RO127465A2 - Complecşi metalici ai clorhexidinei şi procedeu de obţinere a acestora - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie se referă la compuşi complecşi metalici ai clorhexidinei, cu acţiune dezinfectantă, şi la un procedeu de obţinere a acestora. Compuşii sunt complecşii metalici ai clorhexidinei sau ai sărurilor sale cu Cu(II) sau Zn(II) şi/sau Ag(I), sub formă de pulberi microcristaline stabile, intens colorate, cu puncte de topire cuprinse între 100 şi 230°C (descompunere). Procedeul de obţinere a compuşilor complecşi metalici constă din următoarele etape: solubilizarea în alcool etilic a clorhexidinei, respectiv, a sărurilor acesteia, ajustareaH-ului la 6,5 şi aducerea în soluţie a sărurilor metalice, în raport molar de amestec metal:clorhexidină de 2:1 şi 1:1, iar în cazul complecşilor cu ioni metalici, în rapoarte molare metal 1:metal 2:clorhexidină de 1:1:1, amestecarea soluţiilor de reactanţi cu agitare la 40...50°C, concentrarea soluţiei, filtrarea şi spălarea precipitatului cu alcool etilic, şi uscarea compusului.

Description

DESCRIEREA INVENȚIEI

OFICIUL DE STÂtpE^TrÎi INVENȚII Și MĂRClI

Cerere de brevet de invenție

Nr.

[ Data depozit

Din cercetările de dată recentă se semnalează pe lista agenților antimicrobieni frecvent comercializați ca principali ingredient! activi, alături de alcooli, iod, iodoform, hexaclorofen și clorhexidina (notație CHX).

CHX este activă împotriva bacteriilor Gram pozitive și mai puțin activă împotriva bacteriilor Gram negative, fungi și specii de Proteus', are activitate numai împotriva unor tipuri de virusuri (hepatită, herpes simplex, HIV, citomegalovirus și virus respirator).

CHX manifestă activitate redusă împotriva micobacteriilor și nulă pentru endospori și chisturi ale protozoarelor.

CHX acționează asupra membranei celulare provocând distrugerea acesteia și pierderea materialului intracelular și produce inhibiția respiratorie și coagularea citoplasmatică.

Clorhexidina este o baza tare cu solubilitate redusă in apa. Sărurile acesteia, in special cele cu acidul gluconic și cu acetul acetic sunt solubile in apă (CHX-digluconat 20g/100 mL, CHX-acetat 1.9 g/l 00 mL) [US 2006/0051385 Al].

In ceea ce privește natura ionilor metalici utilizați drept centre de coordinare, un număr important de studii vizează complecși ai metalelor cu relevanță biologică semnificativă, cum sunt zincul, cuprul și argintul. Dintre acțiunile biologice specifice acestor ioni metalici, interesul maxim a fost suscitat de activitatea antimicrobiană și cicatrizantă a acestora [Bryan Greener, Antimicrobial biguanide metal complexes, J. Pharmaceutical Sciences, 69(2), 215-217, 2006], [Farrigton, K. L., Morrow, L.E., Antimicrobial Metals: A Nonantibiotic Approach to Nosocomial Infections - Silver and copper may prove key in preventing a problem that kills nearly 88.000 per year, 2005, www.rxmed.com/monographs]. Este cunoscută combinația complexă a Ag(I) cu sulfodiazina, polimer de coordinație in care ionul Ag⁺ este pentacoordinat, un agent antibacterian mult mai eficient comparativ cu ligandul liber, împotriva unor tulpini bacteriene cum ar fi Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus [US 20030035848 Al/2003], [US 2002/0072480 Al],

Capacitatea antibacteriană a ionilor de argint este corelată cu starea de oxidare și este dovedit faptul ca ionii de argint in stări de oxidare II și III au o acțiune antibacteriană mai mai puternică decât Ag(I). Totuși, AgNCȚ și complecși cum ar fi Ag(I)-sulfadiazina sunt agenți antibacterieni eficienți, deși conțin Ag(I). Un complex Ag(III)-CHX sub formă nanocristalină, sintetizat prin tehnica microemulsiei inverse a prezentat activitate antibacteriană puternică pe bacterii Gram-pozitive (Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Propionibacterium acnes (ATCC 6919)) și Gram-negative (Acinetobacter calcoaceticus (ATCC 23055), Citrobacter freundii (ATCC 6750), Klebsiella pneumonia (ATCC 10031) si Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)) și pe tulpini rezistente la meticilină de Staphylococcus aureus. Concentrațiile inhibitorii minime (MIC) ale complexului Ag(III)-CHX au fost insă mult mai mici decât cele ale ligandului liber, CHX bază, AgNCȚ și Ag(I)-sulfadiazina [Synthesis of Highly Antibacterial

Nanocrystalline Trivalent Silver Polydiguanide, Sukdeb Pal, Eun Jeong Yoon, Yu Kyung Țak. Eung Chil Choi, and Joon Myong Song, J. Am. Chem. Soc. 2009,131,16147-16155].

