PL230912B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR - Google Patents
Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCRInfo
- Publication number
- PL230912B1 PL230912B1 PL410980A PL41098015A PL230912B1 PL 230912 B1 PL230912 B1 PL 230912B1 PL 410980 A PL410980 A PL 410980A PL 41098015 A PL41098015 A PL 41098015A PL 230912 B1 PL230912 B1 PL 230912B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- heterodera
- species
- paratylenchus
- nematodes
- identification
- Prior art date
Links
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 title abstract description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 title abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 47
- 241001143330 Paratrichodorus minor Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000040429 Heterodera humuli Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000040388 Heterodera carotae Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000040390 Heterodera cruciferae Species 0.000 claims abstract description 12
- 241001148488 Helicotylenchus pseudorobustus Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000379510 Heterodera schachtii Species 0.000 claims abstract description 11
- 241001267634 Paratylenchus bukowinensis Species 0.000 claims abstract description 10
- 241001268457 Paratylenchus nanus Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 35
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 35
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 22
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 10
- 101150036041 HPSE gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 6
- 241001540512 Hoplolaimidae Species 0.000 claims description 5
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims description 4
- 241000243783 Heteroderidae Species 0.000 claims description 4
- 241001540434 Trichodoridae Species 0.000 claims description 4
- 241001148649 Paratylenchidae Species 0.000 claims description 3
- 241001148650 Paratylenchus Species 0.000 claims description 3
- 241001540466 Tylenchulidae Species 0.000 claims description 2
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 claims description 2
- 241001540447 Tylenchus Species 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241001480224 Heterodera Species 0.000 description 4
- 241000580319 Heterodera goettingiana Species 0.000 description 4
- 241000243782 Tylenchida Species 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241001148481 Helicotylenchus Species 0.000 description 2
- 241001481225 Heterodera avenae Species 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000418378 Paratylenchus projectus Species 0.000 description 2
- 241001148645 Paratylenchus straeleni Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000196509 Anguinidae Species 0.000 description 1
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 1
- 241001133184 Colletotrichum agaves Species 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000567357 Helicotylenchus varicaudatus Species 0.000 description 1
- 241001148489 Helicotylenchus vulgaris Species 0.000 description 1
- 102100030378 Hemoglobin subunit theta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101000843063 Homo sapiens Hemoglobin subunit theta-1 Proteins 0.000 description 1
- 241001540493 Hoplolaiminae Species 0.000 description 1
- 241001287835 Meloidogynidae Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001220303 Paratrichodorus pachydermus Species 0.000 description 1
- 241001408787 Paratrichodorus teres Species 0.000 description 1
- 241000193945 Pratylenchidae Species 0.000 description 1
- 241001132771 Rotylenchus buxophilus Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000024293 detection of nematode Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000000010 nanu Nutrition 0.000 description 1
- 244000082862 nanu Species 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Ujawniono sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni obejmujących gatunki Helicotylenchus pseudorobustus, Heterodera carotae, Heterodera cruciferae, Heterodera humuli, Heterodera schachtii, Paratrichodorus minor, Paratylenchus bukowinensis oraz Paratylenchus nanus. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR. W szczególności, wynalazek dotyczy sposobu i zestawu do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Helicotylenchus pseudorobustus z rodziny Hoplolaimidae, Heterodera carotae, Heterodera cruciferae, Heterodera humuli i Heterodera schachtii z rodziny Heteroderidae, Paratrichodorus minor z rodziny Trichodoridae, Paratylenchus bukowinensis i Paratylenchus nanus z rodziny Tylenchulidae.
Według najnowszej klasyfikacji rodzinę Anguinidae reprezentują w Polsce 34 gatunki, Heteroderidae - 17 gatunków, Meloidogynidae - 5 gatunków, Pratylenchidae - 5 gatunków, a w rodzinie Trichodoridae wykazano 11 gatunków. Wiele spośród nich to szkodniki roślin uprawnych. Porażone rośliny mają uszkodzony system korzeniowy, a zmniejszony pobór wody prowadzi do ich zamierania. Wymienione powyżej gatunki nicieni uznawane są za pasożyty lub potencjalne pasożyty roślin. Część naziemna zainfekowanej rośliny żółknie, a bulwy są mniejsze, pokryte brunatnymi plamami, co obniża ich wartość handlową.
Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.
Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.
Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real-Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real-Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real-Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.
PL 230 912 B1
Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism). Metoda polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych wykorzystuje enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności. Amiri S., Subbotin S. A. i Moens M., Identification of the beet cyst nematode Heterodera schachtii by PCR, European Journal of Plant Pathology (2002), 108: 497-506 analizowali tą metodą łącznie prawie 60 populacji tworzących cysty nicieni, co pozwoliło im dobrać odpowiednie enzymy restrykcyjne do identyfikacji H.schachtii, H.betae i H.trifolii. Subbotin S. A., Waeyenberge L. i Moens M. użyli w swojej publikacji Identification of cyst forming nematodes of the genus Heterodera (Nematoda: Heteroderidae) based on the ribosomal DNA-RFLP, Nematology (2000), 2 (2): 153-164 aż 26 różnych enzymów restrykcyjnych: AluI, AvaI, BamHI, BglI, BsiZI, BsuRI, Bshl236I, Bspl43I, CfoI, Ddel, EcoRI, Hpall, Hindlll, Hinfl, KpnI, MvaI, Pstl, PvuII, Psal, Sali, SfuI, SspI, ScrFI, TaqI, Tru9I i XbaI, dzięki czemu wyodrębnili 27 różnych gatunków i typów nicieni w próbie, między innymi H.carotae, H. cruciferae, Heterodera humuli i Heterodera schachtii.
Najnowsze podejście do molekularnych metod identyfikacji nicieni polega na zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym. Madani M., Subbotin S. A. i Moens M. w Quantitative detection of the potato cyst nematode, Globodera pallida, and the beet cyst nematode, Heterodera schachtii, using Real-Time PCR with SYBR green I dye, Molecular and Cellular Probes (2005), 19: 81-86 wykorzystali do szybkiej identyfikacji gatunku specyficzne startery i barwnik fluorescencyjny SYBR Green I. Wykorzystali oni mieszankę starterów opisanych we wcześniejszych publikacjach - 0,1 pM każdego ze starterów: SH6Mod 5'-CGT GTT CTT ACG TTA CTT CAA-3', SH4 5'-AGC ATG CGA AGG ATT GG-3', PITSp4 5'-ACA ACA GCA ATC GTC GAG-3' oraz Pal3 5'-ATG TTT GGG CTG GCA C-3', 12 pl barwnika i 4 pl DNA próbki w łącznej objętości końcowej 25 pl.
Identyfikacja Helicotylenchus pseudorobustus metodą sekwencjonowania DNA została opisana w publikacjach: Subbotin S.A., Vovlas N., Yeates G.W., Hallmann J., Kiewnick S., Chizhov V.N., Manzanilla-López R.H., Inserra R.N., Castillo P. 2011. Diversity and phylogenetic relationships within the spiral nematodes of Helicotylenchus Steiner, 1945 (Tylenchida: Hoplolaimidae) as inferred from analysis of the D2-D3 expansion segments of 28S rRNA gene sequences. Nematology 13(3): 333-345 oraz Subbotin S.A., Vovlas N., Yeates G.W., Hallmann J., Kiewnick S., Chizhov V.N., Manzanilla-López R.H., Inserra R.N., Castillo P. 2015. Morphological and molecular characterisation of Helicotylenchus pseudorobustus (Steiner, 1914) Golden, 1956 and related species (Tylenchida: Hoplolaimidae) with a phylogeny of the genus. Nematology 00: 1-26.
