PL205549B1 - Komórka otrzymana z fuzji komórki pochodzącej z ludzkiej embrionalnej komórki nerki, sposób jej wytwarzania oraz linia komórkowa - Google Patents
Komórka otrzymana z fuzji komórki pochodzącej z ludzkiej embrionalnej komórki nerki, sposób jej wytwarzania oraz linia komórkowaInfo
- Publication number
- PL205549B1 PL205549B1 PL349625A PL34962599A PL205549B1 PL 205549 B1 PL205549 B1 PL 205549B1 PL 349625 A PL349625 A PL 349625A PL 34962599 A PL34962599 A PL 34962599A PL 205549 B1 PL205549 B1 PL 205549B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- cell
- protein
- human
- cell line
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 239
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims description 5
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims description 5
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 abstract description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 12
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 abstract description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 15
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 14
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 11
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 11
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 7
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 101150009389 BZLF1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 5
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 5
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 5
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 5
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 5
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 5
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 5
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 4
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 3
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 3
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010026292 Epstein-Barr viral capsid antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 240000006028 Sambucus nigra Species 0.000 description 2
- 235000003142 Sambucus nigra Nutrition 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000008995 european elder Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010046016 Peanut Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108050006955 Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- RZTAMFZIAATZDJ-UHFFFAOYSA-N felodipine Chemical compound CCOC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC(Cl)=C1Cl RZTAMFZIAATZDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229960000160 recombinant therapeutic protein Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy komórki otrzymanej z fuzji komórki pochodzącej z ludzkiej embrionalnej komórki nerki, sposobu jej wytwarzania oraz linii komórkowej. Takie ludzkie komórki hybrydowe mogą być stosowane do produkcji białek heterologicznych.
Dotychczas większość leczniczych białek rekombinowanych wytwarzano przy zastosowaniu komórek innych niż komórki pochodzące z komórek ludzkich.
Dla przykładu, do wytwarzania leczniczych białek rekombinowanych używano komórek jajnika chomika chińskiego (CHO)(dhfr-)(Urlaub i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216-4220) z ulegającym ampifikacji markerem selekcyjnym reduktazą dihydrofolianu (Kaufman i wsp., 1982, Mol. Biol. 159:601-621; Gasser i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 6522-6526).
Wiele rekombinowanych białek leczniczych wytwarza się w komórkach ssaczych, np. rekombinowany czynnik VIII(rFVIII) (Kaufman i wsp., 1988, J.Biol. Chem. 263: 6352-6362), tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) (patent USA nr 4 7666 075 Goeddel i wsp., 1988), erytropoetyna (EPO) (patent USA nr 4 703 008 Lin, 1987) oraz przeciwciała monoklonalne (mAb) (patent USA nr 4 816 397, Boss i wsp. 1989).
Do wytwarzania rFVIII po selekcji na G418 i zwielokrotnieniu liczby kopii genu metotreksatem (MTX) w komórkach opornych na G418 (patent USA nr 4 965 199, Capon i wsp., 1990) stosowano komórki nerki (BHK21) młodych chomików (BHK).
Do wytwarzania zmienionych technikami inżynierii genetycznej ludzkich przeciwciał anty-TNF (EHEAT) (patent USA nr 4 816 397 Boss i wsp., 1989) stosowano komórki mysiego szpiczaka (NSO). Jednakowoż, ta linia komórkowa wytwarza białka o specyficznie mysim wzorze węglowodanowym, które nie są szczególnie korzystne do stosowania u ludzi.
Ludzka linia komórkowa Namalwa (pochodząca z chłoniaka Burkitta) była stosowana do produkcji interferonu alfa przez Wellcome Research Laboratory oraz do produkcji prourokinazy (Satoh i in., Cytotechnology 18: 167-185, 1996), aktywatora tkankowego plazminogenu (t-PA (Khan i wsp., 1995, Biochem Soc Trans 23:S99), czynnika stymulującego powstawanie kolonii makrofagów (Okamoto i wsp., 1991 Arch Biochem Biophys 286:562-568), interferonów i limfotoksyny (Hosoi i wsp., 1991, Cytotechnology 5: 17-34) oraz czynnika stymulującego tworzenie się kolonii granulocytów (Hosoi i wsp., 1991, Cytotechnology 7:25-32) przez Tokyo Research Laboratories. Jednakże komórki te były bardzo trudne do transfekowania DNA.
Walls i wsp. (1989, Gene 81:139-149) opisał zastosowanie koamplifikacji dhfr/MTX do wyrażania funkcjonalnego białka C w ludzkich embrionalnych komórkach nerki (komórkach 293S). Komórki
293S (Stillman i wsp., Mo. Cell Biol. 5:2051-2060) są znane z tworzenia dużych agregatów w zawiesinie, szczególnie przy wysokim stężeniu wapnia (>100 μΜ), co powoduje dalszą agregację i słabszą przeżywalność komórek (Peshwa i wsp., 1993, Biotech and Bioeng 41:179-187).
Wszystkie cytowane powyżej publikacje włącza się niniejszym jako odnośniki literaturowe.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest komórka otrzymana z fuzji komórki pochodzącej z ludzkiej embrionalnej komórki nerki z komórką 2B8, przy czym komórka 2B8 jest komórką o numerze dostępu nadanym przez American Type Culture Collection (ATCC) CRL-12569.
Korzystnie, komórką pochodzącą z ludzkiej embrionalnej komórki nerki jest komórka 293 albo komórka 293S.
Zgodnie z korzystną postacią wykonania komórka według wynalazku wyraża heterologiczne białko, korzystniej heterologiczne białko wybrane z grupy obejmującej FVIII, BDD-FVIII, przeciwciała monoklonalnego, przeciwciała anty-TNF, rIL4, tPA i EPO.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest linia komórkowa oznaczona jako HKB11 (numer depozytu w ATCC: CRL-12568).
Wynalazek dostarcza również linii komórkowej, wyrażającej heterologiczne białko, otrzymanej z linii komórkowej HKB11 (numer depozytu w ATCC: CRL-12568).
Korzystnie białko jest wybrane spośród ICAM-1, BDD-FVIII, rIL4, FVIII, EPO, TPA, IL-4SA (T13D/R121D) oznaczonej 1G2 (numer depozytu w ATCC: PTA-87), ludzkiego białka o ludzkim wzorze glikozylacji oraz przeciwciała monoklonalnego, korzystniej przeciwciała anty-TNF.
Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ludzkich komórek hybrydowych użyteczny do wyrażania białek heterologicznych, który to sposób obejmuje etapy:
a) otrzymywania komórek pochodzących z ludzkiej embrionalnej nerki,
PL 205 549 B1
b) otrzymywanie komórek 2B8, przy czym komórki 2B8 są oznaczone przez Amerykańską Kolekcję Hodowli Komórkowych jako CRL-12569,
c) kontaktowania komórek z etapu a) z komórkami z etapu b) w warunkach pozwalających na zajście fuzji, i
d) badania przesiewowego komórek z etapu c) dla oznaczenia komórek wydzielających białka heterologiczne w ilościach równych lub większych niż komórki jajnika chomika chińskiego (CHO).
W korzystnej postaci wykonania sposobu wedł ug wynalazku komórkami pochodz ą cymi z ludzkiej embrionalnej komórki nerki są komórki 293, korzystniej komórki 293S.
Klony hybrydowych komórek ludzkich według wynalazku są łatwo transfekującymi się klonami bądź przez elektroporację bądź liposomami kationowymi oraz klonami łatwo przystosowującymi się do hodowli w zawiesinie. Heterologiczne białka mogą być wyrażane przy zastosowaniu niskiego poziomu amplifikacji MTX w środowisku komórek ludzkich. Dodatkowo, komórki te łatwo przystosowują się do wzrostu w pożywce bez surowicy.
Komórki są wynikiem fuzji ludzkich embrionalnych komórek nerki (293S) i komórek chłoniaka Burkitta. Skrótowo opis wytwarzania tych komórek przedstawiono na Figurze 1. Te klony hybrydowe, nazwane HBK, posiadają defektywny genom EBV otrzymany z HH514-16, linii komórkowej pochodzącej z komórek chłoniaka Burkitta P3HR1 (Hinuma i wsp., 1967, J. Virol. 1:1045-1051). Komórki P3HR1 posiadają nieunieśmiertelniający HBV. HH514-16 jest klonem P3HR1 (Hinuma i wsp., 1967, J. Virol. 1:1045-1051), który posiada nieunieśmiertelniający HBV. HH514-16 utraciła het-DNA, sekwencje DNA odpowiedzialne za przerywanie uśpienia wirusa, podczas procedur klonowania (Rabson i wsp., 1983, Proc Natl Acad. Sci USA 87:3660-3664). Tak więc, EBV komórek HKB nie jest wirusem unieśmiertelniającym i pozostaje w uśpieniu.
HBK są ludzkimi komórkami hybrydowymi nadającymi się do rekombinowanego wytwarzania białek leczniczych. Komórki te wytwarza się przez hybrydyzację różnych rodzicielskich linii komórkowych, każdej o różnych korzystnych cechach. Komórki gospodarza posiadające korzystne cechy każdej z linii rodzicielskich otrzymuje się przez wytworzenie hybrydy.
Komórki gospodarza mogą być zmieniane technikami inżynierii genetycznej tak, by wyrażały duże ilości różnego rodzaju białek. Białka, które mogą wytwarzać zmienione technikami inżynierii genetycznej komórki to między innymi rozpuszczalny ICAM-1, rekombinowana interleukina 4 (IL-4), tPA, EPO, rFVIII oraz BDD-FVIII (wariant czynnika VIII o usuniętej domenie B) oraz pochodne tych białek. Czynnik VIII ma budowę domenową składa się z domen A1-A2-B-A3-C1-C2 i jest wytwarzany jako jednołańcuchowy polipeptyd składający się z 2351 aminokwasów, z których 19-aminokwasowy peptyd sygnałowy jest odcinany po przeniesieniu do światła siateczki endoplazmatycznej. Ponieważ czynnik VIII jest silnie glikozylowany, trudno było osiągnąć wysoki pozom jego ekspresji (>0,2 pg/k/d)(Lind i wsp., 1995, Eur. J. Biochem. 232:19-27; Kaufman i wsp., 1989, Mol. Cell Biol. 9:1233-1242). Wyrażanie czynnika VIII w komórkach ssaczych jest zazwyczaj 2-3 rzędy wielkości niższe niż dla innych genów przy zastosowaniu podobnych wektorów i procedur. Produktywność linii komórkowych wytwarzających czynnik VIII mieściła w zakresie 0,5-1 U/k/d (0,1-0,2 pg/k/d).
Wykazano, że domena B czynnika VIII jest zbędna do jego aktywności proskrzepowej. Różne grupy badawcze donosiły o zwiększonym wyrażaniu czynnika VIII w komórkach ssaczych przy stosowaniu skróconych wersji czynnika VIII (Lind i wsp., 1995, Eur. J. Biochem 232: 19-27; Tajima i wsp., 1990, Proc 6th Int Smp H.T. p.51-63; patent USA nr 5 661 008 Almstedt, 1997). Jednakże poziom wyrażania wariantów czynnika VIII przez stabilne klony komórkowe pozostał poniżej 1 pg/k/d. Stwierdzono również, że choć nie wyrażano endogennych immunoglobulin, ekspresja rekombinowanych Ig ze zmienionych technikami inżynierii genetycznej komórek gospodarza była wysoka. Białka wytwarzane przez komórki HKB11 mają specyficzny ludzki wzór glikozylacji. Zatem, klony te są optymalnymi komórkami gospodarza do wytwarzania zmienionych technikami inżynierii genetycznej Ig i innych białek.
Stosowane w niniejszym zgłoszeniu określenie komórka pochodząca z chłoniaka Burkitta dotyczy komórki chłoniaka Burkitta, otrzymanej z komórki chłoniaka Burkitta, otrzymanej z innej komórki pochodzącej z chłoniaka Burkitta lub komórki pochodzącej z podziału mitotycznego którejkolwiek z powyż szych komórek.
„Pochodzący z obejmuje w niniejszym kontekście, ale nie ogranicza się do, zwykły podział mitotyczny komórek oraz procesów takich jak transfekcja, fuzja komórek lub inne techniki inżynierii genetycznej i biologii komórki stosowane do zmiany komórek lub wytworzenia komórek o nowych właściwościach. Podobnie, komórka pochodząca z ludzkiej embrionalnej nerki jest embrionalną komórką
PL 205 549 B1 ludzkiej nerki, pochodzącą z ludzkiej komórki embrionalnej nerki, pochodzącą z innej ludzkiej komórki pochodzącej z embrionalnej nerki lub komórki pochodzącej z podziału mitotycznego którejkolwiek z powyższych komórek. Również, komórka pochodząca z 293S jest komórką 293S, pochodzącą z komórki 293S, pochodzą c ą z innej komórki pochodzą cej z komórki pochodzą cej z 293S lub z podziału mitotycznego którejkolwiek z powyższych komórek. Również, komórka pochodząca z 2B8 jest komórką 2B8, pochodzącą z komórki 2B8, pochodzącą z innej komórki pochodzącej z komórki pochodzącej z 2B8 lub z podziału mitotycznego którejkolwiek z powyższych komórek. Białko heterologiczne to białko zmienione do wytwarzania technikami inżynierii genetycznej.
