PT726902E - Agentes policiclicos antiparasitarios seus processos e estirpes de preparacao e utilizacao - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "AGENTES POLICÍCLICOS ANTIPARASITÁRIOS, SEUS PROCESSOS E ESTIRPES DE PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Agentes antiparasíticos novos, tais como as avermetinas reveladas nas Patentes US 4310519 e 4199569, são bem conhecidos. Contudo, tais avermetinas, embora sendo potentes agentes contra parasitas internos e externos, são estruturalmente muito significativamente diferentes dos presentes compostos. As avermetinas, sendo agentes macrocíclicos isolados de um actinomicete, não estão relacionados com os metabolitos policíclicos fungais comuns. In de Jesus et ai, J. Chem. Soc. Perkin Trans /, p 697-701 (1984) são descritos como metabolitos fungais identificados como jantitremos com uma estrutura policíclica que, contudo, não contém vários dos elementos estruturais dos agentes usuais. O J. Organic Chemistry, Vol. 57, N° 7, pag. 2066-2071 descreve metabolitos fungais úteis como compostos anti-insectos Estes metabolitos fungais previamente descritos nesta arte, têm estruturas policíclicas diferentes daqueles compostos descritos no presente invento.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento relaciona-se com a preparação de agentes antiparasitários novos e agentes ectoparasiticidas. Assim, é objectivo deste invento a divulgação de tais compostos novos. Um outro objectivo é o de -2- providenciar um método novo para a preparação de tais compostos. Um objectivo adicional é a descrição do microorganismo utilizado para a preparação de tais compostos e as condições de fermentação aplicáveis a tais produções. Um outro objectivo adicional é o de descrever composições e métodos utilizando os compostos presentes como agentes antiparasitários. Outros objectivos tomar-se-ão claros pela leitura da seguinte descrição.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DO DESENHO

As Figuras 1, 2 e 3 são espectros de ressonância magnética nuclear protónica dos Compostos 1, 2 e 3 respectivamente. Nas figuras, vários dos picos da ressonância são marcados como um “X”. Estes picos são o resultado da presença do solvente e não são significativos para a estrutura dos compostos. A Figura 1 é um espectro de ressonância magnética nuclear protónica do Composto 1, registado a 500 MHz em CDC12 num Espectrómetro de RMN Varian Unity 500, a 25°C. Os desvios químicos são indicados em ppu relativamente ao TMS (a 0 ppu), utilizando o pico do solvente a δ 5,32 como um sinal interno. Só os picos relevantes para o diagnóstico são anotados. A Figura 2 é um espectro de ressonância magnética nuclear do Composto 2, registado a 400 MHz em CD2CI2 num Espectrómetro de RMN Varian Unity 400, a 25°C. Os desvios químicos são indicados em ppu relativamente ao TMS (a 0 ppu), utilizando o pico do solvente a δ 5,32 como um sinal interno padrão. Só os picos relevantes para o diagnóstico são anotados. A Figura 3 é um espectro de ressonância magnética nuclear do Composto 3, registado a 300 MHz em CDC13 num Espectrómetro de RMN Varian XL300, à temperatura ambiente. Os desvios químicos são indicados em ppu relativamente ao TMS (a 0 ppu), utilizando o pico do solvente a δ 7,24 como -3- um sinal interno. Só os picos relevantes para o diagnóstico são anotados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento diz respeito a compostos novos de estrutura absolutamente característica. Este invento também diz respeito a um novo processo para fazer os compostos referidos num meio de fermentação de Nodulisporium sp. Ou um mutante dele, capaz de produzir os compostos 1 a 3.

Os compostos do presente invento têm as seguintes estruturas:

OH

Composto 3 -4-

As fórmulas estruturais acima referidas estão representadas sem uma estereoquímica definitiva em certas posições e com uma estereoquímica definida em outras posições e este invento deve ser entendido como abarcando todas esses estereoisómeros. Em particular, os estereoisomeros nos vários centros assimétricos pode ser orientado quer como a-, quer como β-, o que quer dizer que esses grupos se encontram abaixo ou acima do plano genérico da molécula, respectivamente.

