PL233836B1 - Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR - Google Patents
Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR Download PDFInfo
- Publication number
- PL233836B1 PL233836B1 PL410976A PL41097615A PL233836B1 PL 233836 B1 PL233836 B1 PL 233836B1 PL 410976 A PL410976 A PL 410976A PL 41097615 A PL41097615 A PL 41097615A PL 233836 B1 PL233836 B1 PL 233836B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- longidorus
- xiphinema
- species
- nematodes
- identification
- Prior art date
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 42
- 241000825546 Longidorus attenuatus Species 0.000 claims abstract description 14
- 241000985102 Longidorus diadecturus Species 0.000 claims abstract description 14
- 241001130173 Paralongidorus maximus Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000825532 Xiphinema californicum Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000998528 Xiphinema brevicolle Species 0.000 claims abstract description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 26
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 26
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 20
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 14
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 7
- 241000201423 Xiphinema Species 0.000 claims description 6
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 241001220360 Longidorus Species 0.000 claims description 3
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 2
- 241001130174 Paralongidorus Species 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 241000201425 Longidoridae Species 0.000 abstract description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241001220357 Longidorus elongatus Species 0.000 description 4
- 241001096501 Longidorus poessneckensis Species 0.000 description 3
- 241001423921 Xiphinema diversicaudatum Species 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241001130178 Longidorus macrosoma Species 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000965849 Delphinium multiplex Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000208367 Euonymus Species 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000522084 Leptocephalus Species 0.000 description 1
- 241000208565 Lignosus Species 0.000 description 1
- 241001021844 Longidorus aetnaeus Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 206010027146 Melanoderma Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000422193 Ormyrus Species 0.000 description 1
- 241000725693 Raspberry ringspot virus Species 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000201421 Xiphinema index Species 0.000 description 1
- 241001423920 Xiphinema italiae Species 0.000 description 1
- 241001423919 Xiphinema vuittenezi Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 244000045561 useful plants Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009369 viticulture Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ujawniono zarówno sposób jak i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników drzew i krzewów owocowych, metodą Real Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Longidorus attenuatus, Longidorus diadecturus, Paralongidorus maximus, Xiphinema brevicollum i Xiphinema californicum z rodziny Longidoridae. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników drzew i krzewów owocowych, metodą Real Time PCR, w szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Longidorus attenuatus, Longidorus diadecturus, Paralongidorus maximus, Xiphinema brevicollum i Xiphinema californicum z rodziny Longidoridae.
W Europie wykazano obecność 79 gatunków Longidoridae, z których 13 występuje w Polsce. Przedstawiciele tej rodziny zaliczani są do pasożytów roślin, są również wektorami wirusów atakujących rośliny. Rozmnażają się w glebie. Okres ich rozwoju jest długi i może trwać nawet kilka miesięcy. Mogą pasożytować na wielu roślinach użytkowych. Porażone rośliny są karłowate lub zamierają, szczególnie gdy porażone zostaną we wczesnym stadium swego rozwoju. Longidorus attenuatus, L. elongatus i L. macrosoma mogą przenosić wirusa czarnej plamistości pierścieniowej pomidorów i wirusa pierścieniowej plamistości malin. Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy, lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia param etrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów.
Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
Wang X., Bosselut N., Castagnone C., Voisin R., Abad P., Esmenjaud D. Multiplex polymerase chain reaction identification of single individuals of the Longidorid nematodes Xiphinema index, X. diversicaudatum, X. vuittenezi, and X. italiae using specific primers from ribosomal genes. Phytopathology. 2003; 93: 160-166 opisali sekwencje starterów do identyfikacji czterech gatunków Xiphinema.
Metoda polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) wykorzystuje enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie
PL 233 836 Β1 miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności, co pozwoliło autorom opracować metodę do identyfikacji 11 gatunków: Longidorus aetnaeus, L africanus, L andalusicus, L artemisiae, L caespiticola, L distinctus, L elongatus, L euonymus, L intermedius, L leptocephalus i L lignosus (Subbotin S.A., Rogozhin E.A., ChizhovV.N. Molecular characterisation and diagnostics of some Longidorus species (Nematoda: Longidoridae) from Russia and other countries using rRNA genes. 2014 Eur J Plant Pathol 138: 377-390).
