PT1076703E

PT1076703E - ''utilizações terapêuticas de polipéptido homólogos de il-17''

Info

Publication number: PT1076703E
Application number: PT99923088T
Authority: PT
Inventors: Audrey Goddard; Austin L Gurney; William I Wood; Ellen Filvaroff; Jian Chen; Hanzhong Li
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2007-10-10
Also published as: CY1106885T1; US8075888B2; US20020106743A1; IL138930A; WO1999060127A9; EP2333069A2; WO1999060127A3; JP2002515246A; US20120128627A1; CA2328496A1; DE69936382T2; NZ508878A; US20110038868A1; ES2292242T3; EP1076703A2; DK1076703T3; US7115398B2; EP1076703B2; EP1076703B1; US20090022725A1

Description

ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

DESCRIÇÃO

"Utilizações terapêuticas de polipéptido homólogos de IL-17" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se genericamente à identificação e isolamento de ADN, a utilizações terapêuticas e à produção recombinante de novos polipéptidos com identidade de sequência com a citoquina IL-17, e o antigénio 8 associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA-8) aqui designado como polipéptido PR01122.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Foi relatado que a citoquina interleucina 17 (IL-17) estimula células epiteliais, endoteliais e fibroblásticas a segregar citoquinas tais como IL-6, IL-8 e factor estimulante de colónias de granulócitos, assim como prostaglandina E2. Embora a expressão de IL-17 seja restrita a células T activadas, o receptor de IL-17 é amplamente expresso, uma propriedade consistente com as actividades pleiotrópicas de IL-17. Adicionalmente, mostrou-se que quando cultivados na presença de IL-17, os fibroblastos podem sustentar a proliferação de maturação preferencial CD34+ em neutrófilos. Em resultado, a IL-17 podia ser um potenciador precoce ou mesmo um elemento de manutenção da reacção inflamatória dependente de células T e/ou um elemento da rede de citoquinas que faz a ponte entre o sistema imunitário e a hematopoiese. Veja-se, Yao, et ai., J. Immunol., 155(12):5483-5486 (1995);

Fossiez et al.r J. Exp Med., 183(6):2593-2603 (1996);

Kennedy, et al.r J. Interferon Cytokine Res., 16(8):611-617 (1996) .

Mais genericamente, todas as novas proteínas têm interesse. As proteínas extracelulares desempenham um importante papel na formação, diferenciação e manutenção de organismos pluricelulares. O destino de muitas células individuais, e.g., proliferação, migração, diferenciação ou interacção com outras células, é tipicamente governado por informação recebida de outras células e/ou do ambiente imediato. Esta informação é frequentemente transmitida por 2 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ polipéptidos segregados (por exemplo, factores mitogénicos, factores de sobrevivência, factores citotóxicos, factores de diferenciação, neuropéptidos e hormonas) que são, por sua vez, recebidos e interpretados por diversos receptores celulares ou proteínas ligadas a membranas. Estes polipéptidos ou moléculas de sinalização segregados normalmente passam através da via de secreção celular para atingir o seu local de acção no ambiente extracelular.

As proteínas segregadas têm várias aplicações industriais, incluindo como fármacos, produtos de diagnóstico, biossensores e biorreactores. A maior parte dos fármacos proteinicos disponíveis presentemente, tais como agentes trombolíticos, interferões, interleucinas, eritropoietinas, factores estimulantes de colónias e várias outras citoquinas, são proteínas secretórias. Os seus receptores, que são proteínas de membrana, têm também potencial como agentes terapêuticos ou de diagnóstico.

Estão a decorrer esforços, tanto industrial como academicamente, para identificar novas proteínas segregadas nativas. Muitos esforços estão focados na pesquisa de bibliotecas de ADN recombinante de mamífero, para identificar as sequências de codificação para novas proteínas segregadas. Exemplos de métodos e técnicas de pesquisa estão descritos na literatura [veja-se, por exemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 93:7108-7113 (1996); Patente U.S. 5,536,637)]. Os resultados desses esforços estão aqui apresentados. A interleucina-17 é uma citoquina derivada de células T recentemente descrita, cujas funções biológicas estão apenas a começar a ser entendidas. Spriggs et al., J. Clin. Immunol. 17:366 (1997); Broxmeyer, H.E., J. Exp. Med. 183: 2411 (1996). Quando a IL-17 foi inicialmente identificada como um clone de ADNc a partir de um linfoma de células T de roedor, foi reconhecido que possuía uma sequência similar a um quadro de leitura aberto de um herpesvírus de primata, o Herpervirus saimiri Rouvier et al., J. Immunol. 150: 5445 (1993), Yao et al., Immunity 3: 811 (1995) [Yao-1], Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996). Subsequentemente, foi confirmado que esta proteína virai possui muitas, se não todas, as actividades imunoestimulantes encontradas para a IL-17 do ΕΡ 1 076 703/ΡΤ hospedeiro. Fleckenstein e Desrosiers, "Herpesvirus saimiri and herpesvirus ateies," em The Herpesviruses, I.B. Roizman, ed, Plenum Publishing Press, New York, p.253 (1982), Biesinger, B.i. et al., Procl Natl Acad Sei. USA 89: 3116 (1992) . A IL-17 humana é uma proteína homodimérica de 20-30 kDa, ligada por dissulfureto, com glicosilação variável. Yao-1, supra; Fossier et al., supra. É codificada por um quadro de leitura aberto de 155 aminoácidos que inclui uma sequência de sinal de secreção N-terminal de 19-23 aminoácidos. A sequência de aminoácidos de IL-17 é apenas semelhante à proteína de Herpesvirus descrita acima e não apresenta identidade significativa com as sequências de outras citoquinas ou outras proteínas conhecidas. Adicionalmente, o ARNm que codifica IL-17 que foi detectado foi detectado apenas em células T de memória CD4+ activadas e células PBMC estimuladas com PMA/ionomicina.

Apesar da sua restrita distribuição nos tecidos, a IL-17 exibe actividades biológicas pleiotrópicas em vários tipos de células, tais como fibroblastos, células endoteliais e células epiteliais. Spriggs, M.K., supra.; Broxmeyer, H.E., supra. Verificou-se que a IL-17 estimula a produção de muitas citoquinas: TNF-α e IL-Ιβ de macrófagos [Jovanovic et al., J. Immunol. 160: 3513 (1998)]; IL-6, IL-8 e a molécula de adesão intracelular (ICAM-1) de fibroblastos humanos. Fossiez et al., supra, Yao et al., J. Immunol. 155: 5483 (1995) [Yao-2] ; factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSM) e prostaglandina (PGE-2) de sinoviócitos, Fossiez et al., supra. Através da indução de várias citoquinas, a IL-17 é capaz de mediar uma ampla gama de respostas, principalmente a pró-inflamatória e a hematopoiética. Isto conduziu à sugestão de que a IL-17 pode desempenhar um papel crucial na iniciação ou sustentação de uma resposta inflamatória. Jovanovic et al., supra.

Em consistência com a ampla gama de efeitos da IL-17, verificou-se que o receptor da superfície celular para a IL-17 é amplamente expresso em muitos tecidos e tipos celulares, Yao et al., Cytokine 9: 794 (1997) [Yao-3]. Embora a sequência de aminoácidos do receptor da hIL-17 (866 a.a.) preveja uma 4 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ proteína com um único domínio transmembranar e um domínio intracelular longo de 525 aminoácidos, a sequência do receptor é única e não é semelhante à de nenhum dos receptores da família de receptores de citoquinas/factores de crescimento. Isto, juntamente com a ausência de semelhança da própria IL-17 com outras proteínas conhecidas, indica que a IL-17 e o seu receptor podem fazer parte de uma nova família de proteínas de sinalização e receptores.

Mostrou-se ainda, por sinalização intracelular, que a IL-17, estimula o influxo transiente de Ca2+ e uma redução em [AMP c] i em macrófagos humanos. Jovanovic et al., supra. Fibroblastos e macrófagos tratados com IL-17 induzem a activação de NF-κΒ, Yao-1, supra, Jovanovic et al., supra., enquanto macrófagos com ela tratados activam NF-κΒ e proteína-quinases activadas por mitogénios. Shalom-Barek et al., J Biol. Chem, 273: 27467 (1998). A presente descrição descreve a clonagem e a caracterização de duas novas proteínas, denominadas PRO1031 (IL-I7B) e PR01122 (IL-17C), e suas variantes activas, que são semelhantes em sequência de aminoácidos à IL-17. A invenção relaciona-se com esta última, PR01122 IL-17C. W099/61617, que é relevante para a avaliação apenas da novidade, relaciona-se também com a mesma proteína, aí designada por IL-21.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os Requerentes identificaram um clone de ADNc que codifica um novo polipéptido possuindo identidade de sequência com IL-17, em que o polipéptido é designado no presente pedido de patente por PR01122".

Um aspecto da invenção, tal como definido nas reivindicações refere-se à utilização de um polipéptido PR01122 isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência, mais preferivelmente cerca de 82% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência, ainda mais 5 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a sequência de resíduos de aminoácido de cerca de 1 ou cerca de 19 a cerca de 197, inclusive, da Figura 3 (SEQ ID NO:3). Num aspecto preferido, o polipéptido compreende os resíduos de aminoácido de cerca de 1 ou cerca de 19 a cerca de 197, inclusive, da

Figura 3 (SEQ ID NO:3).

Num outro aspecto, tal como definido nas reivindicações, a invenção refere-se à utilização de um polipéptido PR01122 isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência, ainda mais 6 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 93% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 94% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com os aminoácidos codificados pelo ADNc de proteína humana depositado na ATCC em 22 Dezembro de 1998 com o número de depósito ATCC 203552.

Numa concretização preferida, o polipéptido PR01122 é obtido ou obtenível por expressão do polipéptido codificado pela inserção de ADNc do vector depositado em 22 de Dezembro de 1998 com o número de depósito na ATCC 203552 (DNA62377-1381-1).

Num aspecto especifico, a invenção utiliza um polipéptido PR01122 isolado sem a metionina de iniciação e/ou a sequência de sinal do terminal N. Processos para a produção do mesmo são também aqui descritos, sendo que esses processos compreendem a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um vector que compreende a molécula de ácido nucleico codificante apropriada sob condições adequadas para a expressão do polipéptido PR01122 e a recuperação do polipéptido PR01122 a partir da cultura celular.

Ainda noutra concretização, como definido nas reivindicações, a invenção refere-se a antaqonistas de um polipéptido PR01122 nativo. Num aspecto particular, o antaqonista é um anticorpo anti-PROH22.

Ainda numa outra concretização, como definido nas reivindicações, a invenção refere-se a uma composição compreendendo um antagonista do polipéptido PR01122 como atrás 7 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ definido, em combinação com um transportador. Preferivelmente, o transportador é farmaceuticamente aceitável.

Ainda numa outra concretização, como definido nas reivindicações, a invenção refere-se à utilização de um polipéptido PR01122, ou um seu antagonista como atrás descrito, que pode ser um anticorpo anti-PR01122), para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma condição que é responsiva ao polipéptido PR01122 ou um seu agonista ou antagonista (e.g., anti-PR01122). Num aspecto particular, a invenção refere-se à utilização de um polipéptido PR01122, ou um seu antagonista, num método para o tratamento de uma desordem cartilaginosa degenerativa.

Ainda numa outra concretização, a invenção refere-se a moléculas antagonistas de PR01122.

Em ainda outra concretização, como definido nas reivindicações, a invenção refere-se a uma composição terapêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PR01122 em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:l) derivada dos nucleótidos 42-581 de SEQ ID NO:2. Mostram-se igualmente na Figura 1 o péptido de sinal, um local de N-glicosilação, uma região possuindo identidade de sequência com IL-17, o peso molecular, e o pi aproximado. A Figura 2 mostra uma sequência nucleotidica (SEQ ID NO:2) contendo a sequência nucleotidica de um ADNc de PRO1031 de sequência nativa (nucleótidos 42-581 de SEQ ID NO:2), em que a sequência nucleotidica (SEQ ID NO:2) é um clone aqui designado por "UNQ516" e/ou "DNA59294-1381". A Figura 3 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:3) derivada dos nucleótidos 50-640 de SEQ ID NO:4. Mostram-se igualmente as localizações aproximadas do péptido de sinal, um padrão "fecho-de-correr" de leucinas numa região 8 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ possuindo identidade de sequência com IL-17. Mostram-se também o peso aproximado em daltons, e o pi aproximado. A Figura 4 mostra uma sequência nucleotidica (SEQ id NO:4) contendo a sequência nucleotidica de um ADNc de PR01122 de sequência nativa (nucleótidos 50-640 de SEQ ID NO:l), em que a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 4) é um clone aqui designado por "UNQ561" e/ou "DNA62377-1381-1". Mostram-se também a sequência complementar e sequências de aminoácidos deduzidas. A Figura 5 mostra o DNA47332 (SEQ ID NO:5), um fragmento de ADN virtual utilizado no isolamento de DNA59294 (SEQ ID NO:2). A Figura 6 mostra o DNA49665 (Incyte EST 1347523) (SEQ ID NO:7), um fragmento virtual utilizado no isolamento de DNA62377 (SEQ ID NO:4). A Figura 7A mostra um alinhamento entre as sequências de proteina codificadas por DNA59624 (IL17-B) (SEQ ID NO:l), DNA62377 (IL17-C) (SEQ ID NO:3) e IL-17 (SEQ ID NO:ll). As sequências de sinal putativas estão sublinhadas, os potenciais locais de glicosilação ligada a N têm duplo sublinhado e os resíduos de triptofano e cisteína conservados estão marcados com asteriscos. As IL-17, IL-17B e IL-17C partilham 26-28% de identidade de aminoácidos com entre si. A Figura 7B mostra um alinhamento entre apenas as proteínas codificadas a partir de DNA59624 (SEQ ID NO:l) e de DNA62377 (SEQ ID NO:3). A Figura 8 é uma análise de transferência de ARN de IL-17B (UNQ516)(SEQ ID NO:1). O Northern blot representa o ARNm de tecidos humanos (Clontech) hibridado com uma sonda radiomarcada específica para IL17B humana como descrito no Exemplo 8. Mostram-se à esquerda marcadores de tamanho de ARN. Uma nova hibridação do mesmo material da transferência com uma sonda de ADNc de β-actina humana é mostrada no fundo.

As Figuras 9A-9B representam gráficos de barras que representam as actividades biológicas de IL17 (SEQ ID NO:ll), IL17B (UNQ516) (SEQ ID NO:1) e IL17C (UNQ561)(SEQ ID NO:3). A Figura 9A mostra células fibroblastos de prepúcio humano (HFF) 9 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ cultivadas com proteína de fusão com Fc de controlo, IL-17, IL-17B.FC (SEQ ID NO:12) ou IL-17C.FC (SEQ ID NO:13) a 100 ng/ml durante 18 horas e os meios condicionados foram ensaiados quanto a IL-6 (SEQ ID NO:14) como descrito no Exemplo 10. A Figura 9B mostra a linha celular leucémica humana, THPl, que foi tratada com as mesmas citoquinas (100 ng/ml) que acima sob as mesmas condições, em que os sobrenadantes foram ensaiados quanto ao nível de libertação de TNF-α. Os resultados são expressos como a media +/- ep de determinações em triplicado a partir de uma experiência representativa. A Figura 10 representa no decorrer de tempo, a dependência da libertação activada por IL17B e IL17C de TNF-a por células THPl. Na Figura 10A, as células THPl foram incubadas com 100 ng/ml (2,2 nM) de IL17B.FC (SEQ ID NO:12) ou IL17C.FC (SEQ ID NO:13) durante 0,5 a 32 horas, os meios condicionados foram recolhidos, e a concentração de TNF-α foi quantificada como descrito no Exemplo 10. Na Figura 10B, as células THPl foram tratadas com a IL-17B.Fc e a IL-17C.Fc numa gama de concentrações de 0 a 120 nM durante 18 horas e foi determinada a libertação de TNF-a. A Figura 11 é uma imunoprecipitação de ECD de IL-17R (SEQ ID NO: 15) com IL-17 (SEQ ID NO:ll), IL17B (SEQ ID NO:l) e IL-17C (SEQ ID NO: 3) . O ECD do receptor de IL-17 marcado com His foi expresso em células 293 e metabolicamente marcado com 35S como descrito no Exemplo 11. Recuperou-se o sobrenadante, e utilizaram-se contas de Ni-NTA para precipitar por afinidade o ECD de IL-17R marcado com His (SEQ ID NO:15) no sobrenadante (pista 1). Na Figura 11A, incubaram-se IL-17 (SEQ ID NO:ll), IL-17B.FC (SEQ ID NO:12) e IL-17C.FC (SEQ ID NO:13), OU proteínas de fusão com Fc de controlo, com o sobrenadante e adicionaram-se contas de proteína-A-agarose para precipitar as proteínas de fusão com Fc. Para a reacção de imunoprecipitação da IL-17, incluíram-se anticorpos anti-IL-17. A Figura 11B mostra os resultados de uma experiência de ligação competitiva, em que a imunoprecipitação de ECD de IL-17R (SEQ ID NO:22) pela IL-17 (SEQ ID NO:ll) foi realizada na presença de um excesso de cinco vezes de lL-17B.his (SEQ ID NO:23) e proteínas de controlo marcadas com His. Os precipitados em ambas as Figura 11A e Figura 11B foram analisados por 10 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ electroforese sobre géis de NuPAGE (4-12% de Bis-Tris) . Os marcadores de peso molecular estão indicados à esquerda de cada painel. A Figura 12 mostra a análise FACS da ligação de IL-17B.Fc (SEQ ID NO:12) e IL-17C.FC (SEQ ID NO:13) as células THP-1. As células THP-1 foram incubadas com IL-17B.FC (A) ou IL-17C.Fc (B) ou proteínas de fusão com Fc de controlo em PBS (soro de cavalo a 5%) e seguiu-se a adição de anticorpos secundários anti-Fc conjugados com FITC. A Figura 13 mostra o efeito de IL-17 (SEQ ID NO:ll) sobre a cartilagem articular. Cultivaram-se explantes de cartilagem com a concentração indicada de IL-17 sozinha (cheio) ou na presença de IL-Ια na concentração indicada (tracejado) (SEQ ID NO:25) ou ILlra (antagonista de receptor de IL-1, R&D Systems, 1 pg/ml) (SEQ ID NO:26) durante 72 horas. A libertação de proteoglicanos (PG) para o meio (painel superior) indica a quebra da matriz. A síntese de matriz foi determinada por incorporação de 35S-sulfato no tecido (painel inferior) . A Figura 14 mostra o efeito de IL-17 (SEQ ID NO:11) sobre a libertação de óxido nítrico. Trataram-se explantes com IL-17 (10 ng/ml) sozinho (colunas da esquerda) ou na presença de IL-la (10 ng/ml) (SEQ ID NO:25) (colunas da direita). Após 48 horas, ensaiaram-se os meios quanto à concentração de nitrito. A Figura 15 mostra o efeito de NO sobre alterações no metabolismo da matriz induzidas por IL-17. Trataram-se explantes com IL-17 (5 ng/ml) (SEQ ID NO:ll) sozinha (+) ou com um inibidor irreversível de óxido nítrico-sintase, NOS (L-NIO, Caymen Chemical, 0,5mM). Após 72 horas de tratamento, ensaiaram-se os meios quanto a (A) nitrito e (B) proteoglicanos (PG). (C) A síntese de proteoglicano foi determinada por incorporação de 35S-sulfato no tecido. A Figura 16 mostra o efeito da inibição de NO sobre alterações no metabolismo dos proteoglicanos (PG) induzidas por IL-Ια. Trataram-se explantes de cartilagem articular com IL-la (5 ng/ml) (SEQ ID NO:25) sozinha ( + ) ou com inibidores de NOS (L-NIO ou L-NIL) (L-NIL, inibidor reversível de NOS, 11 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Caymen Chemical) ou IL-lra (antagonista de receptor de IL-1, R&D Systems, 1 pg/ml) (SEQ ID NO:26). Após 72 horas de tratamento, os meios foram ensaiados quanto a (A) concentração de nitrito e (B) quantidade de proteoglicanos. (C) A síntese de matriz foi determinada por incorporação de 35S-sulfato no tecido. A Figura 17 mostra o efeito de UNQ516 (SEQ ID NO:l) sobre a cartilagem articular. Trataram-se explantes com UNQ561 a 1% ou 0,1% na ausência (3 colunas mais à esquerda) ou na presença (três colunas mais à direita) de IL-Ια (SEQ ID NO:25) a 10 ng/ml, e a síntese de proteoglicano (PG) e a produção de nitrito foram determinadas como descrito no Exemplo 16. A Figura 18 mostra o efeito de UNQ561 (SEQ ID NO:3) sobre a cartilagem articular. Trataram-se explantes com LTNQ561 a 1% ou 0,1% na ausência (três colunas mais à esquerda) ou na presença (três colunas mais à direita) de IL-la (+) (10 ng/ml) (SEQ ID NO:25). A libertação e a síntese de proteoglicano (PG) estão apresentadas como a quantidade acima do controlo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS I. Definições

Os termos "polipéptido PR01122" e "PR01122", quando aqui se utilizam abrangem o PR01122 de sequência nativa e suas variantes polipeptídicas (que são adicionalmente aqui definidas). O polipéptido PR01122 pode ser isolado de várias fontes, tais como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos.

Um "polipéptido PR01122 de sequência nativa" compreende um polipéptido possuindo a mesma sequência de aminoácidos que um polipéptido PR01122 derivado da natureza. Este polipéptido PR01122 de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meios recombinantes ou sintéticos. A expressão "polipéptido PR01122 de sequência nativa" abrange especificamente formas de ocorrência natural segregadas ou truncadas de um polipéptido PR01122 (e.g., formas solúveis contendo, por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (e.g., formas de 12 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ splicing alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural de um polipéptido PR01122.

Numa concretização da invenção, o polipéptido PR01122 de sequência nativa que é utilizado é um polipéptido PR01122 de sequência nativa de comprimento completo ou maduro compreendendo os aminoácidos 1 ou 19 a 197 da Figura 3 (SEQ ID NO:3). Igualmente, embora o polipéptido PR01122 descrito na Figura 3 (i.e., UNQ561), seja mostrado como principiando com um residuo de metionina designado como posição de aminoácido 1, é conceptivel e possível que outro resíduo de metionina localizado quer a montante quer a jusante da posição de aminoácido 1 na Figura 3 possa ser empregue como resíduo de aminoácido de partida. O termo "UNQ561" refere-se à proteína PR01122 de sequência nativa específica representada na Figura 3.

Opcionalmente, o polipéptido PR01122 é obtido ou obtenível por expressão do polipéptido codificado pela inserção de adnc do vector DNA62377-1381-1, com o número de depósito na ATCC 203552. "Variante de PR01122" significa um polipéptido PR01122 "activo" tal como definido adiante possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com o polipéptido PR01122 possuindo a sequência de aminoácidos deduzida dos resíduos 1 ou cerca de 19 a 197 apresentada na Figura 3 (SEQ ID NO:3), para um polipéptido PR01122 de sequência nativa maduro ou de comprimento completo. Estas variantes de polipéptido PR01122 incluem, por exemplo, polipéptidos PR01122, em que um ou mais resíduos de aminoácido foram adicionados, substituídos ou eliminados, no terminal N ou C ou no interior da sequência da Figura 3 (SEQ ID NO:3). Normalmente, uma variante de polipéptido PR01122 terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, preferivelmente pelo menos cerca de 81% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 82% de identidade de sequência de aminoácidos, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 83% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 84% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência, ainda mais 13 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ preferivelmente pelo menos cerca de 86% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 87% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 88% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 89% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 91% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 92% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 96% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 97% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% de identidade de sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da Figura 3 (SEQ ID NO:3), com ou sem o péptido de sinal (e.g., com os resíduos de aminoácido 1 a 197 do péptido de sinal de SEQ ID NO:3, sem o péptido de sinal de cerca de 19 a 197 de SEQ id NO:3) . As variantes aqui proporcionadas excluem as sequências de PR01122 de sequência nativa assim como os polipéptidos e ácidos nucleicos aqui descritos com os quais os polipéptidos PR01122 partilham 100% de identidade e/ou que são já conhecidos na especialidade. A "percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências de aminoácidos de PR01122 identificadas aqui define-se como a percentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência de um polipéptido PR01122, após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, se necessário, para se conseguir a máxima percentagem de identidade de sequências, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias maneiras que fazem parte das qualificações do perito na especialidade, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao público tal com os programas ALIGN, ALIGN-2, Megalign (DNASTAR)ou BLAST (e.g., Blast, Blast-2, WU-Blast-2). Os peritos na especialidade podem determinar os parâmetros apropriados para a medição do alinhamento, incluindo quaisquer 14 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ algoritmos necessários para se conseguir o alinhamento máximo ao longo da totalidade do comprimento das sequências que se estão a comparar. Por exemplo, os valores de % de identidade aqui utilizados são gerados utilizando WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996). A maioria dos parâmetros de busca de WU-BLAST-2 estão estabelecidos nos valores por defeito. Os valores que não estão estabelecidos nos valores por defeito, í.e., os parâmetros ajustáveis, são estabelecidos nos seguintes valores: "overlap span = 1", "overlap fraction = 0.125", "word threshold (T) = 11", e "scoring matrix = BLOSUM 62". Para os presentes fins, um valor de % aminoácido identidade de sequência de aminoácidos é determinado dividindo (a) o número de residuos de aminoácido com correspondência idêntica entre a sequência de aminoácidos do polipéptido PR01122 de interesse e a sequência de aminoácidos de comparação de interesse (í.e., a sequência contra a qual o polipéptido PR01122 de interesse está a ser comparado) como determinado por WU-BLAST-2, por (b) o número total de residuos de aminoácido do polipéptido PRO 1122 de interesse. "Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipéptidos aqui revelados, significa um polipéptido que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Preferivelmente, o polipéptido isolado está isento de associação com todos os componentes com os quais está naturalmente associado. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderiam tipicamente interferir com utilizações terapêuticas ou de diagnóstico, do polipéptido, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 residuos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interna utilizando um sequenciador de copo giratório, ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições não redutoras ou redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou, preferivelmente, com prata. O polipéptido isolado inclui o polipéptido in situ no interior de células recombinantes, pois pelo menos um componente do ambiente natural do polipéptido PR01122 não estará presente. Normalmente, contudo, o 15 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ polipéptido isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação ligada operativamente num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucariotas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores.

Um ácido nucleico está "ligado operativamente" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou comando de secreção está ligado operativamente a um ADN para um polipéptido se for expresso na forma de uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou um potenciador estão ligados operativamente a uma sequência de codificação se afectam a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está ligado operativamente a uma sequência de codificação se estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligado operativamente" significa que as sequências de ADN a ligar são contíguas, e, no caso de um comando de secreção, contíguas e em fase de leitura. Contudo, os potenciadores não têm que ser contíguos. A ligação é conseguida por ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existirem, utilizam-se adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional. O grau de "rigor" das reacções de hibridação é prontamente determinável por um perito na especialidade, e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, da temperatura de lavagem e da concentração salina. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas mais elevadas para uma hibridação correcta, enquanto as sondas curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridação geralmente depende da capacidade do ADN desnaturado para voltar a hibridar quando estão presentes cadeias complementares num ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejado entre a sonda 16 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ e a sequência hibridável, mais elevada a temperatura relativa que se pode utilizar. Em resultado, segue-se que temperaturas relativas mais elevadas tenderão a tornar as reacções mais rigorosas, enquanto temperaturas mais baixas, menos rigorosas. Para detalhes e explicações adicionais sobre o rigor de reacções de hibridação, veja-se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condições rigorosas" ou "condições muito rigorosas", como aqui se define, podem ser identificadas como aquelas que: (1) empregam baixa força iónica e temperatura elevada para a lavagem, por exemplo cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecilsulfato de sódio a 0,1%, a 50°C; (2) empregam durante a hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina sérica bovina a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão de fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida a 50%, SSC 5x (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0, 075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, solução de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmão tratado com ultra-sons (50 pg/ml), SDS a 0,1%, e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com lavagens a 42°C com SSC 0,2x (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55°C, seguidas por uma lavagem muito rigorosa consistindo em SSC 0,lx contendo EDTA a 55°C. "Condições moderadamente rigorosas" podem ser identificadas como descrito por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem a utilização de solução de lavagem e condições de hibridação (e.g., temperatura, força iónica e % de SDS) menos rigorosas do que as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é a incubação durante a noite a 37°C numa solução compreendendo: formamida a 20%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, sulfato de dextrano a 10%, e ADN de esperma de salmão desnaturado por corte a 20 mg/ml, seguida de lavagem dos filtros com SSC lx a cerca de 37-50°C. O perito saberá como ajustar a temperatura, 17 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ a força iónica, etc. conforme necessário para acomodar factores como o comprimento da sonda e semelhantes. A expressão "marcado com epítopo", quando aqui se utiliza, refere-se a um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido PR01122 ou um seu domínio, fundido com um "polipéptido marcador". O polipéptido marcador possui resíduos suficientes para proporcionar um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser criado, ou que pode ser identificado por qualquer outro agente, e no entanto é suficientemente curto para não interferir com a actividade do polipéptido PR01122. O polipéptido marcador preferivelmente também é francamente único de modo a que o anticorpo não reaja de modo cruzado substancialmente com outros epítopos. Os polipéptidos marcadores adequados geralmente possuem pelo menos seis resíduos de aminoácido e usualmente entre cerca de 8 e cerca de 50 resíduos de aminoácido (preferivelmente, entre cerca de 10 e cerca de 20 resíduos).

Como aqui se utiliza, o termo "imunoadesina" designa moléculas semelhantes a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efectoras de domínios constantes de imunoglobulinas. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma sequência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada que é outra que não o reconhecimento do antigénio e o local de ligação de um anticorpo (í.e., é "heterólogo"), e uma sequência de domínio constante de imunoglobulina. A parte adesina de uma molécula de imunoadesina tipicamente é uma sequência de aminoácidos contígua compreendendo pelo menos o local de ligação de um receptor ou um ligando. A sequência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG-1, lgG-2, lgG-3 ou lgG-4, igA (incluindo lgA-1 e IgA-2), IgE, igD ou IgM. O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e cobre especificamente anticorpos monoclonais únicos anti-polipéptido PR01122 (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes), anti-PR01122, composições de anticorpos com especificidades poliepitópica, anticorpos anti- 18 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ PR01122 de cadeia simples, e fragmentos de anticorpos anti-PR01122. A expressão "anticorpo monoclonal", como aqui se utiliza, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, í.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades minoritárias. "Activo" ou "actividade", para os presentes fins, referem-se a forma(s) de PR01122 que retêm as actividades biológica e/ou imunológica do polipéptido PR01122 nativo ou de ocorrência natural. Mais elaborado, actividade "biológica" refere-se a uma função biológica (quer inibidora, quer estimulante) causada por um PR01122 nativo ou de ocorrência natural, outra que não a capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigénico em posse de um PR01122 nativo ou de ocorrência natural e uma actividade "imunológica" refere-se apenas à capacidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigénico em posse de um PR01122 nativo ou de ocorrência natural. Uma actividade biológica preferida inclui, por exemplo, a libertação de TNF-a por células THPl. "Desordem cartilaginosa degenerativa" descreve um hospedeiro de desordens que se caracterizam principalmente pela destruição da matriz de cartilagem. Patologias adicionais incluem produção de óxido nítrico e quebra elevada de proteoglicano. Desordens exemplificativas abrangidas nesta definição incluem, por exemplo, artrite (e.g., osteoartrite, artrite reumatóide, artrite psoriásica), sépsia, colite ulcerativa, psoríase, esclerose múltipla, diabetes do tipo I, artrite de células gigantes, lúpus eritematoso sistémico e síndrome de Sjõgren. O termo "antagonista" é utilizado no sentido mais lato, e inclui qualquer molécula que parcial ou completamente bloqueia, inibe ou neutraliza uma actividade biológica de um polipéptido PR01122 nativo aqui revelado. De maneira similar, o termo "agonista" é utilizado no sentido mais lato e inclui qualquer molécula que imite uma actividade biológica de um polipéptido PR01122 nativo aqui revelado. As moléculas de agonistas ou antagonistas adequadas incluem especificamente 19 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ anticorpos agonistas ou antagonistas ou fragmentos de anticorpos, fragmentos ou variantes de sequências de aminoácidos de polipéptidos PR01122 nativos, péptidos, moléculas orgânicas pequenas, etc. Os métodos para a identificação de agonistas ou antagonistas de um polipéptido PR01122 podem compreender o contacto de um polipéptido PR01122 com uma molécula agonista ou antagonista candidata e a medição de uma alteração detectável numa ou mais actividades biológicas normalmente associadas ao polipéptido PR01122. "Anticorpos" (Ab) e "imunoglobulinas" (Ig) são glicoproteinas possuindo as mesmas caracteristicas estruturais. Enquanto os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antigénio especifico, as imunoglobulinas incluem tanto os anticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpos que não têm especificidade antigénica. Os polipéptidos deste ultimo tipo são, por exemplo, produzido em baixos niveis pelo sistema linfático e em níveis aumentados por mielomas. O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e cobre especificamente, sem limitação, anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (e.g. anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos, e fragmentos de anticorpo desde que exibam a actividade biológica desejada.

Os termos "tratar", "tratamento" e "terapia", como aqui utilizados, referem-se a terapia curativa, terapia profiláctica e terapia preventiva. Um exemplo de "terapia preventiva" é a prevenção ou diminuição da condição ou desordem patológicas alvo. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a desordem assim como aqueles que são propensos a ter a desordem ou aqueles em quem se pretende prevenir a desordem.

Administração "crónica" refere-se à administração do(s) agente (s) num modo contínuo, em oposição a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico (actividade) inicial durante um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é o tratamento que não é realizado consecutivamente, sem interrupção, mas é em vez disso de natureza cíclica. 20 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ Ο termo "mamífero", como aqui utilizado, refere-se a qualquer mamífero classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de criação, e animais de zoológico, de desporto ou de companhia, tais como gado bovino (e.g. vacas), cavalos, cães, ovelhas, porcos, coelhos, cabras, gatos, etc. Numa concretização preferida da invenção, o mamífero é o ser humano.

Administração "em combinação com" um ou mais outros agentes terapêuticos inclui a administração simultânea (em co-corrente) e consecutiva em qualquer ordem.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade mínima de agente activo (e.g., PR01122, um seu antagonista ou agonista) que é necessária para conferir um beneficio terapêutico a um mamífero. Por exemplo, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para um mamífero que sofre ou é propenso a sofrer, ou para prevenir que sofra, uma desordem cartilaginosa degenerativa, é uma quantidade tal que induza, melhore ou de outro modo cause uma melhoria dos sintomas patológicos, progressão da doença, das condições fisiológicas associadas com, ou resistência a sucumbir à desordem caracterizada principalmente pela destruição da matriz de cartilagem. "Transportadores", como aqui se utiliza, incluem transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a célula ou o mamífero que estão a ser a eles expostos, nas dosagens e concentrações empregues. Frequentemente, o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Os exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; aldóis 21 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; e/ou tensioactivos não iónicos tais como TWEEN®, polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™. "Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente a região variável ou de ligação ao antigénio do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al., Protein Engin, 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão por papaina de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antigénio idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antigénio, e um fragmento residual "Fc", uma designação que reflecte a capacidade para cristalizar prontamente. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com antigénio e é ainda capaz de ligar de modo cruzado o antigénio. "Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um local de reconhecimento e ligação ao antigénio completo. Esta região consiste num dimero de um domínio variável da cadeia leve e um da pesada em forte associação não covalente. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variável interactuam para definir um local de ligação ao antigénio sobre a superfície do dimero VH-VL. Colectivamente, as seis CDR conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antigénio. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antigénio, embora com menor afinidade do que o local de ligação completo. O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CHI) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fv pela adição de alguns resíduos no terminal carboxi do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para um Fab' em que o(s) resíduo (s) de cisteína dos domínios 22 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ constantes são portadores de um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 originalmente eram produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que possuem cisteinas de charneira entre si. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2.

Os fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "sFv" compreendem os domínios de anticorpo VH e VL, em que esses domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. Preferivelmente, o polipéptido Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de sFv, veja-se Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigénio, fragmentos estes que compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL) . Utilizando um ligante que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antigénio. Os diacorpos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404 097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993). 23 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Um anticorpo "isolado" é um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com as utilizações em diagnóstico ou terapêuticas do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e o mais preferivelmente mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminais ou internos utilizando um sequenciador de copo giratório; ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando coloração com azul de Coomassie ou, preferivelmente, com prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ no interior de células recombinantes pois pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, contudo, um anticorpo isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação. A palavra "marcador", quando aqui utilizada, refere-se a um composto ou composição detectáveis que são conjugados directa ou indirectamente ao anticorpo de modo a gerar um anticorpo "marcado". O marcador pode ser detectável por si próprio (e.g. marcadores radioisotópicos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável. "Fase sólida" pretende significar uma matriz não aquosa à qual o anticorpo da presente invenção pode aderir. Os exemplos de fases sólidas aqui abrangidas incluem as que são formadas parcial ou totalmente por vidro (e.g., vidro de poro controlado), polissacáridos (e.g., agarose), poliacrilamidas, poliestireno, poli(álcool vinílico) e silicones. Em certas concretizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode constituir o poço de uma placa de ensaio; em outras é uma coluna de purificação (e.g., uma coluna de cromatografia de afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas discretas, como as descritas na Patente U.S. 4,275,149. 24 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lípidos, fosfolípidos e/ou tensioactivos que é útil para a entrega de um fármaco (tal como um polipéptido PR01122 ou um seu anticorpo) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são vulgarmente dispostos numa conformação em bicamada, similar ao arranjo lipídico das membranas biológicas.

Uma "molécula pequena" é definida aqui como possuindo um peso molecular abaixo de cerca de 500 Daltons. O termo "modular" significa afectar (e.g., quer supra-regular, infra-regular ou de outro modo controlar) o nível de uma via de sinalização. Os processos celulares sob o controlo de transdução de sinal incluem, mas não se lhes limitam, a transcrição de genes específicos, funções celulares normais, tais como metabolismo, proliferação, diferenciação, adesão, apoptose e sobrevivência, assim como processos anormais, tais como transformação, bloqueio de diferenciação e metástase. II. Composições e Métodos da Invenção A. Polipéptido PRQ1122 de Comprimento Completo A presente invenção identifica e isola sequências nucleotídicas que codificam polipéptidos referidos no presente pedido de patente como PR01122. Em particular, os Requentes identificaram e isolaram ADNc que codifica um polipéptido PRO1031 (e.g., UNQ516, IL-17B, SEQ ID NO:l) e PR01122 (e.g., UNQ561, IL-17C, SEQ ID NO:3), como revelado com mais detalhes nos Exemplos seguintes. Utilizando os programas de computador para alinhamento de sequências BLAST e FastA, os Requerentes verificaram que várias porções dos polipéptidos PRO1031 e PR01122 possuem identidade de sequência com IL-17. Assim, crê-se presentemente que os polipéptidos PRO1031 e PR01122 revelados no presente pedido de patente são membros pela primeira vez identificados da família das citoquinas e assim podem estar envolvidos na inflamação e/ou na função do sistema imunitário. Este último constitui o objecto da invenção.

Como apresentado anteriormente, o termo "PR01122" refere-se à sequência nativa e variantes, enquanto o termo 25 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ "UNQ561" se refere à sequência de aminoácidos específica da Figura 3 (SEQ ID NO:3) e/ou a proteínas codificadas pelo ADNc depositado na American Type Culture Collection, com o número de Depósito 203552.

Como se revela nos Exemplos adiante, o clone de ADNc aqui designado por DNA62377-1381-1 foi depositado na ATCC. A sequência de nucleótidos real do clones pode ser prontamente determinada por um perito por sequenciação do clone depositado utilizando métodos de rotina na especialidade. A sequência de aminoácidos prevista pode ser determinada a partir da sequência de nucleótidos utilizando conhecimentos de rotina. Para o polipéptido PR01122 e o ácido nucleico de codificação aqui descritos, os Requerentes identificaram o que se crê ser o quadro de leitura mais bem identificável com a informação sobre a sequência disponível na altura. B. Variantes de PRO 1122

Em adição ao polipéptido PR01122 de sequência nativa de comprimento completo aqui descrito, está contemplado que possam ser preparadas variantes de PR01122. As variantes de PR01122 podem ser preparadas introduzindo alterações de nucleótidos apropriadas no ADN que codifica o PR01122, ou através de síntese do polipéptido PR01122 desejado. Os peritos na especialidade notarão que alterações de aminoácidos podem alterar processos pós-tradução do polipéptido PR01122, tais como a alteração do número ou da posição de locais de glicosilação ou a alteração de características de ancoragem à membrana.

Variações no PR01122 de sequência nativa de comprimento completo ou em vários domínios do polipéptido PR01122 aqui descritos, podem ser feitas, por exemplo, utilizando quaisquer das técnicas e directrizes para mutações conservativas e não conservativas estabelecidas, por exemplo, na Patente U.S. 5,364,934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais codões que codificam o polipéptido PR01122 que resultam numa alteração na sequência de aminoácidos do polipéptido PR01122 comparativamente com a do PR01122 de sequência nativa. Opcionalmente, a variação é efectuada por substituição de pelo menos um aminoácido por 26 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ qualquer outro aminoácido num ou mais dos domínios do polipéptido PR01122. Directrizes para a determinação de que resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou eliminado sem afectar adversamente a actividade desejada, podem ser encontradas comparando a sequência do polipéptido PR01122 com a de moléculas de proteína homólogas conhecidas e minimizando o número de alterações na sequência de aminoácidos efectuadas em regiões de homologia elevada. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado da substituição de um aminoácido por outro aminoácido possuindo propriedades estruturais e/ou químicas similares, tais como a substituição de uma leucina por uma serina, i.e., substituições conservativas de aminoácidos. As inserções ou as deleções podem opcionalmente ser na gama de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e testando as variantes resultantes quanto à actividade (tal como em qualquer dos ensaios in vitro descritos nos Exemplos adiante) quanto à actividade exibida pela sequência nativa de comprimento completo ou madura. São aqui proporcionados fragmentos de polipéptido PR01122. Estes fragmentos podem ser truncados no terminal N ou no terminal C, ou podem ter falta de resíduos internos, por exemplo, comparativamente com uma proteína nativa ou de comprimento completo. A certos fragmentos faltam resíduos de aminoácido que não são essenciais para uma actividade biológica desejada do polipéptido PR01122.

Os fragmentos de PR01122 podem ser preparados por qualquer uma de várias técnicas convencionais. Os fragmentos peptídicos desejados podem ser quimicamente sintetizados. Uma abordagem alternativa envolve gerar fragmentos de PR01122 por digestão enzimática, e.g., por tratamento da proteína com uma enzima que se sabe clivar proteínas em locais definidos por resíduos de aminoácido particulares, ou por digestão do ADN com enzimas de restrição adequadas e isolamento do fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve o isolamento e a amplificação de um fragmento de ADN que codifica um fragmento polipeptídico desejado, por reacção em cadeia com polimerase (PCR). Os oligonucleótidos que definem os terminais desejados do fragmento de ADN são empregues nos iniciadores 5' 27 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ e 3' na PCR. Preferivelmente, os fragmentos de polipéptido PR01122 partilham pelo menos uma actividade biológica e/ou imunológica com o polipéptido PR01122 nativo apresentado na Figura 3 (SEQ ID NO:3).

Em concretizações particulares, mostram-se na Tabela substituições conservativas de interesse na Tabela, na coluna com o titulo de "Substituições Preferidas". Se essas substituições resultarem numa alteração da actividade biológica, então são introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "Substituições Exemplificativas" na Tabela 1, ou como adicionalmente descrito adiante em referência a classes de aminoácidos, e os produtos são pesquisados.

Tabela 1

Substituições conservativas

Resíduo Substituições exemplificativas Substituições Original preferidas Ala (A) vai; leu; ile vai Arg (R) lys; gin; asn lys Asn (N) gin; his; lys; arg gin Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gin (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gin; lys; arg arg Ile (I) leu; vai; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; vai; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; vai; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Vai (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu 28 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

As modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipéptido PR01122 são realizadas seleccionando substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou da hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural dividem-se em grupos com base nas propriedades comuns das cadeias laterais: (1) hidrófobos: sys, ser, thr; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por um de outra classe. Estes resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais de substituição conservativa ou, mais preferivelmente, nos locais remanescentes (não conservados).

Variações podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na especialidade tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida ao local), varrimento de alaninas e mutagénese por PCR. Mutagénese dirigida ao local [Cárter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., .10:6487 (1987)], mutagénese por cassetes [Wells et al., Gene, 3_4:315 (1985)], mutagénese de selecção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas, podem ser realizadas no ADN clonado para produzir o ADN variante que codifica PRO1031. A análise por varrimento de aminoácidos também pode ser empregue para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Entre os aminoácidos preferidos para o varrimento estão os aminoácidos neutros, relativamente pequenos. Estes aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido preferido para varrimento entre este grupo porque elimina a cadeia 29 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ lateral para além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante. A alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Adicionalmente, encontra-se frequentemente tanto em posições expostas como ocultas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Se a substituição por alanina não originar quantidades adequadas de variante, pode ser utilizado um aminoácido isotérico. C. Modificações de PR01122

As modificações covalentes de polipéptidos PR01122 estão incluídas no âmbito da presente invenção como definido nas reivindicações. Um tipo de modificação covalente inclui a reacção de residuos de aminoácido alvo de um polipéptido PR01122 com um agente orgânico de derivatização que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou os residuos N- ou C-terminais de um polipéptido PR01122. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para a reticulação de PR01122 numa matriz de suporte insolúvel em água ou numa superfície para utilização no método para purificação de anticorpos anti-PR01122, e vice-versa. Os agentes de reticulação normalmente utilizados incluem, e.g., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissuccinimidilo tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Outras modificações incluem desamidação de resíduos glutaminilo e asparaginilo nos correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal. 30 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Outro tipo de modificação covalente do polipéptido PR01122 incluída no âmbito da presente invenção como definido nas reivindicações compreende a alteração do padrão de glicosilação nativo do polipéptido. A "alteração do padrão de glicosilação nativo" significa, para os presentes fins, a eliminação de uma ou mais porções hidrato de carbono encontradas no polipéptido PR01122 de sequência nativa, e/ou adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no polipéptido PR01122 de sequência nativa. Adicionalmente, a frase inclui alterações qualitativas na gl icosilação das proteínas nativas, envolvendo uma alteração na natureza e proporções das várias porções hidrato de carbono presentes . A adição de locais de glicosilação aos polipéptidos PR01122 pode ser conseguida alterando a sua sequência de aminoácidos. A alteração pode ser realizada, por exemplo, através da adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina no polipéptido PR01122 de sequência nativa (para locais de glicosilação com ligação a O) . A sequência de aminoácidos de PR01122 pode opcionalmente ser alterada através de alterações ao nível do ADN, particularmente, por mutação do ADN que codifica o polipéptido PR01122 em bases pré-seleccionadas de modo a que sejam gerados codões que se irão traduzir nos aminoácidos desejados.

Outro meio para aumentar o número de porções hidrato de carbono no polipéptido PR01122 é através de acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipéptido. Estes métodos estão descritos na especialidade, e.g., em WO 87/05330 publicado em 11 de Setembro de 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). A remoção de porções hidrato de carbono presentes no polipéptido PR01122 pode ser realizada química ou enzimaticamente ou por substituição mutacional de codões que codificam para resíduos de aminoácido que servem como alvos de glicosilação. As técnicas de desglicosilação química são conhecidas na especialidade e estão descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). A clivagem enzimática de porções hidrato de carbono nos polipéptidos pode 31 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ ser conseguida utilizando uma variedade de endo- e exo-glicosidases como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138 :350 (1987) .

Outro tipo de modificação covalente de PR01122 compreende a ligação do polipéptido PR01122 a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, da maneira descrita nas Patentes U.S. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ou 4,179,337.

Os polipéptidos PR01122 podem também ser modificados de maneira a formar moléculas quiméricas compreendendo um polipéptido PR01122, respectivamente, fundido com outro polipéptido ou sequência de aminoácidos heterólogos. Numa concretização, esta molécula quimérica compreende uma fusão de um polipéptido PR01122 com um polipéptido marcador que proporciona um epitopo ao qual um anticorpo anti-marcador se pode ligar selectivamente. O marcador epitópico é geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do polipéptido PR01122. A presença destas formas marcadas com epitopo de um polipéptido PR01122 pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Também, proporcionar o marcador epitópico permite que o polipéptido PR01122 seja prontamente purificado por purificação por afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao marcador epitópico. vários polipéptidos marcadores e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na especialidade. Os exemplos incluem marcadores poli-histidina (poli-His) ou poli-histidina-glicina (poli-His-Gly); o polipéptido marcador HA da gripe e o seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol, Cell, Biol,, 8_:2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5^:3610—3616 (1985)]; e o marcador glicoproteina D (gD) do virus Herpes Simplex e o seus anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 2(β);547-553 (1990)]. Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6^:1204-1210 (1988)]; o péptido epitópico KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um péptido epitópico a-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o marcador peptídico de proteína do gene 10 de T7 [Lutz- 32 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)] .

Numa concretização alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão de um polipéptido PR01122 com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica, esta fusão pode ser com a região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig preferivelmente incluem a substituição de uma forma solúvel (dominio transmembranar eliminado ou inactivado) de um polipéptido PR01122 em vez de pelo menos uma região variável no interior de uma molécula de Ig. Numa concretização particularmente preferida, a fusão de imunoglobulina inclui as regiões charneira, CH2 e CH3, ou charneira, CHI, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGl. Para a produção de fusões de imunoglobulina veja-se também a Patente US 5,428,130 concedida em 27 de Junho, 1995.

Ainda numa outra concretização, os polipéptidos PR01122 podem também ser modificados de maneira a que formem uma molécula quimérica compreendendo um polipéptido PR01122 fundido com um fecho-de-correr de leucinas. Vários polipéptidos fecho-de-correr de leucinas foram descritos na especialidade. Veja-se, e.g., Landschulz et al., Science 240:1759 (1988); WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatis et al., Nature 341:24 (1989). Crê-se que a utilização de um fecho-de-correr de leucinas fundido a um polipéptido PR01122 pode ser desejável para auxiliar na dimerização ou trimerização de polipéptidos PR01122 solúveis em solução. Os peritos na especialidade notarão que o fecho-de-correr de leucinas pode ser fundido quer à extremidade N-quer C-terminal da molécula de PR01122. D. Preparação de PR01122 A descrição que se segue refere-se principalmente à produção de PR01122 por cultura de células transformadas ou transfectadas com um vector contendo ácido nucleico que codifica polipéptido PR01122. Está, evidentemente, contemplado que possam ser empregues métodos alternativos, que são bem conhecidos na especialidade, para preparar os polipéptidos PR01122. Por exemplo, a sequência de PR01122, ou suas porções, 33 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ podem ser produzidas por síntese peptídica directa utilizando técnicas em fase sólida [veja-se, e.g., Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85_: 2149-2154 (1963)]. A síntese de proteínas in vitro pode ser realizada utilizando técnicas manuais ou automatizadas. A síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, utilizando um sintetizador de péptidos da Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando as instruções do fabricante. As várias porções de polipéptidos PR01122 podem ser quimicamente sintetizadas separadamente e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir um polipéptido PR01122 de comprimento completo. 1. Isolamento de ADN que codifica PR01122 O ADN que codifica um polipéptido PR01122 pode ser obtido a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se crê possuir o ARNm de PR01122 e expressá-lo a um nível detectável. Deste modo, ADN que codifica PR01122 humano pode ser obtido convenientemente a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos Exemplos. O gene que codifica PR01122 pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou por procedimentos sintéticos conhecidos (e.g., procedimentos de síntese automatizada, síntese de oligonucleótidos).

As bibliotecas podem ser pesquisadas com sondas (tais como anticorpos contra um polipéptido PR01122 ou oligonucleótidos de pelo menos cerca de 20-80 bases) desenhadas para identificar o gene de interesse ou a proteína por ele codificada. A pesquisa da biblioteca genómica ou de ADNc com a sonda seleccionada pode ser conduzida utilizando procedimentos Standard, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar genes consiste em utilizar a metodologia de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] .

Os Exemplos que se seguem descrevem técnicas para a pesquisa de uma biblioteca de ADNc. As sequências 34 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ oligonucleotídicas seleccionadas como sondas deverão ter comprimento suficiente e ser suficientemente não ambíguas para que sejam minimizados os falsos positivos. O oligonucleótido é preferivelmente marcado de modo a poder ser detectado após hibridação com ADN na biblioteca a pesquisar. Os métodos de marcação são bem conhecidos na especialidade, e incluem a utilização de marcadores radioactivos como ATP marcado com 32P, biotinilação ou marcação enzimática. As condições de hibridação, incluindo as de rigor moderado e as muito rigorosas, são proporcionadas em Sambrook et al., supra.

As sequências identificadas através destes métodos de pesquisa de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas com outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicas tais como a GenBank ou outras bases de dados de sequências privadas. A identidade de sequência (quer ao nível dos aminoácidos quer ao dos nucleótidos) no interior de regiões definidas da molécula ou ao longo da totalidade do comprimento da sequência, pode ser determinada utilizando métodos conhecidos na especialidade e como aqui descrito (e.g., através de alinhamento de sequências utilizando programas de computador tais como ALIGN, DNAstar, BLAST, BLAST-2, INHERIT e ALIGN-2, que empregam vários algoritmos para medir a homologia). 0 ácido nucleico possuindo a sequência de codificação da proteína pode ser obtido através da pesquisa de bibliotecas seleccionadas, genómicas ou de ADNc, utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui revelada pela primeira vez, e, se necessário, utilizando procedimentos convencionais de alongamento de iniciadores como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores e processando os intermediários de ARNm que podem não ter sofrido transcrição inversa em ADNc. 2. Selecção e Transformação de Células Hospedeiras

As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vectores de expressão ou clonagem aqui descritos para a produção de polipéptido PR01122 e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, selecção de transformantes ou 35 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e semelhantes, podem ser seleccionadas pelo perito sem experimentação desnecessária. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Ce 11 BioTechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., supra. São conhecidos das pessoas competentes na matéria métodos de transfecção, por exemplo, CaP04 e electroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas Standard apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou a electroporação, são geralmente utilizados para procariotas ou outras células que contêm barreiras de parede celular substanciais. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para a transformação de certas células vegetais, como descrito por Shaw et al., Gene, 23_:315 (1983) e WO 89/05859 publicado em 29 de Junho de 1989. Para células de mamífero sem estas paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) . Aspectos gerais de transformações em sistemas de células hospedeiras de mamífero foram descritos na Patente U.S. 4,399,216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), _76_; 3829 (1979). Contudo, podem também ser utilizados outros métodos para a introdução de ADN em células, tais como por micro-injecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas, ou policatiões, e.g., polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para a transformação de células de mamífero, veja-se Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ácido nucleico {e.g., ADN) nos presentes vectores incluem células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores. Os procariotas adequados incluem, mas não se lhes limitam, eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou 36 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como E. coli. Várias estirpes de E. coli estão disponíveis ao público, tais como E. coli K12 estirpe MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli estirpe W3110 (ATCC 27,325) e K5 772 (ATCC 53,635). Outras células hospedeiras procariotas adequadas incluem Enterobacteriaceae tais como Escherichia. e.g., E. coli. Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans e Shigella, assim como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P revelado em DD 266,710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. A estirpe W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro parental particularmente preferido pois é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN recombinante. Preferivelmente, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a estirpe W3110 pode ser modificada para efectuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas ao hospedeiro, incluindo os exemplos destes hospedeiros E. coli W3110 estirpe 1A2, que possui o genótipo completo tonA; E. coli W3110 estirpe 9E4, que possui o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 estirpe 27C7 (ATCC 55,244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan'; E. coli W3110 estirpe 40B4, que é a estirpe 37D6 com uma mutação de deleção de degP não resistente a canamicina; e uma estirpe de E. coli possuindo protease periplasmática mutante revelada na Patente U.S. 4,946,783 concedida em 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, são adequados métodos de clonagem in vivo, e.g., PCR ou outras reacções com ácido nucleico-polimerase.

Em adição aos procariotas, micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vectores de codificação de PR01122. A Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariota inferior vulgarmente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pornbe (Beach e Nature, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139383 publicado em 2 de Maio de 1995); hospedeiros Kluyveromyces (Patente U.S. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tais como, e.g., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. 37 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Bacteriol., 737 [1983]), Κ. fragilis (ATCC 12, 424), Κ. bulgaricus (ATCC 16,045), Κ. wickeramii (ATCC 24,178), Κ. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowía (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:5359-5263 [1979]): Schwanníomyces tais como Schwanniomyces occidentalis (EP 394538 publicado em 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de Janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergíllus tais como A. nidulans (Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983];

Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). As leveduras metilotrópicas são seleccionadas dos géneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma listagem de espécies especificas que constituem exemplos desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Antony, The Biochemistry of Metilotrophs, 269 (1982) .

As células hospedeiras adequadas para a expressão de PR01122 glicosilado são derivadas de organismos pluricelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluem células de insecto tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, Spodoptera highõ, bem como células vegetais. Os exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e COS. Exemplos mais específicos incluem a linha CVl de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovário de hamster chinês/- dhfr (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather,

Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmão humano

(W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51). 38 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Considera-se que a selecção da célula hospedeira apropriada faz parte da pericia na especialidade. 3. Selecção e Utilização de um Vector Replicável O ácido nucleico (e.g., ADNc ou ADN genómico) que codifica o polipéptido PR01122 desejado pode ser inserido num vector replicável para clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Vários vectores estão disponíveis ao público. O vector pode, por exemplo, estar na forma de um plasmideo, cosmideo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vector através de uma variedade de procedimentos. Em geral, o ADN é inserido num local ou locais para endonucleases de restrição apropriados utilizando técnicas conhecidas na especialidade. Os componentes do vector incluem geralmente, mas não se lhes limitam, um ou mais de entre uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vectores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas Standard de ligação que são conhecidas dos peritos. O polipéptido PR01122 pode ser produzido recombinantemente não apenas directamente, mas também na forma de um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem especifico no terminal N da proteína ou do polipéptido maduros. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vector, ou pode fazer parte do ADN que codifica o PR01122 que é inserido no vector. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal de procariota seleccionada, por exemplo, do grupo dos comandos de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou enterotoxina estável ao calor II. Para secreção em leveduras, a sequência de sinal pode ser, e.g., o comando da invertase de levedura, o comando do factor alfa (incluindo comandos de factor α de Saccharomyces e Kluyveromyces, este último descrito na Patente U.S. 5,010,182), ou o comando da fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albicans (EP 362179 publicado em 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamífero, 39 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ podem-se utilizar sequências de sinal de mamifero para dirigir a secreção da proteína, tais como as sequências de sinal de polipéptidos segregados da mesma espécie ou de espécies relacionadas, bem como comandos de secreção virais.

Tanto os vectores de expressão como os de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vector replique numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Estas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para leveduras, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero.

Os vectores de expressão e clonagem tipicamente conterão um gene de selecção, também denominado um marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir dos meios complexos, e.g., o gene que codifica D-alanina-racemase para Bacilli.

Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para assimilar o ácido nucleico que codifica PR01122, tais como DHFR ou timidina-quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando é empregue DHFR do tipo selvagem é a linha de células de CHO deficientes em actividade de DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). Um gene de selecção adequado para utilização em levedura é o gene trpl presente no plasmídeo YRp7 de levedura [Stinchcomb et al.r Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura a que falta a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N°. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)] . 40 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Os vectores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor ligado operativamente à sequência de ácido nucleico que codifica PR01122 para dirigir a sintese de ARNm. Os promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são bem conhecidos. Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem os sistemas promotores de β-lactamase e lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36776], e promotores híbridos tais como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)]. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente ao ADN que codifica o polipéptido PR01122.

Os exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato-quinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização da maltose e da galactose. Os vectores e promotores adequados para utilização na expressão em leveduras são adicionalmente descritos em EP 73657. A transcrição de PR01122 a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como 41 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ poliomavírus, vírus fowlpox (UK 2,211,504 publicado em 5 de Julho de 1989), adenovírus (tais como Adenovírus 2), papilomavírus de bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus de hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamífero heterólogos, e.g., o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, e a partir de promotores de choque por calor, desde que estes promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. A transcrição de um ADN que codifica um polipéptido PR01122 por eucariotas superiores pode ser aumentada inserindo uma sequência potenciadora no vector. Os potenciadores são elementos de ADN que actuam em eis, usualmente com cerca de 10 a 300 pb, que actuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Muitas sequências potenciadoras são actualmente conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, utilizar-se-á um potenciador de um vírus de célula eucariota. Os exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovírus. O potenciador pode ser unido com splicing no vector numa posição a 5' ou 3' da sequência de codificação do PR01122, mas está preferivelmente localizado do lado 5' do promotor.

Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucariotas (células de levedura, de fungo, de insecto, vegetais, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos pluricelulares) conterão também sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Estas sequências estão vulgarmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas a 5' e, ocasionalmente a 3', de ADN ou ADNc eucariotas ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica PR01122.

Ainda outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese de polipéptidos PR01122 em cultura de células recombinantes de vertebrado, estão 42 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981);

Mantei et al.f Nature, 281:40-46 (1979); EP 117060; e EP 117058. 4. Detecção de Amplificação/Expressão de Genes A amplificação e/ou expressão de genes podem ser medidas numa amostra directamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências aqui proporcionadas. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que podem reconhecer dúplices especificas, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN e dúplices híbridas de ADN-ARN ou dúplices de ADN-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado onde a dúplex está ligada a uma superfície, de modo a que pela formação da dúplex na superfície, a presença de anticorpo ligado à dúplex possa ser detectada. A expressão de genes, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecidos e ensaio de culturas celulares ou de fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto génico. Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de amostras de fluidos podem ser monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido PR01122 de sequência nativa ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas ou contra uma sequência exógena fundida com ADN que codifica PR01122 e codificando um epítopo de anticorpo específico. 5. Purificação do Polipéptido

As formas de PR01122 podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou de lisados das células hospedeiras. Se estiver ligado à membrana, pode ser libertado da membrana utilizando uma solução de detergente adequado (e.g. Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. As células empregues 43 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ na expressão de polipéptidos PR01122 podem ser rompidas através de vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, tratamento com ultra-sons, ruptura mecânica ou agentes de lise celular.

Pode-se desejar purificar o PR01122 a partir de proteínas ou polipéptidos de células recombinantes. Os procedimentos que se seguem são exemplos de procedimentos de purificação adequados: por fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia sobre sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A-Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes de metais para ligar formas marcadas com epítopo do polipéptido PR01122. Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregues e esses métodos são conhecidos na especialidade e estão descritos por exemplo em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). 0(s) passo(s) de purificação seleccionado(s) irão depender, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do polipéptido PR01122 particular produzido. E. Utilizações para PR01122

As sequências de nucleótidos (ou seu complemento) que codificam polipéptidos PR01122 têm várias aplicações na especialidade da biologia molecular, incluindo utilizações como sondas de hibridação, em mapeamento de cromossomas e genes e na geração de ADN e ARN anti-sentido. O ácido nucleico que codifica PR01122 também será útil para a preparação de polipéptidos PR01122 por técnicas recombinantes aqui descritas. A sequência de nucleótidos de DNA62377-1381-1 de comprimento completo (SEQ ID NO:4) ou a sequência de nucleótidos de codificação de PR01122 de sequência nativa, de comprimento completo, ou suas porções, podem ser utilizadas como sondas de hibridação para uma biblioteca de ADNc para isolar o gene de PR01122 de comprimento completo ou para 44 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ isolar ainda outros genes (por exemplo, os que codificam variantes de ocorrência natural de PR01122 ou o mesmo de outras espécies) que têm uma identidade de sequência desejada com a sequência de nucleótidos de PR01122 revelada na Figura 4 (SEQ ID NO:4). Opcionalmente, o comprimento das sondas será de cerca de 20 a cerca de 50 bases. As sondas de hibridação podem ser derivadas da sequência de nucleótidos DNA62377-1381-1 de SEQ ID NO:4 como mostrado na Figura 4 ou de sequências genómicas incluindo promotores, elementos potenciadores e intrões de ADN que codifica PR01122 de sequência nativa. A titulo de exemplo, um método de pesquisa compreenderá o isolamento da região de codificação do gene de PR01122 utilizando a sequência de ADN conhecida para sintetizar uma sonda seleccionada de cerca de 40 bases. As sondas de hibridação podem ser marcadas por uma variedade de marcadores, incluindo radionuclidos tais como 32P ou 35S, ou marcadores enzimáticos tais como fosfatase alcalina acoplada à sonda por via de sistemas de acoplamento avidina/biotina. As sondas marcadas possuindo uma sequência complementar à do gene de PR01122 da presente invenção podem ser utilizadas para pesquisar bibliotecas de ADNc humano, ADN genómico ou ARNm para determinar com que membros dessas bibliotecas a sonda híbrida. As técnicas de hibridação estão descritas com mais detalhes nos Exemplos adiante.

Quaisquer sequências de EST (ou seus fragmentos) reveladas no presente pedido de patente podem ser similarmente empregues como sondas, utilizando os métodos aqui revelados.

Outros fragmentos úteis dos ácidos nucleicos de PR01122 incluem oligonucleótidos de sentido directo ou anti-sentido compreendendo uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (quer ARN, quer ADN) capaz de se ligar a sequências alvo de ARNm de PR01122 (sentido directo) ou ADN de PR01122 (anti-sentido). Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo, de acordo com a presente invenção, compreendem um fragmento da região de codificação do ADN de PR01122. Este fragmento geralmente compreende pelo menos cerca de 14 nucleótidos, preferivelmente de cerca de 14 a 30 nucleótidos. A capacidade de derivar um oligonucleótido anti-sentido ou um de sentido directo, com base numa sequência de ADNc que codifica uma determinada proteína está descrita, por 45 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ exemplo, em Stein e Cohen (Câncer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988). A ligação de oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo a sequências de ácido nucleico alvo resulta na formação de dúplices que bloqueiam a transcrição ou a tradução da sequência alvo através de um de vários meios, incluindo a degradação aumentada das dúplices, a terminação prematura da transcrição ou da tradução, ou por outros meios. Os oligonucleótidos anti-sentido podem assim ser utilizados para bloquear a expressão de proteínas PR01122. Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo compreendem ainda oligonucleótidos possuindo esqueletos de açúcar-fosfodiéster modificados (ou outras ligações de açúcares, tais como as descritas em WO 91/06629) e em que essas ligações de açúcares são resistentes a nucleases endógenas. Estes oligonucleótidos com ligações de açúcares resistentes são estáveis in vivo (i.e., capazes de resistir a degradação enzimática) mas retêm a especificidade da sequência para se poder ligar a sequências de nucleótidos alvo.

Outros exemplos de oligonucleótidos de sentido directo ou anti-sentido incluem os oligonucleótidos que estão ligados covalentemente a porções orgânicas, tais como os descritos em WO 90/10048, e outras porções que aumentam a afinidade do oligonucleótido para com uma sequência de ácido nucleico alvo, tais como poli-(L-lisina). Adicionalmente, agentes intercalantes, tais como elipticina, e agentes alquilantes ou complexos metálicos, podem ser ligados a oligonucleótidos de sentido directo ou anti-sentido para modificar as especificidades de ligação do oligonucleótido anti-sentido ou de sentido directo para com a sequência de nucleótidos alvo.

Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por qualquer método de transferência de genes, incluindo, por exemplo, transfecção de adn mediada por CaP04, electroporação ou utilizando vectores de transferência de genes tais como o vírus de Epstein-Barr. Num procedimento preferido, um oligonucleótido anti-sentido ou de sentido directo é inserido num vector retroviral adequado. Uma célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo é colocada em 46 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ contacto com ο vector retroviral recombinante, quer in vivo quer ex vivo. Os vectores retrovirais adequados incluem, mas não se lhes limitam, os derivados dos retrovírus murinos M-MuLV, N2 (um retrovirus derivado de M-MuLV), ou os vectores de cópia dupla designados por CDT5A, DCT5B e DCT5C (veja-se WO 90/13641) .

Os oligonucleótidos de sentido directo ou anti-sentido também podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de nucleótidos alvo por formação de um conjugado com uma molécula de ligação a um ligando, como descrito em WO 91/04753. As moléculas de ligação a ligandos adequadas incluem, mas não lhes estão limitadas, receptores da superfície celular, factores de crescimento, outras citoquinas, ou outros ligandos que se ligam a receptores da superfície celular. Preferivelmente, a conjugação da molécula de ligação ao ligando não interfere substancialmente com a capacidade da molécula de ligação ao ligando se ligar à sua molécula ou receptor correspondentes, nem bloqueia a entrada do oligonucleótido de sentido directo ou anti-sentido ou da sua versão conjugada, na célula.

Alternativamente, um oligonucleótido de sentido directo ou um anti-sentido pode ser introduzido numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por formação de um complexo oligonucleótido-lípido, como descrito em WO 90/10448. O complexo oligonucleótido de sentido directo ou anti-sentido-lípido é preferivelmente dissociado no interior da célula através de uma lipase endógena.

As sondas podem também ser empregues em técnicas de PCR para gerar um conjunto de sequências para identificação de sequências de PR01122 estreitamente relacionadas.

As sequências de nucleótidos que codificam um polipéptido PR01122 podem também ser utilizadas para construir sondas de hibridação para mapeamento de genes que codificam esse polipéptido PR01122 e para a análise genética de indivíduos com desordens genéticas. As sequências de nucleótidos aqui proporcionadas podem ser mapeadas num cromossoma e regiões específicas de um cromossoma utilizando técnicas conhecidas, tais como hibridação in situ, análise de ligação génica 47 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ (linkage analysis) contra marcadores cromossómicos conhecidos e pesquisa por hibridação com bibliotecas.

Quando as sequências de codificação para PR01122 codificam uma proteína que se liga a outra proteína (por exemplo, quando o polipéptido PR01122 funciona como um receptor), o polipéptido PR01122 pode ser utilizado em ensaios para identificar as outras proteínas ou moléculas envolvidas na interacção de ligação. Através destes métodos, podem ser identificados inibidores da interacção de ligação receptor/ligando. As proteínas envolvidas nestas interacções de ligação podem também ser utilizadas para pesquisar inibidores peptídicos ou de molécula pequena ou agonistas da interacção de ligação. Também, o polipéptido PR01122 receptor pode ser utilizado para isolar ligando(s) correlacionados. Podem ser desenhados ensaios de pesquisa para encontrar compostos líder que imitam a actividade biológica de um PR01122 nativo ou um receptor para PR01122. Estes ensaios de pesquisa incluirão ensaios susceptíveis de pesquisa de alto rendimento de bibliotecas químicas, o que os torna particularmente adequados para a identificação de candidatos a fármacos de molécula pequena. As moléculas pequenas contempladas incluem compostos sintéticos orgânicos ou inorgânicos. Os ensaios podem ser realizados numa variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de pesquisa bioquímicos, imunoensaios e ensaios à base de células, que estão bem caracterizados na especialidade.

Os ácido nucleicos que codificam polipéptido PR01122 ou quaisquer das suas formas modificadas podem também ser utilizados para gerar animais transgénicos não humanos ou animais "knock-out" não humanos que, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e pesquisa de reagentes terapeuticamente úteis. Um animal transgénico não humano (e.g., um ratinho ou rato) é um animal possuindo células que contêm um transgene, transgene este que foi introduzido no animal ou num ascendente do animal num estágio pré-natal, e.g., estágio embrionário. Um transgene é um ADN que está integrado no genoma de uma célula a partir da qual se desenvolve o animal transgénico. Numa concretização, o ADNc que codifica polipéptido PR01122 pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica PR01122 de acordo com técnicas estabelecidas e as sequências genómicas 48 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ podem ser utilizadas para gerar animais transgénicos que contêm células que expressam o ADN que codifica o PR01122. Os métodos para gerar animais transgénicos, particularmente animais tais como ratinhos ou ratos, tornaram-se convencionais na especialidade e estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 4,736,866 e 4,870,009. Tipicamente, células particulares serão escolhidas como alvo para a incorporação do transgene de PR01122 com potenciadores específicos de tecidos. Os animais transgénicos que incluem uma cópia de um transgene que codifica PR01122 introduzida na linha germinal do animal num estágio embrionário podem ser utilizados para examinar o efeito de expressão aumentada de ADN que codifica PR01122. Estes animais podem ser utilizados como animais de teste para reagentes que se pensa conferirem protecção contra, por exemplo, condições patológicas associadas à sua sobre-expressão. De acordo com esta faceta da invenção, um animal é tratado com o reagente e uma incidência reduzida da condição patológica, comparada com a de animais não tratados portadores do transgene, indicaria uma potencial intervenção terapêutica para a condição patológica.

Alternativamente, homólogos não humanos de PR01122 podem ser utilizados para construir um animal "knock-out" relativamente a PR01122 que possui um gene codificador de PR01122 defectivo ou alterado em resultado de recombinação homóloga entre o gene endógeno que codifica PR01122 e o ADN genómico alterado que codifica PR01122 introduzido numa célula embrionária do animal. Por exemplo, ADNc que codifica PR01122 pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica PR01122 de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do ADN genómico que codifica PR01122 pode ser eliminada ou substituída por outro gene, tal como um gene codificando um marcador seleccionável que pode ser utilizado para monitorar a integração. Tipicamente, estão incluídas no vector várias quilobases de ADN flanqueador inalterado (em ambas as extremidades 5' e 3') [veja-se e.g., Thomas e Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para uma descrição de vectores de recombinação homóloga]. O vector é introduzido numa linha de células estaminais embrionárias (e.g., por electroporação) e as células em que o ADN introduzido foi homologamente recombinado com o ADN endógeno são seleccionadas [veja-se e.g., Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. As células seleccionadas são então 49 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ injectadas num blastocisto de um animal (e.g., um ratinho ou rato) para formar quimeras de agregação [veja-se e.g., Bradley, em Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Um embrião quimérico pode então ser implantado num animal hospedeiro fêmea pseudo-grávida adequada e o embrião é levado a termo para criar um animal "knock-out". A progénie portadora do ADN homologamente recombinado nas suas células germinais pode ser identificada por técnicas Standard e utilizada para criar animais em que todas as células do animal contêm o ADN homologamente recombinado. Os animais knock-out podem ser caracterizados por exemplo, pela sua capacidade de se defenderem contra certas condições patológicas e pelo seu desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência do polipéptido PR01122. O ácido nucleico que codifica os polipéptidos PR01122 pode também ser utilizado em terapia génica. Em aplicações de terapia génica, os genes são introduzidos em células de modo a conseguir a síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente eficaz, por exemplo para substituição de um gene defectivo. A "terapia génica" inclui tanto a terapia génica convencional onde um efeito duradouro é conseguido através de um único tratamento, como a administração de agentes terapêuticos génicos, que envolve a administração de uma só vez ou repetida de um ADN ou ARNm terapeuticamente eficazes. Os ADN e arn anti-sentido podem ser utilizados como agentes terapêuticos para o bloqueio da expressão de certos genes in vivo. Mostrou-se já que oligonucleótidos anti-sentido curtos podem ser importados pelas células onde actuam como inibidores, apesar das suas baixas concentrações intracelulares causadas pela sua restrita assimilação pela membrana celular. (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:4143-4146 [1986]). Os oligonucleótidos podem ser modificados para aumentar a sua assimilação, e.g. substituindo os seus grupos fosfodiéster negativamente carregados por grupos não carregados.

Existem uma variedade de técnicas disponíveis para a introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células de cultura in vitro, ou in vivo nas células do 50 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ hospedeiro pretendido. As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamifero in vitro incluem a utilização de lipossomas, electroporação, micro-injecção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. As técnicas de transferência de genes in vivo presentemente preferidas incluem a transfecção com vectores virais (tipicamente retrovirais) e transfecção mediada por lipossomas de proteína do revestimento virai (Dzau et al., Trends in BioTechnology 11, 205-210 [1993]) . Em algumas situações é desejável proporcionar a fonte de ácido nucleico com um agente que tem como alvo as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína de membrana da superfície celular ou para a célula alvo, um ligando para um receptor na célula alvo, etc. Quando são empregues lipossomas, podem ser utilizadas proteínas que se ligam a uma proteína de membrana da superfície celular associada a endocitose, para atingir e/ou facilitar a assimilação, e.g. proteínas da cápside ou seus fragmentos trópicos para um tipo de células em particular, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclos, proteínas que têm como alvo uma localização intracelular e aumentam a semivida intracelular. A técnica de endocitose mediada por receptores é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 3410-3414 (1990) . Para uma revisão de protocolos de marcação de genes e terapia génica veja-se Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992).

Os polipéptidos PR01122 aqui descritos podem também ser empregues como marcadores de peso molecular para fins de electroforese de proteínas. A molécula de ácido nucleico que codifica os polipéptidos PR01122 ou seus fragmentos aqui descritos são úteis para a identificação de cromossomas. A este respeito, existe uma necessidade crescente de identificar novos marcadores de cromossomas, pois estão actualmente disponíveis relativamente poucos reagentes marcadores para cromossomas, baseados nos actuais dados de sequências. Cada molécula de ácido nucleico de PR01122 da presente invenção pode ser utilizada como um marcador de cromossoma. 51 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Os polipéptidos PR01122 e moléculas de ácido nucleico da presente invenção podem também ser utilizados para a tipificação de tecidos, em que os polipéptidos PR01122 da presente invenção podem ser expressos diferencialmente num tecido em comparação com outros. As moléculas de ácido nucleico de PR01122 serão úteis para gerar sondas para PCR, análise de Northern, análise de Southern e análise de Western.

Os polipéptidos PR01122 da presente invenção que possuem actividade biológica relacionada com a da IL-17 podem ser empregues tanto in vivo para fins terapêuticos como in vitro. Os peritos na especialidade saberão bem como empregar os polipéptidos PR01122 da presente invenção para estes fins. O PR01122 pode ser utilizado em ensaios com os polipéptidos com os quais tem identidade para determinar as actividades relativas. Os resultados podem ser aplicados em concordância.

Um alinhamento da sequência de aminoácidos prevista de IL-17B (e.g., UNQ516) (SEQ ID NO:1) e IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) com a sequência conhecida de IL-17 (SEQ ID NO:ll), mostra que esta é uma família de sequências relacionadas com uma identidade de aminoácidos de 26-28% entre os três membros (Figura 7) . Todos os três polipéptidos contêm uma sequência hidrófoba no terminal N que se espera que funcione como uma sequência de sinal de secreção de 18-20 aminoácidos, dando uma gama de tamanhos prevista para os membros desta família de 155 a 197 aminoácidos (PM maduro de 17 a 20 kDa). O alinhamento da Figura 7 mostra vários aminoácidos conservados, incluindo um resíduo de triptofano e 5 cisteínas na metade C-terminal das proteínas. O ácido nucleico que codifica PR01122 ou seus fragmentos podem também ser utilizados para localizações cromossómicas. Por exemplo, a localização cromossómica de IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:1) e IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) foi determinada utilizando iniciadores Taqman e sondas desenhadas nas regiões não traduzidas a 3' de IL-17B e IL-17C, foi realizada por PCR com o painel Stanford Radiation Hybrid Panei G3. A IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) foi mapeada no cromossoma humano 5q32-34, enquanto a IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) foi localizada no 52 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ cromossoma 16q24. A IL-17 humana, ela própria, é encontrada no cromossoma 2q31. Rouvier et ai., M Immunol. 150: 5445 (1993).

Com o isolamento e a caracterização dos dois novos parentes da IL-17, os Requerentes estabeleceram e expandiram o potencial papel que esta familia de citoquinas pode desempenhar na resposta imunitária pró-inflamatória e noutras respostas. Os três membros da familia, IL-17 (SEQ ID NO:ll), IL-17B (SEQ ID NO:1) e IL-17C (SEQ ID NO:3), relacionam-se modestamente em termos de estrutura primária com cerca de 27% de identidade global de aminoácidos incluindo 5 resíduos de cisteína conservados (Figura 7) . Os três membros da família partilham várias características - têm 150-200 resíduos de aminoácido de comprimento, são segregados pelas células por via de uma sequência de sinal de secreção hidrófoba, e são expressos na forma de homodímeros ligados por dissulfureto que em alguns casos parecem estar glicosilados.

Embora membros da mesma família de genes com base na semelhança de sequências de aminoácidos, as três proteínas são expressas em diferentes tecidos e estão dispersas no genoma. A expressão de IL-17 (SEQ ID NO:11) foi relatada apenas em células T activadas, Fossiez et al., J Exp. Med. 183: 2593 (1996), Yao et al., J. Immunol. 155: 5483 (1995) [Yao-3], enquanto se demonstra que a IL-17B (DNA59294) (SEQ ID NO:2) é expressa em pâncreas humano adulto normal, intestino delgado e estômago (Figura 8). O padrão de expressão da IL-17C (DNA62377) (SEQ ID NO:4), contudo, é muito mais restrito, já que a expressão continuada noutros tecidos ainda não foi verificada.

As caracterizações aqui descritas demonstram que as actividades biológicas de IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) e IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) são consideravelmente diferentes das actividades estabelecidas para a IL-17 (SEQ ID NO:ll). A IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) e a IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) são ambas incapazes de induzir a produção de IL-6 em fibroblastos de prepúcio humano (Exemplo 10) (Figura 9A). Isto está em contraste com a indução marcada conhecida para a IL-17 (SEQ ID NO:ll). Yao et al., Immunity 3:811 (1995) [Yao-1], Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995) [Yao-3]. Ao contrário, a IL-17B (SEQ ID NO:l) e a IL-17C (SEQ ID NO:3), ambas induzem a 53 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ libertação de TNF-α pela linha celular monocítica, THPl, enquanto a IL-17 tem apenas um efeito muito pequeno (Figura 9B) . A libertação de TNF-α em células THPl estimulada pela IL-17B (SEQ id no: 1) e pela il-170 (SEQ id no: 3) é dependente do tempo e da concentração, (Exemplo 10) (Figura 10), sendo a IL-17B (SEQ ID NO:l) cerca de 10 vezes mais potente do que a IL-17C (SEQ ID NO:3) [EC50 = 2,4 nM para IL-17B vs. 25 nM para IL-17C].

Os diferentes efeitos biológicos da IL-17 (SEQ ID NO:ll) comparativamente com as IL-17B ou C (SEQ ID NO:l & 3), sugerem que estas podem funcionar por via de um receptor da superfície celular diferente (ou alguns componentes diferentes do receptor) do receptor de IL-17 conhecido. Yao et al., Cytokine 9:794 (1997) [Yao-3]. Num esforço para examinar directamente a questão da especificidades dos receptores, os Requerentes demonstraram que tanto a IL-17B (SEQ ID NO:l) como a IL-17C (SEQ ID NO:3) são incapazes de se ligar ao ECD do receptor de IL-17 (SEQ ID NO:16) (Figura 11A), e são também incapazes de competir pela ligação de IL-17 (SEQ ID NO:ll) ao ECD do seu receptor (SEQ ID NO:16) (Figura 11B). A IL-17B (SEQ ID NO:l) e a IL-17C (SEQ ID NO:3) ligam-se à superfície de células THPl, onde têm actividade (Figura 12) . A interacção é específica pelo menos na medida em que uma proteína de fusão com Fc de controlo não se consegue ligar a estas células. Os resultados sugerem que pode haver um conjunto de receptores que ligam e transduzem o sinal a partir da família de citoquinas da IL-17, um modelo de receptor/ligando que foi encontrado para muitas famílias de citoquinas e factores de crescimento.

As novas citoquinas aqui reveladas, PRO1031 (e.g., 516) e PR01122 (e.g., UNQ561), diferem da IL-17 (SEQ ID NO:ll) nos seus padrões de expressão e actividades biológicas. A expressão diferencial acoplada com a incapacidade de interacção com o receptor de IL-17 conhecido sugere e expandiu o papel da família da IL-17 na resposta imunitária pró-inflamatória . F. Anticorpos Anti-PRQ1122 A presente invenção utiliza ainda anticorpos anti-polipéptido PR01122. Os exemplos de anticorpos incluem 54 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados. 1. Anticorpos Policlonais

Os anticorpos anti-PR01122 utilizados na presente invenção podem compreender anticorpos policlonais. São conhecidos dos peritos na especialidade métodos de preparação de anticorpos policlonais. Os anticorpos policlonais podem ser criados num mamífero, por exemplo, através de uma ou mais injecções de um agente imunizante e, se pretendido, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante serão injectados no mamífero por múltiplas injecções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir o polipéptido PR01122 ou uma sua proteína de fusão. Pode ser útil conjugar o agente imunizante a uma proteína que se sabe ser imunogénica no mamífero a imunizar. Os exemplos de tais proteínas imunogénicas incluem, mas não se lhes limitam, hemocianina de lapa Fissurella, albumina sérica, tiroglobulina bovina e inibidor de tripsina de soja. Os exemplos de adjuvantes que podem ser empregues incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trealose sintético). 0 protocolo de imunização pode ser seleccionado por um perito na especialidade sem experimentação desnecessária. 2. Anticorpos monoclonais

Os anticorpos anti-PR01122 podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridomas, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975). Num método de hibridoma imuniza-se tipicamente um ratinho, um hamster ou outro animal hospedeiro adequado, com um agente de imunização, para eliciar linfócitos que produzem, ou são capazes de produzir, anticorpos que se ligarão especificamente ao agente de imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. O agente de imunização incluirá tipicamente o polipéptido PR01122, ou uma sua proteína de fusão. Em geral, utilizam-se linfócitos de sangue periférico ("PBL") caso se pretendam 55 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ células de origem humana, ou utilizam-se células de baço ou células de nódulos linfáticos caso se pretendam fontes de mamifero não humano. Os linfócitos são então fundidos com uma linha celular imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) p. 59-103]. As linhas celulares imortalizadas são usualmente células de mamifero transformadas, nomeadamente células de mieloma de origem em roedor, bovina e humana. Usualmente, utilizam-se linhas celulares de rato ou ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se as células parentais não contiverem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias que impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT.

As linhas celulares imortalizadas preferidas são as que se fundem eficazmente, suportam expressão estável em niveis elevados de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT. Constituem linhas celulares imortalizadas mais preferidas as linhas de mieloma murino, que podem ser obtidas, por exemplo, de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia e de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Foram também descritas linhas celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications, Mareei Dekker, Inc., New York, (1987) p. 51-63]. O meio de cultura no qual se cultivam as células de hibridoma pode então ser ensaiado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra um polipéptido PR01122. Preferivelmente, determina-se a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma por imunoprecipitação ou através de um ensaio de 56 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ ligação ίη vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio de imunoassorção com enzimas ligadas (ELISA). Estas técnicas e ensaios são conhecidos na especialidade. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980) .

Após terem sido identificadas as células de hibridoma pretendidas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescidos por métodos Standard [Goding, supra] . Os meios de cultura adequados para este objectivo incluem, por exemplo, meio de Eagle modificado por Dulbecco e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo na forma de ascites num mamífero.

Os anticorpos monoclonais excretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou do fluido ascítico por procedimentos de purificação de imunoglobulinas convencionais tais como, por exemplo, cromatografia em proteína A-Sepharose, hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais podem também ser preparados por métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na Patente U.S. 4,816,567. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais do invento pode ser prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., por utilização de sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma do invento servem como fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outra forma não produzem proteínas imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os ADN podem também ser modificados, por exemplo, por substituição com a sequência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos em vez das sequências homólogas murinas [Patente U.S. 4, 816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81, 57 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 6851-6855 (1984)] ou por ligação covalente à sequência de codificação de imunoglobulina de toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido que não imunoglobulina. Este polipéptido que não imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo do invento ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo do invento para criar um anticorpo bivalente quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. São bem conhecidos na especialidade métodos para preparar anticorpos monovalentes. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante de cadeia leve e cadeia pesada modificada de imunoglobulina. A cadeia pesada é, em geral, truncada em qualquer ponto na região Fc de modo a evitar a ligação cruzada da cadeia pesada. Alternativamente, substituem-se os resíduos de cisteína relevantes por outro resíduo de aminoácido ou eliminam-se para evitar ligação cruzada. São também adequados métodos in vitro para preparar anticorpos monovalentes. Pode efectuar-se a digestão de anticorpos para produzir seus fragmentos, em particular fragmentos Fab, utilizando técnicas de rotina conhecidas na especialidade. 3. Anticorpos humanos e humanizados

Os anticorpos anti-PR01122 utilizados na presente invenção podem adicionalmente incluir anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recebedor) em que os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do recebedor são substituídos pelos resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho apresentando as especificidade, afinidade e capacidade pretendidas. Em alguns casos, substituem-se resíduos do esqueleto de Fv da 58 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ imunoglobulina humana por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se encontram no anticorpo recebedor, nem nas sequências de CDR ou de esqueleto importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de uma imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado incluirá optimamente também pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., _2:593-596 (1992)] . São bem conhecidos na especialidade métodos para humanizar anticorpos não humanos. Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos, de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são usualmente denominados resíduos de "importação", que são tipicamente tomados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser essencialmente efectuada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por substituição por CDR ou sequências de CDR de roedor as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. 4,816,567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por locais análogos em anticorpos de roedor.

Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na especialidade, incluindo bibliotecas de exibição em fagos [Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. 59 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Biol. 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. De igual modo, podem ser preparados anticorpos humanos por introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgénicos, e.g., ratinhos nos quais os gene de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente inactivados. Após provocação, observa-se a produção de um anticorpo humano, que é muito semelhante ao observado em seres humanos em todos os sentidos, incluindo rearranjo de genes, montagem e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 e nas seguintes publicações científicas: Marks et al., Bio/Technology, K)_:779-783 (1992); Lonberg et al.,

Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996);

Lonberg e Huszar, Intern, Rev. Immunol., l_3:65-93 (1995). 4. Terapia com Pró-fármaco Mediada por Enzima Dependente de Anticorpo (ADEPT)

Os anticorpos da presente descrição podem também ser utilizados em ADEPT por conjugação do anticorpo com uma enzima activadora de pró-fármacos que converte um pró-fármaco (e.g., um agente quimioterapêutico de peptidilo, veja-se WO 81/01145) num fármaco anticanceroso activo. Veja-se, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. 4 975 278. A componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui uma enzima capaz de actuar sobre um pró-fármaco de forma a convertê-lo na sua forma citotóxica, mais activa.

As enzimas que são úteis no método incluem, mas não se lhes limitam, glicosidase, glucose-oxidase, lisozima humana, glucuronidase humana, fosfatase alcalina útil para converter pró-fármacos contendo fosfatos em fármacos livres; arilsulfatase, útil para converter pró-fármacos contendo sulfatos em fármacos livres; citosina-desaminase, útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticanceroso 60 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 5-fluorouracilo; proteases, tais como protease de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases (por exemplo, carboxipeptidase G2 e carboxipeptidase A) e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para converter pró-fármacos contendo péptidos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter pró-fármacos que contêm substituintes D-aminoácido; enzimas que clivam hidratos de carbono, tais como β-galactosidase e neuraminidase, úteis para converter pró-fármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase, útil para converter fármacos derivatizados com β-lactamas em fármacos livres; e penicilina-amidases, tais como penicilina V-amidase ou penicilina G-amidase, úteis para converter fármacos derivatizados nos seus azotos da amina com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, podem ser utilizados anticorpos com actividade enzimática, também conhecidos na especialidade como "abzimas" para converter os pró-fármacos do invento em fármacos activos livres (veja-se, e.g., Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). Podem preparar-se conjugados anticorpo-abzima tal como aqui descrito, para entrega da abzima a uma população de células tumorais.

As enzimas podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos anti-PR01122 por técnicas bem conhecidas na especialidade, tais como a utilização dos agentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, podem ser construídas proteínas de fusão incluindo pelo menos a região de ligação ao antigénio do anticorpo ligada a pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma enzima, utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na especialidade (veja-se, e.g., Neuberger et ai., Nature, 312:604-608 (1984)). 5. Anticorpos biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferivelmente humanos ou humanizados, que apresentam especificidades de ligação para com pelo menos dois antigénios diferentes. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para com um polipéptido PRO1031 e a outra é para com qualquer outro antigénio e preferivelmente para com uma 61 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ proteína ou receptor ou subunidade de receptor de superfície celular. São conhecidos na especialidade métodos para preparar anticorpos biespecíficos. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Dada a distribuição aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais só uma tem a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta é usualmente conseguida por passos de cromatografia de afinidade. Descrevem-se procedimentos semelhantes em WO 93/08829, publicado a 13 de Maio de 1993 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) .

Os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação pretendidas (locais de combinação anticorpo-antigénio) podem ser fundidos com sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é, preferivelmente, com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, caso se pretenda, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados e são co-transfectados num organismo hospedeiro adequado. Para mais detalhes sobre a geração de anticorpos biespecíficos veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita em WO 96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida inclui pelo menos uma parte da região CH3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, substituem-se uma ou mais cadeias laterais pequenas de 62 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo por cadeias laterais maiores (e.g., tirosina ou triptofano). Criam-se "cavidades" de compensação de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(ais) grande(s) na interface da segunda molécula de anticorpo por substituição de cadeias laterais grandes de aminoácidos por cadeias mais pequenas {e.g., alanina ou treonina). Isto proporciona um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodimero relativamente a produtos secundários indesejáveis, tais como homodímeros.

Podem preparar-se anticorpos biespecificos na forma de anticorpos de comprimento completo ou fragmentos de anticorpo (e.g., anticorpos biespecificos F(ab')2). Foram descritas na literatura técnicas para gerar anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos biespecificos utilizando ligação química. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que se clivam proteoliticamente anticorpos intactos para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente de complexação de ditiol, arsenieto de sódio, para estabilizar ditióis vizinhos e evitar a formação de dissulfureto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos nos derivados tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecifico. Os anticorpos biespecificos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização selectiva de enzimas.

Os fragmentos Fab' podem ser recuperados directamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecificos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico F(ab')2 completamente humanizada. Cada fragmento Fab' foi excretado separadamente de E. coli e sujeito a acoplamento químico directo in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que sobre-expressam o receptor ErbB2 e a células T humanas normais, bem como desencadear a actividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humanos. 63 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Foram também descritas várias técnicas para preparar e isolar fragmentos de anticorpos biespecificos directamente da cultura de células recombinantes. Por exemplo, produziram-se anticorpos biespecificos utilizando fechos-de-correr de leucinas. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992) em que se ligaram péptidos fecho-de-correr de leucinas das proteínas Fos e Jun às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão génica. Reduziram-se os homodímeros de anticorpo na região de charneira para formar monómeros e seguidamente re-oxidaram-se para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia do "diacorpo" descrita por Hollinger et al.r Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 9_0: 6444-6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos incluem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) através de um ligante que é demasiado curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antigénio. Foi também relatada outra estratégia para preparar fragmentos de anticorpos biespecificos por utilização de dímeros Fv de cadeia simples (sFv). Veja-se, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Estão contemplados anticorpos com mais de duas valências. Por exemplo, podem preparar-se anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991).

Anticorpos biespecificos exemplificativos podem ligar-se a dois epítopos diferentes numa determinada proteína "Pro". Alternativamente, pode combinar-se um braço anti-proteína "PRO" com um braço que se liga a uma molécula desencadeadora num leucócito, tal como uma molécula de receptor de célula τ (e.g., CD2, CD3, CD28 ou B7) ou receptores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de modo a focar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa a proteína "PRO" particular. Os anticorpos biespecificos podem ser também utilizados para localizar agentes citotóxicos em 64 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ células que expressam um polipéptido "PRO" particular. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a "PRO" e um braço que se liga a um agente citotóxico ou um quelante de radionuclidos, tal como eotube, DPTA, dota ou teta. Outro anticorpo biespecifico de interesse liga o polipéptido "PRO" e liga adicionalmente o factor tissular (TF). 6 . Anticorpos heteroconjugados

Os anticorpos heteroconjugados estão também no âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos ligados covalentemente. Estes anticorpos foram, por exemplo, propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas [Patente U.S. 4,676,980] e para tratamento de infecção por VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Está contemplado que os anticorpos possam ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos em quimica de síntese de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, podem construir-se imunotoxinas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou por formação de uma ligação tioéter. Os exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os descritos, por exemplo, em Patente U.S. 4,676,980. 7. Manipulação da Função Efectora

Pode ser desejável modificar o anticorpo utilizado no invento relativamente à função efectora, de modo a aumentar a eficácia do anticorpo. Por exemplo, pode(m) introduzir-se resíduo(s) de cisteína na região Fc, permitindo assim formação de ligação dissulfureto intercadeia nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) melhoradas. Veja-se, Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922 (1992) . Podem também preparar-se anticorpos homodiméricos com actividade antitumoral aumentada utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais, tal como descrito em Wolff et al., Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode manipular-se um anticorpo que tem regiões Fc duplas e 65 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ pode portanto apresentar capacidades de lise de complemento e ADCC melhoradas. Veja-se, Stevenson et al., Anti-Cancer Druq Design, 3_:219-230 (1989). 8. Imunoconjugados O invento refere-se também a imunoconjugados compreendendo um anticorpo conjugado com um agente citotóxico, tal como um agente quimioterapêutico, uma toxina (por exemplo, uma toxina activa enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou seus fragmentos ou uma toxina de molécula pequena) ou um isótopo radioactivo (í.e., um radioconjugado).

Foram descritos acima agentes quimioterapêuticos úteis na geração destes imunoconjugados. As toxinas de proteína enzimaticamente activas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem, cadeia A de difteria, fragmentos activos não ligantes de toxina de difteria, toxina da cólera, toxina botulinica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, protões de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, saporina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. As toxinas de molécula pequena incluem, por exemplo, caliqueamicinas, maitansinóides, palitoxina e CC1065. Encontram-se disponíveis vários radionuclidos para a produção pi p ioq de anticorpos radioconjugados. Os exemplos incluem, Bi, I, 131ln, 90Y e 186Re.

Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são preparados utilizando vários agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tais como suberato de dissuccinimidilo), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoíl)hexanodiamina), derivados bis-diazónio (tal como bis-(p-diazónio-benzoíl)etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) compostos de flúor bis- 66 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, pode ser preparada uma imunotoxina de ricina tal como descrito em Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). Constitui um exemplo de agente quelante para a conjugação de radionucleótidos ao anticorpo, o ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilenotriaminopenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono-14. Veja-se WO94/11026.

Noutra concretização, o anticorpo pode ser conjugado com um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização no pré-direccionamento a tumores em que o conjugado anticorpo-receptor é administrado ao doente, seguido de remoção do conjugado não ligado da circulação utilizando um agente de depuração e seguidamente administração de um "ligando" (e.g., avidina) que está conjugado a um agente citotóxico (e.g., um radionucleótido). 9. Imunolipossornas

Os anticorpos aqui revelados podem também ser formulados na forma de imunolipossomas. Os lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na especialidade, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8_2:3688 (1985); Hwang et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 7_7:4030 (1980); e Patentes U.S. 4,485,045 e 4,544,545. Revelam-se lipossomas com tempo de circulação aumentado na Patente U.S. 5,013,556.

Podem gerar-se lipossomas particularmente úteis pelo método de evaporação de fase inversa com uma composição de lípidos incluindo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Extrudem-se os lipossomas através de filtros de tamanho de poro definido para obter lipossomas com o diâmetro pretendido. Podem conjugar-se aos lipossomas fragmentos Fab' do anticorpo do presente invento tal como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) através de uma reacção de permuta de dissulfureto. O lipossoma contém no seu interior opcionalmente um agente quimioterapêutico (tal como doxorrubicina). Veja-se, Gabizon et al., J. National Câncer Inst., 81 (19) :1484 (1989). 67 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 10. Composições Farmacêuticas de Anticorpos

Podem administrar-se anticorpos que se ligam especificamente a um polipéptido PR01122 aqui identificado, bem como outras moléculas identificadas pelos ensaios de pesquisa aqui revelados, para o tratamento várias desordens, sob a forma de composições farmacêuticas.

Se um polipéptido PR01122 é intracelular e se são utilizados anticorpos completos como inibidores, são preferidos anticorpos de internalização. Contudo, podem também utilizar-se lipofecções ou lipossomas para entregar o anticorpo ou um fragmento de anticorpo às células. Quando se utilizam fragmentos de anticorpo, é preferido o fragmento de inibição mais pequeno que liga especificamente o domínio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, podem conceber-se moléculas de péptidos que retêm a capacidade de ligar a sequência da proteína alvo. Estes péptidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou ser produzidos por tecnologia de ADN recombinante. Veja-se, e.g., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:7889-7893 [1993]. A formulação aqui pode também conter mais do que um composto activo, conforme necessário para a indicação particular a tratar, preferivelmente os que apresentam actividades complementares que não se afectam adversamente entre si. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode incluir um agente que melhore a sua função, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, citoquinas, agentes quimioterapêuticos ou um agente inibidor do crescimento. Estas moléculas encontram-se presentes adequadamente em combinação em quantidades que são eficazes para o objectivo pretendido.

Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas 68 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ técnicas estão descritas em Reminqton's Pharmaceutical Sciences, supra.

As formulações para utilização em administração in vivo têm que ser estéreis. Isto pode ser facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

Podem preparar-se preparações de libertação sustentada. Os exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, matrizes essas que se encontram sob a forma de artigos conformados, e.g., filmes ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Patente U.S. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto que os polímeros tal como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, determinados hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um longo período de tempo podem desnaturar ou agregar como resultado de exposição a humidade a 37°C, resultando em perda de actividade biológica e possíveis alterações de imunogenicidade. Podem ser concebidas estratégias racionais para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é formação de ligação S-S intermolecular através de permuta de tiossulfureto, pode conseguir-se estabilização por modificação de resíduos sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos adequados e desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas. 69 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ G. Utilizações para Anticorpos anti-PRQ1122

Os anticorpos anti-PR01122 da presente invenção têm várias utilidades. Por exemplo, os anticorpos anti-PROH22 podem ser utilizados em ensaios de diagnóstico para polipéptidos PR01122, e.g., detectando a sua expressão em células, tecidos ou soros específicos. Podem ser utilizadas várias técnicas de ensaio de diagnóstico conhecidas na especialidade, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche directos ou indirectos, ensaios de imunoprecipitação conduzidos em fases heterogéneas ou homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of

Technigues, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Os anticorpos utilizados nos ensaios podem ser marcados com uma porção detectável. A porção detectável deverá ser capaz de produzir, quer directa ou indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal

q i 4 q p qq 19S como H, C, P, S ou I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina, ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano. Qualquer método conhecido na especialidade para a conjugação do anticorpo à porção detectável pode ser empregue, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, _13:1014 (1974); Pain et al., J.

Immunol. Meth., 4_0_:219 (1981) ; e Nygren, J. Histochem. and

Cytochem., 3_0 : 407 (1982).

Os anticorpos anti-PR01122 também são úteis para a purificação por afinidade de polipéptidos PR01122 a partir de uma cultura de células recombinantes ou fontes naturais. Neste processo, os anticorpos contra um polipéptido PR01122 são imobilizados num suporte adequado, tal como uma resina Sephadex ou um papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na especialidade. O anticorpo imobilizado é então colocado em contacto com uma amostra contendo o polipéptido PR01122 a purificar, e depois o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra excepto o polipéptido PR01122, que fica ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado que irá libertar o polipéptido PR01122 do anticorpo. 70 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ Η. Antagonistas/Agonistas de PRQ1122 A presente descrição abrange métodos de pesquisa de compostos para identificar aqueles que imitam o polipéptido PR01122 (agonistas) ou que previnem o efeito do polipéptido PR01122 (antagonistas). Os ensaios de pesquisa para fármacos antagonistas candidatos são desenhados para identificar compostos que se ligam ou complexam aos polipéptidos PR01122 codificados pelos genes aqui identificados, ou que de outro modo interferem com a interacção dos polipéptidos codificados com outras proteínas celulares. Estes ensaios de pesquisa incluirão ensaios susceptiveis a pesquisa de alto rendimento de bibliotecas quimicas, o que os torna particularmente adequados para a identificação de candidatos a fármacos de molécula pequena.

Os ensaios podem ser realizados numa variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de pesquisa bioquímicos, imunoensaios e ensaios à base de células, que estão bem caracterizados na especialidade. Por exemplo, para pesquisar antagonistas e/ou agonistas de sinalização de PR01122, a mistura de ensaio é incubada sob condições nas quais, excepto quanto à presença do agente farmacológico candidato, o PR01122 induz a libertação de TNF-a pelas células THP-1 com uma actividade de referência. Alternativamente, a actividade testada pode ser a libertação de óxido nítrico (NO) e proteoglicanos por cartilagem articular tratada com IL17 e/ou IL-la.

Em ensaios de ligação, a interacção é a ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura reaccional. Numa concretização particular o polipéptido PR01122 codificado pelo gene aqui identificado ou o candidato a fármaco é imobilizado numa fase sólida, e.g., numa placa de microtítulo, por fixação covalente ou não covalente. A fixação não covalente é geralmente conseguida através do revestimento da superfície sólida com uma solução do polipéptido PR01122 e secagem. Alternativamente, pode ser utilizado um anticorpo imobilizado, e.g., um anticorpo monoclonal, específico para o polipéptido PR01122 a imobilizar, para o ancorar à superfície sólida. O ensaio é realizado por adição do componente não 71 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ imobilizado, que pode ser marcado com um marcador detectável, ao componente imobilizado, que pode ser marcado com um marcador detectável, ao componente imobilizado, e.g., a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reacção está completa, os componentes que não reagiram são removidos, e.g., por lavagem, e os complexos ancorados à superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não imobilizado é portador de um marcador detectável, a detecção do marcador imobilizado sobre a superfície indica que ocorreu complexação. Quando o componente originalmente não imobilizado não é portador de um marcador, a complexação pode ser detectada, por exemplo, utilizando um anticorpo marcado que se liga especificamente ao complexo imobilizado.

Se o composto candidato interactua com, mas não se liga a, um polipéptido PR01122 particular codificado por um gene aqui identificado, a sua interacção com esse polipéptido pode ser ensaiada por métodos bem conhecidos para a detecção de interacções proteína-proteína. Estes ensaios incluem abordagens tradicionais, tais como, e.g., ligação cruzada, co-imunoprecipitação e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Em adição, as interacções proteína-proteína podem ser monitoradas através de gradientes ou colunas cromatográficas. Em adição, as interacções proteína-proteína podem ser monitoradas utilizando um sistema genético à base de levedura descrito por Fields e colaboradores (Fields e Song, Nature 340: 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 88: 9578-9582 (1991) como descrito por Chevray e Nathans, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5789-5-791 (1991). Muitos activadores da transcrição, tais como GAL4 de levedura, consistem em dois domínios modulares fisicamente discretos, um que actua como domínio de ligação ao ADN, enquanto o outro funciona como domínio de activação da transcrição. O sistema de expressão em levedura descrito nas publicações anteriores (genericamente referido como "sistema de dois híbridos") toma a vantagem desta propriedade, e emprega proteínas de dois híbridos, uma em que a proteína alvo está fundida com o domínio de ligação ao ADN de GAL4, e outra em que as proteínas de activação candidatas estão fundidas com o domínio de activação. A expressão do gene repórter GALl-lacZ sob o controlo de um promotor activado por GAL4 depende da 72 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ reconstituição da actividade de GAL4 por via da interacção proteína-proteína. As colónias que contêm polipéptido com interacção são detectadas com substrato cromogénico para a β-galactosidase. Está comercialmente disponível na Clontech um kit completo (MATCHMAKER™) para a identificação de interacções proteína-proteína entre duas proteínas específicas utilizando a técnica dos dois híbridos. Este sistema pode também ser estendido ao mapeamento de domínios de proteínas envolvidos em interacções específicas da proteína assim como para apontar resíduos de aminoácido que são cruciais para estas interacções.

Os compostos que interferem com a interacção de um gene que codifica um polipéptido PRO 1122 aqui identificado e outros componentes intra- ou extracelulares, podem ser testados como se segue: usualmente, prepara-se uma mistura reaccional contendo o produto do gene e o componente intra- ou extracelular sob condições e durante um tempo que permitam a interacção e a ligação dos dois produtos. Para testar a capacidade de um composto candidato inibir a ligação, a reacção é realizada na ausência e na presença do composto de teste. Em adição, pode ser adicionado um placebo a uma terceira mistura reaccional, para servir como controlo positivo. A ligação (formação do complexo) entre o composto de teste e o componente intra- ou extracelular presente na mistura é monitorada como atrás descrito. A formação de um complexo na(s) reacção(ões) de controlo mas não na mistura reaccional contendo o composto de teste indica que o composto de teste interfere na interacção do composto de teste com o seu parceiro de reacção.

Os antagonistas podem ser detectados combinando o polipéptido PR01122 e um antagonista potencial com receptores de polipéptido PR01122 ligados à membrana ou receptores recombinantes sob condições apropriadas para um ensaio de inibição competitiva. O polipéptido PR01122 pode ser marcado, por exemplo por radioactividade, de modo que o número de moléculas de polipéptido PR01122 ligadas ao receptor pode ser utilizado para determinar a eficácia do antagonista potencial. O gene que codifica o receptor pode ser identificado por números métodos conhecidos dos peritos na especialidade, por exemplo, panning de ligandos e selecção por FACS, Coligan et 73 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ al.r Current Protocols in Immun. 1(2): Ch. 5 (1991). Preferivelmente, emprega-se clonagem de expressão em que se prepara ARN poliadenilado a partir de uma célula responsiva ao polipéptido PR01122 e uma biblioteca de adnc criada a partir deste ARN é dividida em conjuntos e utilizada para transfectar células COS ou outras células que não sejam responsivas ao polipéptido PR01122. As células transfectadas que são crescidas sobre lâminas de vidro são expostas a polipéptido PR01122 marcado. O polipéptido PR01122 pode ser marcado através de uma variedade de meios incluindo iodação ou inclusão de um local de reconhecimento para uma proteína-quinase especifica do local. Após fixação e incubação, as lâminas são submetidas a análise autorradiográfica. Os conjuntos positivos são identificados e preparam-se subconjuntos e re-transfectam-se utilizando um processo interactivo de divisão em sub-conjuntos e nova pesquisa, eventualmente originando um único clone que codifica o receptor putativo.

Como abordagem alternativa para a identificação de receptores, o polipéptido PR01122 marcado pode ser ligado por fotoafinidade a preparações de membrana ou extracto celular que expressam a molécula receptora. O material ligado cruzadamente é resolvido por PAGE e exposto a filme para raios-X. O complexo marcado contendo o receptor pode ser excisado, resolvido em fragmentos peptídicos e submetido a micro-sequenciação de proteínas. A sequência de aminoácidos obtida a partir da micro-sequenciação seria utilizada para desenhar um conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para pesquisar uma biblioteca de ADNc para identificar o gene que codifica o receptor putativo.

Noutro ensaio para antagonistas, células de mamífero ou uma preparação de membrana que expressa o receptor seriam incubadas com polipéptido PR01122 marcado na presença do composto candidato. A capacidade do composto para aumentar ou bloquear esta interacção pode então ser removida.

Exemplos mais específicos de potenciais antagonistas incluem um oligonucleótido que se liga às fusões de imunoglobulina com polipéptido PR01122, e, em particular, anticorpos incluindo, sem limitação, anticorpos poli- e 74 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ monoclonais ou fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia única, anticorpos anti-idiotipicos e versões quiméricas ou humanizadas destes anticorpos ou fragmentos, assim como anticorpos e fragmentos de anticorpos humanos. Alternativamente, um potencial antagonista pode ser uma proteina estreitamente relacionada, por exemplo, uma forma mutada do polipéptido PR01122 que reconhece o receptor mas não confere efeito, inibindo assim competitivamente a acção do polipéptido PR01122.

Outro potencial antagonista de polipéptido PR01122 é uma construção de ADN ou ARN anti-sentido preparada utilizando a tecnologia anti-sentido, onde, e.g., uma molécula de ARN ou ADN anti-sentido actua para bloquear directamente a tradução de ARNm por hibridação com ARNm alvo e prevenir a sua tradução numa proteina. A tecnologia anti-sentido pode ser utilizada para controlar a expressão génica através da formação de hélices triplas ou ADN ou ARN anti-sentido, sendo ambos os métodos baseados na ligação de um polinucleótido a ADN ou ARN. Por exemplo, a porção de codificação a 5' da sequência polinucleotidica, que codifica aqui os polipéptidos PR01122 maduros, é utilizada para desenhar uma sequência oligonucleotidica de ARN anti-sentido, que codifica aqui os polipéptidos PR01122 maduros, é utilizada para desenhar um oligonucleótido de ARN anti-sentido de cerca de 10 a 40 pares de bases de comprimento. Um oligonucleótido de ADN é desenhado para ser complementar a uma região do gene envolvida na transcrição (hélice tripla - veja-se Lee et al., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); Dervan et al., Science 251: 1360 (1991)), desse modo evitando a transcrição e a produção do polipéptido PR01122. O oligonucleótido de ARN anti-sentido híbrida com o ARNm in vivo e bloqueia a tradução da molécula de ARNm no polipéptido PR01122 (anti-sentido - Okano, Neurochem. 546: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL. 1988). Os oligonucleótidos atrás descritos podem também entregues às células de modo a que o ARN ou ADN anti-sentido possam ser expressos In vivo para inibir a produção do polipéptido PR01122. Quando se utiliza ADN anti-sentido, preferem-se oligodesoxirribonucleótidos derivados do local de iniciação da 75 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ tradução, e.g., entre cerca das posições -10 e +10 da sequência nucleotidica do gene alvo.

Os antagonistas potenciais incluem pequenas moléculas que se ligam ao local activo, ao local de ligação ao receptor ou factor de crescimento ou outro local de ligação relevante do polipéptido PR01122, desse modo bloqueando a actividade biológica normal do polipéptido PR01122. Os exemplos de moléculas pequenas incluem, mas não se lhes limitam, péptidos pequenos ou moléculas tipo péptido, preferivelmente péptidos solúveis e compostos orgânicos ou inorgânicos não peptidilo sintéticos.

As ribozimas são moléculas de ARN enzimáticas capazes de catalisar a clivagem específica de ARN. As ribozimas actuam por hibridação específica da sequência com o ARN alvo complementar, seguida de clivagem endonuclítica. Os locais de clivagem específicos para a ribozima num ARN alvo potencial podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para mais detalhes, veja-se e.g., Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994) e a publicação PCT N.° WO 97/33551 (publicado em 18 de Setembro, 1997) .

As moléculas de ácido nucleico em formação de hélice tripla utilizadas para inibir a transcrição deverão ser de cadeia simples e compostas por desoxinucleótidos. A composição de bases destes oligonucleótidos é desenhada de modo a que promova a formação de hélices triplas por via das regras de emparelhamento de bases de Hoogsteen, que geralmente requerem trechos dimensionáveis de purinas ou pirimidinas numa cadeia de uma dúplice. Para mais detalhes veja-se, e.g., publicação PCT N.° WO 97/33551, supra. I. Utilizações de Diagnóstico

Outra utilização dos compostos aqui revelados (e.g., variantes de PR01122 e anticorpos anti-PROH22) aqui descrita consiste em auxiliar o diagnóstico de se uma desordem é conduzida, em algum grau, por sinalização modulada por PR01122. 76 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Um ensaio de diagnóstico para determinar se uma desordem em particular (e.g., desordem cartilaginosa degenerativa) é conduzida por sinalização de PR01122, pode ser realizado utilizando os passos seguintes: (1) cultura de células ou tecidos de teste que expressam PR01122; (2) administração de um composto que pode inibir a sinalização modulada por PR01122; e (3) medição dos efeitos fenotipicos mediados por PR01122 nas células de teste. Os passos podem ser realizados utilizando técnicas Standard à luz da presente descrição. Por exemplo, podem ser utilizadas técnicas Standard para isolar células ou tecidos e cultura ou in vivo.

Compostos com vários graus de selectividade são úteis para o diagnóstico do papel do PR01122. Por exemplo, compostos que PR01122 em adição a outra forma de molécula adaptadora podem ser utilizados como composto de teste inicial para determinar se uma de várias moléculas adaptadoras conduzem a desordem. Os compostos selectivos podem então ser utilizados para adicionalmente eliminar o possível papel das outras proteínas adaptadoras na condução da desordem. Os compostos de teste deverão ser mais potentes na inibição de actividade de sinalização intracelular do que a exercer um efeito citotóxico (e.g., uma IC5o/LD5o superior a um). As ΙΟ50 e LD50 podem ser medidas por técnicas Standard, tais como um ensaio MTT, ou por medição da quantidade de LDH libertada. O grau de IC5o/LD5o de um composto deverá ser tomado em conta na avaliação do ensaio de diagnóstico. Geralmente, quanto maior a razão mais relativa a informação. Os controlos apropriados têm em conta o possível efeito citotóxico de um composto, tal como o tratamento de células não associadas a uma desordem proliferativa celular (e.g., células de controlo) com um composto de teste, podem também ser utilizados como parte do ensaio de diagnóstico. Os métodos de diagnóstico da invenção envolvem a pesquisa de agentes que modulam os efeitos de PR01122 após desordens cartilaginosas degenerativas. Os exemplos de técnicas de detecção incluem marcação radioactiva e imunoprecipitação (U.S.P. 5,385, 915) .

Por exemplo, anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo, podem ser utilizados para qualitativa ou quantitativamente detectar a expressão de proteínas codificadas pelos genes relacionados com doenças ("produtos de 77 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ genes marcadores"). Ο anticorpo preferivelmente é equipado com um marcador detectável, e.g. fluorescente, e a ligação pode ser monitorada por microscopia óptica, citometria de fluxo, fluorimetria, ou outras técnicas conhecidas na arte. A detecção in situ da ligação de anticorpos aos produtos de genes marcadores pode ser realizada, por exemplo, por imunofluorescência ou microscopia imunoelectrónica. Para este fim, um espécime histológico é removido do paciente, e um anticorpo marcado é-lhe aplicado, preferivelmente por recobrimento com o anticorpo de uma amostra biológica. Este procedimento permite também a determinação da distribuição do produto do gene marcador no tecido examinado. Será evidente para os peritos na especialidade que uma ampla variedade de métodos histológicos estão prontamente disponíveis para detecção in situ. J. Composições Farmacêuticas O PR01122 ou seus antagonistas (e.g., anticorpos), assim como outras moléculas identificadas pelos ensaios de pesquisa aqui descritos, podem ser empregues como agentes terapêuticos. Estes agentes terapêuticos são formulados de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, através das quais o PRO 1122, os seus antagonistas ou agonistas, são combinados em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável.

No caso de anticorpos antagonistas de PR01122, se a proteína codificada pelo gene amplificado for intracelular e forem utilizados anticorpos completos como inibidores, preferem-se anticorpos internalizantes. Contudo, podem também utilizar-se lipofecções ou lipossomas para entregar o anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, às células. Quando se utilizam fragmentos de anticorpo, prefere-se o menor fragmento inibidor que se liga especificamente ao domínio de ligação da proteína alvo. Por exemplo, com base nas sequências da região variável de um anticorpo, podem-se desenhar moléculas peptídicas que retêm a capacidade para se ligarem à sequência da proteína alvo. Estes péptidos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de ADN 78 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ recombinante (veja-se, e.g. Marasco et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 90: 7889-7893 [1993]).

As formulações terapêuticas são preparadas para armazenagem por mistura do ingrediente activo possuindo o grau de pureza desejado com transportadores, excipientes ou estabilizantes opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os beneficiários nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butilico ou benzilico; alquilparabenos tais como metil- ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (e.g. complexos Zn-proteína); e/ou tensioactivos nao íonicos tais como TWEEN ,

TM PLURONICS ou polietilenoglicol (PEG). A presente formulação pode também conter mais do que um composto activo, conforme necessário para a indicação particular a tratar, preferivelmente aqueles com actividades complementares que não se afectam adversamente entre si. Alternativamente, ou em adição, a composição pode compreender um agente citotóxico, uma citoquina ou um agente inibidor do crescimento. Estas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos. 79 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Os ingredientes activos podem também ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanoparticulas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a utilizar para administração in vivo têm que ser estéreis. Isto é prontamente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.

As presentes composições terapêuticas são geralmente colocadas num recipiente possuindo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica.

Podem preparar-se preparações de libertação sustentada. Os exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o anticorpo, matrizes estas que são na forma de artigos conformados, e.g. filmes ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactidos (Pat. U.S. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. A microencapsulação de proteínas recombinantes para libertação sustentada foi realizada com sucesso com hormona de crescimento humana (rhGH), interferão- rhIFN-), interleucina-2, e MN rpg 120. Johnson et al., Nat. Med. 2: 795-799 (1996); Yasuda et al., Biomed. Ther. 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technoloqy 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and

Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide 80 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Polyglycolide Microsphere Systems." Em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman. eds., (Penum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692; WO 96/40072; WO 96/07399; e Pat. U.S. 5,654,010.

As formulações de libertação sustentada destas proteínas podem ser desenvolvidas utilizando polímero ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) devido à sua biocompatibilidade e ampla gama de propriedades biodegradáveis. Os produtos da degradação de PLGA, ácidos láctico e glicólico, podem ser rapidamente eliminados do corpo humano. Adicionalmente, a degradabilidade deste polímero pode ser ajustada de meses a anos, dependendo do seu peso molecular e composição. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", em Biodegradable Polymers as Druq Delivery Systems (Mareei Dekker; New York, 1990), M. Chasin e R. Langer (Eds.) pp. 1-41.

Enquanto polímeros como etileno-acetato de vinilo e ácido láctico-ácido glicólico permitem a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um longo período de tempo, podem desnaturar ou agregar-se em resultado de exposição a humidade a 37°C, resultando uma perda de actividade biológica e possíveis alterações de imunogenicidade. Podem ser deduzidas estratégias racionais para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, quando se verifica que o mecanismo de agregação é a formação de ligações S-S intermoleculares através de permuta de tiodissulfureto, a estabilização pode ser conseguida por modificação de resíduos de sulfidrilo, liofilização a partir de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições de matrizes poliméricas específicas. K. Métodos de Tratamento

Está contemplado que os compostos da presente invenção possam ser utilizados para tratar várias condições, incluindo as que são caracterizadas por sobre-expressão e/ou activação dos genes associados à doença aqui identificados. A invenção 81 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ proporciona utilizações relacionadas para polipéptidos PR01122 e antagonistas assim como antagonistas para utilização nestes métodos, ambos como definido nas reivindicações. Os exemplos de condições ou desordens a tratar com estes anticorpos e outros compostos, incluindo, mas não se lhes limitando, moléculas anti-sentido, etc. incluem desordens inflamatórias e imunológicas, especialmente aquelas que são caracterizadas por quebra da matriz de cartilagem tais como artrite, (e.g., osteoartrite, artrite psoriática, artrite reumatóide) ou outras doenças inflamatórias degenerativas.

Os agentes activos da presente invenção, e.g. anticorpos, são administrados a um mamífero, preferivelmente um ser humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como por administração intravenosa na forma de bolus ou por infusão continua ao longo de um período de tempo, por administração intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intracerebrospinal, subcutânea, intra-acucutar, intra-sinovial, intratecal, intra-ocular, intralesional, oral, tópica, por inalação ou através de libertação sustentada.

Podem combinar-se outros regimes terapêuticos com a administração do PR01122, ou dos antagonistas, e.g. anticorpos da presente invenção.

Para a prevenção ou tratamento de doenças, a dosagem apropriada de um agente activo, (e.g. um anticorpo) dependerá do tipo de doença a tratar, como atrás definido, da gravidade e decurso da doença, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia prévia, da história clinica do paciente e da resposta ao agente, e da opinião do medico assistente. O agente é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez ou ao longo de uma série de tratamentos.

As dosagens e a concentração de fármaco desejadas das composições farmacêuticas da presente invenção podem variar dependendo da utilização particular pretendida. A determinação da dosagem ou via de administração apropriadas está bem dentro das competências de um perito. Experiências com animais proporcionam directrizes fiáveis para a determinação das doses eficazes para terapia humana. A passagem de escala inter- 82 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ espécies de doses eficazes pode ser realizada seguindo os princípios estabelecidos por Mordenti, J. e Chappell. W. "The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics." Em Toxicokinetics and New Druq Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46.

Quando se emprega a administração in vivo de um polipéptido PR01122 ou um seu agonista ou antagonista, as quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10 ng/kg até 100 mg/kg de peso corporal do mamífero ou mais, por dia, preferivelmente cerca de 1 pg/kg/dia até 100 mg/kg de peso corporal do mamífero ou mais, por dia, dependendo da via de administração. É proporciona orientação quanto a dosagens e métodos de entrega particulares na literatura; veja-se, por exemplo, Pat. U.S. 4,657,760, 5,206,344 ou 5,255,212. Está no âmbito da invenção que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes desordens, que a administração com alvo num órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de entrega de uma maneira diferente da que é usada para outro órgão ou tecido. Adicionalmente, as dosagens podem ser administradas através de uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. A progressão desta terapia é facilmente monitorada por técnicas e ensaios convencionais. L. Artigos de Fabrico

Pode ser proporcionado um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o diagnóstico ou tratamento das desordens atrás descritas. O artigo de fabrico compreende um recipiente e um rótulo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente retém uma composição que é eficaz para o diagnóstico ou tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco ou frasco de solução intravenosa possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica). O 83 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ agente active na composição é tipicamente um polipéptido PR01122, um seu antagonista ou agonista. O rótulo sobre, ou associado ao, recipiente indica que a composição é utilizada para o diagnóstico ou tratamento da condição de eleição. O artigo de fabrico pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de utilização.

Os exemplos que se seguem são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção de nenhum modo.

EXEMPLOS

Os reagentes disponíveis no comércio referidos nos exemplos foram utilizados conforme as instruções do fabricante a menos que indicado de outro modo. A fonte das células identificadas nos exemplos que se seguem, e em todo o fascículo, pelos números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. EXEMPLO 1 Antecedente: Isolamento de Clones de ADNc que Codificam PRQ1031 Humano

As sequências do domínio extracelular (ECD) (incluindo o sinal de secreção, se existir) de cerca de 950 proteínas segregadas conhecidas da base de dados de proteínas pública Swiss-Prot, foram utilizadas para a pesquisa de bases de dados de marcadores de sequências expressas (EST). As bases de dados de EST incluíam bases de dados de EST públicas (e.g., GenBank, Merck/Wash.U.), e uma base de dados de ADN de EST privada (LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA). A pesquisa foi realizada utilizando o programa de computador BLAST ou BLAST2 (Altshul, et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) na forma de uma comparação das sequências de proteínas ECD com uma tradução através de "6 frame translation" das sequências de EST. Estas comparações que resultam numa pontuação BLAST de 70 (ou em alguns casos de 90) ou mais que 84 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ não codificavam proteínas conhecidas foram agrupadas e montadas em sequências de ADN de consenso com o programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington).

Um fragmento de sequência virtual inicial (montagem de consenso) foi montado relativamente a outras sequências EST utilizando phrap. A sequência de ADN de consenso inicial foi prolongada utilizando ciclos repetidos de BLAST e phrap para estender a sequência de consenso tanto quanto possível utilizando as fontes de sequências EST atrás discutidas. O resultado desta montagem é mostrado na Figura 5 (SEQ ID NO:5), também referida como DNA47332.

Uma sequência compreendendo a montagem de consenso, W74558 (clone 344649) (SEQ ID NO:6) foi adicionalmente examinada. A sequência foi obtida do consórcio IMAGE e analisada, Lennon et al., Genomics 33: 151 (1996). A sequenciação do ADN originou a sequência de ADN de comprimento completo para PRO1031 [aqui designada como DNA59294-1381] (SEQ ID NO:2) e a sequência da proteína derivada PRO1031 (UNQ516) (SEQ ID NO:1). A totalidade da sequência nucleotídica de DNA59294-1381 é apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2). O Clone DNA59294-1381 contém um único quadro de leitura aberto com um aparente local de iniciação da tradução nas posições de nucleótido 42-44 e terminando no codão de paragem nas posições de nucleótido 582-584 (Figura 2) (SEQ ID NO:2). O polipéptido precursor previsto tem 180 aminoácidos de comprimento (Figura 1) (SEQ ID NO:l). A proteína PRO1031 de comprimento completo (UNQ5.16) mostrada na Figura 2 (SEQ ID NO:l) possui um peso molecular estimado de cerca de 20437 e um pi de cerca de 9,58. O clone DNA59294-1381 (SEQ ID NO:2) foi depositado na ATCC e foi-lhe atribuído o número de depósito 209866. No caso de quaisquer irregularidades ou erros de sequenciação com as sequências aqui proporcionadas, entende-se que o clone depositado contém a sequência correcta para DNA59624 (SEQ ID NO:2). Adicionalmente, as sequências aqui proporcionadas são o resultado de técnicas de sequenciação conhecidas. 85 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ A análise da sequência de aminoácidos do polipéptido PRO1031 de comprimento completo (UNQ516) (SEQ ID NO:l) sugere que esta é uma nova citoquina. A análise adicional da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 revela que o péptido de sinal putativo está a cerca dos aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO:2. Uma local de N-glicosilação está a cerca dos aminoácidos 75-78 de SEQ ID NO:2. Uma região possuindo identidade de sequência com il-17 está a cerca dos aminoácidos 96-180. Os nucleótidos correspondentes podem ser rotineiramente determinados dadas as sequências aqui proporcionadas. EXEMPLO 1: Isolamento de clones de ADNc que Codificam PRQ1122 Humano

Uma base de dados de ADN de sequências marcadoras expressas (EST) (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA) foi pesquisada e foi identificada uma EST. A EST era Incyte 1347533 (SEQ ID NO:7) também denominada DNA49665. Com base em DNA49665 (SEQ ID NO:7), sintetizaram-se oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR uma biblioteca de ADNc que continha a sequência de interesse, e 2) para utilização como sondas para isolar um clone da sequência de codificação de comprimento completo para o PR01122, [e.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Os iniciadores directo e inverso de PCR geralmente variam de 20 a 30 nucleótidos e são muitas vezes desenhados para originar um produto de PCR de cerca de 100-1000 pb de comprimento. As sequências de sondas têm tipicamente 40-55 pb de comprimento. Em alguns casos, são sintetizados oligonucleótidos adicionais quando a sequência de consenso é superior a cerca de 1-1,5 kpb. De modo a efectuar a pesquisa de várias bibliotecas quanto a um clone de comprimento completo, o ADN das bibliotecas foi pesquisado por amplificação por PCR, seguindo Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Bíology, com o par de iniciadores de PCR. Foi então utilizada uma biblioteca positiva para isolar 86 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ clones que codificam o gene de interesse utilizando a sonda oligonucleotidica e um dos pares de iniciadores. iniciador de PCR directo: 5'-ATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCG-3' (SEQ ID NO:8) iniciador de PCR inverso: 5'-GGGACGTGGATGAACTCGGTGTGG-3' (SEQ ID NO:9) sonda de hibridação: 5'-TATCCACAGAAGCTGGCCTTCGCCGAGTGCCTGTGCAGAG-3' (SEQ ID NO:10).

De modo a pesquisar várias bibliotecas quanto a uma fonte de um clone de comprimento completo, pesquisou-se o ADN das bibliotecas por amplificação por PCR com o par de iniciadores de PCR atrás identificado. Foi então utilizada uma biblioteca positiva para isolar clones que codificam o gene de PR01122 utilizando a sonda oligonucleotidica e um dos iniciadores de PCR. O ARN para a construção das bibliotecas de ADNc foi isolado a partir de tecido de rim fetal humano. As bibliotecas de ADNc utilizadas para isolar os clones de ADNc foram construídas utilizando métodos Standard utilizando reagentes disponíveis no comércio tais como os da Invitrogen, San Diego, CA. O ADNc foi iniciado com oligo dT contendo um local NotI, ligado com extremidades lisas a adaptadores tratados com hemiquinase Sall, clivado com NotI, apropriadamente dimensionado por electroforese em gel, e clonado numa orientação definida num vector de clonagem adequado (tal como pRKB ou pRKD; pRK5B é um precursor de pRK5D que não contêm o local Sfil; veja-se, Holmes et al., Science, 235:1278-1280 (1991)) nos locais únicos Xhol e NotI. A sequenciação do ADN dos clones isolados como descrito acima originou a sequência de ADN de comprimento completo para o PR01122 [aqui designada como DNA62377-1381-1] (SEQ ID NO:4), e a sequência derivada da proteína PR01122 (UNQ561) (SEQ ID NO:3). A totalidade da sequência nucleotídica de DNA62377-1381-1 (SEQ ID NO:4) está apresentada nas Figuras 4A-4B (SEQ ID NO:4). O clone DNA62377-1381-1 (SEQ ID NO:4) contém um único quadro de leitura aberto com um local de iniciação da tradução 87 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ aparente nas posições de nucleótido 50-52 e terminando no codão de paragem nas posições de nucleótido 641-643 de SEQ ID NO:4 (Figuras 4A-4B). O precursor polipeptidico previsto tem 197 aminoácidos de comprimento (Figura 3) (SEQ ID NO:3). A proteína PR01122 de comprimento completo mostrada na Figura 3 (UNQ561) (SEQ ID NO:3) tem um peso molecular estimado de cerca de 21765 daltons e um pi de cerca de 8,53. O clone DNA62377-1381-1 foi depositado na ATCC em 22 de Dezembro, 1998, e foi-lhe atribuído o número de depósito 203552. Entende-se que na eventualidade de uma irregularidade de sequenciação ou erro nas sequências aqui proporcionadas, a sequência correcta é a sequência depositada. Adicionalmente, todas as sequências aqui proporcionadas são o resultado de técnicas de sequenciação conhecidas. A análise da sequência de aminoácidos do PR01122 (UNQ561) de comprimento completo isolado sugere que esta possui similaridade com IL-17, indicando assim que PR01122 (UNQ561) pode ser uma nova citoquina. A Figura 3 (SEQ ID NO:3) mostra também as localizações aproximadas do péptido de sinal, do padrão de fecho-de-correr de leucinas e uma região possuindo identidade de sequência com IL-17. Os nucleótidos correspondentes podem ser rotineiramente determinados, e.g., por referência a Figuras 4A-4B. EXEMPLO 2: Utilização de ADN que codifica PR01122 como sonda de hibridação O método seguinte descreve a utilização de uma sequência de nucleótidos que codifica PR01122 na forma de sonda de hibridação. ADN compreendendo a sequência de codificação de PR01122 de comprimento completo (conforme mostrado na Figura 4, SEQ ID NO: 4) ou um seu fragmento, é empregue como sonda para a pesquisa de ADN homólogos (tais como os que codificam variantes de ocorrência natural de PR0122) em bibliotecas de ADNc de tecido humano ou bibliotecas genómicas de tecido humano. A hibridação e a lavagem de filtros contendo ADN das bibliotecas são realizadas sob as seguintes condições de 88 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ elevado rigor. A hibridação da sonda derivada do polipéptido PR01122 radiomarcada aos filtros é realizada numa solução de formamida a 50%, 5x SSC, SDS a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8, 2x Solução de Denhardt e sulfato de dextrano a 10%, a 42°C durante 20 horas. A lavagem dos filtros é realizada numa solução aquosa de 0,lx SSC e SDS a 0,1%, a 42°C.

Os adn possuindo uma identidade de sequências desejada com o ADN que codifica o polipéptido PR01122 de comprimento completo de sequência nativa podem então ser identificados utilizando técnicas Standard conhecidas na arte. EXEMPLO 3: Expressão de Polipéptidos PR01122 em E. coli

Este exemplo ilustra a preparação de formas não glicosiladas de polipéptidos PR01122 por expressão recombinante em E. coli. A sequência de ADN que codifica o PR01122 de comprimento completo ou um seu fragmento ou variante, é inicialmente amplificada utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores deverão conter locais para enzimas de restrição que correspondem aos locais para enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado. Pode ser empregue uma variedade de vectores de expressão. Um exemplo de um vector adequado é o pBR322 (derivado de E. coli; veja-se Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contém genes para resistência a ampicilina e a tetraciclina. O vector é digerido com enzimas de restrição e desfosforilado. As sequências amplificadas por PCR são então ligadas ao vector. O vector incluirá preferivelmente sequências que codificam para um gene de resistência a antibiótico, um promotor trp, um comando poli-His (incluindo os primeiros seis codões de STII, a sequência poli-His e o local de clivagem para a enteroquinase), a região de codificação de PR01122, o terminador de transcrição lambda e um gene argU. A mistura de ligação é então utilizada para transformar uma estirpe de E. coli seleccionada utilizando os métodos descritos em Sambrook et al., supra. Os transformantes são identificados pela sua capacidade para crescer em placas LB e 89 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ as colónias resistentes ao antibiótico são então seleccionadas. O ADN plasmídico pode ser isolado e confirmado por análise de restrição e sequenciação do ADN.

Os clones seleccionados podem ser crescidos durante a noite em meio de cultura liquido tal como caldo LB suplementado com antibióticos. A cultura da noite pode subsequentemente ser utilizada para inocular uma cultura em maior escala. As células são então crescidas até uma densidade óptica desejada, durante o que o promotor de expressão é activada.

Após cultura das células durante mais várias horas, as células podem ser recolhidas por centrifugação. A pelete celular obtida na centrifugação pode ser solubilizada utilizando vários agentes conhecidos na arte, e o polipéptido PR01122 solubilizado pode então ser purificado utilizando uma coluna quelante de metais sob condições que permitam uma forte ligação do polipéptido. EXEMPLO 4: Expressão de polipéptidos PR01122 em células de mamífero

Este exemplo ilustra a preparação de formas glicosiladas de polipéptidos PR01122 por expressão recombinante em células de mamifero. O vector, pRK5 (veja-se EP 307 247, publicado em 15 de Março de 1989), é empregue como vector de expressão. Opcionalmente, o ADN que codifica o PR01122 é ligado a pRK5 com enzimas de restrição seleccionadas para permitir a inserção do ADN que codifica PR01122 utilizando métodos de ligação tal como descrito em Sambrook et al., supra. O vector resultante é denominado pRK5-PR01122.

Numa concretização, as células hospedeiras seleccionadas podem ser células 293. As células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são crescidas até à confluência em placas de cultura de tecidos num meio tal como DMEM suplementado com soro de vitelo fetal e opcionalmente, componentes nutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 μρ de ADN de pRK5-PR01122 são misturados com cerca de 1 μρ de ADN que codifica o gene VA ARN 90 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] e dissolvidos em 500 μΐ de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0,227 Μ. A esta mistura adicionaram-se, gota a gota, 500 μΐ de HEPES 5 0 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaP04 1,5 mM, e deixa-se o precipitado formar durante 10 minutos a 25°C. O precipitado é suspendo e adicionado às células 293 e deixa-se assentar durante cerca de quatro horas a 37°C. O meio de cultura é aspirado e adicionam-se 2 ml de glicerol a 20% em PBS durante 30 segundos. As células 293 são então lavadas com meio isento de soro, adiciona-se meio fresco e incubam-se as células durante cerca de 5 dias.

Aproximadamente 24 horas depois das transfecções, o meio de cultura é removido e substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio de cultura contendo 200 μθί/ιη1 de 35S-cisteina e 200 μοί/ιηΐ de 35S-metionina. Após uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado num filtro rotativo, e carregado sobre um gel de SDS a 15%. O gel processado pode ser seco e exposto a um filme durante um periodo de tempo seleccionado para revelar a presença de polipéptido PR01122. As culturas contendo células transfectadas podem sofrer uma incubação adicional (em meio isento de soro) e o meio é testado em bioensaios seleccionados.

Numa técnica alternativa, o ADN que codifica PR01122 pode ser introduzido em células 293 transientemente utilizando o método do sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci.r 12:7575 (1981). As células 293 são crescidas até uma densidade máxima num balão rotativo e adicionaram-se 700 μρ de ADN de pRK5-PROH22. As células são primeiro concentradas a partir do balão rotativo por centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de ADN-dextrano é incubado na pelete de células durante quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% durante 90 segundos, lavadas com meio de cultura de tecidos, e reintroduzidas no balão rotativo contendo o meio de cultura de tecidos, 5 μρ/ml de insulina bovina e 0,1 μρ/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatro dias, o meio condicionado é centrifugado e filtrado para remover as células e os detritos. A amostra contendo o polipéptido PR01122 expresso pode então ser 91 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ concentrada e purificada por qualquer método seleccionado, tal como diálise e/ou cromatografia em coluna.

Noutra concretização, o polipéptido PR01122 pode ser expresso em células CHO. O vector pRK5-PR01122 pode ser transfectado para células CHO utilizando reagentes conhecidos tais como CaP04 ou DEAE-dextrano. Tal como atrás descrito, as culturas de células podem ser incubadas, e o meio substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio contendo um marcador radioactivo tal como S-metionina. Após determinação da presença de PR01122, o meio de cultura pode ser substituído por meio isento de soro. Preferivelmente, as culturas são incubadas durante cerca de 6 dias, e depois o meio condicionado é recolhido. O meio contendo o polipéptido PR01122 expresso pode então ser concentrado e purificado por qualquer método seleccionado. O polipéptido PR01122 marcado com um epítopo pode também ser expresso em células hospedeiras CHO. O adn que codifica PR01122 pode ser subclonado fora vector pRK5. A inserção do subclone pode sofrer PCR para fundir em enquadramento com um marcador epitópico seleccionado tal como um marcador poli-His num vector de expressão de baculovírus. A inserção de ADN que codifica PR01122 marcada com poli-His pode então ser subclonada num vector de SV40 contendo um marcador de selecção tal como DHFR para a selecção de clones estáveis. Finalmente, as células CHO podem ser transfectadas (como descrito atrás) com o vector de SV40. A marcação pode ser realizada, como descrito atrás, para verificar a expressão. O meio de cultura contendo o polipéptido PR01122 marcado com poli-His expresso pode então ser concentrado e purificado por qualquer método seleccionado, tal como por cromatografia de afinidade em quelato de Ni2+. EXEMPLO 5: Expressão de um Polipéptido PR01122 em Levedura O método seguinte descreve a expressão recombinante de polipéptidos PR01122 em levedura.

Primeiro, constroem-se vectores de expressão em levedura para a produção intracelular ou secreção de polipéptido PR01122 a partir do promotor ADH2/GAPDH, ADN que codifica o 92 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ polipéptido PR01122 de interesse, um péptido de sinal seleccionado e o promotor é inserido nos locais adequados para enzimas de restrição no plasmideo seleccionado para dirigir a expressão intracelular do polipéptido PR01122. Para secreção, o ADN que codifica o polipéptido PR01122 pode ser clonado no plasmideo seleccionado, juntamente com ADN que codifica o promotor ADH2/GAPDH, a sequência sinal de secreção/de comendo do factor alfa de levedura e sequências ligantes (se necessário) para a expressão do polipéptido PR01122. Células de levedura, tais como a estirpe de levedura AB 110, podem então ser transformadas com os plasmideos de expressão atrás descritos e cultivadas em meios de fermentação seleccionados. Os sobrenadantes de levedura transformada podem ser analisados por precipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação por SDS-PAGE, seguida por coloração dos géis com corante Azul de Coomassie. 0 polipéptido PR01122 recombinante pode ser subsequentemente isolado e purificado por remoção das células de levedura do meio de fermentação por centrifugação e depois concentração do meio utilizando filtros de cartucho seleccionados. O concentrado contendo o polipéptido PR01122 pode ser adicionalmente purificado utilizando resinas de cromatografia em coluna seleccionadas. EXEMPLO 6: Expressão de Polipéptidos PR01122 em Células de Insecto Infectadas com Baculovírus O método seguinte descreve a expressão recombinante de polipéptidos PR01122 em células de insecto infectadas com Baculovirus. O ADN que codifica PR01122 é fundido a montante de um marcador epitópico contido num vector de expressão em baculovirus. Estes marcadores epitópicos incluem marcadores de poli-His e marcadores de imunoglobulina (como regiões Fc de IgG) . Pode ser empregue uma variedade de plasmideos, incluindo plasmideos derivados de plasmideos comercialmente disponíveis tais como pVLl393 (Novagen). Resumidamente, o ADN que codifica PR01122 ou a porção desejada do ADN que codifica PR01122 (tal como a sequência que codifica o domínio extracelular de uma 93 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ proteína transmembranar) é amplificado por PCR com iniciadores complementares às regiões 5' e 3'. O iniciador 5' pode incorporar locais de enzimas de restrição (seleccionados) flanqueadores. O produto é depois digerido com essas enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. O baculovírus recombinante é gerado por co-transfecção do plasmídeo anterior e adn do vírus BaculoGold™ (Pharmingen) em células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponível de GIBCO-BRL). Após 4 a 5 dias de incubação a 28°C, os vírus libertados são colhidos e utilizados para amplificações adicionais. A infecção virai e a expressão de proteína são realizadas como descrito por 0'Reilley et al., Baculovírus Expression vectors: A Laboratory Manual. Oxford: Oxford University Press (1994) . O polipéptido PR01122 marcado com poli-His expresso pode ser então purificado, por exemplo, por cromatografia de afinidade em quelato de Ni2+ como se segue. Preparam-se extractos a partir de células Sf9 recombinantes infectadas com vírus como descrito por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Resumidamente, as células Sf9 são lavadas, ressuspensas em tampão de ultra-sons (25 mL de Hepes, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; Glicerol a 10%; NP-40 a 0,1%; KC1 0,4 M), e tratadas com ultra-sons duas vezes durante 20 segundos em gelo. Os resultantes do tratamento com ultra-sons são clarificados por centrifugação e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, Glicerol a 10%, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 pm. Prepara-se uma coluna de agarose Ni2+-NTA (comercialmente disponível de Qiagen) com um volume de leito de 5 mL, lava-se com 25 mL de água e equilibra-se com 25 mL de tampão de carga. O extracto celular filtrado é carregado na coluna a 0,5 mL por minuto. A coluna é lavada até à A28o da linha de base com tampão de carga, ponto em que se inicia a recolha de fracções. Em seguida, a coluna é lavada com um tampão de lavagem secundário (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, Glicerol a 10%, pH 6,0), que eluiu a proteína ligada de forma não específica. Depois de atingir novamente a linha de base a A2eo, desenvolve-se a coluna com um gradiente de Imidazole de 0 a 500 mM no tampão de lavagem secundário. Recolhem-se fracções 94 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ de mL e analisam-se por SDS-PAGE e coloração com prata ou Western blot com Ni2+-NTA conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). Reúnem-se as fracções que contêm o polipéptido PR01122 marcado com Hisio e dialisam-se contra tampão de carga. Alternativamente, a purificação do polipéptido PR01122 marcado com igG (ou marcado com Fc) pode ser realizada utilizando técnicas de cromatografia conhecidas, incluindo por exemplo, cromatografia em coluna de Proteína A ou Proteína G. EXEMPLO 7: Preparação de anticorpos que se ligam a polipéptidos PRQ1122

Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que podem ligar-se especificamente a um polipéptido PR01122.

As técnicas para a produção dos anticorpos monoclonais são conhecidas na arte e estão descritas, por exemplo, em Goding, supra. Os imunogénios que podem ser empregues incluem polipéptido PR01122 purificado, proteínas de fusão contendo um polipéptido PR01122 e células que expressam polipéptido PR01122 recombinante na superfície celular. A selecção do imunogénio pode ser feita por um perito na especialidade sem experimentação desnecessária.

Ratinhos, tais como Balb/c, são imunizados com o imunogénio PR01122 emulsionado em adjuvante de Freund completo e injectado subcutaneamente ou intraperitonealmente numa quantidade de 1-100 microgramas. Alternativamente, o imunogénio é emulsionado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injectado nas almofadas das patas dos animais. Os ratinhos imunizados recebem então reforços 10 a 12 dias mais tarde com imunogénio adicional emulsionado no adjuvante seleccionado. Posteriormente, durante várias semanas, os ratinhos podem também receber reforços com injecções de imunização adicionais. Amostras de soro podem ser periodicamente obtidas dos ratinhos por sangria retro-orbital para teste em ensaios ELISA para detectar anticorpos anti-polipéptido PR01122.

Após detectar um anticorpo adequado, os animais "positivos" para anticorpos pode ser injectados com uma 95 ΕΡ 1 076 703/PT injecção intravenosa final de polipéptido PR01122. Três a quatro dias mais tarde, os ratinhos são sacrificados e as células do baço são recolhidas. As células do baço são então fundidas (utilizando polietilenoglicol a 35%) a uma linha celular de mieloma murino seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponível na ATCC, No. CRL 1597. As fusões geram células de hibridoma que podem então ser plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células do baço.

As células de hibridoma serão pesquisadas num ELISA quanto à reactividade contra polipéptido PR01122. A determinação de células de hibridoma "positivas" que segregam os anticorpos monoclonais desejados contra polipéptido PR01122 faz parte das qualificações do perito na especialidade.

As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c singénicos para produzir ascites contendo os anticorpos monoclonais anti-polipéptido PR01122. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas em balões de cultura de tecidos ou frascos rotativos. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nos ascites pode ser realizada utilizando precipitação com sulfato de amónio, seguida por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, pode ser empregue cromatografia de afinidade baseada na ligação de anticorpo a proteína A ou proteína G.

Exemplo 8: Expressão de ARN

Adquiriram-se blots de tecidos múltiplos contendo ARN poli A+ (2pg por pista) de vários tecidos humanos a Clontech (Paio Alto, CA) . Utilizaram-se a totalidade das regiões de codificação de IL-17B humana (LINQ516) (700 pb) (SEQ ID NO:17) e IL-17C (UNQ561) (1,1 kpb) (SEQ ID NO:18) como sondas de hibridação. Marcaram-se as sondas de ADN com [a- P]-dCTP por iniciação aleatória de contas de marcação de ADN (Pharmacia Biotech) . A hibridação foi realizada utilizando Expresshyb (Clontech) contendo as sondas radiomarcadas a 68°C durante 1 hora. Os blots foram então lavados com solução de SSC 2X/SDS 96 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ a 0,05% à temperatura ambiente durante 40 minutos, seguida de lavagens com solução de SSC 0,1X/SDS a 0,05% a 55°C durante 40 minutos com uma troca por solução fresca. Os blots foram expostos num Phosphorimager e a imagem resultante está aqui apresentada na Figura 8.

Para a IL-17B (SEQ ID NO:l), encontrou-se um transcrito de ARNm de 800 pb no pâncreas, intestino delgado e no estômago de tecidos humanos adultos: detectou-se uma banda mais fraca nos testículos, (Figura 8) . A expressão de IL-17C (SEQ ID NO: 2) foi examinada no mesmo conjunto de tecidos humanos adultos, mas não se observaram sinais detectáveis.

Exemplo 9: Geração de proteínas de fusão com Fc/His

As sequências de codificação de IL17B (SEQ ID NO:17) e de IL17C (SEQ ID NO:18) foram amplificadas por PCR e subclonadas nos locais EcoRI e Smal de pBPH.His.c para gerar um marcador GHHHHHHHH C-terminal (SEQ ID NO:19) ou nos locais EcoRI e Stu de pBPH.IgG para gerar uma fusão C-terminal com a região Fc de IgGl humana. Os vectores pBPH.His.c e pBPH.IgG são derivados do vector de expressão de baculovirus pVLl393 (Pharmingen). Construiu-se uma proteína de controlo marcada com Fc ou His de maneira semelhante por ligação no terminal C da proteína associada a pancreatite (175 aminoácidos) à porção Fc da IgGl humana ou um marcador His8.

As proteínas de fusão foram expressas em células H5 utilizando o procedimento recomendado pelo fabricante (Invitrogen). Em resumo, as construções de ADN foram co-transfectadas com ADN de Baculovirus BaculoGold (Pharmingen) numa razão de 7:1 em células Sf9 aderentes. As células foram incubadas a 28°C durante 4 dias e recolheu-se o sobrenadante. O sobrenadante da transfecção foi amplificado e foi submetido a purificação de afinidade em contas de proteína A-Sepharose (Pharmacia) para proteínas de fusão com Fc ou contas de Ni-NTA agarose (QIAGEN) para proteínas marcadas com His.

Para examinar a expressão de proteína, aplicou-se análise por SDS-PAGE às proteínas recombinantes purificadas por afinidade sob condições redutoras e não redutoras, seguida de coloração com prata. 97 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Exemplo 10: Indução de IL-6 e libertação de TNF-g

Utilizando o procedimento delineado em Yao et al., J. Immunol 155: 5483 (1995) (Yao-2) para a libertação de IL-6 (SEQ ID NO:14), cultivaram-se células fibroblastos de prepúcio humano (ATCC CRL-2091) em meio MEM (FBS a 10%) com a citoquina de teste. Após incubação durante 18 horas a 37°C e C02 a 5%, ensaiaram-se os meios condicionados quanto a IL-6 utilizando um kit de ELISA (R&D Systems). Para a secreção de TNF-a, cultivaram-se células THP-1 monociticas de leucemia humana em meio RPMI (FBS a 10%) com a citoquina de teste. Após incubação durante 18 horas a 37°C e C02 a 5%, quantificaram-se os meios condicionados quanto a TNF-α (SEQ ID NO:20) utilizando e um kit de ensaio de ELISA (R&D Systems). Células fibroblastos de prepúcio humano (ATCC) foram separadamente cultivadas em meio MEM (FBS a 10%) na presença de IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:1) e IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3). Após incubação durante 18 horas a 37°C e C02 a 5%, ensaiaram-se os meios condicionados quanto a IL-6 (SEQ ID NO:14) utilizando um kit de ELISA (R&D Systems). Em contraste com o elevado nivel de IL-6 (SEQ ID NO:14) induzida por IL-17 (SEQ ID NO: 11) , nem IL-17B (SEQ ID NO:l) nem IL17C (SEQ ID NO:3) estimularam a secreção de IL-6 (SEQ ID NO:14) em células fibroblastos (Figura 9A).

Utilizando o procedimento delineado em Yao et al., Cytokine 9: 794 (1997) [Yao-3], utilizou-se uma linha celular monocitica leucémica humana, THP-1, para o ensaio à estimulação da libertação TNF-α (SEQ ID NO:20) por IL-17 (SEQ ID NO: 11) , UNQ516 (SEQ ID NO:l) e UNQ561 (SEQ ID NO:3) por cultura em meio RPMI (FBS a 10%) . Após incubação durante 18 horas a 37°C e C02 a 5%, quantificaram-se os meios condicionados quanto a TNF-α (SEQ ID NO:19) utilizando um kit de ensaio de ELISA (R&D Systems). Enquanto a IL-17 (SEQ ID NO:11) induziu apenas um baixo nivel de TNF-α (SEQ ID NO:19) em células THP-1, tanto a IL-17B como a IL-17C (na forma de proteinas de fusão com Fc) estimularam a produção de TNF-α em células THP-1 (Figura 9B) . Uma proteina de fusão com Fc de controlo não teve efeito. 98 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

De modo a adicionalmente caracterizar a estimulação da libertação de TNF-α por IL-17B e IL-17C, ensaiaram-se a dependência da concentração e do decorrer de tempo da resposta em células THP-1. A Figura 10 ilustra que a IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO: 1) e a IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) estimulam a libertação de TNF-α (SEQ ID NO:19) de uma maneira dependente da concentração e do tempo. A EC50 para IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) estimulação é de 2,4 nM, enquanto para a IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3), é 25 nM.

Embora as preparações de IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) e de IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) utilizadas nestas experiências contivessem um nivel indetectável de endotoxina (inferior a 1 EU/ml), realizaram-se experiências de controlo adicionais para confirmar que a libertação de TNF-α (SEQ ID NO:19) pelas células THP-1 era real e não artefactual. As actividades de IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) e IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) não foram afectadas por tratamento com polimixina B e foram eliminadas por tratamento térmico, o que suporta adicionalmente a noção de que eram as próprias proteínas as responsáveis pelas actividades e não qualquer endotoxina contaminante.

Exemplo 11: Ligação ao Receptor de IL-17

Clonagem do ECD de Receptor de hlL-17:

De modo a clonar o ECD do receptor de IL-17 humana, desenharam-se dois iniciadores oligonucleotidicos nas extremidades 5' e 3' de ECD de IL-17R (SEQ ID NO:15) baseados na sequência publicada. Yao et al., supra (Yao-3) . As duas sondas tinham as sequências seguintes: iniciador 1: 5'-CTG TAC CTC GAG GGT GCA GAG-3' (SEQ ID NO:20) iniciador 2: 5'-CCC AAG CTT GGG TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG CCA CAG GGG CAT GTA GTC C-3' (SEQ ID NO:21)

Utilizaram-se os iniciadores anteriores em reacções PCR para amplificar o ADNc de comprimento completo de uma biblioteca de ADNc de testículo humano com ADN-polimerase Pfu Turbo (Promega). Introduziu-se um marcador de His C-terminal por PCR através da adição de nucleótidos que codificam oito 99 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ histidinas ao iniciador da extremidade 3'. O produto da PCR foi então subclonado num vector plasmidico de expressão pRK5B. A análise da sequência confirmou que a inserção contém um fragmento de ADN que codifica o dominio extracelular (1-320 aminoácidos) do receptor de hIL-17 publicado (SEQ ID NO:15).

Imunoprecipitação do ECD de IL-17R: A actividade diferencial de IL-17 comparativamente com a IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) e a IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) sugeriu que estas podem ligar e activar diferentes receptores de superfície celular. De modo a testar se a IL-17B (UNQ516) (SEQ ID NO:l) ou a IL-17C (UNQ561) (SEQ ID NO:3) se ligam directamente ao receptor, transfectou-se um plasmídeo de expressão contendo o IL-17R (C-terminal, marcado com His) (SEQ ID NO:22) em células 293, utilizando o reagente de transfecção SuperFect (Qiagen). Realizou-se uma marcação metabólica de células 293, 16 horas após a transfecção, utilizando uma mistura de 50 μθί/ml de [35S]-Cys/Met durante 6 horas. Recolheu-se o meio condicionado e concentrou-se (Centricon-10, Amicon) . Para examinar a expressão do ECD de IL-17R (SEQ ID NO:15), utilizaram-se contas de Ni-NTA (Qiagen) para precipitar por afinidade o ECD de IL-17R marcado com His (SEQ ID NO:22) a partir do meio condicionado.

Diluiu-se o meio condicionado em tampão ripa (NP40 a 1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, SDS a 0,1% em PBS), incubou-se com IL-17 (SEQ ID NO: 11) e as proteínas de fusão com Fc, durante a noite a 4°C. Adicionaram-se contas de proteína A-agarose (Pierce) para precipitar as proteínas de fusão com Fc. Lavaram-se os precipitados três vezes para precipitar as proteínas de fusão com Fc. Lavaram-se os precipitados três vezes em tampão RIPA, desnaturaram-se em tampão de amostra de SDS, e submeteram-se a electroforese em géis NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Novex). Para a imunoprecipitação de IL-17 (SEQ ID NO:11), adicionou-se anticorpo anti-lL-17 (R&D Systems). Numa experiência de ligação competitiva, realiza-se a imunoprecipitação de ECD de IL-17R (SEQ ID NO: 15) por IL-17 (SEQ ID NO:ll) na presença de um excesso molar de 5 vezes de IL-17B.his (SEQ ID NO:23, IL-17C.his (SEQ ID NO:24 e proteína marcada com His de controlo. 100 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ Ο ECD de IL-17R (SEQ ID ΝΟ:15 migrou na forma de uma banda de 60 kDa quando purificada por via do seu marcador de histidina (Fig. 11A, pista 1). Adicionalmente, o ECD de IL-17R (SEQ ID NO:15 também precipitou em combinação com IL-17 (SEQ ID NO:11) (pista 3). Contudo, nem a IL-17B (SEQ ID NO:l) nem a IL-17C (SEQ ID NO:3) competiram pela ligação de IL-17 (SEQ ID NO:11) para o ECD do receptor de IL-17 marcado (SEQ ID NO:15, Fig. 11B, pista 15 e 16).

Exemplo 12: Análise por Separação de Células Activadas por Fluorescência (FACS) da Ligação a Células THP-1 Células THP-1 (5 x 105) foram pré-incubadas em PBS contendo 5% de soro de cavalo a 4°C durante 30 minutos para bloquear ligação não especifica. Adicionaram-se IL-17 (SEQ ID NO:11), IL-17B.fc (SEQ ID NO:12), IL-17C.FC (SEQ ID NO:13) ou Fc de controlo (1 pg de cada) e incubou-se com as células THP-1 num volume de 0,25 ml em gelo durante 1 hora. Para a experiência de ligação a IL-17, adicionaram-se anticorpo anti-hIL-17 primário (diluição de 1:100) e anticorpo de cabra anti-ratinho secundário conjugado a FITC (Jackson Immunology Lab, diluição de 1:100), sequencialmente, com incubação de 30-60 minutos e lavagens extensivas antes de cada adição. Para as proteínas de fusão com Fc, coraram-se as células com IgG de cabra anti-humana conjugada com FITC (específica de Fc, Jackson Immunology Lab., diluição de 1:100). Após lavagens intensas, analisou-se um mínimo de 5000 células utilizando um aparelho FACScan (Becton Dickinson). O resultante do anterior procedimento foi que ambas as proteínas de fusão com Fc de IL-17B (SEQ ID NO:12) e IL-17C (SEQ ID NO:13) apresentaram ligação a células THP-1 comparativamente com uma proteína de fusão com Fc de controlo (Fig. 13). EXEMPLO 13: Purificação de Polipéptidos PRQ1122 Utilizando Anticorpos Específicos

Os polipéptidos PR01122 nativos ou recombinantes podem ser purificados através de uma variedade de técnicas Standard na especialidade da purificação de proteínas. Por exemplo, 101 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ purifica-se pró-polipéptido PR01122, polipéptido PR01122 maduro ou pré-polipéptido PR01122 por cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos específicos para o polipéptido PR01122 de interesse. Em geral, constrói-se uma coluna de imunoafinidade por acoplamento covalente do anticorpo anti-polipéptido PR01122 a uma resina cromatográfica activada.

As imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros imunes quer por precipitação com sulfato de amónio quer por purificação em Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB BioTechnology, Piscataway, N.J.). Do mesmo modo, os anticorpos monoclonais são preparados a partir de fluido ascítico de ratinhos por precipitação com sulfato de amónio ou cromatografia em Proteína A imobilizada. A imunoglobulina parcialmente purificada é covalentemente ligada a uma resina cromatográfica tal como SEPHAROSE® activada por CnBr (Pharmacia LKB BioTechnology). O anticorpo é acoplado à resina, a resina é bloqueada e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante.

Uma tal coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação de polipéptido PR01122 preparando uma fracção de células contendo polipéptido PR01122 numa forma solúvel. Esta preparação é derivada por solubilização da célula completa ou de uma fracção subcelular obtida por centrifugação diferencial pela adição de detergente ou por outros métodos bem conhecidos na especialidade. Alternativamente, polipéptido PR01122 solúvel contendo uma sequência de sinal pode ser segregado em quantidade útil para o meio em que as células são crescidas.

Uma preparação contendo polipéptido PR01122 solúvel é passada através da coluna de imunoafinidade e a coluna é lavada sob condições que permitem a absorvância preferencial de polipéptido PR01122 (e.g., tampões de elevada força iónica na presença de detergente) . Então, a coluna é eluída sob condições que rompem a ligação anticorpo-polipéptido PR01122 (e.g., um tampão de baixo pH tal como aproximadamente pH 2-3, ou uma elevada concentração de um caotropo tal como ureia ou ião tiocianato) e recolhe-se o polipéptido PR01122. 102 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ exemplo 14: Pesquisa de Fàrmacos A presente invenção é particularmente útil para a pesquisa de compostos utilizando polipéptidos PR01122 ou seus fragmentos de ligação em qualquer uma de uma variedade de técnicas de pesquisa de fàrmacos. O polipéptido PR01122 ou fragmento empregues nestes testes podem estar livres em solução, afixados num suporte sólido, suportados numa superfície celular ou localizados intracelularmente. Um método de pesquisa de fàrmacos utiliza células hospedeiras eucariotas ou procariotas que são transformadas estavelmente com ácidos nucleicos recombinantes que expressam o polipéptido PR01122 ou o fragmento. Os fàrmacos são pesquisados contra essas células transformadas em ensaios de ligação competitiva. Estas células, quer na forma viável quer fixadas, podem ser utilizadas para ensaios de ligação Standard. Pode-se medir, por exemplo, a formação de complexos entre polipéptido PR01122 ou um fragmento e o agente a testar. Alternativamente, pode-se examinar a diminuição na formação de complexos entre o polipéptido PR01122 e a sua célula alvo ou receptores alvo, causada pelo agente a testar.

Assim, a presente invenção proporciona métodos de pesquisa para fàrmacos ou quaisquer outros agentes que possam afectar uma doença ou desordem associadas ao polipéptido PR01122. Estes métodos compreendem o contacto de um tal agente com um polipéptido PR01122 ou seu fragmento e o ensaio (i) quanto à presença de um complexo entre o agente e o polipéptido PR01122 ou o fragmento, ou (ii) quanto à presença de um complexo entre o polipéptido PR01122 ou o fragmento e a célula, por métodos bem conhecidos na especialidade. Nestes ensaios de ligação competitiva, o polipéptido PR01122 ou o fragmento são tipicamente marcados. Após incubação adequada, o polipéptido PR01122 ou o fragmento livres são separados daqueles que estão presentes na forma ligada, e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade do agente particular se ligar ao PR01122 ou interferir com o complexo polipéptido PR01122/célula.

Outra técnica para a pesquisa de fàrmacos proporciona uma pesquisa de alto rendimento para compostos possuindo afinidade de ligação adequada para com um polipéptido e está descrita com detalhes em WO 84/03564, publicado em 13 de Setembro, 103 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 1984. Resumidamente, grandes números de diferentes compostos de teste peptídicos pequenos são sintetizados sobre um substrato sólido, tal como pinos de plástico ou alguma outra superfície. Como aplicado a um polipéptido PR01122, os compostos de teste peptídicos são feitos reagir com polipéptido PR01122 e lavados. O PR01122 ligado é detectado por métodos bem conhecidos na especialidade. O polipéptido PR01122 purificado pode também ser utilizado para revestir directamente placas para utilização nas técnicas de pesquisa de fármacos atrás mencionadas. Em adição, podem-se utilizar anticorpos não neutralizantes para capturar o péptido e imobilizá-lo sobre o suporte sólido. A presente invenção também contempla a utilização de ensaios de pesquisa de fármacos competitivos em que anticorpos neutralizantes capazes de ligação ao polipéptido PR01122 competem especificamente com um composto de teste pela ligação ao polipéptido PR01122 ou a seus fragmentos. Desta maneira, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de qualquer péptido que partilhe um ou mais determinantes antigénicos com o polipéptido PR01122. EXEMPLO 15: Desenho Racional de Fármacos O objectivo do desenho racional de fármacos consiste em produzir análogos estruturais de polipéptidos de interesse biologicamente activos (i.e., um polipéptido PR01122) ou de moléculas pequenas com as quais interactuam, e.g., agonistas, antagonistas ou inibidores. Qualquer destes exemplos pode ser utilizado para desenhar fármacos que são formas mais activas ou estáveis do polipéptido PR01122 ou que aumentam ou interferem com a função do polipéptido PR01122 in vivo (c.f. Hodgson, Bio/Technology, 9_: 19-21 (1991)).

Numa abordagem, a estrutura tridimensional do polipéptido PR01122, ou de um complexo polipéptido PR01122-inibidor, é determinada por cristalografia de raios-x, por modelação em computador ou, mais tipicamente, pela combinação das duas abordagens. Tanto o formato como as cargas do PR01122 têm que ser determinadas para elucidar a estrutura e para determinar local(ais) activo(s) da molécula. Menos frequentemente, informação útil relativa à estrutura do PR01122 pode ser obtida através de modelação baseada na 104 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ estrutura de proteínas homólogas. Em ambos os casos, utiliza-se a informação estrutural relevante para desenhar moléculas análogas semelhantes a polipéptido PR01122 ou para identificar inibidores eficientes. Os exemplos úteis de desenho racional de fármacos podem incluir moléculas que têm actividade ou estabilidade melhoradas como mostrado por Braxton e Wells, Biochemistry, 3_1:7796-7801 (1992) ou que actuam como agonistas, inibidores, ou antagonistas de péptidos nativos como mostrado por Athauda et al., J. Biochem., 113:742-746 (1993). É também possível isolar um anticorpo específico do alvo, seleccionado por ensaio funcional, como descrito atrás, e depois resolver a sua estrutura cristalina. Esta abordagem, em princípio, produz uma estrutura nuclear de fármaco ("pharmacore") na qual se pode basear um subsequente desenho de fármacos. É possível circundar completamente a cristalografia da proteína gerando anticorpos anti-idiotípicos (anti-id) contra um anticorpo funcional, farmacologicamente activo. Tal como uma imagem no espelho de uma imagem no espelho, é de esperar que o local de ligação dos anti anti-id seja um análogo do receptor original. O anti-id pode então ser utilizado para identificar e isolar péptidos a partir de bancos de péptidos produzidos quimicamente ou biologicamente. Os péptidos isolados actuariam então como estrutura nuclear de fármaco.

Em virtude da presente invenção, podem ser tornadas disponíveis suficientes quantidades do polipéptido PR01122 para realizar estudos analíticos como a cristalografia de raios-x. Em adição, o conhecimento da sequência de aminoácidos do polipéptido PR01122 aqui proporcionada proporcionará orientação aos que empregam técnicas de modelação em computador em vez de, ou em adição a, cristalografia de raios-x.

Exemplo 16: Ensaio de Explante de Cartilagem Articular Introdução:

Como mencionado anteriormente, a IL-17 provavelmente desempenha um papel na iniciação ou na manutenção da resposta pró-inflamatória. A IL-17 é uma citoquina expressa por células Th CD4+ e induz a secreção de citoquinas pró-inflamatórias e 105 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ hematopoiéticas (e.g., IL-Ιβ, TNF-α. IL-6, IL-8, GM-CSF.

Aarvak et al., J. Immunol 162: 1246-1251 (1999); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593-2603 (1996); Jovanovic et al., J. Immunol. 160: 3513-3521 (1998) em vários dos tipos celulares incluindo sinoviócitos e macrófagos. Na presença de IL-17, fibroblastos sustentam a proliferação de progenitores hematopoiéticos CD34+ e induzem a sua maturação preferencial em neutrófilos. Em resultado, a IL-17 pode constituir um iniciador precoce da reacção inflamatória dependente de células T e ser parte da rede de citoquinas que faz a ponte entre o sistema imunitário e a hematopoiese.

Verificou-se que a expressão de IL-17 no sinóvio de pacientes com artrite reumatóide, artrite psoriática ou osteoartrite, mas não em tecidos de articulações normais. A IL-17 pode ter efeito sinérgico com as citoquinas pré-inflamatórias derivadas de monócitos, IL-Ιβ ou TNF-α, para induzir IL-6 e GM-CSF. Ao actuar directamente sobre sinoviócitos, a IL-17 pode aumentar a secreção de citoquinas pró-inflamatórias in vivo e assim exacerbar a inflamação e destruição da articulação.

Para adicionalmente entender o possivel papel da IL-17, os Requerentes testaram os efeitos de IL-17 sobre o metabolismo da matriz da cartilagem. À luz dos efeitos catabólicos conhecidos do óxido nitrico (NO) sobre a cartilagem, e da existência de elevados niveis de NO em articulações artríticas, mediu-se também a produção de NO. Métodos:

Explantes de Cartilagem Articular: A articulação metacarpofalângica de um porco fêmea de 4-6 meses de idade foi dissecada assepticamente, e a cartilagem articular é removida por laminação manual de maneira cuidadosa de modo a evitar o osso subjacente. A cartilagem foi triturada e cultivada em bruto durante pelo menos 24 horas numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO2 em meio isento de soro (SF) (DME/F12 1:1) com 0,1% de BSA e antibióticos. Após lavagem, três vezes, dividiu-se a cartilagem articular em aliquotas de aproximadamente 80 mg em tubos micrónicos e incubou-se durante pelo menos 24 horas no meio SF anterior. Foram então adicionadas proteínas de teste a 1%, sozinhas ou em combinação 106 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ com IL-Ια (10 ng/ml) (SEQ ID NO:25). Recolheu-se o meio e trocou-se em vários pontos de tempo (0, 24, 48, 72 horas) e ensaiou-se quanto ao teor de proteoglicano utilizando o ensaio colorimétrico com azul de 1,9-dimetilmetileno (dmb) descrito em Famdale e Buttle, Biochem. Biophys. Acta 883: 173-177 (1985). Após marcação (durante a noite) com 35S-enxofre, pesaram-se os tubos para determinar a quantidade de tecido. Após digestão durante uma noite, determinou-se a quantidade de proteoglicano restante no tecido assim como a sintese de proteoglicano (incorporação de 35S) .

Medição da produção de NO: O ensaio é baseado no principio de que o 2,3-diaminonaftaleno (DAN) reage com nitrito sob condições ácidas para formar 1-(H)-naftotriazole, um produto fluorescente. Como o NO é rapidamente metabolizado em nitrito (N02-1) e nitrato (N03-1), a detecção de nitrito constitui um meio de detecção (apesar de subvalorizado) do NO realmente produzido. Adicionam-se 10 pL de DAN (0,05 mg. mL em HC1 0,62m) a 100 pL de amostra (sobrenadante de cultura celular), mistura-se e incuba-se à temperatura ambiente durante 10-20 minutos. A reacção é terminada com 5 mL de NaOH 2,8N. A formação de 2,3-diaminonaftotriazole foi medida utilizando um leitor de placas fluorescentes Cytoflor com excitação a 360 nm e leitura de emissão a 450 nm. Para uma medição óptima da intensidade de fluorescência, utilizaram-se placas pretas com fundos transparente.

Resultados e Discussão:

Observou-se que a IL-17 (SEQ ID NO:11) aumenta a libertação, e diminui a sintese de proteoglicanos (Figura 13). Adicionalmente, este efeito foi aditivo ao efeito observado a partir de IL-Ια. (Figura 13) (SEQ ID NO:25). Os efeitos da IL-17 não se limitam à produção de óxido nítrico, nem a inibição da libertação de óxido nítrico aumenta a quebra da matriz. UNQ561 (SEQ ID NO:3) aumenta a quebra da matriz e inibe a síntese da matriz. Assim, a expressão de PR01122 está provavelmente associada a desordens cartilaginosas degenerativas. Por outro lado, UNQ516 (SEQ ID NO:l) aumenta a síntese de matriz e inibe a libertação de óxido nitrico por explantes de cartilagem articular. 107 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Em conclusão, a IL-17 contribui provavelmente para a perda de cartilagem articular em articulações artríticas, e assim a inibição da sua actividade poderá limitar a inflamação e a destruição da cartilagem. A il-1 e a IL-17 têm actividades similares ainda que distintas, devido à sua utilização de diferentes receptores e mecanismos de sinalização a montante sobrepostos.

Dadas as constatações dos potentes efeitos catabólicos da IL-17 sobre explantes de cartilagem articular e a homologia de UNQ516 e UNQ561 relativamente a IL-17, antagonistas de qualquer uma ou todas estas proteínas podem ser úteis para o tratamento de condições inflamatórias e defeitos da cartilagem tais como artrite. Contudo, a nossa constatação de que UNQ 516 inibe a produção de NO e aumenta a síntese de matriz, sugere que esta proteína e os seus agonistas podem ter efeitos benéficos na articulação e podem assim, em si e de si, ser úteis para o tratamento das desordens atrás mencionadas.

Finalmente, é bem conhecido que os factores de crescimento podem ter efeitos bifásicos e que o tecido doente pode responder de forma diferente do tecido normal a um determinado factor in vivo. Por estas razões, antagonistas ou agonistas (e.g., as próprias proteínas) de UNQ 561 podem ser úteis para o tratamento de condições inflamatórias e desordens articulares tais como artrite.

Depósito de Material

Os seguintes materiais foram depositados na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA USA 20110-2209 (ATCC):

Material N.° Dep. ATCC Data do Depósito DNA5 9294-1381 209866 14 de Maio de 1998 DNA62377-1381-1 203552 22 de Dezembro de 1998

Este depósito foi realizado segundo as disposições do Tratado de Budapeste para o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Efeitos do Procedimentos em Matéria de Patentes e seus Regulamentos (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável 108 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ do depósito durante 30 anos desde a data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC segundo os termos do Tratado de Budapeste, e sujeito a um acordo entre a Genentech, inc. e a ATCC, que assegura a disponibilidade permanente e sem restrições da progénie da cultura do depósito ao público após a publicação da patente U.S. pertinente ou após disponíveis ao público qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeira, aquele que primeiro acontecer, e assegura a disponibilidade da progénie a quem determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks estar para isso qualificado de acordo com 35 USC § 122 e as regras do Commissioner correspondentes (incluindo 37 CFR § 1.14 com particular referência para 886 OG 638) . A cessionária do presente pedido de patente concordou que se uma cultura dos materiais depositados vier a morrer ou se perder ou for destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos após notificação por outros iguais. A disponibilidade do material depositado não deve ser entendida como uma licença para a prática da invenção em contravenção dos direitos concedidos pela autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis sobre patentes. A descrição escrita anterior é considerada suficiente para permitir que um perito na especialidade ponha em prática a invenção. A presente invenção não deve ser limitada em âmbito pela construção depositada, pois a concretização depositada pretende ser uma mera ilustração de certos aspectos da. O depósito de material não constitui uma admissão de que a presente descrição escrita é inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser entendido como limitante do âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que representa. 109 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Listagem de Sequências <110> Jian Chen,

Ellen Filvaroff,

Audrey Goddard,

Austin Gurney,

Hanzhong Li,

William I.Wood,

<120> POLIPÉPTIDOS HOMÓLOGOS DE IL-17 E UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS <130> P1381-R1 <141> 1999-05-14 <150> US 60/085, 579 <151> 1998-05-15 <150> US 60/113, 621 <151> 1998-12-23 <160> 26

< 210 > 1 < 211> 180 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile 1 5 10 _15 Phe Leu Gly Leu Gly Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Vai 35 40 45 Pro Leu Asp Leu Vai Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu 50 55 60 Glu Tyr Glu Arg Asn He Glu Glu Met Vai Ala Gin Leu Arg Asn 65 70 75 Ser Ser Glu Leu Ala Gin Arg Lys Cys Glu Vai Asn Leu Gin Leu 80 85 90 Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr ser lie 95 100 105 110 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Aan His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Vai Asp Leu Pro Glu Ala Arg 110 115 120

Cys Leu Cys Leu Gly Cys Vai Asn Pro Phe Thr Met Gin Glu Asp 125 130 135

Arg Ser Met Vai Ser Vai Pro Vai Phe Ser Gin Vai Pro Vai Arg 140 145 ISO”

Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gin 155 160 165

Arg Ala Vai Met Glu Thr Ile Ala Vai Gly Cys Thr Cys Ile Phe 170 175 180

<210> 2 <211> 687 < 212 > ADN <213> Homo sapíens <400> 2 aggcgggcag cagctgcagg ctgaccttgc agcttggcgg aatggactgg 50 cctcacaacc tgctgtttct tcttaccatt tccatcttcc tggggctggg 100 ccagcccagg agccccaaaa gcaagaggaa ggggcaaggg cggcctgggc 150 ccctggcccc tggccctcac caggtgccac tggacctggt gtcacggatg 200 aaaccgtatg cccgcatgga ggagtatgag aggaacatcg aggagatggt 250 ggcccagctg aggaacagct cagagctggc ccagagaaag tgtgaggtca 300 acttgcagct gtggatgtcc aacaagagga gcctgtctcc ctggggctac 350 agcatcaacc acgaccccag ccgtatcccc gtggacctgc cggaggcacg 400 gtgcctgtgt ctgggctgtg tgaacccctt caccatgcag gaggaccgca 450 gcatggtgag cgtgccggtg ttcagccagg ttcctgtgcg ccgccgcctc 500 tgcccgccac cgccccgcac agggccttgc cgccagcgcg cagtcatgga 550 gaccatcgct gtgggctgca cctgcatctt ctgaatcacc tggcccagaa €00 gccaggccag cagcccgaga ccatcctcct tgcacctttg tgccaagaaa 650 ggectatgaa aagtaaacae tgacttttga aagcaag 687

<210> 3 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens 111 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ <400> 3

Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr 1 5 10 15 Cys Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser 20 25 30 HiS Gly Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly 35 40 45 Gin Ala Pro Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gin 50 55 60 Ala Leu Pro Vai Ala Leu Vai Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His 65 70 75 Arg Gly Arg His Glu Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gin Cys Pro Vai 80 85 SO Leu Arg Pro Glu Glu Vai Leu Glu Ala Asp Thr His Gin Arg Ser 95 100 105 Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Vai Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr 110 115 120 Pro Gin Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile 125 130 135 Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu Asn Ser Vai Arg 140 145 150 Leu Leu Gin Ser Leu Leu Vai Leu Arg Arg Arg Pro Cys Ser Arg 155 160 165 Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe His Thr 170 175 180 Glu Phe Ile His Vai Pro Vai Gly Cys Thr Cys Vai Leu Pro Arg 185 190 195

Ser Vai 197

<210> 4 <211> 1047 <212> ADN <213> Homo sapiens 112

ΕΡ 1 076 703/PT < 4 0 0 > 4 gccaggtgtg caggccgctc caagcccagc ctgccccgct gccgccacca 50 tgacgctcct ccccggcctc ctgtttctga cctggctgca cacatgcctg 100 gcccaccatg acccctccct cagggggcac ccccacagtc acggtacccc 150 acactgctac tcggctgagg aactgcccct cggccaggcc cccccacacc 200 tgctggctcg aggtgccaag tgggggcagg ctttgcctgt agccctggtg 250 tccagcctgg aggcagcaag ccacaggggg aggcacgaga ggccctcagc 300 tacgacccag tgcccggtgc tgcggccgga ggaggtgttg gaggcagaca 350 cccaccagcg ctccatctca ccctggagat accgtgtgga cacggatgag 400 gaccgctatc cacagaagct ggccttcgcc gagtgcctgt gcagaggctg 450 tatcgatgca cggacgggcc gcgagacagc tgcgctcaac tccgtgcggc 500 tgctccagag cctgctggtg ctgcgccgcc ggccctgctc ccgcgacggc 550 tcggggctcc ccacacctgg ggcctttgcc ttccacaccg agttcatcca 600 cgtccccgtc ggctgcacct gcgtgctgcc ccgtCcagtg tgaccgccga 650 ggccgtgggg cccctagact ggacacgtgt gctccccaga gggcaccccc 700 tatttatgtg tatttattgt tatttatatg cctcccccaa cactaccctt 750 ggggtctggg cattccccgt gtctggagga cagcccccca ctgttctcct 800 catctccagc ctcagtagtt gggggtagaa ggagctcagc acctcttcca 850 gcccttaaag ctgcagaaaa ggtgtcacac ggctgcctgt accttggctc 900 cctgtcctgc tcccggcttc ccttacccta tcactggcct caggccccgc 950 aggctgcctc ttcccaacct ccttggaagt acccctgttt cttaaacaat 1000 tatttaagtg tacgtgtatt attaaactga tgaacacatc cccaaaa 1047

< 210 > 5 <211> 830 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> desconhecida <222> 105-115 <223> base desconhecida 113 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ < 4 0 0 > 5 ggcagcaggg accaagagag gcacgcttgc cctctracga catcagagcc au cotggttctt gctccttggg actctgggac ttacaccagt ggcacccccg 100 gctcnnnnnn nnnnnaattc ggtacgaggc tggggttcag gcgggcagca 150 gctgcaggct gaccttgcag cttggcggaa tggactggcc tcacaacctg 200 ctgtttcttc ttaccatttc catcttcctg gggctgggcc agcccaggag 250 ccccaaaagc aagaggaagg ggcaagggcg gcctgggccc ctggtccceg 300 gcectcacca ggtgccactg gacctggtgt cacggatgaa accgtatgcc 350 cgcatggagg agtatgagag gaacatcgag gagatgttgg cccagctgag 400 gaacagttca gagctggccc agagaaagtg tgaggtcaac ttgcagctgt 450 ggatgtccaa caagaggagc ctgtctccct ggggctacag catcaaccac 500 gaccccagcc gtatccccgt ggacctccgg aggcacggtg cctgtgtctg 550 ggcttgtgtg aaccccttca ccatgcagga ggaccgcagc atggtgagcg 600 tgccggtgtt cagccaggtt cctgtgcgcc gccgcctctg cccgccaccg 650 ccccgcacag ggccttgccg ccagcgcgca gtcatggaga ccatcgctgt 700 gggctgcacc tgcatcttct gaatcgacct ggcccagaag ccaggccagc 750 agcccgagac catcctcctt gcacctttgt gccaagaaag gcctatgaaa 800 agtaaacact gacttttgaa agcaaaaaaa 830 <210> 6 <211> 397

< 212 > ADN <213> Artificial <220> <221> desconhecida < 2 2 2 > 10, 150, 267 <223> base desconhecida 114 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ < 4 0 0 > 6 aggcgggcan agctgcaggc tgaccttgca gcttggcgga atggactggc 50 ctcacaacct gctgtttctt cttaccattt ccatcttcct ggggctgggc 100 agccaggagc cccaaaagca agaggaaggg gcaagggcgg cctgggcccn 150 tggcctggcc tcaccaggtg ccactggacc tggtgtcacg gatgaaaccg 200 tatgcccgca tggaggagta tgagaggaac atcgaggaga tggtggccca 250 gctgaggaac agctcanaag ctggcccaga gaaagtgtga ggtcaacttg 300 cagctgtgga tgtccaacaa gaaggagcct gtctcccttg gggctacaag 350 catcaaccac cgaccccagc cgtatccccg tgggaccttg ccgggac 397 <210> 7 <211> 230 <212> ADN <213> Artificial <400> 7 cacggatgag gaccgctatc cacagaagct ggccttcgcc gagtgcctgt 50 gcagaggctg tatcgatgca cggacgggcc gcgagacagc tgcgctcaac 100 tccgtgcggc tgctccagag cctgctggtg ctgcgccgcc ggccctgctc 150 ccgcgacggc tcggggctce ccacacctgg ggcctttgcc ttccacaccg 200 agttcatcca cgtccccgtc ggctgcacct 230

<210> 8 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <400> 8 atccacagaa gctggccttc gccg 24 < 210 > 9 <211> 24

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <400> 9 gggacgtgga tgaactcggt gtgg 24 <210> 10 <211> 40

< 212 > ADN <213> Sequência artificial < 4 0 0 > 10 tatccacaga agctggcctt cgccgagtgc ctgtgcagag 40 115 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ <210 > 11 <211> 155

< 212 > PRT <213 > Humana < 4 0 0 > 11

Het Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Vai Ser Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Glu Ala Ile Vai Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn 20 25 30 Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Vai • . 35 40 45 Met Vai Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro 50 55 60 Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn 65 70 75 Leu ΗΪ9 Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Vai Ile Trp 80 85 90 Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn 95 100 105 Vai Asp Tyr His Met Asn Ser Vai Pro Ile Gin Gin Glu Ile Leu 110 115 120 Vai Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 125 130 135 Glu Lye Ile Leu Vai Ser Vai Gly Cys Thr Cys Vai Thr Pro Ile 140 145 150 Vai Hls Hie Vai Ala 155 <210> 12 <211> 408 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-408 116 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ < 4 0 0 > 12

Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile 1 5 10 15 Phe Leu Gly Leu Gly Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Val 35 40 45 Pro Leu Asp Leu Vai Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu 50 55 60 Glu Tyr Glu Arg Asn Zle Glu Glu Met Vai Ala Gin Leu Arg Asn 65 70 75 Ser Ser Glu Leu Ala Gin Arg Lys Cys Glu Vai Asn Leu Gin Leu 80 85 90 Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile 95 100 105 Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Vai Asp Leu Pro Glu Ala Arg 110 115 120 Cys Leu Cys Leu Gly Cys vai Asn Pro Phe Thr Met Gin Glu Asp 125 130 135 Arg Ser Met Vai Ser Vai Pro Vai Phe Ser Gin Val Pro Val Arg 140 145 150 Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gin 155 160 165 Arg Ala Vai Met Glu Thr Ile Ala Vai Gly Cys Thr Cys Ile Phe 170 175 180 Pro Asp Lys Thr Hie Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 185 190 195 Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 200 205 210 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Val Val Val 215 220 225 117 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Asp Vai Ser Hia Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 230 235 240

Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 245 250 255

Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 260 265 270*

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 275 280 285

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala • 290 295 300

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 305 310 315

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 320 325 330

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 335 340 345

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp 3S0 355 360

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 365 370 375

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His 380 385 390

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 395 400 405

Pro Gly Lys 408 < 210 > 13 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-425 118 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ < 4 0 0 > 13

Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr 15 10 15

Cys Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly Hie Pro Hie Ser 20 25 30

Hie Gly Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly 35 40 45

Gin Ala Pro Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gin 50 55 60

Ala Leu Pro Vai Ala Leu Vai Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His 65 70 75

Arg Gly Arg His Glu Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gin Cys Pro Vai 80 85 90

Leu Arg Pro Glu Glu Vai Leu Glu Ala Asp Thr His Gin Arg Ser 95 100 105

Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Vai Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr 110 115 120

Pro Gin Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile 125 130 135

Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu Asn Ser Vai Arg 140 145 150

Leu Leu Gin Ser Leu Leu Vai Leu Arg Arg Arg Pro Cys Ser Arg 155 160 165

Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe His Thr 170 175 180

Glu Phe Ile His Vai Pro Vai Gly Cys Thr Cys Vai Leu Pro Arg 185 190 195

Ser Vai Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 200 205 210

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 215 220 225

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 230 235 240

Vai Vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 245 250 255 119 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lya Pro Arg 260 265 270

Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 275 280 285

Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Âsn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 290 295 300*

Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser 305 310 315

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 320 325 330

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys 335 340 345

Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 350 355 360

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai 365 370 375

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 380 385 390

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai 395 400 405

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 410 415 420

Leu Ser Pro Gly Lys 425

<210> 14 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Vai Ala Phe Ser 15 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Vai Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Vai 20 25 30 120 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Vai Ala Ala Pro Hia Arg Gin 35 40 45

Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gin Ile Arg Tyr lie 50 55 60

Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 65 . 70 75

Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu 80 85 90

Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly 95 100 105

Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Vai Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu 110 115 120

Glu Phe Glu Vai Tyr Leu Glu Tyr Leu Gin Asn Arg Phe Glu Ser 125 130 135

Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Vai Gin Met Ser Thr Lys Vai Leu 140 145 150

Ile Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr 155 160 165

Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gin 170 175 180

Ala Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr Kis Leu Ile Leu 185 190 195

Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg 200 205 210

Gin Met 212 < 210 > 15 <211> 320

< 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Vai Pro Gly Pro Leu 15 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Vai Leu Ala Pro Gly Gly 20 25 30 121 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Ala Ser Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Vai Cys Ser Gin 35 40 45

Pro Gly Leu Asn Cys Thr Vai Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp 50 55 60

Ser Trp Ile His Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp 65 70 75"

Leu Gin lie Gin Leu His Phe Ala His Thr Gin Gin Gly Asp Leu 80 85. 90

Phe Pro Vai Ala His Ile Glu Trp Thr Leu Gin Thr Asp Ala Ser 95 100 105

Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala Glu Leu Ser Vai Leu Gin Leu Asn 110 115 120

Thr Asn Glu Arg Leu Cys Vai Arg Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu 125 130 135

Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe Thr Phe Ser His Phe Vai 140 145 150

Vai Asp Pro Asp Gin Glu Tyr Glu Vai Thr Vai His His Leu Pro 155 160 165

Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gin Ser Lys Asn Phe 170 175 180

Leu Vai Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Vai Thr Thr Pro 185 190 195

Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr Vai Glu 200 205 210

Thr Leu Glu Ala His Gin Leu Arg Vai Ser Phe Thr Leu Trp Asn 215 220 225

Glu Ser Thr His Tyr Gin Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met 230 235 240

Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro 245 250 255

Arg Pro Glu Glu Phe His Gin Arg Ser Asn Vai Thr Leu Thr Leu 260 265 270 122 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Arg Asn Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gin Vai Gin Ile Gin Pro 275 2Θ0 285

Phe Phe Ser Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr 290 295 300

Vai Ser Cys Pro Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp 305 310 315

Tyr Met Pro Leu Trp 320

<210> 16 <211> 543 <212> ADN <213> Eomo sapiens <400> 16 atggactggc ctcacaacct gctgtttctt cttaccattt ccatcttcct 50 ggggctgggc cagcccagga gccccaaaag caagaggaag gggcaagggc 100 ggcctgggcc cctggcccct ggccctcacc aggtgccact ggacctggtg 150 tcacggatga aaccgtatgc ccgcatggag gagtatgaga ggaacatcga 200 ggagatggtg gcccagctga ggaacagctc agagctggcc cagagaaagt 250 gtgaggtcaa cttgcagctg tggatgtcca acaagaggag cctgtctccc 300 tggggctaca gcatcaacca cgaccccagc cgtatccccg tggacctgcc 350 ggaggcacgg tgcctgtgtc tgggctgtgt gaaccccttc accatgcagg 400 aggaccgcag catggtgage gtgccggtgt tcagccaggt tcctgtgcgc 450 cgccgcctct gcccgccacc gccccgcaca gggccttgcc gccagcgcgc 500 agtcatggag accatcgctg tgggctgcac ctgcatcttc tga 543 < 210 > 17 <211> 594

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 17 atgacgctcc tccccggcct cctgtttctg acetggctgc acacatgcct 50 ggcccaccat gacccctccc tcagggggca cccccacagt cacggtaccc 100 123 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ cacactgcta ctcggctgag gaactgcccc tcggccaggc ccccccacac 150 ctgctggctc gaggtgccaa gtgggggcag gctttgcctg tagcectggt 200 gtccagcctg gaggcagcaa gccacagggg gaggcacgag aggccctcag 250 ctacgaccca gtgcccggtg ctgcggccgg aggaggtgtt ggaggcagac 300 acccaccagc gctccatctc accctggaga taccgtgtgg acacggatga 350 ggaccgctat ccacagaagc tggccttcgc cgagtgcctg tgcagaggct 400 gtatcgatgc acggacgggc cgcgagacag ctgcgctcaa ctccgtgcgg 450 ctgctccaga gcctgctggt gctgcgccgc cggccctgct cccgcgacgg 500 ctcggggctc cccacacctg gggcctttgc cttccacacc gagttcatcc 550 acgtccccgt cggctgcacc tgcgtgctgc cccgttcagt gtga 594 <210> 18 <211> 9

< 212 > PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-9 <400> 18

Gly His His His His His His His His 15 9

<210> 19 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Vai Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lya Pro Vai Ala His 15 10 15

Vai Vai Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn 20 25 30

Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Vai Glu Leu Arg Asp 35 40 45

Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser 50 55 60 124 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Gin Vai Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr Hie Vai Leu 65 70 75

Leu Thr Hie Thr lie Ser Arg Ile Ala Vai Ser Tyr Gin Thr Lys 80 85 90

Vai Aen Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr 95 100 105

Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu 110 115 120

Gly Gly Vai Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu 125 130 135

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Vai 140 145 150

Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 155 157 <210> 20 < 211 > 21 < 212 > ADN < 213 > Artificial <220> < 2 2 3 > Sequência artificial 1-21 < 4 0 0 > 20 ctgtacctcg agggtgcaga g 21 <210> 21 <211> 58 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-58 <400> 21 cccaagcttg ggtcaatgat gatgatgatg atgatgatgc cacaggggca 50 tgtagtcc 58

<210> 22 <211> 328 < 212 > PRT <213> Homo sapiens 125 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ <400> 22

Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Vai Pro Gly Pro Leu 15 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Vai Leu Ala Pro Gly Gly 20 25 30

Ala Ser Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Vai Cys Ser Gin 35 40 45“

Pro Gly Leu Asn Cys Thr Vai Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp 50 55 60

Ser Trp Ile His Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp 65 70 75

Leu Gin Ile Gin Leu His Phe Ala His Thr Gin Gin Gly Asp Leu 80 85 90

Phe Pro Vai Ala His Ile Glu Trp Thr Leu Gin Thr Asp Ala Ser 95 100 105

Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala Glu Leu Ser Vai Leu Gin Leu Asn 110 115 120

Thr Asn Glu Arg Leu Cys Vai Arg Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu 125 130 135

Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe Thr Phe Ser His Phe Vai 140 145 150

Vai Asp Pro Asp Gin Glu Tyr Glu Vai Thr Vai His His Leu Pro 155 160 165

Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gin Ser Lys Asn Phe 170 175 180

Leu Vai Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Vai Thr Thr Pro 185 190 195

Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr Vai Glu 200 205 210

Thr Leu Glu Ala His Gin Leu Arg Vai Ser Phe Thr Leu Trp Asn 215 220 225

Glu Ser Thr His Tyr Gin Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met 230 235 240 126 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His lie Pro Ala Pro 245 250 255 Arg Pro Glu Glu Phe His Gin Arg Ser Asn Vai Thr Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Asn Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gin Vai Gin Ile Gin Pro 275 280 285 Phe Phe Ser Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr 290 295 300 Vai Ser cys Pro Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp 305 310 315 Tyr Met Pro Leu Trp His His His His His His His His 320 325 328 <210> 23 <211> 175 < 212 > PRT < 213 > Art: Íf ici .al <220> < 2 2 3 > Sequênci .a artifi ciai 1-1 75 <400> 23 Ile Phe Leu Gly Leu Gly Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg 1 5 10 15 Lys Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin 20 25 30 Vai Pro Leu kep Leu Vai Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met 35 40 45 Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Vai Alá Gin Leu Arg 50 55 €0 Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gin Arg Lys Cys Glu Vai Asn Leu Gin 65 70 75 Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser 80 85 90 Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Vai Asp Leu Pro Glu Ala 95 100 105 Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Vai Asn Pro Phe Thr Met Gin Glu 110 115 120 127 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Asp Arg Ser Met Vai Ser Vai Pro Vai 125

Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro 140

Gin Arg Ala Vai Met Glu Thr Ile Ala 155 «

Phe Gly His His His His His His His 170 <210> 24 <211> 206

< 212 > PRT <213> Artificial < 2 2 0 > <223> Sequência artificial 1-206 <400> 24

Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe 1 5

Cys Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu 20

His Gly Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala 35

Gin Ala Pro Pro His Leu Leu Ala Arg 50

Ala Leu Pro Vai Ala Leu Vai Ser Ser 65

Arg Gly Arg His Glu Arg Pro Ser Ala eo

Leu Arg Pro Glu Glu Vai Leu Glu Ala 95

Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Vai Asp 110

Pro Gin Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys 125

Phe Ser Gin Vai Pro Vai 130 135 Arg Thr Gly Pro Cys Arg 145 ISO Vai Gly Cys Thr Cys Ile 160 16? His 175

Leu Thr Trp Leu His Thr 10 15 Arg Gly His Pro His Ser 25 30 Glu Glu Leu Pro Leu Gly 40 45 Gly Ala Lys Trp Gly Gin 55 60 Leu Glu Ala Ala Ser His 70 75 Thr Thr Gin Cys Pro Vai 85 90 Asp Thr His Gin Arg Ser 100 105 Thr Asp Glu Asp Arg Tyr 115 120 Leu Cye Arg Gly Cys Ile 130 135 128 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu Asn Ser Vai Arg 140 145 150

Leu Leu Gin Ser Leu Leu Vai Leu Arg Arg Arg Pro Cys Ser Arg 155 160 165

Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe His Thr 170 .175 180

Glu Phe lie His Vai Pro Vai Gly Cys Thr Cys Vai Leu Pro Arg 185 * 190 195

Ser Vai Gly His His His His His His His His 200 205 206

<210> 25 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25

Met Ala Lys Vai Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr 1 5 10 15

Ser Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser lie Asp His Leu Ser Leu 20 25 30

Asn Gin Lys Ser Phe Tyr His Vai Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu 35 · 40 45

Gly Cys Met Asp Gin Ser Vai Ser Leu Ser lie Ser Glu Thr Ser 50 55 60

Lys Thr Ser Lys Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Vai Vai Vai Ala 65 70 75

Thr Asn Gly Lys Vai Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gin 80 85 90

Ser Ile Thr Asp Asp Asp Leu Glu Ala Xle Ala Asn Asp Ser Glu 95 100 105

Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg Ser Ala Pro Phe ser Phe Leu Ser 110 115 120

Asn Vai Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile 125 130 135

Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gin 140 145 150 129 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Vai Lys 155 160 165 Fhe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile 170 175 180 Thr Vai Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gin Leu Tyr Vai Thr Ala 185 190 19Γ Gin Asp Glu Asp Gin Pro Vai Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile 200 205 210 Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp 215 220 225 Glu Thr Kis Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Vai Ala His Pro 230 235 240 Asn Leu Phe lie Ala Thr Lys Gin Asp Tyr Trp Vai Cys Leu Ala 245 250 255 Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gin Ile Leu Glu Asn Gin 260 265 270 Ala 271 < 210 > 26 <211> 177 <212> PRT < 213 > Homo sapiens < 4 0 0 > 26 Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser Kis Leu Ile Thr Leu Leu 1 5 10 15 Leu Phe Leu Phe His Ser Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg 20 25 30 Lys Ser Ser Lys Met Gin Ala Phe Arg Ile Trp Asp Vai Asn Gin 35 40 45 Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu Vai Ala Gly Tyr Leu 50 55 60 Gin Gly Pro Asn Vai Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Vai Vai Pro 65 70 75 130 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile Hls Gly Gly Lys Met 80 85 90

Cys Leu Ser Cys Vai Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gin Leu 95 100 105

Glu Ala Vai Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gin Asp 110 115 120

Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser 125 130 135

Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met 140 145 150

Glu Ala Asp Gin Pro Vai Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly 155 160 165

Vai Met Vai Thr Leu Phe Tyr Phe Gin Glu Asp Glu 170 175 177

Listagem de Sequências <110> Genentech, Inc., et al.

<120> POLIPÉPTIDOS HOMÓLOGOS DE IL-17 E SUAS UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS

<130> P1381-R1-PCT <140> PCT/US99/10733 <141> 1999-05-14 <150> US 60/085, 579 <151> 1998-05-15 <150> US 60/113, 621 <151> 1998-12-23 <160> 26

<210> 1 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens 131

ΕΡ 1 076 703/PT <400> 1

Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile 1 5 10 15 Phe Leu Gly Leu Gly Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Vai 35 40 45 Pro Leu Asp Leu Vai Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu 50 55 60 Glu Tyr Glu Arg Asn Xle Glu Glu Met Vai Ala Gin Leu Arg Asn 65 70 75 Ser Ser Glu Leu Ala Gin Arg Lys Cys Glu Vai Asn Leu Gin Leu 80 85 90 Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile 95 100 105 Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Vai Asp Leu Pro Glu Ala Arg 110 115 120 Cys Leu Cys Leu Gly Cys Vai Asn Pro Phe Thr Met Gin Glu Asp 125 130 135 Arg Ser Met Vai Ser Vai Pro Vai Phe Ser Gin Vai Pro Vai Arg 140 145 150 Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gin 155 160 165 Arg Ala Uai Met Glu Thr Ile Ala Vai Gly Cys Thr Cys Ile Phe 170 175 180

< 210 > 2 <211> 687 < 212 > ADN <213> Homo sapiens 132 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ <400> 2 aggcgggcag cagctgcagg ctgaccttgc agcttggcgg aatggactgg 50 cctcacaacc tgctgtttct tcttaccatt tccatcttcc tggggctggg 100 ccagcccagg agccccaaaa gcaagaggaa ggggcaaggg cggcctgggc 150 ccctggcccc tggccctcac caggtgccac tggacctggt gtcacggatg 200 aaaccgtatg cccgcatgga ggagtatgag aggaacatcg aggagatggt 250 ggcccagctg aggaacagct cagagctggc ccagagaaag tgtgaggtca 300 acttgcagct gtggatgtcc aacaagagga gcctgtctcc ctggggctac 350 agcatcaacc acgaccccag ccgtatcccc gtggacctgc oggaggcacg 400 gtgcctgtgt ctgggctgtg tgaacccctt caccatgcag gaggaccgca 450 gcatggtgag cgtgccggtg ttcagccagg ttcctgtgcg ccgccgcctc 500 tgcccgccac cgccccgcac agggccttgc cgccagcgcg cagtcatgga 550 gaccatcgct gtgggctgca cctgcatctt ctgaatcacc tggcccagaa 600 gccaggccag cagcccgaga ccatcctcct tgcacctttg tgccaagaaa 650 ggcctatgaa aagtaaacac tgacttttga aagcaag 687

<210> 3 <211> 197 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr 15 10 15

Cys Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser 20 25 30

His Gly Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly 35 40 45

Gin Ala Pro Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gin 133

ΕΡ 1 076 703/PT 50 55 60

Ala Leu Pro Vai Ala Leu Vai Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His 65 70 75

Arg Gly Arg His Glu Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gin Cys Pro Vai 80 85 90

Leu Arg Pro Glu Glu Vai Leu Glu Ala Asp Thr His Gin Arg Ser 95 100 105

Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Vai Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr 110 115 120

Pro Gin Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile 125 130 135

Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu Asn Ser Vai Arg 140 145 150

Leu Leu Gin Ser Leu Leu Vai Leu Arg Arg Arg Pro Cys Ser Arg 155 160 165

Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe His Thr 170 175 180

Glu Phe Ile His Vai Pro Vai Gly Cys Thr Cys Vai Leu Pro Arg 185 190 195

Ser Vai 197

<210> 4 <211> 1047 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 4 gccaggtgtg caggccgctc caagcccagc ctgccccgct gccgccacca 50 tgacgctcct ccccggccce ctgtttctga cctggctgca cacatgcctg 100 gcecaccatg acccctccct cagggggcac ccccacagtc acggtacccc 150 acactgctac tcggctgagg aactgcccct cggccaggcc cccccacacc 200 tgetggctcg aggtgccaag tgggggcagg ctttgcctgt agccctggtg 250 tccagcctgg aggcagcaag ccacaggggg aggcacgaga ggccctcagc 300 tacgacccag tgcccggtgc tgcggccgga ggaggtgttg gaggcagaca 350 cccaccagcg ctccatctca ccctggagat accgtgtgga cacggatgag 400 gaccgctatc cacagaagct ggccttcgcc gagtgcctgt gcagaggctg 450 134 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ tatcgatgca cggacgggcc gcgagacagc tgcgctcaac tccgtgcggc 500 tgctccagag cctgctggtg ctgcgccgcc ggccctgctc ccgcgacggc 550 tcggggctcc ccacacctgg ggcctttgcc ttccacaccg agttcatcca 600 cgtccccgtc ggctgcacct gcgtgctgcc ccgttcagtg tgaccgccga 650 ggccgtgggg cccctagact ggacacgtgt gctccccaga gggcaccccc 700 tatttatgtg tacttattgt tatttatatg cctcccccaa cactaccctt 750 ggggtctggg cattccccgt gtctggagga cagcccccca ctgttctcct 800 catctccagc ctcagtagtt gggggtagaa ggagctcagc acctcttcca 850 gcccttaaag ctgcagaaaa ggtgtcacac ggctgcctgc accttggctc 900 cctgtcctgc tcccggcttc ccttacccta tcactggcct caggccccgc 950 aggctgcctc ttcccaacct cctcggaagc acccctgttt cttaaacaat 1000 tatttaagtg tacgtgtatt attaaactga tgaacacatc cccaaaa 1047 < 210 > 5 <211> 830

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <220> <221> desconhecida <222> 105-115 <223> base desconhecida < 4 0 0 > 5 ggcagcaggg accaagagag gcacgcttgc ccttttatga catcagagct 50 cctggttctt gctccttggg actctgggac ttacaccagt ggcacccctg 100 gctcnnnnnn nnnnnaattc ggtacgaggc tggggttcag gcgggcagca 150 gctgcaggct gaccttgcag cttggcggaa tggactggcc tcacaacctg 200 ctgtttcttc ttaccatttc catcttcctg gggctgggcc agcccaggag 250 ccccaaaagc aagaggaagg ggcaagggcg gcctgggccc ctggtccctg 300 gccctcacca ggtgccactg gacctggtgt cacggatgaa accgtatgcc 350 cgcatggagg agtacgagag gaacatcgag gagatgttgg cccagctgag 400 gaacagttca gagctggccc agagaaagcg tgaggtcaac ttgcagctgt 450 ggatgtccaa caagaggagc ctgtctccct ggggctacag catcaaccac 500 gaccccagcc gtatccccgt ggacctccgg aggcacggtg cctgtgtctg 550 135 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ ggcttgtgtg aaccccttca ccatgcagga ggaccgcagc atggtgagcg tgccggtgtt cagccaggtt cctgtgcgcc gccgcctctg cccgccaccg ccccgcacag ggccttgccg ccagcgcgca gtcatggaga ccatcgctgt gggctgcacc tgcatcttct gaatcgacct ggcccagaag ccaggccagc agcccgagac catcctcctt gcacctttgt gccaagaaag gcctatgaaa agtaaacact gactcttgaa agcaaaaaaa 830 <210> 6 <211> 397 < 212 > ADN <213> Ar ti ficial <220> <223> Sequ ência art <220> <221> de sc onhecida < 2 2 2 > 10, 150, 267 <223> base desconhei <400> 6 aggcgggcan agctgcaggc tgaccttgca gcttggcgga atggactggc ctcacaacct gctgtttctt cttaccattt ccatcttcct ggggctgggc agccaggagc cccaaaagca agaggaaggg gcaagggegg cctgggcccn tggcctggcc tcaccaggtg ccaccggacc cggtgtcacg gatgaaaccg tatgcccgca tggaggagta tgagaggaac atcgaggaga tggtggccca gctgaggaac agctcanaag ctggcccaga gaaagtgtga ggtcaacttg cagctgtgga Cgtccaacaa gaaggagccc gtctcccttg gggctacaag catcaaccac cgaccccagc cgtatccccg tgggaccttg ccgggac 397 <210> 7 <211> 230

<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-230 <400> 7 cacggatgag gaccgctatc cacagaagct ggccttcgcc gagtgcctgt gcagaggctg tatcgatgca cggacgggcc gcgagacagc tgcgctcaac 100 136 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ tccgtgcggc tgctccagag cctgctggtg ctgcgccgcc ggccctgctc 150 ccgcgacggc tcggggctcc ccacacctgg ggçctttgcc ttccacaccg 200 agttcatcca cgtccccgtc ggctgcacct 230 <210> 8 <211> 24

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial 1-24 <400> 8 atccacagaa gctggccttc gccg 24 <210> 9 <211> 24

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial 1-24 <400> 9 gggacgtgga tgaactcggt gtgg 24

<210> 10 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência artificial 1-40 <400> 10 tatccacaga agctggcctt cgccgagtgc ctgtgcagag 40 <210> 11

< 211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Vai Ser Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Glu Ala Ile Vai Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn 20 25 30 Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Vai 35 40 45

Met Vai Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro 50 55 60 137 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn 65 70 75

Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Vai Ile Trp 80 85 90

Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn 95 100 105

Vai Asp Tyr His Met Asn Ser Vai Pro Ile Gin Gin Glu Ile Leu 110 115 120

Vai Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu 125 130 135

Glu Lys Ile Leu Vai Ser Vai Gly Cys Thr Cys Vai Thr Pro Ile 140 145 150 val His His Vai Ala 155 <210> 12 <211 > 408 <212> PRT < 213 > Artificia .1 <220> <223> Sequência . artif ici; al 1 .-408 <400> 12 Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr Ile Ser Ile 1 5 10 15 Phe Leu Gly Leu Gly Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys 20 25 30 Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Val 35 40 45 Pro Leu Asp Leu val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu 50 55 60 Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gin Leu Arg Asn 65 70 75 Ser Ser Glu Leu Ala Gin Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gin Leu 80 85 90 Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser Ile 95 100 105 Asn His Asp Pro Ser Arg lie Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg 110 115 120

Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn Pro Phe Thr Met Gin Glu Asp 138

ΕΡ 1 076 703/PT 125 130 135

Arg Ser Met Vai Ser Vai Pro Vai Phe Ser Gin Vai Pro Vai Arg 140 145 150

Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg Gin 155 160 165

Arg Ala Vai Met Glu Thr Ile Ala Vai Gly Cys Thr Cys Ile Phe 170 175 180

Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 185 190 195

Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 200 205 210

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 215 220 225

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai 230 235 240

Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 245 250 255

Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu 260 265 270

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser 275 280 285

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 290 295 300

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 305 310 315

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 320 325 330

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 335 340 345

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp 350 355 360

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys 365 370 375

Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His 380 385 390

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 395 400 405 O u 04 Gly Lys 408 <210> 13 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-425 139 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ <400> 13

Ket Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr 15 10 15

Cys Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser 20 25 30

His Gly Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly 35 40 45

Gin Ala Pro Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gin 50 55 60

Ala Leu Pro Vai Ala Leu Vai Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His 65 70 75

Arg Gly Arg His Glu Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gin Cys Pro Vai 80 85 90

Leu Arg Pro Glu Glu Vai Leu Glu Ala Asp Thr His Gin Arg Ser 95 100 105

Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Vai Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr 110 115 120

Pro Gin Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile 125 130 135

Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu Asn Ser Vai Arg 140 145 150

Leu Leu Gin Ser Leu Leu Vai Leu Arg Arg Arg Pro Cys Ser Arg 155 160 165

Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe His Thr 170 175 180

Glu Phe Ile His Vai Pro Vai Gly Cys Thr Cys Vai Leu Pro Arg 185 190 195

Ser Vai Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 200 205 210

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 215 220 225 140 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai 230 23S 240

Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp 245 250 255

Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 260 265 270

Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr 275 280 285

Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 290 295 300

Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 305 · 310 315

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 320 325 330

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys 335 340 345

Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu 350 355 360

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai 365 370 375

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai 380 385 390

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai 395 400 405

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 410 415 420

Leu Ser Pro Gly Lys 425 <210> 14 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Vai Ala Phe Ser 15 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Vai Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Vai 20 25 30

Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Vai Ala Ala Pro His Arg Gin 141 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 35 40 45 pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gin Ile Arg Tyr Ile 50 55 60

Leu Asp Gly He Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser 65 70 75

Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu 80 85 90

Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly 95 100 105

Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Vai Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu 110 115 120

Glu Phe Glu Vai Tyr Leu Glu Tyr Leu Gin Asn Arg Phe Glu Ser 125 130 135

Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Vai Gin Met Ser Thr Lys Vai Leu 140 145 150

Ile Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr 155 160 165

Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gin 170 175 180

Ala Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu 185 190 195

Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg 200 205 210

Gin Met 212

<210> 15 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Vai Pro Gly Pro Leu 15 10 15

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Vai Leu Ala Pro Gly Gly 20 25 30

Ala Ser Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Vai Cys Ser Gin 35 40 45

Pro Gly Leu Asn Cys Thr Vai Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp 50 55 60 142 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Ser Trp Xle His Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp 65 70 75

Leu Gin Ile Gin Leu His Phe Ala His Thr Gin Gin Gly Asp Leu 80 85 90

Phe Pro Vai Ala His Ile Glu Trp Thr Leu Gin Thr Asp Ala Ser 95 100 105

Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala Glu Leu Ser Vai Leu Gin Leu Asn 110 115 120

Thr Asn Glu Arg Leu Cys Vai Arg Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu 125 130 135

Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe Thr Phe Ser His Phe Vai 140 145 150

Vai Asp Pro Asp Gin Glu Tyr Glu Vai Thr Vai His His Leu Pro 155 160 165

Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gin Ser Lys Asn Phe 170 175 180

Leu Vai Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Vai Thr Thr Pro 185 190 195

Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr Vai Glu 200 205 210

Thr Leu Glu Ala His Gin Leu Arg Vai Ser Phe Thr Leu Trp Asn 215 220 225

Glu Ser Thr His Tyr Gin Ile Leu Leu Thr Ser phe Pro His Met 230 235 240

Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro 245 250 255

Arg Pro Glu Glu Phe His Gin Arg Ser Asn Vai Thr Leu Thr Leu 260 265 270

Arg Asn Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gin Vai Gin Ile Gin Pro 275 280 285

Phe Phe Ser Ser Cy3 Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr 290 295 300

Vai Ser Cys Pro Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp 305 310 315

Tyr Met Pro Leu Trp 320

<210> 16 <211> 543 < 212 > ADN <213> Homo sapiens 143 ΕΡ 1 076 703/PT <400> 16 atggactgge ctcacaacct gcCgtttctt cttaccattt ccatcttccC ggggctgggc cagcccagga gccccaaaag caagaggaag gggcaagggc ggcctgggcc cctggcccct ggccctcacc aggtgccact ggacctggtg tcacggatga aaccgtatgc ccgcatggag gagtatgaga ggaacatcga ggagatggtg gcccagctga ggaacagctc agagctggcc cagagaaagt gtgaggtcaa cttgcagctg tggatgtcca acaagaggag cctgtctccc tggggctaca gcatcaacca cgaccccagc cgtatccccg tggacccgcc ggaggcacgg tgcctgtgte tgggctgtgt gaacccctte accatgcagg aggaccgcag catggtgage gtgccggtgt tcagccaggt tcctgtgcgc cgccgcctct gcccgccacc gccccgcaca gggccttgcc gccagcgcgc agtcatggag accatcgctg tgggctgcac ctgcatcttc tga 543

<210> 17 <211> 594 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 atgacgctcc tccccggcct cctgtttctg acctggctgc acacatgcct ggcccaccat gacccctccc tcagggggca cccccacagt cacggtaccc cacactgcta ctcggctgag gaactgcccc tcggccaggc ccccccacac ctgctggctc gaggtgccaa gtgggggcag gctttgcctg cagccctggt gtccagcctg gaggcagcaa gccacagggg gaggcacgag aggccctcag ctacgaccca gtgcccggtg ctgcggccgg aggaggtgtt ggaggcagac acccaccagc gccccatctc accctggaga taccgtgcgg acacggatga ggaccgctat ccacagaagc tggccttcgc cgagtgcctg tgcagaggct gtatcgatgc acggacgggc cgcgagacag ctgcgctcaa ctccgtgcgg ctgctccaga gcctgctggt gctgcgccgc cggccctgct cccgcgacgg cccggggctc cccacacctg gggcctttgc cttccacacc gagttcatcc acgtccccgt cggctgcacc tgcgtgctgc cccgttcagt gtga 594 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-9 <400> 18

Gly His His Hís His His His His His 1 5 9 144 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

<210> 19 <211> 157 < 212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Vai Ala His 15 10 15

Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn 20 25 30

Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp 35 40 45

Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser 50 55 60

Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu 65 70 75

Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys 80 85 90

Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr 95 100 105

Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu 110 115 120

Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu 125 130 135

Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val 140 145 150

Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 155 157 <210> 20 <211> 21 < 212 > ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-21 <400> 20 ctgtacctcg agggtgcaga g 21 <210> 21 <211> 58 < 212 > ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-58 <400> 21 cccaagcttg ggtcaatgat gatgatgatg atgatgatgc cacaggggca 50 tgtagtcc 58 145 145 Ala Vai Pro Gly Pro Leu 10 15 Vai Leu Ala Pro Gly Gly 25 30 Ala Leu Vai Cys Ser Gin 40 45 Ser Thr Cys Leu Asp Asp 55 60 Pro Ser Ser Pro Lys Asp 70 75 Thr Gin Gin Gly Asp Leu 85 90 Leu Gin Thr Asp Ala Ser 100 105 Ser Vai Leu Gin Leu Asn 115 120 Glu Phe Leu Ser Lys Leu 130 135 Thr Phe Ser His Phe Vai 145 150 Thr Vai His His Leu Pro ΕΡ 1 076 703/ΡΤ <210> 22 <211> 328 <212> PRT < 213 > Homo sapiens <400> 22

Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser 1 5

Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly 20

Ala Ser Leu Arg Leu Leu Asp His Arg 35

Pro Gly Leu Asn Cys Thr Vai Lys Asn 50

Ser Trp Ile His Pro Arg Asn Leu Thr 65

Leu Gin Ile Gin Leu His Phe Ala His 80

Phe Pro Vai Ala His Ile Glu Trp Thr 95

Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala Glu Leu 110

Thr Asn Glu Arg Leu Cys Vai Arg Phe 125

Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe 140

Vai Asp Pro Asp Gin Glu Tyr Glu Vai 146 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 155 160 165

Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gin Ser Lys Asn Phe 170 175 180

Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Vai Thr Thr Pro 185 190 195

Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr Val Glu 200 205 210

Thr Leu Glu Ala His Gin Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp Asn 215 220 225

Glu Ser Thr His Tyr Gin Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met 230 235 240

Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro 245 250 255

Arg Pro Glu Glu Phe His Gin Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu 260 265 270

Arg Asn Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gin Val Gin Ile Gin Pro 275 280 285

Phe Phe Ser Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr 290 295 300

Val Ser Cys Pro Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp 305 310 315

Tyr Met Pro Leu Trp His His His His His His His His 320 325 328 <210> 23 <211> 175 < 212 > PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência <400> 23

Ile Phe Leu Gly Leu Gly Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg 15 10 15

Lys Gly Gin Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin 20 25 30

Val Pro Leu Asp Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met 35 40 45

Glu Glu Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Glu Met Val Ala Gin Leu Arg 50 55 60 147 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Asn Ser Ser Glu Leu Ala Gin Arg Lys Cys Glu Vai Asn Leu Gin 65 70 75

Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser 80 85 90

Ile Asn His Asp Pro Ser Arg Ile Pro Vai Asp Leu Pro Glu Ala 95 100 105

Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Vai Asn Pro Phe Thr Met Gin Glu 110 115 120

Asp Arg Ser Met Vai Ser Vai Pro Vai Phe Ser Gin Vai Pro Vai 125 130 135

Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr Gly Pro Cys Arg 140 145 150

Gin Arg Ala Vai Met Glu Thr Ile Ala Vai Gly Cys Thr Cys Ile 155 160 165

Phe Gly His His His His His His His His 170 175 <210> 24 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência artificial 1-206 <400> 24

Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr 1 5 10 15 Cys Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser 20 25 30 His Gly Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly 35 40 45 Gin Ala Pro Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gin 50 55 60 Ala Leu Pro Vai Ala Leu Vai Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His 65 70 75 Arg Gly Arg His Glu Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gin Cys Pro Vai 80 85 90 Leu Arg Pro Glu Glu Vai Leu Glu Ala Asp Thr His Gin Arg Ser 95 100 105 Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Arg Vai Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr 110 115 120 148 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Pro Gin Lys Leu Ala Phe Ala Glu Cys Leu Cys Arg Gly Cys Ile 125 130 135 Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala Ala Leu Asn Ser Val Arg 140 145 150 Leu Leu Gin Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg Arg Pro Cys Ser Arg 155 160 165 Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe Ala Phe His Thr 170 175 180 Glu Phe Ile His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Leu Pro Arg 185 190 195 Ser Vai Gly His His His His His His His His 200 205 206 <210> 25 <211> 271 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Ala Lys Val Pro Asp Met Phe Glu Asp Leu Lys Asn Cys Tyr 1 5 10 15 Ser Glu Asn Glu Glu Asp Ser Ser Ser Ile Asp His Leu Ser Leu 20 25 30 Asn Gin Lys Ser Phe Tyr His Val Ser Tyr Gly Pro Leu His Glu 35 40 45 Gly Cys Met Asp Gin Ser Val Ser Leu Ser Ile Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Lys Thr Ser Lys Leu Thr Phe Lys Glu Ser Met Val Val Val Ala 65 70 75 Thr Asn Gly Lys Val Leu Lys Lys Arg Arg Leu Ser Leu Ser Gin 80 85 90 Ser Ile Thr Asp Asp Asp Leu Glu Ala Ile Ala Asn Asp Ser Glu 95 100 105 Glu Glu Ile Ile Lys Pro Arg Ser Ala Pro Phe Ser Phe Leu Ser 110 115 120 Asn Vai Lys Tyr Asn Phe Met Arg Ile Ile Lys Tyr Glu Phe Ile 125 130 135 Leu Asn Asp Ala Leu Asn Gin Ser Ile Ile Arg Ala Asn Asp Gin 140 145 150

Tyr Leu Thr Ala Ala Ala Leu His Asn Leu Asp Glu Ala Vai Lys 149 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 155 160 165

Phe Asp Met Gly Ala Tyr Lys Ser Ser Lys Asp Asp Ala Lys Ile 170 175 180

Thr Vai Ile Leu Arg Ile Ser Lys Thr Gin Leu Tyr Vai Thr Ala 185 190 195

Gin Asp Glu Asp Gin Pro Vai Leu Leu Lys Glu Met Pro Glu Ile 200 205 210

Pro Lys Thr Ile Thr Gly Ser Glu Thr Asn Leu Leu Phe Phe Trp 215 220 225

Glu Thr His Gly Thr Lys Asn Tyr Phe Thr Ser Vai Ala His Pro 230 235 240

Asn Leu Phe Ile Ala Thr Lys Gin Asp Tyr Trp Vai Cys Leu Ala 245 250 255

Gly Gly Pro Pro Ser Ile Thr Asp Phe Gin Ile Leu Glu Asn Gin 260 265 270

Ala 271

<210> 26 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg ser His Leu Ile Thr Leu Leu 15 10 15

Leu Phe Leu Phe His Ser Glu Thr Ile Cys Arg Pro Ser Gly Arg 20 25 30

Lys Ser Ser Lys Met Gin Ala Phe Arg Ile Trp Asp Vai Asn Gin 35 40 45

Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gin Leu Vai Ala Gly Tyr Leu 50 55 60

Gin Gly Pro Asn Vai Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Vai Vai Pro 65 70 75

Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met 80 85 90

Cys Leu Ser Cys Vai Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gin Leu 95 100 105

Glu Ala Vai Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gin Asp 110 115 120 150 ΕΡ 1 076 703/ΡΤ

Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser 125

Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly 140

Glu Ala Asp Gin Pro Vai Ser Leu 155

Vai Met Vai Thx Leu Phe Tyr Phe 170

Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser 130 135

Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met 145 150

Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly 160 165

Gin Glu Asp Glu 175 177

Lisboa,

Claims

ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polipéptido PR01122 para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma desordem cartilaginosa degenerativa, em que o referido polipéptido PR01122 é um polipéptido isolado possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos com um polipéptido seleccionado do grupo que consiste em: (i) um polipéptido PR01122 consistindo na sequência de resíduos de aminoácido 1 a 197 apresentada na Figura 3 (SEQ ID NO:3), (ii) um polipéptido PR01122 consistindo na sequência de resíduos de aminoácido 19 a 197 apresentada na Figura 3 (SEQ ID NO:3), (iii) um polipéptido PR01122 codificado pela sequência de codificação de comprimento completo do ADNc depositado na ATCC com o número de acesso 203552, e (iv) um polipéptido PR01122 codificado pela sequência de codificação de comprimento completo do ADNc depositado na ATCC com o número de acesso 203552, a que falta o seu péptido de sinal associado, sendo a identidade de sequências de aminoácidos determinada ao longo da totalidade do comprimento do polipéptido PR01122 de (i), (ii), (iii) ou (iv), e sendo o polipéptido isolado capaz de induzir a libertação de TNF-α por células THP-1 e/ou aumentar a quebra de matriz e inibir a síntese de matriz em explantes de cartilagem articular.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a identidade de sequências de aminoácidos é de pelo menos 90%.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a identidade de sequências de aminoácidos é de pelo menos 95%.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a identidade de sequências de aminoácidos é de pelo menos 98%.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a identidade de sequências de aminoácidos é de pelo menos 99%. ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 2/3
6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido PR01122 isolado compreende os aminoácidos 1 ou 19 a 197 da Figura 3 (SEQ id NO:3).
7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido PR01122 isolado é codificado pela sequência de codificação de comprimento completo do ADNc depositado na ATCC com o número de acesso 203552, e possui ou não o seu péptido de sinal associado.
8. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o tratamento é de artrite.
9. Antagonista de um polipéptido PR01122, em que o referido antagonista compreende: (1) um anticorpo anti-PR01122 que se liga especificamente a um polipéptido PR01122 consistindo na sequência de resíduos de aminoácido 1 ou 19 a 197 apresentada na Figura 3 (SEQ ID NO:3), ou (2) um antagonista de ácido nucleico dirigido contra o ácido nucleico da Figura 4 (SEQ ID NO:4), que é um ácido nucleico anti-sentido, um oligonucleotidico de ácido desoxinucleico adaptado para a formação de hélices triplas, ou uma ribozima, e antagoniza a actividade do polipéptido PR01122 consistindo na sequência de resíduos de aminoácido 1 ou 19 a 197 apresentada na Figura 3 (SEQ ID NO:3) para induzir a libertação de TNF-α por células THP-1 e/ou aumentar a quebra de matriz e inibir a síntese de matriz em explantes de cartilagem articular.
10. Composição farmacêutica terapêutica compreendendo o antagonista de PR01122 de acordo com a reivindicação 9 em mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável.
11. Antagonista de um polipéptido PR01122, para utilização num método de tratamento, em que o antagonista é tal como definido na reivindicação 9. ΕΡ 1 076 703/ΡΤ 3/3
12. Antagonista de acordo com a reivindicação 11, em que o tratamento é de uma condição inflamatória e/ou uma desordem cartilaginosa degenerativa.
13. Antagonista de acordo com a reivindicação 12, em que o tratamento é de artrite.
14. Utilização de um antagonista tal como definido na reivindicação 9 no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma condição inflamatória e/ou uma desordem cartilaginosa degenerativa.
15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o tratamento é de artrite. Lisboa,