JPH05507707A - 結晶性インターロイキン―４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 結晶性インターロイキン−４ 念盟Ω互量 ＴＡ［ｌＩ胞由来インターロイキン（Ｉ　Ｌ−４）は、活性化したＢ、［胞の増 殖を同時刺激することができるネズミ因子として最初に記載された［ハワード（ Ｈｏｗａｒｄ）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１５’５　：　９１４　（１９８２） １．ｅいて、ネズミＩＬ−４は、Ｂ＠胞；ボール（Ｐａｕｌ）ら、Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ。

Ｔｍｍｕｎｏｌ、５：４２９　（１９８７）；ノエレ（Ｎｏｅｌｌｅ）ら、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、じＳＡ　８１．：６１４９　（１９８４） ；レーム（Ｒｏｅｈｍ）ら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６０：６７９　（１９８４ ）；ヴイテッタ（Ｖｉｔｅｔｔａｌら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６２：１７２６ 　（１９８５）；コツマン（Ｃｏｆｆｍａｎ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｉ３６ ：４５３８　（１９８６）：：ｙフマンら、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１３６：９４ ９（１９８６）コ並びにＴＩＩ胞〔モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎｌら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ　ＩＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：　５６５４　（１９８６）：フェ ルナンデツ・ホトラン（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｔｒａｎ）ら、Ｊ、Ｅｘ　、 Ｍｅｄ、１６４：５８０　＜１９８６）；ツー・す（Ｈｕ−Ｌｉ）ら、Ｊ、Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、１６ヲ：Ｌ５７　（１９８７）；グラブスタイン（Ｇｒａｂｓｔｅ 　ｉｎ）ら、１−Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３９：１１４８（１９８７）；ツロトニソ ク（Ｚｌｏｔｎｉｃｋ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳ Ａベシェル（Ｐｅｓｃｈｅｌ）ら、ＢＩｏｏ、ｄ、ヱ旦：２５４　（１９８７１ ；および肥満細胞（モスマン、上記）を含む他の細胞種に対して種々の生物学的 作用をすることかできるということが実証された。

ネズミＩ　Ｌ−４との相同性に基づいて、ｃＤＮ、Ａコードヒトインターロイキ ン−４（ｈｕＩＬ　４）はクローン化されこヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、Ｐｒｏ ｃ。

Ｎａｔ　１．、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８３　二５８９４　（１９８６） ］、そして補補動動物’Ｊ−（Ｌｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、２６３　 ：１０８１７　（１９８８）：ソノダ（Ｓｏｎｏｄａ）ら、Ｊ、Ｂユｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏ　、９：６１　（１９８８）；タゲベ（Ｔａｋｅｂｅｌら、Ｍｏ１１． Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

旦：４６６　（１９８８）”＋および細菌［ヴアン・キメナーデ（ｖａｎＫｉｍ ｍｅｎａｄｅ）ら、Ｅｕｒ、、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３：１０９　（１９８ ８）：宿主双方において発現された。ネズミＩＬ−４と同様に、組換え体ｈｕＩ Ｌ−４（ｒｈｕＩＬ−４）は、種々の細胞種に対して作用する多面的リンホカイ ンである。したかって、例えば、ｒｈｕＩＬ−４は、活性化ＴおよびＢ双方のリ ンパ球の増殖を誘導することかできこスピンッ（Ｓｐｉｔｓ）ら、二Ｉｍｍｕｒ ＋ｏ１．１３９：１１４２　（１９８７）：デ・フランス（ＤｅＦｒａｎｃｅｌ ら、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１３９：１１３５（１９８７）ｒ、ｓＭＥ胞て′のク ラスＴＴ主要組織適合性抗原およびＩｇＥに対する低親和性受容体の発現を増大 させることができ３ルーセｙト（Ｒｏｕｓｓｅｔ）ら、Ｊ工Ｉｍｍｕｎｏ１．１ ４０：２６２５　（１９８８）；デ・フランスら、Ｊ、旦ΔエエＭｅｄ、１６’ ５：１４５９（１９８７）３．そしてＩｇＥおよび他の免疫グロブリンの産生を 誘導することかできる〔ペン（Ｐｅｎｅ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：６８８０　（１９８８）：、Ｂ、ＩＢ胞起源 の慢性リンパ性白血＠細胞のＩＬ−２依存増殖を阻害するｒｈｕＩＬ−４の能力 は、Ｂ細胞新生物における臨床的用途を示唆したこカレイ（Ｋａｒｒａｙ）ら、 Ｊ。

