ramce do wektora ekspresyjnego pET. Klony wstępnie stabilizowano w komórkach E. coli DH5^ przed wprowadzeniem do E. coli BL21(^DE3) lub AD494 (^DE3) w celu otrzymania ekspresji obciętych cząsteczek BVH-3 lub BVH-11. Każdy z otrzymanych konstruktów plasmidowych potwierdzono przeprowadzając analizę sekwencji nukleotydów. Ekspresję zrekombinowanych białek prowadzono jako fuzję N-końców z tioredoksyną i Hislag lub jako fuzję C-końców z Hislag. Zrekombinowane białka ulegające ekspresji oczyszczano z frakcji supernatantu otrzymanych w wyniku wirowania sonikowanych indukowanych IPTG hodowli E. coli stosując żywicę chelatującą metale His-Bind (QIAgen, Chatsworth, CA). Wytworzone produkty genowe zostały wymienione w tabeli 3. Produkty genowe odpowiadające sekwencjom: region N-końcowy włącznie z sekwencją sygnałową oznaczono jako Lipidowane-białka lub lipobiałka (L-białka). Produkty genowe odpowiadające sekwencjom: region N-końcowy bez sekwencji sygnałowej są określane jako białka bez sekwencji sygnałowej (w/o ss).
T a b e l a 2. Lista starterów oligonukleotydów do PCR
Starter Sekw. nr. Sekwencja 5' - 3' Pozycja nukleotydu Miejsca restryk- cyjne
OCRR479 17 cagtagatctgtgcctatgcactaaac Sekw. nr 1: 61-78 BglII
OCRR 480 18 gatctctagactactgctattccttacg ctatg Sekw. nr 11: 4909-4887 Xbal
OCRR 497 19 atcactcgagcattacctggataatcctgt Sekw. nr 1 : 1525-1506 XhoI
OCRR 498 20 ctgctaagcttatgaaagatttagat Sekw. nr 1: 1534-1548 HindlII
OCRR 499 21 gatactcgagctgctattccttac Sekw. nr 11: 4906-4893 XhoI
HAMJ 172 22 gaatctcgagttaagctgctgctaattc Sekw. nr 1: 675-661 XhoI
HAMJ 247 23 gacgctcgagcgctatgaaatcagataaattc Sekw. nr 1: 3117-3096 Xhol
HAMJ 248 24 gacgctcgagggcattacctggataatcctgttcatg Sekw. nr 1: 1527-1501 XhoI
HAMJ 249 25 cagtagatctcttcatcatttattgaaaagagg Sekw. nr 11: 1749-1771 BglII
HAMJ 278 26 ttatttcttccatatggacttgacagaagagcaaattaag Sekw. nr 1: 1414-1437 Ndel
HAMJ 279 27 cgccaagcttcgctatgaaatcagataaattc Sekw. nr 1: 3117-3096 Hindlll
HAMJ 280 28 cgccaagcttttccacaatataagtcgattgatt Sekw. nr 1: 2400-2377 Hindlll
HAMJ 281 29 ttatttcttccatatggaagtacctatcttggaaaaagaa Sekw. nr 1: 2398-2421 Ndel
HAMJ 300 30 ttatttcttccatatggtgcctatgcactaaaccagc Sekw. nr 1: 62-82 Ndel
HAMJ 313 31 ataagaatgcggccgcttccacaatataagtcgattgatt Sekw. nr 1: 2400-2377 Notl
OCRR 487 32 cagtagatctgtgcttatgaactaggtttgc Sekw. nr 3: 58-79 BglII
OCRR 488 33 gatcaagcttgctgctacctttacttactctc Sekw. nr 12: 2577-2556 Hindlll
PL 204 073 B1 cd. tabeli 2
HAMJ 171 34 ctgagatatccgttatcgttcaaacc Sekw. nr 3: 1060-1075 EcoRV
HAMJ 251 35 ctgcaagcttttaaaggggaataatacg Sekw. nr 3: 1059-1045 Hindlll
HAMJ 264 36 cagtagatctgcagaagccttcctatctg Sekw. nr 3: 682-700 BglII
HAMJ 282 37 tcgccaagcttcgttatcgttcaaaccattggg Sekw. nr 3: 1060-1081 Hindlll
HAMJ 283 38 ataagaatgcggccgccttactctcctttaataaagccaatagtt Sekw. nr 3: 2520-2492 Ndel
HAMJ 284 39 catgccatggacattgatagtctcttgaaacagc Sekw. nr 3: 856-880 Ncol
HAMJ 285 40 cgccaagcttcttactctcctttaataaagccaatag Sekw. nr 3: 2520-2494 Hindlll
HAMJ 286 41 cgacaagcttaacatggtcgctagcgttacc Sekw. nr 3: 2139-2119 Hindlll
HAMJ 287 42 cataccatgg g cctttatgaggcacctaag Sekw. nr 3: 2014-2034 Ncol
HAMJ 288 43 cgacaagcttaagtaaatcttcagcctctctcag Sekw. nr 3: 2376-2353 Hindlll
HAMJ 289 44 gataccatggctagcgaccatgttcaaagaa Sekw. nr 3: 2125-2146 Ncol
HAMJ 290 45 cgccaagcttatcatccactaacttgactttatcac Sekw. nr 3: 1533-1508 Hindlll
HAMJ 291 46 cataccatgg atattcttgccttcttagctccg Sekw. nr 3: 1531-1554 Ncol
HAMJ 301 47 catgccatggtgcttatgaactaggtttgc Sekw. nr 3: 59-79 Ncol
HAMJ 302 48 cgccaagctttagcgttaccaaaaccattatc Sekw. nr 3: 2128-2107 Hindlll
HAMJ 160 49 gtattagatctgttcctatgaacttggtcgtcacca Sekw. nr 13: 172-196 BglII
HAMJ 186 50 cgcctctagactactgtataggagccgg Sekw. nr 13: 2460-2443 Xbal
HAMJ 292 51 catgccatggaaaacatttcaagccttttacgtg Sekw. nr 11: 754-778 Ncol
HAMJ 293 52 cgacaagcttctgtataggagccggttgactttc Sekw. nr 11: 2457-2434 Hindlll
HAMJ 294 53 catgccatggttcgtaaaaataaggcagaccaag Sekw. nr 11: 2038-2062 Ncol
HAMJ 297 54 catgccatggaagcctattggaatgggaag Sekw. nr 11: 622-642 Ncol
T a b e l a 3. Listy obcię tych produktów genowych BVH-3 i BVH-11 wytworzonych z S. pneumoniae SP64
Zestawy starterów do PCR Określenie białek Oznaczenie (kodowane aminokwasy) Sekw.nr. Wektor do klonowania
OCRR479-OCRR480 BVH-3M BVH-3 w/o ss (21-1039) 55 pSL301
OCRR479-OCRR497 BVH-3AD BVH-3 N'koniec w/o ss (21-509) 56 pSL301
HAMJ248-HAMJ249 L-BVH-3AD BVH-3 N'koniec (1-509) 57 pET-21(+)
OCRR498-OCRR499 BVH-3B BVH-3 C'koniec (512-1039) 10 pSL301
OCRR479-HAMJ172 BVH-3C BVH-3 N'koniec w/o ss (21-225) 59 pET-32 c(+)
OCRR487-OCRR488 BVH-11U BVH-11 w/o ss (20-840) 60 pCMV-GH
HAMJ251-OCRR487 BVH-11A BVH-11 N'koniec w/o ss (20-353) 61 pET-32 c (+)
HAMJ171-OCRR488 BVH-11B BVH-11 BVH-11 C'koniec (354-840) 62 pET-32 a(+)
HAMJ264-OCRR488 BVH-11C BVH-11 C'koniec (228-840) 63 pET-32 a(+)
PL 204 073 B1 cd. tabeli 3
HAMJ278-HAMJ279 NEW1 BVH-3 C'koniec (472-1039) 64 pET-21b(+)
HAMJ278-HAMJ280 NEW2 BVH-3 C'koniec (472-800) 65 pET-21b(+)
HAMJ281-HAMJ279 NEW3 BVH-3 C'koniec (800-1039) 66 pET-21b(+)
HAMJ284-HAMJ285 NEW4 BVH-11 C'koniec (286-840) 67 pET-21d(+)
