PT1959992E - Composição imunogénica compreendendo um adjuvante - Google Patents

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PT1959992E PT06831376T PT06831376T PT1959992E PT 1959992 E PT1959992 E PT 1959992E PT 06831376 T PT06831376 T PT 06831376T PT 06831376 T PT06831376 T PT 06831376T PT 1959992 E PT1959992 E PT 1959992E
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adjuvant
antigen
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Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO IMUNOGÉNICA COMPREENDENDO UM ADJUVANTE"
CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a composições de vacina melhoradas, a métodos para a sua preparação e à sua utilização em medicina. Em particular, a invenção refere-se a composições de vacina adjuvadas em que o adjuvante é uma formulação lipossomal, compreendendo uma saponina e um lipopolissacárido. A presente invenção refere-se ainda a formulações de vacina da gripe e a regimes de vacinação para imunização contra a gripe.
ANTECEDENTES TÉCNICOS
Composições ou vacinas novas com uma imunogenicidade melhorada são sempre necessárias. Como uma estratégia, foram utilizados adjuvantes para tentar e melhorar a resposta imune produzida contra qualquer antigénio dado.
Os lipopolissacáridos (LPS) são a principal molécula de superfície, e ocorrem exclusivamente aí, do folheto externo da membrana externa de bactérias Gram-negativas. Os LPS impedem a destruição da bactéria pelos complementos séricos e células fagocíticas e estão envolvidos na aderência para a colonização. Os LPS são um grupo de moléculas complexas relacionadas estruturalmente de aproximadamente 10000 Daltons de tamanho e consistem em três regiões covalentemente ligadas: 1 (i) uma cadeia polissacarídica específica de 0 (antigénio 0) na região externa (ii) uma região central de oligossacárido nuclear (iii) lipido A - a região mais recôndita que serve como âncora hidrofóbica, a qual compreende unidades de disacárido de glucosamina que contém ácidos gordos de cadeia longa.
Foi demonstrado que as actividades biológicas dos LPS, tais como toxicidade letal, pirogenicidade e adjuvanticidade, estão relacionadas com a unidade de lipido A. Pelo contrário, a imunogenicidade está associada com o componente de polissacárido específico de 0 (antigénio 0) . Os LPS e o lipido A são há muito conhecidos pelos seus fortes efeitos adjuvantes, mas a elevada toxicidade destas moléculas, impossibilitou a sua utilização em formulações de vacina. Tem sido feito, deste modo, um esforço significativo para reduzir a toxicidade dos LPS ou do lipido A enquanto é mantida a sua adjuvanticidade. 0 mutante R595 de salmonella minnesota foi isolado em 1966 a partir de uma cultura da estirpe parental (suave) (Luderitz et al. Ann. 1966 N. Y. Acad. Sei. 133:349-374) . As colónias seleccionadas foram rastreadas para a sua susceptibilidade a lise através de um painel de fagos e apenas aquelas colónias que apresentaram uma estreita gama de sensibilidade (susceptível a apenas um ou dois fagos) foram seleccionadas para estudo adicional. Este esforço conduziu ao isolamento de uma estirpe mutante fortemente rugosa que é deficiente na biossíntese de LPS e referida como S. minnesota R595.
Em comparação com outros LPS, aqueles produzidos pelo mutante S. minnesota R595 têm uma estrutura relativamente simples. 2 (i) não contêm a região específica de 0 - uma característica que é responsável pelo desvio do fenótipo suave de tipo selvagem para o fenótipo rugoso de mutante e resulta numa perda de virulência (ii) a região nuclear é muito curta - esta característica aumenta a susceptibilidade da estirpe a uma variedade de químicos (iii) a unidade de lípido A é altamente acilada com até 7 ácidos gordos. 0 lípido A 4'-monofosforilo (MPL) que pode ser obtido por hidrólise ácida de LPS extraídos de uma estirpe mutante fortemente rugosa de bactérias Gram-negativas, retém as propriedades adjuvantes de LPS, enquanto demonstra uma toxicidade que é reduzida por um factor de mais de 1000 (como medida por dose letal em ovos de embrião de pintainho) (Johnson et al. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl:S512-S516) . O LPS é tipicamente submetido a refluxo em soluções de ácido mineral de força moderada (e. g. , 0,1 M de HC1) durante um período de aproximadamente 30 minutos. Este processo resulta em desfosforilação na posição 1 e descarbo-hidratação na posição 6 ', produzindo o MPL. 0 lípido A monofosforil-3-O-desacilado (3D-MPL) que pode ser obtido por hidrólise alcalina suave do MPL, tem uma toxicidade mais reduzida enquanto mantém novamente a adjuvanticidade, ver documento US4912094 (Ribi Immunochemicals). A hidrólise alcalina é tipicamente realizada em solvente orgânico, tal como uma mistura de clorofórmio/metanol, por saturação com uma solução aquosa de base fraca, tal como carbonato de sódio a 0,5 M a pH 10,5. 3
Informação adicional sobre a preparação de 3D-MPL está disponível, por exemplo, nos documentos US4912094 e WO02/078637 (Corixa Corporation).
As saponinas de Quillaja são uma mistura de glicósidos de triterpeno extraídos da casca da árvore Quillaja saponaria. As saponinas em bruto têm sido extensivamente utilizadas como adjuvantes veterinários. A Quil-A é um extracto aquoso parcialmente purificado de material saponínico de Quillaja. QS21 é uma fracção purificada de HPLC, não tóxica, de Quil A e o seu método de produção é divulgado (como QA21) na patente U.S. N° 5057540. A título de exemplo, vacinas da gripe e vacinas contra o vírus do papiloma humano (HPV) foram desenvolvidas com adjuvantes.
Os vírus da gripe são um dos vírus mais ubíquos presentes no mundo, afectando humanos e animais de criação. A gripe resulta num encargo económico, morbidade e mesmo mortalidade que são significativos. 0 virus da gripe é um vírus de ARN com envelope, com um tamanho de partícula de cerca de 125 nm de diâmetro. Consiste basicamente de uma nucleocápside interna ou núcleo de ácido ribonucleico (ARN) associada com nucleoproteína, envolvida por um envelope virai com uma estrutura de bicamada lipídica e glicoproteínas externas. A camada interna do envelope virai é composta predominantemente de proteínas de matriz e a camada externa maioritariamente de material lipídico derivado do hospedeiro. O vírus da gripe compreende dois antigénios de superfície, as glicoproteínas neuraminidase (NA) e hemaglutinina (HA) que aparecem como espigões, com 10 a 12 nm de comprimento, 4 à superfície das partículas. São estas proteínas de superfície, particularmente a hemaglutinina que determinam a especificidade antigénica dos subtipos da gripe.
Estes antigénios de superfície sofrem progressivamente, às vezes rapidamente, algumas alterações que conduzem às variações antigénicas da gripe. Estas alterações antigénicas, chamadas "variações" e "desvios" são imprevisíveis e podem ter um impacto dramático de um ponto de vista imunológico, uma vez que conduzem eventualmente à emergência de novas estirpes de gripe que permitem ao vírus escapar ao sistema imune, provocando as bem conhecidas, quase anuais, epidemias.
As estirpes do vírus da gripe a serem incorporadas na vacina da gripe em cada estação são determinadas pela organização mundial de saúde em colaboração com autoridades nacionais de saúde e fabricantes de vacinas. A HA é o antigénio mais importante na definição da especificidade serológica das diferentes estirpes de gripe. Esta proteína de 75-80 kD contém numerosos determinantes antigénicos, alguns dos quais estão em regiões que sofrem alterações de sequência em diferentes estirpes (determinantes específicos de estirpe) e outros em regiões que são comuns a muitas moléculas de HA (determinantes comuns).
Os vírus da gripe provocam epidemias em quase todos os invernos, com taxas de infecção para o vírus tipo A ou B tão altas quanto 40% ao longo de um período de seis semanas. A infecção gripal resulta em vários estados patológicos, desde uma infecção subclínica passando por infecção ligeira das vias respiratórias superiores até pneumonia virai grave. As epidemias típicas da gripe provocam aumentos de incidência de pneumonia e 5 doença das vias respiratórios inferiores, como testemunhado por taxas crescentes de hospitalização ou mortalidade. A gravidade da doença é determinada principalmente pela idade do hospedeiro, o seu estado imunitário e local de infecção.
As pessoas idosas, com 65 anos de idade ou mais, são especialmente vulneráveis, sendo responsáveis por 80-90% de todas as mortes relacionadas com a gripe em países desenvolvidos. Os indivíduos com doenças crónicas subjacentes vão muito provavelmente também sofrer de tais complicações. Os bebés também podem sofrer de doença grave. Estes grupos em particular necessitam, deste modo, de serem protegidos. Além destes grupos de "risco", as autoridades de saúde estão também a recomendar a vacinação de adultos saudáveis que estão em contacto com as pessoas idosas. A vacinação desempenha um papel crítico no controlo das epidemias anuais de gripe. As vacinas da gripe actualmente disponíveis são vacinas da gripe inactivadas ou atenuadas vivas. As vacinas da gipe inactivadas são compostas de três formas possíveis de preparação do antigénio: vírus inteiro inactivado, sub-viriões em que partículas virais purificadas são fragmentadas com detergentes ou outros reagentes para solubilizar o envelope lipídico (denominada vacina "fragmentada") ou HA e NA purificadas (vacina de subunidade). Estas vacinas inactivadas são administradas intramuscularmente (i.m.) ou intranasalmente (i.n.).
As vacinas da gripe, de todos os tipos, são geralmente vacinas trivalentes. Contêm geralmente antigénios derivados de duas estirpes de vírus A da gripe e uma estirpe B da gripe. Na maioria dos casos, uma dose injectável padrão de 0,5 mL contém 15 pg do componente antigénico de hemaglutinina de cada estirpe, 6 como medida por imunodffusão radial simples (SRD) (J.M. Wood et ai.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et ai., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330).
As vacinas da gripe actualmente disponíveis são consideradas seguras em todos os grupos etários (De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Contudo, existe pouca prova de que as vacinas da gripe actuais funcionem em crianças pequenas com menos de dois anos de idade. Além disso, as taxas reportadas de eficácia de vacina para prevenção de doença gripal confirmada típica são 23-72% para os idosos, as quais são significativamente inferiores do que as taxas de eficácia de 60-90% reportadas para jovens adultos (Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoe., 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann. Intern. Med. 123. 523-527) . Foi demonstrado que a eficácia de uma vacina da gripe está correlacionada com os títulos séricos de anticorpos de inibição da hemaglutinação (Hl) para a estirpe virai, e diversos estudos verificaram que adultos mais velhos apresentam títulos de Hl mais baixos após imunização do que adultos mais novos (Murasko, 2002, Experimental Gerontology, 37, 427-439).
Deste modo, são ainda necessárias novas vacinas com uma imunogenicidade melhorada. A formulação de antigénios de vacina com potentes adjuvantes é uma abordagem possível para aumentar as respostas imunes aos antigénios do subvirião.
Uma vacina de subunidade da gripe, adjuvada com o adjuvante MF59, na forma de uma emulsão óleo-em-água está comercialmente 7 disponível e demonstrou a sua capacidade para induzir um título de anticorpo mais elevado do que o obtido com vacinas de subunidade não adjuvadas (De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Contudo, numa publicação posterior, a mesma vacina não demonstrou o seu perfil melhorado comparativamente a uma vacina fragmentada não adjuvada (Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23, 283-289). A título de antecedente técnico, durante os períodos inter-epidémicos, os vírus da gripe que circulam estão relacionados com aqueles da epidemia anterior. Os vírus espalham-se entre pessoas com vários níveis de imunidade a partir de infecções anteriores. Tal circulação, durante um período geralmente de 2-3 anos, promove a selecção de novas estirpes que variaram o suficiente para provocar novamente uma epidemia entre a população geral; este processo é denominado "variação antigénica". Os "variantes" podem ter impactos diferentes em comunidades, regiões, países ou continentes diferentes em qualquer ano, embora ao longo de vários anos o seu impacto global seja frequentemente semelhante. Por outras palavras, uma epidemia de gripe ocorre quando um novo vírus da gripe aparece, contra o qual a população humana não tem imunidade. As epidemias tipicas de gripe provocam aumentos na incidência de pneumonia e doença das vias respiratórias inferiores, como testemunhado por taxas crescentes de hospitalização ou mortalidade. É muito provável que os idosos ou aqueles com doenças crónicas subjacentes sofram de tais complicações, mas os bebés também podem sofrer de doença grave.
Em intervalos imprevisíveis, surgem novos vírus da gripe com um antigénio de superfície chave, a hemaglutinina, de um subtipo totalmente diferente das estirpes que circularam na estação anterior. Aqui, os antigénios resultantes podem variar desde 20% 8 até 50% da proteína correspondente de estirpes que circulavam previamente em humanos. Isto pode resultar em vírus que escapam a "imunidade da população" e estabelecem a epidemia. Este fenómeno é denominado "desvio antigénico". Pensa-se que ocorreu, pelo menos, na epidemia passada quando um vírus da gripe de uma espécie diferente, tais como um vírus da gripe aviária ou porcina, atravessou a barreira da espécie. Se tais virus tiverem o potencial para se espalharem de pessoa em pessoa, estes podem-se espalhar mundialmente no intervalo de alguns meses até um ano, resultando numa epidemia. Por exemplo, em 1957 (epidemia da gripe asiática) , os vírus do subtipo H2N2 substituíram os vírus H1N1 que tinham circulado na população humana desde, pelo menos, 1918 quando o vírus foi pela primeira vez isolado. Os H2HA e N2NA sofreram um desvio antigénico entre 1957 e 1968 até que o HA ter sido substituído em 1968 (epidemia da gripe de Hong-Kong) pela emergência do subtipo H3N2 da gripe, após o qual ο N2NA continuou a desviar conjuntamente com ο H3HA (Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106. 383-395).
As características de uma estirpe de vírus da gripe que lhe proporcionam o potencial para provocar um surto epidémico são: conter uma hemaglutinina nova comparativamente à hemaglutinina na estirpes actualmente em circulação que pode ou não estar acompanhada de uma alteração no subtipo de neuraminidase; ser capaz de ser transmitida horizontalmente na população humana; e ser patogénica para humanos. Uma hemaglutinina nova pode ser uma que não esteve evidente na população humana durante um período de tempo prolongado, provavelmente várias décadas, tal como H2. Ou pode ser uma hemaglutinina que não esteve em circulação na população humana anteriormente, por exemplo H5, H9, H7 ou H6 que são encontradas em aves. Em qualquer dos casos, a maioria ou, pelo menos, uma grande proporção ou mesmo a totalidade da 9 populaçao nao tinha estado previamente em contacto com o antigénio e está imunologicamente naive ao mesmo.
Os papilomavírus são pequenos vírus de ADN tumorais que são muito específicos de espécie. Até à data, foram descritos mais de 100 genótipos individuais de papilomavírus humano (HPV). Os HPV são geralmente específicos para a pele (e. g., HPV-1 e -2) ou para superfícies mucósicas (e. g. , HPV-6 e -11) e provocam geralmente tumores benignos (verrugas) que persistem durante vários meses ou anos. Tais tumores benignos podem provocar mal-estar nos indivíduos em causa mas tendem a não colocar a vida em risco, com algumas excepções.
Alguns HPV estão também associados com cancros. A mais forte associação positiva entre um HPV e um cancro humano é aquela que existe entre HPV-16 e HPV-18 e o carcinoma do colo do útero. O cancro do colo do útero é a malignidade mais comum em países em vias de desenvolvimento, com cerca de 500000 novos casos por ano no mundo. É agora tecnicamente praticável combater activamente as infecções primárias de HPV-16 e mesmo cancros contendo HPV-16 estabelecidos, utilizando vacinas. Para uma revisão no panorama da vacinação profiláctica e terapêutica contra HPV-16, ver Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293-306 e Hagenesee M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556, 559-564.
Embora ocorram pequenas variações, todos os genomas de HPV descritos têm, pelo menos, oito genes precoces, EI a E8 e dois genes tardios LI e L2. Além disso, uma região reguladora a montante alberga as sequências reguladoras que parecem controlar a maioria dos eventos transcripcionais do genoma de HPV. 10
As vacinas de HPV baseadas em LI sao divulgadas nos documentos W094/00152, WO94/20137, WO93/02184 e WO94/05792. Uma tal vacina pode compreender o antigénio LI como um monómero, um capsómero ou uma partícula de tipo virai. Os métodos para a preparação de VLP são bem conhecidos na técnica e incluem abordagens de desmontagem-remontagem de VLP para proporcionar homogeneidade aumentada, por exemplo como descrita nos documentos WO9913056 e US6245568. Tais partículas podem adicionalmente compreender proteínas L2. As vacinas baseadas em L2 são descritas, por exemplo, no documento WO93/00436. Outras abordagens de vacina de HPV são baseadas nas proteínas precoces, tal como E7 ou em proteínas de fusão, tal como L2-E7. 0 documento W09633739 divulga uma composição de vacina compreendendo uma saponina imunologicamente activa e um esterol.
Existe ainda uma necessidade para vacinas melhoradas, especialmente no caso da gripe e, em particular, de epidemias de gripe e para a população idosa, ou no caso de vacinas de HPV.
Foram previamente divulgadas combinações contendo adjuvantes lipopolissacáridos e saponinas de Quillaja, por exemplo, no documento EP0671948. Esta patente demonstrou uma forte sinergia quando um lipopolissacárido (3D-MPL) foi combinado com uma saponina de Quillaja (QS21). Verificou-se agora que podem ser obtidas boas propriedades adjuvantes com combinações de lipopolissacáridos e saponina de Quillaja como imunoestimuladores numa composição adjuvante, mesmo quando o immunoestimuladores estão presentes em baixas quantidades numa dose humana. 11
EXPOSIÇÃO DA INVENÇÃO
No primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição imunogénica num volume adequado para uma dose humana compreendendo um antigénio ou uma preparação antigénica em combinação com um adjuvante, cujo adjuvante compreende uma fracção saponinica imunologicamente activa derivada da casca de Quillaja saponaria Molina, presente na forma de um lipossoma e um lipopolissacárido em que a referida fracção saponinica e o referido lipopolissacárido estão ambos presentes na referida dose humana a um nivel entre de dois e 30 pg.
Num segundo aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição imunogénica compreendendo um virus da gripe ou uma sua preparação antigénica, em combinação com um adjuvante saponinico presente na forma de um lipossoma. Numa forma de realização especifica deste aspecto, a composição imunogénica compreende ainda um derivado de Lípido A, tal como 3D-MPL.
Apropriadamente, o adjuvante saponinico na forma de um lipossoma de acordo com a invenção compreende uma fracção activa da saponina derivada da casca de Quillaja saponaria Molina, tal como QS21, e um esterol, tal como colesterol, numa razão saponina:esterol desde 1:1 a 1:100 p/p.
Em particular, a referida composição imunogénica compreende um antigénio com um epitopo de célula T CD4. Alternativamente, a referida composição imunogénica compreende um antigénio com um epitopo de célula B. A invenção refere-se também à utilização de um virus da gripe ou de uma sua preparação antigénica, e de um adjuvante compreendendo uma fracção saponinica imunologicamente activa 12 derivada da casca de Quillaja saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e de um lipopolissacárido no fabrico de uma composição imunogénica para a prevenção de infecção e/ou doença do vírus da gripe. A invenção refere-se também à utilização de um antigénio ou antigénios do vírus do papiloma humano ou uma sua preparação antigénica e de um adjuvante compreendendo uma fracção saponínica imunologicamente activa derivada da casca de Quillaja saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e de um lipopolissacárido no fabrico de uma composição imunogénica para prevenção de infecção e/ou doença do vírus do papiloma humano. A invenção refere-se também à utilização de um antigénio ou antigénios de Citomegalovírus ou uma sua preparação antigénica, e de um adjuvante compreendendo uma fracção saponínica imunologicamente activa derivada da casca de Quillaja saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e de um lipopolissacárido no fabrico de uma composição imunogénica para prevenção de infecção e/ou doença do Citomegalovirus. A invenção refere-se também à utilização de um antigénio ou antigénios de Streptococcus pneumoanie ou uma sua preparação antigénica e de um adjuvante compreendendo uma fracção saponínica imunologicamente activa derivada da casca de Quillaja saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e de um lipopolissacárido definido no fabrico de uma composição imunogénica para prevenção de infecção e/ou doença do Streptococcus pneumonaie. A invenção refere-se também à utilização de um antigénio ou antigénios de Plasmodium falciparum ou uma sua preparação antigénica e de um adjuvante compreendendo uma fracção 13 saponínica imunologicamente activa derivada da casca de Quillaja saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e de um lipopolissacárido no fabrico de uma composição imunogénica para prevenção de infecção do Plasmodium falciparum e/ou da doença malária. A invenção refere-se também à utilização de um antigénio ou antigénios do vírus Varicella zoster ou uma sua preparação antigénica e de um adjuvante compreendendo uma fracção saponínica imunologicamente activa derivada da casca de Quillaja saponaria Molina apresentada na forma de um lipossoma e de um lipopolissacárido no fabrico de uma composição imunogénica para prevenção de infecção e/ou doença do vírus Varicella zoster.
Num outro aspecto, é proporcionada a utilização de (a) um antigénio ou uma sua preparação antigénica e (b) um adjuvante como aqui definido abaixo no fabrico de uma composição imunogénica para indução num humano de, pelo menos, um ou, pelo menos, dois ou todas das seguintes: (i) uma resposta imune melhorada de célula T CD4 contra o referido antigénio ou uma sua preparação antigénica, (ii) uma resposta imune humoral melhorada contra o referido antigénio ou uma sua preparação antigénica, (iii) uma resposta melhorada de célula B de memória contra o referido antigénio ou uma sua preparação antigénica.
Em particular, o referido antigénio é um antigénio de vírus da gripe, HPV, Citomegalovírus (CMV), vírus Varicella zoster (VZV), Streptococcus pneumoniae ou malária ou uma sua preparação antigénica, e o referido humano é um indivíduo ou população imuno-comprometida, tais como um adulto de elevado risco, um adulto idoso ou uma criança. Numa forma de realização específica, é proporcionada a utilização de um antigénio ou uma sua preparação antigénica e um adjuvante como aqui definido na 14 preparação de uma composição imunogénica para vacinação do humano, em particular um adulto idoso humano, contra o patogéneo a partir do qual é derivado o antigénio na composição imunogénica. Especificamente, o referido antigénio é um antigénio ou antigénios do virus da gripe, virus do papiloma humano, citomegalovirus, virus Varicella zoster, Streptococcus pneumoniae, parasita Plasmodium ou uma sua preparação antigénica. É também proporcionado um método de vacinação compreendendo a distribuição de um antigénio ou de uma composição antigénica, em particular um virus da gripe ou HPV, citomegalovirus, virus Varicella zoster, Streptococcus pneumoniae, parasita Plasmodium, ou uma sua preparação antigénica e um adjuvante como aqui definido abaixo, a um indivíduo ou a uma população com a sua necessidade.
Numa forma de realização específica, a composição imunogénica é capaz de induzir uma resposta imune melhorada de célula T CD4 contra o referido antigénio ou uma sua preparação antigénica e, em particular, é ainda capaz de induzir uma resposta imune humoral ou uma resposta melhorada de célula B de memória ou ambas, comparativamente àquela obtida com o antigénio ou composição antigénica não adjuvadas. Especificamente, a referida resposta imune de célula T CD4 envolve a indução de uma resposta de T CD4 auxiliar de reacção cruzada. Especificamente, a referida resposta imune humoral envolve a indução de uma resposta imune humoral de reacção cruzada.
Numa forma de realização adicional, é proporcionado um método ou uma utilização como aqui definido abaixo, para protecção contra infecção ou doença provocada por um patogéneo que é uma variante do patogéneo do qual é derivado o antigénio 15 na composição imunogénica. Noutra forma de realização, é proporcionado um método ou uma utilização, como aqui definido abaixo, para protecção contra infecções ou doenças provocadas por um patogéneo que compreende um antigénio que é uma variante daquele antigénio na composição imunogénica. Numa forma de realização especifica, é proporcionada a utilização de um antigénio, em particular um virus da gripe ou HPV, ou uma sua preparação antigénica, no fabrico de uma composição imunogénica para revacinação de humanos vacinados previamente com uma composição imunogénica compreendendo um antigénio, em particular um virus da gripe ou HPV, ou uma sua preparação antigénica, em combinação com um adjuvante como aqui descrito.
Numa forma de realização especifica, a composição utilizada para a revacinação pode adicionalmente conter um adjuvante. Noutra forma de realização especifica, a composição imunogénica para a revacinação contém um antigénio que partilha epitopos comuns da célula T CD4 com um antigénio ou uma composição antigénica utilizada para uma vacinação anterior. Especificamente, a composição imunogénica para a revacinação contém um virus da gripe ou uma sua preparação antigénica que partilha epitopos comuns de célula T CD4 com o virus da gripe ou uma sua preparação antigénica virai utilizada para a primeira vacinação.
Num aspecto, a revacinação é realizada em indivíduos que foram vacinados na estação anterior contra a gripe. Tipicamente, a revacinação é realizada, pelo menos, 6 meses após a primeira vacinação, de um modo preferido, 8 a 14 meses após, de um modo mais preferido, por volta de 10 a 12 meses após. Num outro aspecto, a revacinação é realizada em indivíduos que foram vacinados com uma composição compreendendo um virus da gripe ou uma sua preparação antigénica em que, pelo menos, uma estirpe 16 está associada com um surto epidémico ou tem o potencial para estar associada com um surto epidémico.
Num aspecto adicional da presente invenção, é proporcionada a utilização de um virus da gripe ou uma sua preparação antigénica a partir de uma primeira estirpe de gripe, no fabrico de uma composição imunogénica como aqui definida para protecção contra infecções da gripe provocadas por uma estirpe de gripe variante. A invenção refere-se também a um método de vacinação compreendendo a distribuição de um virus da gripe ou de uma sua preparação antigénica e de um adjuvante como aqui definido.
Num outro aspecto, é proporcionado um método de vacinação de um indivíduo ou de uma população humana imuno-comprometida, tais como adultos de elevado risco ou pessoas idosas, compreendendo a administração de uma composição imunogénica de gripe compreendendo um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica em combinação com um adjuvante como aqui definido.
Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um método para revacinação de humanos previamente vacinados com uma composição imunogénica de gripe compreendendo um antigénio gripal ou uma sua preparação antigénica a partir de, pelo menos, uma estirpe de vírus da gripe em combinação com um adjuvante como aqui definido, cujo referido método compreende a administração ao referido humano de uma composição imunogénica compreendendo um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica, adjuvada ou não adjuvada. A invenção refere-se também a um método para a preparação de uma composição imunogénica compreendendo a combinação de um 17 adjuvante saponínico na forma de um lipossoma com um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica, e opcionalmente com 3D-MPL.
Outros aspectos e vantagens da presente invenção são adicionalmente descritos na seguinte descrição detalhada das suas formas de realização preferidas.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 - representação em diagrama da preparação de MPL.
Figura 2 - Resposta humoral contra várias estirpes de gripe, após imunização de furões com formulações experimentais: Teste de Inibição da Hemaglutinação (GMT + /- IC95) antes e após iniciação heteróloga (H1N1 A/Estocolmo/24/90), após imunização (H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 e B/Shangdong/7/97) e após desafio heterólogo (H3N2 A/Wyoming/3/2003).
Figura 3 - Estudo de furão: Titulação virai em lavagens nasais após desafio (dia 42).
Figura 4 - Estudo de murganhos: Resposta humoral contra as três estirpes da vacina da gripe, após imunização de murganhos com formulações experimentais: Teste de Inibição da Hemaglutinação (GMT + /- IC95) 21 dias após imunização (H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Wyoming/3/2003 e B/Jiangsu/10/2003). 18
Figura 5 - Estudo de murganhos: resposta imune mediada por célula: respostas de célula T CD4+ especificas de gripe no Dia 7 Pós-imunização.
Figura 6 - Estudo de murganhos: CMI para CD4 - Estirpe agrupada (toda a dobrar) - Dia 0 e Dia 21
Figura 7 - GMT nos dias 0 e 21 para anticorpos Hl.
Figura 8: Incidência de sintomas locais e gerais em humanos (Total e relacionados com grau 3) reportados durante o periodo de acompanhamento de 7 dias, após imunização com formulações adjuvadas de virus da gripe, comparando adjuvantes que têm duas concentrações diferentes de imunoestimuladores .
Figura 9: Respostas humorais a HPV 16 e 18 LI em murganhos, após imunização com formulações adjuvadas de HPV, comparando adjuvantes que têm duas concentrações diferentes de imunoestimuladores.
Figura 10: Resposta imune mediada por célula em murganhos: Coloração Intracelular de Citocinas - célula T CD4+ VLP16 e 18, após imunização com formulações adjuvadas de HPV, comparando adjuvantes que têm duas concentrações diferentes de imunoestimuladores.
Figura 11: Produção de células B de memória especificas, após imunização com formulações adjuvadas de HPV, comparando adjuvantes que têm duas concentrações diferentes de imunoestimuladores. 19
Figura 12; Comparação pré-clínica de vacinas adjuvadas de S. pneumonaie em murganhos, comparando adjuvantes gue têm duas concentrações diferentes de imunoestimuladores.
Figura 13: Títulos de ELISA Anti-gB de cobaio, após imunização com vacina adjuvada de Gb, comparando adjuvantes que têm duas concentrações diferentes de imunoestimuladores.
Figura 14: Títulos neutralizantes anti-CMV de cobaio, após imunização com vacina adjuvada de Gb, comparando adjuvantes que têm duas concentrações diferentes de imunoestimuladores.
Figura 15: Títulos de ELISA Anti-gB de murganho, após imunização com vacina adjuvada de gB.
Figura 16 : Títulos neutralizantes anti-CMV de murganhos, após imunização com vacina adjuvada de gB.
Figura 17: Estudo de murganhos: Imunidade mediada por célula células CD4+ e CD8+ específicas de CMV, após re- estimulação com um agrupamento de péptidos gB (7 dias após a segunda imunização).
Figura 18: Estudo de murganhos. Imunidade mediada por célula - células CD4+ específicas de CMV, após re-estimulação com duas dosagens diferentes de um agrupamento de péptidos gB (21 dias após a segunda imunização).
Figura 19: Estudo de murganhos. Imunidade mediada por célula - células CD8+ específicas de CMV, após re-estimulação com duss dosagens diferentes de um agrupamento de péptidos gB (21 dias após a segunda imunização). 20
Figura 20; Média geométrica de títulos de anticorpo (GMT) contra a proteína circunsporozoíta CSP, após Imunização com vacina adjuvada RTS,S em murganhos; comparando adjuvantes que têm imunoestimuladores a duas concentrações diferentes.
Figura 21: Média geométrica de títulos de anticorpo (GMT) contra antigénios de superfície de hepatite B (HB), após imunização com vacina adjuvada RTS,S em murganhos; comparando adjuvantes com imunoestimuladores a duas concentrações diferentes. e/ou IFN gama por após imunização com RTS,S, comparando duas concentrações e/ou IFN gama por após imunização com RTS,S, comparando duas concentrações
Figura 22: Expressão ex vivo de IL-2 células T CD4 e CD8 especificas de CSP, uma composição imunogénica adjuvada adjuvantes com imunoestimuladores a diferentes.
Figura 23: Expressão ex vivo de IL-2 células T CD4 e CD8 especificas de HBs, uma composição imunogénica adjuvada adjuvantes com imunoestimuladores a diferentes.
Figura 24: Respostas humorais em murganhos, após imunização com vacina da gripe fragmentada trivalente adjuvada (A/Nova Caledónia, A/Wyoming, B/Jiangsu), imunoestimuladores a duas concentrações diferentes.
Figura 25: Resposta imune mediada por célula em murganhos, após imunização com vacina da gripe trivalente adjuvada (A/Nova Caledónia, A/Wyoming, B/Jiangsu), imunoestimuladores a duas concentrações diferentes. 21
Figura 26: Resultados pré-clínicos em murganhos, comparando vacinas VZV gE adjuvadas com AS01 B ou AS01E.
Figura 27: Títulos virais de lavagens nasais, após iniciação e desafio com antigénios de vírus da gripe - imunização com A/Nova Caledónia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou adjuvadas com composições adjuvantes compreendendo imunoestimuladores a duas concentrações diferentes, em furões
Figura 28: Monitorização da temperatura corporal em furões, após iniciação e desafio com antigénios da gripe. Imunização com A/Nova Caledónia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou adjuvadas com composições adjuvantes compreendendo imunoestimuladores a duas concentrações diferentes.
Figura 29: Títulos Anti-HI para as estirpes A na formulação de vacina trivalente, após imunização e desafio com preparações de antigénio gripal. Imunização com A/Nova Caledónia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou adjuvadas com composições adjuvantes compreendendo imunoestimuladores a duas concentrações diferentes.
Figura 30: Títulos Anti-HI para B/Jiangsu e a estirpe de desvio utilizada para desafio, após imunização e desafio com preparações de antigénio gripal. Imunização com A/Nova Caledónia, A/Wyoming, B/Jiangsu simples ou adjuvadas com composições adjuvantes compreendendo imunoestimuladores a duas concentrações diferentes. 22
DESCRIÇÃO DETALHADA A presente requerente verificou que uma composição adjuvante que compreende uma saponina, presente na forma de um lipossoma e um lipopolissacárido, em que cada imunoestimulador está presente a um nível entre 1 e 30 pg por dose humana, pode melhorar respostas imunes a uma preparação antigénica, enquanto ao mesmo tempo tem uma reactogenicidade mais baixa do que algumas das formulações da técnica anterior em que os imunoestimuladores estavam presentes a níveis mais elevados por dose humana. A presente requerente verificou ainda que uma formulação gripal compreendendo um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica conjuntamente com um adjuvante compreendendo uma saponina, presente na forma de um lipossoma, e opcionalmente ainda com um derivado de lípido A, tal como 3D-MPL, foi capaz de melhorar a resposta imune da célula T CD4 contra o referido antigénio ou composição antigénica comparativamente àquela obtida com o vírus não adjuvado ou uma sua preparação antigénica. As formulações adjuvadas com saponina, presentes na forma de um lipossoma, são utilizadas vantajosamente para induzir respostas da célula T CD4 anti-gripe capazes de detecção de epitopos da gripe apresentados por moléculas da classe II de MHC. A presente requerente verificou que é eficaz direccionar para o sistema imune mediado por célula de modo a aumentar a responsividade contra estirpes da gripe de desvio e homólogas (após vacinação e infecção). É uma forma de realização específica da presente invenção que as composições para utilização na presente invenção possam ser capazes de proporcionar, em humanos, melhor seroprotecção contra a gripe após revacinação, como avaliada pelo número de indivíduos humanos que tiveram contacto com a gripe que se 23 correlaciona com a protecção. Além disso, é outra forma de realização específica que a composição para utilização na presente invenção seja também capaz de induzir uma maior resposta de memória da célula B, após a primeira vacinação num indivíduo humano, e uma maior resposta humoral após revacinação, comparativamente à composição não adjuvada.
As composições gripais adjuvadas de acordo com a invenção têm diversas vantagens: 1) Uma imunogenicidade melhorada: vão permitir restaurar a fraca resposta imune nas pessoas idosas (mais de 50 anos de idade, tipicamente mais de 65 anos de idade) para níveis observados em pessoas jovens (respostas de anticorpo e/ou de célula T); 2) Um perfil melhorado de protecção cruzada: protecção cruzada aumentada contra estirpes variantes (desvio) da gripe; 3) Vão também permitir uma dosagem reduzida de antigénio a ser utilizado para uma resposta semelhante, assegurando assim uma capacidade aumentada em caso de emergência (por exemplo, epidemia).
Noutro aspecto da invenção, a requerente verificou que a composição adjuvante como aqui definida demonstra resultados de imunogenicidade para a produção de anticorpos e frequência pós-vacinação de CD4 específico da gripe que são equivalentes, ou por vezes superiores, àqueles produzidos com vacina não adjuvada. Este efeito tem particular valor na população idosa e pode ser conseguido com um adjuvante como aqui definido, contendo uma dose mais baixa de imunoestimuladores. Além disso, os sintomas de reactogenicidade mostraram uma tendência para serem maiores no grupo que recebeu a vacina adjuvada com a concentração mais elevada de imunoestimuladores comparativamente ao grupo que recebeu a vacina adjuvada em que os imunoestimuladores estão numa concentração mais baixa.
Estas observações podem ser aplicadas a outras formas dos mesmos antigénios e a outros antigénios.
Adjuvante saponínico A composição adjuvante da invenção compreende um adjuvante saponínico, presente na forma de um lipossoma.
Uma saponina particularmente adequada para utilização na presente invenção é Quil A e os seus derivados. A Quil A é uma preparação de saponina isolada a partir da árvore sul-americana Quillaja saponaria Molina e foi primeiro descrita por Dalsgaard et al. em 1974 ( "Saponin adjuvants", Arclv. fiir die gesamte
Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlim, p243-254) como tendo actividade adjuvante. Foram isolados por HPLC fragmentos purificados de Quil A que retêm a actividade adjuvante sem a toxicidade associada com Quil A (documento EP 0362278), por exemplo QS7 e QS21 (também conhecidos como QA7 e QA21). A QS-21 é uma saponina natural derivada da casca de Quillaja saponaria Molina que induz células T CD8+ (CTL) citotóxicas, células Thl e uma resposta predominante de anticorpo IgG2a e é uma saponina preferida no contexto da presente invenção.
Numa forma adequada da presente invenção, o adjuvante saponínico na composição imunogénica é um derivado de quil A de Saponaria molina, de um modo preferido, uma fracção imunologicamente activa de Quil A, tais como QS-17 ou QS-21, adequadamente QS-21. Numa forma de realização, as composições da 25 invenção contêm a fracção saponínica imunologicamente activa na forma substancialmente pura. De um modo preferido, as composições da invenção contêm QS21 na forma substancialmente pura, isto é, QS21 é, pelo menos, 90% pura, por exemplo, pelo menos, 95% pura ou, pelo menos, 98% pura.
