PT92024B - Processo para a purificacao da estreptoquinase de proteinas contaminadoras - Google Patents
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Description
PROCESSO PARA A PURIFICACAO DA ESTREPTOQUINASE DE PROTEI NAS CONTAM INADORAS o contacto da mistura com um reagente R-X, em que R é um grupo capaz de reagir com um grupo tiol livre e X é um grupo R1 capaz de reagir com um grupo tiol livre ou é uma matriz que contém o tiol, e depois a separação das proteí nas contaminadoras quimicamente modificadas resultantes da mistura, para fornecer a estreptoquinase numa forma substancialmente livre de proteínas contaminadoras.
A estreptoquinase é clinicamente usada como um agente trombolltico intravenosa para o trata mento da infrecção miocárdia aguda.
Este invento relaciona-se com um processo para a purificação da estreptoquinase.
A estreptoquinase é uma proteína extracelular , produzida por varias estirpes de estreptococci A sua actividade foi, pela primeira vez, descrita por W.S. Tillet e R.L. Garner (1933), J. Exp. Med. 58, 488-502, que descobriram que esta proteína causava a actividdde da lisina (lisis) dos a coágulos do sangue. Está agora bem estabelecido que a actividade fibrinol Itica da estreptoquinase origina, na sua capacidade, activar o plasminogene do plasma (F. J. Castelliqo }1979) Trends Biochem.
Sei. (Pers. Ed ) , 4, 1-5) .
A estreptoquinase é usada clinicamente como um agente trombolitico para o tratamento de enfartes miocárdios agudos Gruppo Italiano per lo studio deli; streptochinase nel infarto Miacardico (Gissi) (1986),
Lancet 387). E também um dos dois componentes dos agentes trombolIticos, conhecido como CAEPA (complexo Activador da estreptoquinase de plasminogene anisoilado) descrito em PE-A-002 8489.
A estreptoquinase é produzida por certos Streptococci e algumas bactérias, que contêm o material genetico apropriado derivado de Streptococci dos grupos de Lancefield A, C. ou G. A estreptoquianse que é para ser usaeda para fins clínicos, é vulgarmente preparada a partir de culturas de H 464 da estirpe de S. equ i s imi11i s.
Numerosos métodos de purificação da estreptoquinase, que têm sido descritos são baseados nas
-4diferenças quantitativas aa solubilidade, na carga electrica, na dimensão e na forma molecular ou nas interacções fisicas não especificas com superficies. Métodos purificados normalmente resultam em perdas não aceitáveis da estreptoquinase ou na remoção inaquada de impurezas e no emprego dispendioso de reagentes inflamáveis ou reagentes desagradáve i s .
A estreptoquinase , mesmo com as proteinas contaminadoras que formam as impurezas, como a estrepto1isina ou a estreptodorna se , não contêm os aminoácidos cisteina ou cistina (Einarsson et a 1 ( 1979 ) Biochim. Biophys. Acta 568, 19-29; De Renzo et a I ( 1967), J. Biol. Chem. 242, 533-542 ). Esta diferença estrutural pode ser empregue para fornecer um método mais eficaz para a purificação da estreptoquinase, a partir do caldo de fermentação.
De acordo com o presente invento, fornece-se um processo para a separação da estreptoquinase de proteinas contaminadoras numa mistura que contem a estreptoquinase, que compreende o tratamento da mistura con um agente redutor para reduzir as pontec de dissulfureto nas proteinas contaminadoras a grupos tiol livres, o contac to da mistura com um reagente R-X, em que R é um grupo capaz de reagir com um grupo tiol livre e X é um grupo R^ capaz de reogir com um grupo tiol livre ou uma matriz que contenha o tiol, e depois a separação das proteinas contaminadoras quimicamente modificadas resultantes, da mistura para fornecer a estreptoquinase numa forma substancialmente livre de proteinas contaminadoras.
-5A estreptoquinase purificada preferencialmente adequar-se-á com a especificação de pureza da farmacopeia Europeia e preferencialmente compreenderá menos do que 141 de estreptodornase/10.000 UI de estreptoquinase e menos do que 1UI de estreptolisina /1.000.000 UI de estreptoquinase.