Krótki opis Figur
Na Figurze 1 przedstawiono w skrócie sposób otrzymania komórek HKB.
Na Figurze 2 przedstawiono mapę fizyczną wektorów ekspresyjnych, wspominanych w tekście. Wszystkie plazmidy skonstruowano na szkielecie pBR322 i zawierają jednostkę ekspresji dhfr. Wszystkie geny kodujące białka będące przedmiotem zainteresowania są regulowane przez promotor/wzmacniacz CMV(CMVe/p); intron 5' (MIS lub CIS) umieszczono tak, by znalazł się na końcu 5' genów, z wyjątkiem BZLF1. Rejon sygnału poliA oznaczono pA. Oba plazmidy, pSH157 p pCIS25DTR zawierają sekwencję EBV-TR (402 bp).
Na Figurze 3 przedstawiono porównanie linii komórek gospodarzy dla ekspresji genu po teście przejściowej transfekcji. Transfekcji dokonywano w takich samych warunkach: taka sama liczba komórek 293S, 2B8 i HKB11 była transfekowana taką samą ilością DNA plazmidowego przy pomocy tego samego środka transfekującego. Płyn z hodowli komórkowych zbierano 2 dnia po transfekcji. Stężenia białek oznaczano przy pomocy testów ELISA (IgG i ICAM-1; mierzone jako ng białka/ 106komórek/2 dni) oraz Coatest® (rFVIII; mierzone jako milijednostki/107 komórek/2 dni).
PRZYKŁADY WYKONANIA WYNALAZKU
Materiały i Metody
HH514-16 uprzejmie udostępnił Dr George Miller (Yale University). Komórki 293S otrzymano od Dr Brad Zerler (Molecular Therapeutic Institute, West Heaven, CT). Komórki 293S są komórkami 293 (ATCC CRL-1573) przystosowanymi do hodowli w zawiesinie (Stillman i wsp., 1985, Mol. Cell Biol. 5:
2051-2060).
Plazmidy
Wszystkie opisane w niniejszym opisie wektory ekspresyjne są oparte na plazmidzie pBR322 z fragmentem zawierającym gen dhfr. Fizyczne mapy wektorów przedstawiono na Figurze 2. Plazmidy pSH157 oraz pCIS25DTR posiadają również terminalne sekwencje powtarzające się wirusa Epsteina-Barra (EBV-TR). Sekwencja EBV-TR, patrz zgłoszenie patentowe Cho i Chan i oznaczone MSB-7254 „Sekwencje terminalnych powtórzeń wirusa Epsteina-Barra wzmagają selekcję przez leki. Wektora pSH131, zdeponowanego w American Type Culture Collection, AtCC 98879, można użyć do wytworzenia wektorów ekspresyjnych dla wybranych białek jak opisane w Cho i Chan (MSB-7254, supra).
ELSA
Dla zmierzenia wydzielania tICAM-1 monoklonalne przeciwciało dla ICAM-1, C92,5 (McClelland i wsp., Proc. Natl Acad. Sci USA 88: 7993-7997) zaadsorbowano na okrągłodennych płytkach mikrotitracyjnych. Płytki zablokowano stosując roztwór buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) zawierający 1% albuminę bydlęcą z osocza (BSA), a następnie inkubowano z próbkami zawierającymi tlCAM1. Następnie płytki przemywano buforem do przemywania (PBS plus 0,005% Tween20) i inkubowano z biotynylowanym C78,5, drugim przeciwciałem monoklonalnym dla odmiennego epitopu tICAM-1 (McClelland i wsp., supra). Po przemyciu płytki inkubowano z HRP-streptawidyną. Następnie płytki przemyto buforem do przemywania, przeprowadzono rekcję z tetrametylobenzydyną (TMB), którą zatrzymywano 1 N HCl. Stężenie tICAM-1 określano odczytując OD przy długości fali 450/570 nm i przy pomocy krzywej standardowej sporządzonej dla oczyszczonego tICAM-1.
Aby zmierzyć wydzielanie immunoglobulin (Ig), do pokrycia płytki używano przeciwciała anty-Ig, po czym, jako przeciwciała do wykrywania stosowano biotynylowane przeciwciała anty-Ig. Jako standardu używano znanego stężenia cząsteczek Ig. Poza tym procedura pozostawała jak wyżej.
Aby zmierzyć wydzielanie interleukiny 4(IL-4), do pokrycia płytki używano przeciwciała anty- IL-4, po czym, jako przeciwciała do wykrywania stosowano biotynylowane przeciwciała anty-IL-4. Jako standardu używano oczyszczonej IL-4.
Oznaczenie wydzielania rFVIII
Do ilościowego oznaczenia rFVIII stosowano odczynniki z zestawu Coatest® VIII:C/4 (Chromogenix, Molndal, Szwecja). Jako standardu do pomiaru na wstępnie ogrzanych do 37°C w Select Heat
PL 205 549 B1
Blocks (VWR Scientific, San Francisco, CA) szalkach EIA/RIA A/2 (Corning, Crning, NY) użyto będącego standardem USA czynnika antyhemofilitycznego (czynnika VIII) znanego jako MEGA 1 (Office of Biologics Research and Review, Bethesda, NY). Do każdej próbki dodawano czynnik IXa, czynnik X, fosfolipid i CaCl2, a następnie inkubowano przez 10 minut, do aktyw owacji czynnika X. Następnie dodawano substrat chromogenny (S2222) i inkubowano przez 10 minut aby uwolnić grupę chromogenną pNA. Reakcję zatrzymywano dodatkiem 50% kwasu octowego. Absorbancję mierzono kolorymetrycznie przy długości fali 405/450 nm czytnikiem spektrofotometrycznym do mikropłytek SPEC-TRAmax® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), a dane obliczano z zastosowaniem oprogramowania SOFTmax®, Molecular Devices.
Otrzymanie wrażliwej na HAT i opornej na G418 linii komórek chłoniaka Burkitta
Dla wytworzenia komórek wrażliwych na HAT otrzymano ustalone linie komórek pozbawionych fosforybozylotransferazy hipoksantynowej (HGPRT) (Szybalska i wsp., Proc. Natl Acad. Sci. USA 48:2026-2034, 1962; Littlefield Proc. Natl Acad. Sci. USA 50:568-576, 1963) przy zastosowaniu standardowego protokołu opisanego przez Siadak i wsp. (Patent Stanów Zjednoczonych 4
834 975, 1989).
