RS20050203A - Vodo-rastvorni polimerni alkanali - Google Patents

Vodo-rastvorni polimerni alkanali

Info

Publication number
RS20050203A
RS20050203A YUP-2005/0203A YUP20305A RS20050203A RS 20050203 A RS20050203 A RS 20050203A YU P20305 A YUP20305 A YU P20305A RS 20050203 A RS20050203 A RS 20050203A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
conjugate
polymer
peg
hgh
compound
Prior art date
Application number
YUP-2005/0203A
Other languages
English (en)
Inventor
Antoni Kozlowsky
Original Assignee
Nektar Therapeuticals Al.Corporation,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nektar Therapeuticals Al.Corporation, filed Critical Nektar Therapeuticals Al.Corporation,
Publication of RS20050203A publication Critical patent/RS20050203A/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/30—Compounds having groups
    • C07C43/315—Compounds having groups containing oxygen atoms singly bound to carbon atoms not being acetal carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/27—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by oxidation
    • C07C45/30—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by oxidation with halogen containing compounds, e.g. hypohalogenation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C47/00—Compounds having —CHO groups
    • C07C47/02—Saturated compounds having —CHO groups bound to acyclic carbon atoms or to hydrogen
    • C07C47/198—Saturated compounds having —CHO groups bound to acyclic carbon atoms or to hydrogen containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/26—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds
    • C08G65/2603—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring from cyclic ethers and other compounds the other compounds containing oxygen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Compounds Of Alkaline-Earth Elements, Aluminum Or Rare-Earth Metals (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na alkanalne derivate vodo-rastvornih polimera kao što su poli(etilenglikol), njihove odgovarajuće hidrate i acetale i na metode za proizvodnju i korišćenje takvih polimernih alkanala. Polimerni alkanali iz pronalaska su proizvedeni u visokom stepenu čistoće i pokazuju stabilnost pri skladištenju.

Description

VODO-RASTVORNIPOLIMERNIALKANALI
OBLAST TEHNIKE
Ovaj pronalazak se odnosi na odredjene aldehidne derivate vodo-rastvornih polimera i na metode za njihovo dobijanje i korišćenje takvih polimernih aldehidnih derivata.
STANJE TEHNIKE
Poslednjih godina, humani terapeutici sve više obuhvataju lekove sa malim molekulima koji su tradicionalni u oblasti biofarmaceutike. Otkriće novih proteina i peptida vodilo je do razvoja brojnih proteinskih i polipeptidnih biofarmaceutika. Na žalost, proteini i polipeptidi, kada se koriste kao terapeutici, često pokazuju svojstva koja ih čine ekstremno teškim za formulisanje ili primenu, kao što su kratak poluživot cirkulacije, imunogenost, proteolitička razgradnja i slaba rastvorljivost. Jedan pristup za poboljšanje farmakokinetičkih ili farmakodinamičkih svojstava biofarmaceutika je konjugacija za prirodne ili sintetičke polimere, kao što je polietilenglikol (PEG). Kovalentno vezivanje PEG za terapeutski protein može omogućiti brojne prednosti, kao što su (i) maskiranje antigenih epitopa proteina, čime se smanjuje njihov retikuloendotelijalni klirens i prepoznavanje od strane imunog sistema, (ii) smanjenje razgradnje sa proteolitičkim enizimima i (iii) smanjenje renalne filtracije.
Mnogo napora je uloženo na razvoj polimernih derivata za kuplovanje biofarmaceutika kao što su peptidi i posebno na razvoj polimernih derivata za kuplovanje reaktivnih amino grupa u proteinima. Takvi polimerni derivati se nazivaju "elektrofilno aktivirani", pošto nose elektrofilne grupe pogodne za reakcije sa nukleofilima kao što su amini. Primeri takvih PEG derivata uključuju PEG dihlortriazin, PEG tresilat, PEG sukcinimidil karbonat, PEG karbonilimidazol i PEG sukcinimidil sukcinat. Na žalost, korišćenje ovih posebnih reagenasa, može dovesti do jednog ili više od sledećih problema: neželjenih sporednih reakcija pod reakcionim uslovima neophodnim za postizanje kuplovanja, nedostatka selektivnosti i/ili formiranja slabih (odnosno, nestabilnih) veza izmedju biofarmaceutika i PEG.
U naporu da se prevazidju neki od ovih problema, razvijeni su mnogi novi ili "druga generacija" elektrofilno aktiviranih PEG, kao što su PEG propionaldehid i PEG acetaldehide (videti, na primer, U.S. Patent Br. 5,252,714 i 5,990,237, respektivno). Aldehidni derivati su posebno interesantni reagensi za kuplovanje za proteine i druge biomolekule, pošto aldehidi reaguju samo sa aminima (to jest, selektivni su u njihovoj herniji kuplovanja). Gore pomenuti reagensi nude mnoge prednosti: oni se mogu proizvesti kako bi se izbegli problemi sa PEG diol kontaminacijom, nisu ograničeni na mPEG sa malom molekulskom težinom, formiraju stabilne aminske veze tokom kuplovanja i selektivni su. Iako gore navedeni derivati nude mnoge prednosti nad PEG reagensima prve generacije, podnosioci Prijave moraju da naznače neke odredjene nezgode vezane za ove aldehidne reagense, čineći ih manje idealnim u odredjenim slučajevima.
Odredjenije, podnosioci Prijave su prepoznali, u njihovom opširnom radu sa tim reagensima, daje PEG acetaldehid veoma nestabilan, posebno u baznim medijumima i teško je izolovati ga zbog suvišnog formiranja soli nastale iz neutralizacije reakcione smeše. Posebno, PEG acetaldehid je veoma podložan dimerizaciji preko aldolne kondenzacije. PEG propionaldehid, koji je mnogo bolji reagens sa aspekta njegove stabilnosti, poseduje neke nepoželjne osobine zbog sporednih reakcija koje se mogu javiti tokom njegove proizvodnje, čineći teškim dobijanje PEG propionaldehida visoke čistoće.
