PT1505964E - Compostos de pirrole anelados como inibidores da bomba de protão para o tratamento da úlcera - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSTOS DE PIKROLE ANELADOS COMO INIBIDORES DA ΒΟΜΒΑ DE PROTÃO PARA 0 TRATAMENTO DA ÚLCERA" A presente invenção refere-se à utilização de compostos de pirrole anelados e em particular a ML3000, um seu sal ou éster, como inibidor da bomba de protão.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As úlceras pépticas são uma das doenças mais prevalecentes em nações industrializadas. .

Os inibidores do ácido secretório estão entre as medicações mais altamente prescritas, reflectindo o adágio fisiológico "Nenhum ácido, nenhuma úlcera". A ruptura farmacológica ou patofisiológica das barreiras mucosais gástricas à difusão posterior de HCI leva à erosão rápida da mono-camada epitelial gástrica e a ulceração consequente da mucosa. A inibição da secreção ácida por antagonismo no receptor de H2 da histamina da célula parietal (cimetidina), ou por derivação e inactivação covalente directa da bomba de protão gástrica (omeprazole, lansoprazole, rabeprazole) é a rotina para melhorar e promover a cura de úlceras gástricas. A bomba de protão gástrica é uma enzima que também é conhecida como H+/K+-ATPase. Está localizada na membrana de células parietais gástricas e é responsável pelo transporte de protões do sangue ao lúmen, que por sua vez resulta na redução do pH dos conteúdos do estômago. 0 próprio omeprazole é de facto um pró-fármaco o qual em condições acidicas se converte no fármaco activo, nomeadamente na sua correspondente sulfenamida. 0 mecanismo da acção do omeprazole é 2 bem estudado e conhecido que implica um ataque nucleofilico de um (ou dois) grupo (s) de tiol da H+/K+-ATPase no átomo de enxofre da sulfenamida quimicamente activa. A modificação química resultante do (s) grupo (s) de tiol da enzima (a formação de uma ligação de dissulfito entre o enxofre de H+/K+-ATPase e o enxofre do sal de piridínio do benzimidazole) causa a inibição observada da bomba de protão. Deve ser acentuado no entanto, que a conversão do pró-fármaco ao inibidor de enzima activo só pode ser realizada em meios acídicos o que também resulta na degradação substancial da sulfenamida activa. Em resumo, a instabilidade do omeprazole em ambientes acidicos, que é um pré-requisito para a sua activação em um inibidor de bomba de protão, é a principal falta deste fármaco.

Em adição à secreção ácida a secreção da interleucina-8 representa uma função mucosal gástrica adicional a qual desempenha um papel importante na ulceração gástrica. A bactéria ulcerogénica Helicobacter pylorí foi mostrada como aumentando a taxa e a amplitude da secreção de IL-8 tanto in vitro como in vivo, e até como regulando a expressão do gene de IL-8. Os efeitos semelhantes de pró-secreção do IL-8 são vistos como um resultado da estimulação de IL-lb de células epiteliais gástricas.

Os anti-flogísticos não esteroidais (NSAIDs), tais como o ácido acetilsalicílico (ASA) , o diclofenac, a indometacina, o ibuprofeno e o naproxeno, são largamente usados na medicina. De um ponto de vista farmacológico eles actuam como os inibidores da ciclo-oxigenase (COX).

As propriedades anti-inflamatórias de NSAIDs estão relacionadas à sua supressão da síntese de prostaglandina. No entanto, a supressão da prostaglandina gástrica reduz o fluxo de sangue mucosal gástrico, com sensibilidade mucosal acompanhada ao dano tópico por 3 uma variedade de irritantes. A ulceração gástrica induzida por NSAIDs limita significativamente a utilidade destes fármacos.

As pirrolizinas que actuam farmacologicamente semelhantemente, são conhecidas a partir de numerosas publicações. Por exemplo, as pirrolizinas anti-flogisticamente activas são descritas em Arch. Pharm. 319, 65-69 (1986); 319, 231-234 (1986); 318, 661-663 (1985); 318, 663-664 (1985); 319, 500-505 (1986); 319, 749-755 (1986); .327, 509-514(1994); 330, 307-312 (1997) assim como em J. Med. Chem. 1987, 30, 820-823 e 1994, 37, 1894-1897.

Além disso as pirrolizinas podem ser tomadas a partir dos documentos US 5,260,451 (correspondente ao EP 0397175) bem como dos documentos WO 95/32970; WO 95/32971; e WO 95/32972. Estes compostos são representados pela fórmula estrutural

e partilham uma fracção de diarilpirrolo anelado assim como um terceiro resíduo acídico R3. Os compostos são caracterizados por uma elevada lipofilicidade, boa biodisponibilidade e meias-vidas na variedade média, ver Drugs of the Future, 1995, 20 (10): 1007-1009.

As pirrolizinas adicionais de constituição semelhante são descritas nos documentos DE 198 45 446.6 e WO 01/05792. Além disso, as pirrolizinas substituídas por alquilsulfinilbenzoílo e alquilsulfonilbenzoílo, de acordo com o documento US 4,232,038, são tidas como tendo propriedades anti-inflamatórias, analgésicas e 4 antipiréticas. De acordo com os documentos DE 196 24 290.8 e DE 196 24 289.4 certos compostos deste tipo têm uma acção de redução de lipidos. O ML-3000 (ácido [2,2-dimetil-6- (4-clorofen.il) -7-fenil-2,3-di- hidro-1 H-pirrolizina-5-il]-acético) da Fórmula (Ia)

é um inibidor duplo equilibrado não antioxidante de COX e 5-Lipoxigenases (5-L0) (1) . 0 fármaco é um inibidor não selectivo de COX, que inibe tanto o C0X-1 como o C0X-2. Este fármaco tem actividade analgésica, antipirética e anti-inflamatória, e foi demonstrado como tendo uma acção anti-inflamatória potente em um número de modelos de animais incluindo o edema da pata induzida por carraginano no rato, e a artrite adjuvante (2) no rato. 0 documento WO .96/41626 descreve combinações de inibidores de COX-1 com inibidores de 5-LO (tais como o ML3000) para o tratamento de inflamações e de doenças relacionadas com a inflamação. Além disso, foi relatado que o ML3000 mostra excelente tolerância gastrintestinal (12,13). As propriedades gastroprotectoras, no entanto, não foram observadas (11).

Surpreendentemente, foi verificado que certos compostos de pirrole anelados, tais como o ML-3000, têm um efeito gastroprotector significativo. Este fenómeno está associado não só com uma inibição significativa da bomba de protão gástrica, mas também com a 5

inibição da secreção de IL-8 em células epiteliais gástricas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim, a presente invenção refere-se à utilização de ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-di-hidro-lH-pirrolizina-5-il]-acético (ML3000) representado pela fórmula (Ia):

um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolisável para preparar uma composição farmacêutica para tratar uma lesão mucosal gástrica; tratar ou prevenir a gastrite erosiva; tratar ou prevenir a gastrite não'erosiva; tratar ou prevenir a ulceração gástrica; ou tratar ou prevenir a úlcera duodenal ou a úlcera ventricular. A presente invenção também se refere a uma combinação de (i) ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-di-hidro-lH-pirrolizina-5-il]-acético da fórmula (Ia)

6 um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolisável com (±i) um ou mais do que um agente anti-inflamatório ulcerogénico para a utilização em terapia, em que o agente anti-inflamatório ulcerogénico é seleccionado a partir do grupo que consiste de ácido acetilsalicilico (ASA), salicilato de sódio, acetaminofeno, fenacetina, ibuprofeno, cetoprofeno, indometacina, flurbiprofeno, diclofenac, naproxeno, piroxicam, tebufelona, nabumetona, tenidap, alcofenac, antipirina, amimopirina, dipirona, animopirona, feniylbutazona, clofezona, oxifenbutazona, prexazona, apazona, benzidamina, bucoloma, cincopeno, clonixina, ditrazol, epirizole, fenoprofeno, floctafenina, ácido flufenâmico, glafenina, indoprofeno, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico, salidifamidas, sulindac, suprofeno, tolmetina, nabumetona, tiaramida, proquazona, bufexamac, flumizole, tinoridina, timegadina, dapsona, diflunisal, benorilado, fosfosal, fenclofenac, fentiazac, tilomisole, carprofeno, fenbufeno, oxaprozina, ácido tiaprofénico, pirprofeno, feprazona, piroxicam, sudoxicam, isoxicam, tenoxicam, ou uma composição farmacêutica que compreende (i), (ii), e (iii) um portador farmaceuticamente aceitável.

