PT100781B - Sequencias de dna codificadoras de proteinas de superficie externa, proteinas contendo as referidas sequencias, obtidas a partir de borrelia burgdorferi, e vacinas contendo as referidas proteinas - Google Patents

Description

SEQUÊNCIAS DE DNA CODIFICADORAS DE PROTEÍNAS DE SUPERFÍCIE EXTERNA, PROTEÍNAS CONTENDO AS REFERIDAS SEQUÊNCIAS, OBTIDAS A PARTIR DE BORRELIA BURGDORFERI, E VACINAS CONTENDO AS REFERIDAS PROTEÍNAS

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a sequências de DNA codificadoras de proteínas de superfície externa (OspA) ou seus derivados, às proteínas contendo as referidas sequências de DNA, e a novas Borrelias e antigénios OspA derivados delas, a partir das quais são obtidas as proteínas. Estes antigénios apresentam pouca homologia com OspA conhecidas e são portanto úteis como vacinas ou reagentes de diagnóstico. São também divulgadas vacinas de multicomponentes baseadas em OspAs de diferentes grupos de Borrelia.

presente invento está relacionado com novos antigénios, métodos para a sua produção, composições que os incluem e com a sua utilização na prevenção, tratamento e diagnóstico da doença de Lyme em seres humanos e outros animais. Em particular o presente invento descreve novos serotipos/genótipos da proteína da superfície externa (OspA) da espiroqueta Porrelia burgorferi, o agente causador da doença de Lyme e vacina e reagentes de diagnóstico baseados em B. burqdorferi de mais de um subgrupo.

A doença de Lyme em humanos é uma doença crónica progressiva causada por B. burodorferi, a qual é transmitida a humanos principalmente pelas carraças Ixodes. A doença ataca muitos orgãos, principalmente a pele, coração, fígado, sistema nervoso central e periférico, rins assim como o sistema musculatura-esqueleto .

A doença de Lyme por si só é a infecção mais comum transmitida por vectors nos USA e foi descrita em todos os continentes excepto na Antártida.

Uma série de grupos foram isolados e proposta uma proteína de superfície principal (Osp A) de B♦ burqdorferi, como sendo um potencial candidato a vacina para usar contra a doença de Lyme. Por exemplo, o pedido de patente Internacional publicado como W090/04411 (SIMBICOM) descreve a clonagem e expressão de uma proteína Osp A derivada de B. burqdorferi B31 e a sua utilização como vacina, M.M. Simon e colaboradores clonaram e expressaram Osp A a partir de B. burqdorferi ZS7 (Pedido de Patente Europeia N2 90117943.2 publicado com ο N2 0418827) e demonstraram a sua capacidade protectora para induzir anticorpos em murganhos SCID imunizados passivamente (PNAS: 87 1990, 3768-3772). Flavell e colaboradores (Science (1991) 250 p553-556) clonaram e expressaram o gene de OspA derivado de B. burqdorferi, N40 e demonstraram a sua eficácia protectora em murganhos C3H/He.

Todos os isolados de B. burqdorferi identificados atrás parecem estar estreitamente relacionados. No entanto, identificámos agora seis subgrupos de B. burqdorferi analisando 55 isolados de espiroquetas derivados de áreas geográficas e fontes diferentes recorrendo a uma série de técnicas imunológicas, bioquímicas e de genética molecular. A observação de diferentes subgrupos de isolados de B. burqdorferi tem implicações importantes tanto para a vacinação como para o diagnóstico da doença de Lyme. Assim os ensaios de diagnóstico de ELISA dirigidos contra uma estirpe de cuja espécie N40 é um membro não dão reacção cruzada de todo ou apenas parcialmente com espécies de outros subgrupos. Igualmente uma vacina baseada em apenas uma Osp A por exemplo derivada de N40 não proporcionaria uma protecção óptima contra B. burqdorferi de um subgrupo diferente.

Os presentes inventores identificaram cinco subgrupos adicionais de B. burqdorferi baseados na sua transferência Southern e na amplificação por PCR das sequências OspA e diferenças nas próprias sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos e também na reactividade contra anticorpos monoclonais contra proteínas OspA.

A descoberta surpreendente de que B. burqdorferi apresenta tal heterogeneidade tem implicações importantes para vacinas e reagnetes de diagnóstico para a detecção da doença de Lyme, uma bez que vacinas ou diagnósticos baseados numa OspA de um grupo de B. burqdorferi podem não detectar ou proteger contra a infecção de B. burqdorferi de um segundo grupo. De facto os presentes inventores mostraram que enquanto a protecção pode ser proporcionada por anticorpos anti OspA gerados por OspA

recombinante ou organismos viáveis ou mortos dentro de um grupo de estirpes estreitamente relacionadas não se observa protecção ou apenas protecção parcial se o teste for feito com um organismo derivado de um grupo diferente.

Um primeiro subtipo tendo como representante ZS7, B31, N40 é aqui referido como grupo I (a nomenclatura alternativa refere-se às estirpes do grupo como grupo A).

Um segundo subgrupo daqui em diante grupo II (alternativamente conhecido como grupo B) é aqui divulgado e é exemplificado pela espécie ZQ1. Esta espécie foi depositada na DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen de Mascheroderweg 91B D-3300 Braunschweig em 11 de Julho de 1991 e dado o número de acesso N2 DSM6606. Este grupo é distinto de várias maneiras do grupo I.

Em primeiro lugar, a análise de plasmídeos da estirpe ZQ1 quando comparado com os representantes do grupo I mostra que ZQ1 tem pelo menos dois plasmídeos únicos de 18 e 14 Kd. Ainda, o plasmídeo de 16 Kb encntrado nas estirpes do grupo I está ausente na estirpe ZQ1. Em segundo lugar quando examinado por electroforese em géis de poliacrilamida OspA derivado de ZQ1 tem um peso molecular aparente de 32 Kd.

Em terceiro lugar vários anticorpos monolconais específicos de OspA do grupo I, como sejam os anticorpos designados LA2, L26, LA28, LA33 não reagem com OspA derivada do grupo II. O anticorpo LA2 e LA26 são conhecidos e foram descritos no pedido de patente europeia N^e EPO418827. 0 hibridoma produtor de LA2 foi depositado com o número de acesso ECACC 89 09 1302 em 13 de Setembro de 1989 na Colecção Europeia de culturas de células animais, serviços de laboratórios de saúde pública Porton Down

Wiltshire SP40J9. 0 hibridoma produtor de LA26 foi depositado na mesma colecção de culturas com o número de acesso N2 9005406 em de Junho de 1990.

No entanto, um outro anticorpo monoclonal, LA31.1, reage com OspA das espécies dos subgrupos I e II sugerindo epítopos comuns entre espécies de OspA de subgrupos diferentes.

Também caracterizámos DNA de OspA derivado de estirpes do grupo II por amplificação de PCR. Foram usados dois pares de iniciadores de OspA, sendo estes designados prOspA Al-prOspA4 e prOsp Al-prOspA2.

Os inciadores tinham as seguintes sequências:

prOspAl: 5'-GGGAATAGGT CTAATATTAG CC-3' prOspA2: 5'-TGCCTGAATT CCAAGCTGCA-3' prOspA4: 5'-GCAGTTAAAG TTCCTTCAAG AACATAGC-3' e correspondem aos nucleotidos nas posições 138-160 (prOspAl), 611-638 (prOspA4) e 759-778 (prOspA2), de ZS7 OspA respectivamente. DNA total de B. burqdorferi do grupo II é distinto do do grupo por o grupo II não permitir a amplificação por PCR (reacção em cadeia com polimerase) com êxito quando prOspAl e prOspA2 são usados como iniciadores enquanto DNA total do grupo I permite uma reacção bem sucedida. Pelo contrário, quando prOspAl e prOspA4 são usados como iniciadores, então tanto os DNAs do grupo I como do grupo II sofrem reacção em cadeia com polimerase.

Estes resultados mostram que B. burqdorferi do grupo II tem umas sequências de OspA diferentes das OspAs do grupo I.

Igualmente DNA de OspA do grupo II pode-se distinguir do DNA de OspA do grupo I por transferência Southern usando como sonda a sequência Osp A ZS7. A digestão de DNA genómico de B. burqdorferi grupo II com a enzima de restrição HindIII mostra um padrão de bandas diferente do da estirpe do grupo I.

Por exemplo uma estirpe do grupo revela dois fragmentos de hibridação de 1,2 Kb e 0,3 Kb enquanto que uma estirpe do grupo II expressou dois fragmentos de 0,9 Kb e 0,4 Kb.

Também, a imunização passiva de murganhos SCID com soros imunes contra OspA do grupo II não protegerá contra B. burqdorferi do grupo I.

,·

Finalmente quando comparado com a sequência de OspA ZS7 o DNA e a sequência de aminoácidos de OspA da estirpe ZQ1 ID1 e 2 (i.e. uma estirpe do grupo II) demonstra a variação substancial entre uma estirpe do grupo I e do grupo II tanto ao nível do DNA como dos aminoácidos.

A incapacidade surpreendente para proteger contra uma infecção heteróloga significa que uma vacina baseada numa única OspA de um orgamnismo do grupo I pode ser ineficaz contra a infecção com B. burodorferi de organismo do grupo II e viceversa. Consequentemente exista a necessidade de uma vacina que proteja contra a infecção pelo grupo II.

Assim é umaproporcionada uma sequência de DNA codificadora de uma OspA derivada de uma B. burqdorferi caracterizado por a amplificação por reacção em cadeia com polimerase ocorrerá

usando os iniciadores prOsp A1-A4, mas não com prOsp A1-A2 e o invento proporciona ainda OspA purificada ou isolada.

De preferência a OspA do presente invento não reagirá com o anticorpo monoclonal LA2 ou LA26. Mais preferencialmente, a OspA do presente invento terá um peso molecular relativo de 32 Kd conforme determinado por electroforese na presença de SDS utilizando marcadores de peso molecular como padrão.

De preferência a OspA deriva de ZQ1 ou de NE11H ou de outra estirpe do grupo II.

Preferencialmente a proteína é pelo menos 70% pura conforme determinado por electroforese em gel de SDS e poliacrilamida, em particular pelo menos 80% pura e mais preferencialmente pelo menos 95% puro. De preferência o antigénio OspA tem um peso molecular relativo de 32 KDa conforme determinado por electroforese em gel de SDS e poliacrilamida. De preferência o antigénio OspA não reagirá com o anticorpo monoclonal LA2.

Num outro aspecto do presente invento é proporcionada uma sequência de DNA substancialmente idêntica à sequência de DNA codificadora de OspA derivada de ZQ1. Por substancialmente idêntico pretende-se significar que uma sequência de DNA contem uma sequência que é pelo menos 85% idêntica e preferencialmente 90% idêntica à sequência OspA de ZQ1 descrita na sequência ID1. A proteína madura começa na posição 17 e preferencialmente o invento proporciona uma sequência de DNA que é pelo menos 95% idêntico à sequência codificadora da proteína madura conforme indicado na Sequência ID2.