Identyfikacja Paratylenchus bukowinensis metodą sekwencjonowania DNA została opisana w publikacji Subbotin S.A., Vovlas N., Crozzoli R., Sturhan D., Lamberti F., Moens M., Baldwin J.G. 2005. Phylogeny of Criconematina Siddiqi, 1980 (Nematoda: Tylenchida) based on morphology and D2-D3 expansion segments of the 28S-rRNA gene sequences with application of a secondary structure model. Nematology 7(6): 927-944 a Paratrichodorus minor, Li X., Guo K., Zhang Y., Yan X., Zheng J. 2010. First Report of the Stubby Root Nematode, Paratrikhodorus minor in Mainland China. Plant Diseases 94(3): 376 http://dx.doi.org/10.1094/PDIS-94-3-0376A. Identyfikacja Paratylenchus nanus techniką sekwencjonowania DNA została opisana w publikacjach: Bae C.H., Szalanski A.L., Robbins R.T. 2009 Phylogenetic Analysis of the Hoplolaiminae Inferred from Combined D2 and D3 Expansion Segments of 28S rDNA. Journal of Nematology 41(1): 28-34 oraz van den Berg E., Tiedt L.R., Subbotin S.A. 2014. Morphological and molecular characterisation of several Paratylenchus Micoletzky, 1922 (Tylenchida: Paratylenchidae) species from South Africa and USA, together with some taxonomic notes. Nematology 16 (2014) 323-358.
W stanie techniki istnieje nadal potrzeba dostarczenia narzędzia umożliwiającego detekcję wybranych gatunków nicieni nieidentyfikowanych metodami genetycznymi, jak również dostarczenia udoskonalonego sposobu identyfikacji tych gatunków nicieni, które są wykrywane znanymi technikami genetycznymi natomiast nie zapewniają wysokiej precyzyjności i nie wykluczają błędów w analizie.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu umożliwiającego identyfikację gatunków nicieni z dużą czułością i specyficznością. Celem wynalazku jest również dostarczenie sposobu identyfi kacji nicieni, które nie były dotychczas wykrywane metodami analizy materiału genetycznego badanych gatunków. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond bądź nieoczywistego wyboru znanych sekwencji i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
PL 230 912 Β1
Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicieni w próbce gleby wybranych z grupy zawierającej gatunki Helicotylenchus pseudorobustus, Heterodera carotae, Heterodera cruciferae, Heterodera humuli, Heterodera schachtii, Paratrichodorus minor, Paratylenchus bukowinensis oraz Paratylenchus nanus, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji PCR, zwłaszcza, Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | 5’ starter | 3' starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| HeiiiOłyffrndms pseudorobustus | Hpsefv | acggaccanggagtnag | Hpserv | ttgaccitciicuicaugc | Hpse | tltcgacgcccaiitgactcg |
| Heterodera carotae | Hcarfv | ctsctgctggalcattac | Hcarrv | caaccgtagaggcgtaaa | Hcar | caiccatiagcgicagccagi |
| Heterodera cruciferae | Hcrufv | cgccattggagtlatatc | Hcrurv | gcgattaniicatacagatca | Hera | cgaagcacatitagtcacaecga |
| Heterodera faunu?/ | Hhumfv | glgcattacagacteacc | Hhumrv | cacacataccacsacua | Hhum | ccgaggacacalaaccacagl |
| Heterodera schachtii | Hsclifv | aggcacataacacact&a | Hsclirv | ataocagcaapcacaaac | Hsch | ctgęgaacgaenccaccnEc |