Ｅｘ　、Ｍｅｄ、１６８：８５　（１９８８＞　Ｅ。

ミリグラム量の精製ｒｈｕＩＬ−４の入手可能性は、タンパク質の構造および横 遣−機能関係についての研究の開始を容易にした０本発明は、結晶性ｒｈｕ　Ｉ Ｌ−４を製造するための条件の知見に関する。更に、本発明は、結晶性ｒｈｕ　 ＩＬ−４自体に関する。結晶はＸ線回折研究に適当であつ且つｒｈｕｌＬ−４の 精製および処方における用途を有する。

ユ里Ω！致 最も広範ｆ：悪態様おいて、本発明は、結晶形のインターロイキン−４に関する 。

更に、本発明は、結晶形のヒトインターロイキン−４に間する。

更に、本発明は、組換えＤＮＡ技術によって製造された結晶形のヒトインターロ イキン−４に関する。

更に、本発明は、グリコジル化または非グリコジル化することかて゛きる結晶形 のインターロイキン−４に関する。

更に、本発明は、硫酸塩またはクエン酸塩を含む＃ｌ！衝されｆ、−ｐＨ５〜７ の水ン８液からインターロイキン−４を結晶化することを含む、インターロイキ ン−４の結晶を製造する方法に関する６ 魚咀Ｏ紅頻皇説朋 本発明の結晶性インターロイキン−４は、Ｘ線結晶学的分析におよびインターロ イキン−４による処置に感受性の任意の医学的症状を治療するための薬剤組成物 の製造に有用である。

本発明の実施を例証するために、ｈｕＩＬ−４の成熟形態を大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｔ）において発現させた。他のＩＬ−４並びに池の形態のｒｈｕＩＬ−４ も同様に用いることができる。１！ｉｌ胞上澄み液からのｒｈｕＩＬ−４の精製 は、慣用的なりロフトグラフ法（ツーら、上記）によって行われた。懸涌基気拡 散実験を２４−ウェル組織培養プレート（マルチウェル（Ｍｕｌｔｉｗｅ！　ｌ ）、ベクトン・ティゲンソン・アンド・カンパニー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅ ｎｓｏｎ＆Ｃｏ、）、リンカーン・パーク、ＮＪ）中で実施した。ｈｕｌＬ−４ を２０ｍｇ／ｍｌ、１５〜２０％飽和ａＢアンモニウム、４０　ｍ　Ｍリン酸ナ トリウム、ｐＨ６，０〜７．０を含む小滴（６μし）を、２４−ウェル組織培養 プレート中に伏せたシリコーン処理したカバーグラスから滴らせた。これらの小 滴を、３０〜４０％飽和砒酸アンモニウム、４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６ ，０〜７．０の１ｍｌに対して１２°Ｃかまたは２２℃で平衡にした。温度制御 されたインキュベーションを、１２℃または２２℃に設定したＲＥＶＣＯ環境室 中で実施した。

各種緩衝液中のｒｈｕｌＬ　４の４度を、吸光係数０．５７／ｃｍ／ｍｇｚ’１ ０！を用いて２７８ｎｍで分光光度分析によって決定した。ドデシル硫酸ナトリ ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞を、レムリ（Ｌａｅ ｍｍｌ　ｉ）　「Ｎａｔｕｒｅ、２２ヱ：　６８０　（１９７０＞　］の方法に したがって実施した。逆相高速潅木りロマトクラフィー念、０．１％トリフルオ ロ酢酸中のアセトニトリルの直線勾配を用いて展開したレイニン（Ｒａｉｎｉｎ ）Ｃ４カラム（４，６ｘ２５０ｎｍ：ダイナマクス（Ｄｙｎａｍａｘ）、３００ ７ｒングストローム）上で実施した。ヒト末梢血液リンパ球を用いるＴ細胞増殖 活性の決定を、前記に記載したように（ヨコタら、上記）実施した。Ｘ線研究に 対して、大型の正方晶系結晶をガラス毛管中に固定し且っりカフ（Ｒｉｇａｋｕ ）ＲＵ−３００回転陽極からのＣｕＫα放射線を用いて２２゛ｃてブレセツショ ンカメラによって撮影した。完全な未処理データセットを、同一の放射線源を用 いてニコレット（Ｎｉｃｏｌｅｔ）Ｘ　１００Ａ面積検出器で集めた。