Numa realização alternativa é proporcionada uma OspA contendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à

sequência estabelecida na sequência ID2. O termo substancilamente idêntico em relação à sequência de aminoácidos significa sequência de aminoácidos que é pelo menos 85% e preferencialmente 90% idêntica à sequência de proteína descrita na figura e de preferência pelo menos 85% idêntica â proteína madura.

Os presentes inventores também encontraram, utilizando as mesmas técnicas imunológicas e bioquímicas, outros grupos de B. burqdorferi não relacionados com o grupo I ou com o grupo II. Dois isolados característicos do grupo III (ou grupo C) são a estirpes designadas 19857 e 21038. Tais estirpes, tal como o grupo II, reagem nas condições de PCR com prOspA-lA2 mas não com prOspAl-A4. No entanto, elas diferem das estirpes do grupo II quando analisados por transferências Northern quando se usa a sonda ZS7 e a enzima de restrição HindIII. Tal análise revela fragmentos de hibridação de 4,0 Kb e 0,5 Kb. Em adição eles reagem com o anticorpo monoclonal LA26 mas não com LA2.

Sequenciámos utilizando a tecnologia de PCR e expressámos uma sequência de DNA codificadora de uma OspA da estirpe 19857. O DNA e a sequência de aminoácidos estão descritos na sequência ID N2 3 e 4. Uma comparação com a sequência de outros grupos mostra que a OspA tem apenas aproximadamente 65% de identidade aos níveis de DNA e de aminoácidos com OspA de outros subgrupos.

Assim o presente invento proporciona uma sequência de DNA codificadora de uma proteína OspA em que a sequência de DNA é substancialmente idêntica à sequência de DNA da Sequência ID 3. Numa outra realização é proporcionada uma proteína OspA que tem a sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à proteína como descrito na Sequência ID4.

termo substancialmente idêntico como aqui é usado em relação às sequências descritas na sequência ID N2 3 e 4 significa pelo menos 70% de identidade, de preferência 80-85% de identidade, mais preferencialmente 85-95% de identidade.

Um quarto subgrupo, grupo IV (ou grupo D) de B. burqdorferi, como exemplificado por um isolado sueco ACA-1 difere de qualquer um dos grupos I, II ou III, M. Jonsson et al. (Int. Conf. Lyme Borreliosis 1990). Este grupo não sofre PCR com prOsp A1-A2 ou prOsp A1-A4. As suas Ops As reagem com o anticorpo monoclonal LA26 mas não com LA2.

A análise de transferências Southern quando se usa uma sonda ZS7 e a enzima de restrição HindIII revela um único fragmento de hibridação de aproximadamente 1,7 Kb.

OspA isolada ou recombinante derivada do grupo IV também faz parte do presente invento tal como composições de vacina ou de diagnóstico que a contenha.

Usando as mesmas técnicas de bioquímica, os presentes inventores identificaram representantes do grupo V e do grupo IV. Um isolado do grupo V é conhecido como 20047 e um representante do grupo IV é a estirpe conhecida como S90.

OspA isolada a partir de uma estirpe do grupo V e Vi também fazem parte do invento.

presente invento também está relacionado com derivados imunogénicos da OspA derivada do grupo II, grupo III, grupo IV e grupo V ou grupo VI de B. burqdorferi.

O termo derivado imunogénico como aqui é usado engloba qualquer molécula como seja uma proteína truncada ou híbrida que seja imnologicamente reactiva com anticorpos gerados pela infecção de um hospedeiro mamífero com B. burodorferi do grupo II, III, IV, V ou VI e que preferencialmente não reage com os anticorpos monoclonais designados LA2. Tais derivados podem ser preparados por substituição ou rearranjo de aminoácidos ou pela sua modificação química.

Fragmentos imunogénicos da proteína que podem ser úteis na preparação de vacinas de subunidades, podem ser preparados por expressão dos fragmentos de genes apropriados ou por síntese de peptídeos, por exemplo usando a síntese de Merrifield (The Pepptides, Vol. 2, Academic Press, NY, página 3).

O derivado imunogénico do invento pode ser um híbrido, ou seja um polipeptídeo de fusão contendo sequências adicionais que podem ser portadoras de um ou mais epítopos de outros imunogénios de B. burcrdorferi incluindo OspA e/ou OspB ou outros imunogénios derivados por exemplo de outros patogénios. Como alternativa, o derivado imunogénico do invento pode ser fundido com um polipeptídeo veículo como seja o antigênio de superfície ou do núcleo da Hepatite B ou com um outro veículo que tenha propriedades estimuladoras como no caso de um adjuvante ou que de outra forma aumente a resposta imune à proteína OspA ou seu derivado ou que seja útil na expressão purificação ou formulação da proteína ou seu derivado.

invento também engloba a proteína OspA ou seus derivados imunogénicos quando quimicamente conjugados com uma macromolécula usando um agente de ligação convencional como seja glutaraldeído (Geerlings et al., (1988) J. Immunol. Methods, 106, 239-244).

Derivados particularmente preferidos são proteínas de fusão híbridas da proteína não estrutural do vírus da gripe NS1 e OspA ou derivados truncados de OspA. Isto pode ser vantajosamente produzido por técnicas de DNA recombinante com altos rendimentos em E. coli.

Assim o presente invento proporciona uma proteína OspA fundida com a fracção N-terminal da proteína NS1 do vírus da gripe. De preferência a fracção de OspA da proteína de fusão é truncada de forma a remover pelo menos a sequência sinal hidrofóbica. Mais preferencialmente os 16 aminoácidos do extremo N representando a sequência sinal e o resíduo císteina que é o primeiro aminoácido da proteína madura OspA estão ausentes.

Preferencialmente a parte NS1 da proteína de fusão compreende entre 3 e 81 aminoácidos da fracção do extremo N do qene. Prefere-se uma fracção qrande de NS1 na proteína de fusão pois isto permite níveis de expressão mais elevados das proteínas.

Estas proteínas híbridas do presente invento são recuperáveis a partir da fracção solúvel como proteína não agregada ao contrário da proteína OspA recombinante nativa e são expressas num nível amis alto. As proteínas retêm a sua capacidade para reagir com anticorpos monoclonais induzidos contra OspA nativa e são capazes de induzir uma resposta imune protectora em animais de laboratório, e.g. murganhos e coelhos.

Numa realização do invento , é proporcionada uma proteína de fusão NSl-OspA, conhecido como grupo I, eg. uma OspA da estirpe ZS7 como descrito em EP 0418-827 ou B31 como descrito por Howe et al. Science 227 p645, 1985 ou N40 como descrito por Flavell et al. Tais OspAs apresentam homologia de sequências

significativa tanto no nível de DNA como de aminoácidos e dão protecção cruzada.

Numa outra realização do presente invento é proporcionada uma NSl-OspA em que OspA deriva do grupo conhecido como grupo II. Por exemplo a OspA derivada da estirpe ZQ1 de B. burqdorferi como aqui descrito.

Ainda numa outra realização do presente invento é proporcionada uam NSl-OspA em que a OspA deriva do grupo conhecido como grupo III. Por exemplo a estirpe 19857. 0 inventoainda proporciona uma NSl-OspA do grupo IV, por exemplo em que a OspA deriva da estirpe Acal.

presente invento proporciona ainda uma sequência de DNA que codifica uma proteína de fusão NSl-OspA como aqui descrito. Em particular o presente invento proporciona uma sequência de DNA codificadora de uma proteína NSl-OspA e a própria proteína como se mostra nas Sequências ID Nos 5 a 12 apensas.

As proteínas do presente invento podem ser produzidas por métodos convencionais para a produção de outras proteínas OspA de outras estirpes conhecidas. Por exemplo, as proteínas OspA podem ser produzidas em E. coli usando tecnologia de DNA recombinante. Em particular as proteínas podem ser produzidas como proteínas imaturas de tamanho completo ou proteínas maduras. As proteínas podem também ser expressas como proteínas de fusão, tais como proteínas de fusão com NS1.

Uma sequência de DNA codificadora das proteínas do presente invento (eg OspA ZQ1 ou OspA 19857) pode ser sintetizada usando técnicas convencionais de síntese de DNA tais como por ligação enzimática como descrito por D.M. Roberts et al. em

Biochemistry 1985, 24., 5090-5098, por síntese química, por polimerização enzimática in vitro ou por tecnologia de PCR usando por exemplo uma polimerase estável ao calor ou por uma combinação destas técnicas.

A polimerização enzimática de DNA pode ser realizada in vitro usando uma DNA-polimerase como seja a DNA-polimerase I (fragmento Klenow) num tampão adequado contendo os trifosfatos de nucleósidos dATP, dCTP, dGTP e dTTP conforme necessário a uma temperatura de 10°-37°C geralmente num volume de 50 μΐ ou menos. A ligação enzimática dos fragmentos de DNA pode ser realizada usando uma DNA-ligase como seja a DNA-ligase de T4 num tampão adequado, como seja 0,05M Tris (pH 7,4), 0,001M MgCl₂, 0,01M ditiotreitol, 1 mM espermidina, 1 mM ATP e 0,1 mg/ml de albumina sérica bovina, a uma temperatura entre 4°C e temperatura ambiente, geralmente num volume de 50 ml ou menos. A síntese química do polímero de DNA ou de fragmentos pode ser realizada por química convencional de fosfotriéster, fosfito ou fosforamideto, usando técnicas de fase sólida como sejam as descritas em 'Chemical and Enzimatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual⁷ (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) ou noutras publicações científicas, por exemplo M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat e R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat e W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al.', Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J.Biernat, J. McMannus e H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; e H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

Como alternativa, a sequência codificadora pode derivar de mRNA de B. burqdorferi usando técnicas conhecidas (e.g. transcrição reversa do mRNA para gerar uma cadeia de cDNA complementar) e kits de cDNA comerciais.

Polímeros de

DNA que codificam mutantes das OspA podem ser preparados por mutgénese dirigida do codifica a proteína por métodos convencionais como descritos por G. Winter et al. em Nature 1982, 299, 756-758 por Zoller e Smith 1982; Nucl. Acids Res., 10, 6487-6500 proteínas

CDNA sejam que os ou ou mutagénese de deleção tal como descrito por Chan e Smith em Nucl.

Acids Res., 1984, 12, 2407-2419 ou por G. Winter et al. em

Biochem. Soc. Trans., 12., 224-225.