A redução das pontes de dissulfureto pode ser realizado com qualquer um reagente redutor adequado Exemplos incluem os tiôis com baixos potenciais redox, como o ditiotreitol (DTT) e o ditioeritritol , tanto sozinho como acoplado a um segundo agente redutor, como o NADPH (Lou M.F. Methods in Enzymology 143, p124 Academic Press 1987). Alguns boro-hidretos como o boro-hidreto de sodio ou o cianoboro-hidreto, podem também ser udados, como pode ser por redução electroquimica (Kadin H. Methods em Enzymology 143 p256 Acad. Press. 1987). Outros métodos de redução de proteínas serão compreendidas a partir da análise de Jocelyn, P.C. (Meth. Enz. 143, p246 Academic Press 1987). Outros métodos de redução de proteínas serão compreendidos a partir disto. Destes métodos o tratamento com o ditiotreitol é o preferido, preferencia 1 mente a uma concentração em DDT de 5-100 mM, mais preferencialmente de 25-100 mM, a um pH de 6,0-8,5 e a uma temperatura de 5° a 35°C.
Exemplos adequados dos grupos de R e R1 incluem o 5-nitro-2-ρiridi 1-tiο , o 5-carboxi-2-pir£ dil-tio, o 2-piridi1-tiο , o 4-piridi1 -1iο , o 2-benzotiaoli1 -tio, o 4-nitro-3-carboxifeni1-tio e os N-óxidos dos grupos piridilo acima mencionados.
-6Matrizes adequadas para serem utilizadas no processo do invento, incorporam aqueles materiais hidrofllicos insolúveis particulares, que podem ser usados como matrizes em varias formas de cromatografia para proteínas, notavelmente agarose, dextrano e silica modificadas e que foram mddifiçadas para incorporar os grupos tióis, como descrito, por exemplo, na Patente da GB No.150 6403 ou 1597757, ou que foram formados por polimerização de monómeros, que incluem os compostos de tiol. Exemplos desses materiais estão descritos por B1ock1ehurst, K et al (1973) Biochem J. 133, 593-584 , e vendidos sob as nomes de gel de sulfidrilo Affigel por Biorard Inc e Tiopropil-Sefarose GB ou Agarose-éter-tiol Agthiol por Pharmacia ,Lt<J.
Os grupos tiol na matriz podem mais efectivamente ser ligados â matriz através de meios de grupos de espaçamento que facilitam o contacto com os grupos tio nas proteínas reduzidas. Os grupos tiol que se ligam â matriz com grupos amino ou carboxilato adjacentes ao tiol são particularmente adequados. Um exemplo disso, um material preferido é a cisteina ou a glutationa imobilizado à Sefarose.
Um reagente preferido R-R^ é 2,2'diρíridi1-dissu1fureto , que é vendido por Aldrich Chemical co, sob o nome comercial de Aldrithiol-2 .
A mistura de estreptoquinase é preferencia lmente separada do caldo de fermentação, em primeiro lugar, antes da purificação, de acordo com o invento, por uma técnica como a centrifugação, a filtração ou a adsorção, que permite a separação da estreptoquinase das células bacterianas. Esta separação é preferencialmente combinada com um outro passo de purificação, em que a estre ptoquinase está livre de grande contaminação com tiol, que contem impurezas. Técnicas adequadas para o pré-tratamento de caldos, incluem a precipitação fraccionária, a Florisil e a cromatografia de permuta ionica, por exemplo, como descrita na Patente da Alemanha de Este No.12 6342 e 121 522, De Renzo E.C. (1967) J. Biol. Chem. 242, 533 ou na Patente dos EUA no.278 4145. Os tratamentos preferidos são a cromatografia por natureza e evita a exposição e reagentes, que podem modificar a estreptoquinase.
A separação das proteinas contaminadoras quimicamente modificadas podem ser realizadas fisicamente e/ou quimicamente.
Quando o reagente está na forma de R-R1 , a sua reacção com a mistura de estreptoquinase fornecerá dissu1furetos misturados com os grupos R e R1 e as impurezas reduzidas da mistura. A reacção, sob maior parte das condições, resulta na precipitação das proteinas contaminadoras quimicamente resultantes.
As condições à volta deste passo de precipitação podem ser controladas de modo a maximizar a formação do precipitado.
Em particular, a concentração preferida do reagente R-R1 é de 10-200 mM e a activação é preferencialmente realizada a um pH de 6,0-8,5 e a uma temperatura de 5 a 35°C.
precipitado pode ser removido da mistura por qualquer procedimento físico convencional adequado, por exemplo, filtração, sedimentação, centrifugação ou retenção do precipitado com uma coluna de cromatografica ou outro dispositivo adequado.
A filtração pode ser efectuada pela utilização de qualquer filtro adequado, preferencialmente capaz de reter partículas de dimensão de 1 um ou menores. Materiais adequados incluem fibra de vidro, poli-sulfona , difluoreto de polivini1ideno e fibra sintética (nylon.)
Quando a precipitação for optimizada, a separação da mistura por filtração pode resultar em estreptoquinase do grau de pureza necessário. Contudo, quando o grau requerido de pureza não foi atingido, o filtrado por si só pode ser aplicado a uma matriz que contem o tiol para remover a proteína contaminadora do residual por cromatografia de permuta de tiol.
Em alternativa, em particular quando a precipitação incompleta, ocorreu, a mistura pode ser aplicada directamente à matriz que contem o tiol, sem filtração anterior.
9As concentrações contaminadoras baixas (por exemplo, menor do que 25 Ul/ml ), a precipitação pode não ser efectiva e o método da matriz pode vantalosamente ser empregue.
Quando o reagente está na forma de R-X, em que R é como previamente definido e X é uma matriz que contem a tiol, c processo do invento essencialmente envolve o contacto da mistura reduzida com uma matriz que contém o tiol activada.
A activação da matriz que contem o tiol pode ser atingida através do tratamento da matriz com um reagente R-R1, em que R e R1 são como previamente definidos, para fornecer dissulfuretos misturados com os grupos R e R^ e a matriz com grupos tiol. Um reagente preferido é o Aldrithiol-2, que pode ser ueado para preparar 2-piridi1-dissulfuretos nas matrizes com grupos tio adequados, para reacção com misturas de estreptoquinase reduzida. Estes 2-piridi1-díssulfuretos na matriz com grupos tip podem também ser preparados por meios alternativos, como aqulees descritos em GB 150 6409 e podem ser usados em substituição daqueles preparados a partir da matriz com grupos tio.
Deste modo, num aspecto do invento, í jrnece-se um processo para a separação da estreptoquinase das proteínas contaminadoras, numa mistura que contem a estreptoquinase, que compreende o tratamento da mistura com um agente redutor, para reduzir as pontes de dissulfureto nas proteínas contaminadoras a grupos tiol livres, o contacto da mistura com uma matriz, que compreende os compostos que têm tiol, em que uma da mistura reduzida e da matriz, sejam activadas antes do contacto, e a eluição da es treptoquinase da matriz, na forma subtancialmente livre das proteínas contaminadoras.
A estreptoquinase pode convenientemente ser separada da matriz através da lavagem com um tampão aquoso, que é convenientemente estabelecido , para minimizar qualquer interacção não covalente entre a estreptoquinase e a matriz. Tampões que contem pelo menos iões sodio 200 mM e opcionaImente um agente de quelação como o EDTA, foram encontrados como adequados.
Depois da separação da estreptoquinaser, a matriz pode ser tratada com um agente redutor, como aqueles descritos aqui anteriormente, antes da lavagem com um tampão aquoso, para regenerar a coluna para uma nova utilização.
A matriz é convenientemente forneci_ da na forma de uma coluna, e a purificação pode ser realizada num modo continuo ou num modo descontínuo.
A purificação da estreptoquina se de acordo com o invento é agora descrito usando os métodos e os materiais seguintes.
11EXEMPLOS DE PURIFICAÇÃO DA ESTREPTOQUINASE
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
A Sefarose 4B foi obtida em Pharma' cia LKB, Uppsala, Suécia. A tio-hidroxipropi lo e as agaroses da glutationa foram também obtidas am Pharmacia ou foram sintetizados de acordo oom o método de Dean et a 1 , ( 1985 ).
2,21-dipirildissulfureto (Aldritiol-2) foi obtido em Aldrich Chemical Company, Gillingham, Dorset. Outros compostos quimicos finos foram obtidos em Sigma (London) Chemical Co, Poole, Dorset, UK, ou Fisons,
Loughborouqh, Leics, UK.
Métodos
1. Cromatografia covalente (a) Pré-tratamento de soluções de proteinas oontaminadoras da estreptoquinase (i) A solução de proteína foi reduzida com DTT, 25 mM e incubada, a 30°C, durante 30 minutos.
D DTT em excesso, foi removido ou por cromatografia G-25 usando permuta do tampão em colunas Pharmacia PD-10 ou permuta do tampão por diafiltração, num sistema de ultrafi ltração agitada. A micron. Em ambos as casos a solução de proteína foi permutada para SaCl , 150 mM, NaH2
-12ΡΟ^, 100 mM, EDTA, 1mM, tampão de pH 7,0 desgaseifiçados.
(ii) As soluções de proteina foram reduzidas, com DTT 25 mM e incubadas, aos 30°C, durante 30 minutos, com agitação, suave. (A solução de proteina está neste ponto em NaH2P04), 10mM, NaCl 200 mM, tampão de pH 7,0). 0 ÃLdritiol-2-(2,2'-dipiridi1-dissulfureto foi adicionado a uma concentração final de 50 mM, 0 Aldritj. ol-2- em excesso fpi depois removido através de um ou dois métodos descritos acima.
(b) Cromatografia
A cromatografia covalente f i i realizada por um ou dois métodos seguintes: pelo método A) (no caso do método de pré-tratamento da estreptoquinase i) ou pelo método B) (no caso do método de pré-tratamento i i ).
A) 20 ml da agarose de glutationa ou de cgarose de hidroxj_ -tiqpropilo foram carregar na forma de uma 1 ama a 50% numa coluna de cromatografia Pharmacia C-16. A coluna foi depois lavada com NaCl 150 mM, EDTA 1Mm, NaH2P04 100 mM, pH 7,0(tampão A) a uma velocidade de fluxo de 20 cm. h“\ até que um leito de massa compacta estável for obtido. Depois 100 ml de DTT 50 mM, foram passados através da coluna a uma velocidade de fluxo superficiel de 10 cm h~\ para assegurar a redução total da agarose de tiol. A coluna foi depois lavada com o tampão A desgasífiçado até que haja completa libertação do DTT. (10 volumes da coluna). A coluna foi depois lavada com uma solução satu13rada de Aldritiol-2 a uma velocidade de fluxo superficial de 10 cm h . (100 ml) e novamente lavado com tampão A desgasifiçado até à libertação do Aldritiol-2-.
As soluções de proteína preparadas pelo método i) (volume de 10-20 ml) foram carregadas numa coluna a uma velocidade de fluxo de 10 cm.h^ e lavado com tampão A. A coluna foi monotorizada a 280 nm e o pico da proteína lavada foi retido e ensaiado, A coluna pode depois ser regenerada através do método descrito previamen te.
B) 20 ml de agarose de glutationa ou de agarose de hidroxi-tiopropi lo foram carreíjar, na forma de uma lama a 50% numa coluna de cromatografia Pharmacia C-16. A colu na foi depois lavada com NaCl 150 mM, EDTA 1mM, Nah^PO^, 100 mM, pH7,0 tampao A, a uma talocidade de refluxo de 20 cm.h~\ até que um leito de massa compacta estável for obtida. Depois 100 ml de DTT, 50 mM, foram passados através da coluna da/a uma velocidade de fluxo de 10 cm-h“1. para assegurar a redução total de agarose de tiol.
A coluna foi lavada com o tampão A desgaseificado até que haja completa liberdade do DTT (10 volumes de coluna).
A solução de proteína prepaairda pelo método ii) volume de 20-100 ml) foi carregar a coluna a uma velocidade de fiuxo de 10 cm e lavada com o tampão A. A coluna foi monotorizada a 280 nm e o pico da proteína lavada foi retido e ensaiado. A coluna pode depois ser regenerada através do método descrito previamente
2. Precipitação covalente (Método C) (a) Pré-Tratamento da solução de proteína que contém a estreptoqu i na se
A solução de proteína foi reduzida com DTT, 100 mM, e incubada aos 30°C, durante 30 minutos Depois o Aldritiol-2 com uma concentração final de 150mM foi adicionado e a solução (a pH 7,5) incubada com agitação, durante 20 minutos',' aos 30°C, seguido por 15 minutos aos 35°C. A solução foi depois arrefecida aos 5°C e deixada ficar durante 20 minutos.
(b) Remoção do precipitado
Aldritiol-2 residual e os contaminantes de proteína precipitada foram removidos tanto por (i) Filtração através de um pré-filtro GF/A de microfibra de vidro Whatman (dimensão de poro de 1,6 um) seguido por um filtro final GF/F de microfibra de vidro Whatman (dimensão de poro 0,7 um) sob vacuo, num sistema de filtro de buchner e o filtrado foi retido e ensaiado; ou
(ii) Centrifugação a 6000 χ g durante 20 minutos, aos 5°C. 0 sobrenadante foi depois decantado do precipitado, foi retido e ensaiado.
Ensaio
As amostras para o teste são seria mente diluidas dez vezes com solução salina tamponizada por fosfato, para originai as diluições seguintes:
; 0,1; 0,01 e 0 ,001 .
Estas amostras diluidas foram depois ensaiadas para a estreptolisina-0 através de uma adaptação do método da Farmacopeia Europeia, que requer a utilização de 1/5 dos volumes da amostra e dos reagentes indicados em European Pharmacopeoea 2nd Edition 356-3 (1034). 0 procedimento foi repetido oom diluições intermédias das amostras.
Os resultados estão resumidos no Ouadro segu i nte.
ο ex
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| < z — H Ot w ω t—t J gl b | 18.0 | • XJ • c | 1.3 | <3.00 | <0.19 | <0.87 | <0.54 | 0.36 | 0.68 | |
| E-J m' C/5 O W — -1-n— | ||||||||||
| w w < z H 3 | ||||||||||
| CU f? | 114 | in σι | σ* xo | 00 co | CO tn 04 | n ># 04 | 224 | 6178 | CO XO xo OJ | |
| w -- 05 | ||||||||||
| ÊSTREPTOLISINA (UI/10 mgEq) | 1050 | 5405 | 670 | 4370 | 6820 | 2940 | 8160 | 2080 | 90 | |
| 05 to < z H t) | 131.0 | 114.0 | 70.0 | 69.0 | 272.0 | 293.0 | 270.0 | 6240 | 2750 | |
| 05 - 05 | ||||||||||
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| MÉTODO | -4 | « | ο |
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DISCUSSÃO
Todos os métodos (métodos A, B e
C) são rendimentos elevados em estreptoquinase (80-100%) e todos oferecem redução significativa em niveis de estrep to 1 is ina .
método A origina niveis detectáveis em estreptolisina em solução. No caso do método B, devido à baixa concentração da estreptoquinase, os niveis em estreptolisina estão abaixo da sensibilidade do ensaio, por conseguinte, os resultados estão descritos como menos do que.
No caso do método B, Realização 1, o nível em estreptoquinase foi insuficiente para determinar se a amostra passou ou falhou o padrão da Farmacopeia Europeia, Níveis baixos em estrepto1isina são detectá veis em materiais produzidos pelo método C, mas estes estão nos limites da especificação da Farmacopeia Europeia 0 método C é preferido quando for necessário produzir material nos padrões da Formacopeia Europeia em pureza, sem o custo da utilização das matrizes com tiol.
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1a.- Processo para a separação de estreptoquinase de proteinas contaminadoras numa mistura que contenha a estreptoquinase, caracterizado por compreender o tratamento da mistura com um agente redutor para reduzir as pontes de dissulfureto nas proteinas contaminadoras a grupos tiol livres, o contacto da mistura com um reagente de R-X, em que R é um grupo capaz de reagir com um tiol livre e X ê um grupo R1 capaz de reagir com um gri£ po tiol livre ou é uma matriz que contém o tiol, e depois a separação das proteinas contaminadoras quimicamente modificadas resulatntes da mistura, para fornecer a estrep toquinase numa forma substancialmente liVre de proteinas contaminadoras.
- 2a.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente redutor ser d i t iotreltol.
- 3a.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por os grupos R e R1 serem seleccionados a partir de:5-n i t r o-2-p i r i d i ltio5-carboxi-2-piridiltio2-piridiltio
- 4-piridiltio2-benzotiazoli ltio-194-nitro-3-carboxifeniltio, e os N-óxidos dos grupos piridilo anteriores.4a.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o reagente R-X estar na forma de R-r\
- 5a.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o reagente R-R^ ser 2,'2'-dipiridil-dissulfureto.
- 6a.- Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado por a concentração do reagente R-R1 ser 10-200 mM.
- 7a.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado por a reacção da mistura reduzida oom o reagente R-R ser realizada a pH 6,0-
- 8,5 .-208a.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado por a reac ção da mistura reduzida com o reagente R-R1 ser realizada a uma temperatura de 5-35°C.
- 9a.- Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado por as proteínas contaminadoras quimicamente por filtração, sedimentação, eentrifugação, ou por retenção numa coluna cromatográf i ca.
- 10a.- Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por as proteínas contaminadoras quimicamente modificadas residuais serem removidas por cromatografia de permuta de tiol.
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