Complecși ai clorhexidinei cu Ag(III) au fost obținuți sub formă de compozitj temperatura ambiantă, compiițjifl lele utilizate e-a substrat ie^disnozitivele

X.

fe

c\-io 1 o-onito - 2 9 -11- 2010 fost utilizate in tratamentul sau profilaxia infecțiilor microbiene (bacteriene) [US WO 2007/000590 Al], [US 2006/0051385 Al],

Acțiunea antimicrobiană a unor astfel de complecși CHX-Ag(III) este superioară celei a ligandului liber sau a ionului Ag(I) in compușii AgNO3 sau Ag(I)-sulfadiazina, utilizați deja in tratamentul clinic al infecțiilor bacteriene. Articole destinate uzului medical (instrumentar cu pelicula antiseptică, e.g. sonde de intubare - evitarea infecțiilor nosocomiale, pansamente antimicrobiene bioadezive) produse prin impregnarea cu CHX-Ag(III) (prin imersare in soluția de complex) sau prin acoperirea cu CHX-Ag(III) pulbere pot fi păstrate perioade îndelungate (câțiva ani) la presiunea și temperatura ambiantă in ambalaje sterile tradiționale. CHX-Ag(III) dispersat prin amestecare mecanică in IntraSite Gel (Smith&Nephew Medical Ltd.) conduce la obținerea unui hidrogel stabil chimic cu acțiune antimicrobiană față de Staphylococcus aureus (zona de inhibiție = 6.4 mm), Pseudomonas aeruginosa (zona de inhibiție = 5.4 mm) [US 2002/0072480 Al], [US WO 2007/000590 Al],

Complecși ai CHX cu Ag(I) și Ag(II): [Ag(CHX)]⁺ și [Ag(CHX)]²⁺ au prezentat activitate antibacteriană superioară și viteze letale mai mari in comparație cu CHX si AgNO3 și pot reprezenta o noua generație/clasă de agenți antibacterieni in tratamentul rănilor. Acești complecși [Ag(CHX)](NO3) și [Ag(CHX)](NO3)2 au fost sintetizați prin precipitare din soluții apoase neutre sau slab acide (H2SO4, 2N) de CHX si AgNO3. Complexul [Ag(CHX)](NO3)2 cu Ag(II) a fost obținut prin oxidarea Ag(I) din soluția CHX:AgNO3 cu peroxodisulfat de sodiu (Na2S20g) [Metallopharmaceuticals based on silver(I) and silver(II) polydiguanide complexes: activity against burn wound pathogens, Pal S, Yoon EJ, Park SH, Choi EC, Song JM, J Antimicrob Chemother. 2010;65(10):2134-40], Activitatea antibacteriana a acestor complecși a fost stabilită prin determinarea concentrațiilor MIC si MBC pe 4 bacterii Gram-pozitive si pe 4 bacterii Gram-negative: Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. Concentrațiile MIC pentru complecșii [Ag(CHX)]⁺ și [Ag(CHX)]²⁺ au fost mult mai scăzute decât cele ale clorhexidinei, AgNO3 și complexului Agsulfadiazina. Vitezele biocide ale complecșilor [Ag(CHX)]⁺ si [Ag(CHX)]²⁺ pe bacteriile testate au fost de 2-8 ori mai mari decât cele corespunzătoare clorhexidinei sau AgNO₃ la concentrații egale cu MIC sau de 4 ori mai mari decât aceasta.

In studiile clinice, produsele de îngrijire orală (pasta de dinți, ape de gură) ce conțin amestecuri CHX: Zn(II) s-au dovedit mult mai eficiente in controlul formării plăcii dentare, gingivitei și a compușilor cu sulf volatili din cavitatea bucala, decât produsele care au in componență doar CHX.

Ionii de zinc și CHX prezintă un efect inhibitoriu sinergie asupra creșterii in vitro a S. sobrinus și S. sanguis. Efectele asupra plăcii bacteriene au fost determinate pentru 8.0 mM, 0.44 mM CHX și a combinării celor două, mai eficientă fiind combinația [E. Gierstein, A. A. Scheie, G. Rolla, Scandinavian Journal of Dental Research, 1988,96(6), 541-550].

Ionii de zinc, CHX si clorura de cetilpiridiniu sunt compuși cunoscuti pentru inhibarea compușilor volatili pe baza de sulf (VCS). Ionii de zinc la concentrația de 1% au un gust neplăcut si din acest motiv este de dorit sa fie eficienți la concentrații mai mici.

CHX are gust neplăcut la 0.2%. Zincul are cel mai bun efect anti-VCS in conc lh, CHX are același efect la 0.2%, in 3h [A. Young, G. Jonski, G. Rolla, European / Sciences, 2003,111(5), 400].

5’2 O 1 O - 0 1 2jâs0 - 2 9 -11- 2010

Cuprul este un metal de interes clinic, metal esențial in nutriția umană și are toxicitate redusă.

CHX și Cu²⁺, soluții de 1.1 mM au fost folosite in experimente vizând reducerea plăcii bacteriene. CHX, in concentrația 1.1 mM, este mai eficientă decât Cu²⁺ [S. M. Waler, G. Rolla, Scandinavian Journal of Dental Research, 1982, 90(2), 131-133].