Os sais fisiologicamente aceitáveis incluem os sais de adição ácidos ou de base.

Os sais de adição ácidos são sais de compostos da Fórmula (Ia) com ácidos inorgânicos, tais como o ácido clorídrico, o ácido sulfúrico, o ácido nítrico ou o ácido fosfórico, ou com ácidos orgânicos, em particular ácidos carboxílicos, por exemplo o ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido málico, ácido amigdálico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico ou ácido sulfónico, por exemplo o ácido metanossulfónico, o ácido fenilsulfónico e o ácido toluenossulfónico. 7

Os sais de adição de base são sais de compostos da Fórmula (Ia) com bases inorgânicas, tais como o hidróxido de potássio ou de sódio ou com bases orgânicas, tais como mono-, di- ou trietanolamina.

Os ésteres fisiologicamente hidrolizáveis dos compostos da fórmula (Ia) incluem em particular pró-fármacos dos compostos da fórmula (Ia) os quais são reconvertidos in vivo aos compostos da fórmula (Ia) ou a uma sua forma activa (metabolito) . Os exemplos são os ésteres de alquilo (compreendendo a funcionalidade de COOAlquilo), aralquilo (compreendendo a funcionalidade de COOAlcarilo, por exemplo, COOAlcFenil), pivaloiloximetilo, acetoximetilo, ftalidilo, indanilo e metoximetilo dos compostos da fórmula (Ia). 0 termo "alquilo" inclui grupos de alquilo lineares ou ramificados, tais como CH3, C2H5, n-propilo, CH(CH3)2, n-butilo, CH (CH3) -C2H5, isobutilo, C(CH3) 3, n-pentilo ou n-hexilo, em particular CH3, C2H5 ou CH(CH3}2f preferivelmente tendo - a menos que declarado de outra maneira - de 1 a 8, em particular de 1 a 6 e mais preferivelmente de 1 a 4 átomos de carbono. -COOAlquilo significa alcoxicarbonilo, tal como CO-OCH3, CO-OC2H5, CO-OCH2-C2H5, CO-OCH (CH3) 2, n-butoxicarbonilo, CO-OCH (CH3)-C2H5, C0- 0CH2—CH (CH3) 2, CO-OC (CH3)3, em particular CO-OCH3, CO-OC2H5, CO-OCH (CH3) 2 ou CO-OCH2-CH (CH 3)2- O-COOAlcFenilo significa um grupo de alkoxicarbonilo o qual é substituído na fracçâo de alquilo com fenilo, tal como o benziloxicarbonilo. "Arilo" preferivelmente significa naftilo e em particular fenilo. 8 0 termo "iníbidor da bomba de protão" como aqui usado será

entendido como referindo-se àqueles compostos os quais inibem a actividade de H+,K+-ATPase gástrico. Esta actividade pode ser determinada em ensaios bem conhecidos, por exemplo em termos da libertação de fosfato inorgânico a partir do substrato de ATP (Hongo Γ. et al., J.J. Pharmacol. 52: 295 (1990)). Preferidos são aqueles compostos da Fórmula (Ia) que têm uma concentração inibitiva meio-máxima (IC50) de 50 μΜ ou menos. Utilizando os compostos de Fórmula (Ia) que têm um IC50 de 5 μΜ ou menos pode ser vantajoso de acordo com a invenção. Os inibidores da bomba de protão muito eficazes da Fórmula (Ia) têm um IC50 de 5 μΜ ou menos. De acordo com um aspecto adicional, aqueles compostos da Fórmula (Ia) são preferidos os quais reversivelmente inibem a bomba de protão. Ainda de acordo com um aspecto adicional, aqueles compostos da Fórmula (Ia) são preferidos cuja actividade de inibição da bomba de protão é essencialmente independente do pH sobre uma variação de pH de aproximadamente 3 a 8.

Tais compostos podem ser identificados entre os compostos da Fórmula (Ia) utilizando os procedimentos de rastreio bem conhecidos tais como os procedimentos de rastreio de elevada quantidade tratada (HTS). Um procedimento típico compreende testar a inibição do H+, K+-ATPase gástrico por cada um de um número de compostos candidatos de Fórmula (la) e a identificação daqueles que têm a actividade desejada. Também será apreciado que tal bomba de protão que inibe os compostos também possa possuir a acção anti-inflamatória.

Assim, de acordo com um aspecto particular, a presente invenção refere-se à utilização de inibidores da bomba de protão os quais são seleccionados entre os compostos da Fórmula (Ia). Estes 9 compostos da Fórmula (Ia) são eficazes como inibidores da secreção de ácidos gástricos.

Os compostos podem ser usados para a prevenção e o tratamento de condições relacionadas com o ácido gástrico em mamíferos e especialmente no homem, seleccionado da gastrite, duodenite, ulceração gástrica, úlcera especialmente gástrica e úlcera duodenal. A gastrite pode ser erosiva ou não erosiva, aguda ou crónica. Em particular, os compostos são úteis como agente de anti-úlcera.

De acordo com um aspecto particular, a invenção refere-se à utilização de compostos gastroprotectores da Fórmula (Ia). 0 termo "gastroprotector" como aqui usado será entendido para se referir àqueles compostos os quais são em particular capazes de reduzir a sensibilidade da mucosa gastrintestinal e em particular a mucosa gástrica ao dano tópico. Tal dano tópico pode ser causado por irritantes. De acordo com um aspecto particular da invenção os referidos irritantes são seleccionados a partir do grupo que consiste essencialmente de NSAIDs e inibidores de COX. A primeira descoberta patológica bruta em ulcerogénese é a corrosão da mono-camada epitelial gástrica. Com a progressão da referida corrosão a integridade da mucosa gástrica diminui, e os segmentos da mucosa gastrintestinal penetram através da mucosa muscular.

As modificações na defesa normal da mucosa e a reparação por certos factores tais como os NSAIDs e H. pylori, também desempenham um papel na patologia da doença da úlcera péptica.

