PT92487B

PT92487B - Processo para a preparacao de derivados de peptidos

Info

Publication number: PT92487B
Application number: PT92487A
Authority: PT
Inventors: Rainer Albert; Eric P Krenning; Steven W J Lamberts; Janos Pless
Original assignee: Sandoz Sa
Priority date: 1988-12-05
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 1996-01-31
Also published as: IE893866L; GB2225579A; SE508799C2; KR0156541B1; IE62091B1; DK175338B1; FI102540B; JPH1095737A; FI102540B1; ATA901789A; JPH02184698A; AU633859B2; DK612689D0; FR2639947B1; FI895809A0; CA2004532C; MY106120A; SE8904087D0; HK189995A; KR900009697A

Description

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de polipeptidos, a composiçoes farmacêuticas que os contêm e ao seu uso como farmacos, por exemplo para o tratamento de tumores positivos de receptor de somatostatina para diagnóstico ao vivo proporcionando imagens ’ dos agentes.

I

Nos últimos anos tem-se demonstrado uma elevada incidência de reoep!tores de somatostatina em vários tumores humanos, por exemplo tumores! pituitários, tumores do sistema nervoso central, tumores do peito, ? tumores gastro-enteropancreáticos e suas metastasses. Alguns deles j sao pequenos ou tumores de crescimento lento que sao difíceis de localizar com precisão por meio dos processos de diagnóstico convencionais

A visualização in vitro dos receptores de somatostatina tem sido reajlizada através de autoradiografia dos tecidos tumorais usando para tal somatostatina iodizada ou análogos de somatostatina, por exemplo £¹²5l-Tyr¹^2-somatostatina-14 (Taylor, J.E. et al., Life Science (198S) 43» 421), ou,f¹²⁵I-Tyr³/SMS 201-995 também denominado /¹²\/ 204-090 (Reubi, J.C. et al., Brain Res. (1987) 406: 89I; Reubi, J.C. et al., J.Clin. Endocr. Metab. (1987) 65; 1127; Reubi, J.C. et al., Câncer Res. (1987) 42/: 551} J.C. et al., Cancen Res. (1987) 42.» 5758) .

Descobriram-se agora novos péptidos de somatostatina úteis em termos terapêuticos e que podem ser marcados para aplicações terapêuticas e diagnósticos in vivo.

De acordo com a invenção, desenvolve-se um péptido de somatostatina que possui pelo menos um grupo quelante de um elemento detetável; sendo o referido grupo quelante ligado a um grupo amino do referido péptido, não tendo o citado grupo amino nenhuma afinidade de ligação significativa em relação aos receptores de somatostatina. ί

I

Estes compostos são, a partir daqui, referidos como os LIGANDOS DA . INVENÇÃO . Eles possume um grupo quelante capaz de reagir com um elemento detectável, por exemplo um elemento radio-nucleado, um elemento radio-opaco ou um iao paramagnético, para se preparar um complexo : e posteriormente serem capazes de se ligarem aos receptores de soma-

tostatina, por exemplo expressos ou sobre—expressos por tumores ou metastases.

I grupo quelante liga-se ao grupo amino do peptido por uma ligação covalente. 0 grupo quelante é ligado de preferência ao grupo N-amino

I terminal do péptido de somatostatina. j j

De acordo com a invenção, o grupo quelante pode ser ligado tanto direótamente como indirectamente, por exemplo por meio de um grupo inter— ! mediário ao grupo amino do péptido de somatostatina. j

Um grupo de LIGANDOS é aquele em que o grupo quelante é ligado direc- ; tamente ao grupo amino do péptido de somatostatina.

Um outro grupo de ligandos é aquele em que o grupo quelante está ligado indirectamente por um grupo intermediá. buem ponte, ao grupo amino do péptido de somatostatina.

De preferência o grupo ligante é ligado por uma ligação amida ao peptido .

I termo ” peptido de somatostatina inclui as soaatostatinas que ocorrem naturalmente ( tetradecapéptido) e seus análogos ou derivados.

Os termos ” análogos ou derivados ” tal como aqui se usam, significam qualquer polipéptido de cadeia linear ou cíclica, derivado do tetradecapéptido somatostatina que ocorre naturalmente,, em que uma ou mais unidades de aminoácido tenham sido removidas e/ou substituídas por um ou mais radicais de outros aminoácidos e/ou em que um ou mais grupos funcionais tenham sido substituidos por um ou vários outros grupos funjcionais e/ou um ou mais grupos tenham sido substituídos por um ou vári-r os outros grupos isostéricos. Geralmente, o termo emgloba todos os de-!

i rivados modificados de um péptido activo biologicamente, que tenha um ' efeito qualitativamente semelhante ao do péptido de somatostatina não-modifiçado, por exemplo ligam-se aos receptores de somatostatina e diminuem a secresão hormonal.

Os análogos da somatostatina de cadeia linear, cíclicos em ponte e cí-| clicos sao compostos conhecidos. Tais compostos e sua preparaçáo estáoj descritos por exemplo,nas Memórias descritivas das Patentes Europeias I ep-a-1295; 29.5795 215.1715 203.031; 214.872; 298.732; 277.419.

Os LIGANDOS da invenção preferidos são os derivados dos análogos da somatostatina que se seguem:

A. Análogos de Fórmula I

A

ch₂-s-y₁ y₂-s-ch₂ n-ch-cO-B-C-D-E-NH-CH-G (I) na qual o símbolo A representa alquilo em C7-C10 ou um grupo de

C^-C^₂, fenil-alquilo em fórmula RCO-, em que

i) osimbolo R representa hidrogénio, alquilo em

0^-0^, fenilo ou fenil-alquilo em ^ou ii) RCO- e

a) um resíduo L- ou D- fenilalanina opcionalmente substituído no anel por F, Cl, Br, NOg, NHg, OH, alquilo em C^^-C^ e/ou alcoxi em C₁~C^;

b) o resíduo de um a-aminoácido natural ou sintético, diferente do anteriormente definido em a), ou de um D-aminoácido correspondente, ou

c) um resíduo dipeptidico, em que os residuos individuais dos aminoácidos são iguais ou diferentes e são escolhidos entre os definidos em a) e/ou b)

grupo βί-amino dos resíduos dos aminoácidos de a) e h) e o grupo N-amino terminal dos resíduos dipéptidicos c) sendo opcionalmente monoI ou di-alquilado em ^ou P^or alcanoilo em ί simhola A· ^Y1 ^{e Y}2 representa hidrogénio, alquilo em C^-C.^ ^oufenil-alquilo em representam em conjunto uma ligação directa ou cada um dos slmholos Y^ e Y^ são, independentemente um do outro, hidrogénio ou um radical das

fórmulas (l) a (5)
R		CH_n
a I
1 -CO-C-(CH₂)_m-H I	-CO-CH
1 ^Rh
(I)		(2)

-CO-NHR		-CO-NH-CH-COOR
c		1 ⁰
		R.
(3)		d (4)
	R , “
	a*
-CO-(NH)_p-	C	-^(0H^-O^⁸⁸

	R. , £>’ >	\_R S !

nas quais (5) ^Rb m

^Ra'^{e R}b‘ ^r8 ^{e R}9

P q

Γ

B é metilo ou etilo é hidrogénio, metilo ou etilo !

