PL233893B1 - Sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, ważnego szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, szkodnika roślin uprawnych, metodą Real Time PCR. Dzięki specyficznie dobranym starterom i sondom rozwiązanie to umożliwia precyzyjną identyfikację wskazanych gatunków nicieni niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób i zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana metodą Real Time PCR.

Według najnowszej klasyfikacji rodzinę nicieni Heteroderidae reprezentują w Polsce 17 gatunków. Heterodera goettingiana jest ważnym szkodnikiem roślin uprawnych. Porażone rośliny mają uszkodzony system korzeniowy, a zmniejszony pobór wody prowadzi do ich zamierania. Część naziemna zainfekowanej rośliny żółknie, a bulwy są mniejsze, pokryte brunatnymi plamami, co obniża ich wartość handlową,

Identyfikacja gatunków nicieni oparta jest na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych, w tym diagnozowane są m.in.: zabarwienie samicy na poszczególnych etapach rozwojowych, kształt cysty, długość i kształt guzów sztyletu, długość larwy inwazyjnej, wzór na płytce perinealnej. Jest to jednak analiza bardzo pracochłonna i czasochłonna. Wymaga dużo wiedzy i doświadczenia w pracy z materiałem biologicznym. Ponadto, istnieje możliwość nachodzenia na siebie wymiarów różnych gatunków. Metody opartej na analizie cech morfologicznych i morfometrycznych nie można zastosować do identyfikacji młodocianych osobników, u których cechy morfologiczne nie są jeszcze wykształcone.

Obecnie w diagnostyce nematologicznej coraz częściej stosowane są techniki oparte na analizie kwasów nukleinowych, w tym wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR). Podstawą techniki PCR jest powielenie fragmentu/ów DNA, specyficznego dla określonego organizmu, do poziomu umożliwiającego jego szybką i prostą detekcję przy użyciu elektroforezy. Uzyskuje się to stosując krótkie jednoniciowe oligonukleotydy (12-40 nukleotydów), tzw. startery, specyficzne dla powielanego fragmentu DNA oraz enzym - termostabilną polimerazę, która umożliwia powielenie żądanego fragmentu w cyklicznej, trzyetapowej reakcji, złożonej z denaturacji, wiązania starterów oraz syntezy DNA. Zazwyczaj po około 30 cyklach reakcji uzyskuje się ponad milion kopii powielanego fragmentu DNA, co pozwala zidentyfikować go techniką elektroforezy żelowej.

Udoskonaleniem łańcuchowej reakcji polimerazy jest Real Time PCR, to jest rekcji PCR z pomiarem ilości powielonego fragmentu w każdym cyklu reakcji. Do pomiaru ilości powielonego fragmentu wykorzystuje się fluorochromy (barwniki fluorescencyjne), np.: SYBR Green I, SYTO9, Eva Green, SYBR Gold, których fluorescencja jest proporcjonalna do ilości powielonego fragmentu. Identyfikację powstałych produktów przeprowadza się poprzez pomiar wielkości fluorescencji oraz analizę krzywej topnienia produktów reakcji bez elektroforezy. Czułość reakcji Real Time PCR jest znacznie większa niż tradycyjnego PCR, a brak elektroforezy skraca czas analizy. Wadą Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi (podobnie jak tradycyjnego PCR) jest ograniczona specyficzność reakcji. W większości przypadków reakcja PCR zachodzi nie tylko w przypadku 100% identyczności sekwencji starterów do sekwencji matrycy lecz również gdy 1-2 nukleotydy są nieidentyczne. Ta właściwość tradycyjnego PCR i Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi wymaga precyzyjnego ustawienia parametrów termicznych reakcji. Ponadto, barwniki fluorescencyjne wiążą się z każdym dwuniciowym fragmentem DNA, powstałym również w wyniku amplifikacji starterów (produkty primer-primer, primer-dimer), co wymaga również starannego doboru odpowiedniego stężenia starterów. Alternatywą dla barwników fluorescencyjnych są sondy DNA znakowane fluorescencyjnie. Są to krótkie odcinki DNA, komplementarne do poszukiwanej sekwencji, które po przyłączeniu do DNA podczas reakcji PCR emitują fluorescencję o określonej długości fali. Obecnie znanych jest kilka rodzajów sond, np.: TaqMan, FRET, molecular beacons, czy scorpions. Specyficzność reakcji Real Time PCR ze znakowanymi sondami jest znacznie wyższa niż z barwnikami fluorescencyjnymi. W odróżnieniu od starterów niedopasowanie jednego nukleotydu w sekwencji sondy prowadzi przeważnie do braku reakcji lub bardzo istotnego zmniejszenia wydajności, co jest łatwe do stwierdzenia podczas monitorowania przebiegu reakcji lub analizy wyników reakcji.

