PT1126876E - Sistemas adjuvantes e vacinas - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "SISTEMAS ADJUVANTES E VACINAS" A presente invenção refere-se a vacinas melhoradas, sistemas adjuvantes e a processos para a preparação dessas vacinas e sistemas adjuvantes. Em particular, as vacinas e os sistemas adjuvantes da presente invenção compreendem sais de alumínio e monofosforil lípido A 3-des-0-acilado.
Os sais de alumínio são bem conhecidos na técnica, por proporcionarem um excipiente seguro, com actividade adjuvante. Julga-se que o mecanismo de acção destes adjuvantes inclua a formação de um depósito de antigénio, de forma a que o antigénio possa permanecer no local da injecção durante até 3 semanas após a administração e, também, a formação de complexos de antigénio/sal metálico, os quais são mais facilmente incorporados por células apresentadoras de antigénio. Para além do alumínio, têm sido utilizados outros sais metálicos para adsorver antigénios, incluindo sais de zinco, cálcio, cério, crómio, ferro e berílio. Os sais de hidróxido e fosfato de alumínio são os mais comuns. São conhecidas na técnica, formulações de vacina contendo sais de alumínio, antigénio e imunoestimulantes adicionais. Essas formulações induziram respostas imunitárias maiores, em comparação com as estimuladas por apenas sais de alumínio e antigénio. Anteriormente, a formulação destas preparações de vacina envolvia um processo específico de produção, uma vez que, 1 de forma a ocorrer uma resposta imunitário óptima, se considerava que o antigénio devia ser adsorvido na mesma partícula de sal de alumínio do imunoestimulante. Deste modo, quando o antigénio é incorporado por uma célula apresentadora de antigénio, o imunoestimulante co-adsorvido exerce a sua actividade estimulante directamente sobre a mesma célula apresentadora de antigénio.
As formulações de vacina baseadas em alumínio, em que o antigénio e o imunoestimulante monofosforil lípido A 3-des-0-acilado (3D-MPL) são adsorvidos na mesma partícula, são descritas nos documentos EP 0576478 Bl, EP 0689454 BI e EP0633784 Bl. Nestes casos, o antigénio é inicialmente adsorvido no sal de alumínio, seguida pela adsorção do 3D-MPL imunoestimulante nas mesmas partículas de sal de alumínio. Esses processos envolvem, inicialmente, a suspensão de 3D-MPL num banho de água, por sonicação, até as partículas atingirem um tamanho entre 80 e 500 nm. Tipicamente, o antigénio é adsorvido no sal de alumínio durante uma hora à temperatura ambiente, sob agitação. A suspensão de 3D-MPL é, então, adicionada ao antigénio adsorvido e a formulação é incubada à temperatura ambiente durante 1 hora e, seguidamente, mantida a 4 C° até a utilização. O documento W 98/15287 divulga uma composição de vacina, compreendendo lipossomas (incluindo esterol), Q521, alúmen e monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, como adjuvante, e um antigénio. O documento WO97/00697 divulga composições de vacina contendo um antigénio de conjugado polissacarídico adsorvido em fosfato de alumínio. 2 0 documento W096/26741 divulga composições de vacina contendo antigénio de superfície da hepatite B, em combinação com fosfato de alumínio e monofosforil lípido A 3-des-0-acilado.
Os processos de formulação da técnica anterior proporcionam vacinas potentes de um ponto de vista imunológico, no entanto, estes apresentam várias desvantagens comerciais. Para uma vacina ser adequada para a administração humana, o processo deve ser uniforme e sujeito a controlo das Boas Práticas de Produção (GMP) e a Controlo de Qualidade (QC) . Em alguns casos, os processos da técnica anterior proporcionam uma vacina em que a totalidade do antigénio ou dos antigénios, é adsorvida na mesma partícula de sal metálico. 0 processo é, então, complicado pela necessidade do 3D-MPL ser adsorvido na mesma partícula metálica. Isto pode ser particularmente problemático no caso de vacinas de combinação contendo múltiplos antigénios (cuja adsorção pode ser dependente da afinidade de cada antigénio para o sal metálico particular, a um determinado pH) . Os processos da técnica anterior podem apresentar problemas, dependendo de quais antigénios estão presentes, da reprodutibilidade e do QC da vacina. Além disso, se ocorrer algo indesejado com o QC de um antigénio particular ou uma ocorrência que possa resultar na contaminação da vacina, isto pode resultar na perda da totalidade dos componentes individuais e não apenas do antigénio particular no qual o problema ocorreu. Além disso, em algumas circunstâncias, as vacinas de combinação podem requerer a adição sequencial dos antigénios, sendo esse processo extremamente moroso e dispendioso. Os processos da técnica anterior podem, consequentemente, ser complexos, difíceis de controlar e dispendiosos. 3
Surpreendentemente, os requerentes verificaram que não é necessário adsorver o antigénio e o monofosforil lipido A 3-des-O-acilado na mesma partícula de alumínio. Contrariamente ao entendimento aceite na técnica, foi verificado que podem ser produzidas boas vacinas, quando o antigénio é adsorvido em partículas de sal de alumínio particulares que são distintas das partículas de alumínio que estão associadas com o monofosforil lipido A 3-des-0-acilado. 0 processo melhorado compreende a adsorçâo de imunoestimulante, o qual é o monofosforil lipido A 3-des-0-acilado, numa partícula de sal de alumínio, seguida pela adsorçâo do antigénio numa outra partícula de sal de alumínio, seguida pela mistura das partículas metálicas distintas, de forma a constituir uma vacina. Além disso, são proporcionadas vacinas pela presente invenção, que são caracterizadas por o imunoestimulante, o qual é o monofosforil lipido A 3-des-0-acilado, ser adsorvido em partículas de sal de alumínio, não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorçâo às referidas partículas de sal de alumínio serem em antigénio e por as partículas de sal de alumínio que estão adsorvidas ao antigénio serem caracterizadas por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorçâo às referidas partículas de sal de alumínio ser monofosforil lipido A.
Consequentemente, é proporcionado um processo para a produção de uma vacina compreendendo a mistura de um adjuvante, compreendendo monofosforil lipido A 3-des-O-acilado, o qual foi adsorvido numa partícula de um sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorçâo às partículas de sal de alumínio ser antigénio, com um 4 antigénio. De um modo preferido, o antigénio foi pré-adsorvido num sal de alumínio. 0 referido sal de alumínio pode ser idêntico ou semelhante ao sal de alumínio que é adsorvido no monofosforil lípido A 3-des-0-acilado. A presente invenção proporciona, ainda, uma composição de vacina compreendendo imunoestimulante, o qual é monofosforil lípido A 3-des-0-acilado, adsorvido numa primeira partícula de um sal de alumínio e antigénio adsorvido num sal de alumínio, caracterizado por as primeiras e segundas partículas de sal de alumínio serem diferentes.
Alternativamente, as vacinas que constituem parte da presente invenção compreendem duas populações principais de complexos, um primeiro complexo compreendendo (a) imunoestimulante, o qual é monofosforil lípido A 3-des-0-acilado, adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorção às referidas partículas de sal de alumínio ser antigénio; e um segundo complexo compreendendo (b) antigénio adsorvido numa partícula de sal de alumínio. A composição de vacina pode compreender, igualmente, duas populações principais de complexos, um primeiro complexo compreendendo (a) imunoestimulante, o qual é monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorção às referidas partículas de sal de alumínio ser antigénio; e um segundo complexo compreendendo (b) antigénio adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorção às referidas partículas de sal de alumínio ser monofosforil lípido A 3-des-O-acilado. 5
Os sais de alumínio presentes nestas duas populações principais de complexos podem ser idênticos ou diferentes. Além disso, no caso de uma vacina de combinação, em que podem estar presentes vários antigénios diferentes, o segundo complexo (descrito acima) pode compreender vários antigénios adsorvidos em partículas de alumínio diferentes.