Complecși pe bază de CHX-I, se regăsesc în următoarele formulări: [GB1128833/1966] și [PEP1340490B1/2003], colutoriu pe baza de clorhexidină, sub formă de soluție pentru igiena orală bazată pe CHX și acid ascorbic, care nu are ca efect secundar pigmentarea dinților. La soluția de CHX și acid ascorbic (cu rol de reducere a Fe³⁺ la Fe²⁺, împiedicarea reacțiilor Maillard) se adaugă metabisulfit de sodiu care are rolul de a stabiliza acidul ascorbic (împiedicarea oxidării acestuia) in soluție apoasă. Cu citrat de sodiu pH-ul colutoriului este păstrat la valori: 5.7-63, domeniu in care activitatea clorhexidinei este maximă.

Dezavantajele sau limitele clorhexidinei prezente ca principiu activ:

• Transformarea ligandului intr-o forma hidrosolubila. CHX (baza liberă) este insolubila in apă si există doar la pH > 8. CHX este folosită sub formă de săruri ale unor acizi organici: CHX diacetat, CHX diclorhidrat, CHX digluconat. Totuși, posibilitatea unor interacții nedorite ale anionului cu alte specii, organice sau anorganice, sau coprecipitarea face din aceste specii surse nu foarte potrivite de ligand CHX. întrucât valorile pKa pentru CHX (2.2 și 10.3) arată că aceasta este diprotonată pe întreg domeniul de valori corespunzătoare pH-ului fiziologic, solubilizarea acesteia se poate ușor realiza prin tratarea cu H2SO4 diluat și transformarea in CHX²⁺-2(HSO₄).

• Limitările clorhexidinei prezente ca principiu activ in actualele forme farmaceutice constau în obținerea de forme farmaceutice lichide (ape de gură) care permit o scădere a concentrației clorhexidinei la nivelul cavității orale prin diluare rapidă cu saliva, reacții adverse, limitarea activității antimicrobiene ca și durata efectului terapeutic.

Problema tehnica pe care o rezolva invenția si ce dezavantaje înlătură invenția:

Prin asocierea clorhexidinei si a sărurilor acesteia cu ioni metalici cu activitate farmacologică proprie (antibacteriană, antifungică, cicatrizantă, antiinflamatoare) in compuși cu proprietăți antiseptice, dezinfectante si antiparazitare se pot elimina problemele generate de utilizarea CHX libere.

Invenția rezolvă următoarele probleme biofarmaceutice si anume:

• creșterea contactului preparatului cu mucoasa bucală, respectiv cale topică, respectiv prelungirea acțiunii terapeutice, precum și posibilitatea folosirii de noi compuși neutilizați în terapeutică, activi in vitro la concentrații mai mici comparativ cu sărurile de clorhexidină folosite.

• eliminarea reacțiilor adverse (dermatite iritante de contact -CHX libera) si minimalizarea efectelor secundare (gingivite descuamative, decolorarea dinților si a limbii, alterarea gustului, alergii care pot conduce la șoc anafilactic).

• găsirea unei formulari/compoziții farmaceutice care să aibă o solubilitate in medii apoase superioară concentrației minime inhibitorii (MIC) a organismului tratat.

• preparate farmaceutice stabile chimic in domeniul de pH = 6.5-8, domeniul de eficacitate maximă al CHX.

i • evitarea contaminării produsului in procesul de sinteza - pentru păstrarea activității nealterate.

.7 ! , - , ...

t\-2 Ο 1 Ο - Ο 1 2jăj0 - 2 9 -11- 2010 proprietățile principiilor active ale acestora. Prin obținerea complecșilor clorhexidinei cu ioni metalici ca Zn(II), Cu(II) si Ag(I) s-a urmărit creșterea capacității de inhibiție a activitatii streptococice si stafilococice comparativ cu cea a ligandului clorhexidină, precum și a acțiunii antiseptice a clorhexidinei, prevenind aderenta tulpinilor de Candida albicans la suprafețele nonbiologice.

• prin noile structuri chimice se reduce inactivarea clorhexidinei si a sărurilor sale (prin expunere la unii surfactanti neionici, a unor ioni comuni prezenti in apa sau prin includerea sa in unele produse de igiena oro-dentara (geluri, ape de gura) prin selectarea unui pH compatibil, a unor solvenți si baze de hidrogeluri compatibile).

Avantajele obținerii complecșilor metalici pe bază de clorhexidină, conform invenției:

-Asocierea clorhexidinei si a sărurilor acesteia cu ioni metalici cu activitate biologică proprie (antibacteriană, antifungică, cicatrizantă, antioxidantă).

-înlocuirea clorhexidinei și a sărurilor acesteia ca principii active in preparatele farmaceutice cu combinații complexe ale acestora cu ioni de Cu(II), Zn(II) și Ag(I). Se elimina astfel prezența clorhexidinei libere in preparatele farmaceutice și implicit, se diminuează efectele adverse cauzate de aceasta.

- Combinațiile complexe obținute prezintă activitate biologică comparabilă sau chiar mărită comparativ cu cea a clorhexidinei, dar la o concentrație mai mică a acesteia în preparatul farmaceutic.

