PL239946B1 - Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów - Google Patents
Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów Download PDFInfo
- Publication number
- PL239946B1 PL239946B1 PL413941A PL41394115A PL239946B1 PL 239946 B1 PL239946 B1 PL 239946B1 PL 413941 A PL413941 A PL 413941A PL 41394115 A PL41394115 A PL 41394115A PL 239946 B1 PL239946 B1 PL 239946B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- formula
- nucleotide
- synthesis
- sequence
- compound
- Prior art date
Links
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 71
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 38
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 25
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 title claims description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 10
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 title claims description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 title 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 24
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 22
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 13
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N triethylammonium acetate Chemical compound CC(O)=O.CCN(CC)CC AVBGNFCMKJOFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000001399 1,2,3-triazolyl group Chemical group N1N=NC(=C1)* 0.000 claims description 4
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 claims description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 4
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 claims description 4
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 claims description 4
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 claims description 4
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 claims description 4
- 150000001345 alkine derivatives Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 claims description 2
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims description 2
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N Allylamine Chemical compound NCC=C VVJKKWFAADXIJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 copper (I) ions Chemical class 0.000 description 8
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- QPUYECUOLPXSFR-UHFFFAOYSA-N 1-methylnaphthalene Chemical compound C1=CC=C2C(C)=CC=CC2=C1 QPUYECUOLPXSFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010461 azide-alkyne cycloaddition reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N isobutane Chemical compound CC(C)C NNPPMTNAJDCUHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- GRERKWAIZGIGIM-UHFFFAOYSA-N (1-benzyltriazol-4-yl)methanamine Chemical compound N1=NC(CN)=CN1CC1=CC=CC=C1 GRERKWAIZGIGIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PEEUITQAXNZZPU-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-azido-3-methylbutanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)N=[N+]=[N-] PEEUITQAXNZZPU-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-benzyltriazol-4-yl)-n,n-bis[(1-benzyltriazol-4-yl)methyl]methanamine Chemical compound C=1N(CC=2C=CC=CC=2)N=NC=1CN(CC=1N=NN(CC=2C=CC=CC=2)C=1)CC(N=N1)=CN1CC1=CC=CC=C1 WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 1H-1,2,3-Triazole Chemical compound C=1C=NNN=1 QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOVXKUCVZUROAN-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-1h-indole Chemical compound C1=CC=C2C(CC)=CNC2=C1 GOVXKUCVZUROAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000003775 Density Functional Theory Methods 0.000 description 1
- 238000006736 Huisgen cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003851 azoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000005898 carboxamidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- XMSHRLOQLUNKSN-UHFFFAOYSA-N destosyl pyrazolate Chemical compound CC1=NN(C)C(O)=C1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1Cl XMSHRLOQLUNKSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000001282 iso-butane Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N sulfamide Chemical group NS(N)(=O)=O NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1048—SELEX
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów. Przedmioty wynalazku znajdują zastosowanie w selekcji in vitro aptamerów, wykorzystywanych jako cząsteczki terapeutyczne, jak i podstawowe składniki molekularnych narzędzi diagnostycznych.
Aptamery to oligonukleotydy - jednoniciowe fragmenty kwasu rybonukleinowego lub deoksyrybonukleinowego (RNA lub DNA), zwykle o długości od kilkunastu do kilkudziesięciu nukleotydów, których określona sekwencja pozwala im na przyjęcie struktury trójwymiarowej dopasowanej do molekularnej struktury liganda i wiązanie go z wysoką czułością i selektywnością. Aptamery znajdują bardzo liczne zastosowania w biotechnologii i medycynie, zarówno jako cząsteczki terapeutyczne jak i podstawowe składniki molekularnych narzędzi diagnostycznych. To sprawia, że aptamery często przyrównywane są do powszechnie używanych przeciwciał. Jednakże pula potencjalnych ligandów, na które już udało się wyselekcjonować działające aptamery, jest znacznie szersza niż głównie białkowi partnerzy przeciwciał. Wśród ligandów zawierają się bowiem również związki niskocząsteczkowe o praktycznie dowolnej strukturze, takie jak np. jony metali, alkaloidy, barwniki organiczne, aminokwasy, nukleozydy, nukleotydy, porfiryny czy cukry [1-3]. Kolejnymi zaletami aptamerów, które w wielu zastosowaniach stawiają je ponad przeciwciałami, są: ich niewielki rozmiar (najmniejszy wyselekcjonowany działający aptamer ma długość 15 nukleotydów [4], co odpowiada masie około 4600 g/mol); niska lub zerowa immunogenność; tania i wydajna synteza chemiczna, dzięki której również otrzymujemy stuprocentowo homogenny preparat; możliwość wprowadzenia wielorakich modyfikacji chemicznych; wysoka odporność na niefizjologiczne warunki i możliwość spontanicznej renaturacji, oraz stosunkowo szybki proces selekcji aptamerów na wybrany cel molekularny.
Aptamery otrzymywane są za pomocą procesu „ewolucji in vitro”, zwanego metodą SELEX (ang. Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment). Opiera się on na repetytywnym wiązaniu puli (zazwyczaj 1012-1014 cząsteczek w pierwszej rundzie selekcji) cząsteczek oligonukleotydów o różnych sekwencjach (zwanych biblioteką) z wybranym celem molekularnym, a następnie fizycznym oddzieleniu cząsteczek, które związały cel, od pozostałych. Po rozdziale oligonukleotydy wiążące cel są enzymatycznie powielane i proces jest powtarzany, zazwyczaj w zaostrzających się warunkach tak, aby wyselekcjonować cząsteczki o pożądanych parametrach wiązania celu [5, 6]. W ten sposób uzyskane aptamery poddaje się sekwencjonowaniu - poznanie sekwencji nukleotydowej pozwala na chemiczną syntezę czystego aptameru przeznaczanego do dalszych zastosowań, lub też do dalszej optymalizacji, polegającej na przykład na wprowadzaniu modyfikacji lub skracaniu oligonukleotydów.