De acordo com um aspecto da presente invenção, a utilização de compostos da Fórmula (Ia) é dirigida ao tratamento ou à prevenção 10 do dano mucosal mediado por ácido e a ulceração subsequente. Em particular, a referida utilização é dirigida ao tratamento ou à prevenção das modificações patológicas implicadas com isso. A presente invenção fornece utilizações e composições farmacêuticas úteis aqui bem como por conseguinte uma embalagem conveniente, que são aplicáveis a mamíferos que sofrem de uma condição como definido em cima ou no futuro podem sofrer de gastrite erosiva, gastrite não erosiva, ulceração gástrica, úlcera duodenal ou úlcera ventricular. A utilização dos compostos da Fórmula (la) tem vantagens particulares sobre outros NSAIDs, especialmente os mais estabelecidos na utilização, os quais podem exacerbar de facto o progresso de lesões mucosais e em particular a ulceração gástrica, especialmente quando a aplicação de longo prazo é indicada. Os compostos da Fórmula (la) são úteis no tratamento de tais lesões mucosais e em particular na ulceração gástrica. A capacidade dos compostos da fórmula (Ia) para prevenir e inverter o processo de doença que por fim leva à destruição mucosal tem implicações de longo alcance para o tratamento seguro e eficaz de mamíferos, especialmente aqueles que precisam de terapia anti-inflamatória de longo prazo.

Como aqui usado, o temo "mamífero (s) " denota qualquer mamífero, preferivelmente seres humanos, gato, cão ou cavalo, dos quais existe um grande número de raças diferentes.

De acordo com a presente invenção, um tratamento ou prevenção compreende especialmente o melhoramento, a diminuição, tratar activamente, reverter ou prevenir uma condição como definida em cima. A expressão "tratamento ou prevenção" como aqui usado com referência à administração dos compostos gastroprotectores da 11 presente invenção, é entendido como referindo-se tanto ao objectivo terapêutico da referida administração como aos resultados terapêuticos actualmente conseguidos pela referida administração. Como discutido em cima, a extensão da terapia realizada pela administração dos referidos compostos pode variar de uma melhoria a uma diminuição significativa do curso da doença, e além do tratamento activo da doença, incluindo uma reversão do processo de doença. 0 tratamento ou a prevenção das referidas condições também pode compreender a administração em adição de um ou mais do que um composto da Fórmula (Ia), um ou vários membros seleccionados a partir do grupo que consiste essencialmente de agentes anti-bacterianamente activos, além disso agentes gastroprotectores como inibidores de protão adicionais e antagonistas do receptor H2, agentes de anti-ácido, alginatos e agentes procinéticos.

As combinações com agentes anti-bacterianamente activos são especialmente úteis no tratamento de indivíduos positivos ao H. Pylori (terapia anti-H. pylori). Os agentes anti-bactêrianamente activos tais como a claritromicina mais a metronidazole ou a amoxicilina em combinação com os inibidores de bomba de protão produzem elevadas taxas de erradicação a respeito de infecções por H. pylori. Os agentes convenientes anti-bacterianamente activos adicionais que podem ser mencionados são os antibióticos de β-lactama, por exemplo penicilinas (tais como a benzilpenicilina, fenoximetilpenicilina, propicilina, azidicilina, dicloxacilina, flucloxacilina, oxacilina, amoxicilina, bacampicilina, ampicilina, meziocilina, piperacilina ou aziocilina), cefalosporinas (tais como cefadroxilo, cefaclo, cefalexina, cefalexima, cefuroxima, cefetamete, cefadroxila, ceftibuteno, cefpodoxima, cefotetano, cefazolina, cefoperazona, ceftizoxima, ceftaxima, ceftazidima, cefamandole, cefepima, cefoxitina, cefodizima, cefsulodina, 12 ceftriaxona, cefotiama ou cefmenoxima) ou outros antibióticos de β-lactama (por exemplo aztreoname, loracarbefo ou meropenemo); inibidores de enzima por exemplo sulbactame, tetraciclinas, por exemplo a tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina'ou doxiciclina aminoglicósídos, por exemplo a tobramicin, gentamicina, neomicina, estreptomicina, amicacina, netilmicina, paromomicina ou espectinomicina; anfericóis, por exemplo cloramfenicol ou tiamfenicol; antibióticos de lincomicinas e macrolidos, por exemplo a clindamicina, lincomicina, eritromicina, claritromicina, espiramicina, roxitromicina ou azitromicina; antibióticos de polipéptidos, por exemplo colistina, polimixina B, teloplanina ou vancomicina, inibidores da girase, por exemplo norfloxacina, cinoxacina, ciprofloxacina, ácido pipemídico, enoxacina, ácido nalidíxico, pefloxacina, fleroxacina ou ofloxacina; nitroimidazoles, por exemplo metronidazole; ou outros antibióticos, por exemplo a fosfomicina ou o ácido fucidico, em que estas substâncias anti-bacterianamente activas são administradas por si próprias ou alternativamente podem ser combinadas uma com a outra.

Os compostos seguintes podem ser principalmente mencionados como inibidores de bomba de protão adicionais: omeprazole, lansoprazole, rabeprazole, leminoprazole, nepaprazole e pantoprazole..

Para utilização na presente invenção os compostos da Fórmula (Ia) também podem ser combinados com outros ingredientes terapeuticamente activos os quais seriam prontamente evidentes para o especialista neste campo, e que serão normalmente determinados pelas circunstâncias nas quais o agente terapêutico da presente invenção deve ser administrado. Os exemplos de tais outros ingredientes terapeuticamente activos incluem os agentes acima mencionados. 13

Os exemplos adicionais de tais outros ingredientes terapeuticamente activos incluem agentes anti-inflamatórios, em particular os NSAIDs e as classes adicionais dos agentes anti-inflamatórios e os seus exemplos incluem, por exemplo, os antagonistas do receptor de Hj.; antagonistas do receptor de quinino-Bi e B2; inibidores da prostaglandina tais como os antagonistas do receptor de PGD, PGF, PGI2, e PGE; inibidores de tromboxano A2 (TXA2-); antagonistas do receptor de PAF; ouro na forma de um grupo aurotio em conjunto com vários grupos hidrofílicos; agentes imunorepressivos, por exemplo, a ciclosporina, azatioprina, e metotrexato; glucocorticóides anti-inflamatórios, por exemplo, a dexametasona; antibióticos antiparasíticos de largo espectro, por exemplo, as avermectinas e as milbemicinas; penicilamina; hidroxicloroquina; agentes de anti-gota, por exemplo, a colchicina, os inibidores da oxidase de xantina, por exemplo, alopurinol, e agentes uricosúricos, por exemplo, probenecide, sulfinpirazona, e benzbromarona.

De acordo com um aspecto particular da presente invenção, um ou mais do que um composto da Fórmula (la) é combinado com um agente anti-inflamatório ulcerogénico. Os agentes anti-inflamatórios são ulcerogénicos se eles inibirem a ciclo-oxigenase, em particular a ciclo-oxigenase 1, e como uma consequência, a produção de certas prostaglandinas, em particular a prostaglandina E2. Os agentes anti-inflamatórios ulcerogénicos são o ácido acetilsalicilico (ASA), salicilato de sódio, acetaminofeno, fenacetina, ibuprofeno, cetoprofeno, indometacina, flurbiprofeno, diclofenac, naproxeno, piroxicame, tebufelona, etodolac, nabumetona, tenidap, alcofenac, antipirina, amimopirina, dipirona, animopirona, fenilbutazona, clofezona, oxifenbutazona, prexazona, apazona, benzidamina, bucoloma, cincopeno, clonixina, ditrazol, epirizole, fenoprofeno, floctafenina, ácido flufenâmico, glafenina, indoprofeno, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico, salidifamidas, 14 sulindac, suprofeno, tolmetina, nabumetona, tiaramida, proquazona, bufexamac, flumizole, tinoridina, timegadina, dapsona, diflunisal, benorilato, fosfosal, fenclofenac, etodolac, fentiazac, tilomisole, carprofeno, fenbufeno, oxaprozina, ácido tiaprofénico, pirprofeno, feprazona, piroxicam, sudoxicam, isoxicam, tenoxicam. De acordo com uma forma de realização particular, o ácido acetilsalicilico é combinado com um ou mais do que um composto da Fórmula (Ia).