é um número inteiro de l a 4 !

i é um número inteiro de l a 5 é alquilo em C^-Cg repoesenta o substituinte ligado ao átomo o^carbono de um cf-aminoácido natural ou sintético (incluindo ; hidrogénio);

é alquilo em C.-C_r

5 ' são independentemente um do outro, hidrogénio, metilo ou etilo, são independentemente um do outro hidrogénio,halogeneo, alquilo em C^-C^ ou alcoxi em C^-C^; é 0 ou 1 é 0 ou 1, e é 0| 1 ou 2, é Phe-opcionalmente substituído no anel com um halogéneo, NC>2 NH₂, OH, alquilo em C^-C^ e/ou alcoxi em C^-C^ ( incluindo pentabluor-alanina), ou ^-naftil-Ala;

C é (L)-Trp- ou (D)-Trp- opcionalmente <(-N-metilados e opcionalmente substituídos no anel benzénico com um halogéneo,

NO^, NH^, OH, alquilo em C^-C^ e/ou alcoxi em C^-C^j

D é Lys, na qual a cadeia lateral compreende um átomo de 0 ou S na posição Ji, tF-Lys ou oF-Lys, opcionalmen te oÇ-metilados, ou um residuo 4-amino-ciclohexil-Alaj

I ou um 4-amino-ciclohexil-Gly é Thr, Ser, Vai, Phe, Ile ou um residuo do ácido araib no-isobutirlco ou aminobutirico é um grupo de fórmula nas quaisj

-coor₇, -ch₂or_1o,

é hidrogénio ou alquilo em C^-C^i j é hidrogénio ou um residuo de um éster fisiologicamente aceitável, fisiologicamente hidrolisável;

é hidrogénio, alquilo em C^-C^, fenilo ou fenilalquilo em θγ-^θ;

é hidrogénio, alquilo em ou um grupo de fórmula

-ch(r₁₃)-x₁, é CH₂OH, -(CH₂)₂-OH, -(CH₂)₃-OH, ou -CH(CH₃)OR ou reperesenta o suhstituinte ligado ao átomo de carbono na posição de um c(-aminoácido sintético ou natural ( incluindo hidrogénio) e é um gcupo de fórmula -COOR?; -Cí^OR^q ou na qual ^R7 ® ^R10

R.

têm os significados acima referidos;

é hidrogénio ou alquilo em C^-C₃ e é hidrogénio, alquilo em C^-C₃, fenilo ou fenil14 '15 .-¾

ί-alquilo em Ογ-Ο^θ, e é hidrogénio ou hidroxi, com a condição de que quando R^₂ é -CH(R^^)-X^ então R^j é hidrogénio ou metiio, : na qual os resíduos B, D e E possuem a configuração L, e os resíduos nas posições 2 e 7 ® qualquer um dos resíduos Y^ 4) θ 4) possuem cada um 'independentemente a configuração (L) ou (d).

Os significados de A e A’ na fórmula I são de preferência escolhidos de forma que o composto compreenda um grupo -NH- terminal capaz de se ligar a um agente quelante.

Nos compostos de fórmula I, são preferidos os seguintes significados, tanto individualmente, como em qualquer combinação ou sub-conbinação:

1. 0 símbolo A representa : fenil-alquilo em especialmente fenil-etilo, ou um grupo de fórmula RCO. De preferência o símbolo A representa um grupo de fórmula RCO.

1.1 De preferência o símbolo R representa um alquilo em C^-C^^ ^ouum fenil-alquilo em θγ“θιθ» ^esP^ec-’-^aT^men‘te & um fenil-alquilo em C^-C^q, preferencialmente é fenil-etilo,ou um grupo de fórmula RCO tem como significado a), b) ou c).

1.2 Quando RCO tem como significado a), b) ou c) , o grupo c(-amino dos resíduos dos aminoácidos a) e b) e o grupo amino N-terminal dos resíduos dipeptídos c) é de preferência não alquilo ou mono alquilo em C^-C^₂, ^esP^eci^al^menTe alquilado em C^-Cg, n>^ai^s especialmente metilado. Preferencialmente, o grupo N-terminal não é alquilado. ;

1.3 Quando o grupo de fórmula RCO tem o significado descrito em a) este é de preferência a·) um resíduo L- ou D-fenil-alanina ou - tirosina, de preferência mono-N-alquilado em C^-C^₂· preferencialmente a’) é um resíduo L- ou D- fenil-alanina.

1.4 .5

Quando o grupo de fórmula RCO tem o significado referido em b) ou c), o resíduo referido é de preferência liofílico. Os resíduos preferidos b) são consequentemente os definidos em b’) resíduos c(-aminoácidos que possuem uma cadeia lateral de hidrocarbonetos, por exemplo alquilos com 3, de preferência j 4 ou mais átomos de carbono, por exemplo até 7 átomos de carbono, naftil-metilo ou hetero-arilo, por exemplo 3—(2— ou 1-naftil)-alarína, piridil-metilo ou resíduo de tritofano, possuindo os resíduos citados configuração L-ou D-, e os resíduos i

preferidos em C) preferidos são resíduos dipeptídicos em que j os resíduos individuais de aminoácidos são idênticos ou dife-[

I rentes e são escolhidos entre oe definidos acima em a*) e b·) Um exemplo de um resíduo c) é resíduo 3-(2-naftil)-alanina.

grupo de fórmula RCO de máxima preferência tem o significa· do a) especialmente a*)

B e B' , em que B’ é PHe ou Tyr.

C e C’, em que C’ é (D)Trp.

DéB', em que D' é Lys, Melys ou Lys (E-Me), especialmente Lys.

E e E’, em que E* é Vai ou Thr, especialmente Thr

G e G’, em que G' é um grupo de fórmula - CO-N

especialmente um grupo de fórmula -CO-N ch(r₁₃)-x₁ .Λ ,7 Õ * ( sendo neste caso R^j^ ou CH^) . A último caso a estrutura -ChÇr^^) — -X^ de preferência apresenta a configuração L.

6.1

6.2 *11 ^€ de preferência hidrogénio.

Como substituinte ligado ao átomo de carbono na posiçãot^-de um 'aminoácido natural ( isto é , de fórmula H^N-CH(r₁₃)-COOH), R₁₃ é de preferência -CH₂-OH, -CH(CH₃)-OH, isobutilo ou butilo,ou R₁₃ é (CH₂)₂-0H ou -(CH^^-OH.

$ especialmente -CH₂OH ou -CH(CH,)OH.

6.3

X^ é de preferência um grupo de fórmula -CO-N ou -CH₂-CR^q, especialmente de fórmula -ΟΙ^-ΟΑ^θ, *15 ^e *10 é de preferência hidrogénio ou tem o significado dado mais abaixo no ponto 7. Muito preferénciamente R^q é hidrogénijo

Os compostos individuais que se seguem são ilustrativos dos compostos de fórmula I :

H-(D)Phe-Cys-Fhe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol também conhecido como octreotíó-ôo (D)Phe-Cys-Thr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH₂ l

(D)Phe-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-TrpNI^ (D)-Trp-Cys-Phe-(B)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrWI^ ( D)-Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH₂ ^Γ11

I-1

3-(2-naft il)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-C ys-ThrNH_r

3-( 2-naf til) -(D) Ala-Cys-Tyr-( D) Trp-Lys-Val-Cys-^3-Nal-NH„

3-( 2-naftil)-(d) Ala-Cys-B-Nal-(D) Trp-Lys-Val-Cys-TbrNH^ ( D)Phe-Cys-Phe-(D)-Trp-Lys-Thr-Cys-B-Nal-NH_r

B. Análogos de fórmula II

I-1

H-Cys-Phe-Phe-(D)-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-ol II /vide Vale et al., Metabolism, 27, Supp. 1, 139, (1978)/

I-1

H-C ys-Hi s-Hi s-Phe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH III (vide EP-A-2OO, 188)

O conteúdo de todas as publicações anteriores, incluindo os compostos específicos, sáo incorporadas especificamente aqui como referência.

