ES2249929T3

ES2249929T3 - Celula hospedadora hibrida humana para la expresion de genes de mamiferos.

Info

Publication number: ES2249929T3
Application number: ES99963067T
Authority: ES
Inventors: Myung-Sam Cho
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1998-12-10
Filing date: 1999-12-08
Publication date: 2006-04-01
Anticipated expiration: 2019-12-08
Also published as: SK7912001A3; DE69927707D1; NO330548B1; IL143351A; EP1137768A1; PL205549B1; AU1938300A; EP1137768A4; JP2014131513A; HUP0104681A2; KR20020002360A; TR200101642T2; UA77642C2; IL143351A0; CA2353698C; CN1230532C; BG65263B1; SI20693B; JP2002531125A; CZ20012023A3

Abstract

Una célula (número de depósito de la ATCC: CRL- 12568) derivada de la fusión de una célula 293 con una célula 2B8 (número de depósito de la ATCC: CRL-12569).

Description

Célula hospedadora híbrida humana para la expresión de genes de mamíferos.

Solicitudes relacionadas

La solicitud de Cho y Chan denominada MSB-7254 (Nº Ser. EE.UU. 09/209.915), "Vectors Having Terminal Repeat Sequence of Epstein-Barr Virus" y la solicitud de Cho y col. denominada MSB-7255 (Nº Ser. EE.UU. 09/209.916), "Expression system for factor VIII", contienen materias relacionadas. Ambas solicitudes se presentaron el 10 de diciembre de 1998.

Antecedentes de la invención Campo

Esta invención se refiere en general a la manipulación genética de líneas celulares de mamífero para la producción de una proteína biológicamente activa. Específicamente, la invención se refiere a clones de células híbridas humanas derivados del procedimiento de fusión de células embrionarias de riñón humano (293S) y células del linfoma de Burkitt. Estas células híbridas humanas pueden usarse para la producción de proteínas heterólogas.

Antecedentes

Hasta la fecha, la mayoría de las proteínas recombinantes terapéuticas se han producido a partir de células de mamífero no humanas. Algunos ejemplos son:

Las células de ovario de hámster chino (CHO) (dhfr-) (Urlaub y col., 1980, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 77: 4216-4220) con la dihidrofolato reductasa como marcador de selección amplificable (Kaufman y col., 1982, Mol. Biol. 159: 601-621; Gasser y col., 1982, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 79: 6522-6526) se han usado para la producción de proteínas recombinantes terapéuticas.

Se conoce una diversidad de proteínas terapéuticas recombinantes producidas en células de mamíferos, por ejemplo, el factor VIII recombinante (rFVIII) (Kaufman y col., 1988, J Biol Chem 263: 6352-6362); el activador del plasminógeno tisular (tPA) (Patente de EE.UU. Nº 4.766.075 de Goeddel y col., 1988), eritropoyetina (EPO) (Patente de EE.UU. Nº 4.703.008 de Lin, 1987) y anticuerpos monoclonales (AcM) (Patente de EE.UU. Nº 4.816.397 de Boss y col., 1989).

Se han usado las células (BHK21) de cría de riñón de hámster (BHK) para la producción de rFVIII tras la selección con G418 y amplificación con metotrexato (MTX) de las células resistentes (Patente de EE.UU. Nº 4.965.199 de Capon y col., 1990).

Las células de mieloma de ratón (NSO) se usaron para la producción de un anticuerpo anti-TNF humano (EHAT) manipulado genéticamente. (Patente de EE.UU. Nº 4.816.397 de Boss y col., 1989). Sin embargo, esta línea celular produce proteínas que tienen patrones de carbohidrato específicos de ratón que no favorecen su uso en humanos.

Se usó una línea celular humana, la Namalwa (derivada de un linfoma de Burkitt), para la producción de interferón alfa por el Wellcome Research Laboratory y para la producción de prouroquinasa (Satoh y col., 1996, Cytotechnology 18: 167-185, 1996), activador de plasminógeno tisular (t-AP) (Khan y col., 1995, Biochem Soc Trans 23: S99), factor estimulador de colonias de granulocito-macrófago (Okamoto y col., 1991, Arch Biochem Biophys 286: 562-568), interferones y linfotoxina (Hosoi y col., 1991, Cytotechnology 5: 17-34) y factor estimulante de colonias de granulocitos (Hosoi y col., 1991, Cytotechnology 7: 25-32) de Tokyo Research Laboratories. Sin embargo, estas células eran muy difíciles de transfectar con ADN.