- Asocierea în compoziția combinației complexe a doi ioni metalici diferiți (cupru cu zinc sau cupru cu argint) s-a dovedit a contribui la potențarea activității antimicrobiene și la reducerea efectelor secundare ale clorhexidinei.

-La obținerea noilor complecși au fost utilizați ca liganzi CHX bază, diclorhidratul și diacetatul de clorhexidină față de tradiționalul digluconat de clorhexidină, în scopul valorificării tuturor compușilor derivați de clorhexidină, a obținerii de complecși la valori de pH care vor permite stabilitate, compatibilitate cu substanțele auxiliare asociate în formule și cu căile de administrare (mucoasa bucală, calea topică), cu o bună solubilitate în solvenți polari și utilizarea lor în terapeutică în forme farmaceutice nepropuse pentru acești compuși.

Procedeul de obținere a complecșilor metalici pe bază de clorhexidină conform invenției, constă în schema tehnologică prezentată în Figura nr. 1.

Este indicat mai jos, un exemplu de obținere a complexului metalic al clorhexidinei, tetracloroclorhexidin cupru(II) zinc(II), (3).

[CuZn(CHX)Cl₄], tetracloroclorhexidin cupru(II) zinc(II), complex (3).

Complexul a fost obtinut utilizând diacetat de clorhexidină si un amestec de săruri metalice conținând clorura de cupru dihidratată si clorura de zinc anhidra, în raport masic diacetat de clorhexidină: CuCh 2H2O: ZnCh = 4.7: 1.25: 1. Diacetatul de clorhexidină se dizolva in etanol sub agitare; la aceasta soluție s-a adaugat o soluție etanolica ce conține sărurile de cupru si zinc iar amestecul de reacție a fost agitat la 40-50 °C timp de 2 ore. Se formează un precipitat roz-violet. Amestecul se concentrează prin evaporarea parțiala a solventului, apoi precipitatul filtrare la vid, se spală cu alcool etilic și se usucă în exsicator pe pentaoxid de difosfor. prezintă sub formă de pulbere microcristalină, culoare violet intens, P.t. > 100 °C solubil in dimetilsulfoxid, di idă, aebtQititiili'pârtial solubil in acetonă, alcool&

rm, benzen, stabil' ' ^on'·' mbiantăsi metilic și insolubil în apa„6 l! ''•Silit Itl //u. nv

I» rκ t ș f o·'. | r

A, <

A-2 o 1 o - O 1 2^0 - 2 9 -11- 2010

Se dau 6 exemple de realizare a complecșilor metalici ai clorhexidinei conform invenției, în legătură cu Tabelul nr. 1 și cu Figura nr. 1, care reprezintă schema tehnologică de obținere a complecșilor metalici ai clorhexidinei, conform invenției.

Tabel nr. 1 Exemple de obținere a complecșilor metalici ai clorhexidinei

Reactanți	Complex metalic (1)	Complex metalic (2)	Complex metalic (3)	Complex metallic (4)	Complex metalic (5)	Complex metalic (6)
Părți în greutate
Clorhexidina bază	-	3.71	-	-	-	-
Diacetat de clorhexidina	1.33	-	4.7	-	-	3.78
Diclorhidrat de clorhexidina	-	-	-	4.25	2.89	-
Cu(NO3)2-3H2O	1	1.77	-	-	-	-
CuC12-2H2O	-	-	1.25	1.25	-	1
Cu(CH3COO)2-H2O	-	-	-	-	1	-
ZnCl2	-	1	1	1	-	-
AgNO3	-	-	-	-	-	1

Formule atribuite, date analitice și spectrale (IR, UV-VIS, RPE) pentru complecșii metalici ai clorhexidinei, conform invenției:

[Cu2(CHX)(CH₃COO)2](NO3)2-2C2H₅OH, diazotat de diacetatoclorhexidin bis cupru(II) dialcoolat, complex (1).

Solid, pulbere microcristalină, de culoare roz-violeta, P.t. > 100 °C (descompunere); parțial solubil in etanol si acetona, solubil in DMSO la rece, parțial solubil in DMF, și insolubil în apa, eter etilic, cloroform, CC1₄, stabil la temperatura ambiantă și lumină.

Date analitice: exp.%: C: 37.02; N: 17.48; Cu: 13.23; calc.%: C: 37.22; N: 17.37; Cu: 13.26.

Benzi caracteristice in IR (v_max, cm⁴): v(O-H), 3320 m ; v(=NH), 3305 m; v(C=N), 1659 i; δ(ΝΗ) + v(C-N), 1591m, 1337 m; v(C_ai_if-N), 1241 m; v_as(C=O), 1570 i; v_sim(C=O), 1390 i; v(NO₃ ionic), 1384 fi, 800 m.

UV-VIS: 41666 (σ - σ*); 33557 cm’¹ (π - π*) ; 30303 cm'¹ (η-π*); 18880 cm⁴ (²B, ^²E), simetrie tetraedrica distorsionata.

EPR: g_± = 2.058.

[CuZn(CHX)(N03)202]-2C2H5OH, diclorodinitroclorhexidin cupru(II) zinc(II) dialcoolat, complex (2).