Os compostos deste invento têm utilização primordial como agentes antiparasitários no tratamento e/ou prevenção e tratamento de doenças causadas por parasitas, por exemplo, parasitas artrópodes tais como carraças, piolhos, pulgas, e outros insectos que piquem em animais domésticos e aves de capoeira, tais como Tenophalides, Ixodes, Psoroptes, Lucilia e Hemotobia. Eles são também efectivos no tratamento de doenças parasitárias que possam ocorrer em outros animais como os humanos. A quantidade óptima a ser empregue para obter os melhores resultados possíveis irá, com certeza, depender da espécie do animal a ser tratado e do tipo e gravidade da infecção parasitária ou infestação. Geralmente, os melhores resultados são obtidos com os nossos novos compostos pela administração oral de cerca de 0,001 g a cerca de 100 mg por kg do peso do corpo do animal, de tal modo que a dose total seja dada duma única vez, ou em doses múltiplas, durante um período relativamente curto de tempo tal como 1-5 dias. Com o novo composto do invento presente, é obtido em animais um controle excelente de tais parasitas pela administração de cerca de 0,025 a cerca 50 mg por kg de peso do corpo numa única dose. Tratamentos repetidos são dados, quando necessário para combater reinfecções e estão dependentes das espécies de parasitas e das técnicas de criação animal que estejam a ser empregues. As técnicas de administração destes materiais a animais são conhecidas dos especialistas da área veterinária. -5- O presente composto é também activo contra pestes domésticas tais como a barata, Blatella sp., formigas, a traça da roupa Solenopsis, Tineola sp., escaravelho das carpetes, Attagenus sp. a mosca doméstica, Musca domestica. O composto do presente invento é também útil contra insectos daninhos de grão armazenado, tais como o Tribolium sp., Tenebrio sp. e plantas agrícolas, tais como os ácaro vermelho. (Tetranychus sp.), afídeos, ortópteros migratórios Acyrthiosiphon tais como os gafanhotos e estágios imaturos de insectos vivendo em tecidos de plantas. Os compostos são úteis como nematocidas para o controle de nematodes do solo e parasitas de plantas tais como os Meloidogine sp. o que pode ser de importância para a agricultura.

Os presentes compostos podem ser administrados oralmente numa unidade de dosagem tal como uma cápsula, bolus ou comprimido, ou uma poção líquida que é normalmente uma solução, suspensão ou dispersão do ingrediente activo, usualmente em água, juntamente com um agente de suspensão tal como a bentonite e um agente humidificante ou um excipiente semelhante. Geralmente as poções líquidas também contém um agente antiespuma. As formulações das poções líquidas contêm geralmente de cerca de 0,001 a cerca de 1,0% em peso dos compostos activos. As formulações das poções líquidas preferidas podem conter de cerca de 0,01 a cerca de 0,1% em peso. As cápsulas e bolus compreendem o ingrediente activo misturado com um veículo transportador tal como amido, talco, estearato de magnésio, ou fosfato dicálcico.

Se for desejável a administração dos compostos do presente invento numa forma de dosagem unitária sólida e seca, são empregues cápsulas, bolus ou comprimidos, contendo as quantidades desejadas dos compostos referidos. Estas formas de dosagem são preparadas por mistura íntima e uniforme do ingrediente -6- -6-

jfmttaag» activo com agentes adequados e finamente divididos de diluição, de enchimento, desintegrantes e/ou ligantes tais como o amido, lactose, talco, estearato de magnésio, gomas vegetais e semelhantes. Estas formulações de dosagens unitárias podem ser variadas amplamente no que respeita ao seu peso total e conteúdo do agente parasitário, dependendo de factores tais como o tipo de hospedeiro animal a ser tratado, a gravidade e tipo de infecção e o peso do hospedeiro.

Quando os compostos do presente invento estão para ser administrados via uma ração animal, eles são misturados infimamente na ração ou utilizados como uma cobertura de topo ou na forma de pastilhas que podem ser depois adicionados à ração final ou , opcionalmente dados separadamente. Altemativamente, os compostos antiparasitários do nosso invento pode ser administrado aos animais parenteralmente, por exemplo por via intraruminal, intramuscular, intratraqueal, ou injecções subcutâneas em que o ingrediente activo é dissolvido ou disperso num veículo de transporte líquido, em qualquer destes casos. Para a administração parenteral, o material activo é misturado adequadamente com um veículo adequado, preferivelmente duma variedade de óleo vegetal tal como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão e semelhantes. Outros veículos parenterais, tais como preparações orgânicas utilizando solketal, glicerol, formal e formulações aquosas parenterais são também utilizados. Os compostos do presente invento são dissolvidos ou suspensos em formulações parenterais para administração: tais formulações contêm geralmente de cerca de 0,55% a cerca de 5% em peso, do composto em causa.

Quando os compostos descritos aqui são administrados como componentes das rações dos animais, ou dissolvidos ou suspensos na água de beber, são providenciadas composições em que o ingrediente activo é disperso -7- intimamente num veículo ou diluente inerte. Por veículo inerte quer-se significar aquele que não irá reagir com o agente antiparasitário e aquele que pode ser administrado aos animais de forma segura. Preferivelmente, um veículo para administração na ração é aquele que é, ou pode ser, um ingrediente da tal ração animal.

Composições adequadas incluem pré-misturas ou suplemento de rações em que os compostos em causa estão presentes em relativamente grandes quantidades e as quais são adequadas para a alimentação directa ao animal ou para a adição à ração quer directamente ou depois de diluição intermediária ou de um passo de mistura. Veículos típicos ou diluentes adequados para tais composições incluem, por exemplo, grão seco de destilaria, papas de milho, papa de limão, resíduos de fermentação, concha moída da ostra, farinha de trigo de segunda escolha , melaço solúvel, papa de espiga de milho, ração de feijão triturado edível, grãos de soja, pedra calcária moída e semelhantes. Os compostos do presente invento são dispersos intimamente por todo o veículo por métodos tais como, trituração, agitação, moagem ou mistura em tambor rotativo. As composições contendo de cerca de 0,005% a cerca de 2,0% em peso do composto em causa são particularmente adequadas como pré-misturas de rações. Os suplementos de rações que são directamente dados ao animal, contém de cerca de 0,0002% a cerca de 0,3% em peso do presente composto.