Biblioteki to zbiory jednoniciowych kwasów nukleinowych, zawierających w sekwencji region o losowej sekwencji nukleotydów. Podczas procesu SELEX z biblioteki zostają wyselekcjonowane sekwencje (klony), które mają zdolność wiązania wybranego celu molekularnego, na który przeprowadzana była selekcja. Każda cząsteczka kwasu nukleinowego w bibliotece posiada tę samą strukturę dwa regiony starterowe na końcach, pozwalające na amplifikację biblioteki w reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR), oraz region o losowej sekwencji w środku.
Zarówno DNA jak i RNA są podatne na trawienie przez enzymy nukleolityczne. Zastosowanie aptamerów in vivo lub nawet in vitro z preparatami zawierającymi nukleazy (np. lizaty komórkowe) jest więc utrudnione ze względu na degradację kwasów nukleinowych przez te enzymy. By zniwelować ten problem, zaproponowano wiele modyfikacji łańcucha cukrowo-fosforanowego aptamerów, wprowadzając na przykład podstawienie grupy hydroksylowej przy węglu 2' grupą aminową, lub zamianę jednego z atomów tlenu w wiązaniu fosfodiestrowym na atom siarki (tioaptamery). Innymi sposobami zmniejszenia podatności kwasów nukleinowych na trawienie enzymatyczne może być przykładowo wprowadzenie „spiegelmerów”, czyli oligonukleotydów, w których część cukrowa zbudowana jest z izomeru L rybozy, nie zaś z naturalnie występującego izomeru D, lub użycie LNA (ang. locked nucleic acid) - analogu, w którym cząsteczki rybozy posiadają dodatkowe wiązanie, łączące węgiel 4' i tlen 2' (zamykając w ten sposób rybozę w konformacji 3'-endo-, co wpływa na właściwości hybrydyzacyjne oligonukleotydu).
Osobnym problemem jest ubogi repertuar monomerów (nukleotydów), z których tworzone są łańcuchy kwasów nukleinowych w naturze. W skład naturalnie występujących kwasów nukleinowych wchodzą jedynie cztery różne cząsteczki zasad azotowych: adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy (lub uracylu w przypadku RNA), posiadające jedynie kilka grup chemicznych, mogących brać udział w potencjalnym wiązaniu celu molekularnego. Wygenerowało to potrzebę wzbogacania bibliotek oligonukleotydowych
PL 239 946 B1 używanych do procesu SELEX w nowe, nienaturalne nukleotydy i grupy chemiczne - analogi naturalnie występujących nukleotydów, które mogą pomóc w wyselekcjonowaniu aptamerów o lepszych parametrach wiązania celu. By sprostać temu wyzwaniu, wiele grup badawczych prowadziło prace nad enzymatyczną inkorporacją modyfikowanych nukleotydów do bibliotek i zastosowaniu ich do selekcji [7-9].
W obecnym stanie techniki, modyfikowane nukleotydy uzyskiwane są przy użyciu zaawansowanych metod syntezy organicznej, często długich i wieloetapowych procesów o niskiej wydajności, niemożliwych do przeprowadzenia w laboratorium bez specjalnego wyposażenia do syntezy organicznej [8-11]. Istnieje więc zapotrzebowanie na prostszą, wydajniejszą i szybszą metodę syntezy modyfikowanych nukleotydów, które będą mogły być inkorporowane do kwasów nukleinowych metodami enzymatycznymi, dzięki czemu możliwe będzie ich zastosowanie do selekcji nowych, modyfikowa nych aptamerów, o lepszych parametrach niż aptamery zawierające jedynie naturalnie występujące nukleotydy.
Katalizowana miedzią (I) reakcja cykloaddycji azydkowo-alkinowej Huisgena (Copper-catalysed Azide-Alkyne Cycloaddition - CuAAC) pozwala na wysoce selektywną, wydajną (często powyżej 90%), szybką (czas koniugacji może wynosić nawet poniżej godziny), przeprowadzaną w łagodnych warunkach (temperatura pokojowa, ciśnienie normalne, duży wybór możliwych rozpuszczalników, w tym woda, pH w przybliżonym zakresie od 4 do 12), jednoetapową koniugację dwóch związków, z których jeden posiada wolną grupę azydkową (-N3), a drugi terminalne wiązanie alkinowe (-C^CH). Reakcja zachodzi w obecności jonów miedzi (I) (będącej katalizatorem), zaś powstające stabilne kowalenc yjne wiązanie triazolowe zachowuje zawsze tę samą regioizomerię [12, 13]. Z tych powodów reakcję tę klasyfikuje się jako przykład tzw. „Click Chemistry”, czyli prostej i wydajnej niczym „sprzączka” chemii koniugacyjnej o szerokim zastosowaniu [14, 15].