Još odredjenije, podnosioci Prijave su pronašli da kada se proizvodi PEG propionaldehidin situiz njegovog prekursora PEG aldehid hidrata, prinos proizvoda generalno dostiže samo oko 50 %, zbog jedne eliminacione reakcije koja koristi znatne količine acetalnog reagensa. Mada se može koristiti poboljšani sintetski put za sintezu PEG propionaldehida, kao što je preko bazno katalizovane reakcije 3-hidroksipropionaldehid dietil acetala sa PEG mezilatom, podnosioci Prijave su otkrili da taj reakcioni put takodje dovodi do jedne eliminacione sporedne reakcije koja daje značajne količine PEG vinil etra, koji je nestabilan i proizvodi teškoće u uklanjanju početnog dihidroksi PEG (takodje naznačenog kao PEG diol). Kao posledica toga, prinos ove reakcije je generalno manji od oko 85 % do 90 %. Pored toga, korišćenje gore opisanih sinteza za PEG propionaldehid, zahteva hidrolizu acetalnog intermedijera na veoma niskoj pH, na primer, na pH vrednostima od 2 ili niže. Hidroliza na tako niskim vrednostima pH je nepoželjna zbog velike količine baze, neophodne za neutralizaciju reakcione smeše do pH vrednosti pogodnih za konjugaciju. Pored toga, kuplovanje PEG propionaldehida za protein pri baznim vrednostima pH može biti problematično zbog formiranja značajne količine akroleina (nastao iz sporedne reakcije retro-Mihaelovog (Michael) tipa), koga je jako teško ukloniti. Formiranje takvih neželjenih sporednih proizvoda povećava potrebu za prečišćavanjem kako bi se dobio proizvod farmaceutskog stepena čistoće.
Zbog toga, postoji potreba za poboljšanjem elektrofilno aktiviranih polimernih derivata za konjugaciju biološki aktivnih molekula i površina, naročito polimernih derivata koji (i) su selektivni u njihovoj herniji kuplovanja, (ii) se mogu proizvesti u visokom prinosu i u nekoliko reakcionih koraka, (iii) su stabilni u širokom opsegu vrdnosti pH, (iv) se mogu lako izolovati, (iv) se mogu proizvesti u visokom stepenu čistoće (odnosno, znatno odsustvo nečistoća nastalih iz polimera i sporednih proizvoda i (v) prevazilaze najmanje neke od nezgoda koje su prisutne kod poznatih polimernih derivata kao što su oni koji su gore opisani.
KRATAK PREGLED PRONALASKA
Ovaj pronalazak obezbedjuje jedinstvenu familiju polimernih alkanala - odnosno, polimere koji sadrže najmanje jednu aldehidnu funkcionalnu vezu, kuplovanu za polimerni segment pomoću jednog ili više umetnutih ugljenikovih atoma.
Polimerni alkanali iz pronalaska su znatno manje reaktivni u odnosu na prethodno dobijene aldehidne derivate i, zbog toga, mnogo selektivniji. Dalje, polimerni alkanali iz pronalaska su proizvedeni u visokom prinosu i neke strukture se mogu proizvesti u jednostrukom postupku u jednom koraku. Neki od polimernih aldehida koji su ovde opisani su mnogo stabilniji pri baznim vrednostima pH nego što su prethodno poznati aldehidni derivati i formirani su bez značajnih ili čak bez merljivih količina sporednih proizvoda reakcija retro-Mihaelovog tipa. Pored toga, polimerni alkanali iz pronalaska su formirani iz odgovarajućih acetalnih prekursora pomoću hidrolize pod blago kiselim uslovima, odnosno, pod mnogo manje oštrim kiselim uslovima nego što je potrebno za, bilo PEG acetaldehid ili PEG propionaldehid. Takvi blagi uslovi dozvoljavaju direktnuin situkonjugaciju polimernih derivata iz pronalaska sa proteinima, peptidima ili drugim ciljnim molekulima bez potrebe za korišćenjem izolacionog koraka. Polimerni alkanali iz pronalaska su takodje proizvedeni u visokom stepenu čistoće, što ih čini posebno pogodnim za kuplovanje za lekove i biofarmaceutike za dobijanje polimernih konjugovanih kompozicija koje imaju stepen čistoće koji je dovoljan za primenu kod subjekata sisara.
Još odredjenije, u jednom aspektu, ovaj pronalazak je usmeren na vodo-rastvorne polimere koji imaju strukturu:
U gore prikazanoj strukturi, POLI predstavlja vodo-rastvorni polimerni segment; X' je povezujući deo; z' je jedan ceo broj od 1 do oko 21; R<1>u svakom slučaju, je nezavisno H ili neki organski radikal odabran iz grupe koja sadrži alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril; i R<2>, u svakom slučaju, je nezavisno H ili neki organski radikal odabran iz grupe koja sadrži alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril.
U odredjenim slučajevima, polimerni alkanali iz pronalaska će posedovati odredjene karakteristike. Na primer, prema jednom rešenju pronalaska, kada je POLI linearan: (a) ukupan broj karbonila (isključujući/ne ubrajajući aldehidni karbonilni ugljenik) prisutnih u polimeru je 0 ili 2 ili veći osim kada X' obuhvata jedan ili više graničnih (-CH2CH20-) ili (-CH2CH2NH-) segmenata. Kada X' obuhvata jedan ili više graničnih (-CH2CH20-) ili (-CH2CH2NH-) segmenata, tada ukupan broj karbonila prisutnih u polimeru je 0,1,2 ili veći.
U još jednom primeru, prema unapredjenom rešenju, kada X' je kiseonik ili obuhvata najmanje jedan (-CH2CH20-) segment i z' je od 2 do 12, tada najmanje jedan od R<1>ili R<2>u najmanje jednom slučaju, je neki organski radikal kako je definisano gore ili je heterobifunkcionalni polimer, gde POLI obuhvata
V
reaktivnu grupu na jednom kraju koji nije hidroksil.
Polimerni alkanali dobijeni ovde mogu posedovati bilo koju od brojnih globalnih geometrija ili struktura, koje će biti opisane u više detalja ovde. Poželjno je da, kada je POLI razgranat, tada može biti da (i) najmanje jedan od R<1>ili R<2>u najmanje jednom slučaju je neki organski radikal kako je definisano gore ili (ii) X' uključuje -(CH2CH20)1>, gde je b od 1 do oko 20 u slučaju gde POLI obuhvata lizinski deo. Alternativno, kada je POLI razgranat i poseduje dva polimerna kraka, tada ni jedan polimerni krak ne sadrži kiseonik kao jedini heteroatom u slučaju kada POLI obuhvata "C-H" kao tačku granjanja.