Tais suplementos são adicionados à ração animal numa quantidade tal que a ração final contém a concentração desejada do composto activo para o tratamento e controle das doenças parasíticas. Embora a concentração desejada dos compostos do presente invento possa variar dependendo dos factores mencionados previamente como também do composto específico empregue, os compostos deste invento são usualmente dados em concentrações entre cerca de 0,001% a cerca de 0,2% na ração, de tal modo que atinjam o desejado efeito -8- antiparasitário.

Em adição, quando o composto está para ser adicionado a uma ração animal, é possível utilizar o bolo micelar seco do meio de fermentação. Os micélios contém uma actividade preponderante e visto que o nível de actividade dos micélios pode ser determinada, o bolo pode ser adicionado directamente à ração animal.

Os composto deste invento são também úteis no combate a pestes agrícolas que causam danos às culturas quando estas estão em crescimento ou armazenadas. O composto é aplicado utilizando técnicas conhecidas como sprays, pós, emulsões e semelhantes, no crescimento ou armazenamento de culturas para as proteger de tais pestes agrícolas. A actividade antiparasitária dos compostos em causa pode ser determinada pela administração oral através da ração, de uma amostra do composto específico, de uma mistura de tais compostos, de um extracto concentrado, ou de outras técnicas semelhantes a um rato que tenha sido infectado 3 dias antes com o parasita apropriado. Aos 11, 12 e 13 dias depois do início da medicamentação, as fezes do rato são examinadas para detectar ovos, no dia seguinte o rato é sacrificado e o número de vermes presente no tracto proximal do intestino delgado é determinado. Um composto activo é reconhecido quando se dá uma redução significativa da contagem dos ovos e vermes quando comparada com os controles infectados e não medicamentados.

Os novos compostos do presente invento são preparados por fermentação duma estirpe do gene fungai Nodulisporium. Uma tal cultura tem a designação de MF-5954 na colecção de culturas da Merck & Co., Inc., Rahway, Nova Jersey. Uma estirpe activa de MF-5954 foi depositada na colecção

permanente da “American Type Culture Collection” em 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, a que foi dado o número de acesso de 74245. O depósito foi feito em 21 de Setembro de 1993 de acordo com o Tratado de Budapeste de Reconhecimento Internacional dos Depósitos de Microrganismos para Procedimentos de Patentes.

As características morfológicas e da cultura do Nodulisporium sp. MF-5954, são as seguintes: O MF-5954 (produz L-954.967) foi isolado como JP337, um fungo endofítico de tecido de planta lenhosa pelo método de esterilização à superfície de Bills e Polishook (1991). Na descrição que se segue, os nomes a letra maiúscula são de Ridgway (1912).

Numa colónia de agar de papa de milho (Difco) atingindo um diâmetro de 42 mm depois de 6 dias a 25°C, 50% de humidade relativa e fotoperíodo de 12 horas de luz fluorescente. Com o tapete de crescimento da colónia submerso e a superfície apressa a felpuda, incolor por toda a parte; ausência de exudado ou pigmentos solúveis; o reverso incolor; odor doce e aromático presente.

Numa colónia de agar de papa de aveia (Singleton et al, 1992) atingindo um diâmetro de 42 mm depois de 6 dias sob as mesmas condições. O tapete da colónia apresenta-se apresso a penugem escassa, o centro da colónia é amarelo acastanhado (Amarelo de Marte, Siena Cru) a amarelo acastanhado claro (Laranja amarelado claro, Amarelo de Antimónio) a meio da margem; a margem inteira, branca; ausência de exudado, odor e pigmentos solúveis; o reverso castanho claro.

Numa colónia de agar de sacarose de batata (Difco) atingindo um -10-

diametro de 43 mm depois de 6 dias nas mesmas condições. O tapete da colónia é apresso a penugem escassa, o centro da colónia é castanho avermelhado (Cor de Vinho Russet claro) desmaiando para hialino na margem, margem indistinta; ausência de exudado, e pigmentos solúveis; o reverso vermelho acastanhado (Cor de Vinho escura). A 37°C, em agar de papa de milho e no escuro, atingindo a colónia um diâmetro de 82 mm depois de 6 dias; o tapete da colónia apresenta-se com penugem por toda a parte excepto no ponto de inoculação em que o tapete é apresso, branco; a margem inteira, branca; ausência de exudado, e pigmentos solúveis; o reverso incolor; odor doce e aromático presente.