| Paratrichodorus minor | Ρπιίηίν | gctcgtctgątgtaaitag | Pniinrv | cttggtccgtgittcaag | Pmin | caccgiagaccuatęagccaatc |
| Para/yfenduts bufanvwensis | Pbukfv | cfggttgaggtgcattig | Pbukrv | giacgagcagaccaaaca | Pbuk | cugcggatcagcuctggac |
| Paratylenchus ułiwts | Pnanfv | .cctcgtciggtgtaattag | Pnanrv | c t tg c tc c gtglt Icaag | Pnan | caccglagaccllalgagccautc |
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji nicieni wybranych z grupy obejmującej gatunki Helicotylenchus pseudorobustus, Heterodera carotae, Heterodera cruciferae, Heterodera humuli, Heterodera schachtii, Paratrichodorus minor, Paratylenchus bukowinensis oraz Paratylenchus nanus, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę wybrane z listy:
| Gatunek | 5’ starter | 3’ starter | Sonda | |||
| Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | Nazwa | Sekwencja | |
| Hciicołytcłichus pseudorobustus | Hpsefv | acggaccaaggagtitag | Hpserv | ngaccttcactttcaltgc | Hpse | Ittcgacgcccaatgactcg |
| Heterodera carotae | Hcarfy | ctgctgciggatcauac | Hcarrv | caaccougaggcgiaaa | Hcar | catccanagcgtcagccagt |
| flelerotlem cruciferae | Hcrufy | cgccattggagitaiatc | Hcrtir? | gcgaitaaacaiacagatca | Hcru | cgaagcacaiaagtcacaccga |
| Heterodera Inunuli | Hhumfv | glgcattacagaclgacc | Hhumrv | cacacagaccacgagttn | Hhum | cc gaggacacatiiaccucaBt |
| Het e rade w &·&« chtii | Hsc!ifv | aggcacataacacactga | Hschrv | giagcagcaageacaaac | Hsch | ctgssaacgacaccaccatc |
| Paratrichodorus minor | Pnnnfe | gcicgicigąigtaaitag | Pniinry | cuggtccgtgittcaag | Pmin | caccgtagaccllalgagccaatc |
| Paratylenchus bukowinensis | Pbukfv | ciggtigaggtgcattlg | Pbukrv | g t acgagcagaccaaaca | Pbuk | cttgcggatcnccttctggac |
| Pclratylendnis nanus | Pnanfv | gctcgtciggtgfaattug | Pnanrv | cttggtccgtgtttcaag | Pnan | caccglagaccttatgagccaruc |
Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilną Taq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.
Nazwom sekwencji starterów oraz sond odpowiadają kolejne numery sekwencji:
Hpsefv (SEKW NR ID: 1), Hpserv (SEKW NR ID: 2), Hpse (SEKW NR ID: 3), Hcarfv (SEKW NR ID: 4), Hcarrv (SEKW NR ID): 5), Hcar (SEKW NR ID: 6), Hcrufv (SEKW NR ID: 7), Hcrurv (SEKW NR ID: 8), Hcru (SEKW NR ID: 9) Hhumfv (SEKW NR ID: 10), Hhumrv (SEKW NR ID: 11), Hhum (SEKW NR ID: 12), Hschfv (SEKW NR ID: 13), Hschrv (SEKW NR ID: 14), Hsch (SEKW NR ID: 15), Pminfv (SEKW NR ID: 16), Pminrv (SEKW NR ID: 17), Pmin (SEKW NR ID: 18), Pbukfv (SEKW NR ID: 19), Pbukrv (SEKW NR ID: 20), Pbuk (SEKW NR ID: 21), Pnanfv (SEKW NR ID: 22), Pnanrv (SEKW NR ID: 23), Pnan (SEKW NR ID: 24).
PL 230 912 Β1
Fig. 1 przedstawia krzywe amplifikacji dla Helicotylenchus pseudorobustus.
Fig. 2 przedstawia krzywe amplifikacji dla Heterodera carotae.
Fig. 3 przedstawia krzywe amplifikacji dla Heterodera cruciferae.
Fig. 4 przedstawia krzywe amplifikacji dla Heterodera humuli.
Fig. 5 przedstawia krzywe amplifikacji dla Heterodera schachtii.
Fig. 6 przedstawia krzywe amplifikacji dla Paratrichodorus minor.
Fig. 7 przedstawia krzywe amplifikacji dla Paratylenchus bukowinensis.
Fig. 8 przedstawia krzywe amplifikacji dla Paratylenchus nanus.
