ES2378471T3 - Composición inmunogénica que comprende un adyuvante - Google Patents

Composición inmunogénica que comprende un adyuvante Download PDF

Info

Publication number
ES2378471T3
ES2378471T3 ES06831376T ES06831376T ES2378471T3 ES 2378471 T3 ES2378471 T3 ES 2378471T3 ES 06831376 T ES06831376 T ES 06831376T ES 06831376 T ES06831376 T ES 06831376T ES 2378471 T3 ES2378471 T3 ES 2378471T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
adjuvant
influenza
vaccine
composition according
mpl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES06831376T
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre Vandepapeliere
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=37876836&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2378471(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GBGB0525321.6A external-priority patent/GB0525321D0/en
Priority claimed from GB0609902A external-priority patent/GB0609902D0/en
Priority claimed from GB0620337A external-priority patent/GB0620337D0/en
Priority claimed from GBGB0620336.8A external-priority patent/GB0620336D0/en
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2378471T3 publication Critical patent/ES2378471T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/104—Pseudomonadales, e.g. Pseudomonas
    • A61K39/1045—Moraxella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10111—Atadenovirus, e.g. ovine adenovirus D
    • C12N2710/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16771—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20071—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Una composición inmunogénica en un volumen apropiado para una dosis humana que comprende un antígeno opreparación antigénica, en combinación con un coadyuvante que comprende una fracción de saponinainmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposomay un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en dichadosis humana a un nivel de entre 1 Ig y 30 Ig.

