PL214634B1 - Przeciwcialo monoklonalne przeciwko CD40 i jego czesc wiazaca antygen, zawierajaca go kompozycja i jego zastosowanie, oraz wyizolowana linia komórkowa, czasteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania - Google Patents

Przeciwcialo monoklonalne przeciwko CD40 i jego czesc wiazaca antygen, zawierajaca go kompozycja i jego zastosowanie, oraz wyizolowana linia komórkowa, czasteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania

Info

Publication number
PL214634B1
PL214634B1 PL392809A PL39280902A PL214634B1 PL 214634 B1 PL214634 B1 PL 214634B1 PL 392809 A PL392809 A PL 392809A PL 39280902 A PL39280902 A PL 39280902A PL 214634 B1 PL214634 B1 PL 214634B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
amino acid
sequence
light chain
seq
Prior art date
Application number
PL392809A
Other languages
English (en)
Other versions
PL392809A1 (pl
Inventor
Vahe Bedian
Ronald P. Gladue
Jose Corvalan
Xiao-Chi Jia
Xiao Feng
Original Assignee
Amgen Fremont Inc
Pfizer Prod Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23370387&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL214634(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Fremont Inc, Pfizer Prod Inc filed Critical Amgen Fremont Inc
Publication of PL392809A1 publication Critical patent/PL392809A1/pl
Publication of PL214634B1 publication Critical patent/PL214634B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne przeciwko CD40 i jego część wiążąca antygen, zawierająca go kompozycja i jego zastosowanie, oraz wyizolowana linia komórkowa, cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania.
Antygen CD40 jest glikoproteiną o wielkości 50 kDa występującą na powierzchni komórki, należącą do rodziny receptora czynnika martwicy nowotworu (TNF-R). (Stamenkovic i wsp., EMBO J. 8: 1403-10 (1989)). CD40 jest wyrażany w wielu typach komórek prawidłowych i nowotworowych, w tym również w limfocytach B, komórkach dendrytycznych, monocytach, makrofagach, nabłonku grasicy, komórkach śródbłonkowych, fibroblastach i komórkach mięśni gładkich. (Paulie S. i wsp., Cancer Immunol, lmmunother. 20: 23-8(1985); Banchereau J. i wsp., Adv. Exp. Med. & Biol. 378: 79-83 (1995); Alderson M.R. i wsp., J. of Exp. Med. 178: 669-74 (1993); Ruggiero G. i wsp., J. of Immunol. 156: 3737-46 (1996); Hollenbaugh D. i wsp., J. of Exp. Med. 182: 33-40 (1995); Yellin M.J. i wsp., J. of Leukocyte Biol. 58: 209-16 (1995); Lazaar A.L. i wsp., J. of Immunol. 161: 3120-7 (1998)). CD40 jest wyrażany we wszystkich chłoniakach typu B i w 70% wszystkich guzów litych. Chociaż jest wyrażany konstytutywnie, wytwarzanie CD40 wzrasta w komórkach prezentujących antygen w wyniku regulacji przez sygnały dojrzewania, takie jak LPS, IL-1 β, IFN-γ i GM-CSF.
Aktywacja CD40 pełni kluczową rolę w regulacji humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Prezentacja antygenu bez aktywacji CD40 może prowadzić do tolerancji, podczas gdy przekazywanie sygnału przez CD40 może odwrócić taką tolerancję, zwiększyć prezentację antygenu przez wszystkie komórki prezentujące antygen (APC, ang. antigen presenting cell), prowadzić do wydzielania pomocniczych cytokin i chemokin, zwiększyć ekspresję cząsteczek ko-stymulujących i przekazywanie sygnałów oraz stymulować aktywność cytolityczną komórek odpornościowych.
CD40 ogrywa kluczową rolę w proliferacji komórek B, ich dojrzewaniu i zmianie klas. (Foy T.M. i wsp., Ann. Rev of Immunol. 14: 591-617 (1996)). Przerwanie szlaku przekazywania sygnału przez CD40 prowadzi do nieprawidłowej dystrybucji izotypów immunoglobulin surowicy, braku preaktywacji komórek CD4+ T i zaburzeń w drugorzędowych odpowiedziach humoralnych. Przykładowo, sprzężony z chromosomem X zespół hiper-IgM jest chorobą związaną z mutacją w ludzkim genie CD40L, charakteryzującą się niemożnością wytwarzania przez osobniki nią dotknięte przeciwciał innych niż te o izotypie IgM, co wskazuje, że do skutecznej odpowiedzi immunologicznej wymagane jest efektywne współdziałanie pomiędzy CD40 i CD40L.
Rekrutacja CD40 przez CD40L prowadzi do połączenia cytoplazmatycznej domeny CD40 z TRAF (czynniki związane z TNF-R, ang. TNF-R associated factors). (Lee H.H. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1421-6 (1999); Pullen S.S. i wsp., Biochemistry 37: 11836-45 (1998); Grammar A.C. i wsp., J. of Immunol. 161: 1183-93 (1998); Ishida T.K. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9437-42 (1996); Pullen S.S. i wsp., J. of Biol. Chem. 274: 14246-54 (1999)). Oddziaływanie z TRAF może osiągać punkt kulminacyjny przez aktywację dwóch szlaków NFkB i Jun/AP1 (Tsukamoto N. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1234-9 (1999); Sutherland C.L. i wsp., J. of Immunol. 162: 4720-30 (1999)). Zależnie od typu komórki, przekazanie sygnału prowadzi do zwiększenia wydzielania cytokin, takich jak IL-6 (Jeppson J.D. i wsp., J. of Immunol. 161: 1738-42 (1998); Uejima Y. i wsp., Int. Arch, of Allergy & Immunol. 110: 225-32 (1996)), IL-8 (Gruss H.J. i wsp., Blood 84: 2305-14 (1994); von Leoprechting A. i wsp., Cancer Res. 59: 1287-94 (1999); Denfeld R.W. i wsp., Europ. J. of Immunol. 26: 2329-34 (1996)), IL-12 (Cella M. i wsp., J. of Exp. Med. 184: 747-52 (1996); Ferlin W.G. I wsp., Europ. J. of Immunol. 28: 525-31 (1998); Armant M. i wsp., Europ. J. of Immunol. 26: 1430-4 (1996); Koch F. i wsp., J. of Exp. Med. 184: 741-6 (1996); Seguin R. i L.H. Kasper, J. of Infect. Diseases 179: 467-74 (1999); Chaussabel D. i wsp., Infection & Immunity 67: 1 929-34 (1999)), IL-15 (Kuniyoshi J.S. i wsp., Cellular Immunol. 193: 48-58 (1999)) i chemokin (MIP1a, ΜΙΡΙβ, RANTES i inne) (McDyer J.F. i wsp., J. of Immunol. 162: 3711-7 (1999); Schaniel C. i wsp., J. of Exp. Med. 188: 451-63 (1988); Altenburg A. i wsp., J. of Immunol. 162: 4140-7 (1999); Deckers J.G. i wsp., J. of the Am. Society of Nephrology 9: 1187-93 (1998)), zwiększonej ekspresji MHC klasy I i II (Santos-Argumedo L. i wsp., Cellular Immunol. 156: 272-85 (1994)) i zwiększonego wytwarzania cząsteczek adhezyjnych (np. ICAM) (Lee H.H. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1421-6 (1999); Grousson J. i wsp., Archives of Dermatol. Res. 290: 325-30 (1998); Katada Y. i wsp., Europ. J. of Immunol. 26: 192-200 (1996); Mayumi M. i wsp., J. of Allergy & Clin. Immunol. 96: 1136-44 (1995); Flores-Romo L. i wsp., Immunol. 79: 445-51 (1993)) i cząsteczek ko-stymulujących (np. B7) (Roy M. i wsp., Europ. J. of Immunol. 25: 596-603 (1995); Jones K.W. i C.J. Hackett, Cellular Immunol. 174: 42-53 (1996); Caux C. i wsp., JourPL 214 634 B1 nal of Exp. Med. 180: 1263-72 (1994); Kiener P.A. i wsp., J. of Immunol. 155: 4917-25 (1995)). Cytokiny indukowane przez zaangażowanie CD40 zwiększają przeżycie i aktywację komórek T.
Dodatkowo, oprócz zwiększenia funkcji komórkowej i immunologicznej, skutki aktywacji CD40 obejmują: rekrutowanie i różnicowanie przez chemokiny i cytokiny; aktywację monocytów; podniesienie aktywności cytolitycznej limfocytów T cytolitycznych (CTL, ang. cytolytic T lymphocyte) i komórek naturalnych zabójców (NK, ang. natural killer), indukowanie apoptozy w nowotworach dodatnich względem CD40; podniesienie immunogenności nowotworów dodatnich względem CD40 i wytwarzanie przeciwciał specyficznych wobec nowotworu. Rola aktywacji CD40 w odpowiedziach immunologicznych za pośrednictwem komórek jest również dobrze poznana i została opisana w: Grewal i wsp., Ann. Rev. of Immunol. 16: 111-35 (1998); Mackey i wsp., J. of Leukocyte Biol. 63: 418-28 (1998) i Noelle R.J., Agents & Actions - Suppl. 49: 17-22 (1998).
Badania z zastosowaniem układu modelu krzyżowej preaktywacji wykazały, że aktywacja APC przez CD40 może zamienić wymagane pomocnicze komórki T na pokolenie limfocytów T cytolitycznych (CTL). (Bennett i wsp., Nature 393: 478-480 (1998)). Z doświadczeń na myszach z niedoborem CD40L jasno wynika wymóg przekazania sygnału przez CD40 w preaktywacji komórek T pomocniczych. (Grewal I.S. I wsp., Science 273: 1864-7 (1996); Grewal I.S. i wsp., Nature 378: 617-20 (1995)). Aktywacja CD40 przekształca skądinąd tolerogenne, niosące antygeny komórki B w kompetentne APC. (Buhlmann J.E. i wsp., Immunity 2: 645-53 (1995)). Aktywacja CD40 indukuje dojrzewanie i różnicowanie komórek macierzystych krwi z pępowiny do komórek dendrytycznych. (Flores-Romo L. i wsp., J. of Exp. Med. 185: 341-9 (1997); Mackey M.F. i wsp., J. of Immunol. 161: 2094-8 (1998)). Aktywacja CD40 indukuje również różnicowanie monocytów do funkcjonalnych komórek dendrytycznych. (Brossart P. i wsp., Blood 92: 4238-47 (1998)). Ponadto, aktywacja CD40 zwiększa aktywność cytolityczną komórek NK przez cytokiny indukowane APC-CD40. (Carbone E. i wsp., J. of Exp. Med. 185: 2053-60 (1997); Martin-Fontecha A. i wsp., J. of Immunol: 162: 5910-6 (1999)).
Obserwacje te wskazują na to, że CD40 odgrywa istotną rolę w wywoływaniu i wzmacnianiu odpowiedzi immunologicznych przez indukowanie dojrzewania APC, wydzielanie pomocniczych cytokin, podwyższoną regulację cząsteczek ko-stymulujących i wzmocnienie funkcji efektorowych.
Ważna rola jaką pełni przekazywanie sygnału przez CD40 w wywoływaniu i dojrzewaniu humoralnych i cytotoksycznych odpowiedzi immunologicznych czyni z tego układu idealny cel do zwiększania odporności. Zwiększanie to może być szczególnie ważne we wzmacnianiu skutecznych odpowiedzi immunologicznych wobec antygenów nowotworowych, które są na ogół prezentowane układowi immunologicznemu przez krzyżową preaktywację aktywowanych APC. (Huang A.Y. i wsp., Ciba Foundation Symp. 187: 229-44 (1994); Toes R.E.M. i wsp., Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998); Albert M.L. i wsp., Nature 392: 86-9 (1998); Bennett S.R. i wsp., J. of Exp. Med. 186: 65-70 (1997)).
Kilka grup badawczych wykazało skuteczność aktywacji CD40 w odpowiedziach przeciwnowotworowych in vitro i in vivo. (Toes R.E.M. i wsp., Seminars in Immunol. 10: 443-8 (1998)). Dwie grupy, stosując modele z przerzutami do płuc raka komórek nerkowych i guzów podskórnych w komórkach transformowanych wirusem, wykazały niezależnie, że aktywacja CD40 może odwrócić tolerancję na antygeny specyficzne dla nowotworów, dając w efekcie skuteczną przeciwnowotworową preaktywację komórek T. (Sotomayor E.M. i wsp., Nature Medicine 5: 780-787 (1999); Diehl L. i wsp., Nature Medicine 5: 774-9 (1999)). Istnieje również doniesienie o aktywności przeciwnowotworowej leczenia za pomocą CD40L i przeciwciałami anty-CD40 w modelu linii ludzkiego raka sutka u myszy SCID, w nieobecności komórek immunologicznych. (Hirano A. i wsp., Blood 93: 2999-3007 (1999)). Ostatnio wykazano, że aktywacja CD40 przez przeciwciała anty-CD40, eliminuje CD40+ i chłoniaki CD40 w modelach mysich. (French R.R. i wsp., Nature Medicine 5: 548-53 (1999)). Ponadto, wcześniejsze badania prowadzone przez Glennie i wsp. wykazały, że aktywność przekazywania sygnału przez przeciwciała anty-CD40 jest skuteczniejsza w indukowaniu klirensu nowotworu in vivo, niż w przypadku innych, zdolnych do rekrutacji efektorów przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym. (Tutt A. L. i wsp., J. of Immunol. 161: 3176-85 (1998)). Zgodnie z tymi obserwacjami, kiedy badano przeciwciała anty-CD40 pod względem aktywności wobec komórek nowotworowych CD40+ in vivo, większość, ale nie cała aktywność nowotworobójcza, była związana raczej z przekazywaniem sygnału przez CD40 niż z ADCC. (Funakoshi S. i wsp., J. of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol. 19:93-101 (1996)). W innym badaniu, komórki dendrytyczne (DC) szpiku kostnego poddawano ex vivo działaniu różnych czynników i badano aktywność przeciwnowotworową in vivo. Badania te wykazały, że DC stymulowane przez CD40L były najbardziej dojrzałymi i najbardziej skutecznymi komórkami, wzmagającymi odpowiedź przeciwnowotworową.
PL 214 634 B1
Kluczową rolę CD40 w odporności przeciwnowotworowej wykazano również przez porównanie odpowiedzi myszy typu dzikiego i CD40-/- na szczepionki nowotworowe. Badania te pokazują, że myszy CD40-/- są niezdolne do osiągnięcia odporności przeciwnowotworowej, obserwowanej u myszy prawidłowych. (Mackey M.F. i wsp., Cancer Research 57: 2569-74 (1997)). W innym badaniu, wykazano że splenocyty myszy niosących nowotwór stymulowane komórkami nowotworowymi i traktowane ex vivo aktywującymi przeciwciałami przeciwko CD40, mają podniesioną specyficzną wobec nowotworu aktywność CTL. (Donepudi M. i wsp., Cancer Immunol. Immunother. 48: 153-164 (1999)). Badania te wykazały, że CD40 odgrywa kluczową rolę w odporności przeciwnowotworowej, zarówno w nowotworach dodatnich względem CD40 jak i ujemnych. Ponieważ CD40 jest wyrażany w chłoniakach, białaczkach, szpiczaku mnogim, w większości raków noso-gardzieli, pęcherza, jajnika, wątroby, i w niektórych rakach sutka oraz okrężnicy i odbytu, aktywacja CD40 może wykazywać szeroki zakres zastosowań klinicznych.
Aktywujące przeciwciała monoklonalne anty-CD40 mogą przyczyniać się do usuwania nowotworu za pośrednictwem kilku ważnych mechanizmów. Najważniejszy spośród nich to aktywacja komórek dendrytycznych gospodarza, w celu wzmagania przetwarzania antygenów nowotworowych i ich prezentacji, jak również zwiększenia prezentacji antygenu lub immunogenności samych dodatnich względem CD40 komórek nowotworowych, co prowadzi do aktywacji specyficznych wobec nowotworów limfocytów CD4+ i CD8+. Dodatkowa aktywność przeciwnowotworowa może odbywać się zarówno za pośrednictwem innych efektów przekazywania sygnału przez CD40 wzmagających odporność (wytwarzanie chemokin i cytokin, rekrutacja i aktywacja monocytów oraz wzmacnianie aktywności cytolitycznej CTL i NK), jak i przez bezpośrednie zabijanie nowotworów CD40+ przez indukcję apoptozy lub przez stymulowanie humoralnej odpowiedzi prowadzącej do ADCC. Przechodzące apoptozę i obumierające komórki nowotworowe mogą również stać się ważnym źródłem antygenów specyficznych wobec nowotworów, przetwarzanych i prezentowanych przez APC, aktywowane za pośrednictwem CD40.
Zgodnie z tym, istnieje zapotrzebowanie na terapeutyczne, klinicznie istotne, agonistyczne przeciwciała anty-CD40.
Krótki opis rysunków
Figury 1A-1H są przyrównaniami przewidywanych sekwencji aminokwasowych izolowanych zmiennych domen lekkiego i ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała anty-CD40 z sekwencjami aminokwasowymi linii zarodkowej (linii germinalnej, ang. germline) odpowiadającymi genowi łańcucha lekkiego i ciężkiego. Różnice pomiędzy sekwencją klonów i linii zarodkowej zaznaczono przez zacieniowanie. Podkreślono sekwencje linii zarodkowej CDR1, CDR2 i CDR3. W przyrównaniu sekwencji łańcucha ciężkiego, oczywiste insercje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji linii zarodkowej, a oczywiste delecje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji klonu.
Fig. 1A: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu lekkiego łańcucha kappa przeciwciała monoklonalnego (mAb) 3.1.1 i 7.1.2 z sekwencjami aminokwasowymi VK=A3/A19 i J=Jk1 genu linii zarodkowej.
Fig. 1B: przewidywana sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu lekkiego łańcucha kappa z klonu 15.1.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (Vk=A3/A19 i J=Jk2);
Fig. 1C: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu lekkiego łańcucha kappa mAb 10.8.3 i 21.4.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (Vk=L5 (DP5) i J=Jk4);
Fig. 1D: przewidywana sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb
3.1.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=3-30+(DP-49), D=D4+DIR3 i J=JH6);
Fig. 1E: przewidywana sekwencja aminokwasowa zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb
7.1.2 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=3-30+(DP-49), D=DIR5+D1-26 i J=JH6);
Fig. 1F: przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego mAb 10.8.3 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=4,35(VIV-4), D=DIR3 i J=JH6);
Fig. 1G: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb
15.1.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=4-59(DP-71), D=D4-23 i J=JR4) oraz
Fig. 1H: przewidywane sekwencje aminokwasowe zmiennego regionu łańcucha ciężkiego mAb
21.4.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=1-02(DP-75), D=DLR1 i J=JH4).
Figury 2A-2H są przyrównaniami przewidywanych sekwencji aminokwasowych izolowanych zmiennych domen lekkiego i ciężkiego łańcucha monoklonalnego przeciwciała anty-CD40 z sekwenPL 214 634 B1 cjami aminokwasowymi linii zarodkowej odpowiadającymi genowi łańcucha lekkiego i ciężkiego. Różnice pomiędzy sekwencją klonów i linii zarodkowej zaznaczono pogrubioną czcionką. Podkreślono sekwencje linii zarodkowej CDR1, CDR2 i CDR3. W przyrównaniu sekwencji łańcucha ciężkiego, oczywiste insercje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji linii zarodkowej, a oczywiste delecje w regionie CDR3 zaznaczono za pomocą myślnika (-) w sekwencji klonu.
Fig. 2A: przewidywane sekwencje aminokwasowe lekkiego łańcucha kappa mAb 22.1.1, 23.5.1 i 23.29.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK=A3/A19 i J=JK1);
Fig. 2B: przewidywana sekwencja aminokwasowa lekkiego łańcucha kappa z mAb 21.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK=A3/A19 i J=JK3);
Fig. 2C: przewidywane sekwencje aminokwasowe lekkiego łańcucha kappa mAb 23.28.1, 23.28.1L-C92A i 24.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VK=A27 i J=JK3);
Fig. 2D: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 21.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=3-30+, D=DIR3+D6-19 i J=JH4);
Fig. 2E: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 22.1.1, 22.1.1H-C109A i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=3-30+, D=D1-1 i J=JH6);
Fig. 2F: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 23.5.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=3-30+, D=D4-17 i J=JH6);
Fig. 2G: przewidywana sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego mAb 23.29.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=3-30,3, D=D4-17 i J=JH6) i
Fig. 2H: przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego mAb 23.28.1, 23.28.1HD16E i 24.2.1 i sekwencja aminokwasowa linii zarodkowej (VH=4-59, D=DIR1+D4-17 i J=JH5).
Fig. 3 jest krzywą zależności odpowiedzi od dawki, ilustrującą zdolność przeciwciała anty-CD40 (21.4.1) do zwiększenia wytwarzania IL-12p40 przez ludzkie komórki dendrytyczne.
Fig. 4 jest krzywą zależności odpowiedzi od dawki, ilustrująca zdolność przeciwciała anty-CD40 (21.4.1) do zwiększenia wytwarzania IL-12p70 przez ludzkie komórki dendrytyczne.
Fig. 5 jest wykresem ilustrującym zdolność przeciwciała anty-CD40 (21.4.1) do podniesienia immunogenności komórek stymulujących Jy i do wzmocnienia aktywności CTL wobec komórek docelowych Jy.
Fig. 6 jest krzywą hamowania wzrostu nowotworu, ilustrującą zredukowany wzrost nowotworów Daudi, dodatnich względem CD40, u beżowych myszy SCID, traktowanych przeciwciałem anty-CD40 (21.4.1) .
Fig. 7 jest krzywą hamowania wzrostu nowotworu, ilustrującą zredukowany wzrost nowotworów K.562 ujemnych względem CD40, u beżowych myszy SCID, traktowanych przeciwciałem anty-CD40 (21.4.1) oraz ludzkimi komórkami dendrytycznymi i komórkami T.
Fig. 8 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworów K562 ujemnych względem CD40 u myszy SCID, pod wpływem różnych stężeń agonistycznego mAb 23.29.1 anty- CD40.
Fig. 9 przedstawia hamowanie wzrostu CD40 ujemnych nowotworów K.562 u myszy SCID, pod wpływem różnych stężeń agonistycznego mAb 3.1.1 anty-CD40.
Fig. 10 przedstawia hamowanie wzrostu dodatnich względem CD40 nowotworów Raji, w obecności i pod nieobecność komórek T i komórek dendrytycznych u myszy SCID, pod wpływem agonistycznego mAb anty-CD40.
Fig. 11 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworów Raji dodatnich względem CD40 u myszy SCID, pod wpływem agonistycznych przeciwciał anty-CD40.
Fig. 12 przedstawia hamowanie wzrostu komórek raka sutka BT 474 u beżowych myszy SCID, pod wpływem agonistycznych przeciwciał anty-CD40.
Fig. 13 przedstawia hamowanie wzrostu nowotworów prostaty PC-3 u beżowych myszy SCID, pod wpływem agonistycznych przeciwciał anty-CD40.
Fig. 14 przedstawia krzywą przeżycia beżowych myszy SCID, którym wstrzyknięto (iv - dożylnie) komórki nowotworowe Daudi i które leczono agonistycznymi przeciwciałami anty-CD40.
Fig. 15 przedstawia analizę typu Western blot agonistycznych przeciwciał anty-CD40 względem zredukowanego (R) i nie-redukowanego (NR) ludzkiego CD40.
Fig. 16 przedstawia uszeregowanie domen D1-D4 mysiego i ludzkiego CD40.
Fig. 17 przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowych mysiego i ludzkiego CD40, pokazujące miejsca fuzji w chimerach.
Fig. 18 przedstawia grupę schematycznych diagramów konstruktów chimerycznych CD40.
PL 214 634 B1
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążąca antygen, które swoiście wiąże ludzki CD40, przy czym przeciwciało obejmuje łańcuch ciężki i łańcuch lekki, przy czym (a) łańcuch ciężki obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 domeny zmiennej łańcucha ciężkiego wybrane z grupy składającej się z:
(i) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, które ma takie same sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego jak przeciwciało 3.1.1 (nr dostępu ATCC PTA-3600), z tą różnicą, że w sekwencji łańcucha ciężkiego treonina jest podstawiona za alaninę pozycji 78, alanina jest podstawiona za walinę pozycji 88, a alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 97; oraz w sekwencji łańcucha lekkiego metionina jest podstawiona za leucynę w pozycji 4, a walina jest podstawiona za leucynę w pozycji 83;
(ii) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego obejmującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 92; oraz (iii) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego obejmującej sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID: 91; oraz (b) łańcuch lekki obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 domeny zmiennej łańcucha lekkiego wybrane z grupy składającej się z:
(i) domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V;
(ii) domeny zmiennej łańcucha lekkiego obejmującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 94; oraz (iii) domeny zmiennej łańcucha lekkiego obejmującej sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID: 93.
Korzystnie sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID: 92, a sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID: 94.
Również korzystnie łańcuch ciężki obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 92, a łańcuch lekki obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 94.
W korzystnej postaci wykonania sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego przeciwciała według wynalazku stanowią odpowiednio sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego określonego powyżej przeciwciała 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83 V.
Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało monoklonalne obejmujące:
a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 6 bez sekwencji sygnałowej, przy czym w sekwencji dojrzałej reszta 78 jest zamieniona z alaniny na treoninę, reszta 88 jest zamieniona z waliny na alaninę i reszta 97 jest zamieniona z waliny na alaninę, oraz
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 8 bez sekwencji sygnałowej, przy czym w dojrzałej sekwencji reszta 4 jest zamieniona z leucyny na metioninę, a reszta 83 jest zamieniona z leucyny w walinę.
W korzystnej postaci wykonania przeciwciało według wynalazku lub jego część wiążąca antygen wykazuje co najmniej jedną cechę wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) współzawodniczy krzyżowo o wiązanie CD40 z określonym powyżej przeciwciałem
3.1.1 H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83 V;
b) wiąże się z tym samym epitopem CD40 co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83 V;
c) wiąże CD40 z zasadniczo tą samą KD co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A- V97A/3.1.1L-L4M-L83V; oraz
d) wiąże CD40 z zasadniczo tą samą szybkością dysocjacji co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83 V.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznej obejmującej przeciwciało lub część wiążącą antygen według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie przeciwciała lub części wiążącej antygen według wynalazku do wytwarzania leku.
PL 214 634 B1
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała lub części wiążącej antygen według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia raka u człowieka tego potrzebującego lub do wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej u człowieka tego potrzebującego.
Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania przeciwciała lub części wiążącej antygen według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia u człowieka nowotworu ujemnego względem CD40.
Przedmiotem wynalazku jest także wyizolowana linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało lub jego część wiążącą antygen według wynalazku.
Wynalazek dotyczy cząsteczki wyizolowanego kwasu nukleinowego obejmującej sekwencję nukleotydową, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen lub sekwencję nukleotydową, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, lub oba, przeciwciała lub jego części wiążącej antygen według wynalazku.
Korzystnie cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych wybranych z grupy składającej się z:
a) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen z przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V;
b) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen z przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V;
c) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen oraz sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen, przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83 V;
d) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 92 lub 94;
e) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 92 oraz sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową z 94;
f) sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.: 91 lub 93; oraz
g) sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.: 91 oraz sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.: 93.
W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza wektora obejmującego cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, który ewentualnie obejmuje sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z cząsteczką kwasu nukleinowego.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza obejmująca wektor lub cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku.
W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania przeciwciała anty-CD40 lub jego części wiążącej antygen obejmującego hodowanie komórki gospodarza lub linii komórkowej według wynalazku w odpowiednich warunkach i odzyskiwanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen.
Szczegółowy opis wynalazku
Definicje i ogólne techniki
Naukowe i techniczne terminy zastosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku powinny mieć znaczenie powszechnie rozumiane przez specjalistów w dziedzinie, o ile nie zdefiniowano ich niniejszym w inny sposób. Ponadto, o ile nie wymaga tego kontekst, określenia w liczbie pojedynczej odnoszą się do przedmiotów w liczbie mnogiej, a określenia w liczbie mnogiej obejmują przedmioty w liczbie pojedynczej. Ogólnie, techniki oraz nazewnictwo stosowane niniejszym w odniesieniu do hodowli komórkowej i tkankowej, biologii molekularnej, immunologii, mikrobiologii, genetyki chemii białek i kwasów nukleinowych oraz hybrydyzacji są dobrze znane i powszechnie stosowane w dziedzinie.
Sposoby i techniki przedstawione poniżej są zazwyczaj prowadzone zgodnie z klasycznymi, dobrze znanymi w dziedzinie, sposobami i tak jak to opisano w ogólnej i bardziej szczegółowej literaturze, która jest cytowana w niniejszym szczegółowym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej. Zobacz, np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) i Ausubel i wsp., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) oraz Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Reakcje enzymatyczne i techniki oczyszczania są wykonywane zgodnie z zaleceniami producentów, jak powszechnie wykonuje się je w dziedzinie lub jak to tutaj opisano. Procedury i techniki laboratoryjne oraz nazewnictwo stosowane tutaj w odniesieniu do chemii analitycznej, syntezy organicznej oraz chemii medycznej i farmaceutycznej są dobrze znane i powszechnie stosowane w dziedzinie. Zastosowano standardowe techniki syn8
PL 214 634 B1 tez chemicznych, analiz chemicznych, przygotowania farmaceutycznych preparatów, formulacji oraz dostarczenia farmaceutycznego i leczenia pacjentów.
Następujące terminy, o ile nie zaznaczono inaczej, powinny być rozumiane w następującym znaczeniu:
Termin „polipeptyd” obejmuje natywne lub sztuczne białka, fragmenty białek i polipeptydowe analogi sekwencji białka. Polipeptyd może być monomeryczny lub polimeryczny.
Termin „wyizolowane białko”, „wyizolowany polipeptyd” lub „wyizolowane przeciwciało” oznacza białko, polipeptyd lub przeciwciało, które ze względu na swoje pochodzenie lub źródła pochodzenia (1) nie jest związane z naturalnie związanymi składnikami, które towarzyszą jemu w jego natywnym stanie, (2) jest wolne od innych białek z tego samego rodzaju, (3) jest wytwarzane przez komórkę innego rodzaju lub (4) nie występuje w naturze. W ten sposób polipeptyd, syntetyzowany chemicznie lub syntetyzowany w układzie komórkowym różniącym się od komórki, z której naturalnie pochodzi, będzie „izolowany” od jego naturalnie dołączonych składników. Ponadto białko można otrzymać w postaci zasadniczo wolnej od naturalnie z nim związanych składników przez izolację, stosując techniki oczyszczania białka dobrze znane specjalistom.
Przykłady wyizolowanych przeciwciał obejmują przeciwciało anty-CD40, oczyszczane przy zastosowaniu powinowactwa z CD40, przeciwciało anty-CD40, które syntetyzowano w komórkach hybrydoma lub w innej linii komórkowej in vitro oraz ludzkie przeciwciało anty-CD40 pochodzące z transgenicznych myszy.
Białko lub polipeptyd jest „zasadniczo czyste”, „zasadniczo homogenne" lub „zasadniczo oczyszczone”, kiedy co najmniej około 60 do 75% próbki stanowi pojedynczy rodzaj polipeptydu. Polipeptyd lub białko mogą być monomeryczne lub multimeryczne. Zasadniczo czysty polipeptyd lub białko będzie typowo obejmować około 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% w/w próbki białka, częściej zazwyczaj około 95% i korzystniej będzie czyste w ponad 99%. Czystość białka lub homogenność można określić za pomocą wielu sposobów dobrze znanych w dziedzinie, takich jak elektroforeza próbki białka w żelu poliakryloamidowym, z następującą po niej wizualizacją pojedynczego prążka polipeptydu podczas barwienia żelu barwnikiem dobrze znanym w dziedzinie. Z kilku przyczyn, lepszy rozdział można osiągnąć przez zastosowanie HPLC lub innych sposobów dobrze znanych w dziedzinie oczyszczania.
Zastosowany tutaj termin „fragment polipeptydu” odnosi się do polipeptydu, z delecją na końcu aminowym i/lub końcu karboksylowym, ale w którym pozostała sekwencja aminokwasowa jest identyczna z odpowiadającymi pozycjami w naturalnie występującej sekwencji. W niektórych wykonaniach, fragmenty mają długość co najmniej 5, 6, 8 i 10 aminokwasów. W innych wykonaniach, fragmenty mają długość co najmniej 14, co najmniej 20, co najmniej 50 lub co najmniej 70, 80, 90, 100, 150 lub 200 aminokwasów.
Zastosowany tutaj termin „analog polipeptydu” odnosi się do polipeptydu, który obejmuje segment, zasadniczo identyczny z częścią sekwencji aminokwasowej i który ma co najmniej jedną z następujących właściwości: (1) specyficzne wiązanie do CD40 w warunkach odpowiednich dla wiązania, (2) zdolność aktywowania CD40, (3) zdolność regulowania wytwarzania cząsteczek na powierzchni komórki, takich jak ICAM, MHC-II, B7-1, B7-2, CD71, CD23 i CD83 lub (4) zdolność do zwiększania wytwarzania cytokin, takich jak IFN-e1, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 i IL-23. Zazwyczaj, analogi polipeptydu obejmują konserwatywną substytucję aminokwasów (lub insercję lub delecję) względem sekwencji występującej naturalnie. Zazwyczaj analogi mają długość co najmniej 20 lub 25 aminokwasów, korzystniej co najmniej 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 lub 200 aminokwasów lub więcej i często mogą być tak długie, jak długi jest pełnej długości naturalnie występujący polipeptyd.
Korzystnymi substytucjami aminokwasowymi są takie, które: (1) obniżają wrażliwość na proteolizę. (2) obniżają wrażliwość na utlenianie, (3) zmieniają powinowactwo wiązania dla tworzących się kompleksów białkowych i (4) nadają lub zmieniają inne właściwości fizykochemiczne lub funkcjonalne takich analogów. Analogi mogą obejmować różne muteiny sekwencji, inne niż naturalnie występująca sekwencja peptydu. Przykładowo, pojedyncze lub liczne substytucje aminokwasowe (korzystniej konserwatywne substytucje aminokwasowe) można przeprowadzić w naturalnie występującej sekwencji (korzystniej w części polipeptydu poza domeną(-ami) odpowiedzialnymi za oddziaływanie między cząsteczkami). Konserwatywna substytucja aminokwasowa nie powinna w rzeczywistości zmienić strukturalnej charakterystyki sekwencji rodzicielskiej (np. zamiana aminokwasu nie powinna zmierzać do złamania helisy, występującej w rodzicielskiej sekwencji lub do zniszczenia innych typów struktury drugorzędowej, charakteryzującej sekwencję rodzicielską). Przykłady rozpoznawanych w dziedzinie
PL 214 634 B1 drugorzędowych i trzeciorzędowych struktur polipeptydów opisano w Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, wyd., W.H. Freeman and Company, Nowy Jork (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze. wyd., Garland Publishing, Nowy Jork, N. Y. (1991)); oraz Thornton i wsp., Nature 354:105 (1991).
W przemyśle farmaceutycznym często stosowane są analogi niepeptydowe jako leki o właściwościach analogicznych do tych, które ma wzorcowy peptyd. Takie rodzaje niepeptydowego składnika są określane jako „peptydowe mimetyki” lub „peptydomimetyki”, Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber i Freidinger, TINS str. 392 (1985); oraz Evans i wsp., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Składniki takie są często tworzone przy pomocy komputerowego modelowania molekularnego. Mimetyki peptydowe, strukturalnie podobne do peptydów wykorzystywanych terapeutycznie, mogą być stosowane do wytwarzania równoważnego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego. Ogólnie, peptydomimetyki są strukturalnie podobne do polipeptydu wzorcowego (tj. polipeptydu, który ma pożądaną właściwość biochemiczną lub aktywność farmakologiczną), takiego jak ludzkie przeciwciało, ale ma jedną lub więcej grup wiążących peptydu dowolnie zamienionych przez związane grupy wybranej z grupy składającej się z: -CH2NH-,-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-, przy użyciu metod dobrze znanych w dziedzinie. Do tworzenia bardziej stabilnych peptydów może być również wykorzystana systematyczna substytucja jednego lub więcej aminokwasów w sekwencji najwyższej zgodności, D-aminokwasem tego samego typu (np. D-Iizyna w miejsce L-lizyny). Dodatkowo, sposobami znanymi w dziedzinie mogą być otrzymywane peptydy „wymuszone” obejmujące sekwencję najwyższej zgodności lub zasadniczo identyczny wariant sekwencji najwyższej zgodności.
(Rizo i Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992)), na przykład, przez dodawanie wewnętrznych reszt cysteinowych zdolnych do tworzenia wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych, które sprawiają, że peptyd staje się cykliczny.
Termin „przeciwciało'" odnosi się do kompletnego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, która współzawodniczy z nienaruszonym przeciwciałem o specyficzne wiązanie. Zobacz, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul W., red., 2 wyd., Raven Press, N.Y. (1989)). Części wiążące antygen można wytwarzać stosując techniki rekombinacji DNA lub enzymatyczne czy chemiczne rozszczepianie nienaruszonych przeciwciał. Części wiążące antygen obejmują, między innymi, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb i fragmenty regionu determinującego dopasowanie (CDR, ang. complementarity determining region), przeciwciała o jednym łańcuchu (scFv), przeciwciała chimeryczne, podwójne przeciwciała i polipeptydy, zawierające co najmniej część przeciwciała, która wystarcza do nadania specyficzności wiązania antygenu do polipeptydu.
Od końca N do końca C, domeny zmienne zarówno łańcucha lekkiego jak i ciężkiego obejmują regiony FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przypisanie aminokwasów do każdej domeny jest zgodne z definicjami Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Insitutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) Iub Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); Chothia i wsp., Nature 342: 878-883 (1989).
Zgodnie z zastosowanym tu systemem, przeciwciało oznaczone numerem jest przeciwciałem monoklonalnym, otrzymywanym z hybrydoma o tym samym numerze. Przykładowo, przeciwciało monoklonalne 3.1.1 jest otrzymywane z hybrydoma 3.1.1.
W stosowanym tu znaczeniu, fragment Fd oznacza fragment przeciwciała, zawierający domeny VH i CH1 fragment Fv obejmuje domeny VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała, a fragment dAb (Ward i wsp., Nature 341: 544-546 (1989)), zawiera domenę VH.
W niektórych postaciach wykonania, przeciwciało jest przeciwciałem o jednołańcuchowym (scFv), w którym domeny VL i VH są sparowane tworząc monowalentne cząsteczki dzięki syntetycznemu łącznikowi, który umożliwia im tworzenie pojedynczego łańcucha białkowego, (Bird i wsp., Science 242: 423-426 (1988) i Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). W niektórych wykonaniach, przeciwciała są podwójnymi przeciwciałami, tj. są przeciwciałami biwalentnymi, w których domeny VH i VL są wytwarzane jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy, ale dzięki zastosowaniu łącznika, który jest zbyt krótki, aby pozwolić na sparowanie pomiędzy dwiema domenami tego samego łańcucha, narzuca w ten sposób sparowanie domen z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzy dwa miejsca wiążące antygen. (Patrz np., Holliger P. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) i Poljak R. J. i wsp., Structure 2: 1121-1123 (1994)). Jeden lub więcej CDR z przeciwciała według wynalazku może być włączonych do cząsteczki kowalencyjnie lub nie-kowalencyjnie, aby uczynić ją immunoadhezyną, specyficznie wiążącą CD40. W takich wykona10
PL 214 634 B1 niach, CDR(y) może być włączony jako część większego łańcucha polipeptydowego, może być kowalencyjnie połączony z innym łańcuchem polipeptydowym lub może być włączony niekowalencyjnie.
W postaciach wykonania, w których występuje jedno lub więcej miejsc wiązania, miejsca wiązania mogą być identyczne lub różne.
W stosowanym tu znaczeniu termin „ludzkie przeciwciało” oznacza każde przeciwciało, w którym wszystkie sekwencje domen zmiennych i stałych są sekwencjami ludzkimi. Przeciwciała te mogą być wytworzone wieloma sposobami, jak to opisano poniżej.
W stosowanym tu znaczeniu termin „przeciwciało chimeryczne”, oznacza przeciwciało, które zawiera regiony z dwóch lub większej liczby różnych przeciwciał. W jednym przeciwciele, jedno lub więcej CDR może pochodzić od ludzkiego przeciwciała anty-CD40. W innym przypadku, wszystkie CDR pochodzą od ludzkiego przeciwciała anty-CD40. Możliwe są przypadki w których, CDR od większej liczby różnych ludzkich przeciwciał anty-CD40, są połączone w przeciwciało chimeryczne. Przykładowo, przeciwciało chimeryczne może obejmować CDR1 z lekkiego łańcucha pierwszego ludzkiego przeciwciała anty-CD40, CDR2 z lekkiego łańcucha drugiego ludzkiego przeciwciała anty-CD40 i CDR3 z lekkiego łańcucha trzeciego ludzkiego przeciwciała anty-CD40, a CDR z ciężkiego łańcucha mogą pochodzić z jednego lub większej liczby innych przeciwciał anty-CD40. Dalej, regiony zrębowe mogą pochodzić od jednego z tych samych przeciwciał anty-CD40 lub od jednego lub większej liczby różnych ludzkich przeciwciał.
W stosowanym tu znaczeniu termin „przeciwciało aktywujące” (również określane tutaj jako „przeciwciało agonistyczne”) oznacza przeciwciało, które zwiększa jedną lub więcej aktywności CD40 o co najmniej około 20%, po dodaniu do komórki, tkanki lub organizmu wyrażającego CD40. W niektórych wykonaniach, przeciwciało aktywuje aktywność CD40 o co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%. Przeciwciało aktywujące może być dodawane w obecności CD40L. Aktywność przeciwciała aktywującego można określić stosując test regulacji dodatniej cząsteczek powierzchniowych pełnej krwi. Zobacz Przykład VII. Aktywność przeciwciała aktywującego można także określić stosując test z zastosowaniem komórek dendrytycznych, w celu pomiaru uwalniania IL-12. Zobacz Przykład VIII. Aktywność przeciwciała aktywującego można mierzyć stosując nowotworowy model in vivo. Zobacz Przykład X.
Fragmenty lub analogi przeciwciał lub cząsteczki immunoglobulin mogą być łatwo wytworzone przez specjalistów w dziedzinie, na podstawie ujawnień zawartych w niniejszym opisie. Korzystne fragmenty lub analogi końców amino- i karboksylowych powstają blisko granic z domenami funkcjonalnymi. Domeny strukturalne i funkcjonalne mogą być rozpoznane przez porównywanie danych o sekwencji nukleotydowej i/lub aminokwasowej z sekwencją znajdującą się w publicznych lub komercyjnych bazach danych. Korzystnie, stosowane są komputerowe metody porównywania w celu identyfikowania motywów sekwencji lub potwierdzania domen przewidywanego białka, występujących w innych białkach o znanej strukturze i/lub funkcji. Znane są metody identyfikowania sekwencji białka, sfałdowanego w znaną strukturę trzeciorzędową. Zobacz Bowie i wsp., Science 253: 164 (1991)).
W stosowanym tu znaczeniu termin „rezonans plazmonów powierzchniowych” odnosi się do zjawiska optycznego, które pozwala na analizę biospecyficznych oddziaływań w czasie rzeczywistym przez wykrywanie zmian stężenia białka w macierzy biosensorowej, stosując przykładowo system BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja i Piscataway, N.J.). Dalsze informacje można znaleźć w Jonsson U. i wsp., Ann. Biol. Clin. 51: 19-26 (1993); Jonsson U. i wsp., Biotechniques 11: 620-627 (1991); Jonsson B. i wsp., J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); oraz Johnsson B. i wsp., Anal. Biochem. 198: 268-277(1991)).
Termin „KD” odnosi się do stałej równowagi dysocjacji dla określonego oddziaływania przeciwciało-antygen.
Termin „epitop” obejmuje każdą determinantę białkową zdolną do specyficznego wiązania immunoglobuliny lub receptora komórki T. Determinanty epitopowe składają się zazwyczaj z aktywnych chemicznie ugrupowań na powierzchni cząsteczki, takich jak aminokwasy lub cukrowe łańcuchy boczne, które zazwyczaj mają zarówno specyficzną strukturę trzeciorzędową, jak i specyficzny ładunek.
Uważa się, że przeciwciało wiąże swoiście antygen, kiedy stała równowagi dysocjacji wynosi < 1 μΜ, korzystniej < 100 nM i bardziej korzystnie < 10 nM.
W stosowanym tu znaczeniu dwadzieścia konwencjonalnych aminokwasów i ich skróty są zgodne z tradycyjnym użyciem. Patrz Immunology - A Synthesis (2 wyd., E.S. Golub i D.R. Gren, red., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).
PL 214 634 B1
W stosowanym tu znaczeniu termin „polinukleotyd” oznacza polimeryczną formę nukleotydów o długości co najmniej 10 zasad, albo rybonukleotydów albo deoksyrybonukleotydów lub modyfikowanych form obu typów nukleotydów. Termin obejmuje formy jedno- i dwu-niciowe.
W stosowanym tu znaczeniu termin „izolowany polinukleotyd” oznacza polinukleotyd pochodzący z genomu, cDNA lub syntetyczny lub oznacza pewną ich kombinację, przy czym ze względu na swoje pochodzenie „izolowany polinukleotyd” (1) nie jest związany ze wszystkimi lub częścią polinukleotydów, z którymi „izolowany polinukleotydy” występuje naturalnie, (2) jest funkcjonalnie połączony z polinukleotydom, z którym nie jest połączony w naturze, lub (3) nie występuje w naturze jako część większej sekwencji.
W stosowanym tu znaczeniu termin „oligonukleotyd” obejmuje naturalnie występujące i zmodyfikowane nukleotydy, połączone ze sobą wiązaniami występującymi naturalnie lub nie występującymi naturalnie w oligonukleotydach. Oligonukleotydy są podzbiorem polinukleotydów zasadniczo obejmujących długość 200 zasad lub mniej. Korzystnie oligonukleotydy mają długość od 10 do 60 zasad i korzystniej 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 lub 20 do 40 zasad długości. Oligonukleotydy są zazwyczaj jednoniciowe, np. dla starterów i sond; chociaż oligonukleotydy mogą być dwunicowe, np. do stosowania w konstruowaniu zmutowanych genów. Oligonukleotydy tu opisane mogą być oligonukleotydami sensownymi lub anty-sensownymi.
W stosowanym tu znaczeniu termin „naturalnie występujące nukleotydy” obejmuje deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy. W stosowanym tu znaczeniu termin „modyfikowane nukleotydy” obejmuje nukleotydy ze zmodyfikowanymi lub podstawionymi grupami cukrowymi i im podobnymi. W stosowanym tu znaczeniu termin „wiązania oligonukleotydowe” obejmuje wiązania występujące w oligonukleotydach, takie jak tiofosforanowe, ditiofosforanowe, selenofosforanowe, diselenofosforanowe, anilotiofosforanowe, anilidofosforanowe, amidofosforanowe i tym podobne. Zobacz np. LaPlanche i wsp., Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec i wsp., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein i wsp., Nucl. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon i wsp., Anti-Cancer Drud Design 6: 539 (1991); Zon i wsp., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, str. 87-108 (F. Eckstein, red., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Patent USA nr 5151510; Uhlmann i Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990). Jeśli jest to pożądane, oligonukleotyd może zawierać znacznik do wykrywania.
Sekwencje „funkcjonalnie połączone” obejmują zarówno sekwencje kontrolujące ekspresję, sąsiadujące z będącym przedmiotem zainteresowania genem oraz sekwencje kontrolujące ekspresję, działające w pozycji trans lub w oddaleniu od genu, będącego przedmiotem zainteresowania. W stosowanym tu znaczeniu termin „sekwencja kontrolująca ekspresję” oznacza sekwencje polinukleotydowe, konieczne do wdrożenia ekspresji i przetwarzania sekwencji kodujących, z którymi są zligowane. Sekwencje kontrolujące ekspresję obejmują sekwencje inicjacji i terminacji transkrypcji, promotora i enhancera: wydajne sygnały przetwarzania RNA, takie jak sygnały składania i poliadenylacji; sekwencje stabilizujące cytoplazmatyczny mRNA; sekwencje wzmacniające wydajność translacji (tj. sekwencja najwyższej zgodności Kozak); sekwencje wzmacniające stabilność białka i jeśli jest to pożądane sekwencje wzmacniające wydzielanie białka. Cechy takich kontrolujących sekwencji są różne i zależą od organizmu gospodarza; u prokariota, takie sekwencje kontrolujące obejmują zazwyczaj promotor, miejsce wiązania rybosomów i sekwencję terminacji transkrypcji; u eukariota takie kontrolujące sekwencje obejmują zazwyczaj promotory i sekwencję terminacji transkrypcji. Termin „sekwencje kontrolujące” obejmuje przynajmniej wszystkie składniki, których obecność jest konieczna do ekspresji i przetwarzania, i może również obejmować dodatkowe składniki, których obecność jest korzystna, na przykład, sekwencje liderowe i sekwencje partnera fuzji.