Os LIGANDOS particularmente preferidos sao aqueles derivados a partir do:

H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

Os grupos quelantes adequados sáo os grupos quelantes aceitáveis fisiologicamente, capazes de complexarem um elemento detectável. j

De preferência o grupo quelante possui substarcialmente um caracter hidroxflico. Exemplos de grupos quelantes incluem grupos amino-dicarboxllicos, grupos poliamino-policarboxilicos, por exemplo os derivados de ligandos náo cíclicos, por exemplo do ácido etileno diamino12

-tetra-acético (SDTA), ácido dietileno triamina penta-acêtico (DTPA), ácido etileno glicol-0-0’-bis-(2-amino-etil)-N-,N ,N* ,H’-tetra-acético (EGTA) , ácido N,N*-bis(hidroxibenzil)etilenodíamina-N-N’-diacético (HBBD) e ácido trietilenotetraamina hexa-acético (TTHA), os derivados;

!

! de EDTA ou DTPA substituídos, por exemplo p-isotiocianato-benzil-EDTA; ou —DTPA, os derivados de ligandos macrocíclicos,por exemplo ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclo-dodecano-N,N,N,N’-tetra-acético (DOTA) e ácido 1,4,8,ll-tetra-azaciclododecano-N,N^f ,N',’N-”'_-fcetra-acético (TETA) os derivados de aminas macrocíclicos N-substituídas ou C-substituídas', incluindo também cilamas, por exemplo os desvendados da Patente Euro-i peia 304.780 AI e WO 89/OI476-A, grupos de fórmula IV ou V

0 0 | II II

Hj -O-S-(CH₂)_n,-C-(TTj.-O- _IV i!

R₂-C-S-( CH₂ ) _n, -G -NH-CH,

CH-C _R C-S-(GH ) - C-N ³II íl em nas quais cada um dos símbolos R^, R₂ e R^ são independentemente um alquilo C^-Gg, arilo em Cg-Cg ou aril-alquilo C^—G^, cada um substituído opci onalmente por OH, alcoxi em G^-G^, GOOH ou SO^H, é 1 ou 2 i é um numero inteiro entre 2 e 6, e

TT são independentemente c(- ou J3-aminoáeidos ligados um ao outro por ligações amida, grupos derivados de derivados de bis-aminotiol, por exemplo compostos de fórmula VI is w»'

SE

HS

na qual cada um dos símbolos R₂₀> ^R21 ’ ^R22 ^{e R}23 ^s^° ^indeP^enden'^a3men‘^teuns dos outros hidrogénio ou alquilo em C^-C^, X₂ é um grupo capaz de reagir com um grupo N-amino- do péptido, e m* é 2 ou 3>

grupo derivados de derivados de di-tiasemicarbazone, por exemplo compostos de fórmula VII

VII na qual

Xj é o já acima definido, grupos derivados de derivados de propileno amina oxima, por exemplo compostos de fõrmula VIII

1/

VIII na qual cada um dos grupos ^R26 ’^27*^28 ^e &29 ^sa° ^ⁿ^-^eP^en(-'-^en'1'^emen^^e uns dos outros hidrogénio ou alquilo em C^-C^, e

X₂ e m sao os já acima definidos; grupos derivados de diamina dimercaptideos_;por exemplo compostos de fórmula IX

IX na qual

X- é um radical divalente opcionalmente substituído,que possui um grui po capaz de reagir com o grupo N-amino do péptído, por exemplo alqui-j leno em C^-C^ ou fenileno que possui um grupo X^, e é hidrogénio oú CO₂R₃q, na qual R^_q é alquilo em C^-C^; os grupos derivados de porfirinas, por exemplo N-benzil-5-10,15,20-tetrakis-(4^-carboxifenil)porfií na, ou TPP, que possui um grupo X₂ tal como já acima se definiu.

Arilo é de preferencia fenilo, 0 aril-alquilo é de preferencia benzilo.

Os exemplos de X^ incluem radicais de fórmula -X^, ^na

X. é alcileno em C^-C^J ^ου· alcileno em C^-Gg opcionalmente ligado ao :

átomo de oxigénio ou por -NH-;

í n* * :

é 0 ou 1 e X^ é -NCS, um grupo carboxi ou um seu derivado funcio-j nal por exemplo um halogeneto ácido, anidrido ácido ou hidrazida áciI da. Entenda-se que o grupo X^ está ligado a um átomo de carbono do gru po ^0U em lugar de um átomo de hidrogénio. J j

grupo quelante pode ser ligado, tanto directa, como indirectamente, ao grupo N-amino do péptido de somatostatina. Quando está ligado indirectamente, é de preferencia ligado através de um grupo em ponte ou de um grupo distanciador, por exemplo um grupo de fórmula (<(1)

Z—R—C 0— (<1)

R^_c é um alcileno em C. -CL. , alcenileno em C -C.,, ou -CH(R')35 1 11 2 11 na qual R’ é um resíduo ligado na posição c( a um qf-aminoácido natural ou sintético, por exemplo hidrogénio, 'alquilo em C^-C^j, benzilo, benzilo opcionalmente substituído, naftil-metilo, piridil-metiloj

Z é uma estrutura funcional capaz de reagir por - covalência com agentes quelantes.

Z pode ser por exemplo um grupo que pode formar uma ligaçao de éter, de éster ou de amida com o grupo quelante. Z é de preferência amino.

Os grupos quelantes, quando compreendem um grupo carboxi, podem pos- i suir grupos -SO^H e/ou amino sob a forma livre ou de sal.

Os grupos quelantes preferidos sao os derivados de grupos poliamino- j -policarboxilicos, por exemplo os derivados de EDTA, DTPA, BOTA, TSTÂ, ou EDTA ou DTPA substituídos. Os grupos quelantes mais preferidos são

os derivados de DTPA.

Nos LIGANDOS DA INVENÇÃO o grupo quelante, quando poli-funcional, pode ser ligado, tanto a uma única molécula ou péptido de somatostatina, i

I como a mais do que uma, por exemplo a duas moléculas do péptido de so-[

I matostatina. j

Os LIGANDOS DA INVENÇÃO podem existir por exemplo sob a forma livre ou de sal. Os sais incluem sais de adiçao de ácido como por exemplo ácidos orgânicos ácidos poliméricos ou ácidos inorgânicos, por exemplo cio ridratos e acetatos, e sob a forma de sais obtidos com os grupos de á-| eidos carboxilico ou sulfénico presentes no grupo quelante, por exempljo

I sais de metais alcalinos, tais como sódio ou potássio, ou sais de amónio substituídos ou insubstituídos.

A presente invenção inclui também um processo para a preparaçao dos LIGANDOS DA INVENÇÁO, podendo estes ser produzidos por analogia com os métodos conhecidos.

Os LIGANDOS DA INVENÇÃO podem ser preparados por exemplo da forma que se segue i

a) removendo-se pelo menos um !num péptido de somatostatina, grupo protector, o qual está presente que possui um grupo quelante, ou

b) ligando-se um ao outro, por meio de uma ligaçao de amida, dois fragmentos de péptidos que contem cada um pelo menos um aminoácido, ou um aminoálcool em forma protegida ou nao protegida e um deles possui o grupo quelante, e em que a ligaçao de amida se efectua de forma a obte: -se a desejada sequencia de aminoácido, e em seguida efectua-se opcionalmente a fase a) do processo, ou

c) ligando-se um ao outro um agente quelante e o desejado péptido de j somatostatina, na forma protegida u não protegida, de maneira que o í

grupo quelante é fixado no desejado grupo N-amino do péptido, e depois realiza-se opcionalmente a operação a): ou /7 β 'f //

d) removendo-se um grupo funcional de um péptido protegido ou não pro-i tegido, que possui um grupo quelante ou transformando-se esse grupo a .outro grupo funcional, de forma que se obtenha um outro péptido protegido ou não protegido, que possua um grupo quelante e neste último ca-j so, se reàlizar a operaçao processual a); ou i

e) oxidando-se um péptido de somatostatina modificado com um grupo' quei lante, no qual os grupos mercapto dos radicais Cys estão sob a forma livre, para se produzir um análogo, em que os dois radicais Cys estão ligados por uma ponte S-S e se recuperar o LIGANDO assim obtido, sob a forma livre ou sob a forma de sal.

As reacções anteriores podem ser realizadas em analogia com os processos conhecidos, por exemplo como se descreve nos exemplos que se seguem, particularmente com os processos a) e c). Quando o grupo quelante é ligado por uma ligaçao de amida, esta pode ser realizada análogamente aos processos usados para a formação de amida. Quando desejado, nestas reacções os grupos protectores, qué sao adquados para o uso em péptidos ou para os grupos quelantcs desejados, podem ser usados para grupos funcionais que nao participam na reacçao. 0 termo grupo protector pode também incluir um polímero de resina que possui grupos funcionais.

Quando se desejar ligar o grupo quelante ao grupo N-amino terminal do péptido ou do fragmento peptídico usado como material de iniciação, e que compreende um ou mais grupos amino de cadeia lateral, estes são co venientemente protegidos com um grupo protector, por eremplo, como se usa em química dos péptidos_o nQuando se desejar ligar o grupo quelante à cadeia lateral do grupo amino de um péptido, ou fragmento péptídico, usado como material de iniciação e se o péptido compreender um grupo N-amino terminal livi'e, este ! último será de preferencia protegido com um grupo protector.

fragmento peptídico que suporta o grupo quelante e que é usado na fase b) pode ser preparado fazendo reagir o fragmento peptídico que com—j i

preende pelo menos um aminoácido ou um aminoálcool, sof a forma protegida ou não protegida com o grupo quelante. A reacção pode ser realizada em analogia à fase c)·

Os grupos quelantes de fórmulas IV ou V podem ser ligados a um péptidoi fazendo reagir*-se o agente quelante de fórmula IV* ou V*

0 0 i^-c-s-C ch₂ ) _n, -G-( TT) .-C-X

IV»

R₉-C-S-( CH₂)_n ,-C-NH—CH,

II

CH-C-X

R₃-C-S-(CH₂)_n,-C-NH

II II

0 na qual X é um grupo de activação capaz de formar uma ligação de amids. com o grupo N-amino do póptido. A reacção pode ser levada a cabo de acordo com o desvendado na Patente europeia 247·866 Al.

agente quelante usado na fase c) pode ser um já conhecido, ou ser preparado em analogia com as técnicas conhecidas. 0 composto usado é tal que permita a introdução do agente quelante desejado no péptidode somatostatina, por exemplo um ácido poliaminopolicarhoxllico como foi desvendado, um seu sal ou anidrido.

No processo anterior, quando nos aminoácidos, nos fragmentos peptldicos ou nos péptidos, usados como material de iniciação, o grupo quelaii te está ligado através de uma ponte ou de um grupo distanciador ao pép

I tido, por exemplo um radical de fórmula (cÇl) tal como já acima se definiu, tais aminoácidos, fragmentos péptidicos podem ser preparados fazendo-se reagir de forma convencional, os aminoácidos corresponden19 grupo em ponte ou um grupo distandádor com capaz de formar uma ligação em ponte ou de por exemplo um ácido ou um derivado reactio grupo em ponte ou de distanciamento, por I

Z-R^_c-COOH ou um seu derivado reactivo de i 35 ivo. Exemplos de grupos ésteres activos ou

U tes ou péptidos livres cio um composto correspondente deicbar um distanciamento, vo de ácido que compreende xemplo um ácido de fórmula ácido tal como um éster ac grupos carboxi activadores são por e κηρίο 4-nitro-fenilo, pentaclorofel nilo, pentafluorfenilo succinimidilo ou 1-hidroxi-benzotriazolilo.

í

Em alternativa o agente quelante pode reagir primeiramente com um composto capaz de formar a ligaçao em ponte ou em produz ir· um grupo distan ciador, no sentido de suportar o grupo em ponte ou de distanciamento e de reagir emtão de forma convencional com o péptido, o fragmento pep tidíco ou o aminoácido.

Os LIGANDOS DA INVENÇÃO podem ser purificados de forma convencional, por examplo por cromatografia. De preferencia os LIGANDOS DA INVENÇÃO compreendem menos de 5% ^em peso de péptidos isentos de agentes quelantes.

Os LIGANDOS DA INVENÇÃO sob a forma livre ou de sais farmaceuticamente aceitáveis sao compostos valiosos. De acordo com outras realizações, c LIGANDOS DA INVENÇÃO podem ser complexados com um elemento detectável.

Consequentemente a presente invenção desenvolve também os LIGANDOS DA INVENÇÃO tal como já acima se definiu, os quais sao complexados com uir elemento detectável ( a partir daqui referidos como QUELATOS DA INVENÇÃO) , sob a forma livre ou de um sal, a sua preparação e o seu uso para o tratamento terapêutico e diagnósticos in vivo.

Por ' ©Lemento detectável entende-se qualquer elemento, de preferência [ um ião metálico que exiba uma propriedade detectável em técnicas de dl

I agnóstico ou terapêuticas in vivo, por exemplo um ião metálico que emi ta uma radiaçao detectável, ou um ião metálico que seja capaz de influ enciar as propriedades <b diminuição do RMN.

Iões metálicos detectáveis adequados incluem por exemplo elementos pesados ou iões terra raras, por exemplo os usados no TAC (Tumografia Axial Computadorizada), ioes paramagnéticos, por exemplo Gd^J , Mn e Cr2+, iões metálicos fluorescentes, por exemplo Eu^, e elementos radionucleares, por exemplo radionucleos que emitem radiações gama,beta i ou alfa e elementos radio-isotopos que emitem positrões, por exemplo ⁶⁸Ga. !

i

Os elementos radio-isótopos emissores de radiações gama incluem aque-j les que sao uteis em técnicas de diagnóstico. Os radio-isótopos eraisso res de radiações gama possuem vantajosamente um tempo médio de vida ; compreendida no intervalo de 1 hora a 40 dias, de preferencia entre 5 ! horas e 4 dias, mais preferencialmente entre 12 horas e 3 dias. Os j exemplos sao os radio-isotopos derivados do gálio, fndio, técnecio, I itérbio, rénio, e tálio por exemplo ^^Ga, ^^^mTc, ló9Yb e '^Re,

De preferenciaos radio-isótopos emissores de radiações gama são selec-¹· cionados em função do metabolismo dos LIGANDOS DA INVENÇÃO ou do péptido de somatostatina usado. Mais preferivelmente, o LIGANDO DA INVENÇÃO é quelatado com um radio-isótopo-gama que possui um tempo de vida médio mais longo, do que o tempo de vida médio do péptido de somatostatina sobre 0 tumor.

Outros radio-isótopos adequados incluem aqueles que emitem positroes, por exemplo os acima mencionados_o

Os radio-isotopos emissores de radiações beta adequados incluem aqueles que são uteis em aplicações terapêuticas, por exemplo ^θΥ, ^”^Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁶?Er, ¹²¹Sn, ^Te, ¹⁴²Pr. Os radio-isótopos beta possuem vantajosamente um tempo de vida médio de cerca de 2,3 horas a 14,3 dias, de preferência entre 2,3 ® I 100 horas. De preferência os radio-isótopos beta são escolhidos no I sentido de possuírem um maior período de vida médio do que a vida mé-! dia do péptido de somatostatina no tumor.

Os radio-isotópos alfa adequados são aqueles que sao usados em trata-:

211 212 mentos tenapeuticos, por exemplo At, Bi.

6s QUELATOS DA INVENÇÃO podem ser preparados fazendo reagir o LIGANDO com um elemento detectável correspondente, originando o composto, por exemplo um sal metálico, de preferência um sal solúvel em água. A reacçao pode ser levadc. a cabo por analogia às técnicas conhecidas, por exemplo como desvendado por Perrin em Organic, Chemical Data Sereis, 22. NY Pergamon Press (1982); por Krejcarit and Tucker,em Biophys, Biochem, Res. Com. 77t 5θ1 (1977) e por Wagner e Welch, em J. Nucl. Med. 20:428 (1979).

De preferencia a complecaç&o do ligando é realizada a um pH ao qual o

LIGANDO DA INVENÇÃO é fisiologicamente estável.

Sn alternativa, o elemento detectável pode também ser desenvolvido em

I *·* ^! soçao como um complexo com um agente quelante intermediário, por exemípio, um agente quelante que forma um complexo quelato que torna o elemento solúvel no pH fisiológico do LIGANDO, mas é menos estável em ter mos termodinâmicos do que o QUELATO. Exemplo deste agente quelante intermediário é o ácido 4,5“úi-hidroxi-l,3-benzeno-di-sulfónico (Tiron).

Em tal processo,o elemento detectável comuta o ligando.

Os QUELATOS DA INVENÇÃO podem também ser produzidos ligando um ao outro o agente quelante complexado com o elemento detectável, e um pepti do de somatostatina sob a forma protegida ou não protegida e,se desejado, eliminando pelo menos um grupo protector que se encontra presente. A mesma reacçao pode ser realizada com um iao metálico detectável e então no péptido complexado resultante o ião metálico pode ser substituído pelo elemento detectável desejado.

Os QUELATOS DA INVENÇÃO podem também ser produzidos ligando conjuntaiimente um agente quelante complexado com um elemento detectável, e um jfragmentodo péptido de somatostatina que compreende pelo menos um aminoácido sob a forma protegida ou não protegida, e continuando então a síntese peptidica passo a passo, até que se obtenha a sequencia final do péptido e, se desejado, eliminando-se pelo menos um grupo protector que está presente. Em vez do elemento detectável,o agente complexante pode ser complexado com. um metal não detectável e este metal pode ser

ι ·. .· '•cS

Ú resultante dc então substituído por um elemento detectável no complexo péptido de somatostatina.

i í

'Quando o grupo quelante é ligado através de um grupo ponte ou grupo distanciador ao péptido de somatostatina,por exemplo,através de um radical de fórmula (c(l), tal como já acima se definiu, tanto o péptido ;de somatostatina, como o fragmento peptídico ou o agente ligante podem [comportar o referido grupo em ponte ou o grupo distanciador.

As reacções acima mencionadas podem ser realizadas de forma análoga aos métodos conhecidos. A eficácia da marcação, dependendo do grupo quelante presente, pode aproximar-se dos 100^, de forma que a purifijcação não é necessária. Os rádio-isótopos, tal como o Tcnécio-99m, podem ser usados na sua forma oxidada, por exemplo, Tc—99® pertecnetato, o qual pode ser complexado sob condiçoes de redução.

As reacções acima mencionadas são convenientemente levadas a cabo sob condiçoes que evitem a contaminação de vestígios de metal_o De preferência usam-se água denionizada destilada, reagentes ultrapuros, radioactividade gradual de quelaçao, etc. para redução dos efeitos de metais vestigiais. Os QUELATOS DA INVENÇÃO podem existir sob a forma livre ou de sais. Os sais incluem os sais de adiçao de ácido, como por exemplo ácidos orgânicos, ácidos poliméricos ou ácidos inorgânicos, por exemplo, cloridratos e acetatos e formas de sais que se podem obter com jos grupos de ácidos carboxílicos presentes na molécula, que nao partijcipam na formaçao do quelante, por exemplo sais de metais alcalinos [como potásio ou sódio, ou sais de amónio substituídos ou não substituiI dos.

;0s quelatos da invenção e os sais sais farmaceuticamente aceitáveis exijbem actividade farmacêutica e sao, consequentemente, úteis tanto como ^agentes de formaçao de imagem, por exemplo, visualizaçao de tumores positivos de receptor de somatostatina e metastases, quando complexados com um iao metálico emissor de radiações gama paramagnético ou um rádio-isotopo emissor· de positroes ou um rádio-isótopo farmacêutico para o tratamento in vivo de tumores positivos de receptor de somatos23

Τ' Λ?

tatina, quando complexados com radio-isótopos alfa ou beta, tal como indicaram os ensaios padrao.

ESn particular, os QUELATOS DA INVENÇÃO possuem afinidade para os receptores de somatostatina, exepressa ou sobre-expressa pelos tumores e metastases, como indicaram os ensaios-padrao de ligação in vitro.

ί

Um tumor positivo de receptor de somatostatina originado pelo tracto gastro intestinal humano é removido de um paciente e imediatamente colocado em gelo e, num tempo máximo de 30 minutos é congelado a -80°C. Para posteriormente se autoradiografar,este material congelado é cortado num criostato (Leitz 1720 ) em secções de 10 jxn, montado em slides microscópicos préviamente limpos e armazenados a -20°C durante pelo _ j menos 3 dias para melhorar a adesao do tecido ao slide. As secções são; pré-incubadas num tampao Tris-HCl (5θ mM, pH 7,4) que compreende CaCl I (2 mM) e KC1 (5 mK) , durante 10 minutos, à temperatura ambiente e são ' então lavadas duas vezes durante 2 minutos, no mesmo tampão, sem adição de sais adicionais. As secções são então incubadas com um QUELATO j DA INVENÇÃO durante duas horas, á temperatura ambiente, num tampão | Tris-HCl ( 170 mM, pH 7,4) que compreendia albumina de soro de buvino ' (10 g/l) , bacitracina (40 mg/l) e MgClg (. 5mM) para inibição das proteasses endogénas. Nao se determiou nenhuma ligação especifica pela adi- ~ i çao do péptido dc somatostatina não-marcado, não-modifiçado,a uma con-j centraçao de 1 . As secções incubadas são lavadas duas vezes durante minutos, num tampão de incubação frio que continha 0,25 g/l BSA. Após uma breve infusão em água destilada para remoção de sais, as secções são rapidamente secas e expostas a películas /^H/-LKB. Após um tempo de exposição de uma semana em cassetes de raios X, observou-se que os QUELATOS DA INVENÇÃO, por exemplo um QUELATO radio-isótopo, originou muito bons resultados na marcaçao dos tecidos tumorais, sem que ocorre se marcaçao dos tecidos saudáveis circundantes quando adicionado a uma corrente compreendida no intervalo de 10 a 10 M.

A afinidade dos QUELATOS DA INVENÇÃO para os receptores de somatostatina pode também ser revelada por testes in vivo.

·, Ratos possuidores de tumores positivos de receptores de somatostotina

I i pancreática de exocrina transplantada sao tratados com uma injecção I intravenosa de um QUELATO DA INVENÇÃO. 0 composto foi injectado na : veia do pénis. Imediatamente após a administração, os animais são po! sicionados num colimador de camara-gama e a distribuição da radioactividade é moniturizada a vários intervalos de tempo. !

A biodistribuiçao da radioactividade pode também ser determinada através do sacrifício em-série de um número de ratos assim tratados e determinado a radioactividade no orgão.

Após administrar o QUELATO DA, INVENÇÃO, por exemplo um QUELATO radio-isótopo, por exemplo emissor de radiações gama, a uma dosagem compreendida no intervalo entre 1 a 5 /*g/kg do LIGANDO com uma quantidade compreendida entre 0,1 a 2 mCi do radio-isótopo,o tumor torna-se detectável em conjunto com orgãos onde a excreção se realiza essencialmente.

Consequentemente, numa série de realizações específi ca.3 ou alternativas, a presente invenção desenvolve também:

1. Um processo para a detecçao in vivo de tumores positivos ou metastases de receptor de somatostatina num indivíduo, que compreende

a) a administraçao de um QUELATO DA INVENÇÃO ao referido indivíduo, e

b) o registo da localizaçao dos receptores marcados pelo referido QUELADO.

Os QUELATOS da invenção para uso no processo de detecçao in vivo da invenção são os QUELATOS complexados com rádio-isótopos emissores de radiações gama, positrões ou ioes metálicos paramagnéticos, por exemplo, como os já mencionados acima.

Os QUELATOS DA INVENÇÃO para uso como agentes proporcionadores de imagem no processo (1) podem ser administrados por via parentérica, de ;

preferida por via intravenosa,por exemplo sob a forma de soluçoes injectáveis ou suspensões,de preferencia numa dose única.. A dosagem apropriada variará evidentemente em função,por exemplo, do LIGANDO e do Upo do elemento detectável usado, por exemplo, do radio-isótopo. A dose adequada a ser injectada situa-se no intervalo que proporciona imagem Ipor meio de técnicas conhecidas de foto-pesquisa. Quando um QUELATO DA INVENÇÃO radio-marcado é usado, pode ser vantajosamente administrado numa dose que possui radioactividade compreendida no intervalo de 0,1 a 50 mCi, de preferencia compreendida no intervalo entre 0,1 a 30 mCi, e preferencialmente entre 0,1 a 20 mCi. Um intervalo de dosagem indics.da pode ser de 1 a 200 ^ig do LIGANDO marcado com 0,1 a 50 mCi, preferencialmente entre 0,1 a 30 mCi, por exemplo 3 a- 15 mCi, radio-isétopo emissor de radiações- gama, dependendo do radio-isótopo-gama usado. Por exemplo com In, é preferido o uso de uma radioactividade no intervalo inferior, ao passo que com Tc se prefere o uso de radioactividade no intervalo superior.

enriquecimento das zonas tumorais com os QUELATOS pode ser seguido pelas técnicas de imagem correspondentes, por exemplo usando instrumentação de imagem nuclear média, por exemplo um écran, uma camara gama, uma camara rotatória gama, cada um dos quais é assistido de preferencfe por computador; écran PET (Tumografia de emissão de protoes); equipamento HRI ou equipamento TAC.

Os QUELATOS DA INVENÇÃO, por exemplo a maior parte dos QUELATOS emissores-gama são substancialmente eliminados através dos rins e nao se acumulam significativamente no figado.

2. Um processo para tratamento in vivo de tetastases e tumores positivos de receptor de somatostatina num individuo em estado de carência de tal tratamento,que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um QUELATO DA INVENÇÃO.

Os QUELATOS DA INVENÇÃO, para uso no processo de tratamento in vivo da invenção, sao quelatos complexados com radio-isótpos alfa ou beta como já acima se definiu.

/] f »-a

2b oresenxe wJ As dosagens usadas na prática do processo terapêutico da vençao irão evidentemente, variar em função por exemplo da condição particular a ser tratada,por exemplo do volume do tumor, do QUSLATO particular usado,por exemplo do tempo médio de vida do QUSLATO no tu— imor, e da terapia desejada. Sta geral, a dose é calculada com base na distribuição da radioactividade para cada orgão e no aumento ao sinal j observado. Por exemplo, o QUSLATO pode ser administrado num intervalo J de dosagem diária, que possui uma radioactividade de cerca de 0,1 a 3 mCi/Kg de peso corporal,por exemplo de 1 a 3 mCi, de preferencia entre 1 a 1,5 mCi/kg de peso corporal. Um intervalo de dosagem diária indicado é o compreendido entre 1 a 200 do LIGANDO marcado com 0,1 a 3 mCi/kg de peso corporal,por exemplo, de 0,1 a 1,5 mCi/Kg de peso corporal do radio-isótopo alfa ou beta, convenientemente administrado em dojses divididas até 4 vezes por dia. !

I

Os QUBLATOS DA INVENÇÃO emissores de radiações alfa ou beta podem ser j administrados por qualquer via convencional, em particular por via parentérica, por exemplo sob a forma de soluçoes injectáveis ou suspen- i soes. Podem também ser administrados por infusão, por exemplo uma infur- t sao de 30 a 60 minutos. Dependendo da localizaçao do tumor, podem ser administrados o mais próximo possivel da zona do tumor, por exemplo por meio de catéteres. 0 modo de administração escolhido pode depender (I da taxa de dissociação do QUELATO usado e da taxa de excreção.

Os QUSLATOS DA INVENÇÃO podem ser administrados sob a forma livre ou numa forma farmaceuticamente aceitável. Tais ss.is podem ser preparados de forma convencional e exibem o mesmo nível de actividade que os compostos livres. ' | Os QUELATOS DA INVENÇÃO para o uso no processo da presente invenção i ~ í podem ser de preferência preparados pouco antes da administração ao indivíduo, isto e, radio-marcação com o ião metálico detectável desejada, particularmente o radio-isótopo alfa beta ou gama, pode ser realizada pouco antes da administraçao.

Os QUELATOS DA INVENÇÃO podem ser adquados para proporcionarem imagens i

/) ou tratarem tumores, tais como pituitários, gastro-entero-pancreáticos, do sistema nervoso central, da mama, prostáticos, ovários ou colónicos, cancro do pulmão de pequenas células, paragangliomas, neuroblastomas j feocromocitomas carcinomas medulares da tiréide, mielcmas, etc., e suas metastases. !

De acordo com outras realizações da invenção, os QUELATOS DA INVENÇÃO, emissores de radiações gama, podem também ser usados como agentes proi porcionadores de imagens para avaliaçao da função renal.

Usaram-se grupos de 5 ratos. Cada rato foi injectado por via intravenoI sa, na veia da cauda, com 0,1 ml compreendendo 1 mCi de 1 QUELATO DA ! INVENÇÃO. Os ratos são colocados em gaiolas metabólicas para recolha da urina. Após 10 ou 120 minutos da injecção as ureteras sao ligadas e os ratos anestesiados com clorofórmio. A imagem do sistema uropoietico é realizada usando-se atécnica de imagem usual. Neste teste, os QUELATOS DA INVENÇÃO, emissores de radiações gama, melhoram a imagem da exf-j creçao renal quando administrados a uma dosagem compreendida no intervalo de 0,1 a 30 mCi.

Por conseguinte, a presente invenção desenvolve ainda um processo para a avaliaçao in vivo da função renal de um indivíduo, que compreende a aàministraçao ao referido indivíduo de uma quantidade efectiva de um QUELATO emissor de radiações gama e o registo da função renal.

De acordo com outros aspecto3 da invenção desenvolveu-se:

i. Uma composição farmacêutica que compreende um LIGANDO DA INVENÇÃO, sob a forma livre ou de um sal farmaceuticamente aceitavel, conjuntamente com uma

I ou mais substâncias veiculares ou diluentes farma-i ceuticarnente aceitáveisj ' ii. Uma composição farmacêutica que compreende um QUE-;

I

LATO de acordo com a invenção, sob a forma livre ou de sal farmaceuticamente aceitável, em conjunto conj

2tí / · / í

um ou mais diluentes ou substancias veiculares far- ; maceutiosmente aceitáveis.

Tais composiçoes podem ser produzidas de forma convencional.

Uma composição de acordo com a invenção pode também ser apresentada numa embalagem separada, com instruções para misturar o ligando com o ião metálico e para administração do QUELANTE resultante. Pode também ser apresentada sob a forma de uma embalagem dupla, isto é, uma única embalagem que contém doses unitárias separadas do LIGANDO e o ião metálico detectável, com instruções para os misturar e para a administra Çao do QUELATO.

Podem estar presentes diluentes ou substâncias veiculares sob a forma de dosagens unitárias.

Nos exemplos que se seguem, todas as temperaturas estão apresentadas em °C e os valores de /<7^2< ^D - nao foram corrigidos. Sao usadas as j seguintes abreviaturas:

Boc terc,-butilcabonilo

TFA ácido trifluoracético

DTPA ácido dietilenotriamina-penta-acético

EXEMPLO 1: DTPA-DPhe-Cys-Phe-Dtrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

1,1 g de Dphe-Cys-Phe-Dtrp-Lys( -Boc )-Thr-Cys-Thr-ol na base livre (1 mM) foram dissolvidos em 5 1 de dioxaúo/H^O 1:1 (v/v) e reagiram com 5 g de NahCO^. Adicionaram-se lentamente 520 mg de DTPA di-anidri·· do, com agitaçao. A mistura reacçional foi agitada durante mais 30 mii nutos e congelada a seco. 0 resíduo foi dissolvido em 250 ml de água j e o pH ajustado para 2,5 HC1 concentrado. 0 produto precipitado foi removido por filtração, lavado e seco sobre pentóxido de fósforq. Apésí cromatografia numa coluna de cílica gel, são isolados os seguintes

I-——| I produtos: 230 mg de DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Tbr-Cys-Thr-ol e 5®6rrg

Ζ)

Λ / do dlmero correspondente DTPA-(DPhe-Cys-phe-Dtrp-LysÇ-Boc)-thr-Cys-ol)2.

i-—-Misturara-se 3 ml de TFA com 200 mg de DTPA-DPhe-Cys-Phe-Dtrp-Lys-(-Boc) -Thr-C^s-Thr-ol. Depois de 5 minutos S. temperatura ambiente, a mistura) foi precipitada com éter di-isopropílico, removida por filtração e seca. 0 resíduo foi des-salinado sobre Duolite e liofilizado, para se obter 150 mg do composto título:

/c(J²⁰D = 26,6°( c = 1,95% AcOH) !

material de iniciação pode ser produzido da seguinte maneira: !

a) H-Dphe-C^s-Phe-Dtr£-Ly£-£.b£cj_-thr-çj£-thr-£l

Adicionam-se gota a gota lentaraente, % 25 g de di-terc-butil-pirocarbonato, dissolvidos em 30 ml de DMF, à temperatura ambiente,a uma solu~ 1-—-¹—>

çao de 10 g de acetato de H-Dphe-Cys-Fhe-Dtrp-Lya-Thr-Qys^fchr-olem 100 ml de DMF. Duas horas depois a temperatura ambiente, 0 dissolvente é removido sob vácuo, lavado com éter di-isopropílico e seco. 0 produto bruto é purificado por cromatografi»' sobre sílica gel ( eluente: CH^Cl₂/MeOH 9:1) e é então isolado sob a forma de um ρδ branco amorfo.

A7²⁰ - 29,8°C (c ₌ 1,28 em DMF).

D

EXEMPLO 2: DTPA-( DPhe-C.ys-Phe-DTrp-Lys-Thr-gys-Thr-cl)

A fracçao que contém o produto intermediário DTPA-ÇDPhe-Cys-Phe-Dtrp-1

-LysÇ-Boc-)-Thr-Cys-Thr-cl)£, obtida no Exemplo 1, foi tratada como j descrito acima, para se obter a forma monoméríca correspondente, os grupos protectores Boc foram removidos, para se abter 0 composto título:

= -24,5°C (c - 0,55 95 °]o AcOH). j

EXEMPLO 3? H₂M CH₂)-5-CO-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

a. 0,56 g de H-BPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-thr-Cys-Thr-ol, 0,5 mmol de _ 1 de ácido Fmoc-c.-amir.ocapoíco - e 115 mg de hidroxi-benzotriazol foram : dissolvidos em 10 ml de DMF e arrefecidas a -30°G. A esta solução adi-j cionou-se uma solução de 115 ml de diclohexilcarbodiimida em 5 ml de j DMF ( arrefeci ia a -10°C).

Após o tempo reaccional de ,24 horas, durante o qual se permitiu que i j

a temperatura atingisse a temperatura ambiente, a ôiciclohexilureia ! resultante foi removida por filtração e o filtrado foi diluído com á- j gua para 10 x o seu volume. 0 produto reaccional precipitado foi removido por filtração, lavado e seco sobre pentóxido do fósforo. 0 produto bruto foi usado sem pusterior purificação na faBe seguinte.

b. Ebi o c-clivagem

0, 5 g do produto bruto,obtido na reacção de ligação (a) foram tratados durante 10 minutos à temperatura ambiente com 5 ml de DM^/pipéridina 4:1 v/v ( solução limpida) e subsequentemente misturados com 100 ml de di-isopropiléter. 0 produto reaccional, que então se precipitou, foi removido por filtração, lavado e seco.

Este produto bruto foi usado sem posterior purificação na fase seguinte. )

c. BOC-clivagem !

300 g do produto bruto obtido em (l.b) foram tratados durante 30 minu-j i

tos à temperatura ambiente, com 5 ml de THF a 100% ( completamente dissolvido) e posteriormente misturados com 50 ml de di-isopropil-éter. Após adiçao de 2 ml de HCl/di-etiléter, o depósito resultante foi renovido por filtração, lavado e seco a alto vácuo.

produto final foi purificado por cromatografia em sílica gel (CHC13/ /ΜβΟΗ/ϊΚΟ/ΑοΟΗ 7:3:0,5:0,5), com subsequente des-salinaçao sobre Duoli31

te (gradiente: ^O/AcOH 95^5)---H^O/dioxano/AcOH 45*50*5) .