Uopšteno govoreći, polimerni alkanali iz pronalaska poseduju strukturu gde z' spada unutar jednog od sledećih opsega: z' je od oko 2 do 21, od oko 3 do 12, od oko 3 do 8, ili od 3 do oko 6.
U jednom posebnom rešenju pronalaska, polimer ima strukturu:
gde POLI, X', svaki R<1>, svaki R<2>i R<3>su kako je definisano gore. U prethodnoj strukturi, Cioznačava aldehid karbonilni ugljenik; C2označava ugljenik koji je susedan do ili a (alfa), do karbonilnog ugljenika ili C^; C3označava atom ugljenika koji je uklonjen iz karbonilnog ugljenika ili u p (beta) poziciji; i C4označava atom ugljenika u y poziciji. Polimerni alkanali koji imaju globalnu strukturu opisanu sa I-A se generalno ovde vode kao polimerni butanali. U poželjnoj varijaciji sa formulom I-A gore, R<1>privezan za C2je alkil i sve druge R<1>i R<2>promenljive su H. Poželjno, R<1>privezan za C2je niži alkil. Alternativno, polimerni alkanal odgovara strukturi I-A gore, gde R<1>privezan za C3je alkil i sve druge R<1>i R<2>promenljive su H. U još jednom poželjnom rešenju, polimerni alkanal je opisan sa strukturom I-A gde R<1>privezan za C4 je alkil i sve druge R<1>i R<2>promenljive su H.
V
U još jednom posebnom rešenju, polimerni alkanal iz pronalaska odgovara formuli I i poseduje jedan dodatni atom ugljenika u alkilen lancu kada odgovara strukturi I-A. U ovom rešenju (videti strukturu I-B ovde), z' je 4, R<1>privezan za C2je alkil i sve druge R<1>i R<2>promenljive su H. Alternativno, može biti da R<1>privezan za C3 ili C4je alkil i sve druge R<1>i R<2>promenljive su H.
U još jednom posebnom rešenju, koje potpada u okvir formule I, z' je 5, R<1>privezan za C2 je alkil i sve druge R<1>i R<2>promenljive su H (videti strukturu I-C ovde). Alternativno, jedna od R<1>promenljivih, privezana za C3ili C4ili C5je alkil i sve druge R<1>i R<2>promenljive su H.
Polimerni alkanal u saglasnosti sa formulom I, u nekim rešenjima, poseduje povezujući deo generalno opisan sa formulom: -(CH2)c-De-(CH2)fili -(CH2)p-Mr-C(0)-Ks-(CH2)q-, gde je c u opsegu od nule do 8; D je 0, NH, ili S; e je 0 ili 1; f je u opsegu od nule do 8; p je u opsegu od nule do 8; M je -NH ili 0; K je NH ili 0; q je u opsegu od nule do 8 i r i s su, svaki nezavisno 0 ili 1. Specifični povezivači koji potpadaju u okvir ove generalne formule su opisani u više detalja u daljem tekstu.
Povezujući deo može opciono uključiti neki oligomerni segment koji odgovara strukturi -(CH2CH20)b- ili -(CH2CH2NH)g-, gde b i g su, svaki nezavisno 1 do 20. Poželjno, b i g, svaki nezavisno su u opsegu od oko 1 do 10 i čak poželjnije u opsegu od oko 1 do oko 6. Ovi oligomerni povezivači obezbedjuju dodatnu stabilnost alkanalima iz pronalaska i takodje obezbedjuju prednost u metodologiji sinteze za proizvodnju polimera, koji su opisani u više detalja u daljem tekstu.
Još odredjenije, u nekim rešenjima, X' obuhvata deo koji odgovara strukturi: -(CH2)c-De-(CH2)f-P- ili -(CH2)D-Mr-C(0)-MCH2)q-T-, gde su P i T, svaki nezavisno, -(CH2CH20)b- ili -(CH2CH2NH)g; i b i g, svaki nezavisno su u opsegu od 1 do oko 20. U specifičnom rešenju polimernih alkanala u saglasnosti sa formulom I, X' obuhvata -C(0)NH-(CH2)!.6NH-C(0)- ili -NHC(0)NH-(CH2)!.6NH-C(0)-.
Poželjno, vodo-rastvorni polimerni segment polimernog alkanala iz pronalaska je poli(alkilenoksid), poli(vinilpirolidon), poli(vinilalkohol), polioksazolin, poli(akriloilmorfolin) ili poli(oksietilovani poliol). U poželjnom rešenju, polimerni segment je poli(alkilenoksid), poželjno poli(etilenglikol).
Prema jednom rešenju, poli(etilenglikol) segment obuhvata strukturu: Z-(CH2CH20)n- ili Z-(CH2CH20)n-CH2CH2-, gde je n u opsegu od oko 10 do oko 4000 i Z je deo koji sadrži funkcionalnu grupu odabranu iz grupe koja sadrži hidroksi, amino, estar, karbonat, aldehid, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, sulfon, tiol, karboksilnu kiselinu, izocijanat, izotiocijanat, hidrazid, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, alkoksi, benziloksi, silan, lipid, fosfolipid, biotin i fluorescin.
Alternativno, POLI može biti terminalno kaptiran sa nekim terminalnim delom za zatvaranje, kao što je alkoksi, supstituisani alkoksi, alkeniloksi, supstituisani alkeniloksi, alkiniloksi, supstituisani alkiniloksi, ariloksi i supstituisani ariloksi. Poželjne grupe za terminalno zatvaranje uključuju metoksi, etoksi i benziloksi.
Generalno, POLI poseduje nominalnu prosečnu molekulsku masu koja spada u jedan od sledećih opsega: od oko 100 daltona do oko 100,000 daltona, od oko 1,000 daltona do oko 50,000 daltona, ili od oko 2,000 daltona do oko 30,000 daltona. Poželjne molekulske mase za POLI uključuju 250 daltona, 500 daltona, 750 daltona, 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa i 50 kDa, ili čak veće.
U još jednom posebnom rešenju, polimerni alkanal iz pronalaska obuhvata strukturu:
gde POLI, svaki X', svaki (z'), svaki R<1>, svaki R<2>i svaki R<3>su kako je prethodno definisano. U specifični rešenju, POLI je linearan i polimer je homobifunkcionalan.
Kako je navedeno gore, polimerni segment unutar polimernog alkanala može posedovati bilo koju od brojnih geometrija, kao što su linearna, razgranata, račvasta, multi-krakna, ili dendritična, što je opisano u više detalja u daljem tekstu.
