PT97409B - Processo para a preparacao de mutantes beta-lactama-acilases por expressao genetica - Google Patents

Description

A presente invenção refere.....ss a mutações ds genes que codificam acilases tendo como resultado altera.....

ções ds especificidade de enzimas de acilase. Algumas destas enzimas mutantes possuem propriedades catalíticas que as tornas particularmente apropriadas para a desaci1ação/aci1 ação ds derivadas ds beta-1actama. Entre estes, encontra-se um grupo preferido que é concebido para a transfarmação numa operação da Cefalosporina C e derivados em ácido 7-amino.....cefalasparânico e seus derivados.

□3 antibióticas básicos do tipo ds bsta.....lactama sao principalmente obtidos por fermentação. Os fungos do género penicillium e Cephalosporium (Acremonium) são usados para a produção de matérias-primas para antibióticos de bsta.....lactama tais como penicilina S, penicilina V e cefa.....

1asparina C. Estes produtos ds fermentação, também designados por PenQ, PenV e CefC, respectivamente, são os materiais da partida para quase todas as penicilinas a cefalosporinas corrsntsmente comercializadas. As cadeias laterais destes compostos, fenil.....acetilo, fenoxi-acstilo e amino.....adipilo, ras.....

pectivamente, são eliminadas por clivagem de uma ligação ds

amida (desacilação), obtendo-se cama resultada o ácida 6-aminopeniciISnico (&-APA>, na casa das duas moléculas ds pe.....

nicilina e o ácida 7-amino-cefalasparânica (7-ACA), ria casa da cefalasporina. As enzimas particulares qus realizam estas transformaÇões são designadas na presente memória descritiva como adisses su amidases. Estas denominações» tal cama são utilizadas na presente memória dascriti va , tem a mesma significação.

Também se menciona a transf armação ds Ca~ falsaporina G em ácido 7.....amino-3-desacetoxi.....cefalosporlnico

C7-ADCA). Na entanto, a Cafalasparina G (CefS) não é um produto ds fermentação, mas é usualmente produzida quimicamente a partir da penicilina S. As estruturas básicas das várias penicilinas e cefalosporinas acima mencionadas estão representadas ns Figura i.

A manipulação sintética apra produzir as várias penicilinas s cefalosporinas escolhidas começa basi.....

camente a partir ds 6-APA» 7-ACA e 7.....ADCA, respectivamente.

A transfarmação de penicilina G s ds penicilina V s-b 6.....APA pode realizar-se tanto por via química como por via enzimática. A maneira de proceder clássica é a clivagem química mas, hoje em dia» prefersm-se os processos enzimátícas (para revisão, veja-se Lowe (D). Os custas e as considerações ds ordem ambiental são argumentos a favor do processo por via enzimática.

A clivagem da oadoia lateral ds CafC com obtenção ds 7-ACA realiza- -ss geralmente por via química, ds caordo com o chamado prooesso ds haloqsnoto de imina. No cn tanto» este processo tem sérios inconvenientes, visto qus é complexo, necessitando, inter alia., a utilização ds andares múltiplos» temperaturas extremamente baixas e reagentes dis.....

pendiosos.

A transformação ds produtos intermediários ds beta-lactama nos antibióticas semi-sintéticos pre.....

tendidos pode realizar-se quimicamente s enzimaticamsnts, sendo a via enzimática basicamente preferida ss ss disposer de uma enzima apropriada. As psniciiina-acilases são essas enzimas num certo número de casas. A transformação enzimática tem a vantagem ds que qualquer reacção enzimática é rever.....

síveí, ss ss aplicarem as condições corrsctas ÍB.J. Abbott Í2>).

Na literatura, propuseram—se vários tipos ds microorganismos caso estirpes produtoras ds asilasse úteis para a desacilação ds derivados de beta-lactama obtidas por fermentação e/ou sei 1 ação ds £—APA e ds 7.....ACA com obtenção dos antibióticas ds beta-lactama semi-sintáticos pretendidos. São exemplos desses microorganismos que produzem acilase certas estirpes das espécies gs£bsri£kiã._____£Sll» Klyvyera

ÇitroBhila., Pí^teus^j^sttgeri , Pseudomonas sp. , Al sal.l genes fagÇêÃís, B5^1Àys_j^hasricus e Arthrokâ£Èer_viscosus.

Ds acorda cam a literatura, podem tomar-ss em consideração diversos tipos ds acilases com base na sus estrutura molecular e na especificidade do substrato CE.J. Vandamme (3)).

As acilases ds Tipo-I são especificas da

Penicilina V. Estas enzimas são constituídas por quatro sub.....

unidades idênticas, tendo cada uma delas um peso molecular ds 35 fcDa. Uma sequência de nucleótidos completa do gene cionado ds Saci 11us sphaeri cus foi já indicada CA. Gilson C4)).

As acilases ds Tipo.....11 possuem todas uma estrutura molecular comums estas enzimas são hátero.....dímsros constituídas por uma pequena subunidade (alfa; 23 a 25 kDa) s uma grande subunidade Cbetaj &3 a 65 kDa>. Em relação ã sspecificidads do substrato, as acilases de Tipo.....II podem ainda dividir-se em dois grupos:

Acilases de Τχρο-ΙΪΑ são muito específicas para a Penicilina G. Em geral, nao são especificas de agrupamento adjacente ao átomo ds azoto ds grupo amida (este pode ssr um grupo cefémico, um grupo penémico, um aminoáoido, etc) mas a especificidade do substrato reside no agrupamento acilo do substrato. Este agrupamento acilo pode ser muito hidrofóbico s é preferivelmente benzilo ou alquilo (curto). Sao exemplos de substratos que não são hidrolisados pelas acilases ds Tipo-IIA aqueles que boxílicos como agrupamento acilos adipilo s também amino.....adipilo, a cadeia lateral de CefC. São exemplos de acilasss do Tipo-ΣΙΑ as enzimas provenientes ds

Escherichia coli, Kluyvera____citrophila, proteus rettgeri e

Alçalj^enes_faeçaUs.

possuem ácidos dicarsuccinxlo, glutarilo,

As acilases de Tipo-IIB foram indicadas como sendo capazes ds hxdroixsar cefalosporinas (incluindo o derivado de desacetoxi) com succinilo, glutarilo e adipilo como agrupamento acila e mesmo na caso CefC em grau muito limitado CY.Shibuya (5>; A. Hatsuda Câ)>. Até agora, estas acilasss sá foram encontradas em especies ds pseudomonas s em certas estirpes de Baci..l.lus____jSêSãtâíLlW. a oílShESbaclsr.

élsçosus.

A literatura rsfere-ss principalmente a acilases de penicilina. 0 potencial sintético das acilases ds penicilina, no entanto, é limitado devido à especificidade da enzima. Em anos mais recentes, aparecem também publicações sobro as acilasss de Cefaloeporina C mas a actividade das enzimas referidas é rslativamente pequena. Hoje em dia, não está á disposição qualquer processo enzimático comercial para a transformação ds Cefalosporina C em 7.....ACA, não obstante os intensos esforços realizados para encontrar uma encima apropriada (veja-se R.B. Walton (7>).

Por consequência, existe um interesse substancial em desenvolver enzimas ds .-acilase que sejam altamente eficientes nas reacções ds desacilaçãc/acilação para produsir os produtos químicos pretendidos. Tem interesse particular a dssacilaÇão enzimática ds beta-lactamas s especificamente de PenG, PenV e CsfG e dos seus derivados» ds maneira a obter-se 6-ApA e 7-ACA e os seus derivados, respectivamente» e a acilação dos últimos compostas para ss obterem penicilinas s cefalosporinas semi-sintéticas ds interesse, é da maior importância a este respeito dispor ds uma enzima acilase eficiente capaz ds catalisar a transformação ds CefC Ce cs seus derivados) cas obtenção ds 7.....ACA

C e as seus derivadas).

A presente invenção tem como objectivo proporcionar essas enzimas eficientes.

Mahajan CS) faz uma revisão geral das várias acilases de penicilina e faz a distinção entre as acilases específicas penG e PenV.

A memória descritiva do pedido da patente de Invenção Europeia EP -A.....02S32ÍS descreve usa transf ormação enzimática duma fase de CefC e dos ssus derivados cem obtenção de 7.....ACA e dos seus derivados» utilizando uma encima derivada da estirpe Arthrobacter viscosus, ATCC 53594.

A Patente ds Invenção Europeia EP.....A.....

0322032 refere-se à mesma transformação enzimática dum único andar, utilizando uma enzima derivada da estirpe ATCC 53667 ds Bacillus megatsrium.

A Patente ds Invenção ‘Mor te-Americana Número 4 774 179 refere-se basicamente à mesma transformação» utilizando Pseudomonas sp. SE-S3 ou SE-495 ou o material obtido a partir destes microorganismos submetendo-os a tratamento químico s/ou física.

Coma já ss referiu anteriormente, a baixa actividade destas enzimas acontece na sua utilização comercial até hoje.

A utilização de métodos de ADN rscsabinante permitiu o aumento dos níveis de produção das penicilina-acilases comereialmente empregadas (Mayer (9?) s alargou as possibi1 idades do processamento destas enzimas (Schumacher (10) ).. A penici 1 ina-aci 1 ase de E.coli verificou......

-se ssr produzida como uma proteína precursora de grandes dimensões, que foi posteriormente processada na proteína madura periplástica que constitui uma pequena subunidade (alfa) e uma grande (beta) subunidade. A clonação e o sequên.....

ciamento do gone ds acilase ds acilase ds Kluyvsra ctrqphi 1 a revelou uma apertada homologia com o gene de acilase de

E.coli (Barbero (11)). Também para a penicilina G.....acilase de

Proteus rettqeri, foi descrita uma subunidads pequena e uma subunidads grande CDsumy (12))..

Williams (33) descreve modificações da especificidade do substrato da PenG acilase de E.coli ATCC

9637 por mutagénese in_________vitro. 0 método bassia-se na subclonação de substituição ds regiões no gene ds tipo natural por regiões equivalentes do gene ds um mutants na.....

tura!..

a selecção ds substrato da da eficiência

Forney (34, 35) descreve amidasas eom novas especificidades do penici1ina-amidase ds E.coli e a alteração catalítica dessa penicilina.....amidase (ds E.coli ATCC 11105) por mutagsnese in vitro. Uti1isou-se D-C.....).....alfa.....aminofsnil.....

aceti1-CL)-1 suei na oomo substrato análogo ds ampicilina 2 cefalsxina. Verificou.....se ser possível alterar a especificidade do substrato ds penici1ina-amidase a obter enzimas que, a baixo pH., hidrelissm amidas oom agrupamentos de alfa.....

aminofsnil.....acetilo mais rapidamente.

Estas publicações não referem nem sugerem a presente invenção.

A presente invenção refere—se a mutações ds genes ds acilase, algumas das quais têm como resultado alterações da especificidade do substrato ds enzimas ds acilase. As mutações são criadas em nócleótidos especificos dos genes ds acilase e, sss várias formas ds realização especificas, as encimas mutantes mostram tsr propriedades bioquímicas alteradas, que podem tsr como resultado, mas não ss limitam a, especificidade aumentada em relação à dssaciiayãs ds certos antibióticos ds feets-Isctsms.

Ds acordo asm uma forma ds realização preferida, proporcionam-se novas enzimas mutantes que são particularmente apropriadas para a transformação sm uma fase ds CefC s os seus derivados sm 7-ACA a os seus derivados.

Ds acordo com uma outra forma ds realização preferida, proporcionam-se novas enzimas mutantes que sao particularmente apropriadas para a acilação de &-ApA e ds

7.....A(D)CA, tendo como resultado a produção ds derivados da penicilina s ds cef alosporina' pretendidos.