Autorzy patentu US 6,175,001 B1 (Barbas i Kandasamy, 2001) [10] opisują wytworzenie i użycie do syntezy DNA trójfosforanów nukleozydów, posiadających modyfikację w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego deoksyuracylu - składa się ona z łącznika w formie alliloaminy (prop-2-en-1-aminy), oraz grupy funkcyjnej przyłączanej do łącznika poprzez wiązanie amidowe. Jako grupy funkcyjne wykorzystano m.in. kwas benzoesowy, imidazol, pirydynę, benzyloaminę, czy fenol. Szereg reakcji syntezy organicznej, w której ze związku wyjściowego 5-jododeoksyrudyny powstał prekursorowy dla innych modyfikacji trójfosforan 5-(3-aminopropen)-deoksyurydyny, osiągnął w tym przypadku wydajność 24%. Następnie, z tego prekursora autorzy uzyskali modyfikowane trójfosforany nukleozydów w reakcjach, których wydajność kształtowała się w zakresie 58-73%.
Z publikacji naukowej „Expanding the chemistry of DNA for in vitro selection”, Vaught i współ., JACS 2010, 132, 4141-4151 [9], znane są struktury i sposób uzyskania modyfikowanych trójfosforanów nukleozydów. Autorzy użyli 5-jododeoksyurydyny w reakcji karboksyamidacji katalizowanej palladem, by uzyskać pochodne, których grupy funkcyjne (m.in. benzylowa, izobutanowa, metylonaftalenowa, imidazol-4-etanowa czy (1H-indol-3-ylo)etanowa), przyłączone są do węgla numer 5 pierścienia pirymidynowego wiązaniem amidowym. Sama reakcja koniugacji jest jednoetapowa, trwa jednak 48-72 godziny. Ponadto wymaga uprzedniego przygotowania substratu poprzez wprowadzenie grup ochronnych dla grup hydroksylowych w kilku reakcjach. Wydajność procesu została przedstawiona przez autorów jako średnia do dobrej - 30 do 60%. Następnie autorzy przeprowadzili testy, w których wykazali, że modyfikowane nukleotydy są inkorporowane do DNA w reakcji wydłużania startera (ang. Primer Extension Reaction, PER) przez DNA-zależne polimerazy DNA (KOD XL, Pfu (exo-), D. Vent (exo-), Tth, Taq, KF (exo-)), oraz że oligonukleotydy, zawierające w sekwencji modyfikowane nukleotydy, mogą również być użyte jako matryca w reakcji PER. Modyfikowane nukleotydy nie mogły być jednak z sukcesem wykorzystane w reakcji PCR.
Z kolei autor publikacji naukowej „Synthesis of Deoxynucleoside Triphosphates that Include Proline, Urea, or Sulfonamide Groups and Their Polymerase Incorporation into DNA”, Marcel Hollenstein, Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 [16], zaprezentował syntezę i inkorporację, do cząsteczek DNA, nukleotydów wzbogaconych o rozbudowane grupy funkcyjne (zawierające m.in. reszty proliny, ugrupowanie mocznikowe, ugrupowanie sulfamidowe) przyłączone do węgla numer 5 pierścienia pirymid ynowego za pomocą łącznika w formie alliloaminy (prop-2-en-1-aminy) i wiązania amidowego. Przygotowanie pośredniego prekursora z 5-jodourydyny przeprowadzone zostało z wydajnością 31%. Następnie prekursor ten został wykorzystany do syntezy pięciu różnych trójfosforanów nukleozydów - łańcuch syntez o najwyższej wydajności pozwolił uzyskać ok. 23% produktu z prekursora.
Prezentowane sposoby uzyskania modyfikowanych nukleotydów wymagają wielu reagentów, specjalistycznego wyposażenia do syntezy organicznej, cechują się też niewielką wydajnością oraz wieloetapowością, co wydłuża czas uzyskania finalnego, pożądanego związku.
PL 239 946 B1
Problemem technicznym stawianym przed niniejszym wynalazkiem jest zaproponowanie takiego sposobu syntezy zmodyfikowanych nukleotydów i/lub nukleozydów, który będzie pozwalał uzyskać zmodyfikowane nukleotydy i/lub nukleozydy, które będą mogły być inkorporowane do kwasów nukleinowych metodami enzymatycznymi, dzięki czemu możliwe będzie ich zastosowanie do selekcji nowych, modyfikowanych aptamerów, o lepszych parametrach niż aptamery zawierające jedynie naturalnie występujące nukleotydy, przy czym sposób ten nie będzie wymagał wykorzystania skomplikowanego i drogiego specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, będzie stanowił proces o wysokiej wydajności, nie wymagający uprzedniego przygotowania substratu, przy tym będzie relatywnie prosty i szybki, a uzyskany produkt będzie cechował się wysokim stopniem czystości. Nieoczekiwanie wspomniane problemy techniczne i cele rozwiązał prezentowany wynalazek.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, stanowiącego mono-, di- lub trójfosforan, znamienny tym, że przeprowadza się reakcję katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej Huisgena związku o wzorze ogólnym 1 ze związkiem o wzorze ogólnym 2 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 3 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 4 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 5, przy czym mieszanina reakcyjna zawiera bufor trietyloamina-kwas octowy, askorbinian sodu i DMSO, przy czym synteza związku opisanego wzorem 6 jest prowadzona w czasie 2 godzin i w temperaturze 40°C, ze związku opisanego wzorem 2, przy czym synteza związków o wzorami 7-9 jest prowadzona w czasie 1-6 godzin i w temperaturze 40°C-55°C z odpowiednich związków opisanych wzorami 3-5 i oczyszczanie produktu reakcji jest wykonywane techniką chromatografii na odwróconej fazie.