Numa forma de realização especifica, a QS21 é proporcionada na sua composição menos reactogénica onde é inactivada com um esterol exógeno, tal como colesterol, por exemplo. Existem várias formas particulares de composições menos reactogénicas em que QS21 é incativada com um colesterol exógeno. Numa forma de realização especifica, a saponina/esterol está na forma de uma estrutura lipossomal (documento WO 96/33739, Exemplo 1). Nesta forma de realização, os lipossomas contêm adequadamente um lipido neutro, por exemplo fosfatidilcolina que é adequadamente não cristalino à temperatura ambiente, por exemplo, fosfatidilcolina de gema de ovo, dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) ou dilaurilfosfatidilcolina. Os lipossomas podem também conter um lipido carregado que aumenta a estabilidade da estrutura lipossoma-QS21 para lipossomas compostos de lipidos saturados. Nestes casos, a quantidade de lipido carregado é adequadamente 1-20% p/p, de um modo preferido 5-10%. A razão de esterol para fosfolipido é 1-50% (mol/mol), adequadamente 20-25%.
Os esteróis adequados incluem β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol e colesterol. Numa forma de realização particular, a composição adjuvante compreende colesterol como esterol. Estes esteróis são bem conhecidos na técnica, por exemplo, o colesterol é divulgado no índice Merck, 11° Ed., página 341, como um esterol de ocorrência natural encontrado na gordura animal. 26
As composições adjuvantes da invenção compreendendo QS21 e um esterol, em particular colesterol, mostram uma reactogenicidade diminuída quando comparada às composições em que o esterol está ausente, enquanto o efeito adjuvante é mantido. Os estudos de reactogenicidade podem ser avaliados de acordo com os métodos divulgados no documento WO 96/33739. 0 esterol de acordo com a invenção significa um esterol exógeno, i. e., um esterol que não é endógeno ao organismo do qual a preparação antigénica é retirada, mas é adicionada à preparação antigénica ou subsequentemente no momento da formulação. Tipicamente, o esterol pode ser adicionado durante formulação subsequente da preparação antigénica com o adjuvante saponinico, utilizando, por exemplo, a saponina na sua forma inactivada com o esterol. Apropriadamente, o esterol exógeno é associado ao adjuvante saponinico como descrito no documento WO 96/33739.
Nos casos em que a fracção activa da saponina é QS21, a razão QS21:esterol será tipicamente na ordem de 1:100 a 1:1 (p/p) , adequadamente entre 1:10 e 1:1 (p/p) e, de um modo preferido, 1:5 a 1:1 (p/p). Adequadamente, o esterol está presente em excesso, sendo a razão QS21:esterol, pelo menos, 1:2 (p/p). Numa forma de realização, a razão QS21:esterol é 1:5 (p/p). 0 esterol é adequadamente o colesterol.
Outras saponinas úteis são derivadas das plantas Aesculus hippocastanum ou Gyophilla struthium. Outras saponinas que foram descritas na literatura incluem Escina que foi descrita no índice Merck (12a ed: entrada 3737) como uma mistura de saponinas que ocorrem na semente da árvore de castanheiro-da-índia, lat: Aesculus hippocastanum. O seu isolamento é descrito por cromatografia e purificação (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) e por resinas de permuta iónica (Erbring et al., U.S. 3238190). As fracções de escina foram purificadas e 27 mostraram ser biologicamente activas (Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bul (Tóquio) 1996 Agosto; 44(8):1454-1464)). A sapoalbina de Gypsophilla struthium (R. Vochten et al. , 1968, J. Pharm. Belg., 42, 213-226) foi também descrita relativamente à produção, por exemplo, de ISCOM.
Um aspecto chave da presente invenção, é o facto da saponina imunologicamente activa que é, de um modo preferido, QS21, poder ser utilizada em quantidades menores do que se tinha previamente pensado ser útil, adequadamente entre 1 e 30 pg, por dose humana da composição imunogénica. A invenção proporciona, deste modo, uma dose humana de uma composição imunogénica compreendendo saponina imunologicamente activa, de um modo preferido, QS21, a um nível entre 1 e 30 pg.
Numa forma de realização, uma composição imunogénica num volume que é adequado para uma dose humana, em que a dose humana da composição imunogénica compreende QS21 a um nível em torno de 25 pg, por exemplo entre 20 - 30 pg, adequadamente entre 21 - 29 pg ou entre 22 e 28 pg ou entre 23 e 27 pg ou entre 24 e 26 pg, ou 25 pg. Numa outra forma de realização, a dose humana da composição imunogénica compreende QS21 a um nível em torno de 10 pg, por exemplo entre 5 e 15 pg, adequadamente entre 6 e 14 pg, por exemplo entre 7 e 13 pg ou entre 8 e 12 pg ou entre 9 e 11 pg, ou 10 pg.
Numa forma de realização adicional, a dose humana da composição imunogénica compreende QS21 a um nivel em torno de 5 pg, por exemplo entre 1 e 9 pg, ou entre 2 e 8 pg ou adequadamente entre 3 e 7 pg ou 4 e 6 pg, ou 5 pg. 28
Uma quantidade adequada de QS21 é, por exemplo, qualquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 pg (p/v) por dose humana da composição imunogénica.
Pelo termo "dose humana" entende-se uma dose que está num volume adequado para utilização humana. Geralmente isto é entre 0,3 e 1,5 mL. Numa forma de realização, uma dose humana é 0,5 mL. Numa forma de realização adicional, uma dose humana é superior a 0,5 mL, por exemplo, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mL. Numa forma de realização adicional, uma dose humana está entre 1 mL e 1,5 mL. A invenção é caracterizada por cada dose humana conter entre 1 e 30 pg de QS21. A invenção proporciona ainda uma composição adjuvante compreendendo 1 e 30 pg de QS21. Tipicamente, uma tal composição adjuvante estará num volume adequado para dose humana. No caso em que o adjuvante está num forma líquida para ser combinada com uma forma líquida de uma composição antigénica, a composição adjuvante estará num volume adequado para dose humana, o que é aproximadamente metade do volume final pretendido da dose humana, por exemplo, um volume de 36 0 pL para uma dose humana pretendida de 0,7 mL ou um volume de 250 pL para uma dose humana pretendida de 0,5 mL. A composição adjuvante é diluída quando combinada com a composição antigénica para proporcionar a dose humana final de vacina. O volume final de tal dose irá naturalmente variar dependendo no volume inicial da composição adjuvante e do volume da composição antigénica adicionada à composição adjuvante. Numa forma de realização alternativa, o adjuvante líquido é utilizado para reconstituir uma composição antigénica liofilizada. Nesta forma de realização, o volume adequado da dose humana da composição adjuvante é
aproximadamente igual ao volume final da dose humana. A 29 composição adjuvante líquida é adicionada ao frasquinho contendo a composição antigénica liofilizada. A dose humana final pode variar entre 0,5 e 1,5 mL. Numa forma de realização particular, a dose humana é 0,5 mL. Nesta forma de realização a composição de vacina da invenção irá compreender um nível de QS21 entre 1 e 30 pg, por 0,5 mL de dose humana. Além disso, nesta forma de realização uma composição adjuvante da invenção irá compreender um nível de QS21 entre 1 e 30 pg, por 250 pL de composição adjuvante ou por 500 pL de composição adjuvante, dependendo se a composição adjuvante for pretendida para ser combinada com uma composição antigénica líquido ou liofilizada, respectivamente.
Especificamente quando combinada com um antigénio gripal, uma quantidade de QS21 pode ser utilizada, por exemplo, numa quantidade de 1 a 100 pg (p/v) por dose de composição, de um modo preferido, numa quantidade de 10 a 50 pg (p/v ) por dose de composição. Uma quantidade adequada de QS21 é, por exemplo, qualquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 pg (p/v) por dose de composição. De um modo mais preferido, uma quantidade de QS21 varia desde 25 a 75 pg (p/v) por dose de composição. Geralmente uma dose de composição irá variar desde cerca de 0,5 mL a cerca de 1 mL. Uma dose típica de vacina é 0,5 mL, 0,6 mL, 0,7 mL, 0,8 mL, 0,9 mL ou 1 mL. Numa forma de realização preferida, uma concentração final de 50 pg de QS21 está contida por mL de composição de vacina ou 25 pg por dose de vacina de 0,5 mL. Noutras formas de realização preferidas, uma concentração final de 35,7 pg ou 71,4 pg de QS21 está contida por mL de composição de vacina. Especificamente, um volume de dose de vacina de 0,5 mL contém 25 pg ou 50 pg de QS21 por dose. 30 A dose de QS21 é adequadamente capaz de aumentar uma resposta imune a um antigénio num humano. Em particular, uma quantidade de QS21 adequada é aquela que melhora o potencial imunológico da composição comparativamente à composição não adjuvada, ou comparativamente à composição adjuvada com uma outra quantidade de QS21, enquanto for aceitável a partir de um perfil de reactogenicidade.
Adjuvante 3D-MPL A composição compreende ainda um adjuvante adicional que é um lipopolissacárido, adequadamente um derivado não tóxico de lípido A, particularmente lípido A monofosforilo ou mais particularmente lípido A monofosforil-3-desacilado (3D-MPL). 0 3D-MPL é vendido sob o nome MPL pela GlaxoSmitKline Biologicals N.A. e é referido ao longo do documento como MPL ou 3D-MPL. Ver, por exemplo, patentes U.S. N° 4436727; 4877611; 4866034 e 4912094. 0 3D-MPL promove principalmente respostas de célula T CD4+ com um fenótipo IFN-g (Thl) . 0 3D-MPL pode ser produzido de acordo com os métodos divulgados no documento GB 2220211A. Quimicamente é uma mistura de lípido A monofosforil-3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. De um modo preferido, nas composições da presente invenção é utilizado 3D-MPL de pequena partícula. 0 3D-MPL de pequena partícula tem um tamanho de partícula tal que pode ser esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 pm. Tais preparações são descritas no documento WO 94/21292.
Um aspecto chave da presente invenção é o facto do lipopolissacárido que é, de um modo preferido, 3D-MPL, poder ser utilizado em quantidades menores do que se tinha previamente 31 pensado ser útil, adequadamente entre 1 e 30 pg, por dose humana da composição imunogénica. A invenção proporciona, deste modo, uma dose humana de uma composição imunogénica compreendendo lipopolissacárido, de um modo preferido, 3D-MPL, a um nivel entre 1 e 30 pg.
Numa forma de realização, a dose humana da composição imunogénica compreende 3D-MPL a um nivel em torno de 25 pg, por exemplo, entre 20 - 30 pg, adequadamente entre 21 - 29 pg ou entre 22 e 28 pg ou entre 23 e 27 pg ou entre 24 e 26 pg, ou 25 pg.
Noutra forma de realização, a dose humana da composição imunogénica compreende 3D-MPL a um nivel em torno de 18 pg, por exemplo, entre 5 e 15 pg, adequadamente entre 6 e 14 pg, por exemplo, entre 7 e 13 pg ou entre 8 e 12 pg ou entre 9 e 11 pg, ou 10 pg.
Numa forma de realização adicional, a dose humana da composição imunogénica compreende 3D-MPL a um nivel em torno de 5 pg, por exemplo , entre 1 e 9 pg ou entre 2 e 8 pg ou adequadamente entre 3 e 7 pg ou 4 e 6 pg, ou 5 pg. Uma quantidade adequada de 3D- MPL é, por exemplo, qualquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 pg (p/v) por dose humana da composição imunogénica.
Numa forma de realização, o volume da dose humana é 0,5 mL. Numa forma de realização adicional, a composição imunogénica está num volume adequado para uma dose humana cujo volume é superior a 0,5 mL, por exemplo, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mL. Numa 32 forma de realização adicional, a dose humana está entre 1 mL e 1,5 mL. A invenção é caracterizada por cada dose humana conter entre 1 e 30 pg de 3D-MPL. A invenção proporciona ainda uma composição adjuvante compreendendo entre 1 e 30 pg de 3D-MPL. Tipicamente, uma tal composição adjuvante estará num volume adequado para dose humana. No caso em que o adjuvante está num forma líquida para ser combinada com uma forma líquida de uma composição antigénica, a composição adjuvante estará num volume adequado para dose humana, o que é aproximadamente metade do volume final pretendido da dose humana, por exemplo, um volume de 360 pL para uma dose humana pretendida de 0,7 mL ou um volume de 250 pL para uma dose humana pretendida de 0,5 mL. A composição adjuvante é diluída quando combinada com a composição antigénica para proporcionar a dose humana final de vacina. 0 volume final de tal dose irá naturalmente variar dependendo no volume inicial da composição adjuvante e do volume da composição antigénica adicionada à composição adjuvante. Numa forma de realização alternativa, o adjuvante líquido é utilizado para reconstituir uma composição antigénica liofilizada. Nesta forma de realização, o volume adequado da dose humana da composição adjuvante é aproximadamente igual ao volume final da dose humana. A composição adjuvante líquida é adicionada ao frasquinho contendo a composição antigénica liofilizada. A dose humana final pode variar entre 0,5 e 1,5 mL. Numa forma de realização particular, a dose humana é 0,5 mL. Nesta forma de realização a composição de vacina da invenção irá compreender um nível de 3D-MPL entre 1 e 30 pg, por 0,5 mL de dose humana. Além disso, nesta forma de realização uma composição adjuvante da invenção irá compreender um nível de 3D-MPL entre 1 e 30 pg, por 250 pL de composição adjuvante ou por 500 pL de composição adjuvante, dependendo se a composição adjuvante for pretendida 33 para ser combinada com uma composição antigénica liquido ou liofilizada, respectivamente.
Quando a composição imunogénica contém um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica, a composição adjuvante que compreende uma saponina na forma de um lipossoma contém ainda opcionalmente um derivado do lípido A, particularmente lípido A monofosforilo ou mais particularmente 3D-MPL. Nesta forma de realização, o 3D-MPL pode ser utilizado, por exemplo, numa quantidade de 1 a 100 pg (p/v) por dose de composição, de um modo preferido, numa quantidade de 10 a 50 pg (p/v) por dose de composição. Uma quantidade adequada de 3D-MPL é, por exemplo, qualquer de 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 pg (p/v) por dose de composição. De um modo mais preferido, a quantidade de 3D-MPL varia desde 25 a 75 pg (p/v) por dose de composição. Geralmente uma dose da composição irá variar desde cerca de 0,5 mL a cerca de 1 mL. Uma dose típica de vacina é 0,5 mL, 0,6 mL, 0,7 mL, 0,8 mL, 0,9 mL ou 1 mL. Numa forma de realização, uma concentração final de 50 pg de 3D-MPL está contida por mL de composição de vacina ou um 25 pg por dose de vacina de 0,5 mL. Noutra forma de realização, uma concentração final de 35,7 pg ou 71,4 pg de 3D-MPL está contida por mL de composição de vacina. Especificamente, um volume de dose de vacina de 0,5 mL contém 25 pg ou 50 pg de 3D-MPL por dose. A dose de 3D-MPL é adequadamente capaz de aumentar uma resposta imune a um antigénio num humano. Em particular, uma quantidade adequada de 3D-MPL é aquela que melhora o potencial imunológico da composição comparativamente à composição não adjuvada ou comparativamente à composição adjuvada com outra 34 quantidade de MPL, enquanto for aceitável a partir de um perfil de reactogenicidade.
As composições adequadas da invenção são aquelas em que os lipossomas são inicialmente preparados sem MPL (como descrito no documento WO 96/33739) e o MPL é depois adicionado, adequadamente como partículas pequenas abaixo de partículas de 100 nm ou partículas que são susceptíveis a filtração estéril através de uma membrana de 0,22 pm. O MPL não está, deste modo, contido numa membrana vesicular (conhecida como MPL out) . As composições em que o MPL está contido na membrana vesicular (conhecida como MPL in) também formam um aspecto da invenção. O antigénio pode estar contido na membrana vesicular ou contido fora da membrana vesicular. Adequadamente, os antigénios solúveis estão fora e os antigénios hidrofóbicos ou lipidados estão contidos dentro ou fora da membrana.
Numa forma de realização, a composição adjuvante da invenção compreende lipopolissacárido e saponina imunologicamente activa. Numa forma de realização específica da invenção, o lipopolissacárido é 3D-MPL e a saponina imunologicamente activa é QS21. Numa forma de realização adicional da invenção, a composição adjuvante consiste essencialmente de um lipopolissacárido e saponina imunologicamente activa numa formulação lipossomal. Apropriadamente, numa forma desta forma de realização, a composição adjuvante consiste essencialmente de 3D-MPL e QS21, opcionalmente com esterol que é, de um modo preferido, o colesterol.
Numa forma de realização adicional da invenção, a composição adjuvante compreende, numa formulação lipossomal, lipopolissacárido e saponina imunologicamente activa em combinação com um ou mais imunoestimuladores ou adjuvantes 35 adicionais. Apropriadamente, numa forma desta forma de realização, o lipopolissacárido é 3D-MPL e a saponina imunologicamente activa é QS21.
Numa forma de realização especifica, QS21 e 3D-MPL estão presentes na mesma concentração final por dose humana da composição imunogénica. Num aspecto desta forma de realização, uma dose humana da composição imunogénica compreende um nível final de 25 pg de 3D-MPL e 25 pg de QS21. Numa forma de realização adicional, uma dose humana de composição imunogénica compreende um nível final de 10 pg de cada um de MPL e QS21. Numa forma de realização específica adicional, é proporcionada uma composição adjuvante que tem um volume de 250 pL e compreendendo um nível de 25 pg de 3D-MPL e 25 pg de QS21, ou 10 pg de cada um de MPL e QS21.
Os antigénios que podem ser utilizados com as composições adjuvantes da presente invenção incluem antigénios virais, parasíticos, bacterianos ou associados a tumores, por exemplo:
Um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica para utilização de acordo com a presente invenção que pode ser um vírus da gripe fragmentado ou uma sua preparação antigénica de vírus fragmentado. Numa forma de realização alternativa, a preparação da gripe pode conter um outro tipo de antigénio gripal inactivado, tais como vírus inteiro inactivado ou HA e NA (subunidade de vacina) purificados ou um virossoma gripal. Ainda noutra forma de realização, o vírus da gripe pode ser uma preparação atenuada viva da gripe.
Um vírus da gripe fragmentado ou uma sua preparação antigénica do vírus fragmentado para a utilização de acordo com a presente invenção é adequadamente uma preparação de vírus 36 inactivado em que as partículas virais são fragmentadas com detergentes ou outros reagentes para solubilizar o envelope lípidico. 0 vírus fragmentado ou suas preparações antigénicas de virus fragmentado são adequadamente preparadas por fragmentação do vírus inteiro da gripe, infeccioso ou inactivado, com concentrações solubilizantes de solventes orgânicos ou detergentes e remoção subsequente de todo ou da maioria do agente solubilizante e de algum ou da maioria do material lipídico virai. Por sua preparação antigénica de vírus fragmentado entende-se uma preparação do virus fragmentado que pode ter sido submetida a algum grau de purificação comparativamente ao vírus fragmentado, enquanto retém a maioria das propriedades antigénicas dos componentes do vírus fragmentado. Por exemplo, quando produzido em ovos, o vírus fragmentado pode ser empobrecido em proteínas contaminantes do ovo ou quando produzido em cultura de células, o vírus fragmentado pode ser empobrecido em contaminantes da célula hospedeira. Uma preparação antigénica do vírus fragmentado pode compreender componentes antigénicos do vírus fragmentado de mais do que uma estirpe virai. As vacinas contendo vírus fragmentado (denominadas "vacina da gripe fragmentada") ou preparações antigénicas do vírus fragmentado contêm geralmente proteína da matriz e nucleoproteína residuais e, por vezes, lípido, assim como as proteínas do envelope da membrana. Tais vacinas do vírus fragmentado conterão geralmente a maioria ou todas as proteínas estruturais do vírus, embora não necessariamente nas mesmas proporções que ocorrem no vírus inteiro.
Alternativamente, o virus da gripe pode estar na forma de uma vacina de vírus inteiro: Isto pode provar ser uma vantagem sobre uma vacina de vírus fragmentado para uma situação epidémica, de modo a evitar a incerteza relativamente se uma vacina de vírus fragmentado pode ser produzida com sucesso para 37 uma nova estirpe de vírus da gripe. Para algumas estirpes, os detergentes convencionais utilizados para produzir o vírus fragmentado podem lesar o vírus e torná-lo inutilizável. Embora exista sempre a possibilidade de utilizar detergentes diferentes e/ou desenvolver um processo diferente para produzir uma vacina fragmentada, isto levaria tempo que pode não estar disponível numa situação de epidemia. Além do maior grau de certeza com uma abordagem de vírus inteiro, existe também uma maior capacidade de produção da vacina do que para o vírus fragmentado, uma vez que quantidades consideráveis de antigénio são perdidas durante passos adicionais de purificação necessários para preparar uma vacina fragmentada adequada.
Noutra forma de realização, a preparação do vírus da gripe é na forma de uma vacina de subunidade purificada de gripe. As vacinas de subunidade da gripe contêm geralmente as duas principais proteínas do envelope, HA e NA, e podem ter uma vantagem adicional sobre vacinas de virião inteiro, uma vez que são geralmente menos reactogénicas, particularmente em jovens vacinados. As vacinas de subunidade podem ser produzidas de forma recombinante ou purificadas a partir de partículas virais fragmentadas.
Noutra forma de realização, a preparação do vírus da gripe é na forma de um virossoma. Os virossomas são vesículas unilamelares esféricas que retêm as glicoproteínas do envelope virai HA e NA funcionais na conformação autêntica, intercaladas na bicamada membranar de fosfolípidos dos virossomas. 0 referido vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica podem ser derivados de ovo ou derivados de cultura de células. 38
Por exemplo, o antigénio do vírus da gripe ou as suas preparações antigénicas de acordo com a invenção podem ser derivados a partir do método convencional de ovo embrionado, por cultivo do vírus da gripe em ovos e purificação do líquido alantóico recolhido. Os ovos podem ser acumulados em grandes números a curto prazo. Alternativamente, podem ser derivados a partir de qualquer dos métodos de nova geração utilizando células ou cultura de células para cultivar o vírus ou para expressar antigénios recombinantes da superfície do vírus da gripe. Os substratos celulares adequados para cultivar o vírus, incluem, por exemplo, células de rim de cão, tais como MDCK, ou células de um clone de MDCK, células de tipo MDCK, células de rim de macaco, tal como células AGMK incluindo células Vero, linhas celulares de porco adequadas ou qualquer outro tipo de células de mamífero adequado para a produção do vírus da gripe para fins de vacina. Os substratos celulares adequados incluem também células humanas, e. g., células MRC-5. Os substratos celulares adequados não estão limitados às linhas celulares; por exemplo, estão também incluídas células primárias, tais como fibroblastos de embrião de galinha e linhas celulares aviárias. 0 antigénio do vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica podem ser produzidos por qualquer de uma variedade de processos comercialmente aplicáveis, por exemplo, o processo da gripe fragmentada descrito nas patentes n° DD300833 e DD211444. Tradicionalmente, a gripe fragmentada era produzida utilizando um tratamento de solvente/detergente, tal como fosfato de tri-n-butilo ou dietiléter em combinação com Tween™ (conhecido como fragmentação "Tween-éter") e este processo ainda é utilizado em algumas instalações de produção. Outros agentes de fragmentação agora utilizados, incluem detergentes ou enzimas proteolíticas ou sais biliares, por exemplo, desoxicolato de sódio como descrito na patente n° DD155875. Os detergentes que podem ser 39 utilizados como agentes de fragmentação incluem detergentes catiónicos, e. g., brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), outros detergentes iónicos, e. g., laurilsulfato, taurodesoxicolato ou detergentes não iónicos tal como aqueles descritos acima incluindo Triton X-100 (por exemplo, num processo descrito em Una et al. , 2000, Biologicals 28, 95-103) e Triton N-101, ou combinações de quaisquer dois ou mais detergentes. O processo de preparação para uma vacina fragmentada pode incluir uma variedade de diferentes passos de filtração e/ou outros de separação, tais como passos de ultracentrifugação, ultrafiltração, centrifugação zonal e cromatografia (e. g., permuta iónica) numa variedade de combinações e opcionalmente um passo de inactivação, e. g. , com calor, formaldeido ou β-propiolactona ou U.V. que podem ser realizados antes ou depois da fragmentação. 0 processo de fragmentação pode ser realizado como um processo descontinuo, continuo ou semi-continuo. Um processo de fragmentação e purificação preferido para uma composição imunogénica fragmentada é descrito no documento WO 02/097072.
As preparações antigénicas preferidas de vacina da gripe fragmentada, de acordo com a invenção, compreendem uma quantidade residual de Tween 80 e/ou Triton X-100 remanescente do processo de produção, embora estes possam ser adicionados ou as suas concentrações ajustadas após preparação do antigénio fragmentado. De um modo preferido, estão presentes Tween 80 e Triton X-100. As gamas preferidas para as concentrações finais destes tensioactivos não iónicos na dose de vacina são:
Tween 80: 0,01 a 1%, de um modo mais preferido cerca de 0,1% (v/v) 40 *Triton X-100: 0,001 a 0,1 (% p/v), de um modo mais preferido 0,005 a 0,02% (p/v).
Numa forma de realização específica, a concentração final para Tween 80 varia desde 0,025%-0,09% p/v. Noutra forma de realização específica, o antigénio é proporcionado como uma mistura 2 vezes concentrada que tem uma concentração de Tween 80 que varia desde 0, 025%-0,2% (p/v) e tem que ser diluído duas vezes após formulação final com o adjuvado (ou tampão na formulação de controlo).
Noutra forma de realização específica, a concentração final para Triton X-100 varia desde 0,004%-0,017% p/v. Noutra forma de realização específica, o antigénio é proporcionado como uma mistura 2 vezes concentrada que tem uma concentração de Triton X-100 que varia desde 0,005%-0,034% (p/v) e tem que ser diluído duas vezes após formulação final com o adjuvado (ou o tampão na formulação de controlo).
De um modo preferido, a preparação da gripe é preparada na presença de baixo nível de tiomersal ou, de um modo preferido, na ausência de tiomersal. De um modo preferido, a preparação da gripe resultante é estável na ausência de conservantes organomercúricos, em particular, a preparação não contém tiomersal residual. Em particular, a preparação do vírus da gripe compreende um antigénio de hemaglutinina estabilizado na ausência de tiomersal ou a baixos níveis de tiomersal (geralmente 5 pg/ mL ou menos) . Especificamente, a estabilização da estirpe de gripe B é realizada por um derivado de alfa tocoferol, tal como succinato de alfa tocoferol (também conhecido como succinato de vitamina E, i. e., VES). Tais preparações e métodos para os preparar são divulgados no documento WO 02/097072. 41
Uma composição preferida contém três antigénios de virião fragmentado inactivado preparado a partir das estirpes recomendadas da OMS da estação apropriada da gripe.
De um modo preferido, o virus da gripe ou uma sua preparação antigénica e o adjuvante de acordo com a invenção são contidos no mesmo recipiente. É referida como uma "abordagem de um único frasquinho". De um modo preferido, o frasquinho é uma seringa pré-cheia. Numa forma de realização alternativa, o virus da gripe ou uma sua preparação antigénica e o adjuvante de acordo com a invenção são contidos em recipientes ou frasquinhos separados e misturados imediatamente antes ou com a administração no indivíduo. É referida como uma "abordagem de dois frasquinhos". A título de exemplo, quando a vacina é uma vacina de 2 componentes para um volume total de dose de 0,7 mL, os antigénios concentrados (por exemplo, os antigénios de virião fragmentado inactivado trivalente concentrado) são apresentados num frasquinho (335 pL) (recipiente de antigénio) e uma seringa pré-cheia contém o adjuvante (360 pL) (recipiente de adjuvante). No momento da injecção, o conteúdo do frasquinho contendo os antigénios de virião fragmentado inactivado trivalente concentrado são removidos do frasquinho através da utilização de seringa contendo o adjuvante, seguida por mistura suave da seringa. Antes da injecção, a agulha utilizada é substituída por uma agulha intramuscular e o volume é corrigido para 530 pL. Neste exemplo, uma dose do candidato a vacina da gripe adjuvada reconstituída corresponde a 530 pL.
Num aspecto da invenção, nos casos em que existe uma composição multivalente, então, pelo menos uma estirpe da gripe, na referida composição imunogénica multivalente, como aqui definida, está associada com um surto epidémico ou tem o potencial para estar associada com um surto epidémico. Tal 42 estirpe pode também ser referida como "estirpes epidémicas" no texto abaixo. Em particular, quando a vacina é uma vacina multivalente, tais como uma vacina bivalente ou trivalente ou tetravalente, pelo menos uma estirpe está associada com um surto epidémico ou tem o potencial para estar associada com um surto epidémico. As estirpes adequadas são, mas não limitadas a: H5N1, H9N2, H7N7 e H2N2. 0 referido virus da gripe ou uma sua preparação antigénica é adequadamente multivalente, tais como bivalente ou trivalente ou tetravalente. De um modo preferido, o virus da gripe ou uma sua preparação antigénica é trivalente ou tetravalente, tendo um antigénio de três estirpes diferentes da gripe, estando, pelo menos, uma estirpe associada com um surto epidémico ou tendo o potencial para estar associada com um surto epidémico.
As caracteristicas de uma estirpe de virus da gripe que lhe dão o potencial para provocar um surto epidémico são: conter uma nova hemaglutinina comparativamente à hemaglutinina nas estirpes actualmente em circulação; ser capaz de ser transmitida horizontalmente na população humana; e ser patogénica para humanos. Uma hemaglutinina nova pode ser uma que não esteve evidente na população humana durante um período de tempo prolongado, provavelmente várias décadas, tal como H2. Ou pode ser uma hemaglutinina que não esteve em circulação na população humana anteriormente, por exemplo H5, H9, H7 ou H6 que são encontradas em aves. Em qualquer dos casos, a maioria ou, pelo menos, uma grande proporção ou mesmo a totalidade da população não tinha estado previamente em contacto com o antigénio e está imunologicamente naive ao mesmo. 43
Determinados grupos têm geralmente um risco aumentado de se tornarem infectados com gripe numa situação de epidemia. As pessoas idosas, os doentes crónicos e as crianças pequenas são particularmente susceptíveis, mas muitas pessoas jovens e aparentemente saudáveis estão também em risco. Para a gripe H2, a parte da população nascida após 1968 tem um risco aumentado. É importante para que estes grupos estejam protegidos eficazmente o mais cedo possivel e de um modo simples.
Outro grupo de pessoas que tem um risco aumentado são os viajantes. As pessoas viajam mais hoje do que em qualquer outra altura no passado e as regiões onde surge a maioria dos novos virus, China e sudeste Asiático, têm-se tornado destinos populares de viagens nos últimos anos. Esta alteração nos perfis de viagem permite aos novos virus alcançarem locais no globo numa questão de semanas, em vez de meses ou anos.
Assim para estes grupos de pessoas existe uma necessidade particular para vacinação de modo a proteger contra a gripe numa situação de epidemia ou numa potencial situação de epidémica. As estirpes adequadas são, mas não limitadas a: H5N1, H9N2, H7N7 e H2N2 .
Opcionalmente a composição pode conter mais do que três valências, por exemplo, três estirpes não epidémicas mais uma estirpe epidémica. Alternativamente, a composição pode conter três estirpes epidémicas. De um modo preferido, a composição contém três estirpes epidémicas. São também exemplos de antigénios para a composição imunogénica da invenção os antigénios estreptocócicos, tais como Streptococcus do grupo A ou Streptococcus do grupo B mas, de um modo muito preferido, de Streptococcus pneumoniae. De um modo 44 muito preferido, é utilizada, pelo menos, uma proteína e/ou, pelo menos, um antigénio sacarídico. 0, pelo menos, um antigénio proteico de Streptococcus pneumoniae é seleccionado, de um modo muito preferido, do grupo consistindo de: pneumolisina, PspA ou as suas variantes de deleção transmembranares, PspC ou as suas variantes de deleção transmembranares, PsaA ou as suas variantes de deleção transmembranares, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, CbpA ou as suas variantes de deleção transmembranares, PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl3 0 e Spl33, OU os seus equivalentes imunologicamente funcionais (por exemplo, fusões de domínios das proteínas acima, por exemplo, as proteínas de fusão PhtDE descritas nos documentos WO 01/98334 e WO 03/54007).
Determinadas composições são descritas nos documentos WO 00/56359 e WO 02/22167 e WO 02/22168. O antigénio pode compreender antigénios sacarídicos capsulares (de um modo preferido, conjugados a uma proteína veículo), em que os sacáridos (de um modo muito preferido, polissacáridos) são derivados de, pelo menos, quatro serotipos de pneumococos. Numa forma de realização, os quatro serotipos incluem 6B, 14, 19F e 23F. Numa forma de realização adicional, pelo menos, 7 serotipos estão incluídos na composição, por exemplo, aqueles derivados de serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F,
e 23F. Numa forma de realização adicional, pelo menos, 10 serotipos estão incluídos na composição, por exemplo, a composição numa forma de realização inclui sacáridos capsulares derivados de serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (de um modo preferido, conjugados a uma proteína veículo). Noutra forma de realização, a composição imunogénica compreende sacáridos capsulares derivados de serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Numa forma de realização preferida da 45 invenção, pelo menos 13 antigénios sacarídicos (de um modo preferido, conjugados a uma proteína veículo) estão incluídos, embora mais antigénios sacarídicos, por exemplo, de valência 23 (tais como os serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F) estão também contemplados pela invenção.
Embora os sacáridos acima estejam vantajosamente na sua forma polissacarídica nativa de tamanho total, deve ser entendido que também podem ser utilizados polissacáridos de tamanho reduzido que são ainda imunogénicos (ver, por exemplo, os documentos EP 497524 e 497525), se necessário quando acoplados a um veículo proteico.
Para a prevenção/melhoria da pneumonia na população idosa ( + 55 anos) e da Otite média em bebés (até 18 meses) e crianças pequenas (tipicamente 18 meses a 5 anos), é uma forma de realização preferida da invenção combinar um sacárido multivalente de Streptococcus pneumonia como aqui descrito, com uma proteína de Streptococcus pneumoniae seleccionada, de um modo preferido, do grupo de proteínas listado acima. Uma combinação de proteínas pneumocócicas pode também ser vantajosamente utilizada como descrito abaixo.
Proteínas Pneumocócicas
Os antigénios de Streptococcus pneumoniae são seleccionados, de um modo preferido, do grupo consistindo de: uma proteína da família da tríade de poli-histidina (Pht), uma proteína da família Lyt, uma proteína de ligação a colina, proteínas que têm um motivo LPXTG (em que X é qualquer aminoácido), proteínas que têm um motivo de sequência de sinal de Tipo II de LXXC (em que X 46 é qualquer aminoácido) e proteínas que têm um motivo de sequência de sinal de Tipo I. Os exemplos preferidos dentro destas categorias (ou motivos) são as seguintes proteínas (ou truncadas ou os seus equivalentes imunologicamente funcionais): A família Pht (Tríade de Poli-Histidina) compreende as proteínas PhtA, PhtB, PhtD e PhtE. A familia é caracterizada por uma sequência de lipidação, dois domínios separados por uma região rica em prolinas e várias tríades de histidina, possivelmente envolvidas em ligação de metal ou nucleósido ou actividade enzimática, (3-5) regiões de hélices enroladas, um N-terminal conservado e um C-terminal heterogéneo. Está presente em todas as estirpes de pneumococos testadas. Foram também encontradas proteínas homólogas noutros estreptococos e Neisseria. Os membros preferidos da família compreendem PhtA, PhtB e PhtD. De um modo mais preferido, compreendem PhtA ou PhtD. Contudo é entendido que os termos Pht A, B, D e E se referem a proteínas que têm sequências divulgadas nas citações abaixo, assim como as suas variantes de ocorrência natural (e sintéticas) que têm uma homologia de sequência que seja, pelo menos, 90% idêntica às proteínas referenciadas. De um modo preferido, seja, pelo menos, 95% idêntica e seja, de um modo muito preferido, 97% idêntica.
Relativamente às proteínas Pht, PhtA é divulgada no documento WO 98/18930 e é também referida como Sp36. Como assinalado acima, é uma proteína da família da tríade de poli-histidina e tem o motivo de sinal do tipo II de LXXC.
PhtD é divulgada no documento WO 00/37105 e é também referida como Sp036D. Como assinalado acima, é também uma proteína da família da tríade de poli-histidina e tem o motivo 47 de sinal do tipo II LXXC. PhtB é divulgada no documento WO 00/37105 e é também referida como Sp036B. Outro membro da família PhtB é o Polipéptido de Degradação de C3, como divulgado no documento WO 00/17370. Esta proteína é também da família da tríade de poli-histidina e tem o motivo de sinal do tipo II LXXC. Um equivalente imunologicamente funcional preferido é a proteína Sp42 divulgada no documento WO 98/18930. Um truncado de PhtB (aproximadamente 79 kD) é divulgado no documento W099/1567 que é considerado também um membro da família PhtX. A PhtE é divulgada no documento WO00/30299 e é referida como BVH-3. A SpsA é uma proteína de ligação a colina (Cbp) divulgada no documento WO 98/39450. A família Lyt consiste de proteínas associadas à membrana relacionadas com a lise celular. O domínio N-terminal compreende domínio (s) de ligação a colina, contudo a família Lyt não tem todas as características encontradas na família da proteína de ligação a colina (Cbp) assinalada abaixo e, assim, para a presente invenção, a família Lyt é considerada distinta da família Cbp. Contrariamente à família Cbp, o domínio C-terminal contém o domínio catalítico da família da proteína Lyt. A família compreende LytA, B e C. Relativamente à família Lyt, LytA é divulgada em Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987) . LytB é divulgada no documento WO 98/18930 e é também referida como Sp46. A LytC é também divulgada no documento WO 98/18930 e é também referida como Sp91. Um membro preferido dessa família é LytC.
Uma outra forma de realização preferida são proteínas truncadas da família Lyt (particularmente LytA), em que "Lyt" é definida acima e "truncadas" refere-se às proteínas que carecem de 50% ou mais da região de ligação a colina. De um modo preferido, tais proteínas carecem de toda a região de ligação a 48 colina. A Spl25 é um exemplo de uma proteína de superfície pneumocócica com o Motivo Ancorado à Parede Celular de LPXTG (em que X é qualquer aminoácido). Verificou-se que qualquer proteína dentro desta classe de proteínas de superfície pneumocócicas com este motivo é útil no contexto desta invenção e é considerada, deste modo, uma proteína adicional da invenção. A própria Spl25 é divulgada no documento WO 98/18930 e é também conhecida como ZmpB - uma metaloproteínase de zinco. A SplOl é divulgada no documento WO 98/06734 (em que tem a referência n° y85993) . É caracterizada por uma sequência de sinal de Tipo I. A Spl33 é divulgada no documento WO 98/06734 (em que tem a referência n° y85992). É também caracterizada por uma sequência de sinal de Tipo I. As Spl28 e Spl30 são divulgadas no documento WO 00/76540.