Solid, pulbere microcristalină, de culoare roz-violeta, P.t. > 120 °C (descompunere); Solubil în dimetilsulfoxid, dimetilformamidă, acetonitril, acetonă, parțial solubil in alcool etilic si alcool metilic și insolubil în apa, eter etilic, cloroform, CC1₄, stabil la temperatura ambiantă și lumină.

Date analitice: exp.%: C: 33.72; N: 18.35; Cu: 7.02; Zn: 7.01; calc.%: C:

6.94; Zn: 6.95.

B3Cfeith>.y(=NH), 3125 δ(ΝΗ) + v(C-N), 1590 m^l346 m; v(C_aUf-N), l Wî; yfKO^OoVâihat), 1094 fi;

Benzi caracteristice in IR (v_max, cm⁴): vy.

O), 511 s.

e<-2 Ο 1 0-0 12^,0-2 9 -11- 2010

UV-VIS : 45270 cm’¹ (σ - σ*); 31810 cm’¹ (π - π*); 26590 cm'¹ (η - π*); 19280 cm'¹ (²B]g—>²A]g); 15630 cm'¹ (²Big—>²Eg); 12880 cm'¹ (²Big —>²B2g), simetrie D_4h pentru ionul Cu²⁺.

EPR: _g// = 2.20; g_± = 2.064.

[CuZn(CHX)CI₄], tetracloroclorhexidin cupru(II) zinc(II), complex (3).

Solid, pulbere microcristalină, de culoare roz-violeta, P.t. > 180 °C (descompunere); solubil in dimetilsulfoxid, dimetilformamidă, acetonitril, parțial solubil in acetonă, alcool etilic si alcool metilic și insolubil în apa, eter etilic, cloroform, benzen, stabil la temperatura ambiantă și lumină.

Date analitice: exp.%: C: 33.90; N: 18.12; Cu: 8.15; Zn: 8.10; calc.%: C: 34.02; N: 18.04; Cu: 8.24; Zn: 8.25.

Benzi caracteristice in IR (v_max, cm’¹): v(=NH), 3290 m; v(C=N), 1654 i; δ(ΝΗ) + v(C-N),

1590 m, 1374 i; v(C_aUrN), 1238 i; v(M-N), 607 s, 568 s.

UV-VIS: 46900 cm'¹ (σ - σ*); 38230 cm'¹ (π - π*); 26250 cm'¹ (η - π*); 18500 cm'¹ (²B,g^²Alg, ²Bjg—>²Eg) ; 13950 cm'¹ (²B]g —»²B2g), simetrie D_4h pentru ionul Cu²⁺.

EPR: _g// = 2.20; g_± = 2.065.

[CuZn(CHXH2)Cl₄]C12, diclorura de tetracloro clorhexidinato cupru(II) zinc(II), complex (4).

Solid, pulbere microcristalină, de culoare albastra, P.t. > 230 °C (descompunere). Este parțial solubil in etanol si acetona, ușor solubil in DMF si DMSO și insolubil în apa, eter etilic, cloroform, benzen, stabil la temperatura ambiantă și lumină.

Date analitice: exp.%: C: 30.92; N: 16.64; Cu: 7.32; Zn: 7.45; calc.%: C: 31.09; N: 16.48; Cu: 7.53; Zn: 7.65.

Benzi caracteristice in IR (v_max, cm'¹): vas(NH2⁺), vsim(NH₂ ⁺), 3313; v(=NH), 3201 m; δ(ΝΗ₂ ⁺),

1633 i; v(C=N), 1650 i; δ(ΝΗ) + v(C-N), 1597 m, 1346 m; v(C_aUrN), 1234 m; v(M-N), 621 s.

UV-VIS: 48000 cm'¹ (σ - σ*); 38400 cm'¹ (π - π*); 30300 cm'¹ (η - π*); 185200 cm'^{1 2}Big^²Aig, 15380 cm’¹ (²B]g—>²Eg) ; 12050 cm'¹ (²B]g -^²B2g), simetrie D₄h pentru ionul Cu²⁺.

EPR: _g// = 2.207; g_± = 2.049.

[Cu(CHXH₂)CI₂]Cl₂, diclorura de dicloroclorhexidinato cupru(II), complex (5).

Solid, pulbere microcristalină, colorat in violet-intens, p.t. > 140 °C (descompunere); parțial solubil in acetona, dimetiformamida, insolubil in eter etilic, cloroform, benzen, stabil la temperatura ambiantă și lumină.

Date analitice: exp.%: C: 36.92; N: 19.74; Cu: 9.05; calc.%: C: 37.02; N: 19.63; Cu: 8.97. Benzi caracteristice in IR (v_max, cm'¹): vas(NH2⁺), vsim(NH₂ ⁺), 3308; v(=NH), 3201 m; δ(ΝΗ₂ ⁺),

1633 i; v(C=N), 1639 m; δ(ΝΗ) + v(C-N), 1580 m, 1379 m; v(C_alirN), 1239 m; v(Cu-N), 667 s.