Dotychczas najczęściej stosowaną metodą molekularnej identyfikacji nicieni było PCR-RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism). Metoda polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych wykorzystuje enzymy restrykcyjne, które tną nić DNA w specyficznym dla siebie miejscu. Różnice w długości pociętych fragmentów DNA świadczą o zmienności. Amiri S., Subbotin S. A. i Moens M., Identification of the beet cyst nematode Heterodera schachtii by PCR, European Journal of Plant Pathology (2002), 108: 497-506 analizowali tą metodą łącznie prawie 60 populacji tworzących cysty nicieni, co pozwoliło im dobrać odpowiednie enzymy restrykcyjne do identyfikacji H. schachtii, H.betae i H.trifolii. Subbotin S. A., Waeyenberge L. i Moens M. użyli w swojej publikacji Identification of cyst forming nematodes of the genus Heterodera (Nematoda: Heteroderidae) based on the ribosomal

PL 233 893 Β1

DNA-RFLP, Nematology (2000), 2(2): 153-164 aż 26 różnych enzymów restrykcyjnych: Alul, Aval, BamHI, Bgll, BsiZI, BsuRI, Bsh1236I, Bsp143I, Cfol, Ddel, EcoRI, Hpall, Hindlll, Hinfl, KpnI, Mval, Pstl, PvuII, Psal, Sali, Stul, Sspl, ScrFI, Taql, Tru9I i Xbal, dzięki czemu wyodrębnili 27 różnych gatunków i typów nicieni w próbie, między innymi H.carotae, H, cruciferae, Heterodera humuli i Heterodera schachtii. Madani, M; Vovlas, N; Castillo, P; Subbotin, SA, Moens, M. 2004. Molecular characterization of cyst nematode species (Heterodera spp.) from the Mediterranean Basin using RFLPs and sequences of ITS-rDNA. Journal of phytopathology 152(4): 229-234 opisali identyfikację Heterodera goettingiana metodą PCR-RFLP.

Najnowsze podejście do molekularnych metod identyfikacji nicieni polega na zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym. Madani M., Subbotin S. A. i Moens M. w Quantitative detection of the potato cyst nematode, Globodera pallida, and the beet cyst nematode, Heterodera schachtii, using Real-Time PCR with SYBR green I dye, Molecular and Cellular Probes (2005), 19: 81-86 wykorzystali do szybkiej identyfikacji gatunku specyficzne startery i barwnik fluorescencyjny SYBR Green I. Wykorzystali oni mieszankę starterów opisanych we wcześniejszych publikacjach -0,1 μΜ każdego ze starterów: SH6Mod 5’-CGT GTT CTT ACG TTA CTT CAA-3’, SH4 5’-AGC ATG CGA AGG ATT GG-3% PITSp4 5’-ACA ACA GCA ATC GTC GAG-3’ oraz Pal3 5’-ATG TTT GGG CTG GCA C-3’, 12 μΙ barwnika i 4 μΙ DNA próbki w łącznej objętości końcowej 25 μΙ.

Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu identyfikacji Heterodera goettingiana z dużą czułością i specyficznością oraz dostarczenie nowych sekwencji nukleotydowych starterów i sond, mających zastosowanie w sposobie wykrywania nicieni techniką PCR, zwłaszcza Real Time PCR, niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju. Powyższe cele zrealizowano w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana w próbce gleby obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji;

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, przy czym do identyfikacji gatunku w reakcji PCR, zwłaszcza, Real-Time PCR stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:

Gatunek	5' starter	3' starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Heterodera goellinRuifia	Hetgofv	GGGTGTATGTGTG TGATG	Hetgorc	CGAGAACATGCA ATGAGA	Hetgos	CCGAACTAACTGCTG GTACG

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do identyfikacji Heterodera goettingiana metodą PĆR, zwłaszcza Real Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 3’ i 5’ oraz sondę:

Gatunek	5’ starter	3' starter	Sonda
Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja	Nazwa	Sekwencja
Heterodera goettingiana	Hetgofv	GGGTGTATGTGTG TGATG	Hetgorv	CGAGAACATGCA ATGAGA	Hctgos	CCGAACTAACTGCTG GTACG

Mieszanina reakcyjna zawiera bufor, termostabilnąTaq polimerazę, jony magnezu, startery i sondę. Stężenie starterów w mieszaninie reakcyjnej wynosi 1-2 μΜ, sondy 50-100 nM, jonów magnezu 2-5 mM. Reakcję prowadzi się przy temperaturze przyłączania starterów 55-60°C, w objętości mieszaniny reakcyjnej 10-20 μΙ, przy zastosowaniu od 35 do 40 cykli reakcji. Identyfikacji produktów dokonuje się poprzez porównanie krzywych amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej.