As proteínas utilizadas na presente invenção são seleccionadas, de um modo preferido, do grupo PhtD, PhtA e PhtE, ou uma combinação de 2 ou todas as 3 destas proteínas (i. e., PhtA+D, A+E, D+E ou A+D+E).
Antigénios proteicos pneumocócicos adicionais que podem ser incluídos são um ou mais do grupo consistindo de: pneumolisina (também referida como Ply; de um modo preferido, destoxifiçada por tratamento químico ou mutação) [documentos WO 96/05859, WO 90/06951, WO 99/03884], PsaA e as suas variantes de deleção transmembranares (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dez; 64(12):5255-62), PspA e as suas variantes de deleção transmembranares (documentos U.S. 5804193, WO 92/14488, WO 99/53940), PspC e as suas variantes de deleção transmembranares (documentos WO 97/09994, WO 99/53940), um membro da família da proteína de ligação a colina (Cbp) [e. g., CbpA e as suas variantes de deleção transmembranares (documentos WO 97/41151; WO 99/51266)], Gliceraldeído-3-fosfato- 49
Desidrogenase (Infect. Immun. 1996 64:3544), HSP70 (documento WO 96/40928), PcpA (Sanchez-Beato et al. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14), proteína de tipo M (pedido de patente EP 0837130 da SB) e adesina 18627 (pedido de patente EP 0834568 da SB) . A presente invenção abrange também equivalentes imunologicamente funcionais ou proteínas truncadas de tais proteínas (como acima definido).
Relativamente à família da Proteína de Ligação a Colina, os membros dessa família foram originalmente identificados como proteínas pneumocócicas que podiam ser purificadas por cromatografia de afinidade a colina. Todas as proteínas de ligação a colina estão ligadas não covalentemente a unidades de fosforilcolina de ácido teicóico da parede celular e ácido lipoteicóico associado à membrana. Estruturalmente têm várias regiões em comum com toda a família, embora a natureza exacta das proteínas (sequência de aminoácidos, comprimento, etc. ) possa variar. Em geral, as proteínas de ligação a colina compreendem uma região N-terminal (N), regiões de repetição conservadas (Rl e/ou R2) , uma região rica em prolina (P) e uma região de ligação a colina conservada (C), composta de múltiplas repetições que compreende aproximadamente metade da proteína. Como utilizada neste pedido, a expressão "família da Proteína de Ligação a Colina (Cbp)" é seleccionada do grupo consistindo de Proteínas de Ligação a Colina como identificadas no documento WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD e CbpG. A CbpA é divulgada no documento WO 97/41151. As CbpD e CbpG são divulgadas no documento WO 00/29434. A PspC é divulgada no documento WO 97/09994. A PbcA é divulgada no documento WO 98/21337. De um modo preferido, as Proteínas de Ligação a Colina são seleccionadas do grupo consistindo de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. 50
Se uma Cbp for a proteína adicional utilizada, esta pode ser uma Cbp truncada, em que "Cbp truncada" é definida acima e "truncada" refere-se às proteínas que carecem de 50% ou mais da região de ligação a colina (C) . De um modo preferido, tais proteínas carecem de toda a região de ligação a colina. De um modo mais preferido, tal proteína truncada carece (i) da região de ligação a colina e (ii) assim como uma porção da metade do N-terminal da proteína, contudo retém, pelo menos, uma região de repetição (RI ou R2). De um modo ainda mais preferido, a proteína truncada tem 2 regiões de repetição (RI e R2) . Os exemplos de tais formas de realização preferidas são NRlxR2, RlxR2, NRlxR2P e RlxR2P como ilustrados nos documentos W099/51266 ou W099/51188, contudo, outras proteínas de ligação a colina que carecem de uma região semelhante de ligação a colina estão também contempladas no âmbito desta invenção.
As proteínas quiméricas Cbp truncada-Lyt truncada (ou fusões) podem também ser utilizadas na composição de invenção. De um modo preferido, estas compreendem NRlxR2 (ou RlxR2 ou NRlxR2P ou RlxR2P) de Cbp e a porção C-terminal (Cterm, i. e., carecendo dos domínios de ligação a colina) de Lyt (e. g.,
LytCCterm ou Sp91 Cterm) . De um modo mais preferido, a Cbp é seleccionada do grupo consistindo de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. De um modo ainda mais preferido, é CbpA. De um modo preferido, Lyt é LytC (também referida como Sp91). Pode também ser utilizada uma PspA ou PsaA truncada carecendo do domínio de ligação a colina (C) e expressa como uma proteína de fusão com Lyt. De um modo preferido, Lyt é LytC.
Numa composição pneumocócica é possível combinar diferentes proteínas pneumocócicas da invenção. De um modo preferido, a combinação de proteínas da invenção é seleccionada de 2 ou mais (3 ou 4) categorias diferentes, tal como proteínas que têm um 51 motivo de sequência de sinal de Tipo II de LXXC (em que X é qualquer aminoácido, e. g., a família da tríade de poli-histidina (Pht)), proteínas de ligação a colina (Cbp), proteínas que têm um motivo de sequência de sinal de Tipo I (e. g., SplOl), proteínas que têm um motivo LPXTG (em que X é qualquer aminoácido, e. g., Spl28, Spl30), toxinas (e. g., Ply) , etc. Os exemplos preferidos dentro destas categorias (ou motivos) são as proteínas mencionadas acima ou os seus equivalentes imunologicamente funcionais. São combinações de categoria preferidas Toxina + Pht, Toxina + Cbp, Pht + Cbp e Toxina + Pht + Cbp. As combinações benéficas preferidas incluem, mas não estão limitadas a, PhtD + NRlxR2, PhtD + NRlxR2-Sp9ICterm quiméricas ou proteínas de fusão,
PhtD + Ply, PhtD + Spl28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, PhtA + NRlxR2-Sp9ICterm quiméricas ou proteínas de fusão, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, . NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl28, RlxR2 + LytC, RlxR2 + PspA, RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA. De um modo preferido, NRlxR2 (ou RlxR2) são de CbpA ou PspC. De um modo mais preferido, é de
CbpA.
Uma combinação particularmente preferida de proteínas pneumocócicas compreende Ply (ou uma proteína truncada ou seu equivalente imunologicamente funcional) + PhtD (ou uma proteína truncada ou seu equivalente imunologicamente funcional) opcionalmente com NRlxR2 (ou RlxR2 ou NRlxR2P ou RlxR2P). De um modo preferido, NRlxR2 (ou RlxR2 ou NRlxR2P ou RlxR2P) são de CbpA ou PspC. De um modo mais preferido, é de CbpA. 0 antigénio pode ser um conjugado sacarídico pneumocócico compreendendo antigénios polissacarídicos derivados de, pelo menos, quatro serotipos, de um modo preferido, pelo menos, sete 52 serotipos, de um modo mais preferido, pelo menos, dez serotipos, e, pelo menos, uma mas, de um modo preferido, 2, 3 ou 4 proteínas de Streptococcus pneumoniae seleccionadas, de um modo preferido, do grupo de proteínas descrito acima. De um modo preferido, uma das proteínas é PhtD (ou um seu equivalente imunologicamente funcional) e/ou Ply (ou um seu equivalente imunologicamente funcional).
Um problema associado com a abordagem polissacarídica para vacinação é o facto dos polissacáridos per se serem poucos imunogénicos. Para superar isto, os sacáridos podem ser conjugados a veículos proteicos que proporcionam ajuda de células T presentes. É preferido, deste modo, que os sacáridos utilizados na invenção estejam ligados a tal veículo proteico. Os exemplos de tais veículos que são, geralmente, actualmente utilizados para a produção de imunogénios sacarídicos incluem os toxóides da difteria e tétano (DT, DT CRM197 e TT, respectivamente), Hemocianina do Caramujo (KLH), OMPC de N. meningitidis e o derivado proteico purificado de tuberculina (PPD).
Um veículo preferido para as composições imunogénicas (ou vacinas) baseadas em sacárido pneumocócico é a proteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 594610-B) ou os seus fragmentos. Os fragmentos adequados para utilização incluem fragmentos que incluem epitopos de T-auxiliar. Em particular, um fragmento da proteína D conterá, de um modo preferido, 1/3 do N-terminal da proteína. Um veículo de proteína D é útil como um veículo nas composições em que são conjugados múltiplos antigénios sacarídicos pneumocócicos. Um ou mais sacáridos pneumocócicos numa combinação podem ser vantajosamente conjugados na proteína D. Um veículo preferido adicional para o sacárido pneumocócico é a própria proteína pneumocócica (como 53 definida acima na secção de "Proteínas Pneumocócicas da invenção"). 0 sacárido pode ser ligado à proteína veiculo por qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S 4372945 e por Armor et al ., Patente U.S 4474757) . De um modo preferido, é realizada conjugação com CDAP (documento WO 95/08348). De um modo preferido, a razão proteína:sacárido (pesorpeso) dos conjugados é 0,3:1 a 1:1, de um modo mais preferido, 0,6:1 a 0,8:1 e , de um modo muito preferido, cerca de 0,7:1.
As composições particularmente preferidas da invenção compreendem um ou mais sacáridos pneumocócicos conjugados e uma ou mais proteínas pneumocócicas da invenção. Além disso, os sacáridos e proteínas pneumocócicos podem ser estavelmente armazenados como componentes em bruto, adsorvidos sobre fosfato de alumínio numa forma líquida.
Noutro aspecto da invenção, a composição de vacina pode compreender um antigénio de citomegalovírus humano (HCMV). O HCMV é um vírus de ADN humano que pertence à família dos vírus herpes e é uma importante causa de defeitos congénitos em recém nascidos e também provoca estados clínicos sérios em doentes imunocomprometidos. A doença clínica provoca uma variedade de sintomas incluindo febre, hepatite, pneumonite e mononucleose infecciosa.
Numa forma de realização, o antigénio de HCMV é uma proteína de fusão quimérica ou um seu derivado imunogénico compreendendo uma porção de uma glicoproteína de HCMV fundida a uma porção de uma glicoproteína de HSV. A glicoproteína de HCMV é tipicamente gB e a glicoproteína de HSV é tipicamente gD, em particular HSV de tipo 2 gD (gD2). A fusão é tipicamente entre um aminoácido na 54 parte do N-terminal de uma porção da proteína gB de HCMV e um aminoácido no C-terminal de uma porção da proteína gD de HSV. Os componentes da proteína gB de HCMV e da proteína gD de HSV da proteína de fusão podem carecer de um domínio de âncora membrananar. A porção da proteína gB de HCMV pode compreender uma forma não clivável de gB de HCMV. Adequadamente, isto é conseguido por alteração de um ou mais aminoácidos num local de clivagem da proteína, por exemplo, pela troca de Arg458 e Arg459 por Glu e Thr, respectivamente. A porção da proteína de HSV pode compreender a sequência de sinal de gD2 (aminoácidos 1 a 25) e, opcionalmente, os aminoácidos 26 a 52 de gD2 e/ou a sequência de gD2 que é PEDSALLEDPED ou os seus equivalentes funcionais que podem ser mais curtos ou longos. Podem ser adicionadas sequências adicionais de gD HSV à proteína de fusão, por exemplo, no C-terminal da proteína gB de HCMV.
Numa forma de realização, a proteína de fusão compreende os aminoácidos 1 a 52 da proteína gD2 de HSV fundida aos resíduos 28 a 685 da proteína gB de HCMV. Tal proteína de fusão é designada gB685* de HCMV. Numa forma de realização adicional, a sequência de aminoácidos PEDSALLEDPED que é derivada de uma sequência interna de gD2, pode ser incluída na extremidade C-terminal da proteína gB685* de HCMV para produzir a proteína designada gB685** de HCMV. Estas proteínas de fusão especificas são descritas mais detalhadamente no documento WO 95/31555.
Outro imunogénio adequado para utilização como uma vacina de HCMV é pp65, uma proteína de matriz de HCMV como descrita no documento WO 94/00150 (City of Hope). 55
Numa forma de realização adicional da presente invenção, as composições imunogénicas contêm um antigénio ou uma preparação antigénica derivada do Vírus Papilloma Humano (HPV) considerado ser responsável por verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros) e/ou os vírus HPV responsáveis pelo cancro do colo do útero (HPV16, HPV18 e outros).
Numa forma de realização, as composições terapêuticas ou profilácticas para a forma de verruga genital compreendem partículas LI ou capsómeros, e proteínas de fusão compreendendo um ou mais antigénios seleccionados das proteínas de HPV El, E2, E5, E6, E7, LI e L2.
Numa forma de realização, as formas de proteína de fusão são: L2E7 como divulgada no documento WO 96/26277 e proteínaD(1/3)-E7 divulgada no documento GB 9717953.5 (documento PCT/EP98/05285).
Uma composição terapêutica ou profiláctica preferida do cancro ou infecção do colo do útero de HPV pode compreender antigénios de HPV 16 ou 18. Por exemplo, os monómeros antigénicos LI ou L2, ou os antigénios LI ou L2 apresentados conjuntamente como uma partícula de tipo virai (VLP) ou a proteína LI sozinha apresentada numa VLP ou estrutura de capsómero. Tais antigénios, partículas de tipo virai e capsómeros são conhecidos per se. Ver, por exemplo, os documentos W094/00152, WO94/20137, WO94/05792 e WO93/02184.
Podem ser incluídas proteínas precoces adicionais, sozinhas ou como proteínas de fusão, tais como E7, E2 ou, de um modo preferido, E5 por exemplo; as formas de realização particularmente preferidas desta invenção incluem uma VLP 56 compreendendo as proteínas de fusão LI E7 (documento WO 96/11272).
Numa forma de realização, os antigénios de HPV 16 compreendem as proteínas precoces E6 ou E7 em fusão com um veículo de proteína D para formar as fusões proteína D - E6 ou E7 de HPV 16, ou suas combinações; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (documento WO 96/26277).
Alternativamente, as proteínas precoces E6 e E7 de HPV 16 ou 18 podem ser apresentadas numa única molécula, de um modo preferido, uma fusão de proteína D-E6/E7. Tal composição pode conter, opcionalmente, cada uma ou ambas as proteínas E6 e E7 de HPV 18, de um modo preferido, na forma de uma proteína de fusão proteína D-E6 ou proteína D-E7, ou proteína de fusão proteína D-E6/E7. A composição da presente invenção pode adicionalmente compreender antigénios de outros tipos de HPV, de um modo preferido, de HPV 31 ou 33.
Os tipos de HPV oncogénico incluem HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. Assim, a composição da presente invenção pode compreender antigénios de um ou mais destes tipos de HPV, além de HPV 16 e/ou HPV 18.
Os VLP ou capsómeros de HPV LI úteis na invenção podem compreender ou consistir de LI de tamanho total ou um fragmento imunogénico de Ll. Nos casos em que o VLP ou capsómero compreende ou consiste de um fragmento imunogénico de Ll, então os fragmentos imunogénicos adequados de HPV Ll, incluem mutantes de truncamento, deleção, substituição ou inserção de Ll. Tais fragmentos imunogénicos são adequadamente capazes de aumentar 57
uma resposta imune, sendo a referida resposta imune capaz de reconhecer uma proteína LI, tal como uma partícula de tipo virai, do tipo de HPV da qual a proteína LI foi derivada. Os fragmentos LI imunogénicos adequados incluem proteínas LI truncadas. Num aspecto, o truncamento remove um sinal de localização nuclear. Noutro aspecto, o truncamento é um truncamento do C-terminal. Num aspecto adicional, o truncamento C-terminal remove menos de 50 aminoácidos, tal como menos de 40 aminoácidos. Nos casos em que LI é de HPV 16, então noutro aspecto, o truncamento C-terminal remove 34 aminoácidos de LI de HPV 16. Nos casos em que LI é de HPV 18, então num aspecto adicional, o truncamento C-terminal remove 35 aminoácidos de LI de HPV 18.
As sequências LI truncadas adequadas de HPV 16 e 18 são apresentadas no documento WO 06/114312. A sequência de HPV 16 pode também ser aquela divulgada nos documentos WO9405792 ou US6649167, por exemplo, truncada adequadamente. Truncadas adequadamente são truncadas numa posição equivalente àquela discutida acima, como avaliada por comparação de sequências. Uma sequência alternativa de HPV 18 é divulgada no documento W09629413 que pode ser truncada adequadamente. Truncadas adequadamente são truncadas numa posição equivalente àquela descrita acima, como avaliada por comparação de sequências.
Outras sequências de HPV 16 e HPV 18 são bem conhecidos na técnica e podem ser adequadas para utilização na presente invenção.
Nos casos em que existe uma proteína LI de outro tipo de HPV, então podem ser utilizados truncamentos de C-terminal que correspondem àqueles realizados para HPV 16 e HPV 18, com base em alinhamentos de sequência de ADN ou proteína. Os truncamentos 58 adequados das proteínas Ll de HPV 31 e 45 são apresentados no documento WO 06/114312.
Os truncamentos adequados de, por exemplo, HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68 podem também ser realizados, num aspecto, removendo porções C-terminais equivalentes da proteína Ll àquelas descritas acima, como avaliado por alinhamento de sequências. A proteína Ll ou o fragmento imunogénico da invenção podem estar opcionalmente na forma de uma proteína de fusão, tal como a fusão da proteína Ll com L2 ou uma proteína precoce. A proteína Ll de HPV está adequadamente na forma de um capsómero ou partícula de tipo virai (VLP) . Num aspecto, as VLP de HPV podem ser utilizadas na presente invenção. As VLP de HPV e métodos para a produção de VLP são bem conhecidos na técnica. As VLP são tipicamente construídas a partir de proteínas estruturais Ll e, opcionalmente, L2 do vírus, ver, por exemplo, documentos WO9420137, US5985610, W09611272, US6599508B1, US6361778B1, EP 595935. Qualquer VLP adequada de HPV pode ser utilizada na presente invenção para proporcionar protecção cruzada, tal como uma VLP de Ll ou Ll + L2.
Apropriadamente, a VLP é uma VLP de apenas Ll. A composição de invenção pode conter uma combinação de VLP de HPV 16 Ll e de VLP de HPV 18 Ll, ou uma combinação de VLP de HPV Ll de HPV 16, 18, 31 e 45, ou combinações maiores, e inclui VLP de Ll de HPV 16 e 18 ou HPV 16, 18, 31 e 45, ou combinações maiores, em que Ll é opcionalmente truncado como aqui descrito. 59
Numa forma de realização particular da invenção, um ou mais antigénios adicionais de tipos de HPV causadores de cancro são utilizados com antigénios de HPV 16 e/ou 18, sendo os antigénios seleccionados dos seguintes tipos de HPV: HPV 31, 45, 33, 58 e 52. Como aqui descrito, o antigénio pode ser em cada caso Li, por exemplo, na forma de VLP ou capsómeros de Li. Assim, os antigénios de HPV para utilização nas composições, métodos e utilizações aqui descritas podem compreender ou consistir de VLP ou capsómeros de Li de HPV 16, 18, 31, 45, 33, 58 e 52.
As VLP de Li podem ser VLP apenas de Li ou em combinação com outro antigénio, tal como L2 em VLP de Li + L2. A proteína LI pode ser adequadamente truncada como aqui descrito. A formação de VLP pode ser avaliada por técnicas padrão, por exemplo, microscopia electrónica e difusão dinâmica de radiação laser. A VLP pode compreender a proteína Ll de tamanho total. Num aspecto, a proteína Ll utilizada para formar a VLP é uma proteína Ll truncada, como descrito acima.
As VLP podem ser produzidas em qualquer substrato celular adequado, tais como células de levedura ou células de insecto, e. g. , num sistema de expressão de baculovírus, e as técnicas para preparação de VLP são bem conhecidas no campo técnico, tal como os documentos WO9913056, U.S. 6416945B1, U.S. 6261765B1 e US6245568, e referências aí.
As VLP podem ser produzidas por técnicas de desmontagem e remontagem que podem proporcionar VLP de papillomavírus mais estáveis e/ou homogéneas. Por exemplo, McCarthy et al. , 1998 "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavírus 60
Type 11 Vírus Like Particles in Vitro" J. Virology 72(1):33-41, descrevem a desmontagem e a remontagem de VLPs de LI HPV 11 recombinante purificado de células de insecto, de modo a obter uma preparação homogénea de VLP. Os documentos WO9913056 e US6245568 também descrevem processos de desmontagem/remontagem para produzir VLP de HPV.
Num aspecto, as VLPS de HPV são produzidas como descrito nos documentos WO9913056 ou US6245568
As composições da presente invenção podem compreender antigénios ou preparações antigénicas derivadas de parasitas que provocam a malária, tais como Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. Por exemplo, os possíveis antigénios derivados de Plasmodium falciparum incluem a proteína circunsporozoíta (proteína do CS), RTS,S, MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMAI e TRAP. A RTS é uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a porção C-terminal da proteína circunsporozoíta (CS) de P. falciparum ligada através de quatro aminoácidos da porção preS2 do antigénio de superfície da hepatite B ao antigénio de superfície (S) do vírus da Hepatite B. A sua estrutura completa é divulgada no Pedido de Patente Internacional N° PCT/EP92/02591, publicado sob o Número WO 93/10152 que reivindica prioridade do pedido de patente UK N° 9124390.7. Quando expressa em levedura, a RTS é produzida como uma partícula lipoproteica e quando é co-expressa com o antigénio S de HBV produz uma partícula mista conhecida como RTS,S. Os antigénios TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional N° PCT/GB89/00895, publicado sob o N° WO 90/01496. Uma forma de realização preferida da presente invenção é uma vacina de malária em que a preparação antigénica compreende uma combinação dos antigénios RTS,S e TRAP. Outros antigénios de plasmódios que são candidatos prováveis para serem componentes de uma vacina 61 multi-fase da malária são MSP1, AMAI, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, PfEMPl, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPl, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs,16, Pfs48/45, Pfs230 de P. faciparum e os seus análogos em Plasmodium spp. Uma forma de realização da presente invenção é uma composição compreendendo RTS,S ou proteína CS ou um seu fragmento, tal como a porção CS de RTS,S em combinação com um ou mais antigénios maláricos adicionais que podem ser seleccionados, por exemplo, do grupo consistindo de MSP1, MSP3, AMAI, LSA1 ou LSA3. Os possíveis antigénios de P. vivax incluem a proteína circunsporozoíta (proteína CS) e a proteína de ligação ao antigénio de Duffy e os seus fragmentos, tal como PvRII (ver, e. g. , documento WO02/12292).
Outros antigénios possíveis que podem ser utilizados nas composições imunogénicas da presente invenção incluem:
Antigénios estreptocócicos, tais como antigénios de Streptococcus do Grupo A ou Streptococcus do Grupo B, são adequadamente derivados de HIV-1, (tais como o antigénio F4 ou os seus fragmentos, ou gag ou os seus fragmentos, tais como p24, tat, nef, gpl20 ou gpl60 ou fragmentos de qualquer um destes), vírus de herpes humano, tais como gD ou os seus derivados ou proteína imediatamente precoce, tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus ((esp Human)(tal como gB ou os seus derivados), Rotavirus (incluindo vírus vivos atenuados), vírus Epstein Barr (tal como gp350 ou os seus derivados), vírus Varícella zoster (tal como gpl, II e IE63) ou de um vírus da hepatite, tal como o vírus da hepatite B (por exemplo, o antigénio de superfície da hepatite B ou um seu derivado) , vírus da hepatite A, vírus da hepatite C e vírus da hepatite E, ou de outros patogéneos virais, tais como paramixovírus: Vírus Sincicial Respiratório (tais como 62 as proteínas F, N e G ou os seus derivados), vírus parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da papeira, vírus do papilloma humanos (por exemplo HPV6, 11, 16, 18), flavivírus (e. g., vírus da Febre Amarela, vírus de Dengue, vírus da encefalite da carraça, vírus da encefalite japonesa) ou vírus da gripe (vírus inteiro vivo ou inactivado, vírus da gripe fragmentado, cultivados em ovos ou células MDCK, ou virossomas de gripe inteira (como descritos por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou as suas proteínas purificadas ou recombinantes, tais como proteínas HA, NP, NA ou M, ou suas combinações), ou derivados de patogéneos bacterianos, tais como Neisseria spp, incluindo N. gonorrhea e N. meningitidis (por exemplo, sacáridos capsulares e os seus conjugados, proteínas de ligação a transferrina, proteínas de ligação a lactoferrina, PilC, adsinas,); S. Pyogenes (por exemplo, proteínas M ou os seus fragmentos, protease C5A, ácidos lipoteicóicos), S. agalactiae, S. mutans; H. Ducreyi; Moraxella spp, incluindo M. catarrhalis, também conhecida como Branhamella catarrhalis (por exemplo, adesinas e invasinas de peso molecular baixo e elevado); Bordetella spp, incluindo, B. pertussis (por exemplo pertactina, toxina de pertussis ou os seus derivados, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fimbriae), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluindo M. tuberculosis (por exemplo ESAT6, Antigénio 85A, -B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L. pneumophila; Escherichia spp, incluindo E. coli enterotóxica (por exemplo, factores de colonização, toxina termolábil ou os seus derivados, toxina termoestável ou os seus derivados), E. coli entero-hemorrágica, E. coli enteropatogénica (por exemplo toxina do tipo toxina shiga ou os seus derivados) ; 63
Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo toxina da cólera ou os seus derivados); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo uma proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo, toxinas adesinas e invasinas) e C. coli; Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listería spp., incluindo L. monocitogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo, urease, catalase, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluindo E. faecalis, E. faecium; Clostrídium spp., incluindo C. tetani (por exemplo toxina tetânica e os seus derivados), C. botulinum (por exemplo, toxina botulínica e os seus derivados), C. difficile (por exemplo, toxinas A ou B de Clostrídium e os seus derivados); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo, toxina botulínica e os seus derivados); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo, toxina diftérica e os seus derivados); Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por exemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo E. equi e o agente da Erliquiose Granulocítica Humana; Rickettisia spp, incluindo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação a heparina), C. pneumoniae (por exemplo, MOMP, proteínas de ligação a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo, as raras proteínas da membrana externa), 64 T. denticola, Τ. hyodysenteriae; ou derivados de parasitas, tais como Plasmodium spp., incluindo P. falcíparum; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica;
Babesia spp., incluindo B. microti; Tripanosoma spp., incluindo T. cruzi; Giardia spp., incluindo G. lamblia; Leshmania spp., incluindo L. major; Pneumocistis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluindo S. mansoni, ou derivados de levedura, tais como Candida spp., incluindo C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.
Outros antigénios específicos preferidos para M. tuberculosis são, por exemplo, Tb Ral2, Tb H9, Tb Ra35, Tb3 8-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCCl (documento WO 99/51748), Mtb72F e M72. As proteínas para M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e as suas variantes em que, pelo menos, dois, de um modo preferido, três polipéptidos de M. tuberculosis estão fundidos numa proteína maior. As fusões preferidas incluem Ral2-TbH9-Ra35, Erdl4-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2 , Erdl4-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2,
TbH9-DPV-MTI (documento WO 99/51748). Uma sequência
Ral2-Tbh9-Ra35 particular que pode ser mencionada é definida pela SEQ ID N° 6 do documento W02 0 06 /1172 40 conjuntamente com variantes em que a Ser704 dessa sequência é mutada para outro aminoácido à excepção de Serina, e. g. , Ala, e os seus derivados, que incorporam um marcador His no N-terminal de um comprimento apropriado (e. g. , SEQ ID N° 2 ou 4 do documento W02 0 06/117240) .
Os antigénios exemplificativos para Chlamydia sp, e. g. , C. trachomatis são seleccionados de CT858, CT089, CT875, MOMP, 65 CT622, PmpD, PmpG e os seus fragmentos, SWIB e fragmentos imunogénicos de qualquer um dos anteriores (tais como PmpDpd e PmpGpd) e as suas combinações. As combinações preferidas de antigénios incluem CT858, CT089 e CT875. As sequências e combinações especificas que podem ser utilizadas são descritas no documento W02006/104890. As composições bacterianas preferidas compreendem antigénios derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae tipo B (por exemplo PRP e seus conjugados), H. influenzae não tipáveis, por exemplo, OMP26, adesinas de elevado peso molecular, P5, P6, proteína D e lipoproteina D, e fimbrina e péptidos derivados de fimbrina (documento U.S. 5843464) ou variantes de múltiplas cópias ou as suas proteínas de fusão. Os derivados do antigénio de superfície da hepatite B são bem conhecidos na técnica e incluem, inter alia, aqueles antigénios S PreSl, PreS2 descritos nos Pedidos de Patente Europeia EP-A-414374; EP-A-0304578 e EP198474. Num aspecto preferido, a formulação de vacina da invenção compreende o antigénio HIV-1, gpl20, especialmente quando expresso em células CHO. Numa forma de realização adicional, a composição de invenção compreende gD2t como aqui definido abaixo.
As composições podem também conter um antigénio antitumoral e serem úteis para o tratamento imunoterapêutico de cancros. Por exemplo, o antigénio pode ser antigénios de rejeição tumoral, tais como aqueles para cancros da próstata, mama, colorrectal, pulmão, pancreático, renal ou melanoma. Os antigénios exemplificativos incluem MAGE 1, 3 e MAGE 4 ou outros antigénios MAGE tal como divulgados no documento WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (também conhecido como NY Eos 1), SAGE e HAGE (documento WO 99/53061) ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinicai & Laboratory Research 66 (submetido em 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Câncer Institute 89, p293. De facto, estes antigénios são expressos numa vasta gama de tipos de tumor, tais como melanoma, carcinoma do pulmão, sarcoma e carcinoma da bexiga.
Os antigénios MAGE para utilização na presente invenção podem ser expressos como uma proteína de fusão com um intensificador de expressão ou um parceiro de fusão imunológico. Em particular, a proteína Mage pode ser fundida à Proteína D de Heamophilus infuenzae B ou um seu derivado lipidado. Em particular, o parceiro de fusão pode compreender o primeiro 1/3 da Proteína D. Tais construções são divulgadas no documento WO 99/40188.
Outros antigénios específicos de tumor incluem, mas não estão limitados a, gangliósidos específicos de tumor KSA (GA733), tais como GM 2 e GM3 ou os seus conjugados com proteínas veículo; ou o referido antigénio pode ser uma hormona peptídica, tal como a hormona libertadora de hormona Gonadotrofina de tamanho total (GnRH, documento WO 95/20600), um péptido curto de 10 aminoácidos, úteis no tratamento de muitos cancros ou na imunocastração.
Numa forma de realização preferida, são utilizados antigénios da próstata, tais como antigénio específico da Próstata (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95(4) 1735 -1740 1998), PSMA ou o antigénio conhecido como Prostase. A Prostase é uma protease de serina específica da próstata (tipo tripsina), de 254 aminoácidos de comprimento, com uma tríade catalítica H-D-S de serina protease conservada e uma sequência amino-terminal de pré-propéptido, indicando uma potencial função secretória (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. 67
Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression", em Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1999) 96, 3114-3119) . Foi descrito um local putativo de glicosilação. A estrutura prevista é muito semelhante a outras serina proteases conhecidas, mostrando que o polipéptido maduro se enrola num único domínio. A proteína madura tem 224 aminoácidos de comprimento, com um epitopo A2 que mostrou ser processado naturalmente. A sequência de nucleótidos e a sequência polipeptídica deduzida da Prostase e homólogos são divulgados em Ferguson, et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999, 96, 3114-3119) e nos Pedidos de Patente Internacional N° WO 98/12302 (e também a correspondente patente U.S. 5955306 concedida), WO 98/20117 (e também as correspondentes patentes U.S. 5840871 e U.S. 5786148 concedidas) (calicreína específica da próstata) e WO 00/04149 (P703P). A presente invenção proporciona composições compreendendo fusões da proteína prostase com base na proteína prostase e os seus fragmentos e homólogos ("derivados"). Tais derivados são adequados para utilização em formulações de vacina terapêuticas que são adequadas para o tratamento de tumores da próstata. Tipicamente, o fragmento irá conter, pelo menos, 20, de um modo preferido, 50, de um modo mais preferido, 100 aminoácidos contíguos, como divulgado na patente e pedidos de patente referenciados acima.
Um antigénio da próstata preferido adicional é conhecido como P501S, sequência ID N° 113 do documento W098/37814. Os seus fragmentos e porções imunogénicos compreendendo, pelo menos, 20, de um modo preferido, 50, de um modo mais preferido, 100 aminoácidos contíguos, como divulgado no pedido de patente 68 referenciado acima. Ver, por exemplo, PS108 (documento WO 98/50567) .
Outros antigénios específicos da próstata são conhecidos a partir dos documentos W098/37418 e WO/004149. Outro é STEAP PNAS 96 14523-14528 7-12 1999.
Outros antigénios associados a tumores, úteis no contexto da presente invenção incluem: Plu-1 J. Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999, HASH-1, Hash-2, Cripto (Salomon et al. Bioessays 199, 21 61-70, patente U.S. 5654140), Criptina patente U.S. 981215. Adicionalmente, os antigénios particularmente relevantes para terapia do cancro também compreendem tirosinase e survivina.
Os péptidos derivados de Mucina, tais como Mucl, ver, por exemplo, documentos U.S. 5744144 U.S. 5827666, WO 8805054, U.S. 4963484. Estão especificamente contemplados péptidos derivados de Muc 1 que compreendem, pelo menos, uma unidade de repetição do péptido Muc 1, de um modo preferido, pelo menos, duas dessas repetições e que são reconhecidas pelo anticorpo SM3 (documento U.S. 6054438). Outros péptidos derivados de mucina incluem o péptido de Muc 5. O antigénio da invenção pode ser antigénios do cancro da mama, tais como her 2/Neu, mamaglobina (patente U.S. 5668267) ou aqueles divulgados nos documentos WO/0052165, W099/33869, W099/19479, WO 98/45328. Os antigénios her2/Neu são divulgados, inter alia, na patente U.S. 5801005. De um modo preferido, o her2/Neu compreende a totalidade do domínio extracelular (compreendendo aproximadamente 1-645 aminoácidos) ou seus fragmentos e, pelo menos, uma porção imunogénica ou a totalidade do domínio intracelular, aproximadamente 580 aminoácidos do 69 C-terminal. Em particular, a porção intracelular deve compreender o domínio de fosforilação ou os seus fragmentos. Tais construções são divulgadas no documento WOOO/44899. Uma construção particularmente preferida é conhecida como ECD PD, uma segunda é conhecida como ECD PD, ver o documento WO/OO/44899. 0 her 2/Neu como aqui utilizado pode ser derivado de rato, murganho ou humano.
As composições podem conter antigénios associados com mecanismos de suporte de tumores (e. g., angiogénese, invasão tumoral), por exemplo, tie 2, VEGF. É previsto que as composições da presente invenção possam utilizar antigénios derivados de Borrelia sp. Por exemplo, os antigénios podem incluir ácidos nucleicos, antigénio ou preparações antigénicas derivados de patogéneo, proteína ou péptidos produzidos recombinantmente e proteínas de fusão quiméricas. Em particular, o antigénio é OspA. A OspA pode ser uma proteína totalmente madura numa forma lipidada em virtude da célula hospedeira (E. coli) denominada (Lipo-OspA) ou um derivado não lipidado. Tais derivados não lipidados incluem a proteína de fusão NSl-OspA não lipidada que tem os primeiros 81 aminoácidos do N-terminal da proteína não estrutural (NS1) do vírus da gripe, e a proteína OspA completa, e outro é MDP-OspA uma forma não lipidada de OspA que contém 3 aminoácidos adicionais do N-terminal.
As composições da presente invenção podem ser utilizadas para a profilaxia ou terapia de alergia. Tais vacinas compreendem antigénios específicos de alergénio (por exemplo, Der pl) e não específicos de alergénio (por exemplo, péptidos derivados de IgE humana, incluindo mas não limitado ao decapéptido stanwort (documento EP 0477231B1)). 70
As composições da presente invenção podem também ser utilizadas para a profilaxia ou terapia de distúrbios crónicos para além da alergia, cancro ou doenças infecciosas. Tais distúrbios crónicos são doenças, tais como a aterosclerose e AIzheimer.
As composições da presente invenção são particularmente adequadas para o tratamento imunoterapêutico de doenças, tais como estados crónicos e cancros, mas também para a terapia de infecções persistentes. Desta forma, as composições da presente invenção são particularmente adequadas para imunoterapia de doenças infecciosas, tais como tuberculose (TB), SIDA e infecções do virus da hepatite B (HepB).
Também, no contexto da SIDA, é proporcionado um método de tratamento de um indivíduo susceptível ou que sofre de SIDA. 0 método compreende a administração de uma vacina da presente invenção ao indivíduo, reduzindo assim a quantidade do declínio de células T CD4+ provocado por infecção subsequente de HIV, ou retardando ou parando o declínio de células T CD4+ num indivíduo já infectado com HIV.