W stosowanym tu znaczeniu termin „wektor” oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego zdolną do transportowania innego kwasu nukleinowego, z którym jest połączona. W niektórych wykonaniach, wektor jest plazmidem, tj. kolistą pętlą dwuniciowego DNA, do której można wprowadzić przez ligację dodatkowe segmenty DNA. W niektórych wykonaniach, wektor jest wektorem wirusowym, gdzie dodatkowe segmenty DNA można wprowadzić przez ligację do genomu wirusowego. W niektórych wykonaniach, wektory są zdolne do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza, do której je wprowadzono (np. wektory bakteryjne mające bakteryjne miejsce startu replikacji i episomalne wektory ssacze). W innych wykonaniach, wektory (np. nie-episomalne wektory ssacze) mogą być włączane do genomu komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i przez to ulegają replikacji razem z genomem gospodarza. Co więcej, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, z którymi są funkcjonalnie połączone. Wektory takie są tutaj określone jako „zrekombinowane wektory ekspresyjne” (lub prościej „wektory ekspresyjne”).
PL 214 634 B1
W stosowanym tu znaczeniu termin „zrekombinowana komórka gospodarza” (lub prościej „komórka gospodarza”) oznacza komórkę, do której wprowadzono zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być rozumiane, że „zrekombinowana komórka gospodarza” i „komórka gospodarza” oznaczają nie tylko określoną komórkę osobnika, ale również potomstwo takiej komórki. Ponieważ w kolejnych pokoleniach, pod wpływem mutacji lub środowiska, mogą zdarzać się pewne modyfikacje, opisywane potomstwo może faktycznie nie być identyczne z komórką rodzicielską, ale nadal mieści się w zakresie zastosowanego tutaj terminu „komórka gospodarza”.
W stosowanym tu znaczeniu termin „selektywnie hybrydyzować” odnosi się do wykrywalnego i specyficznego wiązania. Polinukleotydy, oligonukleotydy i ich fragmenty hybrydyzują selektywnie z nićmi kwasu nukleinowego w warunkach hybrydyzacji i płukania, które znacznie minimalizują ilości wykrywalnych wiązań z niespecyficznymi kwasami nukleinowymi. W celu otrzymania warunków sele ktywnej hybrydyzacji można zastosować warunki o „wysokiej ostrości” lub „wysoce ostre”, jak to wiadomo w dziedzinie i jak to jest tutaj omówione. Przykładem warunków o „wysokiej ostrości” lub „wysoce ostrych” jest inkubacja polinukleotydu z innym polinukleotydem, w której jeden polinukleotyd może być związany ze stałą powierzchnią, taką jak membrana, w buforze hybrydyzacyjnym 6xSSPE lub SSC, 50% formamid, 5x odczynnik Denhardt'a, 0,5% SDS, 100 μg/ml denaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia w temperaturze hybrydyzacji 42°C przez 12-16 godz., a następnie dwukrotne płukanie w temp. 55°C z zastosowaniem buforu płuczącego 1xSSC, 0,5% SDS. Zobacz również Sambrook i wsp., powyżej, str. 9.50-9.55.
Termin „procent identyczności sekwencji” w kontekście sekwencji kwasu nukleinowego oznacza reszty w dwóch sekwencjach, które są takie same w przyrównaniu z maksymalnym dopasowaniem. Długość identyczności sekwencji w przyrównaniu może obejmować odcinki o co najmniej dziewięciu nukleotydach, zazwyczaj co najmniej około 18 nukleotydach, częściej co najmniej około 24 nukleotydach, typowo co najmniej około 28 nukleotydach, bardziej typowo co najmniej około 32 nukleotydach i korzystniej co najmniej około 36, 48 lub o większej liczbie nukleotydów. Specjalistom znane są liczne różne algorytmy, które można zastosować do pomiaru identyczności sekwencji nukleotydowej. Przykładowo, sekwencje polinukleotydowe można porównywać stosując programy FASTA, Gap lub Bestfit, z pakietu Wisconsin Package Version 10,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, zawierający np. programy FASTA2 i FASTA3, dostarcza przyrównania i procent identyczności sekwencji regionów najlepiej pokrywających się w sekwencjach badanych i przeszukiwanych (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998)). O ile nie określono inaczej, stosuje się parametry domyślne do konkretnego programu lub algorytmu. Przykładowo, procent identyczności sekwencji pomiędzy sekwencjami kwasów nukleinowych można określać stosując FASTA z jego parametrami domyślnymi (wielkość wyrażenia 6 i czynnik NOPAM do macierzy liczenia) lub stosując Gap z jego parametrami domyślnymi, jak to dostarczono w GCG, wersja 6.1.
Odniesienie do sekwencji nukleotydowej obejmuje jej sekwencję komplementarną, o ile nie określono tego inaczej. Dlatego też odniesienie do kwasu nukleinowego o konkretnej sekwencji powinno być rozumiane jako obejmujące jego komplementarną nić, z jej komplementarną sekwencją.
W dziedzinie biologii molekularnej, naukowcy stosują zamiennie terminy „procent identyczności sekwencji” „procent podobieństwa sekwencji” i „procent homologii sekwencji”. W niniejszym zgłoszeniu, terminy te mają takie samo znaczenie, ale tylko w stosunku do sekwencji kwasu nukleinowego.
Termin „zasadnicze podobieństwo” lub „zasadnicze podobieństwo sekwencji”, w odniesieniu do kwasu nukleinowego lub jego fragmentu, oznacza, że przy optymalnym przyrównaniu z odpowiednimi insercjami lub delacjami nukleotydu z innym kwasem nukleinowym (lub jego komplementarną nicią), istnieje identyczność sekwencji nukleotydowej w co najmniej około 85%, korzystniej w co najmniej około 90% i bardziej korzystnie w co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% par nukleotydowych, jeśli mierzy się ją za pomocą każdego dobrze znanego algorytmu identyczności sekwencji, takiego jak FASTA, BLAST lub Gap, jak to omówiono powyżej.
Termin „zasadnicza identyczność" zastosowany do polipeptydów oznacza, że dwie sekwencje peptydowe, optymalnie przyrównane za pomocą programów GAP lub BESTFIT, stosując wagi za wprowadzenie przerwy, mają co najmniej 70, 75 lub 80 procent identyczności sekwencji, korzystniej co najmniej 90 lub 95 procent identyczności sekwencji i bardziej korzystnie co najmniej 97, 98 lub 99 procent identyczności sekwencji. Korzystnie, pozostałe pozycje, które nie są identyczne, różnią się konserwatywnymi podstawieniami aminokwasów. „Konserwatywne podstawienie aminokwasowe” jest takim, w którym reszta aminokwasowa jest podstawiana inną resztą aminokwasową mającą grupę R
PL 214 634 B1 łańcucha bocznego z podobnymi właściwościami chemicznymi (takimi jak np. ładunek i hydrofobowość). Ogólnie, konserwatywne podstawienie aminokwasowe nie zmieni istotnie funkcjonalnych właściwości białka. W przypadkach, kiedy dwie lub więcej sekwencji aminokwasowych różnią się od siebie konserwatywnymi podstawieniami, procent identyczności sekwencji lub stopień podobieństwa można ustalić z góry, aby skorygować konserwatywną naturę substytucji. Sposoby wykonywania takiego ustalania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Zobacz np. Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Przykłady grup aminokwasów, mających łańcuchy boczne z podobnymi właściwościami chemicznymi obejmują 1) alifatyczne łańcuchy boczne: glicyna, alanina, walina, leucyna i izoleucyna; 2) alifatyczno-hydroksylowe łańcuchy boczne: seryna i treonina; 3) łańcuchy boczne zawierające grupę amidową: asparagina i glutamina: 4) aromatyczne łańcuchy boczne: fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan; 5) zasadowe łańcuchy boczne: lizyna, arginina i histydyna; 6) kwasowe łańcuchy boczne: kwas asparaginowy i kwas glutaminowy oraz 7) łańcuchy boczne zawierające siarkę: cysteina i metionina. Korzystnymi grupami podstawień aminokwasów konserwatywnych są: walina-leucyna-izoleucyna, fenyloalanina-tyrozyna, lizyna-arginina, alanina-walina, glutaminian-asparaginian i asparagina-glutamina.
Alternatywnie, zastąpienie konserwatywne jest każdą zmianą wykazującą wartość pozytywną w macierzy log-prawdopodobieństwa PAM250, przedstawionej w publikacji Gonnet i wsp, Science 256: 1443-45 (1992). „Umiarkowanie konserwatywne" zastąpienie jest każdą zmianą nie wykazującą negatywnej wartości w macierzy log- prawdopodobieństwa PAM250.
Podobieństwo sekwencji dla polipeptydów, określane również jako identyczność sekwencji, typowo mierzy się stosując oprogramowanie do analizy sekwencji.
Oprogramowanie do analizy białka odpowiednio dobiera podobne sekwencje stosując pomiary podobieństwa przypisane różnym podstawieniom, delecjom i innym modyfikacjom, w tym konserwatywnym podstawieniom aminokwasowym. Przykładowo, programy zawierające GCG, takie jak „Gap” i „Bestfit”, które można stosować z parametrami domyślnymi w celu określenia homologii sekwencji lub identyczności sekwencji pomiędzy blisko spokrewnionymi polipeptydami, takimi jak homologiczne polipeptydy pochodzące od różnych gatunków lub pomiędzy białkiem typu dzikiego i jego muteiną. Zobacz np. GCG wersja 6.1. Sekwencje polipeptydowe można również porównywać stosując FASTA używając parametrów domyślnych lub zalecanych, programu GCG wersji 6.1. FASTA (np. FASTA2 i FASTA3) dostarcza przyrównania i procent identyczności sekwencji regionów najbardziej się pokrywających, pomiędzy sekwencjami badanymi i przeszukiwanymi (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Innym korzystnym algorytmem do porównywania sekwencji z bazą danych zawierającą dużą liczbę sekwencji pochodzących od różnych organizmów, jest program komputerowy BLAST, zwłaszcza blastp lub tblastn, z zastosowaniem domyślnych parametrów. Zobacz np. Altschul i wsp., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); oraz Altschul i wsp., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997).
Długość sekwencji polipeptydowych porównywanych pod względem homologii zazwyczaj wynosi co najmniej około 16 reszt aminokwasowych, zazwyczaj co najmniej około 20 reszt, częściej co najmniej około 24 reszt, typowo co najmniej około 28 reszt i korzystnie więcej niż około 35 reszt. Kiedy przeszukiwana jest baza danych zawierająca sekwencje pochodzące od dużej liczby różnych organizmów, korzystniejsze jest porównywanie sekwencji aminokwasowych.
Zastosowane tutaj terminy „znacznik” lub „wyznakowany” odnoszą się do włączenia innej cząsteczki do przeciwciała. W jednym wykonaniu, znacznik jest wykrywalnym markerem np. włączenie znakowanego radioaktywnie aminokwasu lub dołączenie do polipeptydu cząstek biotynylowych, które można wykrywać znakowaną awidyną (np. streptawidyną zawierającą znacznik fluoroscencyjny lub mającą aktywność enzymatyczną, wykrywalną metodami optycznymi lub kolorymetrycznymi). W innym wykonaniu, znacznik lub marker może być terapeutyczny, np. skoniugowany lek lub toksyna. W dziedzinie są znane i mogą być stosowane różne metody znakowania polipeptydów i glikoprotein. Przykłady znaczników dla polipeptydów obejmują w sposób nieograniczający: radioizotopy lub radionuklidy (np. 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), znaczniki fluoroscencyjne (np. FITC, rodamina, fosfory-lantanowcowe), znaczniki enzymatyczne (np. peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna), markery chemiluminescencyjne, grupy biotynylowe, określone wcześniej epitopy polipeptydowe rozpoznawane przez drugorzędowy znacznik reporterowy (np. sekwencje par z suwaka leucynowego, miejsca wiązania przeciwciał drugorzędowych, domeny wiążące metal, znaczniki epitopowe), czynniki magnetyczne, takie jak gadolinowe kompleksy chelatowe, toksyny jak toksyna krztuścowa, taksol, cytochalazyna B, gramicydyna D, bromek etydyny, emetyna, mitomycyna,
PL 214 634 B1 etopozyd, tenopozyd, winkrystyna, winblastyna, kolchicyna, doksorubicyna, daunorubicyna, dihydroksyantracynodion, mitoksantron, mitramycyna, akinomycyna D, 1-dehydrotestosteron, glukokortykoidy, prokaina, tetrakaina, lidokaina, propranolol i puromycyna i ich analogi lub homologi. W niektórych przypadkach, znaczniki są przyłączane przez różnej długości ramiona łącznikowe, w celu zredukowania potencjalnej zawady przestrzennej.
Termin pacjent obejmuje osobniki ludzkie i zwierzęce.
W szczegółowym opisie i w zastrzeżeniach słowo „obejmować” lub jego odmiany takie jak „obejmuje” lub „obejmujący", będą rozumiane jako mieszczące w sobie włączenie określoną całość lub grupy całości, a nie jako wyłączenie jakiejkolwiek innej całości lub grupy całości.
Ludzkie przeciwciała anty-CD4-i ich charakterystyka
Przeciwciał ludzkich nie dotyczy kilka problemów związanych z przeciwciałami, posiadającymi inne od ludzkich (np. gryzoni) regiony zmienne i/lub stałe. Problemy te obejmują szybki klirens przeciwciał lub odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko przeciwciału. Dlatego też niniejszym opisano humanizowane przeciwciała anty-CD40. Opisane zostały również ludzkie przeciwciała anty-CD40. Ludzkie przeciwciała anty-CD40 mogą być wytwarzane przez immunizowane gryzonie, których genom zawiera geny ludzkiej immunoglobuliny, w ten sposób gryzoń wytwarza ludzkie przeciwciała. Przypuszcza się, że ludzkie przeciwciała anty-CD40 zminimalizują immunogenne i alergiczne odpowiedzi właściwe dla nie będących ludzkimi lub nie pochodzących od ludzi przeciwciał monoklonalnych (mAb) i w ten sposób podniosą skuteczność i bezpieczeństwo podawanych przeciwciał. Można przypuszczać, że używanie w pełni ludzkich przeciwciał dostarcza istotnej korzyści w leczeniu przewlekłych i nawracających chorób człowieka, takich jak zapalenie i rak, które mogą wymagać powtarzania podawania przeciwciała.
Niniejszym ujawniono jedenaście aktywujących ludzkich monoklonalnych przeciwciał (mAb) anty-CD40 i wytwarzających je linii komórkowych hybrydoma. W Tabeli A wymieniono identyfikatory sekwencji (SEKW. NR ID.:) kwasów nukleinowych kodujących łańcuchy ciężkie i lekkie o pełnej długości (w tym sekwencje liderowe), odpowiadające im przewidywane sekwencje aminokwasowe o pełnej długości oraz sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego.
T a b e l a A
Ludzkie przeciwciała anty-CD40
MAb Identyfikator sekwencji (SEKW. NR ID.:)
Region zmienny Cała długość
Ciężki Lekki Ciężki Lekki
DNA Białko DNA Białko DNA Białko DNA Białko
3.1.1 1 2 3 4 5 6 7 8
7.1.2 9 10 11 12 13 14 15 16
10.8.3 17 18 19 20 21 22 23 24
15.1.1 25 26 27 28 29 30 31 32
21.2.1 33 34 35 36 37 38 39 40
21.4.1 41 42 43 44 45 46 47 48
22.1.1 49 50 51 52 53 54 55 56
23.5.1 57 58 59 60 61 62 63 64
23.28.1 65 66 67 68 69 70 71 72
23.29.1 73 74 75 76 77 78 79 80
24.2.1 81 82 83 84 85 86 87 88
PL 214 634 B1
Niniejszym opisano ponadto ludzkie mAb 23.25.1 anty-CD40 i wytwarzające je linie komórkowe hybrydoma.
Niniejszym ujawniono ponadto warianty ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha kilku wymienionych wyżej ludzkich mAb anty-CD40, obejmujących jedno lub więcej podstawień aminokwasowych. Zgodnie z wynalazkiem ujawniono dwa warianty łańcuchów ciężkich mAb 3.1.1. W jednym, alanina w pozycji 78 jest zamieniona na treoninę. W drugim, alanina w pozycji 78 jest zamieniona na treoninę, a waliny w pozycji 88 i 97 są zamienione na alaniny. Wynalazek dostarcza wariantów łańcucha lekkiego mAb 3.1.1, w którym leucyna w pozycji 4 i leucyna w pozycji 83 są odpowiednio zamienione na metioninę i walinę. Kombinacja wariantu łańcucha ciężkiego lub lekkiego z łańcuchem lekkim lub ciężkim typu dzikiego, jest oznaczana odpowiednio przez łańcuch zmutowany. W ten sposób, przeciwciało zawierające łańcuch lekki typu dzikiego i łańcuch ciężki obejmujący mutację, w wyniku której w pozycji 78 zamiast alaniny jest treonina oznaczane jest jako 3.1.1H-A78T. Niniejszym ujawnono także przeciwciała 3.1.1 obejmujące każdą kombinację wariantu ciężkiego łańcucha i wariantu lekkiego łańcucha. W szczególności rozwiązania według wynalazku dotyczą przeciwciała 3.1.1 H-A78T-V88AV97A/3.1.1 L-L4M-L83 V.
Niniejszym przedstawiono także wariant łańcucha ciężkiego mAb 22.1.1, w którym cysteina w pozycji 109 jest zamieniona na alaninę. Przeciwciało monoklonalne obejmujące wariant łańcucha ciężkiego i łańcuch lekki 22.1.1 jest oznaczane jako mAb 22.1.1 H- C109A. Dalej opisane zostały dwa warianty łańcuchów ciężkich i wariant łańcucha lekkiego mAb 23.28.1. W jednym wariancie łańcucha ciężkiego, kwas asparaginowy w pozycji 16 jest zamieniony na kwas glutaminowy. mAb obejmujące wariant wariantu łańcucha ciężkiego i łańcuch lekki 23.28.1 jest oznaczone jako 23.28.1H-D16E. Możliwy do otrzymania jest również wariant lekkiego łańcucha 23.28.1, w którym cysteina w pozycji 92 jest zamieniona na alaninę. mAb obejmujące łańcuch ciężki 23.28.1 i wariant łańcucha lekkiego jest oznaczone jako 23.28.1L-C92A. Niniejszym ujawniono mAb obejmujące warianty łańcucha ciężkiego
23.28.1 z wariantem łańcucha lekkiego 23.28.1.
Łańcuch lekki wytwarzany przez hybrydoma 23.29.1 obejmuje mutację w regionie stałym, w pozycji 174. Łańcuch lekki wytwarzany przez hybrydoma ma w tej pozycji argininę zamiast kanonicznej lizyny. Zgodnie z tym, przedstawiono tu łańcuch lekki 23.29.1 z kanoniczną lizyną w pozycji 174 i mAb oznaczane jako 23.29.1L-R174K, zawierające łańcuch ciężki 23.29.1 i wariant łańcucha lekkiego.
W korzystnej postaci wykonania przeciwciało anty-CD40 według wynalazku stanowi przeciwciało 3.1.1.H-A78T-V88A-V97A/3.1.1.L-L4M-L83V. Jednakże niniejszym zostały opisane inne przeciwciała anty-CD40: 3.1.1.H-A78T, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.2.1, 21.4.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1,
23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1. Przedstawione w niniejszym opisie przeciwciała anty-CD40 mogą obejmować łańcuch lekki zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEKW. NR ID.: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 lub 102, lub jego region zmienny, lub kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego wybranego spośród SEKW. NR ID.: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 93, 99 lub 101. Przeciwciało anty-CD40 może też obejmować łańcuch lekki zawierający co najmniej CDR2 z jednego z wymienionych przeciwciał, jedną z wyżej podanych sekwencji aminokwasowych (jak przedstawiono na Fig. 1A-1C i 2A-2C) lub kodowaną przez jedną z wyżej wymienionych sekwencji kwasów nukleinowych. Łańcuch lekki może ponadto obejmować CDR1 i CDR3 niezależnie wybrane ze zmiennego regionu łańcucha lekkiego, który zawiera nie więcej niż 10 aminokwasów z sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen Iinii zarodkowej VkA3/A19, L5 lub A27, lub obejmuje CDR1 i CDR3 niezależnie wybrane z jednego z CDR1 i CDR3 (1) przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,
21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23,29.1L-R174K lub 24.2.1; (2) sekwencji aminokwasowej z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102 lub (3) kodowanych przez sekwencję kwasu nukleinowego z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99 lub 101.
Opisane tu przeciwciało anty-CD4 może obejmować także łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z SEKW. NR ID.: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 lub 86, lub jego zmienny region, lub kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego wybranego z SEKW. NR ID.: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77 lub 85. Przeciwciało anty-CD40 może też obejmować łańcuch ciężki zawierający co najmniej CDR3 z jednego spośród wymienionych przeciwciał, jedną z wyżej wymienionych sekwencji aminokwasowych jak przedstawiono na Fig. 1A-1C i 2A-2C) lub kodowaną przez jedną z wyżej wymienionych sekwencji kwasów nukleinowych. Łańcuch ciężki może obejmować dalej CDR1 i CDR2 niezależnie wybrane ze zmiennego regionu łańcucha ciężkiego, który zawiera nie wię16
PL 214 634 B1 cej niż osiemnaście aminokwasów z sekwencji aminokwasowej kodowanej przez gen linii zarodkowej
VH3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 lub 3-30.3, lub obejmuje CDR1 i CDR2 niezależnie wybrane z jednego z CDR1 i CDR2 (1) przeciwciała wybranego z 3.1.1., 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2,
10.8.3.15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E,
23.29.1 i 24.2.1; (2) sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66. 74, 82, 90, 92, 96 lub 98, lub (3) kodowanych przez sekwencję kwasu nukleinowego SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 lub 97. Przeciwciało anty-CD40 zawiera łańcuch ciężki i łańcuch lekki jak zdefiniowano powyżej.
Ujawnione tu przeciwciało 3.1.1H-A78T jest identyczne z 3.1.1 z wyjątkiem pozycji 78 łańcucha ciężkiego, gdzie w miejscu alaniny jest treonina. Podobnie w przeciwciele 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, pozycja 78 jest zamieniona na A, a w pozycjach 88 i 97 łańcucha ciężkiego walina jest zamieniona na alaninę. Przeciwciało 3.1.1L-L4M-L83V jest identyczne z 3.1.1 z wyjątkiem, w łańcuchu lekkim, pozycji 4, w której zamiast leucyny jest metionina i pozycji 83, w której zamiast leucyny jest walina. Przeciwciało 22.1.1H-C109A jest identyczne z 22.1.1 z wyjątkiem pozycji 109 łańcucha ciężkiego, w której cysteinę zmieniono na alaninę. Przeciwciała 23.28.1H-D16E i 23.28.1L-C92A są identyczne z 23.28.1 z wyjątkiem, odpowiednio, pozycji 16 w łańcuchu ciężkim, w której aspartanian zmieniono na glutaminian i pozycji 92 w łańcuchu lekkim, w której cysteinę zamieniono na alaninę. Przeciwciało 23.29.1L-R174K jest identyczne z 23.29.1 z wyjątkiem pozycji 174 łańcucha lekkiego, w której argininę zamieniono na lizynę.
Klasa i podklasa przeciwciał anty-CD40
Klasę i podklasę przeciwciał anty-CD40 można określać za pomocą każdej metody znanej w dziedzinie. Ogólnie, klasę i podklasę przeciwciał anty-CD40 można określać stosując przeciwciała swoiste dla specyficznej klasy i podklasy przeciwciała. Przeciwciała takie są dostępne na rynku. Klasę i podklasę można określać zarówno za pomocą testów typu ELISA lub Western Blot jak i innymi technikami. Alternatywnie, klasę i podklasę można określać za pomocą sekwencjonowania wszystkich lub części stałych regionów łańcuchów ciężkich i/lub lekkich przeciwciał, porównywania ich sekwencji aminokwasowych ze znanymi sekwencjami aminokwasowymi immunoglobulin różnych klas i podklas, i określania klasy i podklasy przeciwciał.
Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym. Przeciwciało anty-CD40 może być cząsteczką IgG, IgM, IgE, IgA, lub IgD. Korzystnie przeciwciało anty-CD40 należy do IgG i do podklasy IgG1, IgG2, IgG3 lub IgG4. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało anty-CD40 należy do podklasy IgG2.
Selektywność gatunkowa i cząsteczkowa
W innym aspekcie przeciwciała anty-CD40 wykazują selektywność zarówno gatunkową jak i cząsteczkową. Przeciwciało anty-CD40 może wiązać się z CD40 naczelnych i ludzkim CD40. Przeciwciało anty-CD40 może wiązać się z ludzkim, pochodzącym od makaka jawajskiego lub rezusa CD40. Przeciwciało anty-CD40 nie wiąże się natomiast z mysim, szczurzym, psim czy króliczym CD40. Stosując wiedzę tego szczegółowego opisu selektywność gatunkową przeciwciała anty-CD40 można określić za pomocą metod dobrze znanych specjalistom. Przykładowo, można określić selektywność rodzajową stosując testy typu Western Blot, FACS, ELISA lub RIA. (Zobacz np. Przykład IV).
W niektórych wykonaniach, przeciwciało anty-CD40 jest 100 razy bardziej selektywne w stosunku do CD40 niż w stosunku do RANK (receptorowy aktywator jądrowego czynnika kappa B), 4-1BB (CD137), TNFR-1 (receptor 1 czynnika martwicy nowotworu) i TNFR-2 (receptor 2 czynnika martwicy nowotworu). W niektórych wykonaniach przeciwciało anty-CD40 nie wykazuje żadnego godnego zauważenia specyficznego wiązania z jakimkolwiek innym białkiem, innym niż CD40. Selektywność przeciwciała anty-CD40 w stosunku do CD40 można określać stosując metody dobrze znane w dziedzinie, postępując zgodnie ze wskazaniami tego szczegółowego opisu. Przykładowo, selektywność można określać stosując Western blot, FACS, ELISA lub RIA (zobacz np. Przykład 5).
Identyfikacja epitopów CD40 rozpoznawanych przez przeciwciało anty-CD40
Wynalazek dostarcza ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-CD40, które wiąże CD40 i konkuruje krzyżowo z i/lub wiąże ten sam epitop i/lub wiąże się z CD40 z tą samą stałą KD jak ludzkie przeciwciało anty-CD40 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V. Niniejszym opisano także przeciwciało, które wiąże CD40 i konkuruje krzyżowo z i/lub wiąże ten sam epitop i/lub wiąże się z CD40 z tą samą stałą KD jak ludzkie przeciwciało wybrane spośród przeciwciał 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.2.1, 21.4.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K lub 24.2.1; lub ludzkiego przeciwciała anty-CD40, które obejmuje
PL 214 634 B1 zmienny region ciężkiego łańcucha, mający sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub ludzkiego przeciwciała anty-CD40, które obejmuje zmienny region lekkiego łańcucha, mający sekwencję aminokwasową SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102.
Stosując jakąkolwiek z metod znaną specjalistom, można określić czy przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem lub konkuruje krzyżowo o wiązanie z przeciwciałem anty-CD40. Na przykład, można pozwolić na związanie się przeciwciała anty-CD40 według wynalazku z CD40 w nasyconych warunkach, a następnie mierzyć zdolność badanego przeciwciała do wiązania CD40. Jeśli badane przeciwciało jest zdolne do wiązania się z CD40 w tym samym czasie co przeciwciało anty-CD40, wtedy badane przeciwciało wiąże się z różnymi epitopami jak przeciwciało anty-CD40. Jednakże, jeśli badane przeciwciało nie jest zdolne do wiązania się z CD40 w tym samym czasie, wtedy badane przeciwciało wiąże się z tym samym epitopem, pokrywającym się częściowo epitopem lub epitopem, który jest w bliskim sąsiedztwie epitopu wiązanego przez ludzkie przeciwciało anty-CD40. Doświadczenie to można wykonać stosując ELISA, RIA, FACS lub rezonans plazmonów powierzchniowych (zobacz np. Przykład VI). W bardziej korzystnym wykonaniu stosuje się BIAcore.
Powinowactwo wiązania przeciwciał anty-CD40 z CD40
Ujawnione niniejszym przeciwciała anty-CD40 wiążą CD40 z wysokim powinowactwem.
W szczególności przeciwciało przeciwko CD40 wiąże CD40 z KD wynoszącą 2 x 10-8 M lub mniejszą,
-9 -10 -11 korzystnie z KD wynoszącą 2 x 10-9, 2 x 10-10, 4 x 10-11 M lub mniejszą, najkorzystniej z KD wynoszącą 2,5 x 10-12 M lub mniejszą.
Przeciwciało według wynalazku wiąże CD40 z zasadniczo z taką samą KD jak przeciwciało
3.1.1 H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V.
Inne przeciwciała tu ujawnione wiążą CD40 z zasadniczo z taką samą KD jak przeciwciała wybrane spośród 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.2.1,
21.4.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K lub 24.2.1.
Przeciwciało ujawnione w niniejszym opisie może także wiązać CD40 z zasadniczo taką samą KD jak:
- przeciwciało obejmujące CDR2 lekkiego łańcucha i/lub CDR3 ciężkiego łańcucha z przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1,
21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1 L-C92A,
23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1;
- przeciwciało obejmujące region zmienny łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej
SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub
- przeciwciało obejmujące łańcuch lekki o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102;
- przeciwciało obejmujące CDR2 zmiennego regionu łańcucha lekkiego o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102 lub CDR3 zmiennego regionu łańcucha ciężkiego o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58,
66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98.
Niektóre z ujawnionych tu przeciwciał anty-CD40 mają niską szybkość dysocjacji. Przeciwciało anty-CD40 ujawnione niniejszym ma Koff wynoszącą 2,0 x 10-4 lub niższą, korzystniej Koff wynoszącą 2,0 x 107 lub niższą. Koff dla przeciwciała według wynalazku ma zasadniczo taką samą wartość co dla przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V. W przypadku innych opisanych tu przeciwciał wartość Koff zasadniczo ma taką wartość, jak przeciwciało wybrane spośród 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 21.4.1, 22.1. 1HC109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1.
Przeciwciało ujawnione w niniejszym opisie może także wiązać CD40 z zasadniczo taką samą
Koff-jak:
- przeciwciało obejmujące CDR3 ciężkiego łańcucha lub CDR2 lekkiego łańcucha z przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1;
- przeciwciało obejmujące region zmienny ciężkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub obejmujące region zmienny
PL 214 634 B1 lekkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76,
84, 94, 100 lub 102;
- przeciwciało obejmujące CDR2 zmiennego regionu lekkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100 lub 102 lub CDR3 regionu zmiennego ciężkiego łańcucha o sekwencji aminokwasowej SEKW. NR ID.: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78, 86, 90, 92, 96 lub 98.
Powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji przeciwciała przeciwko CD40 w stosunku do CD40 można określać za pomocą każdej metody znanej w dziedzinie. Powinowactwo wiązania można mierzyć za pomocą testów współzawodnictwa typu ELISA, RIA lub rezonansu plazmonów powierzchniowych, takiego jak BIAcore. Szybkość dysocjacji można również mierzyć za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych. Korzystnie powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się za pomocą rezonansu plazmonów powierzchniowych. Bardziej korzystnie powinowactwo wiązania i szybkość dysocjacji mierzy się za pomocą BIAcore™. Zobacz np. Przykład XIV.
Zastosowanie genu łańcucha lekkiego i ciężkiego
Przeciwciało anty-CD40 może obejmować ludzki lekki łańcuch kappa lub lambda lub pochodzącą od nich sekwencję aminokwasową. W przypadku lekkiego łańcucha kappa, domena zmienna lekkiego łańcucha (VL) jest kodowana w części przez ludzki gen VKA3/A19 (DPK-15), L5 (DP5) lub A27 (DPK-22).
VL przeciwciała anty-CD40 może zawierać jedno lub więcej podstawień aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. VL przeciwciała anty-CD40 może obejmować 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 podstawień aminokwasowych w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. W niektórych przypadkach, jedno lub większa liczba tych podstawień w stosunku do linii zarodkowej znajduje się w regionach CDR lekkiego łańcucha. Podstawienia aminokwasowe w stosunku do linii zarodkowej są w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji jak podstawienia względem linii zarodkowej w każdym jednym lub w większej liczbie VL przeciwciał: 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1. Przykładowo VL przeciwciała anty-CD40 może zawierać jedno lub więcej podstawień aminokwasowych względem linii zarodkowej, znajdującej się w przeciwciele 21.4.1 i innych podstawień aminokwasowych względem linii zarodkowej, znajdujących się w przeciwciele 10.8.3, które wykorzystuje ten sam gen VK jak przeciwciało 21.4.1. Zmiany aminokwasowe mogą być takie same w jednej lub w większej liczbie pozycji, ale obejmują inną mutację niż ta w przeciwciele referencyjnym.
Zmiany aminokwasowe względem linii zarodkowej mogą powstawać w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji jak w każdym VL przeciwciała 3.1.1, 3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.IL-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1, ale mogą reprezentować konserwatywne podstawienia aminokwasowe w tej pozycji(ach) w stosunku do aminokwasu w przeciwciele referencyjnym. Przykładowo, jeśli konkretna pozycja w jednym z tych przeciwciał jest zmieniona w stosunku do linii zarodkowej i jest to glutaminian, można w tej pozycji konserwatywnie podstawić asparaginian. Podobnie, jeśli aminokwasowym podstawieniem w stosunku do linii zarodkowej jest seryna, można w tej pozycji konserwatywnie podstawić treoninę zamiast seryny. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe są omówione powyżej.
Łańcuch lekki ludzkiego przeciwciała anty-CD40 może obejmować sekwencję aminokwasową, która jest taka sama jak sekwencja aminokwasowa VL przeciwciała 3.1.1 (SEKW . NR ID.: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEKW. NR ID.: 94), 7.1.2 (SEKW. NR ID.: 12), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 20), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 28), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 36), 21.4.1 (SEKW. NR ID.: 44), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 52),
23.5.1 (SEKW. NR ID.: 60), 23.28.1 (SEKW. NR ID.: 68), 23.28.1L-C92A (SEKW. NR ID.: 100),
23.29.1 (SEKW. NR ID.: 76), 23.29.1L-R174K (SE KW . NR ID.: 102) lub 24.2.1 (SEKW. NR ID.: 84) lub omawiana sekwencja aminokwasowa posiadająca do 1, 2, 3, 4, 6, 8 lub 10 konserwatywnych podstawień aminokwasowych i/lub ogółem do 3 niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych.
Łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 opisanego niniejszym obejmuje co najmniej CDR2 łańcucha lekkiego i może również obejmować regiony CDR1 i CDR3 sekwencji linii zarodkowej, jak tu opisano. Lekki łańcuch może obejmować CDR1 i CDR2 przeciwciała niezależnie wybranego spośród
3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1 lub regiony CDR, z których każdy ma mniej niż 8, mniej niż 6, mniej niż 4 lub mniej niż 3 konserwatywne podstawienia aminokwasowe i/lub ogółem trzy lub mniej niekonserwatywne podstawienia aminokwasowe. Łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 może zawierać co
PL 214 634 B1 najmniej CDR2 łańcucha lekkiego, jak również regiony CDR1 i CDR3, z których każdy jest niezależnie wybrany z regionów CDR1 i CDR3 przeciwciała posiadającego zmienny region łańcucha lekkiego obejmujący sekwencję aminokwasową wybraną z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 lub 100 lub kodowaną przez cząsteczkę kwasu nukleinowego wybranego z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 lub 99.
Biorąc pod uwagę łańcuch ciężki, sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego łańcucha ciężkiego jest kodowana w części przez ludzki gen VH3-30+, VH 4-59, VH 1-02, VH 4.35 lub VH 3-30.3. VH przeciwciała anty-CD40 może zawierać jedno lub więcej podstawień aminokwasowych, delecji lub insercji (addycji) w stosunku do sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. Domena zmienna łańcucha ciężkiego może obejmować 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 lub 18 mutacji względem sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. Mutacja(e) mogą być niekonserwatywnymi podstawieniami w porównaniu z sekwencją aminokwasową linii zarodkowej i mogą występować w regionach CDR łańcucha ciężkiego. W niektórych przypadkach, zmiany aminokwasowe są wykonane w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji co mutacje z linii zarodkowej w dowolnym jednym lub w większej liczbie VH przeciwciał 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1. 1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1. Zmiany aminokwasowe występują w jednej lub w większej liczbie tych samych pozycji, ale obejmują inną mutację, niż w przeciwciele referencyjnym.
Łańcuch ciężki może obejmować sekwencję aminokwasową zmiennej domeny (VH) przeciwciała
3.1.1 (SEKW. NR ID.: 2), 3.1.1H-A78T (SEKW. NR ID.: 90), 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (SEKW. NR ID.: 92),
7.1.2 (SEKW. NR ID.: 10), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 18), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 26), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 34), 21.4.1 (SEKW. NR ID.: 42), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 50), 22.1.1H-C109A (SEKW. NR ID.: 96),
23.5.1 (SEKW. NR ID.: 58), 23.28.1 (SEKW. NR ID.: 66), 23.28.1H-D16E (SEKW. NR ID.: 98), 23.29.1 (SEKW. NR ID.: 74) i 24.2.1 (SEKW . NR ID.: 82) lub sekwencję aminokwasową posiadającą do 1, 2, 3, 4, 6, 8 lub 10 konserwatywnych podstawień aminokwasowych i/lub ogółem do 3 niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych.
Łańcuch ciężki może obejmować regiony CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego przeciwciał
3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A,
23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1 (jak przedstawiono na Fig. 1D-1H Iub 2D-2H) lub regiony CDR, z których każdy ma mniej niż 8, mniej niż 6, mniej niż 4 lub mniej niż 3 konserwatywne podstawienia aminokwasowe i/lub ogółem trzy lub mniej niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych.
Łańcuch ciężki może obejmować CDR3 oraz może również obejmować regiony CDR1 i CDR2 sekwencji linii zarodkowej, jak to opisano powyżej lub może obejmować CDR1 i CDR2 przeciwciała, z których każde jest niezależnie wybrane spośród przeciwciała obejmującego łańcuch ciężki przeciwciała wybranego z 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1. Łańcuch ciężki może obejmować CDR3 i również regiony CDR1 i CDR2, z których każdy jest niezależnie wybrany z regionu CDR1 i CDR2 zmiennego regionu łańcucha ciężkiego obejmującego sekwencję aminokwasową wybraną spośród SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 (jak przedstawiono na Fig. 1D-1H lub Fig. 2D-2H) lub kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego wybranego spośród SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 lub 97. Przeciwciało może również obejmować łańcuch ciężki i łańcuch lekki, jak opisano powyżej.
Jeden typ podstawienia aminokwasowego, który można wykonać, to zmiana jednej lub większej liczby cystein w przeciwciele, które mogą być chemicznie reaktywne, na inną resztę, nieograniczająco, taką jak, alanina lub seryna. Podstawienie cysteiny może być wykonane w regionie zrębowym domeny zmiennej lub w domenie stałej przeciwciała. Cysteina ta może występować w niekanonicznym regionie przeciwciała. Inny typ podstawienia aminokwasowego, który można wykonać to zmiana jakichkolwiek potencjalnych miejsc proteolitycznych w przeciwciele, zwłaszcza tych, które występują w regionie zrębowym domeny zmiennej, w domenie stałej przeciwciała lub w niekanonicznym regionie przeciwciała. Podstawienie reszt cysteinowych i usunięcie miejsc proteolitycznych może obniżyć ryzyko każdej heterogenności w produkcie przeciwciała i w ten sposób zwiększać jego homogenność. Inny typ podstawienia aminokwasowego to eliminacja par asparagina-glicyna, tworzących potencjalne miejsca deamidacji, przez zmianę jednej lub obu reszt. Korzystnie jest to wykonywane w regionach zrębowych, domeny stałej lub regionów niekanonicznych przeciwciała.
PL 214 634 B1
Aktywacja CD40 przez przeciwciało anty-CD40
Przeciwciało anty-CD40 może być przeciwciałem aktywującym, tj. agonistą CD40. Przeciwciało aktywujące zwiększa lub zastępuje oddziaływania CD40L na CD40. Przeciwciało aktywujące może być zasadniczo naśladowcą CD40L i konkuruje z CD40L o wiązanie z CD40. W niektórych wykonaniach, przeciwciało nie konkuruje z CD40L o wiązanie z CD40, ale powiela skutek wiązania CD40L z CD40. W niektórych wykonaniach, przeciwciało anty-CD40 aktywuje CD40 w obecności lub przy braku CD40L.
Zahamowanie in vivo wzrostu guza przez przeciwciała anty-CD40
Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku hamuje proliferację komórek guza in vitro lub wzrost guza in vivo.
Przeciwciało według wynalazku może hamować wzrost guza o co najmniej 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%. W niektórych wykonaniach, przeciwciało może hamować wzrost guza o co najmniej 75%. Zahamowanie wzrostu guza może być wykrywalne 14 dni po początkowym podaniu przeciwciała lub 7 dni po początkowym podaniu przeciwciała. Przeciwciało przeciwko CD-40 można podawać zwierzęciu wraz z innym przeciwneoplastycznym czynnikiem. Czynnik przeciwneoplastyczny hamuje dalej wzrost guza. W niektórych wykonaniach czynnikiem przeciwneoplastycznym jest adriamycyna lub taksol. Jednoczesne podawanie czynnika przeciwneoplastycznego i przeciwciała anty-CD40 hamuje wzrost guza o co najmniej 50%, po okresie 22-24 dni od początkowego podania, w porównaniu do wzrostu guza u zwierzęcia nie leczonego.
Indukcja apoptozy przez przeciwciała anty-CD40
Opisane tu przeciwciała anty-CD40 indukują śmierć komórkową komórek dodatnich względem CD40. W niektórych wykonaniach przeciwciało powoduje apoptozę komórek dodatnich względem CD40 zarówno in vivo jak i in vitro.
Wzmocnienie wyrażania cząsteczek z powierzchni komórki
Przeciwciało anty-CD40 może wzmacniać ekspresję cząsteczek na powierzchni komórek B, w tym ale nie jedynie, ICAM, MHC-II, B7-2, CD71, CD23 i CD83. 1 μg/ml przeciwciała może wzmacniać wyrażanie ICAM. w teście podwyższonej regulacji cząsteczek na powierzchni komórek B w krwi pełnej, co najmniej dwukrotnie lub co najmniej czterokrotnie. 1 μg/ml przeciwciała może też wzmacniać ekspresję MHC-II, w teście podwyższonej regulacji cząsteczek na powierzchni komórek B w krwi pełnej, co najmniej dwukrotnie lub co najmniej trzykrotnie. 1 μg/ml przeciwciała może też wzmacniać ekspresję CD23, w teście podwyższonej regulacji cząsteczek z powierzchni komórek B w krwi pełnej, co najmniej dwukrotnie lub co najmniej pięciokrotnie. Zobacz np. Przykład VII, Tabela 25.
Ujawnione niniejszym przeciwciało anty-CD40 wzmacnia ekspresję cząsteczek z powierzchni komórki dendrytycznej, w tym lecz nie wyłącznie, MHC-II, ICAM, B7-2, CD83 i B7-1. Zakres regulacji jest podobny do zakresu regulacji obserwowanego w komórkach B. Zobacz np. Tabele 25 i 26, poniżej. Przeciwciało korzystnie zwiększa poziom wyrażania cząsteczek, takich jak B7-2 i MHC-II, na powierzchni komórki dendrytycznej w porównaniu do poziomu wyrażania tych cząsteczek z komórek B. Zobacz, np. Tabela 27.
Wzmocnienie wydzielania cytokin komórkowych
Przeciwciało tu ujawnione może zwiększać komórkowe wydzielanie cytokin, w tym lecz nie wyłącznie, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18 i IL-23.
Przeciwciało może zwiększać wydzielanie cytokin przez komórki dendrytyczne i adherentne monocyty. Wytwarzanie cytokin jest ponadto wzmacniane przez ko-stymulację jednym lub większą liczbą LPS, IFN-γ lub IL-1 β. Przeciwciało tu ujawnione wraz z ko-stymulacją przez LPS wzmaga wytwarzanie IL-12p70 w teście komórek dendrytycznych z EC50 wynoszącym około 0,48 μg/ml. Przeciwciało może zwiększać wytwarzanie IL-12p40 w komórkach dendrytycznych z EC50 wynoszącym około 0,21 μg/ml. (Zobacz, np. Przykład VIII).
Przeciwciało może zwiększać wydzielanie IFN-gamma przez komórki T w teście typu allogeniczna komórka T/komórka dendrytyczna, jak opisano w Przykładzie VIII. Przeciwciało może zwiększać wydzielanie IFN-gamma w teście typu allogeniczna komórka T/komórka dendrytyczna z EC50 wynoszącym około 0,3 μg/ml, około 0,2 μg/ml około 0,03 μg/ml.
Sposoby wytwarzania przeciwciał i linie komórkowe wytwarzające przeciwciała
Immunizacja
Ludzkie przeciwciała mogą być wytwarzane przez immunizowane zwierzę, niebędące człowi ekiem, zawierające w swoim genomie niektóre lub wszystkie Ioci ciężkiego łańcucha i lekkiego łańcuPL 214 634 B1 cha ludzkiej immunoglobuliny z antygenem CD40. Niebędącym człowiekiem zwierzę stanowi mysz
XenoMouse™.
Myszy XenoMouse™ są skonstruowanymi rodzajami myszy zawierającymi duże fragmenty Ioci łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny, a jednocześnie ich zdolność do wytwarzania mysich przeciwciał została upośledzona. Zobacz, np. Green i wsp., Nature Genetics 7:13-21 (1994) i patenty USA nr 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364, 6162963 i 6150584. Zobacz również WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 i WO 00/037504.
Niniejszym opisano sposób wytwarzania przeciwciał anty-CD40 u zwierząt niebędących człowiekiem i niebędących myszą, przez immunizowanie transgenicznych zwierząt, niebędących ludźmi, które zawierają Ioci ludzkiej immunoglobuliny z antygenem CD40. Zwierzęta takie można konstruować stosując sposoby opisane w powyżej cytowanych dokumentach. Sposoby ujawnione w tych dokumentach mogą być modyfikowane, jak to opisano w patencie USA nr 5994619. Korzystne zwierzęta stanowią szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie.
Myszy XenoMouse™ wytwarzają dojrzały jak ludzki zestaw w pełni ludzkich przeciwciał i wytwarzają antygenowo swoiste ludzkie przeciwciała. Myszy XenoMouse™ mogą zawierać około 80% zestawu genów ludzkiego przeciwciała V, dzięki wprowadzeniu fragmentów Ioci ludzkiego ciężkiego łańcucha i Ioci lekkiego łańcucha kappa o konfiguracji linii zarodkowej i wielkości mega par zasad, umieszczonych na sztucznym chromosomie drożdży (YAC). Zobacz Mendez i wsp., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green i Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) i WO 98/24893.
Zwierzęta niebędące ludźmi zawierające geny ludzkiej immunoglobuliny mogą być zwierzętami mającymi „minilocus” ludzkiej immunoglobuliny. W podejściu z minilocus, egzogenny locus Ig naśladowany jest przez włączenie indywidualnych genów z locus Ig. W ten sposób jeden lub więcej genów VH, jeden lub więcej genów DH, jeden lub więcej genów JH, stała domena mu i druga stała domena (korzystnie stała domena gamma) tworzą formę konstruktu do wprowadzenia zwierzętom. Podejście to jest opisane między innymi, w patentach USA nr 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669, 5612205, 5721367, 5789215, i 5643763.
Korzyścią podejścia z minilocus jest szybkość z jaką można tworzyć konstrukty zawierające części locus Ig i wprowadzać do zwierząt. Jednakże, potencjalnie niekorzystna w podejściu z multilocus jest możliwość niewystarczającej różnorodności immunoglobulin, wspierającej pełny rozwój komórek B, tak że poziom wytwarzania przeciwciał może być niższy.
Niniejszym opisano sposób otrzymywania humanizowanych przeciwciał anty-CD40. W tym podejściu niebędące ludźmi zwierzęta są immunizowane antygenem CD40, jak to opisano poniżej, w warunkach, które pozwalają na wytwarzanie przeciwciała. Komórki wytwarzające przeciwciało są izolowane ze zwierząt, łączone w fuzje z komórkami szpiczaka w celu utworzenia hybrydoma i izolowane są kwasy nukleinowe kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała anty-CD40 będącego przedmiotem zainteresowania. Kwasy nukleinowe są następnie poddawane manipulacji z zastosowaniem technik znanych specjalistom w dziedzinie, i jak opisano poniżej, w celu ograniczenia ilości sekwencji niebędących ludzkimi, tj. humanizowania przeciwciał, tak aby ograniczyć odpowiedź immunologiczną u ludzi.
Antygenem CD40 może być izolowany i/lub oczyszczony CD40. W korzystnym wykonaniu, antygen CD40 jest ludzkim CD40. Antygen CD40 może być fragmentem CD40, takim jak zewnątrzkomórkowa domena CD40. Korzystnie fragment CD40 obejmuje co najmniej jeden epitop CD40. Jednakże antygen CD40 może być komórką, która na swojej powierzchni wyraża lub nadeksprymuje CD40 lub jego immunogenny fragment. Antygen CD40 może być też białkiem fuzyjnym CD40.
Immunizację zwierząt można przeprowadzać za pomocą każdej metody znanej w dziedzinie. Zobacz np. Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Sposoby immunizowania niebędących ludźmi zwierząt, takich jak myszy, szczury, owce, kozy, świnie, bydło i konie są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Harlow i Lane, powyżej, i patent USA nr 5994619. Antygen CD40 podawany jest z adiuwantem w celu stymulowania odpowiedzi immunologicznej. Przykładowe adiuwanty obejmują kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda, RIBI (dipeptydy muramylowe) lub ISCOM (kompleksy immunostymulujące). Adiuwanty takie mogą chronić polipeptyd przed szybkim rozproszeniem przez jego oddzielenie w miejscowym depozycie lub mogą zawierać substancje stymulujące gospodarza do wydzielania czynników chemotaktycznych dla makrofa22
PL 214 634 B1 gów i innych czynników układu odpornościowego. Korzystnie polipeptyd jest podawany według schematu immunizacji obejmującego dwa lub większą liczbę podań polipeptydu, na przestrzeni kilku tygodni.
P r z y k ł a d I opisuje wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał anty-CD40.
Wytwarzanie przeciwciał i linii komórkowych wytwarzających przeciwciała
Po immunizacji zwierzęcia antygenem CD40, ze zwierzęcia można otrzymywać przeciwciała i/lub komórki wytwarzające przeciwciała. Surowicę zawierającą przeciwciało anty-CD40 otrzymuje się ze zwierzęcia przez skrwawienie lub bezbolesne uśmiercenie zwierzęcia. Surowicę można wykorzystać w formie w jakiej została otrzymana ze zwierzęcia, można też otrzymać frakcję immunoglobulin lub oczyścić z surowicy przeciwciała anty-CD40. Specjalistom w dziedzinie wiadomo, że otrzymane w ten sposób surowica lub immunoglobuliny są poliklonalne. Stosowanie poliklonalnych przeciwciał przygotowanych z surowicy jest niekorzystne, ponieważ ilość przeciwciał, które można otrzymać jest ograniczona, a przeciwciało poliklonalne posiada szereg heterogennych właściwości.