Hubschen J., Kling L., Ipach U., Zinkernagel V., Brown D.J.F., Neilson R. 2004. Development and validation of species-specific primers that provide a molecular diagnostic for virus-vector longidorid nematodes and related species in German viticulture. European Journal of Plant Pathology 110: 883-891 opisali startery do identyfikacji Paralongidorus maximus oraz trzech gatunków Longidorus (Ł. attenuatus, L. elongatus, L. macrosoma) metodą klasycznego POR.
W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nie identyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi, natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfikacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wybranych z grupy zawierającej gatunki Longidorus attenuatus, Longidorus diadecturus, Paralongidorus maximus, Xiphinema brevicollum i Xiphinema californicum, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | 5’ starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Longidorus attenuatus | Lattfv | t8£»BCtttcatUgttc | Lattrv | ctacggaaaccttgttac | Latt | cgaactacgttatctatagg |
| Longidorus diadecturus | Ldiafv | gaacgaaagtctggttgg | Ldiarv | gctcaatgctaacgtcta | Ldia | ttcgtaagctgcgttcgttc |
| Paralongidorus maximus | Pmaxfv | ccagttcgttggtctaia | Pmaxrv | aacgggaataaacgtaac | Pmax | ctttccaccgcctcgaacga |
| Xiphi»ema breyicollum | Xbefv | gtcgagttgaggtcgaac | Xbcrv | gaigctttatatiagatccgaca | Xbe | ictaccgaacgagctftgttóc |
| Xiphinema californicum | Xcafv | ctgcgattcattatcagac | Xcarv | cgactctttaaatctgcc | Xca | aactaacgctaatccactacggc |
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Longidorus attenuatus, Longidorus diadecturus, Paralongidorus maximus, Xiphinema brevicollum i Xiphinema californicum, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | 5' starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Longidorus attenuatus | Lattfv | tggagctttcattagttc | Lattrv | ctacggaaaccttgttac | Latt | cgaactacgttalctatagg |
| Longidorus diadecturus | Ldiafv | gaacgaaagtctggttgg | Ldiarv | gctcaatgctaacgtcta | Ldia | ttcgtaagctgcgttcgttc |
| Paralongidorus maximus | Pmaxfv | ccagttcfittftgtciata | Pmaxrv | aacgggaataaacgtaac | Pmax | ctttccaccgcctcgaacga |
| Xiphinema bresicollum | Xbefv | gtcgagttgaggtcgaac | Xberv | gaigctttatattagalccgaca | Xbc | tctaccgaacgagctggtac |
| Xiphinema californicum | Xcafv | ctgcgattcattatcagac | Xcarv | cgactctttaaatctgcc | Xca | aactaacgctaatccactacggc |
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny
PL 233 836 Β1 reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji: Lattfv (SEKW NR ID: 1), Lattrv (SEKW NR ID: 2), Latt (SEKW NR ID: 3), Ldiafv (SEKW NR ID: 4), Ldiarv (SEKW NR ID: 5), Ldia (SEKW NR ID: 6), Pmaxfv (SEKW NR ID: 7), Pmaxrv (SEKW NR ID: 8), Pmax (SEKW NR ID: 9), Xbefv (SEKW NR ID: 10), Xberv(SEKWNR ID: 11), Xbe (SEKW NR ID: 12), Xcafv(SEKW NR ID: 13), Xcarv(SEKWNR ID: 14),Xca (SEKW NR ID: 15).
Fig. 1 przedstawia krzywe amplifikacji dla Longidorus attenuatus.
Fig. 2 przedstawia krzywe amplifikacji dla Longidorus diadecturus.
Fig. 3 przedstawia krzywe amplifikacji dla Paralongidorus maximus.
Fig. 4 przedstawia krzywe amplifikacji dla Xiphinema brevicollum.
Fig. 5 przedstawia krzywe amplifikacji dla Xiphinema californicum.
Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.