Walls y col. (1989, Gene 81: 139-149) informaron del uso de la estrategia de amplificación conjunta dhfr/MT para expresar una proteína C funcional en células embrionarias de riñón humano (células 293S). Se sabe que las células 293 (Stillman y col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 2051-2060) forman grandes agregados en suspensión, especialmente en condiciones de elevada concentración de calcio (>100 \muM), que promueve mayor agregación y menor viabilidad celular (Peshwa y col., 1993, Biotech and Bioeng 41: 179-187).

Resumen de la invención

Ahora, se han estabilizado clones de células humanas hibridadas que se transfectan fácilmente por electroporación o por liposomas catiónicos y que se adaptan fácilmente al crecimiento en cultivo en suspensión. Pueden expresarse proteínas heterólogas usando niveles bajos (50-100 nM) de amplificación con MTX en un entorno celular humano. Además, las células se adaptan fácilmente al crecimiento en un medio sin suero.

Estas células son el producto de una fusión entre células embrionarias de riñón humano (293S) y células de linfoma de Burkitt. Véase la Figura 1 para el resumen. Estos clones híbridos, denominados HKB, contienen un genoma defectivo del EBV derivado de HH514-16, que es una línea celular derivada de células de linfoma de Burkitt, P3HR1 (Hinuma y col., 1967, J Virol 1: 1045-1051). Las células P3HR1 contienen un EBV incapaz de inmortalizarlas. HH514-16 es un clon de P3HR1 (Hinuma y col., 1967, J Virol 1: 1045-1051) que portan un EBV incapaz de inmovilizarlas. HH514-16 ha perdido un ADN-het, un ADN que interrumpe la latencia, durante el procedimiento de clonación (Rabson y col., 1983, Proc Natl Acad Sci USA 87: 3660-3664). Por tanto, el EBV de los clones HKB es un virus incapaz de inmortalizar y que permanece latente.

Las HKB son células hospedadoras híbridas humanas adecuadas para la producción recombinante de proteínas terapéuticas. Estas células hospedadoras se obtienen por la hibridación de diferentes líneas celulares parentales, teniendo cada una diferentes características ventajosas. Las células hospedadoras que poseen características ventajosas de cada una de las líneas celulares parentales se obtienen a partir de células resultantes de la hibridación.

Las células hospedadoras pueden manipularse genéticamente para expresar niveles elevados de una amplia gama de proteínas. Las proteínas que pueden producirse en las células hospedadoras manipuladas genéticamente incluyen, pero no de forma limitante, ICAM-1 soluble, interleuquina-4 (IL-4) recombinante, tPA; EPO, rFVIII y BDD-FVIII (variantes de deleción del dominio B del Factor VIII) y derivados de estas proteínas. El factor VIII tiene una organización de dominios A1-A2-B-A3-C1-C2 y se sintetiza como una única cadena polipeptídica de 2351 aminoácidos, a partir del cual se escinde un péptido señal de 19 aminoácidos tras la translocación a la luz del retículo endoplásmico. Debido al hecho de que el factor VIII está altamente glicosilado ha sido difícil conseguir un elevado nivel de expresión (> 0,2 pg/c/d) del factor VIII (Lind y col., 1995, Eur J Biochem. 232: 19-27; Kaufman y col., 1989, Mol Cell Biol. 9: 1233-1242). Típicamente, la expresión del factor VIII en células de mamífero es 2-3 órdenes de magnitud menor que la observaba con otros genes usando vectores y aproximaciones similares. La productividad para la producción del factor VIII por las líneas celulares estaba en el intervalo de 0,5-1 U/c/d (0,1-0,2 pg/c/d).

Se ha demostrado que el dominio B del factor VIII es prescindible para la actividad procoagulante. Usando variantes truncadas del factor VIII, diversos grupos han informado de mejoras en la expresión del factor VIII (Lind y col., 1995, Eur J Biochem 232: 19-27; Tajima y col., 1990, Proc 6º Int Symp H. T. pág. 51-63; Patente de EE.UU. Nº 5.661.008 de Almstedt, 1997). Sin embargo, el nivel de expresión de las variantes del factor VIII se mantiene por debajo de 1 pg/c/d para un clon celular estable. También se ha encontrado que, aunque no se expresaba inmunoglobulina (Ig) endógena, la expresión de Ig recombinante a partir de las células hospedadoras manipuladas genéticamente era elevada. Las proteínas producidas por las células HKB11 tienen perfiles de glicolisación específicos de humanos. Por tanto, los clones son células hospedadoras óptimas para la producción de Ig manipulada genéticamente y de otras proteínas.