Specifična rešenja pronalaska uključuju polimerne alkanale koji odgovaraju sledećim strukturama:
U gornjim strukturama, PEG je poli(etilenglikol) i b i g su, svaki nezavisno 0 do 20, a je 0 do 6. Za generalizovane strukture koje se nalaze u ovom odeljku, promenljive odgovaraju odnosu opseg/vrednost prethodno iznetom, ukoliko nije drugačije naznačeno.
U specifičnom rešenju, polimerni alkanal u saglasnosti sa pronalaskom odgovara strukturi:
Posebno poželjno je da polimerni alkanal koji spada u okvire generalizovane strukture III-D poseduje strukturu:
Prema drugom aspektu, pronalazak je usmeren na kompozite koji sadrže vodo-rastvorni polimer koji ima strukturu:
gde u kompoziciji nije prisutna merljiva količina vrsta koje sadrže jod ili proizvode reakcije retro-Mihaelovog tipa. To je posebna prednost jer vrste koje sadrže jod mogu dovesti do degradacije poli(etilenglikol)-nog lanca zbog rascepanja lanca, što dovodi do polimernih proizvoda koji imaju visoku vrednost polidisperzije, odnosno, veću od oko 1,2. Poželjno je da polimerni alkanal iz pronalaska poseduje vrednost polidisperzije manju od oko 1,2, poželjno je manje od oko 1,1 i čak poželjnije je manje od oko 1,05. Čak, najpoželjniji su polimerni alkanali kao što su oni koji su opisani ovde naznačeni time da imaju polidisperziju od 1,04,1,03 ili manje.
U saglasnosti sa još jednim aspektom, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži vodo-rastvorne polimere koji imaju strukturu:
gde je POLI linearan, terminalno kaptiran na kraju, vodo-rastvoran polimerni segment i u kompoziciji nije prisutna merljiva količina derivata dialdehidnog polimera.
Jedna dodatna osobina polimernih alkanala iz pronalaska je njihova stabilnost, odnosno, stabilnost tokom skladištenja, u poredjenju sa drugim poznatim kompozicijama polimernih aldehida. Na primer, ovde je dobijena kompozicija polimernog alkanala koja pokazuje 10 % ili manje degradacije polimerne aldehidne grupe kada se skladišti na 40 °C u toku 15 dana, kako je odredjeno pomoću NMR.
U prioritetnom rešenju, kompozicija pronalaska obuhvata polimerni alkanal koji odgovara sledećoj strukturi:
U čak prioritetnijem rešenju, u saglasnosti sa strukturom VII-A, POLI poseduje strukturu Z-(CH2CH20)n-CH2CH2-, gde Xje 0, nje u opsegu od oko 10 do oko 4000 i Z obuhvata funkcionalnu grupu, ciljani deo, reporter, zatvarajuću grupu ili slično.
Druga kompozicija iz pronalaska obuhvata polimer u saglasnosti sa strukturom:
U još jednom aspektu pronalaska, dobijeni su hidratni ili acetalni oblik gore-opisanog polimernog alkanala.
Acetali iz pronalaska uključuju dimetil acetal, dietil acetal, di-izopropil acetal, dibenzil acetal, 2,2,2-trihloretil acetal, bis(2-nitrobenzil) acetal, S,S'-dimetil acetal, S,S'-dietil acetal i dioksolane.
Još odredjenije, neki acetalni ili hidratni oblik polimernog alkanala iz pronalaska se može generalno opisati pomoću sledeće strukture:
gde W<a>i W<b>su, svaki nezavisno 0 ili S i R<3>i R<4>su, svaki nezavisno, H, ili neki organski radikal odabran iz grupe koja sadrži metil, etil, izopropil, benzil, 1,1,1-trihloretil i nitrobenzil, ili kada su uzeti zajedno,su-( CH2) rili -(CH^-, koji formiraju 5 ili 6-o člani prsten kada su uzeti u obzir zajedno sa W<a>, Cii sa W<b>. Polimerni acetali su korisni prekursori alkanala iz pronalaska i mogu se hidrolizovati do dobijanja polimernih alkanala.
U jednom posebnom rešenju, obezbedjen je vodo-rastvorni polimer koji ima strukturu:
U strukturi K-A, alkanal je onaj koji ima samo metilen ili -(CH2)- ugljenike koji odvajaju acetal ili aldehid hidratne delove molekula iz povezivača, X'.
Dalje, pronalazak je usmeren na konjugate koji se formiraju pomoću reakcije biološko aktivnih agenasa sa ovde opisanim polimernim alkanalima, njihovim hidratima i/ili odgovarajućim alkanalima.
Poželjno, konjugati odgovaraju sledećoj strukturi:
gde "NH-biološko aktivni agens" predstavlja biološko aktivni agens koji sadrži neku amino grupu.
Takodje, deo ovog pronalaska čine hidrogelovi formirani iz ovde opisanih polimernih alkanala ili njihovih prekursora.
U saglasnosti sa još jednim aspektom, pronalazak obezbedjuje zaštićene aldehidne reagense. Ovi zaštićeni aldehidni reagensi su posebno korisni za formiranje polimernih alkanala iz pronalaska i odgovaraju generalno sledećim strukturama:
gde je G funkcionalna grupa i preostale promenljive imaju vrednosti utvrdjene gore.
U prioritetnim rešenjima za strukture XI-A, B i C, G je odlazeća grupa, kao što je hlorid, bromid, para-tolilsulfonat estar, metilsulfonil estar, trifluorsulfonilestar i trifluoretilsulfonil estar.
Alternativno, G je funkcionalna grupa odabrana iz grupe koja sadrži -OH, - NH2, -SH i njihove zaštićene oblike.
Još jedan aspekt pronalaska je usmeren na metod za proizvodnju vodo-rastvornog polimernog alkanala, opciono u zaštićenom obliku. Ukratko, metod uključuje korake reakcije vodo-rastvornog polimera koji sadrži najmanje jednu reaktivnu grupu, Y, sa zaštićenim alkanalnim reagensom koji sadrži od oko 2 do 20 ugljenikovih atoma i reaktivnu grupu, K, pogodnu za dislociranje ili alternativno, reakciju sa Y, pod uslovima efikasnim za formiranje u vodi rastvornog polimernog alkanala u zaštićenom obliku. U ovoj metodi, aktivirani polimer je kuplovan za reagens koji nosi alkanalni deo krajnjeg proizvoda ili prekursor uz to.