Quando não mais de 20% em massa do material total, com capacidade de adsorção à partícula de sal de alumínio é antigénio, de um modo preferido, é não mais de 10% e, de um modo muito preferido, é não mais de 5%. Alternativamente, quando não mais de 20% em massa do material total, com capacidade de adsorção à partícula de sal de alumínio é monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, de um modo preferido, é não mais de 10% e, de um modo muito preferido, é não mais de 5%. Podem ser utilizados ensaios de rotina, óbvios para o especialista na técnica, para determinar se o antigénio e o monofosforil lípido A 3-des-O-acilado estão adsorvidos em partículas distintas diferentes, incluindo, mas não limitados, à separação da vacina em fracções distintas pelo fluxo livre da formulação no interior de um campo eléctrico ou técnicas, tais como, análise da velocidade de sedimentação, as quais são particularmente adequadas para antigénios não-particulados, seguidas pelo ensaio do monofosforil lípido A 3-des-O-acilado ou do antigénio nas fracções.
Na presente invenção, é também fornecido um kit compreendendo um recipiente tendo monofosforil lípido A 3-des-O-acilado adsorvido num sal de alumínio; e um segundo recipiente tendo antigénio adsorvido num sal de alumínio. 6 0 processo da presente invenção é especialmente útil quando são necessárias quantidades à escala comercial de vacinas de combinação. As vacinas de combinação são vacinas de dose única que contêm mais de um antigénio proveniente de mais de um agente patogénico. Essas vacinas podem reduzir o número de vacinações necessárias para induzir protecção contra muitos agentes patogénicos e doenças.
Por exemplo, se uma vacina compreende A10H3, 3D-MPL e os antigénios V, W, X, Y, Z, os processos anteriores envolvem a formulação dos antigénios e do 3D-MPL na mesma partícula de A10H3. Os processos da técnica anterior requerem que V, W, X, Y, Z sejam adsorvidos em A10H3, seguido pela adição de 3D-MPL livre a cada um dos complexos de antigénio pré-adsorvidos.
Pelo contrário, no processo de formulação da presente invenção, cada um dos antigénios V, W, X, Y, Z é individualmente adsorvido em partículas separadas de A10H3, em recipientes separados. 0 3D-MPL é, também, adsorvido em AIOH3 num outro recipiente. A vacina é, então, preparada por simples mistura do material obtido a partir de cada um dos recipientes separados. Neste caso, as partículas de A10H3 que estão associadas com o 3D-MPL podem ser distintas das partículas de A10H3 que estão associadas com os antigénios.
Alternativamente, a presente invenção proporciona um processo de preparação de uma vacina compreendendo monofosforil lípido A 3-des-0-acilado, antigénio e um sal de alumínio, compreendendo: 1. Adsorção do antigénio a uma primeira partícula de um sal de alumínio, 7 2. Adsorção do monofosforil lipido A 3-des-0-acilado a uma segunda partícula de um sal de alumínio e 3. mistura dos produtos dos passos 1 e 2 acima. A presente invenção proporciona um processo para a produção de vacinas, o qual supera os problemas presentes na técnica anterior. Cada complexo de antigénio-sal de alumínio individual pode ser sujeito a controlos de GMP e deve qualquer contaminação indesejável de uma preparação de antigénio-sal de alumínio particular, então a integridade de outros antigénios e adjuvante imunoestimulante não será comprometida. Surpreendentemente, e ao contrário do entendimento aceite na técnica, as vacinas produzidas pelo processo da presente invenção são tão potentes como as preparadas utilizando o processo da técnica anterior. 0 monofosforil lipido A é um composto derivado de bactérias com actividade adjuvante. Este composto tóxico foi alterado para formar derivados menos tóxicos, um desses derivados é o monofosforil lipido A 3-des-0-acilado (designado 3D-MPL ou d3-MPL, para indicar que a posição 3 da extremidade glucosamina redutora se encontra des-O-acilada). Para a preparação de 3D-MPL, ver o documento GB 2220211 A. Quimicamente, este consiste numa mistura de monofosforil lipido A 3-desacilado, com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. De um modo preferido, nas composições da presente invenção é utilizado MPL de partícula pequena. O MPL de partícula pequena tem um tamanho de partícula que pode ser esterilizado por filtração através de um filtro com 0,22 pm. Essas preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional N° . WO 94/21292. No documento GB 9807933.8, que divulga preparações estáveis de 3D-MPL, consistindo em análogos tri e tetra acilados, são descritos aperfeiçoamentos adicionais. 0 documento GB 2220211A refere que a endotoxicidade dos lipopolissacáridos enterobacterianos (LPS), anteriormente utilizados, é reduzida, enquanto que as propriedades imunogénicas são conservadas. No entanto, o documento GB 2220211 refere estas verificações apenas em relação a sistemas bacterianos (Gram negativos). A presente invenção refere-se ao processo de formulação particular e às caracteristicas do adjuvante e, deste modo, pode ser utilizada com uma ampla variedade de antigénios. As vacinas da presente invenção podem ser utilizadas nas doses de iniciação e de reforço, utilizadas na indução de respostas imunitárias contra esta e na protecção contra infecção mediada por uma ampla variedade de antigénios. Alguns dos agentes patogénicos e antigénios estão listados abaixo. A hepatite virai, causada pelos virus A, B, C, D e E da hepatite, é uma doença virai muito comum. Através dos virus B e C, em particular, é, também, responsável por muitos casos de cancro do fígado. Deste modo, o desenvolvimento de vacinas eficazes é crítico e, apesar de êxitos notáveis, é ainda uma tarefa em desenvolvimento. Na Lancet de 12 de Maio de 1990, na página 1142 e seg. (Prof A. L. W. F. Eddleston), pode ser encontrada uma revisão das vacinas de hepatite modernas, incluindo várias referências-chave,. Ver, também, "Virai Hepatitis and Liver Disease" (Vyas, B. N., Dienstag, J. L. e Hoofnagle, J. H., eds, Grune e Stratton. Inc. (1984) e "Virai Hepatitis and Liver Disease" (Proceedings of the 1990 9
International Symposium, eds F. B. Hollinger, S. M. Lemon e H. Margolis, publicadas por Williams e Wilkins).
Como aqui utilizada, a expressão "antigénio da hepatite B" é utilizada para designar qualquer material antigénico derivado de um vírus da hepatite B que pode ser utilizado para induzir imunidade contra o vírus em humanos. A infecção com o vírus da hepatite B (HBV) é um problema generalizado mas encontram-se, presentemente, disponíveis vacinas que podem ser utilizadas para a imunização em massa, por exemplo, o produto "Engerix-B" (SmithKline Beecham plc) que é obtido por técnicas de engenharia genética. A preparação do antigénio de superfície da Hepatite B (HBsAg) encontra-se bem documentada. Ver, por exemplo, Harford et al. em Develop. Biol. Standard 54, página 125 (1983), Gregg et al. em Biotechnology. 5. página 479 (1987), documentos EP-A-0226846, EP-A-0299108 e referências incluídas.
Como aqui utilizada, a expressão "antigénio de superfície da Hepatite B" ou "HbsAg" inclui qualquer antigénio HBsAg ou seu fragmento apresentando a antigenicidade do antigénio de superfície do HBV. Será entendido que, para além da sequência com 226 aminoácidos do antigénio HBsAg S (ver Tiollais et al., Nature, 317, 489 (1985) e referências incluídas), o HbsAg, como aqui descrito, se pretendido, pode conter a totalidade ou parte de uma sequência pre-S, como descrito nas referências acima e no documento EP-A-0278940. Em particular, o HBsAg pode compreender um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 12-52, seguida pelos resíduos 133-145, seguidos pelos resíduos 175-400 da proteína L do HbsAg, em 10 relação à grelha de leitura aberta mum vírus da Hepatite B do serotipo ad (este polipéptido é designado como L*; ver o documento EP0414374). HbsAg, dentro do âmbito da invenção, pode, também, incluir o polipéptido preSl-preS2-S, descrito no documento EP 0198474 (Endotronics) ou seus análogos, tais como, os descritos no documento EP 0304578 (Me Cormick e Jones) . HbsAg, como aqui descrito, pode referir-se, também, a mutantes, por exemplo, o "mutante de fuga" descrito no documento WO91/14703 ou no Pedido de Patente Europeia com o Número de Publicação 0511855 Al, especialmente HbsAg, em que a substituição do aminoácido na posição 145 é arginina a partir de glicina.