Según se usa en este documento, una célula procedente de linfoma de Burkitt es una célula que es una célula de linfoma de Burkitt, derivada de una célula de linfoma de Burkitt, derivada de otra célula procedente de linfoma de Burkitt o una célula resultante de la división mitótica de cualquiera de las anteriores. "Derivada de" en este contexto pretende incluir, pero no de forma limitante, una división celular y procedimientos mitóticos normales tales como transfecciones, fusiones celulares u otras técnicas de ingeniería genética o biología celular usadas para alterar células o producir células con nuevas propiedades. De forma similar, una célula de origen embrionario de riñón humano es una célula que es una célula embrionaria de riñón humano, derivada de una célula embrionaria de riñón humano, derivada de otra célula de origen embrionaria de riñón humano o una célula resultante de la división mitótica de cualquiera de las anteriores. También, una célula de origen 293S es una célula que es una célula 293S, derivada de una célula 293S, derivada de otra célula procedente de 293S o una célula resultante de la división mitótica de cualquiera de las anteriores. También, una célula de origen 2B8 es una célula que es una célula 2B8, derivada de una célula 2B8, derivada de otra célula procedente de 2B8 o una célula resultante de la división mitótica de cualquiera de las anteriores. Una proteína heteróloga es una proteína que se produce en una célula manipulada genéticamente para producirla.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un resumen de la derivación de las células HKB.

La Figura 2 muestra los mapas físicos de los vectores de expresión mencionados en el texto. Todos los plásmidos se construyen en base al esqueleto molecular de pBR322 y contiene una unidad de expresión de la dhfr. Todos los genes que codifican proteínas de interés están bajo la regulación del potenciador/promotor del CMV (CMVe/p); el intrón 5' (MIS o CIS) se colocó en el extremo 5' de los genes, excepto en BZLF1. La región de la señal de poli A está indicada con pA. Tanto el plásmido pSH157 como el pCIS25DTR, contiene una secuencia de EBV-TR (402 pb).

La Figura 3 muestra una comparación de la expresión génica de las líneas celulares en un ensayo de transfección transitoria. Las transfecciones se realizaron en las mismas condiciones: se transfectó el mismo número de células 293S, 2B8 y HKB11 con la misma cantidad de ADN plasmídico usando el mismo agente de transfección. Los medios del cultivo tisular se recogieron 2 días después de la transfección. Los niveles de producción de proteína se determinaron por ELISA (IgG e ICAM-1, medidos como ng de proteínas/10^{6} células/2 días) y por el kit del ensayo Coatest®(rFVIII; medido como miliunidades/10^{7} células/2 días).

Realizaciones específicas Materiales y procedimientos

La HH514-16 fue proporcionada amablemente por el Dr. George Miller (Universidad de Yale). Las células 293S se obtuvieron del Dr. Brad Zerlerr (Instituto de Terapia Molecular, West Heaven, CT). Las células 293S son células 293 (ATTC CRL-1573) que se ha adaptado para el crecimiento en cultivo en suspensión (Stillman y col., 1985, Mol Cell Biol 5: 2051-2060).

Plásmidos

Todos los vectores de expresión usados en este informe, estaban fundamentalmente basados en el plásmido pBR322 con un segmento de expresión del gen dhfr funcional. En la Figura 2 se describen los mapas físicos de los vectores de expresión. Los plásmidos, pSH157 y pCIS25DTR, también tienen una secuencia repetida terminal del virus de Epstein-Barr (EBV-TR). Para la secuencia de la EBV-TR, véase la solicitud de patente de Cho y Chan denominada MSB-7254, "La secuencia terminal repetida del virus de Epstein-Barr potencia la proporción de selección de fármacos". El vector pSH131, que se ha depositado en la American Type Culture Collection con el número ATCC 98879, puede usarse para generar vectores de expresión para una proteína elegida, como se describe en Cho y Chan (MSB-7254;
supra).

ELISA

Para medir la secreción de tICAM-1, se adsorbió un anticuerpo monoclonal frente a ICAM-1, C92.5 (McClelland y col., 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88: 7993-7997) en placas de microvaloración con fondo redondo. Las placas se bloquearon mediante el tratamiento con una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 1%; a continuación se incubaron con muestras que contenían tICAM-1. Después, las placas se lavaron con tampón de lavado (PBS más Tween 20 al 0,005%) y se incubaron con C78.5 biotinilado, un segundo anticuerpo monoclonal frente a un epítope diferente de tICAM-1 (McClelland y col., 1991, supra). Tras el lavado, las placas se incubaron con HRP-estreptavidina. A continuación, las placas se lavaron con tampón de lavado, se hicieron reaccionar con tetrametilbenzidina (TMB) y la reacción se paró con HCl 1 N. La concentración de tICAM-1 se determinó leyendo la DO a 450/570 nm y se comparó con una curva patrón de tICAM1 purificado.