Poželjno, reakcija je izvedena pod inertnom atmosferom.
U jednom specifičnom rešenju, POLI-Y, je proizveden pomoću direktne polimerizacije.
Metod može takodje uključiti dodatni korak hidrolize zaštićenog, u vodi rastvornog polimernog alkanala, na primer, u kiselim uslovima, pri čemu se formira odgovarajući, u vodi rastvorni polimerni alkanal.
U prioritetnom rešenju, korak hidrolize je izveden pri vrednosti pH nižoj od oko 3.
Zaštićeni oblici alkanalnog reagensa za izvodjenje metode uključuju acetale kao što su dimetil acetal, dietil acetal, di-izopropil acetal, dibenzil acetal, 2,2,2-tirhloretil acetal, bis(2-nitrobenzil) acetal, S,S'-dimetil acetal i S,S'-dietil acetal, ciklični acetali i ciklični tioacetali.
Još, u daljem rešenju, polimerni alkanal tako proizveden je izolovan pomoću podizanja pH vrednosti reakcione smeše do oko 6,0 do 7,5, ekstrahovanja polimernog alkanala u nekom organskom rastvaraču i uklanjanja rastvarača.
U prioritetnom rešenju za metod, u vodi rastvorni polimer odgovara strukturi, "POLI-Y" i zaštićeni alkanalni reagens odgovara strukturi:
Poželjno, POLI obuhvata poli(etilenglikol) koji može ili ne mora biti terminalno kaptiran na završetku.
U jednom posebnom rešenju za metod, POLIT obuhvata strukturu Z-(CH2CH20)nH, gde je n od oko 10 do oko 4000 i Z je odabran iz grupe koja sadrži -OCH3, -OCH2CH3i -OCH2(C6H5). U daljem rešenju, POLI-Y obuhvata strukture Z-(CH2CH20)nCH2CH20-M<+>, gde POLIT je dobijen pomoću polimerizacije sa anjonskim otvaranjem prstena etilen oksida na soli alkoholata koja je kaptirana na završetku, kao što je Z-CH2CH20"M<+>, koja je dobijena pomoću metalacije terminalne -OH grupe na Z-CH2CH2OH, sa jakom bazom. M<+>predstavlja metalne jone kao što su Na<+>, K<+>, Li<+>, Cs<+>, Rb<+>. POLIT tako dobijen je tada pogodan za reakciju sa zaštićenim alkanalnim reagensom kao što je opisano u tekstu gore.
U još daljem, posebno prioritetnom rešenju, izolovani alkanal je potpuno bez merljivih količina neizreagovanog POLI Y (na primer, Z- (CH2CH20)nH) i proizvoda reakcija retro-Mihaelovog tipa.
U još jednom rešenju za metod, POLIT odgovara PEG-diolu, tako da se može reći, POLIT poseduje strukturu HO-(CH2CH20)nH, gde je n od oko 10 do oko 4000, Kje odabran iz grupe koja se sastoji od: i iz metode se dobija zaštićeni polimerni alkanal koji ima strukturu:
U još jednom rešenju za metod, POLI-Y obuhvata strukturu Z-(CH2CH20)nH, gde je n od oko 10 do oko 4000 i Z je zaštićeni hidroksil. U tom slučaju, prioritetno rešenje za metod uključuje deprotekciju (skidanje zaštite) zaštićenog hidroksila nakon reakcionog koraka, što je opciono praćno konverzijom terminalnog hidroksila na poli(etilenglikol)-u do funkcionalne grupe koja se razlikuje od hidroksila.
Primeri funkcionalnih grupa uključuju amino, estar, karbonat, aldehid, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, sulfon, tiol, karboksilnu kiselinu, izocijanat, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid i silan. Poželjno, funkcionalna grupa je odabrana iz grupe koja sadrži N-hidroksisukcinimidil estar, benzotriazolil karbonat, amin, zaštićeni amin, vinilsulfon i maleimid.
U saglasnosti sa još jednim rešenjem pronalaska, "Y" u POLI-Yje neka jonizujuća grupa ili je derivat neke jonizujuće grupe kao što je karboksilna kiselina, aktivni estar, ili amin. Poželjno je da POLI-Y bude prečišćena hromatografski pre korišćenja u reakcionom koraku. U jednom posebnom rešenju, POLI-Y je prečišćen pre korišćenja, pomoću jonoizmenjivačke hromatografije. Idealno, u tako hromatografski prečišćenom POLIT za korišćenje u reakcionom koraku bitno je odusustvo merljivih količina polimernih nečistoća. U jednom takvom rešenju za ovaj metod, POLIT je kaptiran na završetku i bitno je odsustvo merljivih količina PEG-diola ili difunkcionalnih PEG nečistoća.
Alternativno, u izvodjenju metode pronalaska, alkanalni reagens obuhvata strukturu:
gde su g i b, svaki nezavisno, u opsegu od oko 1 do oko 20. Kao primer, poželjni alkanalni reagens odgovara strukturi: i proizvod reakcionog koraka poseduje opštu strukturu:
U još jednom pristupu za dobijanje polimernog alkanala iz pronalaska, polimerni alkanal, kako je opisan ovde, je dobijen pomoću ugradnje polimernog segmenta direktno u neki acetalni prekursor, kao na primer, pomoću direktne polimerizacije. Još odredjenije, ovaj metod obuhvata sledeće korake: (i) obezbedjenje acetalnog prekursora koji sadrži najmanje jedno aktivno anjonsko mesto pogodno za inicijaciju polimerizacije, (ii) kontakt anjonskog mesta acetalnog prekursora sa reaktivnim monomerom sposobnim za polimerizaciju, kako bi se inicirala polimerizacija reaktivnog monomera na acetalnom prekursoru , (iii) kao rezultat navedenog kontaktnog koraka, dodatak dodatnih reaktivnih monomera u acetalni prekursor za formiranje polimernog lanca, (iv) omogućavanje trajanja navedenog kontakta dok se ne postigne željena dužina polimernog lanca, i (v) završetak reakcije za dobijanje polimernog aldehidnog prekursora iz pronalaska.
Dobijeni polimerni aldehidni prekursor se može dalje hidrolizovati do odgovarajućih alkanala kao što je izneto u tekstu gore, ako se želi.