Drugim przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany nukleotyd, stanowiący mono-, di- lub trójfosforan, zawierający jako zasadę azotową pochodną cytozyny lub uracylu, która w pozycji 5' pierścienia heterocyklicznego posiada grupę 1,2,3-triazolową lub łańcuch alkanowy lub alkinowy, posiadający terminalną grupę 1,2,3-triazolową, oraz podstawiony do tej grupy 1,2,3-triazolowej w pozycji 1' podstawnik, będący pochodną jednego z grupy związków o wzorach ogólnych od 2 do 5, i który to zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd posiada wzór ogólny 1.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA, zawierająca jedno- lub dwuniciowy łańcuch DNA, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji dowolnej lub obu nici jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w drugim przedmiocie wynalazku. Równie korzystnie cząsteczka według wynalazku charakteryzuje się tym, że pozycja jed nego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna. Korzystniej cząsteczka DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
Czwartym przedmiotem wynalazku jest biblioteka oligonukleotydów posiadająca w sekwencji region z sekwencją dowolną o długości co najmniej 10 nukleotydów, oraz flankujące go dwa regiony o sekwencjach stałych o długości co najmniej 10 nukleotydów lub pozbawiona regionów flankujących, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w drugim przedmiocie wynalazku. Równie korzystnie biblioteka charakteryzuje się tym, że pozycja jednego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna. Najkorzystniej biblioteka według wynalazku charakteryzuje się tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
Piątym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie biblioteki oligonukleotydów, określonej w czwartym przedmiocie wynalazku do otrzymywania aptamerów techniką SELEX i pochodnymi. Przedstawiony sposób pozwolił ograniczyć liczbę etapów syntezy i oczyszczania celem uzyskania zmodyfikowanych nukleotydów i/lub nukleozydów, przy czym nie wymagał wykorzystania skomplikowanych urządzeń laboratoryjnych. Synteza i oczyszczanie cechują się wysoką wydajnością procesu, nie wymagają wcześniejszego przygotowania substratów i przebiegają w sposób szybki, a uzyskane produkty charakteryzują się wysokim stopniem czystości. Również enzymatyczna inkorporacja modyfikowanych nukleotydów do oligonukleotydów charakteryzuje się wysoką wydajnością, porównywalną z inkorporacją naturalnie występujących nukleotydów. Oligonukleotydy opisane w trzecim przedmiocie wynalazku, zawierające w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy, charakteryzują się również tym, że mogą stanowić matrycę dla reakcji PER lub PCR, w której z użyciem naturalnie występujących nukleotydów zostają zsyntetyzowane niemodyfikowane oligonukleotydy o sekwencjach komplementarnych do użytego lub użytych jako matryca oligonukleotydów modyfikowanych - warunek ten jest konieczny, by zastosować
PL 239 946 B1 modyfikowaną bibliotekę do selekcji aptamerów techniką SELEX i pochodnymi, jak opisano w piątym przedmiocie wynalazku.
Przykładowe realizacje wynalazku zaprezentowano w przykładach realizacji oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia ogólny schemat katalizowanej miedzią reakcji cykloaddycji azydkowo-alkinowej Huisgena, fig. 2 przedstawia schematy reakcji według niniejszego wynalazku, fig. 3 przedstawia chromatogram nukleotydu o wzorze 6 uzyskany chromatografią odwróconych faz, fig. 4 przedstawia reprezentatywne widmo masowe nukleotydu o wzorze 6 uzyskane z analizy masowej MS-TOF, fig. 5 przedstawia obraz analizy elektroforetycznej produktu enzymatycznej syntezy oligonukleotydu zawierającego w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy o wzorze 9, natomiast fig. 6 przedstawia obraz analizy elektroforetycznej produktu enzymatycznej syntezy oligonukleotydu niemodyfikowanego, dla którego matrycą w reakcji syntezy był oligonukleotyd zawierający w sekwencji nukleotydy o wzorze 6.
P r z y k ł a d 1 - Synteza i oczyszczanie modyfikowanego nukleotydu o wzorze 6
Reakcję syntezy nukleotydu o wzorze 6 przygotowano w 200 μl. Do 4,0 μl roztworu 100 mM EdUTP (5-etynylo deoksyurydyno trójfosforan - wzór 1. a). c). e); 400 nmol) dodano 20 μl buforu 10x TEAA (trietyloamina-kwas octowy 500 mM pH 7,0) i 30 μl rozpuszczonego w DMSO kwasu (S)-2-azydo-3-metylobutanowy (wzór 2) o stężeniu 200 mM (6,0 μmol, 15 ekwiwalentów molowych EdUTP). Następnie dodano 10 μl przygotowanej wcześniej mieszaniny Cu-TBTA (10 mM CuSO4, 25 mM TBTA (trzy[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]amina), 50% DMSO, 16,6% tert-butanol), do końcowego stężenia miedzi w reakcji 0,5 mM (0,25 ekwiwalenta molowego EdUTP). Mieszaninę uzupełniono do 180 μl używając DMSO, wymieszano, a następnie dodano 20 μl askorbinianu sodu o stężeniu 200 mM (do końcowego stężenia 20 mM, 10 ekwiwalentów molowych EdUTP), inicjując reakcję poprzez redukcję miedzi do I stopnia utlenienia, i szczelnie zamknięto probówkę. Równolegle przygotowano próbę negatywną w objętości 20 μl, zachowując stężenia jak w próbie pozytywnej, zastąpiwszy askorbinian sodu wodą dejonizowaną. Reakcję prowadzono w zamkniętej probówce przez 2 godziny w 40°C z mocnym wytrząsaniem.