Komórki HH514-16 (otrzymane od dr G. Millera, Yale University), niezawierające het-DNA EBV (Rabson i wsp., 1983, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:3660-3664) traktowano przez 24 godziny estrem etylowym kwasu metanosulfonowego (MSE) 300 μg/ml (Sigma, St.Louis, MO) w pożywce do hodowania w zawiesinie RPMI-1640 (Life Science, Gaithersburg, MD) uzupełnionej 15% bydlęcą surowicą płodową (FBS)(Hyclone, Logan, UT). Po przemyciu komórek pożywką dla wyselekcjonowania komórek niezawierających HGPRT wysiewano je do pożywki zawierającej 6-tioguaninę (6-TG)(Sigma) (5 μg/ml). Stężenie 6-TG podwyższano od 5 μg/ml do 30 μg/ml podczas sześciomiesięcznego okresu selekcji. Następnie komórki badano pod względem wrażliwości na pożywkę zawierającą HAT. Pojedyncze klony komórek (SSC, Single Cell Colony) otrzymano przez ograniczone klonowanie rozcieńczeń (jedna komórka na studzienkę 96-studzienkowej płytki) wrażliwej na HAT populacji A5. Aby otrzymać komórki oporne na G418 jeden z SSC, A5/1D7, transfekowano pSVneo, posiadającym na wektorze pBR gen neo pod promotorem SV40. Jeden z SSC opornych na G418(1,5 mg/ml), określony jako 2B8 (zdeponowany w American Type Collection, nr CRL-12569), został użyty do fuzji.
PRZYKŁAD 1
Fuzja komórek i otrzymanie klonów pojedynczych komórek
Fuzji komórek dokonywano zasadniczo według metody fuzji z glikolem polietylenowym (PEG) opisanej przez Kennetta (1979, Meth. Enzymol. 58:5-359). Po pięć milionów komórek 293S i 2B8 w fazie logarytmicznej wzrostu przemywano PBS bez Ca++ i Mg++ (Life Technologies, Rockville) i wysiewano do studzienki sześciostudzienkowej szalki pokrytej aglutyniną z orzechów ziemnych (Sigma) (5 μg/ml). Sześciostudzienkowe szalki wypełnione komórkami wirowano przy 400 g przez 6 minut w wirówce Beckman J-6M/E (Beckman, Palo Alto, CA). Po usunięciu ze studzienek PBS na komórki oddziaływano przez minutę 2 ml 40% (w/v) PEG (Sigma). Dla kontroli do jednej ze studzienek nie dodawano PEG. Komórki przemywano trzykrotnie 5 ml PBS zawierającego 5% DMSO, a następnie trzykrotnie PBS. Komórki inkubowano przez 25 minut w świeżej pożywce uzupełnionej 15% FBS. Komórki wysiewano na 96 studzienkowe szalki (1,2 x 106 komórek na szalkę) do świeżej pożywki zawierającej G418 (1 mg/ml) oraz HAT (Life Technology) i 15% FBS. Komórkom zmieniano pożywkę, stosując pożywkę selekcyjną dwa razy na tydzień. W tym przykładzie w początkowej selekcji komórki 293S miały pożądaną właściwość niewrażliwości na pożywkę zawierającą HAT i podobnie, komórki 28B posiadały pożądaną właściwość oporności na G418.
Podczas gdy komórki powstałe w wyniku fuzji wzrastają w warunkach selekcyjnych, zmieszane komórki w tych samych warunkach nie rosną. Po trzech tygodniach selekcji początkowe populacje przenoszono na większe szalki. Aby otrzymać SCC zmieszano dwadzieścia stabilnie rosnących początkowych populacji i wysiano je w dużym rozcieńczeniu pożywką selekcyjną (jedna komórka w studzience). Po uważnej obserwacji mikroskopowej poszczególnych klonów z 15 x 96 studzienkowych szalek wybrano dziewiętnaście klonów. SSC otrzymane z doświadczenia z fuzją określono jako komórki HKB (hybrydowe komórki z komórek ludzkiej nerki i komórek B). Do badania transfekcji wybrano siedem SCC. Następnie badano te siedem SCC do badania stabilnego wytwarzania różnych białek. Jeden z siedmiu SCC, HKB11, został wybrany jako korzystna ssacza komórka gospodarza do wytwarzania białek heterologicznych. Podsumowanie, patrz Figura 1.
PL 205 549 B1
P R Z Y K Ł A D 2
Charakterystyka klonów HKB
Mimo, że wszystkie komórki hybrydowe hodowano w warunkach selekcyjnych, status hybrydy potwierdzano licząc chromosomy w poszczególnych liniach komórek. Rzeczywiście, wszystkie komórki HKB wykazywały średnią liczbę chromosomów 90-110.Ta liczba jest podobna do sumy średnich liczb chromosomów 293S i 2B8 (według danych ATCC odpowiednio 64 i 47). 293S (Stillman i wsp., 1985, Mol Cell Biol 5:2051-2060) jest przystosowaną do wzrostu w zawiesinie 293 (ATCC CRL-1573).
Wszystkie klony hybrydowe zbadano pod względem wyrażania endogennych Ig (mu i kappa) stosując bezpośrednią immunofluorescencję na komórkach utrwalonych metanolem, aby określić które klony komórkowe wydzielają endogenne Ig. W doświadczeniach powtarzanych w długim okresie, na podstawie oznaczenia immunofluorescencyjnego (tablica 1) i ELISA (dane nie pokazane) stwierdzano, że komórki te są negatywne pod względem ekspresji łańcuchów mu i kappa.
T a b l i c a 1. Wykrywanie ekspresji genu Ig
| Ekspresja genów | ||
| Komórki | Łańcuch ciężki (mu) | Łańcuch lekki (kappa) |
| 293S | Brak | Brak |
| 2B8 | Jest | Jest |
| HKB | Brak | Brak |
Tablica 1 pokazuje wyniki oznaczenia immunofluorescencyjnego otrzymane dla trzech rodzajów komórek. Komórki zawieszono w PBS i sporządzono ich rozmaz na szkiełku mikroskopowym. Po wysuszeniu komórek utrwalano je przez 5 minut zimnym (-20°C) metanolem. Komórki wybarwiano przez 45 minut FITC sprzężonym z przeciwciałami anty ludzkie łańcuchy kappa i anty ludzkie łańcuchy mu (rozcieńczenie 1:20) (Zymed laboratories, Inc., So. San Francisco, CA w wilgotnej kamerze w 37°C.Po płukaniu szkiełek przez 10 minut PBS przykrywano je szkiełkami nakrywkowymi stosując PBS/glicerol (1:1). Komórki obserwowano w mikroskopie fluorescencyjnym (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
Typowy ludzki wzór połączeń kwasu sialowego, alfa(2-6) sialotransferazę potwierdzano badaniem FACS komórek HKB przy pomocy lektyny Sambucus nigra (SNA) skoniugowanej z FITC (Sigma, St. Louis, MO).Białka wydzielane przez komórki HKB (klon 1G2) wykazywały w badaniu metodą oligosacharydowych odcisków palców we wzorze glikozylacji połączenia alfa(2-3) i alfa(2-6) kwasu sialowego (dane nie przytoczone). Taka obserwacja wskazuje, że komórki HKB utworzone po fuzji komórek 293S i 2B8 utrzymywały specyficzne dla człowieka enzymy glikozylujące.