U jednom posebnom rešenju za gore navedeni metod, reaktivni monomer je etilen oksid i reaktivno anjonsko mesto koje se nalazi unutar acetalnog prekursora je neki alkoksid anjon (0"), poželjno udružen sa nekim alkalnim metalom ili drugim pogodnim suprotno naelektrisanim elementom. Alkoksidna krajnja grupa prisutna u acetalnom prekursoru je aktivna za polimerizaciju sa otvaranjem anjonskog prstena etilen oksida do formiranja polimernog alkanala iz pronalaska.
Acetalni prekursor će generalno posedovati strukturu koja odgovara sledećoj:
gde promenljive poseduju vrednosti koje su gore opisane, sa izuzetkom da X' završava sa jednim kiseoničnim anjonom, ili 0"(na primer, u svom neutralnom obliku, X' se obično završava sa hidroksil grupom ili -OH, tako da se u prisustvu jake baze, konvertuje do odgovarajuće alkoksidne soli). Pogodni suprotno
naelektrisani elementi uključuju Na<+>, K<+>, Li<+>i Cs<+>. Završni korak generalno obuhvata neutralizaciju reakcije, na primer, pomoću dodavanja kiseline. Opciono, polimerni segment može biti kaptiran pomoću dodavanja nekog alkilirajućeg reagensa ili drugog reagensa pogodnog za obezbedjivanje nereaktivnog kraja.
Ovi i drugi predmeti i karakteristike iz pronalaska će biti očigledniji kada se budu čitali uz sledeći detaljni opis.
KRATAK OPIS SLIKE
SLIKA 1 je opšta reakciona shema za dobijanje polimernog alkanala iz pronalaska pomoću polimerizacije sa otvaranjem anjonskog prstena etilen oksida (EO) na nekom acetalnom prekursoru koji ima anjonsko mesto.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Pre opisa ovog pronalaska u detalje, treba shvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na posebne polimere, tehnike sinteze, aktivne agense i slično, jer oni mogu varirati. Takodje je potrebno razumeti da ovde korišćena terminologija je samo za opisivanje posebnih rešenja i nije ograničavajuća.
Mora se naglasiti da, kako je korišćeno u ovim specifikacijama, jedinični oblici "jedan" i "neki" uključuju i značenja množine ukoliko kontekst jasno ne odredjuje drugačije. Tako na primer, značenje jedan "polimer" uključuje jedinični polimer kao i dva ili više ista ili različita polimera, značenje jedan "konjugat" se odnosi na jedinični konjugat kao i na dva ili više istih ili različitih konjugata, značenje neki "ekscipijent" uključuje jedinični ekscipijent kao i dva ili više istih ili različitih ekscipijenata i slično.
U opisivanju i zahtevima ovog pronalaska, koristiće se sledeća terminologija u saglasnosti sa definicijama koje su opisane u daljem tekstu.
DEFINICITE
Sledeći termini, koji su korišćeni ovde, imaju prikazana značenja.
Kako je korišćeno u specifikaciji i u dodatim zahtevima, jedinični oblik "jedan", "neki", uključuje značenje oblika množine ukoliko kontekst jasno ne odredjuje drugačije.
"PEG" ili "poli(etilenglikol)" koji je korišćen ovde, ima značenje koje obuhvata bilo koji vodo-rastvorni poli (etilen oksid). Obično, PEG za korišćenje u ovom pronalasku obuhvata jednu od sledeće dve strukture: "-(CH2CH20)n-" ili "-(CH2CH20)n.1CH2CH2-", u zavisnosti od toga da lije ili ne krajnji kiseoni-k (-ci), dislociran, kao na primer tokom sintetske transformacije. Promenljiva (n) je 3 do 3000 i krajnje grupe i globalna gradja PEG-a mogu varirati. Kada PEG dalje obuhvata povezujući deo (što će biti opisano u više detalja u daljem tekstu), atomi koji obuhvataju povezujući molekul (X'), koji je kovalentno privezan za PEG segment, ne dovode do formiranja (i) neke kiseonik-kiseonik veze (-0-0-, peroksidna veza), ili (ii) veze azot-kiseonik (N-O, O-N). "PEG" ima značenje daje polimer koji sadrži veći deo, može se reći, više od 50 %, podjedinica koje su -CH2CH20-. PEG za korišćenje pronalasku uključuje one PEG koji imaju različite molekulske težine, strukture ili geometrije (na primer, razgranati, linearni, račvasti PEG, dendritični i slično), što će biti opisano u više detalja u daljem tekstu.
"Vodo-rastvorni", u kontekstu polimera iz pronalaska ili "vodo-rastvorni polimerni segment" je bilo koji segment ili polimer koji je rastvoren u vodi na sobnoj temperaturi. Obično, vodo-rastvorni polimer ili segment će propuštati najmanje oko 75 %, poželjnije najmanje oko 95 % svetlosti, koja je propuštena od strane istog rastvora nakon filtracije. Računato na težinu, poželjno je da su vodo-rastvorni polimeri ili njihovi segmenti najmanje oko 35 % (od težine) rastvorni u vodi, poželjnije je da su najmanje 50 % (od težine) rastvorni u vodi, još poželjnije da su oko 70 % (od težine) rastvorni u vodi i još poželjnije je da su oko 85 % (od težine) rastvorni u vodi. Najpoželjnije je, medjutim daje vodo-rastvorni polimer ili segment oko 95 % (od težine) rastvoran u vodi ili potpuno rastvoran u vodi.
Neka "kaptirajuća na završetku" ili "kaptirana na završetku" grupa je neka inertna grupa prisutna na kraju polimera, kao što je PEG. Neka kaptirajuća na završetku grupa je ona koja ne podleže lako hemijskoj transformaciji pod tipičnim uslovima reakcije sinteze. Neka kaptirajuća na završetku grupa je generalno neka alkoksi grupa, -OR, gde je R neki organski radikal koji se sastoji od 1 - 20 ugljenika i poželjno je, niži alkil (na primer, metil, etil) ili benzil. "R" može biti zasićen ili nezasićen i uključuje aril, heteroaril, ciklo, heterociklo i supstituisani oblik bilo kog od prethodnih. Na primer, jedan kaptiran na završetku PEG će obično sadržati strukturu "RO-(CH2CH20)n", gde je R, kako je definisano u tekstu gore. Alternativno, kao pogodnost, kaptirajuća na završetku grupa može služiti kao merljivi indikator - trejser. Kad polimer ima neku krajnje-zatvarajuću grupu koja je merljivi indikator, količina ili položaj polimera i/ili dela (na primer aktivni agens) za koji je polimer vezan, se može odrediti korišćenjem pogodnog detektora. Takvi indikatori mogu biti, bez ograničenja, fluorescenti, hemiluminescenti, delovi koji se koriste u obeležavanju enzima, kolorimetrici (na primer, boje), metalni joni, radioaktivni delovi i slično.