Hifas hialinas a castanho claro, septadas, com paredes macias a levemente rugosas, espessas de 2,5 - 3,5 pm de comprimento. Conidiofóros mononematosos, erectos, 150 -400 x 3,0 - 4,0 pm, ramificados como a penicilina, hialinos a castanho claro, septados, de paredes finas, macias a levemente rugosas a verrugosa, algumas vezes com projecções redondas e azeitonadas (2,5 pm de diâmetro). Células holoblásticas e conidiogénicas, terminal, 16 -24 x 1,5 - 2,0 pm, enrugadas finamente a verricosas, cilíndricas, irregular no apex. Conídia obovolada a oblonga - elíptica com um ponto de ligação truncado, 4,1 - 5,7 x 1,6 - 2,5 pm, hialina, aseptada, com paredes finas, produzida simpodialicamente do apex da célula conidiogénica, acumulando como um aglomerado apical nos dentículos. O MF-5954 pertence ao gene fungai Nodulisporium (Hifomicetes, Deuteromicotina). As características taxonómicas chave deste gene incluem conidiofóros mononematosos que são tipicamente ramificados e uma produção simpodulosa de conídeos. Em adição, as áreas contendo conídeos são terminais ou intercalares e nodulosas devido a produção copiosa dos conídeos (Jong e - 11 -

Rogers, 1972). Estas características distinguem o gene Nodulisporium de outros fungos similares, tais como o Geniculosporium, Xilocladium e Ustilina. Estes genes são o estado asexual (anamorfo) de muitos fungos xilariaceos (Ascomicotina), tais como Hipoxilon, Xilaria, Rosellinia, etc.

Ao contrário de muitos espécies isoladas de Nodulisporium, o MF-5954 cresce bem a 37°C, mas não exibe nenhuns outros caracteres específicos em cultura que o associem a outras espécies conhecidas. Deste modo, é designado como Nodulisporium sp.

Literatura Citada 1. Bills, G. F. e Polishook, J.D. 1991 “Microfungi from Carpinus caroliniana”., Can. J. Bot. 69(7): 1477-1482. 2. Jong, S. C. e Rogers, J.D. 1972 “Illustrations and descriptions of conideal States of some Hypoxylon species”. Wash. State Agric. Exp. Sta. Tech. Buli. N° 71. pag.51 3. Ridgway, R. 1912. Color standards and color nomenclature. Publ. Pelo autor, Washington, D.C. pag. 43 + 53 pl. 4. Singleton, L.L, Mihail, J.D. e Rush, C.M. (Eds). 1992. Methods for research on soilborne phytopathogenic fungi, appendix A, pag. 247. APS Press, St. Paul, Minesota.

Os compostos em causa são produzidos durante a fermentação aeróbia de sólidos adequados ou meios nutrientes aquosos nas condições acima descritas, utilizando uma estirpe de Noduslisporium sp. Os meios aquosos e - 12- sólidos, semelhantes aos utilizados na produção de muitas substâncias antibióticas, são adequados para a utilização no processo para a produção destes compostos policíclicos.

Tais meios nutrientes contém fontes de carbono e azoto assimiláveis pelos microorganismos e geralmente, baixos níveis de sais inorgânicos. Em adição, o meio de fermentação contém traços do metal necessários para o crescimento dos microorganismos e produção dos compostos desejados. Estes estão presentes numa concentrações adequadas nas fontes de carbono e azoto complexas que podem ser utilizadas como fontes de nutrientes, mas podem, com certeza, ser adicionadas separadamente ao meio, se tal for julgado necessário.

Em geral, carbohidratos tais como os açúcares, por exemplo, glucose, sacarose, maltose, lactose, dextrina, cerelose, papa de milho, papa de aveia e semelhantes, e amidos são fontes adequadas de carbono assimilável no meio nutriente. A quantidade exacta da fonte de carbono que é utilizável no meio será dependente, em parte, dos ingredientes no meio, mas é usualmente reconhecido que a quantidade satisfatória de carbohidratos é de entre 1 e 150 g/1 no meio. Estas fontes de carbono podem ser utilizadas individualmente ou várias das referidas fontes de carbono podem ser combinadas no mesmo meio. Várias fontes de azoto, tais como os hidrolisados de leveduras, autolisados de leveduras, células de leveduras, pasta de tomate, papa de milho, farinha de aveia, papa de soja, hidrolisados de caseína, extractos de leveduras, licores de infusão de milho, extractos solúveis de destilação, papas de semente de algodão, extractos de carne e semelhantes, são facilmente assimiláveis por Noduslisporíum sp. na produção dos composto em causa. As várias fontes de azoto podem ser utilizadas individualmente ou em combinação, em quantidades -13- numa gama entre 1 a 5 g/1 no meio.

De entre os sais inorgânicos nutrientes que podem ser incorporados no meio de cultura, salientam-se os sais comuns capazes de doar sódio, potássio, magnésio, amónia, cálcio, fosfato, sulfato, cloreto, carbonato e iões semelhantes. São aqui incluídos os oligometais tais como o ferro, zinco, manganês, cobre, boro, molibdénio e semelhantes.

Deve ser realçado que os meios descritos aqui e em baixo e nos Exemplos são meramente ilustrativos da enorme variedade de meios que podem ser empregues, e não devem ser entendidos como limitações do método.