Para medir la secreción de inmunoglobulina (Ig), se usó un anticuerpo anti-Ig para recubrir las placas y como anticuerpo de detección, se usó un anticuerpo anti Ig biotinilado Se usó como patrón una molécula de Ig concentración conocida. Por otro lado, el procedimiento seguía siendo el mismo.

Para medir la secreción de interleuquina-4 (IL-4), se usó un anticuerpo anti-IL-4 para recubrir la placa y se usó un anticuerpo anti-IL-4 biotinilado como anticuerpo de detección. Se usó una molécula de IL-4 purificada como patrón.

Ensayo para medir la secreción de rFVIII

La molécula de rFVIII se cuantificó con reactivos del Kit VIII:C/4 Coatest® (Chromogenix, Mölndal, Suecia). Se usó un factor anti-hemofílico convencional de EE.UU. (factor VIII) conocido como MEGA 1 (Oficina de Investigaciones Biológicas y de Revisión, MD) como el patrón de medida para placas de EIA/RIA A/2 (Corning, Corning, NY) precalentado a 37ºC en Select Heat Blocks (VWR Scientific, San Francisco, CA). Se añadieron factor IXa, factor X, fosfolípido y CaCl_{2} a cada muestra y se incubaron durante 10 minutos para que se activara el factor X. A continuación, se añadió un sustrato cromogénico (S2222) y se incubaron durante 10 minutos para liberan el grupo cromogénico, pNA. Esta reacción se paró añadiendo ácido acético al 50%. Después, se midió la absorbancia colorimétrica a 405/450 nm en un espectrofotómetro para leer microplacas SPECTRAmax® 250 (Molecular Devices Sunnyvale, CA) y los datos se calcularon mediante un software de SOFTmax® PRO proporcionado por Molecular Devices.

Derivación de una línea celular de linfoma de Burkitt sensible a HAT y resistente a G418

Para obtener células sensibles a HAT, se establecieron líneas celulares deficientes en la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (Szybalska y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026-2034, 1962; Littlefield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 50: 568-576, 1963) por el protocolo convencional descrito por Siadak y col. (Patente de EE.UU. Nº 4.834.975, 1989).

Las células HH514-16 (obtenidas del Dr. G. Millar, Universidad de Yale), que no tienen el ADN-het de EBV (Rabson y col., 1983, Proc Natl Acad Sci USA 87: 3660-3664); se trataron con 300 \mug/ml de éster etílico del ácido metanosulfónico (MSE) (Sigma, St. Louis, MO) en medio de suspensión RPMI-1640 ( Life Science, Gaithersburg, MD) suplementado con suero bovino fetal al 15% (SBF) (Hyclone Logan, UT) durante 24 horas. Tras lavar las células con medio, las células se sembraron en placas con medio que contenían 6-tioguanina (6TG) (Sigma) (5 \mug/ml) para seleccionar las células HGPRT negativas. La concentración de 6TG se aumentó de 5 \mug/ml a 30 \mug/ml durante el periodo de selección de seis meses. Después, se ensayó la sensibilidad de las células a un medio que contenía HAT. Se obtuvieron clones celulares únicos (CCU) mediante clonación por dilución límite (una célula por pocillo en placas de 96 pocillos) de la población de A5 sensibles a HAT. Uno de los CCU, el A5/1D7, se transfectó con pSV2neo, que tiene un gen neo bajo el control de SV40 en el vector pBR, para obtener células resistentes a G418. Se usó para la fusión uno de los CCU resistentes a G418 (1,5 mg/ml), denominado 2B8 (depositado en la American Type Culture Collection, Nº CRL-12569).