"Koji se ne javljaju u prirodi" u odnosu na polimere iz pronalaska, ima značenje da su polimeri koji se u svojoj celosti ne nalaze u prirodi. Polimeri iz pronalaska koji se ne javljaju u prirodi, mogu medjutim, sadržati jednu ili više podjedinica ili segmenata podjedinica koji se javljaju u prirodi, tako dugo dok se globalna polimerna struktura ne nalazi u prirodi.
"Molekulska masa" u kontekstu vodo-rastvornih polimera iz pronalaska kao što je PEG, se odnosi na nominalnu prosečnu molekulsku masu polimera, koja se obično odredjuje pomoću gel propusne (siže eksclusion) hromatografije, tehnika rasipanja svetlosti ili odredjivanja unutrašnje brzine u 1,2,4-trihlorbenzenu. Polimeri iz pronalaska su obično polidisperzni, poseduju nisku vrednost polidisperzije od manje od oko 1,20.
Termin "reaktivni" ili "aktiviran" kada se koristi uz odredjene funkcionalne grupe, se odnosi na funkcionalnu grupu koja lako reaguje sa nekim elektrofilom ili nukleofilom, koji je obično prisutan na drugom molekulu i podleže transformaciji. To je u suprotnosti sa onim grupama koje zahtevaju jake kataliztore ili oštre reakcione uslove u cilju reagovanja (na primer "nereaktivne" ili "inertne" grupe).
Termin "zaštićen" ili "zaštitna grupa" ili "protektivna grupa" se odnosi na prisustvo delova (odnosno, zaštićene grupe) koja sprečava ili blokira reakciju sa odredjenom hemijski reaktivnom funkcionalnom grupom u molekulu pod odredjenim reakcionim uslovima. Zaštićena grupa će se razlikovati u zavisnosti od tipa hemijski reaktivne grupe koja je zaštićena kao i od reakcionih uslova koji se primenjuju i prisustva dodatnih reaktivnih ili zaštićenih grupa u molekulu, ako ih ima. Zaštitne grupe poznate u oblasti se mogu naći u Greene, T.W. isar..Protective Grou<p>s in Or<g>anic Sintesis. 3rd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York,NY(1999).
Kako je korišćeno ovde, termin "funkcionalne grupe" ili bilo koji sinonim za to, označava da obuhvata njihove zaštićene oblike.
Termin "povezujući deo" je ovde korišćen da označi neki atom ili skup atoma opciono korišćenih za medjusobno povezivanje delova, kao što je polimerni segment i neki alkanal. Povezujući delovi u pronalasku mogu biti hidrolitički stabilni ili mogu uključiti fiziološki hidrolizujuće ili enzimski razgradljive povezivače.
"Fiziološki rascepljiva" ili "hidrolizujuća" ili "razgradljiva" veza je relativno slaba veza koja reaguje sa vodom (odnosno, hidrolizuje) pod fiziološkim uslovima. Tendencija veze da hidrolizuje u vodi će zavisiti od, ne samo opšteg tipa povezivača koji povezuje dva centralna atoma, već i od supstituenata privezanih za te centralne atome. Odgovarajući hidrolitički nestabilni ili slabi povezivači uključuju ali se ne ograničavaju na, karboksilatni estar, fosfatni estar, anhidride, acetale, ketale, aciloksialkil etre, imine, ortoestre, peptide i oligonukleotide.
"Enzimatski razgradljiv povezivač" označava povezivač koji je podložan razgradnji sa jednim ili više enzima.
"Hidrolitički stabilan" povezivač ili veza, se odnosi na hemijsku vezu, obično kovalentnu vezu, koja je jako stabilna u vodi, može se reći, ne podleže hidrolizi pod fiziološkim uslovima do bilo kog primetnog stepena u toku dužeg vremenskog perioda. Primeri hidrolitički stabilnih povezivača uključuju, bez ograničenja, sledeće: ugljenik-ugljenik veze (kao na primer, u alifatičnim lancima), etre, amide, uretane i slično. Generalno, hidrolitički stabilan povezivač je onaj koji pokazuje stepen hidrolize manji od oko 1-2 % dnevno u fiziološkim uslovima. Stepen hidrolize reprezentativnih hemijskih veza se može naći u većini standardnih udžbenika iz hernije.
"Alkanal" se odnosi na aldehidni deo vodo-rastvornog polimera iz pronalaska (CHO), uključujući karbonilni ugljenik i bilo koje dodatne metilene ili supstituisane metilene (-C(R<!>) (R<2>)- sve do povezujućih delova koji vezuju
alkanalni deo polimera za polimerni segment. U navedenom alkanalnom segmentu Cl odgovara karbonilnom ugljeniku. Termin "alkanal", kako je ovde korišćen, ima značenje da obuhvata hidratne i zaštićene oblike aldehidne grupe, kao i analoge kalcogena. Jedan posebno poželjan zaštićeni oblik alkanala iz pronalaska je anacetal.
"Ukupan broj karbonila", u značenju za neke polimerne alkanale iz pronalaska, je ukupan broj karbonilnih grupa koje se nalaze u polimernom alkanalu, bez ubrajanja aldehidnog ugljenika.
"Razgranat" u značenju za geometriju ili globalnu strukturu polimera, označava da polimeri imaju 2 ili više polimernih "krakova". Razgranati polimeri mogu posedovati 2 polimerna kraka, 3 polimerna kraka, 4 polimerna kraka, 6 polimernih krakova, 8 polimernih krakova ili više. Jedan poseban tip jako razgranatih polimera je dendritični polimer ili dendrimer, za koji se smatra da za svrhe pronalaska, poseduje strukturu različitu od one koju imaju razgranati polimeri.
"Tačka granjanja" se odnosi na tačku razdvajanja koja obuhvata jedan ili više atoma u kojima se polimeri dele ili granaju iz linearne strukture u jednu ili više dodatnih polimernih krakova.