Ds acorda com usa forma de realização da presente invenção, os genes que codificam acilases do TipoΙΣΑ ou do Tipo-IIB conhecidas, por exemplo, acilases PenS dc

J<lU^^:ã...JLÍtr.SBJlLi_â.n Al^âlÀaSDSS-uEâSCAllSou dc quaisquer outros micro-organismos qus produzam essas enzimas s glutaril-Cef acilases de Pseudomonas SE-S3 Acyll,

Pseudomonas SY-77 ou de quaisquer outros organismos que pro.....

duzem essas encimas, são mutantes da tal asneira que as enzimas obtêm uma especificidade alterada para os seus substratos.

'T

Estas e outras formas ds realização serão descritas em mais pormenor na presente memória descritiva que ss segue.

8BE5ZE-^ESEBI£SS-I1QSJ1ÊSB^Q£

A Figura i representa esquemas reaccionais de certas transformações ds beta-lactamas. A reacção 1 é a reacção ds dssacilação ds PsnS que tem como resultado a obtenção de 6 APA s de ácido fenil-acético. A reacção 2 reflecte a desacilsção de psnV tendo como resultado a obtenção ds 6-APA e de ácido fenoxi-acética. A reacção 3 é a dosacilação ds CsfC com obtenção ds 7-ACA s ds ácido Calfalamino.....sdípico. A reacção 4 reflecte a dssacilação ds CsfG com obtenção ds 7-ADCA e ds ácido fenil-acético.

A Figura 2 representa o mapa da restrição d ο ρ 1 asmí d so ρ UíMíM I „

A Figura 3 rsprsssnta o mapa ds restrição do plasmídeo pUNÍMEC que protege o gene E.coli ATCC Í1Í05 penici1ina-acilase.

A figura 4 representa o mapa ds restrição do inserto ds 6,4 kb dc plasmídio pAFl.

A Figura 5 representa a sequência de nucleótidos s a sequência de aminoácidos derivados do gene ds penicilina-acilase de Alcaligenes faecalis. Os aminoácidos sãs indicados pelo código ds uma letra.

A Figura 6 representa o inserto da pUNNSL7 que origina o gene Pseudomonas SY.....77 glutaril.....Cefaci1ass.

A Figura 12 representa o mapa do restrição do plasmídeo pL^!CGL7A: plasmídeo pUCIS que origina o gene ds glutaril-Cef-acilase de Pseudomonas SY.....77.

A Figura 8 representa o mapa ds restrição do plasmídeo pTZSES-is plasmídeo pTZISR que protege o gene ds Psgudo.mg.nas SEJ33 Acyll.

A -figura ? representa o mapa do plasmídeo pMcTNdeς um derivada do plasmídeo ds expressão ds mutagénsse pMa/c 5-8 com uma posição ds inserção ds Ndel sob controlo do promotor TAC..

A Figura 10 representa o mapa do pias.....

mídio p!ícTGL7AN ds oom o gene SY.....77 glutaril.....Cs-f.....acilase inserido no sítio ds Ndel (que origina o codão ds iniciação) do plasmídeo phcTNds.

A -figura il representa o mapa do piasmídio pMcTSESNdes plasmidio pMcTNde oom o gene SE.....83 Acyll inserido nc sítio ds Ndel.

A Figura 12 representa o mapa do piasmídio pMcTAFNdes plasmídio pMcTNde com o gene ds A. -faecalis penicilina acilase inserido no sítio Ndel.

A Figura 13 representa a sequência ds nucleôtidos e a sequência ds aminoácidos derivados do gene ds Pssudomonas SY.....77 glutaril-acilase.....Csf completo.

A Figura Í4 representa o alimenta ds aci1ases ds Tipo-II de E, coli Ce.col), Kluyvsra. citrophiia (K.Ycit), Alealiqsnss -faecalis Ca.-fas), Pseudomonas SE.....83

Acyll (Acyll) e Pseudomonas SY--77 (SY.....77) . □ asterisco significa que a sequência contém o mesmo aminoácido naquela posição que a sequência da E. coli acilase.

A Figura 15a representa a região ds sei ec ção na subunidade al-fa de Alcali genes -faecalis.

A Figura 15b representa a região ds sslscção na subunidade beta dc Alcaligenes faecalis..

A Figura 16a representa o resíduo de aminoácido do selecção na subunidade alfa ds SY-77»

A Figura 16b representa o resíduo ds aminoácido ds selecção na subunidade beta ds SY-77.

A Figura 17 representa a transformação ds adi pi 1.....serina pela glutaril.....acilase SY.....77 ds tipo natural e do mutante V&2L. Dosearam-se as enzimas de tal maneira que se obtivesse a mesma actividade sobre glutaril 7-ACA.

A Figura 18 representa a transfarmação ds adipil.....serina por glutaril.....acilase SY.....77 do tipo natural s mutantes Y17SH s V1798. Dosearam-se as enzimas ds tal maneira que ss obtivesse a mesma actividade da glutaril 7.....ACA.

A Figura 19 mostra a transformação ds adipil.....serina por glutaril-acilase SY.....77 do tipo natural e mutantes Y178H e L177I * Y178H. Dosearam-se as enzimas ds tal maneira que se obtivesse a mesma actividade de glutaril 7.....

.....ACA.

DESCRI Ç-SO PORMENORIZADA DA INVENgSO

A presente invenção utiliza 'a engenharia das proteínas como -ferramenta para desenvolver acilases oom a especificidade co substrato alterada. A invenção baseia-se na descoberta ds que os genes que codificam várias acilases (conhecidas) apresentam um grau ds homologia significativo em certas regiões. Fez.....se uma análise comparativa que indicou que certas mutações podem alterar as propriedades bioquímicas das acilases. Ds acordo oom o método que é descrito a baixe, torna.....se evidente certo número ds sítios ds mutação potenciais.

Observou-se que as estruturas terciárias nas proteínas homólogas são muito mais conservadas ss evolução do qus as estruturas primárias s consideravelmente mais do que as sequências do ADN. Isto é ilustrado, por

..... -í fZ,

V

exemplo, pela família ds globina (Dickerson (13)),, A dobra ds globina á codificada por muitas sequências ds aminoácidos diferentes, algumas diferindo das outras tanto quanta SiX C13B ds 150 resíduos). Mão obstante, a sua conformação muito semelhante suporta a hipótese corrente ds que divergem a partir ds um antepassada evolucionário comum.

Quando os organismos divergem no decurso da evolução, os seus genes acumulam gradualmente mutações para originar proteínas com sequências ds aminoácidos muito diferentes. Quanto mais divergem, menor é a homologia da sequência. A frequência ds mutações á elevada em sítios que são irrelevantes para a dobragem, para a estabilidade ou para as propriedades catalíticas. Geralmente, estes sítios ocorres em posições na cadeia ds polipêptido em que a cadeia lateral ss encontra sobre a superfície. Só em casos invertidos, há uma tendência para os resíduos tarem uma das cadeias laterais polares curtas ou serem glicina ou prolina, os resíduos mais frequentemente encontrados nesta posição. Os resíduos interiores são alteradas senos frequentemente e a natursca não polar da cadeia lateral é muito bem conservada. Como a mutação durante a evolução ê um processa aleatória, haverá também substituições que afectam as propriedades funcionais. Só quando estas substituições não provocam inconvenientes ao organismo, elas são toleradas. Por consequência, a variação desses aminoácidos é muito menor,, Geralmente, encontram.....se resíduos direotamente envolvidos na catálise que são altamente conservados. As inserções e as eliminações tendem a ocorrer em laçadas superficiais entre unidades de estruturas secundárias com pequena perturbação do interior. Geralmente, nas moléculas que divergem, os elementos da estrutura se.....

cundária sao arranjados de acordo com uma topologia trid i m e n c i o n a 1 s em e 1 h a n t s.,

A homologia de sequência encontrada entre • as acilasss ds Tipo-II, assim como a semelhança da ar• quitsctura molecular destas moléculas, sugere qus as aci1 ases de Tipo-IIA s ds Tipo-IIB se tenham desenvolvido a partir ds

*_Λίη ónico gene antecessor. Também o processo de maturação t£.....

pico sugere uma origem comum. A comparação das sequências de proteínas que divergem do antepassado comum pode revelar os resíduos que são envolvidos directamente nas propriedades; funcionais ds encima.

Numa forma ds realização da presente invenção, os genes qus codificam acilases conhecidas do Tipo.....

-~ΣΙΑ ou do Tipo-XXB, por exemplo, PenS acilases ds Escherichia coli·, Kluyvsra citrophila,, Al cal i genes faseai is ou quaisquer outros organismos que produzam estas enzimas, e glutaril-Cef.....acilases de Pseudomonas SE-83 Acyll, Pseudomonas

SY--77 ou quaisquer outros micraorganismos qus produzam essas acilases, são mutados ds tal maneira que as enzimas possuem uma espeeificidade alterada rslativamente aos seus subs.....

tratos.

A alteração da espeeificidade do substrato ds PenS acilases (Tipo-IIA? é conseguida ds tal maneira qus as enzimas mutantes sejam capazes ds clivar cu sintetizar penicilina e derivados de oefalosporina que possuem cadeias laterais diferentes ds feni1-acetil, qus á a cadeia lateral natural ds penicilina S.. Qs exemplos ds cadeias laterais que presentemente não são significativamente afectadas por PenS acilases são grupos acilo derivados dos ácidos dicar·boxilicos, ãoido succínico, ácido glutárioo, ácido adípico s áoido amino -adípico (sendo este ôltimo a cadeia lateral natural ds Csf u? .

Numa outra forma ds realicação da presente invenção, a alteração da espeeificidade do substrato ds Cef acilases CTipo-IIb) é realizada ds tal maneira qus as enzimas mutantes clivam ou sintetisam derivados da penicilina e da cefalosporina que possuem cadeias laterais diferentes do agrupamento de ácido glutárioo.. São exemplos ds cadeias late.....

rais apropriadas qus podem ser clivadas ou sintetizadas por essas novas enzimas mutantes as qus presentemente não são sufcstancialmete afectadas por Cef acilase, tais como os agrupamentos derivados ds ãcido amino.....adípico, a caseia lateral natural ds cefalosporina C, cadeias laterais hidrofóbicas tais como o agrupamento derivado do ácido fenil.....

.....acético, a cadeia lateral natural de penicilina Se as cadeias laterais ds alquilo.

Ds acordo ainda com outro aspecto, a alteração da especificidade e da actividade de acilasss CTipo-ΪΙΑ e IIB) é realizada por cadeias laterais que sao substratos já existentes para as referidas acilases. Usando a engenharia das proteínas, a afinidade para um substrato pode ser alterada (por exemplo, aumentada, traduzindo.....se por um menor valor ds K_m para o mencionado substracto) ou o rendimento catalítico pode ser alterado (por exemplo, aumentado, o que é demonstrado por um valor ^Keat maior para o referido substrato;.

A fim de conseguir realizar alterações na molécula da enzima, é evidsntemente muito desejável dispSr da extrutura tri dimensional da referida encima.. No entanto, até agora, não foram publicadas estruturas tridimensionais de acilases. No entanto, vários genes que codificam acilasss foram ssquênciados por exemplo, os genes ds E»cali s ds

Kluyvsra, citrophila (ambos do Tipo.....11A) s de Pseudomonas SE.....33 Acyll (do Tipo-IIB) e isso permitiu observar o pro.....

oessamento biológico destas enzimas,. □ sequenciemento da axtremidae de amino e da extremidade ds carboxi das sub~ unidades isoladas revelou que o gene codifica uma proteína precursora sue consiste numa sequência ds sinal seguida pela subunidade alfa, um péptido de ligação (distanciadar) e final mente a subunidade beta..