Poniżej podano przykład identyfikacji Heterodera goettingiana. Każdorazowo identycznym warunkom izolacji i amplifikacji poddawano próbę zerową (dejonizowana H2O wolna od nukleaz) oraz próbę ujemną. Materiałem dla próby ujemnej było DNA gatunku nicienia należącego do tego samego rodzaju co badany.

PL 233 893 Β1

Przykład

Identyfikacją nicieni z gatunku Heterodera goettingiana

DNA izolowano przy użyciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA NucleoSpin Tissue XS firmy Macherey-Nagel. W reakcji użyto starterów i sondy o następujących sekwencjach:

Starter/sonda	Sekwencja
Hetgofv	GGGTGTATGTGTGTGATG
Hetgorv	CGAGAACATGCAATGAGA
Hetgos	CCGAACTAACTGCTGGTACG

Reakcję Real Time PCR przeprowadzano w mieszaninie o objętości 20 μΙ w aparacie RotorGene 6000 firmy Qiagen przy użyciu odczynników z zestawu LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich) w następujących ilościach:

- H2O wolna od nukleaz do objętości 20 μΙ,

- 2 μ110,0 μΜ każdego ze starterów Hetgofv i Hetgorv,

- 1 μΙ 4,0 μΜ sondy Hetgos znakowanej na końcu 5’ barwnikiem JOE, a 3’-końcu wygaszaczem HBQ1,

- 10 μΙ 2X LuminoCt qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich),

- 2μϋΝΑ.

Mieszaninę reakcyjną umieszczano w probówce o objętości 20 μΙ, umieszczano w rotorze termocyklera RotorGene 6000 i przeprowadzano reakcję amplifikacji w 40 cyklach w następujących warunkach:

Etap	Temperatura [°C]	Czas [s]	Pomiar fluorescencji
Pre-inkubacja	95	180	-
Amplifikacja	denaturacja	95	30	-
przyłączanie	55	30	pojedynczy
synteza	72	30	-
Chłodzenie	40	20

Kontrolę negatywną stanowiło DNA nicieni Heterodera schachtii.

Krzywe amplifikacji uzyskane w wyniku przeprowadzonej analizy przedstawiono na Fig. 1.

Rozwiązanie według wynalazku pozwala na wykrycie nicienia Heterodera goettingiana w glebie w przeciągu kilku godzin, uwzględniając w tym etapy przygotowania prób, izolacji DNA oraz reakcji Real-Time PCR. Metodę według wynalazku, można zastosować do identyfikacji wyżej wymienionego gatunku niezależnie od rodzaju prób badanych, ich pochodzenia i przeznaczenia oraz stadium rozwoju.

Proponowany zestaw starterów i sondy pozwala identyfikować wyżej wymieniony gatunek nicienia w reakcji Real Time PCR, która jest znacznie czulsza i szybsza od innych metod PCR. Zastosowanie w reakcji Real Time PCR sondy znacznie zwiększa specyficzność reakcji w stosunku do reakcji Real Time PCR z barwnikami fluorescencyjnymi.

Wykaz sekwencji starterów i sond

Nr starter a/sondy Nazwa Sekwencja

Nr l	Hetgoft· GGGTGTATGTGTGTGATG
Nr 2	Hctgorv CGAGAACATGCAATGAGA
Nr 3	Hetgos CCGAACTAACTGCTGGTACG

PL 233 893 B1

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana w próbce gleby obejmujący następujące etapy:

a) dostarczenie próbki gleby zawierające nicienie do identyfikacji

b) wypłukanie nicieni z gleby;

c) izolację DNA;

d) przeprowadzenie reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, z zastosowaniem pary starterów 3’ i 5’ oraz sondy;

e) porównanie krzywej amplifikacji badanej próby z krzywymi amplifikacji próby zerowej oraz kontroli negatywnej, znamienny tym, że do identyfikacji gatunku Heterodera goettingiana w reakcji PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, stosuje się właściwe dla danego gatunku startery 5’ (nr 1) i 3’ (nr 2) oraz sondę nr 3.

2. Zestaw do identyfikacji nicienia Heterodera goettingiana, metodą PCR, zwłaszcza Real-Time PCR, zawierający właściwe dla danego gatunku startery 5’ (nr 1) i 3’ (nr 2) oraz sondę nr 3.