Poniżej podano przykłady identyfikacji każdego z wchodzących w skład zestawu gatunków nicieni. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany, mieszanina równych ilości DNA nicieni należących do tego samego gatunku co badany gatunek lub w przypadku braku gatunków należących do tego samego rodzaju, gatunek z tej samej rodziny.
Przykład 1
Identyfikacja nicieni z gatunku Helicotylenchus pseudorobustus.
DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Hpsefv | acggacca aggaglt lag |
| Hpserv | agaccticactttcatigc |
| Hpse | tttcgacgcccaatgactcg |
Reakcję Real-Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (SigmaAldrich) w następujących ilościach:
- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,
- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Hpsefv i Hpserv,
- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Hpse znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,
- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),
- 2 μΙ DNA.
Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:
| Etap | Temperatura [°C] | Czas [s] | Pomiar fluorescencji | |
| Pre-inkubacja | 95 | i 80 | - | |
| Amplifikacja | denaturacja | 95 | 30 | - |
| przyłączanie | 55 | 30 | pojedynczy | |
| synteza | 72 | 30 | - | |
| Chłodzenie | 40 | 20 | - |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Helicotylenchus exallus, Helicotylenchus varicaudatus oraz Helicotylenchus vulgaris.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1.
PL 230 912 Β1
Przykład 2
Identyfikacja nicieni z gatunku Heterodera carotae.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Hcarfv | clgctgctggatcattac |
| Hcarrv | caaccglagaggcgtaaa |
| Hcar | catccattagcgtcagccagt |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Heterodera aver>ae, Heterodera goettingiana oraz Heterodera humuli.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 2. Przykład 3
Identyfikacja nicieni z gatunku Heterodera cruciferae.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Hcrufv | cgccattggagttatatc |
| Hcrurv | gcgaitaaacaiacagalca |
| Hcru | cgaagcacataaglcacaccga |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Heterodera aver>ae, Heterodera goettingiana oraz Heterodera humuli.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 3. Przykład 4
Identyfikacja nicieni z gatunku Heterodera humuli.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Hhumfv | gtgc attacagaclgac c |
| Hhumrv | cacacagac cacgagt la |
| Hhum | ccgaggacacataaccacagt |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Heterodera avenae, Heterodera cruciferae oraz Heterodera goettingiana.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 4. Przykład 5
Identyfikacja nicieni z gatunku Heterodera schachtii.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.
PL 230 912 Β1
W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Hschfv | aggcacalaacacactga |
| Hschrv | glagcagcaagcacaaac |
| Hsch | ctgggaacgacaccaccatc |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Heterodera avenae, Heterodera goettingiana oraz Heterodera humuli.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 5. Przykład 6
Identyfikacją nicieni z gatunku Paratrichodorus minor.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.
W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Slarter/sonda | Sekwencja |
| Pminfv | gctcgtctggtgtaattag |
| Pminrv | cttggtccgtgtttcaag |
| Pmin | caccgtagaccttatgagccaatc |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Paratrichodorus teres oraz Paratrichodorus pachydermus.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 6. Przykład 7
Identyfikacja nicieni z gatunku Paratylenchus bukowinensis.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1.
W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Pbukfv | ctggttgaggtgcatttg |
| Pbukrv | gtacgagcagaccaaaca |
| Pbuk | cttgcggatcagcttctggac |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Paratylenchus nanus, Paratylenchus projectus oraz Paratylenchus straeleni.
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 7. Przykład 8
Identyfikacja nicieni z gatunku Paratylenchus nanus.
Warunki izolacji i amplifikacji odpowiadały warunkom przedstawionym w przykładzie 1. W reakcji Real-Time PCR użyto następujących starterów i sondy:
| Starter/sonda | Sekwencja |
| Pnanfv | gctcgtctggtgtaattag |
| Pnanrv | cttggtccgtgtttcaag |
| Pnan | caccgtagaccttatgagccaatc |
Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Paratylenchus bukowinensis, Paratylenchus projectus oraz Paratylenchus straeleni.