Outros antigénios incluem sacáridos (de um modo preferido capsulares) bacterianos à excepção (ou além de) daqueles antigénios pneumocócicos descritos acima. Os antigénios polissacarídicos são convenientemente armazenados em meio líquido adsorvidos sobre fosfato de alumínio - é deste modo fácil de produzir composições de vacina da invenção por mistura do referido meio liquido com o adjuvante da invenção, extemporaneamente. De um modo preferido, os outros sacáridos bacterianos são seleccionados de um grupo consistindo de: Sacárido capsular do serogrupo A de N. meningitidis (MenA), sacárido capsular do serogrupo C de N. meningitidis (MenC), 71 sacárido capsular do serogrupo Y de N. meningitidis (MenY), sacárido capsular do serogrupo W-135 de N. meningitidis (MenW), sacárido capsular do grupo I de Streptococcus grupo B, sacárido capsular do grupo II de Streptococcus grupo B, sacárido capsular do grupo III de Streptococcus grupo B, sacárido capsular do grupo IV de Streptococcus grupo B, sacárido capsular do grupo V de Streptococcus grupo B, sacárido capsular de tipo 5 de Staphylococcus aureus, sacárido capsular de tipo 8 de Staphylococcus aureus, sacárido Vi de Salmonella typhi, LPS de N. meningitidis, LPS de M. catarrhalis e LPS de H. influenzae. Por LPS entende-se lipopolissacárido nativo (ou lipopoligossacárido) ou lipopolissacárido em que a porção do lipido A foi destoxifiçada por qualquer de uma variedade de métodos conhecidos (ver, por exemplo, os documento WO 97/18837 ou WO 98/33923), ou qualquer molécula compreendendo o O-polissacárido derivado do referido LPS. Por LPS de N. meningitidis entende-se um ou mais dos 12 imunotipos conhecidos (Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Lll ou
L12). As combinações particularmente preferidas são composições compreendendo: 1) Hib conjugado, MenA conjugado e MenC conjugado; 2) Hib conjugado, MenY conjugado e MenC conjugado; 3) Hib conjugado e MenC conjugado; e 4) MenA conjugado, MenC conjugado, MenY conjugado e MenW-135 conjugado. A quantidade de PS em cada um dos conjugados acima pode ser 5 ou 10 Dg cada por O, 5 mL de dose humana. De um modo preferido, Hib, MenA, MenC, MenW-135 e MenY são conjugados de TT.
Um problema associado com a abordagem polissacarídica para vacinação é o facto dos polissacáridos per se serem poucos imunogénicos. Para superar isto, os sacáridos podem ser conjugados a veículos proteicos, que proporcionam ajuda de células T presentes. É preferido, deste modo, que os sacáridos utilizados na invenção estejam ligados a tal veículo proteico. 72
Os exemplos de tais veículos que são, geralmente, actualmente utilizados para a produção de imunogénios sacarídicos incluem os toxóides da difteria e tétano (DT, DT CRM197 e TT, respectivamente) , Hemocianina do Caramujo (KLH), proteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 594610-B) e o derivado proteico purificado de tuberculina (PPD). 0 sacárido pode ser ligado à proteína veículo através de qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S 4372945 e por Armor et al., Patente U.S 4474757). De um modo preferido, é realizada conjugação com CDAP (documento WO 95/08348). De um modo preferido, a razão proteína:sacárido (peso:peso) dos conjugados é 0,3:1 a 1:1, de um modo mais preferido, 0,6:1 a 0,8:1 e , de um modo muito preferido, cerca de 0,7:1.
As combinações dos antigénios que proporcionam protecção contra pneumococos e contra um patogéneo diferente estão incluídas na presente invenção. Muitas vacinas pediátricas são agora administradas como uma vacina de combinação de modo a reduzir o número de injecções que uma criança tem que receber. Assim, para vacinas pediátricas, outros antigénios de outros patogéneos podem ser formulados com as vacinas pneumocócicas da invenção. Por exemplo, as vacinas da invenção podem ser formuladas com (ou administradas separadamente, mas ao mesmo tempo) à bem conhecida vacina de combinação "trivalente" compreendendo o toxóide diftérico (DT), toxóide tetânico (TT) e componentes de pertussis [tipicamente toxóide destoxifiçado de Pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) com pertactina (PRN) e/ou aglutinina 1+2 opcionais], por exemplo, a vacina comercializada INFANRIX-DTPa™ (SmitKlineBeecham Biologicals) que contém antigénios de DT, TT, PT, FHA e PRN, ou com um componente de pertussis de célula inteira, por exemplo, como comercializado I , TM , pela SmrtKlrneBeecham Biologicals S.A., como Tritanrix . A vacina combinada pode também compreender outro antigénio, tal como o 73 antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg), antigénios do vírus da poliomielite (por exemplo, vírus polio trivalente inactivado - IPV), proteínas da membrana externas de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus influenzae não tipável, proteínas da membrana externa de N. meningitidis B.
Os exemplos de antigénios proteicos preferidos de Moraxella catarrhalis que podem ser incluídos numa vacina de combinação (especialmente para prevenção de otite média) são: OMP106 [documentos WO 97/41731 (Antex) e WO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA e/ou LbpB [documento WO 98/55606 (PMC)]; TbpA e/ou TbpB [documentos WO 97/13785 e WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspAl e/ou UspA2 [documento WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (documento PCT/EP99/03824); PilQ (documento PCT/EP99/03823); OMP85 (documento PCT/EP00/01468); lipo06 (documento GB 9917977.2); lipolO (documento GB 9918208.1); lipoll (documento GB 9918302.2); lipol8 (documento GB 9918038.2); P6 (documento PCT/EP99/03038) ; D15 (documento PCT/EP99/03822) ; OmplAl (documento PCT/EP99/06781) ; Hli3 (documento PCT/EP99/03257) ; e OmpE. Os exemplos de antigénios de Haemophilus influenzae não tipáveis que podem ser incluídos numa vacina de combinação (especialmente para prevenção da otite média) incluem: Proteína Fimbrina [(documento U.S. 5766608 -Ohio State Research Foundation)] e fusões compreendendo péptidos daí [e. g., fusões peptídicas de LBl(f); documentos U.S. 5843464 (OSU) ou WO 99/64067]; OMP26 [documento WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [documento EP 281673 (State University of New York)]; TbpA e/ou TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (documento WO 94/12641); proteína D (documento EP 594610); P2; e P5 (documento WO 94/26304). 74
Outras combinações contempladas são sacáridos e proteínas pneumocócicas da invenção em combinação com antigénios virais, por exemplo, da gripe (atenuado, fragmentado ou de subunidade [e. g., neuraminidase (NA) de glicoproteínas de superfície e
hemaglutinina (HA) . Ver, e. g., Chaloupka I. et ai., Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15:121-127], RSV (e. g., antigénios F e G ou fusões de F/G, ver, e. g., Schmidt A. C. et ai., J Virol, Maio de 2001, p4594 - 4603), PIV3 (e. g. , proteínas HN e F, ver Schmidt et ai. supra), Varicella (e. g. , atenuado, glicoproteínas I-V, etc.) e quaisquer (ou todos) os componentes de MMR (sarampo, papeira, rubéola).
Uma vacina de combinação pediátrica preferida contemplada pela presente invenção para o tratamento global ou prevenção da otite média compreende: um ou mais antigénios sacarídicos de Streptococcus pneumoniae (de um modo preferido, conjugados com proteína D) , uma ou mais proteínas pneumocócicas (de um modo preferido, aquelas descritas acima) e um ou mais antigénios expostos à superfície de Moraxella catarrhalis e/ou Haemophilus influenzae não tipável. A proteína D pode ser vantajosamente utilizada como um veículo proteico para os sacáridos pneumocócicos (como mencionados acima) e porque é em si um imunogénio capaz de produzir protecção mediada por célula B contra H. influenzae não tipável (ntHi). Os antigénios de Moraxella catarrhalis ou Haemophilus influenzae não tipável podem estar incluídos na vacina numa forma de subunidade, ou podem ser adicionados como antigénios presentes na superfície de vesículas da membrana externa (blebs) preparadas a partir de bactérias. 75
Propriedades imunogénicas da composição imunogénica utilizada para a vacinação da presente invenção
Na presente invenção, a composição imunogénica é, de um modo preferido, capaz de induzir uma resposta imune melhorada de célula T CD4 contra, pelo menos, um do(s) componente(s) antigénico(s) ou composição antigénica comparativamente à resposta imune da célula T CD4 obtida com a composição correspondente que não é adjuvada, i. e., não contém nenhum adjuvante exógeno (aqui também referida como "composição simples"). Numa forma de realização específica, em que a composição imunogénica é uma composição de gripe e em que a preparação de vacina da gripe é de várias estirpes de gripe, sendo uma das quais uma estirpe epidémica, sendo a referida resposta imune melhorada de célula T CD4 contra a estirpe da gripe epidémica.
Por "resposta imune melhorada de célula T CD4" entende-se que é obtida uma resposta CD4 mais elevada num mamífero, após administração da composição imunogénica adjuvada face àquela obtida após administração da mesma composição sem adjuvante. Por exemplo, uma resposta de célula T CD4 mais elevada é obtida num doente humano após administração de uma composição imunogénica compreendendo um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica conjuntamente com o adjuvante de acordo com a invenção, comparativamente à resposta induzida após administração de uma composição imunogénica compreendendo um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica que não é adjuvada. Tal formulação será vantajosamente utilizada para induzir a resposta de célula T CD4 antigripal capaz de detecção de epitopos da gripe apresentados por moléculas de classe II de MHC. 76
Em particular mas não exclusivamente, a referida resposta imune melhorada de célula T CD4 é obtida num doente imunologicamente não iniciado, i. e., um doente que é seronegativo ao referido vírus ou antigénio gripal. Esta seronegatividade pode ser o resultado do referido doente nunca ter enfrentado o tal vírus ou antigénio (denominado doente "naive") ou, alternativamente, não ter respondido ao referido antigénio uma vez em contacto com o mesmo. Num aspecto específico, a referida resposta imune de célula T CD4 é obtida num indivíduo imunocomprometido, tais como pessoas idosas, tipicamente com 65 anos ou mais, ou num adulto com menos de 65 anos com uma estado clínico de elevado risco ("adulto de elevado risco") ou uma criança com menos de dois anos. A resposta imune melhorada de célula T CD4 pode ser avaliada por medição do número de células que produzem qualquer das seguintes citocinas: • célula produzindo, pelo menos, duas citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa) • célula produzindo, pelo menos, CD40L e outra citocina (IL-2, TNFa, IFNy) • célula produzindo, pelo menos, IL-2 e outra citocina (CD40L, TNFa, IFNy) • célula produzindo, pelo menos, IFNy e outra citocina (IL-2, TNFa, CD40L) • célula produzindo, pelo menos, TNFa e outra citocina (IL-2, CD40L, IFNy)
Existirá resposta imune melhorada de célula T CD4 quando as células que produzem quaisquer das citocinas acima estarão numa quantidade mais elevada após administração da composição adjuvada comparativamente à administração da composição não 77 adjuvada. Tipicamente, pelo menos uma, de um modo preferido, duas de cinco condições aqui mencionadas acima será satisfeita. Numa forma de realização particular, as células que produzem todas as quatro citocinas estarão presentes numa quantidade mais elevada no grupo adjuvado comparativamente ao grupo não adjuvado. A resposta imune melhorada de célula T CD4 conferida por uma composição de gripe adjuvada da presente invenção pode ser obtida idealmente após uma única administração. A abordagem de dose única será extremamente relevante, por exemplo, numa situação de surto de desenvolvimento rápido. Em determinadas circunstâncias, especialmente para a população idosa ou no caso de crianças (com menos de 9 anos de idade) que são vacinadas pela primeira vez contra a gripe, ou no caso de uma epidemia, pode ser benéfico administrar duas doses da mesma composição para essa estação. A segunda dose de referida mesma composição (ainda considerada como "composição para a primeira vacinação") pode ser administrada durante a resposta imune primária em curso e é adequadamente espaçada. Tipicamente, a segunda dose da composição é administrada algumas semanas, ou cerca de um mês, e. g. , 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas ou 6 semanas após a primeira dose, para ajudar a iniciar o sistema imune em indivíduos não responsivos ou pouco responsivos.
Noutra forma de realização, a administração da referida composição imunogénica induz uma resposta melhorada de célula B de memória em doentes administrados com a composição imunogénica adjuvada comparativamente à resposta de célula B de memória induzida em indivíduos imunizados com a composição não adjuvada. Uma resposta melhorada de célula B de memória pretende significar uma frequência aumentada de linfócitos B de sangue periférico capazes de diferenciação em células plasmáticas 78 secretoras de anticorpos após encontro antigénico, como medido por estimulação de diferenciação in vitro.
Noutra forma de realização, a administração da referida composição imunogénica induz uma resposta humoral melhorada em doentes administrados com a composição imunogénica adjuvada, comparativamente à resposta humoral induzida em indivíduos imunizados com a composição não adjuvada. A referida resposta imune humoral pode ser medida de acordo com qualquer processo detalhado no Exemplo I e, especialmente, nas secções 1.1 (1.1.1), 1.2 (1.2.1) e 1.3 (1.3.5.2). Quando a composição imunogénica é uma composição de gripe, especificamente a referida resposta humoral é obtida contra estirpes homólogas e heterólogas. Em particular, a referida resposta imune humoral heteróloga significa uma resposta humoral entre estirpes da gripe e é denominada como resposta imune humoral de "reacção cruzada". A referida resposta imune humoral de "reacção cruzada" envolve a indução de resposta contra uma estirpe de gripe que é uma variante (um desvio) da estirpe de gripe utilizada para vacinação. Um exemplo de tal resposta é ilustrado no Exemplo III. 3.1 e na Figura 2.
Numa forma de realização específica, a administração da referida composição imunogénica adjuvada induz, pelo menos, duas das seguintes respostas: (i) uma resposta imune melhorada de célula T CD4, (ii) uma resposta melhorada de célula B de memória, (iii) uma resposta humoral melhorada contra, pelo menos, um do(s) componente(s) antigénico(s) ou composição antigénica comparativamente à resposta imune obtida com a composição correspondente que é não adjuvada, i. e., não contém nenhum adjuvante exógeno (aqui também referida como "composição simples"). 79
Ainda numa forma de realização especifica adicional, a vacinação com a composição para a primeira vacinação, adjuvada, não tem impacto mensurável na resposta CD8. É uma forma de realização especifica da invenção que a composição compreendendo um virus da gripe ou uma sua preparação antigénica formulada com adjuvante saponínico presente na forma de um lipossoma, em particular saponina QS21 na sua forma inactivada com colesterol, seja eficaz na promoção de respostas de célula T numa população humana imuno-comprometida. Numa forma de realização, o referido adjuvante compreende ainda 3D-MPL. Em particular, a administração de uma única dose da composição imunogénica para a primeira vacinação como descrita na invenção, é capaz de proporcionar melhor seroprotecção, como avaliada pelas correlações de protecção para vacina da gripe, após revacinação contra a gripe numa população idosa humana, do que a vacinação com uma vacina da gripe não adjuvada. A formulação adjuvada reivindicada foi também capaz de induzir uma resposta imune melhorada de célula T CD4 contra o virus da gripe comparativamente àquela obtida com a formulação não adjuvada. Esta observação pode estar associada com um responsividade aumentada após vacinação ou infecção face à exposição antigénica da gripe. Além disso, isto pode também estar associado com um responsividade cruzada, i. e., uma maior capacidade para responder contra estirpes variantes da gripe. Esta resposta melhorada pode ser especialmente benéfica numa população humana imuno-comprometida, tal como a população idosa (65 anos de idade e acima) e, em particular, a população idosa de elevado risco. Isto pode resultar na redução da morbidade global e da taxa de mortalidade e prevenção de admissões hospitalares de emergência para pneumonia e outra doença de tipo gripe. Isto pode também ter beneficio para a população infantil (com menos de 5 anos, de um modo preferido, com menos de 2 anos de idade) . Além disso 80 pode permitir a indução de uma resposta de célula T CD4 que é mais persistente no tempo, e. g. , ainda presente um ano após a primeira vacinação, comparativamente à resposta induzida com a formulação não adjuvada.
Num aspecto específico, a resposta imune de célula T CD4, tal como a resposta imune melhorada de célula T CD4 obtida no indivíduo não iniciado, envolve a indução de uma resposta de reacção cruzada de T CD4 auxiliar. Em particular, a quantidade de células T CD4 de reacção cruzada é aumentada. Por resposta CD4 de "reacção cruzada" entende-se que as células T CD4 alvo partilharam epitopos entre estirpes da gripe.
Geralmente, as vacinas da gripe disponíveis são eficazes apenas contra estirpes infectantes do vírus da gripe que têm hemaglutinina de características antigénicas semelhantes. Quando o vírus infectante (circulante) da gripe sofreu pequenas alterações (tal como uma mutação pontual ou uma acumulação de mutações pontuais que resultam, por exemplo, em alterações de aminoácidos) nas glicoproteínas de superfície, em particular na hemaglutinina (estirpe variante de vírus de desvio antigénico) a vacina pode ainda proporcionar alguma protecção, embora possa proporcionar apenas protecção limitada uma vez que as variantes recentemente criadas podem escapar a imunidade induzida por infecção da gripe anterior ou vacinação. 0 desvio antigénico é responsável por epidemias anuais que ocorrem durante períodos inter-epidémicos (Wiley e Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394). A indução de células T CD4 de reacção cruzada proporciona uma vantagem adicional à composição de invenção, uma vez que pode proporcionar também protecção cruzada, por outras palavras, protecção contra infecções heterólogas, i. e., infecções causadas por uma estirpe de gripe circulante que é uma variante (e. g. , um desvio) da estirpe de gripe contida na 81 composição imunogénica. Isto pode ser vantajoso quando a estirpe circulante é dificil de propagar em ovos ou de produzir em cultura de células, tornando a utilização da estirpe desviada uma alternativa de trabalho. Isto pode também ser vantajoso quando o indivíduo recebeu uma primeira e segunda vacinação separadas por vários meses ou um ano, e a estirpe de gripe na composição imunogénica utilizada para uma segunda imunização é uma estirpe variante de desvio da estirpe utilizada na composição utilizada para a primeira vacinação. A composição imunogénica de gripe adjuvada como aqui definida tem, deste modo, uma maior capacidade para induzir seroprotecção e células T CD4 de reacção cruzada em indivíduos idosos vacinados. Esta característica pode estar associada com uma maior capacidade para responder contra uma estirpe variante da estirpe presente na composição imunogénica. Isto pode provar ser uma importante vantagem numa situação de epidemia. Por exemplo, uma composição imunogénica de gripe multivalente compreendendo qualquer ou várias das estirpes H5, H2, H9, H7 ou H6 pode proporcionar uma maior capacidade para responder contra uma variante epidémica, í. e., uma estirpe de desvio da(s) referida(s) estirpe(s) epidémica(s), após vacinação subsequente ou após infecção pela referida estirpe de desvio.
Detecçao de células T CD4 de reacçao cruzada após vacinaçao com vacina da gripe
As células T CD4 que são capazes de reconhecer estirpes da gripe homólogas e desviadas foram denominadas no presente documento como de "reacção cruzada". As composições gripais adjuvadas como aqui descritas foram capazes de mostrar reactividade cruzada hetero-subtípica uma vez que existe 82 reactividade cruzada observável contra estirpes da gripe desviadas. Como referido acima, a capacidade de uma formulação de vacina epidémica para ser eficaz contra estirpes epidémicas de desvio pode provar ser uma importante caracteristica no caso de epidemia.
Consistentemente com as observações acima, os epitopos de células T CD4 partilhados por diferentes estirpes da gripe foram identificados em humanos (Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506).
Numa forma de realização especifica, a composição adjuvada pode oferecer o beneficio adicional de proporcionar melhor protecção contra estirpes circulantes que sofreram uma importante alteração (tal como, por exemplo, recombinação génica entre duas espécies diferentes) na hemaglutinina (desvio antigénico), contra a qual as vacinas actualmente disponíveis não têm eficácia.
Revacinação e composição utilizada para revacinação (composição de reforço)
Numa forma de realização, a invenção proporciona a utilização de um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica no fabrico de uma composição imunogénica para revacinação de humanos previamente vacinados com uma composição imunogénica como aqui reivindicada.
Num aspecto da presente invenção, é proporcionada a utilização de um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica, de uma primeira estirpe da gripe epidémica, no 83 fabrico de uma composição imunogénica adjuvada como aqui definida, para protecção contra infecções da gripe causadas por uma estirpe de gripe que é uma variante da referida primeira estirpe de gripe.
Noutro aspecto, a invenção proporciona a utilização de um virus da gripe ou uma sua preparação antigénica no fabrico de uma composição imunogénica de gripe, para revacinação de humanos previamente vacinados com uma composição adjuvada como aqui reivindicada ou com uma composição de gripe adjuvada compreendendo uma estirpe variante de gripe, sendo o adjuvante da gripe como aqui definido.
Noutro aspecto, a presente invenção proporciona um método para vacinação de um indivíduo ou população humana contra uma estirpe de vírus da gripe, seguida por revacinação do referido indivíduo ou população humana contra uma estirpe variante do vírus da gripe, o referido método compreendendo a administração ao referido humano (i) uma primeira composição compreendendo um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica de uma primeira estirpe de vírus da gripe e um adjuvante como aqui definido, e (ii) uma segunda composição imunogénica compreendendo uma estirpe variante do vírus da gripe da referida primeira estirpe de vírus da gripe. Numa forma de realização específica, a referida primeira estirpe está associada com um surto epidémico ou tem o potencial de estar associada com um surto epidémico. Noutra forma de realização específica, a referida estirpe variante está associada com um surto epidémico ou tem o potencial de estar associada com um surto epidémico. Em particular, a revacinação é feita com uma composição da gripe compreendendo, pelo menos, uma estirpe que é uma estirpe epidémica circulante. A composição de iniciação e a composição de reforço podem ser multivalentes, i. e., contêm, pelo menos, 84 duas estirpes do vírus da gripe. Quando a(s) composição(ões) é(são) multivalente(s), pelo menos, uma estirpe está associada com um surto epidémico ou tem o potencial de estar associada com um surto epidémico.
Tipicamente, a revacinação é realizada, pelo menos, 6 meses após a primeira vacinação, de um modo preferido, 8 a 14 meses após, de um modo mais preferido, em torno de 10 a 12 meses após. A composição imunogénica para revacinação (a composição de reforço) pode conter qualquer tipo de preparação antigénica, inactivada ou viva atenuada. Pode conter o mesmo tipo de preparação antigénica, e. g. , um vírus fragmentado da gripe ou uma sua preparação antigénica, um virião inteiro ou uma vacina purificada de HA e NA (subunidade), como a composição imunogénica utilizada para a primeira vacinação. Alternativamente, a composição de reforço pode conter um outro tipo de antigénio gripal, diferente daquele utilizado para a primeira vacinação. De um modo preferido, é utilizado um vírus fragmentado. A composição de reforço pode ser adjuvada ou não adjuvada. A composição de reforço não adjuvada pode ser Fluarix™/cx-Rix®/Inf lusplit® administrada intramuscularmente. A formulação contém três antigénios de virião fragmentado inactivado preparados a partir de estirpes recomendadas pela OMS da estação de gripe apropriada. A composição de reforço pode ser adjuvada ou não adjuvada. Numa forma de realização específica, a composição de reforço compreende um adjuvante saponínico que é como aqui definido.
Numa forma de realização específica, a composição imunogénica para revacinação (aqui também denominada abaixo de "composição de reforço") contém um vírus da gripe ou uma sua 85 preparação antigénica que partilha epitopos comuns de células T CD4 com o virus da gripe ou uma sua preparação antigénica utilizada para a primeira vacinação. Um epitopo comum de células T CD4 pretende significar péptidos/sequências/epitopos de diferentes antigénios que podem ser reconhecidos pela mesma célula CD4 (ver exemplos de epitopos descritos em: Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10 (2) : 211-22; Gelder CM et al. J 1996 Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM et al. J 1995 Virol. 1995 69(12) :7497-506) .
Numa forma de realização, de acordo com a invenção, a composição de reforço é uma composição monovalente da gripe compreendendo uma estirpe de gripe que está associada com um surto epidémico ou tem o potencial de estar associada com um surto epidémico. Em particular, a referida estirpe na composição de reforço é uma estirpe epidémica circulante. As estirpes adequadas são, mas não limitadas a: H5N1, H9N2, H7N7 e H2N2. A referida estirpe pode ser a mesma que aquela, ou uma daquelas, presente na composição utilizada para a primeira vacinação. Numa forma de realização alternativa, a referida estirpe pode ser uma estirpe variante, i. e., uma estirpe de desvio, da estirpe presente na composição utilizada para a primeira vacinação.
Noutra forma de realização especifica, a composição de reforço é uma vacina multivalente da gripe. Em particular, quando a composição de reforço for uma vacina multivalente, tais como uma vacina bivalente, trivalente ou tetravalente, pelo menos uma estirpe está associada com um surto epidémico ou tem o potencial de estar associada com um surto epidémico. Numa forma de realização especifica, duas ou mais estirpes na composição de reforço são estirpes epidémicas. Noutra forma de realização especifica, a, pelo menos uma, estirpe epidémica na composição de reforço é do mesmo tipo que aquela, ou uma daquelas, presente 86 na composição utilizada para a primeira vacinação. Numa forma de realização alternativa, a, pelo menos uma, estirpe pode ser uma estirpe variante, i. e., uma estirpe de desvio, da, pelo menos uma, estirpe epidémica presente na composição utilizada para a primeira vacinação. Em particular, a, pelo menos uma, estirpe na composição de reforço é uma estirpe epidémica circulante. A composição de reforço pode ser adjuvada ou não.
Tipicamente, uma composição de reforço, nos casos em que for utilizada, é administrada na seguinte estação de gripe, e. g., aproximadamente um ano após a primeira composição imunogénica. A composição de reforço pode também ser administrada cada ano subsequente (terceira, quarta, quinta vacinação e assim por diante). A composição de reforço pode ser a mesma que a composição utilizada para a primeira vacinação. Apropriadamente, a composição de reforço contém um virus da gripe ou uma sua preparação antigénica que é uma estirpe variante do vírus da gripe utilizado para a primeira vacinação. Em particular, as estirpes virais da gripe ou uma sua preparação antigénica são seleccionadas de acordo com o material de referência distribuído pela Organização Mundial de Saúde de modo que estejam adaptadas à estirpe de gripe que é circulante no ano da revacinação. 0 antigénio gripal ou composição antigénica utilizada na revacinação compreende, de um modo preferido, um adjuvante, adequadamente como descrito acima. 0 adjuvante pode ser uma saponina, presente na forma de um lipossoma, como aqui descrita acima, que é preferida contendo, opcionalmente, um adjuvante adicional, tal como 3D-MPL.
Num aspecto, a revacinação induz alguma, de um modo preferido, duas ou todas das seguintes: (i) uma resposta CD4 melhorada contra o vírus da gripe ou uma sua preparação 87 antigénica, ou (ii) uma resposta melhorada de célula B de memória ou (iii) uma resposta humoral melhorada, comparativamente à resposta equivalente induzida após uma primeira vacinação com o vírus da gripe não adjuvado ou uma sua preparação antigénica. De um modo preferido, a(s) resposta(s) imunológica (s) induzida(s) após revacinação com o vírus da gripe adjuvado ou uma sua preparação antigénica como aqui definida, é(são) maior(es) do que a resposta correspondente induzida após revacinação com a composição não adjuvada. De um modo preferido, as respostas imunológicas induzidas após revacinação com um vírus da gripe não adjuvado, de um modo preferido fragmentado, são maiores na população primeiramente vacinada com a composição de gripe adjuvada, de um modo preferido fragmentada, do que a resposta correspondente na população primeiramente vacinada com uma composição de gripe não adjuvada, de um modo preferido fragmentada.
Numa forma de realização específica, a revacinação dos indivíduos com uma composição de reforço compreendendo um vírus da gripe e um adjuvante saponínico na forma de um lipossoma, como aqui definido acima, apresenta títulos de anticorpo mais elevados do que os valores correspondentes no grupo de pessoas primeiramente vacinadas com a composição não adjuvada e reforçados com a composição não adjuvada. 0 efeito do adjuvante em aumentar a resposta de anticorpo à revacinação é especialmente importante na população idosa que é conhecida por ter uma baixa resposta à vacinação ou infecção pelo vírus da gripe. 0 benefício associado à composição adjuvada foi também acentuado em termos de melhorar a resposta de célula T CD4 após revacinação.
Especificamente, a composição adjuvada de invenção é capaz de induzir uma melhor responsividade cruzada contra estirpes 88 desviadas (a estirpe de gripe da seguinte estação de gripe) comparativamente à protecção conferida pela vacina de controlo. A referida responsividade cruzada mostrou uma maior persistência comparativamente àquela obtida com a formulação não adjuvada. 0 efeito do adjuvante em aumentar a responsividade cruzada contra estirpes desviadas é importante numa situação de epidemia.
Numa forma de realização adicional, a invenção refere-se a um regime de vacinação em que a primeira vacinação é realizada com uma composição de gripe, de um modo preferido, uma composição de gripe fragmentada, contendo, pelo menos, uma estirpe de gripe que poderia potencialmente causar um surto epidémico e a revacinação é realizada com uma estirpe circulante, um estirpe epidémica ou uma estirpe clássica.
Epitopo CD4 em HA
Este desvio antigénico reside principalmente em regiões de epitopo das proteínas de superfície virai hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) . É sabido que qualquer diferença em epitopos de células CD4 e B entre diferentes estirpes da gripe, sendo utilizado pelo vírus para evadir a resposta adaptativa do sistema imune do hospedeiro, irá desempenhar um papel importante na vacinação da gripe.
Foram identificados epitopos de célula T CD4 partilhados por diferentes estirpes da gripe em humanos (ver, por exemplo: Gelder C et al. 1998, Int Immunol. 10(2) : 211 — 22; Gelder CM
et al. J 1996 Virol. 70 (7) : 478 7-9 0; e Gelder CM et al. 1995 J
Virol. 1995 69(12):7497-506). 89
Numa forma de realização específica, a revacinação é realizada através da utilização de uma composição de reforço que contém um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica que partilha epitopos comuns de célula T CD4 com o antigénio do vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica utilizada para a primeira vacinação. A invenção refere-se, assim, à utilização da composição imunogénica compreendendo um vírus da gripe epidémico ou uma sua preparação antigénica e uma saponina na forma de um lipossoma, em particular QS21 na sua forma destoxifiçada com colesterol, opcionalmente com 3D-MPL, no fabrico de um primeiro componente de vacinação de uma vacina multi-dose, a vacina multi-dose compreendendo ainda, como uma dose de reforço, um vírus da gripe ou uma sua preparação antigénica que partilha epitopos comuns de célula T CD4 com o antigénio do vírus da gripe epidémico ou uma sua preparação antigénica virai da dose administrada na primeira vacinação.
Meios de vacinação
As composições imunogénicas da invenção podem ser administradas através de qualquer via adequada de distribuição, tais como, e. g., intradérmica, mucósica, intranasal, oral, intramuscular ou subcutânea. Outras via de distribuição são bem conhecidas na técnica. A via de distribuição intramuscular é preferida para a composição imunogénica adjuvada. A distribuição intradérmica é outra via adequada. Pode ser utilizado qualquer dispositivo adequado para distribuição intradérmica, por exemplo, dispositivos de agulha curta, tais como aqueles descritos nos documentos U.S. 4886499, US5190521, 90 U.S. 5328483, U.S. 5527288, U.S. 4270537, U.S. 5015235, U.S. 5141496, U.S. 5417662. As vacinas intradérmicas podem também ser administradas por dispositivo que limitam o comprimento da penetração efectiva de uma agulha na pele, tal como aqueles descritos nos documentos WO99/34850 e EP1092444, aqui incorporados por referência, e os seus equivalentes funcionais. São também adequados dispositivos da injecção de jacto que distribuem vacinas liquidas à derme através de um injector de jacto liquido ou através de uma agulha que perfura a cama córnea e produz um jacto que atinge a derme. Os dispositivos de injecção de jacto são descritos, por exemplo, nos documentos U.S. 5480381, U.S. 5599302, U.S. 5334144, U.S. 5993412, U.S. 5649912, U.S. 5569189, U.S. 5704911, U.S. 5383851, U.S. 5893397, U.S. 5466220, U.S. 5339163, U.S. 5312335, U.S. 5503627, U.S. 5064413, U.S. 5520639, U.S. 4596556 U.S. 4790824, U.S. 4941880, U.S. 4940460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Também são adequados dispositivos balísticos de distribuição de pó/partículas que utilizam gás comprimido para acelerar a vacina em forma de pó através das camadas externas da pele até à derme. Adicionalmente, podem ser utilizadas seringas convencionais no método clássico de Mantoux de administração intradérmica.
Uma outra via adequada de administração é a via subcutânea. Qualquer dispositivo adequado pode ser utilizado para distribuição subcutânea, por exemplo, uma agulha clássica. De um modo preferido, é utilizado um dispositivo injector a jacto sem agulha, tal como aquele publicado nos documentos WO 01/05453, WO 01/05452, WO 01/05451, WO 01/32243, WO 01141840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637, WO 01/58512, WO 01/64269. WO 01/7881Odocumento WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317. O referido dispositivo é, de um modo mais preferido, pré-cheio com a formulação de vacina líquida. 91
Alternativamente, a vacina é administrada intranasalmente. Tipicamente, a vacina é administrado localmente à área nasof aríngea, de um modo preferido, sem ser inalada para os pulmões. É desejável utilizar um dispositivo de distribuição intranasal que distribui a formulação de vacina à área nasofaríngea, sem ou substancialmente sem entrada da mesma nos pulmões.
Os dispositivos preferidos para administração intranasal das vacinas de acordo com a invenção são dispositivos pulverizadores. Os dispositivos pulverizadores nasais comercialmente disponíveis adequados incluem Accuspray™ (Becton Dickinson). Os nebulizadores produzem uma pulverização muito fina que pode ser facilmente inalada para os pulmões e, deste modo, não alcança eficientemente a mucosa nasal. Os nebulizadores não são, deste modo, preferidos.
Os dispositivos pulverizadores preferidos para utilização intranasal são dispositivos para os quais o desempenho do dispositivo não está dependente da pressão aplicada pelo utilizador. Estes dispositivos são conhecidos como dispositivos de limite de pressão. 0 líquido é libertado pelo bocal apenas quando for aplicada uma pressão limite. Estes dispositivos tornam mais fácil de conseguir uma pulverização com um tamanho regular de gota. Os dispositivos de limite de pressão adequados para utilização com a presente invenção são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nos documentos WO 91/13281 e EP 311863B e EP 516636. Tais dispositivos estão comercialmente disponíveis a partir da Pfeiffer GmbH e são também descritos em Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Set. 1999. 92
Os dispositivos intranasais preferidos produzem gotas (medidas utilizando água como o liquido) na gama de 1 a 200 μπι, de um modo preferido, 10 a 120 μπι. Abaixo de 10 μπι existe um risco de inalação, deste modo é desejável não ter mais do que cerca de 5% das gotas abaixo de 10 μπι. Gotas acima de 120 μπι não se espalham tão bem quanto as gotas menores, sendo assim desejável ter não mais do que cerca de 5% das gotas acima de 12 0 μπι. A distribuição em bi-dose é uma caracteristica preferida adicional de um sistema de distribuição intranasal para utilização com as vacinas de acordo com a invenção. Os dispositivos de bi-dose contêm duas sub-doses de uma única dose de vacina, uma sub-dose para administração a cada narina. Geralmente, as duas sub-doses estão presentes numa única câmara e a construção do dispositivo permite a distribuição eficiente de uma única sub-dose de cada vez. Alternativamente, pode ser utilizado um dispositivo de mono-dose para administrar as vacinas de acordo com a invenção.
Alternativamente, a via epidérmica ou transdérmica de vacinação está também contemplada na presente invenção.
Num aspecto especifico da presente invenção, a composição imunogénica adjuvada para a primeira administração pode ser administrada intramuscularmente e a composição de reforço, adjuvada ou não, pode ser administrada através de uma via diferente, por exemplo, intradérmica, subcutânea ou intranasal. Noutra forma de realização especifica, uma composição imunogénica compreendendo especificamente um antigénio do virus da gripe ou uma sua preparação antigénica para a primeira administração, pode conter um conteúdo padrão de HA de 15 pg por estirpe de gripe, e a composição de reforço da gripe pode conter 93 uma dose baixa de HA, i. e., abaixo de 15 pg, e dependendo da via da administração, pode ser administrada num volume menor.
Populações para vacinar A população alvo para vacinar pode ser humana imuno-comprometida. Os humanos imuno-comprometidos são geralmente menos capazes de responder bem a um antigénio, em particular a um antigénio gripal, em comparação com adultos saudáveis.
De um modo preferido, a população alvo é uma população que não é iniciado contra a gripe, sendo naive (tal como face a uma estirpe epidémica) ou não tendo respondido previamente à infecção da gripe ou vacinação. De um modo preferido, a população alvo são pessoas idosas, adequadamente com 65 anos ou mais, adultos jovens de elevado risco (i. e., entre 18 e 64 anos de idade) tais como as pessoas que trabalham em instituições de saúde ou aqueles adultos jovens com um factor de risco, tais como doença cardiovascular e pulmonar, ou diabetes. Uma outra população alvo são todas as crianças de 6 meses da idade ou mais, especialmente crianças de 6-23 meses de idade que têm uma taxa de hospitalização relacionada com a gripe relativamente elevada. De um modo preferido, a população alvo são idosos com mais de 65 anos. 94
Regimes de vacinação, dosagem e critérios adicionais de eficácia
Apropriadamente, as composições imunogénicas de acordo com a presente invenção são uma dose injectável padrão de 0,5 mL na maioria dos casos e, quando uma composição de gripe, contêm 15 pg do componente antigénico de hemaglutinina de cada estirpe de gripe, como medido por imunodifusão radial simples (SRD) (J. M. Wood et al. : J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., J. Biol. Satnd. 9 (1981) 317-330). Apropriadamente, o volume da dose de vacina será entre 0,5 mL e 1 mL, em particular 0,5 mL padrão, ou 0,7 mL de volume de dose de vacina. Para vacinas da gripe, uma ligeira adaptação do volume da dose será rotineiramente realizada dependendo da concentração de HA na amostra original em bruto.
Adequadamente, a referida composição imunogénica contém uma baixa dose de antigénio HA, por exemplo, qualquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 pg de HA por estirpe de gripe.
Vantajosamente, uma dose de vacina de acordo com a invenção, em particular uma vacina de baixa dose, pode ser proporcionada num volume menor do que as vacinas da gripe fragmentadas injectadas convencionais, que são geralmente em torno de 0,5, 0,7 ou 1 mL por dose. As doses de baixo volume de acordo com a invenção são, de um modo preferido, abaixo de 500 pL, de um modo mais preferido, abaixo de 300 pL e, de um modo muito preferido, não mais do que cerca de 200 pL ou menos por dose.
Assim, uma dose de vacina de baixo volume preferida de acordo com um aspecto da invenção, é uma dose com uma baixa dose de antigénio num baixo volume, e. g., cerca de 15 pg ou cerca de 95 7,5 pg de HA ou cerca de 3,0 pg de HA (por estirpe) num volume de cerca de 200 pL. O medicamento da gripe da invenção cumpre, de um modo preferido, determinados critérios internacionais para vacinas.
