PT97985A - Processo para a preparacao de interleucina-4 cristalina - Google Patents

Description

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ANTECEDESTES DO IffVENTO A interleucina-4 derivada da célula T <IL-4) foi originalmente descrita coíbo um factor de murino que pode co-esti-mular a poliferação das células B activadas CHowerd et alM J. Exp. Med. 155:914 <1982)3, Subsequentemente, foi demonstrado que a IL-4 de murino exerce uma série de efeitos biológicos nas células B [Paul et al, , Ann. Eev. Immunol. 5:429 <1987); Boelle et al., Proc. Bati. Acad. Sei. USA 81:6149 <1984); Roehm et al., J, Exp. Med. 160:679 <1984); Vitetta et al,, J, Exp. Med, 162:1726 <1985){ Coffman et al., J. Immunol. 136:4538 <1986);

Coffman et al., J, Immunol, 136:949 <1986)3 e noutros tipos de células que incluem as células T <Mosmann et al., Proc. Bati. Acad, Sei. USA 83:5654 <1986>; Fernandez-Botran et al., J, Bxp. Med. 164:580 <1986); Hu-Li et al,, J. Exp. Med 165:157 <1987); Grabstein et al,, J, Immunol, 139:1148 <1987); Zlotnick et al., Proc. Bati, Acad, Sei, USA 84:3856 <1987)3, as células progenitoras hematopoiéticas ESennick et al., Proc. Bati. Acad. Sei, USA 84:6889 <1987); Peschel et al. , Blood 70:254 <1987)3 e as células de glândulas <Mosmann, acima).

Basiado na homologia com a IL-4 de murino, um cDBA de código humano da interleucina-4 <huIL-4) foi clonado CYokota et al,, Proc. Bati. Acad. Sei, USA 83:5894 <1986)3 e colocado em ambos mamíferos ELe et al., J. Biol, Chem, 263:10817 <1988); Sonoda et al., J. Biotecnhnology 9:61 <1988); Takebe et al,, Mol, Cell Biol. 8:466 <1988)3 e hospedeiros bacterianos Evan Kimmenade et al., Eur, J. Biochem. 173:109 <1988)3. Igualmente a IL-4 de murine, a huIL-4 recombinante <rhuIL-4) é um linfócito pleiotró-pico que actua numa série de tipos de células, Assim, por exemplo, o rhuIL-4 pode induzir a poliferação de ambos linfócitos T e B activados [Spits et al., J. Immunol. 139:1142 <1987); DeFrance et al., J. Immol, 139:1135 <1987)3, aumenta a expressão de - 3 - histocompatibilidade dos antigenes principal da classe lie baixa a afinidade do receptor para o IgB nas células B [Rousset et al,, J. Immunol. 140:2625 <1988)} DeFrance et al,, J. Exp, Med, 165:1459 <1987)3 e induz a produção de IgE e de outras imunoglo-binas [Pene et al,, Proc, ffatl, Acad, Sei, USA 85:6880 <1988)3, A capacidade de rhuíL-4 para a inibição de 1L-4 que depende da poliferação de células leucémicas linfocíticas de origem da célula B, sugeriu uma aplicação clínica em neoplasmas das células B CKarray et al., J, Exp, Med, 168:85 <1988)3, A disponibilidade de quantidades de miligrama de rhuIL-4 purificada facilita a iniciação de estudos da estrutura e as relaçSes função - estrutura da protéina. O presente invento relaciona-se com a descoberta de condiçbes para a produção de rhuIL-4 cristalina, O invento ainda se relaciona com a própria rIiuXL-4 cristalina, Os cristais são adequados para estudos de difraeção de raio X e têm aplicaçães na purificação e na formulação de rhuIL-4.

SUMÁRIO DO INVENTO

No seu aspecto mais amplo o invento relaciona-se com a Interleucina-4 na forma cristalina. 0 invento ainda se relaciona com a interleucina-4 humana na forma cristalina, O invento ainda se relaciona com a interleucina-4 humana que foi produzida por técnicas de DMA recombinante na forma cristalina. O invento ainda se relaciona com a interleucina-4 na forma cristalina que pode estar glicosilada ou não-glicosilada. - 4 - O invento ainda se relaciona com um método para a produção de cristais de interleucina-4, cujo método compreende a cristalização da interleucina-4 a partir de uma solução aquosa de pH 5 - 7 tamponizada, que compreende um sal de citrato ou de sulfato.

DESCRIÇÃO DO INVENTO A interleucina-4 cristalina deste invento é iítil para a ) análise cristalográfica de raio X e para a preparação de composi çães farmacêuticas para o tratamento de qualquer condição médica susceptlvel de tratamento por interleucina-4.

Para ilustração da prática do presente invento, a forma matura de huIL-4 foi derivada de E. coli. Outros IL-4 assim como outras formas de rivuIL-4 podem ser identicamente utilizadas. A purificação de rhuIL-4 a partir do sobrenadante de células foi obtida por métodos oromatográficos convencionais (Le et al., acima). Experiências de difusão de gota de vapor suspensa foram realizadas em pratos de cultura de tecidos de 24 de fundo <Hulti-fundo, Becton Dickenson 8t Co, Lincoln Parle, MJ). Gotas <6 juL) que contêm 20 rog/ml de huIL-4, 15 - 20 % de sulfato de amónio satura-^ do, fosfato de sódio a 40 mM, pH 6,0 - 7,0, foram suspensas em tiras de cobertura siliconizadas invertidas em pratos de cultura de tecidos de 24 de fundo. Estas gotas foram equilibradas a 12 ou a 22°C contra 1 ml de 30 - 40 % de sulfato de amónio saturado, fosfato de sódio 40 mM, a pH 6,0 - 7,0, A incubação a temperatura controlada foi realizada em câmaras ambientais SEVCO pré-coloca-das a 12° ou a 22°C. A concentração de rhuIL-4 em vários tampSes foi determinada espectrofotometricaraente usando um coeficiente de extinção de 0,57/cm/mg/ml aos 278 nm, Electroforese em gel de - 5 - policrilamida de dodecilsulfato de sódio <SDS-PAGE) foi realizada de acordo com o método de Laemmli [Sature 227;630 <1970)3, CLAR de fase invertida foi realizada numa coluna Rainim C4 <4,6 x 250 nmj Dynamax, 300 Angstrom) desenvolvida com um gradiente linear de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,1 %, A determinação da actividade de poliferização das células T usando linfócitos de sangue periférico humano foi realizada como descrito previamente <Yokota et al,, acima). Para estudos de raio X, grandes cristais tetragonais foram montados em capilares de vidro e fotografados com uma câmara de precisão aos 22°C, usando radiação CuKa de um ânodo de rotação Rigaku RD-3GQ, Dados originais completos foram recolhidos num detector de área Sicolet X-1Q0A, usando a mesma fonte de radiação,

Como indicado previamente, para fins de ilustrração, a interleucina-4 humana cristalina descrita neste invento é inter-leucina-4 humana recombinante derivada de 1, coli, A estrutura primária da proteína é ; 5 10 15 20 25 30 1 H K C D I T LQB I I K T L V S L T B Q K T L C T E L T V T 31 D I F A A S X H T T 1 K B T F C R A A T V L R Q F Y S H H E 61 K D T 1 C li G A T A Q Q F H R H K Q L I R F L K R L D R H L 91 V G L A G L N S c P V K E A N Q S T L E N F L E R L K T I H 121 R E K Y S K C S s

Usando sulfato de amónio como agente precipitante, rhulL-4 foi cristalizado em agulhas e em grandes cristais tetragonais. A cristalização pode ser melhor conseguida em tampão de fosfato de sódio 40 mH, pH 6,0, que contém 34 % de sulfato de amónio, depois de 21 dias de incubação aos 12°C, Os cristais tetragonais têm sido observados em fosfato de sódio a valores de - 6 -

pH desde 5,0 a 7,0 e a concentraçóes de sulfato de amónio na gama desde 30 a 40 % da saturação, A cristalização é realizada a uma gama de pH de 5 a 7, preferencialmente de 5,5 a 6,5 e mais preferencialmente a cerca de pH 5,0, A temperatura pode rondar desde os 5 aos 25°C, preferencialmente desde os 12 aos 22°C e mais preferencialmente os 12°C. A concentração de protéina no equilíbrio deve ser desde cerca de 5 a 60 mg/ml, preferencialmente de 30 a 50 mg/ml e mais preferencialmente a cerca de 40 mg/ml. O período de incubação aos 12°C até os 22°C pode variar desde 2 a 20 dias, ê de anticipar que os métodos de cristalização descritos aqui também são úteis para cristalização de derivados de rhuIL-4 a partir de outras células hospedeiras <e,g, células de mamíferos era cultura, levedura, insectos e outras) ou de huíL-4 derivado de fontes naturais <e.g. linfõcitos do sangue periférico humano ou linhas de células humanas constitutivamente produzindo huIL-4). é também de antecipar que o método será aplicável a homólogos de protéinas de interleucina 4 derivado de outras espécies. A rhuIL-4 cristalina a partir de gotas suspensas foi isolada e lavada totalmente em sulfato de amónio a 55 %, tampão de fosfato de sódio 40 mM, pH 6,6 â temperatura ambiente <22 - 25°C). Depois de redissolução em tampão de fosfato de sódio 20 raM, pH 7,4, com cloreto de sódio 0,15 M, os cristais exibiram 7 actividade de poliferação de células T <2,0 x 10 unidades/g) que foi idêntica â da amostra de rhuIL-4 de controle que foi cristalizada, Quando sujeita a SDS-PAGE, a migração electroforética dos cristais de rhuIL-4 redissolvidos foi idêntica ã da amostra de controle. Identicamente, o modelo de eluição de CLAR de fase invertida dos cristais redissolvidos foi indistinta do modelo de 7 - eluição da amostra de controle, Sfenhuma degradação de protéina foi aparente como um resultado do período longo de incubação, aos 22°C, Mais importante, o processo de cristalização seguido por redissolução em tampão fisiológico falhou na inactivação da actividade de poliferização de células T de rhuIL-4,

Os dados de difracção de raio X foram inicialmente recolhidos a uma resolução de 2,7 A usando o detector de área. Franjas de oscilação cobriram 0,25 e foram medidas durante 10 minutos, A indiciação e a integração dos dados foram realizados usando os programas de processamento XESOEIF CHoward et al,, J, Appl, Crystallogr, 20;383 (1987)3. Os dados indiciados no sistema tetragonal foram com a = 92,1 (2), b = 92,1 (7) e ç = 46,5 <1> A, O grupo de espaço é ou ^2^2 ou F432.j2,

Fotografias de precisão de raio X subsequentes de interleueina-4 confirmam o grupo de espaço e ou os parâmetros de células unitárias. Os cristais tetragonais são estáveis ao raio X e difractara à temperatura ambiente, durante pelo menos cinco dias e difractam pelo menos a uma resolução de 2,7 A. A cristalização em grande escala pode ser conseguida por métodos equivalentes a difusão a vapor, nomeadamente, diálise e ultrafiltração. Cristais de semente obtidos a partir da experiência de gota suspensa, podem ser usados para acelerar a cristalização em grande escala desde que as condiçóes óptimas tenham sido estabelecidas. Embora a utilização de sulfato de amónio como um agente precipitante seja preferido, pode ser substituído por outros sais de citrato e de sulfato como sulfato de sódio, potássio, cálcio ou de magnésio? citrato de sódio, e outros <McPherson, Preparation and Analysis of Protein Cristais, 1982, Jonh Wiley Sr Sons, JFew York, Kew York>. Cristalização em larga escala de rhuIL-4 pode ser introduzida como um passo de 8 purificação final e/ou passo de concentração na manufactura clínica. Armazenamento de longa duração da droga em massa rhuIL-4 numa forma cristalina é também altamente desejável, devido à estabilidade inerente dos cristais, quando comparada com rhuIL-4 armazenada numa solução com conservantes.

Os cristais preparados pelo método descrito também constituem uma forma particularmente vantajosa para preparação da forma de dosagem farmacêutica. Os cristais podem ser usados, por exemplo, como uma base para uma formulação de libertação retardada de rhuIL-4 in vivo. Acredita-se que complexos de metais <e.g. zinco ou ferro) e de huíL-4 possam ser formados e depois subsequentemente cristalizados. Cristais destes complexos podem também ser usados em formulaçães de protéina de libertação retardada que contêm aditivos farmnacêuticos apropriados. Exemplos de formula-çães de protéina de libertação retardada idênticas são complexos cristalinos de zinco - insulina <Eemíngton*s Pharmaceutical ♦Sciences, 1985, Gennaro, A.R., Ed, , Macfc Publishing Co. , Fasten, Pennsylvania, pp 974 - 976) e o complexo cristalino zinco insulina - protamina (Pharmaceutical Kanufacturing Encyclopedia, 1989, Sittig, X., Ed., pp, 820 - 821).

Composiçães farmacêuticas de libertação retardada que compreendem a interleucina-4 cristalina do invento podem ser preparadas por mistura desta interleucina-4 com um agente de coraplexação de metal e/ou de protéina, como descrito acima.

Claims (1)

1. 9 - ι 9 - ι

   REIVIMDICAC5BS 1®. - Método para a produção de interleucina-4, earac-terizado por compreender a Incubação de interleucina-4 numa solução aquosa tamponada a pH 5-7 que compreende um sal sulfato ou citrato, durante um tempo suficiente de modo a permitir a formação de cristais de interleucina-4, 2â, - Método de acordo com reivindicação 1, caracterizado por os cristais de interleucina-4 produzidos serem cristais de interleucina-4 humana, 3â. - Método de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por os cristais de lnterleucina-4 produzidos serem cristais de interleucina-4 que é produzida através de técnicas de ADN recombinante, 4£. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os cristais de interleucina-4 produzidos serem cristais de interleucina-4 que ê não glicosi-lada. 5Ô. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por os cristais de interleucina-4 produzidos serem cristais de interleucina-4 que é srlicosilada, 6&. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por os cristais de interleucina-4 produzidos serem cristais de interleucina-4 que é produzida por E, coli, 10 - 7ã, - Método de acordo cora qualquer uma das reivindicações la 4, caracterizado por a solução tamponada compreender sulfato de araônio a pH 6,0, 8ã. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica compreendendo interleucina-4 na forma cristalina, complexada com um metal e/ou um agente de complexação de proteína, caracterizado por compreender a mistura de interleucina-4 na forma cristalina com um metal e/ou um agente de complexação de proteína. 9ã. - Método para o tratamento de um indivíduo que tenha uma condição médica susceptível de tratamento cora a inter-leuclna-4, caracterizado por compreender a administração a esse indivíduo de uma quantidade eficaz de interleucina-4 na forma cristalina, Lisboa, 14 de Junho de 1991

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOfl CORDON, 10-A 3.» 1200 LISBOA