O processo do invento pode ser realizado por técnicas recombinantes convencionais como sejam as descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

Em particular, o processo pode compreender os passos de:

i) preparação de um vector de expressão replicável ou de integração capaz, numa célula hospedeira, de expressar um polímero de DNA compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica a proteína ou um seu derivado imunogénico;

ii) transformação de uma célula hospedeira com o referido vector;

iii) cultura da referida célula hospedeira transformada em condições que permitam a expressão do referido

polímero de DNA para produzir a referida proteína; e iv) recuperação da referida proteína.

termo 'transformação' é aqui usado para significar a introdução de DNA estranho numa célula hospedeira. Isto pode ser conseguido por exemplo por transformação, transfecção ou infecção com um plasmídeo adequado ou vector virai usando e.g. técnicas convencionais como descrito em Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman e A.J. Kigsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. O termo 'transformado' ou 'transformante' será daqui em diante aplicado à célula hospedeira resultante contendo e expressando o gene estranho de interesse.

Os vectores de expressão são novos e também constituem parte do invento.

Os vectores de expressão replicáveis podem ser preparados de acordo com o invento, clivando um vector compatível com a célula hospedeira para proporcionar um segmento de DNA linear tendo um replicão intacto e combinação do referido segmento linear com uma ou mais moléculas que, juntamente com o referido segmento linear codifica o produto pretendido, como seja o polímero de DNA codificador da proteína OspA ou seu derivado, como seja uma proteína de fusão NSl-OspA nas condições de ligação.

Assim, o polímero de DNA pode ser pré-formado ou formado durante a construção do vector conforme pretendido.

A escolha do vector será determinada em parte pela célula hospedeira, a qual pode ser procariótica ou eucariótica.

Vectores adequados incluem plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e vírus recombinantes.

A preparação do vector. de expressão replicável pode ser realizada convencionalmente com enzimas adequadas para restrição, polimerização e ligação do DNA, por processos descritos por exemplo em Maniatis et al. citado atrás.

A célula hospedeira recombinante é preparada de acordo com o invento por transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão replicável do invento em condições de transformação. Condições de transformação adequadas são as convencionais e estão descritas por exemplo em Maniatis et al. referido atrás ou em DNA Cloning Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.

A escolhas das condições de transformação é determinada pela célula hospedeira. Assim, um hospedeiro bacteriano como seja E. coli pode ser tratado com uma solução de CaCl₂ (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1973, 69, 2110) ou com uma solução compreendendo uma mistura de RbCl, MnCl₂, acetato de potássio e glicerol e depois com ácido 3-[N-morfolino]-propano-sulfónico, RbCl e glicerol. As células de mamífero em cultura podem ser transformadas por coprecipitação com cálcio do DNA vector sobre as células. O invento também engloba uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão replicável do invento.

A cultura da célula hosepedira transformada em condições que permitam a expressão do polímero de DNA é realizada convencionalmente como descrito por exemplo em Maniatis et al. e DNA Cloning referido atrás. Assim, preferencialmente a célula é alimentada com meio nutritivo e cultivada a uma temperatura abaixo dos 50°C. .

produto é recuperado por métodos convencionais de acordo com a célula hospedeira. Assim, sempre que a célula hospedeira é bacteriana, como seja E. coli ela pode ser lisada fisicamente, quimicamente ou enzimaticamente e o produto proteico isolado a partir do lisado resultante. Senmpre que a célula hospedeira é de mamífero o produto pode ser de uma forma geral isolado a partir de meio nutritivo ou a partir de extractos acelulares. As técnicas convencionais de isolamento de proteínas incluem precipitação selectiva, cromatografia de adsorção e cromatografia de afinidade incluindo uma coluna de afinidade com anticorpo monoclonal.

As proteínas do presente invento quando expressas em E. coli como proteínas de tamanho completo produzem micelas de lipoproteína que são imunogénicas. Tais lipoproteínas de tamanho completo constituem parte do presente invento.

Como poderá ser avaliado todas as proteínas do presente invento podem encontrar utilidade em vacinas e diagnóstico.

Ainda, será apreciado que outros componentes antigénios tais como os outros antigénios OspA derivados de isolados de B. burqdorferi ou antigénios derivados de outros patogénios podem ser incluidos numa composição de vacina do presente invento. Em adição outros antigénios de outros organismos podem estar presentes na vacina.

Os antigénios OspA utilizados nas composições do presente invento incluem fragmentos imunogénicos de OspA, i.e. fragmentos de OspA contendo epítopos imunogénicos para células B ou T ou proteínas de fusão contendo tais epítopos, incluindo fusões de OspA de diferentes grupos.

Num aspecto do presente inveno é proporcionada uma vacina ou composição de diagnóstico compreendendo uam OspA ou seu derivado proveniente de uma estirpe do subgrupo II. Em particular uma caracterizada por ser codificada por uma sequência de DNA que permitirá a ocorrência de reacção em cadeia com polimerase usando os iniciadores pr0spAl-A4, mas não prOspAl-A2, a proteína sendo misturada com veículo ou excipiente adequado. Mais particularmente é proporcionada uma composição compreendendo uma OpA ou seu derivado proveniente de uma estirpe do grupo II tendo uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à da sequência proteica descrita na sequência ID N22.

Tais composições podem vantajosamente conter um derivado OspA de uma estirpe do subgrupol.

Assim, o presente invento proporciona numa realização preferida uma composição, de preferência uma composição de vacina contendo um antigénio OspA derivado de uma B, burcrdorferi do subgrupo I e um antigénio OspA derivado de uma B. burcrdorferi do subgrupo II.

De preferência o antigénio OspA derivado do grupo I é seleccionado do grupo constituído por B31, ZS7 e N40.

Preferencialmente o antigénio OspA derivado do grupo II é seleccionado do grupo ZQ, NE11H.

presente invento também proporciona uma vacina ou composição de diagnóstico compreendendo uma OspA ou derivado proveniente de uma estirpe do subgrupo III, a proteína sendo misturada com um excipiente ou veículo adequado. Mais particularmente a vacina ou composição de diagnóstico compreende uma OspA ou seu derivado tendo uma sequência de aminoâcidos substancialmente idêntica à sequência proteica descrita na sequência ID N24.

Preferencialmente a OspA deriva da estirpe 19857.

invento também proporciona uma vacina ou composição de diagnóstico compreendendo uma OspA ou seu derivado proveniente do subgrupo IV, V ou VI.

Numa realização preferida é proporcionada uma vacina sendo uma combinação de antigénios contendo pelo menos duas OspAs ou seus derivados provenientes de diferentes subgrupos de B. burqdorferi. Tais composições de vacina proporcionam protecção contra uma maior gama de infecções por Borrelia do que até agora conferida. De preferência a vacina compreende uma OspA derivada dos grupos I a IV e mais preferencialmente uma OspA dos grupos I a IV.

Na vacina do invento, pode ser usada uma solução aquosa da ou das proteínas. Como alternativa, a proteína com ou sem liofilização prévia pode ser misturada ou absorvida a qualquer um dos adjuvantes conhecidos. Tais adjuvantes incluem mas não estão limitados a hidróxido de alumínio, muramildipeptídeo e saponinas tais como Quil A. São particularmente preferidos os adjuvantes MPL (Lípido A monofosforilado) e 3D-MPL (Lípido A monofosforilado e 3deacilado). Um outro adjuvante preferido é conhecido como QS21. 3 DMPL pode ser obtido por métodos descritos na patente UK N2 2220211, onde QS21 pode ser obtido pelo método descrito na Patente N2 5,057,540. Como exemplo alternativo as proteínas podem ser encapsuladas dentro de micropartículas tais como lipossomas ou associadas a emulsões de óleo em água. Ainda num exemplo alternativo, as proteínas podem ser conjugadas com uma macromolécula estimuladora da resposta imune como seja Bordetella morta ou toxóide do tétano.

As proteínas do presente invento podem ser expressas por vectores vivos como seja BCG, Listeria ou Salmonela e formuladas como vacinas vivas usando tais vectores.

A preparação de vacinas está descrita de uma forma geral em New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. A encapsulação dentro de lipossomas está descxrita por Fullerton, Patente US 4235877. A conjugação de proteínas a macromoléculas está descrita por exemplo por Likhite, Patente US 4372945 e Armor et al. Patente US 4474757.

A utilização de Quil A por Dalsgaard et al., Acta Vet Scand, 18:349 (1977). A utilização de 3D-MPL está descrita por Ribi et al. Microbiology(1986) LEVIE et al. (Eds.) American Soc. for Microbiol. Wash. D.C. pp9-13.

A quantidade da proteína do presente invento presente em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos secundários significativos típicos das vacinas. Tal quantidade variará dependendo do imunogénio específico empregue e se a vacina é formulada ou não com adjuvente. De um modo geral espera-se que cada uma das doses compreenda 1-1000 /xg de proteína, de preferência 1-200 /xg.Uma quantidade óptima para uma vacina particular pode ser determinada por estudos convencionais envolvendo a observação dos títulos de anticorpos e outras respostas nos indivíduos. Após uma vacinação inicial os indivíduos podem eceber uma administração adicional para aumentar a sua resposta imune.

EXEMPLO 1

Oaracterísticas de Bordetelia burqdorferi estirpe Z01

1.1. Isolamento: A mostra do intestino médio de uma fêmea de Ixodes ricinus capturado em Freiburg-Kappel a partir de um cão em 31 de Maio de 1988; cultivada em BSK suplementado com canamicina e fluoruracilo; a cultura tornou-se positiva em 8 de Junho de 1988; congelaram-se amostras a -70°C e em azoto líquido em 20 de Junho de 1988.

As passagens in vitro geralmente usadas nas experiências foram a segunda e a terceira de B. burqdorferi.

1.2. Cultura: Borrelia burqdorferi estirpe ZQ1 foi cultivada em meio de Barbour-Stoenner-Kelly como descrito para a estirpe ZS7 (Schaille et al., J. Exp. Med. 170, 1989;) O tempo de uma geração é cerca de 30 a 40 horas (mais lento do que o da estirpe ZS7; cerca de 20-24 horas).

1.3 Plasmídeos: A análise de plasmídeos foi feita em paralelo para estirpe ZQ1, ZS7, Z37, GeHo e B31 de acordo com o protocolo de Barbour e Garon (1977): Para a estirpe ZQ1 foram encontrados plasmídeos com pesos moleculares de 49, 29, 25, 20 e 18 Kb e uma banda fraca a 14 Kb. Os plasmídeos de 49 e 25 Kb estão também presentes em B31, Z37, GeHo e ZS7, enquanto que os plasmídeos de 29 e 20 Kb são detectáveis apenas em ZS7. Os plasmídeos de 18 e 14 Kb parecem ser únicos para ZQ1. O plasmídeo de 16 Kb que se encontra nas outras estirpes testadas está ausente em ZQ1.

1.4 Electroforese em gel de poliacrilamida: Existe um padrão distinto de proteínas na estirpe ZQ1 quando comparado com outras estirpes conforme revelado por electroforese em gel de poliacrilamida e colorâção com prata; não existe uma banda na gama de 34 KDa (OspB); a banda que mais provavelmente representa OspA tem um peso molecular de cerca de 32 KDa. A banda correspondente nas outras estirpes (ZS7, Z37, GeHo, B31) migra como 31 KDa.