Os padrões são aplicados internacionalmente para medir a eficácia de vacina da gripe. Os critérios oficiais da União Europeia para uma vacina eficaz contra a gripe são apresentados na Tabela 1 abaixo. Teoricamente, para satisfazer os requisitos da União Europeia, uma vacina da gripe tem que satisfazer apenas um dos critérios na Tabela, para todas as estirpes da gripe incluídas na vacina. As composições da presente invenção satisfazem adequadamente, pelo menos, um de tais critérios.
Contudo na prática, pelo menos, dois ou todos os três dos critérios necessitam ser satisfeitos por todas as estirpes, particularmente para uma nova vacina, tal como uma nova vacina para distribuição através de uma via diferente. Sob algumas circunstâncias, dois critérios podem ser suficientes. Por exemplo, pode ser aceitável para dois dos três critérios serem satisfeitos para todas as estirpes, enquanto o terceiro critério pode ser satisfeito por algumas mas não todas as estirpes (e. g. , duas num total de três estirpes). Os requisitos são diferentes para populações adultas (18-60 anos) e populações idosas (> 60 anos). 96
Tabela 1 18 - 60 anos > 60 anos Taxa de seroconversão* > 40% > 30% Factor de conversão** > 2,5 O CM Λ Taxa de protecção*** > 70% > 60% * A taxa de seroconversão é definida como a percentagem de vacinados que têm, pelo menos, um aumento de 4 vezes nos títulos séricos de inibição da hemaglutinina (Hl) após vacinação, para cada estirpe de vacina. ** 0 factor de conversão é definido como o número de vezes que aumentaram os títulos séricos médios geométricos de Hl (GMT) após vacinação, para cada estirpe de vacina. *** A taxa de protecção é definida como a percentagem de vacinados com um título sérico de Hl igual ou maior a 1:40 após vacinação (para cada estirpe de vacina) e é normalmente aceite como indicador de protecção.
Num aspecto adicional, a invenção proporciona um método de concepção de uma vacina para doenças conhecidas por serem curadas ou tratadas por uma activação das células T CD4+, compreendendo 1) seleccionar um antigénio contendo epitopos de CD4+, e 2) combinar o referido antigénio com adjuvante saponínico na forma de um lipossoma como aqui definido acima, em que a referida vacina após administração no referido mamífero é capaz de induzir uma resposta aumentada de células T CD4 no referido mamífero.
Para evitar dívidas, os termos "compreendendo", "compreendem" e "compreende" aqui utilizados pretendem, pela 97 requerente, ser opcionalmente substituíveis com os termos "consistindo de", "consistem de", e "consiste de", respectivamente, em cada exemplo. A invenção será adicionalmente descrita com referência aos seguintes exemplos, não limitativos: 0 Exemplo I descreve métodos visualização imunológica utilizados em estudos de murganhos, furões e humanos. 0 Exemplo II descreve a preparação do adjuvante MPL/QS21 lipossomal. 0 Exemplo III descreve uma avaliação pré-clínica de vacinas da gripe adjuvadas e não adjuvadas em furões. 0 Exemplo IV mostra uma avaliação pré-clinica de vacinas da gripe adjuvadas e não adjuvadas em murganhos C57BI/6 naives e iniciados. 0 Exemplo V descreve uma comparação de vacina da gripe adjuvada com 3D-MPL a duas concentrações diferentes em murganhos. 0 Exemplo VI descreve uma comparação de vacina da gripe adjuvada com 3D-MPL a duas concentrações diferentes em idosas humanos. 0 Exemplo VII descreve uma avaliação pré-clínica de vacinas de HPV adjuvadas em murganhos. 98 0 Exemplo VIII descreve uma avaliação pré-clínica de composições imunogénicas de citomegalovírus adjuvadas e não adjuvadas. 0 Exemplo IX descreve a avaliação pré-clínica de uma composição de vacina de RTS,S adjuvada com 3D-MPL a duas concentrações diferentes. 0 Exemplo X descreve a avaliação pré-clínica de uma vacina de RTS,S adjuvada com 3D-MPL a duas concentrações diferentes.
Exemplo I - Métodos de Visualização Imunológica 1.1. Métodos de murganhos 1.1.1. Teste de Inibição de Hemaglutinação
Processo de teste
Os títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três estirpes do vírus da gripe foram determinados utilizando o teste de inibição da hemaglutinação (Hl). 0 princípio do teste de Hl é baseado na capacidade de anticorpos específicos anti-gripe para inibirem a hemaglutinação da hemaglutinina de glóbulos vermelhos (RBC) de galinha pela hemaglutinina do vírus da gripe (HA) . Os soros inactivadas pelo calor foram previamente tratados com caulino e RBC de galinha para remover inibidores não específicos. Após o pré-tratamento, diluições duas vezes dos soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada estirpe de gripe. Os glóbulos vermelhos de galinha foram depois 99 adicionados e a inibição da aglutinação foi pontuada. Os títulos foram expressos como o inverso da diluição mais elevada de soro que inibiu completamente a hemaglutinação. Uma vez que a primeira diluição dos soros foi 1:20, um nível indetectável foi pontuado como um título igual a 10.
Análise estatística A análise estatística foi realizada nos títulos de Hl após vacinação utilizando UNISTAT. O protocolo aplicado para a análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue:
Transformação logarítmica dos dados
Teste de Shapiro-Wilk em cada população (grupo) de modo a verificar a normalidade da distribuição dos grupos
Teste de Cochran de modo a verificar a homogeneidade de variância entre as diferentes populações (grupos)
Análise de dois factores de variância realizada nos grupos
Teste de Tukey HSD para comparações múltiplas 1.1.2. Coloração intracelular de citocinas
Esta técnica permite uma quantificação de linfócitos T específicos de antigénio com base na produção de citocina: células T efectoras e/ou células T efectoras-memória produzem IFN-γ e/ou células T de memória central produzem IL-2. As PBMC são recolhidas no 7 dia pós-imunização. 100
As células linfóides são re-estimuladas in vitro na presença de inibidor de secreção (Brefeldina): Estas células são depois processadas por processo imunofluorescente convencional utilizando anticorpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-γ e IL-2). Os resultados são expressos como uma frequência de célula positiva a citocina nas células T CD4/CD8. A coloração intracelular de citocinas de células T foi realizada em PBMC 7 dias após a segunda imunização. 0 sangue foi recolhido de murganhos e agrupado em meio heparinizado RPMI + Adie. Para o sangue, as RPMI + Adic-suspensões PBL diluídas foram colocadas sobre um gradiente Lympholyte-Mammal de acordo com o protocolo recomendado (centrifugar 20 minutos a 2500 rpm e t.a.). As células mononucleares na interface foram removidas, lavadas 2x em RPMI + adie e as suspensões de PBMC foram ajustadas para 2 x 106 células/mL em RPMI com 5% de soro fetal de vitela. A estimulação antigénica in vitro de PBMC foi realizada a uma concentração final de 1 x 106 células/mL (tubo FACS) com fragmentado de gripe trivalente sobre pesferas (5 pg de HA/estirpe) ou FI Inteiro (1 pg de HA/estirpe) e depois incubados 2 horas a 37 °C com adição de anti-CD28 e anti-CD49d (1 pg/ mL para ambos). A adição de ambos os anticorpos, aumentou a proliferação e a produção de citocinas por células T e NK activadas e pode proporcionar um sinal co-estimulador para indução de CTL.
Além disso, as PBMC foram também estimuladas de um dia para o outro com fragmentado trivalente de gripe (30 pg de HA/estirpe) - ou FI Inteiro (5 pg de HA/estirpe)- BMDC pulsadas (1 x 105 células/mL) que foram preparadas por pulsão de BMDC com fragmentado de gripe (60 pg de HA/estirpe) ou FI trivalente da Gripe inteiro (10 pg de HA/estirpe) durante 6 horas a 37 °C. 101
Após o passo de re-estimulação antigénica, as PBMC foram incubadas de um dia para o outro a 37 °C, na presença de Brefeldina (1 pg/ mL) a 37 °C para inibir a secreção de citocinas. A coloração de IFN-Y/IL-2/CD4/CD8 foi realizada como se segue: As suspensões celulares foram lavadas, ressuspensas em 50 pL de FCS 1% em PBS contendo 2% de reagente de bloqueamento Fc (1/50; 2.4G2) . Após 10 minutos de incubação a 4 °C, foram adicionados 50 pL de uma mistura de anti-CD4-PE (2/50) e anti-CD8 perCP (3/50) e incubados 30 minutos a 4 °C. Após uma lavagem em FCS 1% em PBS, as células foram permeabilizadas por ressuspensão em 200 pL de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) e incubadas 20 minutos a 4 °C. As células foram depois lavadas com Perm Wash (Kit BD) e ressuspensas com 50 pL de uma mistura de anti-IFN-y APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluido em Perm Wash. Após uma incubação no mínimo de 2 h e no máximo de um dia para o outro a 4 °C, as células foram lavadas com Perm Wash e ressuspensas em FCS 1% em PBS + 1% de paraformaldeído. A análise da amostra foi realizada por FACS. As células vivas foram circunscritas (FSC/SSC) e a aquisição foi realizada em 50000 eventos (linfócitos) ou 35000 eventos em células T CD4+. As percentagens de IFN-γ + ou IL2+ foram calculadas em populações CD4+ e CD8+ circunscritas. 102 1.2. Métodos de furões 1.2.1. Teste de Inibição de Hemaglutinação (Hl)
Processo de teste
Os títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três estirpes do vírus da gripe foram determinados utilizando o teste de inibição da hemaglutinação (Hl). 0 princípio do teste de Hl é baseado na capacidade de anticorpos específicos anti-gripe para inibirem a hemaglutinação da hemaglutinina de glóbulos vermelhos (RBC) de galinha pela hemaglut inina do vírus da gripe (HA) . Os soros foram primeiramente tratados com uma solução de neuraminidase a 25% (RDE) e foram inactivados pelo calor para remover inibidores não específicos. Após o pré-tratamento, diluições duas vezes dos soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada estirpe de gripe. Os glóbulos vermelhos de galinha foram depois adicionados e a inibição da aglutinação foi pontuada utilizando gotas para a leitura. Os titulos foram expressos como o inverso da diluição mais elevada de soro que inibiu completamente a hemaglutinação. Uma vez que a primeira diluição dos soros foi 1:10, um nivel indetectável foi pontuado como um título igual a 5.
Análise estatística A análise estatística foi realizada nos títulos de Hl (Dia 41, antes do desafio) utilizando UNISTAT. O protocolo aplicado para a análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue: 103
Transformação logarítmica dos dados
Teste de Shapiro-Wilk em cada população (grupo) de modo a verificar a normalidade da distribuição dos grupos
Teste de Cochran de modo a verificar a homogeneidade de variância entre as diferentes populações (grupos)
Análise de dois factores de variância realizada nos grupos
Teste de Tukey HSD para comparações múltiplas 1.2.2. Lavagens nasais 104 células viáveis presentes no poço no final do ensaio de titulação virai e é quantificada por medição da absorvência de cada poço no comprimento de onda apropriado (450 nanómetros) . O limite é definido como a média de OD de células não infectadas de controlo - 0,3 OD (0,3 OD corresponde a + /- 3 StDev de OD de células não infectadas de controlo). Uma pontuação positiva é definida quando o OD é < que o limite e, em contraste, uma pontuação negativa é definida quando o OD é > que o limite. Os títulos de disseminação virai foram determinados por "Reed e Muench" e expressos como Log TCID50/mL. 1.3. Ensaios para avaliar a resposta imune em humanos 1.3.1. Ensaio de Inibição de Hemaglutinação A resposta imune foi determinada por medição de anticorpos de Hl utilizando o método descrito pelo Centro de Colaboração para a Gripe da OMS, Centros para Controlo de Doença, Atlanta, EUA (1991).
As medições do título de anticorpos foram conduzidas em amostras séricas descongeladas com um micrométodo estandardizado e detalhadamente validado utilizando 4 unidades de inibição de hemaglutinação (4 HIU) dos antigénios apropriados e uma suspensão a 0,5% de eritrócitos de ave de capoeira. Os inibidores séricos não específicos foram removidos por tratamento de calor e enzima destruidora de receptor.
Os soros obtidos foram avaliados para níveis de anticorpos de Hl. Começando com uma diluição inicial de 1:10, foi preparada uma diluição em série (por um factor de 2) até uma diluição final de 1:20480. O ponto final de titulação foi tomado como o 105 passo de maior diluição que mostrou inibição completa (100%) da hemaglutinação. Todos os ensaios foram realizados em duplicados. 1.3.2. Ensaio de Inibição da Neuraminidase 0 ensaio foi realizado em placas de microtitulação revestidas com fetuina. Foi preparada uma diluição em série de 2 vezes do anti-soro e misturada com uma quantidade estandardizada de virus da gripe A H3N2, H1N1 ou gripe B. 0 teste foi baseado na actividade biológica da neuraminidase que liberta enzimaticamente o ácido neuraminico da fetuina. Após clivagem do ácido neuraminico terminal, a β-D-glactose-N-acetil-galactosamina foi exposta. Foi adicionada aos poços aglutinina de amendoim marcada com peroxidase de rábano (HRP) que se liga especificamente às estruturas de galactose. A quantidade de aglutinina ligada pode ser detectada e quantificada numa reacção de substrato com tetrametilbenzidina (TMB). A maior diluição de anticorpo que ainda inibe a actividade de neuraminidase virai por, pelo menos, 50% foi indicado no titulo de NI. 1.3.3. Ensaio de Anticorpo Neutralizante
As medições de anticorpo neutralizante foram conduzidas em amostras séricas descongeladas. A neutralização virai por anticorpos contidos no soro foi determinada num ensaio de microneutralização. Os soros foram utilizados sem tratamento adicional no ensaio. Cada soro foi testado em triplicado. Uma quantidade estandardizada de virus foi misturada com diluições em série do soro e incubada para permitir a ligação dos anticorpos ao virus. Foi depois adicionada uma suspensão celular contendo uma quantidade definida de células MDCK à mistura de 106 vírus e anti-soro e incubadas a 33 °C. Após o período de incubação, a replicação virai foi visualizada por hemaglutinação de glóbulos vermelhos de galinha. 0 título de 50% de neutralização de um soro foi calculado pelo método de Reed e Muench. 1.3.4. Imunidade mediada por célula foi avaliada por Citometria de Fluxo de Citocina (CFC)
As células T CD4 e CD8 específicas de antigénio de sangue periférico podem ser re-estimuladas in vitro para produzir IL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN, se incubadas com o seu antigénio correspondente. Consequentemente, as células T CD4 e CD8 específicas de antigénio podem ser contadas por citometria de fluxo após marcação imunofluorescente convencional do fenótipo celular, assim como produção intracelular de citocinas. No presente estudo, o antigénio de vacina da gripe, assim como péptidos derivados de proteína específica da gripe foram utilizados como antigénio para re-estimular células T específicas de gripe. Os resultados foram expressos como uma frequência de células T CD4 ou CD8 positivas a citocina(s) dentro da subpopulação de células T CD4 ou CD8. 1.3.5. Métodos Estatísticos 1.3.5.1. Pontos finais primários • Percentagem, intensidade e relação com a vacinação de sinais e sintomas locais e gerais solicitados durante um período de 7 dias de acompanhamento (i. e., dia da vacinação e 6 dias subsequentes) após vacinação e em termos globais. 107
Percentagem, intensidade e relação com a vacinaçao de sinais e sintomas locais e gerais não solicitados durante um período de 21 dias de acompanhamento (i. e., dia da vacinação e 20 dias subsequentes) após vacinação e em termos globais.
Ocorrência de eventos adversos sérios durante a totalidade do estudo. 1.3.5.2. Pontos finais secundários Para a resposta imune humoral:
Variáveis observadas:
Aos dias 0 e 21: inibição da hemaglutinação (Hl) sérica e titulos de anticorpos de NI, testados separadamente contra cada das três estirpes de virus da gripe representadas na vacina (anticorpos anti-HINl, anti-H3N2 e anti-B).
Aos dias 0 e 21: titulos de anticorpos neutralizantes, testados separadamente contra cada das três estirpes de virus da gripe representadas na vacina
Variáveis derivadas (com intervalos de confiança de 95%):
Titulos médios geométricos (GMT) de anticorpos séricos de Hl com intervalos de confiança de 95% (IC de 95%) pré- e pós-vacinação
Taxas de seroconversão* com IC de 95% no dia 21 Factores de conversão** com IC de 95% no dia 21 Taxas de seroprotecção*** com IC de 95% no dia 21 • GMT de anticorpos séricos de NI (com intervalos de confiança de 95%) em todos os pontos de tempo. * A taxa de seroconversão é definida como a percentagem de vacinados que têm, pelo menos, um aumento de 4 vezes nos títulos séricos de Hl no dia 21 comparativamente ao dia 0, para cada estirpe de vacina. ** O factor de conversão é definido como o número de vezes que aumentaram os GMT séricos de Hl no dia 21 comparativamente ao dia 0, para cada estirpe de vacina. *** A taxa de protecção é definida como a percentagem de vacinados com um título sérico de Hl =40 após vacinação (para cada estirpe de vacina) que normalmente é aceite como indicador de protecção.
Para a resposta imune mediada por célula (CMI)
Variável observada
Nos dias 0 e 21: frequência de células CD4/CD8 positivas a citocinas por 106 em testes diferentes. Cada teste quantifica a resposta de células T CD4/CD8 a: • Antigénio peptídico da gripe (pf) (a natureza e a origem precisas destes antigénios necessita ser dada/explicada • Antigénio fragmentado da gripe (sf) • Antigénio inteiro da gripe (wf). 109
Variáveis derivadas : • célula produzindo, pelo menos, duas citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa) • célula produzindo, pelo menos, CD40L e outra citocina (IL-2, TNFa, IFNy) • célula produzindo, pelo menos, IL-2 e outra citocina (CD40L, TNFa, IFNy) • célula produzindo, pelo menos, IFNy e outra citocina (IL-2, TNFa, CD40L) • célula produzindo, pelo menos, TNFa e outra citocina (IL-2, CD40L, IFNy) 1.3.5.3. Análise de imunogenicidade A análise de imunogenicidade foi baseada no coorte total de vacinados. Para cada grupo de tratamento, os seguintes parâmetros (com intervalos de confiança de 95%) foram calculados: • Títulos médios geométricos (GMT) de títulos de anticorpos de Hl e NI nos dias 0 e 21 • Títulos médios geométricos (GMT) de títulos de anticorpos neutralizantes nos dias 0 e 21. • Factores de conversão no dia 21. • Taxas de seroconversão (SC) no dia 21, definida como a percentagem de vacinados que têm, pelo menos, um aumento de 4 vezes nos títulos séricos de Hl no dia 21 comparativamente ao dia 0. • Taxas de protecção no dia 21, definida como a percentagem de vacinados com um título sérico de Hl = 1:40. 110 • A frequência dos linfócitos T CD4/CD8 que segregam em resposta foi resumida (estatística descritiva) para cada grupo de vacinação, em cada ponto do tempo (dia 0, dia 21) e para cada antigénio (peptídico da gripe (pf), fragmentado da gripe (sf) e inteiro da gripe (wf)). • Estatística descritiva em diferenças individuais entre as respostas de ponto do tempo (Pós-pré) para cada grupo de vacinação e cada antigénio (pf, sf, e wf) em cada 5 testes diferentes. • Um teste não paramétrico (teste de Kruskal-Walis) foi utilizado para comparar as diferenças de posição entre os 3 grupos e foi calculado o valor p estatístico para cada antigénio em cada 5 testes diferentes. Todos os testes de significância foram bilaterais. Os valores de p menores ou iguais a 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.
Exemplo II - Preparação do adjuvante lipossomal MPL/QS21 II.3 Preparação da suspensão liquida de MPL 0 MPL (como utilizado ao longo de todo o documento é uma abreviatura para 3D-MPL, i. e., lípido A monofosforil-3-Ο-desacilado) líquido em bruto é preparado a partir de pó liofilizado de 3D-MPL. 0 MPL líquido em bruto é uma dispersão aquosa concentrada estável (em torno de 1 mg/mL) do material em bruto, que está pronto-a-utilizar para a vacina ou formulação adjuvante. Uma representação esquemática do processo de preparação é apresentada na Figura 1. 111
Para um tamanho máximo de lote de 12 g, a preparação de MPL líquido em bruto é realizada em recipientes de vidro estéreis. A dispersão de MPL consiste nos seguintes passos: • suspender o pó de MPL em água para injecção • desagregar quaisquer agregados grandes por aquecimento (tratamento térmico) • reduzir o tamanho de partícula entre 100 nm e 200 nm por microfluidização • pré-filtrar a preparação numa unidade de pré-filtração Sartoclean, 0,8/0,65 pm • filtrar de modo estéril a preparação à temperatura ambiente (unidade Sartobran P, 0,22 pm) 0 pó de MPL é liofilizado por microfluidização resultando numa dispersão aquosa coloidal estável (partículas de MPL de um tamanho susceptível a filtração estéril). O pó liofilizado de MPL é disperso em água para injecção de modo a obter 10 mg/mL de uma suspensão grosseira. A suspensão é depois submetida a tratamento térmico sob agitação. Após arrefecer até à temperatura ambiente, o processo de microfluidização é iniciado de modo a diminuir o tamanho de partícula. A microfluidização é conduzida utilizando um dispositivo Microfluidics M110EH, por circulação continua da dispersão através de uma câmara de interacção de microfluidização, a uma pressão definida durante uma quantidade mínima de passagens (número de ciclos: nmin). A duração da microfluidização, representando o número de ciclos, é calculada com base no caudal medido e no volume de dispersão. Num determinado equipamento e a uma determinada pressão, o caudal resultante pode variar de uma câmara de interacção para outra, e ao longo do ciclo de vida de uma câmara de interacção particular. No presente exemplo, a câmara de interacção utilizada é do tipo F20Y Microfluidics. Uma vez que a eficiência 112 de microfluidização está ligada ao par pressão-caudal, o tempo de processamento pode variar de um lote para outro. 0 tempo requerido para 1 ciclo é calculado com base no caudal. 0 caudal a ser considerado é o caudal medido com água para injecção, imediatamente antes da introdução de MPL no dispositivo. Um ciclo é definido como o tempo (em minutos) necessário para o volume total de MPL passar uma vez através do dispositivo. 0 tempo necessário para obter n ciclos é calculado como se segue: n x quantidade de MPL para tratar (ml·)/caudal (mL/min) 0 número de ciclos é assim adaptado em conformidade. A quantidade mínima de ciclos a realizar (nmin) é descrita para o equipamento e câmaras de interacção preferidos utilizados. A quantidade total de ciclos a utilizar é determinada pelo resultado de uma medição do tamanho de partícula realizada após nmin ciclos. É definido um limite de tamanho de partícula (diim) , com base em dados históricos. A medição é realizada por técnica através de espectroscopia de correlação de fotão (PCES) e o dnm é expresso como um resultado unimodal (Zmédia)· Abaixo deste limite, a microfluidização pode ser parada após nmin ciclos. Acima deste limite, a microfluidização é mantida até ser obtida uma redução de tamanho satisfatória, no máximo durante mais 50 ciclos.
Se a filtração não ocorrer imediatamente após a microf luidização, o MPL disperso é armazenado a +2 a +8 °C, esperando transferência para a área de filtração.
Após microfluidização, a dispersão é diluída com água para injecção e filtrada de modo estéril através de um filtro de 0,22 pm sob fluxo laminar. A concentração final de MPL é 1 mg/mL (0,80-1,20 mg/mL). 113 II.2 Preparação de adjuvante lipossomal MPL/QS21
Este adjuvante, denominado AS01, compreende 3D-MPL e QS21 numa forma inactivada com colesterol e foi preparado como descrito no documento WO 96/33739. Em particular, o adjuvante AS01 foi preparado essencialmente como no Exemplo 1.1 do documento WO 96/33739. 0 adjuvante AS01B compreende: lipossomas, que por sua vez compreendem dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), colesterol e 3D MPL [numa quantidade de 1000 pg de DOPC, 250 pg de colesterol e 50 pg 3D-MPL, cada valor dado aproximadamente por dose de vacina], QS21 [50 pg/dose], tampão fosfato NaCl e água para um volume de 0,5 mL. O adjuvante AS01E compreende os mesmos ingredientes que AS01B mas numa concentração mais baixa, numa quantidade de 500 pg de DOPC, 125 pg de colesterol, 25 pg de 3D-MPL e 25 pg de QS21, tampão fosfato NaCl e água para um volume de 0,5 mL.
No processo de produção de lipossomas contendo MPL, são dissolvidos DOPC (dioleilfosfatidilcolina) , colesterol e MPL em etanol. Uma película lipídica é formada por evaporação do solvente sob vácuo. É adicionado soro fisiológico tamponado com fosfato (9 mM de Na2HP04, 41 mM de KH2P04, 100 mM de NaCl) a pH 6,1 e a mistura é submetida a pré-homogeneização, seguida por homogeneização a alta pressão a 15000 psi (cerca de 15 a 20 ciclos). Isto conduz à produção de lipossomas que são filtrados de modo estéril através de uma membrana de 0,22 pm numa área asséptica (classe 100) . O produto estéril é depois distribuído em recipientes de vidro estéreis e armazenado numa câmara fria (+2 a +8 °C).
Deste modo, os lipossomas produzidos contêm MPL na membrana (a forma de realização "MPL in" do documento WO 96/33739). 114 A QS21 é adicionada em solução aquosa à concentração desejada.
Exemplo III - Avaliação pré-clinica de vacinas da gripe adjuvadas e não adjuvadas em furões III.1. Fundamentação e objectivos A infecção da gripe no modelo de furão mimetiza muito bem a gripe humana, relativamente à sensibilidade à infecção e à resposta clinica. 0 furão é extremamente sensível à infecção com vírus de gripe A e B sem adaptação prévia de estirpes virais. Deste modo, este proporciona um excelente sistema de modelo para estudos de protecção conferida por administração de vacinas da gripe. Este estudo investigou a eficácia de várias vacinas fragmentadas trivalentes, adjuvadas ou não, para reduzir os sintomas de doença (temperatura corporal) e disseminação virai em secreções nasais de furões desafiados com estirpes homólogas. 0 objectivo desta experiência foi demonstrar a eficácia de uma vacina da gripe adjuvada comparativamente à vacina simples (não adjuvada).
Os pontos finais foram: 1) ponto final primário: redução da disseminação virai em lavagens nasais após desafio homólogo: 2) pontos finais secundários: Análise da resposta humoral através de títulos de Hl. 115 III.2. Concepção experimental III. 2.1. Tratamento/grupo (Tabela 1)
Furões fêmeas (Mustela putorius furo) com 14-20 semanas foram obtidos da MISAY Consultancy (Hampshire, RU) . Os furões foram iniciados no dia 0 com estirpe hetero-subtípica H1N1 A/Estocolmo/24/90 (4 Log TCID5o/mL) . No dia 21, os furões foram injectados intramuscularmente com uma dose total humana (dose de vacina de 500 pg, 15 pg de HA/estirpe) de uma combinação de H1N1 A/Nova Caledónia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 e B/Shangdong/7/97. Os furões foram depois desafiados no dia 42 por via intranasal com uma estirpe hetero-subtipica H3N2 A/Wyoming/3/2003 (4,5 Log TCID50/mL).
Tabela 1
Grupo Antigénio + dosagem Formulação + dosagem Comentários (plano/via/ desafio) In/Po Outros tratamentos 1 Simples Trivalente DH Total: 15 pg de HA/estirpe IM; Dia 21 In Iniciação H1N1 (A/Estocolmo/24/90) Dia 0 2 Trivalente /MPL-QS21 em lipossomas DH Total: 15 pg de HA/estirpe IM; Dia 21 In Iniciação H1N1 (A/Estocolmo/24/90) Dia 0 6 furões/grupo. In/Po = Individual/agrupamento 116 III. 2.2. Preparação das formulações de vacina (Tabela 2)
Formulação 1: Formulação simples (nao adjuvada) fragmentada trivalente: É adicionado PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando concentrado uma vez) assim como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades tendo em consideração os detergentes presentes nas estirpes) a água para injecção. Após agitar 5 minutos, são adicionados 15 pg de cada estirpe H1N1, H3N2 e 17,5 pg de estirpe B com 10 minutos de agitação entre cada adição. A formulação é agitada durante o mínimo de 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente.
Formulação 2 : adjuvada de gripe fragmentada trivalente com MPL/QS21 em lipossomas: É adicionado PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando concentrado uma vez) assim como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades tendo em consideração os detergentes presentes nas estirpes) a água para injecção. Após agitar 5 minutos, são adicionados 15 pg de cada estirpe H1N1, H3N2 e 17,5 pg de estirpe B com 10 minutos de agitação entre cada adição. A formulação é agitada durante um mínimo de 15 minutos. Uma pré-mistura denominada DQS21-MPLin é adicionada à formulação que é depois agitada durante 15 minutos. A pré-mistura DQS21-MPLin é uma mistura de lipossomas (feitos de DOPC 40 mg/mL, colesterol 10 mg/mL, MPL 2 mg/mL) e o imunoestimulador QS21. Esta pré-mistura é incubada durante um mínimo de 15 minutos, antes da adição à mistura fragmentada trivalente. A concentração de MPL e QS21 na formulação final é 117 50 pg por 500 pL. A formulação é armazenada a 4 °C, se nao administrada directamente.
Nota: Em cada formulação, é adicionado PBS 10 vezes concentrado para atingir isotonicidade e é 1 vez concentrado no volume final. O volume de H20 é calculado para alcançar o volume desejado.
Tabela 2: Composição final das formulações 1 e 2 (Formulações preparadas com estirpes fragmentadas (para 500 pL))
Formulação Antigénio Tween 80 Triton X-100 VES DOPC Coles terol MPL QS21 1 H1N1:15 pg H3N2: 15 gg B: 17,5 pg 375 gg 55 gg 5 0 gg 2 H1N1:15 gg H3N2: 15 gg B: 17,5 gg 375 gg 55 gg 50 gg 1 mg 250 gg 50 gg 50 gg III.2.3. Leituras (Tabela 3)
Tabela 3
Leitura Ponto do tempo Amostra-tipo Método de análise Disseminação virai D+l a D+7 Pós desafio Lavagens nasais Titulação Anticorpos anti-HI (títulos de Hl) Pré, Pós iniciação, Pós imunização, Pós desafio Soros Teste de inibição de Hemaglutinação 118 III.3. Resultados
Uma representação esquemática dos resultados é apresentada nas Figuras 1 e 2. III.3.1. Imunidade humoral (Figura 1).
Actividade de inibição da hemaglutinação contra as estirpes de vacina H3N2 (estirpe de vacina A/Panamá/2007/99 e estirpe de desafio A/Wyoming/3/2003) foi detectada em soros de 6 animais por grupo, no Dia 17 após iniciação heteróloga intranasal e no Dia 21 Pós-imunização e no Dia 13 Pós-desafio.
Os títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três estirpes de vírus da gripe foram determinados utilizando o teste de inibição da hemaglutinação (Hl) como detalhado no Exemplo 1.2.1. As conclusões são as seguintes: > Para as duas estirpes A/H3N2 e para todos os grupos, um aumento dos títulos de Hl foi observado em todos os grupos vacinados após imunização. ^ Pós-imunização com A/Panamá/2007/99, foram observados títulos de Hl anti-A/Panamá/2007/99 mais elevados, estatisticamente significativos, quando a vacina fragmentada trivalente foi adjuvada com MPL/QS21 em lipossomas comparativamente à vacina simples fragmentada trivalent. > Após imunização com A/Panamá/2007/99, apenas a fragmentada trivalente adjuvada com MPL/QS21 em lipossomas foi capaz de aumentar significativamente os títulos de Hl para a estirpe 119 heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reactividade cruzada antes do desafio com esta estirpe de desvio). ^ Após desafio com A/Wyoming3/2003, foi observado um aumento significativo de títulos de Hl anti-A/Wyoming/3/2003 para a fragmentada trivalente simples e fragmentada trivalente adjuvada com MPL/QS21 em lipossomas. > Para estirpes A/Nova Caledónia/20/99 e B/Shangdong/7/97, foram observados títulos de Hl mais elevados, estatisticamente significativos, quando a fragmentada trivalente foi adjuvada com MPL/QS21 em lipossomas comparativamente à vacina fragmentada trivalente simples. III.3.2. disseminação virai (Figura 3). A titulação virai de lavagens nasais foi realizada em 6 animais por grupo como detalhado no Exemplo 1.2.3. As lavagens nasais foram realizadas por administração de 5 mL de PBS em ambas as narinas em animais acordados. A inoculação foi recolhida numa placa de Petri e colocada em recipientes de amostra a -80 °C. > Dois dias após o desafio, foi observada disseminação virai mais baixa, estatisticamente significativa, com fragmentada trivalente adjuvada com MPL/QS21 em lipossomas comparativamente à fragmentada trivalente simples. > No dia 49 (7 dias Pós-desafio), nenhum vírus foi detectado em lavagens nasais. 120 III.3.3. Conclusão da experiência
Foram observadas respostas humorais mais elevadas (títulos de Hl) com fragmentada trivalente adjuvada com MPL/QS21 em lipossomas comparativamente à fragmentada trivalente simples para todas as 4 estirpes.
Após imunização com A/Panamá/2007/99, apenas a fragmentada trivalente adjuvada com MPL/QS21 em lipossomas foi capaz de aumentar significativamente os títulos de Hl para a estirpe heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reactividade cruzada antes do desafio com esta estirpe). A presença de MPL/QS21 em formulações lipossomais mostrou um benefício acrescentado em termos de eficácia protectora em furões (disseminação virai mais baixo após desafio heterólogo). A reacção cruzada observada após imunização com fragmentada trivalente MPL/QS21 em lipossomas contra a estirpe de desvio utilizada para o desafio pareceu correlacionar com o efeito de protecção observado nestes furões.
Exemplo IV - Avaliação Pré-clinica de vacinas da gripe adjuvadas e não adjuvadas em murganhos C57BI/6 iniciados IV.1. Concepção experimental e objectivo
Foram utilizados murganhos C57BI/6 iniciados com estirpes heterólogas para esta experiência. 0 objectivo foi comparar as respostas imunes humorais (títulos de Hl) e CMI (ICS, coloração intracelular de citocinas) induzidas por uma vacina fragmentada trivalente comercialmente 121 disponível da GlaxoSmitKline (Fluarix™) versus uma vacina trivalente de subunidade (vacina Agrippal™ da Chiron), assim como que a resposta de CMI obtida com estas vacinas adjuvadas com lipossomas contendo apenas 3D-MPL, apenas DQS21 (QS21 em lipossomas, i. e., QS21 destoxifiçada) ou MPL/QS21 em lipossomas. No exemplo aqui apresentado abaixo, as formulações foram preparadas partindo de fragmentados em bruto para alcançar a mesma composição do que na vacina Fluarix e não partir de doses comercialmente disponíveis de Fluarix. As formulações obtidas foram denominadas "tipo Fluarix". IV.1.1. Tratamento/grupo
Os murganhos C57BI/6 fêmeas com 6-8 semanas foram obtidos da Harlan Horst, Holanda. Os murganhos foram iniciados no dia 0 com estirpes hetero-subtípicas (5 pg de HA inteira inactivada H1N1 A/Beijing/262/95, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shangdong/7/97). No dia 28, os murganhos foram injectados intramuscularmente com 1/5 pg de HA fragmentada trivalente simples (A/Nova Caledónia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) ou adjuvada (ver grupos nas Tabelas 4 a 6 abaixo).
Tabela 4
Gr Antigénio/Formulação Outro tratamento 1 Fragmentado trivalente*/simples (não adjuvada) = tipo Fluarix Iniciação heteróloga DO 2 Fragmentado trivalente*/ Lipossomas contendo 3D-MPL Iniciação heteróloga DO 3 Fragmentado trivalente*/DQS21 Iniciação heteróloga DO 122 (continuação)
Gr Antigénio/Formulação Outro tratamento 4 Fragmentado trivalente*/MPL/QS21 em lipossomas Iniciação heteróloga D0 5 TM Agrippal (subunidade) Iniciação heteróloga D0 6 Agrippal1” (subunidade) /Lipossomas contendo 3D-MPL Iniciação heteróloga D0 7 Aggripal1” (subunidade)/DQS21 Iniciação heteróloga D0 8 Aggripal1” (subunidade)/MPL/QS21 em lipossomas Iniciação heteróloga D0 9 PBS Iniciação heteróloga D0 * Tipo Fluarix. 16 murganhos/grupo IV.1.2. Preparaçao das formulações de vacina
Formulação para o grupo 1:
Foi adicionado PBS 10 vezes concentrado (pH 7, 4 quando concentrado uma vez) assim como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades que tomam em consideração os detergentes presentes nas estirpes) a água para injecção. Após agitar 5 minutos, foram adicionados 15 pg de cada estirpe H1N1, H3N2 e 15 pg de estirpe B com 10 minutos de agitação entre cada adição. A formulação é agitada durante no minimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente.
Formulação para o grupo 2:
Foi adicionado PBS 10 vezes concentrado (pH 7, 4 quando concentrado uma vez), assim como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades que tomam em consideração os 123 detergentes presentes nas estirpes) a água para injecção. Após agitar 5 minutos, foram adicionados 15 pg de cada estirpe H1N1, H3N2 e 15 pg de estirpe B com 10 minutos de agitação entre cada adição. A formulação é agitada durante 15 minutos. Foram adicionados lipossomas concentrados contendo 3D-MPL (feitos de DOPC 40 mg/mL, colesterol 10 mg/mL, 3D-MPL 2 mg/mL) para alcançar uma concentração final de MPL de 50 pg por dose. A formulação é depois agitada no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente.
Formulação para o grupo 3:
Foi adicionado PBS 10 vezes concentrado (pH 7, 4 quando concentrado uma vez) assim como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades que tomam em consideração os detergentes presentes nas estirpes) a água para injecção. Após agitar 5 minutos, foram adicionados 15 pg de cada estirpe H1N1, H3N2 e 15 pg de estirpe B com 10 minutos de agitação entre cada adição. A formulação é agitada durante 15 minutos. Uma pré-mistura feita de lipossomas (feitos de DOPC 40 mg/mL, colesterol 10 mg/mL) e QS21 chamado "DQS21" é depois adicionado para alcançar uma concentração de QS21 de 50 pg por dose. Esta pré-mistura é incubada, pelo menos, 15 minutos antes da adição à mistura fragmentada trivalente. A formulação é agitada durante no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente.