Consequentemente, este tipo da medicação fornece um meio para tratar efectivamente condições inflamatórias enquanto tem escassas propriedades gástricas. Isto é particularmente vantajoso em situações em que a administração do agente anti-inflamatório ulcerogénico envolve o tracto gastrintestinal, por exemplo em caso de administração oral ou em condições inflamatórias gastrintestinais.

De acordo com um regime o qual seria usado de acordo com a invenção, é contemplado que os compostos da Fórmula (Ia) seriam administrados em combinação com outras medicações usadas em uma base regularmente marcada. Também é previsto que a administração em combinações poderia assumir um número de formas diferentes e ainda estar dentro do âmbito da presente invenção. Por exemplo, os compostos da Fórmula (Ia) poderiam ser simplesmente formulados com um ou vários de outros agentes terapêuticos os quais devem formar a combinação desejada, em uma forma de dosagem conveniente, como um comprimido oral, contendo todos dos fármacos que formam a combinação. A variação de meias-vidas para os diferentes fármacos pode ser acomodada pelo especialista na preparação de formulações por criar as formas de libertação controladas dos referidos fármacos com tempos de libertação diferentes para que a dosagem relativamente uniforme seja conseguida. Um suprimento medicamentoso usado como a forma de dosagem também pode ser preparado de acordo 15 com princípios bem conhecidos na técnica da formulação, na qual os fármacos usados na combinação estiveram simplesmente presentes em conjunto em mistura na composição de suprimento. A presente invenção também contempla a co-administração na qual a combinação de fármacos é conseguida pela administração simultânea dos fármacos a ser dadas em combinação. Tal co-administração pode mesmo ser por meio de formas de dosagem e vias de administração diferentes. A presente invenção além disso contempla a utilização de tais combinações de acordo com horários de dosagem diferentes mas regulares e contínuos pelo qual os níveis de plasma desejados dos fármacos envolvidos foram mantidos no mamífero a ser tratado, mesmo embora os fármacos individuais que compõem a combinação não tenham sido administrados aos referidos mamíferos simultaneamente. Todas tais combinações estariam bem dentro da especialidade da técnica a planear e a administrar.

Quando os compostos da fórmula (la) são para serem usados como ingredientes activos de acordo com a presente invenção, eles podem ser incorporados em formas de dosagem farmacêuticas padrão. As composições farmacêuticas úteis compreendem um portador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz para inibir a bomba de protão, de um composto da Fórmula (Ia) como definido em cima. Por exemplo, eles são úteis quando administrados em aplicações sistémicas ou locais, orais ou parentéricas e para esta finalidade são combinados com os excipientes, diluentes e adjuvantes farmacêuticos habituais, por exemplo os materiais portadores inertes orgânicos e inorgânicos tais como a água, a gelatina, a lactose, o amido, o estearato de magnésio, o talco, os óleos vegetais, as gomas, os polialquilonaglicóis, etc. Estas preparações farmacêuticas podem ser empregues em uma forma sólida, por exemplo, como comprimidos, cápsulas, e especialmente em combinação com ou para a mistura com 16 um item alimentar agradável conveniente para os mamíferos; ou elas podem ser administradas na forma líquida, por exemplo, como soluções e elixires. Os excipientes e adjuvantes farmacêuticos os quais podem ser adicionados incluem conservantes, anti-oxidantes, agentes anti-microbianos e outros estabilizadores; agentes de humidificação, de emulsificação, e de suspensão, e compostos de anti-depósito; aditivos de fragrância e de coloração; composições para melhorar a compressibilidade, ou para criar uma libertação atrasada, sustentada, ou controlada do ingrediente activo; e vários sais para modificar a pressão osmótica da preparação farmacêutica ou para actuarem como tampões. As formas de dosagem particulares que foram usadas com êxito incluem 5 % de uma solução de micela misturada de ML300 0 para injecção intravenosa, 3 % de uma pasta agradável, e comprimidos orais. A quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula (la) como definido pode ser administrada sistemicamente ao referido mamífero, em que a referida administração sistémica compreende: (1) a injecção ou a infusão em tecidos ou cavidades do corpo convenientes de uma composição farmacêutica quer contém o referido composto em forma líquida conveniente tais como soluções aquosas, emulsões ou suspensões para a sua libertação intra-arterial, intra-ou transdérmica (incluindo subcutânea), ou intra-espinal especialmente intra-tecal e o mais usualmente intramuscular ou intravenosa; ou para servir como um depósito para a sua libertação; (2) a instilação em tecidos ou cavidades do corpo convenientes de uma composição farmacêutica que contém o referido composto em forma sólida conveniente, por exemplo, compreendendo uma matriz de materiais bio-compatíveis e bio-erodíveis nos quais as partículas de um composto gastroprotector sólido da Fórmula (Ia) são dispersas, ou no qual, possivelmente, os glóbulos ou as células isoladas de um composto gastroprotector líquido da Fórmula (Ia) são 17 capturados, para servirem como uma composição de implante sólida para a sua libertação atrasada, sustentada, e/ou controlada; ou (3) a ingestão ou a administração de uma composição farmacêutica que contém o referido composto na forma sólida ou liquida conveniente para a sua libertação transdérmica, por exemplo um emplastro transdérmico ou um implante sub-epidérmico (subcuticular), para a sua libertação perorai.

Um número substancial das formas de dosagem descritas aqui pode ser formulado para fornecer uma libertação controlada, sustentada, e/ou atrasada do ingrediente activo da referida forma de dosagem.

Uma forma de dosagem de libertação controlada útil de ML3000 é aquela que mantém um nivel de plasma de ML3000 maior do que 100 ng/mL durante a maior parte do dia depois de uma dose oral única a 5 mg/kg. As formas de dosagem de libertação controlada orais preferidas de ML3000 são aquelas que mantêm uma concentração de ML3000 no plasma maior do que 100 ng/mL durante um período de tempo maior do que aquele para o qual uma forma de dosagem de libertação imediata de ML3Q00 mantém um nível de plasma comparável, quando a referida forma de dosagem de libertação imediata e a forma de dosagem de libertação controlada são administradas na mesma dose.

As formas de dosagem de libertação imediata de ML3000 que contêm doses de 2,5 e 5 mg/kg mantêm uma concentração de ML3000 no plasma acima de 100 e 200 ng/mL durante 8 horas, respectivamente.

As formas de dosagem perorai preferidas para a administração sistémica são sólidas, por exemplo, composições orais agradáveis tais como biscoitos agradáveis de dissolução rápida, pastilhas, cápsulas, drageias, etc., e líquidas, por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, etc. As composições farmacêuticas de tipos 18 especiais convenientes para a administração oral a mamíferos podem ser usadas, e incluem tais items como uma pasta oral a ser libertada por baixo da língua do mamífero a ser tratado, uma forma granular a ser libertada através da incorporação na comida do mamífero, e uma forma mastigável em que o ingrediente activo é consumido juntamente com uma forma mastigável, ou que se mastiga agradável que pode libertar o ingrediente activo por lixiviamento do corpo de mastigar que não é consumido, durante a mastigação pelo mamífero a ser tratado. A referida quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula (Ia) como definida também pode ser administrada localmente ao referido mamífero, em que a referida administração local compreende: (1) a injecção ou a infusão em um sítio local da condição relacionada com o ácido gástrico de uma composição farmacêutica que contém o referido composto da fórmula (la) na forma líquida conveniente para a sua libertação, incluindo componentes que fornecem a libertação retardada, a libertação controlada, e/ou a libertação sustentada do referido composto no referido sítio local; ou para servir como um depósito para a sua libertação em que a referida composição fornece o armazenamento do referido composto e depois disso a sua libertação atrasada, sustentada, e/ou controlada; ou (2) a instilação de uma composição farmacêutica que contém o referido composto na forma sólida conveniente para servir como um implante sólido para a sua libertação, fornecendo opcionalmente a referida composição uma libertação atrasada, sustentada, e/ou controlada do referido composto ao referido sitio local.