Em seguida são apresentados exemplos de meios adequados para o crescimento de Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245:

Composição do Meio Inclinado

Extracto de Leveduras 4g Extracto de Malte 10 g Glucose 4g Bacto Agar 20 g Agua Destilada 1000 ml pH 7,0

Composição dos Meios de Sementeira e Produção

Meio de Sementeira Sã

Componente - 14-

Extracto de Leveduras 4,0 Extracto de Malte 8,0 Glucose 4,0 Junlon 1,5 g O meio foi preparado com água destilada, o pH ajustado a 7,0 antes da esterilização e volumes de 50 ml foram distribuídos por frascos do tipo Erlenmayer abertos de 250 ml. Foram utilizados tampões de algodão. A esterilização foi efectuada a 121°C durante 20 minutos.

Meio de Produção A 1. Porção Sólida:

Adicionou-se 1250 cc de vermiculite a um frasco de 41 de tambor rolante. Tapou-se com uma rolha de látex; foi autoclavado durante 60 min., mais 30 min. A seco.

Porção Líquida: Componente íg/1) Glucose 150,0 Ureia 4,0 Amina N Z, tipo A 4,0 k2hpo4 0,5 MgS04*7H20 0,25 KC1 0,25 ZnS04*7H20 0,9 - 15- - 15- «y»ffl»WMa«eaa&

CaCC>3 O meio foi preparado com água destilada (sem ajustamento do pH). Foi introduzido num frasco tipo Erlenmeyer como 425 ml / 1 1. Foram utilizados tampões de algodão e o meio esterilizado a 121°C durante 15 minutos.

Meio de Produção B

Componente (g/1)

Glicerol 75,0

Glucose 10,0

Ardamina PH 5,0 (NH4)2S04 2,0

Papa de Soja 5,0

Pasta de Tomate 5,0

Citrato de Sódio 2,0 O meio foi preparado com água destilada e pH a 7,0 antes da esterilização. O meio foi introduzido num frasco aberto do tipo Erlenmeyer a 50 ml por 250 ml. Os frascos foram fechados com algodão e autoclavado a 121°C durante 20 minutos. A fermentação empregando Nodulisporium sp. pode ser efectuada a temperaturas duma gama de cerca de 20°C a cerca de 40°C. Para obter resultados óptimos, é o mais conveniente possível efectuar estas fermentações a temperaturas numa gama de cerca de 22°C a cerca de 36°C.

Temperaturas de cerca de 22°C a cerca de 27°C são as mais preferidas. O pH do meio nutriente adequado para a produção dos compostos em -16- causa, pode variar de cerca de 6,5 a cerca de 8,0 em que a gama preferida é de cerca de 6,8 a cerca de 7,3.

Fermentações em pequena escala são levadas a cabo convenientemente pela introdução de quantidades adequadas do meio do nutriente num frasco empregando técnicas de esterilização conhecidas, inoculando o frasco, ou com esporos, ou com células em crescimento vegetativo de Nodulisporium sp., tapando o frasco folgadamente com algodão e permitindo que a fermentação se dê numa sala a uma constante temperatura ambiente de cerca de 25°C, num agitador rotativo de 95 a 300 rpm, de cerca de 7 a 35 dias. Para trabalhos em escala maior, é preferível promover a fermentação em tanques adequados, providos de um agitador e meios de arejamento do meio de fermentação. O meio nutriente é feito num tanque e depois de esterilizado é inoculado com uma fonte de células em crescimento vegetativo de Nodulisporium sp. A fermentação é deixada continuar de entre 7 a 25 dias enquanto se dá a agitação e/ou o arejamento do meio nutriente, a uma temperatura numa gama de cerca de 22°C a 27°C. O grau de arejamento está dependente de vários factores tais como o tamanho do fermentador, velocidade de agitação e semelhantes. Geralmente, quanto as escalas maiores de fermentação são agitadas a cerca de 95 a 300 rpm e cerca de 50 a 500 litros por minutos (LPM) de ar. A separação dos compostos em causa do caldo total da fermentação e o isolamento do composto pretendido é efectuada através de extracção de solventes e aplicação de fraccionamentos cromatográfícos com várias técnicas cromatográficas e sistemas de solventes.