UV-VIS: 43470 cm'¹ (σ - σ*); 32250 cm'¹ (π - π*); 26300 cm'¹ (η - π*); 18860 cm'¹ (²B|g^²Alg); 14280 cm’¹ (²Big—>²Eg); 11800 cm'¹ (²Blg -^²B2g) simetrie octaedrica deformata

tetragonal.

EPR: g//= 2.19; g± = 2.083.

[CuAg(CHX)Cl2]NO3, azotat de dicloroclorhexidin cupru(II) argint(I), comple Solid, pulbere microcristalină, de culoarejmoy-intens, p.t. > 185 °C (descomp este parțial solubil la rece in alcool etilic si ăcetortâ/tlșoȚvolubil in DMF si DMSO etilic, cloroform, benzen, stabil la temperatura ârnbiaQtă și lțuhină.

/'C>- ^le'î

ISST1 TI I II. NAȚIONAL i>e c-l> PENTRU ȘTIINȚE _Λ A ' ' · I Q r

^-2010-012^0-2 9 -11- 2010

Date analitice: exp.%: C: 32.28; N: 19.24; Cu: 7.88; Ag: 13.02; calc.%: C: 32.59; N: 19.01; Cu: 7.90; Ag: 13.32.

Benzi caracteristice in IR (v_max, cm’¹): v(=NH), 3250 m; v(C=N), 1660 fi; δ(ΝΗ) + v(C-N), 1588 m, 1345 m; v(C_a|_if-N), 1243 m; v(NO₃ ionic), 1383 fi, 800 m; v(M-N), 651 s.

UV-VIS: 40000 cm’¹ (σ - σ*); 33300 cm’¹ (π - π*); 27020 cm’¹ (η - π*); 21740 cm’¹ (²Big—>²A]g); 19230 cm’¹ (²Big—>²Eg); 12540 cm’¹ (²B]g —>²B2g) in simetrie D₄h, pentru ionul Cu²⁺.

EPR: g_z/= 2.19; gj. = 2.066.

Modul de cooordinare al clorhexidinei la ionii metalici a fost argumentat pe baza studiului comparativ al spectrelor in infraroșu ale liganzilor si complecșilor sintetizați.

Diacetat de clorhexidina. Benzi caracteristice in IR (v_max, cm'¹): v(OH), 3326 m ; vas(NH2⁺), Vsim(NH2⁺), 3140 m; v(=NH), 3180 m; δ(ΝΗ2⁺), 1613 m; v(C=N), 1644 i; δ(ΝΗ) + v(C-N), 1574 m, 1337 m; vas(C=O), 1536 m ; v_as(C=O), 1417 i; v(C_alif-N), 1249 m.

In spectrele combinațiilor complexe sintetizate cu diacetatul de clorhexidina (complecșii 1, 3 si 6) se observa deplasarea spre numere de unda mai mari a benzii datorate vibrației de valența a grupării iminice, v(C=N), in acord cu coordinarea ligandului la ionii metalici prin perechea de electroni neparticipanti ai azotului iminic. Coordinarea prin atomii de azot iminici este confirmata si de deplasarea ușoara, spre numere de unda mai mari, a benzii de la 1574 cm’¹ δ(ΝΗ) + v(C-N) si deplasarea spre numere de unda mai mici a benzii de la 1249 cm’¹ datorate vibrației de valența C_aiif-N. Dispariția benzilor caracteristice grupărilor NH₂ ⁺ indica faptul ca la formarea combinațiilor complexe are loc deprotonarea ligandului. De altfel, deplasarea spre numere de unda mai mari a vibrației de valența a grupării azometinice, prin complexare, este un indiciu al participării ligandului in forma deprotonata (prin deprotonare creste densitatea electronica pe legaturile C=N).

Clorhexidina bază. Benzi caracteristice in IR (v_max, cm'¹): v(=NH), 3054 m; v(C=N), 1667 i; δ(ΝΗ) + v(C-N), 1598 m, 1373 m; v(C_alif-N), 1247 m.

Datorita absentei protonarii, spectrul in infraroșu al clorhexidinei in forma “baza” prezintă cateva diferente importante fata de cel al diacetatului de CHX. Astfel, nu se observa nici o banda datorata unei posibile grupări aminice protonate. Banda de valența caracteristica grupării azometinice apare la 1667 cm’¹, in timp ce vibrațiile cuplate δ(ΝΗ) + v(C-N) dau benzi caracteristice la 1598 si 1373 cm¹.

In spectrul combinației complexe sintetizate cu clorhexidina “baza”, complex (2), deplasarea vibrației de valența a grupării C=N are loc spre numere de unda mai mici fata de ligand, in acord cu scăderea densității electronice pe aceste legaturi, prin complexare.

Coordinarea afecteaza, de asemenea, pozițiile benzilor datorate vibrațiilor cuplate δ(ΝΗ) + v(CN), acestea suferind deplasări ușoare, in general, spre numere de unda mai mari.

Diclorhidrat de clorhexidina. Benzi caracteristice in IR (v_max, cm’¹): vas(NH2⁺), vSi_m(NH₂ ⁺), 3120 m; v(=NH), 3195 m; δ(ΝΗ2⁺), -1600 m; v(C=N), 1651 i; δ(ΝΗ) + v(C-N), 1 v(Ca|_if-N), 1239 m.