Następnie produkt oczyszczono używając chromatografii odwróconych faz, stosując bufor TEAA 100 mM oraz metanol jako fazę ruchomą (system chromatograficzny NGC firmy Bio-Rad, kolumna AccQ-Tag Column, 60 A, 4 μm, 3,9 mm x 150 mm firmy Waters). Chromatogram z analizy zarówno próby kontrolnej negatywnej jak i próby pozytywnej reprezentuje figura 3. Zebrane frakcje zawierające oczyszczony nukleotyd o wzorze 6 połączono, odparowano w koncentratorze próżniowym (CentriVap Benchtop Centrifugal Vacuum Concentrator firmy Labconco) i zawieszono w znanej objętości 25% DMSO. Następnie próbkę poddano analizie masowej MS-TOF (spektofotometr Xevo G2-XS QTof firmy Waters) w trybie ujemnej jonizacji elektrospray'u: masa zmierzona 634,04 Da, masa teoretyczna 634,30 Da. Reprezentatywne widmo masowe przedstawia figura 4.
P r z y k ł a d 2 - Synteza i oczyszczanie modyfikowanych nukleotydów o wzorach 7-9
Reakcje syntezy nukleotydów o wzorach 7-9 przeprowadzono analogicznie do syntezy związku o wzorze 6 (Przykład 1), używając azydków o wzorach 3-5 w miejscu związku o wzorze 2. Temperatura reakcji 40-55°C, czas reakcji 1-6 godzin.
Analiza masowa produktów o wzorach 7-9: nukleotyd o wzorze 7: masa zmierzona 634,04 Da, masa teoretyczna 634,30 Da; nukleotyd o wzorze 8: masa zmierzona 721,0 Da, masa teoretyczna 721,38 Da; nukleotyd o wzorze 9: masa zmierzona 658,50 Da, masa teoretyczna 658,75 Da.
P r z y k ł a d 3 - Enzymatyczna synteza jednoniciowego DNA z użyciem modyfikowanego nukleotydu
Enzymatyczną syntezę oligonukleotydu zawierającego w sekwencji modyfikowane nukleotydy o wzorze 9 przeprowadzono w objętości 10 μl z użyciem jednoniciowej matrycy D56 (Sekwencja 1) i startera LHAb (Sekwencja 2; dołączony do końca 5' startera łańcuch polyA pozwala na dyskryminację matrycy i produktu pod względem masy) w procesie PER. Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą D56 w stężeniu 2 μM, LHAb w stężeniu 4 μM, polimerazę Pwo 0,5 U, jednokrotnie stężony bufor z magnezem dostarczony przez producenta polimerazy, wodę dejonizowaną, oraz trójfosforany nukleotydów: dATP, dCTP i DTP, do stężenia 200 μM każdy. Kontrola negatywna (próba N) nie zawierała innych nukleotydów, kontrola pozytywna (próba P) zawierała dodatkowo TTP w stężeniu 100 μM, a próba testowa (próba T) zawierała dodatkowo nukleotyd o wzorze 9 (przygotowany jak w Przykładzie 2) w dziesięciokrotnym rozcieńczeniu. Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez minutę w temperaturze 95°C, dwie minuty w temperaturze 50°C i 30 minut w temperaturze 70°C. Po zakończonej reakcji próby poddano elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym (akrylamid 19:1 bis-akrylamid) denaturującym
PL 239 946 B1 (7 M mocznik), podgrzanym do 55°C, przy stałym napięciu 300 V. Żel zwizualizowano używając barwnika Midori Green (Nippon Genetics) - figura 5.
Analogiczne eksperymenty wykonano dla nukleotydów o wzorach 6-8 potwierdzając ich poprawną inkorporację do DNA w reakcji PER. Potwierdzono również uzyskanie produktu z użyciem innej polimerazy - DeepVent(exo-), jak i z użyciem innych matryc niż oligonukleotyd D56.
Potwierdzono również możliwość syntezy DNA przez polimerazę Pwo na biotynylowanej matrycy zimmobilizowanej na magnetycznych mikrokulkach opłaszczonych streptawidyną, analogicznie do wcześniejszych doniesień [9].
P r z y k ł a d 4 - Enzymatyczna synteza jednoniciowej biblioteki DNA zawierającej w regionie losowym modyfikowane nukleotydy
Syntezę jednoniciowej biblioteki DNA przeprowadzono za pomocą reakcji PER analogicznie jak w Przykładzie 3, ze zmianami: jako matrycę zastosowano bibliotekę niemodyfikowaną (Sekwencja 3), jako starter zastosowano starter L4 (Sekwencja 4).
Jednoniciowa biblioteka zawierająca modyfikowany nukleotyd lub nukleotydy o wzorze 6, 7, 8 lub 9 została uzyskana poprzez rozdział nici dwuniciowego produktu z użyciem magnetycznych mikrokulek opłaszczonych streptawidyną, analogicznie do wcześniejszych doniesień [9], a jej czystość została oceniona poprzez elektroforezę (jak w Przykładzie 3).
Innym sposobem uzyskania jednoniciowej biblioteki zawierającej modyfikowany nukleotyd lub nukleotydy o wzorze 6, 7, 8 lub 9 był rozdział nici produktu dwuniciowego w 10% żelu poliakrylamidowym (akrylamid 19:1 bis-akrylamid) denaturującym (7 M mocznik), podgrzanym do 55°C, przy stałym napięciu 300 V. Żel zwizualizowano używając barwnika Midori Green, a następnie wycięto prążki odpowiadające nici zmodyfikowanej i przeprowadzono ich oczyszczanie zgodnie ze standardowymi protokołami.