Description

Composición inmunogénica que comprende un adyuvante
Campo técnico
La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para hacerlas, y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas potenciadas con adyuvante en lasque el adyuvante es una formulación liposomal, que comprende una saponina y un lipopolisacárido. La presenteinvención se refiere además a formulaciones de vacuna de la gripe y regímenes de vacunación para inmunizaciónfrente a la enfermedad de la gripe.
Antecedentes técnicos
Se necesitan siempre composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.
Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales y se encuentran exclusivamente en la lámina externa de la membrana exterior de bacterias gram-negativas. Los LPS impiden la destrucción de la bacteria por complementos del suero y células fagocíticas, y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño y consisten en tres regiones unidas de forma covalente:
(i)
una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa
(ii)
una región central de oligosacárido del núcleo
(iii) lípido A - la región más interna que sirve como anclaje hidrófobo, comprende unidades de disacárido deglucosamina que llevan ácidos grasos de cadena larga.
Se ha mostrado que las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y adyuvancia, estánrelacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente depolisacárido O-específico (antígeno O). Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por susefectos adyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones devacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS o lípido Amanteniendo al mismo tiempo su adyuvancia.
El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitz y col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374). En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisiscon un grupo de fagos, y sólo las colonias que presentaron un intervalo de sensibilidad estrecho (susceptibles a uno
o dos fagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.
En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.
(i)
no contienen región O-específica - una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce una pérdida de virulencia
(ii)
la región del núcleo es muy corta - esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos
(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.
El 4’-monofosforil lípido A (MPL), que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativas, mantiene las propiedades adyuvantes de los LPS demostrando unatoxicidad que está reducida en un factor de más de 100 (como se mide por dosis letal en huevos embrionarios depollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516). Los LPS se calientan a relujo típicamente en soluciones de ácido mineral para moderar su fuerza (por ejemplo, HCl 0,1 M) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1, y descarbohidrataciónen la posición 6’, produciendo MPL.
El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), que puede obtenerse por hidrólisis alcalina leve de MPL, tiene una toxicidad reducida adicionalmente manteniendo de nuevo la adyuvancia, véase el documento US 4.912.094(Ribi Immunochemicals). La hidrólisis alcalina se realiza típicamente en disolvente orgánico, tal como una mezcla decloroformo/metanol, por saturación con una solución acuosa de una base débil, tal como carbonato sódico 0,5 M a pH 10,5.
Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL en, por ejemplo, los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation).
Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glicósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria. Se han empleado de forma extensa saponinas brutas como adyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxicapurificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de EstadosUnidos Nº 5.057.540.
A modo de ejemplo, se han desarrollado vacunas contra la gripe y vacunas contra el virus de papiloma humano(VPH) con adyuvantes.
Los virus de la gripe son uno de los virus más ubicuos presentes en el mundo, afectando tanto a seres humanoscomo al ganado. La gripe produce una carga económica, morbilidad e incluso mortalidad, que son significativos.
El virus de la gripe es un virus de ARN con cubierta con un tamaño de partícula de aproximadamente 125 nm de diámetro. Consiste básicamente en una nucleocápside interna o núcleo de ácido ribonucleico (ARN) asociado connucleoproteína, rodeado por una envuelta vírica con una estructura de bicapa lipídica y glicoproteínas externas. Lacapa interna de la envuelta vírica está compuesta predominantemente por proteínas de la matriz y la capa externa en su mayor parte por material lipídico derivado del huésped. El virus de la gripe comprende dos antígenos desuperficie, las glicoproteínas neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA), que aparecen como puntas, de 10 a 12 nmde longitud, en la superficie de las partículas. Son estas proteínas de superficie, particularmente la hemaglutinina, las que determinan la especificidad antigénica de los subtipos de gripe.
Estos antígenos de superficie, de manera progresiva, a veces rápidamente, experimentan algunos cambios que conducen a las variaciones antigénicas de la gripe. Estos cambios antigénicos, llamados “derivas” y “cambios”, son impredecibles y pueden tener un impacto drástico desde un punto de vista inmunológico ya que con el tiempoconducen a la aparición de nuevas cepas de la gripe que permiten al virus escapar del sistema inmune causando las epidemias bien conocidas, casi anuales.
Las cepas del virus de la gripe a incorporar en la vacuna de la gripe cada temporada las determina la OrganizaciónMundial de la Salud en colaboración con las autoridades sanitarias nacionales y los fabricantes de vacunas.
La HA es el antígeno más importante para definir la especificidad serológica de las diferentes cepas de la gripe. Estaproteína de 75-80 kD contiene numerosos determinantes antigénicos, varios de los cuales están en regiones queexperimentan cambios en la secuencia en diferentes cepas (determinantes específicos de la cepa) y otros en regiones que son comunes a muchas moléculas de HA (comunes a determinantes).
Los virus de la gripe causan epidemias casi cada invierno, con tasas de infección para el virus de tipo A o B tan altascomo del 40% durante un periodo de seis semanas. La infección de la gripe produce diversas patologías, desde una infección subclínica por infección leve de las vías respiratorias superiores hasta una neumonía vírica grave. Lasepidemias de gripe típicas causan aumentos en la incidencia de neumonía y enfermedades de las vías respiratoriasinferiores como atestiguan las tasas aumentadas de hospitalización o mortalidad. La gravedad de la enfermedad sedetermina principalmente por la edad del huésped, su estado inmune y el sitio de infección.
Las personas ancianas, de 65 años de edad o por encima, son especialmente vulnerables, representando el 80-90%de todas las muertes relacionadas con la gripe en países desarrollados. Es más probable también que los individuoscon enfermedades crónicas subyacentes experimenten tales complicaciones. Los lactantes jóvenes pueden sufrirtambién enfermedad grave. Por lo tanto se necesita proteger a estos grupos en particular. Además de los grupos “enriesgo”, las autoridades sanitarias recomiendan también vacunar a los adultos sanos que estén en contacto con personas ancianas.
La vacunación desempeña un papel crítico para controlar las epidemias de gripe anuales. Las vacunas de la gripe actualmente disponibles son vacunas contra la gripe inactivadas o vivas atenuadas. Las vacunas contra la gripeinactivadas están compuestas de tres posibles formas de preparación de antígeno: virus completo inactivado, subviriones donde las partículas purificadas del virus se alteran con detergentes u otros reactivos para solubilizar laenvuelta lipídica (la llamada vacuna “dividida”) o HA y NA purificadas (vacuna de subunidades). Estas vacunasinactivadas se dan por vía intramuscular (i.m.) o intranasal (i.n.).
Las vacunas contra la gripe, de todos los tipos, son normalmente vacunas trivalentes. Contienen generalmenteantígenos derivados de dos cepas del virus de la gripe A y una cepa de la gripe B. Una dosis inyectable de 0,5 mlconvencional contiene en la mayoría de los casos 15 !g de componente de antígeno hemaglutinina de cada cepa,como se mide por inmunodifusión radial única (SRD) (J.M. Wood y col.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivatedwhole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood y col., International collaborativestudy of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen ofinfluenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330).
Las vacunas contra la gripe actualmente disponibles se consideran seguras en todos los grupos de edad (De Donatoy col. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Sin embargo, existen pocas pruebas de que las vacunas contra la gripeactuales funcionen en niños pequeños por debajo de dos años de edad. Además, las tasas de eficacia de la vacuna presentadas para la prevención de la enfermedad de la gripe confirmada típica son del 23-72% para los ancianos,que son inferiores de forma significativa que las tasas de eficacia del 60-90% presentadas para adultos más jóvenes(Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc., 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527). La eficacia de una vacuna contra la gripe se ha mostrado que está correlacionada con los títulos de suero de los anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HI) contra la cepa vírica, y varios estudios han descubierto que adultos másancianos muestran títulos de HI inferiores después de la inmunización contra la gripe que los adultos más jóvenes(Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439).
Se necesitan todavía, por lo tanto, nuevas vacunas con una inmunogenicidad mejorada. La formulación del antígenode la vacuna con adyuvantes potentes es un enfoque posible para potenciar las respuestas inmunes contra losantígenos del subvirión.
En el mercado se dispone de una vacuna contra la gripe de sub-unidades potenciada con el adyuvante MF59, enforma de una emulsión de aceite en agua, y ha demostrado su capacidad de inducir un título de anticuerpos más alto que el obtenido con la vacuna de sub-unidades sin adyuvante (De Donato y col. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101). Sin embargo, en una publicación posterior, la misma vacuna no ha demostrado su perfil mejorado comparada con unavacuna dividida sin adyuvante (Puig-Barbera y col., 2004, Vaccine 23, 283-289).
A modo de antecedentes, durante los periodos inter-pandémicos, circulan virus de la gripe que están relacionados con los de la epidemia precedente. Los virus se propagan entre personas con niveles variables de inmunidad frente infecciones anteriores en su vida. Tal circulación, durante un periodo normalmente de 2-3 años, promueve la selección de nuevas cepas que han cambiado lo suficiente para provocar una epidemia otra vez entre la poblacióngeneral; este procedimiento se denomina “deriva antigénica”. Las “variantes de deriva” pueden tener impactos diferentes en comunidades, regiones, países o continentes diferentes en cualquier año, aunque durante varios añossu impacto total es a menudo similar. En otras palabras, una pandemia de gripe ocurre cuando aparece un nuevovirus de la gripe contra el cual la población humana no tiene inmunidad. Las epidemias de la gripe típicas causan aumentos en la incidencia de neumonía y enfermedades respiratorias inferiores como se atestigua por las tasasaumentadas de hospitalización o mortalidad. Los ancianos o los que tengan enfermedades crónicas subyacentes esmás probable que experimenten tales complicaciones, pero los lactantes jóvenes pueden sufrir también enfermedad grave.
A intervalos impredecibles, emergen nuevos virus de la gripe con un antígeno de superficie clave, la hemaglutinina,de un subtipo totalmente diferente de las cepas que circularon la temporada anterior. Aquí, los antígenos resultantespueden variar del 20% al 50% de la proteína correspondiente de las cepas que estaban circulando previamente enseres humanos. Esto puede producir virus que escapan de la “inmunidad de la multitud” y establecen pandemias.Este fenómeno se llama “cambio antigénico”. Se piensa que al menos las pandemias pasadas han ocurrido cuando un virus de la gripe de una especie diferente, tal como un virus de la gripe aviar o porcina, ha cruzado la barrera de la especie. Si tales virus tienen el potencial de propagarse de persona a persona, pueden propagarse por todo elmundo en unos pocos meses a un año, produciendo una pandemia. Por ejemplo, en 1957 (pandemia de la gripeasiática), los virus del subtipo H2N2 reemplazaron a los virus H1N1 que habían estado circulando en la población humana desde al menos 1918, cuando el virus se aisló por primera vez. La HA H2 y la NA N2 experimentaron deriva antigénica entre 1957 y 1968 hasta que la HA se reemplazó en 1968 (pandemia de la gripe de Hong-Kong) por laaparición del subtipo de la gripe H3N2, después del cual la NA H2 continuó derivando junto con la HA H3 (Nakajimay col., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395).
Las características de una cepa del virus de la gripe que le dan el potencial de provocar un brote pandémico son:que contenga una nueva hemaglutinina comparada con la hemaglutinina de las cepas que circulan actualmente, quepueden estar o no acompañadas por un cambio en el subtipo de neuraminidasa; que sea capaz de transmitirsehorizontalmente en la población humana; y que sea patogénica para los humanos. Una hemaglutinina nueva puede ser una que no ha puesto de manifiesto en la población humana durante un periodo de tiempo prolongado,probablemente varias décadas, tal como H2. O puede ser una hemaglutinina que no ha estado circulando en la población humana antes, por ejemplo H5, H9, H7 o H6, que se encuentran en aves. En ambos casos la mayoría, oal menos una gran proporción o incluso la población entera no se ha encontrado previamente con el antígeno y esinmunológicamente virgen a él.
Los papilomavirus son virus tumorales pequeños de ADN, que son altamente específicos de especie. Hasta ahora,se han descrito por encima de 100 genotipos de papilomavirus humanos individuales (VPH). Los VPH son generalmente específicos para la piel (por ejemplo VPH-1 y -2) o superficies de mucosas (por ejemplo VPH-6 y -11)y normalmente provocan tumores benignos (verrugas) que persisten durante varios meses o años. Tales tumoresbenignos pueden ser dolorosos para los individuos afectados pero tienden a no ser amenazadores para la vida, conunas pocas excepciones.
Algunos VPH se asocian también con cánceres. La asociación positiva más fuerte entre un VPH y cáncer humano es la que existe entre VPH-16 y VPH-18 y carcinoma cervical. El cáncer cervical es la malignidad más común en países en desarrollo, con aproximadamente 500.000 nuevos casos produciéndose en el mundo cada año. Ahora estécnicamente posible combatir activamente las infecciones por VPH-16, e incluso cánceres establecidos que contienen VPH-16, usando vacunas. Para una revisión sobre las perspectivas para vacunación profiláctica yterapéutica contre VPH-16 véase Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293-306 y Hagenesee M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556, 559-564.
Aunque se producen pequeñas variaciones, todos los genomas de VPH descritos tienen al menos ocho genestempranos, E1 a E8 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una región reguladora cadena arriba aloja las secuenciasreguladoras que parecen controlar la mayoría de los sucesos reguladores del genoma de VPH.
Las vacunas basadas en VPH L1 se describen en los documentos WO94/00152, WO94/20137, WO93/02184 y WO94/05792. Dicha vacuna puede comprender el antígeno L1 en forma de un monómero, un capsómero o una partícula similar a un virus. En la técnica se conocen bien procedimientos para la preparación de PSV, e incluyenenfoques de desensamblado-reensamblado de para proporcionar homogeneidad potenciada, por ejemplo como sedescribe en los documentos WO9913056 y US6245568. Dichas partículas pueden comprender adicionalmenteproteínas L2. Las vacunas basadas en L2 se describen, por ejemplo, en el documento WO93/00436. Otros enfoquesde vacuna contra VPH se basan en las proteínas tempranas, tales como E7 o proteínas de fusión tales como L2-E7.
El documento WP9633739 divulga una composición de vacuna que comprende una saponina inmunológicamenteactiva y un esterol.
Todavía hay la necesidad de vacunas mejoradas, especialmente en el caso de la gripe y en particular pandemias degripe y para la población anciana, o en el caso de vacunas contra VPH.
Los adyuvantes que contienen lipopolisacáridos y saponinas de Quillaja se han descrito anteriormente, por ejemploen el documento EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando se combinaba un lipopolisacárido(3D-MPL) con una saponina de Quillaja (QS21). Ahora se ha descubierto que pueden conseguirse buenas propiedades adyuvantes con combinaciones de lipopolisacárido y saponina de quillaja como inmunoestimulantes enuna composición adyuvante incluso cuando los inmunoestimulantes están presentes en bajas cantidades en unadosis humana.
Declaración de la invención
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende unvolumen adecuado para una dosis humana que comprende un antígeno o preparación antigénica en combinacióncon un adyuvante en el que el adyuvante comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida dela corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dichafracción de saponina y dicho polisacárido están ambos presentes en dicha dosis humana a un nivel de entre dos y 30 !g.
En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende unvirus de la gripe o preparación antigénica del mismo, en combinación con un adyuvante de saponina presentado enforma de un liposoma. En una realización específica de este aspecto, la composición inmunogénica comprende además un derivado de Lípido A, tal como 3D-MPL.
Adecuadamente, el adyuvante de saponina en forma de un liposoma de acuerdo con la invención comprende una fracción activa de la saponina obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21, y un esterol, talcomo colesterol, en una proporción saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p.
En particular, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula T CD4. Comoalternativa, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula B.
La invención también se refiere al uso de un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo, y un adyuvanteque comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida de la corteza de Quillaja SaponariaMolina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la preparación de una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad por virus de la gripe.
La invención también se refiere al uso de un antígeno o antígenos del virus del papiloma humano o preparaciónantigénica del mismo, y un adyuvante que comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida dela corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la preparaciónde una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad por virus del papiloma humano.
La invención también se refiere al uso de un antígeno o antígenos de citomegalovirus o preparación antigénica delmismo, y un adyuvante que comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida de la corteza deQuillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la preparación de una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad por citomegalovirus.
La invención también se refiere al uso de un antígeno o antígenos de Streptococcus pneumoniae o preparaciónantigénica del mismo, y un adyuvante que comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida dela corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido definido en lapreparación de una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad por Streptococcus pneumoniae.
La invención también se refiere al uso de un antígeno o antígenos Plasmodium falciparum o preparación antigénicadel mismo, y un adyuvante que comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida de la cortezade Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la preparación de una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad de malaria por Plasmodium falciparum.
La invención también se refiere al uso de un antígeno o antígenos del virus de Varicela Zoster o preparaciónantigénica del mismo, y un adyuvante que comprende una fracción saponina inmunológicamente activa obtenida dela corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la preparaciónde una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad por virus Varicela Zoster.
En otro aspecto se proporciona el uso de (a) un antígeno o preparación antigénica del mismo, y (b) un adyuvantecomo se ha definido anteriormente en el presente documento en la preparación de una composición inmunogénicapara inducir, en un ser humano, al menos una, o al menos dos, o todas de las siguientes: (i) una respuestainmunitaria de células T CD4 mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (ii) una respuesta inmunitaria humoral mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (iii) una respuesta decélulas B de memoria mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo.
En particular dicho antígeno es un antígeno del virus de la gripe, VPH, citomegalovirus (CMV), virus de Varicela zoster (VZV), Streptococcus pneumoniae o malaria o preparación antigénica del mismo, y dicho ser humano es un individuo o población inmunocomprometida, tal como un adulto de alto riesgo, un adulto anciano o un niño. En unarealización específica, se proporciona el uso de un antígeno o preparación antigénica del mismo y un adyuvante como se define en el presente documento en la preparación de una composición inmunogénica para la vacunaciónde un ser humano, en particular un ser humano adulto anciano, contra el patógeno del que se obtiene el antígeno enla composición inmunogénica. Específicamente dicho antígeno es un antígeno o antígenos de virus de la gripe, virusdel papiloma humano, citomegalovirus, virus de Varicela Zoster, Streptococcus pneumoniae, Plasmodium parasite, o preparación antigénica de los mismos.
También se proporciona un procedimiento de vacunación que comprende el suministro de un antígeno o composición antigénica, en particular un virus de la gripe o VPH, citomegalovirus, virus de Varicela Zoster,Streptococcus pneumoniae, Plasmodium parasite, o preparación antigénica de los mismos y un adyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento a un individuo o población en necesidad del mismo.
En una realización específica, la composición inmunogénica es capaz de inducir una respuesta inmunitaria mejorada de células T CD4 contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, y en particular es capaz de inducirademás una respuesta inmunitaria humoral o una respuesta de células B de memoria mejorada o las dos,comparada con la obtenida con el antígeno o composición antigénica sin potenciar con adyuvante. Específicamente dicha respuesta inmunitaria de células T CD4 implica la inducción de una respuesta auxiliar T CD4 con reactividad cruzada. Específicamente dicha respuesta inmunitaria humoral implica la inducción de respuesta auxiliar humoralcon reactividad cruzada.
En una realización adicional, se proporciona un procedimiento o uso como se ha definido anteriormente en elpresente documento, para protección contra infección o enfermedad causada por un patógeno que es una variantedel patógeno del que se obtiene el antígeno en la composición inmunogénica. En otra realización, se proporciona unprocedimiento o uso como se ha definido anteriormente en el presente documento para protección contrainfecciones o enfermedades causadas por un patógeno que comprende un antígeno que es una variante delantígeno en la composición inmunogénica. En una realización específica, se proporciona el uso de un antígeno, enparticular un virus de la gripe o VPH, o preparación antigénica del mismo en la preparación de una composición inmunogénica para revacunación de seres humanos vacunados previamente con una composición inmunogénicaque comprende un antígeno, en particular un virus de la gripe o VPH o preparación antigénica del mismo, encombinación con un adyuvante como se describe en el presente documento.
En una realización específica, la composición usada para la revacunación puede contener adicionalmente unadyuvante. En otra realización específica, la composición inmunogénica para revacunación contiene un antígeno que comparte epítopos de células T CD4 comunes con un antígeno o composición antigénica usado para una vacunación previa. Específicamente, la composición inmunogénica para revacunación contiene un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo que comparte epítopos de células T CD4 comunes con el virus de la gripe o preparación antigénica del virus del mismo usada para la primera vacunación.
En un aspecto, la revacunación se hace en sujetos que han sido vacunados la temporada anterior contra la gripe.Típicamente la revacunación se hace al menos 6 meses después de la primera vacunación, preferiblemente 8 a 14meses después, más preferiblemente a aproximadamente 10 a 12 meses después. En otro aspecto la revacunación se hace en sujetos que han sido vacunados con una composición que comprende un virus de la gripe o preparaciónantigénica del mismo en la que al menos una cepa se asocia con un brote pandémico o tiene el potencial paraasociarse con un brote pandémico.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo de una primera cepa de la gripe en la preparación de una composición inmunogénica como sedefine en el presente documento para protección contra infecciones de gripe causadas por una cepa de la gripevariante.
La invención también se refiere a un procedimiento de vacunación que comprende el suministro de un virus de lagripe o preparación antigénica del mismo y un adyuvante como se define en el presente documento.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de vacunación a un individuo o población de seres humanosinmunocomprometidos tales como adultos de alto riesgo o ancianos, que comprende administrar una composición inmunogénica contra la gripe que comprende un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo en combinación con un adyuvante como se define en el presente documento.
En otra realización más, la invención proporciona un procedimiento para revacunar seres humanos vacunados previamente con una composición inmunogénica contra la gripe que comprende un antígeno de la gripe o preparación antigénica del mismo de al menos una cepa del virus de la gripe en combinación con un adyuvantecomo se define en el presente documento, comprendiendo dicho procedimiento administrar a dicho ser humano unacomposición inmunogénica que comprende un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo, o potenciada osin potenciar con un adyuvante.
La invención también se refiere a un procedimiento para la preparación de una composición inmunogénica quecomprende combinar un adyuvante de saponina en forma de un liposoma con un virus de la gripe o preparaciónantigénica del mismo, y opcionalmente con 3D-MPL.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la misma.
Descripción de las figuras
Figura 1 - representación esquemática de preparación de MPL.
Figura 2 - Respuesta humoral contra diversas cepas de gripe después de la inmunización de hurones con formulaciones experimentales: Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación (GMT +/- IC95) antes y después de lasensibilización heteróloga (H1N1 A/Estocolmo/24/90), después de la inmunización (H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99,H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97) y después de estimulación heteróloga (H3N2 A/Wyoming/3/2003).
Figura 3 - Estudio con hurones: titulación viral en lavados nasales después de la estimulación (Día 42).
Figura 4 - Estudio con ratones: Respuesta humoral contra las tres cepas de vacuna de gripe después de lainmunización de ratones con formulaciones experimentales: Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (GMT +/-IC95) 21 días después de la inmunización (H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Wyoming/3/2003 y B/Jiangsu/10/2003).
Figura 5 - Estudio con ratones: Respuesta inmunitaria mediada por células: Respuestas de células T CD4+específicas de gripe el Día 7 Después de la inmunización.
Figura 6 - Estudio con ratones: CMI para CD4 - Cepa combinada (todo doble) - Día 0 y Día 21.
Figura 7 - GMT en los días 0 y 21 para anticuerpos HI.
Figura 8: Frecuencia de síntomas locales y generales en seres humanos (total y relacionada con el grado 3) duranteel periodo de seguimiento de 7 días después de la inmunización con formulaciones de virus de la gripe potenciadascon adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 9: Respuestas humorales a VPH 16 y 18 L1 en ratones después de la inmunización con formulaciones deVPH potenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 10: Respuesta inmunitaria mediada por células en ratones: Tinción de citoquina intracelular - PSV16 y célulast CD4+ 18 después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante, comparandoadyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 11: Producción de células B de memoria específicas después de la inmunización con formulaciones de VPHpotenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura12: Comparación preclínica de vacunas de S. pneumoniae potenciadas con adyuvante en ratones, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 13: Títulos de ELISA Anti-gB en Cobaya después de la inmunización con vacuna Gb potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 14: Títulos neutralizantes Anti CMV en Cobaya después de la inmunización con vacuna Gb potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 15: Títulos de ELISA Anti-gB en Ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada con adyuvante.
Figura 16: Títulos neutralizantes Anti CMV en Ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada con adyuvante.
Figura 17: Estudio con ratones: Inmunidad Mediada por Células - Células CD4+ y CD8+ específicas para CMVdespués de la re-estimulación con una reserva de péptidos gB (7 días después de la segunda inmunización).
Figura 18: Estudio con ratones. Inmunidad Mediada por Células - Células CD4+ específicas para CMV después de lare-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segundainmunización).
Figura 19: Estudio con ratones. Inmunidad Mediada por Células - Células CD8+ específicas para CMV después de lare-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segundainmunización).
Figura 20: Títulos de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra proteína de Circumsporozoito CSP después dela inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones; comparando adyuvantes que tieneninmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 21: Títulos de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra antígeno de superficie de Hepatitis B (HB)después de la inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones; comparando adyuvantes coninmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 22: Expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para CSP después de la inmunización con una composición inmunogénica RTS, S potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes coninmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 23: Expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para HB después de la inmunización con una composición inmunogénica RTS, S potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes coninmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 24: Respuestas humorales en ratones después de la inmunización con vacuna contra la gripe dividida trivalente potenciada con adyuvante (A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 25: Respuesta inmunitaria mediada por células en ratones después de inmunización con vacuna contra la gripe con adyuvante (A/Nueva Caledonia,A/Wyoming, B/Jiangsu), inmunoestimulantes a dos concentracionesdiferentes.
Figura 26: Resultados prclínicios en ratones de comparación del adyuvante para vacunas VZV gE con AS01 B o AS01 E.
Figura 27: t�?tulos virales de lavados nasales tras cebado y exposición a antígenos del virus de la gripe- inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes, en hurones
Figura 28: monitorización de la temperatura corporal en hurones tras cebado y exposición a antígenos de la gripe.Inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 29: Tírulos anti HI para las cepas A en la formulación de vacuna trivalente tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe. Inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante
o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 30: Tírulos anti HI para las cepas B/Jiangsu y drift usadas para la exposición tras inmunización y exposición apreparaciones del antígeno de la gripe. Inmunización con A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante
o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Descripción detallada
Los presentes inventores han descubierto que una composición adyuvante que comprende una saponina presentada en forma de un liposoma, y un lipopolisacárido, donde cada inmunoestimulante está presente a un nivelde entre 1 y 30 !g por dosis humana puede mejorar las respuestas inmunitarias contra una preparación antigénica,teniendo al mismo tiempo una reactogenicidad inferior que algunas de las formulaciones de la técnica anterior dondelos inmunoestimulantes estaban presentes a niveles superiores por dosis humana.
Los presentes inventores han descubierto adicionalmente que una formulación contra la gripe que comprende unvirus de la gripe o preparación antigénica del mismo junto con un adyuvante que comprende una saponinapresentada en forma de un liposoma, y opcionalmente también con un derivado de lípido A tal como 3D-MPL, fue capaz de mejorar la respuesta inmunitaria de células T CD4 contra dicho antígeno o composición antigénica encomparación con la obtenida con el virus o preparación antigénica del mismo sin adyuvante. Las formulaciones potenciadas con el adyuvante saponina presentada en forma de un liposoma se usan de manera ventajosa parainducir respuestas de células T CD4 anti-gripe capaces de detectar epítopos de la gripe presentados por moléculasMHC de clase II. En la presente solicitud se ha descubierto que es eficaz dirigir el sistema inmune mediado por células para aumentar la sensibilidad frente a cepas de la gripe homólogas y de deriva (después de la vacunación einfección).
Una realización específica de la presente invención es que las composiciones para su uso en la presente invenciónpueden ser capaces de proporcionar, en seres humanos, mejor sero-protección contra la gripe después de larevacunación, evaluada por la cantidad de sujetos humanos que cumplen las correlaciones de protección contra lagripe. Además, otra realización específica es que la composición para su uso en la presente invención será capaz deinducir una respuesta de memoria de células B superior después de la primera vacunación de un sujeto humano, yuna respuesta humoral superior después de la revacunación, en comparación con la composición sin adyuvante.
Las composiciones de gripe con adyuvante de acuerdo con la invención tienen varias ventajas:
1) Una inmunogenicidad mejorada: permitirán restaurar una ligera respuesta inmunitaria en la gente anciana (más de 50 años de edad, típicamente más de 65 años de edad) a niveles observados en gente joven (respuestas de anticuerpo y/o células T);
2) Un perfil de protección cruzada mejorada: protección cruzada aumentada frente a cepas de la gripevariantes (de deriva);
3) Permitirán usar una dosificación de antígeno reducida para una respuesta similar, asegurando de este modo una capacidad aumentada en caso de emergencia (pandemia, por ejemplo).
En otro aspecto de la invención, se ha descubierto que la composición adyuvante definida en el presente documentodemuestra resultados de inmunogenicidad para la producción de anticuerpos y la frecuencia de CD4 con especificidad para la gripe después de la vacunación que son equivalentes a, o a veces superiores a, los generadoscon vacuna sin adyuvante. Este efecto es en particular de valor para la población anciana y puede conseguirse conun adyuvante definido en el presente documento que contiene una dosis inferior de inmunoestimulantes. Además, los síntomas de reactogenicidad mostraron una tendencia a ser superiores en el grupo que recibió la vacuna conadyuvante con la concentración más alta de inmunoestimulantes en comparación con el grupo que recibió la vacunacon adyuvante en la que los inmunoestimulantes están a una concentración inferior.
Estos descubrimientos pueden aplicarse a otras formas de los mismos antígenos, y a otros antígenos.
Adyuvante saponina
La composición adyuvante de la invención comprende un adyuvante saponina presentado en forma de un liposoma.Una saponina particularmente adecuada para su uso en la presente invención es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada del árbol de América del Sur Quillaja Saponaria Molina y se describió por primera vez por Dalsgaard y col. en 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44,Springer Verlag, Berlín, páginas 243-254) que tiene actividad adyuvante. Los fragmentos purificados de Quil A sehan aislado por HPLC que mantiene su actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (documento EP 0362 278), por ejemplo, QS7 y QS21 (también conocidos como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina naturalobtenida de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce células T citotóxicas CD8+ (CTL), células Th1 y una respuesta de anticuerpos predominante de IgG2a y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.
En una forma adecuada de la presente invención, el adyuvante saponina en la composición inmunogénica es underivado de saponaria molina quil A, preferiblemente una fracción inmunológicamente activa de Quil A, tal como QS17 o QS-21, adecuadamente QS-21. En una realización las composiciones de la invención contienen la fracción de saponina inmunológicamente activa en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, las composiciones de la invención contienen QS21 en forma sustancialmente pura, es decir, la QS21 es al menos el 90% pura, por ejemplo al menos el 95% pura, o al menos el 98% pura.
En una realización específica, QS21 se proporciona en su composición menos reactogénica donde se inactiva con un esterol exógeno, tal como colesterol por ejemplo. Existen varias formas particulares de composiciones menosreactogénicas donde QS21 se inactiva con un colesterol exógeno. En una realización específica, la saponina/esterolestá en forma de una estructura de liposoma (documento WO 96/33739, Ejemplo 1). En esta realización losliposomas contienen adecuadamente un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, que es adecuadamente no cristalina a temperatura ambiente, por ejemplo fosfatidilcolina de la yema del huevo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) odilauril fosfatidilcolina. Los liposomas también pueden contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de laestructura liposoma-QS21 para liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos la cantidad de lípidocargado es adecuadamente del 1-20% p/p, preferiblemente del 5-10%. La proporción de esterol a fosfolípidos es del1-50% (mol/mol), adecuadamente del 20-25%.
Los esteroles adecuados incluyen 1-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una realización particular, la composición adyuvante comprende colesterol como esterol. Estos esteroles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo se describe el colesterol en el Merck Index, 11a Edn., página 341, como unesterol de origen natural encontrado en la grasa animal.
Las composiciones adyuvantes de la invención que comprenden QS21 y un esterol, colesterol en particular,muestran una reactogenicidad disminuida cuando se comparan con composiciones en las que el esterol estáausente, aunque se mantiene el efecto adyuvante. Los estudios de reactogenicidad pueden evaluarse de acuerdocon los procedimientos descritos en el documento WO 96/33739. El esterol de acuerdo con la invención se escoge para que indique un esterol exógeno, es decir un esterol que no es endógeno para el organismo del que se toma lapreparación antigénica pero se añade a la preparación antigénica o posteriormente en el momento de la formulación. Típicamente, el esterol puede añadirse durante la formulación posterior de la preparación de antígeno con eladyuvante saponina, usando, por ejemplo, la saponina en su forma inactivada con el esterol. Adecuadamente elesterol exógeno se asocia con el adyuvante saponina como se describe en el documento WO 96/33739.
Cuando la fracción de saponina activa es QS21, la proporción de QS21:esterol será típicamente del orden de 1:100a 1:1 (p/p), adecuadamente entre 1:10 y 1:1 (p/p), y preferiblemente 1:5 a 1:1 (p/p). Adecuadamente está presente in exceso de esterol, siendo la proporción de QS21:esterol de al menos 1:2 (p/p). En una realización, la proporción de QS21:esterol es 1:5 (p/p). El esterol es adecuadamente colesterol.
Otras saponinas útiles se obtienen de las plantas Aesculus hippocastanum o Gyophilla struthium. Otras saponinas que se han descrito en la bibliografía incluyen Escina, que se ha descrito en el Merck index (12a ed: entrada 3737)como una mezcla de saponinas que se encuentra en la semilla del castaño de indias, Lat: Aesculus hippocastanum. Su aislamiento se describe por cromatografía y purificación (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), y por resinas de intercambio iónico (Erbring y col., documento US 3.238.190). Las fracciones de escina se han purificado y han demostrado se biológicamente activas (Yoshikawa M, y col. (Chem Pharm Bull (Tokio) 1996 agosto; 44(8):14541464)). La Sapoalbina de Gypsophilla struthium (R. Vochten y col., 1968, J. Pharm.Belg., 42, 213-226) también se ha descrito con relación a la producción de ISCOM, por ejemplo.
Un aspecto clave de la presente invención es el hecho de que la saponina inmunológicamente activa, que espreferiblemente QS21, puede usarse a cantidades inferiores que las que se habían creído previamente útiles,adecuadamente por debajo de 30 μg, por ejemplo entre 1 y 30 μg, por dosis humana de la composición inmunogénica.
Por lo tanto, la invención proporciona una dosis humana de una composición inmunogénica que comprende saponina inmunológicamente activa, preferiblemente QS21, a un nivel de 30 μg o menos, por ejemplo entre 1 y 30μg.
En una realización, una composición inmunogénica en un volumen que es adecuado para una dosis humana, en laque la dosis humana d ela composición inmunogénica comprende QS21 a un nivel de aproximadamente 25 μg, porejemplo entre 20-30 μg, adecuadamente entre 21-29 μg o entre 22 y 28 μg o entre 23 y 27 μg o entre 24 y 26 μg, o25 μg. En otra realización, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende QS21 a un nivel deaproximadamente 10 μg por, por ejemplo, entre 5 y 15 μg, adecuadamente entre 6 y 14 μg, por ejemplo entre 7 y 13μg, o entre 8 y 12 μg, o entre 9 y 11 μg, o 10 μg.
En una realización adicional, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende QS21 que está presentea un nivel de aproximadamente 5 μg, por ejemplo entre 1 y 9 μg, o entre 2 y 8 μg o adecuadamente entre 3 y 7 μg o4 y 6 μg, o 5 μg.
Una cantidad adecuada de QS21 es por ejemplo cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, μg (p/v) por dosis humana de la composición inmunogénica.
Con la expresión “dosis humana” se quiere decir una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano, engeneral, está entre 0,3 y 1,5 ml. En una realización, una dosis humana es 0,5 ml. En una realización adicional, una dosis humana es mayor de 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, una dosishumana es entre 1 ml y 1,5 ml. La invención se caracteriza porque cada dosis humana contiene 30 μg o menos, porejemplo entre 1 y 30 μg, de QS21.
La invención proporciona adicionalmente una composición adyuvante que comprende 1 y 30 μg de QS21. Típicamente, dicha composición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana, en el que el adyuvante está en una forma líquida para combinarse con una formalíquida de una composición antigénica, lacomposición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana que es aproximadamente la mitad delvolumen final pretendido de la dosis humana, por ejemplo un volumen de 360 μl para una dosis humana pretendidade 0,7 ml o un volumen de 250 μl para una dosis humana pretendida de 0,5 ml. La composición adyuvante se diluyecuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis humana final de vacuna. El volumenfinal de dicha dosis por supuesto variará dependiendo del volumen inicial de la composición adyuvante y del volumen de la composición de antígeno añadido a la composición adyuvante,. En una realización alternativa, eladyuvante líquido se usa para reconstituit una composición antigénica liofilizada. En esta realización, el volumenadecuado de la dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosishumana. La composición adyuvante líquida se añade al vial que contiene la composición antigénica liofilizada. Ladosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml. En una realización particular, la dosis humana es 0,5 ml, en esta realización la composición de vacuna de la invención comprenderá un nivel de QS21 entre 1 y 30 μg, por 0,5 ml de dosis humana, además en esta realización una composición adyuvante de la invención comprenderá un nivel deQS21 entre 1 y 30 μg, por 250 μl de composición adyuvante, o por 500 !l de la composición adyuvante dependientede si la composición adyuvante está destinada a combinarse con una composición antigénica líquida o liofilizadarespectivamente.
Específicamente cuando se combina con un antígeno de la gripe, puede usarse una cantidad de QS21, por ejemplo,a una cantidad de 1 a 100 μg (p/v) por dosis de composición, preferiblemente en una cantidad de 10 a 50 μg (p/v)por dosis de composición. Una cantidad adecuada de QS21 es por ejemplo cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 μg (p/v) por dosis de composición. Más preferiblemente, la cantidad de QS21 varía de 25 a 75 μg (p/v) por dosis de composición. Habitualmente una dosis de composición variará deaproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml. Una dosis de vacuna típica es 0,5 ml, 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9ml o 1 ml. En una realización preferida, una concentración final de 50 μg de QS21 está contenida por ml de composición de vacuna, o 25 μg por 0,5 ml de dosis de vacuna. En otras realizaciones preferidas, una concentraciónfinal de 35,7 μg o 71,4 μg de QS21 está contenida por ml de composición de vacuna. Específicamente, un volumen de dosis de vacuna de 0,5 ml contiene 25 μg o 50 μg de QS21 por dosis.
La dosis de QS21 es adecuadamente capaz de potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno en un serhumano. En particular una cantidad adecuada de QS21 es la que mejora el potencial inmunológico de la composición en comparación con la composición sin adyuvante, o en comparación con la composición potenciada con otra cantidad de QS21, siendo aceptable de un perfil de reactogenicidad.
Adyuvante 3D-MPL
La composición comprende adicionalmente un adyuvante adicional que es un lipopolisacárido, adecuadamente underivado no tóxico de lípido A, particularmente monofosforil lípido A o más particularmente monofosforil lípido A 3desacilado (3D-MPL).
3D-MPL se vende con el nombre MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. y se menciona en todo el documento como MPL o 3D-MPL. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y
4.912.094. 3D-MPL promueve principalmente las respuestas de células T CD4+ con un fenotipo IFN-g (Th1). 3D-MPL puede producirse de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento GB 2 220 211 A. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Preferiblemente en las composiciones de la presente invención se usa 3D-MPL de partícula pequeña. 3D-MPL de partícula pequeña tiene un tamaño de partícula tal que puede filtrarse a esterilidad a través de un filtro de 0,22 !m. Dichas preparaciones se describen en el documento WO 94/21292.
Un aspecto clave de la presente invención es el hecho de que el lipopolisacárido, que es preferiblemente 3D-MPL,puede usarse a cantidades inferiores que las que se habían creído anteriormente útiles, adecuadamente a un nivelde 30 μg o menos, por ejemplo entre 1 y 30 μg, por dosis humana de la composición inmunogénica.
Por lo tanto la invención proporciona una dosis humana de una composición inmunogénica que comprende lipopolisacárido, preferiblemente 3D-MPL, a un nivel de 30 μg o menos, por ejemplo entre 1 y 30 μg.
En una realización, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 25 μg, por ejemplo entre 20 - 30 μg, adecuadamente entre 21 - 29 μg o entre 22 y 28 μg o entre23 y 27 μg o entre 24 y 26 μg, o 25 μg.
En otra realización, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 10 μg, por ejemplo entre 5 y 15 μg, adecuadamente entre 6 y 14 μg, por ejemplo entre 7 y 13 μg oentre 8 y12 μg o entre 9 y 11 μg, o 10μg.
En una realización adicional, la dosis humana de la composición inmunogénica comprende 3D-MPL a un nivel deaproximadamente 5 μg, por ejemplo entre 1 y 9 μg, o entre 2 y 8 μg o adecuadamente entre 3 y 7 μg o 4 y 6 μg, o 5μg. Una cantidad adecuada de 3D-MPL es por ejemplo cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, μg (p/v) por dosis humana de la composición inmunogénica.
En una realización, la dosis humana es 0,5 ml. En una realización adicional, la dosis humana es mayor de 0,5 ml,por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, la dosis humana es entre 1 ml y 1,5 ml. Lainvención se caracteriza porque cada dosis humana contiene 30 μg o menos, por ejemplo entre 1 y 30 μg de 3D-MPL.
La invención proporciona adicionalmente una composición adyuvante que comprende entre 1 y 30 μg de 3D-MPL. Típicamente, dicha composición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana adecuada. Cuando eladyuvante está en forma líquida para combinarse con una forma líquida de una composición antigénica, lacomposición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana que es aproximadamente la mitad delvolumen final pretendido de la dosis humana, por ejemplo un volumen de 360 μl para una dosis humana pretendidade 0,7 ml o un volumen de 250 μl para una dosis humana pretendida de 0,5 ml. La composición adyuvante se diluyecuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis human final de la composicióninmunogénica. El volumen final de dicha dosis por supuesto variará dependiendo del volumen inicial de la composición adyuvante y del volumen de la composición de antígeno añadido a la composición adyuvante. En unarealización alternativa, la composición adyuvante líquida se usa para reconstituir una composición antigénica liofilizada. En esta realización, el volumen adecuado de dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se añade al vial quecontiene la composición antigénica liofilizada. La dosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml. En unarealización particular la dosis humana es 0,5 ml, en esta realización la composición de vacuna de la invencióncomprenderá un nivel de 3D-MPL entre 1 y 30 μg por 0,5 ml de dosis humana, además en esta realización unacomposición adyuvante de la invención comprenderá un nivel de 3D-MPL entre 1 y 30 μg por 250 μl de composiciónadyuvante o por 500 μl de composición adyuvante dependiente de si la composición adyuvante está destinada acombinarse con una composición antigénica líquida o liofilizada, respectivamente.
Cuando la composición inmunógena contiene un virus de la gripe o preparación antígena del mismo, la composiciónadyuvante que comprende una saponina en la forma de un liposoma opcionalmente y adicionalmente contiene underivado del lípido A, particularmente monofosforilo lípido A o más particularmente 3D - MPL. En esta realización, 3D
-
MPL se puede usar, por ejemplo, en una cantidad de 1 a 100 μg (p/v) por dosis de composición, preferiblemente enuna cantidad de 10 a 50 μg (p/v) por dosis de composición. Una cantidad adecuada de 3D - MPL es, por ejemplo,cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 μg (p/v) por dosis de composición. Máspreferiblemente, la cantidad de 3D - MPL varía entre 25 y 75 μg (p/v) por dosis de composición. Usualmente una dosis de composición variará entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 1 ml. Una dosis típica de vacuna es0,5 ml, 0.6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml o 1 ml. En una realización, está contenida por ml de composición de vacuna una concentración final de 50 μg de 3D - MPL, o 25 μg por 0,5 ml. En otra realización, está contenida por ml decomposición de vacuna una concentración final de 35,7 μg o 71,4 μg de 3D - MPL. Específicamente, un volumen de0,5 ml de dosis de vacuna contiene 25 μg o 50 μg de 3D - MPL por dosis.
La dosis de 3D-MPL es adecuada para permitir que se potencie una respuesta immune a un antígeno en un serhumano. En particular una cantidad adecuada de 3D -MPL es la que mejora el potencial inmunológico de lacomposición comparado con la composición no adyuvantaza, o comparada con la composición adyuvantaza conotra cantidad de MPL, mientras que es aceptable a partir de un perfil de reactogenicidad.
Las composiciones adecuadas de la invención son aquellas en las que los liposomas se preparan inicialmente sinMLP (como se describe en el documento .WO 96/33739), y después se añade MPL, de manera adecuada comopartículas por debajo de partículas de 100 nm o partículas que son susceptibles de filtración estéril a través de membrana de 0,22 Im. Por lo tanto, MPL no está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL fuera). Las composiciones en las que MLP no está contenido dentro de la membrana de vesícula (conocidocomo MPL dentro) también forma un aspecto de la invención. El antígeno puede estar contenido dentro de lamembrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula. Los antígenos solubles adecuados estánfuera y los antígenos hidrófobos o lipídicos están o bien contenidos dentro o fuera de la membrana.
En una realización la composición adyuvante de la invención comprende tanto lipopolisacárido como saponinainmunológicamente activa. En una realización específica de la invención, el lipopolisacárido es 3D-MPL y lasaponina inmunológicamente activa es QS21. En una realización adicional de la invención, la composiciónadyuvante consta esencialmente de un lipopolisacárido y saponina inmunológicamente activa en una formulación deliposomas. De manera adecuada en una forma de esta realización, la composición adyuvante consta esencialmentede 3D - MPL y QS21, con opcionalmente esterol que es preferiblemente colesterol.
En una realización adicional de la invención, la composición adyuvante comprende una formulación liposomal delipopolisacárido y saponina inmunológicamente activa en combinación con uno o más inmunoestimulantes oadyuvantes adicionales. De manera adecuada en una forma de esta realización el lipopolisacárido es 3D - MPL y lasaponina inmunológicamente activa es QS21.
En una realización específica, QS21 y 3D - MPL están presentes en la misma concentración final por dosis humanade la composición inmunogénica. En un aspecto de esta realización, una dosis humana de composición inmunógena comprende un nivel final de 25 μg de 3D - MPL y 25 μg de QS21. En una realización final, una dosis humana de composición inmunógena comprende un nivel final de 25 μg de 3D - MPL y 25 μg de QS21, o 10 μg de cada uno de MPL y QS21.
Los antígenos de la presente invención que se pueden usar con las composiciones de adyuvantes de la presenteinvención incluyen antígenos víricos, de parásitos, bacterianos o asociados con tumores, por ejemplo:
Un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo para uso de acuerdo con la presente invención, que puedeser un virus de la gripe dividido o preparación antigénica de virus dividido del mismo. En una realización alternativaza preparación de influenza puede contener otro tipo de antígeno de influenza inactivado, tal como virus completo inactivado o HA y NA purificados (vacuna de subunidad), o virosoma de influenza. Todavía en otrarealización, el virus de la gripe puede ser una preparación de influenza atenuado vivo.
Un virus de la gripe dividido o preparación antigénica de virus dividido del mismo para uso de acuerdo con lapresente invención es de manera adecuada una preparación de virus adecuada donde las partículas de de virus se rompen con detergentes u otros reactivos para solubilizar la envuelta lipídica. Los virus divididos o preparacionesantigénicas del virus dividido del mismo se preparan de manera adecuada mediante fragmentación del virus de lagripe completo, o bien infeccioso o inactivado, con concentraciones solubilizantes de disolventes o detergentesorgánicos de detergentes y retirada posterior de la mayoría del agente solubilizante y algo o la mayoría del materiallipídico viral. Por preparación antigénica del virus del mismo significa que una preparación del virus dividido quepuede estar sometido en algún grado de purificación comparado con el virus dividido mientras se mantiene la mayoría de las propiedades antigénicas de los componentes del virus dividido. Por ejemplo, cuando se produce enhuevos, el virus dividido se puede agotar a partir de las proteínas que contaminan el huevo, o cuando se produce encultivos de células, el virus dividido se puede agotar a partir de los contaminantes de las células hospedadoras. Unapreparación de antigénica de virus dividido puede comprender componentes antigénicos de más de una cepa viral. Las vacunas que contienen virus fraccionado (llamados “”vacuna fraccionada de influenza”) o preparacionesantigénicas de virus fraccionado generalmente contienen proteína de matriz residual y nucleoproteína y algunasveces lípido, así como las proteínas de envuelta de membrana. Tales vacunas de virus fraccionado usualmente contienen la mayoría de todas las proteínas de virus estructurales aunque no necesariamente en las mismas proporciones que se producen en el virus completo.
Como alternativa, el virus de la gripe puede estar en al forma de una vacuna de virus entero. Esto puede ser unaventaja sobre una vacuna de virus de dividido para una situación pandémica ya que se evita la incertidumbre si sepuede producir exitosamente una vacuna de virus dividido para una nueva cepa de virus de la gripe. Para algunascepas los detergentes convencionales usados para la producción del virus dividido puede dañar el virus y hacer que sea inservible. Aunque siempre existe la posibilidad de usar detergentes diferentes y/o desarrollar un procedimiento diferente para producir una vacuna dividida, esto llevaría tiempo, lo que puede no ser utilizable en una situación pandémica. Además del mayor grado de certidumbre con una solución de virus entero, existe una capacidad deproducción de vacunas mayor que para el virus dividido ya que se pierden cantidades considerables de antígenodurante las etapas adicionales de purificación necesarias para preparar una vacuna fraccionada adecuada.
En otra realización, la preparación de virus de la gripe está en la forma de una vacuna de la subunidad de influenza purificada. Las vacunas de las subunidades de influenza generalmente contienen las dos proteínas principales deenvuelta, HA y NA, y pueden tener una ventaja adicional sobre otras vacuans de viriones adicionales sobre lasvacunas de viriones completas ya que en general son menos reactogénicas, particularmente en vacunas para losjóvenes. Las vacunas en subunidades se pueden producir o bien de manera recombinante o purificadas a parir departículas virales rotas.
En otra realización, la preparación del virus de la gripe está en la forma de virosoma. Los virosomas son vesículasesféricas, unilamelares que mantienen las glicoproteínas de la envuelta viral funcional HA y NA en la conformaciónauténtica., intercalada en la membrana de dos capas de fosfolípidos de los virosomas.
Dicho virus de la gripe o preparación antigénica del mismo puede estar derivado de huevos o derivado de cultivo decélulas.