1.5 Análise de transferência Western: usaram-se os anticorpos monoclonais (mAbs) contra Borreiia burqdorferi (B31, GeHo), ZQ1 mostra um padrão de coloraão distinto do das estirpes ZS7 e B31; não existe coloração com qualquer um dos mAbs específicos de OspA com excepção do mAb LA 31.1 específico de OspA o qual reage com uma banda correspondente a uma gama de peso molecular à volta de 32 KDa. Nenhum dos mAbs específicos para OspB de B31, ZS7 reage com uma proteína de ZQ1. Também não existe coloração com o mAb LA.7 contra o antigénio de 20 KDa. mAbs específicos para os antigénios de 65 KDa e 70 KDa coram estruturas em ZQ1 correspondentes às das outras estirpes.

Soro imune:

A proteína de 32 KDa derivada de ZQ1 (OspA) é reconhecida por soro imune (SI) de coelho contra Borrelia burqdorferi B31, SI de murqanho contra Borrelia burqdorferi ZS7. Não existe coloração na gama de 34 KDa, SI reage contra Borrelia burqdorferi ZQ1 reage com OspA, flagelina e com uma banda de 20 (banda fraca), 50 e 65 (banda fraca) KDa mas não com OspB da estirpe

ZS7.

EXEMPLO 2

2.1 Preparação de DNA e amplificação por PCR

Células de B. burqdorferi foram lisadas usando o detergente SDS e as proteínas foram removidas por digestão com protease serina inespecífica, proteinase K. Os detritos de parede celular, polissacãridos e restantes proteínas foram removidos por precipitação selectiva com CTAB (brometo de cetiltrimetilamónio) e o DNA recuperado a partir do sobrenadante resultante por . . . . . 10 precipitação com isopropanol. Resumidamente, espiroquetas (10 células) foram lavadas em PBS e suspensas em 9 ml de TE. Após adição de 1 ml de SDS (20%) e 50 μΐ de proteinase K (20 mg/ml), a solução foi incubada durante 1 hora a 37°C. Finalmente, 1,5 ml de 5M NaCl e 1,25 ml de CTAB (20% em 0,7M NaCl) foram adicionados e a mistura foi mantida durante 10 minutos a 65 °C. O DNA foi purificado por extracção com fenol e clorofórmio/álcool isoamílico e subsequentemente precipitado com 0,6 vol. de isopropanol durante 10 minutos à temperatura ambiente. O sedimento foi lavado usando etanol a 70%, seco e dissolvido em TE (10 mM Tris 0,1 mole de EDTA pH 7,4).

Os oligonucleótidos iniciadores para a reacção em cadeia com polimerase foram sintetizados quimicamente usando um sintetizador de DNA Applied Biosystems (ABI) e química de b-cianoetilo. As sequências de oligonucleótidos que se seguem foram usadas nas experiências:

prOsp Al: 5'-GGGAATAGGT CTAATATTAG CC-3'; prOsp A2: 5'-TGACCTGAATT CCAAGCTGCA-3·;

prOsp A4: 5'-GCAGTTAAAG TTCCTTCAAG AACATAGC-3·.

DNA-polimerase Taq e reagentes de PCR (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Conn.) foram usados por 50 μ,Ι de reacção. Cada uma das reacções em cadeia com polimerase continha trifosfatos de desoxinucleósido 800 mM, 2U de DNA-polimerase Taq, 1,5 mM MgCl₂ e 0,5 mM para cada um dos iniciadores. Como rotina, 10 ng de DNA genómico total de B. burcrdorferi foi amplificado durante 35 ciclos nas condições que se seguem: 94°C durante 1,2 minutos; 42°C durante 2 minutos; 72°C durante 2 minutos. Um total de 10 μΐ por reacção foi analisado em géis de 1,5% de agarose em condições de electroforese convencionais.

2.2 Análise Southern

DNA genómico total de B. burcrdorferi (20 /xg) foi digerido com as enzimas de restrição indicadas, separado por electroforese num gel de 0,8% de agarose e transferido para membrana de nylon (Hybond-N, Amersham). As transferências foram hibridadas a 60°C em tampão Church (0,5M NaHPO^ 17% NaDodSO^, pH 7,2) durante a noite com uma sonda OspA (estirpe ZS7) maracada 32 ...

com P por extensão ao acaso do iniciador e lavadas a 55°C em 0,lX SSC/0,1% SDS.

Resultados

Tabela 1: Análise genotipica e fenotipica das estirpes de B. burgdorferi conforme analisado por PCR e transferência Southern estão apresentados na Tabela I.

Polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição do gene OspA codificado pelo plasmídeo.

RFPL para OspA usando HindIII revelou pelo menos seis padrões de hibridação distintos entre os isolados de B.

burgdorferi testados. Todas as estirpes de B. burgdorferi designadas como grupo A,A,A, (para uma fia, HSP60, HSP70) são caracterizados por dois fragmentos de hibridação de 1,2 Kb e 0,3 Kb (B31, ZS7; OspA tipo I) e a maioria das estirpes do grupo Β,Β,Β (para fia, HSP60, HSP70) (17/25) expressaram dois fragmentos de 0,9 Kb e 0,4 Kb (ZQ1; OspA tipo II). B. burodorferi estirpes 19857 e 21038 (grupo II, A/B, A para fia, HSP60, HSP70) apresentaram dois fragmentos que hibridaram de 4 kb e 0,5 kb (OspA genótipo III) e todas as estirpes tipo ACA-1 (grupo II,B,A) expressam apenas um fragmento de aproximadamente 1,7 Kb (OspA tipo IV). As estirpes 20047 e S90 (grupo ΙΙ,Β,Β) apresentam apenas um fragmento de 3Kb (OspA tipo V) e 1,1 Kb (OspA tipo VI) respectivamente (Tabelas I). Os DNAs isolados a partir de membros de outras espécies de Borrelia não hibridam com a sonda específica de OspA. As frequências dos genótipos individuais OspA entre os isolados de B. burgdorferi testados são: 30/55 (55%) OspA tipo I. 17/55 (31%) tipo II, 2/55 (4%) tipo III, 4%55 (7%) tipo IV, 1%55 (2%) tipo V e 1/55 (2%) tipo VI. Note-se que os isolados americanos de B. burgdorferi analisados com esta finalidade pertencem apenas a um genótipo de OspA, i.e. tipo I, com excepção de duas estirpes, 19857 e 21038, as quais expressam OspA genótipo III; pelo contrário, entre os isolados Europeus foram encontrados cinco genótipos OspA, i.e. I, II, IV, V e VI. Os resultados estão resumidos na Tabela IV.

EXEMPLO 3 θ Patoqenicidade: A inoculação de murganhos SCID com 10

ZQ1 subcutaneamente na cauda conduz a artrite clínica por volta do dia 50 após inoculação. As alterações histopatológicas nas articulações investigadas no dia 57 foram comparáveis às descritas para murganhos SCID infectados com a estirpe ZS7 em estados mais precoces da doença. ZQ1 é portanto menos patogénico do que

ZS7. As espiroquetas puderam ser isoladas no dia 57 após inoculação de murganhos SCID infectados com ZQ1.

θ

Quando 5 murganhos C57BL/6 foram inoculados com 10 B.b. ZQ1 subcutaneamente na cauda, apenas um murganho desenvolveu artrite clínica unilateral no dia 71 após inoculação dentro da totalidade do período de observação de 160 dias.

EXEMPLO 4

Protecção cruzada: A administração de SI contra ZQ1 (32 /ig de Ig específicas/ml; 100 μΐ nos dias 0 e 4, 200 μΐ nos dias 7 e 11 e 300 μΐ nos dias 15 e 19) a murganhos SCID não protegeu estes murganhos contra a infecção por ZS7 dada no dia 0.

EXEMPLO 5

Realizaram-se outros estudos de protecção cruzada usando a estirpe do Grupo II NE11H e a estirpe do grupo I ZS7. A transferência de soro imune para murganhos SCID conforme apresentado na Tabela II apenas protegeu contra desafio homólogo (i.e. desafio com o mesmo grupo).

EXEMPLO 6

Experiências de protecção cruzada usando isolados e soro imune contra vários isolados de B. burgdorferi ou contra rec.OspA da estirpe ZS7

Materiais e Métodos:

Métodos

Murganhos (C57BL/6 ou DBA/2) foram inoculados cm 1 x g espiroquetas viáveis de B. burgdorferi das estirpes ZS7 (SI anti-ZS7) , ZQ1 (SI anti-ZQl) , NE11H (SI anti-NEUH) , B31 (SI anti-B31) ou uma mistura contendo quantidades iguais das estirpes 20047, ZS7, NE11H, 21305, 21038, 21343, 26816, 28691 e 19535 (SI anti-cocktail) subcutaneamente (sc) na base da cauda.

Rec. OspA da estirpe ZS7 foi expresso a partir do vector de expressão pUEXl em Escherichia coli, as proteínas foram extraídas e purificadas por afinidade usando um mAb específico de OspA (LA-2). Os murganhos foram sensibilizados s.c. e dado o reforço após 10 e 20 dias com 10 μg de rec. OspA em adjuvante (ABM2; Sebac, Aidenbach, FRG).

Os soros imunes (SI) foram obtidos a partir destes murganhos sangrando várias vezes entre a semana três e dez dias após inoculação (p.i). Murganhos SCID foram injectados intraperitonealmente (i.p.) com SI uma vez (60 pg de Ig específica de B. burgdorferi; SI anti-ZS7, SI anti-NEUH, SI anti-cocktail, SI anti rec. OspA) uma hora antes da inoculação ou seis vezes durante três semanas (SI.anti-B31 contendo 60 ^g/ml de Ig específica; SI anti-ZQl contendo 32 μg/ml) com quantidades crescentes de anticorpos (100 μΐ no dia 1 e 4, 200 μΐ dia 7 e 11, 300 μΐ dia

Q e 17 p.i.). Murganhos SCID foram inoculados com 1 x 10 espiroquetas viáveis de B. burqdorferi das estirpes ZS7, SH-2-82-P5, 21038, NE11H ou 20047 s.c. na base da cauda uma hora após a (primeira) transferência de soro.

Resultados:

Soros imunes contra as estirpes do subgrupo I ZS7 e B31 protegeram contra infecção homóloga, apenas parcialmente contra infecção heteróloga com a estirpe 20047 (subgrupo V) e ausência total de protecção contra infecção pela estirpe NE11H do subgrupo II. Os soros imunes contra a estirpe NE11H do grupo IIprotege apenas parcialmente contra a infecção heteróloga com a estirpe 20047 (subgrupo V) e não dá qualquer protecção contra a infecção heteróloga com a estirpe ZS7 subgrupo I).

pré-tratamento de murganhos SCID com soro mono-específico anti-rec. OspA (ZS7) resultou numa protecção considerável contra o desenvolvimento da doença quando da infecção com a estirpe ZS7 (2/6) ou SH-2-82-P5 (2/3; flaA, OspA/OspB I)e em protecção parcial quando da infecção com 20047 (1/3; flaB,

OspA/OspB V) ou 21038 (2/3, fia B, OspA/OspB III; Tabela 2). A artrite clínica observada na maioria destes murganhos nestas condições foi tratados com o apenas suave. Pelo contrário, murganhos SCID mesmo SI contra rec. OspA mas subsequentemente infectados com

NE11H (flaB, OspA/OspB II) não foram de todo protegidos. Todos estes murganhos desenvolveram artrite clínica (3/3) comparável com a observada em murganhos SCID infectados e não tratados (Tabela 3).