P r z y k ł a d 5 - Enzymatyczna synteza niemodyfikowanego jednoniciowego DNA używając matrycy zawierającej w sekwencji modyfikowane nukleotydy
Używając jako matrycy oczyszczonego jednoniciowego oligonukleotydu komplementarnego do Sekwencji 1, zawierającego w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy o wzorze 6 (uzyskanego jak w Przykładzie 3 oraz oczyszczonego z żelu poliakrylamidowego zgodnie ze standardowymi protokołami), przeprowadzono enzymatyczną syntezę niemodyfikowanego jednoniciowego DNA (produkt reakcji to odtworzony oligonukleotyd D56 o sekwencji Sekwencja 1). Reakcję przeprowadzono w objętości 20 μl z użyciem wyżej opisanej matrycy i startera L4 (Sekwencja 4) w procesie PER. Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą matrycę w stężeniu 0,1-2,0 μM, L4 w stężeniu 2-5 μM, polimerazę DeepVent 1 U lub polimerazę Pwo 1 U, jednokrotnie stężony bufor dostarczony przez producenta (odpowiedni do użytej polimerazy), siarczan magnezu w stężeniu 2,0 mM, trójfosforany nukleozydów TTP, dATP, dCTP i dGTP w stężeniu 400 μM każdy, oraz wodę dejonizowaną. Kontrola negatywna (próba N) nie została poddana inkubacji (inkubowana w 4°C). Próbę testową 1 (próba T1) inkubowano przez minutę w temperaturze 95°C, minutę w temperaturze 50°C i 60 minut w temperaturze 70°C. Próbę testową 2 (próba T2) poddano 10 cyklom inkubacji: przez minutę w temperaturze 95°C, minutę w temperaturze 50°C i 20 minut w temperaturze 70°C.
Po zakończonej reakcji próby poddano elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym (akrylamid 19:1 bis-akrylamid) denaturującym (7 M mocznik), podgrzanym do 55°C, przy stałym napięciu 300 V. Żel zwizualizowano używając barwnika Midori Green - figura 6.
Analogiczne eksperymenty wykonano dla matryc oligonukleotydowych zawierających w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy o wzorze 7, 8 lub 9.
PL 239 946 B1
Bibliografia:
1. Famulok, M. Oligonucleotide aptamers that recognize small molecules. Curr. Opin.
Struct. Biol. 9, 324-329 (1999).
2. Mayer, G. The Chemical Biology of Aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 2672-2689 (2009).
3. Radom, F., Jurek, P. M., Mazurek, M. P., Otlewski, J. & Jeleń, F. Aptamers: Molecules of great potential. Biotechnol. Adv. (2013). doi:10.1016/j.biotechadv.2013.04.007
4. Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H. & Toole, J. J. Selection of singlestranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355, 564-566 (1992).
5. Klug, S. J. & Famulok, M. All you wanted to know about SELEX. Mol. Biol. Rep. 20, 97107 (1994).
6. Gold, L. & Tuerk, C. Nucleic Acid Ligands. (1995).
7. Capek, P. et al. An efficient method for the construction of functionalized DNA bearing amino acid groups through cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by primer extension or PCR. Chem. Weinh. Bergstr. Ger. 13, 6196-6203 (2007).
8. Schoetzau, T. et al. Aminomodified Nucleobases: Functionalized Nucleoside Triphosphates Applicable for SELEX. Bioconjug. Chem. 14, 919-926 (2003).
9. Vaught, J. D. et al. Expanding the chemistry of DNA for in vitro selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
10. Barbas, C. F. & Kandasamy, S. Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same. (2001).
11. Gourlain, T. et al. Enhancing the catalytic repertoire of nucleic acids. II. Simultaneous incorporation of amino and imidazolyl functionalities by two modified triphosphates during PCR. Nucleic Acids Res. 29, 1898-1905 (2001).
12. Himo, F. et al. Copper(I)-Catalyzed Synthesis of Azoles. DFT Study Predicts Unprecedented Reactivity and Intermediates. J. Am. Chem. Soc. 127, 210-216 (2005).
13. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V. & Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective 'ligation' of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
14. Kolb, H. C. & Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug Discov. Today 8, 1128-1137 (2003).
15. Kolb, H. C., Finn, M. G. & Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
16. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfonamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Weinh. Bergstr. Ger. 18, 13320-13330 (2012).
PL 239 946 Β1
Sekwencja 1 - D56
Wykaz sekwencji
Sekwencja 2 'Starter LHAb
Sekwencja 4 - starter L4
5’—G TATACCTGCAGCTGAG G—31
Claims (9)
1. Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, stanowiącego mono-, di- lub trójfosforan, znamienny tym, że przeprowadza się reakcję katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej Huisgena związku o wzorze ogólnym 1:
Wzór 1 gdzie:
PL 239 946 Β1
ze związkiem o wzorze ogólnym 2:
Wzór 2 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 3:
Wzór 3 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 4:
Wzór 4 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 5:
Wzór 5 ci przy czym mieszanina reakcyjna zawiera bufor trietyloamina - kwas octowy, askorbinian sodu i DMSO, przy czym synteza związku opisanego wzorem 6 jest prowadzona w czasie 2 godzin i w temperaturze 40°C,
PL 239 946 Β1
Wzór 6 ze związku opisanego wzorem 2, przy czym synteza związkowo wzorami 7-9 jest prowadzona w czasie 1-6 godzin i w temperaturze 40°C-55°C:
Wzór 7 lub
Wzór 8 lub
PL 239 946 Β1
Wzór 9 z odpowiednich związków opisanych wzorami 3-5, i oczyszczanie produktu reakcji jest wykonywane chromatografii na odwróconej fazie.