Por ejemplo, el antígeno del virus de la gripe o preparaciones antigénicas del mismo de acuerdo con la invención sepueden derivar del procedimiento del huevo embrionario convencional, mediante crecimiento del virus de la gripe enhuevos y purificando el fluido alantoides recogido. Los huevos se pueden acumular en grandes cantidades como seade interés. Como alternativa, se pueden derivar a partir de cualquiera de los nuevos procedimientos de generaciónque usan célula o cultivos de células para hacer crecer los virus o expresar los antígenos de superficie de virus de lagripe recombinante. Los sustratos de células adecuados para hacer crecer el virus incluyen, por ejemplo, células de riñón de perro tales como MDCK o células de un clon de MDCK, células de tipo MDCK, células de riñón de mono que incluyen células Vero, líneas celulares de cerdo adecuadas, o cualquier otro tipo de célula de mamífero adecuada para la producción de virus de la gripe para propósitos de vacuna. Los sustratos de células adecuadostambién incluyen células humanas por ejemplo células MRC-5. Los sustratos de células adecuados no se limitan a líneas celulares, por ejemplo, también están incluidas células primarias tales como fibroblastos de embriones de pollo y líneas de células aviares.
El antígeno del virus de la gripe o preparación antigénica del mismo se puede producir mediante cualesquiera de unnúmero de procedimientos comercialmente aplicables, por ejemplo, el procedimiento de flu fraccionado descrito enlas patentes Nº DD 300 833 y DD 211 444, incorporadas en esta memoria descriptiva por referencia., Tradicionalmente flu fraccionado se produjo usando un tratamiento disolvente/detergente, tal como tri-n-butil fosfato,
o dietiléter en combinación con TweenTM (conocido como fraccionamiento de “Tween - éter”) y este procedimiento se usa todavía e algunas instalaciones de producción. Otros agentes de fraccionamiento empleados ahora incluyendetergentes o enzimas proteolíticas o sales biliares, por ejemplo, desoxicolato de sodio según se describe en lapatente Nº DD 155 875, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia. Los detergentes que se pueden usar como agentes de fraccionamiento incluyen detergentes catiónicos por ejemplo, bromuro de cetil trimetil amonio (CTA.), otros detergentes iónicos, por ejemplo, laurilsulfato, taurodeoxicolato, o detergentes no iónicos tales como los descritos anteriormente que incluyen Triton X-100 (por ejemplo en un procedimiento descrito en Lina y col, 2000,Biologicals 28, 95 - 103) y Triton N-101, o las combinaciones de cualesquiera de dos o más detergentes.
El procedimiento de preparación para una vacuna fraccionada puede incluir un número diferente de etapas defiltración y/o separación tales como etapas de ultracentrifugación, ultrafiltración, centrifugación zonal y cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico) en una diversidad de combinaciones, y opcionalmente una etapa de inactivaciónpor ejemplo, con calor, formaldehído o 1-propiolactona o U.V. que se puede llevar a cabo antes o después delfraccionamiento. El procedimiento de fraccionamiento se puede llevar a cabo como un proceso por lotes, continuo o semi continuo. Un proceso de fraccionamiento y purificación preferido para una composición inmunogénica defraccionamiento se describe en el documento WO 02/097072.
Las preparaciones de antígenos de vacunas contra la gripe fraccionadas de acuerdo con la invención comprenden una cantidad residual de Tween 80 y/o Triton X- 100 que queda del proceso de de producción, aunque éstas se pueden añadir o sus concentraciones ajustar después de la preparación del antígeno fraccionado. Preferiblemente tanto Tween 80 como Triton X-100 están presentes. Los intervalos preferidos para las concentraciones finales deestos tensioactivos no iónicos en la dosis de vacuna son:
Tween 80: 0,01 a 1%, más preferiblemente 0,1% (v/v)
*Triton X-100: 0,001 a 0,1 (% p/v), más preferiblemente 0,005 a 0,02% (p/v).
En una realización específica, la concentración final para Tween 80 varía entre 0,025% - 0,09% p/v. En otrarealización específica, el antígeno se proporciona en forma de una mezcla concentrada dos veces, que tiene unaconcentración de Tween 80 que varía entre 0,025% - 0.2% (p/v) y que tiene que diluirse dos veces tras la formulación final con el coadyuvante (o el tampón en la formulación control).
En otra realización específica, la concentración final para el Triton X-100 varía entre 0,004% - 0,017% p/v. En otra realización específica, se proporciona el antígeno como una mezcal concentrada dos veces, que tiene una concentración de Triton X-100 que varía entre 0,005% - 0,034% (p/v) y tiene que diluirse dos veces hasta laformulación final con el adyuvante (o el tampón en la formulación de control).
Preferiblemente la preparación de gripe se prepara en presencia de un bajo nivel de tiomersal, o preferiblemente enla ausencia de tiomersal. Preferiblemente la preparación de influenza resultante es estable en la ausencia de conservantes organomercuriales, en particular la preparación no contiene tiomersal residual. En particular la preparación del virus de la gripe comprende un antígeno de hemaglutinina estabilizado en la ausencia de tiomersal,
o a bajos niveles de tiomersal (generalmente 5 !g/ml o menos). Específicamente la estabilización de la cepa Binfluenza se realiza mediante un derivado de alfa tocoferol, tal como succinato de tocoferol (también conocido como succinato de la vitamina E, es decir VES). Tales procedimientos y preparaciones para prepararlos se describen en eldocumento WO 02/097072.
Una composición preferida contiene tres antígenos de viriones fraccionados inactivados preparados a partir de lascepas recomendadas por la Organización Mundial de la Salud de la estación de gripe apropiada.
Preferiblemente el virus de la gripe o preparación del mismo y el adyuvante de acuerdo con la invención estáncontenidos en el mismo recipiente. Se denomina como “una solución de víal”. Preferiblemente el vial es una jeringallena previamente. En una realización alternativa, el virus de la gripe o preparación antigénica del mismo y adyuvante de acuerdo con la invención están contenidos en recipientes o viales separados y se mezclan brevemente antes o tras la administración al sujeto. Se denomina “solución de dos viales”. A modo de ejemplo,cuando la vacuna es una vacuna de dos componentes para un volumen total de 0,7 ml, los antígenos concentrados (por ejemplo, los antígenos de viriones fraccionados inactivados trivalentes concentrados) están presentes en un vial(335 μl) (recipiente de antígeno) y una jeringa rellena previamente contiene el adyuvante (360 μl) (recipiente deadyuvante). En el momento de la inyección, el contenido del vial que contiene los antígenos de viriones fraccionadosinactivados trivalentes se retira del vial usando la jeringa que contiene el adyuvante seguido de mezcla suave de lajeringa. Antes de la inyección, la aguja usada se reemplaza por una aguja intramuscular y el volumen se corrigehasta 530 !l. En este ejemplo, una dosis del candidato de vacuna de influenza con coadyuvante reconstituido corresponde a 530 !l.
En un aspecto de la invención, cuando existe una composición multivalente, entonces al menos una cepa deinfluenza en dicha composición inmunogénica multivalente como se define en esta memoria descriptiva se asocia ala erupción pandémica o tiene el potencial de asociarse a una erupción pandémica. Tal cepa también se puede denominar como “cepas pandémicas” en el texto que sigue. En particular, cuando la vacuna es una vacuna multivalente tal como una vacuna bivalente, trivalente o cuadrivalente, al menos una cepa está asociada a unaerupción pandémica o tiene el potencial a asociarse con una erupción pandémica. Las cepas adecuadas son, perono se limitan a: H5N1, H9N2, H7N7, y H2N2.
Dicho virus de la gripe o preparación antigénica del mismo es adecuadamente multivalente tal como bivalente otrivalente o cuadrivalente. Preferiblemente el virus de la gripe o preparación antigénica del mismo es trivalente ocuadrivalente, teniendo un antígeno de las tres cepas de influenza diferentes, estando al menos una cepa asociadaa la erupción pandémica o teniendo el potencial de estar asociada a un brote pandémico.
Las características de una cepa del virus de la gripe que le proporcionan el potencial para provocar una erupciónpandémica son: contiene una nueva hemaglutinina comparado con la hemaglutinina en las cepas que circulan actualmente; es capaz de transmitirse de manera horizontal en la población humana; y es patógena para los sereshumanos. Una nueva hemaglutinina puede ser una que no es evidente en la población humana durante un período amplio de tiempo, por ejemplo, probablemente un número de décadas, tal como H2. O puede ser una hemaglutininaque no esté circulando en la población humana antes, por ejemplo: H5, H9, H7 o H6 que se encuentran en pájaros.En cualquier caso la mayoría, o al menos una gran proporción, o incluso la población entera no se ha encontradopreviamente con el antígeno y nunca ha tenido una exposición inmunológica a ella.
Generalmente, determinados grupos presentan un mayor riesgo de llegar a infectarse con la gripe en una situaciónpandémica. Los enfermos crónicos en la senectud, y niños pequeños son particularmente susceptibles pero muchosjóvenes y personas aparentemente sanos también están en riesgo. Para la influenza H2, la parte de la poblaciónnacida después de 1968 está en un riesgo creciente. Es importante para estos grupos protegerse de manera eficaz tan pronto como sea posible y de una manera sencilla.
Otro grupo de personas que tienen un riesgo elevado son los viajeros. Las personas viajan cada día más que antes y en las regiones donde más virus emergen. China y Sudeste de Asia, han llegado a ser destinos de viaje más populares en los años recientes. Este cambio en los patrones de viaje permite que nuevos virus alcancen el globo en cuestión de semanas en lugar de meses o años.
De esta manera para estos grupos de personas existe una necesidad particular de vacunación para proteger contrainfluenza en una situación pandémica o situación pandémica potencial. Las cepas adecuadas son ,pero no se limitan
a: H5N1, H9N2, H7N7, y H2N2.
Opcionalmente la composición puede contener más de tres valencias, por ejemplo tres cepas no pandémicasademás de una cepa pandémica. Como alternativa la composición puede contener tres cepas pandémicas.Preferiblemente la composición contiene tres cepas pandémicas.
También ejemplos de antígenos para la composición inmunogénica de la invención son antígenos de estreptococos tales como estreptococos del grupo A, o estreptococos del grupo B, pero, más preferiblemente, de Streptococcuspneumoniae. Al menos una proteína y/o al menos un antígeno sacárido se usa más preferiblemente. El (los) almenos un (os) antígeno (s) de la proteína de Streptococcus pneumoniae se selecciona más preferiblemente entre elgrupo constituido por: pneumolisina, PspA o las variantes de supresión de transmembrana de los mismos, PspC o las variantes de supresión de transmembrana de los mismos, PsaA o las variantes de supresión de transmembranade los mismos, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, CbpA o las variantes de supresión de transmembrana delos mismos, PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128, Sp130 y Sp133, o el equivalente inmunológicamente funcional de los mismos (por ejemplo fusiones o dominios de las proteínas anteriores, por ejemplo las proteínas de fusión PhtDE descritas en los documentos WO01/98334 y WO 03/54007).
Algunas composiciones se describen en los documentos WO 00/56359 y WO 02/22167 y WO 02/22168.
El antígeno puede comprender antígenos de sacáridos capsulares (preferiblemente conjugados a una proteína vehículo), en la que los sacáridos (más preferiblemente polisacáridos) se derivan de al menos cuatro serotipos de neumococos. En una realización los cuatros serotipos incluyen 6B, 14, 19F y 23F. En una realización adicional, al menos 7 serotipos están incluidos en la composición, por ejemplo los derivados de los serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C,19F, y 23F. En una realización adicional, al menos 10 serotipos están incluidos en la composición, por ejemplo, lacomposición en una realización incluye sacáridos capsulares derivados de los serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F (preferiblemente conjugados a una proteína vehículo). En otra realización, la composición inmunogénicacomprende sacáridos capsulares derivados de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F. En unarealización preferida de la invención al menos 13 antígenos sacáridos (preferiblemente conjugados a una proteínavehículo) están incluidos, aunque antígenos sacáridos adicionales, por ejemplo de valencia 23 (tales como losserotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F), también están contemplados en la invención.
Aunque los sacáridos anteriores están de manera ventajosa en su longitude completa, la forma de polisacárido ingenua, se debe entender que los polisacáridos de tamaño reducido también se pueden usar y sn todavíainmunógenos (véase por ejemplo los documentos EP 497524 y 497525) si es necesario cuando se acopla a unvehículo proteico.
Para la prevención/mejora de la neumonía en la población de ancianos (+ 55 años) y de la otitis media en lactantes(hasta 18 meses de edad) y niños pequeños (típicamente de 18 meses hasta 5 años), se prefiere una realización dela invención para combinar un sacárido de Streptococcus pneumonia multivalentecomo se describe en esta memoria descriptiva con una proteína de Streptococcus pneumoniae preferiblemente seleccionada entre el grupo de proteínas enumeradas anteriormente. También se pueed usar de manera ventajosa una combinación de proteínasde neumococos como se describe más adelante.
Proteínas de neumococos
Lo antígenos de Streptococcus pneumoniae se seleccionan preferiblemente entre el grupo constituido por: una proteína de la familia de triadas de polihistidina (Pht), a una proteína de la familia Lyt, una proteína de unión decolina, proteínas que tienen un motivo LPXTG (donde X es un aminoácido), proteínas que tienen un motivo de secuencia señal de Tipo II de LXXC (donde X es un aminoácido), y las proteínas que tienen un motivo de secuencia señal de Tipo I. Los ejemplos preferidos dentro de estas categorías (o motivos) son las siguientes proteínas (otruncado o equivalente inmunológicamente funcional del mismo):
La familia Pht (Triada poli Histidina) comprende las proteínas PhtA, PhtB, PhtD, y PhtE. La familia se caracteriza porpor una secuencia de lapidación, dos dominios separados por una región rica en prolina y varias triadas de histidina,posiblemente implicadas en la unión a metal o a nucleósidos o actividad enzimática, regiones enrolladas en espiral (3 - 5), un extremo N conservado y un extremo C heterogéneo. Está presente en todas las cepas de neumococosensayados. Las proteínas homólogas también se han encontrado en otros Estreptococos y Neisseria. Los miembros preferidos de la familia comprenden PhtA o PhtD. Sin embargo, se entiende que los términos, Pht A, B, D, y E serefieren a las proteínas que tienen secuencias descritas en las citas más adelante así como las variantes de origen natural (y hechas por el hombre) de las mismas que tienen una homología de secuencias que es al menos 90%idéntica a las proteínas mencionadas. Preferiblemente es al menos 95% idéntica y más preferiblemente es 97%idéntica.
Con referencia a las proteínas Pht, PhtA se describe en el documento WO 98/18930, y también se denomina Sp36.Como se ha indicado anteriormente, es una proteína de la familia de triada de polihistidina y tiene el motivo de señal de tipo II de LXXC.
PhtD se describe en el documento WO 00/37105, y también se denomina Sp036D. Como se ha indicado anteriormente, también es una proteína de la familia de triada de polihistidina y tiene el motivo de señal de tipo II LXXC. PhtB se describe en el documento WO 00/37105, y también se denomina Sp036B. Otro miembro de la familiaPhtB es el polipéptido que degrada C3, como se describe en el documento WO 00/17370. Esta proteína es de lafamilia de la triada de polihistidina y tiene el motivo de señal de tipo II LXXC. Un equivalente inmunológicamentefuncional preferido es la proteína Sp42 descrita en el documento WO 98/18930. Un truncamiento PhtB (aproximadamente 79 kD) se describe en el documento WO99/15675 que también se considera como un miembrode la familia PhtX.
PhtE se describe en el documento WO00/30299 y se denomina BVH-3.
SpsA es una proteína de unión de Colina (Cbp) descrita en el documento WO 98/39450.
La familia Lyt es proteínas asociadas a membrana con lisis celular. El dominio N terminal comprende dominio (s) de unión de colina, sin embargo la familia Lyt no tiene todas las características encontradas en al familia de proteína deunión de colina (Cbp) indiada más adelante y de esta manera para la presente invención, la familia Lyt se considera distinta de la familia Cbp. En contraste a la familia Cbp, el dominios C terminal contiene el dominio catalítico de lafamilia de proteína Lyt. La familia comprende LytA, B y C. Con relación a la familia Lyt, LytA se describe en Ronda y col., Eur J Biochem, 164: 621 - 624 (1987). LytB se describe en el documento WO 98/18930, y también se denomina Sp46. LytC también se describe en el documento WO 98/18930, y también se denomina Sp91. Un miembro preferido de la familia es LytC.
Otra realización preferida son los truncamientos de la familia Lyt (particularmente LytA) en los que “Lyt” se definecomo antes y “truncamientos” se refiere a proteínas que carecen del 50% o más de la región de unión de colina.Preferiblementetales proteínas carecen de la región de unión de colina entera.
Sp125 es un ejemplo de de una proteína de superficie de neumococos con el motivo anclado de la pared celular deLPXTG (donde X es un aminoácido). Cualquier proteína dentro de esta clase de proteína de superficie deneumococos con este motivo se ha encontrado que es útil dentro del contexto de la presente invención, y por lotanto se considera una proteína adicional de la invención. La propia Sp125 se describe en el documento WO98/18930, y también se denomina ZmpB - una metaloproteinasa de cinc.
Sp101 se describe en el documento WO 98/06734 (donde tiene la referencia Nº y85993. Se caracteriza por una secuencia señal de Tipo I.
Sp133 se describe en el documento WO 98/06734 (w donde tiene la referencia Nº y85992. También se caracterizapor una secuencia señal de Tipo I.
Sp128 y Sp130 se describen en el documento WO 00/76540.
Las proteínas usadas en al presente invención se seleccionan preferiblemente entre el grupo constituido por PhtD, PhtA y PhtE, o una combinación de 2 o las 3 de estas proteínas (es decir. PhtA+D, A+E, D+E o A+D+E).
Los antígenos de proteínas de neumococos que se pueden incluir son uno o más del grupo constituido por:neumolisina (también denominada como Ply; preferiblemente desoxificado por el tratamiento químico o mutación[documentos WO 96/05859, WO 90/06951, WO 99/03884], PsaA y las variantes de supresión de transmembrana dela misma (Berry & Paton, Infect Immun diciembre de 1996; 64(12): 5255 - 62), PspA y las variantes de supresión detransmembrana de la misma (documentos US 5804193, WO 92/14488, WO 99/53940), PspC y las variantes desupresión de transmembrana de la misma (documentos WO 97/09994, WO 99/53940), un miembro de la familia deproteína de unión de colina (Cbp) [por ejemplo, CbpA y las variantes de supresión de transmembrana de la misma(documentos WO 97/41151; WO 99/51266)], gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, CbpA (Infect. Immun. 1996
64: 3544), HSP70 (WO 96/40928), PcpA (Sánchez-Beato y col. FEMS Microbiol Lett 1998, 164: 207 - 14), proteínade tipo M (solicitud de patente SB Nº EP 0837130), y adhesina 18627 (solicitud de patente SB Nº EP 0834568). Lapresente invención también abarca equivalentes inmunológicamente funcionales o truncamientos de tales proteínas(como se ha definido anteriormente).
Con relación a la familia de proteína de unión de colina, se identificaron miembros de esa familia como proteínas deneumococos que se podrían purificar mediante cromatografía de afinidad de colina. Todas las proteínas de unión decolina están unidos de manera no covalente a restos de fosfatidilcolina del ácido teitoico de la pared celular y ácidolipoteitoico asociado a membranas. De manera estructural, tienen varias regiones en común sobre la familia completa, aunque puede variar la naturaleza exacta de las proteínas (secuencia de aminoácidos, longitud, etc.). En general, las proteínas de unión de colina comprenden una región N terminal (N), regiones repetidas conservadas(R1 y/o R2), una región rica en prolina (P) y una región de unión de colina conservada (C), hecha de múltiplesrepeticiones, que comprende aproximadamente la mitad de la proteína. Como se usa en esta solicitud, el término“familia de proteína de unión de Colina” (Cbp)” se selecciona entre el grupo constituido por proteínas de unión de colina como se identifica en el documento WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD, y CbpG. CbpA se describe en el documento WO 97/41151. CbpD y CbpG se describen en el documento WO 00/29434. PspC se describe en el documento WO 97/09994. PbcA se describe en el documento WO 98/21337. Preferiblemente las proteínas de unión de colina se seleccionan entre el grupo constituido por CbpA, PbcA, SpsA y PspC.
Si una Cbp es la proteína adicional utilizada puede ser un truncamiento de Cbp en el que “Cbp” se define comoantes y “truncamiento” se refiere a una carencia de proteínas del 50% o más de la región de unión de colina (C).Preferiblemente tales proteínas carecen de la región de unión de colina completa. Más preferiblemente, lostruncamientos de tales proteínas carecen de (i) la región de unión de colina y (ii) una parte de la mitad N - terminalde la proteína también, todavía retiene al menos una región de repetición (R1 o R2). Más preferiblemente todavía, eltruncamiento tiene 2 regiones de repetición (R1 y R2). Los ejemplos de tales realizaciones son NR1xR2, R1xR2,NR1xR2P y R1xR2P como se ilustra en los documentos WO99/51266 o WO99/51188, sin embargo, otras proteínasde unión de colina que carecen de una región de unión de colina similar también se contemplan dentro del ámbito de la presente invención.
Las proteínas quiméricas truncamiento Cbp - truncamiento Lyt (o fusiones) también se pueden usaren lacomposición de la invención. Preferiblemente esto comprende NR1xR2 (o R1xR2 o NR1xR2P o R1xR2P) de Cbp y la parte C - terminal (Cterm, es decir., que carece de los dominios de unión de colina) de Lyt (por ejemplo.,
LytCCterm o Sp91Cterm). Más preferiblemente todavía, es CbpA. Preferiblemente, Lyt es LytC (también denominada Sp91).
También se puede usar un truncamiento PspA o PsaA que carece del dominio de unión de colina (C) y se expresacomo una proteína de fusión con Lyt. Preferiblemente, Lyt es LytC.
En una composición neumocócica es posible combinar diferentes proteínas neumocócicas de la invención. Preferiblemente, la combinación de proteínas de la invención se selecciona de 2 o más (3 ó 4) categorías diferentestales como proteínas que tienen un motivo de secuencia señal LXXC (en el que X es cualquier aminoácido, porejemplo, la familia de la tríada de polihistidina (Pht)), proteínas de unión a colina (Cbp), proteínas que tienen unmotivo de secuencia señal de tipo I (por ejemplo, Sp101), proteínas que tienen un motivo LPXTG (en el que X es cualquier aminoácido, por ejemplo, Sp128, Sp130), toxinas (por ejemplo, Ply), etc. Los ejemplos preferidos dentro de estas categorías (o motivos) son las proteínas citadas anteriormente, o equivalentes inmunológicamente funcionalesde las mismas. Toxina + Pht, toxina + Cbp, Pht + Cbp, y toxina + Pht + Cbp son combinaciones de categoríaspreferidas. Las combinaciones beneficiosas preferidas incluyen, sin limitaciones, PhtD + NR1xR2, PhtD + proteínasquiméricas o de fusión NR1xR2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Sp128, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA +NR1xR2, PhtA + proteínas quiméricas o de fusión NR1xR2-Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Sp128, PhtA + PsaA,PhtA + PspA, NR1xR2 + LytC, NR1xR2 + PspA, NR1xR2 + PsaA, NR1xR2 + Sp128, R1xR2 + LytC, R1xR2 + PspA,R1xR2 + PsaA, R1xR2 + Sp128, R1xR2 + PhtD, R1xR2 + PhtA. Preferiblemente, NR1xR2 (o R1xR2) es de CbpA o PspC. Más preferiblemente, es de CbpA.
Una combinación particularmente preferida de proteínas neumocócicas comprende Ply (o un equivalenteinmunológicamente funcional de la misma) + PhtD (o un equivalente truncado o inmunológicamente funcional de lamisma), opcionalmente con NR1xR2 (o R1xR2 o NR1xR2P o R1xR2P). Preferiblemente, NR1xR2 (o R1xR2 oNR1xR2P o R1xR2P) es de CbpA o PspC. Más preferiblemente, es de CbpA.
El antígeno puede ser un conjugado de sacárido de neumococo que comprende antígenos de polisacárido derivadosde al menos cuatro serotipos, preferiblemente, al menos siete serotipos, más preferiblemente al menos diezserotipos, y al menos una, pero preferiblemente 2, 3 ó 4, proteínas de Streptococcus pneumoniae seleccionadas preferiblemente del grupo de proteínas descrito anteriormente. Preferiblemente, una de las proteínas es PhtD (o un equivalente inmunológicamente funcional de la misma) y/o Ply (o un equivalente inmunológicamente funcional de lamisma).
Un problema asociado al enfoque de polisacárido de la vacunación es el hecho de que los polisacáridos per se son malos inmunógenos. Para superar esto, los sacáridos pueden conjugarse con vehículos proteicos, que proporcionan una ayuda de células T acompañante. Por lo tanto, se prefiere que los sacáridos utilizados en la invención estén unidos a dicho vehículo proteico. Los ejemplos de dichos vehículos que se utilizan comúnmente para la producciónde inmunógenos de sacárido incluyen los toxoides de difteria y tétanos (DT, DT CRM197 y TT, respectivamente), hemocianina de lapa bocallave (KLH), OMPC de N. meningitidis, y el derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD).
Es un vehículo preferido para composiciones inmunogénicas (o vacunas) basadas en sacárido neumocócico laproteína D de Haemophilus influenzae (documento EP 594610-B), o fragmentos de la misma. Los fragmentosadecuados para uso incluyen fragmentos que abarcan epítopos auxiliares de T. En particular, un fragmento deproteína D contendrá particularmente el tercio N-terminal de la proteína. Un vehículo proteína D es útil comovehículo en composiciones en las que se conjugan múltiples sacáridos neumocócicos. Pueden conjugarse ventajosamente sobre la proteína D uno o más sacáridos neumocócicos en una combinación.
Un vehículo preferido adicional para el sacárido neumocócico es la proteína neumocócica misma (como se defineanteriormente en la sección “Proteínas neumocócicas de la invención”).
El sacárido puede ligarse a la proteína vehículo mediante cualquier procedimiento conocido (por ejemplo, por Likhite,patente de EE.UU. 4.372.945 y por Armor y col., patente de EE.UU. 4.474.757). Preferiblemente, se lleva a cabo la conjugación CDAP (documento WO 95/08348).
Preferiblemente, la relación proteína:sacárido (peso:peso) de los conjugados es 0,3:1 a 1:1, más preferiblemente 0,6:1 a 0,8:1, y lo más preferiblemente aproximadamente 0,7:1.
Las composiciones particularmente preferidas de la invención comprenden uno o más sacáridos neumocócicosconjugados, y una o más proteínas neumocócicas de la invención. Además, los sacáridos y proteínas neumocócicospueden almacenarse establemente en forma de componentes en bruto adsorbidos sobre fosfato de aluminio en una forma líquida.
En otro aspecto de la invención, la composición de vacuna puede comprender un antígeno de citomegalovirus humano (HCMV). El HCMV es un virus de ADN humano que pertenece a la familia de los herpesvirus, es una causaimportante de defectos congénitos en recién nacidos y causa también afecciones médicas graves en pacientesinmunocomprometidos. La enfermedad clínica causa una variedad de síntomas, incluyendo fiebre, hepatitis, neumonitis y mononucleosis infecciosa.
En una realización, el antígeno de HCMV es una proteína de fusión quimérica o un derivado inmunogénico de lamisma que comprende una porción de una glicoproteína de HCMV fusionada con una porción de una glicoproteínade HSV. La glicoproteína de HCMV es típicamente gB, y la glicoproteína de HSV es típicamente gD, en particulargD de HSV de tipo 2 (gD2). La fusión es típicamente entre un aminoácido en la parte N-terminal de una porción de laproteína gB de HCMV y un aminoácido en la terminación C de una porción de la proteína gD de HSV. Amboscomponentes de proteína gB de HCMV y de proteína gD de HSV de la proteína de fusión pueden carecer de undominio de anclaje a la membrana.
La porción de la proteína gB de HCMV puede comprender una forma no escindible de gB de HCMV. Adecuadamente, esto se consigue cambiando uno o más aminoácidos en un sitio de escisión de la proteína, porejemplo, intercambiando Arg458 y Arg459 por Glu y Thr, respectivamente. La porción de la proteína de HSV puede comprender la secuencia señal de gD2 (aminoácidos 1 a 25) y, opcionalmente, los aminoácidos 26 a 52 de gD2 y/ola secuencia de gD2 que es PEDSALLEDPED o equivalentes funcionales de la misma, que pueden ser más cortos omás largos. Pueden añadirse secuencias adicionales de gD de HSV a la proteína de fusión, por ejemplo, en laterminación C de la proteína gB de HCMV.
En una realización, la proteína de fusión comprende los aminoácidos 1 a 52 de la proteína gD2 de HSV fusionadoscon los residuos 28 a 685 de la proteína gB de HCMV. Dicha proteína de fusión se designa gB685* de HCMV. Enuna realización adicional, la secuencia de aminoácidos PEDSALLEDPED, que deriva de una secuencia interna degD2, puede incluirse en el extremo C-terminal de la proteína gB685* de HCMV, produciendo la proteína designada como gB685** de HCMV. Estas proteínas de fusión específicas se describen con más detalle en el documento WO95/31555.
Otro inmunógeno adecuado para uso como vacuna de HCMV es pp65, una proteína de matriz de HCMV como sedescribe en el documento WO 94/00150 (City of Hope).
En una realización adicional de la presente invención, las composiciones inmunogénicas contienen un antígeno opreparación antigénica derivado del papilomavirus humano (VPH) considerado responsable de las verrugas genitales (VPH 6 o VPH 11 y otros), y/o de los virus VPH responsables de cáncer cervical (VPH16, VPH18 y otros).
En una realización, las formas de composiciones profilácticas o terapéuticas de verruga genital comprenden partículas L1 o capsómeros, y proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos seleccionados de lasproteínas E1, E2, E5 E6, E7, L1, y L2 de VPH.
En una realización, las formas de proteína de fusión son: L2E7 como se da a conocer en el documento WO 96/26277, y proteína D(1/3)-E7 dada a conocer en el documento GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).
Una composición profiláctica o terapéutica preferida para infección cervical o cáncer por VPH puede comprenderantígenos de VPH 16 ó 18. Por ejemplo, los monómeros antigénicos L1 o L2, o lo antígenos L1 o L2 presentadosconjuntamente en forma de partícula similar a virus (VLP) o la proteína L1 sola presentada en una estructura de VLP
o capsómero. Dichos antígenos, partículas similares a virus y capsómeros son conocidos per se. Véanse, por ejemplo, los documentos WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792, y WO93/02184.
Pueden incluirse proteínas tempranas adicionales solas o en forma de proteínas de fusión tales como E7, E2 o, preferiblemente, E5, por ejemplo; las realizaciones particularmente preferidas de esto incluyen una VLP quecomprende proteínas de fusión L1E7 (documento WO 96/11272).
En una realización, los antígenos de VPH 16 comprenden las proteínas tempranas E6 o E7 fusionadas con unvehículo proteína D formando fusiones de proteína D - E6 o E7 de VPH 16, o combinaciones de las mismas; o combinaciones de E6 o E7 con L2 (documentos 96/26277).
Como alternativa, las proteínas tempranas E6 y E7 de VPH 16 o 18 pueden presentarse en forma de una moléculaúnica, preferiblemente una fusión proteína D- E6/E7. Dicha composición puede contener opcionalmente cualquiera o ambas de las proteínas E6 y E7 de VPH 18, preferiblemente en forma de una proteína de fusión proteína D - E6 oproteína de fusión proteína D - E7 o proteína de fusión proteína D E6/E7.
La composición de la presente invención puede comprender adicionalmente antígenos de otros tipos de VPH,preferiblemente de VPH 31 o 33.
Los tipos de VPH oncogénicos incluyen VPH 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68. Por tanto, la composición de la presente invención puede comprender antígenos de uno o más de estos tipos de VPH, además de VPH 16 y/oVPH 18.
Las VLP o capsómeros de L1 de VPH útiles en la invención pueden comprender o consistir en L1 completa o unfragmento inmunogénico de L1. Cuando la VLP o capsómero comprende o consiste en un fragmento inmunogénicode L1, entonces los fragmentos inmunogénicos adecuados de L1 de VPH incluyen mutantes de truncamiento,deleción, sustitución o inserción de L1. Dichos fragmentos inmunogénicos son adecuadamente capaces de crearuna respuesta inmunitaria, siendo dicha respuesta inmunitaria capaz de reconocer una proteína L1, tal como una partícula similar a virus, del tipo de VPH del que derivaba la proteína L1.
Los fragmentos de L1 inmunogénicos adecuados incluyen proteínas L1 truncadas. En un aspecto, el truncamientoretira una señal de localización nuclear. En otro aspecto, el truncamiento es un truncamiento C-terminal. En un aspecto adicional, el truncamiento C-terminal retira menos de 50 aminoácidos, tal como menos de 40 aminoácidos.Cuando la L1 es de VPH 16, entonces en otro aspecto el truncamiento C-terminal retira 34 aminoácidos de L1 deVPH 16. Cuando la L1 es de VPH 18, entonces en un aspecto adicional el truncamiento C-terminal retira 35 aminoácidos de L1 de VPH 18.
Se dan secuencias de L1 de VPH 16 y 18 truncadas adecuadas en el documento WO 06/114312.
La secuencia de VPH 16 puede ser también la dada a conocer en los documentos WO9405792 o US6649167, porejemplo, adecuadamente truncada. Los truncamientos adecuados se truncan en una posición equivalente a ladiscutida anteriormente, como se evalúa mediante comparación de secuencia.
Se da a conocer una secuencia alternativa de VPH 18 en el documento WO9629413 que puede estar adecuadamente truncada. Los truncamientos adecuados se truncan en una posición equivalente a la descrita anteriormente, como se evalúa mediante comparación de secuencia.
Otras secuencias de VPH 16 y VPH 18 son bien conocidas en la técnica y pueden ser adecuadas para uso en lapresente invención. Cuando hay una proteína L1 de otro tipo de VPH, entonces pueden utilizarse truncamientos Cterminales correspondientes a los hechos para VPH 16 y VPH 18, basándose en alineamientos de secuencia deADN o proteína. Se dan truncamientos adecuados de proteínas L1 de VPH 31 y 45 L1 en el documento WO 06/114312.
Pueden hacerse también truncamientos adecuados, por ejemplo, de VPH 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68, retirando en un aspecto porciones C-terminales de la proteína L1 equivalentes a los descritos anteriormente, como se evalúa mediante alineamiento de secuencia.
La proteína L1 o fragmento inmunogénico de la invención puede estar opcionalmente en forma de una proteína defusión tal como la fusión de la proteína L1 con L2 o una proteína temprana.
La proteína L1 de VPH está adecuadamente en forma de un capsómero o partícula similar a virus (VLP). En unaspecto, pueden utilizarse VLP de VPH en la presente invención. Las VLP de VPH y procedimientos para la producción de VLP son bien conocidos en la técnica. Las VLP se construyen típicamente a partir de las proteínasestructurales L1 y, opcionalmente, L2 del virus, véanse, por ejemplo, los documentos WO9420137, US5985610, W09611272, US6599508B1, US6361778B1, EP 595935. Puede utilizarse cualquier VLP de VPH en la presenteinvención que proporcione protección cruzada tal como una VLP de L1 o L1 + L2.
Adecuadamente, la VLP es una VLP de sólo L1.
La composición de la invención puede contener una combinación de VLP de L1 de VPH 16 y VLP de L1 de VPH 18,
o una combinación de VLP de L1 de VPH 16, 18, 31 y 45, o combinaciones mayores, e incluye VLP de L1 de VPH 16 y 18 o VPH 16, 18, 31 y 45, o combinaciones mayores en las que la L1 está opcionalmente truncada como sedescribe en la presente memoria.
En una realización particular de la invención, se utilizan uno o más antígenos adicionales de tipos de VPH causantesde cáncer con antígenos de VPH 16 y/o 18, seleccionándose los antígenos de los siguientes tipos de VPH: VPH 31, 45, 33, 58 y 52. Como se describe en la presente memoria, el antígeno puede ser en cualquier caso L1, porejemplo, en forma de VLP o capsómeros de VLP. Por tanto, los antígenos de VPH para uso en las composiciones, procedimientos y usos descritos en la presente memoria pueden comprender o consistir en VLP o capsómeros de L1de VPH 16, 18, 31, 45, 33, 58 y 52. Las VLP de L1 pueden ser VLP de sólo L1 o en combinación con otro antígeno tal como L2 en VLP de L1 + L2. La proteína L1 puede truncarse adecuadamente como se describe en la presentememoria.
La formación de VLP puede evaluarse mediante técnicas estándar, por ejemplo, microscopía electrónica y dispersión de luz láser dinámica.
Las VLP pueden comprender la proteína L1 entera. En un aspecto, la proteína L1 utilizada para formar la VLP esuna proteína L1 truncada, como se describe anteriormente.
Las VLP pueden prepararse en cualquier sustrato celular adecuado tal como células de levadura o células deinsecto, por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus, y las técnicas para la preparación de VLP son bienconocidas en la técnica tales como los documentos WO9913056, US 6416945B1, US 6261765B1 y US6245568, y referencias en los mismos, cuyos contenidos completos se incorporan a la presente como referencia.
Las VLP Pueden prepararse mediante técnicas de desensamblaje y reensamblaje, que pueden proporcionar VLP depapilomavirus más estables y/u homogéneos. Por ejemplo, McCarthy y col., 1998 "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Virus like Particles in Vitro" J. Virology 72(1):33-41, describe eldesensamblaje y reensamblaje de VLP de L1 de VPH 11 recombinante purificadas de células de insecto para obtener una preparación homogénea de VLP. Los documentos WO9913056 y US6245568 describen tambiénprocesos de desensamblaje/reensamblaje para preparar VLP de VPH.
En un aspecto, las VLP de VPH se preparan como se describe en los documentos WO9913056 o US6245568
Las composiciones de la presente invención pueden comprender antígenos o preparaciones antigénicas derivadosde parásitos que causan la malaria tales como Plasmodium falciparum o Plasmodium vivax. Por ejemplo, los posibles antígenos de Plasmodia falciparum incluyen proteína de circumsporozoíto (proteína CS), RTS,S MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la porción Cterminal de la proteína de circumsporozoíto (CS) de P. falciparum ligada mediante cuatro aminoácidos de la porción presS2 del antígeno de superficie de la hepatitis B al antígeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Se da aconocer su estructura completa en la solicitud de patente internacional nº PCT/EP92/02591, publicada con el númeroWO 93/10152, que reivindica prioridad de la solicitud de patente del R.U. nº 9124390.7. Cuando se expresa enlevadura, RTS se produce en forma de una partícula de lipoproteína, y cuando se coexpresa con el antígeno S deHBV, produce una partícula mixta conocida como RTS,S. Se describen los antígenos TRAP en la solicitud depatente internacional nº PCT/GB89/00895, publicada como WO 90/01496. Es una realización preferida de la presente invención una vacuna de malaria en la que la preparación antigénica comprenda una combinación de losantígenos RTS,S y TRAP. Otros agentes de Plasmodia que son probablemente candidatos para ser componentesde una vacuna de malaria multietapa son MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1,Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. faciparum ysus análogos en Plasmodium spp. Es una realización de la presente invención una composición que comprendeproteína RTS,S o CS o un fragmento de la misma tal como la porción CS de RTS,S en combinación con uno o másantígenos maláricos adicionales, que pueden seleccionarse del grupo constituido por MSP1, MSP3, AMA1, LSA1 o LSA3. Los antígenos posibles de P vivax incluyen proteína de circumsporozoíto (proteína CS) y proteína de unión al antígeno Duffy y fragmentos de la misma tales como PvRII (véase, por ejemplo, el documento WO02/12292).
Otros posibles antígenos que pueden utilizarse en las composiciones inmunogénicas de la presente invención incluyen:
antígenos estreptocócicos tales como de estreptococos del grupo A o estreptococos del grupo B, los antígenosderivan adecuadamente de HIV-1, (tales como gag o fragmentos de la misma tales como p24, tat, nef, gp120 ogp160 o fragmentos de cualquiera de éstas), de herpesvirus humanos tales como gD o derivados de la misma oproteína temprana inmediata tal como ICP27 de HSV1 o HSV2, de citomegalovirus ((esp Human)(tal como gB oderivados de la misma), de rotavirus (incluyendo virus vivos atenuados), de virus de Epstein Barr (tales como gp350
o derivados de la misma), de virus de la varicela zoster (tales como gpI, II y IE63), o de un virus de hepatitis tal comovirus de hepatitis B (por ejemplo, antígeno de superficie de hepatitis B o un derivado del mismo), virus de hepatitis A,virus de hepatitis C y virus de hepatitis E, o de otros patógenos virales tales como paramixovirus: virus respiratoriosincitial (tales como proteínas F, N y G o derivados de las mismas), virus de la parainfluenza, virus del sarampión,virus de las paperas, de papilomavirus humanos (por ejemplo, VPH6, 11, 16, 18), de flavivirus (por ejemplo, virus dela fiebre amarilla, virus del dengue, virus de encefalitis transmitida por garrapatas, virus de encefalitis japonesa) o devirus de la gripe (virus vivo entero o inactivado, virus de la gripe escindido, crecido en huevos o células MDCK, o virosomas de la gripe completos (como se describen en R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínaspurificadas o recombinantes de los mismos tales como proteínas HA, NP, NA, o M, o combinaciones de las mismas),
o derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, incluyendo N. gonorrhea y N. meningitidis (porejemplo, sacáridos capsulares y conjugados de los mismos, proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión alactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo, proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo, adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp, incluyendo B. pertussis (por ejemplo, pertactina, toxina pertussis o derivados de las mismas, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, antígeno 85A, -B o –C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica (porejemplo, factores de colonización, toxina termolábil o derivados de la misma, toxina termoestable o derivados de lamisma), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatogénica (por ejemplo, toxina similar a shiga o derivados de la misma); Vibrio spp, incluyendo V. cholera (por ejemplo, toxina del cólera o derivados de la misma); Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo, una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni (por ejemplo, toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp, incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejemplo, ureasa, catalasa, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani (porejemplo, toxina del tétanos y derivado de la misma), C. botulinum (por ejemplo, toxina botulínica y derivado de la misma), C. difficile (por ejemplo, toxinas clostridium A o B y derivados de las mismas); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo, toxina botulínica y derivados de la misma); Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo, toxina diftérica y derivados de la misma); Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la ehrlichiosis granulocítica humana; Rickettsia spp, incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo, MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum(por ejemplo las proteínas de membrana externa raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivados de parásitostales como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; Leshmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, o derivados de levadura tales como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans.
Son otros antígenos preferidos para M. tuberculosis, por ejemplo, Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV,MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (documento WO 99/51748). Las proteínas de M. tuberculosis incluyen también proteínas de fusión y variantes de las mismas en las que al menos dos, preferiblemente tres, polipéptidos de M. tuberculosis se fusionan en una proteína mayor. Las fusiones preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento WO 99/51748). Se define una secuencia Ra12-Tbh9-Ra35 particular que puede citarse por la SEC Nº ID 6 del documento WO2006/117240, junto con variantes en las que la Ser 704 de esa secuencia se muta a distinta deserina, por ejemplo, a Ala, y derivados de la misma que incorporan un marcaje de His N-terminal de una longitudapropiada (por ejemplo, SEC Nº ID 2 ó 4 del documento WO2006/117240)”.
Los antígenos ejemplares de Chlamydia sp, por ejemplo, C trachomatis se seleccionan de CT858, CT 089, CT875, MOMP, CT622, PmpD, PmpG y fragmentos de los mismos, SWIB y fragmentos inmunogénicos de cualquiera de losmismos (tales como PmpDpd y PmpGpd) y combinaciones de los mismos. Las combinaciones preferidas de antígenos incluyen CT858, CT089 y CT875. Se describen en el documento WO2006/104890 secuencias y combinaciones específicas que pueden emplearse. Las composiciones bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de Haemophilus spp., incluyendo H. influenzae de tipo B (por ejemplo, PRP y conjugados de la misma), H. influenzae no tipificable, por ejemplo, OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fimbrina (documento US 5.843.464) o variantes de múltiplescopias o proteínas de fusión de las mismas. Los derivados de antígeno de superficie de hepatitis B son bienconocidos en la técnica e incluyen, entre otros, aquellos antígenos PreS1, PreS2 S expuestos y descritos en lassolicitudes de patente europea EP-A-414 374; EP-A-0304 578, y EP 198-474. En un aspecto preferido, laformulación de vacuna de la invención comprende el antígeno de HIV-1 gp120, especialmente cuando se expresa en células CHO. En una realización adicional, la composición de la invención comprende gD2t como se define anteriormente en la presente memoria.
Las composiciones pueden contener también un antígeno antitumoral y ser útiles para el tratamiento inmunoterapéutico de cánceres. Por ejemplo, el antígeno puede ser un antígeno de rechazo de tumor tal como aquellos para cánceres de próstata, mama, colorrectal, pulmón, pancreático, renal o melanoma. Los antígenosejemplares incluyen MAGE 1, 3 y MAGE 4 u otros antígenos MAGE tales como los dados a conocer en el documento WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (también conocido como NY Eos 1) SAGE y HAGE (documento WO 99/53061) o GAGE (Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pág. 628-636; Van den Eynde y col., International Journal of Clinical & Laboratory Research (presentado en 1997); Correale y col. (1997),Journal of the National Cancer Institute 89, pág. 293. Es más, estos antígenos están expresados en un ampliointervalo de tipos de tumor tales como melanoma, carcinoma pulmonar, sarcoma y carcinoma de vejiga.
Los antígenos MAGE para usar en la presente invención se pueden expresar en forma de una proteína de fusióncon un potenciador de la expresión o una pareja de fusión inmunológica. En particular, la proteína Mage puede fusionarse con la proteína D de Heamophilus infuenzae B o de un derivado lipídico de la misma. En particular, lapareja de fusión puede comprender el primer 1/3 de la proteína D. Tales constructos se describen en el documentoWo99/40188.
Otros antígenos específicos de tumores incluyen, entre otros, gangliósidos KSA (GA733) específicos de tumores yGM· o conjugados del mismo con proteínas vehículos; o dicho antígeno puede ser una hormona peptídica propia talcomo la hormona liberadora de hormona gonadotropa de longitud completa (GnRH, documento WO 95/20600), unpéptido corto de 10 aminoácidos, útil en el tratamiento de muchos cánceres o en la inmunocastración.
En una forma de realización preferida, se usan antígenos prostáticos, tales como el antígeno específico (PSA), PAP,PSCA (PNAS 95(4) 1735-1740 1998), PSMA o antígeno conocido como Prostasa.
La prostasa es una serín proteasa específica de la próstata (similar a la tripsina), de una longitud de 254aminoácidos, con una tríada catalítica de serín proteasa conservada H-D-S y una secuencia pre-propeptídica en elextremo amino, lo que indica una potencial función secretora ((P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas,
L. Hood & K. Wand, “Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease withprostate restricted expression, En Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119). Se ha descrito un sitio deglucosilación putativo. La estructura predica es muy similar a otras serín proteasas conocidas, lo que muestra que elpolipéptido maduro se pliega e un único dominio. La proteína madura tiene una longitud de 224 aminoácidos, donde un epítopo A2 se procesa de forma natural.
La secuencia nucleotídica y la secuencia polipeptídica deducida de la prostasa y homólogos se describen el Ferguson y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) y en las solicitudes de patente internacional nº WO98/12302 (y también la correspondiente patente concedida US 5,955,306), WO 98/20117 (y también las correspondientes patentes concedidas US 5,840,871 y US 5,786,148) (calicreína específica de próstata) y el documento WO 00/04149 (P703P). La presente invención proporciona composiciones que comprenden fusiones dela proteína prostasa sobre la base de la proteína prostasa y fragmentos y homólogos de la misma (“derivados”).Tales derivados son adecuados para usar en formulaciones vacunales terapéuticas que son adecuadas para eltratamiento de tumores de la próstata. Típicamente, el fragmento contendrá al menos, 20, preferentemente 50, más preferentemente 100 aminoácidos contiguos, como se describe en la patente y las solicitudes de patente citadasanteriormente.
Otro antígeno prostático preferido se conoce como P501S, ID de secuencia nº 113 del documento Wo98/37814. Fragmentos inmunogénicos y porciones de los mismos que comprenden al menos, 20, preferentemente 50, más preferentemente 100 aminoácidos contiguos se describen en la patente y la solicitud de patente citada anteriormente. Véase, por ejemplo, PS108 (documento WO 98/50567).
Otros antígenos específicos de la próstata se conocen en los documentos Wo98/37418, y WO/004149. Otro esSTEAP PNAS 96 14523 14528 7 –12 1999.
Otros antígenos asociados a tumores útiles en el contexto de la presente invención incluyen. Plu –1 J Biol. Chem274 (22) 15633 –15645, 1999, HASH –1, HasH-2, Cripto (Salomon y col. Bioessays 199, 21 61 –70, patente deEE.UU. 5654140) Criptina patente de EE.UU. 5 981 215, . Además, los antígenos particularmente relevantes para eltratamiento del cáncer también comprenden tirosinasa y survivina.
Péptidos derivados de mucina, tales como Muc1, véase, por ejemplo, los documentos US 5744,144 US 5827, 666WO 8805054, US 4,963,484. Específicamente se contemplan los péptidos derivados de Muc 1 que comprenden almenos una unidad de repetición del péptido Muc 1, preferentemente al menos dos de tales repeticiones, y que es reconocido por el anticuerpo SM3 (documento US 6 054 438). Otros péptidos derivados de mucina incluyen el péptido de Muc 5.
El antígeno de la invención puede ser un antígeno de cáncer de mama, tal como her 2/ Neu, mammaglobina (patente de EE.UU. 5668267) o los descritos en los documentos WO/00 52165, WO99/33869, WO99/19479, WO 98/45328. Los antígenos Her 2 neu se describen, entre otros, en la patente de EE.UU. 5,801,005. Preferentemente el Her 2 neu comprende todo el dominio extracelular (que comprende aproximadamente los aminoácidos 1-645) o fragmentos del mismo y al menos una porción inmunogénico o todo el dominio intracelular aproximadamente los 580aminoácidos del extreme C. En particular, la porción intracelular debería comprender el dominio de fosforilación o fragmentos del mismo. Tales constructor se describen en el documento WO00/44899. Un constructo particularmente preferido se conoce como ECD PD, un segundo se conoce como ECD PD. Véase el documentoWo/00/44899. El her 2 neu, como se usa en la presente memoria descriptiva, puede derivar de rata, ratón o serhumano.
Las composiciones pueden contener antígenos asociados con mecanismos de soporte del tumor (p. ej., angiogénesis, invasión tumoral), por ejemplo tie 2, VEGF.
Se prevé que las composiciones de la presente invención puedan usar antígenos derivados de Borrelia sp. Por ejemplo, los antígenos pueden incluir ácido nucleico, antígeno derivado de patógeno o preparaciones antigénicas,péptidos o proteínas producidas de forma recombinante y proteínas de fusión quiméricas. En particular, el antígenoes OspA. El OspA puede ser una proteína madura completa en forma lipídica en virtud de la célula huésped (e. coli)denominada (Lipo-OspA) o un derivado no lipídico. Tales derivados no lipídicos incluyen la proteína de fusión nolipídica NS1-OspA que posee los primeros 81 aminoácidos del extreme N de la proteína no estructural (NS1) delvirus de la gripe, y la proteína OspA completa, y otra, la MDP-OspA, es una forma no lipídica de OspA que porta 3 aminoácidos adicionales en el extremo N.
Las composiciones de la presente invención pueden usarse para la profilaxis o el tratamiento de la alergia. Tales vacunas comprenderían antígenos específicos del alergeno (por ejemplo Der p1) y no específicos del alergeno (porejemplo péptidos derivados de la IgE humana, incluidos, entre otros, el decapéptido stanworth (documento EP 0 477231 B1)).
Las composiciones de la presente invención también se pueden usar para la profilaxis o el tratamiento de trastornoscrónicos distintos a la alergia, el cáncer o las enfermedades infecciosas. Tales trastornos crónicos sonenfermedades como aterosclerosis y Alzheimer.
Las composiciones de la presente invención son particularmente adecuadas para el tratamiento inmunoterapéuticode enfermedades, tales como afecciones crónicas y cánceres, pero también para el tratamiento de infeccionespersistentes. En consecuencia, las composiciones de la presente invención son particularmente adecuadas para elinmunotratamiento de enfermedades infecciosas, tales como las infecciones víricas tuberculosis (TB), SIDA y hepatitis B (HepB).
Asimismo, en el contexto del SIDA, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo susceptible u que sufre SIDA. El procedimiento comprende la administración al individuo de una vacuna de la presente invención,de forma que reduce la cantidad de disminución de células T CD4+ causado por la posterior infección por VIH y retrasa o detiene la disminución de células T CD4+ en un individuo ya infectado por VIH.
Otros antígenos incluyen sacáridos bacterianos (preferentemente capsulares) distintos (o además) a los antígenosneumocócicos descritos anteriormente. Los antígenos polisacáridos se almacenan convenientemente en el líquido agranel adsorbido sobre fosfato de aluminio, es por tanto sencillo generar composiciones vacunales de la invención mezclando dicho líquido a granel con el adyuvante de la invención de forma extemporánea. Preferentemente, losotros sacáridos bacterianos se seleccionan de un grupo constituido por: Sacárido capsular de N. meningitidis serogrupo A (MenA), sacárido capsular de N. meningitidis serogrupo C (MenC), sacárido capsular de N. meningitidis serogrupo Y (MenY), sacárido capsular de N. meningitidis serogrupo W-135 (MenW), sacárido capsular del grupo I de estreptococos del grupo B, sacárido capsular del grupo II de estreptococos del grupo B, sacárido capsular delgrupo III de estreptococos del grupo B, sacárido capsular del grupo IV de estreptococos del grupo B, sacárido capsular del grupo V de estreptococos del grupo B, sacárido capsular de tipo 5 de Staphylococcus aureus, sacárido capsular de tipo 8 de Staphylococcus aureus, sacárido Vi de Salmonella typhi, LPS de N. meningitidis, LPS de M. catarrhalis y LPS de H. influenzae. Por LPS se pretende decir lipopolisacárido nativo (o lipooligosacárido) olipopolisacárido donde la parte de lípido A se ha destoxificado mediante alguno de una serie de procedimientosconocidos (véase, por ejemplo, los documentos WO 97/18837 o WO 98/33923), o cualquier molécula que comprenda el O-polisacárido derivado de dicho LPS. Por LPS de N. meningitidis se pretende decir uno o más de los 12 inmunofenotipos conocidos (, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11 o L12).
Combinaciones particularmente preferidas son las composiciones que comprenden: 1) Hib conjugado, MenAconjugado y MenC conjugado; 2) Hib conjugado, MenY conjugado y MenW-135 conjugado. La cantidad de PS encada uno de los conjugados anteriores puede ser 5 ó 10 Dg cada uno por 0,5 ml de dosis humana. Preferentemente,Hib, MenA, MenC, MenW-135 and MenY son conjugados TT.
Un problema asociado con el abordaje polisacárido de la vacunación es el hecho de que los polisacáridos per se son malos inmunógenos. Para superarlo, los sacáridos de la invención pueden estar conjugados con vehículosproteicos, que proporcionan ayuda de las células T inespecíficas. Por tanto, se prefiere que los sacáridos utilizadosen la invención estén ligados a tal vehículo proteico. Ejemplos de tales vehículos que en la actualidad se usan deforma habitual para la producción de inmunógenos sacáridos incluyen los toxoides de difteria y tétanos (TD, TDCRM197 y TT, respectivamente), hemocianina de lapa californiana (KLH), proteína D de Haemophilus influenzae (EP 594610-B), OMPC de N. meningitides y el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD).
El sacárido puede unirse a la proteína vehículo por cualquier procedimiento conocido (por ejemplo, por Likhite, patente de EE.UU. 4,372,945 y por Armor y col., patente de EE.UU. 4,474,757). Preferentemente se lleva a cabo la conjugación CDAP (documento WO 95/08348).
Preferentemente, la proporción proteína:sacárido (peso:peso) de los conjugados es 0,3:1 a 1:1, más preferentemente 0,6:1 a 0,8:1 y más preferentemente alrededor de 0,7:1.
En la presente invención se incluyen combinaciones de antígenos que proporcionan protección frente a neumococos y un patógeno diferente. En la actualidad, muchas vacunas pediátricas se administran en forma de una vacuna combinada con el fin de reducir el número de inyecciones que debe recibir un niño. Por tanto, con las vacunas neumocócicas de la invención, para vacunas pediátricas se pueden formular otros antígenos de otros patógenos.Por ejemplo, las vacunas de la invención se pueden formular junto con (o administrarse por separado pero a la vez)la bien conocida vacuna combinada “trivalente” que comprende el toxoide diftérico (TD), el toxoide del tétanos (TT) y componentes de pertussis [normalmente el toxoide de Pertussis destoxificado (TP) y hemaglutinina filamentosa (HAF) con pertactina opcional (PRN) y/o aglutinina 1+2], por ejemplo la vacuna comercializada INFANRIX-DTPaTM (SmithKlineBeecham Biologicals) que contiene los antígenos TD, TT, TP, HAF y PRN, o con un componente de pertussis de células enteras, por ejemplo como comercializa SmithKlineBeecham Biologicals s.a., como TritanrixTM. La vacuna combinada también puede comprender otro antígeno, tal como el antígeno de superficie de la hepatitis B(HBsAg), antígenos del virus de la polio (por ejemplo, el virus de la polio trivalente inactivado-IPV), proteínas de lamembrana externa de Moraxella catarrhalis, proteínas de Haemophilus influenzae no tipificable, proteínas de lamembrana externa de N.meningitidis B.