HAMJ284-HAMJ286 NEW5 BVH-11 wewnętrzny (286-713) 68 pET-21d(+)
HAMJ287-HAMJ288 NEW6 BVH-11 wewnętrzny (672-792) 69 pET-21d(+)
HAMJ285-HAMJ289 NEW7 BVH-11 wewnętrzny (709-840) 70 pET-21d(+)
HAMJ284-HAMJ290 NEW8 BVH-11 wewnętrzny (286-511) 71 pET-21d(+)
HAMJ286-HAMJ291 NEW9 BVH-11 wewnętrzny (511-713) 72 pET-21d(+)
HAMJ160-HAMJ186 BVH-11-2M BVH-11-2 w/o ss (20-838) 73 pSL301
HAMJ292-HAMJ293 NEW 10 BVH-11-2 C'koniec (271-838) 74 pET-21d(+)
HAMJ293-HAMJ294 NEW11 BVH-11-2 C'koniec (699-838) 75 pET-21d(+)
HAMJ282-HAMJ283 BVH-11B BVH-11 C'koniec (354-840) 62 pET-21b(+)
HAMJ286-HAMJ297 NEW14 BVH-11-2 wewnętrzny (227-699) 77 pET-21d(+)
HAMJ300-HAMJ313 NEW 15 BVH-3 N'koniec w/o ss (21-800) 78 pET-21b(+)
HAMJ301-HAMJ302 NEW16 BVH-11 N'koniec w/o ss (20-709) 79 pET-21d(+)
P r z y k ł a d 9
Niniejszy przykład opisuje izolowanie monoklonalnych przeciwciał (Mabs) i zastosowanie Mabs do charakteryzowania epitopów białkowych BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2.
Samice myszy BALB/c (Charles River) immunizowano podskórnie produktami genowymi
BVH-3, BVH-11 lub BVH-11-2 ze szczepu SP64 S. pneumoniae w obecności 15 μg adiuwanta QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Kanada). Jeden zbiór myszy (doświadczenie fuzyjne 1) immunizowano dnia 1 i 14 przy pomocy 25 μg oczyszczonego przez powinowactwo białka fuzyjnego tioredoksyno-His^Tag-BVH-3M. Druga grupa myszy (doświadczenie fuzyjne 2) immunizowano trzy razy z trzytygodniowymi przerwami przy pomocy 25 μg oczyszczonego przez powinowactwo tioredoksyno-His^Tag-BVH-11M. Trzecia grupa myszy (doświadczenie fuzyjne 3) immunizowano dnia 1 i dnia 15 przy pomocy 25 μg oczyszczonego przez powinowactwo białka fuzyjnego tioredoksynoHis^Tag-BVH-11-2M. Czwarta grupy myszy (doświadczenie fuzyjne 4) immunizowano dnia 1 przy pomocy 25 μg oczyszczonego przez powinowactwo białka fuzyjnego tioredoksyno-His^BVH-11B i zwiększano przez iniekcję dożylną dnia 16 i dnia 37 zrekombinowanego BVH-11B w PBS. Trzy do czterech dni przed fuzją, myszom podawano przez iniekcje dożylną 25 μg odpowiednio antygeny zawieszone jedynie w PBS. Hybridomy otrzymywano w wyniku fuzji komórek śledziony z niewydzielnicznymi komórkami SP2/0 jak wcześniej opisano w pracy J. Hamel i wsp.. [J. Med. Microbiol., 23, pp163-170 (1987)]. Supernatanty kultur hybridom początkowo przeszukiwano stosując test immunologiczny wiązania enzymu według procedury opisanej przez Hamel i wsp.. (Supra) stosując szalki powlekane preparatem oczyszczonych zrekombinowanych białek lub zawiesinami komórek S. pneumoniae zabitych ciepłem. Pozytywne hybridomy wybrano na podstawie reagowania w teście ELISA z różnymi antygenami, a następnie zostały sklonowane przez ograniczone rozcieńczenia, zawieszone i zamrożone.
Hybridomy badano testem ELISA lub testem immunoblottingu Westerna przeciwko produktom genowym BVH-3 i BVH-11 w celu scharakteryzowania epitopów rozpoznawanych przez Mabs. BVH-3 i BVH-11 mają wspólne epitopy z 6-ma Mabs (H3-1-F9, H3-1-D4, H3-1-H12, H11-1-E7, H11-1-H10 i H11-1.1-G11) wykazując reaktywność z oboma białkami(Tabela 4). Cząsteczki BVH-11 i BVH-11-2 z S. pneumoniae SP64 mają wspólne epitopy nie obecne na BVH-3 z Mabs (3A1, 13C11, 10H10, 1D8, 10G9, 10A2, 3E8, 10D7, 2H7 i 6H7) reagujące ze zrekombinowanymi białkami zarówno BVH-11 jak i BVH-11-2, (Tabela 5).
PL 204 073 B1
T a b e l a 4. Reaktywność BVH-3-immunoreaktywnych Mabs z zespołem produktów genowych BVH-3 i BVH-11
MAbs Immunoreaktywność z
BVH-3M 21-1039 BVH-3A 21-509 BVH-3B 512-1039 BVH-3C 21-225 NEW2 472-800 NEW3 800-1039 BVH-11M 20-840
H3-1-F9 + + - + - - +
H3-1-D4 + + - + - - +
H3-1-H12 + + - + - - +
H3-2-G2 + + - - - - -
H3-3-A1 + + - - - - -
H3-4-D3 + - + - - + -
H11-1-E7 + + - + - - +
H11-1-H10 + + - + - - +
H11-1.1-G11 + + - + + - +
T a b e l a 5. Reaktywność Mabs skierowanych przeciwko białku BVH-11-2 ze szczepu S. pneumoniae SP64 z zespołem produktów genowych BVH-11
Mabsa Immunoreaktywność z
Produkty BVH-11 Produkty BVH-11-2
BVH-11M 20-840 NEW8 286-511 NEW9 511-713 BVH-11B 354-840 BVH-11-2 20-838 NEW10 271-838 NEW11 699-838 NEW14 227-699
3A1 + + - + + + - +
13C11 + + + + + + - +
10H10 + + + + + + - +
1D8 + + - + + + - +
10G9 + - - + + + - +
10A2 + - - + + + - +
3E8 + - - + + + - +
10D7 + - - + + + - +
2H7 + - - - + - - -
6H7 + - - - + - - -
3A4 - - - - + + + -
14H6 - - - - + + + -
7G2 - - - - + + - +
13H10 - - - - + - - +
7H8 - - - - + - - -
7H6 - - - - + - - -
a Mabs wymienione w tej tabeli nie reagował y ze zrekombinowaną cząsteczką BVH-3
Wyniki otrzymane na podstawie badań immunoreaktywności Mabs (Tabela 4 i Tabela 5) są w zgodzie z sekwencjami biał kowymi pochodzą cymi od odpowiednich sekwencji genowych. W rzeczywistości Mabs reagujące krzyżowo z cząsteczkami BVH-3 i BVH-11 rozpoznającymi białko BVH-3C odpowiadające sekwencjom: region konserwowany oraz specyficzny Mabs BVH-11 i BVHPL 204 073 B1
11-2 reagowały z epitopami zlokalizowanymi na częściach zmiennych tych cząsteczek. BVH-3 i BVH11, i BVH-11 i BVH-11-2 mogą być rozpoznawane ze względu na ich reagowanie z Mabs.