Ds acordo com uma forma ds realização ca presente invenção, a engenharia ds proteínas das acilases rssiiza—ss seguindo duas estratégias, dependendo da dis.....

pc-nihilidads ds uma estrutura tridimensional das acilasss seleccionadas. A maneira ds proceder para determinar uma sstrutura tridimensional é conhecida na técnica,,

Na ausência da conhecimento tridimensional ,, segue-se substancialmente a seguinte estratégias

Em primeiro lugar, clona-se certo número ds genes ds acilase escolhidos num organismo hospedeiro de expressão apropriado. Gs microorganismos preferidos incluem E„ coli, Saci 11 usPseudomonas. Em seguida, determina-se a sequência ds ADN de cada acilase danada. As sequências de ADN são transladadas para ss correspondentes sequências de aminoácidos e estas sequências ds aminoácidos são então alinhadas de tai maneira que ss obtenha uma homologia que seja tão elevada e relevante quanto possível,.

Para o alinhamento da sequência, os tipos do aminoácidos podem ser apropriadamente utilizados como parâmetros, com base na identidade, mas também na similaridade. Por exemplo, a serina é semelhante á troonina, o ácido aspártico é semelhante ao ácido glutãmico, etc. Outros parâmetros apropriados cão, por exemplo, previsões das estruturas secundárias (de acordo com várias maneiras de proceder “correntes, por exemplo, de Chou Fassman) e a distribuição da carga ao longo das sequências. Numa operação subsequente, escolhem.....se as regiões para a mutação.

Os mutantes gerados aleatoriamente são escolhidas permitindo apenas desenvolver os mutantes que são capazes de clivar um substrato específico. Estes substratos compreendem geralmente um derivado de amida que contém como um agrupamento acilo a cadeia lateral para a qual a especifieidads da mencionada acilase s pretendida e, como agrupamento amina, um L-aminoâcido que é indispensável para o crescimento do hospedeiro ds expressão. Portanto, só os hospedeiros que expressam uma acilase com a especificidade Co substrato prtendida são capazes de clivar o citado composto de amida, libertando dessa forma o aminoácido essencial,, Por exemplo, a D.....alfa-amino-adipi1-L.....leucina 'daqui por diante na presente memória descritiva designada como amino-adipi1•l .-‘í

.....!sueina, composto este que se encontra sob a forma D) pode ser utilizada como composto ds amida para sslsccionar usa CsfC acílass usando organismos ds expressão de 1 suei na auxotrõficos. Outro exemplo ds um agrupamento de amina é o amoníaco, que pode servir como a única fonte ds azoto para o hospedeiro -do expressão.

As aci1ases mutantes “positivas que re.....

velam a especificidade de substrato pretendida, com base na maneira dc proceder ds selecçâo utilizada, cãs então purificadas e ensaiadas. Os sítios ds mutagéness sãa iden.....

tifiçados sequencianrio o gene das aci1 ases mutantss. Outras mutações (incluindo substituições ds aminoácidos, supressões e inserções) pedem também realizar-se em ou á volta destes sítios, a fim ds aumentar mais a actividade da acílass mutante.

Quando se dispõe ds uma estrutura tri.....

dimensional de uma aci1ase, as primeiras (quatro) fases da maneira de proceder acima referida necessitam ainda de ser realizadas mas a sslecÇão pode basear-se na estrutura tridimensional„ Pode prever-se a realização ds duas maneiras dc actuar:

a) Um procedimento racional, em que vários aminoácidos são mutados em outros aminoácidos. Isso ds mutantss e por podem ser tratados quanto á sua partir da estrutura não cria uma grande quantidade consequência, todos os mutantss relatívamente à purificação e ao ensaio sspscificidade para o substrato. A tridimensional, podem ser escolhidos um ou mais aminoácidos no sitio activo a fim ds serem mutados de tal maneira que a cadeia lateral pretendida possa ser acomodada optimamente no sítio activo. Por exemplo, a acomodação da cadeia lateral ds amino-adipilo ds CefC numa PsnG acilsss requer que a bolsa de ligação seja primeiro que tudo alargada a fim de se poder encaixar na cadeia de alquilo mais comprida s, em segundo lugar, que este seja fornecido com o ambiente slsetrostâtico le -

apropriado para ligar o grupa amina s/au ds earboxí da cadeia lateral ds amino.....adi pi Io. Como outra exemplo, a introdução do ambiente electrostático apropriada a fim de acomodar o grupe amino carregada pasitivamente da cadeia lateral ds CefC pode alterar a especificidade ds glutaril-Csf acilass (qus já apresenta alguma actividade cos amino-adipilo de Csfalosperina; para ss obter uma CefC acilass.

b) Pode realicar-se uma tentativa ds mutagéness aleatória pretendida íTRM)^iE„ Não obstante s a estrutura tridimensional, pode ser difícil fazer previsses.. Ss έ possível verificar cus alguns aminoácidos estão envolvidos na ligação do substrato, uma mutagênese aleatória pretendida é vsntajosamsnte realizada s seguida por um ensaio ds selecção como ss indicou acima. Esta maneira ds proceder origina, por exemplo, oito mil mutantes possíveis quando us cor.junto ds três sítios s mutado aleatoriamente Cem relação aos aminoácidos 22R’20-r2Qji ao nível ds ADN - ss qus cs mutantes têm ds ser feitos - isso significa tanto como (4-^4^4)-=262 00S mutantes possíveis).

us acordo com um oucro aspecto da pre.....

sente invenção, a requerente descobriu que a encima acilass de Alcaligenes____faocali s apresenta um grau de homologia surprsendsntsmente elevado com as acilaces de £. coli e

Kluyvsra citrophi 1 a. 0 gene que codifica a acilase de

Alcaligenes faecalis foi isolado e sequenciatío e comparado com os genes de outras duas espécies. Verificou.....se qus uma propriedade caractsrística comum das sequências é que cs genes codificam um precursor ds polipéptido de grandes dimensões qus pode ser constituído como se prevê na Tabela 1.

As marcas em questão reiativamente a Alcal1genes faseaiis indicam só que a extremidade das sequências não podia ainda ser determinada s=m ambiguidade,.

TAifiLâ....!.

hiámero ds Aminoácidos por péptido da Aci1ase

,‘í....................................~......................................................... Sf Acilase ds 0	Sequência do sinal	Subuni.....|Péptido dsfSubuni.....í
dade s	1igação	dade β !
Sf HEscherichia coli	26	·-......................................... ». 1 ί	..................................................... 54	557
íuuyvera ci trophi1 a	-··'·. ,ώ,ς-	209	54	555
Alcaligenes faecalis	26	218C?)	29 (?)	551
5 Ii HPseudomo.....
| nas SE.....83 Acyll	0	239 (?)	?	535 P
Pseudomonas SY.....77	••.«o .sU ·....·	16?·?:	?	521 f
1!=:·:=»==			.......................................i'!

Da acorda com um outra aspecto da presente invenção, verificou-se que a subunidade alfa e a subunidade beta da. acilase ds Pseudomonas SY.....77 possuem regiões com asa homologia da. sequência tanto com a acilase do

Tipo.....11Α come oom a acilase SE 83 Acyll do Tipo.....IIS. 0 gene que codifica a acilase de Pseudomonas SY.....77 foi isolado e obteve.....sa a sequência completa do gene. Para ambas as aeilasss da Pseudomonas, não há a evidência ds um péptido ds ligação entre a subunidade alfa s a subunidade beta. A enzima

SY.....77 parece ter um péptido ds sinal, enquanto o saquenciamento da extremidade N da SE~83 Acyll mostrou que a subunidade alfa madura começava prscisamsnte depois da meti oni na de iniciação ÍA. Matsuda (6))..

A cinética das aeilasss do Tipo···· IX é consistente com a catalisa ss realizar por meio de um intermediário ds acil.....enzima (Mahajan (8)).

e + Pe.nG

-ou Pe.nG ♦e-PhAc

Λ

APA

Pb Ac

Na primeira fase trato Pe.nG liga.....so à enzima para do mecanismo, o sube.....

for mar o comp1exo d o ·! ···?

Michaelis.....Menten não covalsnte esPenS. Ma operação sub.....

sequente» forma-se o produto intermediário covalents entre a enzima e o agrupamento de aci lo do substrato íe-PhAc = enzima acrilada; PhAc = ácido fenil.....acético) com a concomitante libertação do primeiro produto 6-APA» A desscilação ocorre com o auxílio ds uma molécula ds água libertando dessa forma o segundo produto PhAc s regenerando a encima,. Este mecanismo está também ds acordo coo as observações de que PhAc actua como um inibidor competitiva s 6-APA como um inibidor não competitivo..

mecanismo acima descrito» que á idêntico ao postulado para as serina-proteases» em conjunto com a descoberta dc que fluoreto ds fenil-metil.....sulfonilo CPNSP, um patente inibidor das serina-protsases) inibe a encima

CMahajan CS)) sugere que estas enzimas são também serina.....

hidrolases que contêm uma tríade catalítica consistindo em serina, histidina s ácido aspártico» Esta tríada catalítica é não só encontrada nas serina.....proteasss da família da tripsina e ca subtilisina» mas foi recentemsnts também descoberta em dois triaci1-glicerol.....lipasss estruturalmente diferentes CD.

Slow (14); F.K. Winkler (15); L» Brsdy (16)) do pâncreas humano s do -fungo Rhicomucor mi eh ei ,. Com base no alinhamento da sequência Ser765 de Alcaligenes faecalis acilase é mais provavelmente o sítio activo da serina» Cem base nesta descoberta, proporcionam-ss outros mutantes com actividade al terada,

Ds acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, os genes gue codificam as acilasse ds

Escherichia coli, Alcaligenes_____faecalis, pseudomonas SY.....77 e

Pseudomonas SE.....S7 Acyll, respectivamente» foram clonadas no organismo hospedeiro ds expressão E» coli.

As sequências ds ADN das acilases de E.

coli, Kluyvera________citrophila, Pseudomonas SE-S3 Acyll e a sequência parcial ds ADN para Pseudomonas SE-77 foram retiradas da literatura.. A sequência ds ADN para a acilase d=

Alcaligenes Faseai is foi determinada» assim oomo a parte restante da sequência de ADN de Pseudomonas SE.....77.

alinhamento das cinco sequências de aminoácidos revelou uma homologia apertada entre as PanS aci1 ases <> 45%), enquanto a homologia entre as PenS aci1 ases e as glutaril-Cef aci I ases era menor (25 - 35“;,;, snquantetambõm s. homologia sntrs as glutaril.....Csf acilasos era da mesma ordem ds grandeza. No entanto, foi possivel detactar regiões de elevada homologia entre as cinco sequências» o qus aponta uma estrutura tridimensional semelhante possivel (jâ suportado pela estrutura hatarodimêrica'. São regiões ds particular interesso para efectuar a mutação as subunidades alfa s beta da aci 1 asa.

Deve ter-se presente qus todos os ami.....

ncácidos, tal oomo são utilizados nesta memória descritiva» ss encontram sob a fsrsa L» a não ser que sa indique outra forma. 0 termo amino-adipi1 o é usado para indicar o agrupamento D.....ai fs.....amino.....adipilo.

Gs seguintes Exemplos são descritivos a título ds ilustração e não a título de limitação.

MATERIAIS Ξ MÉTODOS

Clonagão s Dstecção de Ssnss de Aci1 ase

As técnicas gerais ds clonação foram realizadas oomo é descrito por Maniatis (17?» Ausubsl (IS? e Portal Ci-?. Estes manuais fundamentais descrevem pormenorioadamente os protocolos para a construção e a propagação ds moléculas ds rADM» as maneiras de proceder para obter bibliotecas ds genes e os protocolos para mutar ADN ds uma maneira dirigida para o sítio ou de maneira aleatória. As enzimas utilizadas para as manipulações ds ADN foram adquiridas a fornecedores comerciais s utilizadas de acordo oom as suas instruções. Os plasmídeos e os hospedeiros ds clonação de E........ooli foram obtidos a partir de colecçõss públicas de culturas.

Construção de Plasmidio pUNNl

Construíu-ss o plasmidio pUNNl procsdondo da seguinte formas cortou-se o plasmidio pUBll© (S. aureus) com SnaBI e Taol s clonou-se o fragmento gue possui o gene ds resistência a neomicina em pUCl? digerido por Smal s AccI, obtendo.....ss pPMeo. 0 fragmenta com .....gcal ds pequenas dimensões ds pRNso foi trocado pelo fragmento ds pequenas dimensões com EcoRI-SealI ds pUClQ, obtendo-se como resultado pRMeoIX. Então, clonou-se o pequena fragmento de pPMsoII com Bst-Rst. no único sítio para Pst 1 ds pUN121 CNilsson (20))» Depois da digestão oom Kpnl„ Xbal„ tratamento com naelsase 31 s ligação, recuperou.....ss o plasmidio pUNNl» Este plasmidio pode ssr utilizado como vector ds selecção positivo CMilsson, ibid») e tem a vantagem sm relação aos vectores de clonação comuns ds não conter o gene ds beta-1actamass que pode destruir antibióticos de bsta-lactama.

Ensaiou-ss a actividade ds acilase pelo método espsctrofotométrico com base na dstecção das grupos de amina primária oom fluorescamina f1uorofórica CS. U.nderfriend s col,., (32)). Para a dstecção de 7-ACA» o método foi adaptado por Reyes o col. (21).

A fim ds determinar a actividade encimática, incubou-se a enzima com substrato â temperatura ambiente. A composição da mistura reaccional foi a seguinte: 23mM ds tampão de fosfato ds sódio ds pH 7.5, 1..2 mM de substrato, 1,3 mM do inibidor do beta-1actamsss ãcido 6.....

bromo-penicilãnico o enzima. Interrompeu.....ss a reacÇso adi.....

cionando HCL 0,5 Normal» As raaoÇSss lentas foram ensaiadas imediatamente sem prévia interrupção da reacção oom HCL» Da mistura raacionsl, rstiraras-se 10© microlitros e misturaram.....

se comS00 microlitros ds tampão da acetato ds sódio 0,2 M ds pH 4,5 s oom ISSímicrol i tros ds f luorescamina que foi preparada sm acetona AR Cl mg/ml). Quando o substrato continha um aminoáoido sm vso ds 7--ACA, substituiu-ss o tampão de acetato ds sódio por fosfato de sódio 0,2 M ds p.H **ΜΜ

7,5« Depois de quinze minutos, determinou-se a absorção a 373 nm com us espectrofotómetrc. lívicon 86® e corrigiu-se com os resultados de ensaios com amostras sm branco apropriados. Por meio ds uma curva de zalibração, a absorção a 37S nm pode ser relacionada cas o nássra de grupos aminc livres libertadas per hidrólise do substrato..

Mutagénese de Sanes de Acilase

A mutagénese dirigida ao sitio ds frag.....

mantos de ADM cionados realizou-se como foi descrito per Stanssens (22? , com o- auxilio dc plasmídio dc sistema pMa/o,.

Construíram.....ss moléculas duplex ds genes de acilases ccm interrupções apropriadas. Com oligonueleótidos não adaptados específicos, introduziram-se mutações dirigidas ac sítio. Obteve-se a expressão ds genes ds acilase sm E.. coli WK6 ou a partir de sinais ds Expressão homólogos ou a partir dc promotor lac, tac ou trp ds £. coli (Ds Boer (23)).. Moléculasduplex com interrupção foram recozidas com oligonueleótidos bloqueados para sc obter uma mutagénese aleatória dirigida â região (Hermes (24) ). Estes cl igonuclsótides “bloqueadc-s foram preparados incluindo vestigies ds todos os quatro nueleótidos durante a síntese ds oligonucleótidos num sintstisador ds ADN ds Applied Siosystsms., Como alternativa, a mutagénese aleatória do ADN com intervalos de interrupção realizou.....ss enzimáticamonte da acordo com um método modificado de Leethevsara (25). Mediante a escolha da in.....

terrupção, escolheu.....ss a região a ser mutagsnizada enzimat icamente..

Num outro tipo de experimentação, rsalizcu-se a mutageness aleatória pretendida. Esta compreendeu a inclinação ds todas as quatro bases no codão para um aminoácido especifico durante a síntese do oligonucleõtido.

Ac preceder.....ss assim, pode sintetizar-se um oligonucleõtido mutagénico que podo mutar qualquer aminoácida e todos cs • outras aminoácidos possíveis. Pode mutagsnsr-sc desta maneira • uma única posição ds aminoácido ou uma combinação dc diversas posiÇões.

Meios^SsIscllvos

Preparam-se meios selectivos para fenil.....

acetil.....leucina C^tlfal) como é descrito por Garcia (26)

Preparam-se placas mínimas da seguinte forma;: agar mínima M63, 2 g/1 de glucose, lmg/I de tiamina, IS mg/1 ds prolina s o antibiótico apropriado (5© microgramas por mi de cloranenicol Ccap) eu 25 microgramas per ml de ampicilina (ame? para as selecções da especificidade da cadeia lateral (por exemplo, adipilo ou amino-adipilo) de aci1 ases, incluiram-se nas placas mínimas 100 microgramas/litro da correspondente acil.....leucina. Transformantes ou mutantes ds £« coli HBÍS1

CLeu) que se desenvolvem exclusivamente na presença de acilleucina sãc considerados come protegendo um gene de acilase com a especificidade pretendida. Em ves da leucina, variou.....se o agrupamento de aminoácido do substrato selectiva. Nesse caso, utilisou-se para sslscção um mutante auxotrófico ds E.

col 1 apropriado. Por exemplo, realizou.....sa a escolha do substrato de N-adipi1-lsucina com a estirpe PC235Í de E. coli como hospedeiro (obtida ds Phabagsn, Utrecht, Holanda).. A fenil.....aceti 1.....leucina, a amino-sdipi I.....leucina, a glutarilleucina, a adipil.....alanina s a adipil.....serina foram obtidas da firma LGSS, Transferbursau Nijmegen, Holanda,.

Adicionou-se fenil.....aceti1.....amina até se obter uma concentração final igual a 15 mM ao meio M&3 mínimo suplementado com 3,2/í ou ds succinato, glicerol ou glucose como fonte de carbono e tiamina Ci micro.....grama/mililitro), prolina (10 microgramas/ml) s o antibiótico apropriado. Todos os sais no meio basal foram substituidos pelos correspondentes sais que contêm iões ou !Ma⁺ ou K’, a fim de garantir o desenvoivimento seiactivo na amida CDAumy (12))Adquiriram.....se as amidas ccm cadeias laterais pretendidas em fornecedores comerciais ou preparam.....

se de acordo com técnicos corrssntss. Uti1icaram-se as estirpes JM10Í, UMá, HB-101, PC235Í a PC 1243 de E.coli como

hospedei “ss para sei saci onsr genes mutantss com eepeci.....

fiei dade para ss amidas sei estivas..

£íãnsira_ds______Proçeder_ds____Isolamsnto_de______^..u:±âLÍiz:â£ll.il.tã„.de..

Ilsa.„±ksty;LãL^_!±át£F2te

Col set aram -ss as células por ce.ntrifu.....

gaÇso s rassuspenderam-se em tampão ds fosfato ds sódio 1Í3 .mM ds pH 7,4 gue contém NaCl 14S mM. As células foras rompidas por tratamento com ultrassons (6 x 23 ssg, 1S0W, ÍSS mm de barra, Labsonic 1510; depois de decorridos cada vinte segun.....

dos, as células foram arrefecidas com golo durante trinta segundos).. Subsequentemants» centrifugou-oe a suspensão. Re.....

pstiu.....ss a maneira ds proceder ds tratamento com ultrassons com o pelete rsssuspsndido s, finalmente, separaram—sa os resíduos das células por centrifugaÇão. Reuniram-ss os sobre.....

nadantes s adicionou.....ss sulfato ds amónio até 307 ds saturação. Depois ds ss agitar durante trinta minutos, separou.....se o material precipitado por centrifugação. Aumsn--tou-se a concentração do sulfato de amónio do sobrenadante para 60X ds saturação e, depois ds trinta minutos, colsctou-so o precipitado por centrifugação. Dissolveu-se o bolo em tampão de fosfato ds sódio 29 mM ds pH 7,5 e dialisou.....se sxtsnsamsnto contra o mesmo tampão..

EXEMPLO 1

.........c.g.i..i.

A partir do mapa de restrição publicado e da sequência do gene ds penicilina-aciI ase ds E. coli ATCC

11105 (Sang—Jin (27)), concluiu-se que o fragmento HindIII.....

Smal ds 2,9 kb compreende o gene ds acilase Cpac>„ Dirigiu.....

ss ADN cromossómico com Hindi1I e Smal e fraccionou.....ss em gel ds agarose contendo 3,5”;.. Purificaram.....ss as fracções ds 2 a 4 kb com Geneclsan CBI013Í, La Jolls, CA) e hibridicou-se com a seguinte amostra de ADN de oligonucleôtido.

TCGTACATTTTCAGCTGATCTTCATAGTGCTTATC

A fracção de hibridação positiva foi então ligada ao vector pUNNl s transfarmada sm E. coli H210Í. A hibridação sm filtro ds dois mil transformantes oom a amostra oligo acima mencionada teve oomo resultado a identifioação do plasmídio pUMNECÍ. A respectiva estrutura estã representada na Figura 3.

mg/ml) o 0,5 ml Qârçesçens ATCC quatro horas..

Desenvolveram-se colónias que contêm pCNNECi em placas da agar-HI durante vinte a quatro horas a 3SC. Em seguida, as placas foram recobertas com 5 mi de caldo nutriente de agar superior contendo Penicilina S (5 ds uma cultura durante a noite de Serratia 27117 s incubou-ss dursnta sais vinte e A actividade da penicilina-aciIsso dos transformantes pode dotoctar.....so a partir da oona ds inibição è volta da colónia, que resulta do uma elevada sensibilidade do Ssrrati a marcss c sns para D-APA ÍMssvootisom C2S) ) ..

EXEKPLQ_2

Q.Silã2io...dsL2ÀÍLAlcall5enes± asealis

Isolou.....se ADN cromossómico ds Alcal 1qsnes faseai i s da estirpe ATCC 19SÍ8 C=WCTC4Í5) e digeriu-ss pareialments com Sau3A« Purificaram.....se as fracções cujos comprimentos vao da 4a 7 kb e ligaram-se ao vector pACYÍS4 que foi digerido com BamHl. Transformou.....se o ADN sm E- coli

HB1S1 e placou.....se em chapas com fal Cveja-se Métodos). Foi passível identificar dois clones positivos;; pAFl s pAF2. Estes clones foram também ensaiados com resultado positivo na técnica ds sobreposição oom Scrratia maressesns,,

Q inssrto de D,4 kb do plasmídeo pAFl está representado na Figura 4.

A localização do gene foi determinada com auxilio do um aligonuoleótido designado na sequência terminal • de NHo da subunidade beta da penicilina-acilase de A.