Os compostos em causa têm uma fraca solubilidade em água, mas são solúveis em solventes orgânicos. Esta propriedade pode ser convenientemente empregue no isolamento do composto do caldo da fermentação. Assim, num dos métodos de isolamento, o caldo total da fermentação é combinado com aproximadamente igual volume dum solvente orgânico. Embora seja possível utilizar qualquer solvente orgânico, é preferível utilizar um solvente miscível em água tal como acetato de etilo, diclorometano, clorofórmio e semelhantes. Geralmente várias extracções são desejadas para se conseguir a máxima recuperação. O solvente remove os compostos em causa, bem como outras substâncias que não possuem a actividade antiparasitária do composto em causa. Se o solvente é imiscível em água, as fases são separadas e o solvente orgânico é concentrado a pressão reduzida. O resíduo é posto numa coluna cromatográfica, preferivelmente contendo gel de sílica. A coluna retém o composto desejado e algumas impurezas, mas deixa muitas das impurezas, particularmente as impurezas não polares, passarem. A coluna é lavada com um solvente orgânico moderadamente polar, tal como diclorometano ou clorofórmio, para remover ainda mais as impurezas, e é depois lavado com uma mistura de diclorometano ou clorofórmio e um solvente orgânico em que a acetona, metanol, etanol e semelhantes são preferidos. O solvente é evaporado e o restante resíduo é cromatografado mais uma vez, utilizando cromatografia em coluna, cromatografia em camada fina preparativa, cromatografia líquida de alta pressão e semelhantes, em gel de sílica, óxido de alumínio, resinas de troca iónica, géis de dextrano e semelhantes, como meios cromatográficos, com vários solventes e combinações de solventes, como eluentes. Cromatografia em camada fina, de alta pressão, líquida e em camada fina preparativa podem ser utilizadas para detectar a presença e isolar o composto em causa. A utilização das técnicas seguintes, bem como de outras conhecidas dos especialistas nestas artes, produzirão composições purificadas contendo o composto em causa. A presença do composto desejado é determinada por análises de actividade biológica ou parâmetros físico-químicos, nas várias fracções cromatográficas. Ambos os compostos foram determinados por análises -18- detalhadas das várias características espectrais dos compostos, em particular dos espectros de ressonância magnética nuclear, espectrometria de massa, ultravioleta e infravermelhos. EXEMPLO 1 1. CULTURA: A estirpe MF-5954 foi introduzida em agar inclinado e foi utilizada para preparar FVMs (micélios vegetativos congelados). Uma porção do agar slant foi transferido asepticamente para um meio de sementeira A ( 50 ml num frasco aberto de 250 ml). Este foi incubado num agitador giratório de embolo de 2 polegadas, a 220 rpm, durante 3 dias a 25 °C, 85% de humidade relativa (rh), para obter biomassa. Porções da biomassa, foram transferidas para frascos cónicos estéreis contendo glicerol, e depois congelados (como FVM). Estes foram mantidos numa concentração final de 10-15% de glicerol a -75°C. Foram preparados FVMs secundários dos FVMs primários por transferência de 1,0 ml do FVM primário descongelado no meio de sementeira e incubação durante 2-3 dias a 25°C, 220 rpm e congelação, conforme descrito acima. 2. SEMENTEIRA: Um frasco cónico congelado (FVM) foi descongelado até à temperatura ambiente e utilizado para inocular culturas de sementeira do MF-5954 com 0,5 - 1,0 ml por 50 ml do meio de sementeira A. Estas culturas foram feitas crescer num agitador giratório (220 rpm) durante 2-3 dias a 25°C e 85% rh. Por vezes, foi utilizado um segundo estágio de sementeira. Para desenvolver isto, 1 ml da sementeira do Io estágio, como descrita acima, foi diluída em 50 ml de meio de sementeira A fresco e incubada durante 24-30 horas a 25°C, 220 rpm, 85% rh. 3. PRODUÇÃO. A composição do meio de produção A é a de - 19- um meio de fermentação de substracto sólido. Uma alíquota (18-24 ml) da sementeira foi posta em 425 ml do meio de produção A. O frasco foi agitado em torvelinho vigorosamente para dispersar a biomassa. O conteúdo foi dispensado por introdução num vaso rotativo de cultura de 41 que continha 1250 centímetros cúbicos de vermiculite de partículas grandes. O conteúdo do vaso rotativo foram agitados/misturados para assegurar a inoculação homogénea e cobertura. Os vasos rotativos foram incubados horizontalmente, com uma revolução de aproximadamente 4 rpm num aparelho de rotação Wheaton, a 22-25°C, 50-75% rh durante 19-28 dias, para obter o metabolito secundário no meio de fermentação.

Foram examinadas amostras do meio líquido para monitorizar a produção dos compostos em causa, de tal maneira que a fermentação possa ser mais facilmente adaptada a vasos maiores. A produção foi detectada em apenas um pequeno número de meios líquidos testados. Um meio líquido de cultura B foi utilizado. As culturas de sementeira foram inoculadas como descrito acima e feitas crescer, a 220 rpm, num agitador giratório durante 3 dias a 25°C e 85 rh. Uma alíquota da sementeira (1 ml) foi utilizada para inocular cada um dos frascos de produção, contendo 50 ml (2% inoculo). Os frascos foram incubados num agitador giratório (220 rpm) durante 21-28 dias a 25°C e 50% rh.

Os dois métodos de produção foram essencialmente equivalentes na quantidade de produto conseguido. Contudo, o 2o método ( meio de produção liquido B) tem a vantagem de que pode ser aumentado de escala até vasos giratórios, o que permite a produção de grandes quantidades. O método de produção sólido (vasos giratórios do meio A) toma o aumento de escala difícil.