Ejemplos de antígenos proteicos de Moraxella catarrhalis que se pueden incluir en una vacuna combinada (especialmente para la prevención de la otitis media) son: OMP106 [documento WO 97/41731 (Antex) y documentoWO 96/34960 (PMC)]; OMP21; LbpA y/o LbpB [documento WO 98/55606 (PMC)]; TbpA y/o TbpB [documento WO 97/13785 y documento WO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, y col. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010];UspA1 y/o UspA2 [documento WO 93/03761 (Universidad de Texas)]; OmpCD; HasR (documento PCT/EP99/03824); PilQ (documento PCT/EP99/03823); OMP85 (documento PCT/EP00/01468); lipo06 (documentoGB 9917977.2); lipo10 (documento GB 9918208.1); lipo11 (documento GB 9918302.2); lipo18 (documento GB9918038.2); P6 (documento PCT/EP99/03038); D15 (documento PCT/EP99/03822); OmplA1 (documento PCT/EP99/06781); Hly3 (documento PCT/EP99/03257); y OmpE. Ejemplos de antígenos de Haemophilus influenzaeno tipificable que se pueden incluir en una vacuna combinada (especialmente para la prevención de la otitis media)incluyen: Proteína fimbrina [(documento US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] y de fusiones quecomprenden péptidos de los mismos [eg LB1(f) fusiones peptídicas; documento US 5843464 (OSU) o documento WO 99/64067]; OMP26 [documento WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [documento EP 281673 (State University of NewYork)]; TbpA y/o TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (documento WO 94/12641);proteína D (documento EP 594610); P2; y P5 (documento WO 94/26304).
Otras combinaciones contempladas son el sacárido neumocócico y la proteína de la invención en combinación conantígenos virales, por ejemplo de la gripe (atenuados, divididos o subunidades [p. ej., glicoproteínas de superficieneuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA). Véase, por ejemplo, Chaloupka I. y col, Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect.Dis. 1996, 15:121-127], RSV (p. ej..,antígenos F y G o de fusión F/G, véase, por ejemplo, Schmidt A. C. y col, J Virol, May 2001, p4594 – 4603), PIV3 (p. ej., proteínas HN y F, véase Schmidt y col. supra), Varicela (p. ej., atenuado,glicoproteínas I-V, etc.), y alguno (o todos) los componentes de MMR (sarampión, paperas, rubéola).
Una vacuna de combinación pediátrica preferida contemplada por la presente invención para el tratamiento global ola prevención de la otitis media comprende: Uno o más antígeno(s) sacárido(s) de Streptococcus pneumoniae(preferentemente conjugado con proteína D), una o más proteínas neumocócicas (preferentemente las descritasanteriormente) y uno o más antígenos expuestos en superficie de Moraxella catarrhalis y/o de Haemophilus influenzae no tipificable. La proteína D puede usarse de forma ventajosa como vehiculo proteico pata los sacáridos neumocócicos (como se ha mencionado antes) y porque es en sí misma un inmunógeno capaz de producir protección mediada por células B frente a H. influenzae no tipificable (ntHi). Los antígenos de Moraxella catarrhalis
o de Haemophilus influenzae no tipificable se pueden incluir en la vacuna en forma de una subunidad, o puedeañadirse como antígenos presentes en la superficie de vesículas de la membrana externa (ampollas) preparadas a partir de las bacterias.
Propiedades inmunogénicas de la composición inmunogénica usada para la vacunación de la presente invención
En la presente invención, la composición inmunogénica es, preferentemente, capaz de inducir una mejorada respuesta inmunitaria de las células T CD4 frente a al menos uno de los antígeno(s) componente(s) o composiciónantigénica en comparación con la mejorada respuesta inmunitaria de las células T CD4 obtenida con la correspondiente composición que no está adyuvada, es decir que no contiene ningún adyuvante exógeno (en lapresente memoria descriptiva también denominada “composición sencilla”). En una forma de realización específica, donde la composición inmunogénica es una composición del virus de la gripe y donde la preparación de la vacuna de la gripe procede de varias cepas de la gripe, siendo una de unas cuales una cepa pandémica, dicha respuestainmunitaria de las células T CD4 mejorada está dirigida contra la cepa de la gripe pandémica.
Por “respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada “ se pretende decir que se obtiene una mayor respuestade las células CD4 en un mamífero tras la administración de la composición inmunogénica adyuvada que laobtenida tras la administración de la misma composición sin adyuvante. Por ejemplo, se obtiene una mayorrespuesta de las células T CD4 en un paciente humano tras la administración de una composición inmunogénicaque comprende un virus de la gripe o una preparación antigénica de la misma, junto con un adyuvante de acuerdocon la invención, en comparación con la respuesta inducida tras la administración de una composición inmunogénicaque comprende un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo que no está adyuvada. Tal formulación seusará de forma ventajosa para inducir una respuesta de células T CD4 anti virus de la gripe capaz de detectarepítopos de gripe presentados por las moléculas de clase II del MHC.
En particular, pero no de forma exclusiva, dicha “mejor respuesta inmunitaria de células T CD4” se obtiene en un paciente no sensibilizado inmunológicamente, es decir un paciente que es seronegativo a dicho virus o antígeno dela gripe. Esta seronegatividad puede ser el resultado de que dicho paciente nunca ha estado expuesto a tal virus oantígeno (el denominado paciente “no expuesto previamente”) o, como alternativa, de que no ha respondido a dichoantígeno cuando se ha encontrado con él. En un aspecto específico, dicha respuesta inmunitaria de las células TCD4 se obtiene en un sujeto inmunocomprometido tal como un anciano, normalmente de más de 65 años de edad, oun adulto menor de 65 años de edad con una afección médica de alto riesgo (adulto de “alto riesgo") o un niñomenor de 2 años.
La respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada puede evaluarse midiendo el número de células queproducen cualquiera de las siguientes citocinas:
•
células que producen al menos IL-2 y otra citocina (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa)
•
células que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNFa, IFNy)
•
células que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNFa IFNy)
•
células que producen al menos IFNy y otra citocina (IL-2, TNFa,CD40L)
•
células que producen al menos TNFa y otra citocina (IL-2, CD40L, IFNy)
Habrá una respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada cuando las células productoras de alguna de lascitocinas anteriores se encuentren en mayor cantidad después de la administración de la composición adyuvada encomparación con la administración de la composición sin adyuvar. Normalmente se cumplirán al menos una, preferentemente dos, de las cinco condiciones mencionadas anteriormente en la presente memoria descriptiva. Enuna forma de realización determinada, las células productoras de las cuatro citocinas estarán presentes en una cantidad superior en el grupo adyuvado en comparación con el grupo sin adyuvar.
La respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada conferida por una composición del virus de la gripe adyuvada de la presente invención puede obtenerse idealmente tras una única administración. El abordaje de una única dosis será extremadamente relevante, por ejemplo, en una situación de brotes de evolución rápida. En ciertascircunstancias, especialmente para la población de ancianos, o en el caso de niños pequeños (por debajo de 9 añosde edad) vacunados por primera vez contra la gripe o en el caso de una pandemia, puede ser beneficios administrardos dosis de la misma composición esa temporada. La segunda dosis de esta misma composición (todavíaconsiderada "composición para la primera vacunación" puede administrarse durante la respuesta inmunitaria primaria en marcha y se espacia de forma adecuada. Normalmente, la segunda dosis de la composición seadministra algunas semanas, o aproximadamente un mes, p. ej. 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas ó 6semanas, después de la primera dosis, para ayudar a sensibilizar al sistema inmunológico en individuos no respondedores o malos respondedores.
En otra forma de realización, la administración de dicha composición inmunogénica induce una respuesta de células memoria B mejorada en pacientes a los que se ha administrado la composición inmunogénica adyuvada encomparación con la respuesta de células memoria B inducida en individuos inmunizados con la composición siadyuvar. Con una respuesta de células memoria B mejorada se quiere decir un incremento de la frecuencia de loslinfocitos B de sangre periférica capaces de diferenciarse en células plasmáticas secretoras de anticuerpos tras elencuentro con el antígeno, medido mediante la estimulación de la diferenciación in vitro.
En otra forma de realización, la administración de dicha composición inmunogénica induce una respuesta humoralmejorada en pacientes a los que se ha administrado la composición inmunogénica adyuvada en comparación con larespuesta humoral inducida en individuos inmunizados con la composición si adyuvar. Dicha respuesta inmunitariahumoral se puede medir de acuerdo con alguno de los procedimientos detallados en el Ejemplo 1, y especialmenteen las secciones I.1 (I.1.1), I.2 (I.2.1) and I.3 (I.3.5.2). Cuando la composición inmunogénica es una composición de la gripe, dicha respuesta humoral se obtiene específicamente contra cepas homólogas y heterólogas. En particular,dicha respuesta inmunitaria humoral heteróloga quiere decir una respuesta humoral entre cepas de la gripe y sedenomina respuesta inmunitaria humoral “de reacción cruzada”. Dicha respuesta inmunitaria humoral “de reaccióncruzada" implica la inducción de respuesta contra una cepa de la gripe que es una variante (un derivado) de la cepa de la gripe usada para la vacunación. Un ejemplo de tal respuesta se ilustra en el Ejemplo III.3.1 y en la Figura 2.
En una forma de realización específica, la administración de dicha composición inmunogénica adyuvada induce almenos dos de las siguientes respuestas: (i) una respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada, (ii) unrespuesta de células memoria B mejorada, (iii) una respuesta humoral mejorada, contra al menos uno de losantígeno(s) componente(s) o composición antigénica en comparación con cualquiera de las respuestas inmunitariasobtenidas con la correspondiente composición que está sin adyuvar, es decir que no contiene ningún adyuvanteexógeno (en la presente memoria descriptiva también denominada “composición sencilla”).
En otra forma más de realización específica, la vacunación con la composición de la primera vacunación, adyuvada,no posee ningún impacto mensurable sobre la respuesta de las células CD8.
Es una forma de realización específica de la invención que la composición que comprende un virus de la gripe o unapreparación antigénica del mismo formulada con un adyuvante de saponina presentada en forma de un liposoma, enparticular saponina QS21 en su forma inactivada con colesterol, es eficaz en la estimulación de respuestas de células T en una población de seres humanos inmunocomprometidos. En una forma de realización, dicho adyuvanteademás comprende 3D-MPL. En particular, la administración de una única dosis de la composición inmunogénicapara la primera vacunación como se describe en la invención es capaz de proporcionar mejor seroprotección, según se ha evaluado con las correlaciones de la protección para vacunas de la gripe, tras la revacunación contra el virusde la gripe en una población de seres humanos ancianos, que la vacunación con una vacuna de la gripe sin adyuvar.La formulación adyuvada reivindicada también ha sido capaz de inducir una respuesta inmunitaria de células T CD4mejorada contra el virus de la gripe en comparación con la obtenida con la formulación sin adyuvar. Este hallazgo sepuede asociar con un aumento de la capacidad de respuesta tras la vacunación o la infección en relación con laexposición a un antígeno de la gripe. Además, esto también se puede asociar con una capacidad de respuestacruzada, es decir una mayor capacidad para responder frente a cepas variantes de la gripe. Esta respuesta mejorada puede ser especialmente beneficiosa en una población se seres humanos inmunocomprometidos, tal como la población de ancianos (mayores de 65 años de edad) y, en particular, la población de ancianos de altoriesgo. Esto puede dar como resultado la reducción del índice de morbididad y mortalidad global y la prevención delos ingresos hospitalarios por neumonía y otras enfermedades similares a la gripe. Esto también puede serbeneficioso para la población de niños pequeños (menores de 5 años de edad, preferentemente menores de 2 añosde edad). Además, también puede permitir la inducción de una respuesta de células T CD4 que es más persistente en el tiempo, por ejemplo sigue presente un año después de la primera vacunación, en comparación con la respuesta inducida con la formulación sin adyuvar.
En un aspecto específico, la respuesta inmunitaria de células T CD4, tal como la respuesta inmunitaria de células TCD4 mejorada obtenida en un sujeto no sensibilizado, implica la inducción de una respuesta de las células T CD4 colaboradoras de reacción cruzada. En particular, la cantidad de células T CD4 de reacción cruzada se incrementa. Por respuesta de células CD4 de “reacción cruzada” se quiere decir que las células T CD4 están dirigidas a epítoposcompartidos entre las cepas de la gripe.
Normalmente, las vacunas contra la gripe disponibles son eficaces únicamente contra las cepas infecciosas del virus de la gripe que poseen hemaglutinina de características antigénicas similares. Cuando el virus de la gripe infeccioso (en circulación) ha experimentado pequeños cambios (tal como una mutación puntual o una acumulación de mutaciones puntuales que dan como resultado cambios de aminoácidos), por ejemplo en las glicoproteínas desuperficie, en particular en la hemaglutinina (cepa del virus variante derivada antigénica), la vacuna puede seguirproporcionando algo de protección, aunque puede que sólo proporcione protección limitada porque las variantesrecién creadas pueden escapar a la inmunidad inducida por una infección de gripe o una vacunación previas. La deriva antigénica es responsable de las epidemias anuales que se producen durante periodos interpandémicos(Wiley & Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394). La inducción de células T CD4 con reacción cruzada proporciona una ventaja adicional a la composición de la invención, ya que puede también proporcionar proteccióncruzada, en otras palabras protección contra infecciones heterólogas, es decir infecciones causadas por una cepa de la gripe en circulación que es una variante (p. ej., una deriva) de la cepa de la gripe contenida en la composición inmunogénica. Esto puede ser una ventaja cuando la cepa circulante es difícil de propagar en huevos o de produciren cultivos celulares, lo que hace del uso de una cepa derivada una alternativa de trabajo. Esto también puede serventajoso cuando el sujeto recibió una primera y una segunda vacunación separadas por varios meses o un año, y en la cepa de la gripe en la composición inmunogénica usada para una segunda inmunización es una cepa variantederiva de la cepa usada en la composición usada para la primera vacunación.
La composición inmunogénica de la gripe adyuvada, como se ha definido en la presente memoria descriptiva, posee,por tanto, una mayor capacidad para inducir seroprotección y células T CD4 con reacción cruzada en sujetosancianos vacunados. Esta característica puede asociarse con una mayor capacidad para responder frente a unacepa variante de la cepa presente en la composición inmunogénica. Esto se puede probar que es una importanteventaja en una situación de pandemia. Por ejemplo, una composición inmunogénica multivalente del virus de la gripeque comprende alguna o varias de las cepas H5, a H2, a H9, H7 o H6, puede proporcionar una mayor capacidad para responder frente a una variante pandémica, es decir una cepa derivada de dicha(s) cepa(s) pandémica(s), bientras la siguiente vacunación o tras la infección con dicha cepa derivada.
Detección de células T CD4 de reacción cruzada tras la vacunación con la vacuna de la gripe
Las células T CD4 que son capaces de reconocer cepas de la gripe tanto homólogas como derivadas se handenominado en el presente documento “de reacción cruzada”. Las composiciones de la gripe adyuvadas como se hadescrito en la presente memoria descriptiva han sido capaces de mostrar reactividad cruzada heterosubtípica, ya que se observó reactividad cruzada frente a las cepas de la gripe derivadas. Como se ha mencionado antes, la capacidad de una formulación de vacuna pandémica para ser eficaz contra cepas pandémicas derivadas puede seruna característica importante en el caso de pandemia.
Consistente con las anteriores observaciones, se han identificado en seres humanos epítopos de células T CD4 compartidos por diferentes cepas de la gripe (Gelder C y col. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM y col.1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM y col. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506).
En una forma de realización específica, la composición adyuvada puede ofrecer el beneficio adicional de proporcionar mejor protección frente a cepas circulantes que han experimentado un cambio pequeño (tal como recombinación génica por ejemplo, entre dos especies diferentes) en la hemaglutinina (deriva antigénica) contra laque las vacunas disponibles en la actualidad no poseen eficacia.
Revacunación y composición usada para la revacunación (composición de refuerzo)
En una forma de realización, la invención proporciona el uso de un virus de la gripe o preparación antigénica delmismo en la fabricación de una composición inmunogénica para la revacunación de seres humanos vacunadospreviamente con una composición inmunogénica como se reivindica en el presente documento.
En un aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un virus de la gripe o preparación antigénica delmismo, a partir de una primera cepa de gripe pandémica, en la fabricación de una composición inmunogénicaadyuvada como se define en la presente memoria descriptiva para la protección frente a infecciones de la gripecausadas por una cepa de gripe que es una variante de dicha primera cepa de gripe.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo en lafabricación de una composición inmunogénica de gripe para la revacunación de seres humanos vacunados previamente con una composición inmunogénica de gripe adyuvada como se reivindica en la presente memoriadescriptiva o con una composición de gripe adyuvada que comprende una variante de la cepa de gripe, siendo eladyuvante como se ha definido en el presente documento.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para vacunar una población humana o unindividuo frente una cepa del virus de la gripe, seguido por la revacunación de dicho ser humano o población contra una cepa variante del virus de la gripe, donde dicho procedimiento comprende la administración a dicho ser humano
(i) una primera composición que comprende un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo a partir de una primera cepa del virus de la gripe y un adyuvante como se ha definido en la presente memoria descriptiva, y (ii) una segunda composición inmunogénica que comprende una cepa variante del virus de la gripe de dicha primera cepa del virus de la gripe. En una forma de realización específica, dicha primera cepa está asociada con un brote pandémico o posee el potencial para estar asociada con un brote pandémico. En otra forma de realización específica, dicha cepa variante está asociada con un brote pandémico o posee el potencial para estar asociada conun brote pandémico. En particular, la revacunación se realiza con una composición de gripe que comprende al menos una cepa que es una cepa pandémica circulante. Tanto la composición de sensibilización como lacomposición de refuerzo pueden ser multivalente, es decir pueden contener al menos dos cepas del virus de lagripe. Cuando la(s) composición(es) es (son) multivalente, al menos una cepa está asociada con un brote pandémico o posee el potencial para estar asociada con un brote pandémico.
Normalmente, la revacunación se realiza al menos 6 meses después de la primera vacunación, preferentemente de8 a 14 meses después, más preferentemente alrededor de 10-12 meses después.
La composición inmunogénica para la revacunación (la composición de refuerzo) puede contener cualquier tipo depreparación antigénica, bien inactivada o con virus vivos atenuados. Puede contener el mismo tipo de preparación antigénica, por ejemplo un virus de la gripe dividido o una preparación antigénica del mismo, un virión entero, o una vacuna HA y NA purificada (subunidad), como la composición inmunogénica usada para la primera vacunación.Como alternativa, la composición de refuerzo puede contener otro tipo de antígeno de la gripe distinto al usado parala primera vacunación. Preferentemente se usa un virus dividido. La composición de refuerzo puede estar adyuvada
o sin adyuvar. La composición de refuerzo sin adyuvar puede ser FluarixT/a-Rix®/Influsplit® administrada por vía intramuscular. La formulación contiene tres viriones divididos inactivados preparados a partir de las cepasrecomendadas por la OMS de la temporada adecuada de la gripe.
La composición de refuerzo puede estar adyuvada o sin adyuvar. En una forma de realización específica, la composición de refuerzo comprende un adyuvante de saponina que es como se ha definido en el presente documento.
En una forma de realización específica, la composición inmunogénica para la revacunación (también denominada a continuación en la presente memoria descriptiva la "composición de refuerzo" contiene un virus de la gripe opreparación antigénica del mismo que comparte epítopos ”comunes de las células T CD4 con el virus de la gripe o lapreparación antigénica del mismo usada para la primera vacunación. Con epítopo común de células T CD4 se quieredecir péptidos/secuencias/epítopos de diferentes antígenos que pueden estar reconocidos por la misma célula CD4 (véanse los ejemplos de los epítopos descritos en: Gelder C y col. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM y col.1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM y col. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506).
En una realización se acuerdo con la invención, la composición de refuerzo es una composición de gripemonovalente que comprende una cepa de gripe que está asociada con un brote pandémico o posee el potencialpara estar asociado con un brote pandémico. En particular, dicha cepa en la composición de refuerzo es una cepa pandémica circulante. Las cepas adecuadas son, entre otras: H5N1, H9N2, H7N7, y H2N2. Dicha cepa puede ser lamisma, o una de ellas, que la presente en la composición usada para la primera vacunación. En una forma derealización alternativa, dicha cepa puede ser una cepa variante, es decir una cepa derivada, de la cepa presente enla composición usada para la primera vacunación.
En otra realización específica, la composición de refuerzo es una vacuna de la gripe multivalente. En particular, cuando la composición de refuerzo es una vacuna multivalente tal como una vacuna bivalente, trivalente o tetravalente, al menos una cepa está asociada con un brote pandémico o posee el potencial de estar asociada con un brote pandémico. En una forma de realización específica, dos o más cepas de la composición de refuerzo son cepas pandémicas. En otra forma de realización específica, la al menos una cepa pandémica de la composición derefuerzo es del mismo tipo que la, o una de ellas, presente en la composición usada para la primera vacunación. Enuna forma de realización alternativa, la al menos una cepa puede ser una cepa variante, es decir una cepa derivada,de la al menos una cepa pandémica presente en la composición usada para la primera vacunación. En particular, laal menos una cepa en la composición de refuerzo es una cepa pandémica circulante. La composición de refuerzopuede estar adyuvada o no.
Normalmente, una composición de refuerzo, cuando se usa, se administra en la siguiente temporada de gripe, porejemplo aproximadamente un año después de la primera composición inmunogénica. La composición de refuerzotambién puede administrarse todos los años posteriores (tercera, cuarta, quinta vacunación y así sucesivamente). Lacomposición de refuerzo puede ser la misma que la composición usada para la primera vacunación. De formaadecuada, la composición de refuerzo contiene un virus de la gripe o una preparación antigénica del mismo, que es una cepa variante del virus de la gripe usado para la primera vacunación. En particular, las cepas del virus de la gripe o preparación antigénica del mismo se seleccionan de acuerdo con el material de referencia distribuido por laOrganización Mundial de la Salud, de forma que estén adaptados a la cepa de la gripe en circulación el año de larevacunación.
El antígeno o composición antigénica de la gripe usada en la revacunación comprende, preferentemente, un adyuvante, de forma adecuada como se ha descrito anteriormente. El adyuvante puede ser una saponinapresentada en forma de liposoma, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria descriptiva, que espreferido, que contiene opcionalmente un adyuvante adicional tal como 3D-MPL.
En un aspecto, la revacunación induce alguno, preferentemente dos o todas, los siguientes: (i) una respuesta mejorada de las células CD4 frente al virus de la gripe o a la preparación antigénica del mismo, o (ii) una respuestamejorada de las células B de memoria o (iii) una respuesta humoral mejorada en comparación con la respuestaequivalente inducida tras una primera vacunación con el virus de la gripe sin adyuvar o la preparación antigénica delmismo. Preferentemente, la(s) respuesta(s) inmunológica(s) inducida(s) tras la revacunación con el virus de la gripe adyuvado o la preparación antigénica del mismo como se ha definido en la presente memoria descriptiva, es (son)superior(es) a la correspondiente respuesta inducida tras la revacunación con la composición sin adyuvar.Preferentemente, las respuestas inmunológicas inducidas tras la revacunación con un virus de la gripe sin adyuvar,preferentemente dividido, con superiores en la población vacunada primero con la composición de la gripe adyuvada, preferentemente dividida, a la correspondiente respuesta en la población vacunada primero con la composición de la gripe sin adyuvar, preferentemente divididaEn una forma de realización específica, larevacunación de los sujetos con una composición de refuerzo que comprende un virus de la gripe y un adyuvantesaponina en forma de liposoma, como se ha definido anteriormente en la presente memoria descriptiva, muestra mayores títulos de anticuerpos que los correspondientes valores en el grupo de personas vacunados primero con la composición sin adyuvar y reforzados con la composición sin adyuvar. El efecto del adyuvante en relación con laestimulación de la respuesta de anticuerpos a la revacunación es de especial importancia en la población deancianos, que se sabe que poseen una repuesta baja a la vacunación o la infección por el virus de la gripe. Elbeneficio asociado a la composición adyuvada también fue marcado en términos de mejorar la respuesta de lascélulas T CD4 tras la revacunación.
Específicamente, la composición adyuvada de la invención es capaz de inducir una mejor capacidad de respuesta cruzada frente a la cepa derivada (la cepa de la gripe de la siguiente temporada de gripe) en comparación con laprotección conferida por la vacuna control. Dicha capacidad de respuesta cruzada ha mostrado una mayor persistencia en comparación con la obtenida con la formulación sin adyuvar. El efecto del adyuvante en relación conla estimulación de la capacidad de respuesta cruzada frente a la cepa derivada es de importancia en una situación de pandemia.
En una realización adicional, la invención se refiere a un régimen de vacunación en el que la primera vacunación serealiza con una composición de la gripe, preferentemente una composición de virus de la gripe divididos, quecontenga al menos una cepa de gripe que potencialmente podría causar un brote pandémico y la revacunación serealiza con una cepa en circulación, bien una cepa pandémica o una cepa clásica.
Epítopo de CD4 en HA
Esta deriva antigénica reside principalmente en las regiones epítopo de las proteínas de la superficie viralhemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). Se sabe que cualquier diferencia en los epítopos de las células CD4 y Bentre las diferentes cepas de gripe, usados por el virus para evadir la respuesta adaptativa del sistema inmunológicodel virus, desempeñará un papel crucial en la vacunación frente a la gripe y sus epítopos de células T CD4compartidos por diferentes cepas de gripe se han identificado en seres humanos (véase, por ejemplo: Gelder C y col. 1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM y col. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM y col. 1995 J Virol.1995 69(12):7497-506).
En una realización específica, la revacunación se realiza usando una composición refuerzo que contiene un virus dela gripe o preparación antigénica del mismo que comparte epítopos ”comunes de las células T CD4 con el antígeno del virus de la gripe o la preparación antigénica del mismo usada para la primera vacunación. Por tanto, la invenciónse refiere al uso de la composición inmunogénica que comprende un virus de la gripe pandémico o preparación antigénica del mismo y una saponina en forma de liposoma en particular QS21, en su forma destoxificada concolesterol opcionalmente con 3D-MPL, en la fabricación ce un componente de una primera vacunación de unavacuna multidosis, donde la vacuna multidosis además comprende, como dosis de refuerzo, un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo que comparte epítopos comunes de las células T CD4 con el antígeno del virus de la gripe pandémico o la preparación antigénica del mismo de la dosis administrada en la primera vacunación
Medio de vacunación
Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden administrar por cualquier vía de la administraciónadecuada, tal como intradérmica, mucosa, por ejemplo intranasal, oral, intramuscular o subcutánea. En la técnica se conocen bien otras vías de administración.
Para la composición inmunogénica adyuvada se prefriere la vía de administración intramuscular.
La administración intradérmica es otra vía adecuada. Para la administración intradérmica se puede usar cualquierdispositivo adecuado, por ejemplo dispositivos con agujas cortas tales como los descritos en los documentos US4,886,499, US5,190,521, US 5,328,483, US 5,527,288, US 4,270,537, US 5,015,235, US 5,141,496, US 5,417,662. Las vacunas intradérmicas también pueden administrarse a través de dispositivos que limitan la longitud de lapenetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en los documentos WO99/34850 y EP1092444, incorporados en la presente memoria descriptiva por referencia, y los equivalentes funcionales de los mismos.También son adecuados los dispositivos de chorro, que administran vacunas líquidas en la dermis a través de un inyector de chorro líquido o de una aguja que perfora el estrato córneo y produce un chorro que alcanza la dermis.Los dispositivos de inyección de chorro se describen, por ejemplo, en los documentos US 5,480,381, US 5,599,302,US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 y WO 97/13537. También son adecuados los dispositivos deadministración balística de polvo/partículas que usan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo através de las capas externas de la piel y hacia la dermis. Además, se pueden usar jeringas convencionales en elmétodo manthoux clásico de administración intradérmica.
Otra vía de administración adecuada es la vía subcutánea. Para la administración subcutánea se puede usarcualquier dispositivo adecuado, por ejemplo una aguja clásica. Preferentemente se usa un servicio de inyector achorro sin aguja, tal como el publicado en los documentos WO 01/05453, WO 01/05452, WO 01/05451, WO 01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637, WO 01/58512, WO 01/64269, WO 01/78810,WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317. Más preferentemente, dicho dispositivo está precargado con la formulación de vacuna líquida.
Como alternativa, la vacuna se administra por vía intranasal. Normalmente, la vacuna se administra localmente en elárea nasofaríngea, preferentemente sin que sea inhalada a los pulmones. Es deseable usar un dispositivo de administración intranasal que administra la formulación de la vacuna en el área nasofaríngea, sin entrar, o sustancialmente sin entrar, en los pulmones.
Los dispositivos preferidos para la administración intranasal de las vacunas de acuerdo con la invención sondispositivos de aerosol. Los dispositivos de aerosol nasal adecuados disponibles comercialmente incluyen AccusprayTM (Becton Dickinson). Los nebulizadores producen un aerosol muy fino que puede ser inhalado con facilidad hacia los pulmones y, por tanto, no alcanzan de forma eficaz la mucosa nasal. Por tanto, no se prefieren los nebulizadores.
Los dispositivos de aerosol preferidos para uso intranasal son los dispositivos para los que el funcionamiento deldispositivo no depende de la presión aplicada por el usuario. Estos dispositivos se conocen como dispositivos de presión umbral. El líquido sale por la boquilla únicamente cuando se aplica una presión umbral. Estos dispositivos facilitan alcanzar un aerosol con un tamaño de gota regular. En la técnica se conocen los dispositivos de presiónumbral para usar con la presente invención y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 91/13281 y EP 311863 B y EP 516 636, incorporados en la presente memoria descriptiva por referencia. Tales dispositivos estándisponibles comercialmente en Pfeiffer GmbH y también se han descrito en Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999.
Los dispositivos intranasales preferidos producen gotas (medidas usando agua como el líquido) en el intervalo de 1 a 200 !m, preferentemente de 10 a 120 !m, . Por debajo de 10 !m, existe un riesgo de inhalación, por lo que esdeseable no tener más de aproximadamente el 5% de las gotas por debajo de 10 !m. Las gotas por encima de 120 !m, no se extienden tan bien como las gotas más pequeñas, por lo que es deseable que no más de aproximadamente el 5% de las gotas supere los 120 !m. .
La administración de dos dosis es otra característica de un sistema de administración intranasal para usar con lasvacunas de acuerdo con la invención. Los dispositivos bidosis contienen dos subdosis de una única dosis de lavacuna, una subdosis para administrar en cada fosa nasal. En general, las dos subdosis están presentes en una única cámara y la construcción del dispositivo permite la administración eficaz de una única subdosis cada vez.Como alternativa, se puede usar un dispositivo monodosis para administrar las vacunas de acuerdo con la invención.
Como alternativa, la vía de vacunación epidérmica o transdérmica también se contempla en la presente invención.
En un aspecto específico de la presente invención, la composición inmunogénica adyuvada para la primera administración se puede administrar por vía intramuscular, y la composición de refuerzo, adyuvada o no, se puedeadministrar a través de una vía diferente, por ejemplo intradérmica, subcutánea o intranasal. En otra forma de realización específica, una composición inmunogénica que comprende específicamente un antígeno del virus de lagripe o preparación antigénica del mismo para la primera administración puede contener un contenido estándar deHA de 15 μg por cepa de gripe y la composición de gripe del refuerzo puede contener una dosis baja de HA, es decirinferior a 15 μg, y, dependiendo de la vía de administración, puede administrarse en un volumen menor.
Poblaciones que se van a vacunar
La población diana para vacunar pueden ser seres humanos inmunocomprometidos. En general, los seres humanosinmunocomprometidos son bastante menos capaces de responder a un antígeno, en particular a un antígeno delvirus de la gripe, en comparación con adultos sanos.
Preferentemente, la población diana es una población no sensibilizada a la gripe, bien porque no ha estado expuesto(tal como en relación con una cepa pandémica) o que no ha respondido previamente a la infección o vacunación conel virus de la gripe. Preferentemente, la población diana son personas ancianas, adecuadamente de más de 65 añosde edad, adultos menores de alto riesgo (es decir, de entre 18 y 64 años de edad), tal como personas que trabajanen instituciones sanitarias, o adultos jóvenes con un factor de riesgo como una enfermedad cardiovascular y pulmonar, o diabetes. Otra población diana la componen todos los niños de más de 6 meses de edad, especialmente niños de 6-23 meses de edad que experimenten un índice de hospitalización relacionado con la griperelativamente alto. Preferentemente, la población diana son ancianos mayores de 65 años de edad.
Regímenes de vacunación, dosificación y criterios adicionales de eficacia
Adecuadamente, las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la presente invención son una dosis inyectable estándar de 0,5 ml en la mayoría de los casos y, en caso de una composición de gripe, contiene 15 μg decomponente antigénico de hemaglutinina de cada cepa de gripe, medido mediante inmunodifusión radial sencilla (SRD) (J.M. Wood y col.: J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood y col., J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330). Adecuadamente, el volumen de la dosis de la vacuna será de entre 0,5 ml y 1 ml, en particular un volumen de dosisde vacuna estándar de 0,5 ml o 0,7 ml. Para las vacunas de la gripe, rutinariamente se realizará una ligeraadaptación del volumen de la dosis en función de la concentración de HA en la muestra a granel original.
Adecuadamente, dicha composición inmunogénica contiene una dosis baja de antígeno HA, por ejemplo cualquierade 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 !g de HA por cepa de gripe.
De un modo ventajoso, una dosis de vacuna de acuerdo con la invención, en particular una dosis baja de la vacuna,puede proporcionar un volumen menor que las convencionales vacunas frente a la gripe divididas inyectadas, que en general están alrededor de 0,5, 0,7 ó 1 ml por dosis. Las dosis de volumen bajo de acuerdo con la invención son, preferentemente, inferiores a 500 !l, más preferentemente inferiores a 300 !l, y más preferentemente no superiores a aproximadamente 200 !l, o menos por dosis.
Por tanto, una dosis de vacuna de volumen bajo preferida de acuerdo con un aspecto de la invención es una dosiscon una dosis baja de antígeno en un volumen bajo, por ejemplo aproximadamente 15 !g o aproximadamente 7,5 !g de HA o aproximadamente 3,0 !g de HA (por cepa) en un volumen de aproximadamente 200 !l.
El medicamento frente a la gripe de la invención cumple preferentemente ciertos criterios internacionales para 5 vacunas.
Se aplican patrones internacionales para medir la eficacia de las vacunas frente a la gripe. Los criterios oficiales dela Unión Europea para una vacuna eficaz contra la gripe se indican en la Tabla 1, que se expone más adelante. En teoría, para cumplir los requisitos de la Unión Europea, una vacuna frente a la gripe debe cumplir sólo uno de los criterios de la tabla, para todas las cepas de gripe incluidas en la vacuna. Las composiciones de la presente
10 invención cumplen de forma adecuada al menos uno de tales criterios.
Sin embargo, en la práctica, todas las cepas necesitarán cumplir al menos dos o los tres criterios, en particular para una vacuna nueva tal como una vacuna nueva para su administración por una vía diferente. En algunas circunstancias pueden ser suficientes dos criterios. Por ejemplo puede ser aceptable que todas las cepas cumplan dos de los tres criterios, mientras que el tercero lo cumplen algunas cepas, pero no todas (p. ej., dos de tres cepas).
15 Los requisitos son diferentes para las poblaciones de adultos (18-60 años de edad) y las poblaciones de ancianos (> 60 años de edad).
Tabla 1
18 - 60 años
> 60 años
�?ndice de seroconversión*
>40% >30%
Factor de conversión**
>2,5 >2,0
�?ndice de protección***
>70% >60%
* El índice de seroconversión se define como el porcentaje de vacunados que experimentan un incremento de al menos 4 veces los títulos de inhibición de hemaglutinina en suero (IH) tras la vacunación, para cada cepa vacunal. ** El factor de conversión se define como el incremento de los títulos medios geométricos de IH en suero (TMG) tras la vacunación, para cada cepa vacunal. *** El índice de protección se define como el porcentaje de vacunados con un título de IH en suero igual o superior a 1:40 tras la vacunación (para cada cepa vacunal) y normalmente se acepta como protección indicativa
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para diseñar una vacuna para las enfermedades que se20 sabe que se curan o tratan mediante activación de células T CD4+, que comprende
1) seleccionar un antígeno que contenga epítopos de CD4+, y 2) combinar dicho antígeno con adyuvante de saponina en forma de liposoma como se ha definido anteriormente en la presente memoria descriptiva, donde dicha vacuna tras la administración en dicho mamífero es capaz de inducir una mejor respuesta de células T CD4 en dicho mamífero.
25 Para evitar las dudas en los términos “que comprende”, “comprende”, los inventores pretenden en la presente memoria descriptiva que sean opcionalmente sustituibles con los términos “que consiste en”, “consiste en”, respectivamente en cada caso.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes: El Ejemplo I describe procedimientos inmunológicos usados en estudios con ratones, hurones y seres humanos.
30 El Ejemplo II describe una preparación del adyuvante liposómico MPL/QS21. El Ejemplo III describe una evaluación preclínica de vacunas adyuvadas y sin adyuvar en hurones. El Ejemplo IV muestra una evaluación preclínica de vacunas frente a la gripe adyuvadas y sin adyuvar en ratones
C57Bl/6 no expuestos y sensibilizados. El Ejemplo V describe una comparación de vacunas frente a la gripe adyuvadas con 3D-MPL a dos concentraciones35 diferentes en ratones.
El Ejemplo VI describe una comparación de vacunas frente a la gripe adyuvadas con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes en seres humanos ancianos. El Ejemplo VII describe una evaluación preclínica de vacunas frente a VPH adyuvadas en ratones. El Ejemplo VIII describe una evaluación preclínica de composiciones inmunogénicas frente a citomegalovirus
40 adyuvadas y sin adyuvar.
El Ejemplo IX describe la evaluación preclínica de una composición vacunal frente a RTSS adyuvada con 3D-MPL ados concentraciones diferentes.
El Ejemplo X describe la evaluación clínica de una vacuna RTSS adyuvada con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes.
Ejemplo I – Procedimientos de lectura inmunológica
I.1. Procedimientos en ratones
I.1.1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación
Procedimiento de ensayo
Los títulos de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio de la prueba de la IH se basa en la capacidad de losanticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina(HA) del virus de la gripe. Los sueros inactivados con calor se trataron previamente con caolín y RBC de pollo paraeliminar los inhibidores no específicos. Tras el pretratamiento, diluciones de dos en dos de suero se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y seclasificó la inhibición de la aglutinación. Los títulos se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectablese clasificó como un título igual a 5.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron en los títulos de IH posteriores a la vacunación usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
Transformación log de los datos
Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos
Prueba de Cochran para verificar la homogeneicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)
Análisis bilateral de la varianza realizado en los grupos
Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples
I.1.2. Tinción intracelular de citocinas
Esta técnica permite una cuantificación de linfocitos T específicos de antígeno sobre la base de la producción decitocinas Las células T efectoras y/o las células T de memoria-efectoras producen IFN-y y las células T de memoriacentrales producen IL-2. Las PBMC se recogen el día 7 después de la inmunización.
Las células linfoides se reestimulan in vitro en presencia de un inhibidor de la secreción (Brefeldina): Estas células se procesan a continuación mediante procedimiento de inmunofluorescencia convencional usando anticuerposfluorescentes (CD4, CD8, IFN-y y IL-2) Los resultados se expresan en forma de frecuencia de células positivas para citocinas en las células T CD4/CD8. La tinción intracelular de las citocinas de las células T se realizó en las PBMC 7días después de la segunda inmunización. Se recogió sangre de ratones y se agrupó en medio heparinizado RPMI +Ad. Para la sangre se estratificó las suspensiones de RPMI + Ad en un gradiente de linfocito-mamífero de acuerdocon el protocolo recomendado (centrífuga 20 min a 2500 rpm a TA). Las células mononucleares en la interfase seextrajeron, se lavaron 2 veces en RPMI + Ad y las suspensiones de PBMC se ajustaron a 2 x 106 células/ml en RPMI con 5% de suero bovino fetal.
La estimulación antigénica in vitro de las PBMC se llevó a cabo a una concentración final de 1 x 106 células/ml (entubo para FACS) con Flu trivalente dividido en μesferas (5 μg de HA/cepa) o Fl entera (1 μg de HA/cepa) y después se incubó 2 horas a 37 ºC con la adición de anti-CD28 y anti-CD49d (1 μg/ml para ambos).
La adición de ambos anticuerpos aumentó la proliferación y la producción de citocinas por parte de las células T y NK activadas y pueden proporcionar una señal coestimuladora para la inducción de LTC.
Además, las PBMC también fueron estimuladas durante la noche con Flu trivalente dividida ( 30 μg de HA/cepa) o Flentera (5 μg de HA/cepa) en pulsos de BMDC (1 x 105 células/ml), que se prepararon mediante pulsos de BMDCcon Flu dividida (60 μg de HA/cepa) o Flu trivalente entera Fl (10 μg de HA/cepa) durante 6 horas a 37 ºC. Tras la reestimulación antigénica, las PBMC se incuban O.N. a 37ºC en presencia de Brefeldina (1μg/ml) a 37ºC para inhibirla secreción de citocina.
La tinción de IFN-y /IL-2/CD4/CD8 se realizó del siguiente modo: Las suspensiones celulares se lavaron,resuspendieron en 50 μl de PBS con 1% de FCS que contenga 2% de reactivo Bloqueantes Fc (1/50; 2.4G2). Tras 10 min de incubación a 4ºC, se añadieron 50 μl de una mezcla de anti-CD4-PE (2/50) y anti-CD8-perCp (3/50) y seincubaron durante 30 min a 4ºC. Tras lavar con PBS y 1% de FCS, las células se permeabilizaron mediante resuspensión en 200 μl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) y se incubaron 20 min a 4ºC. A continuación, las células selavaron con Perm Wash (Kit BD) y se resuspendieron con 50 μl de una mezcla de anti-IFN-y APC (1/50) + anti-IL-2FITC (1/50) diluida en Perm Wash. Tras una incubación de como mínimo 2 horas y como máximo durante toda la noche a 4ºC, las células se lavaron con Perm Wash y se resuspendieron en PBS con 1% de FCS + 1% de paraformaldehído. El análisis de la muestra se realizó con FACS. Las células vivas se agruparon (FSC/SSC) y laadquisición se realizó en ~ 50.000 sucesos (linfocitos) o 35.000 sucesos en células T CD4+. Los porcentajes de IFN-y + o IL2+ se calcularon en poblaciones agrupadas de CD4+ and CD8+.
I.2. Procedimientos en hurones
I.2.1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación (IH)
Procedimiento del ensayo
Los títulos de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio de la prueba de la IH se basa en la capacidad de losanticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina(HA) del virus de la gripe. Los sueros se trataron primero con una solución al 25% de neuraminidasa (RDE) y seinactivaron con calor para eliminar los inhibidores inespecíficos. Tras el pretratamiento, diluciones de dos en dos de suero se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y se clasificó la inhibición de la aglutinación usando gotas para la lectura. Los títulos se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 01:10:00, un nivel indetectable se clasificó como un título igual a 5.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron con títulos de IH (día 41 antes de la provocación) usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
Transformación log de los datos.
Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupo.
Prueba de Cochran para verificar la homogeneicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)
Prueba para la interacción de ANOVA unilateral
Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples
I.2.2. Lavados nasales
Los lavados nasales se realizaron mediante la administración de 5 ml de PBS en ambas fosas nasales en animales despiertos. El inóculo se recogió en una placa petri y se introdujo en contenedores de muestras en hielo seco.
Titulación viral el lavados nasales
Todas las muestras nasales primero se filtraron en esterilidad a través de filtros Spin X (Costar) para eliminar toda contaminación bacteriana. 50 μl de diluciones seriadas de diez en diez de lavados nasales se transfirieron a placasde microtitulación que contengan 50 μl de medio (10 pocillos/dilución). A continuación se añadieron 100μl de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) a cada pocillo y se incubaron a 35ºC durante 5-7 días. Tras 6-7 días de incubación, elmedio de cultivo se elimina suavemente y se añaden 100 μl de un medio con /20 WST-1 y se incuban durante otras18 horas.
La intensidad del pigmento amarillo formazán producido tras la reducción de WST-1 mediante células viables esproporcional al número de células viables presente en el pocillo al final del ensayo de titulación vírica y se cuantificamidiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda adecuada (450 nanómetros). El valor de corte sedefine como la DO media de las células control no infectadas, 0,3 DO (0,3 DO corresponde a una desviaciónestándar de +/- 3 de la DO de las células control no infectadas). Una puntuación positiva se define cuando la DO es < del valor de corte y, en contraste, una puntuación negativa se define cuando la DO es > del valor de corte. Lostítulos de eliminación del virus se determinaron mediante “Reed y Muench” y se expresaron en forma de DICT50/ml.
I.3. Análisis para evaluar la respuesta inmunitaria en seres humanos
I.3.1. Análisis de inhibición de la hemaglutinación
La respuesta inmunitaria se determinó midiendo los anticuerpos de IH usando el procedimiento descrito por elCentro colaborador de la OMS para la gripe, Centros de Control de Enfermedades (Collaborating Centre forinfluenza, Centres for Disease Control), Atlanta, EE.UU. (1991).
Las mediciones del título de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas descongeladas con unmicroprocedimiento normalizado y validado exhaustivamente usando 4 unidades inhibidoras de la hemaglutinación(4 UIH) de los antígenos adecuados y una suspensión al 0,5% de eritrocitos de ave de corral. Los inhibidores séricosno específicos se eliminaron mediante tratamiento con calor y enzima destructora del receptor.
Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar los niveles de anticuerpos de IH. Comenzando con una dilucióninicial de 1:10, se preparó una serie de diluciones (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1:20480.
Como criterio de valoración de la titulación se tomó la dilución más elevada que mostró una inhibición completa(100%) de la hemaglutinación. Todos los análisis se realizaron por duplicado.
I.3.2. Análisis de inhibición de la neuraminidasa
El análisis se realizó en placas de microtitulación recubiertas con fetuina. Se preparó una serie de dilución por 2 delantisuero y se mezcló con una cantidad normalizada de H3N2, H1N1 del virus de la gripe A o el virus de la gripe B. La prueba se basó en la actividad biológica de la neuraminidasa que enzimáticamente libera ácido neuramínico apartir de la fetuina. Tras la escisión del ácido neuramínico terminal se descubrió ß-D-galactosa-N-acetilgalactosamina. A los pocillos se añadió aglutinina de cacahuete de Arachis hypogaea marcado con peroxidasa derábano (HRP), que se une de forma específica a las estructuras de galactosa. La cantidad de aglutinina unida sepuede detectar y cuantificar en una reacción de sustrato con tetra-metilbenzidina (TMB), Como título de IN se indicó la dilución de anticuerpos más elevada que todavía inhibía la actividad de neuraminidasa viral en al menos un 50%.
I.3.3. Análisis de anticuerpos neutralizantes
Las mediciones de los anticuerpos neutralizantes se llevaron a cabo en muestras de suero congeladasdescongeladas. La neutralización de virus por los anticuerpos contenidos en el suero se determinó en un análisis demicroneutralización. Los sueros se usaron sin posterior tratamiento en el análisis. Cada suero se analizó portriplicado. Una cantidad normalizada de virus se mezcló con diluciones seriadas de suero y se incubó para permitir launión de los anticuerpos al virus. A continuación a la mezcla de virus y antisuero se añadió una suspensión celularque contenía una cantidad definida de células MDCK y se incubó a 33 a.C. Tras el periodo de incubación, lareplicación se visualizó mediante hemaglutinación de eritrocitos de pollo. El título de neutralización del 50% de un suero se calculó mediante el procedimiento de Reed and Muench.
I.3.4. La inmunidad mediada por células se evaluó mediante citometría de flujo de citocinas (CFC)
Las células T DC4 y CD8 de sangre periférica específicas del antígeno se pueden reestimular in vitro para producirIL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN si se incuban con su correspondiente antígeno. En consecuencia, las células T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar por citometría de flujo tras marcaje con inmunofluorescenciaconvencional del fenotipo celular, así como producción de citocinas intracelulares. En el presente estudio, comoantígeno para reestimular las células T específicas de la gripe se usaron el antígeno de la vacuna de la gripe asícomo péptidos derivados de proteínas específicas de la gripe. Los resultados se expresaron en forma de unafrecuencia de células T CD4 o CD8 positivas para citocina(s) dentro de la subpoblación de células T CD4 o CD8.
I.3.5. Procedimientos estadísticos
I.3.5.1. Criterios de valoración principales
•
Porcentaje, intensidad y relación con la vacuna de los signos y síntomas locales y generales solicitadosdurante un periodo de seguimiento de 7 días (es decir, día de la vacunación y 6 días posteriores) después de la vacunación y globales.
•
Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no solicitados durante un periodo de seguimiento de 21 días (es decir, día de la vacunación y 20 días posteriores) después de la vacunación y globales.
•
Existencia de acontecimientos adversos serios durante el estudio completo.
I.3.5.2. Criterios de valoración secundarios
Para la respuesta inmunitaria humoral:
Variables observadas:
•
En los días 0 y 21: títulos de anticuerpos de inhibición de la hemoaglutinación (HI) y NI en suero, ensayadospor separado frente a cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).
•
En los días 0 y 21: títulos de anticuerpos neutralizantes, ensayados por separado frente a cada una de lastres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna.
Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95%):
•
Títulos en media geométrica (GMT) de anticuerpos HI en suero con intervalos de confianza del 95% (95% CI)antes y después de la vacunación.
•
Proporciones de seroconversión* con 95% CI el día 21.
•
Factores de conversión** con 95% CI en el día 21.
•
Proporciones de seroprotección*** con 95% CI en el día 21.
•
GMT de anticuerpo NI en suero (con intervalos de confianza del 95%) en todos los momentos puntuales
* La proporción de seroconversión se define como el porcentaje de vacunados que tienen al menos un aumento de 4 veces en los títulos HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna.
** El factor de conversión se define como el aumento en veces en GMT HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna.
*** La proporción de protección se define como el porcentaje de vacunados con un título HI en suero = 40 despuésde la vacunación (para cada cepa de vacuna) que se acepta habitualmente como indicadora de protección.
Para la respuesta inmunitaria mediada por células (CMI)
Variable observada
En los días 0 y 21: frecuencia de células T CD4/CD8 positivas a citoquinas por 106 en diferentes ensayos. Cada ensayo cuantifica la respuesta de células T CD4/CD8 a:
•
Antígeno peptídico (pf) de la gripe (la naturaleza y origen precisos de estos antígenos tiene que proporcionarse/explicarse).
•
Antígeno de la gripe dividido (sf).
•
Antígeno de la gripe completo (wf.)
Variables derivadas:
•
células que producen al menos dos citoquinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNy, TNFa)
•
células que producen al menos CD40L y otra citoquina (IL-2, TNFa, IFNy)
•
células que producen al menos IL-2 y otra citoquina (CD40L, TNFa, IFNy)
•
células que producen al menos IFNy y otra citoquina (IL-2, TNFa, CD40L)
•
células que producen al menos TNFa y otra citoquina (IL-2, CD40L, IFNy)
I.3.5.3. Análisis de Inmunogenicidad
El análisis de inmunogenicidad se basó en la cohorte vacunada total. Para cada grupo de tratamiento, se calcularonlos siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95%):
•
Títulos en media geométrica (GMT) de títulos de anticuerpo HI y NI en los días 0 y 21.
•
Títulos en media geométrica (GMT) de títulos de anticuerpo neutralizante en los días 0 y 21.
•
Factores de conversión en el día 21.
•
Proporciones de seroconversión (SC) en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados que tienen al menosun aumento de 4 veces en los títulos HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0.
•
Proporciones de protección en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados con un título HI en suero = 1:40.
•
La frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 que secretan en respuesta se resumió (estadística descriptiva) para cada grupo de vacunación, en cada momento puntual (Día 0, Día 21) y para cada antígeno (de la gripe peptídico (pf), dela gripe dividido (sf) y de la gripe completo (wf)).
•
Estadística descriptiva en la diferencia individual entre respuestas en momentos puntuales (posterior-anterior) para cada grupo de vacunación y cada antígeno (pf, sf y wf) en cada uno de los 5 diferentes ensayos.
•
Se usó un ensayo no paramétrico (ensayo de Kruskall-Wallis) para comparar las diferencias de localización entre los 3 grupos y se calculó el valor p estadístico para cada antígeno en cada uno de los 5 ensayos diferentes. Todoslos ensayos de significancia tuvieron dos extremos. Los valores p menores o iguales a 0,05 se consideraron como estadísticamente significativos.
Ejemplo II - Preparación del adyuvante liposomal MPL/QS21
II.3 Preparación de suspensión líquida de MPL
Se prepara la carga líquida de MPL (como se usa en todo el documento es una abreviatura de 3D-MPL, es decir,monofosforil lípido 3-O-desacilado) a partir de MPL® en polvo liofilizado. La carga líquida de MPL es una dispersiónacuosa concentrada estable (alrededor de 1 mg/ml) del material sin procesar, que está listo para su uso para una formulación de vacuna o adyuvante. Se proporciona una representación esquemática del procedimiento de preparación en la Figura 1.
Para un tamaño de lote máximo de 12 g, se lleva la preparación de carga líquida de MPL a recipientes de vidrioestériles. La dispersión de MPL consta de las siguientes etapas:
-
se suspende el polvo de MPL en agua para inyección.
-
se disgrega cualquiera agregado grande calentando (tratamiento térmico).
-
se reduce el tamaño de partícula entre 100 nm y 200 nm por microfluidización.
-
se precarga la preparación en una unidad de prefiltro Sartoclean, 0,8/0,65 μm.
-
se filtra hasta esterilidad la preparación a temperatura ambiente (unidad P Sartobran, 0,22 μm).