Unieśmiertelnione linie komórkowe wytwarzające przeciwciała przygotowywane są z komórek izolowanych z immunizowanego zwierzęcia. Po immunizacji, zwierzę jest bezboleśnie uśmiercane, a węzły chłonne i/lub komórki B śledziony poddawane są procesom unieśmiertelniania. Sposoby unieśmiertelniania komórek obejmują, między innymi, transfekowanie ich onkogenami, modulowanie wirusem onkogennym przez hodowanie w warunkach selekcjonujących komórki nieśmiertelne, poddawanie ich działaniu czynników rakotwórczych i mutagennych, fuzję z komórką unieśmiertelnioną, np. komórką szpiczaka i inaktywację genu supresorowego nowotworu. Zobacz np. Harlow i Lane, powyżej. Jeśli stosowana jest fuzja komórkami szpiczaka, korzystnie komórki szpiczaka nie wydzielają polipeptydów immunoglobulin (nie-wydzielnicza linia komórkowa). Komórki unieśmiertelnione przeszukiwane są przy użyciu CD40, jego części lub komórki wyrażającej CD40. Wstępne przeszukiwanie można wykonać stosując test enzymo-immunologiczny (ELISA) lub test radioimmunologiczny. Przykład badania testem ELISA dostarcza WO 00/37504.
Komórki wytwarzające przeciwciało anty-CD40, np. hybrydoma, są wybrane, klonowane i analizowane dalej pod kątem pożądanych cech charakterystycznych, włączając silny wzrost, wysoki poziom wytwarzania przeciwciała i pożądane cechy charakterystyczne przeciwciała, jak omówiono poniżej. Hybrydoma mogą być namnażane in vivo w zwierzętach syngenicznych, w zwierzętach bez układu odpornościowego, np. w nagich myszach lub in vitro w hodowli tkankowej. Sposoby selekcji, klonowania i namnażania hybrydoma są dobrze znane specjalistom w dziedzinie.
Korzystnie immunizowane zwierzę jest zwierzęciem, niebędącym człowiekiem, które wyraża geny ludzkich immunoglobulin, a komórki B śledziony są w fuzji z linią komórkową szpiczaka z tego samego gatunku, co zwierzę, niebędące człowiekiem. Korzystniej, immunizowane zwierzę jest myszą XenoMouse™, a linia komórkowa szpiczaka pochodzi z nie-wydzielniczego szpiczaka mysiego. Bardziej korzystnie linia komórkowa szpiczaka jest linią P3-X63-AG8.653. Zobacz np. Przykład I.
Niniejszym opisano hybrydoma, wytwarzające przeciwciało anty-CD40. Hybrydoma są korzystnie hybrydoma mysimi, jak to opisano powyżej. Hybrydoma mogą być wytwarzane w gatunkach innych niż człowiek i mysz, a mianowicie w takich jak szczury, owce, świnie, kozy, bydło i konie. W innym wykonaniu, hybrydoma są hybrydoma ludzkimi.
Kwasy nukleinowe, wektory, komórki gospodarza i rekombinacyjne sposoby wytwarzania przeciwciał
Kwasy nukleinowe
Przedmiotem wynalazku są cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciała anty-CD40.
Różne cząsteczki kwasów nukleinowych mogą kodować łańcuch ciężki i łańcuch lekki immunoglobuliny anty-CD40. Jednakże łańcuch ciężki i łańcuch lekki immunoglobuliny anty-CD40 mogą być kodowane tą samą cząsteczką kwasu nukleinowego.
Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca zmienną domenę łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję ludzkiego genu VKA3/A19(DPK-15), L5(DP5) lub A27(DPK-22) lub sekwencję pochodną. Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową genu VKA3/A19 i genu JK1, JK2 lub JK3 lub sekwencje pochodne. Cząsteczka kwasu nukleinowego może również obejmować sekwencję nukleotydową genu VKL5 i genu JK4. Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować ponadto sekwencję nukleotydową genu A27 VK i genu JK3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego, kodująca łańcuch lekki koduje sekwencję aminokwasową, która obejmuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 mutacji z sekwencji aminokwasowej linii zarodkowej. Cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwaPL 214 634 B1 sową VL obejmującą 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych i/lub 1, 2 lub 3 niekonserwatywne podstawienia w porównaniu z linią zarodkową. Podstawienia mogą znajdować się w regionach CDR, regionach zrębowych lub w domenie stałej.
Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca domenę zmienną łańcucha lekkiego (VL) koduje sekwencję aminokwasową VL obejmującą jedną lub większą liczbę mutacji w porównaniu z sekwencją linii zarodkowej, które są identyczne z mutacjami znajdującymi się w VL jednego z przeciwciał 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A,
23.29.1 i 24.2.1. Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować co najmniej trzy mutacje aminokwasowe w porównaniu z sekwencją linii zarodkowej znalezioną w VL jednego z przeciwciał 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i 24.2.1.
Ponadto, cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową VL przeciwciała monoklonalnego 3.1.1 (SEKW. NR ID.: 4), 3.1.1L-L4M-L83V (SEKW. NR ID.: 94), 7.1.2 (SEKW. NR ID.: 12), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 20), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 28), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 36), 2.1.4.1 (SEKW. NR ID.: 44), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 52), 23.5.1 (SEKW. NR ID.: 60), 23.28.1 (SEKW. NR ID.: 68), 23.28.1L-C92A (SEKW. NR ID.: 100),
23.29.1 (SEKW. NR ID.: 76) lub 24.2.1 (SEKW. NR ID.: 84) lub jej część. Część ta obejmuje co najmniej region CDR3. Kwas nukleinowy może kodować także sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego regionów CDR omawianego przeciwciała. Wyżej wskazana część sekwencji aminokwasowej jest częścią ciągłą obejmującą CDR1-CDR3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 lub 100 lub taką sekwencję bez sekwencji sygnałowej. Cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 lub 99 lub jej część, przy czym omawiane sekwencje ewentualnie nie posiadają sekwencji sygnałowej.
Wyżej wskazana część korzystnie koduje region VL lub koduje co najmniej region CDR2. Kwas nukleinowy może kodować sekwencję aminokwasową regionów CDR łańcucha lekkiego omawianego przeciwciała. Korzystnie wyżej wskazana część koduje ciągły region z CDR1-CDR3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować sekwencję aminokwasową VL, która jest co najmniej w 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% lub 99% identyczna z sekwencją aminokwasową VL dowolnego z przeciwciał 3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1,
23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 lub 24.2.1 lub sekwencją aminokwasową VL dowolnej z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52. 60. 68, 76. 84, 94 lub 100. Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmują kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ostrych warunkach, takich jak te opisane powyżej, z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94 lub 100 lub posiadającą sekwencję kwasu nukleinowego z SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93 lub 99.
Kwas nukleinowy może kodować łańcuch lekki pełnej długości przeciwciała wybranego spośród
3.1.1, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K lub 24.2.1 lub łańcuch lekki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80, 88, 94, 100 lub 102 lub łańcuch lekki obejmujący mutację, taką jak tu ujawniona. Ponadto, kwas nukleinowy może obejmować sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.: 7, 15, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79 lub 87 lub cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch lekki obejmujący mutację, taką jak tu ujawniona.
Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego koduje domenę zmienną łańcucha ciężkiego (VH), która obejmuje sekwencję ludzkiego genu VH 3-30+, 4-59, 1-02, 4.35 lub 3-30.3 lub jej pochodną sekwencję. Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować ludzki gen VH3-30+, gen D4 (DIR3) i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen D1-26 (DIR5) i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 4.35, ludzki gen DIR3 i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 4-59, ludzki gen D4-23 i ludzki gen JH4; ludzki gen VH 1-02, ludzki gen DLR1 ludzki gen JH4; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen D6-19 (DIR3) i ludzki gen JH4; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen Dl-1 i ludzki gen Jh6; ludzki gen VH 3-30+, ludzki gen D4-17 i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 3-30.3, ludzki gen D4-17 i ludzki gen JH6; ludzki gen VH 4-59, ludzki gen D4-17 (DIR1) i ludzki gen JH5 lub sekwencję pochodzącą z ludzkich genów.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować sekwencję aminokwasową obejmującą 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 lub 18 mutacje w porównaniu z sekwencją aminokwaso24
PL 214 634 B1 wą linii zarodkowej ludzkich genów V, D lub J. Omawiane mutacje mogą występować w regionie VH, a niektórych wykonaniach omawiane mutacje występują w regionach CDR.
Cząsteczka kwasu nukleinowego koduje jedną lub większą liczbę mutacji aminokwasowych w porównaniu z sekwencją linii zarodkowej, które są identyczne z mutacjami aminokwasowymi obecnymi w VH przeciwciała monoklonalnego 3.1.1, 3.1.1 H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3,
15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 lub
24.2.1. Kwas nukleinowy koduje co najmniej trzy mutacje aminokwasowe w porównaniu z sekwencjami linii zarodkowej, które są identyczne z co najmniej trzema mutacjami aminokwasowymi obecnymi w wymienionych powyżej przeciwciałach monoklonalnych.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może obejmować sekwencję nukleotydową, która koduje co najmniej część sekwencji aminokwasowej VH Z przeciwciała 3.1.1 (SEKW. NR ID.: 2), 3.1.1H-A78T (SEKW. NR ID.: 90), 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (SEKW. NR ID.: 92), 7.1.2 (SEKW. NR ID.: 10), 10.8.3 (SEKW. NR ID.: 18), 15.1.1 (SEKW. NR ID.: 26), 21.2.1 (SEKW. NR ID.: 34), 21.4.1 (SEKW. NR ID.: 42), 22.1.1 (SEKW. NR ID.: 50), 22.1.1H-C109A (SEKW. NR ID.: 96), 23.5.1 (SEKW. NR ID.: 58),
23.28.1 (SEKW. NR ID.: 66), 23.28.1H-D16E (SEKW. NR ID.: 98), 23.29.1 (SEKW. NR ID.: 74) lub
24.2.1 (SEKW. NR ID.: 82) lub tę sekwencję z konserwatywnymi mutacjami aminokwasowymi i/lub sumarycznie trzema lub mniejszą liczbą niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych. Sekwencja może kodować jeden lub większą liczbę regionów CDR, korzystnie region CDR3, wszystkie trzy regiony CDR, ciągłą część obejmującą CDR1-CDR3 lub cały region VH, z lub bez sekwencji sygnałowej.
Cząsteczka kwasu nukleinowego tu opisana obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje sekwencję aminokwasową jednej spośród SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub tę sekwencję bez sekwencji sygnałowej. Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje co najmniej część sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 lub 97 lub tę sekwencję bez sekwencji sygnałowej. Korzystnie wyżej wskazana część koduje region VH (Z lub bez sekwencji sygnałowej), region CDR3, wszystkie trzy regiony CDR lub ciągły region obejmujący CDR1-CDR3.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może kodować sekwencję aminokwasową VH, która jest w co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% lub 99% identyczna z sekwencją aminokwasową VH przedstawioną na Fig. 1A-1C lub 2A-2C lub z dowolną sekwencją aminokwasową VH z SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98. Cząsteczki kwasu nukleinowego tu ujawnione obejmują kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w ostrych warunkach, takich jak te opisane powyżej, z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96 lub 98 lub mającą sekwencję kwasu nukleinowego z SEKW. NR ID.: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95 lub 97. Cząsteczka kwasu nukleinowego korzystnie obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje w ostrych warunkach, takich jak te opisane powyżej, z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą VH opisany tu powyżej.
Kwas nukleinowy może kodować łańcuch ciężki pełnej długości przeciwciała wybranego spośród 3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1 lub łańcuch ciężki obejmujący sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 6, 14, 22, 30, 38, 46, 54, 62, 70, 78 lub 86 lub łańcuch ciężki obejmujący mutację, taką jak jedna z omówionych tu mutacji. Ponadto, kwas nukleinowy może obejmować sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID.: 5, 13. 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85 lub 89 lub cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą łańcuch ciężki zawierający mutację, taką jak jedna z omówionych tu mutacji.
Cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującego łańcuch ciężki lub cały łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 lub jego część można wyizolować z dowolnego źródła wytwarzającego takie przeciwciało. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być izolowane z komórki B izolowanej ze zwierzęcia immunizowanego CD40 lub z unieśmiertelnionej komórki pochodzącej od takiej komórki B wytwarzającej przeciwciało anty-CD40. Sposoby izolowania mRNA kodującego przeciwciało są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz, np., Sambrook i wsp. mRNA można użyć do wytworzenia cDNA do zastosowania w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) lub klonowania cDNA genów przeciwciał.
Cząsteczka kwasu nukleinowego może być korzystnie wyizolowana z hybrydoma, której jednym z partnerów fuzji jest komórka wytwarzająca ludzką immunoglobulinę z transgenicznego zwierzęcia, niebędącego człowiekiem. Ponadto komórka wytwarzająca ludzką immunoglobulinę może być wyizoPL 214 634 B1 lowana ze zwierzęcia XenoMouse™. Komórka wytwarzająca ludzką immunoglobulinę może także pochodzić z transgenicznego zwierzęcia, niebędącego człowiekiem ani myszą, jak opisano powyżej. Kwas nukleinowy może być także wyizolowany ze zwierzęcia, które nie jest transgeniczne i nie jest człowiekiem. Cząsteczki kwasu nukleinowego wyizolowane ze zwierzęcia, które nie jest transgeniczne i nie jest człowiekiem można zastosować, np. do humanizowanych przeciwciał.
Kwas nukleinowy kodujący łańcuch ciężki przeciwciała anty-CD40 może obejmować sekwencję nukleotydową kodującą domenę VH połączoną w zgodnej ramce odczytu z sekwencją nukleotydową kodującą domenę stałą łańcucha ciężkiego z dowolnego źródła. Podobnie, cząsteczka kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40 może obejmować sekwencję nukleotydową kodującą domenę VL połączoną w zgodnej ramce odczytu z sekwencją nukleotydową kodującą domenę stałą łańcucha lekkiego z dowolnego źródła.
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego domenę zmienną łańcuchów ciężkiego (VH) i lekkiego (VL) są „przekształcane” w geny przeciwciał o pełnej długości. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego domeny VH lub VL są przekształcane w geny przeciwciał o pełnej długości przez wprowadzenie do wektora ekspresyjnego kodującego już, odpowiednio, domenę stałą łańcuch ciężkiego lub domenę stałą łańcucha lekkiego tak, że segment VH jest połączony funkcjonalnie z segmentem(ami) CH W wektorze, a segment VL jest połączony funkcjonalnie z segmentem CL W wektorze. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące domeny VH i/lub VL mogą być przekształcane w geny przeciwciał o pełnej długości przez łączenie, np. ligację, cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej domeny VH i/lub VL z cząsteczką kwasu nukleinowego kodującą domenę CH i/lub CL przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej. Sekwencje kwasu nukleinowego ludzkich genów domen stałych łańcucha ciężkiego i lekkiego immunoglobuliny są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz, np., Kabat i wsp., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Wyd. 5., NIH Publ. nr. 91-3242, 1991. Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące pełnej długości łańcuchy ciężki i/lub lekki mogą następnie ulegać ekspresji w komórce do której zostały wprowadzone i można izolować przeciwciało anty-CD40.
Cząsteczki kwasu nukleinowego można stosować do rekombinacyjnej ekspresji dużych ilości przeciwciał anty-CD40. Cząsteczki kwasu nukleinowego można także stosować do wytwarzania przeciwciał chimerycznych, przeciwciał biswoistych, przeciwciał jednołańcuchowych, immunoadhezyn, diprzeciwciał, przeciwciał zmutowanych i pochodnych przeciwciał, jak opisano poniżej. Jeśli cząsteczki kwasu nukleinowego nie pochodzą od człowieka, i nie pochodzą od transgenicznego zwierzęcia, cząsteczki kwasu nukleinowego można stosować do humanizacji przeciwciał, także jak opisano poniżej.
Cząsteczka kwasu nukleinowego opisana niniejszym jest stosowana jako sonda lub starter PCR dla specyficznej sekwencji przeciwciała. Przykładowo, kwas nukleinowy można zastosować jako sondę w sposobach diagnostycznych lub jako starter PCR do amplifikacji regionów DNA, które można użyć, między innymi, do izolacji cząsteczek kwasu nukleinowego kodującego domeny zmienne przeciwciał anty-CD40. Cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być oligonukleotydami. Oligonukleotydy pochodzą z wysoce zmiennych regionów łańcuchów ciężkiego i lekkiego przeciwciała. Oligonukleotydy mogą kodować wszystkie lub część jednego lub większej liczby CDR przeciwciał 3.1.1. 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1,
22.1.1, 22.1. 1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 lub 24.2.1.
Wektory
Niniejszym opisano wektory obejmujące cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują łańcuch ciężki przeciwciała anty-CD40 według wynalazku lub jego część wiążącą antygen, oraz wektory obejmujące cząsteczki kwasu nukleinowego, które kodują łańcuch lekki takich przeciwciał lub jego część wiążącą antygen. Niniejszym opisano także wektory obejmujące cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące białka fuzyjne, zmodyfikowane przeciwciała, fragmenty przeciwciał oraz ich sondy.
Przeciwciała anty-CD40 lub części wiążące antygen według wynalazku są wytwarzane przez wprowadzenie cząsteczek DNA kodujących część lub pełnej długości łańcuchy lekkie i ciężkie, uzyskane jak opisano powyżej, do wektorów ekspresyjnych tak, aby geny były funkcjonalnie połączone z koniecznymi do ekspresji sekwencjami kontrolnymi, takimi jak sygnały kontrolujące transkrypcję i translację. Wektory ekspresyjne obejmują plazmidy, retrowirusy, adenowirusy, wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV), wirusy roślinne, takie jak wirus mozaiki kalafiora, wirus mozaiki tytoniu, kosmidy, YAC, episomy pochodzące z EBV i podobne. Gen przeciwciała jest ligowany z wektorem tak, że sygnały kontrolujące transkrypcję i translację w wektorze pełnią swoją zamierzoną funkcję regulacji transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontrolujące ekspresję są wybrane tak, aby były właściwe dla stosowanych komórek gospodarza. Gen łańcucha lekkiego prze26
PL 214 634 B1 ciwciała i gen łańcucha ciężkiego przeciwciała można wprowadzać do oddzielnych wektorów, jednakże korzystnie oba geny są wprowadzone do tego samego wektora ekspresyjnego. Geny przeciwciał są wprowadzane do wektora ekspresyjnego przy pomocy standardowych metod (np. Iigacji komplementarnych miejsc restrykcyjnych we fragmencie z genem przeciwciała i w wektorze lub ligacji tępych końców jeśli nie ma miejsc restrykcyjnych).
Korzystnym wektorem jest taki, który koduje funkcjonalnie kompletną sekwencję CH lub CL ludzkiej immunoglobuliny, z odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi skonstruowanymi tak, aby można było z łatwością wprowadzić dowolną sekwencję VH lub VL i uzyskać jej ekspresję, jak opisano powyżej. W wektorach takich, splicing (składanie genu) zazwyczaj zachodzi pomiędzy miejscem donorowym splicingu we wprowadzonym regionie J i miejscem akceptorowym splicingu poprzedzającym domenę ludzkiego C, a także w regionach splicingu, które występuje w eksonach ludzkiego CH. Poliadenylacja i terminacja transkrypcji występuje w natywnych miejscach chromosomu poniżej regionów kodujących. Zrekombinowany wektor ekspresyjny także może kodować pojedyncze białko, które ułatwia wydzielanie łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała można sklonować w wektorze tak, aby pojedynczy peptyd był połączony w ramce odczytu z końcem N łańcucha immunoglobuliny. Peptyd sygnałowy może być immunoglobulinowym peptydem sygnałowym lub heterologicznym peptydem sygnałowym (tzn. peptydem sygnałowym z białka niebędącego immunoglobuliną).
Oprócz genów łańcucha przeciwciała, rekombinowane wektory ekspresyjne niosą sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Specjaliści w dziedzinie wiedzą, że schemat wektora ekspresyjnego, włączając wybór sekwencji regulacyjnych, może zależeć od czynników takich jak wybór komórki gospodarza do transformacji, żądanego poziomu wytwarzania białka itd. Korzystne sekwencje regulacyjne dla ekspresji w ssaczych komórkach gospodarza obejmują elementy wirusowe, które kierują wytwarzaniem wysokich poziomów białka w komórkach ssaka, takie jak promotory i/lub enhancery pochodzące z retrowirusowych LTR, cytomegalowirusa (CMV) (takie jak promotor/enhancer CMV), wirusa małpiego 40 (SV40) (takie jak promotor/enhancer SV40), adenowirusa (np. główny późny promotor adenowirusa (AdMLP)), poliomawirusa i silne promotory ssacze, takie jak promotory natywnej immunoglobuliny i aktyny. Dodatkowy opis wirusowych elementów regulacyjnych i ich sekwencji można znaleźć w np. patencie USA nr 5168062, patencie USA nr 4510245 i patencie USA nr 4968615. Sposoby wytwarzania przeciwciał w roślinach, włączając opis promotorów i wektorów, jak również transformacji roślin są znane specjalistom. Zobacz, np. patenty USA 6517529. Sposoby wytwarzania polipeptydów w komórkach bakterii lub w komórkach grzybów, np. komórkach drożdży, są także dobrze znane specjalistom w dziedzinie.
Oprócz genów łańcuchów przeciwciał i sekwencji regulacyjnych, rekombinowane wektory ekspresyjne według wynalazku mogą nieść dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórkach gospodarza (np. miejsca początku replikacji) i geny markerów selekcyjnych. Geny markerów selekcyjnych ułatwiają selekcję komórek gospodarza do których wprowadzono wektor (zobacz np. patent USA nr 4399216, 4634665 i 5179017). Przykładowo, gen markera selekcyjnego zazwyczaj nadaje komórce gospodarza, do której wprowadzono wektor, oporność na leki, takie jak G418, higromycyna lub metotreksat. Korzystne geny markerów selekcyjnych obejmują gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (do użycia w komórkach dhfr- z selekcją/amplifikacją z metotreksatem), gen neo (selekcja z G418) i gen syntetazy glutaminianowej.
Komórki gospodarza niebędące hybrydoma i sposoby wytwarzania zrekombinowanego białka
Cząsteczki kwasu nukleinowego kodującego przeciwciała anty-CD40 i wektory obejmujące te cząsteczki kwasu nukleinowego można użyć do transfekcji odpowiedniej ssaczej, roślinnej, bakteryjnej lub drożdżowej komórki gospodarza. Transformację można przeprowadzić dowolnym sposobem wprowadzania polinukleotydów do komórki gospodarza. Sposoby wprowadzania polinukleotydów heterologicznych do komórek ssaczych są dobrze znane specjalistom i obejmują transfekcję za pośrednictem dekstranu, wytrącanie fosforanem wapnia, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, fuzję protoplastów, elektroporację, zamykanie polynukleotydu(ów) w liposomach oraz bezpośrednią mikroiniekcję DNA do jądra. Dodatkowo cząsteczki kwasu nukleinowego można wprowadzać do komórek ssaczych za pomocą wektorów wirusowych. Sposoby transformacji komórek są dobrze znane specjalistom. Zobacz, np. patent USA nr 4399216, 4912040, 4740461 i 4959455 (które to patenty są tu włączone jako odniesienie). Sposoby transformacji komórek roślinnych są dobrze znane specjalistom, i obejmują, np. transformację za pośrednictwem Agrobacterium, transformację biolistyczną, iniekcję bezpośrednią, elektroporację i transformację wirusową. Metody transformacji komórek bakteryjnych i drożdżowych są dobrze znane specjalistom.
PL 214 634 B1
Linie komórek ssaczych dostępne jako gospodarze do ekspresji są dobrze znane w dziedzinie i obejmują wiele unieśmiertelnionych linii komórkowych dostępnych z American Type Culture Collection (ATCC). Obejmują one, między innymi, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO), komórki NSO, SP2, komórki HeLa, komórki nerki oseska chomika (BHK), komórki nerki małpy (COS), komórki ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (np. Hep G2), komórki A549 i szereg innych linii komórkowych. Szczególnie korzystne linie komórkowe są wybrane dzięki określeniu, które linie komórkowe dają wysokie poziomy ekspresji. Innymi liniami komórkowymi, które można zastosować są linie komórkowe owadów, takie jak komórki Sf9. Wówczas, gdy zrekombinowane wektory ekspresyjne kodujące geny przeciwciał są wprowadzane do ssaczych komórek gospodarza, przeciwciała są wytwarzane przez hodowanie komórek gospodarza przez taki okres czasu, który wystarcza na wyrażenie przeciwciała w komórkach gospodarza lub, korzystniej, wydzielenie przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której hodowane są komórki gospodarza. Przeciwciała można odzyskiwać z pożywki hodowlanej przy użyciu standardowych metod oczyszczania białek. Komórki gospodarza roślinnego obejmują komórki np. Nicotiana, Arabidopsis, rzęsy, kukurydzy, pszenicy, ziemniaków itd. Komórki bakteryjnego gospodarza obejmują komórki E. coli i gatunków Streptomyces. Komórki drożdżowego gospodarza obejmują komórki Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae i Piehia pastoris.
Ponadto, ekspresja przeciwciał według wynalazku (lub innych cząstek pochodzących od nich) w produkcyjnych liniach komórkowych można wzmocnić przy użyciu szeregu znanych technik. Przykładowo, powszechnym podejściem wzmocnienia ekspresji w pewnych warunkach jest zastosowanie systemu ekspresji genu syntetazy glutaminianowej (system GS). System GS jest omówiony w całości lub częściowo w połączeniu z patentem europejskim nr 0 216 846, 0 256 055 i 0 323 997 oraz zgłoszeniem patentu europejskiego nr 89303964.4.
Należy się spodziewać, że przeciwciała wyrażane w różnych liniach komórkowych lub w zwierzętach transgenicznych będą różniły się wzorem glikozylacji.
Zwierzęta i rośliny transgeniczne
Przeciwciała anty-CD40 według wynalazku można także wytwarzać transgenicznie przez wygenerowanie ssaka lub rośliny, transgenicznych pod względem będących przedmiotem zainteresowania sekwencji łańcucha ciężkiego i lekkiego, oraz przez wytwarzanie przeciwciał w taki sposób, że można je odzyskiwać. W przypadku transgenicznej produkcji u ssaków, przeciwciała anty-CD40 można wytwarzać, i odzyskiwać z mleka kóz, krów lub innych ssaków. Zobacz np. patent USA nr 5827690, 5756687, 5750172 i 5741957. W niektórych przypadkach, zwierzęta transgeniczne niebędące człowiekiem, które obejmują Ioci ludzkiej immunoglobuliny mogą być immunizowane CD40 lub jego immunogenną częścią, jak opisano powyżej. Sposoby wytwarzania przeciwciał w roślinach opisano np. w patentach USA nr 6046037 i US 5959177.
Transgeniczne zwierzęta niebędące człowiekiem lub rośliny są generowane przez wprowadzenie jednej lub większej liczby cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących przeciwciało antyCD40 według wynalazku do zwierzęcia lub rośliny standardowymi technikami transformacji. Zobacz Hogan i patent USA 6417429. powyżej. Komórki transgeniczne stosowane do generowania zwierząt transgenicznych mogą być embrionalnymi komórkami macierzystymi lub komórkami somatycznymi. Transgeniczne organizmy, niebędące człowiekiem, mogą być chimerycznymi, niechimerycznymi hetero-zygotami oraz niechimerycznymi homozygotami. Zobacz, np. Hogan i wsp., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual wyd. 2, Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson i wsp., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000) oraz Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). U niebędących człowiekiem transgenicznych zwierząt następuje kierowana dysrupcja i podmiana docelowym konstruktem, który koduje będące przedmiotem zainteresowania łańcuch ciężki i/lub łańcuch lekki. Zwierzęta transgeniczne mogą zawierać i wyrażać cząst eczki kwasu nukleinowego kodujące łańcuch lekki i ciężki swoiście wiążące CD40, korzystnie ludzkie CD40. Zwierzęta transgeniczne mogą zawierać cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące zmodyfikowane przeciwciało, takie jak przeciwciało jednołańcuchowe, przeciwciało chimeryczne lub przeciwciało humanizowane. Przeciwciała anty-CD40 mogą być wytwarzane w dowolnym zwierzęciu transgenicznym. W korzystnym wykonaniu, zwierzętami niebędącymi człowiekiem są myszy, szczury, owce, świnie, kozy, bydło lub konie. Transgeniczne zwierzę, niebędące człowiekiem, wyraża wyżej wskazane kodowane polipeptydy we krwi, mleku, moczu, ślinie, łzach, śluzie i w innych płynach ustrojowych.
PL 214 634 B1
Biblioteki prezentacji na fagu
Niniejszym opisano sposób wytwarzania przeciwciała anty-CD40 lub jego części wiążącej antygen, obejmującego etapy syntetyzowania biblioteki ludzkich przeciwciał na fagu, przeszukiwania biblioteki za pomocą CD40 lub jego części, izolowania faga wiążącego CD40 i uzyskiwania przeciwciał z faga. Przykładowo, jeden ze sposobów przygotowywania biblioteki przeciwciał, do zastosowania w technikach prezentacji na fagu, obejmuje etapy immunizowania niebędącego człowiekiem zwierzęcia, obejmującego Ioci ludzkiej immunoglobuliny, za pomocą CD40 lub jego części antygenowej w celu wytworzenia odpowiedzi odpornościowej, ekstrakcji z immunizowanego zwierzęcia komórek wytwarzających przeciwciało; wyizolowania RNA z wyekstrahowanych komórek, przepisania RNA na drodze odwrotnej transkrypcji w celu wytworzenia cDNA, amplifikowania cDNA przy użyciu startera i wprowadzenia cDNA do wektora do prezentacji na fagu tak, że przeciwciała są wyrażane na fagu. Tą drogą można uzyskiwać zrekombinowane przeciwciała anty-CD40 według wynalazku.
Zrekombinowane ludzkie przeciwciała anty-CD40 według wynalazku można izolować przez przeszukiwanie zrekombinowanej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał. Korzystnie biblioteka jest biblioteką z prezentacją na fagu scFv, generowaną przy użyciu cząsteczek cDNA dla VL i VH wytworzonych z mRNA wyizolowanego z komórek B. Metodologie przygotowywania i przeszukiwania takich bibliotek są znane w dziedzinie. Na rynku dostępne są zestawy do wytwarzania bibliotek z prezentacją na fagu (np. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nr kat. 27-9400-01 oraz zestaw prezentacji na fagu Stratagene SurfZAP™, nr kat. 240612). Istnieją również inne metody i odczynniki, które można stosować do wytwarzania i przeszukiwania związanych z przeciwciałami bibliotek z prezentacją na fagu (zobacz, np. patent USA nr 5223409; publikacja PCT nr WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs i wsp., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay i wsp., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse i wsp., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty i wsp., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths i wsp., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins i wsp., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson i wsp., Nature 352:624-628 (1991); Gram i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad i wsp., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom i wsp., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991) oraz Barbas i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)).
W celu wyizolowania ludzkich przeciwciał anty-CD40 o pożądanych właściwościach, ludzkie przeciwciało anty-CD40, jak tu opisano, jest najpierw stosowane do wybrania sekwencji ludzkiego łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego posiadających podobną aktywność wiązania z CD40, przy użyciu metod typu mapowania epitopu (ang. epitope imprinting), opisanych w publikacji PCT nr WO 93/06213. Biblioteki przeciwciał stosowane w tej metodzie korzystnie są bibliotekami scFv przygotowanymi i przeszukiwanymi jak opisano w publikacji PCT nr WO 92/01047, McCafferty i wsp., Nature 348:552-554 (1990) oraz Griffiths i wsp., EMBO J. 12:725-734 (1993). Biblioteki przeciwciał scFv są korzystnie przeszukiwane przy użyciu ludzkiego CD40 jako antygenu.
Po wyizolowaniu wstępnych domen ludzkich VL i VH, przeprowadzane są eksperymenty typu „mieszania i dopasowywania” (ang. mix and match), w których różne pary wstępnie wybranych segmentów VL i VH są przeszukiwane pod kątem wiązania z CD40, w celu wyselekcjonowania korzystnych kombinacji par VL/VH. Ponadto, do dalszego polepszenia jakości przeciwciała, segmenty VL i VH z korzystnych par(y) VL/VH można losowo mutować, korzystnie w regionie CDR3 z VH i/lub VL, w procesie analogicznym do procesu mutacji somatycznej in vivo, odpowiedzialnego za dojrzewanie powinowactwa przeciwciał podczas naturalnej odpowiedzi odpornościowej. To dojrzewanie powinowactwa in vitro można osiągnąć przez amplifikację domen VH i VL, przy użyciu starterów do PCR komplementarnych do VH CDR3 lub VL CDR3, odpowiednio, które to startery zostały „naszpikowane” losową mieszaniną czterech zasad nukleotydowych w pewnych pozycjach, tak że uzyskiwane produkty PCR kodują segmenty VH i VL, w których losowe mutacje są wprowadzone w regiony CDR3 VH i/lub VL. Takie losowo zmutowane segmenty VH i VL można ponownie przeszukiwać w badaniu przesiewowym pod kątem wiązania z CD40.
Po badaniu przesiewowym i izolacji przeciwciała anty-CD40 według wynalazku, z biblioteki prezentowanych zrekombinowanych immunoglobulin, kwasy nukleinowe kodujące wyselekcjonowane przeciwciało można odzyskiwać z prezentowanego pakietu (np. z genomu faga) i subklonować w wektorach ekspresyjnych z zastosowaniem standardowych technik rekombinacji DNA. Jeśli pożądane, kwas nukleinowy można następnie poddawać manipulacjom w celu otrzymania innych form przeciwciała, jak opisano poniżej. W celu wyrażenia zrekombinowanego ludzkiego przeciwciała, wyizolowanego przez przeszukiwanie biblioteki kombinatorycznej DNA, kodujące przeciwciało jest klonowane
PL 214 634 B1 w rekombinowanym wektorze ekspresyjnym i wprowadzane do komórek ssaczego gospodarza, jak opisano powyżej.
Przeliczanie klas
Niniejszym opisano sposób przekształcania klas i podklas przeciwciała anty-CD40 w inną klasę lub podklasę. Przy użyciu metod dobrze znanych w dziedzinie, izolowana jest cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca VL lub VH, która nie obejmuje żadnych sekwencji kwasu nukleinowego kodującego CL lub CH. Cząsteczka kwasu nukleinowego jest następnie łączona funkcjonalnie z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą CL lub CH z pożądanej klasy lub podklasy immunoglobuliny. Można to osiągnąć przy użyciu wektora lub cząsteczki kwasu nukleinowego, który obejmuje łańcuch CL lub CH, jak opisano powyżej. Przykładowo, przeciwciało anty-CD40, które pierwotnie było IgM można przełączyć w klasę IgG. Ponadto, przełączanie klas można zastosować do przekształcenia jednej podklasy IgG w inną np. IgG1 w IgG2. Inny sposób wytwarzania przeciwciała według wynalazku, obejmującego pożądany izotyp, obejmuje etapy izolowania kwasu nukleinowego, kodującego łańcuch ciężki przeciwciała anty-CD40 i kwasu nukleinowego kodującego łańcuch lekki przeciwciała anty-CD40, izolowania sekwencji kodującej region VH, ligacji sekwencji VH z sekwencją kodującą domenę stałą łańcucha ciężkiego pożądanego izotypu, ekspresji genu łańcucha lekkiego i konstruktu łańcucha ciężkiego w komórce i zebrania przeciwciała anty-CD40 o pożądanym izotypie.
Przeciwciała deimmunizowane
Inną drogą wytwarzania przeciwciał o zredukowanej immunogenności jest deimmunizacja przeciwciał. Przeciwciało może być deimmunizowane przy użyciu technik opisanych w np. publikacji PCT nr WO 98/52976 i WO 00/34317.
Przeciwciała zmutowane
Cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory i komórki gospodarza można stosować do wytworzenia zmutowanych przeciwciał anty-CD40. Przeciwciała można mutować w domenach zmiennych łańcuchów ciężkiego i/lub lekkiego np. w celu zmiany właściwości wiążących przeciwciała. Przykładowo, można wytworzyć mutację, w jednym lub większej liczbie regionów CDR, w celu podniesienia lub obniżenia KD przeciwciała wobec CD40, podniesienia lub obniżenia Koff lub zmiany swoistości wiązania przeciwciała. Techniki mutagenezy ukierunkowanej są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz np. Sambrook i wsp. oraz Ausubel i wsp. powyżej. Mutacje są wytwarzane w reszcie aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu z linią zarodkową w domenie zmiennej przeciwciała anty-CD40. Jedna lub większa liczba mutacji może być wytwarzana w reszcie aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu z linią zarodkową w regionie CDR lub w regionie zrębowym domeny zmiennej lub w domenie stałej przeciwciała monoklonalnego 3.1.1. 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A, 23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1. Jedna lub większa liczba mutacji może być otrzymywana w reszcie aminokwasowej, o której wiadomo, że jest zmieniona w porównaniu z linią zarodkową w regionie CDR lub w regionie zrębowym domeny zmiennej o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród SEKW. NR ID.: 4, 12, 20, 28, 36, 44, 52, 60, 68, 76, 84, 94, 100, 102, 2, 10, 18, 26, 34, 42, 50, 58, 66, 74, 82, 90, 92, 96, 98, 100 lub 102 lub której sekwencja nukleotydowa jest przedstawiona w SEKW. NR ID.: 3, 11, 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 93, 99, 101, 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 91, 95, 97, 99 lub 101.
Region zrębowy jest zmutowany tak, że uzyskany region(y) zrębowy posiada sekwencję aminokwasową odpowiadającego genu linii zarodkowej. Mutacje można wytworzyć w regionie zrębowym lub w domenie stałej w celu zwiększenia czasu półtrwania przeciwciała anty-CD40. Zobacz np. publikacja PCT nr WO 00/09560. Mutacja w regionie zrębowym lub w domenie stałej może być także wykonana w celu zmiany immunogenności przeciwciała, w celu dostarczenia miejsca kowalencyjnego lub niekowalencyjnego wiązania z inną cząsteczką lub w celu zmiany takich właściwości, jak utrwalenie kompleksu, wiązanie FcR i ADCC. Pojedyncze przeciwciało może mieć mutacje w jednym lub większej liczbie regionów zrębowych, w domenie stałej i w regionach zmiennych.
W domenach VH lub VL zmutowanego przeciwciała anty-CD40 może znajdować się od 1 do 18, włączając każdą liczbę pomiędzy, mutacji aminokwasowych w porównaniu z przeciwciałem anty-CD40 przed mutacją. Mutacje mogą wystąpić w jednym lub większej liczbie regionów CDR. Ponadto, każda z mutacji może być konserwatywnym podstawieniem aminokwasowym. W domenach zmiennych korzystnie występuje nie więcej niż 5, 4, 3, 2 lub 1 zmiana aminokwasowa.
PL 214 634 B1
Przeciwciała zmodyfikowane
Możliwe jest również otrzymanie fuzji przeciwciała lub immunoadhezyny, obejmującej całe lub część przeciwciała anty-CD40 według wynalazku w połączeniu z innym polipeptydem. Fuzja taka może zawierać tylko domeny zmienne przeciwciała anty-CD40 w połączeniu z polipeptydem. Domena VH przeciwciała anty-CD40 może być połączona z pierwszym polipeptydem, podczas gdy domena VL przeciwciała anty-CD40 może być połączona z drugim polipeptydem, który łączy się z pierwszym polipeptydem w taki sposób, że domeny VH i VL mogą oddziaływać ze sobą tworząc miejsce wiązania przeciwciała. Alternatywnie, domena VH może być oddzielona od domeny VL łącznikiem tak, że domeny VH i VL mogą oddziaływać jedna z drugą (zobacz poniżej pod: przeciwciała jednołańcuchowe). Przeciwciało VH-łącznik-VL jest następnie łączone z będącym przedmiotem zainteresowania polipeptydem. Fuzja przeciwciała jest przydatna w kierowaniu polipeptydu do komórki lub tkanki wyrażającej CD40. Polipeptyd może być czynnikiem terapeutycznym, takim jak toksyna, czynnikiem wzrostu lub innym białkiem regulacyjnym lub może być czynnikiem diagnostycznym, takim jak z łatwością uwidaczniany enzym, np. peroksydazą chrzanową. Dodatkowo można tworzyć fuzje przeciwciała, w których dwa (lub większa liczba) przeciwciał jednołańcuchowych jest łączona ze sobą. Jest to przydatne jeśli istnieje potrzeba otrzymania przeciwciała diwalentnego lub poliwalentnego, na pojedynczym łańcuchu polipeptydowym lub jeśli istnieje potrzeba otrzymania przeciwciała biswoistego.
W celu wytworzenia przeciwciała jednołańcuchowego, (scFv), fragmenty DNA kodujące VH i VL są połączone funkcjonalnie z innym fragmentem kodującym elastyczny łącznik, np. kodujący sekwencję aminokwasową (Gly4-Ser)3, tak, że sekwencje VH i VL można wyrażać jako ciągłe białko o pojedynczym łańcuchu, z domenami VL i VH połączonymi elastycznym łącznikiem. Zobacz np. Bird i wsp., Science 242:423-426 (1988); Huston i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty i wsp., Nature 348:552-554 (1990). Przeciwciało jednołańcuchowe może być monowalentne, jeśli użyte są tylko pojedyncze VH i VL, biwalentne, jeśli użyte są dwa VH i VL lub poliwalentne, jeśli użytych jest więcej VH i VL. Można wytwarzać przeciwciała bispecyficzne lub poliwalentne, które swoiście wiążą CD40 i inne cząsteczki.
Możliwe jest również przygotowanie innych zmodyfikowanych przeciwciał stosując cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące przeciwciało anty-CD40. Przykładowo, przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej, stosując wiedzę ze szczegółowego opisu, można wytwarzać cząsteczki typu „Kappa bodies” (I11 i wsp., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), „Minibodies” (Martin i wsp., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), „Diabodies” (Holliger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)) lub „Janusins” (Traunecker i wsp., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) Traunecker i wsp., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)).
Biswoiste przeciwciała lub fragmenty wiążące antygen można wytwarzać różnymi sposobami włączając fuzje hybrydoma lub łączenie fragmentów Fab'. Zobacz np. Songsivilai i Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny i wsp., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Dodatkowo, biswoiste przeciwciała można wytwarzać jako „diprzeciwciała” (ang. diabodies) lub „Janusins”. Przeciwciało biswoiste wiąże dwa różne epitopy z CD40. Przeciwciało biswoiste może mieć pierwszy łańcuch ciężki i pierwszy łańcuch lekki z przeciwciała monoklonalnego
3.1.1, 3.1.1H-A78T, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1,
21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.28.1L-C92A,
23.29.1, 23.29.1L-R174K i 24.2.1 oraz dodatkowy łańcuch ciężki i łańcuch lekki przeciwciała. Dodatkowy łańcuch lekki i łańcuch ciężki mogą także pochodzić z jednego z wymienionych powyżej przeciwciał monoklonalnych, lecz są inne od pierwszego łańcucha ciężkiego i lekkiego.
Opisane powyżej zmodyfikowane przeciwciała są przygotowywane przy użyciu jednej lub większej liczby domen zmiennych lub regionów CDR dostarczonego tu ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty-CD40, sekwencji aminokwasowej omawianego przeciwciała monoklonalnego lub łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego kodowanego przez sekwencję kwasu nukleinowego kodującą omawiane przeciwciało monoklonalne.
Przeciwciała derywatyzowane i znakowane
Przeciwciało anty-CD40 lub część wiążąca antygen według wynalazku można derywatyzować lub łączyć z inną cząsteczką (np. innym peptydem lub białkiem). Zazwyczaj, przeciwciała lub ich część jest derywatyzowana tak, że derywatyzacja lub znakowanie nie zaburzają wiązania CD40. Zatem, przeciwciała i części przeciwciała powinny obejmować zarówno niezmienione jak i zmodyfikowane formy opisanych tu ludzkich przeciwciał anty-CD40. Przykładowo przeciwciało lub część przeciwciała
PL 214 634 B1 według wynalazku mogą być połączone funkcjonalnie (przez sprzęganie chemiczne, fuzję genetyczną, łączenie niekowalencyjne lub inaczej) z jedną lub większą liczbą jednostek molekularnych, takich jak inne przeciwciało (np. przeciwciało biswoiste lub diprzeciwciało), czynnik do wykrywania, czynnik cytotoksyczny, czynnik farmaceutyczny i/lub białko lub peptyd, który pośredniczy w łączeniu przeciwciała lub części przeciwciała z innymi cząsteczkami (takimi jak region rdzenia streptawidyny lub znacznik polihistydynowy).
Jeden typ derywatyzowanego przeciwciała jest wytwarzany przez sieciowanie dwóch lub większej liczby przeciwciał (tego samego typu lub różnych typów, np. w celu stworzenia przeciwciała biswoistego). Stosowne łączniki sieciujące obejmują te, które są bifunkcyjne, posiadają dwie różnie reaktywne grupy oddzielone odpowiednim łącznikiem (np. estrem m-maleimidobenzoilo-N-hydroksysukcynoimidowym) lub są homobifunkcyjne (np. suberynian disukcynoimidylowy). Łączniki takie są dostępne z Pierce Chemical Company, Rockford, I11.
Innym typem derywatyzowanego przeciwciała jest przeciwciało znakowane. Przydatne wykrywane czynniki, którymi można derywatyzować przeciwciało według wynalazku lub jego część wiążącą antygen, obejmują związki fluorescencyjne, włączając fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceiny, rodaminę, chlorek 5-dimetylamino-1-naftalenosulfonylowy, fikoerytrynę, fosforylantanowcowe i tym podobne. Przeciwciało można także znakować przydatnymi w detekcji enzymami, takimi jak peroksydaza chrzanowa, β-galaktozydaza, lucyferaza, fosfataza alkaliczna, oksydaza glukozy i podobne. Gdy przeciwciało jest wyznakowane możliwym do wykrywania enzymem, jego detekcja odbywa się przez dodanie dodatkowych odczynników, które są wykorzystywane przez enzym do wytworzenia widocznego produktu reakcji. Przykładowo, kiedy obecna jest peroksydaza chrzanowa, dodanie nadtlenku wodoru i diaminobenzydyny prowadzi do powstania barwnego produktu reakcji. Przeciwciało można także wyznakować biotyną i wykrywać przez pośredni pomiar wiązania awidyny lub streptawidyny. Przeciwciało można także wyznakować określonym wcześniej epitopem polipeptydowym rozpoznawanym przez drugorzędową cząsteczkę reporteową (np. sekwencje pary suwaka leucynowego, miejsca wiązania dla drugorzędowych przeciwciał, domeny wiążące metal, znaczniki epitopowe). Znaczniki mogą być podłączone przez ramiona łącznikowe o różnej długości, w celu zredukowania potencjalnej zawady przestrzennej.
Przeciwciało anty-CD40 można także znakować aminokwasami wyznakowanymi radioaktywnie. Znacznik radioaktywny można zastosować zarówno do celów diagnostycznych, jak i terapeutycznych. Przykładowo, znacznik radioaktywny można zastosować do wykrywania guzów, wyrażających CD40, za pomocą promieniowania X lub innych technik diagnostycznych. Ponadto, znacznik radioaktywny można zastosować terapeutycznie jako toksynę dla komórki rakowej lub dla guzów. Przykłady znacz3 14 ników dla polipeptydów obejmują nieograniczająco następujące radioizotopy lub radionuklidy - 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.
Przeciwciało anty-CD40 może być poddane derywatyzacji grupą chemiczną, taką jak glikol polietylenowy (PEG), grupą metylową lub etylową, lub grupą węglowodanową. Grupy te są przydatne w polepszaniu właściwości biologicznych przeciwciała, np. w wydłużaniu okresu półtrwania w surowicy lub w polepszaniu wiązania z tkanką.
Kompozycie farmaceutyczne i zestawy
Ludzkie przeciwciało agonistyczne, anty-CD40, może stanowić składnik aktywny kompozycji do leczenia osobników wymagających immunostymulacji. Kompozycje takie są przydatne do leczenia, zapobiegania, redukcji częstości lub ciężkości zakażenia, włączając zakażenia wirusowe i bakteryjne, do leczenia zaburzeń hiperproliferacyjnych, włączając stany nowotworowe i przed nowotworowe, do leczenia stanów genetycznego niedoboru odpornościowego, takich jak zespół hiper-IgM oraz do leczenia pierwotnych i mieszanych stanów niedoboru odpornościowego, włączając stany charakteryzujące się neutropenią, u ssaków w tym ludzi. Osobniki poddawane terapii agonistycznym przeciwciałem anty-CD40 obejmują dowolnego osobnika potrzebującego wzmocnienia odporności, w tym lecz nie wyłącznie, w podeszłym wieku oraz osobniki z obniżoną odpornością, przykładowo po chemioterapii.