Vasos maiores ( tanques de 22 1) foram também utilizados para produzir os compostos em causa, a partir desta cultura. -20- EXEMPLO 2

Purificação e Caracterização suplementar A cultura feita crescer no meio durante 21 dias, em 12 vasos rotatórios de 2 1, foi extraída de cada um deles, com 650 ml de metiletilcetona (MEK), durante 4 horas, numa máquina rotatória a 100 rpm. Os extractos foram filtrados, combinados e evaporados à secura no vácuo, até um peso de 8 gramas. Este material foi dissolvido em 20 ml de diclorometano e introduzido numa coluna de gel de sílica (E. Merck) em diclorometano/metanol 95:5. Foram utilizados volumes correspondentes ao da coluna dos seguintes solventes utilizados na eluição: diclorometano/metanol 95:5, 9:1, 3:1, 1:1 e metanol. Foram recolhidas fracções de 40 ml, tendo-se observado a maioria da actividade nas fracções 51-55, determinada por bioanálise (Lucilia). As fracções foram combinadas e evaporadas à secura no vácuo e pesavam 200 mg. Esta amostra foi dissolvida em 8,5 ml de metanol e introduzida numa coluna de Sephadex LH-20 (Pharmacia) em metanol e foram recolhidas fracções de 13 ml a um fluxo de 6,5 ml/min. Foi observada actividade nas fracções 41-50 e estas fracções foram juntas e evaporadas, pesando 90 mg. Este material foi dissolvido em 0,5 ml de metanol e foi injectado por duas vezes numa coluna de HPLC C-18 (9,6 mm x 250 mm) "Eka Nobel" à temperatura ambiente e monitorizada a 270 nm com um fluxo de 4 ml/min. O sistema de solventes utilizado foi o acetonitrilo/água 70:30 com TFA a 0,1% e o material activo foi isolado nas fracções 26-27 da primeira amostra e 27-28 da segunda amostra. A pureza do composto foi verificada por HPLC analítico numa coluna (4,6 mm x 250 mm, C-18) "Eka Nobel" a um fluxo de 1 ml/min e 40°C e também por TLC em vários sistemas de solventes. As fracções juntas foram concentradas no vácuo e extraídas com diclorometano e evaporadas à secura, tendo-se conseguido 4,8 mg do composto puro (Composto 1). -21 -

As fracções posteriores da coluna de sílica tinham também bioactividade; elas foram combinadas e evaporadas à secura no vácuo e pesavam 1,4 g. O sólido foi lavado com metanol várias vezes e continha componentes com espectro de UV semelhante ao do Composto 1. Esta propriedade espectroscópica foi utilizada para monitorizar os passos seguintes da purificação e a bioactividade foi, por último, verificada na avaliação dos compostos puros. Assim, a solução metanólica contendo 500 mg por peso foi fraccionada numa coluna de Sephadex LH-20 em metanol. A maioria do peso foi recuperada nestas fracções combinadas. Este material foi seco e redissolvido em 3 ml de metanol e injecções foram feitas de 1 ml numa coluna preparativa ZORBAX C-18 (22,5 mm x 250 mm) à temperatura ambiente, utilizando sistema de solventes de acetonitrilo-água 80:20 (0,1% ATF), a um fluxo de 8 ml/min com uma detecção por UV a 270 nm e recolha de fracções de 8 ml. As fracções 29 de cada uma das três corridas foram combinadas para dar o composto 2 e as fracções 21-22 continham o composto 3. Ambas as soluções foram concentradas e extraídas com acetato de etilo, lavadas com água e secas. O Composto 2 tinha um peso de 1,8 mg e o composto 3 de 1,0 mg. Ambos os composto foram caracterizados como análogos do composto 1, por estudos de NMR e EM.

Os espectros de massa de bombardeamento por átomos rápidos (FAB) foram registados num Espectrómetro de Massa JEOL HX110. O espectro de FAB foi obtido utilizando uma matriz de ditiotreitol / ditioeritritol (20/80). As medidas de massa exacta foram feitos a alta resolução com uma ultramarca 1960 (Fomblin) como o composto de referência. Os dados importantes de alta resolução são indicados a seguir. -22-

Composto 1

Encontrado Calculado Fórmula Massa atribuída 680,3891 680,3951 C43H53N06+H M+H 662,3790 662,3854 C43H51NO5+H 68O-H2O Composto 2 Encontrado Calculado Fórmula Massa atribuída 695,3806 695,3822 C43H53N07 M+

Dados de l3C RMN

Os espectros de RMN ,3C foram registados em CD2CI2 a 100 e 125 MHz em Espectrómetros Varian Unity 400 e 500, respectivamente, a 25°C. Os desvios químicos são dados em ppm relativos a tetrametilsilano (TMS) a zero ppm, utilizando um pico de solvente a 53,8 ppm, como padrão interno.

Composto 1 (125 MHz): 198,0 ,172,6, 162,0, 154,7, 154,6, 140,8, 140,0, 138,4, 135,9, 134,0, 125,9, 125,1, 122,7, 122,0, 121,8, 117,5*, 116,7, 113,1, 76,8, 76,4*, 75,3, 73,9, 72,6, 58,2, 56,1, 48,0, 47,8, 45,2, 39,1, 32,3, 32,0, 30,1, 29,9, 27,8, 26,0, 25,7, 24,7, 23,5, 19,6, 18,1*, 15,1, 12,6, ll,2ppm. O número de carbonos de 43, está de acordo com a fórmula molecular de C43H53NO6, derivada do EM de FAB de Alta Res.