Se liofiliza el polvo de MPL por microfluidización produciendo una dispersión acuosa coloidal estable (tamaño departícula de MPL menor de 200 nm). El polvo liofilizado de MPL se dispersa en agua para inyección para obteneruna suspensión gruesa de 10 mg/ml. La suspensión después experimenta un tratamiento térmico con agitación.Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se inicia el procedimiento de microfluidización para disminuir eltamaño de partícula. La microfluidización se realiza usando un aparato Microfluidics M110EH, por circulacióncontinua de la dispersión a través de una cámara de interacción de microfluidización, a una presión definida durante una cantidad mínima de pases (cantidad de ciclos: nmin).La duración de la microfluidización, que representa lacantidad de ciclos, se calcula en base al caudal medido y el volumen de dispersión. En un equipo dado a unapresión dada, el caudal resultante puede variar de una cámara de interacción a otra, y durante todo el ciclo de unacámara de interacción particular. En el presente ejemplo, la cámara de interacción usada es del tipo F20Y Microfluidics. Como la eficacia de la microfluidización está unida a la presión acoplada - caudal, el tiempo deprocesado puede variar de un lote a otro. El tiempo necesario para 1 ciclo se calcula en base al caudal. El caudal aconsiderar es el caudal medido con agua para inyección justo antes de la introducción de MPL en el aparato. Unciclo se define como el tiempo (en minutos) necesario para que el volumen total de MPL pase una vez a través delaparato. El tiempo necesario para obtener n ciclos se calcula del siguiente modo:
n x cantidad de MPL a tratar (ml)/caudal (ml/min)
La cantidad de ciclos, por tanto, se adapta en consecuencia. La cantidad mínima de ciclos a realizar (nmin) sedescribe para el equipo preferido y cámaras de interacción usados. La cantidad total de ciclos a procesar sedetermina por el resultado de una medida del tamaño de partícula realizada después de nmin ciclos. Se define un límite del tamaño de partícula (dlim) en base a los datos históricos. La medida se realiza por la técnica de espectroscopía de correlación de fotones (PCS), y dlim se expresa como un resultado unimodal (Zmedio). En estelímite, la microfluidización puede detenerse después de nmin ciclos. Por encima de este límite, la microfluidización continúa hasta que se obtiene una reducción del tamaño satisfactorio, para un máximo de otros 50 ciclos.
Si la filtración no tiene lugar inmediatamente después de la microfluidización, el MPL dispersado se almacena de +2 a +8ºC en espera de la transferencia al área de filtración.
Después de la microfluidización, la dispersión se diluye con agua para inyección, y se filtra hasta esterilidad a travésde un filtro de 0,22 μm con flujo laminal. La concentración final de MPL es 1 mg/ml ((0,80-1,20 mg/ml).
II.2 Preparación de MPL/QS21 adyuvante liposomal
Este adyuvante, llamado AS01, comprende 3D-MPL y QS21 en una forma inactivada con colesterol, y se preparócomo se describe en el documento WO 96/33739, que se incorpora en el presente documento como referencia. Enparticular el adyuvante AS01 se preparó esencialmente como en el Ejemplo 1.1 del documento WO 96/33739. Eladyuvante AS01B comprende: liposomas, que a su vez comprende dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), colesterol y 3DMPL [en una cantidad de 1000!g DOPC, 250 !g colesterol y 50 !g 3D-MPL, cada valor dado aproximadamente por dosis de vacuna], QS21 [50 !g/dosis], tampón fosfato NaCl y agua hasta un volumen de 0,5ml.
El adyuvante AS01E comprende los mismos ingredientes que AS01B pero a una concentración menor en unacantidad de 500 μg DOPC, 125 μg colesterol, 25 μg 3D-MPL y 25 μg QS21, tampón fosfato NaCl y agua hasta unvolumen de 0,5ml.
En el procedimiento de producción de liposomas que contienen MPL los DOPC (Dioleil fosfatidilcolina), colesterol y MPL se disuelven en etanol. Se forma una película lipídica mediante evaporación de disolvente al vacío. Se añadeSolución salina tamponada con fosfato (Na2HPO4 9 mM, KH2PO4 41 mM, NaCl 100 mM) a pH 6,1 y la mezcla sesomete a prehomogeneización seguida de homogeneización a alta presión a 15.000 psi (aproximadamente 15 a 20ciclos). Esto conduce a la producción de liposomas que se filtran en esterilidad a través de una membrana de 0,22!m en un área aséptica (clase 100). El producto estéril se distribuye después en recipientes de vidrio estériles y sealmacena en una habitación fría (+2 a +8°C).
De esta manera los liposomas producidos contienen MPL en la membrana (el “MPL in” realización del documentoWO 96/33739).
QS21 se añade en solución acuosa a la concentración deseada.
Ejemplo III - Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe con adyuvante y sin adyuvante en hurones
III.1. Fundamento y objetivos
La inyección de la gripe en un modelo de hurón mimetiza estrechamente la gripe de humanos, con respecto a lasensibilidad a infección y la respuesta clínica.
El hurón es extremadamente sensible a infección con virus tanto de la gripe A como B sin adaptación anterior a cepas virales. Por lo tanto, proporciona un excelente sistema de modelo para estudios de protección conferida porvacunas contra la gripe administradas.
Este estudio investigó la eficacia de diversas vacunas Divididas Trivalentes, con o sin adyuvante, para reducir lossíntomas de enfermedad (temperatura corporal) y supresión viral en secreciones nasales de hurones estimuladoscon cepas homólogas.
El objetivo de este experimento fue demostrar la eficacia de una vacuna contra la gripe con adyuvante en comparación con la vacuna sencilla (sin adyuvante).
Los criterios de valoración fueron:
1) criterio de valoración principal: Reducción de la supresión viral en lavados nasales después de la estimulación homóloga 2) criterios de valoración secundarios: Análisis de la respuesta humoral por títulos de HI.
5 III.2. Diseño experimental
III.2.1. Tratamiento/grupo (Tabla 1)
Se obtuvieron hurones hembra (Mustela putorius furo) con edad de 14-20 semanas de MISAY Consultancy (Hampshire, UK). Los hurones se prepararon en el día 0 con la cepa heterosubtípica H1N1 A/Estocolmo/24/90 (4Log TCID50/ml). En el día 21, a los hurones se les inyectó por vía intramuscular una dosis humana completa (dosis
10 de vacuna de 500 !g, 15 !g de HA/cepa) de una combinación de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97. Los hurones después se estimularon en el día 41 por vía intranasal conuna cepa heterosubtípica H3N2 A/Wyoming/3/2003 (4,51 Log TCID50/ml).
Tabla 1
Grupo
Antígeno(s) +dosificación Formulación + dosificación Comentarios (programa/día/estimulación) In/Re Otros tratamientos
1
Sencilla trivalente HD completo: 15!g de HA/cepa IM; Día 21 In Preparación con H1N1 (A/Estocolmo/24/90)Día 0
2
trivalente/ MPL-QS21 en liposomas HD completo: 15!g de HA/cepa IM; Día 21 In Preparación con H1N1 (A/Estocolmo/24/90)Día 0
6 hurones/grupo. In/Re = Individuo/Reserva
15 III.2.2. Preparación de las formulaciones de vacuna (Tabla 2)
Formulación 1: Formulación sencilla trivalente (sin adyuvante):
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contieneTween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a aguapara inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 17,5 !g de la
20 cepa B con agitación durante 10 minutos entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos a temperatura ambiente y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación 2: Trivalente contra la Gripe Dividida con adyuvante MPL/QS21 en liposomas:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contieneTween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua25 para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 17,5 !g de la cepa B con agitación durante 10 minutos entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Se añadeuna mezcla previa del llamado “DQS21-MPLin a la formulación que se agita después durante un mínimo de 15 minutos. La mezcla previa de DQS21-MPLin es una mezcla de liposomas (preparada de DOPC 40mg/ml, colesterol10mg/ml, MPL 2mg/ml) y el inmunoestimulante QS21. Esta mezcla previa se incuba durante un mínimo de 15
30 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La concentración de MPL y QS21 en la formulación final es 50 μg por 500 μl. La formulación se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Observación: En cada formulación, se añade PBS concentrado 10 veces hasta alcanzar isotonicidad y estáconcentrado 1 vez en el volumen final. El volumen de H2O se calcula para alcanzar el volumen objetivo.
Tabla 2: Composición final de las formulaciones 1 y 2 (Formulaciones preparadas con cepas divididas (para 500 μl)) III.2.3. Lecturas (Tabla 3)
Formulación
Antígeno Tween 80 Triton X100 VES DOPC Colesterol MPL QS21
1
H1N1:15 μgH3N2: 15 μgB: 17,5 μg 375 μg 55 μg 50 μg - - - -
2
H1N1:15 μgH3N2: 15 μgB: 17,5 μg 375 μg 55 μg 50 μg 1 mg 250 μg 50 μg 50 μg
Tabla 3
Lectura
Punto temporal Tipo de muestra Procedimiento de análisis
Supresión viral
D+1 a D+7 Después de la estimulación Lavados nasales Titulación
Anticuerpos anti-HI (Títulos de HI)
Antes, después de lapreparación, Después de lainmunización, Después de la estimulación Sueros Ensayo de inhibición de lahemoaglutinación
III.3. Resultados
En las Figuras 1 y 2 se proporciona una representación esquemática.
III.3.1. Inmunidad humoral (Figura 1).
Se detectó la actividad de inhibición de hemoaglutinación frente a las cepas de vacuna contra H3N2 (cepa devacuna A/Panamá/2007/99 y cepa de estimulación A/Wyoming/3/2003) en sueros de 6 animales por grupo en el Día17 después de la Inmunización heteróloga intranasal y en el Día 21 después de la inmunización y Día 13 Despuésde la estimulación.
Se determinaron títulos de anticuerpos anti-hemaglutinina para las tres cepas de virus de la gripe usando el ensayo de inhibición de la hemoaglutinación (HI) como se detalla en el Ejemplo I.2.1. las conclusiones son las siguientes:
•
Para las dos cepas de A/H3N2 y para todos los grupos, se observó un refuerzo de Títulos de HI en todos los grupos vacunados después de la inmunización.
•
Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, se observaron Títulos de HI anti-A/Panamá/2007/99 mayores estadísticamente significativos cuando la vacuna trivalente dividida se potenciaba con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la vacuna trivalente dividida sencilla.
•
Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, solamente la trivalente divida potenciada con MPL/QS21 en liposomas fue capaz de aumentar de forma significativa los Títulos de HI a la cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reactividad cruzada antes de la estimulación con esta cepa de deriva).
•
Después de la estimulación con A/Wyoming3/2003, se observó un aumento significativo de Títulos de HIanti-A/Wyoming/3/2003 para trivalente dividida sencilla y trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 enliposomas.
•
Para cepas A/Nueva Caledonia/20/99 y B/Shangdong/7/97, se observaron Títulos de HI mayoresestadísticamente significativos cuando la trivalente dividida se potenciaba con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la vacuna trivalente dividida sencilla.
III.3.2. Diseminación viral (Figura 3).
Se realizó titulación viral de lavados nasales en 6 animales por grupo como se detalla en el Ejemplo I.2.3. Los lavados nasales se realizaron mediante administración de 5 ml de PBS en ambas fosas nasales en animales despiertos. La inoculación se recogió en una placa de Petri y se colocó en recipientes para muestra a -80°C.
•
Dos días después de la estimulación, se observó diseminación viral menor estadísticamente significativa con Trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas en comparación con Trivalente dividida sencilla.
�
El día49 (7 días después de la estimulación), no se detectaron virus en los lavados nasales.
III.3.3. Conclusión del experimento
Se observaron respuestas humorales mayores (Títulos de HI) con Trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la Trivalente dividida sencilla para las 4 cepas.
Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, solamente la trivalente divida potenciada con MPL/QS21 enliposomas fue capaz de aumentar de forma significativa Títulos de HI a la cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003(reactividad cruzada antes de la estimulación con esta cepa).
MPL/QS21 en formulaciones de liposomas mostró beneficio adicional en términos de eficacia protectora en hurones (supresión viral menor después de estimulación heteróloga). La reacción cruzada observada después de la inmunización con Trivalente dividida MPL/QS21 en liposomas contra la cepa de deriva usada para la estimulaciónparecía estar en correlación con el efecto de protección observado en estos hurones.
Ejemplo IV -Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe con adyuvante y sin adyuvante en ratones C57Bl/6 inmunizados
IV.1. Diseño experimental y objetivo
Ratones C57BI/6 inmunizados con cepas heterólogas se usaron para este experimento.
El propósito era comparar las respuestas inmunes humoral (Títulos de HI) y CMI (ICS, tinción de citoquinaintracelular) inducidas por una vacuna trivalente dividida de GlaxoSmithKline disponible en el mercado (FluarixTM)frente a una Vacuna de subunidad trivalente (vacuna AgrippalTM de Chiron) así como la respuesta CMI obtenida con estas vacunas potenciadas con Liposomas que contienen 3D-MPL en solitario, DQS21 (QS21 en liposomas, es
5 decir, QS21 destoxificado) en solitario o MPL/QS21 en liposomas. En el ejemplo más adelante en el presente documento, se prepararon formulaciones a partir de las monocargas divididas hasta alcanzar la misma composiciónque en la vacuna Fluarix y no de dosis de Fluarix disponible en el mercado. Las formulaciones obtenidas sedenominaron “Similares a Fluarix”.
IV.1.1. Tratamiento/grupo
10 Se obtuvieron ratones C57Bl/6 de 6-8 semanas de edad de Harlan Horst, Países Bajos. Los ratones se prepararon en el día 0 con cepas heterosubtípicas (5 μg HA completa inactivada H1N1 A/Pekín/262/95, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shangdong/7/97). En el día 28, a los ratones se les inyecto por vía intramuscular 1,5 μg de HA Trivalente dividida (A/Nueva Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) sencilla o con adyuvante(véase grupos en Tablas 4 a 6 a continuación).
15 Tabla 4
Gr
Antígeno / Formulación otro tratamiento
1
Trivalente dividida* / Sencilla (sin adyuvante) = Similar a Fluarix Inmunización heteróloga D0
2
Trivalente dividida* / liposomas que contienen 3D-MPL Inmunización heteróloga D0
3
Trivalente dividida* / DQS21 Inmunización heteróloga D0
4
Trivalente dividida* / MPL/QS21 en liposomas Inmunización heteróloga D0
5
Aggripal TM (subunidad) Inmunización heteróloga D0
6
Aggripal TM (subunidad) / liposomas que contienen 3D-MPL Inmunización heteróloga D0
7
Aggripal TM (subunidad) / DQS21 Inmunización heteróloga D0
8
Aggripal TM (subunidad) / MPL/QS21 en liposomas Inmunización heteróloga D0
9
PBS Inmunización heteróloga D0
* Similar a Fluarix. 16 ratones/grupo
IV.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna
Formulación para el grupo 1:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene
20 Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa Bcon 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y sealmacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 2:
25 Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a aguapara inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa Bcon 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Se añaden liposomasque contienen 3D-MPL concentrado (preparado a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml)
30 para alcanzar una concentración final de MPL de 50 μg por dosis. La formulación se agita después un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 3:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contieneTween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua35 para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa B con 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Después se añade una mezcla previa preparada a partir de liposomas (preparada a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml) y QS21denominada “DQS21” hasta alcanzar una concentración de QS21 de 50 μg por dosis. Esta mezcla previa se incubaal menos durante 15 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La formulación se agita durante un
40 mínimo de 15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 4:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contieneTween 80, Triton-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a aguapara inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa B45 con 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Después se añade una mezcla preparada a partir de liposomas que contienen 3D-MPL (preparada a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) y QS21 hasta alcanzar concentraciones de QS21 y MPL 50 μg por dosis. Esta mezcla se incuba al menos durante 15 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La denominada formulación “trivalente dividida MPL/QS21 en liposomas” se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a
50 4°C si no se administra directamente.
Observación: en los grupos 1 a 4, se añade PBS concentrado 10 veces hasta alcanzar isotonicidad y está concentrado 1 vez en el volumen final. El volumen de H2O se calcula para alcanzar el volumen diana.
Formulación para el grupo 5:
Se mezcla una dosis de AggripalTM con un volumen igual de PBS mod pH 7,4. La formulación se agita durante un 5 mínimo de 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 6:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añaden después en agitación liposomas que contienen 3D-MPL (preparados de 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol, 2 mg/ml 3D-MPL) hasta alcanzar el equivalente de50 !g de MPL por dosis. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se
10 administra directamente.
Observación: Se añade PBS para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de laformulación.
Formulación para el grupo 7:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añade después en agitación una premezcla de liposomas
15 (hechos de 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol) y QS21, “DQS21” así llamado hasta alcanzar el equivalente de 50 !g de QS21. Esta premezcla se incuba durante al menos 15 minutos previamente a la adición. La formulación se agita mínimo 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
Observación: Se añade PBS para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de laformulación.
20 Formulación para el grupo 8:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añade después en agitación a la formulación una premezcla llamada de “DQS21-MPLin”. La premezcla de DQS21-MPLin es una mezcla de liposomas (hechos de 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol, 2 mg/ml de MPL) y el inmunoestimulante QS21. Esta premezcla se incuba durante almenos 15 minutos previamente a la adición de la mezcla de Aggripal/PBS. La cantidad de MPL y QS21 en la
25 formulación es 50 !g cada uno. La formulación se agita mínimo 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
Observación: Se añade PBS para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de laformulación.
Tabla 5: Composición final de las formulaciones 1 a 4 preparadas con cepas divididas (para 1 ml)
Grupo
Antígeno Tween 80 Triton X-100 VES DOPC Coles-terol MPL QS21
1
H1N1: 15 !g H3N2: 15 !g B: 17.5 !g 750 !g 110 !g 100 !g _ _ _ _
2
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g 50 !g -
3
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g - 50 !g
4
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g 50 !g 50 !g
Tabla 6: Composición final de las formulaciones 5 a 8 preparadas con vacuna AggripalT (1 ml)
Grupo
Antígeno DOPC Colesterol MPL QS21
5
1 dosis de vacuna Aggripal _ _ _ _
6
Idéntico a 5 1 mg 250 !g 50 !g -
7
Idéntico a 5 1 mg 250 !g - 50 !g
8
Idéntico a 5 1 mg 250 !g 50 !g 50 !g
IV.1.3. Lecturas (Tabla 7)
Tabla 7
Lectura
Punto del tiempo Tipo de muestra In/Po Procedimiento de análisis
Anticuerpos anti-HI (títulos HI)
Día 21 Postinmunización (Día 49) Suero In Ensayo de inhibición de la hemaglutinación
CD4,CD8, IL-2, IFN-y (FACS)
Día 7 Postinmunización (Día 35) PBL Po Tinción de citoquinas intracelulares (ICS)
In= Individual / Po= combinación
IV. 2. Resultados
IV.2.1.Respuesta humoral (títulos HI 21 días post-inmunización)
Respuestas humorales por títulos HI - Figura 4
Se detectó la actividad de inhibición de la hemaglutinación contra las tres cepas de la vacuna (A/Nueva Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) en el suero de 8 animales por grupo en el día 21 postinmunización.
•
Comparado con ratones inmunizados con PBS, se observó un aumento en los títulos HI después de inmunización con todos los candidatos de vacuna de la gripe analizados para todas las tres cepas (vacunadividida trivalente o de subunidades trivalente).
•
Para todas las tres cepas, se observaron títulos HI más altos estadísticamente significativos en ratonesinmunizados con la dividida trivalente potenciada con DQS21 sola MPL/QS21 en liposomas comparados con ratones inmunizados con la sencilla de la gripe dividida trivalente o potenciada con liposomas que contenían3D-MPL solo. La clasificación de la respuesta humoral fue como sigue: (MPL/QS21 en liposomas = DQS21solo) > (liposomas que contenían 3D-MPL solo = sencilla) > PBS
•
Para todas las tres cepas, se observaron títulos HI más altos estadísticamente significativos en ratonesinmunizados con la de subunidades trivalente potenciada con DQS21 solo, liposomas que contenían·3D-MPL solo o MPL/QS21 en liposomas comparados con ratones inmunizados con la sencilla dividida trivalente.La clasificación de la respuesta humoral fue como sigue: (MPL/QS21 en liposomas = DQS21 solo = Liposomas que contenían 3D-MPL solo) > Sencilla > PBS.
•
La dividida trivalente y la de subunidades trivalente inducían títulos HI similares cuando las formulaciones no estaban potenciadas o se potenciaron con DQS21 solo o MPL/QS21 en liposomas.
IV.2.2.Respuesta inmunitaria mediada por células (ICS al 7º día de la inmunización).
Respuestas de células T CD4 - Figura 5
Se recogieron las PBMC de 8 ratones por grupo a 7º día de la inmunizaci y se analizaron en 4 conjuntos de 2ratones/grupo. En términos de células T CD4+ específicas del virus completo de la gripe (que expresan IL-2, IFN-y yambas citocinas):
•
Cualquiera que sea la formulación, se observaron respuestas de células T CD4+ idénticas entre las vacunasdividida trivalente y de subunidades trivalente.
•
Se observaron respuestas de células T CD4+ más altas para las formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) potenciadas con MPL/QS21 en liposomas cuando se compararon con formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) sencillas o potenciadas con liposomas que contenían 3D-MPL solo oDQS21 solo.
•
Para la respuesta celular inducida por una formulación trivalente (dividida o de subunidades), existe unefecto sinérgico de liposomas que contienen 3D-MPL + DQS21 comparado con DQS21 solo o liposomas quecontienen 3D-MPL solo.
•
La clasificación para la respuesta celular fue como sigue: MPL/QS21 en liposomas > (liposomas que contienen 3D-MPL solo = DQS21 solo = sencilla = PBS).
IV.3. Resumen de resultados y conclusiones
•
Para todas las tres cepas, se observaron títulos HI más altos estadísticamente significativos en ratonesinmunizados con formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) potenciadas con DQS21 solo oMPL/QS21 en liposomas comparados con ratones inmunizados con formulaciones trivalentes (divididas o desubunidades) sencillas. Los liposomas que contenían 3D-MPL solo parecían inducir respuesta humoral másalta cuando se formuló con la de subunidades trivalente que con la dividida trivalente.
•
Cualquiera que sea la formulación, se obtuvieron respuestas de células T CD4+ similares para la dividida trivalente (Fluarix) y la de subunidades trivalente (Aggripal).
•
Las formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) potenciadas con MPL/QS21 en liposomasinducían respuestas de células T CD4+ más altas comparadas con formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) sencillas o potenciadas con liposomas que contenían 3D-MPL solo o QS21 en liposomas(DQS21) solo.
Ejemplo V - Comparación preclínica de una vacuna que contiene una preparación de antígeno de la gripedividido potenciada con 3D-MPL/QS21 en una formulación liposomal (3D-MPL a dos concentraciones diferentes).
V.1 - Ratones.
V.1.1 - Diseño experimental y objetivo.
Se usaron para este experimento ratones C57B1/6 inmunizados con cepas heterólogas. El propósito era analizar lasrespuestas inmunes humorales (títulos HI) y CMI (ICS, tinción de citoquinas intracelulares) inducidas por una vacuna dividida trivalente disponible en el mercado en GlaxoSmithKline (FluarixTM) en una forma no potenciada, y cuando sepotenció con liposomas que contenían dos concentraciones diferentes de 3D-MPL y QS21.
V.1.2 Tratamiento/Grupo
Se obtuvieron ratones hembra C57B1/6 de 8 semanas de edad de Harlan Horst, Países Bajos. Los ratones seinmunizaron de forma intranasal en el día 0 con cepas heterosubtípicas (A/Beijing/262/95 inactivada completa, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shandong/7/97). En el día 28, se les inyectó a los ratones de forma intramuscular la dividida(A/Nueva Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu) sencilla o potenciada con dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes en formulaciones liposomales (véase los grupos en la tabla 8 a continuación).
Tabla 8
Grupo
Antígeno(s) + dosificación Formulación + dosificación Otros tratamientos
1
Gripe dividido trivalente 1,5 !g/cepa/50 !l Sencilla Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
2
Gripe dividido trivalente 1,5 !g/cepa/50 !l Liposomas que contienen 50 !g de 3D-MPL por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
3
Gripe dividido trivalente 1,5 !g/cepa/50 !l 50 !g de DQS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
4
Gripe dividido trivalente 1,5 !g/cepa/50 !l 25 !g de MPL y QS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
5
Gripe dividido trivalente 1,5 !g/cepa/50 !l 50 !g de MPL y QS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
6
PBS Ninguno Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos DO de forma intranasal
10 Las formulaciones se prepararon como en el ejemplo IV.
V.1.3 - Resultados
Respuestas humorales por títulos HI - Figura 24.
Se detectó la actividad de inhibición de la hemaglutinación contra las tres cepas de la vacuna en el suero de 9 15 animales/grupo en el día 21 post inmunización.
•
Comparado con ratones inmunizados con PBS, se observó un aumento en los títulos HI después de inmunización con todos los candidatos de vacuna de la gripe analizados para todas las tres cepas
•
Para todas las tres cepas, se observaron títulos HI más altos estadísticamente significativos en ratones
inmunizados con la dividida trivalente potenciada con MPL y QS21 a cualquier concentración comparada con20 ratones inmunizados con la sencilla dividida de la gripe trivalente (valor p máx. = 0,03).
� No se observó diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos de adyuvantes liposomales.
Respuesta inmunitaria mediada por células (ICS en el día 7 post-inmunización) - Figure 25.
Se recogieron las PBMC de 9 ratones/grupo 7 días post-inmunización y se analizaron en tres conjuntos de 3 ratones/grupo. En términos de células T CD4+ específicas del virus de la gripe completo que expresan IL-2, IFN-y o 25 ambas citoquinas:
Como se puede ver en la figura 25 las respuestas específicas de células T CD4+ IFN-y más altas se obtuvieron después de la inmunización con la dividida trivalente potenciada con la concentración más alta de inmunoestimulantes. Sin embargo, las respuestas de células T IL2 e IL2+ IFN-y fueron similares entre las dos concentraciones de inmunoestimulantes.
30 Ejemplo VI - Ensayo clínico en una población anciana por encima de 65 años con una vacuna que contiene una preparación de antígeno de la gripe dividido potenciada con MPL/QS21 en una formulación liposomal (3D-MPL a dos concentraciones diferentes).
VI.1. Diseño del estudio y objetivos
Un estudio de fase I/II abierto, aleatorizado, para demostrar la no inferioridad en términos de respuesta inmunitaria 35 mediada por células de las vacunas candidatas de la gripe de GlaxoSmithKline Biologicals que contienen diversos adyuvantes administradas a una población anciana (65 años de edad y mayor) comparadas con Fluarix™ (conocida como a-Rix™ en Bélgica) administrada en adultos (18-40 años).
Se asignaron cuatro grupos paralelos:
•
75 adultos (18-40 años de edad) en un grupo de control que recibieron una dosis de Fluarix™ (grupo deFluarix)
•
200 sujetos ancianos (65 años de edad y mayores) aleatorizados 3:3:2 en tres grupos:
-
Un grupo con 75 sujetos que recibieron la vacuna de la gripa potenciada con AS01B
-
Un grupo con 75 sujetos que recibió la vacuna de la gripe potenciada con AS01E
-
Grupo de gripe de referencia con 50 sujetos que recibieron una dosis de Fluarix™
Objetivo principal
El objetivo principal es demostrar la no inferioridad 21 días post-vacunación de las vacunas potenciadas de la gripe administradas a sujetos ancianos (65 años de edad y mayores) comparadas con Fluarix™ administrado en adultos (18-40 años de edad) en términos de frecuencia de linfocitos T CDR específicos de la gripe que producen al menosdos citoquinas diferentes (CD40L, IL-2, TNF-a, IFN-y).
Objetivos secundarios
Los objetivos secundarios son:
1) Evaluar la seguridad y reactogenicidad de la vacunación con las vacunas de la gripe candidatas potenciadasdurante 21 días posteriores a la administración intramuscular de la vacuna en sujetos ancianos (65 años de edad y mayores). Se usa FluarixT como referencia.
2) Evaluar la respuesta inmunitaria humoral (título anti-hemaglutinina) 21, 90 y 180 días después de la vacunación con las vacunas candidatas de la gripe potenciadas. Se usa FluarixT como referencia.
Objetivo terciario
El objetivo terciario es evaluar la respuesta inmunitaria mediada por células (producción de IFN-y, IL-2, CD40L, y TNF-a y respuesta de células B de memoria) 21, 90 y 180 días después de la vacunación con las vacunas de lagripe potenciadas. Se usa FluarixT como referencia.
VI.2. Composición de vacuna y administración
Se han usado dos adyuvantes diferentes:
1.
AS01B, un adyuvante basado en liposomas que contiene 50 !g MPL y QS21
2.
AS01E, una formulación de AS01B diluida dos veces.
Control: dosis completa de Fluarix™ por administración IM.
Todas las vacunas están destinadas a administración intramuscular. Las cepas usadas en las cinco vacunas eranlas que había recomendado la OMS para la temporada 2005-2006 en el hemisferio norte, es decir, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Nueva California/7/2004 (H3N2) y B/Jiangsu/10/2003.
Los tres antígenos de viriones divididos inactivados (volúmenes monovalentes) usados en la formulación de lavacuna candidata de la gripe potenciada, son exactamente los mismos que los ingredientes activos usados en laformulación de la vacuna de la gripe inactivada de viriones divididos Fluarix™/a-Rix™ - GSK Bio’s comercial. Se derivan de virus crecidos en huevos. Las cepas de la gripe son las recomendadas para la temporada 2005/2006,como se usan en la formulación de la Fluarix™/a-Rix™ 2005/2006 comercial.
Las cepas usadas en las tres vacunas son las que han sido recomendadas por la OMS para la temporada 2005/2006 en el hemisferio norte, es decir
•
A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116
•
A/Nueva York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157
•
B/Jiangsu/10/2003
Como FluarixT/a-RixT, la vacuna potenciada contiene 15 !g de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de la gripe por dosis.
VI.2.1.Descripción de los lotes de vacunas potenciadas con AS01B
La vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B es una vacuna de 2 componentes constituida por antígenosde viriones divididos inactivados trivalentes concentrados presentados en un vial de vidrio tipo I y por un vial devidrio tipo I que contiene el adyuvante AS01B. En el momento de la inyección, se retira el contenido del vial del adyuvante y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar el contenido, se retira con la jeringa y la aguja se reemplaza por una agujaintramuscular. La aguja usada se reemplaza por una aguja intramuscular y el volumen se corrige a 1 ml. Una dosisde la vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B reconstituida corresponde a 1 ml.
La vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B es una vacuna sin conservantes.
VI.2.2.Composición del lote clínico potenciado con AS01B
Una dosis de la vacuna de la gripe potenciada con AS01B corresponde a 1 ml. Su composición se da en la Tabla 8.Contiene 15 !g de HA de cada cepa del virus de la gripe como en la vacuna FluarixTM/a-Rix® registrada.
Tabla 8 - Composición (componentes de gripe y adyuvantes) de la vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B reconstituida
Componente
Cantidad por dosis Referencia analítica
INGREDIENTES ACTIVOS Viriones divididos inactivados - A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 - A/Nueva York/55/2004 (H3N2) NYMC X157 - B/Jiangsu/10/2003 15 !g HA15 !g HA15 !g HA
Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158
ADYUVANTE AS01B
- Liposomas• dioleil fosfatidilcolina (DOPC) • Colesterol • MPL
1000 !g250 !g50 !g GSK Bio 3217 Ph. Eur. 0993 GSK Bio 2972
- QS21
50 μg GSK Bio 3034
10 VI.2.3.Procedimiento de producción del lote de vacuna potenciada con AS01B
La fabricación de la vacuna de la gripe potenciada con AS01B consiste en tres etapas principales:
• Formulación del volumen final trivalente (concentrada 2x) sin adyuvante y carga en el recipiente delantígeno
15 • Preparación del adyuvante AS01B
• Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01B.
Formulación del volumen final trivalente sin adyuvante y carga en el recipiente del antígeno.
Los volúmenes de los tres volúmenes monovalentes se basan en la medida del contenido en HA de cada volumen monovalente previamente a la formulación y en un volumen objetivo de 1320 ml. Se diluyen en agua para inyección20 solución salina tamponada con fosfato concentrado PO4 Na/K2 (80 !l/dosis) y una premezcla de Tween 80, Triton X100 e hidrogenosuccinato de a-tocoferilo. Los tres monovolúmenes concentrados (A/Nueva Caledonia/20/99 IVR116, A/Nueva York/55/2004 NYMC X-157, B/Jiangsu/10/2003) se diluyen después sucesivamente en la soluciónresultante de solución salina tamponada con fosfato / Tween 80 - Triton X-100 - hidrogenosuccinato de a-tocoferilo (pH 7,8, NaCl 81 mM, KCl 1,56 mM, Na2HPO4 4,79 mM, KH2PO4 0,87 mM, NaH2PO4 7,2 mM, K2HPO4 72,8 mM, 25 750 μg/ml de Tween 80, 110 μg/ml de Triton X-100 y 100 μg/ml de hidrogenosuccinato de a-tocoferilo) para tener una concentración final de 30 !g de HA de cepas A (H1N1 y H3N2) por ml de volumen final trivalente (15 !g deHA/cepa A/500 !l de volumen final trivalente) y 35 !g de HA de cepa B (17,5 !g de HA/cepa B/500 !l de volumen final trivalente). Entre la adición de cada volumen monovalente, la mezcla se agita durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de la último volumen monovalente y 15-30 minutos de agitación, se
30 controla el pH y se ajusta a 7,65 ± 0,25 con HCl o NaOH.
El volumen final trivalente de antígenos se carga de forma aséptica en viales de vidrio tipo I (Ph. Eur.) estériles de 3ml. Cada vial contiene un volumen de 600 !l (500 !l + 100 !l de sobrecarga).
Preparación del volumen de adyuvante AS01B y carga en el recipiente del adyuvante
El adyuvante AS01B se prepara mezclando los dos componentes: QS21 y liposomas que contienen MPL. La35 preparación de cada uno de estos componentes se resume a continuación.
QS21 es un glicósido de triterpeno, obtenido de la corteza del árbol Quillaja saponaria, y lo produce Aquila Worchester, MA, USA (ahora Antigenics).
QS21 se proporciona a GSK Bio como un polvo liofilizado. La preparación de QS21 en GSK Bio consiste en lasuspensión del polvo de QS21 en agua para inyección a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml, ajuste del40 pH a pH 6,0 ± 0,2 y filtración estéril. El volumen líquido de QS21 se almacena a -20ºC en recipientes de polietileno.
MPL es el 4’-monofosforil lípido A 3-O-desacilado obtenido por hidrólisis ácida y básica secuencial del lipopolisacárido de la cepa Re595 de Salmonella minnesota. Lo produce Corixa (anteriormente Ribi Inc.), Hamilton,Montana. El volumen de MPL se suministra a GSK Bio como la sal de trietilamina liofilizada (TEA).
En el procedimiento de producción de liposomas que contienen MPL, se disuelven en etanol DOPC (dioleil45 fosfatidilcolina), colesterol y MPL. Se forma una película lipídica por evaporación del disolvente al vacío. Se añade solución salina tamponada con fosfato compuesta de Na2HPO4 9 mM, KH2PO4 41 mM, NaCl 100 mM a pH 6,1 y lamezcla se somete a prehomogeneización seguido por homogeneización a presión alta a 102 MPa (15.000 psi) (+/- 20 ciclos). Esto conduce a la producción de liposomas, que se filtran de forma estéril a través de una membrana de 0,22 !m en un área aséptica (clase 100). El producto estéril se distribuye después en recipientes de vidrio estériles y
5 se almacenan en la habitación refrigerada (de +2 a +8ºC).
La preparación de volumen estéril de liposomas se mezcla con la solución de volumen de QS21 estéril. Después de 30 minutos de agitación, la mezcla se añade a una mezcla de agua para inyección y fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH 6,1 cuando se diluye 10 veces. La cantidad de fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH 6,1 cuando se diluye 10 se calcula paraalcanzar la isotonicidad en el volumen final. Se controla el pH. El adyuvante se filtra después de forma estéril (0,22
10 !m) y se distribuye de forma aséptica en viales. Los viales se almacenan de +2 a +8ºC.
El diluyente AS01B es un líquido incoloro opalescente, libre de partículas extrañas, contenido en un vial de vidrio tipoI, estéril. El objetivo de llenado para cada vial es 0,7 ml para cumplir la especificación (� 0,5ml).
Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01B
En el momento de la inyección, el contenido del vial que contiene el adyuvante se retira y se inyecta en el vial que
15 contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, el contenido se retira con una jeringa y se reemplaza la aguja por una aguja intramuscular, y el volumen se corrige a 1 ml. Unadosis de vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B reconstituida corresponde a 1 ml.
VI.2.4.Descripción de los lotes de vacunas potenciadas con AS01E
La vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01E es una vacuna de tres componentes constituida por unos
20 antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados presentada en un vial de vidrio tipo I, un vial de vidrio tipo I que contiene el adyuvante AS01B y un vial de vidrio tipo I que contiene el diluyente (solución de clorurosódico para inyección) para la dilución dos veces de AS01B.
Para preparar el adyuvante AS01E el contenido del vial del diluyente se retira con una jeringa y se inyecta en el vial que contiene el adyuvante AS01B, seguido por mezcla. En el momento de la inyección, se retiran 600 !l de
25 adyuvante AS01E con una jeringa del vial de AS01E y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, se retira el contenido con la jeringa y la aguja se reemplaza por una aguja intramuscular. Una dosis de vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B corresponde a 1 ml.
La vacuna candidata contra la gripe potenciada con AS01E es una vacuna sin conservantes.
30 VI.2.5.Composición del lote clínico potenciado con AS01E
Una dosis de la vacuna de la gripe potenciada con AS01E reconstituida corresponde a 1 ml. Su composición se da en la Tabla 9. Contiene 15 !g de cada cepa del virus de la gripe como en la vacuna FluarixTM/a-Rix® registrada.
Tabla 9 Composición (componentes de gripe y adyuvantes) de la vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01E
Componente Cantidad por dosis Referencia analítica
INGREDIENTES ACTIVOS Viriones divididos inactivados
-
A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 Ph. Eur. 158
15 !g HA
-
A/Nueva York/55/2004 (H3N2) NYMC X-
Ph. Eur. 158 157
15 !g HA
Ph. Eur. 158
15 !g HA
-
B/Jiangsu/10/2003 ADYUVANTE AS01B
-
Liposomas
GSK Bio 3217• dioleil fosfatidilcolina (DOPC)
500 !g
Ph. Eur. 0993• Colesterol
125 !g
GSK Bio 2972• MPL
25 !g
-
QS21
25 μg
GSK Bio 3034
35 VI.2.6.Procedimiento de producción del lote de vacuna potenciada con AS01E
La fabricación de la vacuna de la gripe potenciada con AS01B consiste en tres etapas principales:
• Formulación del volumen final trivalente (concentrada 2x) sin adyuvante y carga en el recipiente delantígeno
40 • Preparación del adyuvante AS01B
• Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividida potenciada con AS01B.
Formulación del volumen final trivalente sin adyuvante y carga en el recipiente del antígeno.
Se hace referencia a la sección V.2.3 para la vacuna de la gripe potenciada con AS01B.
Preparación del volumen de adyuvante AS01B y carga en el recipiente del adyuvante
Se hace referencia a la sección V.2.3 para la vacuna de la gripe potenciada con AS01B.
Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01E.
Para preparar el adyuvante AS01E el contenido del vial del diluyente se retira con una jeringa y se inyecta en el vial que contiene el adyuvante AS01B, seguido por mezcla. En el momento de la inyección, se retiran 600 !l de adyuvante AS01E con una jeringa del vial de AS01E y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, se retira el contenido con la jeringa y la aguja se reemplaza por una aguja intramuscular. Una dosis de vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B corresponde a 1 ml.
Cuatro visitas programadas por sujeto: en los días 0, 21, 90 y 180, recogiéndose muestras de sangre en cada visita para evaluar la inmunogenicidad.
Programa de vacunación: una inyección de vacuna de la gripe en el día 0.
VI.2.7 Ensayos inmunológicos
Hemaglutinación- Ensayo de inhibición
La respuesta inmunitaria se determinó midiendo los anticuerpos de IH usando el procedimiento descrito por elCentro colaborador de la OMS para la gripe, Centros de Control de Enfermedades (Collaborating Centre forinfluenza, Centres for Disease Control), Atlanta, EE.UU. (1991). Las mediciones del título de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas descongeladas con un microprocedimiento normalizado y validadoexhaustivamente usando 4 unidades inhibidoras de la hemaglutinación (4 UIH) de los antígenos adecuados y unasuspensión al 0,5% de eritrocitos de ave de corral. Los inhibidores séricos no específicos se eliminaron mediante tratamiento con calor y enzima destructora del receptor. Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar losniveles de anticuerpos de IH. Comenzando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de diluciones (porun factor de 2) hasta una dilución final de 1:20480. Como criterio de valoración de la titulación se tomó la dilución más elevada que mostró una inhibición completa (100%) de la hemaglutinación. Todos los análisis se realizaron porduplicado.
Citometría de flujo de citocinas (CFC) usada para evaluar las frecuencia de los linfocitos cd4 o CD8 positivos.
Las células T DC4 y CD8 de sangre periférica específicas del antígeno se pueden reestimular in vitro para producirIL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN si se incuban con su correspondiente antígeno. En consecuencia, las células T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar por citometría de flujo tras marcaje con inmunofluorescenciaconvencional del fenotipo celular, así como producción de citocinas intracelulares. En el presente estudio, comoantígeno para reestimular las células T específicas de la gripe se usaron el antígeno de la vacuna de la gripe asícomo péptidos derivados de proteínas específicas de la gripe. Los resultados se expresaron en forma de unafrecuencia de células T CD4 o CD8 positivas para citocina(s) dentro de la subpoblación de células T CD4 o CD8.
ELISPOT usado para evaluar la frecuencia de las células B de memoria
La tecnología Elispot de célulasB permite la cuantificación de las células B de memoria específicas para un antígeno dado. Las células B de memoria se pueden inducir para diferenciarse en células plasmáticas, in Vitro tras el cultivode CpG durante 5 días. Las células plasmáticas generadas in Vitro se incuban en placas de cultivo recvestidas con antígeno. Las células plasmáticas específicas del antíogeno formarán manchas anticuerpo/antígeno, que se pueden detectar mediante un procedimiento inmunoenzimático convencional. En el presente estudio se usan las cepas de lavacuna de la gripe, o inmunoglobulina anti-humana, para revestir las placas de cultivo con el fin de enumerar lascélulasplasmáticas secretoras de IgG o anti-gripe, respectivamente. Los resultados se expresan con frecuencia de plasma específica de antçogeno en un millón de células plasmáticas productoras de IgG.
Caracterización Exploratoria de PBMC
La expresión de marcadores seleccionados de superficie/activación (es decir, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA, CD28,CD27 o algún KIR) se puede realizar. La función de los linfocitos T inducidos por la vacuna se puede abordarmediante el análisis de marcadores domésticos (es decir, CCR7, CXCR5) de citocinas (citocinas de T colaborador 1
o de T colaborador 2) o mediante análisis de la expresión de factores asociados con funciones reguladoras comoFoxp3, CTLA-2 o TGF-1. En particular, la población CD8+CD28- u otras poblaciones de células T reguladoras sepuede analizar en relación con las respuestas humoral, de células B y T, al antígeno de la vacuna.
VI.3. Resultados de inmunogenicidad
VI.3.1. Criterios de valoración y resultados de CMI
Con el fin de caracterizar la respuesta de CMI después de la vacunación con las vacunas antigripales acompañadasde adyuvante, los linfocitos T CD4 y CD8 se reestimularon in vitro usando antígenos de las tres cepas de vacuna (usadas individualmente o combinadas). Los linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe se enumeraron porcitometría de flujo de acuerdo con el marcaje por inmunofluorescencia convencional de producción de citoquinasintracelulares (IL-2, IFN-y, TNF-a y CD40L).
Evaluación del criterio de valoración principal.
En el día 21: respuesta de CMI en todos los sujetos con respecto a la frecuencia del linfocito T CD4 específico de lagripe por 106 en pruebas que producen al menos dos citoquinas diferentes (IL-2, IFN-y, TNF-a y CD40L).
Para la evaluación de respuesta de CMI, se analiza la frecuencia del CD4 específico de la gripe como sigue:
5 Usnado el abordaje de no inferioridad, la no inferioridad de al menos una vacuna adyuvada contra la gripe (Administrada a ancianos 65 años de edad. El grupo denominado ancianos Flu o ELD Flu) en comparación con los que recibieron FluarixTM (administrada a adultos de 18-40 años de edad, grupo denominado Jóvenes Flu o Flu YNG)se alcanzó cuando el límite superior del intervalo de confianza bilateral 98,75% en el índice de la media geométrica (GM) entre el grupo de FluarixTM (18-40 años) y el grupo con la vacuna candidata adyuvada contra la gripe (grupo
10 65 años) en términos de frecuencia de células T CD4 específicas de la gripe productoras de al menos dos citocinas el día 21) fue inferior a 2,0.
La relación de la GM con respecto a la frecuencia del CD4 específico de la gripe entre grupos vacunados con vacunas acompañadas de adyuvante y Flu YNG se obtiene usando un modelo ANCOVA en logaritmos de titulación
15 transformados. El modelo ANCOVA incluye el grupo de vacuna en forma de efecto fijo y el logaritmo de titulación transformado de pre-vacunación en forma de regresor. La relación de la GM y su CI al 98,75% se derivan como transformación exponencial de contraste del grupo correspondiente en el modelo. El CI al 98,75% para la GMajustada se obtiene por transformación exponencial de CI al 98,75% para la media del ajuste por mínimos cuadradosdel grupo del modelo ANCOVA anterior.
20 Resultados – Análisis Inferencial (Tabla 10)
En la Tabla 8 se presentan las relaciones de GM y GM ajustada (con su CI al 98,75%) de linfocito T CD4 específicode la gripe que produce al menos dos citoquinas (IL-2, IFN-y, TNF-a y CD40L) en el día 21, después de reestimulación in vitro con “antígenos combinados II”. Para cada vacuna antigripal acompañada de adyuvante, ellímite superior de CI al 98,75% de dos lados de la relación de la GM es bastante inferior al límite clínico de 2,0. Esto
25 muestra la no inferioridad de ambas vacunas antigripales acompañadas de adyuvante administradas a sujetos mayores en comparación con la vacuna Fluarix™ administrada en adultos de edades entre 18 y 40 años conrespecto a frecuencia pos-vacunación de CD4 específico de la gripe.
Tabla 10 Relación de GM ajustada del CD4 específico de la gripe que produce al menos dos citoquinas, Día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad)
Relación GM (Flu YNG / AS01B )
Flu YNG
AS01B 98,8% CI
N
GM N GM Valor LL UL
74
2844,8 71 2725,6 1,04 0,79 1,38
Relación GM (Flu YNG / AS01E )
Flu YNG
AS01E 98.8% CI
N
GM N GM Valor LL UL
74
2879,6 74 2697,0 1,07 0,79 1,44
GM ajustada = media geométrica de anticuerpos ajustada para título de línea basal; N = Número de sujetoscon resultados disponibles de pre- y pos-vacunación; CI al 98,8% = Intervalo de confidencia al 98,8% parala relación de GM ajustada (Modelo Ancova: ajuste para línea basal); LL = Límite inferior, UL = Límite
35 superior; Fuente de Información = Apéndice tabla IIIA
Resultados – Análisis descriptivo (Figura 6)
Los principales resultados fueron: 1) Antes de la vacunación la respuesta de CMI es superior en adultos jóvenes que en mayores 2) Después de la vacunación:
40 - hubo un efecto de refuerzo de la vacuna antigripal sobre la respuesta de CMI en adultos jóvenes (18-40 años)
-
la respuesta de CMI en los mayores que han recibido la vacuna antigripal acompañada de adyuvante se comparacon la respuesta de CMI de adultos jóvenes.
La diferencia entre pre- y pos-vacunación en respuestas de linfocitos T CD4 para todas las citoquinas investigadas (IL-2, CD40L, TNF-a y IFN-y) fue significativamente superior con las vacunas acompañadas de adyuvante en comparación con Fluarix™ (18-40 años) para todas las pruebas.
Análisis del objetivo terciario:
5 Con el fin de evaluar el criterio de valoración terciario, se midieron la frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe y células B de la memoria en los días 0, 21, 90 y 180.
•
La frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe con citoquinas positivas se resumió (estadísticasdescriptivas) para cada grupo de vacunación en los días 0 y 21, para cada antígeno.
•
Se usó una prueba no paramétrica (prueba de Wilcoxon) para comparar la situación de diferencia entre los dos
10 grupos (vacuna antigripal acompañada de adyuvante frente a Fluarix™) y se calcula el valor p estadístico para cada antígeno en cada prueba diferente.
• La estadística descriptiva en diferencia individual entre las respuestas del día 21/día 0 (Pos-/Pre-vacunación)se calcula para cada grupo de vacunación y cada antígeno en cada prueba diferente.
• Se usa una prueba no paramétrica (prueba de Wilcoxon) para comparar la diferencia individual (Pos-/Pre15 vacunación) y se calculará el valor p estadístico para cada antígeno en cada prueba diferente.
En la Tabla 11 se presentan los valores p de la prueba de Wilcoxon usados para comparar la diferencia en lafrecuencia de linfocitos T CD4 específicos de la gripe.
Resultados -Evaluación del criterio de valoración terciario (Tabla 11)
Las conclusiones principales son:
20 • Las frecuencias de GM pre-vacunación de CD4 específicos de la gripe fueron similares en todos los grupos de sujetos mayores, pero superiores en los adultos de edades entre 18 y 40 años.
• La frecuencia pos-vacunación (día 21) de linfocitos T CD4 específicos de la gripe fue similar en sujetosmayores vacunados con vacunas acompañadas de adyuvante y en adultos de edades entre 18 y 40 años vacunados con Fluarix™.
25 • En sujetos mayores, la frecuencia pos-vacunación (día 21) de linfocitos T CD4 específicos de la gripe fue significativamente superior después de la vacunación con vacunas acompañadas de adyuvante que con Fluarix™.
• La frecuencia de GM pre-vacunación y pos-vacunación en célula T CD8 específica de la gripe fue esencialmente similar en todos los grupos.
Tabla11 Estadística inferencial: valores p de las pruebas de Kruskal-Wallis para células T CD4 en cada 30 momento (Cohorte ATP para Inmunogenicidad)
Descripción prueba
Valor p
AS01B frente a Flu YNG
AS01E frente a Flu YNG
día 0
día 21 día 0 día 21
TODOS DOBLES
<0,0001 0,0070 <0,0001 0,0025
CD4OL
<0,0001 0,0056 <0,0001 0,0015
IFNy
<0,0001 0,0009 <0,0001 0,0006
IL2
<0,0001 0,0029 <0,0001 0,0021
TFNa
<0,0001 0,0295 <0,0001 0,0378
AS01B frente a Flu ELD
AS01E frente a Flu ELD
día 0
día 21 día 0 día 21
TODOS DOBLES
0,6165 0,0004 0,6165 0,0004
CD4OL
0,7560 0,0005 0,7560 0,0005
IFNy
0,9936 0,0008 0,9936 0,0008
IL2
0,6702 0,0011 0,6702 0,0011
TFNa
0,5450 0,0022 0,5450 0,0022
Resultados -Evaluación de los criterios de valoración de respuesta inmunitaria Humoral Variables observadas:
En los días 0, 21, 90 y 180: titulaciones de anticuerpos por inhibición de la hemoaglutinación (HI) en suero,35 analizadas por separado frente a cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).
El valor de corte para el anticuerpo por HI frente a todos los antígenos de vacuna se definió por parte del laboratorio antes del análisis (y equivale a 1:10). Un sujeto seronegativo es un sujeto cuya titulación de anticuerpo es inferior alvalor de corte. Un sujeto seropositivo es un sujeto cuya titulación de anticuerpo es superior o igual al valor de corte.A la titulación de anticuerpo inferior al corte del ensayo se le proporciona un valor arbitrario de la mitad del corte.
Los siguientes parámetros se calculan en base a las titulaciones de anticuerpos por HI:
•
Media geométrica de las titulaciones (GMT) del anticuerpo por HI en los días 0 y 21, calculada tomando el antilogaritmo de la media de las transformaciones del logaritmo de titulación.
•
Factores de seroconversión (SF) en el día 21 definidos a medida que aumenta la parte en GMT por HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0.
•
Velocidades de seroconversión (SC) en el día 21 definidas como el porcentaje de vacunas con o bien unatitulación por HI pre-vacunación <1:10 y una titulación pos-vacunación 1:40, o bien una titulación pre-vacunación a
1:10 y un aumento mínimo de cuatro veces en la titulación pos-vacunación.
• Velocidades de seroprotección (SPR) en el día 21 definidas como el porcentaje de vacunas con una titulaciónpor HI en suero 1:40.
El CI al 95% para GM se obtiene dentro de cada grupo por separado. El CI al 95% para la media del logaritmo detitulación transformado se obtiene en primer lugar suponiendo que los logaritmos de titulación transformados sedistribuyen normalmente con variante desconocida. Después el CI al 95% para GM se obtiene por transformación exponencial del CI al 95% para la media del logaritmo de titulación transformado.
El resultado serológico ausente para la medida de un anticuerpo particular no se sustituye. Por tanto, un sujeto sinresultado serológico en un momento dado no contribuye al análisis del ensayo para ese momento.
Resultados de respuesta inmunitaria humoral (Figura 7 y Tabla 12)
Las GMT pre-vacunación de anticuerpos por HI para las 3 cepas de vacuna estaban dentro del mismo intervalo en los 4 grupos de tratamiento. Después de la vacunación, existe un claro impacto de los 2 adyuvantes que aumentanla respuesta humoral en los mayores, en comparación con Fluarix convencional en la misma población (Figura 7).
Las GMT son
•
significativamente superiores para H1N1 para AS01E
•
significativamente superiores para H3N2 para ambos adyuvantes.
Veinte días después de la vacunación, los sujetos de Fluarix (18-40 años) tuvieron una respuesta HI superior para las cepas Nueva Caledonia y B/Jangsu.
Como se muestra en la Tabla 12 las vacunas antigripales acompañadas de adyuvantes sobrepasaron los requisitosde las autoridades europeas para el registro anual de vacunas antigripales de virión dividido [“Nota para la Directrizsobre los requisitos para vacunas antigripales para evaluación inmunológica de los cambios anuales de las cepas”(CPMP/BWP/214/96)] en sujetos de edades superiores a 60 años.
Después de la vacunación. Se produjo una diferencia estadística con respecto a velocidades de seroprotección de anticuerpos por HI entre el grupo de Fluarix ( 65 años) y
• Flu/AS01B y Flu/AS01E para cepa A/H1N1/ Nueva Caledonia
Para cada cepa de vacuna, las velocidades de seroprotección para los 2 grupos de vacuna antigripal acompañadade adyuvante están en el mismo intervalo en comparación con el grupo Fluarix (18-40 años).
Para cada cepa de vacuna, las velocidades de seroconversión para los 2 grupos de vacuna antigripal acompañada de adyuvante están en el mismo intervalo en comparación con el grupo Fluarix (18-40 años), excepto para la cepaNueva Caledonia.
Tabla 12 Velocidades de seroprotección, velocidades de seroconversión y factores de conversión en el día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad)
Cepas
Grupo N Velocidad de seroprotección (titulación HI 40) % Velocidad seroconversión ( aumento cuatro veces) Factor de conversión [CI al 95%]
Norma UE (>60 años)
>60% >30% >2,0
Norma UE (< 60 años)
> 70% > 40% > 2,5
A/Nueva Caledonia (H1N1)
Flu Yng 75 100 [95,20-100] 77,3 [66,2-86,2] 35,1 ^21,9-56,4]
Flu Elderly
49 71,4 [56,74-83,42] 30,6 [18,3-45,4] 3,7 [2,4-5,7]
FluAS01B
75 97,3 [90,70-99,68] 48,0[36,5-59,8] 4,5 [3,3-6,1]
FluAS01E
75 93,3 [85,12-97,80] 52,0 [40,2-63,7] 5,0 [3,6-6,9]
A/Nueva York (H3N2)
Flu Yng 75 93,3 [85,12-97,80] 76,0 [64,7-85,1] 9,2 [7,1-11,8]
Flu Elderly
49 81,6 [67,98-91,24] 69,4 [54,6-81,7] 8,2 [5,7-11,8]
FluAS01B
75 96,0 [88,75-99,17] 85,3 [75,3-92,4] 13,1 [10,0-17,1]
FluAS01E
75 93,3 [85,12-97,80] 80,0 [69,2-88,4] 14,5 [10,4-20,2]
B/Jiangsu (B)
Flu Yng 75 100 [95,20-100] 80,0 [69,2-88,4] 13,9 [10,1-19,1]
Flu Elderly
49 93,9 [83,13-98,72] 81,3 [70,7-89,4] 4,3 [3,0-6,1]
FluAS01B
75 100 [95,20-100] 65,3 [53,5-76,0] 5,2 [4,2-6,5]
FluAS01E
75 97,3 [90,70-99,68] 70,7 [59,0-80,6] 6,7 [5,1-8,9]
N= número total de sujeto; %= Porcentaje de sujetos con titulación en el día 21 dentro del intervalo específico; CI = 5 intervalo de confidencia
VI.3.2. Conclusiones de immunogenicidad
• La frecuencia pre-vacunación de CD4 específico de la gripe fue significativamente inferior en adultos mayoresen comparación con adultos de edades entre 18 y 40 años. Después de la vacunación con Fluarix™, lafrecuencia pos-vacunación (día 21) permaneció inferior en adultos mayores en comparación con los jóvenes.
10 Por el contrario, la no inferioridad con respecto a la frecuencia de frecuencia pos-vacunación de CD4 específico de la gripe después de la vacunación con Fluarix™ en adultos con edades entre 18 y 40 años.
• En lo que se refiere a la respuesta inmunitaria humoral con respecto a la respuesta de anticuerpo por HI, todas las vacunas antigripales cumplieron los requisitos de las autoridades europeas para el registro anual de vacunasantigripales inactivadas [“Nota para la Directriz sobre los requisitos para vacunas antigripales para evaluación
15 inmunológica de los cambios anuales de las cepas” (CPMP/BWP/214/96)]. En adultos mayores, las vacunas acompañadas de adyuvante mediaron al menos una tendencia de respuesta inmunitaria humoral superior a lahemaglutinina de la gripe que Fluarix™. En la Tabla 13 se resume la diferencia significativa entre la respuestainmunitaria humoral frente a cada cepa de vacuna mediada en sujetos mayores por vacunas acompañadas de adyuvante en comparación con Fluarix™. En comparación con adultos de edades entre 18 y 40 años
20 vacunados con Fluarix™, los sujetos mayores vacunados con las vacunas acompañadas de adyuvante mostraron una tendencia de GTM pos-vacunación y factor de seroconversión superiores en el día 21 frente a lacepa A/Nueva York.
Tabla 13 Diferencia significativa en la respuesta inmunitaria humoral entre vacunas con adyuvantes y Fluarix en sujetos ancianos
Post-vac GMT
Factor de Seroconversión Tasa de Seroproteccción Tasa de Seroconversión
FluAS01B
A/ Nueva York A/Nueva Caledonia
FluAS01E
A/ Nueva Caledonia A/ Nueva York A/ Nueva Caledonia
Post-vac GMT= Media geométrica de la Titulación en la post - vacunación.
VI.4 Conclusiones de reactogenicidad
VI.4.1. Registro de episodios adversos (AE)
Se registraron los síntomas solicitados (véase la tabla 14) que se producen durante un período deseguimiento de 7 días (día de vacunación y 6 días posteriores). También se registraron los síntomas no solicitados30 que se producen durante el período de seguimiento de 21 días (día de vacunación y 20 + 3 días posteriores). La
intensidad de los AEs siguientes se determinó como se describe en la Tabla 15.

Tabla 14 Episodios adversos locales/generales solicitados
AEs locales solicitados
AEs generales solicitados
Dolor en el sitio de la inyección Enrojecimiento en el sitio de la inyección Hinchazón en el sitio de la inyección Hematoma
FatigaFiebre MigrañaDolor muscular
Temblor
Dolor en la articulación en el brazo de la inyecciónDolor en la articulación en otras localizaciones
N.B. Se registró la temperatura por la tarde. Las mediciones de temperatura adicional se deben realizar en otrosmomentos del día, se registró la temperatura más alta..

Tabla 15 Escalas de intensidad para los síntomas solicitados en adultos
Episodio adverso
Grado de intensidad Parámetro
Dolor en el sitio de la inyección
0 Ausente
1
cuando se toca
2
cuando se mueve el miembro
3
evita la actividad normal
Enrojecimiento en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Hinchazón en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Hematoma en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Fiebre*
Temperatura de registro en °C / °F
Migraña
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Fatiga
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Dolor de articulación en el sitio de inyección y otras localizaciones
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Dolor muscular
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Temblor
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
*Fiebre se define como la temperatura de la axila 37,5°C (99,5°F) La intensidad máxima del enrojecimiento/hinchazón del sitio de inyección local se puntúa como sigue: 0 es 0 mm; 1 es > 0 - : 20 mm; 2 es > 20 - : 50 mm; 3 es > 50 mm.
10 La intensidad máxima de fiebre se puntúa como sigue: 1 es >37,5 -: 38.0°C; 2 es > 38,0 -: 39,0°C; 3 es > 39,0 El investigador hace una evaluación de la intensidad de los otros AEs, es decir, síntomas no solicitados, que
incluyen SAEs reseñados durante el estudio. La evaluación se basa en el juicio clínico del investigador. La intensidad de cada uno de los registros de AE se asigna a una de las siguientes categorías: 15 1 (suave) = Un valor de AE que se tolera fácilmente por el sujeto, provocando malestar y que no interfiere con las actividades de cada día;;
2 (moderado) = Un valor de AE que es suficientemente molesto para interfiere con las actividades de cada día normales;
3 (grave) = Un valor de AE que evita las actividades normales de cada día (en adultos/adolescentes, tal valor de AEprevendría, por ejemplo, la atención en el trabajo/escuela y necesitaría la administración de terapia correctora).
VI.4.2. Registro de episodios adversos (AE)
En los sujetos ancianos, la reactogenicidad observada con vacunas de adyuvantes, en términos de síntomas tantolocales como generales era más alta que con Fluarix™. No solamente la incidencia sino también la intensidad desíntomas se incrementaron después de la vacunación con vacunas de adyuvantes (Figura 8). Los síntomas de grado 3 muestran una tendencia a ser más alta en el grupo que recibía la vacuna con adyuvantes con la concentración de los inmunoestimulantes más alta (MPL, QS21) al grupo que recibía la vacuna de adyuvantes en el que losinmunoestimulantes están a una concentración menor. Sin embargo, en todos los casos, los síntomas se resuelvenrápidamente.
Ejemplo VII: Evaluación pre-clínica evaluation de las vacunas VPH con adyuvantes en ratones.
Este estudio usó una composición antigénica bivalente de papilomavirus humano (VPH), combinando partículas detipo virus (VLPs) formadas a partir de L1 de VPH 16 y L1 de VPH 18 como antígeno. El objetivo del estudio era comparar la eficiencia de esta preparación antigénica cuando se formula con AS01B y una dilución 1/5 de AS01B,evaluada de manera comparativa con contra el adyuvante actual encontrado en la vacuna de cáncer cervical de GSK, AS04 (MPL sobre alumbre).
VII.1 - Vacunación
Ratones (n = 12 por grupo) cuando se inyectan en los días 0 y 28 con formulaciones de vacuna compuestas porVPH16/18 L1 (2 !g o 0,5μg cada una) derivadas de procedimiento Hi-5 80/80L y formuladas con AS04 (50 μg MPLformuladas con alumbre o AS01B (50 μg QS21 - 50 μg MPL en 0,5 ml) 1/10 y 1/50 de dosis humana. Ya que losestudios se llevaron a cabo en ratones, la dosis humana de 1/10 se puede tomar equivalente a la formulación de AS01B, es decir. 50 μg de QS21 y 50 μg de MPL en 0,5ml y 1/50 se puede tomar para que sea una dilución 1/5 de laformulación humana AS01B es decir: 10 μg de QS21 y 10 μg de MPL en 0,5 ml. Se tomaron muestras de sangre losdías 14 y 45 después de la dosis II para ensayar los anticuerpos específicos de tipo anti - L1 en suero individual. La tinción de citoquinas intracelulares se midieron los días 7 y 14 después de II en PBMC y el día 45 después de IIusando células de bazo. La frecuencia de las células B de memoria específica de VLPs se midieron el día 45 después de II usando células de bazo.
VII.2 - Anti-VPH 16/18 L1 ELISA
La cuantificación de anticuerpos anti-VPH-16 y VPH-18 L1 se realizó mediante ELISA usando VPH-16 y VPH-18 L1como revestimiento. Se diluyeron los antígenos a una concentración final de 0,5 μg/ml in PBS y se adsorbieron durante toda una noche a 4°C a los pocillos de placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorp Immuno-plate,Nunc, Dinamarca). Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1% (tampón de saturación). Suero diluido en tampón que contiene PBS + 0,1% de Tween 20 + 1% de BSAse añadieron a las placas revestidas con VPH L1 y se incubaron durante 1 hora 30 min a 37°C. Las placas se lavaron con cuatro veces con PBS 0,1% de Tween 20 e Ig anti - ratón conjugada a biotina (Dako, Reino Unido)diluido a 1/1000 en tampón de saturación se añadió a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de laetapa de lavado, estreptavidina - peroxidasa de rábano picante (Dako, Reino Unido), diluido 1/3000 en tampón desaturación se añadió durante un tiempo adicional de 30 min a 37°C. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con una solución de 0,04% de ofenilendiamina (Sigma) 0,03% de H2O2 en 0,1% de Tween 0, tampón citrato 0,05 M pH 4,5. La reacción se detuvocon 2N H2SO4 y se leyó a 492/620 nm. Las titulaciones de ELISA se calcularon a partir de una referencia deSoftMaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresa en EU/ml.
VII.3 - Tinción de citoquinas intracelulares (ICS)
La tinción de citoquinas intracelulares de las células T se realizó sobre PBL los días 7 y 14 después de II y sobre lascélulas de bazo el día 45 después de la segunda inmunización. PBMCs (1 conjunto/grupo) o células de bazo (4conjuntos de 3 órganos por grupo) se recogieron de los ratones. La estimulación de antígenos in vitro de células debazo se llevó a cabo a una concentración final de 5 106 células /ml (microplaca de 96 pocillos) con VLP 16, 18, 31 ó 45 (5 μg/ml) + anticuerpos CD49d CD28 (1 μg/ml) y después se incubaron 3H a 37°C. Después de la etapa dereestimulación de antígenos, se incubaron las células durante toda una noche en presencia de Brefeldin (1 μg/ml) a37°C para inhibir la secreción de citoquinas. La tinción de citoquinas se realizó como sigue: se lavaron suspensionescelulares, se resuspendieron en 50 μl de PBS 1% FCS que contiene 2% Fc de reactivo bloqueador (1/50; 2.4G2).Después de 10 minutos de incubación a 4°C, se añadieron 50 μl de una mezcla de anti-CD4-APC (1/50) y anti-CD8perCp (1/50) y se incubaron 30 min a 4°C. Después de lavar en PBS 1% FCS, las células se permeabilizaron resuspendiendo en 200 μl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) y se incubaron durante 20 min a 4°C. Después las célulasse lavaron con Perm Wash (Kit BD) y se resuspendieron con 50 μl de anti- IFy APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) sediluyeron en PermWash. Después de 2H de incubación a 4°C, las células se lavaron con Perm Wash y seresuspendieron en PBS 1% FCS + 1% paraformaldehído. El análisis de muestras se realizó mediante FACS. Se activaron las células vivas (FSC/SSC) y se realizó una adquisición en ~ 20,000 casos (linfocitos). Los porcentajes deIFy + o IL2+ se calcularon en las poblaciones activadas por CD4+ y CD8+.
VII.4 -Memoria de células B
Cuarenta y cinco días después de la segunda inmunización, se sacrificaron los ratones, se separaron las células delbazo mediante un gradiente de linfoprep (Cedarlane). Después se resuspendieron las células B en medio RPMI
1640 (Gibco) que contienen aditivos (piruvato de sodio 1 mM, MEM aminoácidos ano esenciales, Pen/Strep, Glutamina y 1-2 mercaptoetanol), 5% de suero de ternera fetal, 50 U/ml rhIL-2 (eBioscience) y 3 μg/ml de CpG. Secultivaron las células durante cinco días a una concentración final de 106 células/ml, en 5 ml de placas de fondo redondo de 6 pocillos. Después de una etapa de activación con etanol, se recubrieron las placas con nitrocelulosa(Multiscreen-IP; Millipore) 10 μg/ml de VLPs o con Ig Goat anti- ratón (GAM; Sigma) diluido 1/200 in PBS. Después de una etapa de saturación con medio complete, se añadieron 100 μl de 2,106 células/ml a las placas recubiertas con VLPs y se añadieron 100 μl de 106 y 5.105 células/ml a las placas de GAM. Después de un tiempo de incubación de 2 hrs a 37°C, se almacenaron las placas durante toda una noche a 4°C. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS 0,1% Tween 20 y anti-ratón Ig Biot diluido 1/200 en PBS 1% BSA 5% FCS (tampon de dilución) se distribuyó a las placas y se incubó durante 2 horas a 37°C. Después de la etapa de lavado, se añadió Extravidina HRP (Sigma) diluida 1/550 en tampón de dilución durante 1 hora adicional a 37°C. Se lavaron las placas como se ha indicadoanteriormente y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con una solución de AEC (Sigma). Lareacción se detiene enjuagando las placas suavemente hasta que se cubran con agua. Cuando las placas estánsecas, se leen con KS-400.
VII.5 - Análisis estadístico
Los medios de formulación se compararon usando un análisis de una cola de varianza (ANOVA 1). El análisis sellevó a cabo en los datos transformados de log10 para propósitos de normalización. Cuando se detectó una diferencia significativa entre los medios de procedimiento (valor de p : 0,05), comparaciones acertadas de paresentre las medias se realizó a un nivel significativo de 0,05 (ensayo de comparación múltiple de Student - Newman - Keuls).
VII.6 – resultados
Se inmunizaron los ratones como se ha indicado anteriormente VII.1. Se usaron los siguientes grupos
Grupos
Antígeno Adyuvante Dilución de adyuvante
1
VPH 16 - 18 L1 2 Ig AS04 1/10 dosis humana (equivalente a 50 Ig de MPL por 0,5 ml HD)
2
VPH 16 - 18 L1 0,5Ig AS04 1/50 dosis humana (equivalente a 10 Ig MPL por 0,5 ml de HD)
3
VPH 16 - 18 L1 2 Ig AS04 1/10 dosis humana (equivalente a 50 Ig de MPL por 0,5 ml de HD)
4
VPH 16-18 L1 0.5Ig AS04 1/50 dosis humana (equivalente a 10 Ig de MPL por 0,5 ml de HD)
5
VPH 16 - 18 L1 2Ig AS01B 1/10 dosis humana (equivalente a 50 Ig de MPL por 0,5 ml de HD)
6
VPH 16 - 18 L1 0,5 Ig AS01B 1/50 human dose (equivalente a 10 Ig de MPL por 0.5ml HD)
7
VPH 16-18 L1 2Ig AS01B 1/10 dosis humana (equivalente a 50 Ig de MPL por 0,5ml de HD)
8
VPH 16-18 L1 0.5Ig AS01B 1/50 dosis humana (equivalente a 10 Ig de MPL por 0,5ml HD)
VII.6.1 - Respuestas humorales
No se observó intervalo de dosis significativo par las dos dosis ensayadas de antígeno con o bien dilución de adyuvantes para cualquiera de las valoraciones de anti VPH 16-L1 o anti VPH 18-L1 (figura 9)
No se observó intervalo de dosis significativo par las dos dosis ensayadas de cada adyuvante en cuanto la dosis de antígeno para las valoraciones de anticuerpo anti VPH 16-L1.
Cuando se miran las titulaciones de anticuerpo anti VPH 18-L1, se observa un ligero incremento en la valoraciónsegún AS01B (1/10 HD) comparado con AS01B (1/50 HD) como se mide el día 14 después de II (intervalo de dosis 2,5 veces, valor de p = 0,0035), sin embargo este intervalo se observó solamente para 2 Ig de antígeno y no para 0,5 Ig de antígeno (valor de p = 0,0867), el día 45 después de II, no se observó ningún intervalo de dosissignificativo para las dos dosis ensayadas de cada adyuvante con relación a la dosis de antígeno.
VII.6.2 - Respuestas celulares
Tinción de citocinas intracelulares
No se detectó ningún efecto de intervalo de dosis para las dos dosis ensayadas de antígenos con relación a la dosis de adyuvante para VPH 18-L1. Se obtuvieron frecuencias similares de CD4+ T células específicas de VLP16 con dos dosis ensayadas de antígeno con dosis diferentes de adyuvantes. (Figura10).
Se observó un ligero efecto de dosificación (2,6 veces, valor de p = 0,0009 para VPH 18-L1, 2 veces, valor de p =0,0187 para VPH 16-para AS01B (1/10 HD) comparado con AS01B (1/50 HD), sin embargo se observó este intervalo solamente para 2Ig de antígeno y no para 0,5 Ig de antígeno.
Células de memoria B específicas
No se observó ningún efecto de intervalo de dosis para las dos dosis ensayadas de antígenos con relación a la dosisde adyuvante para VPH 16 o 18 L1 (figura 11)
No se observó ningún efecto de intervalo de dosis de adyuvante para las dos dosis ensayadas de adyuvantes conrelación a la dosis de antígeno para VPH 17 o 18 L1.
Como se puede observar a partir de los resultados anteriores, una dilución 1/5 dilución de AS01B produce una formulación que tiene eficacia equivalente en las composiciones inmunogénicas a la propia AS01B.
Ejemplo VIII: Evaluación preclínica de vaunas de S. pneumoniae en ratones.
La vacuna de neumococos usada en este estudio eran unas vacunas conjugadas de neumococos con (11PCV/AS)que constan de una mezcla de 11 conjugados 11 de polisacáridos con adyuvantes o bien con AS01B o AS01E. Losconjugados constan de los serotipos de polisacáridos purificados de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F, cada uno de ellos conjugados individualmente a una proteína vehículo, o bien toxoide de difteria (DT), toxoide de tétanos (TT) o proteína D de H. influenzae (PD). Las vacunas se presentan como un polvo secado por congelación a reconstituir con uno de los líquidos adyuvantes.
11PCV/AS se produce como sigue:
Las condiciones de activación y acoplamiento son específicas para cada polisacárido. Éstas se proporcionan en latabla más adelante. El polisacárido calibrado (excepto para PS5, 6B and 23F) se disolvió en NaCl 2M o en aguapara inyección (WFI). La concentración óptima de polisacárido se evaluó para todos los serotipos. Todos losserotipos excepto el serotipo 18C se conjugaron directamente a la proteína vehículo como se detalla más adelante.
A partir de una solución madre de 100 mg/ml en acetonitrilo o solución de acetonitrilo/agua 50%/50%, se añadióCDAP (relación CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) a la solución de polisacárido. 1,5 minutos después, se añadió 1,5 0,2M -0,3M de NaOH para obtener el pH de activación específica. La activación del polisacárido se realizó a este pHdurante 3 minutos a 25ºC. La proteína purificada (proteína D o DT) (la cantidad depende de la relación inicial dePS/proteína vehículo) se añadió al polisacárido activado y la reacción de acoplamiento se realizó al pH específicodurante hasta dos horas (dependiendo del serotipo) bajo un pH de regulación. Con el fin de inactivar los gruposéster de cianato sin reaccionar, se añadió después una solución 2M de glicina a la mezcla. Se ajustó el pH al pH deinactivación (pH 9,0). La solución se agitó durante 30 minutos a 25ºC y después durante toda una noche a 2 - 8 °Ccon agitación lenta continua.
Preparación de 18C:
18C se ligó a la proteína vehículo mediante un enlace - dihidrazida de ácido adípido (ADH)
Se microfluidificó el serotipo 18C polisacárido antes de la conjugación.
Derivatización del toxoide de tetanus con EDAC
Para la derivatización del toxoide de tétanos, se diluyó TT a 25 mg/ml en NaCl 0,2M y se añadió el espaciador ADH con el fin de alcanzar una concentración final de 0.2 M. Cuando la disolución del espaciador se completó, se ajustóel pH hasta 6,2. EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) se añadió después hasta alcanzar una concentración final de 0,02M y la mezcla se agitó durante 1 hora bajo regulación de pH. La reacción decondensación se detuvo incrementando el pH hasta 9,0 durante al menos 30 minutos a 25ºC.
TT derivatizada se diafiltró después (membrana10 kDa CO) in con el fin de retirar reactivos ADH y EDAC residual.
La cantidad a granel de TTAH se filtró finalmente de manera estéril hasta la etapa de acoplamiento y se almacenó a 70°C.
Acoplamiento químico de TTAH a PS 18C
Los detalles de los parámetros de conjugación se pueden encontrar en la Tabla 1.
Se diluyeron 2 gramos de PS micofluidificado en la concentración definida de agua y se ajustaron hasta 2 M de NaClmediante la adición de NaCl en polvo.
Se añadió solución de CDAP (100 mg/ml preparado recientemente 50/50 v/v acetonitrilo/WFI) para alcanzar la relación apropiada de CDAP/PS.
El pH se incrementó hasta el pH de activación 9,0 mediante la adición de NaOH 0,3 M y se estabilizó a este pH hasta la adición de TTAH.
Después de 3 minutos, se añadió TTAH derivatizado (20 mg/ml en ClNa 0,2 M) hasta alcanzar una relación TTAH /PSde 2; se reguló el pH hasta el pH de acoplamiento de 9,0. Se dejó la solución una hora bajo pH de regulación.
Para inactivar, se añadió una solución de glicina 2M a la mezcla PS/TTAH/CDAP.
Se ajustó el pH hasta el pH de inactivación (pH 9,0).
La solución se agitó durante 30 minutos a 25ºC, y después se dejó durante toda una noche a 2 - 8ºC con agitaciónlenta continua.
Purificación de los conjugados:
Los conjugados se purificaron mediante filtración de gel usando una columna de filtración de gel Sephacryl 500HR
5 equilibrada con NaCl 0,15M (S500HR para 18C) para retirar las moléculas pequeñas (incluyendo DMAP) y PS y proteína no conjugadas. Basándose en los diferentes tamaños moleculares de los componente de reacción, losconjugados PS-PD, PS-TT o PS-DT se eluyen primero, seguido de PS libre, después mediante PD libre o DT libre y finalmente DMAP y otras sales (NaCl, glicina).
Las fracciones que contienen los conjugados se detectan mediante UV280 nm. Se reúnen las fracciones de acuerdo
10 con su Kd, se filtran de manera estéril (0,22 !m) y se almacenan a +2 - 8°C. Se determinaron las relaciones PS/Proteína en las preparaciones de conjugados.
Condiciones específicas de activación/inactivación de conjugados de PS S. pneumoniae - Proteína D/TT/DT
Serotipo
1 Ifluid 3 (μfluid.) 4 Ifluid 5 6B 7F Ifluid
conc. (mg/ml) de PS
2,5 3,0 2,5 7,1 5,0 5,0
disolución de PS
WFI NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M
conc. (mg/ml) de PD
10,0 5,0 10,0 5,0 5,0 10,0
Relación inicial de PS/PD (p/p)
1,5/1 1/1 1,5/1 1/1 1,1/1 1,2/1
conc. de CDAP (mg/mg PS)
0,50 0,75 0,50 0,79 0,83 0,75
pHa=pHc=pHq
9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,5
Serotipo
9V Ifluid 14 Ifluid 18C Ifluid 19F Ifluid 23F
conc, (mg/ml) de PS
5,0 5,0 4,5 9,0 2,38
disolución de PS
NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
conc, (mg/ml) de vehículo proteína
10,0 10,0 20,0 (TT) 20,0 (DT) 5,0
Relación inicial de proteína vehículo/PS (p/p)
1,2/1 1,2/1 2/1 1,5/1 1/1
conc, (mg/mg PS) de CDAP
0,50 0,75 0,75 1,5 0,79
pHa=pHc=pHq
9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
15 Los 11 conjugados se mezclan después, y la preparación antigénica final mezclada con el adyuvanbte antes de la inmunización.
Se inmunizaron IM 40 ratones hembras Balb/c de cuatro semanas de edad los días 0, 14 y 28 con 0,1Ig de conjugados 11-valentes PS formulados con o bien AS01B o AS01E. Se dosificaron anticuerpos Anti-PS IgG mediante ELISA en los sueros recogidos el día 42.
20 Como se puede observar en la figura 12, se observaron respuestas comparables entre la formulación AS01E diluida comparada con la formulación AS01B excepto para PS 14 donde se observó una mayor respuesta con AS01B, y PS19F donde se observó una mayor respuesta con AS01E.
Ejemplo IX: Evaluación preclínica de las composiciones inmunogénicas de citomegalovirus con adyuvantes y sin adyuvantes.
25 IX.1: Cobayas.
IX.1.1 Elisa anti-gB
La cuantificación de anticuerpos anti-gB antibodies se realizó mediante ELISA usando gB como un antígeno decobertura. Se diluyó el antígeno a una concentración final de 4 Ig/ml en PBS y se incubaron 100 Il durante toda una noche a 4 0C en placas de microvaloración de 96 pocillos. Después las placas se saturaron durante 1 hora a 37 0C con 200 Il de PBS que contiene albúmina sérica bovina al 1%. Se añadieron disoluciones en serie dos veces(100 Il/pocillo) y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37 0C. Las placas se lavaron 4 veces con PBS 0,1% de Tween 20 y se añadieron a cada pocillo 100 Il de IgG de peroxidasa de rábano picante anti-cobaya (Dako, Reino
5 Unido) y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37 0C. Se lavaron las placas 4 veces con PBS 0,.1% de Tween 20 y 1 vez con agua agua. Después se incubaron durante 20 minutos a 22 0C con 100 Il de una solución de ofenilendiamina (Sigma) en tampón citrato 0,1 M pH 4,2. Esta reacción se detuvo con 100 Il de H2SO4 2N y se leyó a 490/620 nm. Las valoraciones de Elisa se determinaron mediante interpolación de los valores de la DO a partir deuna referencia de muestra de SoftMaxPr. oLas valoraciones se expresan en EU/ml.
10 Se realizaron analiza estadísticos 14 días después de los datos de 2 Elisa usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de varianza se puede describir brevemente como sigue:
1) Transformación Log de los datos
2) Ensayo Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad
3) Ensayo de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de varianza entre poblaciones15 diferentes (grupos)
4) Análisis de varianza de los datos seleccionados (una cola)
5) Ensayo de Tuckey-HSD para comparación múltiple.
IX.1.2 – Ensayo de Neutralización
Antes del ensayo, se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 3 días a 37ºC con CO2
20 células MRC5 (10000 células/200 Il de medio MEM). Se realizaron e incubaron diluciones de dos veces de suero inactivado (30 minutos a 56ºC) con 100 Il de disolución viral (800/ml) durante 1 hora a 37ºC. Después de laincubación, se inocularon 100 Il de mezcla de suero/virus en microplacas de 96 pocillos que contienen monocapa de MRC5. Las placas se centrifugaron a 2000 RPM durante 1 hora a 35ºC. Después de una incubación a 37ºC, las placas se fijaron con una disolución de acetona al 80% (20 minutos a -20ºC). La disolución de acetona se descartó y
25 las células positivas para CMV Dse detectaron usando un monoclonal específico anti-antígeno temprano inmediato durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y se añadió Ig antirratón conjugada con biotina y seincubó durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió estreptavidina-peroxidasa de rábanopicante durante una adición de 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces y se incubaron durante 10 minutos con una disolución de True-blue. Las señales de color específico se registraron mediante examen bajo el
30 microscopio. Las valoraciones de neutralización se expresaron como la inversa de la dilución más alta de suero dando un 50% de reducción de células CMV positivas comparadas con un control de virus (CMV más células sin suero).
IX.1.3 – Protocolos de Inmunización
Se inmunizaron 4 grupos. Cada grupo contenía 8 conejillos de Indias Hartley Clr:(ha) hembras de 5-8 semanas de
35 edad, excepto por un grupo de control (grupo 4) que contenía sólo 4 sujetos. Los sujetos se inmunizaron IM a 0 y 28 días. Las muestras de suero se recogieron 28 días después de la primera inmunización y 14 días después de lasegunda inmunización. Se llevaron a cabo ensayos de ELISA como se describe anteriormente en suero tomado a 28 tras I y 14 tras II. Los ensayos de neutralización se llevaron a cabo como se describe anteriormente a 14 tras II. Los grupos son como a continuación:
Grupo
Antígeno Coadyuvante
1
gB NaCl
2
gB AS01B
3
gB AS01E
4
NaCl NaCl
40 Para los primeros tres grupos, 15Ig gB (preparados como se describe en el documento WO95/31555) preparado en500 Il de bien PBS, AS01B o bien AS01E (preparados como en el ejemplo II.2 anterior) se inyectaron intramuscularmente. En el grupo 4, PBS solo se administró intramuscularmente.
IX.1.4 – resultados
45 Como se puede ver en la figura 13, se observaron valoraciones de anti-gB ELISA significativamente mayores para los dos grupos coadyuvantes comparadas con la llanura gB (valoración de 8 y 5,5 veces más alta para gB y AS01By gb/AS01E respectivamente). Valoraciones de anticuerpo tras la dosis II fueron muy ligeramente mayores (1,5veces) en el grupo gB/AS01B comparadas con el grupo gB/AS01E.
Comparación múltiple: Tuckey – HSD
Grupo
Casos Media Llanura AS01E AS01B
Llanura
8 4,7917 ** **
AS01E
8 5,5293 **
AS01B
8 5,6942 **
Llanura<AS01E = AS01B
Con respecto a titulaciones de neutralización (figura 14):
•
No se observaron anticuerpos neutralizantes específicos en el grupo de la llanura gB
•
Se detectaron anticuerpos neutralizantes específicos en ambos grupos coadyuvantes
•
Se observaron niveles similares de anticuerpos neutralizantes en ambos grupos coadyuvantes.
IX.2 – Ratones
IX.2.1 – ELISA anti gB
Se llevó a cabo mediante ELISA la cuantificación de anticuerpos anti-gB usando gB como un antígeno de recubrimiento. El antígeno se diluyó a una concentración final de 1 Ig/ml en PBS y se incubaron 100 Il durante toda una noche a 4ºC en placas de microvaloración de 96 pocillos. Las placas se saturaron durante 1 hora a 37ºC con200 Il de PBS que contienen 1% de seroalb·mina bovina. Se añadieron diluciones en serie dos veces de sueros (100 Il/pocillo) y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con Tween 20 al0,1% en PBS y se añadieron 100 Il de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante a cada pocillo durante unos 30minutos adicionales a 37 0C. Las placas se lavaron 4 veces con Tween 20 al 0,1% en PBS y 1 vez con agua. Después de incubaron durante 10 minutos a 22 0C con 100 Il de tetra-metil-benzidina al 75% en tampón citrato 0,1M a pH 5,8. Esta reacción se detuvo con 100 Il de H2SO4 0,4 N y se leyó a 450/620 nm. Se determinaron valoraciones de ELISA mediante interpolación de valores de DO a partir de una referencia de muestra medianteSoftMaxPro. Las valoraciones se expresaron en UE/ml.
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo en los días 14 tras 2 datos de ELISA usando UNISTAT. El protocolo seaplicó para análisis de varianza se puede describir brevemente como sigue:
1) Transformación logarítmica de los datos
2) Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad
3) Prueba de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de varianza entre diferentes poblaciones (grupos)
4) Análisis de varianza en datos seleccionados (una ruta)
5) Prueba Tuckey-HSD para comparación múltiple.
IX.2.2 – Ensayo de Neutralización
Antes del ensayo, se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 3 días a 37ºC con CO2 al 5% células MRC5 (10000 células/200 Il de medio MEM). Se incubaron diluciones de dos veces (60 Il) de suerosinactivados (30 minutos a 56ºC) con 60 Il de disolución viral (800IPU/ml) durante 1 hora a 37ºC. Después de laincubación, se inocularon 100 Il de mezcla de sueros/virus en microplacas de 96 pocillos que contienen célulasMRC5. Las placas de centrifugaron a 2000 RPM durante 1 hora a 35ºC. Después de una incubación a 37ºC, las placas se fijaron con una disolución de acetona al 80% (20 minutos a -20ºC). La disolución de acetona se descartó y las células positivas para CMVD se detectaron usando un antígeno I (IE-I) temprano antiinmediato monoclonalespecífico durante 1 hora a 37ºC. Las placas de lavaron 3 veces con PBS y se añadió Ig antirratón conjugada conbiotina y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió estreptavidina-peroxidasa derábano picante durante una adición de 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces y se incubaron durante 10 minutos con una disolución de True-blue. Las señales de color específico se registraron mediante examen bajo el microscopio. Las valoraciones de neutralización se expresaron como la inversa de la dilución más alta de suero dando un 50% de reducción de células CMV positivas comparadas con un control de virus (CMV más células sin suero).
IX.2.3 – Tinción de citocina Intracelular
Detección intracelular de citoquinas de células T se llevó a cabo en PBL en días 7 y 21 después de la segundainmunización. Se recogieron PBL de ratones y se almacenaron (1 reserva por grupo). Se hizo estimulación conantígeno in vitro de linfocitos (concentración final de 10 · 7 células/ml) bien con una reserva de péptidos que cubre lasecuencia de CMV o bien con la proteína gB. Se incubó mezcla de PBL/antígeno 2 horas a 37ºC. Se incubarondespués células durante toda una noche en presencia de Brefelding (1 Ig/ml) a 37ºC para inhibir secreción decitoquinas.
La tinción celular se llevó a cabo como sigue: las suspensiones celulares se lavaron, se resuspendieron en 50 Il dePBS 1& FCS que contenía reactivo bloqueante de Fc al 2%. Después de 10 minutos de incubación a 4ºC, seañadieron 50 Il de una mezcla de anti-CD4 PE y anti-CD8 perCp y se incubaron 30 minutos a 4ºC. Después de una etapa de lavado en FCS al 1% en PBS, las membranas celulares se permeabilizaron mediante resuspensión en 200Il de Cytofix=Cytoperm (kit de Beckton Dickinson) y se incubaron 20 minutos a 4ºC. Las células se lavaron despuéscon PermWash (kit de BD) y se resuspendieron con 50 Il de un APC anti-IFN-gamma + FITC anti-IL-2 diluidas enPermWash. Después de 2 horas de incubación a 4ºC, las células se resuspendieron en FCS al 1% en PBS + paraformaldehído al 1%.
El análisis de muestras se llevó a cabo mediante FACS. Las células vivas se controlaron y la adquisición se llevó a cabo en +/- 20000 eventos. Los porcentajes de IFNg+ o IL2+ se calcularon en poblaciones CD4+ y CD8+ controladas.
IX.2.4 – Protocolos de Inmunización
Se inmunizaron 4 grupos. Cada grupo contenía 12 ratones C57Bl/6 hembra de 4–10 semanas de edad.
Grupo
Antígeno Coadyuvante
1
gB NaCl
2
gB AS01B
3
gB AS01E
4
NaCl NaCl
5 Para cada grupo, el antígeno (preparado como se describe en el documento WO95/31555 (30 Ig/ml) se prepara en625 Il de PBS o coadyuvante AS01B o AS01E (preparados como en el ejemplo II.2 anterior que tenía una concentración de 100 Il de inmunoestimulantes por ml o 50 Il de inmunoestimulantes por ml respectivamente). 50 Il (es decir 1/10 de una dosis humana de 0,5 ml) se inyectó intramuscularmente. Las inyecciones se llevaron a cabo
10 en los días 0 y 28. Las muestras de suero se recogieron 14 días después de las segundas inyecciones para ensayos ELISA y de Neutralización. Se recogieron PBL 7 días y 21 días tras las segundas inyecciones por ICS.
IX.2.5 – resultados
Valoraciones ELISA Anti–gB (figura 15).
Se observó un nivel de muy débil a indetectable de anticuerpos anti-gB en el grupo gB sin coadyuvantes. Sin 15 embargo, se observó una respuesta de anticuerpos elevada en ambos grupos coadyuvantes. No hubo significancia estadística entre el grupo AS01B y el AS01E.
Comparación múltiple: Tuckey – HSD
Grupo
Casos Media Llanura AS01E AS01B
Llanura
12 2,1132 ** **
AS01E
12 3,9317 **
AS01B
12 3,9375 **
Llanura<AS01E = AS01B
20 Valoraciones neutralizantes anti-CMV (figura 16)
Se observaron valoraciones neutralizantes anti-gB significativamente más altas para los dos grupos coadyuvantescomparados con el grupo llanura gB. No se observó diferencia significativa en valoraciones de anticuerpos neutralizantes entre las formulaciones AS01B y AS01E.
Inmunidad Mediada por células.
25 Debido al nivel muy bajo de respuesta observado después de reestimulación de muestras 7 tras II, no se pudo hacer discriminación entre grupos y no se pudo ver respuesta concluyente para estimulación de CD4 y CD8 (figura 17).Estas respuestas de bajas a indetectables se debieron probablemente a una cuestión técnica durante la preparación de muestras. Sin embargo, se pudieron ver respuestas 21 días tras la segunda inyección. Los datos de CD4 (figura18) no muestran diferencia después de reestimulación mediante gB (5 Ig/ml) o péptidos (2 Ig/ml o 4 Ig/ml). Un
30 perfil de citoquinas similar se ve para AS01E y AS01B. No se puede ver respuesta concluyente para estimulación de CD8 (figura 19)
Estos experimentos muestran que para otra composición antigénica y en dos organismos diferentes, un coadyuvante que tiene niveles más bajos de inmunoestimulantes es tan inmunológicamente efectivo como aquel que tiene niveles mayores.
35 X: Evaluación Preclínica de Vacuna RTS,S con Coadyuvantes
X.1 - Formulación
La composición antigénica, RTS, S se produce en Saccharomyces cerevisiae y consta de dos proteínas, RTS y S,que intracelularmente y espontáneamente se ensamblan dentro de estructuras particuladas poliméricas mezcladasque se estima cada una que contiene, en promedio, 100 polipéptidos. RTS es una cadena polipeptídica híbrida de40 51 kDa de 424 aminoácidos constituida por 189 aminoácidos derivada de un antígeno de superficie de esporozoitos de la cepa NF53 del parásito de la malaria P. falciparum (el antígeno CSP, aminoácidos 207 a 395), condensada alextremo aminoterminal de la proteína S del virus de la hepatitis B. S es un polipéptido de 24 kDa (de 226 aminoácidos de largo) correspondiente al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. El sedimento de antígeno liofilizado contiene aproximadamente 50 Ig (cuando se diseña para formularse en 0,5 ml con AS01B) o 25
45 Ig (cuando se diseña para formularse en 0,5 ml con AS01E) de antígeno.
AS01B y AS01E se prepararon mezclando los diversos componentes (PBS, liposomas, MPL y QS21) en un tanque,y agitando bajo condiciones asépticas. El producto se filtró después de forma estéril antes de cargarse en viales o jeringuillas. El coadyuvante líquido se almacenó desde a +2ºC hasta a +8ºC antes de usarse para reconstituir el sedimento de antígeno liofilizado.
X.2 – Experimentos con ratones
Se llevaron a cabo dos experimentos en ratones que se dirigen a comparar las respuestas inmunes específicas aRTS,S inducidas por RTS,S/AS01B comparadas con RTS,S formulada con AS01E. En cada experimento, se inmunizaron ratones C57Bl/6 (10 ratones/grupo) intramuscularmente tres veces dos semanas aparte con 10, 5 ó 2,5 Ig de RTS,S formulada con coadyuvantes AS01B o AS01E. Controles AS, dos grupos se inmunizaron bien con AS01B o bien con AS01E solo. Las respuestas de anticuerpos específicas para HB y CS se evaluaron para cada ratón mediante ELISA 15 días después de la tercera inmunización. La media geométrica de valoraciones de anticuerpos y sus intervalos de 95% de confianza se calcularon para todos los ratones que reciben el mismotratamiento en ambos experimentos. Los análisis estadísticos para evaluar efecto coadyuvante y efectos de dosisde antígeno se llevaron a cabo en datos almacenados de ambos experimentos. Las respuestas de células T específicas CD4 y células T específicas CD8 se midieron mediante citometría de flujo 7 días después de lasinmunizaciones segunda y tercera en reservas de células sanguíneas de 5 ratones por grupo. Así se generaron dos valores para cada grupo en cada experimento.
Respuesta inmunitaria humoral
Como se muestra en las figuras 20 y 21, ambos coadyuvantes AS01B y AS01E inducen respuestas de anticuerpo comparables fuertes contra CSP y HB.
Una ANOVA de tres rutas en anti-CSP GMT mostró que no hubo ninguna diferencia significativa entre AS01B yAS01E para las dosis de 5 ó 2,5 Ig de RTS,S.
Para la dosis de 10 Ig, se encontró coadyuvante de AS01B para inducir valoraciones anti-CS mayores que AS01E y la razón de GMT “grupo AS01B/grupo AS01E” fue 1,93 (Cl al 95%: 1,33–2,79; p = 0,001)
Respuesta inmunitaria específica mediada por células
Las figuras 22 y 23 muestran los niveles de células T CD4 y CD8 específicas para CSP y HB que expresan IL-2 y/o IFN gamma.
La respuesta CD4 específica para CSP tiende a ser mayor con AS01B comparada con AS01E después de tres inmunizaciones mientras que la respuesta celular de las células T CD8 con AS01E son equivalentes a o mejores que con AS01B.
La respuesta CD4 específica para HBs tiende a ser mayor con AS01B comparada con AS01E después de tresinmunizaciones excepto para las dosis menores de RTS,S donde los niveles de células T CD4 son comparablesentre los dos coadyuvantes. Las respuestas de células T CD8 específicas de HB inducidas por RTS,S formuladascon AS01E son equivalentes a o mejores que las respuestas inducidas mediante RTS,S formuladas con AS01B.
Estas diferencias se piensa que están dentro de la variabilidad esperada de ensayos de inmunología celular.
La evaluación preclínica de la vacuna RTS,S/AS01E en ratones reveló un perfil de seguridad aceptable, similar aaquel de RTS,S/AS01B.
XI: Evaluación clínica de RTS,S/AS01B y RTS,S/AS01E.
Las formulaciones se prepararon como en el ejemplo IX anterior. Se usa sacarosa como un conservante en el sedimento de antígeno liofilizado. Como en el ejemplo IX, el coadyuvante líquido se usó para reconstituir el antígeno liofilizado. Se prepararon AS01B y AS01E como se describe en el ejemplo II.2, y se almacenaron desde a +2 hastaa +8ºC hasta que se necesita para reconstitución.
Un estudio puente de doble ciego aleatorio de fase II de la seguridad e inmunogenicidad de la RTS,S coadyuvadacon AS01E está actualmente en proceso en niños de 18 meses de edad en Gabón. El calendario de vacunación es un calendario de vacunación de 0, 1, 2 – meses. Los objetivos son como sigue para RTS,S/AS01E cuando seadministró a 3 dosis intramuscularmente en un calendario de vacunación de 0, 1, 2 – meses a niños de 18 meses a 4 años de edad que viven en un área endémica de malaria:
Coprincipal
-
para evaluar seguridad hasta un mes tras la dosis 3.
-
para demostrar la no inferioridad a RTS,S/AS02D en términos de respuesta de anticuerpos anti-CS un mes tras la dosis 3.
Secundario
-
para evaluar reactogenicidad hasta un mes tras la dosis 3.
-
para demostrar la no inferioridad a RTS,S/AS02D en términos de respuesta de anticuerpos anti-HB un mes tras la dosis 3.
-
para describir seroprotección contra hepatitis B hasta un mes tras la dosis 3
-
para describir la respuesta anti-CS hasta un mes tras la dosis 3
Terciario
-
Seguridad entre de 1 mes tras la dosis 3 hasta 12 meses tras la dosis 3
-
Respuesta inmunitaria humoral a antígeno CS a 12 meses tras la dosis 3
-Respuesta inmunitaria humoral a antígeno HB a 12 meses tras la dosis 3 5 Exploratorio
-
para evaluar respuesta inmunitaria mediada por células T a antígeno CS hasta 12 meses tras la dosis 3
-
para evaluar respuesta inmunitaria de memoria de células B a antígeno CS hasta 12 meses tras la dosis 3
-
para describir la respuesta anti-CS hasta un mes tras la dosis 3 de acuerdo con el estado de inmunización de HBV documentado en el rastreo.
10 Se apuntarán 180 sujetos. Se estima que aproximadamente 150 sujetos se evaluarán al final del estudio. Se rastrearán los niños masculinos y femeninos de 18 meses de edad a cuatro años de edad. Las vacunas se administran mediante la vía intramuscular al deltoides izquierdo.
Incidencia y naturaleza de los síntomas (solicitados y no solicitados) notificados durante el periodo de 7 días después de la vacunación (días 0-6) tras cada dosis y global (cohorte de vacunados totales)
Cualquier síntoma
Síntomas generales Síntomas locales
IC del 95 %
IC del 95 %
IC del 95 %
Grupo
N n % LL UL N n % LL UL N n % LL UL
Dosis 1
Gr 1 90 40 44,4 34,0 55,3 90 23 25,6 16,9 35,8 90 20 22.2 14,1 32,2
Gr 2
90 47 52,2 41,4 62,9 90 26 28,9 19,8 39,4 90 32 35,6 25,7 46,3
Dosis 2
Gr 1 88 50 56,8 45,8 67,3 88 36 40,9 30,5 51,9 88 35 39,8 29,5 50,8
Gr 2
87 53 60,9 49,9 71,2 87 39 44,8 34,1 55,9 87 34 39,1 28,8 50,1
Dosis 3
Gr 1 83 78 94,0 86,5 98,0 83 34 41,0 30,3 52,3 83 76 91,6 83,4 96,5
Gr 2
85 82 96,5 90,,0 99,3 85 50 58,8 47,6 69,4 85 79 92,9 85,3 97,4
Global/Dosis
Gr 1 261 168 64,4 58,2 70,2 261 93 35,6 29,8 41,8 261 131 50,2 44,0 56,4
Gr 2
262 182 69,5 63,5 75,0 262 115 43,9 37,8 50,1 262 145 55,30 49,1 61,5
Global/Sujeto
90 87 96,7 90,6 99,3 90 60 66,7 55,9 76,3 90 83 92,2 84,6 96,8
90
85 94,4 87,5 98,2 90 70 77,8 67,8 85,9 90 84 93,3 86,1 97,5
Gr, 1= RTS, S, AS01E Gr. 2= controlLL= límite inferiorUL=límite superiorPara cada dosis y global/sujeto: N= número de sujetos con al menos una dosis administrada n/%= número/porcentaje de sujetos que presentan al menos un tipo de síntoma cualquiera que sea la vacuna de estudio administrada Para cada global/dosis: N= número de dosis administradasn/%= número/porcentaje de dosis seguidas por al menos un tipo de síntoma cualquiera que sea la vacuna de estudio administrada IC del 95 %= intervalo de confianza del 95 % exacto, LL= límite inferior, UL= límite superior
Estos datos demuestran que una vacuna RTSS adyuvada con AS01E daba resultados de reactogeneicidadaceptables en una población pediátrica cuando se comparó con una formulación control.
Las respuestas serológicas se midieron evaluando las respuestas de los anticuerpos a HB y a repeticiones de CSP(anti R32LR). El suero para la determinación de anmticuerpos se recogió en la selección, los días 60 y 90 ¨(una
5 segunda vacunación y a la tercera vacunación). Los niveles de anticuperos contra CS se midieron mediante ELISA estándar usando antígeno R32LS absorbido en placa con un anticuerpo de referencia estándar como control deacuerdo con los PNT del laboratorio. Los resultados se indican en UE/ml.
Los anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B se midieron usando un inmunoensayo ELISAdisponible (kit de ensayo AUSAB EIA de Abbott) o equivalente de acuerdo con las instrucciones del ensayo. Los
10 resultados se indican en mUI/ml.
�?ndices de seropositividad y GMC para anticuerpos anti-CS (cohorte de vacunados totales)
>= 0,5 ELU/ml
GMC
IC del 95 %
IC del 95 %
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LL UL valor LL UL Mín Máx
Anti-CS
Gr 1 SELECCIÓN 89 0 0,0 0,0 4,1 0.3 0.3 0.3 <0,5 <0,5
PII (D60)
78 78 100 95,4 100 81,9 64,9 103,2 4,6 568,6
PII (D90)
75 75 100 95,2 100 215,6 178,8 2599,9 14,3 1922,3
GR. 2
SELECCIÓN 90 1 1,1 0,0 6,0 0,3 0,2 0,3 <0,5 0,5
PII (D60)
78 78 100 95,4 100 56,9 45,7 70,9 3,6 2380,9
PII (D90)
80 80 100 95,5 100 164,8 134,1 202,6 6,3 2093,6
Gr, 1= RTS, S, AS01E Gr. 2= control GMC= media geométrica de la concentración de anticuerpo calculada en todos los sujetos N= número de sujetos resultados disponibles n/%= número/porcentaje de sujetos que con concentración dentro del IC del 95% especificado= intervalo de confianza del 95 %; LL= límite inferior UL=límite superior M�?N/M�?X= Mínimo/Máximo
�?ndices de seropositividad y GMC para anticuerpos anti-HB (cohorte de vacunados totales)
>= 010 ELU/ml
GMC
IC del 95 %
IC del 95 %
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LL UL valor LL UL Mín Máx
Anti-HB
Gr 1 SELECCIÓN 89 43 48,3 37,6 59,2 40,8 23,3 71,4 <10,0 46421,6
PII (D60)
78 77 98,7 93,1 100 8936,4 4684,2 17048,7 <10,0 161536,7
PII (D90)
75 75 100 95,2 100 24527,7 15316,5 39278,5 21,1 169430,6
GR. 2
SELECCIÓN 90 37 41,1 30,8 52,0 20,0 12,8 31,0 <10,0 30796,4
PII (D60)
78 77 98,7 93,1 100 3640,0 1963,1 6749,3 <10,0 150811,4
PII (D90)
80 80 100 95,5 100 19485,0 13511,3 28099,9 178,6 110397,4
Gr, 1= RTS, S, AS01E Gr. 2= control GMC= media geométrica de la concentración de anticuerpo calculada en todos los sujetos N= número de sujetos resultados disponibles n/%= número/porcentaje de sujetos que con concentración dentro del IC del 95% especificado= intervalo de confianza del 95 %; LL= límite inferior UL=límite superior M�?N/M�?X= Mínimo/Máximo
15 Estos datos demuestran que una formulación de vacuna RTSS adyuvada con AS01E daba respuestas humorales aceptables en una población pediátrica cuando se comparó con un control validado.
Ejemplo XII: Evaluación preclínica del virus de la varicela zóster con AS01B en comparación con AS01E
La vacuna candidata está compuesta por una proteína truncada de la cubierta del VZV, gE, producida en célulasCHO.
Para peste estudio se primoinmunizaron ratones C57bu6 (n= 48) con una dosis humana (DH) de Varilrix (-4log ufp/dosis) administrada por vía subcutánea. Cinco semanas después de la primoinmunización con Varilrix, losratones se dividieron en 5 grupos de 12 ratones a los que s inyectó por vía intramuscular (tibias) los días 0 y 28, 5 !gde gE sola, , 5 !g de gE + AS01E* (1/10 DH) o , 5 !g de gE + AS01B (1/10 DH). En el grupo control de ratones (solo
5 primoinmunizdos) se inyectó solución salina (NaCl 0,9 %). Las respuestas inmunitarias se evaluaron a los días 14 y/o 30 tras la segunda vacunación. Se evaluaron los niveles de anticuerpos totales específicos de gE y la frecuencia de las células T CD4 y CD8 productoras de citocinas (IL2/IFN).
Respuestas de anticuerpos específicos de gE:
Se realizó un ELISA para detectar y cuantificar los anticuerpos específicos de gE en los sueros de los ratones
10 usando la proteína gE como el antígeno de revestimiento. Los títulos de ELISA se definieron con el recíproco de la dilución del suero que produjo una medida de absorbancia (densidad óptica) igual al 50 % del valor de absorbancia máximo. Los títulos de ELISA se calcularon mediante análisis de regresión.
Los datos demuestran que gE AS01 E y gE AS01 B inducían niveles similares de anticuerpos específicos de gE(valores p > 0,05). Ambas formulaciones indujeron respuestas significativamente mayores en comparación con el
15 antígeno gE solo (10-13 veces, valores p < 0,05) los días 14 y 30 después (Figura 26).
14 días después II
IC 95 % 30 días después II IC 95 %
Grupo
GMT (UE/ml) LL UL GMT (UE/ml) LL UL
gE
12067 5960 24433 3832 911 16115
gE /AS01 E
125934 95504 166059 50439 38071 66825
gE /AS01 B
131728 88112 196934 47589 36158 62635
Varilrix
34 11 105 33 10 102
Respuestas CD4 y CD8 específicas de gE
La producción de citocinas se evaluó en las células CD4 y CD8 usando una técnica de señalización de citocinasintracelulares. Las células del bazo se aislaron de cada grupo de 12 ratones a los 30 días de II y se combinaron en 4
20 grupos de 3 bazos. Las células del bazo (1 x 106) se incubaron durante 2 horas en presencia de péptidos gE (63 péptidos) con la proteína gE completa (péptidos de 20 aa/solapamiento de 10 aa) y después se incubaron durante lanoche en presencia de brefeldina. Después, las células se tiñeron con AcMo fluorescente específico de la superficiecelular de CD4/CD8 y tras la permeabilización de citocinas intracelulares IL-2 e IFNy.
Como se muestra en las figuras 26, aunque las dos formulaciones gE AS01B como gE AS01E inducían perfiles
25 similares de citocinas (IL2/IFNy), la formulación gE AS01B inducía una magnitud mayor de células productoras de citocinas CD4 y CD8 (2 veces, p> 0,05 para CD4, 3,6 veces, p > 0,05 para CD8). Debido a la inesperadamente altavariabilidad de las respuestas de células T, lapotencia para detectar una diferencia significativa entre las dosis deadyuvante era muy limitada (< 50 5). Es importante le hecho de que la gE formulada con AS01B o AS01E inducíacélulas T CD4 productoras de citocinas de una magnitud significativamente mayor (13,3 veces, p< 0,05) en
30 comparación con la gE sola. Niveles mayores de células CD8 tambié fueron inducidas por la gE formulada con AS01 B o AS01 E (3,8 veces, p> 0,05) en comparación con el antígeno gE solo.
Ejemplo XIII: Evaluación preclínica de S01B frente a AS01E en un modelo de gripe en hurones
Procedimientos y materiales
Se obtuvieron hurones hembra (Mustela putorius furo) con edad de 4-6 meses de MISAY Consultancy (Hampshire,
35 UK). Los hurones se prepararon en el día 0 con la cepa heterosubtípica H1N1 A/Estocolmo/24/90 (4 Log TCID50/ml).En el día 21, a los hurones se les inyectó por vía intramuscular una dosis humana completa (dosis de vacuna de1000 !g, 15 !g de HA/cepa, 17,5 g de HA/cepa B) de una combinación de H1N1 A/Nueva Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97. Los hurones después se estimularon en el día 41 por vía intranasal conuna cepa heterosubtípica H3N2 A/Wyoming/3/2003 (4,51 Log TCID50/ml).
40 Las vacunaciones el día 21 fueron con la formulación trivalente sencilla (“plain” en las tablas siguientes) o con la formulación adyuvada trivalente con AS01B (“AS01B” en las tablas siguientes) o AS01E (“AS01E” en las tablassiguientes). Las formuaciones se prepararon como se indica en el ejemplo 3 anterior.
Monitorización de la temperatura corporal:
Las temperaturas individuales se monitorizaron durante el periodo de exposició y se evaluaron usando implantes de
45 telemetría que registraron cada temperatura individual de cada animal cada 15 minutos antes y después de la exposición. Todos los implantes se comprobaron y se realizó una nueva calibración mediante DSI antes de lacolocación en la cavidad intraperitoneal. Todos los animales fueron estabulados individualmente en una sola jaula durante estas mediciones.
Las temperaturas se registraron cada15 minutos, 6 días antes de la inmunización hasta 4 días después de la50 inmunización, así como 3 días antes de la exposición hatsa 7 días después de la exposición.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Procedimiento de ensayo
Los títulos de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (IH). El principio de la prueba de la IH se basa en la capacidad de los
5 anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros inactivados con calor se trataron previamente con caolín y RBC de pollo paraeliminar los inhibidores no específicos. Tras el pretratamiento, diluciones de dos en dos de suero se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos de pollo y seclasificó la inhibición de la aglutinación. Los títulos se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectablese clasificó como un título igual a 5.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron en los títulos de IH posteriores a la vacunación usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
15 Transformación log de los datos
Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos
Prueba de Cochran para verificar la homogeneicidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)
Análisis bilateral de la varianza realizado en los grupos
Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples
Titulación viral en lavados nasales
Todas las muestras nasales primero se filtraron en esterilidad a través de filtros Spin X (Costar) para eliminar toda contaminación bacteriana. 50 μl de diluciones seriadas de diez en diez de lavados nasales se transfirieron a placasde microtitulación que contengan 50 μl de medio (10 pocillos/dilución). A continuación se añadieron 100μl de células
25 MDCK (2,4 x 105 células/ml) a cada pocillo y se incubaron a 35ºC durante 5-7 días. Tras 6-7 días de incubación, el medio de cultivo se elimina suavemente y se añaden 100 μl de un medio con /20 WST-1 y se incuban durante otras18 horas.
La intensidad del pigmento amarillo formazán producido tras la reducción de WST-1 mediante células viables esproporcional al número de células viables presente en el pocillo al final del ensayo de titulación vírica y se cuantificamidiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda adecuada (450 nanómetros). El valor de corte sedefine como la DO media de las células control no infectadas, 0,3 DO (0,3 DO corresponde a una desviaciónestándar de +/- 3 de la DO de las células control no infectadas). Una puntuación positiva se define cuando la DO es < del valor de corte y, en contraste, una puntuación negativa se define cuando la DO es > del valor de corte. Lostítulos de eliminación del virus se determinaron mediante “Reed y Muench” y se expresaron en forma de DICT50/ml..
35 Ensayo de linfoproliferación
Las PBMC se recolectaron mediante centrifugación en gradiente de densidad (20 min a 2500 rpm y 4 ºC) en FicollCedarlane, solución para mamíferos. Las PB,C se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo (RPMI/añadir a 4 ºC) y 10 % de suero normal para hurones. Los aditivos estaban compuestos por piruvato sódico 100 mM, aminoácidosno esenciales MEM, penicilina/estreptomicina, glutamina y 1000 x concentrado de 12-mercaptoetanol. Los PMBC recién aislados se usaron inmediatamente para los ensayos de proliferación in vitro. Las céluals se introdujeron enplacas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pcollos a 2 a 105 células/pocillo y se cultivaron con diferentes concentraciones de antígeno (0,1 a 1 !g HA de virus entero inactivad) durante de 44 a 96 horas y, después, se marcaron con pulsos con 0,5 !Cl de timidina tritiada. La incorporación del radiomarcaje se estimó de 4 a 16 hdespués mediante espectroscopia de emisión 1.
45 Resultados
La carga viral en los lavados nasales tras la exposición.
Los lavados nasales se recogieron 2 días antes de la inmunización (inmunización= día 0), 1, 2 y 7 días después dela inmunización, además de 4 días antes de la exposición (Exposición = día 42) y durante un periodo de 7 días trasla exposición.
Grupo
-2 0 +1 +2 +7 39 42 43 44 45 47 49
Plain
0,82 1,84 5,35 1,85 0,8 1,82 5,77 4,44 1,97 0,9
AS01E
0,82 2,11 5,83 1,65 0,8 1,62 4,93 4,15 2,4 0,85
AS01B
0,82 2,26 5,83 1,91 0,82 1,74 2,25 1,89 1,,350 0,9
Véase Los resultados en la figura 27. Diseminación viral tras la inmunización. Se observó un pico de diseminación viral en todos los hurmoes 2 días
después de la inmunización, 7 días después de la inmunización sólo se observó una carga viral residual en todos los grupos.
Diseminación viral tras la exposición
El pico de diseminación viral se observó 24 horas después de la exposición.
La titulación viral 3 días después de la exposición mostró títulos virales altos (sin protección) en los hrumoesinmunizados con la sencilla trivalente dividida.
Se observó una reducción menor de la diseminación viral en hurones inmunizados con S01E trivalente sencilla dividida que lo observado con la adyuvada trivalente dividida con AS01B.
Monitorización de la temperatura corporal:
La temperatura corporal se monitorizó desde 6 días antes de la inmunización (inmunización dIa = 0) hasta 4 días después, además de 3 días antes de la exposición hasta 7 días después de la exposición (exposición= día 42). Lasmediciones se tomaron cada 15 minutos y se realizó la media al medio día para cada grupo, Los resultados sepueden ver en la figura 28 .
Postinmunización
La temperatura corporal monitorizada antes, durante y después de la inmunización mostró un incremento de latemperatura en todos los grupos.
Postexposición
La interpretación de la monitorización de la temperatura corporal es difícil. Se observó un ligero incremento de latemperatura corporal tras la exposición en hurones inmunizados con la S01 E trivalente sencilla dividida y trivalentedividida, pero no con AS01B trivalente dividida. La puntuación siguiente se obtuvo por el número de hurmoes con unincremento de la temperatura corporal > 0,4 ºC.
Incremento en la temperatura postexposición
Trivalente sencilla: 5/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,7, +0,8)
Trivalente AS01B 0/8
Trivalente AS01E 6/8 ((+0,4, +0,4, +0,5, +0,5, +0,9, +1,6)
Esta lectura es menos sólida que otras lecturas usadas en huriones.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Las muestras de suero se recogieron 4 días antes de la inmunización, 17 días después de la inmunización, 21 díasde la inmunización y 13 días después de la exposición. Los resultados se pueden ver en las figuras 29 y 30. Para lastres cepas de vacuna se observaron títulos de HI significativamente estadísticamente mayores en hurones inmunizados con la trivalente dividida adyvada con AS01B o AS01 E en comparación con la sencilla trivalentedividida. No se observaron diferencias entre los dos grupos adyuvados. En comparación con otros grupos, seobservaron títulos de HI reacción cruzada estadísticamente signficativos frente a A/New York H3N2 (cepa de exposición) tras la inmunización de los hurones con vacunas divididas trivalentes adyuvadas con AS01 B.
T,

Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición inmunogénica en un volumen apropiado para una dosis humana que comprende un antígeno opreparación antigénica, en combinación con un coadyuvante que comprende una fracción de saponinainmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposomay un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en dichadosis humana a un nivel de entre 1 Ig y 30 Ig.
  2. 2.
    Una composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que dicha composición coadyuvante comprendeadicionalmente un esterol, en la que la relación de saponina:esterol es de 1:1 a 1:100 p/p.
  3. 3.
    Una composición antigénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que dicha fracción de saponinainmunológicamente activa es QS21.
  4. 4.
    Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en la que dicho esterol escolesterol.
  5. 5.
    Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho lipopolisacárido es underivado de lípido A.
  6. 6.
    Una composición inmunogénica según la reivindicación 5, en la que dicho derivado de lípido A es 3D-MPL.
  7. 7.
    Una composición inmunogénica según la reivindicación 6, en la que la relación QS21: 3D-MPL es 1 : 1.
  8. 8.
    Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho lipopolisacárido está presente en una cantidad de 25 Ig.
  9. 9.
    Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho lipopolisacárido está presente en una cantidad de 1-15 Ig.
  10. 10.
    Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicha saponina está presente en una cantidad de 1 – 25 Ig.
  11. 11.
    Una composición inmunogénica según la reivindicación 10, en la que dicha saponina está presente en unacantidad de 25 Ig.
  12. 12.
    Una composición inmunogénica según la reivindicación 10, en la que dicha saponina está presente en unacantidad de 1 – 10 Ig.
  13. 13.
    Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho volumen de dosishumana adecuado para uso humanoestá entre 0,5 y 1,5 ml.
  14. 14.
    Una composición inmunogénica según la reivindicación 7, en la que QS21 y ED-MPL están a un nivel de entre20-30 !g.
  15. 15.
    Una composición adyuvante en un volumen adecuado para usar en una dosis humana de una composición inmunogénica que comprende entre 1 y 30 !g de un lipopolisacárico y entre 1 y 30 !g de una fracción de saponina inmunológicamente activa presentada en forma de un liposoma.
  16. 16.
    Una composición adyuvante según la reivindicación 15, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado de lípido
    A.
  17. 17.
    Una composición adyuvante según la reivindicación 16, en la que dicho derivado de lípido A es 3D-MPL.
  18. 18.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en la que dicha fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21.
  19. 19.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho volumen adecuadopara dosis humana es 250 Il.
  20. 20.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho volumen adecuadopara dosis humana es 360 Il.
  21. 21.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho lipopolisacáridoestá presente en una cantidad de 25 Ig.
  22. 22.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho lipopolisacáridoestá presente en una cantidad de 10 Ig.
  23. 23.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, en la que dicho lipopolisacáridoestá presente en una cantidad de 5 Ig.
  24. 24.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-23, en la que dicha saponina inmunológicamente activa está presente en una cantidad de 25 Ig.
  25. 25.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-23, en la que dicha saponina inmunológicamente activa está presente en una cantidad de 10 Ig.
  26. 26.
    Una composición adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 15-23, en la que dicha saponina inmunológicamente activa está presente en una cantidad de 5 Ig.
  27. 27.
    Una dosis humana de una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para uso enmedicina.
    Figura 1 –
    MPL® en polvo L Suspensión (10 mg/ml) L Tratamiento térmico L Enfriamiento L Microfluidización L Dilución a 2 mg/ml L Prefiltración en 0,65 Im L Filtración en 0,2 Im L Dilución a 1 mg/ml L Almacenamiento a +2/+8ºC
    Figura 2 –
    Figura 3 – Figura 4 – Figura 5 – Figura 6 -
    Figura 7
    Figura 8
    % de síntomas reseñados (con IC 95%)
    100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
    Flu YNG Rel. de grado 3Flu ELD
    Rel. de grado 3 AS01B
    Rel. de grado 3 AS01E
    Rel. de grado 3
    Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3 AS01BRel. de grado 3 AS01E
    Rel. de grado 3
    Grupo de vacuna
    Figura 9: Figura 10: Figura 11: Figura 12: Figura 13: Figura 14:
    0,0 0,5 1,0% 1,5% 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5Frecuencia de células B de memoria específicasde VLP 16 en la memoria IgG total
    2μg 0,5μg AS04 1/10 2μg 0,5μg 2μg 0,5μg 2μg 0,5μg GMT +/-AS01B 1/50 1/10 1/50
    Figura 16:
    % específico de CMV en la población de CD8+
    1,5
    1,0
    0,5
    0,0
    1,5μg gB simple CD8+IL2+INFg+ 0,00 CD8+IL2+ 0,00 CD8+INFg+ 0,02
    Reestimulación con péptidos de gB 2 μg/ml
    2,0
    1,5μg gB AS01b 0,00 0,00 0,04
    1,5μg gB NaclAS01e
    0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 0,00
    Figura 18: Figura 19: Figura 20:
    Figura 21:
    AS01B AS01E
    RTS,S 10µg -AS01B RTS,S 5µg -AS01B RTS,S 2,5µg -AS01B RTS,S 10µg -AS01E RTS,S 5µg -AS01E RTS,S 2,5µg -AS01E
    Figura 22: Figura 23: Figura 24: Figura 25:
ES06831376T 2005-12-13 2006-12-12 Composición inmunogénica que comprende un adyuvante Active ES2378471T3 (es)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0525321.6A GB0525321D0 (en) 2005-12-13 2005-12-13 Novel compositions
GB0525321 2005-12-13
GB0609902A GB0609902D0 (en) 2006-05-18 2006-05-18 Novel composition
GB0609902 2006-05-18
GB0620337A GB0620337D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620337 2006-10-12
GB0620336 2006-10-12
PCT/GB2006/004634 WO2007068907A2 (en) 2005-12-13 2006-12-12 Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2378471T3 true ES2378471T3 (es) 2012-04-12