Aby sprawdzić zdolność komórek hybrydowych do wyrażania obcych białek, komórki transfekowano wektorami ekspresyjnymi ICAM-1 i IgG (przeciwciało anty-TNF). Aby zbadać wydzielanie IgG, komórki HKB (5 x 106 komórek) transfekowano przez elektroporację 10 μg plazmidowego DNA odpowiedzialnego za funkcjonalne wyrażanie lekkich (kappa) i ciężkich (gamma) łańcuchów przeciwciał. Aby zbadać poziom wydzielanych rozpuszczalnych ICAM-1, komórki HKB (5 x 106 komórek) transfekowano przez elektroporację 10 μg plazmidowego DNA odpowiedzialnego za funkcjonalne wyrażanie rozpuszczalnych ICAM-1. Poziom wydzielania określano testem ELISA na IgG oraz ICAM-1. Wszystkie 19 SCC wyrażały na stosunkowo wysokim poziomie ICAM-1 (100500 ng/ml/2d) oraz IgG (30-200 ng/ml/2d) w teście przejściowej transfekcji (tablica 2). Dane te wskazują, że komórki hybrydowe podtrzymują ekspresję genów Ig, którymi je transfekowano, choć ekspresja endogennych genów Ig zanikła.
T a b l i c a 2. Oznaczenia wydzielania IgG i rozpuszczalnych ICAM przez klony HKB otrzymane wkrótce po klonowaniu dla przejściowej transfekcji. Wartości są stężeniami wydzielanych białek (ng/ml/2d)
| Klon HKB | IgG | Rozpuszczalne ICAM |
| 1 | 2 | 3 |
| 1 | -150 | -500 |
| 2 | -30 | -30 |
PL 205 549 B1 cd. tablicy 2
| 1 | 2 | 3 |
| 3 | -20 | -50 |
| 4 | -80 | -200 |
| 5 | -100 | -500 |
| 6 | -50 | -300 |
| 7 | -40 | -200 |
| 8 | -30 | Nw |
| 9 | -80 | Nw |
| 10 | -80 | -100 |
| 11 | -200 | Nw |
| 12 | -100 | Nw |
| 13 | -80 | -150 |
| 14 | -80 | Nw |
| 15 | -30 | -200 |
| 16 | -80 | -200 |
| 17 | -160 | -500 |
| 18 | -80 | -200 |
| 19 | -80 | -100 |
Nw - nie wykonane
Wirus Epsteina-Barra (EBV)w komórkach 2B8 ma postać episomów. Wszystkie SCC wykazywały ekspresją EBNA-1 (dane nie przytoczone), co wskazuje, że są pozytywne pod względem EBV. Jednakowoż, nie było wiadomo, czy w komórkach hybrydowych wciąż istnieje kompletny genom EBV. Dlatego też oznaczano status genomu EBV w komórkach EBV transfekując komórki BZLF1, fragmentem genomu EBV, który zawiera gen trans-aktywujący geny przerwania latencji. Komórki HKB (5 x 106 komórek) transfekowano 10 μg DNA plazmidu (pSH121) umożliwiającego funkcjonalną ekspresję BZLF1. Wykrywanie antygenu kapsydowego Ebv (EBV-VCA) przeprowadzano przy pomocy pośredniej immunofluorescencji stosując ludzkie osocze zawierające przeciwciało anty EBV-VCA i skoniugowane z FITC przeciwciało anty-ludzkie IgG. Szczegóły techniczne testu immunofluorescencji opisano poniżej. Jak pokazano w tablicy 3, komórki transfekowane pustym wektorem nie wykazywały ekspresji antygenu kapsydu EBV (EBV-VCA), co wskazuje na brak w nich replikacji EBV. Jednakże niewielka część transfekowanych komórek wyrażała antygen. Dane te wskazują że komórki hybrydowe posiadają genom EBV w uśpionej postaci.
T a b l i c a 3. Indukcja replikacji EBV transfekcją BZLFl.
| Ekspresja antygenu kaspydowego wirusa (%) | ||
| Klon HKB | Transfekcja pustym plazmidem | BZLF1 |
| HKB1 | Brak | 0,20% |
| HKB5 | Brak | 1-2% |
| HKB7 | Brak | 0,20% |
| HKB11 | Brak | 0,20% |
| HKB13 | Brak | 0,50% |
| HKB17 | Brak | 0,20% |
| HKB519 | Brak | 1-2% |
PL 205 549 B1
Komórki hybrydowe przystosowywano do pożywki bez surowicy przez kolejne dwa rozcieńczenia FBS w wytrząsanych butelkach. Po dwóch tygodniach komórki rosły w pożywce nie zawierającej FBS. Komórki w wytrząsanych butelkach rosły w postaci niewielkich skupień. W przeciwieństwie do komórek 293S, komórki hybrydowe łatwo przystosowywały się do hodowli w zawiesinie i bez surowicy. Komórki hybrydowe w pożywce bez surowicy i albuminy, uzupełnionej transferyną i insuliną, mogą być hodowane w zawiesinie w wytrząsanych butelkach hodowane ponad rok.
Aby porównać poziom wydzielania produktów genów, którymi transfekowano komórki, jeden z klonów, HKB11 oraz linie rodzicielskie, 293S i 2B8, transfekowano pSM98 (rozpuszczalne ICAM-1), pSH125(anty-TNF IgG) oraz pCISF8(rFVIII). Jak pokazano na Figurze 3, poziom wydzielania ICAM-1 i IgG był o wiele wyż szy (okoł o 10-krotnie) w komórkach HKB11 niż w komórkach 293S. Wydzielanie obu białek przez 2B8 było niewykrywalne. Poziom wydzielania rFVIII w komórkach HKB11 był podobny do poziomu dla komórek 293S. Te dane wskazują, że wydajność transfekcji komórek HKB11 jest o wiele wyż sza niż linii rodzicielskich.