Composto 2 (100 MHz): 198,1, 172,0; 162,0, 154,8, 147,1,140,1, -23 - \ 138,3, 135,9, 134,0, 126,8, 122,6, 122,0, 121,8, 117,8*, 116,7, 113,2, 106,9, 76,6*, 75,3, 73,9, 73,3, 72,7, 58,2, 55,5, 49,6, 48,1, 44,5, 41,3, 39,5, 32,0, 30,4, 30,1,30,0,29,9,27,8,26,0, 24,8,23,4, 18,0*, 17,7, 16,7, 15,3, 12,5 ppm. O número de carbonos de 43, está de acordo com a fórmula molecular de C43H53N07, derivada do EM de FAB de Alta Res. *Os Carbonos marcados com asterisco foram observados como ressonâncias largas.

Dados de *H RMN

Os espectros de !H RMN foram registados em Espectrómetros de 300, 400, ou 500 MHz. Os desvios químicos são indicados em ppm relativamente ao TMS a zero ppm, utilizando os picos dos solventes como padrões internos.

Composto 1 (veja-se a Fig. 1) (500 MHz): δ 0,96 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,12 (3H, s), 1,14 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,33 (3H, s), 1,42 (3H, s), -1,46 (3H, s lg.), 1,96 (3H, d, J= 1 Hz), 2,32 (1H, dd, J= 11, 14 Hz), 2,75 (1H, dd, J= 6,5, 14 Hz), 2,81 (1H, dd, J= 3, 6,0 Hz), 2,85 (1H, m), 3,43 (1H, m), 4,96 (1H, s lg.) 5,09 (1H, s), 5,20 (1H, s lg.), 5,22 (1H, d, J= 6,0 Hz), 5,95 (1H, d, J= 15 Hz), 6,06 (1H, d, J= 3 Hz), 6,40 (1H, dd, J= 11, 15 Hz), 7,33 (1H, d lg., J - 11 Hz), 7,71 (1H, s).

Composto 2 (veja-se a Fig. 2) (400 MHz): δ 0,95 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,112 (3H, s), 1,126 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,34 (3H, s), 1,42 (6H, s), 1,73 (1H, dd, J= 9,5, 12,5 Hz), 1,86 (3H, d, J= 1,5 Hz), 2,34 (1H, dd lg., J= 7,5, 12,5 Hz), 2,36 (1H, dd, J= 11, 14 Hz), 2,78 (1H, dd, J= 6,5, 14 Hz), 2,81 (1H, dd, J= 3, 6,5, -24- Ηζ), 2,93 (1Η, m), 4,88 (H, q lg., J~8 Hz), 5,00 (1H, s lg.), 5,10 (1H, s), 5,20 (1H, q d, J ~ 1 Hz), 5,21 (1H, d, J= 6,5 Hz), 6,06 (1H, d, J= 3 Hz), 6,93 (1H, dq, J= 8, 1,5 Hz), 7,72 (1H, s).

Composto 3 (veja-se a Fig. 3) (300 MHz): δ 0,91 (3H, s), 1,05 (3H, s), 1,09 (3H, s), 1,11 (3H, d, J ~ 7,5 Hz), 1,13 (3H, s), 1,33 (3H, s), 1,34 (3H, s), 1,47 (3H, s), 2,30 (1H, dd, J= 10,5, 13,5 Hz), 2,72 (1H, dd, J= 6,5, 13,5 Hz), 2,87 (1H, dd, J= 3, 6,0 Hz), 4,00 (1H, dd, J= 2,5, 10,5 Hz), 4,58 (1H, m) 5,02 (1H, s lg.), 5,07 (1H, s), 5,17 (1H, s lg.), 5,23 (1H, d, J= 6,0 Hz), 6,02 (1H, d, J= 3 Hz), 7,67 (1H, s).

Abreviaturas: s = singuleto, d = dupleto, q = quarteto, lg. = largo, m = multipleto, J= constante de acoplamento 'Η-’η em Hertz ( ± 0,5 Hz, ~ = aproximadamente).

Lisboa, 10 de Março de 2000

JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto com a fórmula:

   ou

   (III)
2. 2. Um processo de preparação de um composto da reivindicação 1, que compreende a fermentação num meio com fontes de carbono, azoto e fontes de oligoelementos, uma estripe de produção de Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245 e mutantes destes e isolamento dos compostos.
3. 3. Um processo da Reivindicação 2 em que a estirpe é o Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245.
4. 4. Um composto da Reivindicação 1, como um agente antiparasítico no tratamento, de infecções parasíticas num animal infectado com -2- parasitas.
5. 5. Uma composição útil no tratamento de infecções parasíticas em animais, o que compreende um veículo inerte e um composto da Reivindicação 1.
6. 6. Um método para o tratamento de infecções parasíticas de plantas ou culturas de plantas que compreende a aplicação na planta ou no solo em que ela cresce de uma quantidade efectiva de um composto da Reivindicação 1.
7. 7. Uma composição útil para o tratamento de infecções parasíticas em plantas que compreende um veículo inerte e um composto da Reivindicação 1.
8. 8. Uma cultura biologicamente pura de Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245 e mutantes destes, capazes de produzir os compostos da Reivindicação 1.
9. 9. Uma cultura biologicamente pura da Reivindicação 8 que é Nodulisporium sp. MF-5954, ATCC 74245. Lisboa, 10 de Março de 2000

   Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA