PL159182B1 - Sposób wytwarzania rekombinan towego bialka IL-6 PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1 . Sposób wytwarzania rekombinautowego bialka IL-6, znamien n e tym , ze prowadzi sie hodowle odpowiednich komórek stransformowanych sekwencja cDNA kodujaca bialko, przy czym bialko to zawiera sekwencje peptydowa zasadniczo taka sama jak sekwencja od aminokwasu nr 28 do aminokwasu nr 212 wedlug Fig. 1, a sekwencja cDNA jest operatywnie polaczona z sekwencja kontrolna ekspresji. PL PL PL PL PL PL

Description

Frzedmiotem wyralazku jest sposób wytwarzania rekombinantowego białka IL-6, które bierze udział w regiGacJi immmnclooiczreJ.

Hemtopootyny czyli hentopoetyczne czyrn^l.klwzrostu są to białka, które pobtrizzją przeżywanie, wzrost i różnicowanie się komórek htIMtooPotyczcych. Przeszkodą do biochemicznej i biologicznej identyfikacJi i scharakteryzowania określonych hamtopoetyn są, Jak dotychczas, niewielkie ilości tych czynników, moiiwe do uzyskania ze źródeł naturalnych, np. krwi lub mczu. Tym niemnnej Jednak, za pomocą rekombinantowych mtod inżynierii genetycznej można niektóre z tych hanrfccpoetyc mrClkklarcie klonować, doprowadzać do ekspresji lieterologicznej i oczyszczać aż do uzyskania ^π^^^ζη^^. Do tych htmtoroetyn należą czynniki stymulujące kolonizację /CFS/ scharakteryzowane przez zdolność do podtrzywzrostu in vitro koloid! komórek heratopoctycznych pochodzących z komórek pierwotnych szpiku kostnego, wątroby płodowej i innych organów, np. GM-CSF, G-CSF, CFS-1 i IL-3 ( patrz np. D.Mtcaaf, Blood, 62/2/, 257-267 /1986/, Y.C. Yang 1 in., Cd. 47/1/,

3-10 /1986/, R.Dccahut i in., Naturę, 321, 872 - 875 /1986,/.

Jedna z tego rodzaju htmrtopo3tyc została iidtctyfiOowact przez twórcfa niniejszego wynalazku w powwżej wyszczególnionych zgłoszeniach pierwotnych, Jako CSF-309· Po złożeniu zgłoszeń pierwotnych inni badacze opublikował kilka prac opisujących białka scharakteryzowane inną aktywnością biologiczną i o innych nazwach, które były identyczne z nowym białkia ^itstrzeżoΓ^ym w z^głoszecit^ch. ^Ht^egeⁿt^c i iⁿ., ^Eur. ^J. Bhch^., ¹⁵9, ^{625 - 632} /119⁸⁶/, oraz cytowane tam odro fanki, opisują Je Jako białko 26 kd, które można ΙηΑιΜίΜέ w fibroUastach ludzkich. Zilberstein 1 in., EMDO J., 5, 2529 - 2537 /1986/, określają Je Jako IFN- p -2, ze względu na jego słabą aktywność ictefteoonową. Hirano 1 in., Naturę, 324,

- 76 /1986/, odw^iują się do Jego aktywności polegającej na stymulowaniu komórek B, nazywając je BCDF lub BSF-2. W kilku z tych prac donosi się o czyszczeniu subsSancJl naturalnej. W niniejszym zgłoszeniu białko to jest określone jako IL-6 /patrz R^erman i in.

(l987), w druku/.

Figura 1 przedstawia pełną sekwencję cDNA i jtkwincję aminokwasów IL-6.

159 182

Figura 2 przedstawia zmodyfikowaną sekwencję cDNA szczególnie odpowiednią do bakteryjnej ekspresji IL-6.

Figura 3 przedstawia konstrukcję pALLSeeclL-6-181.

Według wyralazku, sposób wytwarzania ludzkiego białka IL-6 zasadniczo wolnego od połączeń z innymi białkami ludzkimi, polega na prowadzeniu hodowli komórek gospodarza transformowanych sekwencją DNA kodującą białko IL-6, znajdującą się pod kontrolą odpowwednlch sekwencji kontrolnych ekspresji. Sekwencja DNA kodująca białko IL-6 zawiera taką samą sekwencję nukleotydów, lub zasadniczo taką samą sekwencję nukleotydów, jak sekwencja od nukleotydu nr 132 do nukleotydu nr 689, albo od nukleotydu nr 51 do nukleotydu nr 1139, jak przedstawiono na fig. 1. Jedna z sekwencji cDNA do zastosowania w tym sposobie obejmuje kompletną sekwencję nukleotyd<w przedstawioną na fig. 1. Sekwencję DNA wg fig. 1 o około 1,1 kilozasady wprowadzono do plazmidu pCSF3O9 w E.coli MC1CO1, którą zdeponowano w Anmrican Type Culture Collection 12301 Parklawn Dr., Rockviile, MD, dnia 11 lipca 1986 r. pod numerem rejesirccyJyym ATCC 67153.

Korzystną sekwencją DNA kodującą IL-6, nadającą się do zastosowania w sposobie według wynalazku, Jest sekwencja wg fig. 2, którą celowo zmodyfikowano w celu ekspresji w komórkach bakteryjnych. W sposobie według wyralazku można także stosować alleliczne warianty /to jest wynikłe z naturalnie zachodzących zmian zasad w sekwencci, które zdarzają się w obrębie gatunku, a które mogą zmieniać, lub mogą nie zmieniać, sekwencji aminokwasów/ nukleotydu wg fig. 1 i 2, oraz wariacje sekwencji nukleotydów wynikające z degeneracji kodu genetycznego, jeśli kodują one polipeptyd o aktywności IL-6.

Waaiacje w sekwencji o długości 1,1 kilozasady według fig. 1 spowodowane mutacjami punktowymi, albo moddilkacjami indukowanymi w celu wzmooenia aktywności lub tworzenia białka, nie powinny zmieniać funkcjonalrago białka, kodowanego z ekspresją przez tę sekwencję.

I tak np., zmodyfikowana sekwencja wg fig. 2 jest korzystna w zastosowaniu do ekspresji w komórkach bakteryjnych jako gospodarza. Takie celowo wprowadzone do sekwencji DNA moodfikacje nukleotydu może przeprowadzić fachowiec znanymi metodami. Moodfikacje te mogą spowodować delecję, insercję lub substytucję aminokwasów w sekwencji peptydowej IL-6. Np. wymiana jednej, lub więcej niż Jednej reszty cysteiny w kodowanej sekw^ji może wyeliminować odpowiadający im mostek disiaczzkcwy. Dodatkowo, substytucja, insercja lub delecja aminokwasu w jednym, lub więcej niż jednym, trirlptydowym, sprzężonym z aspiiiginą, rozpoznawanym miejscu glikozylacji, może spowodować brak glikozylacji w tym miejscu. Mtody mutagenozy w celu takiej wymiany lub delecji są znane fachowcom /patrz opis patentowy Stan<w Zjednoczonych Ana^ki nr 4 518 584/.

Sposób według wyrnlazku polega na prowadzeniu hodowli odpowiedniej komórki lub linii komórkowej ti^f^nsorre^owan^j sekwencją cDNA kodującą IL-6, włączając w to ziodyfiktwinr sekwencje jak wyżej opisano i przedstawiono na fig. 2. Sekwencja DNA kodująca IL-6 w transformowwnej komórce Jest operatywnie połączona z odpoMwednią sekwencją kontrolną ekspresji.

Selekcja odpowiednich komórek-gospodarzy oraz metody transformacji, ΜΰοΝϋ, impllSikacji, selekcji oraz wytwarzania produktu i oczyszczania są znane w technice /patrz np.

Gething i Sambrook, Naturę, 293, 620 - 625 /1981/, albo, altenrat^wnie, Kaufman i in.,

Mol. Coli. Biol. 5/7/, 1750 - 175? /1985/ albo Bowley i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Anee-yki nr 4 419 446/.

W pre^paratwcnym sposobie wytwarzania IL-6 korzystnie jako komórki gospodarza stosuje się komórki bakteryjne. * rezultacie wytwarzania w bakteriach uzyskuje się duże ilości aktywnego IL-6, szczególnie wtedy, gdy w celu ekspresji stosuje się zmodyfikowaną sekwencję według fig. 2. Jako komórki gospodarzy, które stosuje się Jako umitliwia jące wytwarzanie biologicznie aktywnego IL-6, korzystnie używa się różnych szczepów E. coli, dobrze znanych w dziedzinie biotechnologii /np. szczep MC 1061 oraz szczepy opisane w przykładach/. Lista /nie wykluczająca innych/ różnych szczepów bakteryjnych tdpowiednich

159 182 do ekspresji IL-6 obejmuje B. subtilis, rozmite szczepy Fseudomonas, inne laseczki i-tp.

Jako komórki-gospodarze można do wytwarzania IL-6 zastosować także komórki ssaków.

Jedną ze szczególnie odpowiednich linii komórek ssaków jest linia komórek Jajnika chomika chińskiego /CHO/. Inną odpowiednią linią komórek ssaków, opisaną w załączonych przykładach, jest małpia linia komórkowa COS-1. Fodobnie, odpowiednią linią kom5i-ek ssaków jest linia komórkowa CV-1. Także, komórki licznych szczepów drożdży, znanych fachowcom w tej dziedzinie wiedzy, dostępne są jako komórki-gospodarze do ekspresji IL-6. Dodatkowo, jeżeli jest to pożądane, w sposobie według wynalazku można używać jako komórek-gospodarzy komirek owadzich. Patrz np. Miiler i inn., Genetic Engineering, 8, 277-298 /Plam Press /1986/ i cytowane tam odnośniki.

Wektory stosowane w sposobie według wynalazku korzystnie zawierają pełną sekwencję DNA przedstawioną na fig. 1 lub na fig. 2. Weetory zawierają także odpowiednie sekwencje kontrolne ekspresji pozwwlające na ekspresję sekwencji DNA IL-6. Alternatywnie, wektory zawierające zmodyfikowane lub naturalnie występujące sekwencje alleliczne, jak wyżej opisano, są także użyteczne przy wytwarzaniu IL-6. Wektory można zastosować w sposobie transformowania linii komórkowych i mogą one zawierać wybrane sekwencje regulacyjne w operatywnym połączeniu z sekwencjami DNA wyżej opisanymi, kodującymi IL-6, zdolne do kierowania replikacją i ekspresją sekwencji kodujących w wyselekcjonowanych κomórktah-gospodarzach. Użyteczne sekwencje Konrrolne dla tych wektorów są znane fachowcom i można je wybrać w zależności od wybranych komórek-gospodarzy. Duoói· taki jest ruty nowy i nie stanowi części sposobu według wynalazku. Korzystnymi wektorami są wektory bakteryjne.

Białko IL-b wytwarzane sposobem według wyrnlazku zasadniczo wolne jest od połączeń z innymi białkami ludzkimi. IL-b charakteryzuje się sekwencją peptydową zawierającą taką samą, albo zasadniczo taką samą, sekwencją peptydową jak seKwwncja od aminokwasu nr 28 do aminokwasu nr 212, przedstawiona na fig. 1, pozorną masą cząsteczkową około 20 do 35 kilodaltonów, oznaczoną metodą analizy polegającej na elektroforezie w żelu poliakryloamidowym z -D- w warunkach nieredukujących. W badaniach m vitro na m^sicn komórkach szpiku kostnego białko to, w 10-1000 pikomolowym stężeniu, w koodycjonowanych podłożach pC-F3S9, wywouje tworzenie miycn kolonii typu granulacytowego.

Figura 1 przedstawia kompletną sekwencję DNA o długości 1,1 kilozasady kodującą białko IL-6 i umoUiwia jącą ekspresję w odpowiednich komórkach gospodarza. Sekwencja ta zawiera długą otwartą ramę odczytu odpowiada Jącą 636 nuklutydom, kodującą polipeptyd o 212 aminokwasach i obejmuje około 50-nutleotydową sekwencję zwykłego lidera wydzzelniczego. Region kodujący białko o długości 1,1 kilozasady, rozciąga się od nukleozydu nr 132 /guanina w ^odrnie alaniny, pozycja aminotiasoia nr 28/ do nuklellydu nr 686, po którym następuje TAG jako kodon stop. Istnieją dwa potencjalne, sprzężone z asparaginą, miejsca glikolizacji, przedstawione przez charakterystyczną sekwencję i~. Region kodujący zawiera także cztery cysteiny, co sugeruje dwa wiązania disiarczkowe. Pozostałych 453 nukleoyydto z niekodu^jącej sekwencji 3' regionu o długości 1,1 kilozasady może spełniać rolę regulacyjną w transkrypcji u naturalnego gospodarza. Koniec 3' sekwencji zawiera również segment bogaty w AT. obejmując kilka powtórzeń sekwencji ATTA, co do której uważa się, że odnosi się do stabilności RNA - przekazu /patrz G.Shaw i R.Kamen, Coli, 46/5/ 659-677 ( 1996)/.

Korzystna sekwencja do ekspresji bakteryjnej, przedstawiona na fig. 2, odpowiada sekwencji leplrdoi^j przedstawionej na fig. 1, ale stanowi sekwencję nukleotydów wybiórczo zmodyfikowaną w celu wzmo^nia tworzenia IL-6 w bakteryjnych układach ekspresji. Oprócz tego, w tej korzystnej sekwencji dokonano delecji większości sekwencji liderowej i nietldującej sekwencji 3' obecnej w se^e^ji wg fig. 1.

Jednym z korzystnych wariantw realizacji wyrnlazku Jest wyZw^zenie IL-6 w komórkach bakteryjnych. Z białka wytworzonego w komórkach bakteryjnych, alanina w pozycji 28 zosta159 182

Je na ogół odozczeplona przez enzymy bakteryjne. Tak więc, około 80% bakteryjnie wytworzonego białka 1L-6 ma prolirę w pozycji 29, Jako swój początkowy aminokwas 5 . Bakteryjnie wytworzone IL-6 jest również nieglikozyoowane. W wyniku tego bakteryjnie wytworzone IL-6 ma ber-dziej jednolitą pozorną masą cząsteczkową aniżeli IL-6 wytworzone w innych układach ekspresyjnych. Oprócz tego, gdy Jest kodowane przez sekwencję DNA przedstawioną na fig. 2, bakteryjnie wytwarzane IL-6 powssaje z dużą wydajnością.

IL-6 wytworzone sposobem według wynalazku można stosować same lub razem z innymi substancjami leczniczymi do leczenia chorób charakteryzujących się obniżonym poz!oraem komórek albo szpikowych, albo lirafoldalnych w układzie hemtopoetycznym, albo jednych i drugich. Białko to Jest również zdolne do stymulowania komórek dodatkowych i komórek dojrzałych, np. monocytów, w celu wytwarzania innych czynników podobnych do hemtopoetycznych, które z kolei stymulują tworzenie kolonii Innych komórek hemtopoetycznych, jak również pojaw ienie się innych aktywności, podobnych do heimaoppotycznych. Alternatywnie, IL-6 może wzmagać aktywność innych heraaopoetyn. I tak np. wykazano, że IL-6 wykazywało zdolność /w teście z m/sim szpikiem kostnym po potraktowaniu 5-fluoΓOlracylem/ do wziragania zdolności innych hemaa<^]^t^^1;yn, a mianowicie IL-3 i CSF-1, do stymulowania proliferacji komórek herattopoetycznych bardziej prymitywnych niż te, które były indukowane przez samo CSF-1 lub IL-3.

Tę cechę przypisywano uprzednio białku zwanemu IL-1- d lub hemi^t^^c^^ityną 1, które może indukować ekspresję IL-6. Podobane, w teście z ludzkimi komórkami blastycznymi IL-6 i IL-3 w plwslLlą proliferację kolonii ludzkich wczesnych komórek pnia. Tak więc IL-6 ma potencjalne zastosowanie farmaceutyczne, w ko^mimac:! z IL-3, w leczeniu wielu stanów chorobowych, które dotyczą niewydolności układu imIninnlogicznego.

Na różnego rodzaju niedobory odpornościowe, np. lmmiocytów T i/lub G, względnie zaburzenia immulolooaczne, np. gościec przewlekły postępujący, można również korzystnie oddziaływać przez leczenie za pomocą IL-6. Niedobory odpornościowe, takie jak leukopenia, zmniejszenie ilości krążących leukocytów w krwi obwodo^-wj, mogą być rezultatem zakażeń wirusowych, np. HTLVI, HTLVIT, HIV, poważnej ekspozycci na promieniowanie, skutkami ubocznymi leczenia nowotworu, albo też mogą powstać w wyniku .i^ych działań leczniczych. LUzenie środkami zawierającymi CL--6 może w przypadku pozwolić na uniknięcie nie po żądanych skutków ubocznych spowodowanych działaniem, leków obecnie dostępnych. Do innych stanów podatnych na leczenie CL-υ należą stany chorob·'}^ pacjentów powracających do zdrowia po transplantacjach szpiku kostnego,

Środki do użycia w leczeniu wyżej wymienionych stanów chorobowych zawierają leczniczo skuteczną ilość IL-6 w mieszaninie z farmaceutycznie dozwolonym nośnikiem środek taki można podawać układu albo pozajelitowo, dożylnie albo podskórnie,, środek leczniczy do podawania układ-Jego ma oczywiście postać wolnego od pirogenów, pozajelitowo dopuszczalnego roztworu wodnego. Otrzymywanie takiego pozajelitowo dozwolonego roztworu białka ze zwróceniem należytej u»wgi na pH, izltonicznośó, stabilność itp. znajduje się w zakresie mHiwości fachowca w tej dziedzinie techniki.

Reżim pldawinia związany ze sposobem leczenia wyżej opisanych stand chorobowych może zostać ustalony przez lekarza leczącego z uwzględnieniem rozmitych czynnik! iildCikujących działanie leków, np. stanu, wagi ciała, płci i diety pacjenta, ciężkości każdego schorzenia, czasu po<0awinij i innych czynnik ów klinccznych. Ogólnie, reżim dzienny powinien obejmować zakres 200 - l^OOOyug polipeptydu lub 50 - 5000 jednostek po li peptydu na kilogram wagi, ciała /odnosi się to do jednostki ldpcoiadoαącej stężeniu poliieptydu wywołującemu pobudzenie stanowiące połowę pobudzenia ^ksy^anego» w standardowym teście na mysim szpiku kostnym/.

W yjr^cJnym z korzystnych wariantów, IL-6 stosuje się w połączeniu z innymi czynnikami do aktywowania dojrzałych komórek liίiflidalncch. W szczególności stiieΓĆzlnl» że iL-6 wykazuje· aktywność CDF w opublilowjπym teście /ϊ. Takai i in., J, Iramunii,, 3 37 /ll/

159 182

34g4 - 3500 /1986/ /. Tak więc, IL-6 w połączeniu z samym IL-2 lub z połączeniem IL-2 i •y -interferonu, aktywuje dojrzałe komórki limfoidalne. To szczegóm połączenie może więc zapewnić działanie lecznicze przeciwrrwotworowe 1 przeciwwirusowe. Patrz także Takai 1 in., Science /1986/ w druku. Ta użyteczność jest częściowo związana z cytolityczną aktywnością komórek T wykazywaną przez IL-6. Oczekuje się więc, że Jednoczesne lub kolejne traktowanie pacjenta IL-6 i IL-2 oraz ~ -i^r^-^^reeoo^m może być skuteczne w leczeniu nowotworów w stadium przerzutów. Podobnie, IL-6 można zastosować w połączeniu z IL-2 do leczenia LAK.

Lista /nie wykluczająca innych/ pozostałych odpowiednich he(MtoLportyo, CSF i interleukin do jednoczesnego lub kolejnego wspólnego z IL-6 podawana, obejmuje GM-CSF, CSF-1, G-CS\ Ifeg-CSF, erytropetynę /EPO/, IL-1, IL-3, czynnik wzrostowy komórek B i czynnik różnicowania się eozynofilów. Połączenia takie mogą zwiększać aktywność lub skutek leczenia osiągany innymi, samymi, heratojptotynam..

IL-6 może także zwiększać humoor^l-ną lub komórkową odpowiedź iemmunrogicioą in vivo przy podawniu wspólnym z innymi czynnikami leczniczymi. Np. IL-6 może wzmagać skuteczność szczepionek będących antygenami wirusowymi Jak HIV itp., albo szczepionek będących antygenami nowotworowymi.

Dawkowwnie IL-6 w takim reżimie Wspólnego podawwnia w celu uzupełnienia dodatkowych składników, np. IL-2, w środku leczniczym powinno być przymocowywane w od^esieniu do daw kowania samego IL-6. Fostęp w leczeniu pacjenta można krotΓorować przez okresową ocenę profilu heIratolrgiczoegr, np. liczby białych ciałek itp.

IL-6 można również zastosować w dobrze znanych sposobach postępowania w celu wytworzenia przeciwciał polikjLonalnych lub monorloro lnych, tak ludzkich jak i m^s5-ch, do zastosowania diagnostycznego i leczniczego. Tych przeciwciał mo μΠογο lnych lub pUklona!nych można użyć w celach leczniczych przez przyłączenie do czynników docelowych lub toksycznych, znakujących itp. IL-6 działa także jako czynnik wzrostowy hybrydoma w podłożu hodowi dla Unii komórek hybiydoma, zwiększając ich przyrost;.

Następujące przykłady objaśniają sposób według wy rn lazku przy zastosowaniu se^^wr^nci cDNA kodujących IL-6. Całkowwtą sekwencję DNA przedstawioną na fig. 1 wyodrębniono ze zbioru poliA* mRNA z linii ludzkich komórek T C10MJ2 tranrreΓIrwanych HTLV I /National Institute of Health; S., K. Arya i in., Science, 223, 1086 (1984)/ stosując ekspresyjną metodę klnnnwania opisaną w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameeyki nr 4 675 285 z dnia 23 czerwca 1987.

Frzykład I. Konntrukcja przykaadowego bakteryjnego wektora ekspresyjnego do ekspressi wewnątrzkomórkowy.

Sekwwncję przedstawioną na fig. 1, zawartą w pCSF3O9 (ATCC 67153) jako insert EcoRI (patrz przykład III) można z niego wyciąć przez trawienie EcoRI i wprowadzić do odpowiedniego wektora bakteryjnego i gospodarza w celu wytworzenia IL-6. Tym niemnej jednak, w korzystnym bakterynnym układzie ekspresyjnym dla IL-6, zapew^^jącym wyższą wydajność białka przez zmianę setowonc! 5' kodiącej IL-6, stosuje się sekwwncję przedstawioną na fig. 2. Tej korzystnej terkιweoji używa się do skonstruowania bakteryjnego plazmidu ekspresyjnego pAL309C-781 jak Klon cDNA IL-6 /fig. l/ niesiony przez fragment EcoRR, przenosi się do M13mpl9 ptrz S.Messing, Methods in Eozymology, 101, 20 - 78 (1983);

J. NoreaodeΓ i in., Gene, 26, 101 - 106 (1983) w takiej orientacji, że nić niekodująca zostaje upakowana w fagu.

Otrzymuje się jeaoooiciowy fagowy DNA i łączy się go z rligonukleoyadem d(GCCCCAGTACCCCCAGJAGA)GG. Oligooukleotya rozbudowie się przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA I i pozossały jeanooijiowy region trawi się nikleszą S1. Końce czyni się tępymi przez poddiałanie jeszcze raz fragmentem Klenowa polimerazy DNA i ostatecznie

159 182 otrzymuje się dwimiciowy cDNA IL-6 za pomocą trawienia Hindlll. Tępy koniec przy fragmencie Hindlll liguje się do pAL-181 (ATCC nr 40134), który trawi się KpNI, traktuje fragmentem Klenowa poiimerazy DNA i trawi Hindlll.

Utworzony plazmid pAL309-181 moOdyikuje się najpieiw przez usunięcie fragmentu sekwencji zasad między parą zasad nr 149 - 169 według fig.l, przez ukierunkowaną outagenezę z usunięciem pętli in vitro. Patrz Morinaga i ln., Biotechnology, 2, 636 - 639 (1984). Delecja ta tworzy pojedyncze miejsce Narl w sekwencji IL-6. Plazmid ten trawi się Narl. Jednonicoowe końce uzupełnia się za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA I, a następnie trawi Hindlll. Z mieszaniny po trawieniu wyodrębnia się fragment niosący koniec 3* genu IL-6. Fragment ten miesza się z syntetycznym dupleksem DNA o 42 parach zasad, którego Jeden koniec uczyniono tępym, a który niesie jednoniciową sekwencję TA 5’ na drugim końcu. Mieszaninę tę liguje się z pAL181 przeciętym Ndeł i Hindlll. W wyniku tej trójudziaoowej ligacji otrzymuje się zmooyfikowaną sekwencję genu IL-6 przedstawioną na fig. 2 oraz ekspresyjny plazmid nazwany pAIL5O9B-181.

Plazmid pAL309B-181 przecina się Bani i jadninicCcwy koniec uzupełnia się z użyciem fragmentu Klenowa polimerazy DNA I. Flazmid przecina się potem Ndel i wyodrębnia 3ię klon IL-6. Ten fragment DNA wprowadza się między miejsce Ndel a uzupełnione miejsce Xbal wektora pAL-161, do którego uprzednio klonowano syntezową sekwencję DNA niosącą domniemaną transkrypcyjną sekwencję terminatorową znajdowaną jako 3' ku końcowi sekwencji kodującej aspA E. coli. Tym nowym plazmidem, nazwanym pAL30*9-781, można transorrmować zwykłymi metodami odpowiednią bakteryjną komóókęęgospodarza, zawierającą środki do regulowania promotora PL ( patrz np. przykład V) ekspresji białka IL-6.

Alternatywnie, zmodyfikowaną sekwencję kodującą IL-6 można usunąć z pAL309C—781 za pomocą wycięcia z użyciem Ndel i Hindlll, albo z pCSF3O9 za pomocą wycięcia z użyciem EcoRI i wprowadzić do jakiegokolwiek pożądanego wektora bakteryjnego, stosując metody i wektory takie jak opisane w: T. Mniatis i in. Moecular Cloning A Laboratory Miiual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Tymi przykładowymi wektorami bakteryjnymi można następnie transformować bakteryjne komórri-gospcdarze i doprowadzać przez to do ekspresji IL-b.

F r z y k ł a d II. Konstrukcja przykładowego bakteryjnego wektora ekspresyjnego do poziiomórkiwego wydzielania i ekspresji.

IL-S można wytwarzać za pomocą wydzielania białka do periplazny 3. coli, Tworzy się tek w palni utleniona białko o wysokiej aktywności właściwej w biitesfcach in νινο. Opisany zostaje wektor do wytwarzan-m 1L-6 cym sposobom,

Flazmid pUC18 /Ysnlsch-Ferron i in., Gene, 33, 103 (1935)/ przecina się endonukleazą restyykcyjną Ndel i powssałe lepkie końce czyni się tępymi za pomocą dzinł.niia na nie fragmentem Klenowa polimermy DNA J E. coli i trifo sfora rami deiisfnukleozydów, a następnie przywraca się plazmidowi postać kolistą z użyciem ligazy DNA T4..Utworzony plazmid nr 1 przecina się następnie tak PvuII /trawienie częściowe/ jak i EcoRi i końce czyni tępymi z użyciem fragmentu Kienow8 prllmerazf DNA. Odpowiednie fragmenty oczyszcza się i liguje poiiwnie i celu wytworzenia plazmidu nr 2, w któiym fragment EcoKI-Fwuil zawierający promotor lac został usunięty. Plazmid nr 2 trawi się EcoRi i działa się na niego nukleazą S1 w celu usunięcia jedirniciowfcn końców, następnie plazmid przecina się KpnI,

Plazmid pASl /Rosenberg, Ho i Shatzman, Meeh. Enzymol, 101, 123 (1983)/ przecina się Barwi i Jednorncii^we końce usiwa się za pomocą trawienia iuklanlą S1 . Łącznik o sekwencji d(GTACCCGGGTAC) liguje się z i.ym straw-ociym Drn piS'i w celu uzyskania plazmidu pAS2, który ma mejsce KpnI następujące miejsce BamHI w pASS. pASk przecina się 8gIII, końce Czym tępymi dllnłanaeo fragmentu Nienowa prljoarnzy DNA i przecina Kpnlo tragoenit BgiUI (tępy) -KpnI zawierający sekwencję prorhotora pL liguje się z wektorową sekwencję plazmidu nr 2 EcoRI (tępy) -Kpnl w celu lytworzenin plazmidu pAL-181, który to plazmid promotor pL, o.fejsce przyłączania i inicjacyjny kodm ATG, po któiym bezpośrednio nastę8

159 182 puje miejsce KpiU i region poliłącznika pUC18. Flazmid pAL-181 zdeponowano w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., RocCviHe, teryland dnia 28 sierpnia 1984 r. pod numerem rejestracyjyye 40134.

Plazmid pAL-181 przecina się za pomocą Ndel i KpnI i wprowadza następującą syntetyczną sekwencję DNA lidera wydzielniczego:

TATO AAA AAA AT? A ACT TTC ATT TTT TTT ATT TT A TT A

AC TTT TTA TAT TGA AAG TAA AAA AAA TAA AAT AAT

GCA TCG CCA TTA TAT GCGGTAC CGT AGC GGT AAT ATA CGC

Sekwencja ta koduje sekwencję typowego lidera wydzielniczego. Plazmid będący wynikiem tej konssrUkeci nazwano pAL-Sec-181.

pAL-Sec-181 przecina się KpnI i poddaje działaniu fragmentu Klenowa polimerazy DNA w celu usnięcla Jednonicicwych końców. Plazmid ponownie przecina się Hindlll i liguje z iragmentem zawierającym DNA IL-6 opisanym w przykładach I i III. Fragmnt ten zaczyna się sekwencją CCCCCAGTACCCCCAGGAGAAG, która koduje pierwszy kodon alaniny dojrzałego lL-b i ciągnie się przez całą sekwencję IL-6 oraz nieulegający translacji region 3'aż do osiągnięcia mejsca Hindlll w poliłączniku M13raml9· Powstały plazmid, p^I^--^se--:U5-181, koduje białko, którego synteza regulowana jest przez promotor pL, a które jest złożone z lidera wydzzelniczego połączonego z dojrzałym białkeem IL-6.

Przykład III. K^r^n^lLr^cja przykładowego wektora ekspresyjnego ssaków pCSF3O9.

W celu skonstruowania wektora ssaków do ekspresj IL-6 kompletną sekwencję cDNA przedstawioną na fig. 1 liguje się do wektora ekspresyjnego komóóki COS p91023B strawionego EcoRI /który można otrzymać za pomocą strawienia pCSF-1 (ATCC 39754) z udziałem EcoRI w celu usunięcia insertu o około 750 parach zasad/. p91023B zawiera wzmar^nacz SV40, główny promotor późny adenowirusa, sekwencję kodującą DHFR, miejsce dodawania poli-A późnego przekazu i gen Val. Plazmid powiały w wyniku strawienia p91023B za pomocą EcoRI i insercji sekwinj-i DNA przedstawionej na fig. 1 kodującej IL-6, nazwano pCSF3O9. Za pomocą pCSF3G9 (ATCC nr 67153) można t^^ai^^Orn^c^/aó zwykłymi miodami odpo-Jiednie kommrki ssaków Jako gospodarza w celu ekspresj IL-6.

Przykładowe kommóki-gospodarze do ekspressi w komórkach ssaków obejmują zwłaszcza linie komórek naczelnych, linie komórek gryzoni itp., np. kommóki OOS.

Fachowiec w tej dziedzinie techniki może ławo skonstruować inne wektory ekspresyjne ssaków lorrwrjłwiljr z pCSF3O9, lecz zawierające niecałkowitą sekwencję przedstawioną na fig. 1. Można np. jeżeli jest to pożądane, flankujące sekwencje 5'i 3'wyciąć z sekwinj-i przedstawionej na fig. 1, albo zastosować zm^^yfiłowane lub allenzzne wariacje sekw^nj przedstawionej na fig. 1 przez maipulowanie tą tekienj-ą. Sekwencję DNA przedstawioną na fig. 1 można wyciąć z plazmidu za pomocą EcoRI i zastosować dobrze znane miody rekombinajt.owe ijżynjeΓii genetycznej w celu zmoOdłikowania tej sekwinj-i i wprowaddenia jej do innych znanych wektor!, takich Jak pCD /Okayama i in., Mol. Cen Biol., 2, 161 - 170 (1982)/ oraz pJL3, pJL4 (Gough i in., EMBO J., 4, 645 - 653 (1985)/. Transformowanie tymi wektorami oypowiednich komeóek-gospodarzł może doprowadzić do ekspresj IL-6.

Przykład IV. Konssrukcja wektor! drożdżowych lub owwadich.

W sposób podobny do sposobu opisanego w powyższym przykładzie I, fachowiec w tej dziedzinie techniki może manipulować sekw^^ą przedstawioną na fig. 1 przez eliminację lub zastąpienie sekwinj-i kontrolnych ssaków flarkujących sekwencję kodującą innymi sekwencjami kontrolnymi ekspresj w celu wytworzenia wektor! drożdżowych lub wektor! innych grzyb!. Tak więc, sekwencja ta powinna być w rezultacie zdolna do ekspresj w kommrkach grzyb! jako gospoodrzach. Lista (nie wykluczająca innych) komórek grzybów obejmuje szczepy z rodzaj! Saccharomyces, AstPrrinut i Pichia, jak również inne znane szczepy. Co do konstrukcj wektor! drożdżowych i ekspresj białka w komórkach drożdży patrz np.: mtody opisane w opub^Lioi^y^^nym zgłoszeniu patenoowym PCT nr WO 86 00639.

159 182

Komórek owadzich również można użyć, Jeżeli Jest to pożądane, jako koraórek-gospodarzy i sekwencje przedstawione na fig. fig. 112 zmienić odpowiednio do tego, Układu ekspresyjnego. I tak np., sekwencję kodującą według fig. 1 można wyciąć z pCSF3O9 za pomocą EcoRI i dalej nią mnipulować (np. ligować z innymi znanymi łącznikami albo zmodyfikować przez delecję z niej dekodującej sekwencj lub zmianę w niej nukleotyd© innymi znanymi metodami). Co do konssrUkcji wektorów owadzich, patrz np.: Mtody opisane w opublikowanym zgłoszeniu patentu euro^jskiego nr 155 476.

Przykład V. Ekspresja białka IL-6.

f. Ekspresja bakteryjna - wewnątrzkomórkowa. Plazmidem pAL309C-781 z powyższego przykładu I transformuje się E. coli K12 szczep GI455, pochodną szczepu W3110, do którego wpro wadzono regiony Cj i Rex bakteriofaga λ- niosącego aiiei Cjbó/ do miejsca Ciał genu lacZ w genomie bakteryjnym. Insert ten składa się ze wszystkich sekwekcCi DNA między nukleotydami 35711 i 38104 genomu faga /patrz F. Sanger i in., J. Moo. Biol., Ib2, /29 (1982)/.

Gdy się hodowlę GI455 tΓansOoiiloearnkj pAL309C-781 w temperaturze 30°C do wysokiej gęstości komńrek, a następnie ogrzewa do temperatury 4O°C, IL-6 tworzy się szybko i akummluje się w ciągu najbliższych 2-3 godzin, w wyniku czego Jego ilość osiąga ponad iu% całkowitej zaw^tości białka komórkowego. Białko to tworzone jest w formie nierozpuszczalnej. Musi ono być sglubiligewack oraz poddane ponownemu sl^,ałdoeaciu zwykłymi metodami. Fatrz np.: T. E. Creighton,, Próg. Bigphys. Molec. Biol., 33, 231 - 29/ (1978). Trzewid^e się, że takie bakteryjnie wytworzone IL-6 będzie wykazywać aktywność właściwą w teście na m/sim szpiku kostnym mędzy około 10 a 2.10' jednostek na mg białka.

B. Wycdielanie bakteryjne. Flazmidem pAL-Sse-IL6-181 z powyższego przykładu II transformuje się E. coli K-12 szczep GI400. Szczep ten jest pochodną »3110 /Bachman, ^^cct^rl.al. Rev., 36, 525 (1972)/, do którego to szczepu wprowadzono regiony Cj, Rex i N bakteriofaga λ (nukleotydy 33498 do 38214 genomu faga) /Singer i in., J. Moo. Biol., 162, 729 (1982)/ do miejsca Ciai genu lbu οβόχβ^ΐ. Gen C^ tego insertu jest all^eem Cj857 wrożUwyB no temperaturę.

Gdy Już raz szczep Uinuu zostanie transgoimσlany pAL-Ssecl—6-181, Ι^ιη^Εί można hodować w tem^r^/^óturze 30°C do pożądanej gęstości komórek 1 w temperaturze podwwższonej do 40°C w celu zapoczątkowania wydzlelacla IL-ó. Produkt wyodrębniony z perip.lazmy komórek Jest jednooity pod względem misy cząsteczkowej. W wyniku przetwarzania zostaje usunięta sekwencja Hderowa. N-końcowa alanino także zosteje usunięta z wydzielanego białka, co daje produkt z proliną Jako N-końcowym aminokwasem w większości przypadków. toótriał ten wykazuje wysoką aktywność właściwą w teście có kglgmlacc komórek szpiku kostnego od 1 - ²⁰.]L0⁶ je^dcgs^te^k/m^g biołta.

C. Ekspresja w komórkacn ssaków, ^'iazmzdoiy DNA otrzymany z E.coli MC1061 zawwerającej pCSF3O9, jak opisano w: Madaóis 1 in., supra, oczyszcza się zwykłymi meot^i^mi, w tym za pomocą eiΓoeania do uzyskania róecowigl „ graaiemiacn cniorku cezu zawierających chlorek etydyny. Kommóki COS (ATCC CRL lbbui transfe^je się oczyszczonym DNA w stężeniu około 5 yug plazmidowego DNA có iu° komórek COS i działo na nie chlgrochiną zgodnie z metodami opisanymi przez G^wedga i m. Science, <80 , 810 - 815 (1985) i R.J. Kaufmana i in., Ml. Cen 2, 1304 (198<). Fo upływie /2 godzin od transfekcji możno zebrać podłoże kocdycJoπoeaIlk komórkami COS zawierającymi pCSF3O9. Zawiera ono białko wykazujące aktywność w standózdoeym teście no m/sich kom^koch szpiku kostnego, jak opisano w przykładzie V.

Przykład VI. Aktywność IL-6 w testach na m/sim szpiku kostnym in .itro.