Przykład 1
Identyfikacja nicieni z gatunku Longidorus attenuatus
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Lattiv | tggagctttcattagttc |
| Lattrv | ctacggaaaccttgttac |
| Latt | cgaactacgttatctatagg |
Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Lattfv i Lattrv ,
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Latt znakowanej na końcu 5' barwnikiem JOE, a 3'-końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pomiar fluorescencji | |
| Pte-inkubacja | 95 | 180 | - | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 30 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | - | |
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Longidorus diadecturus, Longidorus elongatus, Longidorus poessneckensis.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 1. Przykład 2
Identyfikacja nicieni z gatunku Longidorus diadecturus
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
PL 233 836 Β1
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Ldiafv | gaacgaaagtctggttgg |
| Ldiarv | gctcaatgctaacgtcta |
| Ldia | ttcgtaagctgcgttcgttc |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Longidorus attenuatus, Longidorus elongatus, Longidorus poessneckensis.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 2. Przykład 3
Identyfikacja nicieni z gatunku Paralongidorus maximus
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Pmaxfv | ccagttcgttggtctata |
| Pmaxrv | aacgggaataaacgtaac |
| Pmax | ctttccaccgcctcgaacga |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Longidorus diadecturus, Longidorus attenuatus, Longidorus poessneckensis.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 3. Przykład 4
Identyfikacja nicieni z gatunku Xiphinema breyicollum
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Xbefv | gtcgagttgaggtcgaac |
| Xberv | gatgctttatattagatccgaca |
| Xbe | tctaccgaacgagctggttac |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Xiphinema californicum, Xiphinema diversicaudatum.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 4.
Przykład 5
Identyfikacja nicieni z gatunku Xiphinema califomicum
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Xcafv | c tgcgattc attatcagac |
| Xcarv | cgactctttaaatctgcc |
| Xca | aactaacgctaatccactacggc |
Kontrolę negatywną stanowiła mieszanka równych objętości roztworów DNA: Xiphinema breyicollum, Xiphinema diversicaudatum.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na fig. 5.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
PL 233 836 Β1
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicieni w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
Zastrzeżenia patentowe
Claims (5)
1. Sposób identyfikacji gatunków nicieni Longidorus attenuatus, Longidorus diadecturus, Paralongidorus maximus, Xiphinema brevicollum i Xiphinema californicum w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
1) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
2) wypłukanie nicieni z gleby;
3) izolację DNA;
4) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem pary starterów 3' i 5' oraz sondy;
5) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
2. Zestaw do identyfikacji gatunków nicieni Longidorus attenuatus, Longidorus diadecturus, Paralongidorus maximus, Xiphinema brevicollum i Xiphinema californicum metodą Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3' i 5' oraz sondy wybrane z listy:
PL 233 836 Β1
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410976A PL233836B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410976A PL233836B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410976A1 PL410976A1 (pl) | 2016-07-18 |
| PL233836B1 true PL233836B1 (pl) | 2019-11-29 |
Family
ID=56370109
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410976A PL233836B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233836B1 (pl) |
-
2015
- 2015-01-16 PL PL410976A patent/PL233836B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410976A1 (pl) | 2016-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPWO2021095798A1 (ja) | 未分化マーカー遺伝子高感度検出法 | |
| KR101624026B1 (ko) | 사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| CN106893764A (zh) | 一种青枯菌的lamp检测引物组合及其lamp检测试剂盒和lamp方法 | |
| KR102128651B1 (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법 | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL232394B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Xiphinema diversicaudatum, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| CN107574259A (zh) | 检测菜用大豆炭疽病菌的环介导等温扩增引物及应用 | |
| KR20230036316A (ko) | 노제마병, 석고병 및 백묵병의 꿀벌 질병 진단 키트 및 진단 방법 | |
| PL233893B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, ważnego szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR | |
| PL230915B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR | |
| Lee et al. | Development of in-field-diagnosis of Aspergillus flavus by Loop-Mediated Isothermal Amplification in Honeybee | |
| PL230913B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233894B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius microdorus, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR | |
| PL233887B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Aphelenchoides sacchari, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| CN101545008B (zh) | 马铃薯金线虫检测用引物及探针 | |
| PL233889B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233838B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow roslin ozdobnych, metoda Real Time PCR | |
| PL233886B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Geocenamus longus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233891B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Mesocriconema curvatum, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233885B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Merlinius brevidens, szkodnika zbóż i traw, metodą Real Time PCR |