前述のように、例示の目的のために、本発明において記載した結晶性ヒトインタ ーロイキン−４は大腸菌由来の組換え体ヒトインターロイキン−４である。そめ タンパク質の一次横遺は以Ｆである。

５　１０　１５　２０　！　３０ １　ＨＫＣＤｒＴＬＱＥ　（ｆＫＴＬＮ５ＬＴＥＱＫＴＬＣ置ＴＶ　Ｔ３１　Ｄ Ｉ　ＦＡＡＳＫＮＴＴＥＫＥＴＦＣＲＡＡＴＶＬＲＱＰＹＳＨＨＥ’６１　ＫＤ ＴＲＣＬＧＡＴＡＱＱＦＨＲＨＫＱＬＩＲＦＬＫＲＬＤＲＮＬ９１　ｗｃＬＡｃ ｔ、ｒｖｓｃｒｖｃ＋＝ＡＮｑｓＴｔｔＮｒｔ、ｇｉｔ、ｘＴｉ　Ｍ１２！　Ｒ Ｅ　）ＣＹ　５　Ｋ　Ｃ５Ｓ硫酸アンモニウムを沈殿剤として用いて、ｒｈｕＩ Ｌ　４を針、ａ′結晶および大型の正方品系結晶に結晶ｊヒした。結晶化は、３ ４％隨敢アンモニウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウムｍ＆ｒＨ１ＰＨ６υ中に おいて１２°Ｃて゛２１日間のインキ、・Ｊベーション晟に最もよく達成するこ とができる。更に、正方晶系結晶は、リン酸ナトリウム中において５０〜７．０ の範囲のｐＨ鎖でおよび３０〜４ｏ０６飽和の範囲の隨酸アンモニウム′ａ度で 観察された。

結晶化をＰＨ範囲５〜７、好ましくは、５．５〜６．５で、そしてＩ＆ら好まし くは、約ＰＨ６，０で実施する。温度は約５〜２５℃、好ましくは、１２〜２２ ℃であることができ、そして最も好ましくは、約１２°Ｃである。平衡でのタン パク質濃度は約５〜６０ｍｇ／ｍ＋−好ましくは、３０〜５０ｍｇ／ｍ１、そし て最も好ましくは、約４０ｍｇ／ｍｌでなければならない。

１２℃〜２２°Ｃでのインキュベーション時間は２〜２０日であることができる 。

本明細書中に記載した結晶化方法は、他の宿主細胞（例えば、培養物中の哺乳動 物細胞、酵母、昆虫およびその他）由来のｒｈｕＩＬ−４または天然源（例えば 、ヒト末梢血液リンパ球またはｈｕＩＬ−４ヒトを構成的に産生ずる４８１胞系 ）由来のｈｕＩＬ−４の結晶化にも有用であると考えられる。更に、その方法は 、池の種由来の相同インターロイキン４タンパク質に応用できると考えられる。

懇情からの結晶性ｒｈｕＩＬ−４を単離し且つ５５％硫酸アンモニウム、４０ｍ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，６中において周囲温度（２２〜２５℃）で 完全に洗浄した。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４中に０．１５Ｍ 塩化ナトリウムと一緒に再溶解した後、結晶は、結晶化されなかった対照ｒｈｕ ＩＬ−４試料の場合と同一であるＴ細胞増殖活性（２，０×１０７単位／ｍｇ） を示した。５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った場合、再溶解したｒｈｕＩＬ−４結晶の電 気泳動は対照試料の場合と同一であった。同様に、再溶解した結晶の逆相高運液 体クロマトグラフィー溶離パターン対照試料の溶離パターンと区別できなかった 。

２２℃で長時間のインキュベーションの結果としてのタンパク質分解は見られな かった。更に重要なことに、結晶化に続いて生理的緩衝液中に再溶解する方法は 、ｒｈｕｌＬ−４のＴＡｌ［ｌ胞増殖活性を失活させなかった。

Ｘ線回折データは、面積検出器を用いて最初に２．７人分解能に集めた。振動フ レームを０．２５にし且つ１０分間測定した０強度データの指数表示および積分 は、ＸＥＮＧＥＮ処理プログラム［ハワードら、Ｊ、Ａｐｐｌ。