As injecções também podem ser feitas de composições farmacêuticas que contêm o composto gastroprotector da Fórmula (Ia), em que a composição farmacêutica está na forma de libertação retardada. 19 libertação controlada, ou de libertação sustentada. Estas formulações de composição reconhecida podem ser umas combinações sólidas, semi-sólidas, géis ou outras líquidas/sólidas nas quais uma matriz erodível ou uma série de revestimentos são usadas para fornecer uma libertação continua do composto da Fórmula (Ia) em uma taxa predeterminada ou em taxas variáveis se desejado. Os termos "libertação estendida" e "de longa duração" bem como outros são usados para descrever estas formulações. Todas destas empregam várias combinações dos polímeros bio-erodiveis, por exemplo, vários polímeros celulósicos, e materiais naturais, por exemplo, amido de milho e estearato de magnésio, para se obter uma distribuição lenta e/ou uniforme do composto da Fórmula (Ia) contido dentro da matriz. A quantidade terapeuticamente eficaz para tratar ou prevenir doenças relacionadas com o ácido gástrico, do composto da Fórmula (Ia), é administrada a um mamífero a ser tratado em uma quantidade expressa como miligramas por quilograma de peso do corpo do referido mamífero, por dia: "mg/kg/dia". A expressão "por dia" como aqui usada não deve ser interpretada como necessariamente necessitando que qualquer forma de dosagem particular seja administrada em uma base diária ao mamífero a ser tratado. A expressão "por dia" é simplesmente uma indicação do segmento conveniente maís pequeno mas arbitrai do tempo que está a ser usado como a parte da unidade total para medir a dose do composto gastroprotector a ser administrado. A dose, isto é, a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da Fórmula (Ia) para tratar ou prevenir doenças relacionadas com o ácido gástrico vai usualmente variar de 0,1 mg/kg/dia a 20,0 mg/kg/dia, preferivelmente de 0,1 mg/kg/dia a 12,0 mg/kg/dia, mais preferivelmente de 0,5 mg/kg/dia a 10,0 mg/kg/dia, e o mais preferivelmente de 0,5 mg/kg/dia a 8,0 mg/kg/dia. As formas de dosagem e as quantidades típicas de ML3000 incluiriam a 20 administração oral de ML3000 em uma taxa de dose de 2,5-5,0 mg/kg/dia de peso do corpo. As exigências especiais podem ser necessárias para pacientes que têm a síndroma de Zollinger-Ellison, tal como uma necessidade de doses mais elevadas do que a média por paciente. É necessário que o especialista, não só determine a via preferida de administração e a forma de dosagem e a quantidade correspondentes, mas que o referido especialista também deve determinar o regime de dosagem, isto é, a frequência de dosagem. Em termos' gerais é mais provável que a escolha estará entre uma dosagem de uma vez por dia (s.i.d), e de uma dosagem de duas vezes por dia (b.i.d), e que o primeiro fornecerá a terapia mais rápida e profunda, enquanto o último fornecerá a terapia menos profunda mas mais sustentada. No entanto, esta generalização não considera tais variáveis importantes como o tipo especifico da doença relacionada com o ácido gástrico implicado, o agente terapêutico específico implicado e os seus farmacocinéticos, e o paciente específico (mamífero) implicado. Para um produto aprovado no mercado, a maior parte desta informação já é fornecida pelos resultados de estudos clínicos executados para se obter tal aprovação. Em outros casos, tal informação pode ser obtida de uma maneira directa de acordo com os ensinamentos e as linhas guias contidas na presente especificação tomada à luz do conhecimento e da habilidade do artesão. Os resultados que são obtidos também podem ser correlacionados com os dados de avaliações correspondentes de um produto aprovado nos mesmos ensaios. 0 método da presente invenção pode ser além disso definido compreendendo dois passos básicos: (I) o estabelecimento da posição de um mamífero candidato como estando presentemente ou prospectivamente em uma condição de doença relacionada com o ácido gástrico, confirmando por esse meio que o referido mamífero precisa 21 de tal tratamento; e logo após (II) o tratamento ou a prevenção da referida condição por se administrar ao referido mamifero uma quantidade terapeuticamente eficaz para tratar ou impedir a referida doença relacionada com o ácido gástrico,· de um composto gastroprotector da Fórmula (Ia). Os vários aspectos do Passo (II) já foram discutidos em cima detalhadamente. Consequentemente, os aspectos do Passo (I) serão discutidos agora detalhadamente.

No que se refere ao diagnóstico, é expediente estabelecer a posição de um mamifero que é candidato para o tratamento de acordo com a presente invenção quanto a se o mamífero é ou não presentemente ou prospectivamente em uma condição de doença relacionada com o ácido gástrico. A expressão "presentemente ou prospectivamente" como aqui usada é destinada a significar que de acordo com os métodos discutidos em baixo de fazer aquela determinação, é possível identificar um mamífero candidato quer como estando presentemente em necessidade de tal tratamento, ou com muita probabilidade ou expectativa precisar de tal tratamento no futuro a curto prazo. A necessidade em perspectiva do tratamento pode ser estabelecida por aquelas determinações de factores positivos os quais da experiência do especialista conduzem directamente à condição da doença relacionada com o ácido gástrico. Por exemplo, o especialista pode estabelecer a partir do exame clínico de um mamífero que ele tem uma doença relacionada com o ácido gástrico, e pode confirmar esta conclusão com evidência adicional da qual pode ser determinada de acordo com os métodos estabelecidos de medição que o mamífero desenvolverá uma doença relacionada com o ácido gástrico dentro de um futuro a curto prazo. 0 estatuto do referido mamifero como estando presentemente ou perspectivamente na referida condição da doença relacionada com o ácido gástrico, e assim em necessidade de tal tratamento, é em 22 particular determinada por resultados positivos do exame clinico e a avaliação do tracto gastrintestinal do mamífero candidato, por exemplo por procedimentos não invasivos incluindo a endoscopia de fibra óptica, visualização por ressonância magnética (MRI) e métodos radiográf icos tais como o raio x de bário de duplo contraste. Outra sintomatologia e sinais clínicos incluiriam aqueles adquiridos por exame directo da mucosa gástrica do mamífero candidato, por exemplo por meio de biópsia.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Efeito de ML 3000 na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco;

Figura 2: Efeito do omeprazole na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco;

Figura 3: Efeito do pH na inibição do ML 3000 da Η,Κ-ATPase gástrica;

Figura 4: Efeito da diluição de ML 3000 na inibição de H,K-ATPasé gástrica;

Figura 5: Efeito do ácido araquidónico na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco;

Figura 6: Efeito de PGE2 na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco;

Figura 7: Efeito do TEDBC na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco;

Figura 8: Efeito do ZD-2138 na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco;

Figura 9: Efeito do ácido acetilsalicílico na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco;

Figura 10: Efeito do NS 398 na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal do porco; 23

Figura 11: Efeito do naproxeno na actividade de H,K-ATPase microssomal do porco;

Figura 12: Efeito da indometacina na actividade de H,K-ATPase microssomal do porco;

Figura 13: Efeito do leucotrieno B4 na actividade de H,K-ATPase microssomal do porco;

Figura 14: Efeito do leucotrieno D4 na Η,Κ-ATPase gástrica;

Figura 15: Efeito de ML 3000 na acidificação estimulada por histamina nas glândulas gástricas do coelho;

Figura 16: Efeito de ML 3000 na acidificação estimulada por forscolina nas glândulas gástricas do coelho;

Figura 17: Efeito de ML 3000 na secreção de IL-8 da linha de base por células epiteliais gástricas humanas;

Figura 18: Efeito de ML 3000 na secreção de IL-8 por células epiteliais gástricas humanas estimuladas por IL-Ιβ;

Figura 19.: Efeito de ZD 2138 na secreção IL-8 de linha de base por células epiteliais gástricas humanas;

Figura 20: Efeito de ZD 2138 na secreção IL-8 porcélulas epiteliais gástricas humanas estimuladas por IL-Ιβ.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Com a finalidade de demonstrar adicionalmente os métodos e as composições da presente invenção, é apresentado nos parágrafos que se seguem exemplos descritivos específicos de procedimentos típicos os quais podem ser empregues na realização dos referidos métodos. Os referidos exemplos são destinados como sendo ilustrativos. EXEMPLO 1 sensível a

Efeitos do ML 3000 na actividade de Η,Κ-ATPase, SCH28080, estimulada por K+ microssomal gástrica. 24

Estratégia. A Η,Κ-ATPase microssomai gástrica, foi preparada a partir de homogenados mucosais gástricos do porco por centrifugação diferencial. Resumidamente, os estômagos de porco obtidos em um matadouro 1 hora depois da morte foram lavados com 0,25 M de sacarose arrefecida em gelo e a base foi dissecada das regiões cardíacas e antral. Todos os procedimentos subsequentes foram a 4 °C. A mucosa foi inundada com NaCl saturado, e o muco superficial e as células superficiais removidas esfregando com toalhas de papel. A mucosa foi raspada do tecido conectivo subjacente, suspensa (10 % p/v) em tampão de isolamento {0,25 M de sacarose, 20 mM de HEPES, pH 7,4, 1 mM de EDTA, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo) , e interrompida por dois períodos de 10 segundos a um poder máximo em um Tissumizer (Tekmar, Cincinnati, OH) . O homogenado foi centrifugado a 20,000 g durante 30 minutos, e o sobrenadante foi centrifugado a 105 g durante 1 hora. O grânulo microssomal resultante foi re-suspenso. no tampão de isolamento, e aplicado a um declive descontinuo de 7 % p/v de Ficoll e 34 % de sacarose (ambos no tampão de isolamento). Depois de 3 horas a 32,500 rpm (rotor Sorvall AI 629 ), a banda microssomal (Gl) recuperada de 7 % de interface de Ficoll foi re-suspensa a 10 mg/mL em 15 mM de PIPES-TRIS, pH 6,8, diluída 1:1 com 60 % de sacarose fria, liofilizada em 0,5 mL de alíquotas, e armazenada a -70 °C. Os microssomas Gl foram aproximadamente de 0,1 mícrones em diâmetro, foram enriquecidos em actividade de H.K.-ATPase, e mais de 80 % do seu conteúdo de proteína junto em 94 kDa por SDS-PAGE. A actividade hidrolítica de ATP de microssomas foi quantificada em termos de libertação de fosfato inorgânico do substrato de ATP e medida em concentrações classificadas (variando de 10_9M a 10_4M) de ML 3000, e uma grande variedade de outros compostos. As misturas de reacção para o ensaio da actividade de ATPase estimulada por K+ nas membranas microssomais gástricas do porco contiveram 5 pg de proteína de membrana, 100 mM de Tris-acetato, pH 7,0, ImM de MgCl2, lmM de 25

I

NaNa, 0,1 inM de EGTA, 5 μΜ de ΑΤΡ (γ“32Ρ-ΑΤΡ, 10 Ci/mmol, NEN, Boston, MA), 0-10 mM de KCI, e 0-100 μΜ de SCH 28080. Depois de 20 minutos de incubação a 37°C, as reacções foram paradas pela adição de 10 % p/v de carvão vegetal activado (Sigma), 5,5 % p/v de ácido tricloroacético, energicamente vortexado, e centrifugado al4,000 g durante 10 minutos a 4 °C. O conteúdo de fosfato inorgânico (γ"32Ρί) do sobrenadante foi medido por contagem de cintilação. A actividade de Η,Κ-ATPase especifica foi calculada como a diferença em actividades de ATPase microssomais na presença e na ausência do inibidor de SCH28080 de Η,Κ-ATPase gástrico especifico, e foi expressa como mmoles de Pi/mg de proteína/hora; o retracto gráfico dos dados mostra a percentagem de inibição da actividade de Η,Κ-ATPase como uma função das concentrações do composto. Os gráficos com barras de erro padrão apresentam uma variação de dados de inter-ensaio em três ensaios independentes em cada um dos quais as actividades de ATPase em três condições de reacção separadas mas idênticas foram medidas. Os gráficos sem barras de erro padrão representam as actividades de ATPase médias em três condições de reacção separadas mas idênticas em um de pelo menos três ensaios independentes; os dados típicos são mostrados nesses casos.

Resultados. A actividade de Η,Κ-ATPase gástrica, foi inibida dependentemente da dose por ML 3000, com uma concentração inibitiva meio-máxima (IC50) de 15 μΜ {Figura 1) . A actividade inibitiva de ML 3000 foi comparada com aquela de um inibidor de bomba de protão clássico (PPI), o omeprazole substituído por benzimidazole. A figura 2 mostra o efeito do omeprazole na actividade de Η,Κ-ATPase em condições de ensaio idênticas àquelas na Figura 1; o IC50 estimado para o omeprazole foi de 1 μΜ. Estes dados mostram que o ML 3000 e o omeprazole expõem IC50 comparáveis com respeito à atividade de Η,Κ-ATPase gástrica, pelo menos no desempenho deste ensaio in vitro particular sob as condições especificadas. Os IC50 26 publicados para o omeprazole com respeito à actividade da bomba de protão gástrica variam de 470 nM a 36 μΜ dependendo das condições do ensaio (3,4,5). Para outros PPls, o IC50 de picoprazole é de 2 μΜ (6), o IC50 de rabeprazole é de 72 nM (3), e o IC50 de lansoprazole é de 2,1 μΜ (7). A grande variedade dos valores de IC50 de PPI publicados para a H, K-ATPase microssomal reflectem a necessidade mecanicista para a acidificação do composto para permitir a formação de um intermediário de sulfóxido reactivo ao , tiol o qual depois derivatiza irreversivelmente a H,K-ATPase uma subunidade dos resíduos de cisteína levando à inibição da enzima. O omeprazole a pH neutro ou mais elevado não exerce nenhuns efeitos inibitivos na H,K-ATPase gástrica. As preparações de vesicula microssomais variam largamente na sua tensão de ião, o que afecta a extensão à qual o pH interno pode ser abaixado por modificação da H,K-ATPase, e por conseguinte a extensão à qual o omeprazole se difunde na vesicula pode ser acidificado e activado. Alternativamente, a anterior acidificação in vitro do omeprazole assegura a indução das suas propriedades inibitivas, e é essencial em ensaios executados usando preparações de H,K-ATPase microssomais permeáveis ao ião. Por esta razão, os dados inibitivos do omeprazole mostrados na Figura 2 foram conseguidos usando o omeprazole acidificado a um pH de 6,1 e incubado com a enzima durante 30 minuto no mesmo pH (8).