Normalmente, o HBsAg irá estar sob a forma de partícula. As partículas podem compreender, por exemplo, a proteína S apenas ou ser partículas compostas, por exemplo (L*, S) , em que L* é como definido acima e S representa a proteína S do HBsAg. A referida partícula está, vantajosamente, na forma sob a qual é expressa em leveduras. O componente que confere protecção contra a Hepatite A é, de um modo preferido, o produto conhecido como "Havrix" (SmithKline Beecham Biologicals), o qual consiste numa vacina morta atenuada, derivada da estirpe HM 175 do HAV [ver "Inactivated Candidiate Vaccines for Hepatitis A" por F. E. Andre, A. Hepburn e E. D'Hondt (1980), Prog. Med. Virol. Vol 37, páginas 72-95 e a literatura do produto "Havrix" publicada por SmithKline Beecham Biologicals (1991).
Deste modo, numa forma de realização preferida da presente invenção, é proporcionada uma vacina de combinação compreendendo HBsAg e o antigénio da Hepatite A. É, também, proporcionado pela 11 presente invenção, um processo para a produção de uma vacina de combinação contra a hepatite A e B e um produto derivado desse processo.
Estão disponíveis no mercado outras vacinas de combinação, incluindo a gama Infanrix™, produzida por SmithKline Beecham Biologicals. Essas vacinas são baseadas numa combinação "nuclear" de toxina da Difteria, toxina do Tétano e antigénios de B. pertussis. Esta vacina compreende um componente da tosse convulsa (quer células de B. pertussis completas mortas quer pertussis acelular que, tipicamente, consiste em dois antigénios - PT e FHA e, frequentemente, 69kDa, opcionalmente com um ou ambos os aglutinogénio 2 ou aglutinogénio 3). Essas vacinas são, frequentemente, designadas como DTPw (célula completa) ou DTPa (acelular).
As vacinas de combinação particulares, dentro do âmbito da invenção, incluem:
Difteria-Tétano-Tosse Convulsa-Hepatite B (DTP-HB)
Difteria-Tétano-Hepatite B (DT-HB)
Hib-Hepatite B
DTP-Hib-Hepatite B IPV (vacina inactivada contra a poliomielite)-DTP-Hib-
Hepatite B 0 componente da tosse convulsa é, adequadamente, uma vacina contra a tosse convulsa de células completas ou uma vacina 12 acelular contra a tosse convulsa contendo antigénios parcialmente ou altamente purificados. As combinações acima podem incluir, opcionalmente, um componente que é protector contra a Hepatite A. De um modo preferido, o componente da Hepatite A é o HM 175 inactivado com formalina. De um modo vantajoso, o HM 175 é purificado por tratamento com tripsina do HM 175 cultivado, separando, por cromatografia de permeação, o vírus intacto das proteínas pequenas digeridas com protease e inactivando com formalina. De um modo vantajoso, a vacina de combinação contra a Hepatite B é uma vacina pediátrica.
Outras vacinas de combinação da presente invenção são divulgadas no documento GB 9805105.5 (SmithKline Beecham Biologicals s. a.), sendo essas vacinas de combinação especialmente benéficas para vacinas para adolescentes. As combinações preferidas são baseadas numa combinação "nuclear" de um antigénio da Hepatite B (Hep B) e de um antigénio de Herpes Simplex (HSVj . Opcionalmente, podem ser adicionados a este "núcleo" um ou mais antigénios derivados do grupo seguinte: antigénio do vírus de Epstein Barr (EBV), antigénio da Hepatite A (Hep A) , antigénio do vírus do Papiloma humano (HPV). Estas vacinas de combinação podem compreender, adicionalmente, Vírus Varicella Zoster (VZV), Citomegalovírus Humano (HCMV) ou antigénios do toxoplasma.
De um modo preferido, as formulações de vacina da presente invenção contêm um antigénio ou uma composição antigénica com capaz de promover uma resposta imunitária contra um agente patogénico humano, em que o antigénio ou a composição antigénica são derivados de HIV-1, (tais como, tat, nef, gpl20 ou gpl60), vírus do herpes humano, tal como gD ou seus derivados ou proteína Imediata Precoce, tal como a ICP27 do HSV1 ou do HSV2, 13 citomegalovírus ( (esp Humano) (tal como gB ou seus derivados), Rotavírus (incluindo vírus vivos-atenuados), vírus de Epstein Barr (tal como gp350 ou seus derivados), Vírus Varicella Zoster (tal como gpl, II e IE63) ou de um vírus de hepatite tal como o vírus da hepatite B (por exemplo, antigénio de superfície da Hepatite B ou um seu derivado), vírus da Hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E ou de outros agentes patogénicos virais, tal como paramixovírus: vírus Sincicial Respiratório (tais como, as proteínas F e G ou seus derivados), vírus da parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da parotidite, vírus do papiloma humano (por exemplo, HPV6, 11, 16 e 18), flavivírus (e. g. Vírus da Febre Amarela, Vírus do Dengue, vírus da encefalite da carraça, Vírus da Encefalite Japonesa) ou vírus Influenza ou derivados de agentes patogénicos bacterianos, tais como, Neisseria spp, incluindo N. gonorrhea e N. menigitidis (por exemplo, polissacáridos capsulares e seus conjugados, proteínas de ligação à transferrina, proteínas de ligação à lactoferrina, PilC, adesinas); Streptococcus spp, incluindo S. pneumoniae (por exemplo, polissacárido capsular e seus conjugados, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de ligação à colina), S. pyogenes (por exemplo, proteínas M ou seus fragmentos, protease C5A, ácidos lipoteicóicos), S. agalactiae, S. mutans, Haemophilus spp, incluindo H. influenzae do tipo B (por exemplo, PRP e seus conjugados), H. influenzae não tipável (por exemplo, OMP26, adesinas de elevado peso molecular, P5, P6, lipoproteína D), H. ducreyi; Moraxella spp, incluindo M. catarrhalis, também conhecida como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de elevado e baixo peso molecular); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por exemplo, pertactina, toxina da tosse convulsa ou seus derivados, hemaglutinina filamentosa, ciclase do adenilato, fímbrias), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., 14 incluindo M. tuberculosis (por exemplo, ESAT6, Antigénio 85A,-B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L. pneumophila; Escheríchia spp, incluindo E. coli enterotóxica (por exemplo, factores de colonização, toxina termolábil ou seus derivados, toxina termostável ou seus derivados), E. coli entero-hemorrágica, E. coli enteropatogénica (por exemplo, toxina semelhante à toxina Shiga ou seus derivados); Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo, toxina da cólera ou seus derivados); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerií; Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo, uma proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo, toxinas, adesinas e invasinas) e C. coli, Salmonela spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuís, S. enteritidis,
Listeria spp., incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo, urease, catalase, toxina de vacuolação); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa;
Staphilococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluindo E. faecalis, E. faecium;
Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo, toxina do tétano e seus derivados), C. botulinum (por exemplo, toxina botulínica e seus derivados), C. difficile (por exemplo, toxinas A ou B de clostrídio e seus derivados); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo, toxina botulínica e seus derivados); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo, toxina da difteria e seus derivados); Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo E. equi e o agente da Erliquiose Granulocítica Humana; Rickettsia spp, 15 incluindo R. rickettsii, Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação à heparina), C. pneumoniae (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação à heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans, Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo, as proteínas raras da membrana externa), T. denticola, T. hyodysenteriae; ou derivado de parasitas tal como Plasmodium spp., incluindo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp., incluindo T. cruzi; Giardia spp., incluindo G. lamblia; Leshmania spp., incluindo L. major; Pneumocystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis, Schisostoma spp., incluindo S. mansoni ou são derivados de leveduras, tais como, Candida spp., incluindo C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.
Num aspecto preferido, a formulação de vacina da invenção compreende o antigénio gpl20 do HIV-1, especialmente quando expresso em células CHO. Numa forma de realização adicional, a formulação de vacina da invenção compreende gD2t como aqui acima definido.
Numa forma de realização preferida da presente invenção as vacinas contendo o adjuvante reivindicado compreendem os vírus HPV, considerados responsáveis pelas verrugas genitais, (HPV 6 ou HPV 11 e outros) e os vírus HPV, responsáveis pelo cancro cervical (HPV 16, HPV 18 e outros) . As formas particularmente preferidas da vacina compreendem partículas Ll ou capsómeros e proteínas de fusão compreendendo um ou mais antigénios seleccionados das proteínas E6, E7, Ll e L2 de HPV 6 e HPV 11.
As formas mais preferidas de proteínas de fusão são: L2E7, como 16 divulgada no documento GB 95 15478.7 e proteína D (1/3)-E7, divulgada no documento GB 9717953.5 (WO99/10375).
As vacinas da presente invenção compreendem, adicionalmente, antigénios derivados de parasitas que causam Malária. Por exemplo, os antigénios preferidos de Plasmodia falciparum incluem RTS,S e TRAP. A RTS é uma proteína híbrida compreendendo, substancialmente, a totalidade da porção C-terminal da proteina do circunsporozoíto (CS) de P. Falciparum, ligada ao antigénio de superfície (S) do vírus da hepatite B, através de quatro aminoácidos da porção pré-S2 do antigénio de superfície da Hepatite B. A sua estrutura completa
é divulgada no Pedido de Patente Internacional N° . PCT/EP92/02591, publicado sob o Número WO 93/10152 reivindicando prioridade sobre 0 pedido de patente UK N°. 9124390.7. Quando expressa em levedura, a RTS é produzida sob a forma de uma partícula lipoproteica e quando é co-expressa com o antigénio S do HBV, esta produz uma partícula mista, conhecida como RTS,S. Os antigénios TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional N°. PCT/GB89/00895, publicado sob WO 90/01496. Uma forma de realização preferida da presente invenção consiste numa vacina contra a Malária, em que a preparação antigénica compreende a combinação dos antigénios RTS,S e TRAP. Outros antigénios de plasmódio que são candidatos prováveis a serem componentes da vacina multi-etapa contra a Malária são MSP1, AMAI, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2 de P. faciparum, Sequestrina, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs 16, Pfs48/45, Pfs230 e os seus análogos em Plasmodium spp.
As formulações podem, também, conter um antigénio antitumoral e serem úteis no tratamento imunoterapeutico de 17 cancros. Por exemplo, a formulação de vacina encontra utilidade com os antigénios de rejeição de tumores, tais como, para os cancros da próstata, mama, colorectal, pulmão, pancreático, renal ou melanoma. Os exemplos de antigénios incluem MAGE 1 e MAGE 3 ou outros antigénios MAGE para o tratamento do melanoma, PRAME, BAGE ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pp 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinicai & Laboratory Research (submetido em 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Câncer Instítute 89, p293. De facto, estes antigénios são expressos numa ampla variedade de tipos de tumor, tais como, melanoma, carcinoma do pulmão, sarcoma e carcinoma da bexiga. Outros antigénios Específicos de Tumores são adequados para a utilização com o adjuvante da presente invenção e incluem, mas não estão restringidos ao antigénio específico da Próstata (PSA) ou Her-2/neu, KSA (GA733), MUC-1 e antigénio carcinoembriónico (CEA). Foram propostos outros antigénios como antigénios terapêuticos contra a generalidade dos cancros, incluindo Tirosinase e Survivina. Consequentemente, num aspecto da presente invenção, é proporcionada uma vacina compreendendo uma composição de adjuvante de acordo com a invenção e um antigénio de rejeição de tumores. É previsível que as composições da presente invenção sejam utilizadas para formular vacinas contendo antigénios derivados de Borrelia sp. Por exemplo, os antigénios podem incluir ácidos nucleicos, antigénios ou preparações antigénicas derivados de agentes patogénicos, proteína ou péptidos produzidos recombinantemente e proteínas de fusão quiméricas. Em particular, o antigénio é OspA. A OspA pode ser uma proteína madura completa da célula hospedeira (E. coli), sob a forma lipidada, designada (Lipo-OspA) ou um derivado não-lipidado. 18
Esses derivados não-lipidados incluem a proteína de fusão NSl-OspA não-lipidada, a qual apresenta os 81 aminoácidos iniciais N-terminais da proteína não-estrutural (NS1) do vírus influenza, e a proteína OspA completa, e uma outra, MDP-OspA, é uma forma não-lipidada da OspA contendo 3 aminoácidos N-terminais adicionais.
As vacinas da presente invenção podem ser utilizadas para a profilaxia ou terapia da alergia. Essas vacinas poderão compreender antigénios específicos de um alergénio (por exemplo Der pl e antigénios relacionados com o pólen) e antigénios não específicos de alergénios (por exemplo, decapéptido de Stanworth) . A quantidade de antigénio em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora, sem efeitos secundários adversos significativos, em vacinados típicos. Essa quantidade irá variar, de acordo com o imunogénio específico que for utilizado e de como é apresentado. De um modo geral, é esperado que cada dose irá compreender 1-1000 pg de antigénio, de um modo preferido, 1-500 pg, de um modo preferido, 1-100 pg, de um modo muito preferido, 1 a 50 pg. Uma quantidade óptima de uma vacina particular pode ser determinada por estudos padrão, envolvendo a observação de respostas imunitárias adequadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de reforço, adequadamente intervaladas. Tipicamente, para administração humana, o imunoestimulante irá estar presente na gama de 1 pg-1000 pg, de um modo preferido, 10pg-500 pg, de um modo mais preferido, 20-200 pg por dose, de um modo mais preferido, 20-100 pg por dose e, de um modo muito preferido, 10-SO pg por dose. 19 A presente invenção proporciona, adicionalmente, as vacinas da presente invenção para utilização em medicina. É, também, proporcionada a utilização das vacinas da presente invenção na produção de um tratamento imunoprofiláctico e imunoterapêutico de infecções virais, bacterianas, parasiticas, alergias ou cancro. As formulações da presente invenção podem ser utilizadas, tanto para objectivos profilácticos como terapêuticos. A preparação de vacina é descrita, de um modo geral, em "Vaccíne Design - the subunit and adjuvant approach” Editado por Powell, M. F. e Newman, M. J.; 1995, Pharmaceutical
Biotechnology (Plenum Press, Nova Iorque e Londres, ISBN 0-30644867-X). A presente invenção é ilustrada, mas não restringida, pelos exemplos seguintes.