Ｃｒｙｓｔａｌｌｏ　ｒ、２０：３８３（１９８７）］を用いて行った。データ は、ａ＝９２．１　（２＞−ｂ＝９２．１　（７）およびｃ＝４６．５　（１） 人によって正方晶系を示した６中間群はＰ２２かまたはＰ４３２□２である。

インターロイキン−４についての次のＸ線プレセツション写真は、空間群および 単位格子パラメーターを確証した。正方晶系結晶はＸ線に適当であり、そして室 温で少なくとも５日間回折し且つ少なくとも２．７人分解ｅ、まで回折する。

大規模な結晶化は、蒸気拡散と同等の方法、すなわち、透析および限外濾過によ って達成することができる。懇情実験がら得られた種結晶を用いて、いっなんｆ ｋＷｉ条件が確立されれば大規模な結晶化を促進することができる。Ｐ＆酸アン モニウムを沈殿剤として用いることは好ましいが、それは池の一般的な硫酸塩お よびクエン酸塩、例えば、硫酸ナトリウム、砒酸カリウム、砒酸カルシウムまた は硫酸マグネシウム：クエン酸ナトリウムおよびその他で置き換えることができ る（マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｓ、１９８２．　ジ ョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、ニ ューヨーク州、ニューヨーク）、ｒｈｕｌＬ−４の大規模な結晶化は最終精製工 程および／または濃縮工程として臨床用製造法に導入することができる。更に、 結晶形のｒｈｕＩＬ−４原薬剤の長期間貯蔵は、結晶の固有の安定性ゆえに、溶 液中に防腐剤と一緒に貯蔵されたｒｈｕｌＬ−４と比較して極めて望ましい。

記載した方法によって製造された結晶は、更に、医薬品列形製造に特に好都合な 形態を構成する０例えば、結晶は、インビボでのｒｈｕＩＬ−４の徐放性処方の ための基準として用いることができる。金属（例えば、亜鉛または鉄）およびｈ ｕＩＬ−４の錯体を生成した後、引き続き結晶化することができると考えられる 。これらの錯体の結晶は、更に、適当な医薬品添加物を含む徐放性タンパク質製 剤で用いることができる。同様の徐放性タンパク質製剤の例は、亜鉛−インスリ ン結晶性錯体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉ ｅｎｃｅｓ、１９８う、ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）、Ａ、Ｒ，監修、マンク・ パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）、フ ァースン・ペンシルバニア州、９７４〜９７６頁）および亜鉛−インスリンーグ ロタミン結晶性銘体（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ　ｉ　ｃａ　ＩＭａｎｕｆａｃｔｕ ｒｉｎｇ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ、１９８９．スイティソク（Ｓｉｔｔｉｇ ）、：Ｖｌ、監修、８２０〜８２１頁）である。

本発明の結晶性インターロイキン−４を含む徐放性薬剤組成物は、前記に記載し たように、この種のインターロイキン−４を金属および／またはタンパク質釦生 成剤（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）と−緒に混合することによって製造 することかできる。

要約書 組換え体ヒトインターロイキン−４（ｒｈｕＩＬ　４）を、硫酸塩またはクエン 酸塩を含む溶液から結晶化する方法を記載する。結晶形はＸ線回折に適当であり 且つ精製、処方および製造を含むいくつかの薬剤処理において広範な用途を有す る。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年１２月１５日 特許庁長官　府中　渡　殿　Ｉ−Ｆ ｌ、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０４０４５ ２、発明の名称 結晶性インターロイキン−４ ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国ニューシャーシー州０７０３３゜テニルワース。ギヤロ ッピング・ヒル・σ−ド　２０００名　称　シエリング・コーポレーション４、 代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話　３２７０−６６４１〜６６４６ 氏名（２７７０）弁理士場浅恭三戸−′５、補正書の提出日 （３４条補正） （英文請求の範囲第７〜８頁の補正） ［原請求の範囲を下記の新請求の範囲に全面差し換え］請求の範囲 １、　インターロイキン−４の正方晶系結晶を含んで成る結晶性インターロイキ ン−４゜ ２、　インターロイキン−４の正方晶系結晶か該Ｘ線を少なくとも２．７人まで 回折する請求項４に記載の結晶性インターロイキン−４゜３、　ヒトインターロ イキン−４である請求項１または２に記載の結晶性インターロイキン〜４４ ４、　組換えＤＮＡ技術によって製造される請求項１〜３に記載の結晶性インタ ーロイキン−４゜ ５、　非グリコジル化されている請求項１〜４に記載の結晶性インターロイキン −４゜ ６、　グリコジル化されている請求項１〜４に記載の結晶性インターロイキン− ４゜ ７、　大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）において生産される請求項５に記載の結晶性イン ターロイキン−４゜ ８、　インターロイキン−４を、ｖＡ酸塩またはクエン酸塩を含み且つインター ロイキン−４の濃度が水溶液１ミリリットル当りインターロイキン−４を約５〜 ６０ミリグラムの平衡状態にあるＭ街されたｐＨ５〜７の水溶液中においてイン ターロイキン−４の結晶を生じさせるのに十分な時間インキュベートすることを 含む、インターロイキン−４の結晶を製造する方法。