Spectrul in IR al diclorhidratului de CHX este asemanator, in regiunea n cu cel al diacetatului de CHX. Banda datorata vibrației de deformare in plan a -1600 cm . ------------ / . . *

* R0 v

«V20 1 Ο - ο 1 2^>0 - 2 9 -11- 2010

Deplasările care apar in spectrele IR ale complecșilor fata de ligandul liber sunt insa diferite fata de cazul complecșilor cu diacetatul de CHX. Astfel, in cazul combinațiilor complexe 4 si 5 se mențin, in spectrele in infrarosu, benzile caracteristice grupării aminice protonate, cu deplasări ușoare in regiunea numerelor de unda mari si cu deplasare puternica a vibrației de deformare in plan, de la 1600 la 1633 cm'¹. Aceste observații indica faptul ca in acești complecși ligandul a ramas in forma protonata. Coordinarea s-a realizat tot prin atomii de azot iminici, fiind confirmata de deplasările benzii caracteristice vibrației de valența a grupării C=N.

Solubilitate

Majoritatea complecșilor sunt solubili in DMF si DMSO, dar dizolvarea este insotita, in unele cazuri, de schimbarea culorii. Aceasta dovedește ca la dizolvare au loc modificări in sfera de coordinare a ionului metalic, de obicei ca urmare a aditiei de molecule de solvent. Complexul (5) este cel mai sensibil la acțiunea solventilor cu constanta dielectrica mare.

Prezintă, de asemenea, modificări de culoare in solventi complexul (2), ce conține azotat in sfera de coordinare si care, realizând legaturi slabe cu ionul metalic, poate fi substituit ușor.

In solventi ca etanolul sau acetona, complecșii sunt greu solubili la rece.

încălzirea complecșilor in orice solvent, la temperaturi mai mari de 30°C, conduce la aglomerări sub forma de cleiuri. Aceasta se explica prin existanta grupărilor NH necoordinate de pe CHX, care pot forma legaturi de hidrogen intermoleculare.

Date spectrale in UV-VIS si magnetice

Maximele tranzițiilor in vizibil, datorate numai ionului Cu , ca si valorile factorului g calculate din spectrele RPE sunt in acord cu o simetrie axiala in jurul acestuia in complecșii (2)-(6) si o simetrie tetraedrica deformata in complexul (1).

Structurile propuse pentru complecșii metalici ai clorhexidinei (1 - 6) conform invenției, sunt următoarele:

[Cu₂(CHX)(CH₃COO)₂](NO₃)₂ 2C₂H_sOH (1);

<\-2 Ο 1 Ο - Ο 1 2ÎXI - 2 9 -11- 2010 &

[CuZn(CHX)(NO₃)₂CI₂] 2C₂H_SOH (2); [CuZn(CHX)Cl₄] (3); [CuAg(CHX)CI₂]NO₃ (6);

n+

Complex (2) M^a = Cu; M^b = Zn; R¹ = ONO2; R² = CI; n = 0; Xⁿ‘ = 2C2H₅OH

Complex (3) M^a = Cu; M^b = Zn; R¹, R² = CI; n = 0; Xⁿ' = absent

Complex (6): M^a = Cu; M^b = Ag; R¹ = CI; R² = absent; η = 1; X^n_ = NO₃’ [CuZn(CHXH₂)Cl₄]Cl₂ (4);

[Cu(CHXH₂)CI₂]Cl₂ (5);

Η H₂ H

r c\-2 Ο 1 Ο - Ο 1 2^0 - 2 9 -11- 2010

Complecșii metalici ai clorhexidinei conform invenției, prezintă activitate antimicrobiană față de tulpinile microbiene Staphylococcus aureus (diametrul de inhibiție 1 - 14 mm), Escherichia coli (diametrul de inhibiție 1 - 8 mm) și Candida albicans (diametrul de inhibiție 1 - 7 mm), mai ridicată comparativ cu liganzii și sărurile metalice din care au fost obținuți.

Testarea fitotoxicității citologice pe meristemul radicelelor de Allium cepa a complecșilor metalici pe baza de clorhexidină vine in completarea testelor anterioare efectuate pe tulpini Gram pozitive si Gram negative. Bulbii cu diametrul de 2 cm utilizați in experiment, au format radicele de 510 mm, apoi au fost introduși în soluții ale complecșilor nou sintetizați. Complecși conform invenției, au fost dizolvați in alcool etilic de concentrație 90%, soluția rezultată având o concentrație de 10'³M. Radicelele au fost măsurate si apoi recoltate meristemele la 24h și respectiv 96h. Preparatele au fost apoi observate microscopic cu diferite obiective. Rezultatele testelor de fitotoxicitate au scos in evidenta faptul ca toti compușii prezintă un efect citostatic la concentrația de 10’ M, dar nu manifestă genotoxicitate.