Exemplo 1, Materiais e Métodos
Serologia A quantificação do anticorpo anti-HBs foi realizada por ELISA utilizando HBs (Hep 286) como antigénio de revestimento. As soluções de antigénio e de anticorpo foram utilizados em 50 pL por poço. O antigénio foi diluído numa concentração final de lpg/mL em PBS e foi adsorvido, durante a noite, a 4 °C, aos poços de placas de microtitulação de 96 poços (Maxisorb Immuno-plate, Nunc. Dinamarca). As placas foram, então, incubadas durante 1 h a 37 °C com PBS contendo albumina de soro bovino a 20 1% e TWEEN 20 a 0,1% (tampão de saturação; 100 pL/poço). Foi adicionado soro diluído duas vezes em tampão de saturação (iniciando na diluição 1/100), às placas revestidas com HBs, que foram incubadas durante 1 h 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS TWEEN 20 a 0,1% e foram adicionadas IgGl, IgG2a, IgG2b ou Ig anti-murganho conjugadas com biotina (Amersham, UK) , diluídas 1/1000 em tampão de saturação, a cada poço e foram incubadas durante 1 h 30 min a 37 °C. Após um passo de lavagem, o complexo estreptavidina-peroxidase biotinilada (Amersham, UK) , diluído 1/5000 em tampão de saturação, foi adicionado durante mais 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e incubadas durante 20 min com uma solução de o-fenilenodiamina (Sigma) a 0,04, H202 a 0,03% em TWEEN 20 a 0,1%, tampão citrato 0,05 M, pH 4,5. A reacção foi parada com H2S04 2 N e foi lida a 490/630 nm. Os títulos de ELISA foram calculados a partir de uma referência por SoftmaxPro (utilizando uma equação de quatro parâmetros) e foram expressos em UE/mL.
Proliferação de células T 2 semanas após a segunda imunização, os murganhos foram mortos e os baços foram removidos assepticamente em grupos. As suspensões celulares foram preparadas em meio RPMI 1640 (GIBCO) contendo L-glutamina 2 mM, antibióticos, 2-mercaptoetanol 5xlO“sM e soro de murganho normal singenésico a 1%. As células do baço foram cultivadas numa concentração final de 2 X 106 células/mL em 200 pL, em placas de 96 poços de fundo redondo, com diferentes concentrações (10-0,03 pg/mL) de antigénio HBs. Cada teste foi realizado em quadruplicado. Após 96 h de cultura a 37 °C. sob C02 a 5%, as células foram pulsadas durante 18 h com 3H-Timidina (Amersham, UK, 5 Ci/mmol) a 0,5 pCi/poço e, seguidamente, foram 21 recolhidas em placas Unifilter (Packard) com um colector de células. A radioactividade incorporada foi medida num contador de cintilação (Topcount, Packard). Os resultados são expressos em cpm (cpm média em poços quadruplicados) ou como indices de estimulo (cpm média em culturas de células com antigénio/cpm média em culturas de células sem antigénio) .
Produção de citocina 2 semanas após a segunda imunização, os murganhos foram mortos, os baços foram removidos assepticamente em conjuntos (3 conjuntos por grupo). As suspensões celulares foram preparadas em meio RPMI 1640 (GIBCO) contendo L-glutamina 2 mM, antibióticos, 2-mercaptoetanol 5 x 10~5 M e soro fetal de vitelo a 5%. As células foram cultivadas numa concentração final de 5 X 106 células/mL em 1 mL, em placas de 24 poços de fundo plano com concentrações diferentes (10-0,1 pg/mL) do antigénio HBs. Os sobrenadantes foram recolhidos ao fim de 96 horas e foram congelados até serem testados para a presença de IFNy e IL-5, por ELISA.
Produção de IFNy A quantificação de IFNy foi realizada por ELISA, utilizando reagentes de Genzyme. As amostras e as soluções de anticorpo foram utilizadas a 50 pL por poço. As placas de microtitulação de 96 poços (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) foram revestidas, durante a noite, a 4 °C, com 50 pL de IFNy de hamster, anti-murganho, diluído a 1,5 pg/mL em tampão carbonato,
a pH 9,5. As placas foram, então, incubadas durante 1 h a 37 °C 22 com 100 μΐ de PBS contendo albumina de soro bovino a 1% e TWEEN 20 a 0,1% (tampão de saturação). Foi adicionado sobrenadante, proveniente da estimulação ín vitro, diluido duas vezes em tampão de saturação (iniciando em 1/2), às placas revestidas com anti-IFNY, e incubadas durante 1 h 30, a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS TWEEN 0,1% (tampão de lavagem) e foi adicionado IFNy de cabra anti-murganho, conjugado com biotina, diluido em tampão de saturação, numa concentração final de 0,5 pg/mL, a cada poço e foram incubadas durante 1 hora a 37°C. Após um passo de lavagem, foi adicionado conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 em tampão de saturação, durante 30 min, a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e foram incubadas com 50 pL de TMB (Biorad) durante 10 min. A reacção foi parada com H2SO4 0,4 N e lida a 450/630 nm. As concentrações foram calculadas utilizando uma curva padrão (padrão de IFNy de murganho) por SoftmaxPro (equação de quatro parâmetros) e foram expressas em pg/mL.
Produção de IL-5 A quantificação da IL-5 foi realizada por ELISA, utilizando reagentes de Pharmingen. As soluções das amostras e de anticorpo foram utilizadas a 50 pL por poço. Foram revestidas placas de microtitulação de 96 poços (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) , durante a noite, a 4 °C com 50 pL de IL-5 de rato anti-murganho diluída a 1 pg/mL em tampão carbonato a pH9,5. As placas foram, então, incubadas durante 1 h a 37 °C, com 100 pL de PBS contendo albumina de soro bovino a 1% e TWEEN 20 a 0,1% (tampão de saturação) . Foi adicionado sobrenadante, proveniente da estimulação in vitro, diluido duas vezes em tampão de saturação (iniciando em 1/2), às placas revestidas com anti- 23 IFNy, e incubadas durante 1 h 30, a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS TWEEN 0,1% (tampão de lavagem) e foi adicionada IL-5 de rato anti-murganho, conjugada com biotina, diluido em tampão de saturação, numa concentração final de 1 pg/mL, a cada poço e incubadas durante 1 hora a 37°C. Após um passo de lavagem, foi adicionado conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 em tampão de saturação, durante 30 min, a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e foram incubadas com 50 pL de TMB (Biorad) durante 15 min. A reacção foi parada com H2S04 0,4 N e lida a 450/630 nm. As concentrações foram calculadas utilizando uma curva padrão (IL-5 recombinante de murganho) por SoftmaxPro (equação de quatro parâmetros) e foram expressas em pg/mL.
Exemplo 2, Estudos de Imunogenicidade em murganhos
Para testar o conceito do MPL num veiculo particulado sólido isento de antigénio, foi realizado um estudo de imunogenicidade em murganhos Balb/C, utilizando várias sequências de formulações de vacinas HABMPL:
Tabela 1, Formulações de vacina
Grupo Formulação 1 (HB-AIPCM + 3D-MPL + (HA-A1(0H)3) 2 (3D-MPL-A1 (OH) 3) + (HA-AL(OH)3) + (HB-AlP04) 3 (3D-MPL-A1P04) + (HA-AL(OH)3) + (HB-A1P04) 24
Descrição do processo de formulação:
Grupo 1, 0 processo de formulação da técnica anterior. 0 antigénio é inicialmente adsorvido no sal metálico, seguido pela adição de 3D-MPL livre, resultando na adsorção do 3D-MPL na mesma partícula de sal metálico que o antigénio.
Grupo 2 e 3, 0 processo de formulação da presente invenção. 0 3D-MPL é adsorvido numa partícula de sal metálico, os antigénios são adsorvidos em partículas separadas de sal metálico, seguido pela mistura dos complexos pré-adsorvidos.
Esquema de imunização
Foram imunizados grupos de 10 murganhos, subcutaneamente, duas vezes, com um intervalo de 4 semanas, com formulações baseadas em HAB (1/10 da Dose Humana, i. e. HAV 72 ELU, 2 pg de HBs, 5 pg de MPL). A resposta linfoproliferativa e a produção de citocina (IL5/IFNy) foram analisadas no dia 14 após II, após re-estímulo in vitro das células do baço com HBs e HAV. No dia 35, foi recolhido sangue do seio retro-orbital e foram monitorizados, por ELISA, a resposta a HBs e HAV, em termos de anticorpos, assim como o perfil isotípico induzido (HBs apenas).
Resultados
As respostas humorais (Ig e isotipos) foram medidas por ELISA, utilizando HBs como antigénio de revestimento para o HBV e utilizando o kit Behring para o HAV. Foi apenas analisada a recolha de sangue 14 dias após II. 25 A Figura 1 mostra as respostas de anticorpo Ig anti-HBs, medidas em soros individuais e representadas como GMT. A Figura 2 mostra a repartição isotipica (IgGl, IgG2a e IgG2b) calculada a partir da análise em soros em conjunto. Não é observada qualquer diferença nos títulos de anticorpo entre o grupo 1 e as novas formulações (grupos 2 e 3) . Além disso, as novas formulações (grupos 2 e 3) estimulam proporções semelhantes dos isotipos IgGl e IgG2a/b, como os estimulados pelas formulações da técnica anterior (grupo 1).
Respostas imunitárias mediadas por células
As respostas imunitárias mediadas por células (linfoproliferação e produção de IFNy/il-5) foram medidas aos 14 dias após II, após re-estímulo in vitro de células do baço com antigénios HBs ou HA. Para cada grupo de murganhos, foram sacrificados 5 animais e os baços foram reunidos para teste in vitro. A Figura 3 mostra a linfoproliferação, monitorizada em células do baço re-estimuladas com HBs. A Figura 4 mostra a produção de citocina, monitorizada em células do baço re-estimuladas com HBs. Não é possível observar qualquer diferença nas respostas linfoproliferativas entre as formulações. 26
Foram observadas respostas IFN-γ fortes (+/- 1000 pg/mL) para todos os grupos, para além disso, não é observada gualguer diferença na produção de IL-5 (abaixo de 60 pg/mL) entre os grupos.
Conclusões Não foram observadas quaisquer diferenças significativas nas respostas humorais e imunitárias a HBsAg mediadas por células, entre as sequências da formulação HABMPL.
Exemplo 3, Vacinação de Cobaias contra HSV.
0 exemplo anterior demonstrou a eficácia das novas formulações e processos, no que respeita a antigénios da Hepatite. Este exemplo investigou a imunogenicidade e a eficácia protectora de vacinas gD contra o Virus Herpes Simplex, formuladas com alúmen e 3D-MPL no processo clássico, em comparação com o processo da presente invenção. As duas vacinas foram comparadas no modelo de protecção intravaginal de Cobaias contra o HSV
Grupo Formulações 4 gD2t (20 pg) + 3D-MPL (50 pg) + AlOH (500 pg) 5 gD2t (20 pg) + AlOH (400 3D-MPL (50 pg) + AlOH ug) (100 pg) 6 Não tratado 27
Protocolo experimental
Foram imunizados grupos de 12 cobaias Hartley fêmeas, duas vezes, nos dias 0 e 28. No dia 57, os animais foram desafiados intra-vaginalmente com 105 pfu da estirpe MS do HSV2 (100 pL) . Após o desafio, os animais foram monitorizados diariamente para sintomas clínicos da doença primária, do dia 4 ao 12. Foi recolhido sangue do seio retro-orbital nos dias 14 e 28 após a segunda imunização e foi monitorizada a resposta de anticorpo anti-gD (IgG) por ELISA.
Processo de formulação A gD2t do HSV2 foi produzida de acordo com técnicas descritas no documento WO 92/16231. O 3D-MPL foi adquirido de Ribi ImmunoChem Inc., Montana, EUA. Ο AIOH3 foi adquirido de Superfos. As formulações foram preparadas 15 dias antes da primeira injecção. Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente, com agitação.
Grupo 4 Formulações baseadas em AI (OH) 3 (250 mL/dose) : a via clássica A gD2t (5g) foi adsorvida em 125 pg de Al(OH)3, durante 15 min, antes da adição de MPL (12,5 pg). Após trinta minutos, a formulação foi tamponada com uma solução de PBS 10 vezes concentrado a pH 7,4. Após 15 min, foram adicionados 500pg/mL de fenoxietanol como conservante. H20 + AI(OH)3 + Ag-15m-MPL-30m-10 x PBS pH 7,4-15m-2 fenoxi 28
Grupo 5 Formulações baseadas em AI (OH)3 (250 mL/dose): nova via A gD2t (5 pg) foi adsorvida em 100 pg de A1(0H)3 durante 15 min e foi armazenada como um monovolume concentrado. Por outro lado, o MPL (12,5 pg) foi adsorvido em 25 pg de AI (OH) 3 durante 30 min e armazenado como um outro monovolume concentrado. Para a formulação final, a gD2t adsorvida foi diluida em H20 e PBS a pH 7,4 10 vezes concentrado. Após quinze minutos, foi adicionado MPL adsorvido, antes da adição de fenoxietanol como conservante. AI(OH)3 + Ag
AI (OH)3 + MPL H20 + 10 x PBS a pH 7,4 + Ads gD2t-15m-Ads MPL-15m-2 fenoxi
Quantificação da Amostra A quantificação do anticorpo anti-gD foi realizada por Elisa, utilizando gD 43B318 como antigénio de revestimento. O antigénio e as soluções de anticorpo foram utilizados a 50 pL por poço. O antigénio foi diluído numa concentração final de lpg/mL em PBS e foi adsorvido, durante a noite, a 4 °C, aos poços das placas de microtitulação de 96 poços (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). As placas foram, então, incubadas durante 1 h a 37 °C com PBS contendo albumina de soro bovino a 1% e Tween 20 a 0,1% (tampão de saturação). Foram adicionados soros diluídos duas vezes em tampão de saturação, às placas 29 revestidas com gD que foram incubadas durante 1 h 30 min a 37°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS Tween 20 a 0,1%, foi adicionada IgG anti-cobaio conjugada com biotina (Amersham, UK), diluída 1/10000 em tampão de saturação, a cada poço e foram incubadas durante 1 h 30 min a 37 °C. Após um passo de lavagem, foi adicionado complexo estreptavidina-peroxidase biotinilada (Amersham, UK), diluido 1/1000 em tampão de saturação, durante mais 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e incubadas durante 20 min com uma solução de o-fenilenodiamina (Sigma) a 0,04%, H202 a 0,03% em tween 20 a 0,1%, tampão citrato 0,05 M pH 4,5. A reacção foi parada com H2S04 2 N e foi lida a 490/630 nm. Os títulos de ELISA foram calculados a partir de uma referência por SoftmaxPro (utilizando uma equação de quatro de parâmetros) e foram expressas em UE/mL.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com dados de serologia utilizando UNISTAT: O protocolo aplicado na análise de variância de uma entrada pode ser descrito, resumidamente, como se segue: 1) Transformação logarítmica dos dados. 2) Teste de Kolmogorov Smimov de cada população (grupo) para verificar a normalidade. 3) Testes de Hartley e Cochran para verificar a homogeneidade da variância entre as diferentes populações (grupos). 30 4) Análise de variância em dados seleccionados: dados de 14 dias após II ou 28 dias após II.
Resultados
Serologia A figura 5, mostra as respostas do anticorpo IgG anti-gD, medidas após II, em soros individuais. Não é observada qualquer diferença significativa nos títulos de anticorpo entre qualquer das formulações no dia 14 após II (17090-18508 UE/mL para GMT) ou 28 dias após II (10227-11965 UE/mL para GMT) . A análise da variância de uma entrada foi realizada, separadamente, para títulos de IgG anti-gD originados por qualquer formulação de vacina, a partir de ambos os pontos temporais, após a transformação logarítmica dos dados. Não foram detectadas quaisquer diferenças estatisticamente significativas entre qualquer das formulações (valores de p = 0,7397 e 0,5078 para, respectivamente, dados de 14 dias após II e 28 dias após II) .
Protecção contra Doença A protecção contra a doença primária foi avaliada entre 4 a 12 dias após desafio, por comparação de vários parâmetros em animais vacinados e não tratados: 31 • A percentagem de animais com e sem lesões (vaginais ou externas) . • 0 índice de infecção primária (PI) calculado para cada grupo como se segue: £ (pontuação máxima x incidência expressa em %). • A soma das pontuações das lesões (dia 4 a 12), expressa como a mediana e o número de animais apresentando lesões (N). • As pontuações cumulativas médias calculadas para cada grupo entre o dia 4 e 12.