Formulação para o grupo 4:
Foi adicionado PBS 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando concentrado uma vez), assim como uma mistura contendo Tween 80, 124
Triton X—100 e VES (quantidades que tomam em consideração os detergentes presentes nas estirpes) a água para injecção. Após agitar 5 minutos, foram adicionados 15 pg de cada estirpe H1N1, H3N2 e 15 pg de estirpe B com 10 minutos de agitação entre cada adição. A formulação é agitada durante 15 minutos. Uma mistura feita de lipossomas contendo 3D-MPL (feitos de DOPC 40 mg/mL, colesterol 10 mg/mL, 3D-MPL 2 mg/mL) e QS21 é depois adicionada para alcançar concentrações de QS21 e MPL de 50 pg por dose. Esta mistura é incubada, pelo menos, 15 minutos antes da adição à mistura fragmentada trivalente. A denominada formulação "fragmentada trivalente MPL/QS21 em lipossomas" é agitada durante no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente.
Nota: Nos grupos 1 a 4, o PBS 10 vezes concentrado é adicionado para alcançar isotonicidade e é 1 vez concentrado no volume final. O volume de H20 é calculado para alcançar o volume desejado.
Formulação para o grupo 5:
Uma dose de Agrippal™ é misturada com volume igual de PBS a pH 7,4 de. A formulação é agitada durante no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente.
Formulação para o grupo 6: São misturados PBS pH 7,4 e uma dose de Agrippal™. São depois adicionados lipossomas contendo 3D-MPL (feitos de DOPC 40 mg/mL, colesterol 10 mg/mL, 3D-MPL 2 mg/mL) sob agitação para alcançar o equivalente de 50 pg de MPL por dose. A formulação é 125 agitada durante no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se nao administrada directamente.
Nota: 0 PBS é adicionado para alcançar isotonicidade no volume final. 0 Aggripal é metade do volume da formulação.
Formulação para o grupo 7: São misturados PBS pH 7,4 e uma dose de Agrippal™. Uma pré-mistura de lipossomas (feitos de DOPC 40 mg/mL, colesterol 10 mg/mL) e QS21 denominado "DQS21" é depois adicionado sob agitação para alcançar o equivalente de 50 pg de QS21. Esta pré-mistura é incubada durante, pelo menos, 15 minutos antes da adição. A formulação é agitada no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente.
Nota: 0 PBS é adicionado para alcançar isotonicidade no
TM volume final. O Aggripal e metade do volume da formulação.
Formulação para o grupo 8: São misturados PBS pH 7,4 e uma dose de Agrippal™. Uma pré-mistura do denominado "DQS21-MPLin" é adicionada sob agitação à formulação. A pré-mistura de DQS21-MPLin é uma mistura de lipossomas (feitos de DOPC 40 mg/mL, colesterol 10 mg/mL, MPL 2 mg/mL) e do imunoestimulador QS21. Esta pré-mistura é incubada durante, pelo menos, 15 minutos antes da adição à mistura de Aggripal/PBS. A quantidade de MPL e QS21 na formulação é 50 pg cada. A formulação é agitada no mínimo 15 minutos e armazenada a 4 °C, se não administrada directamente. 126
Nota: 0 PBS é adicionado para alcançar isotonicidade no volume final. 0 Aggripal é metade do volume da formulação.
Tabela 5: Composição final das formulações 1 a 4 preparadas com estirpes fragmentadas (para 1 mL)
Grupo Antigénio Tween 80 Triton X-100 VES DOPC Coles terol MPL QS21 1 H1N1: 15 pg H3N2: 15 pg B: 17,5 pg 750 pg 110 pg 100 pg 2 Idêntico a 1 Idêntico a 1 110 pg 100 pg 1 mg 250 pg 50 pg — 3 Idêntico a 1 Idêntico a 1 110 pg 100 pg 1 mg 250 pg - 50 pg 4 Idêntico a 1 Idêntico a 1 110 pg 100 pg 1 mg 250 pg 50 pg 50 pg
Tabela 6: Composição final das formulações 5 a 8 preparadas com vacina Agrippal™ (1 mL)
Grupo Antigénio DOPC Colesterol MPL QS21 5 1 dose de vacina - - - - Aggripal 6 Idêntico a 5 1 mg 250 pg 50 pg - 7 Idêntico a 5 1 mg 250 pg - 50 pg 8 Idêntico a 5 1 mg 250 pg 50 pg 50 pg 127 IV.1.3. Leituras (Tabela 7)
Tabela 7
Leitura Ponto do tempo Tipo de amostra In/Po Método de análise Anticorpos anti-HI (títulos de Hl) Dia 21 Pós-Imunização (Dia 49) Soros In Teste de inibição de Hemaglutinação CD4, CD8, IL-2, IFN-γ (FACS) Dia 7 Pós-Imunização (Dia 35) PBL Po Coloração intracelular de Citocinas (ICS) In = Indivíduo/Po = Agrupamneto IV.2. Resultados IV.2.1. Resposta humoral (títulos de Hl 21 dias após imunização).
Respostas humorais por títulos de Hl - Figura 4. A actividade da inibição da hemaglutinação contra as três estirpes de vacina (A/Nova Caledónia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) foi detectada em soros de 8 animais por grupo no Dia 21 Pós-imunização. ^ Comparativamente a murganhos imunizados com PBS, foi observado um aumento em títulos de Hl após imunização com todos os candidatos de vacina da gripe testados para todas as três estirpes (vacina fragmentada trivalente ou trivalente de subunidade). 128
^ Para todas as três estirpes, foram observados títulos de Hl mais elevados, estatisticamente significativos, em murganhos imunizados com fragmentada trivalente adjuvada apenas com DQS21 ou MPL/QS21 em lipossomas comparativamente a murganhos imunizados com gripe fragmentada trivalente simples ou adjuvada com Lipossomas contendo apenas 3D-MPL. A classificação para a resposta humoral foi como se segue: (MPL/QS21 em lipossomas = apenas DQS21) > (Lipossomas contendo apenas 3D-MPL = simples) > PBS ^ Para todas as três estirpes, foram observados títulos de Hl mais elevados, estatisticamente significativos, em murganhos imunizados com subunidade trivalente adjuvada apenas com DQS21, Lipossomas contendo apenas 3D-MPL ou MPL/QS21 em lipossomas comparativamente a murganhos imunizados com fragmentada trivalente simples. A classificação para a resposta humoral foi como se segue: (MPL/QS21 em lipossomas = apenas DQS21 = Lipossomas contendo apenas 3D-MPL) > simples > PBS. ^ Fragmentada trivalente e trivalente de subunidade induzem títulos de Hl semelhantes quando as formulações foram não adjuvadas ou adjuvadas com apenas DQS21 ou MPL/QS21 em lipossomas. 129 IV.2.2. Resposta imune mediada por célula (ICS no dia 7 pós-imunização).
Respostas de célula T CD4 - Figura 5
As PBMC de 8 murganhos por grupo foram recolhidas no Dia 7 Pós-imunização e testadas em 4 agrupamentos de 2 murganhos/grupo. Em termos de células T CD4+ totais especificas de vírus inteiro da gripe (expressando IL-2, IFN-γ e ambas as citocinas): > Qualquer que seja a formulação, foram observadas respostas idênticas de célula T CD4+ entre as vacinas fragmentadas trivalentes e trivalentes de subunidade. ^ Foram observadas respostas de célula T CD4+ mais elevadas para formulações trivalentes (fragmentadas ou de subunidade) adjuvadas com MPL/QS21 em lipossomas quando comparadas a formulações trivalentes (fragmentadas ou de subunidade) simples ou adjuvadas com lipossomas contendo apenas 3D-MPL ou apenas DQS21. ^ Para a resposta celular induzida por uma formulação trivalente (fragmentada ou de subunidade), existe um efeito sinérgico de Lipossomas contendo 3D-MPL + DQS21 comparativamente a apenas DQS21 ou Lipossomas contendo apenas 3D-MPL. ^ A classificação para a resposta celular foi como se segue: MPL/QS21 em lipossomas > (Lipossomas contendo apenas 3D-MPL = apenas DQS21 = simples = PBS). 130 IV.3. Resumo de resultados e conclusões ^ Para todas as três estirpes, foram observados títulos de Hl mais elevados, estatisticamente significativos, em murganhos imunizados com formulações trivalentes (fragmentadas ou de subunidade) adjuvadas com apenas DQS21 ou MPL/QS21 em lipossomas comparativamente a murganhos imunizados com formulações trivalentes (fragmentadas ou de subunidade) simples. Os lipossomas contendo apenas 3D-MPL parecem induzir uma resposta humoral mais elevada quando formulados com subunidade trivalente do que fragmentada trivalente. ^ Qualquer que seja a formulação, foram obtidas respostas semelhantes de célula T CD4+ para fragmentada trivalente (Fluarix) e de subunidade trivalente (Agrippal). ^ As formulações trivalentes (fragmentadas ou de subunidade) adjuvadas com MPL/QS21 em lipossomas induzem respostas de célula T CD4+ mais elevadas comparativamente a formulações trivalentes (fragmentadas ou de subunidade) simples ou adjuvadas com Lipossomas contendo apenas 3D-MPL ou apenas QS21 em lipossomas (DQS21). 131
Exemplo V - Comparação pré-clinica de uma vacina uma preparação antigénica gripal fragmentada adjuvada com 3D-MPL/QS21 numa formulação lipossomai (3D-MPL a duas concent raçõe s diferentes) V.l — murganhos. V.l.l - Concepção experimental e objectivo.
Foram utilizados murganhos C57B1/6 iniciados com estirpes heterólogas para esta experiência. 0 objectivo foi analisar as respostas imunes humorais (titulos de Hl) e CMI (ICS, coloração intracelular de citocinas) induzidas por uma vacina fragmentada trivalente comercialmente disponível da GlaxoSmitKline (Fluarix™) numa forma não adjuvada e quando adjuvada com lipossomas contendo duas concentrações diferentes de 3D-MPL e QS21. V.l.2 Tratamento/Grupo
Foram obtidos murganhos C57B1/6 fêmeas com 8 semanas da Harlan Horst, Holanda. Os murganhos foram iniciados intranasalmente no dia 0 com estirpes hetero-subtípicas (inactivadas inteiras A/Beijing/262/95, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shandong/7/97) . No dia 28, os murganhos foram injectados intramuscularmente com fragmentada trivalente (A/Nova Caledónia, A/Wyoming, B/Jiangsu) simples ou adjuvada com duas concentrações diferentes de imunoestimuladores em formulações lipossomais (ver grupos na Tabela 8 abaixo). 132
Tabela 8
Grupo Antigénio(s) + dosagem Formulação + dosagem Outros tratamentos 1 Gripe fragmentada Trivalente -1,5 pg/estirpe/ 50 pL Simples Iniciação heteróloga D0 inactivada inteira 5 pg/20 pL intranasalmente 2 Gripe fragmentada Trivalente -1,5 pg/estirpe/ 50 pL Lipossomas contendo 3D-MPL 50 pg por dose de 0,5 mL Iniciação heteróloga D0 inactivada inteira 5 pg/20 pL intranasalmente 3 Gripe fragmentada Trivalente -1,5 pg/estirpe/ 50 pL DQS21 50 pg por dose de 0,5 mL Iniciação heteróloga D0 inactivada inteira 5 pg/20 pL intranasalmente 4 Gripe fragmentada Trivalente -1,5 pg/estirpe/ 50 pL MPL e QS21 25 pg por dose de 0,5 mL Iniciação heteróloga D0 inactivada inteira 5 pg/20 pL intranasalmente 5 Gripe fragmentada Trivalente -1,5 pg/estirpe/ 50 pL MPL e QS21 50 pg por dose de 0,5 mL Iniciação heteróloga D0 inactivada inteira 5 pg/20 pL intranasalmente 6 PBS Nenhuma Iniciação heteróloga D0 inactivada inteira 5 pg/20 pL intranasalmente
As formulações foram preparadas como no Exemplo IV. 133 V. 1.3 resultados .
Respostas humorais por títulos de Hl - Figura 24. A actividade de inibição de hemaglutinação contra as 3 estirpes de vacina foi detectada em soros de 9 animais/grupo no dia 21 pós-imunização. > Comparativamente a murganhos imunizados com PBS, foi observado um aumento em títulos de Hl após imunização com todos os candidatos de vacina da gripe testados para todas as três estirpes. > Para todas as três estirpes, foram observados títulos de Hl mais elevados, estatisticamente significativos, em murganhos imunizados com fragmentada trivalente com adjuvante MPL e QS21 em qualquer concentração comparativamente a murganhos imunizados com Gripe Fragmentada Trivalente Simples (valor máximo de p = 0,03) estatisticamente de adjuvantes > Não foi observada qualquer diferença significativa entre os dois grupos lipossomais
Resposta imune mediada por célula (ICS no dia 7 pós-imunização) - Figura 25.
Foram recolhidas PBMC de 9 murganhos/grupos 7 dias pós-imunização e testadas em três agrupamentos de 3 murganhos/grupo. Em termos de células T CD4+ específicas de vírus da gripe inteiro que expressam IL-2, IFN-γ ou ambas as citocinas: 134
Como pode ser observado na Figura 25, as respostas específicas de célula T CD4+ IFN-γ mais elevadas foram obtidas após imunização com fragmentada trivalente adjuvada com a maior concentração de imunoestimuladores. Contudo, as respostas de célula T de IL2 e IL2+ IFN-γ foram semelhantes entre as duas concentrações de imunoestimuladores.
Exemplo VI - Ensaio clinico numa população idosa com mais de 65 anos com uma vacina contendo uma preparação antigénica gripal fragmentada adjuvada com MPL/QS21 numa formulação lipossomal (3D-MPL a duas concentrações diferentes) VI.1. Concepção do ensaio e objectivos
Um ensaio aleatorizado de fase I/II aberto para demonstrar a não inferioridade em termos de resposta imune mediada por célula das vacinas da gripe candidatas da GlaxoSmitKline Biologicals contendo vários adjuvantes administradas numa população idosa (com 65 anos ou mais) em comparação com Fluarix™ (conhecida como α-Rix™ na Bélgica) administrada em adultos (18-40 anos)
Foram atribuídos quatro grupos paralelos: • 75 adultos (com idades de 18-40 anos) num grupo de controlo que recebe uma dose de Fluarix™ (grupo Fluarix) • 200 indivíduos idosos (com 65 anos ou mais) aleatorizados 3:3:2 em três grupos:
Um grupo com 75 indivíduos que recebem a vacina da gripe adjuvada com AS01 B 135
Um grupo com 75 indivíduos que recebem a vacina da gripe adjuvada com AS01E
Grupo de referência da gripe com 50 indivíduos que recebem uma dose de Fluarix™
Objectivo Primário O objectivo primário é demonstrar a não inferioridade 21 dias pós-vacinação das vacinas da gripe adjuvadas administradas em indivíduos idosos (com 65 anos ou mais) comparativamente a Fluarix™ administrado em adultos (com 18-40 anos) em termos de frequência de linfócitos T CD4 específicos de gripe que produzem, pelo menos, duas citocinas diferentes (CD40L, IL-2, TNF-a, IFN-γ).
Objectivos secundários
Os objectivos secundários sao: 1) Avaliar a segurança e a reactogenicidade de vacinação com vacinas da gripe candidatas adjuvadas durante 21 dias, após a administração intramuscular da vacina em indivíduos idosos (com 65 anos ou mais). Fluarix™ é utilizado como referência. 2) Avaliar a resposta imune humoral (titulo anti-hemaglutinina) 21, 90 e 180 dias após vacinação com vacinas da gripe candidatas adjuvadas. Fluarix™ é utilizado como referência. 136
Objectivo Terciário 0 objectivo terciário é avaliar a resposta imune mediada por célula (produção de IFN-γ, IL-2, CD40L e resposta de célula B de memória e TNF-a) 21, 90 e 180 dias após vacinação com vacinas da gripe adjuvadas. Fluarix™ é utilizado como referência. VI.2. Composição de vacina e administração
Foram utilizados dois adjuvantes diferentes: 1. AS01B, um adjuvante baseado em lipossoma contendo 50 pg de MPL e QS21
2. AS01E, uma formulação diluída duas vezes de AS01B
Controlo: dose total de Fluarix™ por administração IM.
Todas as vacinas são pretendidas para administração intramuscular. As estirpes utilizadas nas cinco vacinas são aquelas que foram recomendadas pela OMS para a estação de 2005-2006 do hemisfério norte, i. e., A/Nova Caledónia/20/99 (H1N1), A/Nova Iorque/7/2004 (H3N2) e B/Jiangsu/10/2003.
Os três antigénios de virião fragmentado inactivado (carga monovalente) utilizados na formulação da vacina da gripe candidata adjuvada, são exactamente os mesmos que os ingredientes activos utilizados na formulação comercial de Fluarix™/a-Rix™ - vacina da gripe inactivada de virião fragmentado da GSK Bio. São derivados de vírus cultivados em ovo. As estirpes da gripe são as recomendadas para a estação de 2005/2006, como utilizadas na formulação comercial de Fluarix™/a-Rix™ de 2005/2006. 137
As estirpes utilizadas nas três vacinas são aquelas que foram recomendadas pela OMS para a estação de 2005-2006 do hemisfério norte, i. e., • A/Nova Caledónia/20/99 (ΗχΝι) IVR-116 • A/Nova Iorque/55/2004 (H3N2) NIMC X-157 • B/Jiangsu/10/2003
Tal como Fluarix™/a-Rix™, a vacina adjuvada contém 15 pg de hemaglutinina (HA) de cada estirpe de vírus da gripe por dose.
VI. 2.1. Descrição dos lotes de vacina adjuvada AS01B A vacina da gripe candidata adjuvada com AS01B é uma vacina de 2 componentes consistindo de antigénios de virião fragmentado inactivado trivalentes concentrados apresentados num frasquinho de vidro e de um frasquinho de vidro contendo o adjuvante AS01B. Na altura da injecção, o conteúdo do frasquinho do adjuvante é retirado e injectado no frasquinho que contém os antigénios de virião fragmentado inactivado trivalentes concentrados. Após mistura, o conteúdo é retirado para a seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular. A agulha utilizada é substituída por uma agulha intramuscular e o volume é corrigido para 1 mL. Uma dose da vacina da gripe candidata adjuvada com AS01B reconstituída corresponde a 1 mL. A vacina da gripe candidata adjuvada com AS01B é uma vacina sem conservante. 138
VI. 2.2 . Composição do lote clínico adjuvado AS01B
Uma dose da vacina da gripe adjuvada com AS01B reconstituída corresponde a 1 mL. A sua composição é apresentada na Tabela 8. Contém 15 pg de HA de cada estirpe de vírus da gripe como na vacina registada Fluarix™/a-Rix®.
Tabela 8 - Composição (gripe e componentes adjuvantes) da vacina da gripe candidata adjuvada com AS01B reconstituída
Componente Quantidade Referência por dose Analítica INGREDIENTES ACTIVOS Viriões fragmentados inactivados - A/Nova Caledónia/ 20/99 (H1N1) IVR-116 15 pg de HA Ph. Eur. 158 - A/Nova Iorque/55/2004 (H3N2) NIMC X-157 15 pg de HA Ph. Eur. 158 - B/Jiangsu/10/2003 15 pg de HA Ph. Eur. 158 ADJUVANTE AS01B - Lipossomas • dioleilfosfatidilcolina (DOPC) 1000 pg GSK Bio 3217 • Colesterol 250 pg Ph. Eur. 0993 • MPL 50 pg GSK Bio 2972 - QS21 50 pg GSK Bio 3034 139
VI. 2.3 . Método de produção do lote de vacina adjuvada AS01B 0 fabrico da vacina da gripe adjuvada com AS01B consiste em três passos principais: • Formulação da carga final trivalente (2 x concentrada) sem adjuvante e enchimento no recipiente de antigénio
• Preparação do adjuvante AS01B • Reconstituição extemporânea da vacina de virus fragmentado adjuvada com AS01B.
Formulação da carga final trivalente sem adjuvante e enchimento no recipiente de antigénio
Os volumes das três cargas monovalentes são baseados no conteúdo de HA medido em cada carga monovalente antes da formulação e num volume alvo de 1320 mL. Soro fisiológico tamponado com fosfato concentrado P04Na/K2 (80 pL/dose) e uma pré-mistura de Tween 80, Triton X-100 e hidrogenossuccinato de a-tocoferil são diluídos em água para injecção. As três monocargas concentradas (A/Nova Caledónia/20/99 IVR-116, A/Nova Iorque/55/2004 NIMC X-157, B/Jiangsu/10/2003) são depois diluídas sucessivamente na solução resultante de soro fisiológico tamponado com fosfato/Tween 80 - Triton X-100 hidrogenossuccinato de α-tocoferil (pH 7,8, 81 mM de NaCl, 1,56 mM de KC1, 4,79 mM de Na2HP04, 0,87 mM de KH2P04, 7,2 mM de
NaH2P04, 72,8 mM de K2HP04, 750 pg/mL de Tween 80, 110 pg/mL de
Triton X-100 e 100 pg/mL de hidrogenossuccinato de a-tocoferilo) de modo a ter uma concentração final de 30 pg de HA de estirpes A (H1N1 e H3N2) por mL de carga final trivalente (15 pg de HA/estirpe A/500 pL de carga final trivalente) e 35 pg de HA de estirpe B (17,5 pg de HA/estirpe B/500 pL de carga final 140 trivalente). Entre a adição de cada carga monovalente, a mistura é agitada durante 10-30 minutos à temperatura ambiente. Após adição da última carga monovalente e 15-30 minutos de agitação, o pH é verificado e ajustado para 7,65 ± 0,25 com HC1 ou NaOH. A carga final trivalente de antigénios é cheia assept icamente em frasquinhos de vidro de Tipo I (Ph. Eur.) estéreis de 3 mL. Cada frasquinho contém um volume de 600 pL (500 pL + 100 p de transbordo).
Preparaçao da carga de adjuvante AS01B e enchimento no recipiente de adjuvante
0 adjuvante AS01B é preparado por mistura de dois componentes: QS21 e lipossomas contendo MPL. A preparação de cada um destes componentes é resumida abaixo. A QS21 é um glicósido de triterpeno obtido de casca da árvore Quillaja saponaria e é produzida por Aquila Worchester, MA, EUA (agora Antigenics). A QS21 é proporcionada à GSK Biologicals como um pó liofilizado. A preparação de QS21 na GSK Bio consiste na suspensão do pó de QS21 em água para injecção a uma concentração de aproximadamente 5 mg/mL, ajuste de pH para pH 6,0 ± 0,2 e filtração estéril. A carga liquida de QS21 é armazenada a -20 °C em recipientes de polietileno. O MPL é o lipido A 4'-monofosforil-3-O-desacilado obtido por hidrólises ácidas e básicas sequenciais do lipopolissacárido da estirpe Re595 de Salmonella minnesota. É produzido por GSK Biologicals, Hamilton, Montana. 0 MPL em bruto é fornecido como o sal liofilizado de trietilamina (TEA).
No processo de produção de lipossomas contendo MPL-, DOPC (dioleilfosfatidilcolina) , colesterol e MPL são dissolvidos em 141 etanol. Uma película lipídica é formada por evaporação do solvente sob vácuo. Soro fisiológico tamponado com fosfato feito de 9 mM de Na2HP04, 41 mM de KH2PO4, 100 mM de NaCl a pH 6,1 é adicionado e a mistura é submetida a pré-homogeneização, seguida por homogeneização a alta pressão a 15000 psi ( + /- 20 ciclos) . Isto conduz à produção de lipossomas que são filtrados de modo estéril através de uma membrana de 0,22 pm numa área asséptica (classe 100). O produto estéril é depois distribuído em recipientes de vidro estéreis e armazenado numa câmara fria (+2 a +8 °C). A preparação de carga estéril de lipossomas é misturada com solução de carga QS21 estéril. Após agitar 30 minutos, esta mistura é adicionada a uma mistura de água para injecção e fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH 6,1 quando diluído 10 vezes. A quantidade do fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH 6,1 quando diluído 10 vezes, é calculada para alcançar a isotonicidade no volume final. 0 pH é verificado. 0 adjuvante é depois filtrado de modo estéril (0,22 pm) e distribuído assepticamente em frasquinhos. Os frasquinhos são armazenados a +2 a +8 °C. 0 diluente AS01B é um líquido incolor opalescente, sem partículas estranhas, contido num frasquinho de vidro de tipo 1 estéril. 0 enchimento alvo para cada frasquinho é 0,7 mL de modo a satisfazer a especificação (h 0,5 mL).
Reconstituição extemporânea da vacina de vírus fragmentado adjuvada com AS01B
Na altura da injecção, o conteúdo do frasquinho contendo o adjuvante é retirado e é injectado no frasquinho que contém os antigénios de virião fragmentado inactivado trivalentes 142 concentrados. Após mistura, o conteúdo é retirado para a seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular e o volume é corrigido para 1 mL. Uma dose da vacina da gripe candidata adjuvada com AS01B reconstituída corresponde a 1 mL.
VI, 2,4, Descrição dos lotes de vacina adjuvada com AS01E A vacina da gripe candidata adjuvada com AS01E é uma vacina de 3 componentes consistindo de antigénios de virião fragmentado inactivado trivalentes concentrados apresentados num frasquinho de vidro, um frasquinho de vidro contendo adjuvante AS01B e um frasquinho de vidro contendo o diluente (solução de cloreto de sódio para injecção) para a diluição duas vezes de AS01B. Para preparar o adjuvante AS01E, o conteúdo do frasquinho de diluente é retirado com uma seringa e injectado no frasquinho contendo o adjuvante AS01B, seguido por mistura. Na altura da injecção, 600 pL de adjuvante AS01E são retirados com uma seringa do frasquinho de AS01E e injectados no frasquinho que contém os antigénios de virião fragmentado inactivado trivalentes concentrados. Após mistura, o conteúdo é retirado para a seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular. Uma dose da vacina da gripe candidata adjuvada com AS01B reconstituída corresponde a 1 mL. A vacina da gripe candidata adjuvada com AS01E é uma vacina sem conservante.
VI. 2.5 . Composição do lote clínico adjuvado AS01E
Uma dose da vacina da gripe adjuvada com AS01E reconstituída corresponde a 1 mL. A sua composição é apresentada na Tabela 9. Esta contém 15 pg de HA de cada estirpe do vírus da gripe como na vacina registada Fluarix™/o(-Rix®. 143
Tabela 9 - Composição (gripe e componentes adjuvantes) da vacina da gripe candidata adjuvada com AS01E reconstituída
Componente Quantidade Referência por dose Analítica INGREDIENTES ACTIVOS Viriões fragmentados inactivados - A/Nova Caledónia/ 20/99 (H1N1) IVR-116 15 pg de HA Ph. Eur. 158 - A/Nova Iorque/55/2004 (H3N2) NIMC X-157 15 pg de HA Ph. Eur. 158 - B/Jiangsu/10/2003 15 pg de HA Ph. Eur. 158 ADJUVANTE AS01B - Lipossomas • dioleilfosfatidilcolina (DOPC) 500 pg GSK Bio 3217 • Colesterol 125 pg Ph. Eur. 0993 • MPL 25 pg GSK Bio 2972 - QS21 25 pg GSK Bio 3034 VI. 2.6. Método de produção do lote de vacina adjuvada AS01E 0 fabrico da vacina da gripe adjuvada com AS01B consiste em três passos principais: • Formulação da carga final trivalente (2 x concentrada) sem adjuvante e enchimento no recipiente de antigénio
• Preparação do adjuvante AS01B 144
Preparação do adjuvante AS01E, seguida por reconstituição extemporânea da vacina de vírus fragmentado adjuvada com AS01E.
Formulação da carga final trivalente sem adjuvante e enchimento no recipiente de antigénio É feita referência à secção V.2.3 para a vacina da gripe adjuvada com AS01B.
Preparaçao da carga adjuvante de AS01B e enchimento no recipiente de adjuvante É feita referência à secção V.2.3 para a vacina da gripe adjuvada com AS01B.
Reconstituição extemporânea da vacina de vírus fragmentado adjuvada com AS01E
Para preparar o adjuvante AS01E, o conteúdo do frasquinho de diluente é retirado com uma seringa e injectado no frasquinho contendo o adjuvante AS01B, seguido por mistura. Na altura da injecção, 600 pL de adjuvante AS01E é retirado com uma seringa do frasquinho de AS01E e injectado no frasquinho que contém os antigénios do virião fragmentado inactivado trivalentes concentrados. Após mistura, o conteúdo é retirado para a seringa e a agulha é substituída por uma agulha intramuscular. Uma dose da vacina da gripe candidata adjuvada com AS01E reconstituída corresponde a 1 mL. 145
Quatro visitas programadas por indivíduo: aos dias 0, 21, 90 e 180, com amostra de sangue recolhida em cada visita para avaliar a imunogenicidade.
Programa de vacinação: uma injecção de vacina da gripe no dia 0 VI. 2.7 - Ensaios imunológicos
Ensaio de inibição da hemaglutinação A resposta imune é determinada por medição de anticorpos de inibição da hemaglutinação (Hl) utilizando o método descrito pelo Centro de Colaboração para a Gripe da OMS, Centros para Controlo de Doença, Atlanta, EUA (1991) . As medições do título de anticorpos foram conduzidas em amostras séricas descongeladas com um micrométodo estandardizado e detalhadamente validado utilizando 4 unidades de inibição de hemaglutinação (4 HIU) dos antigénios apropriados e uma suspensão a 0,5% de eritrócitos de ave de capoeira. Os inibidores séricos não específicos foram removidos por tratamento de calor e enzima destruidora de receptor. Os soros obtidos foram avaliados para niveis de anticorpos de Hl. Começando com uma diluição inicial de 1:10, foi preparada uma diluição em série (por um factor de 2) até uma diluição final de 1:20480. O ponto final de titulação foi tomado como o passo de maior diluição que mostrou inibição completa (100%) da hemaglutinação. Todos os ensaios foram realizados em duplicado. 146
Citometria de Fluxo de Citocina (CFC) utilizada para avaliar a frequência de linfócitos T CD4 ou CD8 positivos a citocina(s)
As células T CD4 e CD8 específicas de antigénio de sangue periférico podem ser re-estimuladas in vitro para produzir CD40L, IL-2, TNF-α e IFN-γ, se incubadas com o seu antigénio correspondente. Consequentemente, as células T CD4 e CD8 específicas de antigénio podem ser contadas por citometria de fluxo após marcação imunofluorescente convencional do fenótipo celular, assim como produção intracelular de citocinas. No presente estudo, os antigénios de vacina da gripe serão utilizados como antigénios para re-estimular células T específicas de gripe. Os resultados serão expressos como uma frequência de células T CD4 ou CD8 positivas a citocina(s) dentro da subpopulação de células T CD4 ou CD8. ELISPOT utilizado para avaliar a frequência de células B de memória A tecnologia Elispot de célula B permite a quantificação de células B de memória específicas para um determinado antigénio. As células B de memória podem ser induzidas para se diferenciarem em células plasmáticas in vitro, após cultivo com CpG durante 5 dias. As células plasmáticas específicas de antigénio geradas in vitro podem, deste modo, ser contadas utilizando o ensaio elispot de célula B. Resumidamente, as células plasmáticas geradas in vitro são incubadas em placas de cultura revestidas com antigénio. As células plasmáticas específicas de antigénio irão formar pontos de anticorpo/antigénio que podem ser detectados por processo imuno-enzimático convencional. No presente estudo, as estirpes de vacina da gripe ou imunoglobulina anti-humana são utilizados 147 para revestir as placas de cultura para enumerar células plasmáticas secretoras de anti-gripe ou IgG, respectivamente. Os resultados são expressos como uma frequência de plasma especifico de antigénio em um milhão de células plasmáticas produtoras de IgG.
Caracterização Exploratória de PBMC A expressão de marcadores de superfície/activação seleccionados (i. e., CD4, CD8, CD45R0, CD45RA, CD28, CD27 ou algum KIR) pode ser realizada. A função de linfócitos T induzidos por vacina pode ser abordada através da análise de marcadores caseiros (i. e., CCR7, CXCR5), de citocinas (citocinas de auxiliar T 1 ou auxiliar T 2) ou por análise da expressão de factores associados com funções reguladoras, tais como Foxp3, CTLA-4 ou ΊΌΕβ. Em particular, a população de CD8+CD28- ou outras populações de células T reguladoras podem ser analisadas em relação às respostas humorais de células B e T para o antigénio de vacina. VI.3. Resultados de imunogenicidade VI.3.1. Pontos finais de CMI e resultados
De modo a caracterizar a resposta de CMI após vacinação com as vacinas da gripe adjuvadas, linfócitos T CD4 e CD8 foram re-estimulados in vitro utilizando antigénios das três estirpes de vacina (utilizadas individualmente ou agrupadas). Os linfócitos T CD4/CD 8 específicos da gripe foram contados por citometria de fluxo após marcação imunofluorescente convencional 148 da produção intracelular de citocinas (IL-2, IFN-γ, TNF-α e CD40L) .
Avaliação do ponto final primário.
No dia 21: a resposta de CMI em todos os indivíduos em termos de frequência de linfócitos T CD4 específicos da gripe por 106 em testes que produzem, pelo menos, duas citocinas diferentes (IL-2, IFN-γ, TNF-α e CD40L) .
Para a avaliação da resposta de CMI, a frequência de CD4 específico da gripe é analisado como se segue:
Utilizando a abordagem de não inferioridade, a não inferioridade de, pelo menos, uma vacina da gripe candidata adjuvada (administrada a idosos ^65 anos - o grupo denominado Gripe idosos ou Gripe IDO) comparativamente a Fluarix™ (administrada a adultos com 18 - 40 anos - o grupo denominado Gripe Jovens ou Gripe JOV) foi alcançada quando o limite superior do intervalo de confiança de 98,75% bilateral na razão das médias geométricas (GM) (entre o grupo Fluarix™ (18-40 anos) e a vacina da gripe candidata adjuvada (grupo >65 anos) em termos de frequência de células T CD4 específicas da gripe que produzem, pelo menos, duas citocinas no dia 21) foi inferior a 2,0
UL
IC f Cyr \ Fluam· adultos ^ AGripe adjuvada / <2 149 0 IC de 98,75% de razões GM, 21 dias após vacinação, foi calculado por computador utilizando uma análise do modelo de covariância (ANCOVA) na transformação logarítmica 10 das frequências. 0 modelo ANCOVA incluiu o grupo de vacina como efeito fixo (Fluarix™ (18-40 anos) versus a vacina da gripe candidata adjuvada (^65 anos)) e a frequência de pré-vacinação como um regressor. A razão de GM e seu IC de 98,75% são derivados como transformação exponencial do correspondente grupo de contraste no modelo. O IC de 98,75% para GM ajustada é obtido por transformação exponencial do IC de 98,75% para o grupo menos a média quadrada do modelo de ANCOVA acima.
Resultados - análise de interferência (Tabela 10)
As GM ajustadas e razões de GM (com seus IC de 98,75%) de linfócitos T CD4 específicos da gripe que produzem, pelo menos, duas citocinas (IL-2, IFN-γ, TNF-α e CD40L) no dia 21, após restimulação in vitro com "antigénios agrupados II", são apresentadas na Tabela 10. Para cada vacina da gripe adjuvada, o limite superior de IC de 98,75% bilateral da razão de GM está muito abaixo do limite clínico de 2,0. Isto mostra a não inferioridade de ambas as vacinas da gripe adjuvadas administradas a indivíduos idosos comparativamente à vacina Fluarix™ administrada a adultos com idades entre 18 e 40 anos, em termos de frequência pós-vacinação de CD4 específico da gripe. 150
Tabela 10 Razão de GM ajustada de células T CD4 especificas da gripe que produzem, pelo menos, duas citocinas após re-estimulação com antigénios de vacina agrupados, Dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)
Razão de GM (Gripe JOV/ASOIB) Gripe JOV AS01B 98,8% IC N GM N GM Valor LL UL 74 2844,8 71 2725,6 1, 04 0,79 1,38 Razao de GM (Gripe JOV/ASOIE) Gripe JOV AS01E 98,8% IC N GM N GM Valor LL UL 74 2879,6 74 2697,0 1,07 0, 79 1,44 GM ajustada = média geométrica de anticorpos ajustada para o titulo da linha de base; N = número de indivíduos com resultados pré- e pós-vacinação disponíveis; 98,8% IC = 98,8% de intervalo de confiança para a razão de GM ajustada (modelo Ancova: ajuste à linha de base); L = limite inferior, UL = limite superior; Origem dos dados = Tabela IIIA do apêndice
Resultados - Análise descritiva (Figura 6)
As principais observações foram: 1) Antes da vacinação a resposta CMI é maior em adultos jovens do que em idosos 2) Após vacinação: 151 houve um efeito de reforço da vacina da gripe na resposta CMI em adultos jovens (18-40 anos) a resposta CMI nos idosos que receberam a vacina da gripe adjuvada é comparável à resposta CMI de adultos j ovens. A diferença entre a pré- e pós-vacinação nas respostas de linfócitos T CD4 para todas as citocinas investigadas (IL-2, CD40L, TNF-α e IFN-γ) foi significativamente maior com vacinas adjuvadas comparativamente a Fluarix™ para todos os testes.
Análise do objectivo terciário:
De modo a avaliar o ponto final terciário, a frequência de linfócitos T CD4/CD8 específicos da gripe e células B de memória foi medida nos dias 0, 21, 90 e 180. • A frequência de linfócitos T CD4/CD8 específicos da gripe positivos a citocina foi resumida (estatística descritiva) para cada grupo de vacinação nos dias 0 e 21, para cada antigénio. • Um teste não paramétrico (teste de Wilcoxon) foi utilizado para comparar a localização da diferença entre os dois grupos (vacina da gripe adjuvada versus Fluarix™) e valor p estatístico é calculado para cada antigénio em cada teste diferente. • A estatística descritiva na diferença individual entre respostas do dia 21/dia 0 (Pós-/Pré-vacinação) é calculada para cada grupo de vacinação e cada antigénio em cada teste diferente. • Um teste não paramétrico (teste de Wilcoxon) é utilizado para comparar a diferença individual (Pós-/Pré-vacinação) e 152 o valor ρ estatístico será calculado para cada antigénio em cada teste diferente.