Para determinar se o ML 3000 revelou propriedades de activação ácida comparáveis, uma concentração inibitiva meio-máxima de ML 3000 foi titulada a pHs diferentes e os efeitos na actividade de H,K-ATPase foi medida. Como mostrado na Figura 3, a acidificação de ML 3000 não teve nenhum efeito significativo no seu perfil inibitivo de H,K-ATPase. Estes dados indicam que embora o ML 3000 e o omeprazole tenham IC50 comparáveis para a H,K-ATPase, o ML 3000 27 diferentemente do omeprazole nao necessita de acidificação para a indução da actividade inibitiva.

Considerando que os PPls são inibidores irrevogáveis da actividade de Η,Κ-ATPase, que se ligam covalentemente à ct-subunidade catalítica, foi determinado se a inibição de ML 3000 de Η,Κ-ATPase foi reversível ou irreversível. Os microssomas enriquecidos com Η,Κ-ATPase gástrica foram tratados com uma concentração maximamente inibitiva de ML 3000 e depois diluídos com um grande excesso do tampão para reduzir a concentração de ML 3000 de 100 μΜ para 3,3 μΜ. Os resultados, mostrados na Figura 4, indicaram que a diluição de ML 3000 restaurou a actividade de Η,Κ-ATPase, e é consistente com o ML 3 000 que inibe a actividade de Η,Κ-ATPase de uma maneira reversível, isto é, o ML 3000 não derivatiza covalentemente nenhuma sub-unidade da Η,Κ-ATPase gástrica em vitro. O ácido araquidónico e a prostaglandina E2 (PGE2) também inibiram dependentemente da dose a actividade de Η,Κ-ATPase, com um IC50 de 30 μΜ e 4 5 μΜ respectivamente (Figuras 5 e 6) . Os dados de PGE2 contradizem um estudo prévio no qual nenhum efeito inibitivo de PGE 2 na Η,Κ-ATPase (9) gástrico no porco foi encontrado. As diferenças nos ensaios de ATPase específicos usados naquele estudo podem contar com esta discrepância. Uma vez que o ML3000 e o ácido araquidónico são anfifilos aniónicos, os seus efeitos inibitivos podem resultar de interacções específicas com locais de ligação da sub-unidade de Η,Κ-ATPase, ou de interacções hidrofóbicas menos especificas com lípidos da membrana microssomal associados com a Η,Κ-ATPase, ou uma combinação de ambos os factores.

Uma vez que o ML 3000 também mostra inibição de 5-lipoxigenase, os efeitos de dois inibidores de lipoxigenase na actividade de Η,Κ-ATPase microssomal foram estudados. A figura 7 mostra que 3,4-di-hidroxibenzilidenocianoacetato de 2-(1-tienil)etilo (TEDBC), um 28 inibidor poderoso de 5-, 12-, e 15-lipoxigenses, inibiu a actividade de Η,Κ-ATPase microssomal com um IC50 de 3,3 μΜ. Ao contrário o inibidor especifico de 5-lipoxigenase 6-((3-fluor-5-(metoxi-3,4,5,6-tetra-hidro-2H-piran-4-il)fenoxi)metil)cinolina (ZD-2138) teve um efeito mínimo na actividade de Η,Κ-ATPase (~20 % de inibição a IO”6 M) (Figura 8). Estes dados são consistentes com 12- e 15-lipoxigenases microssomais gástricas que têm um papel na activação de Η,Κ-ATPase, ou com a interacção directa de TEDBC com a conformação da enzima que altera as subunidades de Η,Κ-ATPase e por conseguinte a actividade.

Com a finalidade de comparar o efeito inibitivo de Η,Κ-ATPase de ML 3000 com outros NSAIDs, os efeitos do ácido acetilsalicílico, do naproxeno, da indometacina e de um inibidor de CIX-2 selectivo, NS 398, na actividade da bomba de protão foram medidos. Os quatro NSAIDs não tiveram efeitos inibitivos na actividade de Η,Κ-ATPase microsomal em concentrações de até ΙΟ”4 Μ (IO-3 M em caso do ácido acetilsalicílico) (Figuras 9, 10, 11 e 12) . A indometacina foi anteriormente relatada como inibindo a Η,Κ-ATPase gástrica a uma concentração um tanto mais elevada (Ki = 0,67 x 10”3 M) (10). Estes dados diferenciam claramente o ML 3000 de outros NSAIDs em termos do efeito inibitivo na actividade de Η,Κ-ATPase gástrica.

Com a finalidade de estabelecer se a inibição de ML 3000 da Η,Κ-ATPase gástrica reflectiu os efeitos do composto em vias metabólicas de leucotrieno funcional putativo presente nos microssomas gástricos do porco, os efeitos do leucotrieno B4 e D4 na actividade de Η,Κ-ATPase foram estudados. As questões de solubilidade impediram estudar as concentrações de LTB4 ou LTD4 maiores do que 1 μΜ. Como mostrado nas Figuras 13 e 14, nenhum leucotrieno mostrou qualquer actividade inibitiva contra a Η,Κ-ATPase em concentrações fisiológicas (10”9-10“8 M) ; só em 29 concentrações não fisiológicas maiores do que IO-7 M houve alguma acentuação significativa da actividade de H,K-ATPase. EXEMPLO 2

Efeitos de ML 3000 e de outros compostos em acumulação com o ácido estimulado por histamina na célula parietal gástrica.

Estratégia. As células parietais gástricas foram isoladas a partir de Coelhos Brancos da Nova Zelândia por digestão da pronase/colagenase da mucosa fúndica seguida pelo enriquecimento de células em gradientes de Nycodenz descontínuos de uma maneira conhecida por si. A acumulação de aminopirina em células parietais foi avaliada em placas de filtro de 96 cavidades com membranas de Durapore. Resumidamente, as células foram pré-incubadas com [14C]-aminopirina e depois 100,000 células/200 pL por cavidade foram incubadas sem ou com os compostos de teste durante 15 minutos antes da incubação durante 30 minutos adicionais na ausência ou na presença de 100 μΜ de histamina. Todas as determinações foram executadas em quadruplicado. A acumulação de aminopirina de base foi determinada como a acumulação de aminopirina em células não tratadas subtraídas da acumulação na presença de KSCN {uma reflexão da captura do isótopo não específico). O retracto gráfico dos dados mostra a inibição percentual da acumulação do ácido estimulado por histamina pelas células como uma função de concentrações do composto.

Resultados. O ML 3000 dependentemente da dose inibiu a acumulação do ácido estimulado histamina por células parietais gástricas do coelho, com uma concentração inibitiva meio-máxima (IC50) de 40 μΜ (Figura 15) . O ML 3000 também inibiu dependentemente da dose a acumulação do ácido estimulado por forscolina por células parietais gástricas do coelho, com uma concentração inibitiva meio-máxima 30 (IC50) de ~45 μΜ (Figura 16} . Estes dados indicam que o ML 3000 afecta os mecanismos que segregam o ácido da célula parietal a jusante da mobilização de cAMP induzida pela activação do receptor de H2 da histamina. Os dados são compatíveis com a inibição do ML 3000 da secreção do ácido da célula parietal que resulta da interacção directa de ML 3000 com a Η,Κ-ATPa gástrica. No entanto, a discrepância entre o IC50 do ML 3000 em vesículas microssomais (15 μΜ) e em células parietais isoladas (40-45 μΜ) sugere que o acesso de ML 3000 ao compartimento da Η,Κ-ATPase intracelular em células parietais pode ser reduzido por constrangimento da permeabilidade na membrana de plasma.