Zaburzenia hiperproliferacyjne, które można leczyć przeciwciałem agonistycznym anty-CD40, mogą dotyczyć dowolnej tkanki lub narządu i obejmują, lecz nie ograniczają się do, raka mózgu, płuc, komórki płaskiej nabłonka, pęcherza, żołądka, trzustki, sutka, głowy, szyi, wątroby, nerki, jajnika, prostaty, okrężnico-odbytnicy, przełyku, ginekologicznego, nosogardła lub tarczycy, czerniaka, chłoniaka, białaczki lub czerniaka mnogiego. W szczególności, ludzkie przeciwciała agonistyczne anty-CD40 są przydatne do leczeniu raków sutka, prostaty, okrężnicy i płuc.
PL 214 634 B1
Leczenie może wymagać podawania jednego lub większej liczby monoklonalnych przeciwciał agonistycznych anty-CD40 lub jego fragmentów wiążących antygen, samego lub z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. W użytym tu znaczeniu „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” oznacza dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, podłoża dyspersyjne, środki opłaszczające, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i im podobne, które są fizjologicznie zgodne. Wybranymi przykładami farmaceutycznie dopuszczalnych nośników są woda, sól fizjologiczna, sól fizjologiczna buforowana fosforanem, dekstroza, glicerol, etanol i podobne, jak również ich kombinacje. W wielu przypadkach, korzystne będzie włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, przykładowo, cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol, lub chlorku sodowego. Dodatkowymi przykładami substancji dopuszczalnych farmaceutycznie są czynniki zwilżające lub niewielkie ilości substancji pomocniczych, takich jak czynniki zwilżające lub emulgujące, środki konserwujące lub bufory, które wydłużają czas przechowywania lub skuteczność przeciwciała.
Przeciwciała agonistyczne anty-CD40 i kompozycje je obejmujące można podawać w kombinacji z jednym lub większą liczbą czynników terapeutycznych, diagnostycznych lub profilaktycznych. Dodatkowe czynniki terapeutyczne obejmują inne czynniki przeciwneoplastyczne, przeciwnowotworowe, przeciwangiogeniczne lub chemioterapeutyczne. Takie dodatkowe czynniki mogą znajdować się w tej samej kompozycji lub mogą być podawane oddzielnie. Jedno lub większą liczbę przeciwciał agonistycznych anty-CD40 można stosować jako szczepionkę lub adiuwanty do szczepionki.
Kompozycje farmaceutyczne mogą występować w różnych postaciach, przykładowo, w postaci ciekłej, pół-stałej i stałej, jak ciekłe roztwory (np., roztwory do iniekcji i infuzji), w postaci rozproszonej lub w formie zawiesiny, jako tabletki, pigułki, proszki, liposomy i czopki. Korzystna forma zależy od zamierzonego trybu podawania i zastosowania terapeutycznego. Zazwyczaj korzystne kompozycje występują w postaci roztworów do iniekcji i infuzji, jak kompozycje podobne do tych stosowanych w biernej immunizacji ludzi. Korzystnym trybem podawania jest podawanie pozajelitowe (np. dożylne, podskórne, dootrzewnowe, domięśniowe). W korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest podawane przez dożylne infuzje lub iniekcje. W innym korzystnym wykonaniu, przeciwciało jest podawane przez domięśniową lub podskórną iniekcję.
Kompozycje farmaceutyczne zazwyczaj muszą być sterylne i stabilne w warunkach produkcji i przechowywania. Kompozycja może być przygotowana w postaci roztworu, mikroemulsji, dyspersji, liposomu lub w innej uporządkowanej strukturze, odpowiedniej dla leków o wysokim stężeniu. Sterylne roztwo ry do iniekcji można przygotowywać przez wprowadzenie wymaganej ilości przeciwciała anty-CD40 do odpowiedniego rozpuszczalnika, z jednym lub z kombinacją większej liczby składników wymienionych powyżej, o ile konieczne, a następnie sterylizowanie przez filtrację. Zazwyczaj, dyspersje są wytwarzane przez wprowadzenie aktywnego składnika do sterylnego nośnika, który zawiera podstawowe podłoże dyspergujące i wymagane inne składniki z wymienionych powyżej. W przypadku sterylnych proszków do wytwarzania sterylnych roztworów do iniekcji, korzystnymi sposobami wytwarzania są suszenie w próżni i liofilizacja w wyniku których otrzymywany jest aktywny składnik w postaci proszku, plus dowolny dodatkowy, pożądany składnik z jego wysterylizowanego przez filtrację roztworu. Prawidłową płynność roztworu można utrzymać, przykładowo, przez stosowanie środków opłaszczających takich jak lecytyna, przez podtrzymanie cząsteczek o odpowiednim rozmiarze, w przypadku dispersji, oraz zastosowanie środków powierzchniowo czynnych. Przedłużenie absorpcji kompozycji do iniekcji można osiągnąć przez włączenie do kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, przykładowo, soli monostearynianu i żelatyny.
Przeciwciała według niniejszego wynalazku można podawać różnymi sposobami znanymi specjalistom, chociaż dla wielu zastosowań terapeutycznych korzystną drogą/trybem podawania jest infuzja podskórna, domięśniowa lub dożylna. Specjalistom w dziedzinie wiadomo, że droga i/lub tryb podawania będą różne w zależności od pożądanych wyników.
Aktywny składnik kompozycji przeciwciał można przygotować z nośnikiem, który będzie chronić przeciwciało przed gwałtownym uwalnianiem, tak jak w przypadku preparatów z kontrolowanym uwalnianiem, włączając implanty, przezskórne plastry i systemy dostarczania wykorzystujące mikrokapsułki. Można zastosować biodegradowalne, biokampatybilne polimery, takie jak kopolimer etylenu z octanem winylu, polibezwodniki, polikwas glikolowy, kolagen, poliortoestry i polikwas mlekowy. Wiele sposobów wytwarzania takich preparatów jest opatentowanych lub
PL 214 634 B1 ogólnie znanych specjalistom w dziedzinie. Zobacz, np., Sustained and Controlled Release Drug
Delivery Systems (J. R. Robinson, red., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).
Przeciwciało anty-CD40 według wynalazku można podawać doustnie, przykładowo, z obojętnym rozcieńczalnikiem lub z przyswajalnym, jadalnym nośnikiem. Związek (i inne składniki, jeśli pożądane) można także umieścić w twardej lub miękkiej żelatynowej kapsułce, w sprasowanej tabletce lub wprowadzić bezpośrednio do diety osobnika. Do doustnego podawania terapeutycznego, przeciwciało anty-CD40 można wprowadzać z zarobkami i stosować w odpowiedniej do przyjmowania postaci tabletek, tabletek policzkowych, kołaczyków, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, opłatków do leków i podobnych. Do podawania związku według wynalazku, innego niż podawanie pozajelitowe, może być konieczne opłaszczen ie składnika za pomocą, lub jednoczesne podanie, składnika z materiałem zapobiegającym jego inaktywacji.
Do kompozycji można także wprowadzić dodatkowe aktywne składniki. Przeciwciało antyCD40 według wynalazku może być wytworzone w postaci jednego preparatu z i/lub jednocześnie podawane z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników terapeutycznych. Czynniki te obejmują, ale bez ograniczeń, przeciwciała , które wiążą inne czynniki docelowe (np. przeciwciała, które wiążą jeden lub więcej czynników wzrostu lub cytokiny lub ich receptory powierzchniowe, takie jak anty-CTL4-przeciwciało), czynniki przeciwneoplastyczne, czynniki przeciwnowotworowe, czynniki chemioterapeutyczne, analogi peptydów, które aktywują CD40, rozpuszczalne CD40L, jeden lub większą liczbę czynników chemicznych, które aktywują CD40, i/lub inne znane w dziedzinie czynniki, które mogą wzmocnić odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym, np. IFN-P1, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-γ i GM-CSF. Takie terapie złożone mogą wymagać niższych dawek przeciwciała anty-CD40, jak również czynników podawanych jednocześnie, w celu uniknięcia możliwych działań toksycznych lub komplikacji towarzyszących różnym monoterapiom.
Przeciwciała agonistyczne anty-CD40 według wynalazku i obejmujące je kompozycje można także stosować w kombinacji z innymi trybami terapeutycznymi, w szczególności z radioterapią.
Kompozycje mogą obejmować „skuteczną terapeutycznie ilość” lub „skuteczną profilaktycznie ilość” przeciwciała lub fragmentu wiążącego antygen według wynalazku. „Skuteczna terapeutycznie ilość” odnosi się do skutecznej ilości, w dawkach i przez okres czasu, koniecznej do osiągnięcia pożądanego efektu terapeutycznego. Skuteczna terapeutycznie ilość przeciwciała lub części przeciwciała może być różna, w zależności od czynników takich jak stadium choroby, wiek, płeć i waga osobnika oraz zdolność przeciwciała lub części przeciwciała do wywoływania pożądanej odpowiedzi u osobnika. Skuteczna terapeutycznie ilość jest także taka przy której korzystne efekty terapeutyczne przeciwciała lub części przeciwciała przeważają nad efektami toksycznymi lub przynoszącymi szkodę. „Skuteczna profilaktycznie ilość” odnosi się do skutecznej ilości, w dawkach i przez okres czasu, koniecznej do osiągnięcia pożądanego efektu profilaktycznego. Zazwyczaj, ponieważ dawka profilaktyczna jest stosowana u osobnika przed lub we wczesnych stadiach choroby, skuteczna profilaktycznie ilość będzie mniejsza od ilości skutecznej terapeutycznie.
Tryby dawkowania można ustalić tak, aby dostarczały optymalną pożądaną odpowiedź (np. odpowiedź terapeutyczną lub profilaktyczną). Przykładowo, można podawać pojedynczy bolus, można podawać szereg podzielonych dawek przez pewien czas, lub dawkę można proporcjonalnie redukować lub podnosić, w zależności od krytycznej sytuacji terapeutycznej. Szczególnie korzystne jest przygotowywanie kompozycji do podawania pozajelitowego w formie jednostki dawkowania do łatwego podawania i ujednolicenia dawek. W użytym tu znaczeniu, postać jednostki dawkowania odnosi się do fizycznie osobnych jednostek, stosownych jako jednostkowe dawki do leczenia osobników ssaczych; każda jednostka zawiera ustaloną wcześniej ilość aktywnego składnika obliczoną tak, aby dawała pożądany efekt terapeutyczny, w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Szczegółowy opis postaci jednostek dawkowania jest podyktowany przez i bezpośrednio zależy od (a) unikatowych cech charakterystycznych przeciwciała antyCD40 lub części przeciwciała, a także określonego do osiągnięcia efektu terapeutycznego lub profilaktycznego, oraz (b) ograniczeń właściwych dziedzinie łączenia takiego przeciwciała do leczenia wrażliwości u osobników.
Przykładowy, lecz nie jedyny, zakres skutecznych terapeutycznie lub profilaktycznie ilości przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku wynosi 0,025 do 50 mg/kg, korzystniej 0,1 do 50 mg/kg, korzystniej 0,1-25, 0,1 do 10 lub 0,1 do 3 mg/kg. Należy zaznaczyć, że wartości
PL 214 634 B1 dawki mogą różnić się w zależności od typu i ciężkości stanu, który ma być złagodzony. Należy ponadto rozumieć, że specyficzne tryby dawkowania dla danego dowolnego osobnika powinny być dostosowane do czasu zgodnego z zapotrzebowaniem osobnika i profesjonalnej opinii osoby podającej lub nadzorującej podawania kompozycji oraz, że podane tu zakresy dawek są jedynie przykładowymi i nie mają na celu ograniczenia zakresu i praktycznego wykorzystania zastrzeżonej kompozycji.
Niniejszym opisano zestawy obejmujące przeciwciało anty-CD40 lub część przeciwciała według wynalazku lub kompozycję obejmującą takie przeciwciało. Zestaw może zawierać, oprócz przeciwciała lub kompozycji, czynniki diagnostyczne lub terapeutyczne. Zestaw może także zawierać instrukcje użycia w metodzie diagnostycznej lub terapeutycznej. Korzystnie zestaw zawiera przeciwciało lub obejmującą je kompozycję oraz czynnik diagnostyczny, który można zastosować w metodzie opisanej poniżej. Również korzystnie zestaw zawiera przeciwciało lub obejmującą je kompozycję oraz jeden lub większą liczbę czynników terapeutycznych, które można zastosować w metodzie opisanej poniżej.
Zgodnie z niniejszym ujawnieniem, kompozycje hamujące nieprawidłowy wzrost komórki u ssaka obejmują pewną ilość przeciwciała według wynalazku w kombinacji z pewną ilością czynnika chemioterapeutycznego, przy czym ilości związku, soli, solwatu lub proleku i czynnika chemioterapeutycznego są razem skuteczne w hamowaniu nieprawidłowego wzrostu komórki. W dziedzinie znanych jest obecnie wiele czynników chemioterapeutycznych. Czynnik chemioterapeutyczny może być wybrany z grupy obejmującej: inhibitory mitotyczne, czynniki alkilujące, anty-metabolity, interkalujące antybiotyki, inhibitory czynników wzrostu, inhibitory cyklu komórkowego, enzymy, inhibitory topoizomeraz, modyfikatory odpowiedzi biologicznych, anty-hormony, np. anty-androgeny, i czynniki antyangiogenne.
W kombinacji z przeciwciałem anty-CD40 według wynalazku można stosować czynniki anty-angiogenne, takie jak inhibitory MMP-2 (metaloproteinaza macierzy 2), inhibitory MMP-9 (metaloproteinaza macierzy 9) oraz inhibitory COX-II (cyklooksygenazy II). Przykłady przydatnych inhibitorów COX-II obejmują CELEBREX™ (alecoxib), valdecoxib i rofecoxib. Przykłady przydatnych inhibitorów metaloproteinazy macierzy opisano w WO 96/33172 (opublikowany 24 października 1996), WO 96/27583 (opublikowany 7 marca 1996), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 97304971.1 (zgłoszone 8 lipca 1997), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 99308617.2 (zgłoszone 29 października 1999), WO 98/07697 (opublikowany 26 lutego 1998), WO 98/03516 (opublikowany 29 stycznia 1998), WO 98/34918 (opublikowany 13 sierpnia 1998), WO 98/34915 (opublikowany 13 sierpnia
1998) , WO 98/33768 (opublikowany 6 sierpnia 1998), WO 98/30566 (opublikowany 16 lipca 1998), europejskiej publikacji patentowej 606,046 (opublikowany 13 lipca 1994), europejskiej publikacji patentowej 931,788 (opublikowany 28 lipca 1999), WO 90/05719 (opublikowany 31 maja 1990), WO 99/52910 (opublikowany 21 października 1999), WO 99/52889 (opublikowany 21 października 1999), WO 99/29667 (opublikowany 17 czerwca 1999), międzynarodowym zgłoszeniu PCT nr PCT/IB98/01113 (zgłoszone 21 lipca 1998), europejskim zgłoszeniu patentowym nr 99302232.1 (zgłoszone 25 marca
1999) , zgłoszeniu patentowym Wielkiej Brytanii nr 9912961.1 (zgłoszone 3 czerwca 1999), tymczasowym zgłoszeniu USA nr 60/148464 (zgłoszone 12 sierpnia 1999), patencie USA 5863949 (wydany 26 stycznia 1999), patencie USA 5861510 (wydany 19 stycznia 1999) i europejskiej publikacji patentowej 780386 (opublikowany 25 czerwca 1997). Korzystnymi inhibitorami MMP są te które nie powodują bólu stawów. Korzystniejsze są te, które selektywnie hamują MMP-2 i/lub MMP-9 w porównaniu z innymi metaloproteinazami macierzy (tzn. MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 i MMP-13). Specyficznymi przykładami inhibitorów MMP są: AG 3340, RO 32-3555, RS 13-0830 i związki wymienione poniżej: kwas 3-[[4-(4-fluorofenoksy)-benzenosulfonylo]-(1-hydroksykarbamoilo-cyklopentylo)-amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 3-egzo-3-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonyloamino]-8-oksabicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (2R, 3R) 1-[4-(2-chloro-4-fluoro-benzyloksy)-benzenosulfonylo]-3-hydroksy-3-metylo-piperydyno-2-karboksylowego; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylo-amino]tetrahydro-pirano-4-karboksylowego; kwas 3-[[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylo]-(1-hydroksy-karbamoilo-cyklobutylo)-amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 4-[4-(4-chloro-fenoksy)-benzeno-sulfonyloamino]-tetrahydro-pirano-4-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (R) 3-[4-(4-chloro-fenoksy)-benzeno-sulfonyloamino]tetrahydro-pirano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu (2R, 3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metylo-benzyloksy)-benzenosulfonylo]-3-hydroksy-3-metylo-piperydyno-2-karboksylowego; kwas 3-[[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonylo]-(1-hydroksykarbamoilo-1-metylo-etylo)-amino]-propionowy; kwas 3-[[4-(4-fluoroPL 214 634 B1
-fenoksy)-benzenosulfonylo]-(4-hydroksykarbamoilo-tetrahydro-pirano-4-ylo)-amino]-propionowy; hydroksyamid kwasu 3-egzo-3-[4-(4-chloro-fenoksy)-benzenosulfonylo-amino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego; hydroksyamid kwasu 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonyloamino]-8-oksa-bicyklo[3.2.1]oktano-3-karboksylowego i hydroksyamid kwasu (R) 3-[4-(4-fluoro-fenoksy)-benzenosulfonyloamino]-tetrahydro-furano-3-karboksylowego oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole i solwaty tych związków.
Związek według wynalazku można także użyć z inhibitorami transdukcji sygnału, takimi jak czynniki, które hamują odpowiedzi EGF-R (receptora epidermalnego czynnika wzrostu), jak przeciwciała EGF-R, przeciwciała EGF i cząsteczki , które są inhibitorami EGF-R; inhibitorami VEGF (naczyniowy śródbłonkowy czynnik wzrostu), takimi jak receptory VEGF i cząsteczki, które hamują VEGF oraz inhibitorami receptora erbB2, takimi jak organiczne cząsteczki lub przeciwciała, które wiążą się z receptorem erbB2, przykładowo, HERCEPTINTM (Genentech, Inc.). Inhibitory EGF-R opisano przykładowo w WO 95/19970 (opublikowany 27 lipca 1995), WO 98/14451 (opublikowany 9 kwietnia 1998), WO 98/02434 (opublikowany 22 stycznia 1998) i patencie USA 5747498 (wydany 5 maja 1998) i substancje takie można zastosować w rozwiązaniach tu opisanych. Czynniki hamujące EGFR obejmują, ale bez ograniczeń, przeciwciała monoklonalne C225 i anty-EGFR 22Mab (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix/Cell Genesys), EMD7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. i Merck KgaA) oraz związki ZD-1834, ZD-1838 i ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP-75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomide (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC-310 (Ventech Research), EGF fusion toxin (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Lilgand), ZM-252808 (Imperial Cancer Research Fund), RG-50864 (INSERM), LFM-A12 (Parker Hughes Cancer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cancer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko) i szczepionkę EGF-R (York Medical/Centro de Immunologia Molecular (CIM)). Możliwe jest zastosowanie tych i innych czynników hamujących EGF-R.
Inhibitory VEGF, przykładowo, SU-5416 i SU-6668 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) oraz NX-1838 (NeXstar) można także łączyć ze związkiem według wynalazku. Inhibitory VEGF opisano przykładowo w WO 99/24440 (opublikowany 20 maja 1999), międzynarodowym zgłoszeniu PCT PCT/IB99/00797 (złożony 3 maja 1999), w WO 95/21613 (opublikowany 17 sierpnia 1995), WO 99/61422 (opublikowany 2 grudnia 1999), patencie USA 5834504 (wydany 10 listopada 1998), WO 98/50356 (opublikowany 12 listopada 1998), patencie USA 5883113 (wydany 16 marca 1999), patencie USA 5886020 (wydany 23 marca 1999), patencie USA 5792783 (wydany sierpnia 1998), WO 99/10349 (opublikowany March 4, 1999), WO 97/32856 (opublikowany września 1997), WO 97/22596 (opublikowany 26 czerwca 1997), WO 98/54093 (opublikowany 3 grudnia 1998), WO 98/02438 (opublikowany 22 stycznia 1998), WO 99/16755 (opublikowany 8 kwietnia 1999) i WO 98/02437 (opublikowany 22 stycznia 1998). Innymi przykładami specyficznych inhibitorów VEGF są: IM862 (Cytran Inc.); przeciwciało monoklonalne anty-VEGF z Genentech, Inc.; i angiozym, syntetyczny rybozym z Ribozyme i Chiron. Te i inne inhibitory VEGF można stosować jak tu opisano. Inhibitory receptora ErbB2, jak GW-282974 (Glaxo Wellcome plc) i przeciwciała monoklonalne AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) i 2B-1 (Chiron) mogą ponadto występować w kombinacji ze związkiem według wynalazku, przykładowo te wskazane w WO 98/02434 (opublikowany 22 stycznia 1998), WO 99/35146 (opublikowany 15 lipca 1999), WO 99/35132 (opublikowany 15 lipca 1999), WO 98/02437 (opublikowany 22 stycznia 1998), WO 97/13760 (opublikowany 17 kwietnia 1997), WO 95/19970 (opublikowany 27 lipca 1995), patencie USA 5587458 (wydany 24 grudnia 1996) i patencie USA 5877305 (wydany 2 marca 1999). Przydatne inhibitory receptora ErbB2 są także opisane w tymczasowym zgłoszeniu USA nr 60/117341, złożonym 27 stycznia 1999 i w tymczasowym zgłoszeniu USA nr 60/117346, złożonym 27 stycznia 1999. Związki i substancje inhibitorowe dla receptora erbB2 opisano we wspomnianych wcześniej zgłoszeniach PCT, patentach USA i tymczasowych zgłoszeniach USA. Jednakże ze związkiem według wynalazku można zastosować również inne związki i substancje, które hamują receptor erbBm.
Czynniki anty-przeżyciowe (ang. anti-survival agents) obejmują przeciwciała anty-IGF-IR i czynniki anty-integrynowe, takie jak przeciwciała anty-integrynowe.
PL 214 634 B1
Zastosowanie sposobów diagnostycznych
Niniejszym opisano również sposoby diagnostyczne. Przeciwciała anty-CD40 można użyć do wykrywania CD40 w próbce biologicznej in vitro lub in vivo. Sposób diagnozowania obecności lub lokalizacji guza wyrażającego CD40 u pacjenta tego potrzebującego, obejmuje etapy wstrzyknięcia osobnikowi przeciwciała, określenia poziomu wyrażania CD40 u osobnika przez ustalenie miejsca związania przeciwciała , porównania ekspresji u osobnika z tą u stanowiącego odniesienie osobnika prawidłowego, lub ze standardem, oraz zdiagnozowania obecności lub lokalizacji nowotworu.
Przeciwciała anty-CD40 można stosować w konwencjonalnych testach immunologicznych, w tym, ale bez ograniczeń, w ELISA, RIA, FACS, tkankowym teście immunohistochemicznym, teście typu Western blot lub immunoprecypitacyjnym. Przeciwciała anty-CD40 według wynalazku można stosować do wykrywania CD40 pochodzącego od człowieka. Przeciwciała anty-CD40 można stosować do wykrywania CD40 pochodzących od gatunków naczelnych ze Starego Świata, takich jak makaki jawajskie i rezusy, szympansy i małpy bezogonowe. Sposób wykrywania CD40 w próbce biologicznej może obejmować kontaktowanie próbki biologicznej z przeciwciałem anty-CD40 według wynalazku i wykrywanie związanego przeciwciała. Przeciwciało anty-CD40 może być bezpośrednio wyznakowane wykrywalnym znacznikiem. Alternatywnie przeciwciało anty-CD40 (pierwszorzędowe przeciwciało) nie jest wyznakowane, a wyznakowane jest drugorzędowe przeciwciało lub inna cząsteczka , która może wiązać przeciwciało anty-CD40. Jak dobrze wiadomo specjaliście w dziedzinie, drugorzędowe przeciwciało jest tak dobrane, aby swoiście wiązać określoną klasę pierwszorzędowego przeciwciała, uwzględniając gatunek z którego ono pochodzi. Przykładowo, jeśli przeciwciało anty-CD40 jest ludzkim IgG, drugorzędowe przeciwciało powinno być anty-Iudzkie-IgG. Inne cząsteczki , które mogą wiązać przeciwciała obejmują, ale bez ograniczeń. Białko A i Białko G, oba dostępne handlowo, np. z Pierce Chemical Co.
Stosowne znaczniki przeciwciała lub drugorzędowego przeciwciała zostały ujawnione powyżej i obejmują różne enzymy, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały luminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady stosownych enzymów obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę lub acetylocholinoesterazę; przykłady stoso wnych kompleksów grup prostertycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady stosownych materiałów fluorescencyjnych obejmują umbeliferon, fluoresceinę, izotiocyjanian fluoresceinowy, rodaminę, fluoresceinę dichlorotriazynyloaminową, chlorek danzylu lub fikoerytrynę; przykład stosownego materiału luminescencyjnego obejmuje luminol; przykłady stosow4 Q C d Od Q nego materiału radioaktywnego obejmują 125I, 131I,35S lub 3H.
CD40 można analizować w próbce biologicznej za pomocą kompetycyjnego testu immunologicznego wykorzystującego standardy CD40 wyznakowane wykrywalną substancją i niewyznakowane przeciwciała anty-CD40. W teście tym, próbka biologiczna, wyznakowane standardy CD40 i przeciwciało anty-CD40 są mieszane i określana jest ilość wyznakowanego standardu CD40 związanego z niewyznakowanym przeciwciałem. Ilość CD40 w próbce biologicznej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wyznakowanego standardu CD40 związanego z przeciwciałem anty-CD40.
Ujawnione tu testy immunologiczne można zastosować do wielu celów. Przykładowo, przeciwciała anty-CD40 można stosować do wykrywania CD40 w komórkach w hodowli komórkowej. Przeciwciała anty-CD40 mogą być stosowane do określania ilości CD40 na powierzchni komórek, które traktowano różnymi związkami. Sposób ten można zastosować do identyfikacji związków, które są przydatne w aktywowaniu lub hamowaniu CD40. Zgodnie z tym sposobem, jedna próbka komórek jest traktowana badanym związkiem przez pewien okres czasu podczas gdy inna próbka nie jest poddawana jego działaniu. Jeśli ma być mierzony całkowity poziom CD40, komórki są poddawane lizie i całkowity poziom CD40 jest określany przy użyciu jednego z opisanych powyżej testów immunologicznych. W celu określenia wpływu badanego związku, porównywany jest całkowity poziom CD40 w komórkach poddawanych działaniu badanego związku względem komórek nie poddawanych działaniu.
Korzystnym testem immunologicznym do pomiaru całkowitych poziomów CD40 jest ELISA lub test typu Western blot. Jeśli ma być mierzony poziom CD40 na powierzchni komórek, komórki nie są poddawane lizie i poziomy CD40 na powierzchni komórek są określane przy użyciu jednego z opisanych powyżej testów immunologicznych. Korzystny test immunologiczny, do określania poziomów CD40 na powierzchni komórek, obejmuje etapy znakowania białek na powierzchni koPL 214 634 B1
125 mórek wykrywalnym znacznikiem, takim jak biotyna lub 125I, immunoprecypitacji CD40 z przeciwciałem anty-CD40, a następnie wykrywania wyznakowanego CD40. Innym korzystnym testem immunologicznym do określania lokalizacji CD40, np. poziomów na powierzchni komórkowej, jest zastosowanie immunohistochemii. Sposoby takie jak ELISA, RIA, test typu Western blot, test immunohistochemiczny, znakowanie na powierzchni komórek integralnych białek błonowych i immunoprecypitacja są dobrze znane w dziedzinie. Zobacz, np., Harlow i Lane, powyżej. Dodatkowo, można zwiększać skalę testów immunologicznych w celu zwiększenia wydajności badań przesiewowych, aby możliwe było badanie dużej liczby związków pod kątem ich aktywacji lub hamowania CD40.
Przeciwciała a nty-CD40 według wynalazku można także stosować do określania poziomów CD40 w tkance lub w komórkach pochodzących z tkanki, np. tkanki chorobowej. Tkanka taka może być guzem lub jego bioptatem, które są korzystnie pobrane od pacjenta. Tkanka lub bioptat jest następnie użyty w teście immunologicznym w celu określenia np. całkowitych poziomów CD40, poziomów CD40 na powierzchni komórek lub lokalizacji CD40 przy użyciu sposobów opisanych powyżej.
Opisany powyżej sposób diagnostyczny można stosować do określenia czy CD40 jest wyrażane w guzie na wysokim poziomie. Informacja ta pozwoli na określenie, czy guz ten mógłby być celem w leczeniu przeciwciałem a nty-CD40. Ponadto, ten sam sposób można także stosować do monitorowania wyników leczenia przeciwciałem anty-CD40 przez wykrywanie śmierci komórek w guzie. Sposób diagnostyczny można także stosować do określenia czy tkanka lub komórka wyraża CD40 lub aktywowany CD40 na niewystarczającym poziomie, a zatem jest kandydatem do leczenia aktywującymi przeciwciałami anty-CD40, CD40L i/lub innymi czynnikami terapeutycznymi podnoszącymi poziomy CD40 lub jego aktywność.
Przeciwciała według wynalazku można także stosować in vivo do identyfikowania tkanek i narządów, które wyrażają CD40. Przeciwciała a nty-CD40 mogą być stosowane do identyfikowania guzów wyrażających CD40. Jedną z korzyści stosowania ludzkich przeciwciał anty-CD40 według wynalazku jest to, że odmiennie niż przeciwciała niepochodzące od człowieka lub przeciwciała humanizowane, można je stosować bezpiecznie in vivo bez wywołania odpowiedzi odpornościowej na podawane przeciwciało.
Sposób obejmuje etapy podawania znakowanego przeciwciała anty-CD40, które można wykryć, lub obejmującej je kompozycji pacjentowi potrzebującemu takiego testu diagnostycznego i poddania pacjenta analizie obrazowej, w celu określenia lokalizacji tkanek wyrażających CD40. Analiza obrazowa jest dobrze znana w medycynie i obejmuje, ale bez ograniczeń, promieniowanie rentgenowskie, obrazowanie za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) lub tomografii komputerowej (CE). Przeciwciało można wyznakować dowolnym czynnikiem stosownym dla obrazowania in vivo, przykładowo czynnikiem kontrastującym, takim jak bar, który można stosować przy analizie promieniowaniem rentgenowskim lub magnetycznym czynnikiem kontrastującym, takim jak kompleks chelatowy gadolinu, który można stosować w MRI lub CE. Inne znaczniki obejmują, ale bez ograniczeń, radioizotopy takie jak 99Tc. Alternatywnie, przeciwciało anty-CD40 nie będzie wyznakowane i będzie obrazowane przez podanie przeciwciała drugorzędowego lub innej cząsteczki, którą można wykryć i która wiąże przeciwciało anty-CD40. W wykonaniu, bioptat jest pozyskiwany od pacjenta, w celu ustalenia czy tkanka będąca przedmiotem zainteresowania wyraża CD40.
Zastosowanie sposobów terapeutycznych
Niniejszym opisano sposoby terapeutyczne wykorzystujące przeciwciało anty-CD40 według wynalazku.
Ludzkie przeciwciało agonistyczne anty-CD40 według wynalazku można podawać ludziom lub ssakowi niebędącemu człowiekiem, który wyraża CD40 reagujący krzyżowo. Przeciwciało można podać takiemu ssakowi niebędącemu człowiekiem (tzn. naczelnemu, makakowi jawajskiemu lub rezusowi), w celu weterynaryjnym lub jako modelowi choroby ludzkiej. Takie modele zwierzęce są przydatne w ocenie skuteczności terapeutycznej przeciwciał według wynalazku.
Przeciwciało anty-CD40 może być podawane osobnikowi, który cierpi na pierwotne i/lub mieszane stany niedoboru odpornościowego, włączając zależny od CD40 niedobór odpornościowy z zespołem Hiper-IgM, zwykły zmienny niedobór odpornościowy, agammaglobulinemię Brutona, niedobory podklasy IgG oraz SCID sprężony z X (pospolite mutacje łańcucha gamma). Przeciwciało anty-CD40 może być podawane do leczenia osobnika z obniżoną odpornością, przykła38
PL 214 634 B1 dowo po chemioterapii, lub z wycieńczającą chorobą odpornościową, włączając chorobę nabytego niedoboru odpornościowego, taką jak HIV. Przeciwciało anty-CD40 może być podawane do wzmocnienia odporności osobnika w podeszłym wieku. Alternatywnie, przeciwciało anty-CD40 może być podawane w celu leczenia osobnika, który posiada zakażenie bakteryjne, wirusowe, wywołane grzybami lub pasożytami. Ludzkie przeciwciało agonistyczne anty-CD40 według wynalazku można podawać profilaktycznie osobnikowi, który ze względu na wiek, chorobę lub ogólnie zły stan zdrowia jest podatny na infekcję, w celu zapobiegania lub redukcji liczby zakażeń lub ciężkości zakażenia.
Przeciwciało anty-CD40 może być podawane osobnikowi z zaburzeniem hiperproIiferacyjnym.
Przeciwciało anty-CD40 może być podawane w celu leczenia osobnika z guzem. Guz jest dodatni względem CD40. Alternatywnie guz może być CD40 ujemny. Guz może być lity lub nie, jak chłoniak. Przeciwciało anty-CD40 może być podawane pacjentowi z guzem, który jest rakowaty. Przeciwciało hamuje proliferacje komórek rakowych, hamuje lub zapobiega wzrostowi wagi lub objętości guza i/lub powoduje obniżenie wagi lub objętości guza.
Pacjenci, których można leczyć przeciwciałami anty-CD40 lub częściami przeciwciała według wynalazku obejmują, ale bez ograniczeń, pacjentów zdiagnozowanych z rakiem mózgu, rakiem płuc, rakiem kości, rakiem trzustki, rakiem skóry, rakiem głowy i szyi, czerniakiem skóry lub wewnątrzgałkowym, rakiem macicy, rakiem jajnika, rakiem odbytu, rakiem regionu odbytu, rakiem żołądka, rakiem gastrycznym, rakiem okrężnicy i odbytu, rakiem okrężnicy, rakiem sutka, guzem ginekologicznym (np. mięsakiem macicy, rakiem jajowodów, rakiem śluzówki macicy, rakiem szyjki macicy, rakiem pochwy lub rakiem sromu), rakiem przełyku, rakiem jelita cienkiego, rakiem układu wewnątrzwydzielniczego (np. rakiem tarczycy, przytarczycy lub gruczołów nadnercza), mięsakiem tkanki miękkiej, białaczką, szpiczakiem, szpiczakiem mnogiegim, rakiem cewki moczowej, rakiem penisa, rakiem gruczołu krokowego, białaczką przewlekłą lub ostrą, guzem litym wieku dziecięcego, chorobą Hodgkina, chłoniakiem limfocytowym, chłoniakiem nieziarniczym, rakiem pęcherza, rakiem wątroby, rakiem nerkowym, rakiem nerki lub moczowodu (np. gruczolakorakiem nerki, rakiem miedniczki nerkowej) lub z nowotworem ośrodkowego układu nerwowego (np. pierwotnym chłoniakiem CNS, guzem rdzenia kręgowego, glejakiem pnia mózgu lub gruczolakiem przysadki mózgowej), glejakiem lub włókniakomięsakiem.
Przeciwciało może być podawane od trzech razy dziennie do jednorazowego podania co każde sześć miesięcy i korzystnie może być podawane doustnie, dośluzówkowo, dopoliczkowo, donosowo, przez inhalację, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, pozajelitowe, do guza, przezskórnie lub domiejscowo. Przeciwciało można także podawać w sposób ciągły za pomocą minipompy. Przeciwciało zazwyczaj będzie podawane tak długo jak długo obecny jest guz co powoduje, że przeciwciało wpływa na zahamowanie wzrostu guza lub raka lub na obniżenie jego ciężaru lub objętości. Dawka przeciwciała zazwyczaj będzie mieścić się w zakresie od 0,025 do 50 mg/kg, korzystniej 0,1 to 50 mg/kg, jeszcze korzystniej 0,1-20 mg/kg, 0,1-10 mg/kg, 0,1-5 mg/kg lub nawet jeszcze korzystniej 0,1-2 mg/kg. Przeciwciało można także podawać profilaktycznie.
Przeciwciało anty-CD40 jest podawane, jako część postępowania terapeutycznego, które obejmuje jedno lub większą liczbę dodatkowych przeciwneoplastycznych leków lub cząsteczek, dla pacjenta z zaburzeniem hiperproliferacyjnym, takim jak rak lub guz. Przykłady czynników przeciwnowotworowych obejmują, ale bez ograniczeń, inhibitory mitotyczne, czynniki alkilujące, anty-metabolity, czynniki interkalujące, inhibitory czynników wzrostu, inhibitory cyklu komórkowego, enzymy, inhibitory topoizomeraz, modyfikatory odpowiedzi biologicznych, anty-hormony, inhibitory kinaz, inhibitory metaloproteinaz macierzy, terapeutyki genetyczne i anty-androgeny. Korzystnie, przeciwciało anty-CD40 może być podawane z czynnikiem przeciwneoplastycznym, takim jak adriamycyna lub taksol. Również korzystnie, terapia anty-CD40 jest prowadzona wraz z radioterapią, chemioterapią, terapią fotodynamiczną, zabiegami chirurgicznymi lub inną immunoterapią. Przeciwciało anty-CD40 może być podawane z jednym lub większą liczbą dodatkowych przeciwciał. Przykładowo, przeciwciało anty-CD40 można podawać z przeciwciałami o których wiadomo, że hamują proliferację komórek guza lub raka. Przeciwciała takie obejmują, ale bez ograniczeń, przeciwciało, które hamuje CTLA4, receptor erbB2, EGF-R, IGF-1R, CD20 lub VEGF.
Przeciwciało anty-CD40 może być wyznakowane znacznikiem radioaktywnym, immunotoksyną lub toksyną lub jest białkiem fuzyjnym obejmującym toksyczny peptyd. Przeciwciało antyCD40 lub białko fuzyjne przeciwciała anty-CD40 kieruje radioaktywny znacznik, immunotoksynę lub toksynę do komórki guza lub raka. Znacznik radioaktywny, immunotoksyna lub toksyna jest
PL 214 634 B1 wprowadzana do wnętrza komórki guza lub raka po tym, jak przeciwciało anty-CD40 zwiąże się z CD40 na powierzchni komórki.
Przeciwciało anty-CD40 może być też użyte do celów terapeutycznych, do zaindukowania apoptozy specyficznych komórek u pacjenta. W wielu przypadkach komórki przeznaczone do apoptozy są komórkami pochodzącymi z raka lub guza. Zatem, opisany tu sposób indukuje apoptozę u pacjenta, który tego potrzebuje, przez podawanie przeciwciała anty-CD40.
Niniejszym opisano sposób podawania pacjentowi aktywującego przeciwciała anty-CD40, które zwiększa aktywność CD40. Przeciwciało anty-CD40 jest podawane z jednym lub większą liczbą innych czynników, które zwiększają aktywność CD40. Czynniki takie obejmują CD40L i/lub analogi CD40L, które aktywują CD40.
Przeciwciało anty-CD40 jest podawane z jednym lub większą liczbą dodatkowych czynników wzmacniających układ immunologiczny obejmujących, ale bez ograniczeń, IFN-βΙ, IL-2, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, IFN-γ i GM-CSF.
Ludzkie przeciwciało agonistyczne anty-CD40 może być stosowane jako adiuwant do wzmocnienia skuteczności szczepionki. Stosowane w ten sposób przeciwciało anty-CD40 aktywuje CD40 na komórkach prezentujących antygen, włączając komórki B, komórki dendrytyczne i monocyty, jak również wzmacnia wytwarzanie cząsteczek immunomodulujących, takich jak cytokiny i chemokiny. Efekt immunostymulacji przeciwciała wzmacnia odpowiedź odpornościową zaszczepionego osobnika na antygen szczepionki.
Niniejszym ujawniono sposób wytwarzania szczepionki opartej na komórkach dendrytycznych do immunoterapii komórek rakowych lub dendrytycznych. Zgodnie z tym sposobem, komórki dendrytyczne od pacjenta z rakiem są hodowane przez 1-5 dni z lizatem lub homogenatem nowotworowym, komórkami nowotworowymi uśmierconymi promieniowaniem lub w inny sposób lub z antygenem swoistym dla guza (np. peptydy, idiotypy) i 1-10 μg/ml przeciwciała anty-CD40. Komórki dendrytyczne poddane działaniu antygenu nowotworowego są ponownie wprowadzone do pacjenta, w celu zastymulowania przeciwnowotworowych odpowiedzi odpornościowych, w szczególności odpowiedzi przeciwnowotworowych CTL. Pochodzące od monocytów komórki dendrytyczne, do zastosowania w tym sposobie, można otrzymać z próbki krwi obwodowej przez hodowanie w IL-4 i GM-CSF. Komórki dendrytyczne można także odzyskać ze szpiku kostnego pacjenta przez oczyszczanie magnetyczne lub sortowanie komórek pozytywnych CD34 po hodowaniu w IL-4 i GM-CSF.
Terapia genowa
Cząsteczki kwasu nukleinowego ujawnione niniejszym można podawać pacjentowi tego potrzebującego przez terapię genową. Terapia może być prowadzona in vivo lub ex vivo. Pacjentowi są podawane cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące zarówno łańcuch ciężki i łańcuch lekki. Korzystnie cząsteczki kwasu nukleinowego są podawane tak, że stabilnie integrują do chromosomów komórek B, ponieważ to te komórki są wyspecjalizowane do wytwarzania przeciwciał. Prekursorowe komórki B są transfekowane lub infekowane ex vivo i ponownie przenoszone do pacjenta tego potrzebującego. W innym wykonaniu, prekursorowe komórki B lub inne komórki są infekowane in vivo przy użyciu wirusa o którym wiadomo, że infekuje interesujący rodzaj komórek. Zazwyczaj wektory stosowane w terapii genowej obejmują liposomy, plazmidy i wektory wirusowe. Przykładowymi wektorami wirusowymi są retrowirusy, adenowirusy i wirusy towarzyszące adenowirusom. Po infekcji in vivo lub ex vivo, poziomy wytwarzania przeciwciała można monitorować przez pobranie próbki od leczonego pacjenta i użycie dowolnego testu immunologicznego, znanego w dziedzinie lub tu omówionego.
Sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen z przeciwciała anty-CD40 i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. Sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen z przeciwciała anty-CD40 i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. Korzystnie, sposób terapii genowej obejmuje etapy podawania wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen i wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen z przeciwciała anty-CD40 według wynalazku i ekspresji cząsteczki kwasu nukleinowego. Sposób terapii genowej może także obejmować etap podawania innego czynnika anty-nowotworowego, takiego jak taksol lub adriamycyna.
PL 214 634 B1
W celu lepszego zrozumienia wynalazku przedstawione poniżej zostały przykłady. Przykłady te podane są tylko w celu zilustrowania i nie należy ich interpretować w żaden taki sposób, który ograniczałby zakres wynalazku.
P r z y k ł a d I
Tworzenie hybrydoma wytwarzających przeciwciało anty-CD40
Przeciwciała tu opisane wytwarzano, selekcjonowano i badano w następujący sposób:
Immunizacja i tworzenie hybrydoma
Myszy XenoMice™, w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni, immunizowano przez podanie, dootrzewnowe lub w poduszki tylnych łap, białka fuzyjnego CD40-IgG (10 μg/dawkę/mysz) albo komórek 300.19-CD40, będących transfekowaną linią komórkową, wyrażającą ludzkie CD40 na swojej błonie plazmatycznej (10 x 106 komórek/dawkę/mysz). Podawanie tej dawki powtarzano pięć do siedmiu razy przez okres od trzech do ośmiu tygodni. Cztery dni przed fuzją, myszom podawano końcową iniekcję z zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego CD40 w PBS. Przeprowadzano fuzję limfocytów śledziony i węzłów chłonnych z myszy immunizowanych z nie-wydzielniczą linią komórkową szpiczaka P3-X63-Ag8.653, a fuzje komórkowe podano selekcji typu HAT, jak to uprzednio opisano (Galfre i Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Ustalono panel hybrydoma, z których wszystkie wydzielały ludzkie przeciwciała IgG2K swoiste wobec CD40. Do dalszego badania wybrano jedenaście hybrydoma i określono je jako 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1.
Hybrydoma 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 i 21.4.1, zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim zdeponowano w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 6 sierpnia 2001. Hybrydoma 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1 zdeponowano w ATCC 16 lipca 2002. Hybrydoma nadano następujące numery depozytowe:
hybrydoma nr depozytu
3.1.1 (LN 15848) PTA-3600
7.1.2 (LN 15849) PTA-3601
10.8.3 (LN 15850) PTA-3602
15.1.1 (LN 15851) PTA-3603
21.4.1 (LN 15853) PTA-3605
21.2.1 (LN 15874) PTA-4549
22.1.1 (LN 15875) PTA-4550
23.5.1 (LN 15855) PTA-4548
23.25.1 (LN 15876) PTA-4551
23.28.1 (LN 15877) PTA-4552
23.29.1 (LN 15878) PTA-4553
24.2.1 (LN 15879) PTA-4554
P r z y k ł a d II
Sekwencje przeciwciał anty-CD40
Aby zanalizować struktury przeciwciał wytwarzanych opianym tu sposobem, sklonowano kwasy nukleinowe kodujące fragmenty łańcucha ciężkiego i lekkiego z hybrydoma, wytwarzających monoklonalne przeciwciała anty-CD40. Klonowanie i sekwencjonowanie wykonywano w następujący sposób:
+5
Poli(A)+ mRNA izolowano z około 2 x 105 komórek hybrydoma, pochodzących od myszy XenoMouse™ immunizowanych ludzkim CD40, jak to opisano w Przykładzie I, stosując zestaw FastTrack (Invitrogen). Następnie za pomocą PCR wytworzono losowo powielane cDNA. Stosowano startery specyficzne do zmiennego regionu ludzkiego VH lub ludzkiej rodziny Vk (Marks i wsp., „Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of familyspecific oligonucleotide probes.” Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) Iub uniwersalny starter dla ludzkiego VH, MG-30, CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG (SEKW. NR ID.: 118), w połączeniu ze starterami specyficznymi dla stałego regionu ludzkiego Cj2, MG-40d, 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3' (SEKW. NR ID.: 119) lub stałego regionu Ck (hkP2; jak to uprzednio opisano w Green i wsp., 1994). Stosując startery opisane powyżej, z hybrydoma wytwarzających anty-CD40, otrzymano cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące transkrypty ludzkiego łańcucha ciężkiego i lekkiego kappa, przez bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR wytworzonych
PL 214 634 B1 z poli(A+) RNA. Sklonowano również produkty PCR w PCRII, stosując zestaw do klonowania TA (Invitrogen) i zsekwencjonowano obie nici stosując zestawy do sekwencjonowania Prism dye-terminator i sekwenator ABI 377. Wszystkie sekwencje analizowano przez przyrównanie ich do „V BASE sequence directory” (Tomlinson i wsp., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) stosując oprogramowania MacVector i Geneworks.
Następnie, przeprowadzono klonowanie i sekwencjonowanie DNA pełnej długości z przeciwciał monoklonalnych 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1. Do sekwencjonowania tego, wyizolowano RNA z około 4 x 106 komórek hybrydoma, stosując zestaw do izolacji RNA QIAGEN RNeasy (QIAGEN). mRNA przepisano na drodze odwrotnej transkrypcji stosując oligo-dT(18) i zestaw Advantage RT/PCR (Clonetech). V Base zastosowano do zaprojektowania zgodnych starterów do amplifikacji, zawierających miejsca restrykcyjne, optymalną sekwencję Kozak, miejsce startu ATG i część sekwencji sygnałowej łańcucha ciężkiego. Tabela 1 przedstawia listę zgodnych starterów do amplifikacji, stosowanych do sekwencjonowania klonów przeciwciał.
T a b e l a 1
Klon Zgodny starter łańcucha ciężkiego
3.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTT GGGCTGAGCTG-3'(SEKW. NR ID.: 120)
7.1.2 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTT GGGCTGAGCTG-3'(SEKW. NR ID.: 121)
10.8.3 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCC-3'(SEKW. NR ID.: 122)
15.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACAT CTGTGGTTCTTCC-3'(SEKW. NR ID.: 123)
21.4.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGATCC-3'(SEKW. NR ID.:124)
21.2.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.: 128)
22.1.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.: 129)
23.5.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.: 130)
23.28.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACATCTGTGGTTCTTCC-3' (SEKW. NR ID.:131)
23.29.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3' (SEKW. NR ID.:132)
24.2.1 5'-TATCTAAGCTTCTAGACTCGAGCGCCACCATGAAACATCTGTGGTTCTTCC-3'(SEKW. NR ID.: 133)
Tę samą metodę zastosowano do zaprojektowania startera zawierającego sekwencje kodujące 3', kodon stop stałego obszaru IgG2, (5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3') (SEKW . NR ID.: 125) i miejsca restrykcyjne.
Tę samą metodę zastosowano również do zaprojektowania startera wokół miejsca startu ATG łańcucha kappa: (5'-CTTCAAGCTTACCCGGGCCACCATGAGGCTCC CTGCTCAGC-3') (SEKW. NR ID.: 126). Dodano optymalną sekwencję Kozak (CCGCCACC) do 5' miejsca startu ATG. Starter ten zastosowano do PCR w celu sklonowania lekkich łańcuchów następujących klonów przeciwciał: 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1 i 23.29.1. Do sekwencjonowania lekkich łańcuchów klonów
23.28.1 i 24.2.1. stosowano drugi zgodny starter 5'-TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3' (SEKW. NR ID.: 134). Tę samą metodę zastosowano również do zaprojektowania startera wokół kodonu stop obszaru stałego kappa (5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3') (SEKW. NR ID.:127). W celu amplifikacji cDNA użyto pary starterów, stosując zestaw do PCR Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech). Sekwencję produktu PCR otrzymano przez bezpośrednie sekwencjonowanie stosując standardowe techniki (np. chodzenie starterem, ang. starter walking), korzystając z zestawów do sekwencjonowania dye-terminator i sekwenatora ABI. Produkt PCR sklonowano w ssaczym wektorze ekspresyjnym i aby potwierdzić mutacje somatyczne, klony zsekwencjonowano. Sekwencje obu nici dla każdego klonu potwierdzano w co najmniej w trzech reakcjach.
Analiza wykorzystania genu
Tabela 2 przedstawia wykorzystanie genu, o którym świadczą klony przeciwciał tu ujawnionych z wybranych hybrydoma:
PL 214 634 B1
T a b e l a 2
Wykorzystanie genów łańcucha ciężkiego i lekkiego
Klon Łańcuch ciężki Łańcuch lekki kappa
VH D JH VK JK
3.1.1 (3-30+) DP-49 D4+ DIR3 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
7.1.2 (3-30+) DP-49 DIR5+ D1-26 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
10.8.3 (4.35) VIV-4 DIR3 JH6 L5 (DP5) JK4
15.1.1 (4-59) DP-71 D4-23 JH4 A3/A19 (DPK-15) JK2
21.4.1 (1-02) DP-75 DLR1 JH4 L5 (DP5) JK4
21.2.1 (3-30+) DP-49 DIR3+ D6-19 JH4 A3/A19 (DPK-15) JK3
22.1.1 (3-30+) DP-49 D1-1 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
23.5.1 (3-30+) DP-49 D4-17 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
23.28.1 (4-59) DP-71 DIR1 + D4-17 JH5 A27 (DPK-22) JK3
23.29.1 (3-30.3) DP-46 D4-17 JH6 A3/A19 (DPK-15) JK1
24.2.1 (4-59) DP-71 DIR1 + D4-17 JH5 A27 (DPK-22) JK3
Analiza sekwencji i mutacji
Wiadomo, że analiza wykorzystania genu dostarczyła jedynie ograniczonego spojrzenia na strukturę przeciwciała. Ponieważ komórki B w zwierzętach XenoMouse™ wytwarzają przypadkowe transkrypty ciężkiego łańcucha V-D-J lub lekkiego V-J kappa, występują liczne wtórne procesy, w tym, ale bez ograniczeń, somatyczne hipermutacje, delecje, N-addycje i wydłużanie CDR3. Zobacz, przykładowo Mendez i wsp., Nature Genetics 15:146-156 (1997) i międzynarodowa publikacja patentowa WO 98/24893. Zgodnie z tym, aby dalej badać strukturę przeciwciała, na podstawie cDNA otrzymanych z klonów przewidziano sekwencje aminokwasowe przeciwciał. Tabela A przedstawia identyfikatory sekwencyjne dla każdego nukleotydu oraz przewidywane sekwencje aminokwasowe zsekwencjonowanych przeciwciał.
Tabele 3-7 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkiego i lekkiego kappa przeciwciał 3.1.1 (Tabela 3), 7.1.2 (Tabela 4), 10.8.3 (Tabela 5),
15.1.1 (Tabela 6) i 21.4.1 (Tabela 7).
Tabele 8-13 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe domeny zmiennej łańcuchów ciężkiego i lekkiego kappa przeciwciał 21.2.1 (Tabela 8), 22.1.1 (Tabela 9), 23.5.1 (Tabela 10), 23.28.1 (Tabela 11), 23.29.1 (Tabela 12) i 24.2.1 (Tabela 13).
Sekwencja DNA zsekwencjonowanego pełnej długości przeciwciała monoklonalnego 23.28.1 różni się jedną parą zasad (C w G) od sekwencji DNA otrzymanych z zsekwencjonowania obszaru VH pierwotnego produktu PCR, co daje w rezultacie zmianę w pozycji 16 naturalnego łańcucha ciężkiego z D na E.
Tabele 14-19 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i przewidywane sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkiego i lekkiego kappa przeciwciał 21.2.1 (Tabela 14), 20 22.1.1 (Tabela 15), 23.5.1 (Tabela 16), 23.28.1 (Tabela 17), 23.29.1 (Tabela 18) i 24.2.1 (Tabela 19). W tabelach podkreślono peptydową sekwencję sygnałową (lub zasady ją kodujące).
Skonstruowano dwa zmutowane przeciwciała 22.1.1 i 23.28.1. Ciężki łańcuch przeciwciała
22.1.1 zmutowano, aby zmienić resztę cysteinową w pozycji 109 w resztę alaninową. Zmutowany klon
PL 214 634 B1 oznaczono jako 22.1.1H-CO19A. Zmutowano także lekki łańcuch przeciwciała 23.28.1 w pozycji 92, aby zmienić resztę cysteinową w resztę alaninową. Zmutowany klon oznaczono jako 23.28.1 L-C92A.
Mutagenezę specyficznych reszt wykonywano za pomocą zaprojektowanych starterów i zestawu do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit firmy Stratagene, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Mutacje potwierdzano za pomocą automatycznego sekwencjonowania, a zmutowane wstawki subklonowano do wektorów ekspresyjnych.
Tabela 20 przedstawia sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe zmutowanego łańcucha ciężkiego przeciwciała 22.1.1H-C109A. Tabela 21 dostarcza sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe zmutowanego łańcucha lekkiego przeciwciała 23.28.1. Zmutowane kodony DNA zaznaczono kursywą. Zmutowaną resztę aminokwasową zaznaczono pogrubioną czcionką.
T a b e l a 3
Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 3.1.1
Opis; Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCT
łańcucha ciężkiego CTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTG GAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTC CCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTT CAGTAGTTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTC CAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCA AAGGATGGAGGTAATAAATACCATGCAGACTCCGT GAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCA AGAATGCGCTGTATCTGCAAATGAATAGCCTGAGA GTTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGTGAGAAG AGGGCATCAGCTGGTTCTGGGATACTACTACTACA ACGGTCTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC TTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAG AGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCA GACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGT TGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTG GCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT CACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGG AGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCC CAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCA GCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCG ACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT AAATGA
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVVQPGRS
LRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAViSK DGGNKYHADSVKGRFTISRDNSKNALYLQMNSLRVE DTAVYYCVRRGHQLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVS VLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Sekwencja DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATG
CTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGCTG
ACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGA GAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAG CCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTG GTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCC TGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCC CTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGAT TTTACACTGAAAATCAGCAGATTGGAGGCTGAGGA TGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAAC TCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAA TCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCT TCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACT GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCC AGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACG CCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG CAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGA AACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAG GGGAGAGTGTTAG
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja białkowa łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVLTOSPLSLPVTPGE
PASISCRSSQSLLYSNGYNPLDWYLQKPGQSPQLLIYL GSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRLEAEDVGVYY CMQALQTPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG CCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGG GTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATA CCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAATGCGCTGTATCTGCAA ATGAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGTA TTACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGG GATACTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHW VRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISR DNSKNALYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGY YYYNGLDVWGQGTTVTVSS
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GATATTGTGCTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCC GTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAG GTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAA CTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTC TCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGC CTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGATTG GAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCA AGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGA CCAAGGTGGAAATCAAA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFLD WYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRLEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
DNA łańcucha ciężkiego(domena zmienna) (3.1.1H-A78T) SEKW. NR ID.: 89 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG CCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGG GTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATA CCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCTGTATCTGCAAA TGAATAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCTGTGTAT TACTGTGTGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGG ATACTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCC AAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Białko łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (3.1.1H-A78T) SEKW. NR ID.: 90 QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHW VRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRGHQLVLGY YYYNGLDVWGQGTTVTVSS
DNA łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (3.1.1H-A78T-V88AV97A) SEKW. NR ID.: 91 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGT CCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG CCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGGCATGCACT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGG GTGGCAGTTATATCAAAGGATGGAGGTAATAAATA CCATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCT CCAGAGACAATTCCAAGAATaCGCTGTATCTGCAAA TGAATAGCCTGAGAGcTGAAGACACGGCTGTGTATT ACTGTGcGAGAAGAGGGCATCAGCTGGTTCTGGGA TACTACTACTACAACGGTCTGGACGTCTGGGGCCA AGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Białko łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (3.1.1H-A78T-V88AV97A) SEKW. NR ID.: 92 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHW VRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGHQLVLGY YYYNGLDVWGQGTTVTVSS
DNA łańcucha lekkiego (domena zmienna) (3.1.1L-L4M-L83V) SEKW. NR ID.: 93 GATATTGTGaTGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCC GTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAG GTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATACAA CTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTC TCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGC CTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGAT CAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAgTG GAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCA AGCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGA CCAAGGTGGAAATCAAA
Białko łańcucha lekkiego (domena zmienna) (3.1.1 L-L4M-L83V) SEKW. NR ID,: 94 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNFLD WYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
PL 214 634 B1
T a b e l a 4
Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 7.1.2
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTT AAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTGTGGG GGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCAC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGG CAGTTATATCAAATGATGGAGATAATAAATACCATGCAGA CTCCGTGTGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCA GGAGCACGCTTTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGA GGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGG TCTAGTGGGAGCCGTGGGGATTACTACTACTACTACGGTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTG CTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGC CTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGT GGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCC AGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTAC ACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACC GTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCT TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGAC CCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAA GACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGG AGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTT CAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGC ACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATC TCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACA CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGT CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGAC ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAATGA
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPGRSLRLSC
AASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISNDGDNKYHAD SVWGRFTISRD.NSRSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGMGS SGSRGDYYYYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSR STSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVER KCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVV DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSV LTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQ VYTLPFSREEMTKNQVSLT€LVKGFYPSDfAVEWESNGQPEN NYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTG GGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTC CACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC TCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCTTGTATAGTAATGGATA CAACTTTTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC GTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATT TTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGG GGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGT TCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC TT CT ATCCC AG AG AGGC C A AAGT AC AGT GGAAGGTGG AT A ACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGT CAC A A AG AGCTTC A AC AGGGGAG AGT GTT AG
Sekwencja białkowa łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDiVMTOSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLLYSNGYNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQD8KDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAATGAT GGAGATAATAAATACCATGCAGACTCCGTGTGGGGCCGAT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGGAGCACGCTTTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTATATT ACTGTGCGAGAAGAGGCATGGGGTCTAGTGGGAGCCGTGG GGATTACTACTACTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAG GGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAP GKGLEWVAVISNDGDNKYHADSVWGRFTISRDNSRSTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARRGMGSSGSRGDYYYYYGLDVWGQ GTTVTVSS
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCAC CCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGA GCCTCTTGTATAGTAATGGATACAACTTTTTGGATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTT GGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTG GCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAA GCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPAS1SCRSSQSLLYSNGYNFLDWYLQ KPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKłSRVEAE DVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVE1K
T a b e l a 5
Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 10.8.3
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACACCTGTGGTTĆTTCCTCĆTGCTGGTGGCAGCTCC
CAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGC CCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTAGTTACTACTGGATCT GGATCCGGCAGCCCGCCGGGAAGGGACTGGAATGGATTGG GCGTGTCTATACCAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCC CTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGA ACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGAC ACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGTCTTTACAGGG GGTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCAC CGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCC TGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGC CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCA CCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAA CACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTC GAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGT CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACG TGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACG GGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCAT CGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATG ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
TCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTG GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLVKPSETLSLTCT VSGGSISSYYWIWIRQPAGKGLEWIGRVYTSGSTNYNPSLKSR VTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDGLYRGYGM DVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
Sekwencja DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTG GTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTC CATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATC ACTTGTCGGGCGAGTCAGCCTATTAGCAGCTGGTTAGCCTG GTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATT TATTCTGCCTCCGGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTT CAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCA ACAGACTGACAGTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGCGGGACC AAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCT TCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACT GCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGA GGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCG GGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGT CACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTC AACAGGGGAGAGTGTTAG
Sekwencja białkowa łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLLLWFPGSRCDIOMTOSPSSVSASVGDRVTITC RASQPISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASGLQSGVPSRFSGSG SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTDSFPLTFGGGTKVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGC CTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGTAGTTACTACTGGATCTGGATCCGGCAGCCCGC CGGGAAGGGACTGGAATGGATTGGGCGTGTCTATACCAGT GGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA CCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAA GCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACT GTGCGAGAGATGGTCTTTACAGGGGGTACGGTATGGACGT CTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWIWiRQPAGK GLEWIGRVYTSGSTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSV TAADTAVYYCARDGLYRGYGMDVWGQGTTVTVSS
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATC TGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAG CCTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAG GGAAAGCCCCTAAACTCCTGATTTATTCTGCCTCCGGTTTG CAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGA AGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGACTGACAGTTTCC CGCTCACTTTCGGCGGCGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DiQMTQSPSSVSASVGDRVTlTCRASQPISSWLAWYQQKPGK APKLLIYSASGLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATY YCQQTDSFPLTFGGGTKVEIK
T a b e l a 6
Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 15.1.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCC
CAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGC CCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAAGTTACTACTGGACCT Ζ’Ζ A 'Τ'Ζ^/^Ζ^Ζ^Ζ^ A Z^Z^Z^Z^Z^Z^ A Z^Z^Z-1’ A A Ζ'Ζ^Ζ^ λ ζ^’Τ'Ζ*’Z^ A ζ^’Τ'Ζ^Ζ^ A nrt^z^Z^ GGA ł GGGGGAGGGGGGAGGGAAGGGAG i GGAG ł GGA ł IGG ATATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAATCCCTCCC TCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACATGTCCAAGAA CCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACA CGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAAAGGGTGACTACGGTGG TAATTTTAACTACTTTCACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGG TCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGC
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
GTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTA CTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCG GCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGT GTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGAC CGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCCA-A.AACCCA.AGGA-CA.CCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGG ACGTGAGTCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTA CGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCA CGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCC ATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAG AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGAT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCT GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAG AAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLVKPSETLSLTCT
VSGGSIRSYYWTWiRQPPGKGLEWIGYłYYSGSTNYNPSLKSR VTISVDMSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGDYGGNFNY FHQWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMłSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKT1SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
Sekwencja DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTG
GGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTC
CACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC TCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACATACTAATGGATA CAACTATTTCGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACAACTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGG GTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATT ttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttgg GGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCGTACAGTT TTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGC TGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGT TGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATA ACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCT
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
ACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGT CACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Sekwencja białkowa łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTPGEPASISC
RSSQSLLHTNGYNYFDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYSFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGC CTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAAGTTACTACTGGACCTGGATCCGGCAGCCCCC AGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTATTACAGT GGGAGCACCAACTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCA CCATATCAGTAGACATGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAA GCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTTTATTACT GTGCGAGAAAGGGTGACTACGGTGGTAATTTTAACTACTTT CACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSYYWTWIRQPPGK GLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDMSKNQFSLKLSSVT AADTAVYYCARKGDYGGNFNYFHQWGQGTLVTVSS
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCAC CCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGA GCCTCCTACATACTAATGGATACAACTATTTCGATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAACTCCTGATCTATTT GGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTG GCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAA GCTCTACAAACTCCGTACAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGC TGGAGATCAAA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHTNGYNYFDWYLQ KPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCMQALQTPYSFGQGTKLEIK
T a b e l a 7
Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 21.4.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DNA łańcucha ciężkiego ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAG
CCACAGGAGCCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG GGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCC TGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCA CTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATG
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
GGATGGATCAACCCTGACAGTGGTGGCACAAACTATGCAC AGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTC CATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAACAGGCTGAGATCT GACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGCCCC TAGGATATTGTACTAATGGTGTATGCTCCTACTTTGACTAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCAC CAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGA GCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAA GGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCA GGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAAC GTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACA GTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAG CACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCA AAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGA GGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGG ACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGA CTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAA CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGGCGGAGAACAACTACAA GACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCC TCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGC ACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGG TAAATGA
Sekwencja białkowa łańcucha ciężkiego MDWTWRILFLVAAATGAHSOVOLVOSGAEVKKPGASVKVS
CKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNY AQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQP LGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRS TSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERK CCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVL TVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPiEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK
Sekwencja DNA łańcucha lekkiego GTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTC CATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATC ACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTTACAGCTGGTTAGCCTG GTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATC TATACTGCATCCACT1TACAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTT
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
CAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC AGCAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCA ACAGGCTAACATTTTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCA AGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTT CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTG CCTCTGTrGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAG GCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGG GTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGG ACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCA ACAGGGGAGAGTGTTAG
Sekwencja białkowa łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLLLWFPGSRCDIOMTOSPSSVSASVGDRVTITC
RASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIKRT VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGC CTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATAC ACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCC TGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTGAC AGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGG TCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACAT GGAGCTGAACAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTAT TACTGTGCGAGAGATCAGCCCCTAGGATATTGTACTAATG gtgtatgctcctactttgactactggggccagggaaccctg GTCACCGTCTCCTCA
Sekwencja białkowa dojrzałej domeny zmiennej łańcucha ciężkiego QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQA PGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYM ELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTL VTVSS
Sekwencja DNA dojrzałej domeny zmiennej łańcucha lekkiego GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATC TGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAG GGTATTTAGAGCTGGTTAGCCTGGTATGAGGAGAAACCAG GGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATACTGCATCCACTTTA CAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTG GGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGA AGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACATTTTCC CGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Sekwencja DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGK
białkowa AFNLL1YTASTLQSGVpsRFSGSGSGTDFTLTISSLQpEDFATY
dojrzałej domeny zmiennej łańcucha YCQQANLFP LTFGGGTKYEIK
lekkiego
T a b e l a 8
Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 21.2.2
Opis: Sekwencja;
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAGCTATGTCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGAT GGAAGTAGTAAATACTATGCAAACTCCGTGAAGGGCCGAT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG CAAATAAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATT ACTGTGCGAGAGATGGGGGTAAAGCAGTGCCTGGTCCTGA CTACTGGGGCCAGGGAATCCTGGTCACCGTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYVMHWVRQAP GKGLEWVAVMSYDGSSKYYANSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ INSLRAEDTAVYYCARDGGKAVPGPDYWGQGILVTVSS
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCAC CCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGA GTGTTCTGTATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTT GGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTG GCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAA GTTTTACAAACTCCATTCACTTTCGGCC.CTGGGACCAAAGT GGATATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSVLYSNGYNYLDWYLQ KPGQSPQLL1YLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCMQVLQTPFTFGPGTKVDIK
Tabela 9: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 22.1.1
Opis: Sekwencja:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGAT GGAGGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATT ACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACTACCACTA CTGTGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja:
GTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAP GKGLEWVAVISSDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCTRRGTGKTYYHYCGMDVWGQGTTVT vss
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCAC CCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGA GCCTCCTGTATAGTAATGGATATAACTATTTGGATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACACCTCCTGATCTATTT GGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTG GCAGTGGTTCAGGCACTGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAA GCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG T GGAAATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASiSCRSSQSLLYSNGYNYLDWYEQ KPGQSPHLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 10: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 23.5.1
Opis: Sekwencja:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAACTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAATTATATCATATGAT GGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATGT GCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTAT TACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAGGGATTACTACT CCTACTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGT CACCGTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSNYGMHWVRQAP GKGLEWVAIISYDGSNKYYADSVKGRFTłSRDNSKNTLYVQM NSLRAEDTAVYYCARRGHYGRDYYSYYGLDVWGQGTTVTV SS
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCAC CCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGA GCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTT GGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTG GCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAA GCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSFLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQ KPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
PL 214 634 B1
Tabela 11: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 23.28.1
.....2£is: Sekwencja:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGACACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGA TCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTG GGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACC CCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACA CGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGT GACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAG AAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGC CCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC AG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIR QPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQ FSLKLNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQ GTLVTVSS
DNA łańcucha lekkiego GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTT TGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGG CCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGC ACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCA tctatggtgcatccagcagggccactggcatcccag ACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCA CTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTG CAGTGTATTACTGTCAGCACTGTCGTAGCTTATTCAC TTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSDLAWHQQ KPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRL EPEDFAVYYCQHCRSLFTFGPGTKVDIK
DNA łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (23.28.1H-D16E) (SEKW. NR ID.: 97) CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTG AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCT CTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGA TCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTG GGTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACC CCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACA CGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGT GACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAG AAAGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGTTCGC CCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTC AG
Białko łańcucha ciężkiego (domena zmienna) (23.28.1H-D16E) (SEKW. NR ID.: 98) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIR QPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQ FSLKLNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGWFAPWGQ GTLYTYSS
PL 214 634 B1
Tabela 12: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 23.29,1
Opis: Sekwencja:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTAGCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGAT GGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT TCACCATCTACAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCT GCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTAT TACTGTGCGAGACGCGGTCACTACGGGAATAATTACTACT CCTATTACGGTTTGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGT CACCGTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego QVQLVES GGGVVQPGRSLRLSC AASGFTFS SYAMHWVRQAP GKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTIYRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCARRGHYGNNYYSYYGLDVWGQGTTV TVSS
DNA łańcucha lekkiego GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCAC CCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGA GCCTCCTGCCTGGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTAC CTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTT GGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTG GCAGTGGCTCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAG AGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGATTTATTACTGCATGGAA GCTCTACAAACTCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGG TGGAAATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego DIVMTQSPLSLPVTPGEPASłSCRSSQSLLPGNGYNYLDWYLQ KPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAE DVGIYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIK
Tabela 13: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała24.2.1
Opis: Sekwencja:
DNA łańcucha ciężkiego CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGC CTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGC TCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCC CAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATTACAG TGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTC ACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGA AGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTAC TGTGCGAGAAGGGGGGGCCTCTACGGTGACTACGGCTGGT G
Białko łańcucha ciężkiego QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGYYWSWIRQPPGK GLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVT AADTAVYYCARRGGLYGDYGWFAPWGQGTLVTVSS
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja:
DNA łańcucha lekkiego GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTC TCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAG AGTGTTAGCAGCACCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC CTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGC AGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGT CTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCC TGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGCT TATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAC
Białko łańcucha lekkiego EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSTYLAWYQQKPGQ APRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAW YCQQYSSLFTFGPGTKVDIK
Tabela 14: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 21.2.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTT
AAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG GGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGTCATGCAC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGG CAGTTATGTCATATGATGGAAGTAGTAAATACTATGCAAA CTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATAAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTAA AGCAGTGCCTGGTCCTGACTACTGGGGCCAGGGAATCCTG GTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTC GGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTG TGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC ACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGA TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGG CTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
Białko łańcucha MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPGRSLRLSC
ciężkiego AASGFTFSSYVMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGSSKYYAN SVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCARDGGKAV PGPDYWGQGILVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPA PPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK
DNA łańcucha ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTG
lekkiego GGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTC CACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC TCCTGCAGGTCTAGTCAGAGTGTTCTGTATAGTAATGGATA CAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCT CCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGG GGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGAT TTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTG ULfLi 1 1 i A1 i Αν 1U LA I LLAAb 1 1 1 1 ALAAAL1LL A1 1 LAL 1 TTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAG AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTPGEPASISC
lekkiego RSSQSVLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQVLQTPFTFGPGT KVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
PL 214 634 B1
Tabela 15; Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 22.1,1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTT
AAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGG GGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTCGCTATGGCATGCAC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGG CAGTTATATCATCTGATGGAGGTAATAAATACTATGCAGA CTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGAAGAGGGACTGG AAAGACTTACTACCACTACTGTGGTATGGACGTCTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGG GCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACC TCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACT ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC TCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCC TCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAG ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGA GCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCA CCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACG TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCC AGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCT GAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGG CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAA GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTG CCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGG GAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA ATGA
Białko łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPGRSLRLSC
AASGFTFSRYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISSDGGNKYYAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSERAEDTAVYYCTRRGTGKT YYHYCGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVEC PPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTWHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTG
GGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTGTC
CACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC TCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGTATAGTAATGGATA TAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTC CACACCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGG GTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGCACTGATTT TACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGG GTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACGTT CGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCT GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTT GAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAA CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAG CAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCY TGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTC ACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTPGEPASISC
RSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPHLLIYLGSNRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAK Vqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadye KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 16: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 23.5.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTT
aagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctggg GGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGTAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCATGCAC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGG CAATTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGA CTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC AAGAACACGCTGTATGTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTA CGGGAGGGATTACTACTCCTACTACGGTTTGGACGTCTGGG GCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCA CCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACA GTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGC CCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGT AGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCAC
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
CACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGT CCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACG TTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTG GCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCC ATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGOGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA CCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA
Białko łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGV0C0V0LVESGGGVV0PGRSLRLSC VASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAIISYDGSNKYYADS VKGRFTISRDNSKNTLYVQMNSLRAEDTAVYYCARRGHYGR DYYSYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSES TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVE CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTWH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLP PSREFMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTG GGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTC CACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC TCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATA CAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCT CCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGG GGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGAT TTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTG GGGTTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACG TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTSTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAG AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CYTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Białko łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTPGEPASISC
RSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAXVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 17: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 23.28.1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCC
CAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGC CCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCT GGATCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGG GTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCC TCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAA CCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTGACCGCTGCGGACA CGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAAAGGGGGGCCTCTACGG TGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTG Ζ'Τ'Ζ^ A A ZZT1 ą Z1 Z5 * a Ι'ΖΖΖΕ’Ζ A '’Τ’Ζ^Ζ^ΖΜΓΛ1'Ζ*’’*Ϊ^ΓΤΛ £ w/W/k/kJ i I 1 1 £_ jtł £ 1 £ £ CCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTC GGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTG TGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC ACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGA ACGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGA TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGG CTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Białko łańcucha ciężkiego MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLVKPSETLSLTCT
VSGGSIRGYYWSW1RQPPGKGLEWIGY1YYSGSTNYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLK.LNSVTAADTAVYYCARKGGLYGDYGW FAPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYpSD,AVEWESNGQpENNYKTTppMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DNA łańcucha lekkiego ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTG
GCTCCCAGAATCCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT
CCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCT CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTA GCCTGGCACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCC TCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGA CAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTC ACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATT ACTGTCAGCACTGTCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGG ACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTG TCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAA TCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT TCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego METPAOLLFLLLLWLPESTGEIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCR
ASQSVSSSDLAWHQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSG SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHCRSLFTFGPGTKVDIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTFIQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 18: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 23.29.1
| Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową);
DNA łańcucha ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTT
ciężkiego s AAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGG GGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCCATGCAC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGG CAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGA
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
CTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTACAGAGACAATTCC AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACGCGGTCACTA CGGGAATAATTACTACTCCTATTACGGTTTGGACGTCTGGG GCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCA CCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACA GTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGC CCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGT AGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTT GAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCAC CACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGT CCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAAT GCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACG TTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTG GCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCA AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCC ATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGG agtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaaga CCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA
Białko łańcucha ciężkiego MEFGLSWVFLVALLRGVOCOVOLVESGGGVVOPGRST.Ri.SC
AASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYAD SVKGRFTIYRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGHYG NNYYSYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSNFGTQIYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSH EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTW HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTL PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha lekkiego ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTG
GGTCTCTGGATCCAGTGGGGATATTGTGATGACTCAGTCTC
CACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC TCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATA CAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCT CCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGG GGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGCACAGAT TTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTG GGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACG TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTTCAGTGGAGGGTGGAT AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAG AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTPGEPASISC
RSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQALQTPRTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWRVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
DNA łańcucha lekkiego (23.29.1LR174K ) (SEK.W. NR iD,:10ł) ATGAGGCTCCCTGCTCAGCTCCTGGGGCTGCTAATGCTCTG
ggtctctggatccagtggggatattgtgatgactcagtctc
CACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATC TCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCCTGGTAATGGATA CAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCT CCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGG GGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGCACAGAT TTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTG GGATTTATTACTGCATGCAAGCTCTACAAACTCCTCGGACG TTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGG CTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG TTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAA CTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTTCAGTGGAAGGTGGAT AACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAG AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCAC CCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTC TACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCG TCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
Białko łańcucha lekkiego (23.29.1LR174K ) (SEKW. NR ID.:1O1) MRLPAOLLGLLMLWVSGSSGDIVMTOSPLSLPVTPGEPASISC
RSSQSLLPGNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLiYLGSNRASGVPD RFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQALQTPRTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVT£QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 19: Sekwencje DNA i białkowe przeciwciała 24,2,1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCC
CAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGC CCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG CACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGAGGTTACTACTGGAGCT GGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGG GTATATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCC TCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAA CCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACA CGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGGGGGGCCTCTACGG TGACTACGGCTGGTTCGCCCCCTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACA GCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAAC CGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTC GGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTG TGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGA CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTG GACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGT ACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC ACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGC-CCC CATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGA GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGA TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGG CTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGC TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACC GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
PL 214 634 B1
Opis: Białko łańcucha ciężkiego Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową): MKHLWFFLLLVAAPRWVLSOVOLOESGPGLVKPSETLSLTCT VSGGSIRGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSR VTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARRGGLYGDYGW FAPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDiAVEWFSNGQPENNYKTTPPMLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK
DNA łańcucha lekkiego ATGGAAACCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTG GCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT CCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCT CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCACCTACTTA GCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGA CAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTC ACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATT ACTGTCAGCAGTATAGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGG ACCAAAGTGGATATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTG TCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAA TCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCA AGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCT TCAACAGGGGAGAGTGTTAG
Białko łańcucha lekkiego METPAOLLFLLLLWLPDTTGEIYLTOSPGTLSLSPGERATLSCR ASQSVSSTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSG SGTDFTLT1SRLEPEDFAVYYCQQYSSLFTFGPGTKVDIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Tabela 20: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała 22.1.1H-C109A
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha ciężkiego (SEKW. NR ID.: 95) CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGC CTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTC ACCTTCAGTCGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATCTGAT
PL 214 634 B1
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
GGAGGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGAT TCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTG CAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATT ACTGTACGAGAAGAGGGACTGGAAAGACTTACTACCACTA CGCCGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACC GTCTCCTCAG
Białko łańcucha ciężkiego (SEKW. NR ID.: 96) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYGMHWVRQAP GKGLEWVAVISSDGGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCTRRGTGKTYYHY/łGMDVWGQGTTVT vss
Tabela 21: Sekwencje DNA i białkowe dojrzałych domen zmiennych przeciwciała
23.28.1L-C92A
Opis: Sekwencja (podkreślono sekwencję sygnałową):
DNA łańcucha lekkiego (SEKW. NR ID.: 99) GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTT GTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCA GTCAGAGTGTTAGCAGCAGCGACTTAGCCTGGCACCAG CAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTATGG TGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCA GTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATC AGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTG TCAGCACGCCCGTAGCTTATTCACTTTCGGCCCTGGGA C C A.A.A.OTGGA/T.AfTCA A AC
Białko łańcucha lekkiego (SEKW. NR ID.: 100) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSDLAWHQQKP GQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPED FAVYYCQHJRSLFTFGPGTKVDIK
P r z y k ł a d III
Analiza podstawień aminokwasowych łańcucha ciężkiego i lekkiego
Figury 1D-1H i 2D-2H przedstawiają przyrównanie sekwencji pomiędzy przewidywanymi sekwencjami aminokwasowymi domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciał monoklonalnych 3.1.1.
7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1H-C109A, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1 i 24.2.1, oraz sekwencjami aminokwasowymi ich odpowiednich genów z linii zarodkowej. Większość obszarów CDR3 łańcucha ciężkiego zawiera insercje aminokwasowe.
Gen DLR1 stosowany w domenie VH przeciwciała 21.4.1 koduje 2 reszty cysteinowe (Cys). Analiza za pomocą spektrometrii mas i modelowanie homologiczne pokazało, że dwie reszty cysteinowe łączą się mostkiem dwusiarczkowym i że to połączenie dwusiarczkowe nie niszczy struktury przeciwciała.
Figury 1A-1C i 2A-2C przedstawiają przyrównanie sekwencji pomiędzy przewidywanymi sekwencjami aminokwasowymi domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciał monoklonalnych 3.1.1,
7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.28.1, 23.28.1L-C92A, 23.29.1 i klonów 24.2.1,
PL 214 634 B1 oraz sekwencjami aminokwasowymi ich odpowiednich genów z linii zarodkowej. Łańcuchy lekkie tych przeciwciał pochodzą od trzech różnych genów Vk. Siedem z jedenastu przeciwciał wykorzystuje gen A3/A19 Vk, z których sześć ma dwie mutacje w obszarze CDR1. Dalej, pięć z siedmiu przeciwciał wykorzystujących gen A3/A19 Vk, korzysta również z genu Jk1; we wszystkich tych przeciwciałach pierwszy aminokwas pochodzący z genu Jk1, jest zgodnie zamieniony z W na R.
Należy zdawać sobie sprawę z tego, że wiele zidentyfikowanych powyżej substytucji aminokwasowych lub insercji znajduje się w pobliżu lub w obszarze CDR. Wydaje się. że substytucje takie mają pewien wpływ na wiązanie przeciwciała z cząsteczką CD40. Ponadto, substytucje takie mogą mieć znaczący wpływ na powinowactwo przeciwciał.
P r z y k ł a d IV
Gatunkowa reaktywność krzyżowa przeciwciał
W celu określenia wiązania i powinowactwa przeciwciał tu ujawnionych w stosunku do CD40, przeprowadzono analizy FACS dla różnych gatunków, zwłaszcza pewnych małp Starego Świata. Porcje całkowitej krwi ludzkiej i małpiej inkubowano przez 1 godz. w lodzie z wzrastającymi stężeniami przykładowych przeciwciał anty-CD40 lub z przeciwciałem anty-hemocyjanina skałoczepu (KLH), użytym jako kontrola ujemna. Następnie próbki inkubowano przez 30 min. w lodzie z anty-ludzkim IgG2 skoniugowanym z RPE (fikoerytryna). Wiązanie mierzono za pomocą cystometrii przepływowej komórek B dodatnich względem CD19/CD20, a histogramy intensywności fluorescencji (F12-H) analizowano w stosunku do liczby komórek (zliczenia), stosując oprogramowanie CellQuest. Dla każdego przeciwciała z wykresu szacowano wiązanie (KD), jako średnia intensywności fluorescencji w stosunku do stężenia przeciwciała. Ubytek przeciwciała kontrolowano przez pomiar wiązania w zakresie stężeń komórkowych.
Przeciwciała 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 i 21.4.1 badano pod kątem wiązania z ludzkimi, rezusowymi i makaka jawajskiego komórkami B. Badano również przeciwciała 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 i 24.2.1 pod kątem wiązania z komórkami B ludzkimi i makaka jawajskiego.
Zaobserwowano, że maksymalny sygnał i stężenie dla połowy maksimum wiązania z komórkami małpimi, miały współczynnik dwa, w stosunku do odpowiadających sobie parametrów dla ludzkich komórek B. Nie obserwowano wiązania w podobnych doświadczeniach z krwią myszy, szczura, królika i psa.
P r z y k ł a d V
Selektywność przeciwciał wobec CD40
W celu określenia selektywności wobec CD40 przeciwciał tu ujawnionych przeprowadzono inny test in vitro.
Selektywność CD40 w teście typu ELISA: materiały i metody
Płytki FluroNUNC (Nunc nr kat. 475515) z 96 studzienkami opłaszczono czterema antygenami: CD40/Ig, CD44/Ig, RANK/Ig, 4-1BB/Ig, TNFR-1/Ig i TNFR-2/Ig (antygeny przygotowane we własnym zakresie) przez noc w temp. +4°C, w stężeniu pg/ml przy 100 μΙ/studzienkę, w 0,1 M buforze wodorowęglanu sodu o pH 9,6. Płytkę płukano następnie trzykrotnie stosując PBST (PBS + 0,1% Tween-20) i blokowano PBST+0,5% BSA, stosując 150 pl/studzienkę. Płytkę inkubowano w temp. pokojowej przez 1 godz., a następnie płukano trzykrotnie PBST. Następnie, rozcieńczano przeciwciała anty-CD40, wytworzone w Przykładzie I w bloku przy stężeniu 1 pg/ml i rozcieńczone przeciwciała dodawano do płytki. Płytkę inkubowano w temp. Pokojowej przez 1 godz., a następnie płukano trzykrotnie PBST. Następnie studzienki zawierające przeciwciała wytworzone w Przykładzie I traktowano anty-ludzkim IgG2-HRP (Southern Biotech nr kat. 9070-05) w ilości 100 ml/studzienkę, w rozcieńczeniu 1:4000 w bloku. Jeden rząd traktowano również anty-ludzkim IgG (Jackson nr kat. 209-035-088) rozcieńczonym 1:5000 w bloku i dodawano 100 pl/studzienkę w celu normalizacji opłaszczenia płytki. Jeden rząd traktowano również anty-ludzkim CD40-HRP (Pharmingen nr kat. 345815/Custom HRP koniugowany) w rozcieńczeniu 0,05 pg/ml w bloku, jako kontrolę dodatnią. Płytkę inkubowano w temp. pokojowej przez 1 godz., a następnie płukano trzykrotnie PBST. Dodawano 100 pl/studzienkę substratu TMB (K & P Labs) i płytkę inkubowano przez 5 do 10 min. Następnie odczytywano wyniki z płytki, stosując czytnik do płytek Spectra-Max™. Wyniki pokazały, że przeciwciała wykazują selektywność w stosunku do CD40, która jest co najmniej 100 razy większa niż ich selektywność w stosunku do RANK, 4-1BB, TNFR-1 i TNFR-2, w tym specyficzny sygnał CD40 (sygnał CD40 pomniejszony o tło) jest co najmniej 100 razy mocniejszy, niż odpowiadający sygnał dla innych cząsteczek.
PL 214 634 B1
P r z y k ł a d VI
Badania klasyfikacji epitopów
Po wykazaniu, że przeciwciała tu ujawnione są selektywne wobec CD40, przeprowadzono analizę współzawodnictwa w wiązaniu, stosując BIAcore i FACS.
Badania współzawodnictwa BIAcore
Badania konkurencyjności BIAcore przeprowadzono w celu określenia czy ludzkie przeciwciała anty-CD40 wiążą się z tymi samymi lub różnymi miejscami w cząsteczce CD40.
W doświadczeniach tych zastosowano aparaturę BIAcore 200, postępując zgodnie z protokołami producenta. Białko A unieruchamiano na powierzchniach sensorowych chipów BIAcore. Nasycone stężenie CD40-Ig, obejmujące zewnątrzkomórkową domenę CD40 wiązano z chipem sensorowym. Następnie chipa sensorowego związanego z CD40 w warunkach nasyconych, wiązano z pierwszym ludzkim agonistycznym przeciwciałem anty-CD40 tu ujawnionym, komercyjnym przeciwciałem antyCD40 lub CD40L. Następnie mierzono zdolność drugiego ludzkiego agonistycznego przeciwciała anty-CD40 tu ujawnionego do współzawodnictwa z pierwszym przeciwciałem, komercyjnym przeciwciałem lub CD40L o wiązanie się z CD40. Technika ta umożliwia przypisanie przeciwciał do różnych grup wiążących. Wiązanie z CD40 wskazuje na rozpoznanie niezależnego epitopu. Brak wiązania może wskazywać na rozpoznanie tego samego epitopu lub na zachodzenie na siebie epitopów.
Badania FACS
Badania FACS przeprowadzono w celu określenia czy ludzkie przeciwciała anty-CD40 tu ujawnione wiążą się z tym samym, czy z innym miejscem na cząsteczce CD40 i w celu określenia czy wiążą się one z tym samym, czy z innym miejscem na cząsteczce CD40 co komercyjnie dostępne przeciwciała anty-CD40 EA5 (Alexis nt kat. ANC-300-050), LOB7/6 (Serotec MCA/590PE) i 5C3 (Pharmingen # 555458 (niewyznakowane), i 555460 (wyznakowane PE dla FACS).
Komórki dendrytyczne, traktowane przeciwciałami anty-CD40 tu ujawnionymi z przeciwciałem EA5 wyznakowanym PE lub LOB7/6 wyznakowanym PE barwiono przeciwstawnie w lodzie przez 30 min. Po płukaniu barwienie komórek analizowano w cytometrze typu B-D caliber cytometer. Słabsze wiązanie przeciwciał komercyjnych interpretowano jako oznakę tego, że badane przeciwciało wiąże się z tym samym lub z pokrywającym się epitopem.
Analiza współzawodnictwa wiązania przeprowadzona za pomocą BIAcore i FACS wykazała, że epitopy rozpoznawane przez przeciwciała mAb 21.4.1 zachodzą na epitop rozpoznawany przez przeciwciało EA5, nie zachodzą na epitop rozpoznawany przez komercyjnie dostępne przeciwciało LOB7/6 i nie zachodzą na miejsce wiązania dla CD40L. Epitopy rozpoznawane przez pozostałe przeciwciała nie zachodzą na miejsce wiązania dla CD40L.
Tabela 22 podsumowuje wyniki badań klasyfikacji tych epitopów.
T a b e l a 22
Klasyfikacja BIAcore współzawodnictwa epitopów niektórych z ujawnionych niniejszym przeciwciał anty-CD40
EA5 5C3 LOB7/6 3.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.29.1 21.4.1 23.25.1, 23.28.1, 24.2.1 CD40L
EA5 X X X X
5C3 X X X X X
LOB7/6 X X X X
3.1.1, 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.29.1 X X X
21.4.1 X X X
23.25.1, 23.28.1, 24.2.1 X X X X
CD40L X X X X X X
PL 214 634 B1
P r z y k ł a d VII
Podwyższenie ekspersji cząsteczek powierzchniowych przez przeciwciała anty-CD40 W celu określenia czy ujawnione niniejszym ludzkie przeciwciała anty-CD40 podwyższają ekspresję cząsteczek powierzchniowych na komórkach B, przeprowadzono test z krwią pełną.
Pełną krew ludzką lub naczelnych rozcieńczano 1:1 podłożem RPMI i inkubowano 24 godz.
z różnymi stężeniami przeciwciał agonistów CD40 lub z kontrolami. Komórki barwiono przez 30 min. (w lodzie, w ciemności) pod kątem HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD19/CD20, CD40, CD23 i CD71, stosując komercyjnie dostępne odczynniki będące przeciwciałami znakowanymi fluorochromem. Komórki analizowano następnie w aparacie FACS-Caliber (Becton-Dickinson). Komórki B identyfikowano przez bramkowanie na komórki dodatnie względem CD19 lub CD20, a markery aktywacji określano dla danej bramki.
Maksymalną krotność wzrostu średniej fluores cencji (przy <1 gg/ml przeciwciała) i średnie EC50 otrzymane przy zastosowaniu przeciwciała anty-CD40 (21.4.1), przedstawiono w Tabeli 23.
T a b e l a 23
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki B przez przeciwciało anty-CD40
Maksymalna krotność wzrostu EC50 (ng/ml)
Średnia +/- odchylenie stand. Średnia +/- odchylenie stand.
MHC II 4,50 +/- 0,52 3,85 +/- 0,35
CD71 2,30 +/- 0,77 0,73 +/- 0,28
ICAM 4,52 +/- 2,42 15,3 +/- 7,3
CD23 69,9 +/- 25,8 19,0 +/- 4,4
B7-2 2,74 +/- 0,14 16,0 +/- 21,9
Doświadczenia prowadzono również w celu określenia czy ludzkie przeciwciała anty-CD40 tu ujawnione zwiększają wyrażanie cząsteczek powierzchniowych komórek dendrytycznych pochodzących od monocytów.
Przygotowywanie komórek dendrytycznych pochodzących od monocytów
Krew obwodową pobierano od zdrowych ludzkich ochotników. Komórki jednojądrzaste izolowano stosując probówki Sigma Accuspin (St. Louis, MO), płukano stosując podłoża RPMI (Gibco BRL, Rockville, MD) i umieszczano w stężeniu 5 x 106/ml w kolbach do hodowli tkankowej, w pełnej pożywce RPMI (zawierającej 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 10 mM buforu HEPES, 2 mM glutaminy, 0,1 mM aminokwasów niebędących podstawowymi; wszystko z Gibco BRL); i 10% płodowej surowicy cielęcej (Hyclone, Logan, Utah). Po 3 godz. inkubacji w temp. 37°C (5% CO2), usuwano nieprzylegające komórki, a komórki T izolowano stosując kolumny selekcjonujące (R&D systems, Minneapolis, MN). Komórki przylegające płukano stosując podłoże RPMI i inkubowano przez 7 dni w pełnym podłożu RPMI z dodatkiem 10 ng/ml IL-4 (R&D systems) i 100 ng/ml GM-CSF (R&D systems). Następnie izolowano komórki nieprzylegające, płukano i stosowano jako komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów (mDCs) we wszystkich doświadczeniach. Pozostałe komórki adherentne usuwano stosując trypsynę / EDTA i używano w doświadczeniach z adherentnymi monocytami.
W celu określenia czy ujawnione niniejszym przeciwciała anty-CD40 zwiększają ekspresję markerów powierzchniowych komórki, komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów hodowano z różnymi stężeniami przeciwciał agonistycznych przez 48-72 godz., a następnie barwiono (30 min. w lodzie, w ciemności) pod kątem HLA-DR, ICAM, B7-1, B7-2, CD40 i CD83, stosując komercyjnie dostępne odczynniki będące przeciwciałami znakowanymi fluorochromem. Komórki analizowano następnie na aparacie FACS-Caliber (Becton-Dickinson).
Maksymalną krotność wzrostu średniej fluorescencji (przy <1 μg/ml przeciwciała) i średnie EC50 otrzymane przy zastosowaniu przeciwciała anty-CD40 (21.4.1), przedstawiono w Tabeli 24.
PL 214 634 B1
T a b e l a 24
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki dendrytycznej przez przeciwciało anty-CD40
Maksymalna krotność wzrostu EC50 (ng/ml)
Średnia +/- odchylenie stand. Średnia +/- odchylenie stand.
MHC II 7,7 +/- 5,6 252 +/- 353
CD83 36,3 +/- 42,2 233 +/- 262
ICAM 10,4 +/- 4,8 241 +/- 140
B7-2 21,9 +/- 9,4 71,4 +/- 44,4
Podobne doświadczenia przeprowadzono z komórkami B i mDC stosując różne ujawnione niniejszym przeciwciała anty-CD40 i dodatkowe markery. Mierzono ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórek B (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 i CD23) jak to opisano powyżej, ale stosując 1 μg/ml przeciwciała anty-CD40. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w Tabeli 25. Mierzono ekspresję cząsteczek powierzchniowych komórki dendrytycznej (MHC-II, ICAM, B7-1, B7-2 i CD83) po 72 godz., jak wskazano powyżej, ale stosując 1 pg/mI przeciwciała anty-CD40. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono w Tabeli 26. Tabele 25-26 pokazują krotność wzrostu w średniej intensywności +/odchylenie standardowe.
T a b e l a 25
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki B przez przeciwciała anty-CD40
MHC klasy II ICAM (CD54) B7-1 (CD 80) B7-2 (CD86) CD23
Komórka B Komórka B Komórka B Komórka B Komórka B
3.1.1 3,2 +/- 2.6 1,3 +/- 0,2 1,7 +/- 0,2 1,2 +/- 0,4 5,6 +/- 4,8
21.2.1 1,2 +/- 0,2 1,3 +/- 0,9 0,9 +/- 0,5 1,0 +/- 0,04 1,0 +/- 0,1
21.4.1 3,6 +/- 3,0 5,0 +/- 3,0 1,9 +/- 0,8 1,8 +/- 0,7 21,5 +/- 34,8
22.1.1 1,4 +/- 0,5 1,1 +/- 0,2 1,2 +/- 0,3 1,0 +/- 0,1 1,3 +/- 0,2
23.5.1 1,4 +/- 0,5 1,1 +/- 0,2 1,4 +/- 0,6 1,0 +/- 0,1 1,1 +/- 0,2
23.25.1 2,5 +/- 1,1 2,5 +/- 0,9 1,6 +/- 0,4 1,3 +/- 0,2 4.3 +/- 2,3
23.28.1 1,1 +/- 0,2 1,1 +/- 0,2 1,8 +/- 0,6 1,0 +/- 0,1 1,1 +/- 0,4
23.29.1 1.2 +/- 0,2 1,0 +/- 0.2 1,3 +/- 0,6 0,9 +/- 0,2 1,1 +/- 0,1
24.2.1 1,8 +/- 1,0 1,6 +/- 0,8 1,1 +/- 0,4 1,1 +/- 0,2 0,9 +/- 0,6
T a b e l a 26
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki dendrytycznej przez przeciwciała anty-CD40
MHC klasy II ICAM (CD54) B7-1 (CD 80) B7-2 (CD86) CD83
DC DC DC DC DC
3.1.1 4,4 +/- 2,4 1,5 +/- 0,7 1.8 +/- 0,9 23,7 +/- 33,5 15,2 +/- 18,2
21.2.1 1,8 +/- 1,3 1,5 +/- 0,9 0,9 +/- 0,4 7,4 +/- 10,5 10,8 +/- 16,5
21.4.1 5,0 +/- 3.8 3,7 +/- 1,4 1,5 +/- 1,1 12,9 +/- 13,3 48,6 +/- 49,5
22.1.1 2,3 +/- 1,2 1,6 +/- 0.7 1,4 +/- 1,0 16,3 +/- 25,5 12,0 +/- 17,0
23.5.1 2,3 +/- 1,8 1,2 +/- 0.5 1,1 +/- 0,6 10,7 +/- 17,5 9,2 +/- 11,1
23.25.1 2,1 +/- 1,8 2,4 +/- 1.0 1,1 +/- 0,5 3,3 +/- 4,2 13,6 +/- 28,9
23.28.1 2,4 +/- 1,7 2,7 +/- 2.1 1,3 +/- 0,6 10,6 +/- 17,5 18,3 +/- 22,6
23.29.1 2,0 +/- 1,5 1,2 +/- 0,4 0.9 +/- 0,5 8,4 +/- 10,6 10,6 +/- 13,1
24.2.1 4,7 +/- 3,0 2,1 +/- 1,2 3,8 +/- 3,8 56.6 +/- 95,8 31,2 +/- 28,4
PL 214 634 B1
Tabela 27 porównuje podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych komórki w komórkach dendrytycznych i komórkach B jako proporcję średniej krotności w komórkach dendrytycznych do średniej krotności w komórkach B.
T a b e l a 27
Podwyższenie ekspresji cząsteczek powierzchniowych w komórkach dendrytycznych i komórkach B
B7-1 (CD80) B7-2 (CD86) MHC klasy II ICAM (CD54)
3.1.1 1,08 19,40 1,38 1,15
21.2.1 1,01 7,37 1,49 1,12
21.4.1 0,77 7,04 1,37 0,74
22.1.1 1,18 16,36 1,61 1,44
23.5.1 0,83 10,54 1,59 1,06
23.25.1 0,66 2,57 0,85 0,98
23.28.1 0,71 10,81 2,16 2,57
23.29.1 0,73 9,07 1,66 1,23
24.2.1 3,48 52,30 2,64 1,35
P r z y k ł a d VIII
Wzmacnianie wydzielania cytokin
W celu określenia czy ludzkie przeciwciała anty-CD40 ujawnione niniejszym wzmacniają wydzielanie IL-12p40, IL-12p70 i IL-8, przeprowadzono test komórek dendrytycznych pochodzących od monocytów.
Komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów i monocyty adherentne przygotowywano w sposób, jak opisano powyżej. Komórki hodowano w obecności przeciwciała anty-CD40 (21.4.1) lub z przeciwciałem anty-hemocyjaninowym skałoczepu (KLH), stosowanym jako kontrola ujemna. Cytokiny mierzono w supernatantach po 24 godz., przy pomocy testu ELISA (R&D systems). W niektórych badaniach (zobacz Tab. 28), komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów, traktowane przeciwciałem poddawano również ko-stymulacji 100 ng/ml LPS (Sigma), 1000 U/ml IFNy (R&D systems) lub 25 ng/ml IL-1 β (R&D systems).
Przeciwciało anty-CD40 wzmacnia wytwarzanie IL-12p40, IL-12p70 i IL-8 zarówno w komórkach dendrytycznych pochodzących od monocytów jak i w monocytach adherentnych. Obecność LPS dodatkowo wzmacnia wytwarzanie IL-12p40 i IL-12p70. W supernatantach komórek dendrytycznych inkubowanych z izotypowym przeciwciałem kontrolnym anty-KLH, wykrywano tylko minimalne poziomy cytokin. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Tabeli 28 i na Fig. 3 i 4. Tabela 28 przedstawia główne cytokiny wytwarzane przez komórki dendrytyczne lub monocyty adherentne przy 1 gg/ml przeciwciała antyCD40 (21.4.1) +/- 100 ng/ml LPS. Jak przedstawiono na Fig. 3 przeciwciało anty-CD40 wzmacnia wytwarzanie IL-12p40 przez ludzkie komórki dendrytyczne. Fig. 4 przedstawia wzmocnienie wytwarzania IL-12p70 przez ludzkie komórki dendrytyczne w obecności przeciwciała i 100 ng/ml LPS.
T a b e l a 28
Wzmacnianie wydzielania IL-12p40, IL-12p70 i IL-8 przez przeciwciało anty CD40
Podawanie Indukowana cytokina
Typ komórki Przeciwciało 1 gg/ml LPS 100 ng/ml IL-12p40 pg/ml IL-12p70 pg/ml IL-8 pg/ml
1 2 3 4 5 6
Komórka dendrytyczna 21.4.1 + 32252 1000 ND
21.4.1 - 1200 76 1200
anty-KLH + 14280 352 ND
anty-KLH - 200 4 150
PL 214 634 B1 cd. Tabeli 28
1 2 3 4 5 6
Monocyt adherentny 21.4.1 - ND ND 7000
21.4.1 + ND 425 ND
anty-KLH - ND ND 400
anty-KLH + ND 30 ND
ND = nie określane
Podobne doświadczenia przeprowadzono stosując złożone przeciwciała anty-CD40. Komórki dendrytyczne pochodzące od monocytów przygotowywano jak to opisano powyżej i hodowano w obecności różnych stężeń przeciwciała anty-CD40 i ko-stymulowano 100 ng/ml LPS (Sigma). W supernatancie mierzono IL-12p70 po 24 godz. stosując test ELISA (R&D systems) i dla każdego przeciwciała określano EC50. Wyniki doświadczeń przedstawiono w Tabeli 29.
T a b e l a 29
Wzmacnianie wydzielania IL-12p70 w komórkach dendrytycznych
Klon przeciwciała DC IL-12p70
EC50 gg/ml Maks. pg/ml
21.4.1 0,3 1796-7004
22.1.1 0,1 720-1040
23.25.1 0,2 540-960
23.5.1 0,1 676-1112
24.2.1 0,2 754-3680
3.1.1 0,2 668-960
23.28.1 0,2 1332-1404
23.29.1 0,1 852-900
21.2.1 0,03 656-872
Badano również zdolność przeciwciał anty-CD40 do wzmacniania wydzielania IFN-gamma z komórek T w teście typu allogeniczna komórka T/komórka dendrytyczna. Aby wykonać ten test, komórki T i monocyty izolowano z krwi obwodowej zdrowych ochotników. Monocyty różnicowano do 5 komórek dendrytycznych stosując metody opisane powyżej. 1 x 105 komórek T otrzymanych od osob5 nika hodowano z 1 x 105 komórek dendrytycznych otrzymanych od innego osobnika w obecności przeciwciała anty-CD40 lub przeciwciała kontrolnego. Po 4 dniach hodowli, supernatanty testowano pod kątem wydzielania IFN-gamma stosując test ELISA. Wyniki testu przedstawiono w Tabeli 30.
T a b e l a 30
Klon Przeciwciała allo DC/T IFNy
EC50 gg/ml Maks. pg/ml
21.4.1 0,3 212
22.1.1 0,3 110-180
23.25.1 0,3 180-232
23.5.1 0,2 150-240
24.2.1 0,2 111-194
3.1.1 0,1 100-195
23.28.1 0,2 120-190
23.29.1 0,3 134-150
21.2.1 0,03 230-256
P r z y k ł a d IX
Indukcja cytokin zapalnych przez przeciwciała antv-CD40 ujawnione niniejszym W celu określenia czy cytokiny zapalne są indukowane przez przeciwciała w stężeniu 1, 10 i 100 μg/ml, przeciwciała 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1 i 3.1.1 badano w teście uwalniania cytokin we krwi pełnej, opisanym przez Wing i wsp., Therapeutic. Immunol. 2:183-90 (1995). Nie obserwowano zna78
PL 214 634 B1 czącego wydzielania TNF-α, IL-1 β, IFN-γ, czy IL-6 z tymi przeciwciałami we wskazanych stężeniach we krwi pochodzącej od 10 zdrowych dawców.
P r z y k ł a d X
Wzmacnianie immunogenności linii komórkowej Jy przez przeciwciała anty-CD40
Komórki dodatnie względem JIYOYE CD40 (ATCC CCL 87) („komórki Jy”) hodowano i utrzymywano w podłożu RPMI. Komórki JIYOYE inkubowano 24 godz. z przeciwciałem anty-CD40 (21.4.1) lub z przeciwciałem pasującym izotypowo (anty-KLH), w pełnym podłożu RPMI. Następnie komórki płukano i traktowano 25 mg mitomycyny C (Sigma) / 7 ml podłoża przez 60 min. Następnie komórki te inkubowano z wyizolowanymi ludzkimi komórkami T w stosunku 1:100 przez 6 dni w temp. 37°C (5% CO2). Następnie komórki T zbierano, płukano i określano poziom aktywności CTL wobec komórek JIYOYE znakowanych świeżym chromem 51 (New England Nuclear, Boston, MA). Swoistą aktywność CTL obliczano jako % specyficznej cytolizy =(cytoliza Jy (cpm) - spontaniczna cytoliza (cpm))/(cytoliza całkowita (cpm) - spontaniczna cytoliza (cpm)).
Jak to przedstawiono na Fig. 5 przeciwciało anty-CD40 (21.4.1) znacząco wzmacnia immunogenność wobec komórek Jy, traktowanych przeciwciałem.
P r z y k ł a d XI
Zwierzęcy model guza
W celu dalszego badania aktywności anty-nowotworowej przeciwciał anty-CD40 ujawnionych niniejszym zaprojektowano model myszy beżowej SCID do testowania wpływu przeciwciała na wzrost guza in vivo.
Beżowe myszy SCID otrzymano z Charles River i przed wykorzystaniem pozwolono im na tygodniową aklimatyzację. Komórki guza (komórki Daudi (ATCC CCL 213), CD40(-) komórki K562 (ATCC CCL 243) i CD40(+)komórki Raji (ATCC CCL 86), komórki raka piersi BT474 (ATCC HTB 20) lub komórki prostaty PC-3 (ATCC CRL 1435)) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komó5 rek/zwierzę. W niektórych przypadkach wstrzykiwano komórki T (5 x 105) i komórki dendrytyczne 5 (1 x 105) od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Wstrzykiwano również dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Następnie mierzono wzrost guza. Specyficzne doświadczenia opisano poniżej.
W jednym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 (21.4.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), w dawce 10 mg/kg tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Komórki guza (komórki Daudi) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 10 komórek/zwierzę. Wzrost guza mierzono za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w dniach 17, 19, 20, 21, 25, 26, 27 i 28 po implantacji, w obecności ludzkich komórek T i komórek dendrytycznych. Jak pokazano na Fig. 6, przeciwciało anty-CD40 hamowało wzrost guza o około 60%.
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 (21.4.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), w dawce 0,1 mg/kg, 1 mg/kg lub 10 mg/kg tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Komórki guza (komórki K562) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. W doświadczeniu tym wstrzykiwano komórki T (5 x 105) 5 i komórki dendrytyczne (1 x 105) od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Wzrost guza mierzono za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w dniach 17, 19, 20, 21, 25, 26, 27 i 28 po implantacji. Jak pokazano na Fig. 7 przeciwciało anty-CD40 hamowało wzrost guza o około 60-85%.
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 (21.4.1, 23.29.1 lub 3.1.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Izotypowo dopasowane przeciwciało kontrolne i przeciwciało 21.4.1 wstrzykiwano w dawce 1 mg/ml. Przeciwciała 23.29.1 i 3.1.1 wstrzykiwano w dawce 1, 0,1, 0,01, 0,001 lub 0,0001 mg/kg. Komórki guza (komórki K562) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. W doświadczeniu tym wstrzykiwano komórki T (5 x 105) i komórki dendrytyczne (1 x 105) od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Wzrost guza mierzono za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 28 dniu po implantacji. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na Fig. 8 i 9. Na wykresach każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 (21.4.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1, 0,1, 0,01, 0,001 lub 0,0001 mg/kg. Komórki guza (komórki Raji) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Tym samym zwie55 rzętom wstrzykiwano komórki T (5 x 105) i komórki dendrytyczne (1 x 105) od tego samego ludzkiego
PL 214 634 B1 dawcy wraz z komórkami guza. Następnie mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 28 dniu po implantacji. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na Fig. 10. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W jeszcze innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 (21.4.1, 23.28.1, 3.1.1 lub 23.5.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 lub 0,1, mg/kg. Komórki guza (komórki Raji) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Następnie mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 28 dniu po implantacji. Wyniki tego doświadczenia przedstawiono na Fig. 11. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W jeszcze innym doświadczeniu, dootrzewnowo wstrzykiwano przeciwciało anty-CD40 (21.4.1, 23.29.1 lub 3.1.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 mg/kg. Komórki guza (komórki raka piersi BT474) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Komórki T (5 x 103) 5 i komórki dendrytyczne (1 x 105) wstrzykiwano od tego samego ludzkiego dawcy wraz z komórkami guza. Następnie mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 39 dniu po implantacji. Jak przedstawiono na Fig. 12 wszystkie przeciwciała hamowały wzrost guza raka piersi. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
W jeszcze innym doświadczeniu, dootrzewnowo wstrzykiwano przeciwciało anty-CD40 (3.1.1) lub kontrolę dopasowaną izotypowo (anty-KLH), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza (tylko jedno wstrzyknięcie). Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 mg/kg. Komórki guza (komórki guza prostaty PC-3) wstrzykiwano podskórnie w stężeniu 1 x 107 komórek/zwierzę. Następnie mierzono wzrost guza za pomocą cyrkla do pomiaru średnicy w 41 dniu po implantacji. Jak przedstawiono na Fig. 13 przeciwciało anty-CD40 hamowało wzrost guza prostaty o około 60%. Na wykresie każdy punkt reprezentuje pomiar otrzymany dla pojedynczego zwierzęcia.
P r z y k ł a d XII
Przeżywalność beżowych myszy SCID, którym wstrzyknięto komórki guza Daudi i podano przeciwciała anty-CD40
W innym doświadczeniu, wstrzykiwano dootrzewnowo przeciwciało anty-CD40 lub kontrolę dopasowaną izotypowo (jedno wstrzyknięcie), tuż przed wstrzyknięciem komórek guza. Przeciwciała wstrzykiwano w dawce 1 lub 0,1 mg/kg. Komórki guza (komórki Daudi) wstrzykiwano dożylnie w dawce 5 x 106 komórek/zwierzę. Następnie monitorowano przeżywalność zwierząt. Jak przedstawiono na Fig. 14, wszystkie badane przeciwciała anty-CD40 przedłużały przeżywalność myszy, którym wstrzyknięto komórki guza o co najmniej 6 dni.
Tabela 31 przedstawia wartości ED50 przeciwciał anty-CD40 w różnych modelach guza litego przedstawionych w Przykładzie XI. Tabela 31 przedstawia aktywność przeciwnowotworową niektórych przeciwciał anty-CD40 u myszy SCID. Dodatkowo tabela przedstawia wartości ED50 przeciwciał antyCD40 w modelu narządowego guza Daudi, opisanym powyżej w Przykładzie XII.
T a b e l a 31
Wartości ED50 przeciwciał anty-CD40 przy zastosowaniu różnych modeli guza in vivo w myszach SCID
Przeciwciało CD40(-) K562 & T/DC podskórnie (mg/kg) CD40(+) Raji & T/DC podskórnie (mg/kg) CD40(+) Raji podskórnie (mg/kg) CD40(+) Daudi dożylnie (mg kg)
21.4.1 0,005 0,0008 0,016 0,1
22.1.1 0,01 ND > 1,0 0,1
23.25.1 > 1,0 ND > 1,0 ND
23.5.1 > 1,0 ND > 1,0 ND
24.2.1 > 1,0 ND > 1,0 ND
3.1.1 0,02 ND > 0,1 < 0,1
23.28.1 > 1,0 ND > 1,0 0,1
23.29.1 0,009 ND > 1,0 < 0,1
21.2.1 < 1,0 ND ND ND
ND= nie wykonano
PL 214 634 B1
P r z y k ł a d XIII
Określenie stałych powinowactwa (KD) całkowicie ludzkich przeciwciał anty-CD40 z zastosowaniem aparatury BIAcore
Pomiary powinowactwa oczyszczonych przeciwciał przeprowadzono za pomocą rezonansu pazmonów powierzchniowych stosując urządzenie BIAcore 3000, postępując zgodnie z protokołami producenta.
Biosensorowa aparatura do analizy biospecyficznego oddziaływania (BIAcore) wykorzystuje rezonans plazmonów powierzchniowych do mierzenie oddziaływań molekularnych na chipie sensorowym CM5. Zmiany w indeksach refrakcyjnych pomiędzy dwoma podłożami, szklanym i karboksymetylowanym dekstranem, powodowane przez oddziaływanie cząsteczek z miejscem dekstranowym chipa sensorowego, mierzy się i rejestruje jako zmiany w arbitralnych jednostkach współczynnika odbicia (RU, ang. reflectance units), jak to wyszczególniono w zaleceniach producenta.
Karboksymetylowaną dekstranową powierzchnię kuwety przepływowej na chipie sensorowym aktywowano przez derywatyzację 0,05 M N-hydroksysukcynoimidem za pośrednictwem 0,2 M N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodiimidu przez 7 min. Białko fuzyjne CD40-Ig (opisane w Przykładzie I) w stężeniu 5 gg/ml, w 10 mM octanie sodu, pH 3,5, wstrzykiwano manualnie do kuwety przepływowej z szybkością 5 gl/min i unieruchamiano kowalencyjnie na powierzchni kuwety przepływowej przy pożądanej wartości RU. Dezaktywację niereaktywnych estrów N-hydroksysukcynoimidowych przeprowadzano stosując 1 M chlorowodorek etanoloaminy, pH 8,5. Po immobilizacji, kuwety przepływowe są oczyszczane z nie przereagowanego lub słabo związanego materiału za pomocą regenerujących 5 wstrzyknięć 5 gl 50 mM NaOH do czasu otrzymania stabilnej linii podstawowej. Kuweta przepływowa 2, powierzchnia o wysokiej gęstości, mierzyła w przybliżeniu 300RU po przygotowaniu powierzchni i kuweta przepływowa 3, powierzchnia o niskiej gęstości, mierzyła w przybliżeniu 150 RU. Do kuwety przepływowej 1, aktywowana pusta powierzchnia, 35 gl buforu 10 mM octanu sodu nastrzykiwano podczas unieruchomienia w miejscu antygenu. Kuweta przepływowa 4 zawierała w przybliżeniu 450 RU unieruchomionego CTLA4-Ig, nieistotna kontrola antygenu.
Serie rozcieńczeń każdego przeciwciała przygotowano w zakresie stężeń od 100 μg/ml do 0,1 μg/ml przez połowiczne rozcieńczenie. Szybkość przepływu ustalono na 5 gl/min. i 25 gl próbki każdego punktowego stężenia nastrzykiwano na chip sensorowy z nastrzyknięciem regeneracyjnym 5 gl 50 mM NaOH pomiędzy każdym stężeniem nastrzykiwanego przeciwciała. Dane analizowano stosując oprogramowanie BIAevaluation 3.0.
W doświadczeniach kinetycznych odwróconej orientacji, przeciwciało 21.4.1 unieruchamiano na powierzchni chipa sensorowego stosując protokół opisany powyżej. Jako kontrolę przeciwciał powierzchni zastosowano anty-KLH. Antygen, białko fuzyjne CD40-Ig, nastrzykiwano w zakresie stężeń od 100 μg/ml do 0,1 μg/ml.
Tabela 32 przedstawia pomiary powinowactwa dla reprezentatywnych przeciwciał antyCD40.
T a b e l a 32
Pomiary powinowactwa dla przeciwciał anty-CD40
Przeciwciało Kon (1/Ms) Koff (1/s) Kd (M)
3.1.1 1,12 x 106 3,31 x 10'5 3,95 x 10'11
10.8.3 2,22 x 105 4,48 x 10'7 2,23 x 10'12
15.1.1 8,30 x 104 2,83 x 10'7 4,05 x 10'12
21.4.1 8,26 x 104 2,23 x 10'5 3,48 x 10'10
22.1.1 9,55 x 105 1,55 x 10'4 2,79 x 1010
23.25.1 3,83 x 105 1,65 x 10'7 7,78 x 10'12
23.28.1 7,30 x 105 8,11 x 10'5 1,61 x 10'10
23.29.1 3,54 x 105 3,90 x 10'5 7,04 x 10'11
PL 214 634 B1
P r z y k ł a d XIV
Mapowanie epitopów przeciwciał anty-CD40
Testy wiązania przeprowadzono stosując fuzję antygenową oczyszczonego, przy użyciu Białka A, ludzkiego CD40 z Fe IgG1. Białko fuzyjne ludzkiego CD40-IgG1 Fc sklonowano w firmie Pfizer. Białko fuzyjne ludzkiego CD40 IgG1 było wytwarzane w ssaczej linii komórkowej i oczyszczane na kolumnie z białkiem A. Czystość fuzji antygenowej oceniano stosując SDS/PAGE.
CD40 posiada strukturę typowego białka transbłonowego typu I. Dojrzała cząsteczka składa się z 277 aminokwasów. Zewnątrzkomórkowa domena CD40 składa się z czterech bogatych w cysteinę domen typu TNFR. Zobacz np. Neismith i Sprang, TIBS 23:74-79 (1998); van Kooten i Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67:2-17 (2000); Stamenkovic i wsp., EMBO J. 8:1403-1410(1989).
Wiązanie przeciwciał ant y-CD40 ze zredukowanym i niezredukowanym ludzkim CD40.
Ponieważ zewnątrzkomórkowa domena CD40 składa się z czterech bogatych w cysteinę domen, przerwanie wewnątrzcząsteczkowych wiązań przez czynnik redukujący, może zmienić reaktywność przeciwciała. W celu określenia czy przerwanie wewnątrzcząsteczkowych wiązań przez czynnik redukujący, zmienia reaktywność wybranych przeciwciał anty-CD40, oczyszczone CD40-hIgG nanoszono w SDS/PAGE (4-20% żel) w warunkach nieredukujących (NR) lub redukujących (R). SDS/PAGE przeprowadzano stosując metodę Laemmli, za pomocą systemu mini-żelu. Rozdzielone białka przenoszono na błonę nitrocelulozową. Błony blokowano stosując PBS zawierający 5% (wag./obj.) odtłuszczonego mleka w proszku przez co najmniej 1 godz. przed wywołaniem i analizowano przez 1 godz. z każdym przeciwciałem jako sondą. Przeciwciała anty-CD40 wykrywano stosując skoniugowane z HRP kozie anty-ludzkie immunoglobuliny (rozcieńczenie 1:8000; nr kat. A-8667, Sigma). Błony wywoływano stosując wzmocnioną chemiluminescencję (ECL®; Amersham Bioscience), zgodnie z instrukcjami producenta.
Western Blot analizowano następnie przy użyciu czterech przeciwciał anty-CD40 stosowanych jako sondy: 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 (1 μg/ml), a następnie skoniugowanym z HRP kozim anty-ludzkim IgG (rozcieńczenie 1:8000). Wyniki doświadczenia przedstawiono na Fig. 15. Wyniki wskazują na to, że przeciwciała 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 wiążą niezredukowane, ale nie wiążą zredukowanego CD40, tak więc przeciwciała rozpoznają epitop konformacyjny.
Wiązanie przeciwciał anty-CD40 z białkami ludzkiego CD40 z deletowaną domeną
Zewnątrzkomórkowy obszar CD40 zawiera cztery powtarzające się domeny typu TNFR (określane jako D1-D4). Zobacz np. Neismith i Sprang, TIBS 23:74-79 (1998); van Kooten i Banchereau, J. Leukocyte Biol. 67:2-17 (2000); Stamenkovic i wsp., EMBO J. 8:14031410(1989). Fig. 16 przedstawia sekwencje aminokwasowe domen D1-D4 mysiego i ludzkiego CD40. W celu zbadania udziału różnych obszarów cząsteczki CD40 w prezentowaniu epitopu, skonstruowano liczne mutanty z deletowanymi domenami.
W celu utworzenia konstruktów delecyjnych ludzkiego CD40, całą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego CD40 (aminokwasy 1-193) amplifikowano z cDNA ludzkich komórek B (CD19+) (Multiple tissue cDNA panels, nr kat. K1428-1, Clontech), za pomocą PCR stosując startery o specyficznej sekwencji i dodawano znacznik 6XHis-tag na C-końcu. Starter 5', ludzkiego CD40, 5'-GCAAGCTTCACCAATGGTTCGTCTGCCTCTGCAGTG-3' (SEKW. NR ID.: 135) zastosowano z różną kombinacją starterów 3', do klonowania cząsteczek CD40 pełnej długości i skróconych. Starter 3', do klonowania pełnej długości zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego CD40, miał sekwencję: 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTCTCAGCCGATCCTGGGGACCA-3' (SEKW. NR ID.: 136). Starter 3', zastosowany do klonowania domen D1-D3 ludzkiego CD40, miał sekwencję: 5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGCTCGCGATGGTAT-3' (SEKW. NR ID.: 137) Starter 3', zastosowany do klonowania domen D1-D2 CD40, miał sekwencję:
5'-TCAGTGATGGTGATGGTGATGACAGGTGCAGATGGTGTCTGTT-3' (SEKW. NR ID.: 138). Po utworzeniu tych skróconych konstruktów cDNA CD40, doprowadzano do ich ekspresji w linii komórkowej 293F, stosując wektor pCR3.1 (Invitrogen). Białka fuzyjne CD40-6XHis oczyszczano stosując wymywanie z kolumny niklowej.
Sekwencje aminokwasowe czterech mutantów delecyjnych przedstawiono w Tabeli 33.
PL 214 634 B1
T a b e l a 33
Fuzje białkowe CD40 ze znacznikiem His-Tag
Mutant delecyjny: Sekwencja aminokwasowa (podkreślono sekwencję liderową)
Ludzki CD40-6XHis (cała długość zewnątrzkomórkowej domeny)- MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQ CCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPC GESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTS ETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRS CSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKC HPWTSCETKDLVVQQAGTNKTDVVC GPQDRHHHHHH (SEKW. NR ID.: 139)
Ludzki CD40 (D1-D3)-6xHis MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQ CCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPC GESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTS ETDTICTCEEGWHCTSEACESCVLHRS CSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPHHHHHH (SEKW. NR ID.:140)
Ludzki CD40 (D1-D2)-6Xhis MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQ CCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECLPC GESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTS ETDTICTCHHHHHH (SEKW. NR ID.: 141)
Do ekspresji tych delecyjnych konstruktów ludzkiego CD40, konstrukty klonowano w wektorze pCR3.1 (Invitrogen), a ekspresję oceniano na różnych stabilnie i przejściowo transfekowanych liniach komórkowych 293F. Supernatanty z przejściowo transfekowanych komórek 293F analizowano pod kątem wiązania przeciwciał 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1, stosując testy ELISA i Western Blot.
Testy ELISA przeprowadzono stosując supernatant z komórek 293F transfekowanych różnymi konstruktami CD40. Płytki ELISA opłaszczano poliklonalnymi kozimi przeciwciałami anty-ludzkimi CD40 (R&D nr kat. AF 632) lub poliklonalnymi przeciwciałami kozimi anty-mysimi CD40 (R&D nr kat. AF 440) rozcieńczonymi do 1 gg/ml w buforze ELISA do opłaszczania płytek. Ekspresję konstruktów CD40 w komórkach 293 F potwierdzano przez wykrywanie z biotynylowanym kozim anty-ludzkim CD40 (R&D nr kat. BAF 632), kozim anty-mysim CD40 (R&D nr kat. BAF 440) lub z przeciwciałem skoniugowanym z HRP anty-His (C koniec) (Invitrogen, nr kat. 46-0707). Wiązanie ludzkich przeciwciał anty-CD40 wykrywano skoniugowanym z HRP kozim anty-ludzkim IgG (FC swoisty Caltag H10507), rozcieńczonym 1:2000. Wyniki, jak przedstawiono w Tabeli 34, wskazują, że większość jeśli nie wszystkie epitopy rozpoznawane przez mAb 21.4.1. 23.28.1 i 23.29.1 mieszczą się w obszarze D1-D2 CD40, podczas gdy epitop dla mAb 24.2.1 mieści się, przynajmniej częściowo, w domenie D3-D4. Jako kontrolę zastosowano fuzję białkową ludzkie CD40-królicze Fc, w celu potwierdzenia swoistości wiązania przeciwciała.
T a b e l a 34
ELISA: Wiązanie przeciwciała z mutantami delecyjnymi CD40
Ludzki CD40(D1- D2)-6Xhis Ludzki CD40(D1- D3)-6XHis Ludzki CD40- 6XHis
21.4.1 + + +
23.25.1 + + +
23.29.1 + + +
24.2.1 - + +
anty-His + + +
anty-Rb Ig ND ND ND
ND= nie wykryto
PL 214 634 B1
Konstrukty delecyjne CD40 analizowano również stosując analizę typu Western Blot. Wyniki przedstawiono w Tabeli 35. Wyniki ELISA wykazują, że miejsce wiązania dla przeciwciał 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 wymaga domen D1-D3. Wyniki pokazują również, że miejsce wiązania dla przeciwciał 21.4.1, 23.25.1 i 23.29.1 wymaga domen D1-D2 i, że miejsce wiązania przeciwciała 24.2.1 wymaga domeny D3.
T a b e l a 35
Western Blot: wiązanie przeciwciała z mutantem delecyjnym CD40
Ludzki CD40(D1-D3)-6Xhis Ludzki CD40-6Xhis
21.4.1 + +
23.25.1 + +
23.29.1 + +
24.2.1 + +
anty-His + +
Anty-RbIg ND ND
ND= nie wykryto
Wiązanie przeciwciał anty-CD40 z mysim CD40
Ustalono zdolność przeciwciał 21.4.1,23.25.1,23.29.1 i 24.2.1 do wiązania z mysim CD40.
Dla celów tego doświadczenia, mysie CD40 amplifikowano z cDNA mysich komórek B. Fuzję białkową mysiego CD40(D1-D3)-6xHis sklonowano w pCR3.1, wykorzystującym promotor CMV, w celu kierowania transkrypcją. Starter 5', zastosowany do klonowania zewnątrzkomórkowej domeny mysiego CD40, miał sekwencję: 5'- TGCAAGCTTCACCATGGTGTCTTTGCCTCGGCTGTG-3'.
Starter 3', zastosowany do klonowania domen D1-D3 mysiego CD40, miał sekwencję: 5'-GTCCTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGTGGGCAGGGATGACAGAC-3'. Komórki 293F transfekowano przejściowo mysimi i ludzkimi konstruktami cDNA. Ekspresję zrekombinowanego CD40 wykrywano za pomocą testu ELISA stosując przeciwciała poliklonalne przeciw mysiemu i ludzkiemu CD40, przeciwciała anty-His i przeciwciała anty-CD40 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w Tabeli 36. Doświadczenie pokazuje, że wszystkie przeciwciała są swoiste wobec ludzkiego CD40 i nie reagują krzyżowo z mysim CD40.
T a b e l a 36
Reaktywność krzyżowa mysiego i ludzkiego CD40
Mysi CD40(D1-D3)-6Xhis Ludzki CD40(D1-D3)-6XHis
21.4.1 Nie Tak
23.25.1 Nie Tak
23.29.1 Nie Tak
24.2.1 Nie Tak
Kozi anty-ludzki CD40 Nie Tak
Kozi anty-mysi CD40 Tak Nie
Anty-His Tak Tak
Wiązanie przeciwciał anty-CD40 z ludzkim/mysim chimerycznym CD40
Ponieważ przeciwciała 21.4.1. 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 nie wiążą mysiego CD40, w celu bardziej precyzyjnego zmapowania epitopów tych przeciwciał, skonstruowano ludzkie/mysie chimeryczne białka CD40.
Do skonstruowania fuzji, w zgodnej ramce odczytu, ludzkich i mysich białek chimerycznych
CD40, wykorzystano unikatowe miejsca restrykcyjne na granicach domen CD40, w identycznych pozycjach cDNA zarówno ludzkiego jak i mysiego CD40. Utworzono różne konstrukty cDNA CD40 stosując miejsce restrykcyjne EcoRI na końcu domeny 1 (nukleotyd 244, aminokwas 64) i miejsce restrykcyjne BanI na końcu domeny 2 (nukleotyd 330, aminokwas 94) (Fig. 17).
PL 214 634 B1
Amplifikowano różne domeny CD40 stosując PCR i ligowano. Podejście to pozwoliło na zastąpienie różnych domen mysiego CD40 przez homologiczne domeny z ludzkiego CD40. Otrzymane konstrukty przedstawiono na Fig. 18.
Następnie stosując test ELISA określono czy przeciwciała 21.4.1, 23.25.1, 23.29.1 i 24.2.1 były zdolne do wiązania mysich/ludzkich chimerycznych białek CD40. Wyniki doświadczenia przedstawiono w Tabeli 37. Z danych zamieszczonych w Tabeli 37 wynika, że mAb 21.4.1 i 23.25.1 rozpoznają epitop, położony częściowo w D1 i częściowo w D2; mAb 23.29.1 rozpoznaje epitop położony głównie, jeśli nie całkowicie, w D2; i mAb 24.2.1 rozpoznaje epitop położony w D2 i D3.
T a b e l a 37
Przeciwciało HuD1 HuD2 HuD3 HuD1, D2 HuD2, D3 HuD1, D3
21.4.1 Nie Nie Nie Tak Nie Nie
23.25.1 Nie Nie Nie Tak Nie Nie
23.29.1 Nie Tak Nie Tak Tak Nie
24.2.1 Nie Nie Nie Nie Tak Nie
Wszystkie publikacje i aplikacje patentowe cytowane w tym szczegółowym opisie są włączone niniejszym na drodze odniesienia.

Claims (17)

Zastrzeżenia patentowe
1. Przeciwciało monoklonalne lub jego część wiążąca antygen, które swoiście wiąże ludzki CD40, przy czym przeciwciało obejmuje łańcuch ciężki i łańcuch lekki, przy czym (a) łańcuch ciężki obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 domeny zmiennej łańcucha ciężkiego wybrane z grupy składającej się z:
(i) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, które ma takie same sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego jak przeciwciało 3.1.1 (nr dostępu ATCC PTA-3600), z tą różnicą, że w sekwencji łańcucha ciężkiego treonina jest podstawiona za alaninę w pozycji 78, alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 88, a alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 97; oraz w sekwencji łańcucha lekkiego metionina jest podstawiona za leucynę w pozycji 4, a walina jest podstawiona za leucynę w pozycji 83;
(ii) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego obejmującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 92; oraz (iii) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego obejmującej sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID: 91; oraz (b) łańcuch lekki obejmuje sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 domeny zmiennej łańcucha lekkiego wybrane z grupy składającej się z:
(i) domeny zmiennej łańcucha lekkiego przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V;
(ii) domeny zmiennej łańcucha lekkiego obejmującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 94; oraz (iii) domeny zmiennej łańcucha lekkiego obejmującej sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję nukleotydową z SEKW. NR ID: 93.
2. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, zamienne tym, że sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha ciężkiego stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID: 92, a sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego stanowią sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 z SEKW. NR ID: 94.
3. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że łańcuch ciężki obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 92, a łańcuch lekki obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID: 94.
4. Przeciwciało według zastrz. 1, zamienne tym, że sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego stanowią odpowiednio sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiePL 214 634 B1 go i łańcucha lekkiego przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, które ma takie same sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego jak przeciwciało 3.1.1 (nr dostępu ATCCPTA-3600) , z tą różnicą, że w sekwencji łańcucha ciężkiego treonina jest podstawiona za alaninę w pozycji 78, alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 88, a alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 97; oraz w sekwencji łańcucha lekkiego metionina jest podstawiona za leucynę w pozycji 4, a walina jest podstawiona za leucynę w pozycji 83.
5. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według jednego z zastrz. 1 do 4, które wykazuje co najmniej jedną cechę wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) współzawodniczy krzyżowo o wiązanie CD40 z przeciwciałem 3.1.1H-A78T-V88AV97A/3. 1 . 1 L-L4M-L83V, które ma takie same sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego jak przeciwciało 3.1.1 (nr dostępu ATCC PTA-3600), z tą różnicą, że w sekwencji łańcucha ciężkiego treonina jest podstawiona za alaninę w pozycji 78, alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 88, a alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 97; oraz w sekwencji łańcucha lekkiego metionina jest podstawiona za leucynę w pozycji 4, a walina jest podstawiona za leucynę w pozycji 83;
b) wiąże się z tym samym epitopem CD40 co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V;
c) wiąże CD40 z zasadniczo tą samą KD co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V; oraz
d) wiąże CD40 z zasadniczo tą samą szybkością dysocjacji co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3. 1 . 1 L-L4M-L83 V.
6. Przeciwciało monoklonalne obejmujące:
a) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 6 bez sekwencji sygnałowej, przy czym w sekwencji dojrzałej reszta 78 jest zamieniona z alaniny na treoninę, reszta 88 jest zamieniona z waliny na alaninę i reszta 97 jest zamieniona z waliny na alaninę, oraz
b) sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 8 bez sekwencji sygnałowej, przy czym w dojrzałej sekwencji reszta 4 jest zamieniona z leucyny na metioninę, a reszta 83 jest zamieniona z leucyny w walinę.
7. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen według zastrz. 6, które wykazuje co najmniej jedną cechę wybraną z grupy składającej się z następujących:
a) współzawodniczy krzyżowo o wiązanie CD40 z przeciwciałem 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, które ma takie same sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego jak przeciwciało 3.1.1 (nr dostępu ATCCPTA-3600), z tą różnicą, że w sekwencji łańcucha ciężkiego treonina jest postawiona za alaninę w pozycji 78, alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 88, a alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 97; oraz w sekwencji łańcucha lekkiego metionina jest podstawiona za leucynę w pozycji 4, a walina jest podstawiona za leucynę w pozycji 83;
b) wiąże się z tym samym epitopem CD40 co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V;
c) wiąże CD40 z zasadniczo tą samą KD co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V; oraz
d) wiąże CD40 z zasadniczo tą samą szybkością dysocjacji co przeciwciało 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3. 1 . 1 L-L4M-L83 V.
8. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje przeciwciało lub część wiążącą antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 7 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
9. Zastosowanie przeciwciała lub części wiążącej antygen według jednego z zastrz. 1 do 7 do wytwarzania leku.
10. Zastosowanie przeciwciała lub części wiążącej antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 7 do wytwarzania leku do leczenia raka u człowieka tego potrzebującego lub do wzmocnienia odpowiedzi odpornościowej u człowieka tego potrzebującego.
11. Zastosowanie przeciwciała lub części wiążącej antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 7 do wytwarzania leku do leczenia u człowieka nowotworu ujemnego względem CD40.
12. Wyizolowana linia komórkowa wytwarzająca przeciwciało lub jego część wiążącą antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 7.
13. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową, która koduje łańcuch ciężki lub jego część wiążącą antygen lub sekwencję
PL 214 634 B1 nukleotydową, która koduje łańcuch lekki lub jego część wiążącą antygen, lub oba, przeciwciała lubjego części wiążącej antygen jak określono w jednym z zastrz. 1 do 7.
14. Cząsteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego według zastrz. 13, znamienna tym, że obejmuje jedną lub więcej sekwencji nukleotydowych wybranych z grupy składającej się z:
a) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen z przeciwciała 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A/3.1.1 L-L4M-L83V, które ma takie same sekwencje aminokwasowe łańcucha ciężkiego i lekkiego jak przeciwciało 3.1.1 (nr dostępu ATCC PTA-3600) , z tą różnicą, że w sekwencji łańcucha ciężkiego treonina jest podstawiona za alaninę w pozycji 78, alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 88, a alanina jest podstawiona za walinę w pozycji 97; oraz w sekwencji łańcucha lekkiego metionina jest podstawiona za leucynę w pozycji 4, a walina jest podstawiona za leucynę w pozycji 83;
b) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen z przeciwciała 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A/3.1.1 L-L4M-L83V;
c) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha ciężkiego lub jego części wiążącej antygen oraz sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową łańcucha lekkiego lub jego części wiążącej antygen, przeciwciała 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83 V;
d) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 92 lub 94;
e) sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową z SEKW. NR ID.: 92 oraz sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową z 94;
f) sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.: 91 lub 93; oraz
g) sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR ID.: 91 oraz sekwencji nukleotydowej z SEKW. NR
ID.: 93.
15. Wektor obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 13 lub 14, który ewentualnie obejmuje sekwencję kontrolującą ekspresję funkcjonalnie połączoną z cząsteczką kwasu nukleinowego.
16. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje wektor określony w zastrz. 15 lub cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 13 lub 14.
17. Sposób wytwarzania przeciwciała anty-CD40 lub jego części wiążącej antygen, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 16 lub linii komórkowej określonej w zastrz. 12 w odpowiednich warunkach i odzyskiwanie przeciwciała lub jego części wiążącej antygen.
PL 214 634 B1
Rysunki sekwencji białkowej zmiennej domeny przeciwciała z o akwenie jami linii pierwotnej (QIi)
PL 214 634 B1
PL 214 634 B1
Przeciwciało (pg/ml)
PL 214 634 B1 o
·&
rzeciwciato
FIG. 4
PL 214 634 B1
Stosunek komórek efektorowych do docelowych
I ł-1......t I I » I I I t 1 I 1 1.L1 I I tli.....t i ι 1 > i t t g g S S 8 £ ’ a
O tu
PL 214 634 B1
ΒΖΠδ BSBUJ ejIMO^jBO
FIG. 6
PL 214 634 B1 ezn6 eseui β}ιμο))|βο
Dni po impiantacji guza
PL 214 634 B1
FIG. 8
PL 214 634 B1
FIG. 9 o
o~ o
O co łSj;
0,0001 (zujlu) eznG ese/j
PL 214 634 B1
PL 214 634 B1
FIG. 11 o
« o
V* *
σ>
o ·<
*
A,
Τ’ *
88880 m -4· <*> 01 TCO p=<,0001 {2uilu) eznS ese|/y
PL 214 634 B1
PL 214 634 B1
100
PL 214 634 B1 (OJ.=u)ednjQ
Dni po iniekcji
FIG. 14
PL 214 634 B1
101
102
PL 214 634 B1
PL 214 634 B1
103
Ο
EC
X G Q Q X X X X CO CO G X X co > W ω X X g G < co H G G g X _ β d d G Ο» G G <8 G G co O d d X G o CU g X d d G o X O > M O d 2 O G G O G > > Q Q G CO G 04 G CO Q o G G G > U o O O G d d Ο» O G G G O co z Z d z CU CU 2 ł—1 Q H w Q W Ol 34 G d d 2 X G >4 34 G p> > >< σ G tl d d O x 34 34 G G X g Ol Ol d d O 04 34 34 G G CO o o d H co u < G 34 d u G G H G G co > Cu g G G G d CU 04 G X X o w z Z O G o CU 3 3 > G 34 Ol G o O X > < Q Lu < co > < co G « g G e£ G tl G o d G G u U N Q G η G G w X G G U d co W CO U O 1 fc d co w G G 3 Q d O d 3 •ł G d d X X w > CU G ΟΙ 3 d X G d O O O* d d w G G G G o g x G G G G o d Cu G X g G G G G g G d d CO > G G > W > 2 s < W G G 44 λ: <u o 0 -H •H •rł 3 3 3 N 0 N 0 N 0 ra rM ffl rM ra rM >1 N N N £ O £ U £ U
104
PL 214 634 B1
Departament Wydawnictw UP RP Cena 7,38 zł (w tym 23% VAT)
PL392809A 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne przeciwko CD40 i jego czesc wiazaca antygen, zawierajaca go kompozycja i jego zastosowanie, oraz wyizolowana linia komórkowa, czasteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania PL214634B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34898001P 2001-11-09 2001-11-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL392809A1 PL392809A1 (pl) 2011-03-14
PL214634B1 true PL214634B1 (pl) 2013-08-30

Family

ID=23370387

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392809A PL214634B1 (pl) 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne przeciwko CD40 i jego czesc wiazaca antygen, zawierajaca go kompozycja i jego zastosowanie, oraz wyizolowana linia komórkowa, czasteczka wyizolowanego kwasu nukleinowego, wektor, komórka gospodarza i sposób wytwarzania
PL370514A PL214289B1 (pl) 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne lub jego czesc wiazaca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie do leczenia raka

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL370514A PL214289B1 (pl) 2001-11-09 2002-11-08 Przeciwcialo monoklonalne lub jego czesc wiazaca antygen przeciwko CD40 i jego zastosowanie do leczenia raka

Country Status (47)

Country Link
US (9) US7288251B2 (pl)
EP (2) EP2343086A3 (pl)
JP (3) JP4616555B2 (pl)
KR (1) KR100830086B1 (pl)
CN (2) CN103450360B (pl)
AP (1) AP1918A (pl)
AR (1) AR039067A1 (pl)
AU (1) AU2002356926B2 (pl)
BR (1) BRPI0214137B8 (pl)
CA (1) CA2466128C (pl)
CL (1) CL2009001779A1 (pl)
CR (2) CR7343A (pl)
CU (1) CU23745A3 (pl)
CY (1) CY1115675T1 (pl)
DK (1) DK1476185T3 (pl)
DO (1) DOP2002000507A (pl)
EA (1) EA011449B1 (pl)
EC (1) ECSP045093A (pl)
EG (1) EG25801A (pl)
ES (1) ES2432968T3 (pl)
GE (1) GEP20074222B (pl)
GT (1) GT200200228A (pl)
HN (1) HN2002000318A (pl)
HR (1) HRP20040525B1 (pl)
HU (1) HU229829B1 (pl)
IL (2) IL161823A0 (pl)
IS (1) IS2940B (pl)
MA (1) MA27139A1 (pl)
ME (1) ME00503B (pl)
MX (1) MXPA04004467A (pl)
MY (1) MY137641A (pl)
NI (1) NI200200128A (pl)
NO (1) NO334339B1 (pl)
NZ (1) NZ533180A (pl)
OA (1) OA12725A (pl)
PA (1) PA8557701A1 (pl)
PE (1) PE20030846A1 (pl)
PL (2) PL214634B1 (pl)
PT (1) PT1476185E (pl)
PY (1) PY0227624A (pl)
RS (1) RS52484B (pl)
SI (1) SI1476185T1 (pl)
TN (1) TNSN04078A1 (pl)
TW (2) TWI331040B (pl)
UY (1) UY27537A1 (pl)
WO (1) WO2003040170A2 (pl)
ZA (1) ZA200404207B (pl)

Families Citing this family (269)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7244827B2 (en) * 2000-04-12 2007-07-17 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 24P4C12 useful in treatment and detection of cancer
US6943235B1 (en) * 1999-04-12 2005-09-13 Agensys, Inc. Transmembrane protein expressed in prostate cancer
US20050255106A1 (en) * 1999-05-22 2005-11-17 Linda Diehl Induction of anti-tumor ctl immunity through in vivo triggering of 4-1bb and/or cd40
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
JP2004514423A (ja) 2000-09-07 2004-05-20 シュライバー，　ジョン　アール． トランスジェニックｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）から獲得されるｐｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｌｐｓに対するヒト抗体
WO2005056601A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Schreiber John R Human anti-pseudomonas-aeruginosa antibodies derived from transgenic xenomouse?
CA2658221C (en) 2001-04-27 2012-11-27 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-cd40 monoclonal antibody
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
US20040185040A1 (en) 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
JP2005519586A (ja) 2001-11-21 2005-07-07 セルテック アール アンド ディー， インコーポレイテッド Ｃｄ８３遺伝子産物を利用したサイトカイン・レベルの操作法
CA2487133A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-18 Zymogenetics, Inc. Use of il-21 in cancer and other therapeutic applications
US7052694B2 (en) * 2002-07-16 2006-05-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Dendritic cell potentiation
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
SI1680140T1 (sl) * 2003-10-16 2011-08-31 Imclone Llc Inhibitorji receptorja-1 za fibroblastni rastni faktor in metode za zdravljenje z le-temi
SG148143A1 (en) * 2003-11-04 2008-12-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Antagonist anti-cd40 monoclonal antibodies and methods for their use
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
US20050136055A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Pfizer Inc CD40 antibody formulation and methods
ES2397631T3 (es) 2003-12-25 2013-03-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Mutante antagonista de anticuerpos ANTI-CD40
SI2177537T1 (sl) 2004-01-09 2012-01-31 Pfizer Protitielesa proti MAdCAM
SG151294A1 (en) 2004-03-23 2009-04-30 Biogen Idec Inc Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
JP5902367B2 (ja) * 2004-06-30 2016-04-13 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 抗体
US20060099203A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Pease Larry R B7-DC binding antibody
DK2287195T3 (da) 2004-07-01 2019-08-19 Innate Pharma Pan-kir2dl nk-receptor-antistoffer og anvendelse heraf i diagnostik og terapi
WO2006017574A1 (en) * 2004-08-03 2006-02-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Improving treatments
US7563443B2 (en) * 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
SI1836225T1 (sl) 2005-01-06 2012-06-29 Novo Nordisk As Kir vezujoäśa sredstva in postopki za njihovo rabo
JP4986633B2 (ja) 2005-01-12 2012-07-25 協和発酵キリン株式会社 安定化されたヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ３抗体
EP3312196B1 (en) * 2005-03-23 2019-07-17 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
KR101203328B1 (ko) 2005-04-26 2012-11-20 화이자 인코포레이티드 Ｐ-카드헤린 항체
US8337851B2 (en) 2005-05-18 2012-12-25 Novartis Ag Methods of monitoring the efficacy of anti-CD40 antibodies in treating a subject for a CD40-expressing cancer
PL1889065T3 (pl) * 2005-05-18 2013-12-31 Novartis Ag Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny
GB0512225D0 (en) * 2005-06-16 2005-07-27 Univ Sheffield Immunoglobulin molecules
DK1912671T3 (da) 2005-07-18 2017-11-27 Seattle Genetics Inc Beta-glucuronid-linker-lægemiddelkonjugater
HN2006031275A (es) 2005-09-07 2010-10-29 Amgen Fremont Inc Anticuerpos monoclonales humanos para la quinasa-1 tipo receptor de activina
WO2007103048A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Regents Of The University Of Colorado Tlr agonist (flagellin)/cd40 agonist/antigen protein and dna conjugates and use thereof for inducing synergistic enhancement in immunity
CN101479375B (zh) 2006-05-03 2016-03-30 科罗拉多州立大学董事会 Cd40激动剂抗体/1型干扰素协同佐剂组合、包含前述的结合物及其作为增强细胞免疫的治疗剂的用途
EP1854810A1 (en) * 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
EA200802058A1 (ru) 2006-05-09 2009-06-30 Пфайзер Продактс Инк. Производные циклоалкиламинокислот и их фармацевтические композиции
WO2007131575A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Tolerogenic dendritic cells, method for their production and uses thereof
US20090074711A1 (en) * 2006-09-07 2009-03-19 University Of Southhampton Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody
CA2672581A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-claudin 3 monoclonal antibody and treatment and diagnosis of cancer using the same
CN103396489A (zh) 2007-02-23 2013-11-20 默沙东公司 工程改造的抗IL-23p19抗体
PL2059534T3 (pl) * 2007-02-23 2012-09-28 Merck Sharp & Dohme Przeciwciała Anty-IL-23p19 wytworzone metodą inżynierii genetycznej
DK2176298T3 (en) 2007-05-30 2018-02-12 Xencor Inc Methods and compositions for inhibiting CD32B-expressing cells
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
US8039597B2 (en) * 2007-09-07 2011-10-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 24P4C12 proteins
CN101910414B (zh) 2007-11-07 2016-01-13 健泰科生物技术公司 用于评估b细胞淋巴瘤对抗cd40抗体治疗的响应性的方法和组合物
HUE032735T2 (en) 2007-12-14 2017-10-30 Bristol Myers Squibb Co Binding molecules for the human OX40 receptor
JO2913B1 (en) 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
US8518410B2 (en) * 2009-03-10 2013-08-27 Baylor Research Institute Fusion protein with HIV antigen
ES2378513T3 (es) 2008-08-06 2012-04-13 Pfizer Inc. Compuestos 2-heterociclilamino piracinas sustituidas en posición 6 como inhibidores de CHK-1
CN102170908A (zh) * 2008-08-29 2011-08-31 莱顿大学医学中心附属莱顿教学医院 向个体的肿瘤引流淋巴结递送cd40激动剂
EP2198878A1 (en) 2008-12-18 2010-06-23 University Of Miami Polypeptide bombesin antagonists
AU2016244220B2 (en) * 2008-12-23 2018-05-17 Amgen Inc. Human CGRP receptor binding proteins
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
EP2403524A4 (en) * 2009-03-06 2012-09-26 Agensys Inc CONJUGATES ANTIBODY-DRUG (ADC) BINDING PROTEINS 24P4C12
JP5986382B2 (ja) 2009-03-10 2016-09-06 ベイラー リサーチ インスティテュートＢａｙｌｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 抗原提示細胞ターゲティング癌ワクチン
US9562104B2 (en) 2009-03-10 2017-02-07 Baylor Research Institute Anti-CD40 antibodies
CA2758523C (en) 2009-04-18 2019-03-12 Genentech, Inc. Methods for assessing responsiveness of b-cell lymphoma to treatment with anti-cd40 antibodies
JP5694921B2 (ja) 2009-04-20 2015-04-01 協和発酵キリン株式会社 アミノ酸変異が導入されたＩｇＧ２を有する抗体
TW201138843A (en) 2009-12-18 2011-11-16 Colgate Palmolive Co Biguanide preservation of precipitated calcium carbonate
WO2011083391A2 (en) 2010-01-05 2011-07-14 Pfizer Inc. Biomarkers for anti-igf-ir cancer therapy
PT3178851T (pt) 2010-03-31 2020-07-17 Boehringer Ingelheim Int Anticorpos anti-cd40
GB201006096D0 (en) * 2010-04-13 2010-05-26 Alligator Bioscience Ab Novel compositions and uses thereof
FR2959994B1 (fr) * 2010-05-12 2012-08-24 Lfb Biotechnologies Nouveaux anticorps humanises 12g4 mutes et leurs fragments diriges contre le recepteur humain de l'hormone anti-mullerienne de type ii
CN103221428B (zh) 2010-09-09 2016-02-10 辉瑞公司 4-1bb结合分子
AU2011310887A1 (en) * 2010-09-29 2013-05-02 Universite De Liege Combination of an agonistic anti-CD40 monoclonal antibody or a CD40 ligand and inactivated or attenuated bacteria for use in the treatment and/or prevention of mastitis
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
EP2640750A1 (en) * 2010-11-16 2013-09-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
JP5828909B2 (ja) * 2011-01-10 2015-12-09 シーティー アトランティック リミテッド 腫瘍関連抗原結合抗体を含む併用療法
GB201103578D0 (en) 2011-03-02 2011-04-13 Sabrepharm Ltd Dipyridinium derivatives
EP3556774B1 (en) 2011-03-11 2024-01-03 Beth Israel Deaconess Medical Center Inc. Anti-cd40 antibodies and uses thereof
US20140178368A1 (en) 2011-04-19 2014-06-26 Leslie Lynne SHARP Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
US10654916B2 (en) 2011-04-21 2020-05-19 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica
AR086360A1 (es) 2011-04-21 2013-12-11 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos anticuerpos que antagonizan cd40
WO2012149356A2 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Apexigen, Inc. Anti-cd40 antibodies and methods of use
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
GB201115280D0 (en) * 2011-09-05 2011-10-19 Alligator Bioscience Ab Antibodies, uses and methods
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
CN104136461B (zh) 2011-09-22 2021-06-08 安姆根有限公司 Cd27l抗原结合蛋白
EP3559049B1 (en) 2011-10-28 2025-06-11 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Polypeptide constructs and uses thereof
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013091661A2 (en) * 2011-12-23 2013-06-27 Aarhus Universitet Proteolytic resistant protein affinity tag
DK2809681T3 (en) * 2012-01-31 2019-03-11 Regeneron Pharma ANTI-ASIC1 antibodies and uses thereof
AR090263A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Hoffmann La Roche Terapia combinada de anticuerpos contra el csf-1r humano y las utilizaciones de la misma
EP2837387B1 (en) * 2012-03-08 2020-07-29 Japan Science and Technology Agency Anticancer agent
US20140004131A1 (en) 2012-05-04 2014-01-02 Novartis Ag Antibody formulation
CA2871711A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Pfizer Inc. Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
CA2877286C (en) 2012-06-18 2023-05-16 Yale University Compositions and methods for diminishing an immune response
CN104918957B (zh) 2012-10-30 2018-11-16 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
CA2899960C (en) 2013-02-01 2022-05-03 Transbio Ltd Anti-cd83 antibodies and use thereof
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
NZ712903A (en) 2013-03-18 2018-07-27 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
FI3677591T3 (fi) 2013-04-29 2023-04-03 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd38-vasta-aineet ja fuusiot heikennetylle interferonille alfa-2b
JP6797680B2 (ja) 2013-06-14 2020-12-16 サイオクサス セラピューティクス リミテッド Ｂ型アデノウイルスのための投与計画および製剤
JP6450750B2 (ja) 2013-06-17 2019-01-09 コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェＫｏｎｉｎｋｌｉｊｋｅ Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｎ．Ｖ． 磁気共鳴画像化被験者支持器
GB201311487D0 (en) * 2013-06-27 2013-08-14 Alligator Bioscience Ab Bispecific molecules
CN105612175B (zh) 2013-08-08 2023-05-09 赛腾制药 基于IL-15和IL-15Rαsushi结构域的调节因子
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
SI3021859T1 (en) 2013-10-25 2018-04-30 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenoviruses equipped with heterologous genes
GB201322583D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Alligator Bioscience Ab Antibodies
JP6345787B2 (ja) * 2013-12-20 2018-06-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ａｎｇ２抗体とｃｄ４０アゴニストとの併用療法
EP3094652B1 (en) 2014-01-13 2021-09-29 Baylor Research Institute Novel vaccines against hpv and hpv-related diseases
EP3113796A1 (en) 2014-03-07 2017-01-11 Bristol-Myers Squibb Company Method of using antibody polypeptides that antagonize cd40 to treat ibd
RU2016142476A (ru) 2014-03-31 2018-05-07 Дженентек, Инк. Комбинированная терапия, включающая антиангиогенезные агенты и агонисты, связывающие ох40
KR102526945B1 (ko) * 2014-04-30 2023-04-27 막스-델부뤽-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 인 데어 헬름홀츠-게마인샤프트 Ｃｄ269에 대한 인간화 항체
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
GB201413665D0 (en) 2014-07-03 2014-09-17 Transimmune Ag And Yale University Method for obtaining globally activated monocytes
MX382549B (es) 2014-08-12 2025-03-13 Alligator Bioscience Ab Combinación con anticuerpos anti-cd40 y anticuerpos anti-pd-1.
MX2017001976A (es) 2014-08-14 2017-08-02 Hoffmann La Roche Terapia de combinacion de anticuerpos activadores de la cd40 humana y anticuerpos contra el mp-l1 humano.
EP3070102A1 (en) 2015-03-18 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of antibodies human cd40 activating antibodies and anti human pld-1 antibodies
CA2960756C (en) 2014-09-15 2023-08-01 Amgen Inc. Bi-specific anti-cgrp receptor/pac1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
WO2016061617A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Dendrocyte Biotech Pty Ltd Cd83 binding proteins and uses thereof
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EA037749B1 (ru) 2014-10-29 2021-05-18 Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд ВАРИАНТЫ ИНТЕРФЕРОНА 2b
PL3212230T3 (pl) * 2014-10-29 2021-07-26 Seagen Inc. Dawkowanie i podawanie niefukozylowanych przeciwciał anty-CD40
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
CN107709365A (zh) 2015-04-13 2018-02-16 戊瑞治疗有限公司 癌症组合疗法
TWI799849B (zh) 2015-04-24 2023-04-21 美商安美基公司 治療或預防偏頭痛之方法
US11000559B2 (en) 2015-04-30 2021-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding a B7 protein
PE20221007A1 (es) 2015-06-24 2022-06-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad disenada
KR20180021833A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
CN107771184B (zh) * 2015-06-29 2022-11-01 百时美施贵宝公司 针对cd40的抗体
CN107921087A (zh) 2015-07-16 2018-04-17 百欧肯治疗有限公司 治疗癌症的组合物及方法
KR20250007054A (ko) 2015-09-04 2025-01-13 프리마토프 테라퓨틱스 인크. 인간화 항-cd40 항체 및 그의 용도
US20190048089A1 (en) * 2015-09-30 2019-02-14 Janssen Biotech, Inc. Antagonistic Antibodies Specifically Binding Human CD40 and Methods of Use
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
WO2017055542A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
GB2543550A (en) 2015-10-21 2017-04-26 Hox Therapeutics Ltd Peptides
SMT202200118T1 (it) 2015-11-03 2022-05-12 Janssen Biotech Inc Anticorpi che legano specificamente pd-1 e loro usi
EP3967707A1 (en) * 2015-11-16 2022-03-16 Ubiprotein, Corp. A method for extending half-life of a protein
DE212016000029U1 (de) * 2015-12-07 2017-07-30 Opi Vi - Ip Holdco Llc Zusammensetzungen von Antikörperkonstrukt-Agonist-Konjugaten
CN108697745A (zh) 2015-12-17 2018-10-23 皮斯奥克斯治疗公司 编码抗tcr复合体抗体或片段的b组腺病毒
IL261602B2 (en) * 2016-03-04 2024-06-01 Univ Rockefeller Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
EP3426271B1 (en) 2016-03-10 2025-08-27 CG Oncology, Inc. Methods of treating solid tumors by combination therapy
CN109476756B (zh) 2016-03-15 2022-05-31 埃泰美德(香港)有限公司 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
WO2017165681A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Gensun Biopharma Inc. Trispecific inhibitors for cancer treatment
MA43835A (fr) 2016-03-25 2018-11-28 Seattle Genetics Inc Procédé de préparation de lieurs de médicaments pégylés et leurs intermédiaires
AR108611A1 (es) 2016-05-27 2018-09-05 Abbvie Biotherapeutics Inc Anticuerpos anti-cd40 y sus usos
SG11201810591VA (en) 2016-05-27 2018-12-28 Abbvie Biotherapeutics Inc Bispecific binding proteins binding an immunomodulatory protein and a tumor antigen
CA3026880A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting cd32b expressing cells in igg4-related diseases
CN107474136B (zh) * 2016-06-08 2023-03-07 上海交通大学医学院 增强激动型抗体活性的抗体重链恒定区序列
TWI640536B (zh) 2016-06-20 2018-11-11 克馬伯有限公司 抗體
CA3030636A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
JP7241677B2 (ja) 2016-07-19 2023-03-17 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ４７併用療法
CN109843916B (zh) 2016-08-12 2023-10-31 詹森生物科技公司 具有增强的激动活性的Fc工程化抗TNFR超家族成员抗体及其使用方法
CN109863170B (zh) 2016-08-12 2024-08-16 詹森生物科技公司 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子
EP3504239B1 (en) 2016-08-25 2024-05-29 F. Hoffmann-La Roche AG Intermittent dosing of an anti-csf-1r antibody in combination with macrophage activating agent
IL303187A (en) 2016-08-29 2023-07-01 Akamis Bio Ltd Adenovirus with bispecific T cell activator
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
WO2018088850A2 (ko) 2016-11-11 2018-05-17 다이노나(주) Cd40에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2018115003A2 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Novel tnfr agonists and uses thereof
WO2018115051A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of tumors with an anti-csf-1r antibody in combination with an anti-pd-l1 antibody after failure of anti-pd-l1/pd1 treatment
CN109071656B (zh) 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂
EP3576782A4 (en) * 2017-02-02 2020-12-30 Silverback Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS OF RECOMBINATION PRODUCT-PEPTIDE AND THEIR METHODS OF USE
KR20190115057A (ko) 2017-02-10 2019-10-10 젠맵 비. 브이 폴리펩티드 변이체 및 그의 용도
JP7672196B2 (ja) 2017-03-14 2025-05-07 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
KR102648564B1 (ko) 2017-03-24 2024-03-19 씨젠 인크. 글루쿠로니드 약물-링커의 제조 공정 및 그 중간물
US20200087410A1 (en) * 2017-03-29 2020-03-19 Glycotope Gmbh Humanized anti-cd40 antibodies
EP3604384B1 (en) 2017-03-30 2021-09-08 NOF Corporation Hydrophilic polymer derivative having self-immolative acetal linker and composite using same
CN110475802B (zh) 2017-03-30 2022-03-08 日油株式会社 异双官能性单分散聚乙二醇以及使用该异双官能性单分散聚乙二醇的缀合物
MA49039A (fr) * 2017-04-04 2020-02-12 Hoffmann La Roche Nouvelles molécules bispécifiques de liaison à l'antigène capables de se lier spécifiquement à cd40 et à fap
JP2020516638A (ja) 2017-04-13 2020-06-11 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんを処置する方法における使用のための、インターロイキン２イムノコンジュゲート、ｃｄ４０アゴニスト、および任意選択のｐｄ−１軸結合アンタゴニスト
AU2018278051A1 (en) * 2017-06-01 2020-01-30 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Anti-CD40 antibody, antigen binding fragment thereof and medical use thereof
CA3063652A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic virus and method
CN110506058A (zh) * 2017-06-02 2019-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 免疫激动剂的施用路径
EP3418302A1 (en) 2017-06-19 2018-12-26 F. Hoffmann-La Roche AG Administration routes for immune agonists
CR20200076A (es) 2017-07-14 2020-06-10 Pfizer ANTICUERPOS CONTRA MAdCAM
WO2019025545A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
CN111511762B (zh) 2017-08-21 2025-05-06 天演药业公司 抗cd137分子及其用途
SG11202002366VA (en) * 2017-09-19 2020-04-29 Mab Discovery Gmbh Agonistic cd40 antibodies
US10610585B2 (en) 2017-09-26 2020-04-07 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and compositions for treating and preventing HIV
JP7311425B2 (ja) 2017-11-08 2023-07-19 協和キリン株式会社 ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体
CN111788227B (zh) 2017-12-27 2025-02-25 百时美施贵宝公司 抗cd40抗体及其用途
CN109971717B (zh) * 2017-12-28 2023-06-20 上海细胞治疗研究院 共表达cd40抗体与间皮素特异性嵌合抗原受体的t细胞及其用途
CN109971723B (zh) * 2017-12-28 2023-07-07 上海细胞治疗研究院 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
WO2019148445A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019176875A1 (ja) 2018-03-13 2019-09-19 日油株式会社 主鎖および側鎖に単分散ポリエチレングリコールを有するヘテロ二官能性化合物
KR20200135781A (ko) 2018-03-26 2020-12-03 암젠 인크 세포 배양에서 생산된 항체의 총 비푸코실화 당형태
MX2020010320A (es) 2018-04-02 2021-01-08 Amgen Inc Composiciones de erenumab y usos de las mismas.
KR20210005082A (ko) 2018-04-20 2021-01-13 리브젠 바이오파마 코., 엘티디. 항-cd40 항체 및 이의 용도
WO2019217833A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Abvision, Inc. Monoclonal antibodies activating cd40 and uses thereof
US20190365719A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Combination treatments of hsp90 inhibitors for enhancing tumor immunogenicity and methods of use thereof
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
EP3813864A4 (en) 2018-06-29 2022-07-20 Gensun Biopharma Inc. Antitumor antagonists
TWI803682B (zh) 2018-08-20 2023-06-01 美商輝瑞股份有限公司 抗－ｇｄｆ１５抗體、組成物及使用方法
US12460000B2 (en) 2018-09-07 2025-11-04 Itabmed (Hk) Limited Anti-CD19 and anti-CD3 bispecific antigen binding proteins and uses thereof
WO2020070288A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and systems for controlling the agonistic properties of antibody variable domains by light
BR112021009835A2 (pt) 2018-11-30 2021-08-17 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso farmacêutico dos mesmos
WO2020108621A1 (zh) 2018-11-30 2020-06-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种cd40抗体药物组合物及其用途
WO2020132810A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific antigen binding proteins capable of binding cd19 and cd3, and use thereof
US20220089758A1 (en) * 2019-01-22 2022-03-24 Revmab Biosciences Usa, Inc. Novel anti-cd40 antibodies
US10570210B1 (en) 2019-03-04 2020-02-25 Beijing Mabworks Biotech Co.Ltd Antibodies binding CD40 and uses thereof
EP3947454A1 (en) 2019-03-27 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Recombinant proteins with cd40 activating properties
CN113728008B (zh) * 2019-04-10 2024-04-09 南开大学 抗cd40抗体及其用途
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
CA3140385A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to cd40 and fap
US12466891B2 (en) 2019-05-15 2025-11-11 Kyowa Kirin Co., Ltd. Bispecific antibody binding to CD40 and GPC3
WO2020263312A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Gensun Biopharma, Inc. ANTITUMOR ANTAGONIST CONSISTING OF A MUTATED TGFβ1 - RII EXTRACELLULAR DOMAIN AND AN IMMUNOGLOBULIN SCAFFOLD
EP4027998A1 (en) 2019-09-09 2022-07-20 Basilea Pharmaceutica International AG Pharmaceutical combinations comprising a furazanobenzimidazoles and a cd40 agonist for use in the treatment of neoplastic diseases
CN114450324B (zh) 2019-09-26 2024-02-27 日油株式会社 具有肽连接子的异双官能单分散聚乙二醇
MX2022003461A (es) 2019-09-26 2022-04-19 Amgen Inc Metodos de produccion de composiciones de anticuerpos.
IL293450A (en) * 2019-12-03 2022-07-01 Evotec Int Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins and uses thereof
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
AU2020405230A1 (en) 2019-12-20 2022-06-23 Amgen Inc. Mesothelin-targeted CD40 agonistic multispecific antibody constructs for the treatment of solid tumors
US20210214454A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Symphogen A/S Anti-cd40 antibodies and compositions
IL272194A (en) 2020-01-22 2021-07-29 Yeda Res & Dev Multispecific antibodies for use in treating diseases
US20230210967A1 (en) 2020-04-23 2023-07-06 Brightpath Biotherapeutics Co., Ltd. Improved peptide vaccine
CA3177717A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Adagene Ag Compositions and methods for treating cancer
US20240279309A1 (en) 2020-05-14 2024-08-22 Molecular Partners Ag Recombinant cd40 binding proteins and their use
JP2023528204A (ja) 2020-05-14 2023-07-04 モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト 多選択性タンパク質
MX2022014943A (es) 2020-05-26 2023-03-08 Inst Nat Sante Rech Med Polipéptidos de coronavirus 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo (sars-cov-2) y usos de los mismos para propositos de vacuna.
GB202008003D0 (en) * 2020-05-28 2020-07-15 Quine Medical Ab Anti-CD40 antibody
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
CN116234575A (zh) * 2020-06-04 2023-06-06 赛尔疫苗私人有限公司 激动剂抗cd40抗体
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
JP2023538105A (ja) * 2020-08-21 2023-09-06 ウーシー・バイオロジクス・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド Ｃｄ４０アゴニスト抗体及び使用方法
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
CA3200878A1 (en) 2020-11-12 2022-05-19 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Antibodies conjugated or fused to the receptor-binding domain of the sars-cov-2 spike protein and uses thereof for vaccine purposes
MX2023007610A (es) 2020-12-23 2023-07-12 Inst Nat Sante Rech Med Vacuna contra clamidia basada en el direccionamiento del antigeno momp vs4 a las celulas presentadoras de antigeno.
WO2022147480A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Ansun Biopharma, Inc. Oncolytic virus encoding sialidase and multispecific immune cell engager
TW202241964A (zh) * 2021-01-08 2022-11-01 美商必治妥美雅史谷比公司 因子xia抑制劑之抗體及抗原結合肽及其用途
WO2022152701A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
JP2024504195A (ja) 2021-01-29 2024-01-30 アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） クラミジア・トラコマチス抗原性ポリペプチドおよびワクチン目的のためのその使用
CN116917009A (zh) 2021-02-19 2023-10-20 美国迈胜医疗系统有限公司 用于粒子治疗系统的机架
KR20230169135A (ko) 2021-03-09 2023-12-15 젠맵 에이/에스 치료에 있어서 cd40 및 cd137에 대한 다중특이 결합제
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
AU2022289365A1 (en) 2021-06-07 2023-12-14 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
BR112023026111A2 (pt) * 2021-06-28 2024-03-05 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso médico do mesmo
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
MX2024000674A (es) 2021-07-13 2024-02-07 BioNTech SE Agentes de union multiespecificos contra cd40 y cd137 en terapia de combinacion.
CN118234749A (zh) * 2021-09-17 2024-06-21 诺华股份有限公司 用于预防异种移植中的移植物排斥的方法
EP4408537A1 (en) * 2021-10-01 2024-08-07 MAB Discovery GmbH Agonistic cd40 antibodies as immune stimulatory agents
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
US12234294B2 (en) 2021-11-05 2025-02-25 Kiniksa Pharmaceuticals, Gmbh Pharmaceutical composition of a humanized anti-CD40 antibody
CN118765283A (zh) 2021-11-17 2024-10-11 国家健康科学研究所 通用沙贝病毒疫苗
US20250099588A1 (en) 2022-01-28 2025-03-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
AU2023231622A1 (en) * 2022-03-07 2024-09-26 Agenus Inc. Anti-ilt2 antibodies and uses thereof
WO2023193239A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Peter Peizhi Luo Anti-cd28 antibodies and methods of use thereof
EP4507779A1 (en) 2022-04-14 2025-02-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for controlling the tumor cell killing by light
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CA3257929A1 (en) 2022-05-31 2025-04-22 Futuregen Biopharmaceutical (Beijing) Co., Ltd. Anti-CD40 antibodies, bispecific anti-PD-L1×CD40 antibodies, and their use
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
WO2024059899A1 (en) * 2022-09-20 2024-03-28 Currus Biologics Pty Ltd Bispecific polypeptides and uses thereof
EP4598576A1 (en) * 2022-10-04 2025-08-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Anti-cd40 antibodies and uses thereof
WO2024074571A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Dc-targeting vaccine against nipah virus infection
EP4598946A1 (en) 2022-10-05 2025-08-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024118836A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes with shortened rep step
EP4626446A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 BioNTech SE Multispecific antibody against cd40 and cd137 in combination therapy with anti-pd1 ab and chemotherapy
CN115969997B (zh) * 2022-12-19 2024-02-13 华润生物医药有限公司 一种靶向cldn18.2的抗体药物偶联物及其应用
CN116375870B (zh) * 2022-12-30 2023-09-15 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 抗人cd40蛋白的人源化抗体、制备方法及其应用
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024213635A1 (en) * 2023-04-12 2024-10-17 Evotec International Gmbh Interferon-associated antigen binding proteins for use for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025250159A2 (en) * 2023-08-24 2025-12-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York N-linked glycan removal mutant antibodies and their use against influenza viruses
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
CN120424223A (zh) * 2024-02-04 2025-08-05 苏州泽璟生物制药股份有限公司 包含lrrc15抗原结合结构域的多特异性抗体
WO2025245964A1 (zh) * 2024-05-28 2025-12-04 中生康元生物科技(北京)有限公司 一种树突状细胞制剂及其制备方法

Family Cites Families (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US439216A (en) * 1890-10-28 Maker
US142358A (en) * 1873-09-02 Improvement in the purification of illuminating-gas
US59427A (en) * 1866-11-06 Improvement in fences
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8827305D0 (en) 1988-11-23 1988-12-29 British Bio Technology Compounds
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) * 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
DE69233769D1 (de) 1991-03-01 2009-09-24 Dyax Corp Chimäres Protein mit Mikroprotein mit zwei oder mehr Disulfidbindungen und Ausgestaltungen davon
US5416367A (en) * 1991-03-06 1995-05-16 Quicklogic Corporation Programmable application specific integrated circuit and logic cell therefor
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
JPH05242071A (ja) * 1991-11-20 1993-09-21 Mitsubishi Electric Corp 対象システムを制御または決定・推定する方法、およびその装置
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
US5455258A (en) 1993-01-06 1995-10-03 Ciba-Geigy Corporation Arylsulfonamido-substituted hydroxamic acids
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
FI961285L (fi) 1993-10-01 1996-03-20 Immunex Corp CD40:n vasta-aineita
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
NZ278740A (en) * 1993-12-23 1998-05-27 Immunex Corp Treating disease characterised by neoplastic cells expressing cd40 using a cd40 binding protein
US5612126A (en) * 1994-01-19 1997-03-18 Burlington Industries, Inc. Stiff fabric and method of forming the stiff fabric
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
JPH0812700A (ja) 1994-07-01 1996-01-16 Sumitomo Electric Ind Ltd マウスｃｄ４０に対するモノクローナル抗体
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
GB9425060D0 (en) * 1994-12-13 1995-02-08 Univ Birmingham Carcinoma treatment
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5863949A (en) 1995-03-08 1999-01-26 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
JPH11503360A (ja) * 1995-04-11 1999-03-26 ローベルト ボツシユ ゲゼルシヤフト ミツト ベシユレンクテル ハフツング 燃焼排ガス中の有害物質、特に窒素酸化物を減少させる方法および装置
DK0821671T3 (da) 1995-04-20 2001-04-23 Pfizer Arylsulfonylhydroxamsyrederivater som MMP- og TNF-inhibitorer
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
US5780215A (en) * 1995-07-26 1998-07-14 Konica Corporation Silver halide color photographic light-sensitive material
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
US6440418B1 (en) 1995-11-07 2002-08-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
ES2183905T3 (es) 1995-12-20 2003-04-01 Hoffmann La Roche Inhibidores de metaloproteasa de matriz.
ATE211134T1 (de) 1996-03-05 2002-01-15 4-anilinochinazolin derivate
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
EP0818442A3 (en) 1996-07-12 1998-12-30 Pfizer Inc. Cyclic sulphone derivatives as inhibitors of metalloproteinases and of the production of tumour necrosis factor
ES2191187T3 (es) 1996-07-13 2003-09-01 Glaxo Group Ltd Compuestos heteroaromaticos biciclicos como inhibidores de la proteina tirosin-quinasa.
JP4386967B2 (ja) 1996-07-13 2009-12-16 グラクソ、グループ、リミテッド プロテインチロシンキナーゼ阻害剤としての縮合複素環式化合物
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
HUP9903014A3 (en) 1996-07-18 2000-08-28 Pfizer Phosphinate derivatives having matrix metalloprotease inhibitor effect and medicaments containing the same
US6153609A (en) 1996-08-23 2000-11-28 Pfizer Inc Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US5817690A (en) * 1996-08-27 1998-10-06 American Home Products Corporation 4-aminoethoxy indolone derivatives
ID18494A (id) 1996-10-02 1998-04-16 Novartis Ag Turunan pirazola leburan dan proses pembuatannya
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
AU5131998A (en) 1997-01-06 1998-08-03 Pfizer Inc. Cyclic sulfone derivatives
ES2202796T3 (es) 1997-02-03 2004-04-01 Pfizer Products Inc. Derivados de acidos arilsulfonilaminohidroxamicos.
JP2000507975A (ja) 1997-02-07 2000-06-27 ファイザー・インク Ｎ−ヒドロキシ−β−スルホニルプロピオンアミド誘導体類及びそれらのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬としての使用
BR9807678A (pt) 1997-02-11 2000-02-15 Pfizer Derivados de ácidos arilsulfonil-hidroxâmicos
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
JP2002511852A (ja) 1997-05-07 2002-04-16 スージェン・インコーポレーテッド 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
DE69833755T2 (de) 1997-05-21 2006-12-28 Biovation Ltd. Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen
AU734009B2 (en) 1997-05-30 2001-05-31 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
ID23668A (id) 1997-08-08 2000-05-11 Pfizer Prod Inc Turunan asam ariloksiarilsulfonilamino hidroksamat
ATE368665T1 (de) 1997-08-22 2007-08-15 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
CA2303830A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Merck & Co., Inc. Novel angiogenesis inhibitors
NZ520093A (en) 1997-11-11 2004-03-26 Pfizer Prod Inc Thienopyrimidine and thienopyridine derivatives useful as anticancer agents
GB9725782D0 (en) 1997-12-05 1998-02-04 Pfizer Ltd Therapeutic agents
GB9800569D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
GB9801690D0 (en) 1998-01-27 1998-03-25 Pfizer Ltd Therapeutic agents
US6051228A (en) 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
JP4462654B2 (ja) 1998-03-26 2010-05-12 ソニー株式会社 映像素材選択装置及び映像素材選択方法
PA8469401A1 (es) 1998-04-10 2000-05-24 Pfizer Prod Inc Derivados biciclicos del acido hidroxamico
PA8469501A1 (es) 1998-04-10 2000-09-29 Pfizer Prod Inc Hidroxamidas del acido (4-arilsulfonilamino)-tetrahidropiran-4-carboxilico
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
WO1999061057A2 (en) 1998-05-23 1999-12-02 Tanox, Inc. Molecules targeting cd40 and tumor cells
IL139934A (en) 1998-05-29 2007-10-31 Sugen Inc History 2 - Indulinone converted to pyrrole and pharmaceutical preparations containing them
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
ES2213985T3 (es) 1998-11-05 2004-09-01 Pfizer Products Inc. Derivados de hidroxiamida de acido 5-oxo-pirrolidin-2-carboxilico.
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
DK2112166T3 (en) 1998-12-23 2019-02-04 Pfizer Human monoclonal antibodies to CTLA-4
EP2039368A3 (en) * 1999-04-30 2009-04-01 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Methods for preventing reactivation of latent virus and controlling virus replication
US20030118588A1 (en) * 1999-05-22 2003-06-26 Linda Diehl Induction of anti-tumor CTL immunity through in vivo triggering of 4-1BB and/or CD40
US6946129B1 (en) * 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
WO2001016180A2 (en) * 1999-08-27 2001-03-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd40 agonist compositions and methods of use
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
GB9927757D0 (en) * 1999-11-25 2000-01-26 Kennedy Rheumatology Inst Treatment of autoimmune diseases
CN100490895C (zh) * 2000-02-01 2009-05-27 泛遗传学公司 结合cd40的apc激活分子
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7063845B2 (en) 2000-04-28 2006-06-20 Gemini Science, Inc. Human anti-CD40 antibodies
AU2001259215A1 (en) * 2000-04-28 2001-11-12 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same
EP2796468A2 (en) 2001-01-05 2014-10-29 Pfizer Inc Antibodies to insulin-like growth factor I receptor
AR039067A1 (es) * 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
SI2177537T1 (sl) 2004-01-09 2012-01-31 Pfizer Protitielesa proti MAdCAM
US9881309B2 (en) 2012-03-13 2018-01-30 American Express Travel Related Services Company, Inc. Systems and methods for tailoring marketing
US10884952B2 (en) 2016-09-30 2021-01-05 Intel Corporation Enforcing memory operand types using protection keys

Also Published As

Publication number Publication date
IL161823A (en) 2014-02-27
ES2432968T3 (es) 2013-12-05
US20060093600A1 (en) 2006-05-04
US7618633B2 (en) 2009-11-17
DOP2002000507A (es) 2003-05-15
JP5547532B2 (ja) 2014-07-16
GEP20074222B (en) 2007-10-25
US20090130715A1 (en) 2009-05-21
EP1476185A4 (en) 2007-04-04
AU2002356926C1 (en) 2003-05-19
HK1069122A1 (en) 2005-05-13
PL214289B1 (pl) 2013-07-31
HU229829B1 (en) 2014-09-29
US20070190051A1 (en) 2007-08-16
MXPA04004467A (es) 2005-05-16
WO2003040170A2 (en) 2003-05-15
WO2003040170A3 (en) 2003-10-09
AP2004003034A0 (en) 2004-06-30
MY137641A (en) 2009-02-27
EP2343086A3 (en) 2012-02-22
CY1115675T1 (el) 2017-01-25
DK1476185T3 (da) 2013-10-14
ZA200404207B (en) 2005-08-31
AU2002356926B2 (en) 2007-01-04
US8388971B2 (en) 2013-03-05
NI200200128A (es) 2010-01-11
HUP0402247A2 (hu) 2005-01-28
BRPI0214137B8 (pt) 2021-05-25
US20100098694A1 (en) 2010-04-22
US20120225014A1 (en) 2012-09-06
PE20030846A1 (es) 2003-10-11
CN103450360A (zh) 2013-12-18
EP1476185B1 (en) 2013-07-31
TWI331040B (en) 2010-10-01
BRPI0214137B1 (pt) 2019-03-19
HRP20040525B1 (hr) 2017-06-02
ECSP045093A (es) 2004-07-23
PL370514A1 (pl) 2005-05-30
HN2002000318A (es) 2003-03-10
EP2343086A2 (en) 2011-07-13
UY27537A1 (es) 2003-02-28
CR10878A (es) 2011-01-12
EG25801A (en) 2012-08-08
PT1476185E (pt) 2013-11-05
NO20042388L (no) 2004-08-09
CU23745A3 (es) 2012-01-31
JP5848232B2 (ja) 2016-01-27
KR20050063749A (ko) 2005-06-28
TWI338579B (en) 2011-03-11
KR100830086B1 (ko) 2008-05-20
IS2940B (is) 2016-03-15
AR039067A1 (es) 2005-02-09
NZ533180A (en) 2008-03-28
HRP20040525A2 (en) 2005-04-30
US7338660B2 (en) 2008-03-04
CR7343A (es) 2004-10-28
PL392809A1 (pl) 2011-03-14
CN103450360B (zh) 2016-11-02
SI1476185T1 (sl) 2013-12-31
US7288251B2 (en) 2007-10-30
NO334339B1 (no) 2014-02-10
US20030211100A1 (en) 2003-11-13
US20130024956A1 (en) 2013-01-24
PA8557701A1 (es) 2003-12-19
US20160152713A1 (en) 2016-06-02
CN1582165B (zh) 2013-05-29
CA2466128C (en) 2013-10-29
JP2013099333A (ja) 2013-05-23
EA200400654A1 (ru) 2004-12-30
AP1918A (en) 2008-11-13
OA12725A (en) 2006-06-28
AU2002356926A2 (en) 2003-05-19
CN1582165A (zh) 2005-02-16
EP1476185A2 (en) 2004-11-17
JP2010213704A (ja) 2010-09-30
TNSN04078A1 (fr) 2006-06-01
IS7253A (is) 2004-05-06
US7626012B2 (en) 2009-12-01
RS52484B (sr) 2013-02-28
CL2009001779A1 (es) 2010-02-05
CA2466128A1 (en) 2003-05-15
MA27139A1 (fr) 2005-01-03
EA011449B1 (ru) 2009-02-27
IL161823A0 (en) 2005-11-20
JP4616555B2 (ja) 2011-01-19
RS39204A (sr) 2006-12-15
TW201034686A (en) 2010-10-01
ME00503B (me) 2011-10-10
US7563442B2 (en) 2009-07-21
PY0227624A (es) 2004-06-01
GT200200228A (es) 2008-09-26
BR0214137A (pt) 2004-09-14
TW200306204A (en) 2003-11-16
WO2003040170A9 (en) 2004-06-10
JP2005508176A (ja) 2005-03-31
US20090169563A1 (en) 2009-07-02
HUP0402247A3 (en) 2012-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7618633B2 (en) Antibodies that bind CD40 and methods of treating cancer and enhancing immune responses
AU2002356926A1 (en) Antibodies to CD40
HK1069122B (en) Antibodies to cd40