９、［新液がｐＨ６，０′″Ｃ′硫酸アンモニウムを含む請求項８に記載の方法 。

１０、インターロイキン−４の濃度が３０〜５０ｍｇ／ｍ＋である請求項８に記 載の方法。

１１、インターロイキン−４の濃度が４０ｍｇ／ｍｌである請求項８に記載の方 法。

１２、ＩＬ−４を約１２℃の温度でインキュベートすることを更に含む請求項８ に記載の方法。

１３、請求項８〜１２に記載の方法によって製造される結晶性インターロイキン −４゜ １４、金属および／またはタンパク質錯生成剤と一緒に錯体生成した請求項１〜 ７および請求項１３いずれか１項に記載の結晶形のインターロイキン−４を含む 薬剤組成物。

１５、結晶形のインターロイキン−４を金属および／またはタンパク質錯生成剤 と一緒に混合することを含む請求項１４に記載の薬剤組成物を製造する方法。

１６、インターロイキン−４による処置に対して感受性の医学的症状を治療する ための薬剤組成物の製造に対する請求項１〜７および請求項１３のいずれか１項 に記載の結晶形のインターロイキン−４の使用。

１７、インターロイキン−４による処置に対して感受性の医学的症状を治療する ための請求項１〜７および請求項１３のいずれか１項に記載の結晶形のインター ロイキン−４の使用。

１８、インターロイキン−４による処置に対して感受性の医学的症状を有する患 者に対して請求項１〜７および請求項１３のいずれか１項に記載の結晶形のイン ターロイキン−４の有効量を投与することを含む、該患者を？ｔ３１！する方法 。

手続補正書 平成　４年１２月１５日　−１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．結晶形のインターロイキン−４。
2. ２．ヒトインターロイキン−４である請求項１に記載のインターロイキン−４。
3. ３．組換えＤＮＡ技術によって製造される請求項１または２のいずれかに記載の インターロイキン−４。
4. ４．非グリコシル化されている請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターロ イキン−４。
5. ５．グリコシル化されている請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターロイ キン−４。
6. ６．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において生産される請求項２に記載のインターロイ キン−４。
7. ７．インターロイキン−４を、硫酸塩またはクエン酸塩を含む緩衝されたｐＨ５ 〜７の水溶液中においてインターロイキン−４の結晶を生じさせるのに十分な時 間インキュベートすることを含む、インターロイキン−４の結晶を製造する方法 。
8. ８．緩衝液がｐＨ６．０で硫酸アンモニウムを含む請求項７に記載の方法。
9. ９．金属および／またはタンパク質錯生成剤と一緒に錯体生成した請求項１〜６ いずれか１項に記載の結晶形のインターロイキン−４を含む薬剤組成物。
10. １０．結晶形のインターロイキン−４を金属および／またはタンパク質錯生成剤 と一緒に混合することを含む請求項９に記載の薬剤組成物を製造する方法。
11. １１．インターロイキン−４による処置に対して感受性の医学的症状を治療する ための薬剤組成物の製造に対する請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶形の インターロイキン−４の使用。
12. １２．インターロイキン−４による処置に対して感受性の医学的症状を治療する ための請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶形のインターロイキン−４の使 用。
13. １３．インターロイキン−４による処置に対して感受性の医学的症状を有する患 者に対して請求項１〜６のいずれか１項に記載の結晶形のインターロイキン−４ の有効量を投与することを含む、該患者を治療する方法。