EXEMPLO 7

Construção dos plasmídeos de expressão codificadores da fusão

A Figura 1 descreve a construção dos três plasmídeos pOA-10, pOA-12 e pOA-18.

Resumidamente, pOA-10 foi criado em três passos. Primeiro um fragmento NspH 1 de 1,1 Kb de pZS7-2 (Dr Wallich) contendo o gene de OspA truncado foi ligado, após remoção dos extremos salientes, com pUC19 linearizado com Smal. No plasmídeo resultante, designado pOA-5, o gene OspA está flanqueado por vários sítios de restrição únicos ( no extremo 5' estes são HindIII, Sphl, PstI, Sall, Xba e BamHI e no extremo 3' saci e EcoRI) tornando mais fácila sua subclonagem. Em segundo lugar, pOA-5 foi linearizado por Xbal e ligado com pMG42 linearizado com BamHI, após preenchimento dos extremos de ambos os fragmentos para criar pOA-9. A fracção deste plasmídeo derivado de pUC19 foi subsequentemente removido por uma digestão com Ncol, gerando pOA-10. Neste plasmídeo, o gene OspA truncado está na mesma grelha de leitura do primeiro codão de NS1. A junção no extremo 5' da inserção foi verificada por sequenciação. Para criar pOA-12 e pOA-18, criámos sítios de restrição Ncol e Xbal respectivamente nos extremos 5' e 3' do fragmento de DNA codificador do gene OspA truncado usando reacção em cadeia com polimerase (PCR). Após digestão com Ncol e Xbal, este fragmento foi ligado com pMG42 ou TCM67 digerido com as mesmas enzimas para se obter respectivamente pOA-12 e pOA-18. 0 primeiro plasmídeo pOA-12, expressa o gene OspA truncado fundido ao 42 primeiros aminoácidos, o último, pOA-18, com os primeiros 81 aminoácidos de NS1. A inserção de ambos os plasmídeos foi sequenciada para verificar que nenhuma substituição de aminoácidos foi introduzida no gene OspA durante PCR.

Os três plasmídeos foram usados para transformar E. coli AR120 que permite a indução do promotor lambda pL pela adição de ácido nalidixico. Em adição os três plasmídeos foram usados para transformar E. coli AR58 que permite a indução do promotor lambda pL por um aumento na temperatura.

EXEMPLO 8

Exressão de trOspA recombinante a partir de pQA-10, pOA-12 e DOA-18

Culturas de cinquenta ml (LB suplementado com os antibióticos adequados) das três estirpes AR120 (pOA-10), AR120 (pOA-12) e AR120 (pOA-18) foram inoculadas com 0,25 ml de uma pré-cultura crescida durante a noite e crescidas a 37°C. A uma de cerca de 0,3, as células contidas em 5 ml de cultura 62U foram colhidas e ressuspensas em tampão de amostra com SDS. O ácido nalidixico foi adicionado à restante cultura para uma concentração final de 60 mg/ml. Três horas mais tarde as células de 5 ml de cultura foram colhidas e ressuspensas em tampão de amostra com SDS.

Paralelamente às três estirpes de AR120, as estirpes JM109 e JM109(pZS7-2) foram cultivadas em 50 ml de meio LB até uma densidade óptca (620 nm) de 0,6 e tratadas como descrito atrás. Em JM109(pZS7-2) a forma nativa de OspA é expressa constitutivamente a partir do seu próprio promotor, todas as amostras foram submetidas a SDS-PAGE e análise Western usando um conjunto de mAbs LA-2, LA-26 e LA-31 para detectar os derivados OspA.

Realizou-se a análise das amostras correspondendo a células não induzidas e induzidas (no caso de pZS7-2), hospedeiro sem e com o plasmídeo). A quantidade de material aplicado em cada

em cada uma das cavidades foi normalizado com base na densidade óptica das culturas (0,05 A_g20/cavidade). No gel corado, na faixa induzida de JM109(pZS7-2) e de AR120(pOA-18) induzida, surgiram novas bandas com migrações consistentes com o tamanho esperado dos produtos a serem expressos (respectivamente OspA nativa e trOspA fundidos com 81 aminoâcidos de NS1). OspA nativa surge como um ubleto e representa uma pequena percentagem da proteína total da bactéria. 0 produto de pOA-18 é expresso num nível mais elevado do que o da proteína nativa. A análise Western confirma que estas bandas novas correspondem a derivados de OspA. A transferência mostra ainda que AR120(pIA-12) expressa trOspA fundido com 42 aminoâcidos de NS1 mas num nível inferior. A expressão de trOspA derivada de pOA-10 surge como uma banda fraca, correspondendo ao tamanho esperado de trOspA e foi observada em transferência Western.

Resultados semelhantes foram observados quando os mesmos plamídeos foram introduzidos em E. coli AR58 e a expressão do derivado do gene OspA induzida por um aumento da temperatura. Também obtivemos proteína de fusão semelhante NSl₁__gl OspAZS7 utilizando um plasmídeo codificador de resistência à canamicina.

EXEMPLO 9

Comparação do fraccionamento celular de AR120(pQA18) e JM109(PZS7-2)

E. coli estirpe AR120(pOA18) foi crescida e a expressão dos genes OspA induzida como descrito atrás.

E. coli estirpe JM109(pZS7-2), na qual o gene nativo de OspA é expresso constitutivamente a partir do seu próprio

promotor, foi cultivado em 50 ml de meio LB suplementado com 100 gg/ml de ampicilina até uma densidade óptica (620 nm) de 0,6.

As células de ambas as estirpes foram então tratadas como se segue. As células contidas em 5 ml foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em tampão de amostra SDS-PAGE (amostra T3). As células nos restantes 40 ml foram colhidas, lavadas duas vezes em tampão A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) e reben. 2 tadas no mesmo tampão por duas passagens a 100001b/m através de uma prensa francesa. Os homogenatos celulares foram fraccionados por centrifugação. Os sobrenadantes foram guardados a -20°C (amostras D3). Os sedimentos foram lavados duas vezes em tampão A e solubilizados durante a noite em tampão de amostra SDS-PAGE à temperatura ambiente (amostra C3). Os resultados do fraccionamento celular das 2 estirpes expressoras foram analisados por SDS-PAGE e realizada transferência Western como atrãs excepto ter sido aplicado apenas 0,025 Αθ₂θ de equivalentes celulares em cada cavidade. A OspA nativa, expressa em JM109(pZS7-2), encontra-se tanto nas fracções celulares solúveis (S3) como insolúvel (C3). A banda inferior do dubleto encontra-se parcialmente na fracção insolúvel enquanto que a banda superior está quase totalmente na fracção solúvel. A proteína de alto peso molecular que surge apenas na faixa C3 de JM109(pZS7-2) não é reconhecida pelos anticorpos anti-OspA e portanto não é provavelmente um derivado de OspA. Por outro lado o produto de pOA-18 encontra-se quase exclusivamente na fracção solúvel.

EXEMPLO 10 • l

Reactividade de NSI-OspA derivada de pOA-18 com 4 mAbs anti-OspA

Extractos celulares brutos de pf AR120 (pOA18) e

JM109(pZS7-2) foram preparados como descrito atrás. Eles foram submetidos a SDS-PAGE em quatro séries de cavidades lado a lado (AR120(pOA-18) e JM109(pZS7-2)) e as suas proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi cortada em quatro fragmentos cada um deles contendo um par de faixas lado a lado. Cada um dos fragmentos foi submetido a análise por transferência Western com um mAb anti-OspA diferente. Os resultados indicam que a NSI-OspA codificada por pOA-18 e a OspA nativa reagem com os quatro monoclonais de forma semelhante.

EXEMPLO 11

De forma análoga à construção de pOA-18, os plasmídeos foram construídos para expressarem proteínas de fusão NSI-OspA derivadas de outra estirpe de B. burqdorferi. Em particular foram feitas e testadas as fusões·que se seguem a partir das estirpes seguintes como referido atrás: NSI-OspA (ZQ1); NSI-OspA (Acal) e NSI-OspA (19857).

Sumário e conclusões

Uma forma recombinante truncada de OspA, sem os 16 primeiros aminoácidos da proteína nativa e fundida com os primeiros 81 aminoácidos de NS1, foi expresso num nível mais elewado do que a OspA nativa. Ela é mais solúvel do que a proteína nativa e mantém a reactividade com os anticorpos monoclonais que se ligam à respectiva OspA nativa, é imunogénica quando aplicada com adjuvantes e tem a capacidade de proteger animais da infecção com B. burqdorferi virulento.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: SIMON, MARKUS

KRAMER, MICHAEL

SCHAIBLE, ULRICH

WALLICH, REINHARD

LOBET, YVES (ii) TÍTULO DO INVENTO: VACINAS (ili) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 12 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: MARCUS DALTON SMITHKLINE BEECHAM (B) RUA: GREAT BURGH YEW TREE BOTTOM ROAD (C) CIDADE: EPSOM (D) STATE: SURREY (E) PAÍS: INGLATERRA (F) CÓDIGO POSTAL: KT18 5XQ (V) FORMA LEGÍVEL NO COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Disco não rígido (B) COMPUTADOR: IBM compatível com PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patente a sair #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS CORRENTES DE PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO:

(B) DATA DE ENTREGA (C) CLASSIFICAÇÃO:

(Viii) PROCURADOR/INFORMAÇÃO DO AGENTE:

(A) NOME: DALTON, MARCUS JW (B) NÚMERO DE REGISTO: 22885 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: BB45008 (íx) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO:

(A) TELEFONE: 0737 364000 (B) TELEFAX: 0737 364006 (C) TELEX: 911415 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 825 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: ZQ1 (XÍ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

ATGAAAAAAT ATTTATTGGG AATAGGTCTA ATATTAGCCT TAATAGCATG TAAGCAAAAT

GTTAGCAGCC TTGATGAAAA AAATAGCGTT TCAGTAGATT TACCTGGTGG AATGAAAGTT

120

CTTGTAAGTA 180	AAGAAAAAGA	CAAAGATGGT	AAATACAGTC	TAGAGGCAAC	AGTAGACAAG
CTTGAGCTTA 240	AAGGAACTTC	TGATAAAAAC	AACGGTTCTG	GAACACTTGA	AGGTGAAAAA
ACTGACAAAA 300	GTAAAGTAAA	ATTAACAATT	GCTGAGGATC	TAAGTAAAAC	CACATTTGAA
ATTTTCAAAG 360	AAGATGGCAA	AACATTAGTA	TCAAAAAAAG	TAACCCTTAA	AGACAAGTCA
TCAACAGAAG 420	AAAAATTCAA	CGAAAAGGGT	GAAATATCTG	AAAAAACAAT	AGTAAGAGCA
AATGGAACCA 480	GACTTGAATA	CACAGACATA	AAAAGCGATG	GATCCGGAAA	AGCTAAAGAA
GTTTTAAAAG 540	ACTTTACTCT	TGAAGGAACT	CTAGCTGCTG	ACGGCAAAAC	AACATTGAAA
GTTACAGAAG 600	GCACTGTTGT	TTTAAGCAAG	AACATTTTAA	AATCCGGAGA	AATAACAGTT
GCACTTGATG 660	ACTCTGACAC	TACTCAGGCT	ACTAAAAAAA	CTGGAAAATG	GGATTCAAAG
ACTTCCACTT 720	TAACAATTAG	TGTGAATAGC	CAAAAAACCA	AAAACCTTGT	ATTCACAAAA
GAAGACACAA 780	TAACAGTACA	AAAATACGAC	TCAGCAGGCA	CCAATCTAGA	AGGCAAAGCA

GTCGAAATTA CAACACTTAA AGAACTTAAA GACGCTTTAA AATAA

825

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 274 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: ZQ1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met

Lys

Lys

Tyr

Leu

Leu

Gly

Ile

Gly

Leu

Ile

Leu

Ala

Leu

Ile

Ala

1

5

10

15

Cys

Lys

Gin

Asn

Vai

Ser

Ser

Leu

Asp

Glu

Lys

Asn

Ser

Vai

Ser

Vai

20

25

30

Asp

Leu

Pro

Gly

Gly

Met

Lys

Vai

Leu

Vai

Ser

Lys

Glu

Lys

Asp

Lys

35

40

45

Asp

Gly

Lys

Tyr

Ser

Leu

Glu

Ala

Thr

Vai

Asp

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

50

55

60

Gly

Thr

Ser

Asp

Lys

Asn

Asn

Gly

Ser

Gly

Thr

Leu

Glu

Gly

Glu

Lys

65

70

75

80

Thr Asp

Lys

Ser Lys 85

Val Lys

Leu Thr

Ile Ala 90

Glu

Asp

Leu

Ser 95

Lys

Thr

Thr

Phe

Glu

Ile

Phe

Lys

Glu

Asp

Gly

Lys

Thr

Leu

Val

Ser

Lys

100

105

110

Lys

Vai

Thr

Leu

Lys

Asp

Lys

Ser

Ser

Thr

Glu

Glu

Lys

Phe

Asn

Glu

115

120

125

Lys

Gly

Glu

Ile

Ser

Glu

Lys

Thr

Ile

Val

Arg

Ala

Asn

Gly

Thr

Arg

130

135

140

Leu

Glu

Tyr

Thr

Asp

Ile

Lys

Ser

Asp

Gly

Ser

Gly

Lys

Ala

Lys

Glu

145

150

155

160

Vai

Leu

Lys

Asp

Phe

Thr

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

Ala

Ala

Asp

Gly

Lys

165

170

17 5

Thr

Thr

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Gly

Thr

Val

Val

Leu

Ser

Lys

Asn

Ile

180

185

190

Leu

Lys

Ser

Gly

Glu

Ile

Thr

Val

Ala

Leu

Asp

Asp

Ser

Asp

Thr

Thr

195

200

205

Gin

Ala

Thr

Lys

Lys

Thr

Gly

Lys

Trp

Asp

Ser

Lys

Thr

Ser

Thr

Leu

210

215

220

Thr

Ile

Ser

Vai

Asn

Ser

Gin

Lys

Thr

Lys

Asn

Leu

Val

Phe

Thr

Lys

225

230

235

240

Glu

Asp

Thr

Ile

Thr

Val

Gin

Lys

Tyr

Asp

Ser

Ala

Gly

Thr

Asn

Leu

245

250

255

Glu

Gly

Lys

Ala

Val

Glu

ile

Thr

Thr

Leu

Lys

Glu

Leu

Lys

Asp

Ala

260 265 270

Leu Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 819 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: 19857 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

ATGAAAAAAT ATTTATTGGG 60

GTTAGCAGCC TTGACGAGAA

120

CTTGTAAGCA AAGAAAAAAA

180

AATAGGTCTA ATATTAGCCT

AAACAGCGTT TCAGTAGATG

CAAAGACGGC AAGTACGATC

TAATAGCATG TAAGCAAAAT

TACCTGGTGG AATGAAAGTT

TAATGGCAAC AGTGGACAAC

GTTGATCTTA AAGGAACTTC TGACAAAAAC AATGGATCTG GAATACTTGA AGGCGTAAAA

240

GCTGATAAAA GTAAAGTAAA ATTAACAGTT 300

GTTTTAAAAG AAGATGGTAC AGTAGTGTCA 360

ACAGAAGCAA AATTCAACGA AAAAGGTGAA

420

GGAACTACTC TTGAATACTC ACAAATGACA 480

ACTCTTAAAA ACGGCATTAA GTTTGAAGGA 540

ATTAAAGAAG GCACTGTTAC TCTAAAAAGA 600

TCTTTAAATG ACACTGCATC TGGTTCTAAA

660

ACCTTAACAA TTAGTGCAAA CAGCAAAAAA 720

ACAATTACAG TACAAAATTA TGACTCAGCT

780

GCTGACGATC TAAGCAAAAC CACACTTGAA AGAAAAGTAA CTTCCAAAGA CAAGTCAACA TTGTCTGAAA AAACAATGAC AAGAGCAAAC AATGAAGACA ATGCTGCAAA AGCAGTAGAA AATCTCGCAA GTGGAAAAAC AGCAGTGGAA GAAATTGATA AAAATGGAAA AGTAACCGTC AAAACAGCTT CCTGGCAAGA AAGTACTAGC ACTAAAGATC TAGTGTTCCT AACAAACGGT GGCACTAAAC TTGAAGGATC AGCAGCTGAA

ATTAAAAAAC TCGATGAACT TAAAAACGCT TTAAGATAA

819

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 272 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: 19857 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Met Lys 1

Lys

Tyr Leu Leu 5

Gly Ile Gly

Leu 10

Ile

Leu

Ala

Leu

Ile Ala 15

Cys

Lys

Gin

Asn

Vai

Ser

Ser

Leu

Asp

Glu

Lys

Asn

Ser

Vai

Ser

Vai

20

25

30

Asp

Vai

Pro

Gly

Gly

Met

Lys

Vai

Leu

Vai

Ser

Lys

Glu

Lys

Asn

Lys

35

40

45

Asp

Gly

Lys

Tyr

Asp

Leu

Met

Ala

Thr

Vai

Asp

Asn

Vai

Asp

Leu

Lys

50

55

60

Gly

Thr

Ser

Asp

Lys

Asn

Asn

Gly

Ser

Gly

Ile

Leu

Glu

Gly

Vai

Lys

65

70

75

80

Ala

Asp

Lys

Ser

Lys

Vai

Lys

Leu

Thr

Vai

Ala

Asp

Asp

Leu

Ser

Lys

85

90

95

Thr

Thr

Leu

Glu

Vai

Leu

Lys

Glu

Asp

Gly

Thr

Vai

Vai

Ser

Arg

Lys

100

105

110

val

Thr

Ser 115

Lys

Asp

Lys

Ser

Thr 120

Thr

Glu Ala

Lys

Phe 125

Asn

Glu

Lys

Gly

Glu

Leu

Ser

Glu

Lys

Thr

Met

Thr

Arg

Ala

Asn

Gly

Thr

Thr

Leu

130

135

140

Glu

Tyr

Ser

Gin

Met

Thr

Asn

Glu

Asp

Asn

Ala

Ala

Lys

Ala

Val

Glu

145

150

155

160

Thr

Leu

Lys

Asn

Gly

ile

Lys

Phe

Glu

Gly

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Lys

165

170

175

Thr

Ala

Val

Glu

Ile

Lys

Glu

Gly

Thr

Val

Thr

Leu

Lys

Arg

Glu

Ile

180

185

190

Asp

Lys

Asn

Gly

Lys

Val

Thr

Val

Ser

Leu

Asn

Asp

Thr

Ala

Ser

Gly

195

200

205

Ser

Lys

Lys

Thr

Ala

Ser

Trp

Gin

Glu

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Thr

Ile

210

215

220

Ser

Ala

Asn

Ser

Lys

Lys

Thr

Lys

Asp

Leu

Val

Phe

Leu

Thr

Asn

Gly

225

230

235

240

Thr

Ile

Thr

Val

Gin

Asn

Tyr

Asp

Ser

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Gly

245

250

255

Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu Arg

260 265 270 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1020 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: ZQ1 (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: NS1-ZQ1 (XI) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

ATGGATCCAA ACACTGTGTC 60

CGAGTTGCAG ACCAAGAACT 120

AAATCCCTAA GAGGAAGGGG

180

GGAAAGCAGA TAGTGGAGCG

240

ATGGGAAAGC AAAATGTTAG 300

GGTGGAATGA AAGTTCTTGT

360

AAGCTTTCAG GTAGATTCCT

AGGTGATGCC CCATTCCTTG

CAGCACTCTT GGTCTGGACA

GATTCTGAAA GAAGAATCCG

CAGCCTTGAT GAAAAAAATA

AAGTAAAGAA AAAGACAAAG

TTCTTTGGCA TGTCCGCAAA

ATCGGCTTCG CCGAGATCAG

TCGAGACAGC CACACGTGCT

ATGAGGCACT TAAAATGACC

GCGTTTCAGT AGATTTACCT

ATGGTAAATA CAGTCTAGAG

GCAACAGTAG 420	ACAAGCTTGA	GCTTAAAGGA	ACTTCTGATA	AAAACAACGG	TTCTGGAACA
CTTGAAGGTG 480	AAAAAACTGA	CAAAAGTAAA	GTAAAATTAA	CAATTGCTGA	GGATCTAAGT
AAAACCACAT 540	TTGAAATTTT	CAAAGAAGAT	GGCAAAACAT	TAGTATCAAA	AAAAGTAACC
CTTAAAGACA 600	AGTCATCAAC	AGAAGAAAAA	TTCAACGAAA	AGGGTGAAAT	ATCTGAAAAA
ACAATAGTAA 660	GAGCAAATGG	AACCAGACTT	GAATACACAG	ACATAAAAAG	CGATGGATCC
GGAAAAGCTA 720	AAGAAGTTTT	AAAAGACTTT	ACTCTTGAAG	GAACTCTAGC	TGCTGACGGC
AAAACAACAT 780	TGAAAGTTAC	AGAAGGCACT	GTTGTTTTAA	GCAAGAACAT	TTTAAAATCC
GGAGAAATAA 840	CAGTTGCACT	TGATGACTCT	GACACTACTC	AGGCTACTAA	AAAAACTGGA
AAATGGGATT 900	CAAAGACTTC	CACTTTAACA	ATTAGTGTGA	ATAGCCAAAA	AACCAAAAAC
CTTGTATTCA 960	CAAAAGAAGA	CACAATAACA	GTACAAAAAT	ACGACTCAGC	AGGCACCAAT