P R Z Y K Ł A D 3
Otrzymanie klonów HKB stabilnie wydzielających białka heterologiczne
Klony hybrydowe testowano na stabilną ekspresję białek w systemie wymuszania amplifikacji genów (dhfr/MTX). Komórki wpierw transfekowano odpowiednim wektorem ekspresyjnym, a następnie transfekowane komórki (zwykle 106 komórek n 96 studzienkową szalkę) wysiewano i selekcjonowano/powodowano amplifikację genów pożywką selekcyjną pozbawioną hipoksantyny i tymidyny, ale uzupełnioną FBS i MTX(50 nm). Po pierwszym badaniu przesiewowym szalek wybrano komórki ze studzienek o wysokiej sekrecji i przeniesiono je na szalkę 6-studzienkową. Komórki na szalkach 6-studzienkowych były dalej poddawane wymuszaniu amplifikacji genu wzrastającym stężeniem MTX (100, 200 i 400 nm) w pożywce. Początkowe populacje z szalek 6-studzienkowych dalej badano przesiewowo, aby wyodrębnić najlepszą populację. Ostatecznie tej populacji użyto do otrzymania klonów pochodzących z pojedynczych komórek. Jak pokazano w tablicy 4, komórki HKB11 były optymalne do uzyskiwania wysokich stężeń heterologicznych białek ludzkich. Pod względem wytwarzania ICAM-1, Ig i pochodnej IL-4, komórki HKB11 były równie dobre, jak komórki CHO (dane nie przedstawione). Tym niemniej, klony HKB rosną szybciej niż klony CHO i można je łatwo przystosować do hodowli w zawiesinie i w warunkach pożywki pozbawionej surowicy. Dla BDD-FVIII klony HKB11 wykazują około dziesięciokrotnie większą produktywność niż klony CHO. Powyższe wyniki pokazują, że komórki HKB11 są optymalnymi ludzkimi komórkami do ekspresji ludzkich białek leczniczych.
T a b l i c a 4. Wytwarzanie białek heterologicznych przez klony HKB
| Białko | Komórka gospodarza | Stężenie MTX do amplifikacji | Produktywność specyficzna |
| ICAM-1 | HKB11 | 100 nM | 10 pg/k/d1) |
| Ig | HKB13 | 50 nM | 12 pg/k/d |
| BDD-FVIII | HKB11 | 400 nM | 5-10 uU/k/d2) |
| IL-4SA | HKB11 | 100 nM | 5 pg/k/d3) |
1) Wytwarzanie ICAM-1 przez klony HKB było podobne jak przez komórki 293S. Klon HKB łatwo przystosowywał się do hodowli w zawiesinie.
2) Wydzielanie BDD-FVIII było około 10 razy większe niż dla klonów otrzymanych z komórek CHO transfekowanych tym samym wektorem ekspresyjnym.
3) Wytwarzanie IL-4SA(T13D/R121E) w ilościach rzędu gra mów było możliwe 6 miesięcy po transfekcji dla HKB11, podczas gdy dla równoległych doświadczeń z komórkami CHO, przy użyciu tego samego wektora ekspresyjnego i podobnej procedury, było to możliwe parę miesięcy później.
Linie komórkowe otrzymane dzięki powyższym procedurom obejmowały:(i) otrzymane z komórek HKB11 transfekowanych pSM98 i poddawanych wymuszaniu amplifikacji genu w 100 nM MTX klony wydzielające rozpuszczalne ICAM-1 (10 pg/komórka/dzień), (ii) otrzymane z komórek HKB13 transfekowanych pSS125 i poddawanych wymuszaniu amplifikacji genu w 50 nM MTX, a następnie klonowaniu przez rozcieńczanie bez MTX klony pojedynczych komórek wydzielające monoklonalne przeciwciało anty-TNF (12 pg/ komórka/dzień), (iii) otrzymane z komórek HKB11 transfekowanych pCIS25DTR i poddawanych wymuszaniu amplifikacji genu w 400 nM MTX, a następnie klonowaniu przez rozcieńczanie bez MTX klony pojedynczych komórek wydzielające skrócony rFVIII
PL 205 549 B1 (BDD-FVIII)(5-10μU/k/d, w pożywce bez surowicy), (iv) otrzymane z komórek HKB11 transfekowanych pSH157 i poddawanych wymuszaniu amplifikacji genu MTX klony wydzielające pochodną IL-4 (wybiórczy agon IL-4, IL-4S.A.; o zmienionych dwóch resztach aminokwasowych, T13D i R121E) (5 pg/komórka/dzień). Klon HKB wydzielający IL-4SA, 1G2, zastosowano do stosunkowo szybkiego wytwarzania niewielkich ilości białek (ilości rzędu grama). Mapy fizyczne wyżej wymienianych wektorów - patrz Figura 2.
DYSKUSJA
Opisane w niniejszym zgłoszeniu linie hybrydowych komórek ludzkich wykazują pożądane cechy posiadane przez ich linie rodzicielskie. Komórki HKB, wytworzone przez fuzję ludzkich embrionalnych komórek nerki (lub komórek otrzymanych z ludzkich embrionalnych komórek nerki) z komórkami chłoniaka Burkitta (lub komórkami pochodzącymi z komórek chłoniaka Burkitta) są przydatne do tworzenia linii komórkowych wyrażających heterologiczne białka.
Początkowym celem stworzenia linii hybrydowych 293S i 2B8 było rozwiązanie problemu agregacji komórek 293S, które wykazują tendencje do tworzenia skupień podczas wzrostu w zawiesinie (cecha niepożądana). Komórki HKB otrzymane jako hybrydy rosły w postaci pojedynczej warstwy, gdy je hodowano w butelkach T. Jednakże, komórki te rosną w zawiesinie (nie tworzą dużych agregatów) gdy są hodowane w zawiesinie. Komórki HKB są łatwe w transfekcji i wydajność ich transfekcji jest o wiele wyższa niż w przypadku komórek 293S.
Choć transformacja lub powstanie hybrydy wymagane w większości przypadków do otrzymania ustalonej linii komórkowej może powodować zaburzenie wzorów glikozylacji (Yamashita, 1989, J. Biol. Chem. 264: 2415-2423), stwierdzono, że HKB11, które są hybrydową linią komórek somatycznych, posiadają typowe ludzkie enzymy odpowiadające za glikozylację, np. alfa(2-3) i alfa(2-6) sialotransferazę. Co więcej, białka wytwarzane przez transfekowane komórki HKB posiadają prawidłowe ludzkie wzory glikozylacji połączeń alfa(2-3) i alfa(2-6)kwasu sialowego.
Podsumowując, HKB to ludzkie komórki hybrydowe posiadające korzystne cechy obu linii rodzicielskich; konkretnie, łatwy wzrost w hodowli w zawiesinie bez tworzenia agregatów (jak obserwowane dla komórek 2B8) oraz łatwość transfekcji i pożądana charakterystyka wydzielania (jak obserwowane dla komórek 293S). Korzystna linia ludzkich komórek hybrydowych, HKB11 nie wykazuje ekspresji genów ludzkich immunoglobulin, podobnie jak linia 293S. Ta cecha jest zaletą w przypadku, gdy w ludzkich komórkach pragnie się wytwarzać rekombinowane ludzkie przeciwciała monoklonalne. Odkrycie, że fuzje ludzkich komórek powodują otrzymanie komórek o pożądanych cechach zachęca do dalszych badań fuzji z wykorzystaniem 293S i innych linii pochodzących a komórek B, np. Namalwa i 6F11 do otrzymania nowych kombinacji cech w komórkach hybrydowych powstałych z fuzji różnych linii rodzicielskich.
Powyższe przykłady mają na celu bliższe przedstawienie wynalazku i obejmuje on również liczne modyfikacje, których potrafią dokonać specjaliści w dziedzinie objęte zakresem ochrony określonym przez zastrzeżenia patentowe.
Claims (20)
1. Komórka otrzymana z fuzji komórki pochodzącej z ludzkiej embrionalnej komórki nerki z komórką 2B8, przy czym komórka 2B8 jest komórką o numerze dostępu nadanym przez American Type Culture Collection (ATCC) CRL-12569.
2. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że komórką pochodzącą z ludzkiej embrionalnej komórki nerki jest komórka 293.
3. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że komórką pochodzącą z ludzkiej embrionalnej komórki nerki jest komórka 293S.
4. Komórka według zastrz. 1, znamienna tym, że wyraża heterologiczne białko.
5. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że heterologiczne białko jest wybrane z grupy obejmującej FVIII, BDD-FVIII, przeciwciała monoklonalnego, przeciwciała anty-TNF, rIL4, tPA i EPO.
6. Linia komórkowa oznaczona jako HKB11 (numer depozytu w ATCC: CRL-12568).
7. Linia komórkowa, wyrażająca heterologiczne białko, otrzymana z linii komórkowej HKB11 (numer depozytu w ATCC: CRL-12568).
8. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest ICAM-1.
9. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest BDD-FVIII.
PL 205 549 B1
10. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest przeciwciało monoklonalne.
11. Linia komórkowa według zastrz. 10, znamienna tym, że przeciwciałem monoklonalnym jest przeciwciało anty-TNF.
12. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest rIL4.
13. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest FVIII.
14. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest tPA.
15. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest EPO.
16. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białkiem jest IL-4SA(T13D/R121D), oznaczona 1G2 (numer depozytu w ATCC: PTA-87).
17. Linia komórkowa według zastrz. 7, znamienna tym, że białko jest ludzkim białkiem o ludzkim wzorze glikozylacji.
18. Sposób wytwarzania ludzkich komórek hybrydowych użyteczny do wyrażania białek heterologicznych znamienny tym, że obejmuje etapy:
a) otrzymywania komórek pochodzących z ludzkiej embrionalnej nerki,
b) otrzymywanie komórek 2B8, przy czym komórki 2B8 są oznaczone przez Amerykańską Kolekcję Hodowli Komórkowych jako CRL-12569,
c) kontaktowania komórek z etapu a) z komórkami z etapu b) w warunkach pozwalających na zajście fuzji, i
d) badania przesiewowego komórek z etapu c) dla oznaczenia komórek wydzielających białka heterologiczne w ilościach równych lub większych niż komórki jajnika chomika chińskiego (CHO).
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że komórkami pochodzącymi z ludzkiej embrionalnej komórki nerki są komórki 293.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że komórkami pochodzącymi z ludzkiej embrionalnej komórki nerki są komórki 293S.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/209,920 US6136599A (en) | 1998-12-10 | 1998-12-10 | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL205549B1 true PL205549B1 (pl) | 2010-04-30 |
Family
ID=22780882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL349625A PL205549B1 (pl) | 1998-12-10 | 1999-12-08 | Komórka otrzymana z fuzji komórki pochodzącej z ludzkiej embrionalnej komórki nerki, sposób jej wytwarzania oraz linia komórkowa |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6136599A (pl) |
| EP (1) | EP1137768B1 (pl) |
| JP (3) | JP4332300B2 (pl) |
| KR (1) | KR100627753B1 (pl) |
| CN (1) | CN1230532C (pl) |
| AT (1) | ATE306547T1 (pl) |
| AU (1) | AU757188B2 (pl) |
| BG (1) | BG65263B1 (pl) |
| BR (1) | BRPI9916095B8 (pl) |
| CA (1) | CA2353698C (pl) |
| CU (2) | CU23382A3 (pl) |
| CZ (1) | CZ302677B6 (pl) |
| DE (1) | DE69927707T2 (pl) |
| DK (1) | DK1137768T3 (pl) |
| ES (1) | ES2249929T3 (pl) |
| HU (1) | HU229775B1 (pl) |
| ID (1) | ID30448A (pl) |
| IL (2) | IL143351A0 (pl) |
| NO (1) | NO330548B1 (pl) |
| PL (1) | PL205549B1 (pl) |
| RO (1) | RO121563B1 (pl) |
| RU (1) | RU2228355C2 (pl) |
| SI (1) | SI20693B (pl) |
| SK (1) | SK287888B6 (pl) |
| TR (1) | TR200101642T2 (pl) |
| UA (1) | UA77642C2 (pl) |
| WO (1) | WO2000034462A1 (pl) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6136599A (en) * | 1998-12-10 | 2000-10-24 | Bayer Corporation | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
| US6358703B1 (en) | 1998-12-10 | 2002-03-19 | Bayer Corporation | Expression system for factor VIII |
| US6348192B1 (en) * | 1999-05-11 | 2002-02-19 | Bayer Corporation | Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells |
| US20040235715A1 (en) * | 1999-11-12 | 2004-11-25 | Bayer Corporation | Method of producing glycosylated bikunin |
| US7094587B2 (en) * | 2000-06-27 | 2006-08-22 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 16002 Molecules and uses therefor |
| US6569657B1 (en) * | 2000-06-27 | 2003-05-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 32140, a novel human aldehyde dehydrogenase and uses therefor |
| MY139948A (en) * | 2000-09-28 | 2009-11-30 | Bayer Corp | Enhanced transfection system |
| US7723102B2 (en) * | 2000-09-28 | 2010-05-25 | Bayer Corporation | Enhanced transfection system |
| US20060073141A1 (en) * | 2001-06-28 | 2006-04-06 | Domantis Limited | Compositions and methods for treating inflammatory disorders |
| KR100496861B1 (ko) | 2002-09-26 | 2005-06-22 | 삼성전자주식회사 | 하나의 핸들러에 2개 이상의 테스트 보드를 갖는 테스트장비 및 그 테스트 방법 |
| ATE472556T1 (de) | 2002-12-02 | 2010-07-15 | Amgen Fremont Inc | Gegen den tumor nekrose faktor gerichtete antikörper und deren verwendungen |
| US7244616B2 (en) | 2003-06-27 | 2007-07-17 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Use of molecular chaperones for the enhanced production of secreted, recombinant proteins in mammalian cells |
| KR101468345B1 (ko) | 2004-11-12 | 2014-12-03 | 바이엘 헬스케어 엘엘씨 | Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형 |
| NZ580530A (en) | 2007-06-06 | 2012-04-27 | Domantis Ltd | Anti vegf polypeptides, antibody variable domains and antagonists |
| WO2009126564A1 (en) | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Bayer Healthcare Llc | Methods of recombinant production of glycoproteins |
| KR101005967B1 (ko) * | 2008-04-12 | 2011-01-05 | (주)셀트리온 | 우수한 재조합 단백질을 생산하기 위한 인간 숙주 세포 |
| US9090948B2 (en) | 2008-09-30 | 2015-07-28 | Abbott Molecular Inc. | Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples |
| SG176302A1 (en) * | 2009-06-10 | 2012-01-30 | Bts Res Internat Pty Ltd | Methods of generating hybrid/chimeric cells, and uses thereof |
| US11649449B2 (en) | 2015-09-03 | 2023-05-16 | CHO Plus, Inc. | Hybrid cell lines for high level production of a target protein |
| JP2019525774A (ja) | 2016-07-19 | 2019-09-12 | ブランダイス ユニバーシティー | Ｒｎａ結合ポリペプチドの標的を同定するための組成物および方法 |
| CA3097253A1 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Morphosys Ag | Antibodies targeting glycoprotein vi |
| EP3899539A4 (en) | 2018-12-20 | 2023-02-15 | Orionis Biosciences, Inc. | PARTICLE-BASED SMALL MOLECULE PROTEIN COMPLEX TRAP |
| EP3938393A1 (en) | 2019-03-14 | 2022-01-19 | MorphoSys AG | Antibodies targeting c5ar |
| KR102648479B1 (ko) * | 2019-06-10 | 2024-03-15 | 초 플러스 인크. | 단백질 기반 의약들 (protein-based pharmaceuticals) 의 고 수준 생산을 위한 세포주들 (cell lines) |
| IL301276A (en) | 2020-09-24 | 2023-05-01 | Morphosys Ag | Novel human antibodies that bind to human CD3-epsilon |
| CN113604425B (zh) * | 2021-06-22 | 2022-10-18 | 中山康天晟合生物技术有限公司 | 一种适应无血清培养基环境的wayne293 lvpro细胞及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6045849B2 (ja) * | 1980-08-25 | 1985-10-12 | 林原 健 | ヒトエリトロポエチンの製造方法 |
| JPS6030654B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
| US6136599A (en) * | 1998-12-10 | 2000-10-24 | Bayer Corporation | Human hybrid host cell for mammalian gene expression |
-
1998
- 1998-12-10 US US09/209,920 patent/US6136599A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-08-12 UA UA2001074776A patent/UA77642C2/uk unknown
- 1999-12-08 ES ES99963067T patent/ES2249929T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 HU HU0104681A patent/HU229775B1/hu unknown
- 1999-12-08 ID IDW00200101235A patent/ID30448A/id unknown
- 1999-12-08 JP JP2000586896A patent/JP4332300B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 TR TR2001/01642T patent/TR200101642T2/xx unknown
- 1999-12-08 DE DE69927707T patent/DE69927707T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 SK SK791-2001A patent/SK287888B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-12-08 AT AT99963067T patent/ATE306547T1/de active
- 1999-12-08 AU AU19383/00A patent/AU757188B2/en not_active Expired
- 1999-12-08 WO PCT/US1999/029332 patent/WO2000034462A1/en not_active Ceased
- 1999-12-08 CZ CZ20012023A patent/CZ302677B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-12-08 BR BRPI9916095A patent/BRPI9916095B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-12-08 RO ROA200100648A patent/RO121563B1/ro unknown
- 1999-12-08 KR KR1020017007224A patent/KR100627753B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 EP EP99963067A patent/EP1137768B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 CN CNB998142999A patent/CN1230532C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 PL PL349625A patent/PL205549B1/pl unknown
- 1999-12-08 IL IL14335199A patent/IL143351A0/xx unknown
- 1999-12-08 SI SI9920096A patent/SI20693B/sl active Search and Examination
- 1999-12-08 CA CA2353698A patent/CA2353698C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-08 RU RU2001119161/13A patent/RU2228355C2/ru active
- 1999-12-08 DK DK99963067T patent/DK1137768T3/da active
-
2001
- 2001-05-24 IL IL143351A patent/IL143351A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-06-06 BG BG105566A patent/BG65263B1/bg unknown
- 2001-06-07 CU CU20010130A patent/CU23382A3/es not_active IP Right Cessation
- 2001-06-07 NO NO20012806A patent/NO330548B1/no not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-08-26 CU CU20020182A patent/CU23238A1/es unknown
-
2009
- 2009-03-06 JP JP2009053279A patent/JP5508740B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-02-24 JP JP2014032748A patent/JP5826311B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5826311B2 (ja) | 哺乳類遺伝子発現のためのヒトハイブリッド宿主細胞 | |
| JPH0365148B2 (pl) | ||
| US8778677B2 (en) | Methods of generating hybrid/chimeric cells, and uses thereof | |
| US8361790B2 (en) | Human host cell for producing recombinant proteins with high quality and quantity | |
| MXPA01005783A (es) | Celula huesped hibrida de humano para expresion de gen de mamifero | |
| AU617553B2 (en) | Parent cell line for producing human hybridomas | |
| EP0404925B1 (en) | Method for transforming human b lymphocytes | |
| JP3415840B2 (ja) | 外来蛋白質の産生方法 | |
| Baron et al. | Production of hybridomas | |
| JPWO1994012658A1 (ja) | 外来蛋白質の産生方法 |