Family

ID=37876836

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11168827.1T Active ES2436645T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina
ES11168822.2T Active ES2444623T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un coadyuvante de saponina
ES11168821.4T Active ES2445170T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina
ES11168826.3T Active ES2451573T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina
ES06831376T Active ES2378471T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composición inmunogénica que comprende un adyuvante
ES11168820.6T Active ES2479165T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacunas que comprenden un coadyuvante de saponina

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11168827.1T Active ES2436645T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina
ES11168822.2T Active ES2444623T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un coadyuvante de saponina
ES11168821.4T Active ES2445170T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina
ES11168826.3T Active ES2451573T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11168820.6T Active ES2479165T3 (es) 2005-12-13 2006-12-12 Composiciones de vacunas que comprenden un coadyuvante de saponina

Country Status (28)

Country Link
US (3) US20080279926A1 (es)
EP (6) EP2364721B1 (es)
JP (2) JP5461015B2 (es)
KR (1) KR101363879B1 (es)
CN (3) CN102631670A (es)
AR (1) AR058543A1 (es)
AT (1) ATE542543T1 (es)
AU (1) AU2006325377B2 (es)
BR (1) BRPI0619795B8 (es)
CA (1) CA2633008C (es)
CR (2) CR10101A (es)
CY (3) CY1112589T1 (es)
DK (3) DK1959992T3 (es)
EA (2) EA014353B1 (es)
ES (6) ES2436645T3 (es)
HR (3) HRP20120136T1 (es)
IL (2) IL191703A (es)
MA (1) MA30023B1 (es)
MY (1) MY145943A (es)
NO (1) NO20082472L (es)
NZ (2) NZ568825A (es)
PE (1) PE20071098A1 (es)
PL (3) PL2364724T3 (es)
PT (3) PT1959992E (es)
SG (2) SG10201405533TA (es)
SI (3) SI2364720T1 (es)
TW (1) TWI457133B (es)
WO (1) WO2007068907A2 (es)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101515078B1 (ko) 2005-12-22 2015-04-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
WO2007144772A2 (en) * 2006-06-15 2007-12-21 Novartis Ag Adjuvant-sparing multi-dose influenza vaccination regimen
CA2690708A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
EP2034022A1 (en) 2007-09-10 2009-03-11 Universite Libre De Bruxelles Leukotriene B4 binding soluble lipocalin receptor from ixodes ricinus
EP2045263A1 (en) 2007-10-02 2009-04-08 Universite Libre De Bruxelles Identification and molecular characterisation of salivary metalloproteases expressed in the tick salivary glands
JP5711972B2 (ja) * 2007-12-24 2015-05-07 アイディー バイオメディカル コーポレイション オブ ケベック 組換えｒｓｖ抗原
PE20110992A1 (es) 2009-02-17 2012-02-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende un antigeno del virus del dengue
GB0910046D0 (en) * 2009-06-10 2009-07-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compositions
CN104288763B (zh) * 2009-06-19 2018-03-06 艾金株式会社 宫颈癌疫苗
HUE028085T2 (en) 2009-06-24 2016-11-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant RSV antigens
EP2445527A2 (en) 2009-06-24 2012-05-02 ID Biomedical Corporation of Quebec Vaccine
CA2768186A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same
AU2010335970B2 (en) * 2009-12-22 2016-11-03 Sanofi Pasteur Limited Immunogenic compositions
CN101791401B (zh) * 2009-12-31 2012-04-18 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼用浸泡疫苗多组合佐剂及其应用和使用方法
BR112012018669A2 (pt) 2010-01-27 2017-09-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteína rv3616c modificada, uso de uma proteína rv3616c modificada, polinucleotídeo, uso de um polinucleotídeo, composição farmacêutica, composição imunogênica, proteína de fusão, e, polipeptídeo.
GB201101331D0 (en) * 2011-01-26 2011-03-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions and uses
JP2017071615A (ja) * 2010-10-27 2017-04-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 神経障害を治療するための免疫原性組成物及び方法
CA2835644C (en) 2011-05-13 2021-06-15 Novartis Ag Pre-fusion rsv f antigens
CN103533953A (zh) 2011-05-17 2014-01-22 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 针对肺炎链球菌的疫苗
GB201116248D0 (en) * 2011-09-20 2011-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Liposome production using isopropanol
CN113876945A (zh) * 2011-10-06 2022-01-04 免疫疫苗技术有限公司 包括激活或增加tlr2活性的佐剂的脂质体组合物及其应用
GB201213364D0 (en) 2012-07-27 2012-09-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Purification process
DK2885007T3 (en) * 2012-08-16 2018-12-03 Pfizer Methods for glycoconjugation and compositions
WO2014086787A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
MX2016001695A (es) * 2013-08-05 2016-05-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Composiciones inmunogenas de combinacion.
RU2016109150A (ru) * 2013-10-03 2017-11-10 Нитто Денко Корпорейшн Мукозальная вакцинная композиция
CN105530958A (zh) 2013-10-03 2016-04-27 日东电工株式会社 粘膜疫苗组合物
US10071155B2 (en) 2013-10-03 2018-09-11 Nitto Denko Corporation Nasal mucosal vaccine composition
WO2015050181A1 (ja) * 2013-10-03 2015-04-09 日東電工株式会社 注射ワクチン組成物
GB201318862D0 (en) * 2013-10-25 2013-12-11 Glaxosmithkline Biolog Sa Calcium fluoride compositions
AU2015236106A1 (en) * 2014-03-25 2016-10-20 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Non-toxic adjuvant formulation comprising a monophosphoryl lipid a (MPLA)-containing liposome composition and a saponin
GB201405921D0 (en) * 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3233118A1 (en) * 2014-12-18 2017-10-25 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccination
EP3242883A4 (en) 2015-01-06 2018-10-17 ImmunoVaccine Technologies Inc. Lipid a mimics, methods of preparation, and uses thereof
KR20200038339A (ko) * 2015-09-10 2020-04-10 인벤트프라이즈 엘엘씨 다가 vlp 접합체
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
CN108778289B (zh) 2015-11-06 2020-11-17 佐剂技术公司 三萜皂苷类似物
GB201522068D0 (en) * 2015-12-15 2016-01-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Dried composition
BE1024160B9 (fr) 2015-12-22 2017-12-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Formulation immunogène
CN105770887A (zh) * 2016-03-04 2016-07-20 邓招红 一种用于hbv疫苗的佐剂及其制备方法
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US10695424B2 (en) 2016-12-07 2020-06-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method of making a liposome composition
CN110225757A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CA3061205A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Triterpene saponin analogues
EP3615005B1 (en) 2017-04-28 2025-07-30 The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. Compositions and methods for vaccine delivery
BR112019025104A2 (pt) 2017-05-30 2020-06-23 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Método de fabricar um sistema de entrega não viral, sistema de entrega não viral, e, composição
MX2020002558A (es) 2017-09-07 2020-07-13 Merck Sharp & Dohme Procesos para la formulacion de polisacaridos neumococicos para la conjugacion a una proteina transportadora.
WO2019051149A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Infectious Disease Research Institute LIPOSOMAL FORMULATIONS COMPRISING SAPONIN AND METHODS OF USE
SG11202001826YA (en) 2017-10-16 2020-03-30 Adjuvance Technologies Inc Triterpene saponin analogues
ES2991988T3 (es) 2017-10-30 2024-12-05 Takeda Pharmaceuticals Co Detergentes compatibles con el medio ambiente para la inactivación de virus con envoltura lipídica
WO2019106191A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Saponin extraction
BR112020010790A2 (pt) 2017-12-01 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. purificação da saponina
WO2019175147A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccines against intra-abdominal infections
TWI820099B (zh) 2018-03-28 2023-11-01 台灣浩鼎生技股份有限公司 新穎皂素佐劑及其評估方法
US11389519B2 (en) * 2018-06-11 2022-07-19 Inventprise, Llc Virus-like particle conjugates
CN112969474A (zh) 2018-09-12 2021-06-15 艾芬尼维克斯公司 多价肺炎球菌疫苗
WO2020055503A1 (en) 2018-09-14 2020-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Nanoparticle vaccine adjuvant and methods of use thereof
EP3886901A1 (en) 2018-11-29 2021-10-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2020154595A1 (en) 2019-01-24 2020-07-30 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid nanostructure platform for antigen presentation and vaccine formulations formed therefrom
IL286467B2 (en) 2019-03-18 2026-02-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Methods for producing bioconjugates of polysaccharides E. coli o-antigen, preparations thereof and methods for using them
CA3134216A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
WO2020245207A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Saponin purification
US20220273789A1 (en) 2019-07-21 2022-09-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Therapeutic viral vaccine
EP3777884A1 (en) 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
EP4021407A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
JP2022550884A (ja) 2019-10-02 2022-12-05 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ペプチドおよび使用方法
CN112972671B (zh) 2019-12-13 2024-04-19 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 药物组合物及其用途
WO2021122551A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa S. aureus antigens and compositions thereof
EP4461744A3 (en) 2020-01-16 2025-01-08 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Fimh mutant, compositions therewith and use thereof
JP2023516904A (ja) * 2020-02-14 2023-04-21 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー Ｈｐｖワクチン
BR112022017852A2 (pt) 2020-03-09 2022-11-01 Dynavax Tech Corp Vacinas para herpes zoster compreendendo um agonista de tlr9
WO2021195024A1 (en) * 2020-03-23 2021-09-30 Adjuvance Technologies, Inc. Adjuvant compounds, salt forms, and formulations
EP4146378A1 (en) * 2020-05-05 2023-03-15 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Microfluidic mixing device and methods of use
WO2021245611A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
TWI810589B (zh) 2020-06-21 2023-08-01 美商輝瑞股份有限公司 人巨細胞病毒糖蛋白Ｂ（ｇＢ）多肽
WO2022056195A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 The Rochester General Hospital Haemophilus infuluenzae vaccine and methods of use
AU2021342797B2 (en) 2020-09-17 2024-02-08 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Multivalent vaccine compositions and uses thereof
AU2021367917A1 (en) * 2020-10-28 2023-06-22 Sanofi Pasteur Liposomes containing tlr4 agonist, preparation and uses thereof
GB2600468A (en) 2020-10-30 2022-05-04 Excivion Ltd Adjuvant composition
KR20250007029A (ko) 2021-01-12 2025-01-13 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 FimH 돌연변이체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도
EP4032547A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Hsv1 fce derived fragements for the treatment of hsv
IL307247A (en) 2021-04-01 2023-11-01 Janssen Pharmaceuticals Inc Production of E. Coli O18 bioconjugates
WO2023020994A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
JP2024532127A (ja) * 2021-08-19 2024-09-05 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 熱安定性脂質ナノ粒子およびその使用方法
CN116199727B (zh) * 2021-12-01 2025-04-08 上海安奕康生物科技有限公司 一种mpl三乙胺盐、其制备工艺及应用
WO2023114570A1 (en) 2021-12-19 2023-06-22 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for long-lasting germinal center responses to a priming immunization
US20250161429A1 (en) 2022-02-14 2025-05-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pan-pneumovirus vaccine compositions and methods of use thereof
JP2025509460A (ja) 2022-03-14 2025-04-11 ファイザー・インク アジュバントを生産するための方法
CN114767844B (zh) * 2022-04-28 2025-12-23 泰州拜奥生物技术有限公司 一种水痘-带状疱疹病毒疫苗及其应用
CN116162173B (zh) * 2022-10-28 2024-06-04 安徽农业大学 一种GnRH6-CRM197重组蛋白去势疫苗及制备方法
AU2023403045A1 (en) 2022-12-01 2025-06-12 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
CN120813371A (zh) 2023-03-02 2025-10-17 赛诺菲巴斯德有限公司 用于在衣原体病的治疗中使用的组合物
US12502424B2 (en) 2023-05-05 2025-12-23 Sanofi Pasteur Inc. Compositions for use in treatment of acne
WO2025015042A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Dynavax Technologies Corporation Lyme disease vaccines comprising an adjuvant and a borrelia outer surface protein a antigen
WO2025015077A1 (en) 2023-07-10 2025-01-16 Dynavax Technologies Corporation Lyme disease vaccines comprising an adjuvant and borrelia outer surface protein a and c antigens
TWI909678B (zh) 2023-09-13 2025-12-21 美商輝瑞股份有限公司 產製佐劑之方法
TW202527906A (zh) * 2023-09-14 2025-07-16 美商輝瑞股份有限公司 包含經結合之肺炎鏈球菌莢膜醣抗原之佐劑化致免疫性組成物及其用途
WO2025163460A2 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Pfizer Inc. Vaccines against respiratory diseases
WO2025191415A1 (en) 2024-03-11 2025-09-18 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated escherichia coli saccharides and uses thereof

Family Cites Families (191)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US666843A (en) * 1900-07-02 1901-01-29 Eastman Kodak Co Spirit-level.
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
DE2921961C2 (de) 1979-05-30 1986-02-06 Santrade Ltd., Luzern/Lucerne Bohreinheit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
DD155875A1 (de) 1980-12-31 1982-07-14 Willy Nordheim Verfahren zur herstellung eines ballaststoffarmen inaktivierten influenzaimpfstoffes
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
DD211444A3 (de) 1982-08-19 1984-07-11 Saechsisches Serumwerk Verfahren zur herstellung von influenza-impfstoffen
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
DD300833A7 (de) 1985-10-28 1992-08-13 Saechsische Landesgewerbefoerd Verfahren zur herstellung von inaktivierten influenza-vollvirusimpfstoffen
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
US6054438A (en) 1987-01-07 2000-04-25 Imperial Cancer Research Technology Limited Nucleic acid fragments encoding portions of the core protein of the human mammary epithelial mucin
CA1339204C (en) 1987-01-07 1997-08-05 Joyce Taylor-Papadimitriou Mucin core polypeptide, antibodies and probes
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
EP0362278A4 (en) 1987-06-05 1990-05-14 Us Health Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management.
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
DE3734306A1 (de) * 1987-10-10 1989-04-27 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung fuer fliessfaehige medien
US4963484A (en) 1988-01-29 1990-10-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Genetically engineered polypeptides with determinants of the human DF3 breast carcinoma-associated antigen
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
WO1990006951A1 (en) 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
GB8913737D0 (en) 1989-06-15 1989-08-02 Univ Birmingham A novel anti-allergy treatment
EP0414374B1 (en) 1989-07-25 1997-10-08 Smithkline Biologicals S.A. Novel antigens and methods for their preparation
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
DE4005528C2 (de) * 1990-02-22 1998-01-15 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
CA2059693C (en) 1991-01-28 2003-08-19 Peter J. Kniskern Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae
CA2059692C (en) 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
FI933580A7 (fi) 1991-02-15 1993-10-13 Uab Research Foundation Pneumokokkiproteiinin rakennegeeni
GB9113809D0 (en) 1991-06-26 1991-08-14 Cancer Res Campaign Tech Papillomavirus l2 protein
ES2194839T3 (es) 1991-07-19 2003-12-01 Univ Queensland Vacuna de papilomavirus.
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
AU2927892A (en) 1991-11-16 1993-06-15 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Hybrid protein between cs from plasmodium and hbsag
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
CA2138997C (en) * 1992-06-25 2003-06-03 Jean-Paul Prieels Vaccine composition containing adjuvants
EP1835029A1 (en) 1992-06-25 2007-09-19 Georgetown University Papillomavirus vaccines
JPH06510799A (ja) 1992-06-25 1994-12-01 シティ・オブ・ホープ サイトメガロウイルスのポリペプチドによる細胞溶解性ｔ−リンパ球の誘導
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
GB9224584D0 (en) 1992-11-23 1993-01-13 Connaught Lab Use of outer membrane protein d15 and its peptides as vaccine against haempohilus influenzae diseases
ATE492289T1 (de) 1993-03-09 2011-01-15 Univ Rochester Herstellung von menschlichen papillomavirus hbv- 11 kapsidprotein l1 und virus-ähnliche partikeln
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5776468A (en) 1993-03-23 1998-07-07 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid A
JP3429313B2 (ja) 1993-05-18 2003-07-22 オハイオ・ステイト・リサーチ・ファウンデーション 中耳炎ワクチン
US5744144A (en) 1993-07-30 1998-04-28 University Of Pittsburgh University Patent Committee Policy And Procedures Synthetic multiple tandem repeat mucin and mucin-like peptides, and uses thereof
WO1995008348A1 (en) 1993-09-22 1995-03-30 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs
BE1007535A3 (nl) 1993-09-24 1995-07-25 Innovative Sputtering Tech Gelaagde metaalstructuur.
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
GB9409962D0 (en) 1994-05-18 1994-07-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
DE122007000092I1 (de) 1994-10-07 2008-03-27 Univ Loyola Chicago Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
JP3958360B2 (ja) 1995-02-24 2007-08-15 キャンタブ ファーマシューティカルズ リサーチ リミティド 免疫治療剤として役立つポリペプチド及びポリペプチド調製の方法
IL117459A (en) 1995-03-22 2005-11-20 Merck & Co Inc Dna encoding human papillomavirus type 18
US20030219453A1 (en) * 1998-03-19 2003-11-27 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Vaccines
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US20010053365A1 (en) * 1995-04-25 2001-12-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines
GB9620795D0 (en) * 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US5688267A (en) * 1995-05-01 1997-11-18 Ep Technologies, Inc. Systems and methods for sensing multiple temperature conditions during tissue ablation
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5668267A (en) 1995-05-31 1997-09-16 Washington University Polynucleotides encoding mammaglobin, a mammary-specific breast cancer protein
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
EA199800046A1 (ru) 1995-06-07 1998-06-25 Байокем Вэксинс Инк. Полипептид, последовательность днк, вакцинная композиция (варианты), антитело или его фрагмент, вакцина, применения указанных полипептида, последовательности днк и антитела или его фрагмента
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US5997881A (en) 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
ES2262177T3 (es) 1996-05-01 2006-11-16 The Rockefeller University Proteinas de union a colina para vacunas frente a neumococos.
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
WO1998006734A1 (en) 1996-08-16 1998-02-19 Smithkline Beecham Corporation Novel prokaryotic polynucleotides, polypeptides and their uses
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
JP4469026B2 (ja) 1996-10-31 2010-05-26 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原およびワクチン
JP2002503087A (ja) 1996-11-12 2002-01-29 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ ストレプトコッカス・ニューモニアのｃ３結合タンパク質
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
WO1998033923A1 (en) 1997-01-30 1998-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine MUTANT msbB or htrB GENES
CA2281954A1 (en) 1997-02-25 1998-08-27 Corixa Corporation Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
JP3036686B2 (ja) 1997-02-27 2000-04-24 政夫 高橋 冠状動脈のバイパス手術に用いる血管吻合部の止血保持装置
DE19708537A1 (de) 1997-03-03 1998-09-10 Biotechnolog Forschung Gmbh Neues Oberflächenprotein (SpsA-Protein) von Streptococcus pneumoniae etc.
CN1326564C (zh) * 1997-04-01 2007-07-18 科里克萨有限公司 单磷酰基脂质a的水性免疫佐剂组合物
ZA982968B (en) 1997-04-09 1998-10-27 Corixa Corp Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
WO1998050567A1 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
AU739129B2 (en) 1997-06-03 2001-10-04 Connaught Laboratories Limited Lactoferrin receptor genes of moraxella
GB9712347D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP0998557A2 (en) 1997-07-21 2000-05-10 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
US5928215A (en) * 1997-08-14 1999-07-27 Becton, Dickinson And Acompany Syringe filling and delivery device
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU1145699A (en) * 1997-09-05 1999-03-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Oil in water emulsions containing saponins
EP1015561B1 (en) 1997-09-05 2006-07-19 Medimmune, Inc. In vitro method for disassembly/reassembly of papillomavirus virus-like particles (vlps)
AU9510598A (en) 1997-09-24 1999-04-12 American Cyanamid Company Human complement c3-degrading proteinase from (streptococcus pneumoniae)
AU2447999A (en) 1997-09-26 1999-05-03 Corixa Corporation Murine model for human carcinoma
WO1999033869A2 (en) 1997-12-24 1999-07-08 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
CZ298364B6 (cs) 1998-02-05 2007-09-05 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Deriváty antigenu asociovaných s nádory z MAGE rodiny a sekvence nukleových kyselin kodující tyto deriváty, jejich použití pro prípravu fúzních proteinu a prostredku pro vakcinaci
US20020039584A1 (en) 1998-02-20 2002-04-04 Medigene Ag Papilloma virus capsomere vaccine formulations and methods of use
DE69942176D1 (de) 1998-04-07 2010-05-06 Medimmune Llc Choline-bindende proteine derivate aus pneumokoken als impfstoff
PL202844B1 (pl) 1998-04-07 2009-07-31 Corixa Corp Immunogeniczny polipeptyd, polinukleotyd, polipeptyd, kompozycja farmaceutyczna, wektor ekspresji, kompozycja szczepionki, polipeptyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis, polinukleotyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom Mycobacterium tuberculosis i sposób wytwarzania polipeptydu
IL138939A0 (en) 1998-04-07 2001-11-25 St Jude Childrens Res Hospital A polypeptide comprising the amino acid of an n-terminal choline binding protein a truncate, vaccine derived therefrom and uses thereof
AU3560399A (en) 1998-04-15 1999-11-01 Ludwig Institute For Cancer Research Tumor associated nucleic acids and uses therefor
WO1999053940A1 (en) 1998-04-23 1999-10-28 Uab Research Foundation PNEUMOCOCCAL SURFACE PROTEIN C(PspC), EPITOPIC REGIONS AND STRAIN SELECTION THEREOF, AND USES THEREFOR
GB9809683D0 (en) 1998-05-06 1998-07-01 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9810285D0 (en) 1998-05-13 1998-07-15 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
TR200003608T2 (tr) 1998-06-03 2001-04-20 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Moraxella Catarrhalis'e ait BASB027 proteinleri ve genleri.
GB9812163D0 (en) 1998-06-05 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812440D0 (en) 1998-06-09 1998-08-05 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
HUP0203035A3 (en) 1998-07-14 2007-12-28 Corixa Corp Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer
GB9820002D0 (en) 1998-09-14 1998-11-04 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
EP1115875A1 (en) 1998-09-24 2001-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Human complement c3-degrading polypeptide from streptococcus pneumoniae
WO2000030299A1 (en) 1998-11-17 2000-05-25 Schlumberger Technology Corporation Transmitting information over a communication link
WO2000029434A2 (en) 1998-11-19 2000-05-25 St. Jude Children's Research Hospital PNEUMOCOCCAL CHOLINE BINDING PROTEINS, CbpG AND CbpD, DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES THEREOF
EP1140157B1 (en) 1998-12-21 2009-02-18 MedImmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
CZ20012587A3 (cs) 1999-01-29 2002-05-15 Corixa Corporation Izolovaný protein, nukleová kyselina, virový vektor, farmaceutický prostředek, izolovaná populace T buněk, způsob posílení imunitní odpovědi, způsob odstranění nádorových buněk, způsob stimulace a/nebo namnoľení T buněk a způsob přípravy fúzního proteinu
GB9904559D0 (en) 1999-02-26 1999-04-21 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
AU3391200A (en) 1999-03-04 2000-09-21 Corixa Corporation Compositions and methods for breast cancer therapy and diagnosis
ATE459373T1 (de) 1999-03-19 2010-03-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Impfstoff gegen kapsulare polysaccharide von streptococcus pneumoniae
US6245568B1 (en) 1999-03-26 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Human papilloma virus vaccine with disassembled and reassembled virus-like particles
PT1187629E (pt) 1999-04-19 2005-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicao adjuvante que compreende saponina e um oligonucleotido imunoestimulador
JP2003501110A (ja) 1999-06-10 2003-01-14 メディミューン，インコーポレーテッド 肺炎連鎖球菌タンパク質とワクチン
FR2796289B1 (fr) * 1999-07-16 2001-08-10 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec injecteur a elements superposes
FR2796290B1 (fr) * 1999-07-16 2001-09-14 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille fonctionnant avec un generateur d'onde de choc a travers une paroi
FR2796291B1 (fr) 1999-07-16 2001-09-21 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille munie d'un systeme de declenchement piezo-electrique
GB9917977D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918038D0 (en) 1999-07-30 1999-09-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918302D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB9918208D0 (en) 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US6139179A (en) 1999-09-03 2000-10-31 Davis-Standard Corporation Extruder screw having multi-channeled barrier section
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9921147D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
FR2800619B1 (fr) 1999-11-05 2002-02-08 Cross Site Technologies Seringue sans aiguille avec un moyen de poussee temporairement retenu
FR2802102B1 (fr) 1999-12-08 2002-07-12 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un tube d'ejection a section constante
FR2802103B1 (fr) 1999-12-08 2003-10-03 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec entrainement du principe actif par effet tube a choc
FR2802820B1 (fr) * 1999-12-27 2002-10-18 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par effet tube a choc, avec maintien prealable du principe actif sur le cote
FR2804329B1 (fr) 2000-02-02 2002-12-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un opercule contenant le principe actif
FR2804869B1 (fr) 2000-02-11 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille pour l'injection d'un liquide contenu dans une ampoule pre-remplie
FR2805749B1 (fr) * 2000-03-01 2002-05-17 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille a deux niveaux de vitesse d'injection
FR2807946B1 (fr) * 2000-04-19 2002-06-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant avec un chargement pyrotechnique bicomposition
FR2809626B1 (fr) 2000-05-30 2003-03-07 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille avec membrane d'isolation d'un ejecteur multiconduit
CA2413450C (en) 2000-06-20 2014-02-18 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
FR2810554B1 (fr) 2000-06-22 2003-05-16 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille munie d'un reservoir modulable
FR2812202B1 (fr) 2000-07-28 2002-09-13 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille fonctionnant par mise en compression du reservoir contenant le principe actif liquide
GB0019375D0 (en) 2000-08-07 2000-09-27 Int Centre Genetic Eng & Bio Method of polypeptide renaturation
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB0025577D0 (en) * 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
FR2815544B1 (fr) 2000-10-23 2003-02-14 Poudres & Explosifs Ste Nale Seringue sans aiguille securisee a architecture compacte
CA2438960A1 (en) * 2001-02-23 2002-09-06 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine formulations for intradermal delivery
US20030031684A1 (en) 2001-03-30 2003-02-13 Corixa Corporation Methods for the production of 3-O-deactivated-4'-monophosphoryl lipid a (3D-MLA)
MY134424A (en) 2001-05-30 2007-12-31 Saechsisches Serumwerk Stable influenza virus preparations with low or no amount of thiomersal
GB0123580D0 (en) * 2001-10-01 2001-11-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US20030139364A1 (en) * 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
EP1456231A2 (en) 2001-12-20 2004-09-15 Shire Biochem Inc. Streptococcus antigens
US7026465B2 (en) 2002-02-15 2006-04-11 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis
WO2004005476A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
EP2269638A3 (en) * 2004-05-28 2012-06-13 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant
GB0504436D0 (en) * 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2006104890A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines against chlamydial infection
WO2006114312A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
DK2457926T3 (da) 2005-04-29 2015-01-05 Glaxosmithkline Biolog Sa Ny fremgangsmåde til forebyggelse eller behandling af M. tuberkulose-infektion
JP2008540625A (ja) * 2005-05-19 2008-11-20 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性毒素のＢ−サブユニット、抗原およびアジュバントを含むワクチン組成物

Also Published As

Publication number Publication date
SG10201405533TA (en) 2014-11-27
EP2364724A1 (en) 2011-09-14
ES2479165T3 (es) 2014-07-23
DK2364724T3 (da) 2013-11-11
HRP20120136T1 (hr) 2012-03-31
SI1959992T1 (sl) 2012-04-30
EP2364723B1 (en) 2014-01-15
TW200730189A (en) 2007-08-16
PT2364720E (pt) 2014-06-24
ES2445170T3 (es) 2014-02-28
ES2444623T3 (es) 2014-02-26
EA018860B1 (ru) 2013-11-29
CN102631670A (zh) 2012-08-15
US20080279926A1 (en) 2008-11-13
US10039823B2 (en) 2018-08-07
EP2364722A1 (en) 2011-09-14
EP2364721B1 (en) 2013-11-20
EP2364720B1 (en) 2014-05-07
KR101363879B1 (ko) 2014-02-21
EA014353B1 (ru) 2010-10-29
IL229521A0 (en) 2013-12-31
CY1115308T1 (el) 2017-01-04
IL191703A0 (en) 2008-12-29
EP1959992A2 (en) 2008-08-27
HK1118477A1 (en) 2009-02-13
MA30023B1 (fr) 2008-12-01
EP2364724B1 (en) 2013-09-18
JP2013056927A (ja) 2013-03-28
JP2009519309A (ja) 2009-05-14
PL1959992T3 (pl) 2012-06-29
US20170065715A1 (en) 2017-03-09
PL2364724T3 (pl) 2014-02-28
SI2364720T1 (sl) 2014-07-31
TWI457133B (zh) 2014-10-21
EA200801307A1 (ru) 2008-12-30
MY145943A (en) 2012-05-31
SI2364724T1 (sl) 2013-12-31
AU2006325377A1 (en) 2007-06-21
CN103861100A (zh) 2014-06-18
ES2451573T3 (es) 2014-03-27
CY1114864T1 (el) 2016-12-14
EP2364722B1 (en) 2013-11-13
CN103405764A (zh) 2013-11-27
DK2364720T3 (da) 2014-06-10
BRPI0619795A2 (pt) 2011-10-18
DK1959992T3 (da) 2012-04-23
WO2007068907A2 (en) 2007-06-21
PT1959992E (pt) 2012-03-06
NO20082472L (no) 2008-09-10
PL2364720T3 (pl) 2014-09-30
AU2006325377B2 (en) 2012-02-02
SG170127A1 (en) 2011-04-29
IL191703A (en) 2013-12-31
CR10118A (es) 2008-08-21
HK1157219A1 (en) 2012-06-29
PT2364724E (pt) 2013-12-09
PE20071098A1 (es) 2007-11-07
BRPI0619795B8 (pt) 2021-05-25
HRP20140484T1 (hr) 2014-07-04
EA201001189A1 (ru) 2011-02-28
ATE542543T1 (de) 2012-02-15
EP2364723A1 (en) 2011-09-14
EP2364721A1 (en) 2011-09-14
ES2436645T3 (es) 2014-01-03
CA2633008C (en) 2019-04-30
KR20080079312A (ko) 2008-08-29
WO2007068907A3 (en) 2007-08-09
AR058543A1 (es) 2008-02-13
JP5461015B2 (ja) 2014-04-02
EP1959992B1 (en) 2012-01-25
BRPI0619795B1 (pt) 2019-09-10
NZ568825A (en) 2012-01-12
EP2364720A1 (en) 2011-09-14
HRP20131057T1 (hr) 2013-12-06
NZ596870A (en) 2013-06-28
US20110206758A1 (en) 2011-08-25
US10143745B2 (en) 2018-12-04
CR10101A (es) 2008-09-22
CA2633008A1 (en) 2007-06-21
CY1112589T1 (el) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2378471T3 (es) Composición inmunogénica que comprende un adyuvante
US20090081253A1 (en) Composition
HK1156221A (en) Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
HK1157218A (en) Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
HK1157217A (en) Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
HK1118477B (en) Immunogenic composition comprising an adjuvant
HK1161979A (en) Vaccine compositions comprising a saponin adjuvant
BRPI0609519A2 (pt) composição, uso de uma composição, método de vacinação, uso de um antìgeno, e, método para a preparação de uma composição imunogênica