Testy ne mysim szpiku kostnym przeprowadza się sposobem opisanym w: D. MktgOf, The Hemogogek^c Colony Stimuiaung Factors, Elscvier Press, New York (1984), z następującymi migzfikacjami:

159 182

a) w teście stosuje się ².10⁴ komórek szpiku kostnego/^L;

b) końcowa objętość w teście wynosi 1UU >^i, oraz

c) testy prowadzi się w standardowych płytkach do miKromiereczkowaiiia z 96 dołkami.

Szpik kostny otrzymuje się z kości udowych m^szy samic Balh/c w wieku 6-25 tygodni (Jackson). Przy użyciu podłoża kondyc jonowanego WEll 3 /J.C. Lee i in., J. Imrnunoo., j.2b, 2593 - 2398 (1982/, zawierającego interleukinę-3 jako standardowej kontroli, Jedną

Jednostkę rozcieńczenuwą aktywności definiuje się jako stężenie białka dające mKsyTOiną odpowiedź w tym ^te^ście na sz^piku tostny^ -to jest no^o 2y - ³5 kolonii na 2.:1°⁴ mysito komórek szpiku kostnego.

Podłoże kondycju-uwane komórkami COS zawierającymi pCSk3O9 jest, Jak stwierdzono, aktyw ne w teście na mrsim szpiku kostnym do rozcieńczenia co najmnnej 10 1 wywłuje młe kolonie typu granulocytowego. Ilość i typ Komórek w odpooiedzi mksynalnej będzie zmieniać się w zależności od szczepu i wieku ms^ch dawców.

Podłoże kondycjouowane komórkami E. coli zawierającymi pAL3C0C-78l może wykazywać w tym teście aktywność właściwą co najmnej 10° - 2.10' jednostek/mg białka. Bakteryjnie wytworzone IL-6 również wywouje kolonie grαtulliytlwe.

Przykład VII. Oznaczenie msy cząsteczkowej IL-6.

Metodą R.J. Kaufmana i P.a. Snarpa, J. Mol. Biol. 159» 601 - 629 (1982) można mtabo- 35 licznie wprawdz^ ''o-metioninę do białka IL-6 wytworzonego W wyniku transfekcji komórek

COS DNA pCSFF09. Gdy podłoże kondyiJunoiαtt komórkami COS zawierającymi pCSF3uy ze znako35 weniem S-metioniną bada się w warunkach tiertZtUkujjcych za pomocą elektroforezy w żelu

SDS-poliakrylarrnidunym /u.K. LkemΠl, Naturę, 227, 680 - bbp (19/01/, można wykazać szerokie pasmo wskazujące aa glikozylkiję przy pozornej rasie cząsteczkowej około 20 do 35 kiloiailoncw.

Frzykład VIII. Konntrukcja linii komórek CHO wykazujących ekspresję IL-6 na wysokim poziomie.

Jeden ze sposobów wytwarzaniu IL-6 otrzymanego z komórek ssaków związany jest z konstrukcją komórek zs-w-sraj ących kopie hsttrlIogic<rigo genu IL-6, Gen hefcerologiczny huJe być połączony ze zdc.lnyn do ^'ΐρΐΐϋ^’^ΐ mykt-ras, np. g-ans-w reduktazy dihydro·· fnlljmY/sj (DHFR). U oparciu o ten ππγ’·'.3ϊ· można ΐϊν/ίβΐ^ΐ^οηΰϋό komórki zawierające zwiększoną ilc-ść kopii genu przez rozmn·^^^ się przy zwiększonych stężeniach ιπΙΛοϊ^·· xate (wrX) rztccią Kaufpana i Chsrpa (J. Mol. Bioi., supra), Tego rodzaju p«d-tjśiit do zagadnienia przyjąć ścina w lz·t'.t5ltni’.ι do szeregu rozmitych typó.·/ komórek.

pCSF3O9 i tk.sprtty,ty-π plazmidem DHFR p?.<ŁA26SV-( A)3 (Kaufmsn i Sharp, Mol. Ce.l Diol., supra) kotr^ansfekujo się komórki CHO deficyocwo pod wzglądem BHFH, DkJKK-DII, za pomocą koprecyp.^.teij i fosforanem wapnia i transfekcji. Wyjściowe transformanty wykazujące ekspresję DHFR selekcjonuje s.ię w związku ze wzrostem w podłożach A z dlkliliwaną płodową surowicą cielęcą, o następnie selekcjonuje się w związku z aimUfikacją przez wzrost przy zwiększających się stężeniach ΜΓΧ (kolejne stadia w 0,02, 0,2, 1,0 i 5 mM ΜΠί), jak opisali Kauf'kat i in., Mol. Celi Biol., 5» 1750 (1983). Transformanty klonuje się 1 kontroluje się ekspresję biologiiznit aktywnego IL-6 w testach na ^sim szpiku kostnym. Ekspresja j.L-6 pliirrtk wzrastać wraz ze wzrastającym poziomem oporności na ΜΙΓ).

Claims (4)

1. Sposób wytwarzania rekombinantowego białka IL-6, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę odpowiednich komórek stransOormowanych sekwencją cDNA kodującą białko, przy czym białko to zawiera sekwencję peptydową zasadniczo taką samą Jak sekwencja od aminokwasu nr 28 do aminokwasu nr 212 według fig. 1, a sekwencja cDNA Jest operatywnie połączona z sekwencją kontrolną ekspressi.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja cDNA zawiera zasadniczo tę samą sekwencję nukleotydów, co sekwen<:ja przedstawiona na fig. 1.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja cDNA zawiera zasadniczo tę samą sekwencję nukleotydów, co sekwencja przedstawiona na fig. 2.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tyra, że komórką Jest komórka bakteryjna.