Tabela 2 resume os parâmetros de lesão
Grupo Animais sem lesões(%) Lesões Vaginais(%) Lesões Externas (%) índice de infecção primária* Severidade da lesão (n) ** 4 66,7 25 8,3 29,2-97% 1(4) 5 83,3 16,7 0 8,3-99% 0,5 (2) 6 11,1 0 88, 9 844,4 28,3 (8) * 0 somatório das pontuações de lesão c pós-infecção (os animais sem lesões nãc Pontuações das lesões: sem lesões (0), 1 1), vesículas cutâneas externas (2, 4, 8 ** índice de infecção primária = (pontua incidência); com 1=0, 0,5, 1, 2, 4, 8 urante os dias 4 a 12 d foram considerados). esões vaginais (0,5 ou ou 16). ção máxima I) x (% de ou 16. 32 A Figura 6 mostra as curvas de pontuação cumulativa das lesões após desafio com HSV.
Uma elevada percentagem dos animais vacinados não desenvolveu qualquer lesão (66% a 83%) ou desenvolveu lesões vaginais. Em comparação, 89% dos animais do grupo de controlo apresentavam lesões externas.
Foi observada uma forte redução do indice de infecção primária em animais vacinados (97% a 99%) . Isto foi acompanhado por uma gravidade de lesão muito baixa registada para os grupos vacinados (número médio = 0,5 ou 1), em comparação com o grupo não tratado (número médio = 28).
Como mostrado pelas curvas de pontuações cumulativas, ambos os grupos (4 e 5) originaram um nível de protecção muito bom e comparável contra a doença primária.
Conclusão
Foram comparados os processos antigos e novos para formulação de vacina da vacina contra HSV. Não foi observada qualquer diferença estatisticamente significativa entre os dois processos, quer nos títulos de IgG, quer na protecção contra a doença primária. 33
Exemplo 4, Vacinação de murganhos contra HPV
Foram comparadas várias sequências de formulações (baseadas em A10H ou AIP04) do antigénio E7 do Virus do papiloma Humano e de 3D-MPL, em termos da sua capacidade para induzir respostas humorais especificas para um antigénio. São obtidos títulos de Ig comparáveis, com formulações com adsorção mista de 3D-MPL e proteína D1/3-E7 no mesmo veículo (via 1) e formulações em que o 3D-MPL é adsorvido, separadamente, num veículo isento de antigénio (via 2) . A Proteína D 1/3 E7 foi preparada de acordo com o processo do documento WO 99/10375. O antigénio e as formulações de MPL foram, quer baseadas em A10H, quer baseadas em AIPO4. O antigénio e o 3D-MPL foram adsorvidos sequencialmente nas mesmas partículas de sal de Alumínio (via 1) ou foram realizadas adsorções separadas antes da mistura (via 2).
Foram imunizados grupos de 10 murganhos, utilizando as seguintes formulações (descrição em Material e Métodos):
Grupo Descrição Formulação 7 ProtDl/3 E7-A10H 5 pg de ProtD 1/3 E7 adsorvida em A10H 8 ProtDl/3 E7-A10H/MPL 5 pg de ProtD 1/3 E7 adsorvida em A10H com MPL (via 1) 9 ProtDl/3 E7-A10H/ (AIPO4/MPL) 5 pg de ProtD 1/3 E7 adsorvida em A10H combinada com MPL adsorvido em A1P04 (via 2) 34 10 ProtDl/3 E7-A1P04 5 pg de ProtD 1/3 E7 adsorvida em A1P04 11 ProtDI/3 E7-AIPO4/MPL 5 pg de ProtD 1/3 E7 adsorvida em AIPO4 com MPL (via 1) 12 ProtDl/3 E7-AIPO4/AIOH/MPL) 5 pg de ProtD 1/3 E7 adsorvida em A1P04 combinada com MPL adsorvido em A10H (via 2) 13 ProtDl/3 E7 o/w 5 pg de ProtD 1/3E7 formulada numa emulsão de óleo em água/3D-MPL/QS21
Os murganhos foram imunizados duas vezes por via intramuscular, com um intervalo de 21 dias. Os soros foram recolhidos no Dia 35 (14 dias após II) e foram analisados para a presença de anticorpos específicos para E7 (ver Material e Métodos). As formulações foram preparadas 5 dias antes da primeira injecção. Todas as incubações foram realizadas à temperatura ambiente com agitação. I. Formulações baseadas em AI (50 pL/dose): via clássica (via 1) A PD1/3E7 (5 g) foi adsorvida em 50 pg de AI (OH) 3 ou de A1P04, durante 30 min, antes da adição de MPL (5 pg). Após trinta minutos, a formulação foi tamponada com uma solução de PO4, NaCl pH 6,8, 10 vezes concentrada. Após 15 min, foram adicionadas 50pg/mL de tiomersal como conservante. H20 + AI + Ag-30m-MPL-30m-10x PN pH 6,8-15m-Tio 35 II. Formulações baseadas em AI (50 pL/dose): nova via (via2) A PD1/3E7 (5 pg) foi adsorvida em 10 pg de A1(0H)3 ou de AIPO4, durante 30 min e foi armazenada sob a forma de monovolumes concentrados. Por outro lado, o MPL (5 pg) foi adsorvido em 20pg de AI (OH) 3 ou de A1P04, durante 30 min e foi armazenado como os outros monovolumes concentrados. Para as formulações finais, o antigénio adsorvido foi diluído em H20 e solução de P04, NaCl pH 6,8, 10 vezes concentrada, antes da adição do MPL adsorvido e do restante Al (20 pg) . Após treze minutos, foram adicionados 50pg/mL de tiomersal como conservante.
Al + Ag
Al + MPL H20 + ΙΟχ PN pH 6,8 + Ads PD1/3E7+Ads MPL + Al-30m-Tio
SEROLOGIA A quantificação do anticorpo anti-E7 foi realizada por Elisa, utilizando E7 (Bollen) como antigénio de revestimento. As soluções de antigénio e de anticorpo foram utilizadas a 50 pL por poço. O antigénio foi diluído numa concentração final de 3pg/mL em tampão carbonato a pH 9,5 e foi adsorvido, durante a noite, a 4 °C, aos poços das placas de microtitulação de 96 poços (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) . As placas foram, então, incubadas durante 1 h a 37 °C, com PBS contendo albumina de soro bovino a 1% e Tween 20 a 0,1% (tampão de saturação). Foram adicionados soros diluídos duas vezes em tampão de saturação (iniciando na diluição 1/100), às placas revestidas 36 com E7 e foram incubadas durante 1 h 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween 20 a 0,1% e e foi adicionada (IgGl, IgG2a ou IgG2b ou) IgGtot anti-murganho conjugada com biotina (Amersham, UK), diluida 1/5000 em tampão de saturação, a cada poço e foram incubadas durante 1 h 30 min a 37 °C. Após um passo de lavagem foi adicionado complexo estreptavidina-peroxidase biotinilada (Amersham, UK), diluído 1/5000 em tampão de saturação, durante mais 30 min a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e incubadas durante 10 min com TMB (tetrametilbenzidina) . A reacção foi parada com H2S04 4 N e foi lida a 450 nm. As diluições do ponto médio foram calculadas por SoftmaxPro (utilizando una equação de quatro parâmetros).
Resultados
Os títulos da Ig anti-E7 medidos em soros em conjunto, por ELISA, expressos em UE/mL são como se segue
Formulações baseadas Formulações baseadas em E7-A10H em E7-A1P04 Alúmen 4434 1651 Alúmen/MPL 10780 12666 Alúmen/(Alúmen/MPL) 13390 15495 São obtidos títulos comparáveis, quando são comparadas formulações baseadas em A10H ou formulações baseadas em A1P04. Quando é adicionado MPL às formulações de A10H ou de A1P04, os títulos atingidos situam-se acima de 10000 UE/mL, em comparação 37 com menos de 5000 UE/mL para as formulações de AI. São obtidos títulos comparáveis com ambas as sequências de formulação.
Foram comparadas várias sequências de formulações de antigénio e MPL (baseadas em A10H ou em A1P04) , em termos da sua capacidade para induzir a produção de anticorpos específicos para um antigénio:
Todas as formulações contendo MPL induzem níveis mais elevados de Ig específica para E7 do que formulações de Alúmen. São obtidos títulos de Ig comparáveis, com formulações com adsorção mista de MPL e de pDl/3-E7 no mesmo veículo (via 1) e formulações em que o MPL é adsorvido, separadamente, num veículo isento de antigénio (via 2) .
Lisboa, 13 de Abril de 2007 38

Claims (32)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de uma composição de vacina compreendendo a mistura de a) uma composição adjuvante compreendendo um imunoestimulante, o qual é monofosforil lipido A 3-des-0-acilado, adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorção à partícula de sal de alumínio ser um antigénio, e b) um antigénio.
  2. 2. Processo como reivindicado na reivindicação 1, em que não mais de 5% em massa do material total com capacidade de adsorção à partícula de sal de alumínio é ser um antigénio.
  3. 3. Processo como reivindicado na reivindicação 2, em que a partícula de sal de alumínio está isenta de antigénio adsorvido.
  4. 4. Processo para a produção de uma composição de vacina como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o antigénio do passo (b) ser adsorvido numa partícula de sal de alumínio.
  5. 5. Processo para a preparação de uma composição de vacina compreendendo um imunoestimulante, o qual é monofosforil lipido A 3-des-0-acilado, um antigénio e uma partícula de sal de alumínio, o qual compreende: (a) a adsorção do antigénio numa primeira partícula de um sal de alumínio; (b) a adsorção do imunoestimulante numa segunda partícula de um sal de alumínio; e (c) mistura dos produtos dos passos (a) e (b). 1
  6. 6. Processo como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o antigénio é seleccionado do grupo consistindo em: antigénios derivados de Virus da Imunodeficiência Humana, virus Varicella Zoster, Virus Herpes Simplex de tipo 1 virus Herpes Simplex de tipo 2, citomegalovirus Humano, virus do Dengue, Hepatite A, B, C ou E, virus Sincicial Respiratório, virus do papiloma humano, virus Influenza, Hib, virus da Meningite, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium ou Toxoplasma, péptidos IgE, Der pl, antigénios relacionados com pólen; ou antigénios relacionados com Tumores (TAA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, LnRH(GnRH), CEA, PSA, KSA ou PRAME.
  7. 7. Processo como reivindicado na reivindicação 6, em que o antigénio é uma combinação de antigénio da Hepatite A e antigénio da Hepatite B.
  8. 8. Processo como reivindicado na reivindicação 6, em que o antigénio é o antigénio de superfície da Hepatite B.
  9. 9. Processo como reivindicado na reivindicação 6, em que o antigénio é derivado do vírus do papiloma humano.
  10. 10. Processo como reivindicado na reivindicação 9, em que o antigénio de vírus do papiloma humano é derivado do HPV6, 11, 16 ou 18.
  11. 11. Processo como reivindicado na reivindicação 9 ou 10, em que o antigénio de vírus do papiloma humano é uma partícula LI ou capsómero. 2
  12. 12. Vacina produzível de acordo com o processo reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
  13. 13. Composição de vacina compreendendo duas populações principais de complexos, um primeiro complexo compreendendo (a) um imunoestimulante, o qual é monofosforil lipido A 3-des-0-acilado, adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorção à partícula de sal de alumínio ser um antigénio; e um segundo complexo compreendendo (b) antigénio adsorvido numa partícula de sal de alumínio.
  14. 14. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 13, compreendendo duas populações principais de complexos, um primeiro complexo compreendendo (a) um imunoestimulante, o qual é monofosforil lipido A 3-des-O-acilado, adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorção à referida partícula de sal de alumínio ser um antigénio; e um segundo complexo compreendendo (b) antigénio adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 20% em massa do material total com capacidade de adsorção à referida partícula de sal de alumínio consistir em monofosforil lipido A 3-des-O-acilado.
  15. 15. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 13, ou 14, em que o segundo complexo compreende (b) antigénio adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizada por não mais de 5% em massa do material total com capacidade de adsorção à referida partícula de sal de alumínio ser em monofosforil lipido A 3-des-O-acilado. 3
  16. 16. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 15, em que o segundo complexo compreende (b) antigénio adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizada por a referida partícula de sal de alumínio ser isenta de monofosforil lípido A 3-des-0-acilado adsorvido.
  17. 17. Composição de vacina como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 13 a 16, em que o primeiro complexo compreende (a) um imunoestimulante adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por não mais de 5% em massa do material total com capacidade de adsorção à referida partícula de sal de alumínio ser um antigénio.
  18. 18. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 17, em que o primeiro complexo compreende (a) um imunoestimulante adsorvido numa partícula de sal de alumínio, caracterizado por a referida partícula de sal de alumínio ser isenta de antigénio adsorvido.
  19. 19. Composição de vacina como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 13 a 18, em que o sal de alumínio presente nos primeiros e segundos complexos é idêntico.
  20. 20. Composição de vacina como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 13 a 19, em que o segundo complexo compreende vários sub-complexos, compreendendo cada sub-complexo um antigénio diferente adsorvido numa partícula de sal de alumínio.
  21. 21. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 20, em que o sal de alumínio é hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio. 4
  22. 22. Composição de vacina como reivindicado na reivindicação 21, em que o sal de alumínio é hidróxido de alumínio.
  23. 23. Composição de vacina como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 13 a 22, em que o antigénio é seleccionado do grupo consistindo em: Vírus da Imunodeficiência Humana, vírus Varicella Zoster, Vírus Herpes Simplex de tipo 1 vírus Herpes Simplex de tipo 2, citomegalovírus Humano, vírus do Dengue, Hepatite A, B, C ou E, vírus Sincicial Respiratório, vírus do papiloma humano, vírus Influenza, Hib, vírus da Meningite, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Plasmodium ou Toxoplasma, decapéptido de Stanworth, Der pl, antigénios relacionados com pólen; ou antigénios relacionados com cancro, MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, LnRH (GnRH), CEA, PSA, tirosinase, Survivina, KSA ou PRAME.
  24. 24. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 23, em que o antigénio é uma combinação de antigénio da Hepatite A e antigénio da Hepatite B.
  25. 25. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 23, em que o antigénio é o antigénio da superfície da Hepatite B.
  26. 26. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 23, em que o antigénio é derivado do vírus do papiloma humano.
  27. 27. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 26, em que o antigénio do vírus do papiloma humano é derivado do HPV6, 11, 16 ou 18. 5
  28. 28. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 26 ou 27, em que o antigénio do virus do papiloma humano é uma partícula Ll ou capsómero.
  29. 29. Composição de vacina como reivindicada na reivindicação 23, em que o antigénio é um antigénio de plasmódio, o qual é um ou mais dos antigénios seleccionados do grupo seguinte: RTS,S e TRAP.
  30. 30. Composição de vacina como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 13 a 29, para utilização em medicina.
  31. 31. Utilização de composição de vacina como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 13 a 29, para a produção de um medicamento adequado para a profilaxia ou tratamento de infecções virais, bacterianas, parasíticas, alergias ou cancro.
  32. 32. Kit compreendendo dois recipientes, um recipiente contendo o que é monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, adsorvido num sal de alumínio; e o segundo recipiente contendo antigénio adsorvido num sal de alumínio. Lisboa, 13 de Abril de 2007 6
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