Complecșii metalici pe bază de clorhexidină, conform invenției, au fost testați in vitro în culturi de fibroblaste. Pentru testarea efectului compușilor studiati asupra celulelor s-au analizat viabilitatea celulară (prin metoda cu MTT) si morfologia celulară. Citotoxicitatea a fost testata prin metoda extractului, toți complecșii fiind în stare solidă de pulbere, luând in lucru mai multe concentrații ale complecșilor solubilizați în alcool etilic de concentrație 90%, si mai multe grade de dilutie ale soluțiilor respective. Rezultatele obținute au demonstrat un pronunțat efect citotoxic al complecșilor in forma in care au fost obținuți, comparativ cu proba martor (cultura de celule). La concentrații mai mici de 100gg/mL din fiecare complex și la dilutii mai mici de 1:4 a complecșilor aduși în soluție, nu s-au mai observat efecte de modificare a morfologiei fibroblastelor, acestea avand o viabilitate de peste 95% după 24 ore de cultivare in prezența respectivelor soluții cu complecșii conform invenției.

Testarea activitatii antioxidante a complecșilor metalici ai clorhexidinei conform invenției, prin metoda chemi lumi niscenței, a evidențiat că aceștia prezintă valori ale activității antioxidante în domeniul 45-83%, ceea ce îi indică drept agenți antioxidanți eficienți.

Claims (3)

1. REVENDICĂRI

   1. Complecși metalici ai clorhexidinei cu structura corespunzătoare formulelor generale (1), (2), (3), (4), (5) și (6):

   [Cu₂(CHX)(CH₃COO)₂](NO₃)₂2C₂H₅OH (1) [M^aM^b(CHX)(R¹)2(R²)2]ⁿ⁺-X', M^a = Cu, M^b = Zn, R¹ = ONO2, R² = CI, η = O, X = 2C2H₅OH; (2), M^a = Cu, M^b = Zn, R¹, R² = CI, η = O, X absent (3), M^a = Cu, M^b = Ag, R¹ = CI, R² absent, n = l,Xⁿ' = NO₃‘ (6), [CuZn(CHXH₂)Cl₄]CI₂ (4) [Cu(CHXH₂)C1₂]C1₂ (5) și cu structurile chimice următoare:

   [Cu₂(CHX)(CH₃COO)₂](NO₃)₂ 2C₂H₅OH (1);

   CI

   CH,
2. 2+

   2NO₃ 2C₂H₅OH [CuZn(CHX)(NO₃)₂Cl₂] 2C₂H_sOH (2); [CuZn(CHX)Cl₄] (3); [CuAg(CHX)Cl₂]NO₃ (6);

   Complex (2) M^a = Cu; M^b = Zn; R¹ = ONO2; R² = CI; n = 0; Xⁿ' = 2C2H₅OH

   Complex (3) M^a = Cu; M^b = Zn; R¹, R² = CI; n = 0; X^n_ = absent

   Complex (6): M^a = Cu; M^b = Ag; R¹ = CI; R² = absent; η = 1; X^n_ = NO₃ [CuZn(CHXH₂)Cl₄]Cl₂ (4);

   Ο 1 Ο - Ο 1 2^0 - 2 9 -11- 2010 [Cu(CHXH₂)C1₂]C12 (5);

   Η Η₂ Η

   2. Procedeu de obținere a unor complecși metalici pe bază de clorhexidină cu structura corespunzătoare formulelor prezentate ca la Revendicarea 1, caracterizat prin aceea că se utilizează ca reactanti: diacetatul de clorhexidină si azotatul de cupru(II) - complex 1; clorhexidină baza, azotat de Cu(II) si clorura de zinc - complex 2; diacetatul de clorhexidină, clorura de cupru(II) și clorura de zinc - complex 3; diclorhidratul de clorhexidină, clorura de cupru(II) și clorura de zinc - complex 4; diclorhidratul de clorhexidină și acetat de cupru(II) complex 5; diacetatul de clorhexidină, clorura de cupru(II) și azotat de argint - complex 6, în rapoarte molare de amestec metal : clorhexidină 2:1 și 1:1, iar in cazul complecșilor cu ioni metalici diferiți in raport molar metal(l): metal(2): clorhexidină = 1:1:1, care cuprinde următoarele etape de obținere: solubilizarea în alcool etilic a clorhexidinei, respectiv a sărurilor sale și ajustarea pH-ului la 6.5, aducerea în soluție etanolică a sărurilor metalice, amestecarea soluțiilor reactanților și agitarea la cald (4O-5O°C) a amestecului de reacție, concentrarea soluției, filtrarea precipitatului și spălarea acestuia cu alcool etilic, uscarea compusului solid pe pentaoxid de difosfor. Se obțin produși sub formă de pulberi microcristaline, intens colorați: 1, 2 si 3 - roz-violet; 4 - albastru; 5 si 6 - violet intens, cu puncte de topire cuprinse în intervalul 1OO°C - 23O°C (descompunere), stabili la temperatura ambiantă și lumină.
3. 3. Complecși metalici pe bază de clorhexidină cu structura corespunzătoare formulelor prezentate la Revendicarea 1, caracterizați prin aceea că prezintă activitate antimicrobiană și se utilizează ca principii active în diverse preparate farmaceutice topice de uz extern, pentru proprietățile lor de agenți antibacterieni, antimicotici, dezinfectanți, cicatrizanți, antioxidanți.