Os valores p do teste de Wilcoxon utilizado para comparar a diferença na frequência de linfócitos T CD4 específicos da gripe são apresentados na Tabela 11.
Resultados - Avaliaçao do ponto final terciário (Tabela 11)
As principais conclusões são: • As frequências de GM de pré-vacinação de células T CD4 específicas da gripe foram semelhantes em todos os grupos de indivíduos idosos mas superiores nos adultos com idades entre 18 e 40 anos. • Em indivíduos idosos, a frequência de pós-vacinação (dia 21) de linfócitos T CD4 específicos da gripe foi significativamente maior após vacinação com vacinas adjuvadas do que com Fluarix™. • A frequência de pós-vacinação de linfócitos T CD4 específicos da gripe permaneceu inferior em indivíduos idosos vacinados com vacinas adjuvadas com AS01B ou AS01E do que em adultos com idades entre 18 e 40 anos vacinados com Fluarix™. • A frequência de GM de pré-vacinação e pós-vacinação de células T CD8 específicas da gripe foi essencialmente semelhante em todos os grupos. 153
Tabela 11 Estatística por inferência: valores p de testes Kruskal-Wallis para células T CD4 em cada ponto do tempo (coorte ATP para imunogenicidade)
Descrição do teste valor P AS01B vs. Gripe JOV AS01E vs. Gripe JOV dia 0 dia 21 dia 0 dia 21 TODOS DUPLOS < 0,0001 0,0070 < 0,0001 0,0025 CD40L < 0,0001 0,0056 < 0,0001 0, 0015 IFNy < 0,0001 0,0009 < 0,0001 0,0006 IL2 < 0,0001 0,0029 < 0,0001 0,0021 TFNa < 0,0001 0,0295 < 0,0001 0,0378 AS01B vs. Gripe IDO AS01E vs. Gripe IDO dia 0 dia 21 dia 0 dia 21 TODOS DUPLOS 0,6165 0,0004 0,8744 0,0018 CD40L 0,7560 0,0005 0,9504 0,0021 IFNy 0,9936 0,0008 0,9835 0,0029 IL2 0,6702 0,0011 0,7855 0,0023 TFNa 0,5450 0,0022 0,6688 0,0040
Resultados - Avaliaçao dos pontos finais da resposta imune humoral
Variáveis observadas:
Nos dias 0, 21, 90 e 180: títulos de anticorpos de inibição da hemaglutinação (Hl) sérica, testados separadamente contra 154 cada das três estirpes de vírus da gripe representadas na vacina (anticorpos anti-HINl, anti-H3N2 e anti-B). 0 valor limite para anticorpos de Hl contra todos os antigénios de vacina foi definido pelo laboratório antes da análise (e é igual a 1:10) . Um indivíduo seronegativo é um indivíduo cujo título de anticorpo está abaixo do valor limite. Um indivíduo seropositivo é um indivíduo cujo título de anticorpo é maior ou igual ao valor limite. Ao título de anticorpo abaixo do limite do ensaio é dado um valor arbitrário de metade do limite.
Com base nos títulos de anticorpo de Hl, são calculados os seguintes parâmetros: • Títulos médios geométricos (GMT) de anticorpo de Hl nos dias 0 e 21, calculado tomando o anti-log da média do log das transformações de título. • Factores de seroconversão (SF) no dia 21, definidos como o número de vezes do aumento nos GMT de Hl sérica no dia 21 comparativamente ao dia 0. • Taxas de seroconversão (SC) no dia 21, definidas como a percentagem de vacinados com um titulo de prevacinação de Hl < 1:10 e um título de pós-vacinação >1:40, ou um título de prevacinação > 1:10 e um aumento mínimo de 4 vezes no titulo de pós-vacinação. • Taxas de Seroprotecção (SPR) no dia 21, definidas como a percentagem de vacinados com um título de Hl >1:40. 0 IC de 95% para GM é obtido dentro de cada grupo separadamente. O IC de 95% para a média do título transformado por log é obtido primeiramente, assumindo que os títulos transformados por log são distribuídos normalmente com variância 155 desconhecida. 0 IC de 95% para GM é depois obtido por transformação exponencial do IC de 95% para a média do titulo transformado por log.
Um resultado serológico em falta para uma medida particular de anticorpo não é substituído. Deste modo, um indivíduo sem resultado serológico num determinado ponto do tempo não contribui para a análise do ensaio para esse ponto do tempo.
Resultados da resposta imune humoral (Figura 7 e Tabela 12)
Os GMT de pré-vacinação de anticorpos de Hl para todas as 3 estirpes de vacina estavam dentro da mesma gama nos 4 grupos de tratamento. Após vacinação, existe um impacto claro dos 2 adjuvantes que aumentam a resposta humoral em idosos, comparativamente a Fluarix padrão na mesma população (Figura 7, mostrado numa escala linear, mas o mesmo impacto obviamente observado se mostrado numa gama logarítmica).
Os GMT são
• significativamente maiores para H1N1 1 para AS01E • significativamente maiores para H3N2 para ambos os adjuvantes. • Não foi observada diferença significativa em termos de GMT de pós-vacinação entre os dois grupos de indivíduos que receberam vacinas adjuvadas.
Vinte um dias após a vacinação, os indivíduos de Fluarix (18-40 anos) tiveram uma resposta de Hl mais elevada para as estirpes Nova Caledónia e B/Jangsu. 156
Como mostrado na Tabela 12, as vacinas da gripe adjuvadas excederam os requisitos das autoridades europeias para registo anual de vacinas da gripe de virião fragmentado ["Note for Guidance on Harmonization of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes" (CPMP/BWP/214/96)] em indivíduos com mais de 60 anos.
Após vacinação, existia um diferença estatística em termos de taxas de seroprotecção de anticorpos de Hl entre o grupo Fluarix (^65 anos) e • Flu/ASOIB e Flu/ASOIE para a estirpe A/HINl/Nova Caledónia
Para cada estirpe de vacina, as taxas de seroprotecção para os 2 grupos de vacina da gripe adjuvada estão na mesma gama comparativamente ao grupo Fluarix (18-40 anos).
Para cada estirpe de vacina, as taxas de seroprotecção para os 2 grupos de vacina da gripe adjuvada estão na mesma gama comparativamente ao grupo Fluarix (18-40 anos), excepto para a estirpe Nova Caledónia. 157
Tabela 12 Taxas de Seroprotecção, taxas de seroconversão e factores de conversão no dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)
Estirpes Grupo N Taxa de Seroprotecção (título de Hl ^ 40) g. Taxa de seroconversão (aumento ^4 vezes) [95% IC] o, "o Factor da conversão [95% IC] % Padrão EU (> 60 anos) > 60% > 30% > 2,0 Padrão EU (< 60 anos) > 70% > 40% >2,5 A/Nova Caledónia (H1N1) Gripe JOV 75 100 [95,20-100] 77,3[66,2-86,2] 35,1 [21,9-56,4] Gripe IDO 49 71, 4 [156,74-83,42] 30,6 [18,3-45,4] 3, 7 [2, 4-5, 7] Gripe AS01B 75 97,3 [90,70-99,68] 48,0 [36,5-59, 8] 4,5 [3,3-6,1] Gripe AS01E 75 93,3 [85,12-97,80] 52,0[40,2-63,7] 5, 0[3,6-6,9] A/Nova Iorque (H3N2) Gripe JOV 75 93,3 [85,12-97,80] 76,0[64,7-85,1] 9,2[7,1-11,8] Gripe IDO 49 81,6 [67,98-91,24] 69,4 [54,6-81,7] 8,2[5,7-11,8] Gripe AS01B 75 96,0 [88,75-99,17] 85,3[75,3-92,4] 13,1[10,0-17,1] Gripe AS01E 75 93,3 [85,12-97,80] 80,0[69,2-88,4] 14,5[10,4-20,2] B/Jiangsu (B) Gripe JOV 75 100 [95,20-100] 81,3[70,7-89,5] 13,9[10,1-19,1] Gripe IDO 49 93, 9 [83,13-98,72] 44, 9[30, 7-59,8] 4,3[3,0-6,1] Gripe AS01B 75 100 [95,20-100] 65,3[53:5-76,0] 5,2 [4,2-6,5] Gripe AS01E 75 97, 3 [90,70-99,68] 70,7[59,0-80,6] 6,7[5,1-8,9] N = número total de indivíduos; % = percentagem de indivíduos com título no dia 21 dentro da gama especificada; IC = intervalo de confiança 158 VI. 3.2 . Conclusões de imunogenicidade A frequência de pré-vacinação de CD4 específico da gripe foi significativamente inferior em adultos idosos comparativamente a adultos com idades entre 18 e 40 anos. Após vacinação com Fluarix™, a frequência de pós-vacinação (dia 21) permaneceu inferior em adultos idosos comparativamente aos mais novos. Pelo contrário, a não inferioridade em termos de frequência pós-vacinação de CD4 especifico da gripe após vacinação com vacinas adjuvadas de indivíduos idosos foi demonstrada comparativamente à vacinação com Fluarix™ em adultos com idades entre 18 e 40 anos.
Relativamente à resposta imune humoral em termos de resposta de anticorpo de Hl, todas as vacinas da gripe cumpriram os requisitos das autoridades europeias para registo anual de vacinas da gripe inactivadas ["Note for Guidance on Harmonization of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes" (CPMP/BWP/214/96)]. Em adultos idosos, as vacinas adjuvadas mediaram, pelo menos, uma tendência para uma resposta imune humoral mais elevada a hemaglutinina da gripe do que Fluarix™. As diferenças significativas entre a resposta imune humoral contra cada estirpe de vacina mediada em indivíduos idosos por vacinas adjuvadas comparativamente a Fluarix™ são resumidas na Tabela 13. Comparativamente a adultos com idades entre 18 e 40 anos vacinados com Fluarix™, os indivíduos idosos vacinados com as vacinas adjuvadas mostraram uma tendência para maiores GMT pós-vacinação e factor de seroconversão no dia 21 contra a estirpe A/Nova Iorque. 159
Tabela 13 Estirpes da gripe para as quais foi observada resposta imune humoral significativamente mais elevada (baseada em não sobreposição de 95% IC) em indivíduos idosos vacinados com as diferentes vacinas adjuvadas comparativamente a Fluarix na mesma população. GMT Pós-vac Factor de seroconversão Taxa de Seroprotecção Taxa de Seroconversão FluASOlB A/Nova Iorque A/Nova Caledónia FluASOlE A/Nova Caledónia A/Nova Iorque A/Nova Caledónia GMT Pós-vac = Títulos Médios Geométricos em pós-vacinação VI.4 Conclusões de Reactogenicidade VI. 4.1. Registo de eventos adversos (EA)
Os sintomas solicitados (ver Tabela 14) que ocorrem durante um período de 7 dias de acompanhamento (dia da vacinação e 6 dias subsequentes) foram registados. Os sintomas não solicitados que ocorrem durante um período de acompanhamento de 21 dias (dia da vacinação e 20+3 dias subsequentes) foram também registados. A intensidade dos seguintes EA foi avaliada como descrito na Tabela 15. 160
Tabela 14 Eventos adversos locais/gerais solicitados EA locais solicitados EA Gerais Solicitados Dor no local de injecção Vermelhidão no local de injecção Tumefacção no local de injecção Hematoma Fatiga Febre Dor de cabeça Dor muscular Tremores Dor articular no braço de injecção Dor articular noutros locais N.B. A temperatura foi registada à noite. Se fossem realizadas medições de temperatura adicionais noutros momentos do dia, seria registada a temperatura mais alta.
Tabela 15 Escalas de intensidade para sintomas solicitados em adultos
Evento Adverso Grau de intensidade Parâmetro Dor no local de injecção 0 Ausente 1 Ao toque 2 Quando o membro é movido 3 Impede a actividade normal Vermelhidão no local de injecção Registar o maior diâmetro de superfície em mm Tumefacção no local de injecção Registar o maior diâmetro de superfície em mm Hematoma no local de injecção Registar o maior diâmetro de superfície em mm Febre* Registar a temperatura em °C/°F 161 (continuação)
Evento Adverso Grau de intensidade Parâmetro Dor de cabeça 0 Ausente 1 É facilmente tolerada 2 Interfere com a actividade normal 3 Impede a actividade normal Fatiga 0 Ausente 1 E facilmente tolerada 2 Interfere com a actividade normal 3 Impede a actividade normal Dor articular no 0 Ausente local de injecção 1 É facilmente tolerada e outros locais 2 Interfere com a actividade normal 3 Impede a actividade normal Dor muscular 0 Ausente 1 E facilmente tolerada 2 Interfere com a actividade normal 3 Impede a actividade normal Tremores 0 Ausente 1 É facilmente tolerada 2 Interfere com a actividade normal 3 Impede a actividade normal * A febre é definida como temperatura nas axilas >37,5 °C. (99,5°F) 162 A intensidade máxima da vermelhidão/tumefacção local no sitio de injecção é pontuada como se segue: 0 é 0 mm; lé > 0 - < 2 0 mm; 2 é >20 - <50 mm; 3 é >50 mm. A intensidade máxima da febre é pontuada como se segue: 1 é >37,5 - <38,0 °C; 2 é >38,0 - <39,0 °C; 3 é >39,0 0 investigador faz uma avaliação de intensidade para todos os restantes EA, sintomas não solicitados, i. e., incluindo EA descritos durante o estudo. A avaliação é baseada na avaliação clinica do investigador. A intensidade de cada EA registado é atribuída a uma das seguintes categorias: 1 (suave) = Um EA que é facilmente tolerado pelo indivíduo, causando desconforto mínimo e não interferindo com as actividades diárias; 2 (moderado) = Um EA que é suficientemente desconfortante para interferir com as actividades diárias normais; 3 (grave) = Um EA que impede actividades normais diárias (em adultos/adolescentes, um tal EA poderia, por exemplo, impedir a ida ao trabalho/escola e necessitaria da administração de terapia correctiva). VI,4,2. Registo de Eventos Adversos (EA)
Em indivíduos idosos, a reactogenicidade observada com vacinas adjuvadas, em termos de sintomas locais e gerais, foi maior do que com Fluarix™. Não apenas a incidência mas também a 163 intensidade dos sintomas foi aumentada após vacinação com vacinas adjuvadas (Figura 8). Os sintomas de Grau 3 mostraram uma tendência de serem maiores no grupo que recebeu a vacina adjuvada com a maior concentração de imunoestimuladores (MPL, QS21) comparativamente ao grupo que recebeu a vacina adjuvada em que os imunoestimuladores estão numa concentração mais baixa. Em todos os casos, os sintomas foram, contudo, rapidamente resolvidos.
Exemplo VII: Avaliação Pré-clinica de vacinas de HPV adjuvadas em Murganhos.
Este estudo utilizou uma composição antigénica bivalente de papilomavirus humano (HPV), combinando partículas de tipo virai (VLP) formadas a partir de LI de HPV 16 e LI de HPV 18 como o antigénio. 0 objectivo do estudo foi comparar a eficácia desta preparação antigénica quando formulada com AS01B e uma diluição 1/5 de AS01B, referenciada contra o adjuvante actual encontrado na vacina do cancro do colo do útero da GSK, AS04 (MPL no alúmen). VI1.1 - Vacinação
Foram injectados murganhos (n = 12 por grupo) nos dias 0 e 28 com formulações de vacina compostas de LI de HPV16/18 (2 pg ou 0,5 pg cada) derivadas do processo Hi-5 80/80L e formuladas com AS04 (50 pg de MPL formulado com alúmen ou AS01B (50 pg de QS21 - 50 pg de MPL em 0,5 mL) a 1/10 e 1/50 da dose humana. Como os estudos foram realizados em murganhos, 1/10 da dose humana pode ser tomada como equivalente à formulação humana de AS01B, i. e., 50 pg de QS21 e 50 pg de MPL em 0,5 mL e 1/50 pode 164 ser tomada como uma diluição 1/5 da formulação humano de AS01B, i. e., 10 pg de S21 e 10 pg de MPL em 0,5 mL. As amostras de sangue foram retiradas aos dias 14 e 45 pós-dose II para ensaiar as anticorpos totais específicos de tipo anti-Ll em soros individuais. A coloração intracelular de citocinas foi medida nos dias 7 e 14 pós-II em PBMC e no dia 45 pós-II utilizando células de baço. A frequência de células B de memória específicas para VLP foi medida no dia 45 pós-II utilizando células de baço.
VII.2 - ELISA de LI de 16/18 Anti-HPV A quantificação de anticorpos anti-HPV-16 e HPV-18 de LI foi realizada por ELISA utilizando LI de HPV-16 e HPV-18 como revestimento. Os antigénios foram diluídos a uma concentração final de 0,5 pg/mL em PBS e foram adsorvidos, de um dia para o outro, a 4 °C a poços de placas de microtitulação de 96 poços (Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). As placas foram depois incubadas durante 1 hora a 37 °C com PBS contendo 1% de Albumina de Soro Bovino (tampão de saturação) . Os soros diluídos em tampão contendo PBS + 0,1% de Tween20 + 1% de BSA foram adicionados às placas revestidas com LI de HPV e incubadas durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS contendo 0,1% de Tween20 e foi adicionado a cada poço Ig anti-murganho conjugado com biotina (Dako, RU) diluído a 1/1000 em tampão de saturação e incubadas durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C. Após um passo de lavagem, foi adicionada estreptavidina-peroxidase de rábano (Dako, RU) , diluída 1/3000 em tampão de saturação durante mais 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas como indicado acima e incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente com uma solução a 0,04% de O-fenilenodiamina (Sigma) e 0,03% de H2O2 em 0,1% de 165
Tween20, 0,05 M de tampão citrato pH 4,5. A reacção foi parada com H2S04 2 N e lida a 492/620 nm. Os títulos de ELISA foram calculados a partir de uma referência por SoftMaxPro (utilizando uma equação de quatro parâmetros) e expressa em EU/mL. VII.3 - Coloração intracelular de citocinas (ICS) A coloração intracelular de citocinas de células T foi realizada em PBL nos dias 7 e 14 pós-II e em células de baço no dia 45 após a segunda imunização. As PBMC (1 agrupamento/grupo) ou células de baço (4 agrupamentos de 3 órgãos por grupo) foram recolhidas de murganhos. A estimulação antigénica in vitro de células de baço foi realizada a uma concentração final de 5.106 células/mL (microplacas de 96 poços) com VLP 16 ou 18 (5 pg/mL) + anticorpos CD49d CD28 (1 pg/mL) e depois incubadas 3 h a 37 °C. Depois do passo de re-estimulação antigénica, as células foram incubadas, de um dia para o outro, na presença de
Brefeldina (1 pg/mL) a 37 °C para inibir a secreção de citocinas. A coloração celular foi realizada como se segue: as suspensões celulares foram lavadas, ressuspensas em 50 pL de 1% de FCS em PBS contendo 2% de reagente de bloqueamento Fc (1/50; 2,4G2) . Após 10 minutos de incubação a 4 °C, 50 pL de uma mistura de anti-CD4-APC (1/50) e anti-CD8 perCp (1/50) foi adicionada e incubada 30 minutos a 4 °C. Após uma lavagem em 1% de FCS em PBS, as células foram permeabilizadas através de ressuspensão em 200 pL de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) e incubadas 20 minutos a 4 °C. As células foram depois lavadas com Perm Wash (Kit BD) e ressuspensas com 50 pL de anti-IFY APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluídos em Perm Wash. Após incubação de 2 h a 4 °C, as células foram lavadas com Perm Wash e ressuspensas em 1% de FCS em PBS + 1% de paraformaldeído. A análise das amostras foi realizada por FACS. As células vivas foram circunscritas (FSC/SSC) e a aquisição foi realizada a -20000 eventos (linf ócitos) . As percentagens de IFy+ ou IL2 + foram calculadas em populações CD4+ e CD8+ circunscritas. VII.4 - Célula B de memória
Quarenta e cinco dias após a segunda imunização, os murganhos foram sacrificados, as células do baço foram separadas através de um gradiente lymphoprep (Cedarlane) . As células B foram depois ressuspensas em meio RPMI 1640 (Gibco) contendo aditivos (piruvato de sódio 1 mM, aminoácidos não essenciais MEM, Pen/Strep, glutamina e β-2-mercaptoetanol), 5% de soro fetal de vitela, 50 U/mL de rhIL-2 (eBioscience) e 3 pg/mL de CpG. As células foram cultivadas cinco dias a uma concentração final de 106 células/mL, em 5 mL por 6 poços de fundo plano. Após um passo de activação com etanol, as placas de nitrocelulose (Multiscreen-IP; Millipore) foram revestidas com 10 pg/mL de VLP ou com Ig anti-murganho de cabra (GAM; Sigma) diluído a 1/200 em PBS. Após um passo de saturação com meio completo, foram adicionados 100 pL de 2.106 células/mL a placas revestidas com VLP e foram adicionados 100 pL de 106 e 5.105 células/mL a placas GAM. Após um tempo de incubação de 2 horas a 37 °C, as placas foram armazenadas, de um dia para o outro, a 4 °C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS contendo 0,1% de Tween20 e foi distribuído às placas Ig anti-murganho Biot diluído a 1/200 em 5% de FCS em PBS com 5% de BSA (tampão de diluição) e incubadas durante 2 horas a 37 °C. Após um passo de lavagem, foi adicionada Extravidina HRP (Sigma) diluída a 1/550 em tampão de diluição durante mais 1 hora a 37 °C. As placas foram lavadas como acima e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente com uma solução de AEC (Sigma) . A reacção é parada por lavagem 167 cuidadosa das placas sob água da torneira. Quando as placas estão secas, são lidas com KS400. VII.5 - Análise estatística
Os meios de formulação foram comparados utilizando uma análise de variância unilateral (ANOVA 1). A análise foi conduzida em dados transformados por loglO para fins de normalização. Quando uma diferença significativa entre os meios de processo foi detectada (valor p <0,05), foram realizadas comparações par-a-par entre os meios a um nível de significância de 0,05 (teste de comparação múltiplo de Student-Newman-Keuls). VII.6 - resultados
Os murganhos foram imunizados como em VII.1 acima. Foram utilizados os seguintes grupos:
Grupo Antigénio Adjuvante Diluição do adjuvante 1 LI de HPV 16-18 2 pg AS 04 1/10 da dose humana (equivalente a 50 pg de MPL por 0,5 mL de DH) 2 LI de HPV 16-18 0, 5 pg AS 0 4 1/50 da dose humana (equivalente a 10 pg de MPL por 0,5 mL de DH) 3 LI de HPV 16-18 2 pg AS 0 4 1/10 da dose humana (equivalente a 50 pg de MPL por 0,5 mL de DH) 168 (continuação)
Grupo Antigénio Adjuvante Diluição do adjuvante 4 LI de HPV 16-18 0,5 pg AS 04 1/50 da dose humana (equivalente a 10 pg de MPL por 0,5 mL de DH) 5 LI de HPV 16-18 2 pg AS01B 1/10 da dose humana (equivalente a 50 pg de MPL por 0,5 mL de DH) 6 LI de HPV 16-18 0, 5 pg AS01B 1/50 da dose humana (equivalente a 10 pg de MPL por 0,5 mL de DH) 7 LI de HPV 16-18 2 pg AS01B 1/10 da dose humana (equivalente a 50 pg de MPL por 0,5 mL de DH) 8 LI de HPV 16-18 0,5 pg AS01B 1/50 da dose humana (equivalente a 10 pg de MPL por 0,5 mL de DH) VII.6,1 - Respostas humorais Não foi observada uma gama de dose significativa para as duas doses testadas de antigénios com diluição de adjuvante para títulos de anticorpo anti-HPV 16-L1 ou títulos de anticorpo anti-HPV 18-L1 (Figura 9) Não foi observada uma gama de dose significativa para as duas doses testadas de cada adjuvante, qualquer que fosse a dose de antigénio para títulos de anticorpo anti-HPV 16-L1. 169
Ao analisar os títulos de anticorpo anti-HPV 18-L1, foi observada um ligeiro aumento no título para AS01B (1/10 da DH) comparativamente a AS01B (1/50 da DH) como medido no dia 14 pós-II (gama de dose de 2,5 vezes, valor p = 0,0035), contudo esta gama foi observada apenas para 2 pg de antigénio e não para 0,5 pg de antigénio (valor p = 0, 0867) . Ao dia 45 pós-II, não foi observada gama de dose significativa para as duas doses testadas de cada adjuvante, independentemente da dose de antigénio. VII.6.2 - Respostas celulares
Coloração Intracelular de Citocinas Não foi observado efeito de gama de dose do antigénio para as duas doses testadas de antigénios, qualquer que fosse a dose de adjuvante para HPV 18-L1. Foram obtidas frequências semelhantes de células T CD4+ específicas de VLP16 com as duas doses testadas de antigénios com diferentes doses de adjuvantes (Figura 10).
Um ligeiro efeito de dosagem (2,6 vezes, valor p = 0,0009 para HPV 18-L1, 2 vezes, valor p = 0,0187 para HPV 16-L1) foi observado para AS01B (1/10 da DH) comparativamente a AS01B (1/50 da DH) , contudo esta gama foi apenas observada para 2 pg de antigénio e não para 0,5 pg de antigénio. 170 Células B de Memória Especificas Não foi observado efeito da gama de dose de antigénio para as duas doses testadas de antigénios, qualquer que fosse a dose de adjuvante para LI de HPV 16 ou 18 (Figura 11) Não foi observado efeito da gama de dose de adjuvante para as duas doses testadas de adjuvantes, qualquer que fosse a dose de antigénio para LI de HPV 17 ou 18.
Como pode ser observado a partir dos resultados acima, uma diluição de 1/5 de AS01B produz uma formulação que tem uma eficácia equivalente em composições imunogénicas ao próprio AS01B.
Exemplo VIII: Avaliação pré-clinica de vacinas de S. pneumoniae adjuvadas em murganhos. A vacina pneumocócica utilizada neste estudo foi uma vacina conjugada pneumocócica adjuvada 11-valente (11PCV/AS) consistindo de uma mistura de 11 conjugados polissacaridicos pneumocócicos adjuvados com AS01B ou AS01E. Os conjugados consistem nos polissacáridos purificados dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F de S. pneumoniae, cada um individualmente conjugado a uma proteína veículo, toxóide diftérico (DT), toxóide tetânico (TT) ou proteína D de H. influenzae (PD). As vacinas são apresentadas como um pó liofilizado a ser reconstituído com um adjuvante líquido. 11 PCV/AS é produzida como se segue: 171 A activação e condições de acoplamento são específicas para cada polissacárido. Estas são apresentadas na Tabela abaixo. 0 polissacárido dimensionado (à excepção de PS5, 6B e 23F) foi dissolvido em NaCl 2 M ou em água para injecção (WFI). A concentração óptima do polissacárido foi avaliada para todos os serotipos. Todos os serotipos, excepto o serotipo 18C, foram conjugados directamente à proteína veículo como detalhado abaixo. A partir de uma solução stock a 100 mg/mL em acetonitrilo ou solução de acetonitrilo/água a 50%/50%, foi adicionado CDAP (razão CDAP/PS de 0,75 mg/mg PS) à solução polissacarídica. Após 1,5 minutos, foi adicionado NaOH a 0,2 M-0,3 M para obter o pH específico de activação. A activação do polissacárido foi realizada neste pH durante 3 minutos a 25 °C. Foi adicionada proteína purificada (proteína D ou DT) (a quantidade depende da razão inicial de PS/proteína veículo) ao polissacárido activado e a reacção de acoplamento foi realizada ao pH específico durante até 2 horas (dependendo do serotipo) sob regulação de pH. De modo a inactivar grupos éster de cianato que não reagiram, foi depois adicionada uma solução 2 M de glicina à mistura. 0 pH foi ajustado ao pH de inactivação (pH 9,0) . A solução foi agitada durante 30 minutos a 25 °C e depois, de um dia para o outro, a 2-8 °C, com agitação lenta contínua.
Preparação de 18C: 0 18C foi ligado à proteína veiculo através de um ligante - di-hidrazida do ácido adípico (ADH). O polissacárido do serotipo 18C foi microfluidizado antes da conjugação. 172
Derivatização do toxóide tetânico com EDAC
Para a derivatização do toxóide tetânico, o TT purificado foi diluído a 25 mg/mL em NaCl a 0,2 Me o espaçador ADH foi adicionado de modo a obter uma concentração final de 0,2 M. Quando a dissolução do espaçador estava completa, o pH foi ajustado para 6,2. A EDAC (l-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida) foi depois adicionada para alcançar uma concentração final de 0,02 M e a mistura foi agitada durante 1 hora sob regulação de pH. A reacção de condensação foi parada por aumento do pH até 9,0 durante, pelo menos, 30 minutos a 25 °C. O TT derivatizado foi depois diafiltrado (membrana de CO de 10 kDa) de modo a remover ADH e reagente EDAC residuais. A carga TTAH foi finalmente filtrada de modo estéril até ao passo de acoplamento e armazenada a -70 °C.
Acoplamento quimico de TTah ao PS 18C
Os detalhes dos parâmetros de conjugação podem ser encontrados na Tabela 1. Foram diluídos em água 2 gramas de PS microfluidizado à concentração definida e ajustados a 2 M de NaCl por adição de NaCl em pó. A solução de CDAP (100 mg/mL preparada de fresco em acetonitrilo/WFI a 50/50 v/v) foi adicionada para alcançar a razão CDAP/PS apropriada. O pH foi aumentado até ao pH 9,0 de activação por adição de NaOH a 0,3 Me foi estabilizado a este pH até à adição de TTAH. 173
Após 3 minutos, o TTAh derivatizado (20 mg/mL em NaCl a 0,2 M) foi adicionado para alcançar a razão TTAH/PS de 2; o pH foi regulado para o pH 9,0 de acoplamento. A solução foi deixada uma hora sob regulação de pH.
Para terminar, uma solução de glicina a 2 M, foi adicionada à mistura PS/TTah/CDAP . O pH foi ajustado ao pH de inactivação (pH 9,0). A solução foi agitada durante 30 minutos a 25 °C e depois deixada, de um dia para o outro, a 2-8 °C, com agitação lenta continua.
Purificação dos conjugados:
Os conjugados foram purificados por filtração gel utilizando uma coluna de filtração gel Sephacryl 500HR equilibrada com NaCl a 0,15 M (S500HR para 18C) para remover pequenas moléculas (incluindo DMAP) e PS e proteína não conjugados. Com base nos diferentes tamanhos moleculares dos componentes de reacção, os conjugados PS-PD, PS-TT ou PS-DT são eluídos primeiro, seguidos por PS livre, depois pelo PD livre ou DT livre e finalmente DMAP e outros sais (NaCl, glicina).
As fracções contendo conjugados são detectadas por UV280 nm· As fracções são reunidas de acordo com o seu Kd, filtradas de modo estéril (0,22 pm) e armazenadas a +2-8 °C. Foram determinadas as razões PS/Proteína nas preparações de conjugado. 174
Condições específicas de activação/acoplamento/inactivação de conjugados PS de S. pneumoniae-Proteína D/TT/DT
Serotipo 1 pfluido 3 (pfluido.) 4 pfluido 5 6B 7F pfluido Cone. de PS (mg/mL) 2, 5 3,0 2, 5 7, 1 5, 0 5, 0 Dissolução de PS WFI NaCl 2 M WFI WFI NaCl 2 M NaCl 2 M Cone. de PD (mg/mL) 10,0 5, 0 10,0 5, 0 5, 0 10, 0 Razão inicial PS/PD (p/p) 1, 5/1 1/1 1,5/1 1/1 1,1/1 1, 2/1 Cone. de CDAP (mg/mg de PS) 0, 50 0, 75 0, 50 0, 79 0,83 0, 75 pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,5
Serotipo 9V pfluido 14 pfluido 18C pfluido 19F pfluido 23F Cone. de PS (mg/mL) 5, 0 5, 0 4,5 9,0 2,38 Dissolução de PS NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M NaCl 2 M Cone. de proteína veículo (mg/mL) 10,0 10,0 20,0 (TT) 20,0 (DT) 5,0 Razão inicial proteína veículo/PS (p/p) 1,2/1 1,2/1 2/1 1,5/1 1/1 Cone. de CDAP (mg/mg de PS) 0,50 0, 75 0, 75 1,5 0,79 pHa=pHc=pHq 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 175
Os 11 conjugados foram depois misturados conjuntamente e a preparação antigénica final misturada com o adjuvante apropriado antes da imunização.
Grupos de 40 murganhos Balb/c fêmeas de 4 semanas foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 0,1 pg de conjugados PS 11-valentes formulados com AS01B ou AS01E. Os anticorpos IgG anti-PS foram doseados por ELISA em soros recolhidos no dia 42.
Como pode ser observado a partir da Figura 12, foram observadas respostas comparáveis entre a formulação diluída de AS01E comparativamente à formulação de AS01B, à excepção de PS 14 em que foi observada uma resposta mais elevada com AS01B e PS 19F em que foi observada uma resposta mais elevada com AS01E.
Exemplo IX: Avaliação pré-clinica de composições imunogénicas de citomegalovirus adjuvadas e não adjuvadas. IX.1: Cobaios.
IX.1.1 Elisa anti-gB
A quantificação de anticorpos anti-gB foi realizada por ELISA utilizando gB como um antigénio de revestimento. O antigénio foi diluído a uma concentração final de 4 pg/mL em PBS e foram incubados 100 pL, de um dia para o outro, a 4 °C, numa placa de microtitulação de 96 poços. As placas foram depois saturadas durante 1 hora a 37 °C com 200 pL de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino. Foram adicionadas diluições duas vezes em série de soros (100 pL/poço) e incubadas durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS
contendo 0,1% de Tween20 e foram adicionados a cada poço 100 pL 176 de IgG anti-cobaio com peroxidase de rábano (Dako, RU) e incubadas durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween20 e 1 vez com água. Depois foram incubadas durante 20 minutos a 22 °C com 100 pL de uma solução de O-fenilenodiamina (Sigma) em tampão citrato 0,1 M a pH 4,2. Esta reacção foi parada com 100 pL de H2SO4 2 N e lida a 490/620 nm. Os títulos de Elisa foram determinados por interpolação dos valores de OD a partir de uma amostra de referência por SoftMaxPro. Os títulos foram expressos em EU/mL.
As análises estatísticas dos dados de Elisa foram realizadas nos dias 14 pós 2 utilizando UNISTAT. O protocolo aplicado para a análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue: 1) Transformação logarítmica dos dados 2) Teste de Shapiro-Wilk em cada população (grupo) de modo a verificar a normalidade da distribuição dos grupos 3) Teste de Cochran de modo a verificar a homogeneidade de variância entre as diferentes populações (grupos) 4) Análise de variância em dados seleccionados (unilateral) 5) Teste de Tukey-HSD para comparações múltiplas. IX.1.2 - Ensaio de neutralização
Antes do ensaio, células MRC5 (10000 células/200 pL de meio MEM) foram distribuídas em microplacas de 96 poços e incubadas durante 3 dias a 37 °C com CO2. Foram realizadas diluições duas vezes de soros inactivados (30 minutos a 56 °C) e incubados com 100 pL de solução virai (800/mL) durante 1 hora a 37 °C. Após a 177 incubação, foram inoculados 100 pL de mistura soro/virus em microplacas de 96 poços contendo monocamada de MRC5. As placas foram centrifugadas a 2000 rpm durante 1 hora a 35 °C. Após uma incubação de um dia para o outro a 37 °C, as placas foram fixas com uma solução de acetona a 80% (20 minutos a -20 °C) . A solução de acetona foi rejeitada e as células positivas a CMV foram detectadas utilizando um monoclonal especifico anti-antigénio imediatamente precoce durante 1 hora a 37 °C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS e foi adicionado a cada poço Ig anti-murganho conjugada com biotina e incubadas durante 1 hora a 37 °C. Após um passo de lavagem, foi adicionada estreptavidina-peroxidase de rábano durante mais 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes e incubadas durante 10 minutos com uma solução de True-Blue. Os sinais coloridos específicos foram registados por examinação ao microscópio. Os títulos neutralizantes foram expressos como o inverso da diluição mais elevada de soro que produz uma redução de 50% de célula positivas a CMV comparativamente a um controlo de vírus (CMV mais células sem soro). IX.1.3 - Protocolos de imunização
Foram imunizados 4 grupos. Cada grupo continha 8 cobaios Hartley Cri: (ha) fêmeas com 5-8 semanas, à excepção de um grupo de controlo (grupo 4) contendo apenas 4 indivíduos. Os indivíduos foram imunizados IM nos dias 0 e 28. Foram recolhidas amostras de soro 28 dias após a primeira imunização e 14 dias após a segunda imunização. Foram realizados Elisa como descrito acima em soro retirado a 28 pós-I e 14 pós-II. Os ensaios de neutralização foram realizados como descritos acima a 14 pós-II. Os grupos foram como abaixo: 178
Grupo Antigénio Adjuvante 1 gB NaCl 2 gB AS01B 3 gB AS01E 4 NaCl NaCl 0 antigénio foi preparado como se segue: 0 antigénio de vacina é expresso em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) como gB**, uma quimera truncada contendo sequências péptídicas da glicoproteina gD do virus 2 de Herpes simplex (HSV2) nos seus N e C-terminais. 0 gB** está truncado no seu domínio C-terminal que contém a sequência âncora da membrana e é, deste modo, excretado no sobrenadante de cultura. Para os primeiros três grupos, 15 pg de gB** preparados em 500 pL de PBS, AS01B ou AS01E (preparados como no Exemplo II. 2 acima) foram injectados intramuscularmente . No grupo 4, apenas PBS foi administrado intramuscularmente. IX.1.4 - Resultados
Como pode títulos de ELISA grupos adjuvados maior para gB e de anticorpo de (1,5 vezes) no ser observado na Figura 13, foram observados anti-gB significativamente maiores para os dois comparativamente ao gB simples (8 e 5,5 vezes AS01B e gb/ASOlE, respectivamente). Os títulos pós-dose II foram muito ligeiramente maiores grupo gB/ASOlB comparativamente ao grupo gB/ASOlE. 179
Comparação múltipla: Tuckey-HSD
Grupo Casos Média Simples AS01E AS01B Simples 8 4,7917 * * * * AS01E 8 5,5293 * * AS01B 8 5,6942 * * Simples < AS01E = AS01B
Relativamente a títulos neutralizantes (Figura 14): Não foram observados anticorpos neutralizantes específicos no grupo gB simples
Foram detectados anticorpos neutralizantes específicos em ambos os grupos adjuvados
Foram observados níveis semelhantes de anticorpos neutralizantes em ambos os grupos adjuvados. IX.2 - Murganhos
IX.2.1 - ELISA anti gB
A quantificação de anticorpos anti-gB foi realizada por ELISA utilizando gB como um antigénio de revestimento. 0 antigénio foi diluído a uma concentração final de 1 pg/mL em PBS e foram incubados 100 pL, de um dia para o outro, a 4 °C, numa placa de microtitulação de 96 poços. As placas foram depois saturadas durante 1 hora a 37 °C com 200 pL de PBS contendo 1% de albumina de soro bovino. Foram adicionadas diluições duas vezes em série de soros (100 pL/poço) e incubadas durante 1 hora e 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS
contendo 0,1% de Tween20 e foram adicionados a cada poço 100 pL 180 de estreptavidina-peroxidase de rábano durante mais 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween20 e 1 vez com água. Depois foram incubadas durante 10 minutos a 22 °C com 100 pL de 75% de tetra-metil-benzidina em tampão citrato 0,1 M a pH 5,8. Esta reacção foi parada com 100 pL de H2S04 0, 4 N e lida a 450/620 nm. Os titulos de Elisa foram determinados por interpolação dos valores de OD a partir de uma amostra de referência por SoftMaxPro. Os titulos foram expressos em EU/mL.