CTAGAAGGCA AAGCAGTCGA AATTACAACA CTTAAAGAAC TTAAAGACGC TTTAAAATAA 1020

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 339 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: ZQ1 (vii) FONTE IMEDIATA :

(B) CLONE: NS1-ZQ1 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Met Asp Pro Asn Thr

Vai Ser

Ser Phe Gin Vai Asp 10

Ser

Phe

Leu Trp 15

1

5

His

Vai

Arg

Lys

Arg

Vai

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Gly

Asp

Ala

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Arg

Asp

Gin

Lys

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Gly

Ser

35

40

45

Thr

Leu

Gly

Leu

Asp

Ile

Glu

Thr

Ala

Thr

Arg

Ala

Gly

Lys

Gin

Ile

50

55

60

Vai 65

Glu Arg

ile Leu

Lys Glu Glu 70

Ser

Asp

Glu 75

Ala

Leu

Lys

Met

Thr 80

Met

Gly

Lys

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Leu

Asp

Glu

Lys

Asn

Ser

Val

Ser

85

90

95

Vai

Asp

Leu

Pro

Gly

Gly

Met

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Lys

Glu

Lys

Asp

100

105

110

Lys

Asp

Gly

Lys

Tyr

Ser

Leu

Glu

Ala

Thr

Val

Asp

Lys

Leu

Glu

Leu

115

120

125

Lys

Gly

Thr

Ser

Asp

Lys

Asn

Asn

Gly

Ser

Gly

Thr

Leu

Glu

Gly

Glu

130

135

140

Lys

Thr

Asp

Lys

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Thr

Ile

Ala

Glu

Asp

Leu

Ser

145

150

155

160

Lys

Thr

Thr

Phe

Glu

Ile

Phe

Lys

Glu

Asp

Gly

Lys

Thr

Leu

Val

Ser

165

170

175

Lys

Lys

Val

Thr

Leu

Lys

Asp

Lys

Ser

Ser

Thr

Glu

Glu

Lys

Phe

Asn

180

185

190

Glu

Lys

Gly

Glu

Ile

Ser

Glu

Lys

Thr

Ile

Val

Arg

Ala

Asn

Gly

Thr

195

200

205

Arg

Leu

Glu

Tyr

Thr

Asp

Ile

Lys

Ser

Asp

Gly

Ser

Gly

Lys

Ala

Lys

210

215

220

Glu

Vai

Leu

Lys

Asp

Phe

Thr

Leu

Glu

Gly

Thr

Leu

Ala

Ala

Asp

Gly

225

230

235

240

Lys

Thr

Thr

Leu

Lys

Val

Thr

Glu

Gly

Thr

Val

Val

Leu

Ser

Lys

Asn

245

r-

250

255

Ile

Leu

Lys

Ser

Gly

Glu

Ile

Thr

Val

Ala

Leu

Asp

Asp

Ser

Asp

Thr

260

265

270

Thr

Gin

Ala

Thr

Lys

Lys

Thr

Gly

Lys

Trp

Asp

Ser

Lys

Thr

Ser

Thr

275

280

285

Leu

Thr

Ile

Ser

Val

Asn

Ser

Gin

Lys

Thr

Lys

Asn

Leu

Val

Phe

Thr

290

295

300

Lys

Glu

Asp

Thr

Ile

Thr

Val

Gin

Lys

Tyr

Asp

Ser

Ala

Gly

Thr

Asn

305

310

315

320

Leu

Glu

Gly

Lys

Ala

Val

Glu

Ile

Thr

Thr

Leu

Lys

Glu

Leu

Lys

Asp

325

330

335

Ala Leu Lys

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1014 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: 19857 (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: NS1-19857 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7

ATGGATCCAA 60	ACACTGTGTC	AAGCTTTCAG	GTAGATTCCT	TTCTTTGGCA	TGTCCGCAAA
CGAGTTGCAG 120	ACCAAGAACT	AGGTGATGCC	CCATTCCTTG	ATCGGCTTCG	CCGAGATCAG
AAATCCCTAA 180	GAGGAAGGGG	CAGCACTCTT	GGTCTGGACA	TCGAGACAGC	CACACGTGCT
GGAAAGCAGA 240	TAGTGGAGCG	GATTCTGAAA	GAAGAATCCG	ATGAGGCACT	TAAAATGACC
ATGGGAAAGC 300	AAAATGTTAG	CAGCCTTGAC	GAGAAAAACA	GCGTTTCAGT	AGATGTACCT
GGTGGAATGA 360	AAGTTCTTGT	AAGCAAAGAA	AAAAACAAAG	ACGGCAAGTA	CGATCTAATG
GCAACAGTGG 420	ACAACGTTGA	TCTTAAAGGA	ACTTCTGACA	AAAACAATGG	ATCTGGAATA
CTTGAAGGCG 480	TAAAAGCTGA	TAAAAGTAAA	GTAAAATTAA	CAGTTGCTGA	CGATCTAAGC
AAAACCACAC 540	TTGAAGTTTT	AAAAGAAGAT	GGTACAGTAG	TGTCAAGAAA	AGTAACTTCC
AAAGACAAGT 600	CAACAACAGA	AGCAAAATTC	AACGAAAAAG	GTGAATTGTC	TGAAAAAACA
ATGACAAGAG 660	CAAACGGAAC	TACTCTTGAA	TACTCACAAA	TGACAAATGA	AGACAATGCT
GCAAAAGCAG 720	TAGAAACTCT	TAAAAACGGC	ATTAAGTTTG	AAGGAAATCT	CGCAAGTGGA
AAAACAGCAG 780	TGGAAATTAA	AGAAGGCACT	GTTACTCTAA	AAAGAGAAAT	TGATAAAAAT
GGAAAAGTAA 840	CCGTCTCTTT	AAATGACACT	GCATCTGGTT	CTAAAAAAAC	AGCTTCCTGG
CAAGAAAGTA 900	CTAGCACCTT	AACAATTAGT	GCAAACAGCA	AAAAAACTAA	AGATCTAGTG
TTCCTAACAA 960	ACGGTACAAT	TACAGTACAA	AATTATGACT	CAGCTGGCAC	TAAACTTGAA

GGATCAGCAG CTGAAATTAA AAAACTCGAT GAACTTAAAA ACGCTTTAAA ATAA 1014

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 337 aminoâcidos (B) TIPO: aminoâcidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: 19857 (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: NS1-19857 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: . SEQ ID No.8:

Met 1

Asp

Pro Asn

Thr Val Ser 5

Ser

Phe

Gin Val 10

Asp

Ser

Phe

Leu 15

Trp

His

Val

Arg

Lys

Arg

Val

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Gly

Asp

Ala

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Arg

Asp

Gin

Lys

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Gly

Ser

35

40

45

Thr

Leu

Gly

Leu

Asp

Ile

Glu

Thr

Ala

Thr

Arg

Ala

Gly

Lys

Gin

Ile

50

55

60

Val

Glu

Arg

Ile

Leu

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Met

Thr

65

70

75

80

Met

Gly

Lys

Gin

Asn

Val

Ser

Ser

Leu

Asp

Glu

Lys

Asn

Ser

Val

Ser

85

90

95

Val

Asp

Val

Pro

Gly

Gly

Met

Lys

Val

Leu

Val

Ser

Lys

Glu

Lys

Asn

100

105

110

-

Lys

Asp

Gly

Lys

Tyr

Asp

Leu

Met

Ala

Thr

Val

Asp

Asn

Val

Asp

Leu

115

120

125

Lys

Gly

Thr

Ser

Asp

Lys

Asn

Asn

Gly

Ser

Gly

Ile

Leu

Glu

Gly

Val

130

135

140

Lys Ala 145

Asp

Lys

Ser

Lys Vai Lys Leu Thr Vai Ala Asp

Asp Leu

Ser 160

150

155

Lys

Thr

Thr

Leu

Glu

Vai

Leu

Lys

Glu

Asp

Gly

Thr

Val

Val

Ser

Arg

165

170

175

Lys

Vai

Thr

Ser

Lys

Asp

Lys

Ser

Thr

Thr

Glu

Ala

Lys

Phe

Asn

Glu

180

185

190

Lys

Gly

Glu

Leu

Ser

Glu

Lys

Thr

Met

Thr

Arg

Ala

Asn

Gly

Thr

Thr

195

200

205

Leu

Glu

Tyr

Ser

Gin

Met

Thr

Asn

Glu

Asp

Asn

Ala

Ala

Lys

Ala

Val

210

215

220

Glu

Thr

Leu

Lys

Asn

Gly

ile

Lys

Phe

Glu

Gly

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

225

230

235

240

Lys

Thr

Ala

Vai

Glu

Ile

Lys

Glu

Gly

Thr

val

Thr

Leu

Lys

Arg

Glu

245

250

255

Ile

Asp

Lys

Asn

Gly

Lys

Vai

Thr

Vai

Ser

Leu

Asn

Asp

Thr

Ala

Ser

260

265

270

Gly

Ser

Lys

Lys

Thr

Ala

Ser

Trp

Gin

Glu

Ser

Thr

Ser

Thr

Leu

Thr

275

280

285

Ile

Ser

Ala

Asn

Ser

Lys

Lys

Thr

Lys

Asp

Leu

Val

Phe

Leu

Thr

Asn

290

295

300

Gly

Thr

Ile

Thr

Vai

Gin

Asn

Tyr

Asp

Ser

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

305

310

315

320

Gly Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu

325 330 335

Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9:

(i) OARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1017 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: ACA (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: NS1-ACA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

ATGGATCCAA ACACTGTGTC 60

CGAGTTGCAG ACCAAGAACT 120

AAATCCCTAA GAGGAAGGGG 180

GGAAAGCAGA TAGTGGAGCG 240

ATGGGAAAGC AAAATGTTAG 300

GGTGAGATGA AAGTTCTTGT

360

GCAACAGTAG ACAAGATTGA

420

AAGCTTTCAG GTAGATTCCT AGGTGATGCC CCATTCCTTG CAGCACTCTT GGTCTGGACA GATTCTGAAA GAAGAATCCG CAGCCTTGAT GAAAAAAACA AAGTAAAGAA AAAGACAAAG GCTAAAAGGA ACTTCTGATA