Também, como foi verificado com a Η,Κ-ATPase microssomal, outros NSAIDs tais como o ácido acetilsalicílico, o naproxeno, e o NS 398 (até concentrações de 10-4 M) não tiveram nenhum efeito na acumulação do ácido pór se isolarem as células parietais do coelho. EXEMPLO 3

Efeitos de ML 3000 na secreção de IL-8 induzida por Heliobacter pylori e induzida por IL-Ιβ em células de adenocarcinoma gástrico humano (AGS}.

Estratégia. As células de AGS foram incubadas com compostos de teste, provocadas com IL-Ιβ, e a secreção subsequente de IL-8 no meio de cultura foi medida pelo ensaio de imuno-absorção ligado à enzima; o retracto gráfico dos dados mostra a inibição percentual da secreção de IL-8 não estimulada ou estimulada como uma função de umas concentrações de composto.

Resultados. Sem a estimulação por IL-1 β, e na ausência de ML3000 ou de ZD2138, as células de AGS (5 x 104 em μΐ de meio de cultura) 31 segregaram IL-8 durante um período de 6 horas a uma concentração de ~225 pg/mL (Figuras 17 e 19). Quando estimulada por IL-Ιβ (20 ng/mL), a secreção de IL-8 da célula de AGS durante um período de 6 horas foi aumentada ~27 vezes, a uma concentração de -6000 pg/mL (Figuras 18 e 20). O ML 3000 inibiu tanto a base (Figura 17) como a secreção de IL-8 estimulada por IL-Ιβ (Figura 18), com o IC5o de 0. 75.μΜ e 30 μΜ respectivamente. 0 inibidor específico da 5-lipoxigenase (ZD-2138), o qual não teve efeito na actividade da Η,Κ-ATPase microssomal, mostrou uma inibição dependente da dose da secreção de IL-8 de base por células de AGS (Figuras 19), com um IC5o de -0,4 μΜ. Ao contrário, o ZD-2138 foi sem efeito na secreção de IL-8 estimulada por IL-Ιβ por células de AGS (Figura 20). A inibição de H+,K+-ATPase por ML 3000, que foi demonstrada em cima, não sustenta a inibição do IL-8 secretório neste modelo uma vez que as células de AGS não exprimem a H+,K+-ATPase.

Para a extensão de que o IL-8 é um mediador inflamatório potente na mucosa gástrica, a descoberta de que o ML 3000 inibe profundamente a base e a secreção de IL-8 estimulada por IL-Ιβ em células epiteliais gástricas sugere que a inibição não é efectuada pela actividade inibitiva de 5-lipoxigenase do ML3000.

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Lisboa, 18 de Fevereiro de 2008

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-di-hidro-lH-pirrolizina-5-il]-acético da fórmula (Ia)

um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolizável, para preparar uma composição farmacêutica para tratar uma lesão mucosal gástrica.

2. Utilização de ácido [6-(4-clorofenil)-2, 2-dimetil-7-fenil-2,3-di-hidro-lH-prrolizina-5-il]-acético da fórmula (la).

um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolizável, para preparar uma composição farmacêutica para tratar uma gastrite erosiva. 2

3. Utilização de ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-di-hidro-lH-pirrolizina-5-il]-acético da fórmula (Ia)

Ci Clã), um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolizável, para preparar uma composição farmacêutica para tratar uma gastrite não erosiva.

4. Utilização de ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-di-hidro-lH-pirrolizina-5-il]-acético da fórmula (Ia)

um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolizável, para preparar uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir a ulceração gástrica.

5. Utilização de ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetíl-7-fenil-2,3-di-hidro-lH-pirrolizina-5-il]-acético da fórmula (Ia) um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolizável, para preparar uma composição 3

farmacêutica para tratar ou prevenir a úlcera duodenal ou a úlcera ventricular.

6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, incluindo em adição ao composto de Fórmula (Ia), o sal fisiologicamente aceitável ou o seu éster fisiologicamente hidrolizável, a utilização de um ou mais membros seleccionados a partir do grupo que consiste de agentes anti-bacterianamente activos, agentes gastroprotectores adicionais tais como inibidores de protão adicionais e antagonistas do receptor de H2, agentes de anti-ácido, alginatos e agentes procinéticos.

7. Combinação de (i) ácido [6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-di-hidro- lH-pirrolizina-5-il]-acético da fórmula (Ia). '

um sal fisiologicamente aceitável ou um seu éster fisiologicamente hidrolizável, com (ii) um ou mais do que um agente anti-inflamatório ulcerogénico para a utilização em terapia, em que o agente anti-inflamatório 4 I ulcerogénico é seleccionado a partir do grupo que consiste de ácido acetilsalicilico (ASA), salicilato de sódio, acetaminofeno, fenacetina, ibuprofeno, cetoprofeno, indometacina, flurbiprofeno, diclofenac, naproxeno, piroxicam, tebufelona, nabumetona, tenídap, alcofenac, antipirina, amimopirina, dipirona, animopirona, feniylbutazona, clofezona, oxifenbutazona, prexazona, apazona, benzidamina, bucoloma, cincopeno, clonixina, ditrazol, epírízole, fenoprofeno, floctafenina, ácido flufenâmico, glafenina, indoprofeno, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico, nabumetona, tinoridina, fosfosal, fenbufeno, feprazona, flumizole, benorilado, carprofeno, pirprofeno, salidifamidas, sulindac, suprofeno, tolmetina, tiaramida, proquazona, bufexamac, timegadina, dapsona, diflunisal, fenclofenac, fentiazac, tilomisole, oxaprozina, ácido tiaprofénico, piroxicam, sudoxicam, isoxicam, tenoxicam.

8. Composição farmacêutica que compreende. (i) ácido [6- (4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2, 3-di-hidro-lH-pirrolizina-5-il]-acético da fórmula (Ia).

seu éster um sal fisiologicamente hidrolizável, (ii) um ou mais do que um agente anti-inflamatório ulcerogénico para a utilização em terapia, e opcionalmente (iii) um portador farmaceuticamente aceitável, 5 em que o agente anti-inflamatório ulcerogénico é seleccionado a partir do grupo que consiste de ácido acetilsalicilico (ASA), salicilato de sódio, acetaminofeno, fenacetina, ibuprofeno, cetoprofeno, indometacina, flurbiprofeno, diclofenac, naproxeno, piroxicam, tebufelona, nabumetona, tenidap, alcofenac, antipirina, amimopirina, dipirona, animopirona, feniylbutazona, clofezona, oxifenbutazona, prexazona, apazona, benzidamina, bucoloma, cincopeno, clonixina, ditrazol, epirizole, fenoprofeno, floctafenina, ácido flufenâmico, glafenina, indoprofeno, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, ácido niflúmico, salidifamidas, sulindac, suprofeno, tolmetina, nabumetona, tiaramida, proquazona, bufexamac, flumizole, tinoridina, timegadina, dapsona, diflunisal, benorilado, fosfosal, fenclofenac, fentiazac, tilomisole, carprofeno, fenbufeno, oxaprozina, ácido tiaprofénico, pirprofeno, feprazona, piroxicam, sudoxicam, isoxicam, tenoxicam. Lisboa, 18 de Fevereiro de 2008