O composto título foi obtido sob a forma de um acetato (liofilizado branco).

Γ rt 7²θ ^L = -32°C (c = O,; 555Í AcOH) .

composto resultante pode ser usado para a reacçao com DTPA de acordo com a técnica dos Exemplos 1 e 2.

EXEMPLO 4:

LIGANDO que se segue pode ser preparado seguindo-se as técnicas des vendadas nos Exemplos 1 e 3:

i π

DTPA-^Ala-DPhe-Cys-Pbe-DTrp-Lys-Thr-Gys-Thr-ol.

_y20

L - - 14,8° (c ₌ 0.5 95» AcOH).

I — - j |

EXEMPLO 5s In marcado DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Tbr-ol í mg de DTPA-DPhe-Cys-Pbe -DTrp-Lys-1hr-Cy‘s-Thr-ol é dissolvido em 5 ml de ácido acético 0,01 M_o A solução resultante é filtrada através de um filtDO de 0,22 p. Millex-GV, dividida em porções de 0,1 ml e ar- ; mazenada a -20°C. 0 ^^^InC13 (Amersham, 1 mCi/100 jil) é pré-diluldo num volume igual de acetato de sódio 0,5 M e a marcação é realizada misturando o LIGANDO com a solução de InCle homogeneisando suave- , j

mente â temperatura ambiente₀ í

Adicionou-se então um tampão HSPES, com pH 7,4, para tornar a solução 10^_6M.

,ί

Λ

EXEMPLO 6: marcado DTPA-Dphe-Gys—Phe-DTrp-Lys-Thr-G.ys-Thr-ol ο 9¾ é obtido a partir do gerador de rádio-isótopos ^θδΓ-^θΥ. !

!

A construção do gerador, a sua eluição e a conversão do /^°T^EDTA no complexo acetato foi realizada de acordo com o processo desvendado poi

M. Chinol e D. J. Hnatowich, em J. Nucl. Med. 28, 1465-1470 (1987). 1 mg de ácido acético 0,01 fí, permitiu-se que aquecesse até atingir a 90 temperatura ambiente e adicionou-se 1,0 mCi de Y em 50 pl de acetato 0,5 M estéril. A mistura foi então mantida em repouso durante um iri tervalo de tempo de 30 minutos a 1 hora, para maximizar a quelação.

Um dos grupos dos LIGANDOS DA INVEKÇSO sao os péptidos de somatostatina, por exemplo os análogos da somatostatina, os quais possuem pelo menos uma das unidades dos aminoácidos do grupo quelante que está ligado ao referido grupo amino por uma ligação de amida, sob a forma livre ou de sal.

Um dos grupos dos QUELATOS DA INVENÇÃO são os LIGAND03 já acima mencionados, complexados com um elemento detectável, por exemplo um ião metálico, sob a forma livre ou sob a forma de um sal.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1*- Processo para a preparação de um péptido da somastatina, tendo pelo menos um grupo quelante, para um elemente detectável, estando o re-jferido grupo ligado a um grupo amino do mencionado péptido, quer directamente, quer indirectamente e não possuindo o citado grupo amino nenhuma afinidade de ligação significativa para os receptores da soma- ;

í tostatina ou com a forma de sal, caracterizado pelo facto de compreen-íder as operações que consistem

a) se eliminar pelo menos um grupo de protecçao que está presente num péptido da somastotatina que possui um grupo quelante ou !

h) se ligarem um ao outro, por meio de uma ligação de amida, dois fragmentos de péptido que contém, cada um, pelo menos um aminoácido ou um aminoálcool, em forma protegida e um deles possui o grupo quelan-te e em que a ligaçao de amida se efectua de forma a ohter-se a desejada sequência de aminoácido, e em seguida se efectuar opcionalmente a operação a) do processo ou c) se ligarem um ao outro um agente quelante e o desejado péptido de somatostatina, na forma protegida ou não protegida de maneira que o grupo quelante é fixado no desejado grupo N-amino do péptido, e depois realizar-se opcionalmente a operação a)j ou

d) se eliminar um grupo funcional de um péptido protegido ou não protegido, que possui um grupo quelante ou se transformar esse grupo noutro grupo funcional, de forma que se ohtenha um outro péptido protegi γίο ou não protegido, que possui um grupo quelante e, neste último ca-j so, se realizar a operação processual a); ou

e) se oxidar um péptido de somatostatina modificado com um grupo que-i lante no qual os grupos mercapto dos radicais Cys estão soh forma livre, para se produzir um análogo em que os dois radicais Cys estão ligados por uma ponte S-S, e se recuperar o composto assim obtido sob a forma livre ou sob a forma de sal.

28- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparaçao de um péptido de somatostatina, no qual o grupo quelante é ligado ao péptido: indirectamente por um grupo distanciador, preferivelmente um radical i de fórmula na qual · representa alquileno em alcenileno em ^“^ll ^ou j na qual R’ é o resíduo ligado na posição alfa a um alfa-aminoácido natural ou sintético;

Z é um grupo funcional capaz de reagir covalentemente com um grupo quelante, caracterizado pelo facto de compreender as operações seguintess| fazer-se reagir um péptido ou um fragmento de péptido, isento de um grupo em ponte ou de um grupo distanciador, com um respectivo composto formadcTde um grupo em ponte ou de um grupo distanciador; se ligarem um ao outro um agente quelante e o referido péptido modificado ou um fragmento de péptido, sob a forma protegida ou não protegida, de maneira que o grupo quelante seja fixado no grupo N-amino desejado e, se for necessário, se eliminar pelo menos um grupo de protecção, que está presente no mencionado péptido<>
3»_ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de compreender a reacçao do agente de quelaçao com um agente forma-idor de um grupo em ponte ou de um grupo distanciador, antes de se ligarem um ao outro o agente quelante modificado e o desejado péptido dé somatostatina sob a forma protegida ou não protegida.
4^Ô- Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de o péptido de somatostatina ser um composto j de fórmula I

Λ r\’

A' C^-S^ Y₂-S-CH₂ .N-C H-C O-B-C -D-S-íIH-G H-G na qual

A representa alquilo em C^-C^₂, feailalquilo em θ7~^ΐθ ^{033 13111} S^ruP° <ie fórmula RCO-, na qual

i) Ré hidrogénio, alquilo em , fenilo ou fenilalquilo em Ογ-Ο^θ, ou ii) RCO- é

a) um resíduo de L-fenilalanina ou de D-fenilalanina opcionalmente substituído no anel por F, Cl, Br, N0₂, NH₂, OH, alquilo em C^-C^ e/ou alcoxi em C^-C^j

h) o residuo de um alfa—aminoácido natural ou sintético, diferente do acima citado em a), ou de um correspondente D—aminoácido, ou c) um residuo de dipéptido, no qual os resíduos individuais do aminoácido são iguais au diferentes e sao escolhidos entre os já definidos acima em ) e/ou em h)j opcionalmente, o grupo alfa-amino dos resíduos de aminoácidos a) e h) e o grupo amino N-terminal dos resíduos de dipéptido c) serem monoalqu: lados ou dialquilados por alquilo em C^-C^₂ ou substituídos por alcanoi lo em C^-Cgj

A.’ é hidrogénio, alquilo em C^-C^₂ °u fenilalquilo em Y^ e Y₂ representam em conjunto uma ligaçao directa ou cada um dos símbolos Y^ ou Y₂ é independentemente hidrogénio ou um radical das fórmulas (l)