P r z y k ł a d 10
Niniejszy przykład przedstawia równoczesną ekspresję produktów genowych BVH-3 i BVH-11 u S. pneumoniae.
Standardową technikę blotu Westerna stosowano do badania czy geny BVH-3 i BVH-11 ulegały ekspresji w S. pneumoniae. Szczepy S. pneumoniae SP64 i SP63 hodowano przez noc w temp. 37°C w 5% CO2 na czekoladowych szalkach agarowych, bakterie zawieszono w PBS i zabito ciepłem w temp. 56°C przez 20 min. Do otrzymywania antygenów, zawiesiny S. pneumoniae poddano działaniu buforu próbki zawierającego SDS i 2-merkaptoetanol przez 5 min w temp. 100°C. białkowe antygeny pneumokokowe rozdzielono stosując elektroforezę SDS-PAGE według metody opisanej przez Laemmli [Nature, 227, str. 680-685 (1970)]. Po SDS-PAGE, białka przenoszono elektroforetycznie z żelu na papier nitrocelulozowy sposobem według Towbina [Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 76, str. 4350-4354 (1979)] i sondowano z mysią surowicą odpornościową lub monoklonalnymi przeciwciałami. Detekcja antygenów reagujących z przeciwciałami prowadzono przez niebezpośredni test enzymatyczno-immunologiczny stosując koniugowane przeciwko mysie immunoglobuliny i substrat barwiący. Jeśli surowicę odpornościową skierowaną przeciwko zrekombinowanemu BVH-3 badano przeciwko antygenom S. pneumoniae SP64, to wykryto dwa reaktywne prążki mające rzeczywiste masy cząsteczkowe 127 kDa i 99 kDa. Prążki mające takie same rzeczywiste masy cząsteczkowe również wykryto gdy stosowano Mabs H3-1-F9, H3-1-D4, H3-1-H12, H11-1-E7, H11-1-H10 i H11-1.1-G11 indywidualnie jako sondy immunologiczne. Przeciwnie, stosując Mabs specyficzny względem cząsteczki BVH-3 wykryto jedynie prążek 127 kDa a Mabs specyficzny względem BVH-11 wykryto jedynie prążek 99 kDa, potwierdzając w ten sposób identyczność prążków 127 i 99 kDa jako odpowiednio, BVH-3 i BVH-11. Badania te dostarczają dowodów, że białka BVH-3 i BVH-11 są jednocześnie obecne u S. pneumoniae. Ponadto, wyniki są zgodne z naszymi poprzednimi obserwacjami, że BVH-3 i BVH-11 mają epitopy, które są wspólne dla białek i epitopów, które są wyłączne dla któregoś z tych białek.
W S. pneumoniae SP64, dojrzałe BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 są białkami o 1019, 821 i 819 aminokwasach o przewidywanych masach cząsteczkowych odpowiednio 112,5 kDa, 92,4 kDa, i 91,7 kDa. Pomimo, że jest pewna rozbieżność pomiędzy masami cząsteczkowymi przewidzianymi na podstawie sekwencji a masami cząsteczkowymi wyznaczonymi na SDS-PAGE, BVH-3 mogą być rozpoznawane z BVH-11 dzięki jego wyższym masom cząsteczkowym. Ponadto, cząsteczki BVH-3 ze szczepu S. pneumoniae SP63 mają rzeczywiste masy cząsteczkowe 112 kDa w SDS-PAGE w porównaniu do 127 kDa dla BVH-3 ze szczepu SP64. Dane te są zgodne z usunięciem ciągu 177 reszt aminokwasowych w BVH-3 szczepu S. pneumoniae SP63.
P r z y k ł a d 11
Niniejszy przykład opisuje ochronę uzyskaną w przypadku doświadczalnej infekcji myszy szczepionych zrekombinowanymi produktami genowymi BVH-3 lub BVH-11.
Grupy 7 lub 8 samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowano podskórnie trzy razy z trzytygodniowymi przerwami stosując oczyszczone przez powinowactwo białko fuzyjne tioredoksyno-His^TagBVH-3M, oczyszczone przez powinowactwo białko fuzyjne tioredoksyno-His^Tag-BVH-11M lub, jako kontrolę, tylko z samym adiuwantem QuilA w PBS. Dwanaście do 14 dni po trzeciej immunizacji, myszy prowokowano dożylnie S. pneumoniae szczep WU2 lub donosowo szczepem P4241. Próbki inokulum S. pneumoniae do prowokacji umieszczono na czekoladowych szalkach agarowych do określania CFU i do sprawdzania dawki do prowokacji. Dawki do prowokacji wynosiły około 106 CFU. Przypadki śmiertelne zliczano przez 14 dni i dnia 14 po prowokacji, myszy, które przeżyły uśmiercano i próbki krwi badano pod kątem obecności organizmów S. pneumoniae. Dane określające przeżywalność przedstawiono w tabelach 6 i 7.
T a b e l a 6. Ochrona w której tworzeniu biorą udział zrekombinowane BVH-3M i BVH-11M białka w przypadku doświadczalnej infekcji wirulentymi S. pneumoniae WU2
Doświadczenie Immunogen żywe : martwea Średni dzień przeżycia
1 BVH-3M 8 : 0 >14
żaden 0 : 8 1
2 BVH-11M 8 : 0 >14
żaden 0 : 8 1
a Ilość myszy ż ywych : ilość myszy martwych dnia 14 po prowokacji.
PL 204 073 B1
T a b e l a 7. Ochrona w której tworzeniu biorą udział zrekombinowane BVH-3M i BVH-11M białka w przypadku doświadczalnej infekcji wirulentymi S. pneumoniae P4241
Doświadczenie Immunogen żywe : martwe3 Średni dzień przeżycia
1 BVH-3M 6 1 >14
żaden 1 7 4.5
BVH-3M 8 0 >14
2 BVH-11M 8 0 >14
żaden 0 8 4
a Ilość myszy ż ywe : ilość myszy martwe dnia 14 po prowokacji.
Wszystkie myszy immunizowane zrekombinowanym białkiem BVH-3M lub BVH-11M przeżyły zakażenie WU2, podczas gdy żadna z kontrolnych myszy którym podano sam adjuwant nie przeżyła. Wszystkie z wyjątkiem jednej myszy immunizowanej zrekombinowanym białkiem BVH-3M lub BVH-11M przeżyły zakażenie P4241 podczas gdy tylko jedna mysz kontrolna, z myszy którym podano sam adjuwant przeżyła. Wszystkie posiewy krwi pobrane od myszy, które przeżyły były negatywne dnia 14 po prowokacji.