PL 230 912 Β1
Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 8.
Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicieni w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.
Proponowany zestaw sond pozwala identyfikować wyżej wymienione gatunki nicienie w reakcji Real-Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real-Time PCR sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real-Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.
Claims (2)
1. Sposób identyfikacji gatunków nicieni Helicotylenchus pseudorobustus z rodziny Hoplolaimidae, Heterodera carotae, Heterodera cruciferae, Heterodera humuli i Heterodera schachtii z rodziny Heteroderidae, Paratrichodorus minor z rodziny Trichodoridae, Paratylenchus bukowinensis i Paratylenchus nanus z rodziny Tylenchulidae w próbce gleby, obejmujący następujące etapy:
a) dostarczenie próbki gleby zawierającej nicienie do identyfikacji;
b) wypłukanie nicieni z gleby;
c) izolację DNA;
d) przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;
e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji jednego z powyższych gatunków w reakcji Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane z listy:
PL 230 912 Β1
2. Zestaw do identyfikacji gatunków nicieni Helicotylenchus pseudorobustus z rodziny Hoplolaimidae, Heterodera carotae, Heterodera cruciferae, Heterodera humuli i Heterodera schachtii z rodziny Heteroderidae, Paratrichodorus minor z rodziny Trichodoridae, Paratylenchus bukowinensis i Paratylenchus nanus z rodziny Tylenchulidae metodą Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondy wybrane z listy:
Rysunki
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410980A PL230912B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410980A PL230912B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410980A1 PL410980A1 (pl) | 2016-07-18 |
| PL230912B1 true PL230912B1 (pl) | 2019-01-31 |
Family
ID=56370046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410980A PL230912B1 (pl) | 2015-01-16 | 2015-01-16 | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL230912B1 (pl) |
-
2015
- 2015-01-16 PL PL410980A patent/PL230912B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410980A1 (pl) | 2016-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Subbotin | Molecular identification of nematodes using polymerase chain reaction (PCR). | |
| JPWO2021095798A1 (ja) | 未分化マーカー遺伝子高感度検出法 | |
| RU2016136727A (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров, зондов и способ выявления мутации 35delg гена gjb2 методом аллель-специфическая пцр амплификации при наследственной несиндромальной глухоте | |
| CN110423748A (zh) | 一种快速检测爪哇根结线虫的lamp引物及其应用、检测方法 | |
| PL230912B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników warzyw, metodą Real Time PCR | |
| PL230915B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin okopowych, metodą Real Time PCR | |
| PL230914B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233837B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow upraw roslin motylkowych, metoda Real Time PCR | |
| PL233893B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, ważnego szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR | |
| CN101545008B (zh) | 马铃薯金线虫检测用引物及探针 | |
| PL232393B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paratrichodorus pachydermus, szkodnika roślin, metodą Real Time PCR | |
| PL233631B1 (pl) | Wspomagany magnetycznie bioreaktor | |
| PL233836B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni szkodzacych drzewom i krzewom owocowym metoda Real Time PCR | |
| KR101967404B1 (ko) | 말 파이로플라즈마증 진단용 세트, 이를 이용한 말 파이로플라즈마증의 진단방법 및 키트 | |
| PL233892B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus eonymus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL230913B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodników grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233888B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paralongidorus maximus szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233890B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Rotylenchus buxophilus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL231512B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus intermedius, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL231510B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Rotylenchus capitatus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| RU2791958C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:N501Y SARS-CoV-2 | |
| PL231513B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Longidorus poessneckensis, szkodzącego drzewom i krzewom owocowym, metodą Real Time PCR | |
| PL233889B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Paraphelenchus myceliophthorus, szkodnika grzybów, metodą Real Time PCR | |
| PL233886B1 (pl) | Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Geocenamus longus, szkodnika roślin leśnych, metodą Real Time PCR | |
| PL233839B1 (pl) | Sposob i zestaw do identyfikacji nicieni, szkodnikow zboz i traw, metoda Real Time PCR |