Ejemplo 1

Fusión celular y derivación de clones celulares únicos

La fusión se realizó principalmente según el procedimiento de fusión con polietilénglicol (PEG) descrito por Kennett (1979, Meth Enzymol 58: 5-359). Cinco millones de células 293S y 2B8 en fase de crecimiento logarítmico se lavaron con PBS sin Ca^{++} ni Mg^{++} (Life Technologies, Rockville, MD) y se pusieron en un pocillo de una placa de 6 pocillos pre-tratados con aglutinina de cacahuete (Sigma) (5 \mug/ml). Las placas de 6 pocillos cargadas con las células se centrifugaron a 400 g durante 6 minutos en una centrífuga Beckman J-6M/E (Beckman, Palo Alto, CA). Tras retirar el PBS del pocillo, las células se trataron con 2 ml de PEG (Sigma) al 40% (p/v) durante un minuto. Como control, uno de los pocillos no se trató con PEG. Las células se lavaron tres veces con 5 ml de PBS que contenían DMSO al 5% seguido de tres lavados con PBS. Las células se incubaron con medio recién preparado suplementado con SBF al 15% durante 25 minutos. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (1,2 x 10^{6} células por placa) usando el medio recién preparado que contenía G418 (1 mg/ml) y HAT (Life Technology) suplementado con SBF al 15%. El medio de selección de las células se cambiaba dos veces a la semana. En este ejemplo, para la selección inicial, las células 293S tenían la característica deseable de carecer de sensibilidad al HAT que contiene el medio y, de forma similar, las células 2B8 tenían la característica deseable de ser resistentes a G418.

Mientras las células fusionadas crecían en condiciones selectivas, las células mezcladas no crecían en las mismas condiciones. Tres semanas después de la selección, las poblaciones iniciales se transfirieron a formatos mayores. Para obtener los CCU, se mezclaron veinte poblaciones iniciales estables y se sometieron a clonación por dilución límite (una célula por pocillo) usando el medio selectivo. A partir de 15 placas de 96 pocillos, se seleccionaron 19 CCU tras analizar cuidadosamente los clones individuales usando un microscopio. Los CCU derivados del experimento de fusión se denominaron célula HKB (células híbridas de riñón humano y de células B). Se eligieron 7 CCU a partir del estudio de transfección. Además, se analizó la producción estable de diversas proteínas en estos siete CCU. Se eligió uno de los siete CCU, el HKB 11, como un hospedador celular de mamíferos preferido para la producción de proteínas heterólogas. Véase el resumen en la Figura 1.

Ejemplo 2

Caracterización de los clones HKB

Aunque todas las células híbridas se seleccionaron en condiciones selectivas, la condición de híbrido se confirmó contando el número de cromosomas en las células. De hecho, todas las HKB mostraban un número cromosómico modal de 90-110. Estos números eran similares a la suma de los números cromosómicos modales de 293S y 2B8 (64 y 47, respectivamente según los datos de la ATCC). Las células 293S (Stillman y col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 2051-2060) son 293 adaptadas a la suspensión (ATCC CRL-1573).

Se ensayó la expresión de Ig (mu y kappa) endógena en todos los clones celulares híbridos, mediante un ensayo de inmunofluorescencia directa usando células fijadas con metanol para determinar qué clones celulares secretan Ig endógena. En experimentos repetidos durante un periodo largo de tiempo, se observó que estas células no expresaban las cadenas mu y kappa, en función de un ensayo de inmunofluorescencia (Tabla 1) y ELISA (datos no mostrados).

TABLA 1 Detección de la expresión del gen de la g

	Expresión génica
Células	Cadena pesada (mu)	Cadena ligera (kappa)
293S	negativa	negativa
2B8	positiva	positiva
HKB	negativa	negativa

La Tabla 1 muestra los resultados observados en el ensayo de inmunofluorescencia para los tres tipos de células. Las células se resuspendieron en PBS y se aplicaron como un frotis en un portaobjetos. Después de secar las células, los portaobjetos se fijaron en metanol frío (-20ºC) durante 5 minutos. Las células se tiñeron con anticuerpos frente a las cadenas kappa humana y mu humana-FITC (dilución 1:20) (Zymed Laboratories, Inc., So. San Francisco, CA) en una cámara húmeda a 37ºC durante 45 minutos. Tras lavar los portaobjetos con PBS durante 10 minutos, los portaobjetos se montaron junto con un cubreobjetos usando PBS/Glicerol (1:1). Las células se observaron en un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).

El patrón específico humano de unión de ácido siálico por la alfa (2-6) sialiltransferasa, se confirmó mediante un análisis en FACS de las células HKB usando la lectina de Sambucus nigra (SNA) conjugado con FITC (Sigma, St. Louis, MO). La proteína secretada a partir de las células HKB (clon 1G2) mostraba un perfil de glicosilación de ácido siálico en uniones alfa (2-3) y alfa (2-6), analizado por el procedimiento de las huellas genéticas de oligosacáridos (datos no mostrados). Esta observación indica que las células HKB derivadas de la fusión de las células 293S y 2B8 mantenían enzimas de glicosilación específicas de humanos.