- faecalis. A sequência ds aminoácidos é a seguinte, •?ZL

S.....N-L......W--S--TZR.....CC).....P-E.....CC) -V

Utilizou.....os o seguinte zXigonuoIsótido como amostra ds hibridizaÇão no inserto pAFi,

ABC AAC CTS TGG AGC A/C C/G C TBC CCS GAG TGC GT

A partir da posição do sinal do hibridização no mapa ds restrição, determinou-se a orientação do gene pac ds A. faecalis (Figura 4). 0 subclone Sau3A~NdeI ds

3,9 kb do inserto do 6,4 kb verificou-se possiur actividade ds penicilina.....acilase, enquanto o fragmenta Sau7A-Sphí de 7,1 kb era inactivc (Figura 4). Determinou.....ss a sequência ds ADN do inserto de 3,9 kb por sequsnciamsntc ds desdesoxi ds fragmentos apropriados em pTZiSR a pTZ19R (pharmaoia). A sequência, de codificação s a sequência ds aminoácidos derivados para penicilina.....acilase ds â»____faecalis estão representados na Figura 5..

EXEMPLO 3

ClanaçãçLágUugL-Sgne-áeJalut·^^ d£lJ^fiUdfí.Gonao....iA.L

Pseudomonas 3Y-77 produz uma ano ima capaz de hidrolisar ácido glutaril-amido-cefalosporãnico oom a obtenção ds 7-ACA e ds ácido glutárico. 0 gens que codifica essa enzima foi clonado (Matsuda (29))» Q ADN extraído ds Pseudomonas. ΞΥ--77 foi digerido oom Hpal e Smal s clonado no vector pUNNÍ linearizado oom Sma1 na estirpe HB1S1. Bslscc lanaram--ss transformantes ss placas hifcridizaram.....zz oom uma amostra derivada da (Matsuda (29), ibid.),

ATG CTG AGA GTT CTG CAC CBS GCG GCG TCC GCC TTS

Verificou.....ss que o plasmídio ds hibridização pUNNSL-7 protegia a fragmento que codifica a acilase ds Pseudomonas SY-77 pelo mapeamento de restrição (Figura 6). Este plasmídio foi purificada e digerido parcialmente oom ds nsomioina s osquercia ds ADN

BamHI e Sal I. Purificaram.....ss s= fragmentos ds 2,6 kb sís gel ds agaross (Geneclean) e ligaram.....se com obtenção ds pUCíS linear içado com BamHI s Sal I (Pharmacia). Carsctsrizou.....ss s plasmídio resultante como ss mostra na Figura 7» Ac colónias foram desenvolvidas em msio ds LBC s analisaram.....ss reiativamente ã sus actividade de acilase Cver métodos).

Verificou.....ss gue o plasmídio pUCGL.....7A produz S unidades/grama ds pslete ds células.

Clonou-se também o mesmo fragmento oom

BamHI.....Sal 1 dentro do plasmídio pTZISR ípharmacia), obtendo.....ss como resultada o plasmídio pTZí98L.....7A. Dstsrmonou-ss a seguência ds ADN total do fragmento oom BamHI.....Sal I oom 2,6 kb (veja-se a Figura 13) s derivou-se a sequência completa ds aminoácidos da acilase SY.....77. Os primeiros trezentos a onze resíduas (dum total de oitocentos s cinquenta) são idênticos á sequência parcial publicada ds acilase SY.....77 (Mat.....suda (22), ibid,,),.

EXSEkCLl

E2sudogsnâs_ll>.

microorganismo Pseudomonas SE.....83 produz uma acilase capas do hidrolizar ácido glutari1-amido.....

cofalosporênico e cefalosporina 8 com obtenção ds 7.....ASA s ds ácido glutárico. Um gene cue codifica a enzima responsável foi clonado a partir do ADN cromossómico de Pseudomonas SE-83 (Acyll em Natsuda (30)),. A partir desses dados foi decidido cionar um fragmento Bg1II ds 6,0 kb de Pseudomonas SE-83 no plasmídio pUN121 linearizado com BclI (Nilsson (20)),, Hibridizaram-sa os transformantes resultantes em JM101 oom um oligonuclsótido derivado da sequência de ADN ds Acyll (Natsuda (38), ibid,.)

888 CCS ATS CTC CTC CCC CCA SCC GCG CCC GGT CAG GTT CTG CGT CSC GAC GGA

Iso1ou-ss um οIone Purificou.....ss um fragmento Saci-Smal ds positivo, pUNSE.....5.

2,3 kb do plasmídio

pliUSE-S o subclonou-sa no vector pTZIS para so obter pTZISSES.....1 (Figura S).

Exggtaj £âSÊâaãú?MJãLuÍEi^

Na Figura 14, estão alinhadas as sequências ds aminoácidos das formas precursoras de várias aci1 ases cm relação á sequência da aci1 ase ds Escheri chia S.3.LL

As aci1 ases que são originadas a partir ds Escher.ioh£s_...c2ÃÍ_ <E. co 1 i ) , jQiÀpvsr a_______cii^Sfãlii a C K. c i t) s

Alcaligenes_______faecalis < A „ f a s) são ac iIasss do tipo.....11A (aci 1 ases PsnG), enquanto as aci 1 ases de Pseudomonas (SE.....S3 ε

SY.....77) são aciIases de Τίρα~ΣΣδ (glutaril.....Cef acilasas).

Na Figura if, estão também indicadas as posições sm que a subunidade alfa principal, o péptido de ligação o a subunidade beta comsÇam. Estas posições foram deduzidas a partir dos dados de sequenciamento des péptidos, resumidas na Tabela 2. Quando não se dispunha de dados de sequenciamento, as posições foram deduzidas a partir das cor.....

respondentes posições sm S. coli.

Dados	de ooqaonciamento......do	Pspti dos.......do	Subunidades	Alfa e
	Beta ds	Asilasse.....de......Tipo	11
Enci ma	Subunidade.....a	Subunidade.....β j.
	Extremi dade	E:	; tremidads	Extremidade	Refj
	de N		ds C	de N	(
2. Cal	Fr-JU.....EQOSS		QTA.....COOH	H,5H--SNM	......... .................... E1SZÍ
1 E. Col	ΗζΝ-EQSSSEl	NQQNSQTA.....COOH	:0:.....SNH0V10	E3Í2 :
In Cif	ASPPTC7K		TOTA COOU	Ηζυ.....SNUNVIG	ί < Ε ί í 3 ! ™’E?V
A „ f 53	h5m-g?q?vevm?t	nao	determinado	íÇm-símluct?
j; SE--S3	ÍUH.....TNAAKT......	não	determinada	H,,H.....oHHUA. .	». EST ‘
sy -77	hjy eptstpoa,, „	não	determinado	HJM--SNS7AVA	- - E2S3 ‘

• 4 entre as

Calcularam.....ss as homol ogi as sequências ds aminoácidos para as subunidades alfa (pro.....

váveis) s subunidades beta (Tabelas 3 s 4, respsctivaments)»

IAB.EU1.3

Í^.O..uJ=J.Í2.S^^

Acilases de Tipo.....XX «Tipo.....ΙΣΑ

I.E.col 2»!<»cii 3.. A., f ae

Tipo.....HB

4.SE.....33 « 5»SY-77 lf

100

S3(39)

47(00)

26(33)

30(40)

100

46(61)

26(43) 29(42)

100

32(42)

23(33)

100

25(32) ||

TABELA 4

22,31,	ic ds Homologia das Cubunidades Bata
,„..â.ãi 1 <2es_de_TÍ£SL- U.
				.....................................................i
	í„	»	3.	4.. | .........~.............—.......—...........—}
Tipo I IA				...............................................................í i
i.E.ool	100
2JGoit	63(91)	130		0
T.A.fae	41(56)	41(55)	133	Π jj
Tipo-UB				H íi
4.SE.....33	22(35)	23(36)	27(34)	103 j
5» SY-77	26(35)	27(39)	22(32)	28(36)| ..........................................~.................í|
	(Qs valores indicados dentro	de parên-
tesas indicam	a homologia	baseada em resíduos	semelhantes,
enquanto os	valores antes	dos valores	indicados dentro de
parênteses sao para resíduos	i dênti oos)
	A partir	das Tabelas	3 e 4	pode con-
cluir.......ss que	há elevado grau	de homologia	dentro	das aeilaces
do Tipo.....IIA compreendida entre 46 e 333	para as	subunidades
alfa e entre	41 e 367 para	as subunidads	s beta..	Estas hemo-
logias tornar	.....ss ainda maioros quando so	toma sm	consideração

s. similaridade entre resíduos (por exemplo, Ser/Thr, Asp/Slu, Arg/Lys, etc.). Este elevado grau ds homologia sugere que a estrutura tridimensional das três acilases PenG seja muito semelhante..

A homologia entre as acilases ds Tipo-ΣΣΑ e do Tipo-ΣΣΒ ê menor (22 a 33%). Estes valores tornam.....se no.....

vamente maiores quando es toma em consideração a similaridade entre aminoácidos (35 a 45%). Portanto, as acilases de Tipo.....

.....ΣΙΒ parecem ssr estruturalmente relacionadas com as acilases de Tipo.....ΙΣΑ. A homologia não é igualmente distribuída ao longo das sequências do aminoácidos, mas ocorram certas áreas de elevada homologia.

A determinação das sequências das acilases do Alcalígenes faecalis a ds Pseudcmonas SY.....'77 torna possível identificar os resíduos que podem estar directamente envolvidos na catálise..

A observação ds aue as acilasss do Tipo.....

.....II sao inibidas por PMSF sugere fortements que, na catálise, está envolvida uma serina activada. A presença ds ssrinss activadas foi observada em proteases ds serina e em lipases. Foram também encontradas conjuntamente com histidina e ácido aspártico, formando uma trâde catalítica.

alinhamento das sequências repre.....

sentadas na Figura 14 mostra apenas três ssrinas conservadas:: Ser 174, Ssr2óó e Ser765 (numeração ds A. f aec.al is)

A Ssr174 está situada na subunidads alfa numa região reiativamente bem conservada dentro das acilases ds Tipo.....IIA, que, no entanto, é fracamente conservada nas acilasss do Tipo.....ΣΣΒ (Figura 14),. Tomando também em consideração e observação experimental de que o amonáeido . sensível a PMSF está situado na subunidads beta (Daumy (12)), . Ser1/4 é improvável que seja a serina do sítio activo.

A ser266 fica situada na extremidade de N da subunidade beta s é mais provavelmente conservada porque á essencial para a maturaçao da enzima. Par consequência, é também um candidato improvável da serina da sitia activa.

A Ser765 fica situada ns subunidads festa (confirmando α resultado experimental ds qus α aminoácido sensível a PMSF fica situado na subunidade festa? e, portanto, á muita provável qus seja a serina do sitio activo.

A sequência ds consenso em volta desta

.. „ -Gly-X)ÍX~Ssr~. „ . .

A glicina qus precede a serina é comum a todas as hidrolases ds serina (Blow <14; >.

Duas histidinas diferentes mantêm.....se conservadas através das cinco sequências (Figura 14): a Hi s42 e a His777„ Ambas se encontram numa região que é altamente conservada em todas as sequências. No entanto, a His777 está relativamente próxima do sítio activa postulada da serina na posição 765 o, portanto, á um candidata improvável. Pelo contrário, a His42 encontra-se numa região de elevada homologia. Supondo cus esta His42 é a histidina do sitio activo, ficando localizada na subunidade alfa, está também ds acordo com as observações experimentais ds qus apenas o heterodímero á a forma activa da encima (isto é, a serina ns subunidads festa e a histidina na subunidads alfa).

Com respeito ao terceiro resíduo da tríade catalítica proposta, há três candidatos que ss encontram na subunidads beta (Asp442, AspcPS c Asp7Sê) s um na sub unoidade alfa <Acp36). Este último está como inicio ds uma região fortemente conservada, muito embora próxima da • sítio activo proposto His42. Ds maneira semelhante,a Asp7SS . está numa região fortemente conservada, mas próximo da Ssr765 activa proposta. Os aminoácidos Asp443 o Asp59S estão ambos

3S

numa região moderadamente conservada e, por conseguinte, ambos são candidatos prováveis coso sítio activo do ácido aspártica.

E.XEMPL£L.Á

Ei=oIha de Rssíduo2^ai^jautã3^S£s 5as^ â£Ílagaã_do_TÍ£arliA

Neste exempla, escolhem-se os resíduos ds aminoácidos que podem ssr mutados a -fim de ss obterem acilases coo propriedades bioquímicas alteradas. Estas propriedades alteradas podem ter coíbo resultado a alteração da especificidade do substrato, das acilasss ds Tipo-Σϊ so relação à aci lação ε/ou ã desacilação de certos antibióticos de beta.....lactama. Os critérios para a selecção são esboçados enquanto ao mesmo tempo ss faz referência ãs Figuras 15a s 15b que contêm todas as posições seleccionadas. Por razões de simplificação, os resíduos referidos são os da acilase de

Tipo.....IIA de Alcaligenes faecalis. Qs correspondentes resíduos nas outras acilasss podem ssr encontrados usando a sequência de dados alinhados da Figura 14»

A selecção das regiões para mutagénese baseou.....so nos seguintes critérios:

1? a fim de modificar a especificidade dc substrato das acilasss ds Tipo.....II, as mutações restringiram.....

ss às subunidadas alfa e bata maduras» Isto significa os resíduos 27-236 (subunidade alfa) s 266.....S:L6 (subunidade beta), obtendo.....se como resultado um total do 210 o ds 551 rssiduos, respecti vaments.

2) Qs aminoácidos das PsnE-acilaces (Tipo.....IIA), que estão a ligar a cadeia lateral hicrofóbica de fenil.....acetilo da PenS, são conservadas nas acilasss do Tipo.....

IIA e, devido ás diferentes especificidades do substrato, provavelmente não são conservados nas acilasss ds Tipo.....IIB.

Por consequência, das subunid-adss alfa e bata, são prafa.....

rivelmente escolhidos aqueles resíduos que, no alinhamento da Figura 14, são idênticos ou semelhantes ás acilases; de Tipo31

ΙΪΑ provenientes de E.. col i , Kluyvera citrophila e AI cal i genes faeçaliã.

Diz-ss que uss pcsiçac contém um residuo ds aminoácido semelhante quando es resíduos que se encontram naquela posição pertencem a um dos seguintes grupos:

a) resíduos hidrofábicos ..... este grupe inclui os aminoáoidos isoleucina, valina, leucina, cisteina, metionina, alanina, feniI-alanina, triptofano s tirosina?

h > _________oom.

uSâ.........jãâ^sa.ã..™±e.Q.íísIloi5....._j£rs__________se......„sncojv^.^m..,JãeeL.........segmento.

flexível - este grupo inclui alanina, glicina, serina, trso.....

nina, prolina, valina e cisteina?

o ) rss£duos„j^o 1 ares_.

tricamsnXe glutami na, arqinina e ··· este grupo inclui serina, asparagina, ácido aspártioo i sina.

ou carregados electreoni na, hi sti di na, , ácido glutâmino, número do posições ss considerar para a mutagénese na subunidade alfa restringe-se devido a estes critérios ds selecção a íà? (SSK) e, na subunidade beta, a 416 C7SX). Nas Figuras 15a e 15b, estes resíduos escolhidos estão reunidos nas colunas com o número referem.....ss as posições dos respectivos sequência da acilase de Alcaligenes faecalis, na figura 14.

1. Qs números aminoáoidos na como se indica ds PsnG ss supõe serem de só podem ser escolhidas os

3) Um grupo preferido é escolhido com base na hipótese de que, visto que as interseções entre a PsnG.....acilase e a cadeia lateral natureza fertemente hidrofófaiea, aminoáoidos conservados s semelhantes que não sao carregados. Isto significa a omissão de qualquer posição escolhida que contenha pelo menos um resíduo carregado num conjunto conservado ou semelhante, como se definiu acima para o grupo

3Ξ

c. Este critério de escolha restringe ainda mais o número de posições ds aminoácidos preferidas ns subunidada alfa ao 119 <457.' e na sufcunidade beta a.o 3S4 <557.1. As Figuras 15a e Í5b rsúnssi estes resíduos nas colunas som o número 2.

4) Um outro grupo ainda preferido á escolhido com base na observação de qus os resíduos ds glicina e ds prolina conservados geral mente desempenham um papel estrutural na proteína, ds preferência a um papel catalítico. Doirando de fora os grupas Gly e Pro conservados do conjunto escolhido ds aminoácidos, obtêm-se oomo resultado um grupo mais preferido de 102 aminoácidos na subunidads alfa C492? s ds 25S na subunidads beta (472):; as Figuras Í5a s 15b resumem esse grupo na ooluna com o número 3,. Este conjunto ds aminoáoidos consiste, portanto, s;n resíduos conservados e semelhantes, com a excepção dos aminoácidos carregados, glicinas conservadas s prolinas conservadas.

5) Qbtám -=s um grupo ainda mais preferido ds aminoácidos escolhidos so ss fiser a hipótese do qus s

também menos provável glutamina, aspargina» qus aminoácidos polaros, tais oomo trsonina, serina s outros estejam envolvidos na ligação do substrato hidrofóbica. Usando este outro critério cs selecção, obtém ss um grupo de 74 aminoácidos na subunidads alfa C352; e ds 162 aminoácidos na subunidads bota (292;. As Figuras 15a o 15b rssumsm estes aminoácidos na coluna 4. Este conjunto ds aminoácidos consiste apenas em aminoácidos hidrofóbicos idênticos e semelhantes oomo são definidos acima na parágrafo 2.

alinoa a) do

o) Fac.....so ainda uma outra seiacção ds aminoácidos a ssrsm mutados ou capac ds serem mutados com base na hipótese ds qus o sítio de ligação das acilasso ds Tipa-lIA è constituído por aminoáoidos hidrofóbioos idênticos. Esta hipótese reduz ainda mais o número de aminoáoiods escolhidos a um conjunto final do 44 smincáeiods hidrofóbicos conservados, na sufc unidade alfa (sondo 212 do número total do aminoàoidos da subunidade alfa) s dc dl aminoácidos hidrc-f ó-bicos conservado na subunidsde- beta C15X do total ds sobunidade beta). As colunas 5 das Fuguras 15a e 15b reénem este conjunto· escolhido de aminoácidos.

EXEMPLO 7

Escolha de Resíduos para Mutaqenese com Base em Diferenças de

Polaridade entre Acilasas ds Tipo-IIA e de Tipo.....1IB

As acilasss do Tipo-ΣΙ são especificas ds substrato gue contêm ácidos dicarboxilícos como agrupamento acilo, tais como ácido succínico, ácido glutárico e ácido adípico. Este facto sugere que o sítio de ligação é muito mais polar sm comparação com as acilasss do Tipo.....ΣΣΑ. Pede mesmo conter uma carga positiva para compensar a carga negativa existente no agrupamento acilo do substrato. Esperase que estas propriedades características sejam conservadas entre as encimas que revelam esta especificidade de substrato. Por conseguinte, comparam.....so estas sequências ds acilass do Tipo-ΣΣΑ ds ds Tipo.....IIP a fim de determinar as regiões qus são conservadas tanto nas sequências de acilasss de Tipo.....ΙΣΑ o do Tipo-ΣΣΒ, mas tenham polaridade trocada a fim de so obter uma ligação mais favorável do agrupamento do acetilo carregado negativamente.

Os critérios de seleção são esboçados sm seguida, enquanto ao messe tempo so fac referência às figuras Í6a e 16b que contêm todas as posições escolhidas. Os resíduos apresentados sao os da acilase SY-77 do Tipo.....ΠΒ. Os correspondentes resíduos nas outras acilasss podam achar-se usando os dados da sequência alinhada da Figura 14.

Efsctuou.....ss a identificação das regiões que são conservadas nas acilasss do Tipo-ΣΣΒ do acordo com uma maneira de preceder semslhnate à qus ss dssorsvsu no Exemplo 6 para as acilasss do Tipo-IIAs í; Restringiram.....ss as mutações ès sufaunidades alfa e beta maduras. Isto significa resíduas 32.....

í?2 (subunidade alfa) e .....723 (subunidade beta).

2) Escolhem.....ss as posições nas acilasc-s do Tipo-llS qus contêm resíduos do aminoácidos idênticos ou semelhantes ds acordo coo o agrupamento referida no Exempla 6. Os resíduos escolhidos estão sumárizadas nas Figuras 16a e 16b nas colunas coo o número 1..

3í A escolha seguinte baseia-se na hipótese ds que as interacçoes entre as PenG-aci1 ases (acilases de Tipo IIA) e a cadeia lateral de Per.S são ds naturaca for temente hidróf á-bica enquanto para o clutarilo da acilase ss supôs um sítio de ligação mais polar que pode mesmo proteger resíduos carregados positivamente. Por conseguinte, foram omitidas todas as posições do alinhamento da Figura 14 que apresentam carga nas acilases tanto do Tipo-IIA como do Tipo-llS. Só eis situações em que a acilase do Tipo11A possui uo grupo Asp ou Glu enquanto as acilasso do Tipo.....

113 apresentam sem qualquer ambiguidade resíduos earre-gadoe muito nonos nogativamonte» se mantêm a posição. A aplicação desta escolha restringe o número ds posições ds aminoácidos. As Figuras 16a o 16b resumem estes resíduos ns coluna con o

titulo 2„

4> Fas.....ss outra escolha deixando de Tora os resíduos ds Gly s de Pro conservados do conjunto tíe aminoácidos escolhido como foi referide anteriormente no

Exemplo 6» Vejam.....ss as Figuras 15a s 15b para o resumo dssts conjunto ris aminoácidos na coluna com o número 3.

5) Pode obter-se ainda um posterior estreitamento dos aminoácidos escolhidos supondo que no Tipo

113 glutaril.....Cef aoilass é monos provável do que os sminoácidcs hitírofóbicos envolvidos na ligação da cadeia • lateral do glutarilo carregado r.egati vamsnte. Portanto» ~ omitem so as posições dentro oas acilases de Tipo 1X3 que contêm resíduos hidrofóticos idênticas cu semelhantes da colecção que ficou depois da operação 4. As Figuras 16a e láb resumem os resultados ns coluna com o título 4.

&) 0 conjunto de resíduos que permanecem contém principalmente resíduos polares ou carregados. Pode fazer-ss ainda uma posterior escolha dos aminoácidos a ser mutados ou capaees de sarem mutados supondo que as posições qus possuem resíduos polares ns Tipo-ÍIA s Tipo-IIB sãc prováveis resíduos superficiais que não sao necsssariamente envolvidos na ligação ccm o substrato. Por conseguinte, asses resíduos foram omitidos na fase 3 nas Figuras 16a e 16b.

7; Na fase 7, escolheram.....se as posições que acomodam resíduos em qus os resíduos desiguais na correspondente posição nas acilases ds Tipo- HA pedem encaixar.....so oiectrostaticamsrto com uma cadeia lateral do glutarilo carregado negativamente. Em particular, sítios que sao hidrofóbicos nas acilases de Tipo.....HA c carregados posi ti vamente nas acilases ds Tipo-IIB foram escolhidos- para mutagéness.

EXWLS....J.

£3ZLSÈaá£lÇ âsJáSLSistemaJ?eçtg^ ^es_de_Acilase

Com o fim de se usar em mutagénsse, dssenvolveu-se o plasmídio pTZ19GL 7A sob a forma ds ADN ds cordão único ds acordo com o fornecedor. Utilizaram.....ss os seguintes oligonucleótidos para introduzir um sítio Ndel (CATATG) no codão ds iniciação ATG

GAG AAG TGT CAG GAT ATG TTT CGC CTG TCA

Para conseguir—se uma mutagdnsse sficien.....

te dirigida para o sitio s para a região, subclonou-sa e fragmento Ndel.....HindlII do mutante resultante em pNoTMde, um derivado do plasmídio pHc-5 íStanssens C22)'. Derivou.....se o plasmídio pMoTNds de ρΜοΞ.....5 HF.....A--0T5ÍS29) per inserção de “TA

um fragmento que codifica o promotor TAS seguida ds um sítio RSS e um sítio ds clonação Ndel (Figura »

Procedendo-se ds maneira semelhante, mu·tagenizou.....se o plasmídio pTZSES.....1 com o seguinte oligonucleótido

ASS TCC ASA SAB CAT ATG ACS

ATS SCS

para criar um sítio Ndel ns posição do codão ds iniciação do gene do aciiaoo. 0 Fragmento Mtísl.....Smal do mutante resultante foi também transferido para o plasmídio pMcTMde, que foi clivado com Ndsl z Smal. Qs plasmídios resultantes, pMoTGL/ANds (Figura 10) a pMcTSE5Nds (Piguraí15, dirigem a sintese da actividade tíe glutaril -Cef acilase· SY.....77 s SE.....S3, respectivamente, sob o controlo do promotor TAS indutivel forte (De Boer (235 5 .

Qs níveis de expressão em E.coli WK6 rm meio de LBC são 2,2 e 12,3 unidades/gramas ds matéria sólida de células, respectivamsnts.

Determinou-se a sequencia da região ds codificação da acilase completa ds plasmídio pMcTSL7ANde. 0 resultado está indicado na Figura 12.

EXEMPLQ 9

Dirigiu.....se o plasmídio pMaTHdeSLTA ccm

Ndel s Ncol. Fez-se um duplex som interrupção ccm pMcTNdeQLTA de cordão único e realizou -ss a mutagénsss enzimática da folga de cordão único como se descreveu (Métodos'. Transformou-so a biblioteca mutante resultante em E„col 1 UL6 Muts e subsequentemente transformou- se cm E.coli HB1-01 e seiaceionou-so em placas mínimas contendo amino-atíipil.....

leucin-a suplementada ccm eS microgramas/mi 1 i 1 itro de cap. Ensaiaram-ss as colónias que são capazes de ss dssenvolverem nestas placas s não em placas mínimas (porque estas eram

rsvsrtentss da leucina) rslativamente à actividade snzimatica sobre Cefalosporins C„ para a mutagéness dirigida para a região, incorporam.....se oligómsros bloqueados que cobrem várias porçães da suburd dade alfa do gene acilase da mesma maneira que se procedeu da acordo com o protocolo dc mufagdnsso dirigida ao sitio ÍGtar.ssens (22)).

Utilizaram.....ss os seguintes oligonucleó.....

tidos som 27 dc contaminação incluída durante a síntese. Caca um dos oligómsros foi concedido para proteger uma mutação silenciosa que permito a discriminação dos plasmídios de tipo natural o mutante com Caso na ocorrência ou desapareci mento dc um sitio dc reconhecimento da enzima ris restrição» Ds resíduos da acilase DY.....77 cobertos pelos respectivos oligonucleótidos são identifiçados dentro de parênteses

AB2237 (resíduos 50-22)

GCCCTGGG7 SCGCGCCTGG GCGCAGCCA7 ASCCS7ASAA GGCTSAGGGC GCGTGTAGGG CGTAGATGTG GGGSACGGCG TAGCCGTCGC ACAG

AB2233 (resíduos Sl-109)

CCA GACGGTCGTD TGTTCGTAAT CCSGTCCCCA G7A7TCGSCC CCGTTGGGGG GGGGTTGTGG ATACACOCCC AGSATATTGT C

AB2234 (resíduo 109-136)

GAATGGG TCGAGGTTGG CGCGGAAATG AGGCGAGTGG TC^GCA^ACC AG7GGTGAGC GCSCTCCGGC ACGGCGTTGS TGAGGAG

AB2235 (resíduo 137-164)

G GCGCCGGAAA GGGGGAGGAG CTGCCGCACG TGGGGCGAGA

TGTCGTCGGC STTCTGCTGC SCATAGSCST TGATSCCCSC TGC

AB2236 (resíduo 165-192)

CGGCG GGTGGCGGTG OCCCABGBTG GGGGCG3GGG ACGCGACATA GAGGAAGTTC ATCAGSCGGT QGGCGTGSGC CACCACGTC

Para cada cligonuclsócio, construiu-se uma biblioteca mutante com > 13^ colónias independentes em

E.coli GAP muts. Estas b i b I í o t o c as f cr am t r an sf c r msoas

E.coli PC2Q51 para escolha em adiei 1.....ssrina s sss E.coli HB131 para escolha cm amino.....atíipil.....leucina. Ac colónias escolhidas por crescimento durante des dias a 30°C foram subsequen.....

temente ensaiadas relativamente à inversão para a prototroíia e para a ligação da capacidade de desenvolvimento e a prsssnça ds plasmídio.

EOcelheram-ss os seguintes mutantes com boa capacidade de dssenvolvimento em adipil.....ssrina

Qligonuclsótido bloqueado

AB 2237

AB

Mutação CDNA)	Mutação Camincáci do)
GTA ..........>	GTA	.......................................... . ........................ VÔ2L
TAT ........>	CAT	71702
GTC —>	GGC	71720
TAT .......>	CAT3	ÍL. 17771
CTC ..........>	ATO	ÍYI78K

Estes plasmídeos utilizados como material de partida para te de mutagênosss usando oligonucleótidos unidade alfa com uma subsequente escolha -adipi 1leucina (construção da biblioteca

mutantes foram ma sério subesquen.....

bloqueados da sub.....

com base cm amino em E^.c.ol.1 HD1G1)..

Ccmo os resíduos 177, 173 e 173 foram identifiçados como sendo cruciais para a especiFicidade do substrato ds SY-77 acilase, pode aplicar- se uma tentativa de mutagénsss aleatória pretendida. Para esta finalidade, sintetizaram.....se os seguintes oligonucleátidos mistos para “mutagé.....

nsss aleatória pretendida 176, 177, 173, 172 e 1S2I

ÍS7

GCC GAG GGT GCG GCC GCG CGA MNN NNN NNN

163

NNN NNN GTT GAT CAG GCG GTG GGC GTG GGC

Pode aplicar-ss a mesma estratégia è re.....

giao 63.....64 com os seguintes oligonucleótidos;

ATA GCC CTA CAA CCC TCA GGG NNN Midi NNN

NNN NNN GAT GTG GGG GAG GGC GTA GGC

Obtiv2ras!-55 bibliotecas mutantes com 18mutantes com cs oligonueleótidos acima mencionados sc 7,........ccl1

HDÍ81 s escolheram.....ss ss placas ccm aminoácidos amino-sdipil-leucina.

Também ss realizou a sutsgênsss aleatória pretendida sobre a mesma molécula duplex ccm interrupção u.....

sande a seguinte oligonucleótido

GGT GCG CGC CTG NNN NNN GCC NNN GCC NNN GAA NNN TCA GGG CGC GTC

Isso teve como resultado s substituição das posições dos aminoácidos 67, 69, 71, 73 a 74 da SY.....77 acilase sm todos os vinte aminoácidos passáveis. Construiu.....sc uma biblioteca mutante ccm 1S^Z mutantes s ssleccicncu-cc cm ciscas com aminc -adipiI.....leucina.

Aplicou-ss uma maneira ds procsdsr ssms.....

lhanta á acima descrita para a subunidade alfa cm regiões ss!sccionadss da subunidade bata ds SY-77 acilase. Com base na comparação das sequências o nos critérios de escolha acima descritos, sscolhsraai-ss as seguintes regiões para a mutagénese ds oligonueleótidos bloqueados com os seguintes oligonucle ó t i d os , r s sp se t i vamer. t a

AS2399 (residuo 253--2775

ATAGTTG2TG GCCCCCACCA TGCCGTTAAC GGTATTGGTG ATGCCCATCC GCTGGTTGAA GSCGAAGCES ATGAC

AD243S (residuo 375.....399

CTCCGC CCCTTTSCGC SCCACGCCST TGAAGCTGTA GTTGATGGTA

CCTTCGCGGT CCGCGTASAC SATGTTGAA

AB24S1 (resíduo 415-442)

ATTGE AATTCTGCAC GAASCCSCCC GAGATGSTCC ASCGGGTGTS TCTCGSTCCA

GSCSGATTGG TGACSCGCGS

CAGGTAAGG

ΑΒ24Θ2 (resíduo 405.....529)

CAGCAS SCGCGCCSCC SCCTGGACCT CGGGATCGGG ATCGATCAGG GCGGGGGSGA TCAGGTCCSG CAAGGTECG

AB2403 (resíduo 668.....6vb>

GTGG GCGGGGGACA CSCSTTCGAT CTSATCQCTS TAGTGCGTCG TGCCGGGGTG CCGAGAGTTC CCGTACCTCA TCAGGGCATA

Com estes oligonucleótidos, obtiveram-se bibliotecas mutantes para as regiões específica- da subunidads bsta e escolheram-se oom base em adipi 1-serina ou am i ηo.....adipil-Isue i na

oligonuclsá-tido AB2433 abrange a região à volta ds Ser674 qus á identificada oom base na comparação da sequência oom, entre outros, A._____faecalis Psn-aci1 ase s SY.....

acilass como um candidato para o resídua de serina cataií.....

tioa» Espora.....se qus as mutações om volta desta região sejam próximas do sítio catalítico que aumenta a possibilidade de uma alteração na especificidade do substrato.

EX£MELa_lâ

EsÊSçr£fcidads Aum^^

Adi pi 1-Serina

Transformaram-se os mutantes num auxotro.....

fro ds serina ds E„ coli o selsccionarsm.....se pela sua capacidade em ss desenvolverem num meio mínimo qus continha adipil.....

serina como única fonte do carbono. As células qus continham SY-77 giutaril -acilass de tipo natural desenvolveram--ss apenas muito pouco neste meio., Não se observaram colónias signi.....

ficativas ao fim de catcrxs dias. Escolheram.....ss as colónias que ss tinham desenvolvido ao fim dos catorcc dias nas placas e verificou.....se que elas não se desenvolviam quando se omite adipil serina nas placas,, Em seguida, isolou-so o plasmídeo ii 1

ds ADN das colónias escolhidas e transformou-se em células ds

E. col i natural.. Verificou.....se que as células transf ormantes ainda ss desenvolviam no meio selectivo contendo adipi1-serins. Obtiveram.....se os seguintes mutantess Vá2L, Y17SH, V179S e LI771 :· Y178H»

Ensaiou-se a ΞΥ--77 glutari 1-aci 1 sss de tipo natural s as SV.....77 glutaril.....acilases mutantos sem glutã.....

ril.....7-ACA, glutaril-leucina e adipil.....ssrina coso substratos.

Seguiu.....ss a hidrólise dos substratos medindo a libertação de

ACA, de louoina ou de ssrina com fluorescamina a 373 nm. Nos ensaias dc actividade cos glutari1-Iaucina s adipil so rina, os mutantes e a enzima do tipo natural foram ensaiados ds acorda com a sua actividade sobro glutaril 7 ACA„ Ao Figu ras 17-19 representam a taxa ds hidrólise com adipi 1 —serina para os mutantes indicados. A hidrólise -foi seguida em função do tempo medindo- o aumento de absorção a 37S nm após reacção da f1uorascsmina som a. sorins libertada. Os mutantes aprsssn.....

tam uma actividade três a cinco veces maior sobre adipil-serins dc que a glutaril.....acilase SY--77 ds tipo natural,. Como a acilase do tipo natural ss desenvolve mais lentamente quando a adipi1-ssrina é a única fonte de carbono, concluiu.....ss que os mutantes EY -77 acilase referidas tâm maior especificidade cobre este substrato,,

Para a glutaril-leucina, seguiu-ss a mes.....

ma maneira de proceder de ensaio que se utiliceu para adipil.....

sorina a fim ds comparar a actividade ds mutantes a ds encimas naturais,. A glutaril.....leucina á um substrato apropriado para ensaiar ss as mutações afectam ou não a especifioidado para a cadeia lateral ds aoilo ou para a cadeia lateral complementar, tal como o agrupamento ds beta.....lactama cu um aminoácido. Ss as mutações afectam a especificidade para a ca.....

doia lateral ds aoilo, então a actividade da glutaril.....acilase natural e da glutari1-aci1 aso mutante provavelmente aprssen.....

tam a mesma tendência para substratos tais como glutaril 7

A3A e glutaril.....Isucina,, Como, nos ensaios, as encimas são co.....

soadas ds acorda com a sua actividade da glutaril 7.....ACA,

2. sso

implica que as actividades sobre glutari1 - -leucina sejam muito semelhantes para as mutantes s para a encima natural. Na realidade, dentro do erro das determinações, todos os mutantes coincidem com a actividade do tipo natural, o que indica que as mutações que atestam a especificidade para a cadeia iate.....

ral ds asilo aumentam mais sspeci-f icamente a especificidade para o agrupamento ds adipilo,.

EXE&Q_Ã1

Realizou.....se a mutagénsse dirigida â regias s aleatória pretendida ds pMcTSESNds depois da criação ds uma molécula duplex com interrupção som a encima EcoRI.

Utilizou-se um oligonuclsõtido “bloqueado” que cobre as posi.....

Ções dos aminoácidos 30 a 5S ds SE-83.

Realizou.....ss a mutagénese TR!Í com o seguinte oligonuelsótido

AAG CCS CTC CTG NMN NNN GAG NNN GCC MíMN CGC NNN ATA NNM ATC GGC CTC GCC

Realisou-ss outra mutagénsse TRN na região homóloga à região 176.....180 de SY-77 acilase,. Utilizou.....

ss o seguinte oliginucleótido misto

CCA GAG CTT GAA CCA GAC CCA MMM NNN WNN NÍMN NÍMN CAG CCG CCG CAT CAC GGC

Criou.....ss uma segunda interrupção oom as enzimas Notl o Smal. Mutagsnisou-se este duplo:: interrompido oom o oligonucleótido bloqueado qus oobro as posições dos aminoácidos 738 a 711, do CE.....83» Realizou.....so a mutagénese TRM som o seguinte oligonueleótido

CAC CAT CGC SCA NNN GCT CCA NNN NNN ATT CTG GTC GGC NNN GTC GGG GCT GGC

Seieooionaram.....se os mutantes sm placas ds agar oom amino-adipil.....louoina ou oom amino adipil.....amida.

EXEMPLO 12

Mutagéness^e^rlass......de...j^„f.aeeaU.l.

Num sabclone pTZlSR do fragmento de

5au3A.....KgaI ds 4 kb do xnssrto pAFl, construiu-se um sistema de Ndel sobre o codão ds iniciação do gene de A. faecalis eom o auxilie do seguinte oligonuclsátido

G GCC TTT GTG GAT ATG TGT CGG TTA TTT TTA

Depois ds digestão eom Hdel do plasmidio mutants resultante, construiu-sa o plasmidio pMaAFnde. Depois da Iinearicação oom BamHI, construiu-se um duplex interrompido oom pMefiFNde ds cordão único. Utilizou.....ss uma região ds cobertura do oligonuoleétido bloqueado 37.....46 para a mutagénese ds região o, dopeis da transferência para E.coli

UK6 liuts s subsequsntemente para E„ coli HB101, escolheu.....ss a biblioteca mutants sm placas mínimas eom Í0 microgramas/mi1i.....

litro ds glutaril.....leucina e 50 microgramas/mi ds agente bloqueants. As colónias que ss desenvolverem nestas placas (e nãc nas placas mínimas) foram ensaiadas reiativaments à sua actividade sobre glutaril.....cefalosporina. Realisoa-se uma experiência semelhante com um oligonucleátido qus cobre a região 51.....72 ds A._„,faagalii..

Peaiisou.....se a mutagénese aleatória pretendida (TRM) sobre a mesma molécula duplex interrompida usando o seguinte oligonucleátido

GAG AGG GTG TTG HUH :ULH2 GGG NrLU ACG URU GGG MtdU ATA LHH GGG ATA GTG GCT

A utilização deste oligonucleátido teve como resultada uma substituição das posições 51. 53, 55, 57, e 60 sa todos os aminoácidos possíveis. Realizou.....se outra

TRM nas rsgiées homólogas ás posições 176-120 do SY-77 acilase eom o seguinte olxgonucleótido misto

TTC CAG ATT GGT GTC GGA HHH HHH NNH HHH MNH CGA CCC CAC CCA CAT CAT

Construiu.....ss uma biblioteca mutante oom

10·' mutantes e seleccionou.....ss am placas ds amimo-adieiI.....

leucina ou glutaril.....leucina.

Em outra experiência, construiu-sa uma muláoula duplex interrompida usando NruI s MluL, Mutsgsnizou.....

ss este duplex interrompido com um oligonucleétido bloqueado¹' que cobre as posições dos aminoácidos 761 a 790.

Escolheu.....ss a biblioteca mutants resultante oom giutarilleucina o amino-adipil-leucina, respectivamente.

EXSMELS.....1Z

Subclonou.....se o inssrto do plasmidio pUMNECÍ no vector pTZÍS utilizando as sítios ds restrição HlndXII s Smal. oom o seguinte oligonucleótido específico, criou-ss um sítio ds Hdsl no codão ds iniciação

TCT ATT TTT CAT ATC ATC CTC TGG CAC

Subclonou.....ss então o gene tíe acilase no plasmidio pMaTEChide usando as enzimas ds restrição NdeX s Smal,. !iutagonizou--se este plasmidio sem um cl igonucleótido “bloqueado que cobre os aminoácidos 53 a 74 do acilase de

E.coli e seleccionou.....se procedendo da mesma maneira qus se rf õp t Γ ™Vãí;..; ΠΟ ΕΞX SiT:p 1 lD ? «

Realizou-se a ΤΠΗ da Psn-acilase de E.soli ccm um oiigonucleótido misto homólogo para ss posições

176.....1C0 de SY 77 acilase.. Empregou-se o seguinte eliqonucleótidoi:

TTG GCT ACT GCT ATC AGA NNN NMN HHH NHN HHH GCT GCG CAC AAA .TAT CAT .··? R

Todas as publicações, incluindo patentes s pedidos de patente mencionadas nesta memória descritiva são indicativas do nível ds conhecimentos dos peritos na assunto a que a invenção sa rsfers. Todas as publicações citadas na presente memória descritiva são incorporadas nela como referência soas sa cada publicação individual ou pedido de patente fossem específicas e individualmente indicadas coco sendo incorporadas como referência.

Muito embora a presente invenção seja descritiva com algum pormenor a título da ilustração e de exemplo para finalidades de clareza facilmente evidente para os peritos da compreensão, é c o m c o n h s c i m s n t o s valsaras sobre o assunto, à luz das indicações referidas na presente memória descritiva, efectuar modificações sem afastamento do espírito ou r si vi nd i caç ões anexas alterações s do âmbito das

Por exemplo.. s evidente que se podem utilizar mutantes escolhidos para uma ronda consecutiva de mutaqéneses com quaisquer dos métodos acima mencionados ou com quaisquer dos oligonucleótidos bloqueados referidos. Também a combinação de dois cu mais oligonucieótidos bloqueados numa única experiência ds mutaqénese se considera como incluída dentre do Smbito da presente invenção,,

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35. Fornsy L.J.. st al. , Appl» Environ» Microbicl»

2556.....2562 (1999)

Claims (2)

1. Prccsssa para a preparação ds mutantes ds beta.....Isctsma-acilases por expressão genética, as quais tem uma sequência de aminoácidos que difere da sequência da £~

   -lactarns.....acilase natural as pelo menos um aminoácidos e se caractcricar por possuírem uma especificidade do substrato alterada, caracterizado por, sm primeiro lugar, ss obter um vector ds expressão que compreende usa sequência ds ADN que codifica a mutante pretendi ca;; se transformar com o referido vector uma estirpe ds microorganismos procariáticos adequada; se efectuar a cultura da estirpe transformada; e se recuperar a encima resultante a partir da biomassa resultante da cul tura.

   ..... 2o Processo de acorde com a reivindicação 1, caracteriçado por compreender efectuar.....se a mutação duma en.....

   cima acilase natural do Tipo.....II s ensaiar.....se a alteração da actividade pretendida na encima resultante da referida mutação.

   - 3s ··

   Processo de acordo com as reivindicaÇSes 1 su 2, caracterizado pelo facto ds a mutação ss efectuar numa ou mais posições das subunidades e e 0 da mencionada acilase.

   ..... 4ã .....

   Processo ds acordo com a reivindicação 3, caracterizado polo facto ds a citada acilase derivar ds » Al ç a I £o ens s... Ji «sç 1.11 .i...

   ..... O Γ:·:::::::: οaaoordo ooo qua.l:: vi ndicapeea anteriores, o ar ao t orí oaoo por oonp; dação duna aoiiaoo natante o-oolhida que pooeu:: :::; o a:::: t i v :L d a d 0 0 r 51 o n d i d a, d o p o0 d o roa i í e a d a a eaÇao do aoordo oom a roi vindi oaÇão 2,.

   ---- cultura da mencionada estirpe hospe.....

   deira por msio da qual ss expressa o citado gene mutante s sa produz uma acilase mutante;

   a identificação ds uma au mais acila.....

   sas mutantes que t§m pelo menos uma alteração ds actividade pretendida para uso em reacções de aci1 ação ou ds desaci1 ação.

   - 10ã ~

   Processo caracterizado por ss obter uma sequência ds ADN que codifica uma acilase mutante somo ss define em qualquer das rei vindicações anteriores.

   - llã Prooesso caracterizada por ss obter um vector de expressão qus compreende uma sequência de ADN quando obtida do acordo com a rei vindicação 10.

   - 121 Processo caracterizado por se obter uma estirpe ds um microorganismo hospedeira modificada com um vector de expressão quando obtido de acordo com a reivindicação 11.

   ·- 131 Processo ds acordo com s rei vindicação 12, caracterizado pelo facto de a estirpe ser o hospedeiro precariótico Eseherlehia^çQli.

   ..... 141 -»

   Prooesso para a realização ds reacções ds aci1 ação ou de dssacilação, caracterizado por ss empregar uma ou mais β-lsctama.....aciIases mutantes quando preparadas pelo processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a v»

   Procssso para a produção ds compostos ds
2. 2.....lactama, oaraoterizado por ss empregar uma ou mais 2-lac.....

   ta.i?.a --aci lasss quando prsparadas psi o processo ds acordo oom qualquer das reivindicaÇães 1 a 9.