2. Zmodyfikowany nukleotyd, stanowiący mono-, trójfosforan, zawierający jako zasadę azotową cytozyny lub uracylu, która w pozycji 5' pierścienia heterocyklicznego posiada grupę 1,2,3-triazolową lub łańcuch alkanowy lub alkinowy, posiadający terminalną grupę 1,2,3-triazolową, oraz podstawiony do tej grupy 1,2,3-triazolowej w pozycji 1' podstawnik, będący pochodną jednego z grupy związków o wzorach ogólnych od 2 do 5, i który to zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd posiada wzór ogólny 1:
Wzór 1 gdzie:
PL 239 946 Β1
R1 = rs= 1-3
3. Cząsteczka DNA, zawierająca jedno- lub dwuniciowy łańcuch DNA, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji dowolnej lub obu nici jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w zastrz. 2.
4. Cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że pozycja jednego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna.
5. Cząsteczka DNA według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
6. Biblioteka oligonukleotydów posiadająca w sekwencji region z sekwencją dowolną o długości co najmniej 10 nukleotydów, oraz flankujące go dwa regiony o sekwencjach stałych o długości co najmniej 10 nukleotydów lub pozbawiona regionów flankujących, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w zastrz. 2.
7. Biblioteka według zastrz. 6, znamienna tym, że pozycja jednego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna.
8. Biblioteka według zastrz. 6 albo 7, znamienna tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
9. Zastosowanie biblioteki oligonukleotydów, określonej w zastrz. 7 albo 8, do otrzymywania aptamerów techniką SELEX i pochodnymi.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413941A PL239946B1 (pl) | 2015-09-17 | 2015-09-17 | Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
| PT168469443T PT3350195T (pt) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Método de síntese e purificação de um nucleósido e/ou um nucleótido, um nucleósido e/ou nucleótido modificado, uma molécula de adn e uma biblioteca de oligonucleótidos compreendendo o referido nucleósido e/ou nucleótido modificado e a utilização da referida biblioteca de oligonucleótidos |
| SI201631318T SI3350195T1 (sl) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Postopek sinteze in čiščenja nukleozida in/ali nukleotida, modificiranega nukleozida in/ali nukleotida, molekule DNA in knjižnice oligonukleotidov, ki vsebije navedeni modificirani nukleozid in/ali nukleotid, ter uporaba navedene knjižnice oligonukleotidov |
| HUE16846944A HUE055954T2 (hu) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Eljárás nukleozid és/vagy nukleotid szintézisére és tisztítására, módosított nukleozid és/vagy nukleotid, DNS-molekula és oligonukleotidkönyvtár a módosított nukleoziddal és/vagy nukleotiddal, és az oligonukleotidkönyvtár alkalmazása |
| DK16846944.3T DK3350195T3 (da) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Fremgangsmåde til syntese og oprensning af nukleosid og/eller nukleotid, modificeret nukleosid og/eller nukleotid, dna-molekyle og oligonukleotidbibliotek omfattende det modificerede nukleosid og/eller nukleotid og anvendelse af oligonukleotidet |
| PCT/PL2016/050038 WO2017048147A1 (en) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | The method of synthesis and purification of a nucleoside and/or a nucleotide, a modified nucleoside and/or nucleotide, a dna molecule and an oligonucleotide library comprising said modified nucleoside and/or nucleotide and the use of said oligonucleotide library |
| LTEPPCT/PL2016/050038T LT3350195T (lt) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Nukleozido ir/arba nukleotido sintezės ir gryninimo būdas, modifikuotas nukleozidas ir/arba nukleotidas, dnr molekulė ir oligonukleotidu biblioteka, apimanti šį modifikuotą nukleozidą ir/arba nukleotidą, ir šios oligonukleotidu bibliotekos panaudojimas |
| PL16846944T PL3350195T3 (pl) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Sposób syntezy i oczyszczania nukleozydu i/lub nukleotydu, zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
| ES16846944T ES2885824T3 (es) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Procedimiento de síntesis y purificación de un nucleósido y/o un nucleótido, un nucleósido y/o nucleótido modificados, una molécula de ADN y una biblioteca de oligonucleótidos que comprende dicho nucleósido y/o nucleótido modificados y la utilización de dicha biblioteca de oligonucleótidos |
| US15/760,915 US10450673B2 (en) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Method of synthesis and purification of a nucleoside and/or a nucleotide, a modified nucleoside and/or nucleotide, a DNA molecule and an oligonucleotide library comprising said modified nucleoside and/or nucleotide and the use of said oligonucleotide library |
| EP16846944.3A EP3350195B9 (en) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | The method of synthesis and purification of a nucleoside and/or a nucleotide, a modified nucleoside and/or nucleotide, a dna molecule and an oligonucleotide library comprising said modified nucleoside and/or nucleotide and the use of said oligonucleotide library |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413941A PL239946B1 (pl) | 2015-09-17 | 2015-09-17 | Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL413941A1 PL413941A1 (pl) | 2017-03-27 |
| PL239946B1 true PL239946B1 (pl) | 2022-01-31 |
Family
ID=58289513