Para comprobar si estas células híbridas tenían la capacidad para expresar genes extraños, las células se transfectaron con vectores de expresión para ICAM-1 e IgG (anticuerpo anti-TNF). Para comprobar la secreción de IgG, las células HKB (5 x 10^{6} células) se transfectaron por electroporación con 10 \mug de ADN plasmídico que proporcionaba la expresión funcional de las cadenas pesada (gamma) y ligera (kappa). Para comprobar los niveles de expresión de ICAM-1 soluble, se transfectaron células HKB (5 x 10^{6} células) por electroporación con 10 \mug de ADN plasmídico que proporcionaba la expresión funcional de ICAM-1 soluble. Los niveles de secreción de IgG o ICAM-1 se determinaron por ELISA. En un ensayo de transfección transitoria (Tabla 2), los 19 CCU secretaban niveles relativamente elevados de ICAM-1 (100-500 ng/ml/2d) e IgG (30-200 ng/ml/2d). Estos datos indican que las células híbridas mantienen la expresión de los genes de Ig transfectados; a pesar de que se haya eliminado la expresión del gen de la Ig endógena.

El virus de Epstein Barr (EBV) está como episomas en las células 2B8. Todos los CCU expresaban EBNA-1 (datos no mostrados) lo que indica que contenían el EBV. Sin embargo, no se sabía si las células híbridas seguían conteniendo un genoma completo de EBV.

TABLA 2 Ensayos de transfección transitoria para la secreción de IgG y de ICAM soluble a partir de clones HKB que se obtuvieron inmediatamente después del procedimiento de clonación. Los valores son los niveles de secreción de proteínas (ng/ml/2d)

Clon HKB	IgG	ICAM-1 soluble
1	\sim150	\sim500
2	\sim30	\sim30
3	\sim20	\sim50
4	\sim80	\sim200
5	\sim100	\sim500
6	\sim50	\sim300
7	\sim40	\sim200
8	\sim30	nd
9	\sim80	nd
10	\sim80	\sim100
11	\sim200	nd
12	\sim100	nd
13	\sim80	\sim150
14	\sim80	nd
15	\sim30	\sim200
16	\sim80	\sim200
17	\sim160	\sim500
18	\sim80	\sim200
19	\sim80	\sim100
nd = no determinada

Por tanto, el estado del genoma del EBV en las células híbridas se analizó transfectando las células con el fragmento BZLF1 del genoma de EBV, un gen transactivador que interrumpe la latencia. Las células HKB (5 x 10^{6} células) se transfectaron con 10 \mug de ADN plasmídico (pSH121) permitiendo la expresión funcional de BZLF1. La detección del antígeno de la cápside del EBV (EBV-VCA) se realizó por inmunofluorescencia indirecta usando suero humano que contenía valores de anticuerpo frente a EBV-VCA y anti-IgG humana conjugada con FITC. Los detalles técnicos del ensayo de inmunofluorescencia se describen a continuación. Como se muestra en la Tabla 3, las células pseudotransfectadas no expresaban el antígeno de la cápside del EBV (EBV-VCA), lo que indica que el EBV no se replicaba en ellas. Sin embargo, un pequeño porcentaje de las células transfectadas expresaban el antígeno. Estos datos indican que las células híbridas llevan el genoma del EBV en su forma latente.

TABLA 3 Inducción de la replicación de EBV por transfección con BZLF1

	Expresión del antígeno de la cápside del virus (%)
Clon HKB	pseudotransfección	BZLF1
HKB1	Negativa	0,20%
HKB5	Negativa	1-2%
HKB7	Negativa	0,20%
HKB11	Negativa	0,20%
HKB13	Negativa	0,50%
HKB17	Negativa	0,20%
HKB19	Negativa	1-2%

Las células híbridas se adaptaron a un medio sin suero mediante reducciones 1/2 seriadas de SBF en frascas con agitación. Después de dos semanas, las células se cultivaron en el medio sin SBF. Las células crecían en las frascas con agitación como pequeños agregados. Al contrario que las células 293S, las células híbridas se adaptaron fácilmente a los cultivos en suspensión sin suero. Las células híbridas en medio sin suero y sin albúmina, suplementados con transferrina e insulina podían mantenerse en cultivos en suspensión durante más de un año usando frascas con agitación.

Para comparar los niveles de secreción de los productos génicos transfectados, uno de los clones, el HKB11 y las células parenterales, 293S y 2B8, se transfectaron con pSM98 (ICAM1 soluble), pSH125 (IgG anti-TNF) y pCISF8 (rFVIII). Como se muestra en la Figura 3, los niveles de secreción de ICAM-1 e IgG eran muchos mayores (aproximadamente 10 veces) en células HKB11 que en células 293S. Los niveles de secreción de ambas proteínas a partir de 2B8 eran indetectables. Los niveles de secreción de rFVIII en las células HKB11 eran similares a los de las células 293S. Estos datos indican que la eficaz transfección de las células HKB11 era mucho mayor que las de las células parentales.