TTCTTTGGCA TGTCCGCAAA

ATCGGCTTCG CCGAGATCAG

TCGAGACAGC CACACGTGCT

ATGAGGCACT TAAAATGACC

GCGCTTCAGT AGATTTGCCT

ACGGTAAGTA CAGTCTAAAG

AAGACAATGG TTCTGGAGTG

CTTGAAGGTA 480	CAAAAGATGA	CAAAAGTAAA	GCAAAATTAA	CAATTGCTGA	CGATCTAAGT
AAAACCACAT 540	TCGAACTTTT	CAAAGAAGAT	GGCAAAACAT	TAGTGTCAAG	AAAAGTAAGT
TCTAAAGACA 600	AAACATCAAC	AGATGAAATG	TTCAATGAAA	AAGGTGAATT	GTCTGCAAAA
ACCATGACAA 660	GAGAAAATGG	AACCAAACTT	GAATATACAG	AAATGAAAAG	CGATGGAACC
GGAAAAGCTA 720	AAGAAGTTTT	AAAAAACTTT	ACTCTTGAAG	GAAAAGTAGC	TAATGATAAA
GTAACATTGG 780	AAGTAAAAGA	AGGAACCGTT	ACTTTAAGTA	AGGAAATTGC	AAAATCTGGA
GAAGTAACAG 840	TTGCTCTTAA	TGACACTAAC	ACTACTCAGG	CTACTAAAAA	AACTGGCGCA

TGGGATTCAA AAACTTCTAC TTTAACAATT AGTGTTAACA GCAAAAAAAC TACACAACTT 900

GTGTTTACTA AACAAGACAC AATAACTGTA CAAAAATACG ACTCCGCAGG TACCAATTTA 960

GAAGGCACAG CAGTCGAAAT TAAAACACTT GATGAACTTA AAAACGCTTT AAAATAA 1017 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 338 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(vi)	FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: BORRELIA (B) ESTIRPE: ACAI	BURGDORFERI
(Vii)	FONTE IMEDIATA: (C) CLONE: NS1-ACA1
(xi)	DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA:	SEQ ID NO:10:

Met Asp 1

Pro

Asn Thr Vai Ser Ser Phe Gin

Vai Asp

Ser

Phe

Leu 15

Trp

5

10

His

Vai

Arg

Lys

Arg

Vai

Ala

Asp

Gin

Glu

Leu

Gly

Asp

Ala

Pro

Phe

20

25

30

Leu

Asp

Arg

Leu

Arg

Arg

Asp

Gin

Lys

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Gly

Ser

35

40

45

Thr

Leu

Gly

Leu

Asp

Ile

Glu

Thr

Ala

Thr

Arg

Ala

Gly

Lys

Gin

Ile

50

55

60

Vai

Glu

Arg

Ile

Leu

Lys

Glu

Glu

Ser

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Met

Thr

65

70

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(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 1017 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: ZS7 (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: NS1-ZS7 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

ATGGATCCAA 60	ACACTGTGTC	AAGCTTTCAG	GTAGATTCCT	TTCTTTGGCA	TGTCCGCAAA
CGAGTTGCAG 120	ACCAAGAACT	AGGTGATGCC	CCATTCCTTG	ATCGGCTTCG	CCGAGATCAG
AAATCCCTAA 180	GAGGAAGGGG	CAGCACTCTT	GGTCTGGACA	TCGAGACAGC	CACACGTGCT
GGAAAGCAGA 240	TAGTGGAGCG	GATTCTGAAA	GAAGAATCCG	ATGAGGCACT	TAAAATGACC
ATGGGAAAGC 300	AAAATGTTAG	CAGCCTTGAC	GAGAAAAACA	GCGTTTCAGT	AGATTTGCCT
GGTGAAATGA 360	ACGTTCTTGT	AAGCAAAGAA	AAAAACAAAG	ACGGCAAGTA	CGATCTAATT
GCAACAGTAG 420	ACAAGCTTGA	GCTTAAAGGA	ACTTCTGATA	AAAACAATGG	ATCTGGAGTA

CTTGAAGGCG 480	TAAAAGCTGA	CAAAAGTAAA	GTAAAATTAA	CAATTTCTGA	CGATCTAGGT
CAAACCACAC 540	TTGAAGTTTT	CAAAGAAGAT	GGCAAAACAC	TAGTATCAAA	AAAAGTAACT
TCCAAAGACA 600	AGTCATCAAC	AGAAGAAAAA	TTCAATGAAA	AAGGTGAAGT	ATCTGAAAAA
ATAATAACAA 660	GAGCAGACGG	AACCAGACTT	GAATACACAG	AAATTAAAAG	CGATGGATCT
GGAAAAGCTA 720	AAGAGGTTTT	AAAAAGCTAT	GTTCTTGAAG	GAACTTTAAC	TGCTGAAAAA
ACAACATTGG 780	TGGTTAAAGA	AGGAACTGTT	ACTTTAAGCA	AAAATATTTC	AAAATCTGGG
GAA.GTTTCAG 840	TTGAACTTAA	TGACACTGAC	AGTAGTGCTG	CTACTAAAAA	AACTGCAGCT
TGGAATTCAG 900	GCACTTCAAC	TTTAACAATT	ACTGTAAACA	GTAAAAAAAC	TAAAGACCTT
GTGTTTACAA 960	AAGAAAACAC	AATTACAGTA	CAACAATACG	ACTCAAATGG	CACCAAATTA

GAGGGGTCAG CAGTTGAAAT TACAAAACTT GATGAAATTA AAAACGCTTT AAAATAA 1017

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 338 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FONTE ORIGINAL:

(A) ORGANISMO: BORRELIA BURGDORFERI (B) ESTIRPE: ZS7 (vii) FONTE IMEDIATA:

(C) CLONE: NS1-ZS7 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12:

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TABELA II

Protecção cruzada
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ZS7	NE11H	-
NE11H	NE11H	+
NE11H	ZS7	-
NE11H	20047°	+
NE11H	19857°	+
ZS7	20047°	+
ZS7	19857°	+
Cocktail*	20047°	+
Cocktail*	19857°	+

* incluindo 20047, ZS7 e NE11H;— ° estirpes que apresentaram uma patogenicidade reduzida em testemunhas não protegidas.

TABELA III - Protecção cruzada

soro imune	estirpe	artrite	protecção espir<
transferido	inoculada clínica	histopatologia+
		d23-25p.	i.
-	ZS7	8/8	+	5/7
ZS7	ZS7	0/3	-	0/3
ZS7	NE11H	3/3	+	3/3
ZS7	20047	(2/3)°	+	3/3
B31	ZS7	0/3	-	3/3
-	NE11H	7/7	+	4/5
NE11H	NE11H	(2/6) °	-Λ	0/6
NE11H	ZS7	3/3	+	3/3
NE11H	20047	(2/3)°	+	1/3
ZQ1	ZS7	3/3	+	3/3
-	20047	4/4	+	2/3
Cocktail*	20047	0/3	_ A	1/3
rec.OspA	ZS7	(2/6)°	_ A	5/6
rec.OspA	NE11H	3/3	+	2/3
rec.OspA	20047	(1/3)°	+	0/2
-	SH-2-82	-P5 2/2	+	1/2
rec.OspA	SH-2-82	-P5 (2/3)°	A	0/3
-	21038	(2/2)	+	1/2++
rec.OspA	21038	(2/3)°		0/2

Legenda: tabela III: Protecção cruzada * incluindo organismos B.burgdorferi das estirpes 20047, ZS7 e NE11H;

+ artrite, cardite, hepatite, miosite ⁰ apenas artrite clínica suave ^Λ apenas alterações histopatológicas menores _ recultura ++ espiroquetas não móveis o cr Q < cr

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Lisboa, 14 de Agosto de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3?

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES

   13. - Sequência de DNA codificadora de uma proteína de suoerfície externa (OspA) ou seu derivado, caracterizada por a sequência codificadora da fracção OspA ser substancialmente idêntica à sequência descrita na Sequência ID N2 1 ou 3.

   23. - Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser 90% idêntica à sequência descrita na Sequência ID Ne 1 ou 3.

   3â. - Sequência de DNA codificadora de um derivado de OspA de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por o derivado ser uma proteína de fusão com NS1.

   4a. - Sequência de DNA codificadora de uma proteína OspA, caracterizada por a reacção em cadeia com polimerase ser realizada utilizando iniciadores prOspAl-A4 mas não iniciadores prOsp A1-A2.

   53. - Proteína OspA ou seu derivado, caracterizada por conter uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à sequência descrita em Sequência ID N2 2 ou 4.

   63. - Proteína OspA ou seu derivado, caracterizada por não reagir com o anticorpo monoclonal LA2 mas reagir com o anticorpo monoclonal LA31.

   7â. - Proteína OspA ou seu derivado, caracterizada por ser obtida a partir de B. burqdorferi subgrupo II, III, IV, V ou VI.

   8a. - Derivado de OspA, caracterizado por ser uma proteína de fusão com NS1.

   93. - Proteína de fusão NSl-OspA, caracterizada por a fracção OspA ser seleccionada de um derivado de OspA obtido a partir de B. burgdorferi espécies ZS7, ZQ1, 19857 e ACA I.

   103. - Proteína de fusão NSl-OspA de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada por a parte da proteína OspA estar truncada.

   lia. - Composição de vacina ou diagnóstico, caracterizada por compreender pelo menos duas proteínas OspA ou seus derivados, em que as proteínas OspA ou derivados são de grupos diferentes.

   12a. - Composição de vacina, caracterizada por compreender uma OspA ou seu derivado seleccionada a partrir do grupo I, grupo II, grupo III e grupo IV e uma segunda OspA ou derivado seleccionada do grupo I, grupo II, grupo III e grupo IV desde que a primeira e segunda OspA sejam seleccionadas de um grupo diferente.

   133. - Vacina de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizada por compreender uma OspA ZS7 ou seu derivado numa mistura com um veículo adequado.

   14â. - Composição de vacina, caracterizada preender uma proteína OspA ou derivado de acordo com a cação 5 ou 6 numa mistura com um veículo adequado.

   por comreivindi15â. - Composição de vacina, caracterizada por compreender uma proteína de fusão NSl-OspA misturada com um veículo adequado.

   16^. - Vector, caracterizado por compreender uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 1 a 4.

   17a. - Método para a produção de uma proteína OspA ou seu derivado de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizando por compreender:

   a) a transformação de um hospedeiro com um vector da reivindicação 16;

   b) a expressão da referida proteína ou derivado num hospedeiro adequado;

   c) o isolamento da proteína ou derivado produzido.

   18â. - Método para o tratamento de um mamífero susceptível à infecção por Borrelia, caracterizado por compreender a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de uma proteína ou derivado como aqui reivindicado.

   qga. - Método para o tratamento.de uma mamífero susceptível à infecção por Borrelia, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma vacina como aqui reivindicada.

   203. - proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-10, caracterizada por se destinar à utilização em medicina.
2. 2ia. - Microorganismo, caracterizado por ser B. burqdorferi estirpe ZQ1.