Wyniki te jasno wskazują, że oba, BVH-3M i BVH-11M, wywołują ochronne anty-paciorkowcom odpowiedzi immunologiczne u myszy. Fakt, że te białka są wysoce konserwowane w przypadku izolatów S. pneumoniae podkreśla skuteczność BVH-3 i BVH-11 jako uniwersalnych kandydatów do przygotowywania szczepionek. W rzeczywistości, białka BVH-3 i BVH-11 z grupy surowiczej 6 S. pneumoniae szczepu SP64 powodują ochronę przeciwko zakażeniu paciorkowcami w przypadku szczepów o różnych serotypach otoczkowych.
Idealnie, szczepionka, która może zabezpieczać przeciwko chorobom spowodowanym przez paciorkowce, może chronić przeciwko zapaleniu opon, zapaleniu ucha środkowego, bakteremii lub, zapaleniu płuc. BVH-3 i BVH-11 miały działanie ochronne przeciwko letalnym ogólnoustrojowym i płucnym modelom infekcji, co sugeruje, że u ludzi, szczepionki oparte na białkach BVH-3 i BVH-11 mogą zmniejszać częstość występowania choroby w szerokim spektrum chorób powodowanych przez zasadniczo wszystkie S. pneumoniae niezależnie od serotypu otoczkowego.
Dane z tabeli 6 i 7 jasno wykazują, że BVH-3 i BVH-11 były obydwa, cząsteczkami z S. pneumoniae wywołującymi ochronę. Jednakże nie było wiadomym, czy w ochronie mogą pośredniczyć specyficzne sekwencje, które nie były obecne w cząsteczkach BVH-3 i BVH-11. Grupy samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowano podskórnie trzy razy z trzytygodniowymi przerwami stosując oczyszczane przez powinowactwo białko fuzyjne tioredoksyno-His^Tag- BVH-3AD, -BVH-3B lub -BVH-3C w obecności 15 μg adjuwanta QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Kanada). Myszy kontrolne immunizowano tylko samym adjuwantem QuilA w PBS lub oczyszczanym przez powinowactwo białkiem fuzyjnym tioredoksyno-His^Tag lub tioredoksyno-His^Tag (His-Tio) w obecności QuilA.
Do określania zdolności ochronnych zestawu obciętych białek, zakończonych NEW4, NEW5, NEW6, NEW7, NEW8, NEW9, NEW10, NEW11, NEW14 i BVH-11B, grupy samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowano podskórnie dwa razy z trzytygodniowymi przerwami 25 μg bądź oczyszczonym przez powinowactwo HisTag-białkiem fuzyjnym w obecności 15 μg adiuwanta QuilA. Dziesięć do 14 dni po ostatniej immunizacji, myszy prowokowano wirulentymi S. pneumoniae. Nasze wyniki wskazują, że, BVH-3B, obcięta cząsteczka BVH-3 zawierająca 512-1039 aminokwasów, wywołuje ochronę przeciwko wirulentnych względem myszy szczepów WU2 i P4241.
Podobnie, cząsteczki BVH-11B, NEW4 i NEW5, trzy obcięte cząsteczki BVH-11 zawierające 354-840 aminokwasów, 286-840 aminokwasów i 286-713 aminokwasów, odpowiednio, wywoływały ochronę przeciwko doświadczalnym dożylnym prowokacjom WU2 i donosowym prowokacjom P4241. Ponadto, szczepienie NEW10 i NEW14, zawierającym 272-838 aminokwasów i 227-699 aminokwasów z cząsteczki BVH-11-2 również prowadziło do uzyskania ochrony przeciwko śmierci spowodowanej przez szczepy paciorkowców.
Wyniki te wskazują, że region zawierający 428 aminokwasów rozciągający się w sekwencjach białkowych odpowiednio, od aminokwasów 286-713 i aminokwasów 272-699 w S. pneumoniae SP64 BVH-11 i BVH-11-2 zawiera epitopy ochronne. Region ten jest wysoce konserwowany przy ogólnej 91% identyczności i 94% homologii pomiędzy trzynastoma sekwencjami białkowymi BVH-11.
PL 204 073 B1
T a b e l a 8. Ocena ochrony wywoływanej przez szczepienie myszy produktami genowymi BVH-3 i BVH-11
Prowokacja WU2 Prowokacja P4241
Doświadczenie Immunogen żywe : martwea Średni dzień przeżycia żywe : martwea Średni dzień przeżycia
1b Żaden 0 : 8 1.5 1 : 7 4.5
NEW4 8 : 0 >14 8 : 0 >14
NEW5 8 : 0 >14 8 : 0 >14
NEW7 0 : 8 2 0 : 8 5
BVH-11M 8 : 0 >14 8 : 0 >14
2b Żaden 0 : 8 1 0 : 8 4
NEW5 8 : 0 >14 8 : 0 >14
NEW 8 0 : 8 1.5 0 : 8 5.5
NEW9 3 : 5 3.5 2 : 6 7
BVH-11M 8 : 0 >14 8 : 0 >14
3b Żaden 0 : 8 1 0 : 8 4
NEW6 0 : 8 1 4 : 4 10.5c
NEW 10 8 : 0 >14 8 : 0 >14
NEW 11 0 : 8 1.5 1 : 7 6
BVH-11M 8 : 0 >14 8 : 0 >14
4b Żaden 0 : 8 2 0 : 8 4
BVH-11B 7 : 1 >14 8 : 0 >14
NEW 14 8 : 0 >14 8 : 0 >14
5 His-Tio 0 : 8 2
BVH-3AD 1 : 7 2.5
BVH-3B 5 : 3 >14
6 His-Tio 0 : 8 1
BVH-3 0 : 8 1
a Ilość myszy ż ywe : ilość myszy martwe dnia 14 po prowokacji.
b dawka prowokacji WU2 105 CFU.
c u myszy, które żyły dłużej niż 14 dni, oznaczano czas przeżycia 14 dni w celu okreś lenia wartości średnich.
P r z y k ł a d 12
Niniejszy przykład przedstawia klonowanie i ekspresję chimerycznego genu kodującego chimeryczny polipeptyd odpowiadający sekwencjom: region końca karboksylowego BVH-3 w połączeniu na końcu C z regionem końca karboksylowego BVH-11 i dodatkową ochronę obserwowano po szczepieniu chimerycznym polipeptydem.
Jasne jest z badań przedstawionych powyżej, że BVH-3 i BVH-11 są serologicznie różniącymi się cząsteczkami jednocześnie obecnymi w S. pneumoniae. Wyniki badań immunologicznych myszy wskazują, że oba białka są dobrymi kandydatami do przygotowania szczepionki. Białka te mogą być skuteczne w zapewnianiu ochrony przeciwko wszelkim paciorkowcom, bez względu na serotyp. Pomimo, że dwa białka mają takie same epitopy i sekwencje, mają one różne charakterystyki i mogą służyć różnym funkcjom biologicznym. Zatem, immunizacja przeciwko dwóm białkom może dostarczyć wyższy poziom ochrony niż uzyskiwany przez każde z białek oddzielnie. W celu sprawdzenia tej tezy, kilka dróg może być badanych, BYH-3 i BVH-11 pełnej długości lub obcięte, podawane w połączeniu z lub w sprzężeniu. W niniejszym opisie opisujemy inżynierię genetyczną genu fuzyjnego i białka
PL 204 073 B1
BVH-3-BVH-11, zakończonego NEW 12 (odpowiednio Sekwencja nr 76 i Sekwencja nr 58) i możliwość zastosowania białka NEW12 jako szczepionki.
Fragmenty genowe BVH-3 i BVH-11 odpowiadające sekwencjom: koniec 3' genów amplifikowano metodą PCR stosując pary oligonukleotydów zaprojektowane do prowadzenia amplifikacji fragmentów obejmujących nukleotydy 1414 do 3117 (Sekwencja nr 1) i nukleotydy 1060 do 2520 (Sekwencja nr 3) ze szczepu S. pneumoniae SP64 genów odpowiednio BVH-3 i BVH-11. Stosowane startery, HAMJ278 i HAMJ279; HAMJ282 i HAMJ283 miały miejsca cięcia endonukleaz na końcu 5', co umożliwia bezpośrednie klonowanie w ramce amplifikowanego produktu do trawionego wektora plazmidowego pET21b(+) (Tabela 2). Produkty amplifikacji PCR trawiono endonukleazami restrykcyjnymi i ligowano ze linearyzowanym plazmidem pET21b(+), trawionym podobnie. Otrzymane konstrukty plazmidowe potwierdzono przeprowadzając analizę sekwencji nukleotydów. Zrekombinowane plazmidy pET21b(+) zawierające produkt PCR NdeI-Hindlll BVH-3 linearyzowano trawiąc enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Notl w celu klonowania w ramce fragmentu Hindlll-Notl DNA otrzymanego ze zrekombinowanego pET21(+) wektora zawierającego fragment genu BVH-11. Klony na wstępnie stabilizowano w E. coli DH5^ przez wprowadzenie do E. coli BL21(^DE3) w celu uzyskania ekspresji chimerycznej cząsteczki białka paciorkowców. Zrekombinowany chimeryczny polipeptyd, zakończony NEW 12, ulegał ekspresji jako połączenie C-końcowe z His-tag. Otrzymane w wyniku ekspresji zrekombinowane białko NEW 12 oczyszczano z frakcji supernatantu otrzymanej w wyniku wirowania sonikowanej indukowanej IPTG hodowli E. coli stosując żywicę chelatującą metal His-Bind (QIAgen, Chatsworth, CA).
Według tej samej procedury opisanej powyżej, możliwe jest skonstruowanie innych chimerycznych polipeptydów, w wyniku jednoczesnej ekspresji New 1 i New 4, New 1 i New 5, New 1 i New 10, lub New 1 i New 14. Konstrukt może zawierać New 1 upstream lub downstream względem New 4, New 5, New 10, BVH-11B lub New 14. W wyniku jednoczesnej ekspresji więcej niż dwóch fragmentów dowolnego z genów BVH-3, BVH-11 lub BVH-11-2, jest również możliwe skonstruowanie innych chimerycznych polipeptydów.
Grupy 8 samic myszy BALB/c (Charles River) immunizowano podskórnie dwa razy z trzytygodniowymi przerwami 25 μg dowolnym oczyszczonym przez powinowactwo fuzją His^Tag z białkiem NEW1, BVH-11B lub NEW12 w obecności 15 μg adiuwanta QuilA. dziesięć do 14 dni po ostatniej immunizacji, myszy prowokowano wirulentym S. pneumoniae. Jak wykazano poprzednio, cząsteczki NEW1 i BVH-11 B zawierające odpowiednio, aminokwasy 472 do 1039 z białka BYH-3 i aminokwasy 354-840 z białka BVH-11, odpowiadają częściom białka zdolnego do wywołania ochronnej odpowiedzi immunologicznej. W celu określania czy chimeryczny polipeptyd może specyficznie zwiększać ochronę porównano z ochroną obserwowaną dla poszczególnych części, dawki do prowokacji dostosowano w sposób, taki, aby nie spodziewać się ochrony w przypadku cząsteczek NEW1 i BVH-11B. Co ciekawe, chimeryczne białko NEW12, wywołuje odpowiedź przeciwko mysim wirulentnym szczepom WU2 i P4241. Siedem z 8 myszy immunizowanych NEW12 było nadal żywe 10 dni po prowokacji podczas gdy 28 z 32 myszy immunizowanych NEW1, BVH-11B, BVH-3M lub samym adiuwantem było martwych pięć dni po prowokacji. Zatem, szczepienie myszy NEW12 zapewniało najwyższy stopień ochrony przeciwko prowokacji WU2. Wyniki te wskazują, że immunizacja chimerycznym polipeptydem i możliwe połączenia produktów genowych BVH-3 i BVH-11 mogą dostarczyć dodatkowej ochrony do tej jaką otrzymano w wyniku podawania samych antygenów BVH-3 lub BVH-11.
T a b e l a 9. Ocena ochrony wywoływanej przez szczepienie myszy chimeryczną cząsteczką NEW12
Prowokacja WU2 Prowokacja P4241
Immunogen żywe : martwea Średni dzień przeżycia żywe : martwea Średni dzień przeżycia
Żaden 0 : 8 1 0 : 8 5
NEW1 2 : 6 2 1 : 7 8
BVH-11B 1 : 7 3,5 8 : 0 >14
NEW12 6 : 2 >14 7 : 1 >14
BVH-3M 1 : 7 3 8 : 1 >14
PL 204 073 B1
P r z y k ł a d 13
Niniejszy przykład przedstawia identyfikacja dodatkowych pokrewnych sekwencji BVH-3 BVH-11 u gatunków Streptococcus innych niż S. pneumoniae.
Wykazano uprzednio, że BVH-3, BVH-11 i BVH-11-2 stanowią rodzinę pokrewnych białek mających wspólne sekwencje. Przeprowadzono badania homologii z sekwencją nukleotydową z regionu konserwowanego tych genów i porównano z sekwencjami z GenBank i EMBL stosując technikę FASTA. Najbardziej znaczącą homologię obserwowano z genem kodującym 2.469-kb obliczoną masą 92-kDa białka (Sekwencja nr 81) o nieznanej funkcji u S. agalactiae zwanych również paciorkowce grupy B lub GBS. Gen oznaczono jako BVH-71. Białko wykazujące 99.2% identyczności i 99.5% podobieństwa z GBS było również zidentyfikowane w S. pyogenes zwanym również paciorkowcem grupy A lub GAS (Sekwencja nr 83). Region 5' sekwencji BVH-71 (Sekwencja nr 80 i Sekwencja nr 82), obejmujący nukleotydy 1 do 717, wykazano 58 i 60% identyczności z regionami konserwowanymi genów odpowiednio BVH-3 (nukleotydy 1 do 675) i BVH-11 (nukleotydy 1 do 684). Pierwsze 239 aminokwasy sekwencji GBS i GAS BVH-71 otwarte ramki odczytu, które uległy translacji są w 51 i 54% identyczne z pierwszymi 225 i 228 aminokwasami odpowiednio BVH-3 i BVH-11. Oprócz podobieństw strukturalnych, białka pneumokokowe BVH-3, BVH-11 i BVH-71 również mają epitopy antygenowe. Prążek 97-kDa ujawniony w analizie metodą Western blot całych komórek GAS lub GBS, stosując Mab H11-1.1-G11 reagujące z regionami konserwowanymi BVH-3 i BVH-11. Podobnie, zrekombinowane białka BVH-71 GAS i GBS wykryto analizą Western immunoblot.
Wyniki te wskazują, że białka BVH-71, BVH-3 i BVH-11 mogą mieć podobne funkcje.

Claims (43)

1. Izolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 80% z sekwencją aminokwasów nr 6, lub polinukleotyd komplementarny do niego.
2. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 90% z sekwencją aminokwasów nr 6.
3. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 95% z sekwencją aminokwasów nr 6.
4. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że kodowany polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów nr 6.
5. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4, znamienny tym, że kodowany polipeptyd jest zdolny do wytwarzania przeciwciał wykazujących specyficzność wiązania wobec polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasów nr 6, oraz ten kodowany polipeptyd jest zdolny do wywoływania u osobnika reakcji immunologicznej na paciorkowce.
6. Izolowany polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 80% z sekwencją nukleotydów nr 5 lub polinukleotyd komplementarny do niego.
7. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 90% z sekwencją nukleotydów nr 5.
8. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 95% z sekwencją nukleotydów nr 5.
9. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydów nr 5.
10. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że ma postać DNA.
11. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 6, znamienny tym, że ma postać DNA.
12. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że ma postać RNA.
13. Izolowany polinukleotyd według zastrz. 6, znamienny tym, że ma postać RNA.
14. Wektor zawierający izolowany polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 1-9, znamienny tym, że jest funkcjonalnie połączony z regionem kontroli ekspresji.
15. Komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą wektora określonego w zastrz. 14.
16. Sposób wytwarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 1-9, znamienny tym, że obejmuje hodowlą komórek gospodarza określonych w zastrz. 15 w warunkach odpowiednich do uzyskania ekspresji tego polipeptydu.
PL 204 073 B1
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że ponadto obejmuje izolowanie polipeptydu z hodowli komórek gospodarza.
18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że polipeptyd jest polipeptydem rekombinowanym.
19. Izolowany polipeptyd zawierający sekwencją aminokwasów identyczną w co najmniej 80% z sekwencją aminokwasów nr 6.
20. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 90% z sekwencją aminokwasów nr 6.
21. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasów identyczną w co najmniej 95% z sekwencją aminokwasów nr 6.
22. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasów nr 6.
23. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19 albo 20 albo 21 albo 22, znamienny tym, że z sekwencji nr 6 jest usunięta N-terminalna reszta metioninowa.
24. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19 albo 20 albo 21 albo 22, znamienny tym, że z sekwencji nr 6 jest usunięta wydzielnicza sekwencja aminokwasów.
25. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19 albo 20 albo 21 albo 22, znamienny tym, że izolowany polipeptyd jest przyłączony do sacharydu.
26. Izolowany polipeptyd według zastrz. 23, znamienny tym, że izolowany polipeptyd jest przyłączony do sacharydu.
27. Izolowany polipeptyd według zastrz. 24, znamienny tym, że izolowany polipeptyd jest przyłączony do sacharydu.
28. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19, znamienny tym, że jest zdolny do wytwarzania przeciwciał wykazujących specyficzność wiązania wobec polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasów nr 6.
29. Izolowany polipeptyd według zastrz. 19, znamienny tym, że jest zdolny do wywoływania u osobnika reakcji immunologicznej na paciorkowce.
30. Izolowany polipeptyd według zastrz. 29, znamienny tym, że paciorkowiec jest wybrany spośród Streptococcus pneumoniae, grupy A Streptococcus (Streptococcus pyogenes), grupy B Streptococcus (Streptococcus agalactiae), Streptococcus dysgalactiae, lub Streptococcus uberis.
31. Izolowany polipeptyd według zastrz. 29, znamienny tym, że paciorkowcem jest Streptococcus pneumoniae.
32. Kompozycja do szczepionek znamienna tym, że zawiera skuteczną profilaktycznie lub terapeutycznie ilość polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 19-31, oraz farmaceutycznie akceptowalny nośnik lub rozcieńczalnik.
33. Kompozycja do szczepionek według zastrz. 32, znamienna tym, że zawiera ponadto farmaceutycznie akceptowalny adiuwant.
34. Zastosowanie kompozycji określonej w zastrz. 32 albo 33 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania zakażeniu osobnika paciorkowcem.
35. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że zakażenie paciorkowcem obejmuje zapalenie opon, zapalenie ucha środkowego, bakteriemię lub zapalenie płuc.
36. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że osobnikiem jest ssak.
37. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że osobnikiem jest człowiek.
38. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że zakażenie paciorkowcem jest wywołane przez Streptococcus pneumoniae, grupę A Streptococcus (Streptococcus pyogenes), grupę B Streptococcus (Streptococcus agalactiae), Streptococcus dysgalactiae lub Streptococcus uberis.
39. Zastosowanie według zastrz. 34, znamienne tym, że zakażenie paciorkowcem jest wywołane przez Streptococcus pneumoniae.
40. Sposób diagnozowania zakażenia paciorkowcem, znamienny tym, że obejmuje:
(a) inkubację przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, z próbką biologiczną od pacjenta do utworzenia mieszaniny, przy czym przeciwciało lub jego fragment wykazuje specyficzność wiązania wobec polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 19-22; oraz (b) wykrywanie specyficznie związanego przeciwciała, lub jego fragmentu wiążącego antygen, w mieszaninie, co wskazuje na obecność paciorkowca.
PL 204 073 B1
41. Sposób wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje:
(a) inkubację polipeptydu określonego w jednym z zastrz. 19-22 lub jego fragmentu, z próbką biologiczną od pacjenta do utworzenia mieszaniny; oraz (b) wykrywanie specyficznie związanego peptydu lub jego fragmentu w mieszaninie, co wskazuje na obecność przeciwciała, które wykazuje specyficzność wiązania wobec antygenów paciorkowców.
42. Sposób wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej, znamienny tym, że obejmuje:
(a) inkubację próbki DNA zawierającej izolowany polinukleotyd określony w jednym z zastrz. 1-13 lub jego fragment, z próbką biologiczną od pacjenta do uzyskania mieszaniny; oraz (b) wykrywanie specyficznie związanej próbki DNA w mieszaninie, co wskazuje na obecność paciorkowca.
43. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, które to przeciwciało lub jego fragment wykazują specyficzność wiązania z polipeptydem określonym w jednym z zastrz. 19-22, do wytwarzania preparatu do wykrywania u pacjenta zakażenia paciorkowcem, przy czym przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest znakowany w sposób wykrywalny.
PL382438A 1998-12-23 1999-12-20 Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający ten polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca ten polipeptyd, zastosowanie tej kompozycji w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom paciorkowcem, sposób diagnozowania zakażenia paciorkowcem, sposób wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca, sposób wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej PL204073B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11380098P 1998-12-23 1998-12-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL204073B1 true PL204073B1 (pl) 2009-12-31

Family

ID=22351610

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL382437A PL205041B1 (pl) 1998-12-23 1999-12-20 Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający izolowany polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytwarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, chimeryczny polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca polipeptyd oraz jej zastosowanie w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniu osobnika paciorkowcem
PL382438A PL204073B1 (pl) 1998-12-23 1999-12-20 Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający ten polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca ten polipeptyd, zastosowanie tej kompozycji w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom paciorkowcem, sposób diagnozowania zakażenia paciorkowcem, sposób wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca, sposób wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej
PL349777A PL206576B1 (pl) 1998-12-23 1999-12-20 Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający ten polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytwarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, chimeryczny polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca izolowany polipeptyd lub chimeryczny polipeptyd oraz terapeutyczne zastosowanie tej kompozycji w zakażeniach paciorkowcem

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL382437A PL205041B1 (pl) 1998-12-23 1999-12-20 Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający izolowany polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytwarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, chimeryczny polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca polipeptyd oraz jej zastosowanie w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniu osobnika paciorkowcem

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL349777A PL206576B1 (pl) 1998-12-23 1999-12-20 Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający ten polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytwarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, chimeryczny polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca izolowany polipeptyd lub chimeryczny polipeptyd oraz terapeutyczne zastosowanie tej kompozycji w zakażeniach paciorkowcem

Country Status (29)

Country Link
EP (2) EP1141306B1 (pl)
JP (2) JP4761623B2 (pl)
KR (4) KR100802198B1 (pl)
CN (3) CN101134775A (pl)
AP (1) AP2001002199A0 (pl)
AR (1) AR029322A1 (pl)
AT (1) ATE394489T1 (pl)
AU (1) AU1764900A (pl)
BR (1) BR9916477A (pl)
CA (1) CA2356836C (pl)
CL (1) CL2009002037A1 (pl)
CY (3) CY1108223T1 (pl)
CZ (2) CZ303675B6 (pl)
DE (1) DE69938670D1 (pl)
DK (3) DK2261358T3 (pl)
EA (1) EA007409B1 (pl)
ES (3) ES2480417T3 (pl)
HU (1) HU229664B1 (pl)
IL (3) IL143905A0 (pl)
MX (1) MXPA01006427A (pl)
NO (1) NO330800B1 (pl)
NZ (1) NZ512574A (pl)
OA (1) OA11736A (pl)
PL (3) PL205041B1 (pl)
PT (3) PT1950302E (pl)
TR (2) TR200102497T2 (pl)
UY (1) UY25877A1 (pl)
WO (1) WO2000039299A2 (pl)
ZA (1) ZA200105114B (pl)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2321106C (en) 1998-02-20 2013-07-23 Biochem Pharma Inc. Group b streptococcus antigens
EP1801218A3 (en) * 1998-07-27 2007-10-10 Sanofi Pasteur Limited Nucleic acids and proteins from streptococcus pneumoniae
US20030134407A1 (en) 1998-07-27 2003-07-17 Le Page Richard William Falla Nucleic acids and proteins from Streptococcus pneumoniae
EP1140157B1 (en) * 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
US7128918B1 (en) 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
KR100802198B1 (ko) * 1998-12-23 2008-02-11 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 신규한 스트렙토코커스 항원
US6866855B2 (en) 2000-06-12 2005-03-15 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection
DK1294771T3 (da) 2000-06-12 2008-12-15 Univ Saskatchewan Kimært GapC-protein fra Streptococcus og anvendelse deraf til vaccinering og diagnosticering
US6833134B2 (en) 2000-06-12 2004-12-21 University Of Saskacthewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against Streptococcus infection
CA2413450C (en) 2000-06-20 2014-02-18 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
US7074415B2 (en) 2000-06-20 2006-07-11 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
WO2002079475A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Shire Biochem Inc. Streptococcus pyogenes antigens and corresponding dna fragments
BR0210875A (pt) 2001-07-06 2004-06-22 Shire Biochem Inc Antìgenos de streptococcus do grupo b e fragmentos de dna correspondentes
GB0130228D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Hansa Medica Ab Protein
EP1456231A2 (en) * 2001-12-20 2004-09-15 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
EP2287315A1 (en) * 2003-03-04 2011-02-23 Intercell AG Streptococcus pyogenes antigens
EP2311988A1 (en) * 2003-04-15 2011-04-20 Intercell AG S. pneumoniae antigens
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
CA2690708A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
WO2009012588A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-29 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic polypeptides and monoclonal antibodies
ES2553113T3 (es) 2008-04-16 2015-12-04 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacuna
CN102223876A (zh) 2008-09-26 2011-10-19 纳米生物公司 纳米乳剂治疗性组合物及其使用方法
US20120052088A1 (en) 2009-04-30 2012-03-01 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
WO2011027257A2 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Pfizer Vaccines Llc Pcsk9 vaccine
GB201003920D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
MX2013006255A (es) 2010-12-03 2015-08-05 Sanofi Pasteur Ltd Composicion para inmunizacion contra streptococcus pneumoniae.
WO2012100233A1 (en) * 2011-01-20 2012-07-26 Genocea Biosciences, Inc. Vaccines and compositions against streptococcus pneumoniae
WO2012131504A1 (en) 2011-03-02 2012-10-04 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
CN103533953A (zh) 2011-05-17 2014-01-22 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 针对肺炎链球菌的疫苗
ES2642184T3 (es) * 2012-01-05 2017-11-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Péptidos para su uso en el tratamiento y diagnóstico de cánceres positivos a IDH1 R132H
EP2931743A4 (en) * 2012-12-14 2016-08-03 Sanofi Pasteur Ltd METHOD FOR ASSESSING IMMUNOGENICITY
BR112016015835B1 (pt) 2014-01-21 2023-12-26 Pfizer Inc Processo de preparação de conjugados compreendendo polissacarídeos capsulares de streptococcus pneumoniae
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PL3096786T3 (pl) 2014-01-21 2021-11-08 Pfizer Inc. Polisacharydy otoczkowe streptococcus pneumoniae i ich koniugaty
CN110859957B (zh) 2014-01-21 2024-04-12 辉瑞公司 包含缀合荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其用途
ES2701169T3 (es) 2014-02-14 2019-02-21 Pfizer Conjugados glucoproteicos inmunogénicos
HUE062499T2 (hu) 2015-01-15 2023-11-28 Pfizer Pneumococcus-vakcinákban történõ alkalmazásra szolgáló immunogén készítmények
KR102225282B1 (ko) 2015-07-21 2021-03-10 화이자 인코포레이티드 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
BR112019014833A2 (pt) 2017-01-20 2020-04-14 Pfizer composições imunogênicas para uso em vacinas pneumococais
GB201711635D0 (en) 2017-07-19 2017-08-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3120922A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
WO2020208502A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
PH12022550110A1 (en) 2019-07-31 2022-12-12 Sk Bioscience Co Ltd Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same
US20230000966A1 (en) 2019-11-01 2023-01-05 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN119371566A (zh) 2020-02-21 2025-01-28 辉瑞公司 糖类的纯化
BR112022014555A2 (pt) 2020-02-23 2022-09-20 Pfizer Composições de escherichia coli e métodos das mesmas.
WO2022084852A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
US12138302B2 (en) 2020-10-27 2024-11-12 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
PE20231934A1 (es) 2020-10-27 2023-12-01 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas
CA3200602A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
US12357681B2 (en) 2020-12-23 2025-07-15 Pfizer Inc. E. coli FimH mutants and uses thereof
JP2024517780A (ja) 2021-05-03 2024-04-23 ファイザー・インク 細菌およびベータコロナウイルス感染症に対するワクチン接種
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
JP2024521847A (ja) 2021-05-28 2024-06-04 ファイザー・インク コンジュゲート化莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
MX2023013434A (es) 2021-05-28 2023-12-12 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados y sus usos.
CA3247998A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions based on conjugated capsular saccharidic antigens and their uses
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
CA3256617A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. PROCESS FOR PRODUCING VACCINE FORMULATIONS WITH PRESERVATIVES
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP4622665A2 (en) 2022-11-22 2025-10-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
AU2023403045A1 (en) 2022-12-01 2025-06-12 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
WO2024166008A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
PE20252774A1 (es) 2023-03-30 2025-12-22 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados y usos de estos
AU2024255922A1 (en) 2023-04-14 2025-10-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024224266A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
KR20260015203A (ko) 2023-05-19 2026-02-02 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 호흡기 세포융합 바이러스 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 감염에 대한 면역 반응을 유발하는 방법
TW202527906A (zh) 2023-09-14 2025-07-16 美商輝瑞股份有限公司 包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原之佐劑化致免疫性組成物及其用途
WO2025133971A1 (en) 2023-12-23 2025-06-26 Pfizer Inc. Improved methods for producing bacterial capsular saccharide glycoconjugates
WO2025186705A2 (en) 2024-03-06 2025-09-12 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2025191415A1 (en) 2024-03-11 2025-09-18 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated escherichia coli saccharides and uses thereof
WO2025219908A2 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Pfizer Inc. Media and fermentation methods for polysaccharide production in bacterial cell culture
WO2025219904A1 (en) 2024-04-19 2025-10-23 Pfizer Inc. Improved methods for producing glycoconjugates by reductive amination in aprotic solvent

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4431739A (en) 1979-11-05 1984-02-14 Genentech, Inc. Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein
US4425437A (en) 1979-11-05 1984-01-10 Genentech, Inc. Microbial polypeptide expression vehicle
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
HU217582B (hu) * 1993-03-19 2000-02-28 Gunnar Lindahl Streptococcus B csoportba tartozó törzsek elleni immunitást biztosító, Rib fehérjenevű felületi protein, eljárás a protein tisztítására, reagenskészlet és gyógyszerkészítmény
EA199800046A1 (ru) * 1995-06-07 1998-06-25 Байокем Вэксинс Инк. Полипептид, последовательность днк, вакцинная композиция (варианты), антитело или его фрагмент, вакцина, применения указанных полипептида, последовательности днк и антитела или его фрагмента
US5882896A (en) * 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5928895A (en) * 1996-09-24 1999-07-27 Smithkline Beecham Corporation IgA Fc binding protein
JP4469026B2 (ja) * 1996-10-31 2010-05-26 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原およびワクチン
AU9510598A (en) * 1997-09-24 1999-04-12 American Cyanamid Company Human complement c3-degrading proteinase from (streptococcus pneumoniae)
WO1999053940A1 (en) * 1998-04-23 1999-10-28 Uab Research Foundation PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN C(PspC), EPITOPIC REGIONS AND STRAIN SELECTION THEREOF, AND USES THEREFOR
ATE361365T1 (de) * 1998-07-27 2007-05-15 Sanofi Pasteur Ltd Streptococcus pneumoniae proteine und nukleinsäuren
CN1318103A (zh) * 1998-07-27 2001-10-17 微生物技术有限公司 肺炎链球菌的核酸和蛋白质
EP1115875A1 (en) * 1998-09-24 2001-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
EP1140157B1 (en) * 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
KR100802198B1 (ko) * 1998-12-23 2008-02-11 샤이어 바이오켐 인코포레이티드 신규한 스트렙토코커스 항원

Also Published As

Publication number Publication date
JP4761623B2 (ja) 2011-08-31
DE69938670D1 (de) 2008-06-19
TR200200633T2 (tr) 2002-06-21
AP2001002199A0 (en) 2001-09-30
JP2002533123A (ja) 2002-10-08
IL143905A0 (en) 2002-04-21
KR20010104693A (ko) 2001-11-26
CA2356836C (en) 2011-09-13
CN1654657A (zh) 2005-08-17
JP5039802B2 (ja) 2012-10-03
IL143905A (en) 2011-05-31
DK1950302T3 (da) 2013-01-14
HU229664B1 (en) 2014-04-28
NO330800B1 (no) 2011-07-18
DK1141306T3 (da) 2008-08-18
NO20013045L (no) 2001-08-20
KR20080036666A (ko) 2008-04-28
AR029322A1 (es) 2003-06-25
CZ20012161A3 (cs) 2001-10-17
JP2010142246A (ja) 2010-07-01
KR101170203B1 (ko) 2012-07-31
CZ302790B6 (cs) 2011-11-09
ES2480417T3 (es) 2014-07-28
CZ303675B6 (cs) 2013-02-27
OA11736A (en) 2005-06-12
CN100398653C (zh) 2008-07-02
HUP0104774A3 (en) 2007-10-29
ATE394489T1 (de) 2008-05-15
PT1950302E (pt) 2013-01-16
WO2000039299A3 (en) 2000-11-02
KR101078919B1 (ko) 2011-11-01
PT1141306E (pt) 2008-07-30
KR100891398B1 (ko) 2009-04-02
CN1191362C (zh) 2005-03-02
CY1108223T1 (el) 2014-02-12
ZA200105114B (en) 2002-11-21
EP1141306B1 (en) 2008-05-07
IL194230A (en) 2013-12-31
ES2400280T3 (es) 2013-04-08
EA007409B1 (ru) 2006-10-27
IL194230A0 (en) 2011-08-01
MXPA01006427A (es) 2002-06-04
NZ512574A (en) 2004-03-26
KR20060134227A (ko) 2006-12-27
EP1141306A2 (en) 2001-10-10
PL205041B1 (pl) 2010-03-31
TR200102497T2 (tr) 2002-01-21
HUP0104774A2 (hu) 2002-04-29
EP2261358B1 (en) 2014-05-14
PL206576B1 (pl) 2010-08-31
BR9916477A (pt) 2004-06-22
AU1764900A (en) 2000-07-31
KR20100063814A (ko) 2010-06-11
KR100802198B1 (ko) 2008-02-11
CY1115340T1 (el) 2017-01-04
PL349777A1 (en) 2002-09-09
WO2000039299A2 (en) 2000-07-06
EP2261358A2 (en) 2010-12-15
EA200100565A1 (ru) 2002-04-25
ES2306528T3 (es) 2008-11-01
DK2261358T3 (da) 2014-07-28
CN1332803A (zh) 2002-01-23
PT2261358E (pt) 2014-07-30
CA2356836A1 (en) 2000-07-06
UY25877A1 (es) 2000-08-21
CL2009002037A1 (es) 2010-06-25
CN101134775A (zh) 2008-03-05
EP2261358A3 (en) 2011-02-23
NO20013045D0 (no) 2001-06-19
HK1118575A1 (en) 2009-02-13
CY1114722T1 (el) 2016-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL204073B1 (pl) Izolowany polinukleotyd, wektor zawierający ten polinukleotyd, komórka gospodarza transfekowana lub transformowana za pomocą tego wektora, sposób wytarzania polipeptydu kodowanego przez izolowany polinukleotyd, izolowany polipeptyd, kompozycja do szczepionek zawierająca ten polipeptyd, zastosowanie tej kompozycji w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom paciorkowcem, sposób diagnozowania zakażenia paciorkowcem, sposób wykrywania przeciwciała specyficznie wiążącego się z antygenem paciorkowca, sposób wykrywania obecności paciorkowców w próbce biologicznej
US8211437B2 (en) Streptococcus antigens
US7262024B2 (en) Streptococcus antigens
US7074415B2 (en) Streptococcus antigens
EP1950302B1 (en) Streptococcus antigens
AU2008229967B2 (en) Novel streptococcus antigens
HK1118575B (en) Streptococcus antigens

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20091220