Ejemplo 3 Derivación de clones HKB estables que secretan proteínas heterólogas

Se analizó la expresión estable de proteínas en un sistema génico amplificable (dhfr/MTX), a partir de los clones híbridos. Las células se transfectaron primero con un vector de expresión apropiado y, a continuación, las células transfectadas (normalmente 10^{6} células por placa de 96 pocillos) se sembraron en placas y se seleccionaron/amplificaron con el medio de selección carente de hipoxantina y timidina, pero complementado con SBF y MTX (50 nM). Después del primer análisis de las placas, se eligieron las células de los pocillos con alto nivel de secreción y se transfirieron a placas de 6 pocillos. Adicionalmente, las células en las placas de 6 pocillos se ampliaron con concentraciones crecientes de MTX (100, 200 y 400 nM) en el medio. Además, se analizaron poblaciones iniciales de las placas de 6 pocillos para obtener como resultado, la mejor población. Eventualmente, estas poblaciones se usaron para clonar los clones derivados de una única célula. Como se muestra en la Tabla 4, las células HKB11 eran óptimas para la producción de elevados niveles de proteínas heterólogas. Para la producción de ICAM-1, Ig y un derivado de IL-4, las células HKB11 eran tan buenas como las células CHO (datos no mostrados). Sin embargo, los clones HKB crecían más rápido que los clones CHO y podían adaptarse fácilmente a la suspensión celular y a las condiciones sin suero. En el caso de la producción de BDD-FVIII, los clones HKB11 mostraban aproximadamente una producción diez veces mayor que los clones de CHO. Los resultados anteriores indican que las células HKB11 son un hospedador celular humano óptimo útil para la expresión de proteínas terapéuticas humanas.

TABLA 4 Producción de proteínas heterólogas a partir de clones HKB

Proteína	Célula hospedadora	Amplificación con MTX	Productividad específica
ICAM-1	HKB11	100 nM	10 pg/c/d ^{1)}
Ig	HKB13	50 nM	12 pg/c/d
BDD-FVIII	HKB11	400 nM	5-10 \muU/c/d ^{2)}
IL-4SA	HKB11	100 nM	5 pg/c/d ^{3)}
1) \begin{minipage}[t]{145mm} El nivel de producción de ICAM-1 a partir de clones HKB era similar al de las células 293S. El clon HKB que secretaba ICAM-1 se adaptaba fácilmente al cultivo en suspensión, mientras que los clones 293S eran muy difíciles de adaptar al cultivo en suspensión. \end{minipage}
2) \begin{minipage}[t]{145mm} El nivel de secreción de la secreción de BDD-FVIII era aproximadamente 10 veces mayor que el de los clones derivados de células CHO transfectadas con el mismo vector de expresión. \end{minipage}
3) \begin{minipage}[t]{145mm} La producción de gramos de IL-4SA (T13D/R121E) fue posible 6 meses después de la transfección usando HKB11, mientras que se necesitaron algunos meses más usando células CHO en experimentos simultáneos con el mismo vector de expresión y un procedimiento similar. \end{minipage}

Las líneas celulares derivadas del procedimiento anterior incluían (i) clones que secretaban ICAM-1 soluble (10 pg/célula/día) derivados a partir de células HKB11 transfectadas con pSM68 tras la amplificación con 100 nM de MTX, (ii) clones celulares únicos que secretaban un anticuerpo monoclonal (anti-TNF) (12 pg/célula/día) derivados de las HKB13 transfectadas con pSS125 tras la amplificación con 50 nM de MTX y clonación por dilución límite sin MTX; (iii) clones celulares únicos que secretan rFVIII truncado (BDD-FVIII) (5-10 \muU/c/d, en condiciones sin suero) derivados de células HKB11 transfectadas con pCIS25DTR tras la amplificación (400 nM MTX) y clonación por dilución límite sin MTX y (iv) clones que secretaban derivados de IL4 (agonista selectivo de IL-4, IL-4SA; mutada en dos posiciones de aminoácidos, T13D y R121E) (5 pg/c/d) derivados de HKB11 transfectadas con pSH157 tras la amplificación con MTX. El clon HKB que secretaba IL-4SA, el 1 G2, se usó para la producción relativamente rápida de pequeñas cantidades de proteína (en gramos). Véase en la Figura 2 el mapa físico de los vectores de expresión mencionados anteriormente.

Discusión

Las líneas celulares humanas híbridas, descritas en este documento, muestran características deseables de sus líneas celulares parentales. Las líneas celulares HKB, que se producen por la fusión de células embrionarias de riñón humano (o células derivadas de células embrionarias de riñón humano) con células de linfoma de Burkitt (o células derivadas de células de linfoma de Burkitt), son útiles para desarrollar líneas celulares para la expresión de proteína heterólogas.

El propósito inicial de establecer las líneas celulares híbridas de 293S y 2B8 era resolver el problema de la agregación de las células 293S, que tienden a aglomerarse cuando se cultivan en un cultivo en suspensión (una característica no deseada). Las células HKB desarrolladas a partir del procedimiento de hibridación crecen como una monocapa cuando se cultivan en frascas de cultivo. Sin embargo, estas células crecen como células en suspensión (no forman grandes agregados) cuando se cultivaban a modo de suspensión. Las células HKB son muy fáciles de manejar para la transfección y la eficacia de transfección es mucho mayor que con las células 293S.

Aunque el suceso de transformación o hibridación requerido en la mayoría de los casos para producir una línea celular estable puede alterar los perfiles de glicosilación (Yamashita, 1989, Biol Chem 264: 2415-24223), se ha encontrado que HKB11, que es una línea celular híbrida somática, tiene enzimas de glicosilación típica de humanos, por ejemplo, las alfa (2-3) y alfa (2-6) sialiltransferasas. Además, las proteínas producidas a partir de las células HKB transfectadas tienen patrones de glicosilación normales en humanos de uniones con ácido siálico alfa (2-3) y alfa (2-6).

En resumen, las HKB son células híbridas humanas que tienen las características deseables de cada una de las líneas celulares parentales; particularmente, crecen fácilmente en cultivo en suspensión sin agregación (como se ha observado con las células 2B8) y son fáciles de transfectar y tienen características de secreción deseables (como se observa en las células 293S). La línea celular híbrida humana preferida, la HKB11, no expresa el gen de la inmunoglobulina al igual que las células 293S. Esta particularidad es una ventaja en los casos en que se desee producir anticuerpos monoclonales de forma recombinante a partir de células humanas. El hallazgo de que la fusión de células humanas da lugar a células que tienen características ventajosas sirve para promover estudios adicionales de fusión usando 293S y otras líneas celulares derivadas de células B, por ejemplo, Namalwa y 6F11, para obtener nuevas combinaciones de características en las células híbridas a partir de fusiones diferentes de líneas celulares parentales diferentes.

Los ejemplos anteriores pretenden ilustrar la invención y se piensa que los expertos en la materia podrán hacer variaciones. Por consiguiente, se pretende que el alcance de la invención esté solo limitado por las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Una célula (número de depósito de la ATCC: CRL-12568) derivada de la fusión de una célula 293 con una célula 2B8 (número de depósito de la ATCC: CRL-12569).

2. Una célula según la reivindicación 1 que expresa una proteína heteróloga.

3. Una célula según la reivindicación 2, en la que la proteína heteróloga se selecciona entre el grupo compuesto por FVIII, BDD-FVIII, anticuerpo monoclonal, anticuerpo anti-TNF, rIL4, tPA y EPO.

4. Una línea celular HKB11 (número de depósito de la ATCC: CRL-12568) que se ha manipulado genéticamente para que exprese una proteína.

5. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es ICAM-1.

6. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es BDD-FVII.

7. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es un anticuerpo monoclonal.

8. Una línea celular según la reivindicación 7 en la que el anticuerpo monoclonal es un anti-TNF.

9. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es rIL4.

10 Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es FVIII.

11. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es tPA.

12. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es EPO.

13. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es IL-4SA (T13D/R121E).

14. Una línea celular según la reivindicación 4 en la que la proteína es una proteína humana que tiene un perfil de glicosilación humano.

15. Un procedimiento de producción de células híbridas humanas útiles para la expresión de una proteína heteróloga que comprende las etapas de:

a) obtener las células 293,

b) obtener las células 2B8 (número de depósito de la ATCC: CRTL-12569),

c) poner en contacto las células de la etapa a) con las células de la etapa b) en condiciones que permitan que tenga lugar la fusión celular.

d) seleccionar las células resultantes de la etapa c) que secretan proteínas heterólogas en cantidades mayores que las células de ovario de hámster chino (CHO).

16. El procedimiento de la reivindicación 15 en el que las células derivadas de riñón embrionario humano son las células 293S.