As análises estatísticas dos dados de Elisa foram realizadas nos dias 14 pós 2 utilizando UNISTAT. O protocolo aplicado para a análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue: 1) Transformação logarítmica dos dados 2) Teste de Shapiro-Wilk em cada população (grupo) de modo a verificar a normalidade da distribuição dos grupos 3) Teste de Cochran de modo a verificar a homogeneidade de variância entre as diferentes populações (grupos) 4) Análise de variância em dados seleccionados (unilateral) 5) Teste de Tukey-HSD para comparações múltiplas. IX.2.2 - Ensaio de neutralização
Antes do ensaio, células MRC5 (10000 células/200 pL de meio MEM) foram distribuídas em microplacas de 96 poços e incubadas durante 3 dias a 37 °C com C02. Foram incubadas diluições duas vezes (60 pL) de soros inactivados (30 minutos a 56 °C) com 60 pL de solução virai (800 IPU/mL) durante 1 hora a 37 °C. Após a incubação, foram inoculados 100 pL de mistura soros-vírus em 181 microplacas de 96 poços contendo células MRC5. As placas foram centrif ugadas a 2000 rpm durante 1 hora a 35 °C. Após uma
incubação de um dia para o outro a 37 °C, as placas foram fixas com uma solução de acetona a 80% (20 minutos a -20 °C) . A solução de acetona foi rejeitada e as células positivas a CMV foram detectadas utilizando um monoclonal especifico anti-antigénio imediatamente precoce I (IE-I) durante 1 hora a 37 °C. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS e foi adicionado a cada poço Ig anti-murganho conjugado com biotina e incubadas durante 1 hora a 37 °C. Após um passo de lavagem, foi adicionada estreptavidina-peroxidase de rábano durante mais 30 minutos a 37 °C. As placas foram lavadas 4 vezes e incubadas durante 10 minutos com uma solução de True-Blue. Os sinais coloridos específicos foram registados por examinação ao microscópio. Os títulos neutralizantes foram expressos como o inverso da diluição mais elevada de soro que produz uma redução de 50% de célula positivas a CMV comparativamente a um controlo de vírus (CMV mais células sem soro). IX.2.3 - Coloração Intracelular de Citocinas A coloração intracelular de citocinas de células T foi realizada em PBL nos dias 7 e 21 após a segunda imunização. Os PBL foram recolhidos de murganhos e agrupados (1 agrupamento por grupo). A estimulação antigénica in vitro de linfócitos (concentração final de 10*7 células/mL) foi realizada com um agrupamento de péptidos que cobrem a sequência CMV ou com a proteína gB. A mistura de PBL/antigénio foi incubada 2 h a 37 °C. As células foram depois incubadas, de um dia para o outro, na presença de Brefeldina (1 pg/mL) a 37 °C para inibir a secreção de citocina. A coloração celular foi realizada como se segue: as suspensões celulares foram lavadas, ressuspensas em 182 50 pL de 1% de FCS em PBS contendo 2% de reagente de bloqueamento. Após 10 minutos de incubação a 4 °C, 50 pL de uma mistura de anti-CD4 PE e anti-CD8 perCp foi adicionada e incubada 30 minutos a 4 °C. Após um passo de lavagem em 1% de FCS em PBS, as membranas celulares foram permeabilizadas através de ressuspensão em 200 pL de Cytofix-Cytoperm (Kit Beckton Dickinson) e incubadas 20 minutos a 4 °C. As células foram depois lavadas com Perm Wash (Kit BD) e ressuspensas com 50 pL de um anti-IFN-gama APC + anti-IL-2 FITC diluídos em Perm Wash. Após incubação de 2 h a 4 °C, as células foram ressuspensas em 1% de FCS em PBS + 1% de paraformaldeido. A análise das amostras foi realizada por FACS. As células vivas foram circunscritas e a aquisição foi realizada a +/-20000 eventos. As percentagens de IFNg+ ou IL2+ foram calculadas em populações CD4+ e CD8+ circunscritas. IX.2.4- Protocolos de Imunização
Foram imunizados 4 grupos. Cada grupo continha 12 murganhos C57BI/6 fêmeas com 4-10 semanas.
Grupo Antigénio Adjuvante 1 gB PBS 2 gB AS01B 3 gB AS01E 4 NaCl NaCl O antigénio foi preparado como se segue: O antigénio de vacina é expresso em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) como gB**, uma quimera truncada contendo sequências péptídicas da glicoproteina gD do vírus 2 de Herpes simplex (HSV2) nos seus 183 N e C-terminais. 0 gB** está truncado no seu domínio C-terminal que contém a sequência âncora da membrana e é, deste modo, excretado no sobrenadante de cultura.
Para cada grupo, gB** a uma concentração de 1,5 pg/dose foi preparado em 625 pL de PBS ou adjuvante AS01B ou AS01E (preparado como no Exemplo II. 2 acima tendo uma concentração de 100 pL de imunoestimuladores por mL ou 50 pL de imunoestimuladores por mL, respectivamente). Foram injectados 50 pL (i. e., 1/10 de uma dose humana de LO O mL) intramuscularmente. Um grupo de controlo de murganhos foi injectado com soro fisiológico. As injecções foram realizadas nos dias 0 e 28. As amostras de soro foram recolhidas 14 dias após as segundas injecções para ensaios de ELISA e de Neutralização. Os PBL foram recolhidos 7 dias e 21 dias após as segundas injecções para ICS. IX.2.5 - Resultados Títulos de ELISA anti-gB (Figura 15).
Um nível muito fraco a indetectável de anticorpos anti-gB foi observado no grupo gB não adjuvado. Contudo, foi observada uma resposta elevada de anticorpo (65 e 66 vezes maior) em ambos os grupos de adjuvante, AS01B e AS01E, respectivamente. Não existe significância estatística entre o grupo AS01B e AS01E. 184
Comparação múltipla: Tuckey-HSD
Grupo Casos Média Simples AS01E AS01B Simples 12 2,1132 * * * * AS01E 12 3,9317 ★ * AS01B 12 3,9375 * * Simples < AS01E = AS01B Títulos neutralizantes anti-CMV (Figura 16)
Foram observados títulos neutralizantes anti-gB significativamente maiores para os dois grupos adjuvados comparativamente ao grupo gB simples. Não foi observada diferença significativa em títulos de anticorpos neutralizantes entre as formulações de AS01B e AS01E.
Imunidade mediada por célula.
Devido ao nível muito baixo de resposta observado após re-est imulação de 7 amostras pós-II, não pode ser feita discriminação entre grupos e não pode ser observada resposta conclusiva para estimulação de CD4 e CD8 (Figura 17) . Estas respostas baixas a indetectáveis foram provavelmente devido a uma questão técnica durante a preparação das amostras. Contudo, podiam ser observadas respostas 21 dias após a segunda injecção. Os dados de CD4 (Figura 18) não mostram qualquer diferença após re-estimulação por gB (5 pg/mL) ou péptidos (2 pg/mL ou 4 pg/mL). Um perfil de citocina semelhante é observado para AS01E e AS01B. Não pode ser observada resposta conclusiva para estimulação de CD8 (Figura 19) 185
Estas experiências mostram que para outra composição antigénica e em dois organismos diferentes, um adjuvante que tem níveis menores de imunoestimuladores é imunologicamente tão eficaz quanto aquele que tem níveis maiores. X: Avaliação pré-clinica de Vacina RTS,S Adjuvada X.1 — Formulação A composição antigénica RTS,S é produzida em Saccharomyces cervisiae e consiste em duas proteínas, RTS e S, que intracelularmente e espontaneamente se juntam em estruturas particuladas poliméricas mistas que é estimado conterem, em média, 100 polipéptidos. A RTS é uma cadeia polipeptídica híbrida de 51 kDa de 424 aminoácidos que consiste em 189aa derivados de um antigénio de superfície esporozoíta do parasita da malária P. falciparum estirpe NF53 (o antigénio CSP, a.a. 207 a 395), fundida à extremidade do terminal amino da proteína S do vírus da hepatite B. S é um polipéptido de 24 kDa (226 aminoácidos de comprimento) que corresponde ao antigénio de superfície do vírus da hepatite B. O sedimento antigénico liofilizado contém aproximadamente 50 pg (quando concebido para ser formulado em 0,5 mL com AS01B) ou 25 pg (quando concebido para ser formulado em 6,5 mL com AS01E) de antigénio. AS01B e AS01E foram preparados por mistura dos vários componentes (PBS, lipossomas, MPL e QS21) num recipiente e agitando sob condições assépticas. O produto foi depois filtrado de modo estéril antes ser cheio em frasquinhos ou seringas. O adjuvante líquido foi armazenado a +2 °C a +8 °C antes de ser utilizado para reconstituir o sedimento antigénico liofilizado. 186 Χ.2 - Experiências de murganhos
Foram realizadas duas experiências em murganhos visando comparar as respostas imunes especificas a RTS,S induzidas por RTS,S/AS01B comparativamente a RTS,S formulado com AS01E. Em cada experiência, foram imunizados intramuscularmente murganhos C57BI/6 (10 murganhos/grupo) três vezes com intervalos de duas semanas com 10, 5 ou 2,5 pg de RTS,S formulado com adjuvantes AS01B ou AS01E. Como controlos, dois grupos foram imunizados com apenas AS01B ou AS01E. As respostas de anticorpo específicas para HB e CS foram avaliadas para cada murganho por ELISA, 15 dias após a terceira imunização. Os títulos médios geométricos de anticorpo e os seus intervalos de confiança de 95% foram calculados para todos os murganhos que recebem o mesmo tratamento em ambas as experiências. Foram realizadas análises estatísticas para avaliar o efeito dos adjuvantes e os efeitos de dose de antigénio em dados agrupados de ambas as experiências. As respostas de células T específicas de CD4 e CD8 foram medidas por citometria de fluxo, 7 dias após as segundas e terceiras imunizações em agrupamentos de células sanguíneas de 5 murganhos por grupo. Assim, foram gerados dois valores para cada grupo em cada experiência.
Resposta Imune Humoral
Como mostrado nas Figuras 20 e 21, ambos os adjuvantes AS01B e AS01E induzem respostas de anticorpo comparáveis fortes contra CSP e HB. Uma ANOVA de três factores em GMT anti-CSP mostrou que não existiu diferença significativa entre AS01B e AS01E para as doses de 5 ou 2,5 pg de RTS,S. Para a dose de 10 pg, verificou-se que o adjuvante AS01B induz títulos anti-CS mais elevados do 187 foi que AS01E e a razao GMT "grupo ASOlB/grupo AS01E" 1,93 (IC de 95%: 1,33 - 2,79; p = 0,001).
Resposta imune mediada por célula especifica
As Figuras 22 e 23 mostram os níveis de células T CD4 e CD8 específicas para CSP e HB que expressam IL-2 e/ou IFN gama. A resposta de CD4 específica para CSP tende a ser maior com AS01B comparativamente a AS01E após três imunizações, enquanto que a resposta de célula T CD8 com AS01E é equivalente ou melhor do que com AS01B. A resposta de CD4 específica para HB tende a ser maior com AS01B comparativamente a AS01E após três imunizações, excepto para a dose mais baixa de RTS,S em que os níveis de células T CD4 são comparáveis entre os dois adjuvantes. As respostas de célula T CD8 específicas de HB induzidas por RTS,S formulado com AS01E são equivalentes ou melhores do que as respostas induzidas por RTS,S formulado com AS01B.
Pensa-se que estas diferenças estejam dentro da variabilidade prevista de ensaios imunológicos celulares. A avaliação pré-clinica da vacina RTS,S/AS01E em murganhos revelou um perfil aceitável de segurança, semelhante àquele de RTS,S/AS01B. XI: Avaliação clinica de RTS,S/AS01E.
As formulações são preparadas como no Exemplo X acima. A sacarose é utilizada como um excipiente no sedimento antigénico liofilizado. Como no Exemplo X, o adjuvante líquido é utilizado para reconstituir o antigénio liofilizado. AS01E foi preparado 188 como descrito no Exemplo II. 2 e armazenado a +2 a +8 °C até ser necessário para a reconstituição.
Um ensaio duplamente cego aleatorizado de fase II de segurança e imunogenicidade de RTS,S adjuvada com AS01E está actualmente em curso em crianças com 18 meses a 4 anos que vivem no Gabão. 0 plano de vacinação é um plano de vacinação de 0, 1, 2 meses. Os objectivos são como se seguem para RTS,S/AS01E quando administrado como 3 doses intramuscularmente numa plano de 0, 1, 2 meses a crianças com 18 meses a 4 anos que vivem numa área endémica de malária:
Co-primários avaliar a segurança até um mês pós-Dose 3.
Demonstrar a não inferioridade de uma vacina RTS,S adjuvada de emulsão óleo-em-água em termos de resposta de anticorpo anti-CS um mês pós-Dose 3.
Secundários
avaliar a reactogenicidade até um mês pós-Dose 3 demonstrar a não inferioridade de uma vacina RTS,S adjuvada de emulsão óleo-em-água em termos de resposta de anticorpo anti-HB um mês pós-Dose 3 descrever seroprotecção contra hepatite B até um mês pós-Dose 3 descrever a resposta anti-CS até um mês pós-Dose 3
Terciários
Segurança entre um mês pós-Dose 3 até 12 meses pós-Dose 3 189
Resposta imune humoral ao antigénio CS aos 12 pós-Dose 3 Resposta imune humoral ao antigénio HB aos 12 pós-Dose 3
Exploratórios avaliar a resposta imune mediada por célula T ao antigénio CS até 12 meses pós-Dose 3 avaliar a resposta imune de célula B de memória ao antigénio CS até 12 meses pós-Dose 3 descrever a resposta anti-CS até um mês pós-Dose 3 de acordo com estado de imunização de HBV na selecção.
Foram inscritos 180 indivíduos, foi administrada a 90 uma vacina adjuvada com um adjuvante de emulsão óleo-em-água registado e previamente validado (denominado "controlo" nas Tabelas abaixo) e foi administrada a 90 uma vacina adjuvada com AS01E. Foram seleccionadas crianças masculinas e femininas saudáveis com 18 meses a 4 anos de idade. As vacinas foram administradas por via IM ao deltoide esquerdo. 190 Τ 6 Τ
Incidência e natureza dos sintomas (solicitados e não solicitados) reportados durante o período de 7 dias (Dias 0-6) pós-vacinação após cada dose e em termos globais (coorte de vacinados total)
Qualquer sintoma Sintomas gerais Sintomas locais 95% IC 95% IC 95% IC Grupo N n % LL UL N n % LL UL N n % LL UL Dose 1 Gr 1 90 40 44,4 34,0 55,3 90 23 25,6 16,9 35,8 90 20 22,2 14,1 32,2 Gr 2 90 47 52,2 41,4 62,9 90 26 28,9 19,8 39,4 90 32 35,6 25,7 46,3 Dose 2 Gr 1 88 50 oo VD L-£ > 45,8 67,3 88 36 40,9 30,5 51,9 88 35 39,8 29,5 50,8 Gr 2 87 53 60,9 49,9 71,2 87 39 44,8 34,1 55,9 87 34 39,1 28,8 50,1 Dose 3 Gr 1 83 78 94,0 86,5 98,0 83 34 41,0 30,3 52,3 83 76 91,6 83,4 96,5 Gr 2 85 82 96,5 90,0 99,3 85 50 58,8 47,6 69,4 85 79 92,9 85,3 97,4 Global/ dose Gr 1 261 168 64,4 58,2 70,2 261 93 35,6 oo CTi Ov] 41,8 261 131 50,2 44,0 56,4 Gr2 262 182 69,5 63,5 75,0 262 115 43,9 37,8 50,1 262 145 55,3 49,1 61,5 Global/ indivíduo Gr 1 90 87 96,7 90,6 99,3 90 60 66,7 55,9 76,3 90 83 92,2 84,6 oo Gr 2 90 85 94,4 87,5 98,2 90 70 77,8 67,8 85,9 90 84 93,3 86,1 97,5
Gr 1 = RTS,S.AS01E, Gr 2 = controlo, LL = limite inferior, UL = limite superior Para cada dose e em termos globais/indivíduo: N = número de indivíduos com, pelo menos, um dose administrada n/% = número/percentagem de indivíduos que apresentam, pelo menos, um tipo de sintoma, independentemente da vacina de estudo administrada Para global/dose: N = número de doses administradas n/% = número/percentagem de doses seguidas por, pelo menos, um tipo de sintoma, independentemente da vacina de estudo administrada 95¾ IC = intervalo de confiança exacto de 95%, LL = limite inferior, UL = limite superior
Estes dados demonstram que uma vacina RTS,S adjuvada com AS01E produziu resultados de reactogenicidade aceitáveis numa população pediátrica quando comparada com uma formulação de controlo.
As respostas serológicas foram medidas por avaliação das respostas de anticorpo a HB e a repetições de CSP (anti R32LR). 0 soro para a determinação de anticorpo foi recolhido na selecção, no dia 60 e no dia 90 (na segunda vacinação e na terceira vacinação). Os níveis de anticorpo contra CS foram medidos por metodologia padrão de ELISA utilizando placas adsorvidas com antigénio R32LR, com um anticorpo de referência padrão como um controlo de acordo com Procedimentos Operativos Normalizados (SOP) do laboratório. Os resultados são dados em EU/mL. 0 anticorpo para o antigénio de superfície da hepatite B foi medido utilizando um imunoensaio de ELISA comercialmente disponível (kit de teste AUSAB EIA da Abbott) ou equivalente de acordo com as instruções do ensaio. Os resultados são dados em mLU/mL. 192
Taxas de seropositividade e GMC para anticorpos anti-CS (coorte de vacinados total) ε 6 τ >= 0,5 ELU/ML GMC 95¾ IC 95¾ IC Anticorpo Grupo Instante N n % LL OL Valor LL OL Hin Nax Anti-CS Gr 1 SELECÇÃO 89 0 0,0 0,0 4,1 0,3 0,3 0,3 <0,5 <0,5 PII(D60) 78 78 100 95,4 100 81,9 64,9 103,2 4,6 568,6 PIII(D90) 75 75 100 95,2 100 215,6 178,8 259,9 14,3 1922,3 Gr 2 SELECÇÃO 90 1 u 0,0 6,0 0,3 0,2 0,3 <0,5 0,5 PII(D60) 78 78 100 95,4 100 56,9 45,7 70,9 3,6 2380,9 PIII(D90) 80 80 100 95,5 100 164,8 134,1 202,6 6,3 2093,6 Gr 1 = RTS,S.AS01E Gr 2 = Controlo GMC = concentração média geométrica de anticorpo calculada em todos os indivíduos N = número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/percentagem de indivíduos com concentração dentro da gama especificada 95¾ IC = intervalo de confiança de 95¾) LL = Limite inferior, UL = Limite superior Min/Max = Mínimo/Máximo
Taxas de seropositividade e GMC para anticorpos anti-HB (coorte de vacinados total) 6 Τ >= 10 ELU/ML GMC 95% IC 95% IC Anticorpo Grupo Instante N n 1 LL UL Valor LL UL Min Max Anti-HB Gr 1 SELECÇÃO 89 43 48,3 37,0 59,2 40,8 23,3 71,4 <10,0 46421,6 PII(D60) 78 77 98,7 93,1 100 8930,4 4684,2 17048,7 <10,0 161536 7 PIII(D90) 75 75 100 95,2 100 24527,7 15316,5 39278,5 21,1 169430 6 Gr 2 SELECÇÃO 90 37 41,1 30,8 52,0 20,0 12,8 31,0 <10,0 30796,4 PII (D60) 78 77 98,7 93,1 100 3640,0 1963,1 6749,3 <10,0 150811 4 PIII(D90) 80 80 100 95,5 100 19485,0 13511,3 28099,9 178,6 110397 4 Gr 1 = RTS,S.AS0 Gr 2 = Controlo GMC = concentraç N = número de in< n/% = número/per 951 IC = interva Min/Max = Mínimo 1E ão média geométrica de anticorpo calculada em todos os indivíduos livíduos com resultados disponíveis oentagem de indivíduos com concentração dentro da gama especificada lo de confiança de 95%; LL = Limite inferior, UL = Limite superior /Máximo
Estes dados demonstram que uma formulação de vacina RTS,S adjuvada com AS01E produziu respostas imunes humorais aceitáveis numa população pediátrica quando comparada a um controlo validado.
Exemplo XII: Avaliação pré-clinica do Vírus Varicella Zoster com AS01B comparativamente a AS01E. A vacina candidata é composta de uma proteína truncada do envelope do VZV, gE, produzida em células CHO.
Para este ensaio, foram iniciados murganhos C57BU6 (n=48) com uma dose humana (DH) de Varilrix (-4 log pfu/dose) administrada subcutaneamente. Cinco semanas após a iniciação com Varilrix, os murganhos foram divididos em 5 grupos de 12 murganhos e injectados intramuscularmente (tíbias) nos dias 0 e 28 com apenas 5 pg de gE, 5 pg gE + AS01E* (1/10 da DH) ou 5 pg de gE + AS01B (1/10 da DH) . O grupo de controlo dos murganhos (apenas iniciados) foi injectado com soro fisiológico (0,9% de NaCl) . As respostas imunes foram avaliadas nos dias 14 e/ou 30 que seguem a segunda vacinação. Os níveis de anticorpos totais específicos de gE e a frequência de células T CD4 e CD8 produtoras de citocinas (IL2/IFNy) foram avaliados.
Respostas de anticorpo específicas de gE:
Foi desenvolvido um ELISA para detectar e quantificar anticorpos específicos de gE em soros de murganhos, utilizando proteína gE como o antigénio de revestimento. Os títulos de ELISA foram definidos como o inverso da diluição sérica que produziu uma medida de absorvência (densidade óptica) igual a 195 50% do valor máximo de absorvência. Os títulos de ELISA foram calculados por análise de regressão.
Os dados demonstram que gE AS01E e gE AS01B induzem níveis semelhantes de anticorpos específicos de gE (valores p >0,05). Ambas as formulações induziram respostas significativamente maiores comparativamente a apenas antigénio gE (10-13 vezes, valores p <0,05) 14 e 30 dias pós-II (Figura 26). 14 dias pós-II 95% IC 30 dias pós-II 95% IC Grupo GMT (EU/mL) LL UL GMT (EU/mL) LL UL gE 12067 5960 24433 3832 911 16115 qE/ASOlE 125934 95504 166059 50439 38071 66825 gE/ASOlB 131728 88112 196934 47589 36158 62635 Varilrix 34 11 105 33 10 102
Respostas de CD4 e CD8 específicas de gE A produção de citocinas foi avaliada em células T CD4 e CD8 utilizando uma técnica de coloração intracelular de citocinas. As células de baço foram isoladas de cada grupo de 12 murganhos 30 dias pós-II e reunidas em 4 grupos de 3 baços. As células de baço (lxlO6) foram incubadas durante 2 horas na presença de péptidos gE (63 péptidos) cobrindo a totalidade da proteína gE (20 aa peptídicos/10 aa de sobreposição) e depois incubadas de um dia para o outro na presença de brefeldina. Subsequentemente, as células foram coradas com mAb fluorescente específico para CD4/CD8 de superfície celular e seguindo a permeabilização de citocinas intracelulares IL-2 e IFNy.
Como mostrado nas Figuras 26, embora tenham sido induzidos perfis semelhantes de citocinas (IL2/IFNY) com ambas as 196 formulações gE AS01B e gE AS01E, a formulação AS01B induziu uma maior magnitude de células produtoras de citocinas CD4 e CD8 (2 vezes, p>0,05 para CD4, 3,6 vezes, p>0,05 para CD8). Devido a uma inesperada elevada variabilidade das respostas de célula T, a capacidade para detectar uma diferença significativa entre doses adjuvantes foi muito limitada {<50%) . De modo importante, ambos os gE formulados com AS01B ou AS01E induziram células T CD4 produtoras de citocinas de uma magnitude significativamente maior (13,3 vezes, p<0,05) comparativamente a apenas gE. Maiores níveis de células CD8 foram também induzidos por gE formulado com AS01B ou AS01E (3,8 vezes, p>0,05) comparativamente a apenas antigénio gE.
Exemplo XIII: Avaliação Pré-clinica de AS01B vs AS01E num modelo de Furão da Gripe.
Materiais e métodos
Furões fêmeas (Mustela putorius furo) com 4-6 meses foram obtidos da MISAY Consultancy (Hampshire, RU) . Os furões foram iniciados no dia 0 com a estirpe hetero-subtípica H1N1 A/estocolmo/24/90, (4LogTCID50/mL) , 250 pL administrados intranasalmente. No dia 21, os furões foram injectados intramuscularmente com uma dose humana inteira (1000 pL de dose de vacina, 15 pg de HA por estirpe A, 17,5 pg de estirpe B) de uma combinação de H1N1 A/Nova Caledónia C/20/99 (15 pg/mL), H3N2 A/Wyoming/3/2003 (15 pg/mL) e B/Jiangsu/10/2003 (17,5 pg/mL). Os furões foram depois desafiados no dia 42 por via intranasal com 250 pL de uma estirpe hetero-subtípica Wh.A/NY/55/04 (4,51 Log TCID50/mL). As vacinações no dia 21 foram com formulação trivalente simples ("simples" nas Tabelas abaixo) ou com a formulação trivalente adjuvada com AS01B ("AS01B" nas Tabelas 197 abaixo) ou AS01E ("AS01E" nas Tabelas abaixo). As formulações foram preparadas como estabelecido no Exemplo 3 acima.
Monitorização da temperatura corporal:
As temperaturas individuais foram monitorizadas durante o período de desafio e foram avaliadas utilizando implantes telemétricos que registaram a temperatura individual de cada animal todos os 15 minutos, antes e depois do desafio. Todos os implantes foram verificados e restabelecidos, e uma nova calibração foi realizada por DSI antes da colocação na cavidade intraperitoneal. Todos os animais foram abrigados individualmente numa gaiola individual durante estas medições. As temperaturas foram registadas cada 15 minutos, 6 dias antes da iniciação até 4 dias pós-iniciação, assim como 3 dias antes do desafio até 7 dias pós-desafio.
Teste de Inibição da Hemaglutinação (Hl).
Processo de teste
Os títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três estirpes do vírus da gripe foram determinados utilizando o teste de inibição da hemaglutinação (Hl). 0 princípio do teste de Hl é baseado na capacidade de anticorpos específicos anti-gripe para inibirem a hemaglutinação de glóbulos vermelhos (RBC) de galinha pela hemaglutinina do vírus da gripe (HA). Os soros foram primeiro tratados com uma solução a 25% de neuraminidase (RDE) e inactivados pelo calor para remover inibidores não específicos. Após pré-tratamento, diluições duas vezes dos soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada estirpe de 198 gripe. Os glóbulos vermelhos de galinha foram depois adicionados e a inibição da aglutinação foi pontuada utilizando gotas para a leitura. Os títulos foram expressos como o inverso da diluição mais elevada de soro que inibiu completamente a hemaglutinação. Uma vez que a primeira diluição dos soros foi 1:10, um nível indetectável foi pontuado como um título igual a 5.
Análise estatística A análise estatística foi realizada nos títulos de Hl utilizando UNISTAT. O protocolo aplicado para a análise de variância pode ser resumidamente descrito como se segue: • Transformação logarítmica dos dados. • Teste de Shapiro-Wilk em cada população (grupo) de modo a verificar a normalidade da distribuição dos grupos. • Teste de Cochran de modo a verificar a homogeneidade de variância entre as diferentes populações (grupos). • Análise de variância uni-factorial realizada nos grupos. • Teste de Tukey-HSD para comparações múltiplas
Titulaçao virai em lavagens nasais
Todas as amostras nasais foram primeiro filtradas de modo estéril através de filtros Spin X (Costar) para remover qualquer contaminação bacteriana. Foram transferidos 50 pL de diluições dez vezes em série de lavagens nasais para placas de microtitulação contendo 50 pL de meio (10 poços/diluição). Foram depois adicionados 100 pL de células MDCK (2,4 x 105 células/mL) a cada poço e incubadas a 35 °C durante 6-7 dias. Após 6-7 dias de incubação, o meio de cultura é cuidadosamente removido e são 199 adicionados 100 pL de um meio contendo 1/20 WST-1 e incubadas durante mais 18 horas. A intensidade do corante formazan amarelo produzida após redução de WST-1 por células viáveis é proporcional ao número de células viáveis presentes no poço no final do ensaio de titulação virai e é quantificada por medição da absorvência de cada poço no comprimento de onda apropriado (450 nanómetros) . O limite é definido como a média de OD de células não infectadas de controlo - 0,3 OD (0,3 OD corresponde a +/- 3 StDev de OD de células não infectadas de controlo) . Uma pontuação positiva é definida quando o OD é < limite e, em contraste, uma pontuação negativa é definida quando o OD é > que o limite. Os títulos de disseminação virai foram determinados por "Reed e Muench" e expressos como Log TCID50/mL.
Ensaio de Linfoproliferação.
As PBMC foram recolhidas por centrifugação de gradiente de densidade (20 minutos a 2500 rpm e 4 °C) em solução de linfócito de mamífero Ficoll Cedarlane. As PBMC foram ressuspensas em 5 mL de meio de cultura (RPMI/adicionar a 4 °C) e 10% de soro normal de furão. Os aditivos foram compostos por 100 mM de piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais MEM,
Penicilina/estreptamicina, glutamina e β2-ιηθηο3ρόοθό3ηο1 concentrado xlOOO. As PBMC isoladas de fresco foram utilizadas imediatamente para ensaios de proliferação in vitro. As células foram colocadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano a 2 x 105 células/poço e cultivadas com diferentes concentrações de antigénio (0,1 a 1 pg de HA de vírus inteiro inactivado) durante 44 a 96 h e depois foram marcadas por impulso com 0,5 pCi de [3H]timidina. A incorporação do marcador radioactivo foi estimada 4 a 16 h mais tarde, por espectroscopia de emissão β. 200
Resultados
Carga virai em lavagens nasais após desafio.
As lavagens nasais foram recolhidas 2 dias antes da iniciação (iniciação = dia 0), 1, 2 e 7 dias pós-iniciação, assim como 4 dias antes do desafio (desafio = dia 42) e durante um periodo de 7 dias pós-desafio.
Grupo -2 0 + 1 + 2 + 7 39 42 43 44 45 47 49 Simples 0,82 1, 84 5,35 1,85 0, 8 1,82 5, 77 4, 44 1, 97 0,9 ASO 1E 0, 82 2, 11 5, 83 1,65 0, 8 1,62 4, 93 4, 15 2,4 0,85 ASO 1B 0, 81 2,26 5,38 1,91 0, 82 1,74 2,25 1, 89 1, 350 0,9
Ver resultados na Figura 27.
Disseminação virai pós-iniciação
Foi observado um pico de disseminação virai em todos os furões 2 dias após a iniciação. 7 Dias pós-iniciação, foi apenas observada carga virai residual em todos os grupos.
Disseminação virai após desafio 0 pico de disseminação virai foi observado 24 horas após desafio. A titulação virai 3 dias pós-desafio mostrou elevados títulos virais (nenhuma protecção) em furões imunizados com fragmentada trivalente simples. Foi observada uma redução menor da disseminação virai em furões imunizados com fragmentada trivalente AS01E do que foi observado com fragmentada trivalente adjuvada com AS01B. 201
Monitorização da temperatura: A temperatura corporal foi monitorizada desde 6 dias pré-iniciação (iniciação = dia 0) até 4 dias pós-iniciação, assim como desde 3 dias pré-desafio até 7 dias pós-desafio (desafio = dia 42) . As medições foram tomadas cada 15 minutos e foi calculada uma média a meio do dia para cada grupo. Os resultados podem ser observados na Figura 28. Pós-iniciação A temperatura corporal monitorizada antes, durante e depois da iniciação mostrou um aumento na temperatura em todos os grupos. Pós-Desafio A interpretação da monitorização da temperatura corporal é difícil. Foi observado um ligeiro aumento da temperatura corporal pós-desafio em furões imunizados com fragmentada trivalente simples e fragmentada trivalente AS01E, mas não com fragmentada trivalente AS01B. A pontuação abaixo foi obtida pelo número de furões com um aumento da temperatura corporal >0,4 °C.
Aumento da temperatura pós-desafio
Trivalente Simples: 5/8 ( + 0,4, +0,4, +0,5, + 0,7 Trivalente AS01B 0/8 Trivalente AS01E 6/8 ( + 0,4, +0,4, +0,5, + 0,5 +0,9, +1,6) 202
Esta leitura é menos robusta do que as outras leituras utilizadas em furões.
Teste de Inibição de Hemaglutinaçao (Hl)
As amostras séricas foram recolhidas 4 dias antes da iniciação, 17 dias pós-iniciação, 21 dias pós-imunização e 13 dias pós-desafio. Os resultados podem ser observados nas Figuras 29 e 30. Para todas as três estirpes de vacina, foram observados títulos de Hl mais elevados, estatisticamente significativos, em furões imunizados com fragmentada trivalente adjuvada com AS01B ou AS01E comparativamente a fragmentada trivalente simples. Não foi observada qualquer diferença entre os dois grupos adjuvados. Comparativamente a outros grupos, foram observados títulos de Hl de reacção cruzada mais elevados, estatisticamente significativos, para A/Nova Iorque H3N2 (estirpe de desafio) após imunização de furões com vacinas fragmentadas trivalentes adjuvadas com AS01B.
Lisboa, 22 de Fevereiro de 2012 203

Claims (27)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica num volume adequado para uma dose humana compreendendo um antigénio ou uma preparação antigénica, em combinação com um adjuvante, cujo adjuvante compreende uma fracção saponinica imunologicamente activa derivada da casca de Quillaja saponaria Molina, presente na forma de um lipossoma e um lipopolissacárido, em que a referida fracção saponinica e o referido lipopolissacárido estão presentes na referida dose humana a um nível entre 1 pg e 30 pg.
  2. 2. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição adjuvante compreende ainda um esterol, em que a razão saponina:esterol é desde 1:1 a 1:100 p/p.
  3. 3. Composição imunogénica reivindicações 1 a 2, em imunologicamente activa é
  4. 4. Composição imunogénica reivindicações 2 a 3, colesterol. de acordo com qualquer das que a referida fracção saponinica QS21. de acordo com qualquer das em que o referido esterol é
  5. 5. Composição imunogénica de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido lipopolissacárido é um derivado de lípido A.
  6. 6. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 5, em que o referido derivado de lípido A é 3D-MPL. 1
  7. 7. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 6, em que a razão QS21:3D-MPL é 1:1.
  8. 8. Composição imunogénica de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido lipopolissacárido está presente numa quantidade de 25 yg.
  9. 9. Composição imunogénica de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o referido lipopolissacárido está presente numa quantidade de 1 - 15 yg.
  10. 10. Composição imunogénica de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a referida saponina está presente numa quantidade de 1 - 25 yg.
  11. 11. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 10, em que a referida saponina está presente numa quantidade de 25 yg.
  12. 12. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 10, em que a referida saponina está presente numa quantidade de 1 - 10 yg.
  13. 13. Composição imunogénica como reivindicada em qualquer reivindicação anterior, em que o referido volume de dose adequado para utilização humana está entre 0,5 e 1,5 mL.
  14. 14. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 7, em que QS21 e 3D-MPL estão a um nível entre 20 - 30 yg. 2
  15. 15. Composição adjuvante num volume adequado para utilização numa dose humana de uma composição imunogénica compreendendo entre 1 e 30 pg de um lipopolissacárido e entre 1 e 30 pg de uma fracção saponínica imunologicamente activa presente na forma de um lipossoma.
  16. 16. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 15, em que o referido lipopolissacárido é um derivado de lipido A.
  17. 17. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 16, em que o referido derivado de lipido A é 3D-MPL.
  18. 18. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 17, em que a referida fracção saponínica imunologicamente activa é QS21.
  19. 19. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 18, em que o referido volume adequado de dose humana é 250 pL.
  20. 20. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 18, em que o referido volume adequado de dose humana é 360 pL.
  21. 21. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 18, em que o referido lipopolissacárido está presente numa quantidade de 25 pg.
  22. 22. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 18, em que o referido lipopolissacárido está presente numa quantidade de 10 pg. 3
  23. 23. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 18, em que o referido lipopolissacárido está presente numa quantidade de 5 pg.
  24. 24. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 23, em que a referida saponina imunologicamente activa está presente numa quantidade de 25 pg.
  25. 25. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 23, em que a referida saponina imunologicamente activa está presente numa quantidade de 10 pg.
  26. 26. Composição adjuvante de acordo com qualquer das reivindicações 15 - 23, em que a referida saponina imunologicamente activa está presente numa quantidade de 5 pg.
  27. 27. Dose humana de uma composição imunogénica como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 14 para utilização em medicina. Lisboa, 22 de Fevereiro de 2012 4
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