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL413941A PL239946B1 (pl) | 2015-09-17 | 2015-09-17 | Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
| PL16846944T PL3350195T3 (pl) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Sposób syntezy i oczyszczania nukleozydu i/lub nukleotydu, zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL16846944T PL3350195T3 (pl) | 2015-09-17 | 2016-09-13 | Sposób syntezy i oczyszczania nukleozydu i/lub nukleotydu, zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10450673B2 (pl) |
| EP (1) | EP3350195B9 (pl) |
| DK (1) | DK3350195T3 (pl) |
| ES (1) | ES2885824T3 (pl) |
| HU (1) | HUE055954T2 (pl) |
| LT (1) | LT3350195T (pl) |
| PL (2) | PL239946B1 (pl) |
| PT (1) | PT3350195T (pl) |
| SI (1) | SI3350195T1 (pl) |
| WO (1) | WO2017048147A1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL442186A1 (pl) * | 2022-09-02 | 2024-03-04 | Pure Biologics Spółka Akcyjna | Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu i/lub nukleozydu, zmodyfikowany nukleotyd i/lub nukleozyd, cząsteczka DNA zawierająca jedno- lub dwuniciowy łańcuch oligonukleotydów, biblioteka oligonukleotydów, zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6175001B1 (en) | 1998-10-16 | 2001-01-16 | The Scripps Research Institute | Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same |
| US9096856B2 (en) * | 2007-07-19 | 2015-08-04 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Nucleotides and aptamers containing boronic acid groups having biased binding to glycosylated proteins, and uses thereof |
-
2015
- 2015-09-17 PL PL413941A patent/PL239946B1/pl unknown
-
2016
- 2016-09-13 WO PCT/PL2016/050038 patent/WO2017048147A1/en not_active Ceased
- 2016-09-13 ES ES16846944T patent/ES2885824T3/es active Active
- 2016-09-13 HU HUE16846944A patent/HUE055954T2/hu unknown
- 2016-09-13 DK DK16846944.3T patent/DK3350195T3/da active
- 2016-09-13 SI SI201631318T patent/SI3350195T1/sl unknown
- 2016-09-13 PL PL16846944T patent/PL3350195T3/pl unknown
- 2016-09-13 US US15/760,915 patent/US10450673B2/en active Active
- 2016-09-13 PT PT168469443T patent/PT3350195T/pt unknown
- 2016-09-13 LT LTEPPCT/PL2016/050038T patent/LT3350195T/lt unknown
- 2016-09-13 EP EP16846944.3A patent/EP3350195B9/en active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL442186A1 (pl) * | 2022-09-02 | 2024-03-04 | Pure Biologics Spółka Akcyjna | Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu i/lub nukleozydu, zmodyfikowany nukleotyd i/lub nukleozyd, cząsteczka DNA zawierająca jedno- lub dwuniciowy łańcuch oligonukleotydów, biblioteka oligonukleotydów, zastosowanie biblioteki oligonukleotydów |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017048147A1 (en) | 2017-03-23 |
| LT3350195T (lt) | 2021-09-10 |
| HUE055954T2 (hu) | 2022-01-28 |
| ES2885824T3 (es) | 2021-12-15 |
| US10450673B2 (en) | 2019-10-22 |
| PT3350195T (pt) | 2021-09-06 |
| SI3350195T1 (sl) | 2021-11-30 |
| PL3350195T3 (pl) | 2021-10-11 |
| EP3350195A4 (en) | 2019-07-03 |
| EP3350195B1 (en) | 2021-06-02 |
| US20180265862A1 (en) | 2018-09-20 |
| DK3350195T3 (da) | 2021-08-30 |
| EP3350195A1 (en) | 2018-07-25 |
| EP3350195B9 (en) | 2021-09-29 |
| PL413941A1 (pl) | 2017-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2023200611B2 (en) | A method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides | |
| Ménová et al. | Scope and limitations of the nicking enzyme amplification reaction for the synthesis of base-modified oligonucleotides and primers for PCR | |
| CN113195720B (zh) | 酶促rna合成 | |
| El-Sagheer et al. | Synthesis and polymerase chain reaction amplification of DNA strands containing an unnatural triazole linkage | |
| JP2002527523A (ja) | 機能付与したピリミジン誘導体 | |
| KR20140059256A (ko) | Dna-코딩된 라이브러리에 태그부착하는 방법 | |
| Petkovic et al. | Synthesis and engineering of circular RNAs | |
| JP2022511255A (ja) | ライブラリー富化を改善するための組成物および方法 | |
| Bugaut et al. | SELEX and dynamic combinatorial chemistry interplay for the selection of conjugated RNA aptamers | |
| Groher et al. | In vitro selection of antibiotic-binding aptamers | |
| RU2699522C2 (ru) | Способ ферментативного получения модифицированных ДНК для создания реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений | |
| PL239946B1 (pl) | Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów | |
| Schwarz et al. | A four-helix bundle DNA nanostructure with binding pockets for pyrimidine nucleotides | |
| Eremeeva et al. | Enzymatic synthesis using polymerases of modified nucleic acids and genes | |
| Wiesmayr et al. | An on-bead tailing/ligation approach for sequencing resin-bound RNA libraries | |
| WO2024256604A1 (en) | Salt addition during enzymatic polynucleotide synthesis | |
| JP7016511B2 (ja) | 核酸合成法 | |
| Flamme et al. | Enzymatic formation of an artificial base pair using a modified adenine nucleoside triphosphate | |
| EP3546471B1 (en) | Nucleoside derivative or salt thereof, polynucleotide synthesis reagent, method for producing a polynucleotide, polynucleotide and method for producing a binding nucleic acid molecule | |
| HK40027466A (en) | A method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides | |
| Blain et al. | Chapter Five: Site-specific ‘click’chemistry with RNA transcripts | |
| WO2018051581A1 (ja) | ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法 | |
| WO2005012546A2 (en) | Methods for isolating and identifying novel target-specific structuremers for use in the biological sciences |