"Dendrimer" je loptast, monodisperzni polimer u kome se sve veze javljaju zvezdasto od centralne fokalne tačke ili jezgra sa regularnim modelom granjanja i sa ponovljenim jedinicama od kojih svaka doprinosi tački granjanja. Dendrimeri pokazuju neka svojstva dendritičnih stanja kao što je inkapsulacija jezgra, što ih
čini jedinstvenim u odnosu na druge tipove polimera.
"Znatno" ili "bitno" označava skoro potpuno ili kompletno, na primer, 95 % ili više od neke date količine.
"Proizvodi retro-Mihaelovog tipa" se odnosi na proizvde nastale iz reverznih ili reakcija adicije Mihaelovog-tipa. Mihaelove reakcije adicije (pravac u napred) se odnosi na adiciju nukleofilnih ugljeničnih vrsta do neke elektrofilne dvostruke veze. Obično, ali ne obavezno, nukleofil je neki enolat ili neki enamin mada nukleofil može biti takodje neki alkoksid ili neki amin ili druge vrste. Elektrofil je obično neki alfa, beta-nezasićeni keton, estar, ili nitril, mada druge grupe, primaoci elektrona takodje mogu aktivirati ugljenik-ugljenik dvostruku vezu za nukleofilni napad. Proizvod nastao iz reverzne (ili suprotno usmerene)
adicije Mihaelovog tipa, kako je opisano gore, tako da se može reći, neka reakcija eliminacije koja dovodi do gubitka nukleofilnih ugljeničnih vrsta (to može biti, ali ne obavezno, neki enolat ili enamin) i formiranja neke elektrofilne dvostruke veze kao što je neki alfa, beta nezasićen keton ili slično, kako je opisano u tekstu gore, se smatra proizvodom retro - Mihaelovog tipa. Na primer, reakcija retro - Mihaelovog tipa za mPEG-propionaldehid daje proizvode retro-Mihaelovog tipa, mPEG-OH i akrolein (CH2=CH-CHO).
"Alkil" se odnosi na ugljovodonik, koji obično sadrži u opsegu od oko 1 do 20 atoma u dužini. Takvi ugljovodonični lanci su, poželjno ali ne obavezno, zasićeni i mogu biti razgranati ili ravni lanci, mada je obično poželjno da bude ravan lanac. Primeri alkil grupa uključuju metil, etil, propil, butil, pentil, 1-metilbutil, 1-etilpropil, 3-metilpentil i slično. Kako je korišćeno ovde, "alkil" uključuje cikloalkil kada je tri ili više atoma ugljenika vezano.
"Niži alkil" se odnosi na alkil grupu koja sadrži od 1 do 6 atoma ugljenika i može biti ravan lanac ili razgranat, kao primeri su metil, etil, n-butil, i-butil, t-butil.
"Cikloalkil" se odnosi na zasićen ili nezasićen ciklični ugljovodonikov lanac, uključujući premošćena, spojena ili spiro ciklična jedinjenja, poželjno izgradjena od 3 do oko 12 atoma ugljenika, poželjnije od 3 do oko 8.
"Neometajući supstituenti" su one grupe koje, kada su prisutne u molekulu, su obično nereaktivne sa drugim funkcionalnim grupama koje se nalaze unutar molekula.
Termin "supstituisani" kao u, na primer, "supstituisani alkil" se odnosi na deo (na primer, neka alkil grupa) supstituisan sa jednim ili više neometajućih supstituenata, kao što su, bez ograničenja: C3-C8cikloalkil, kao na primer, ciklopropil, ciklobutil i slično; halo, kao na primer, fluor, hlor, brom i jod; cijano; alkoksi, niži fenil; supstituisani fenil; i slično. Za supstituciju na fenilnom prstenu, supstituenti mogu biti u bilo kojoj orijentaciji (odnosno, orto, meta ili para).
"Alkoksi" se odnosi na neku -O-R grupu, gde R je alkil ili supstituisani alkil, poželjno C1-C20alkil (kao na primer, metoksi, etoksi, propiloksi, benzil i slično), poželjno C1-C7.
Kako je korišćeno ovde, "alkenil" se odnosi na razgranati ili nerazgranatu ugljovodoničnu grupu sa od 1 do 15 atoma u dužini, koja sadrži najmanje jednu dvostruku vezu, kao što je etenil, n-propenil, izopropenil, n-butenil, izobutenil, oktenil, decenil, tetradecenil i slično.
Termin "alkinil", kako je ovde korišćeno, se odnosi na razgranani ili nerazgranatu ugljovodoničnu grupu od 2 do 15 atoma u dužini, koja sadrži najmanje jednu trostruku vezu, etinil, n-propinil, izopropinil, n-butinil, izobutinil, oktinil, decinil i tako dalje.
"Aril" ima značenje daje jedan ili više aromatičnih prstenova, svaki sa od 5 ili 6 atoma ugljenika u jezgru. Aril uključuje multiple aril prstenove koji mogu biti spojeni, kao kod naftila ili nespojeni, kao u bifenilu. Arilni prstenovi mogu takodje biti spojeni ili nespojeni sa jednim ili više cikličnih ugljovodonika, heteroarila ili
heterocikličnih prstenova. Kako je korišćeno ovde, "aril" uključuje heteroaril.
"Heteroaril" je neka arilna grupa koja sadrži od jedan do četiri heteroatoma, poželjno N, 0, ili S, ili njihovu kombinaciju. Heteroarilni prstenovi mogu takodje biti spojeni sa jednim ili više cikličnih ugljovodonika, heterocikličnih, arilnih ili heteroarilnih prstenova.
"Heterocikli" ili "heterociklični" označavaju jedan ili više prstenova sa 5 - 12 atoma, poželjno 5 - 7 atoma, sa ili bez nezasićenja ili aromatičnog karaktera, koji imaju najmanje jedan atom u prstenu koji nije ugljenik. Poželjni heteroatomi uključuju sumpor, kiseonik i azot.
"Supstituisani heteroaril" je heteroaril koji ima jednu ili više neometajućih grupa kao supstituente.
"Supstituisani heterocikl" je heterocikl koji ima jedan ili više sporednih lanaca formiranih od neometajućih supstituenata.
"Elektrofili" označava neki jon, atom ili skup atoma koji mogu biti joni koji imaju elektrofilni centar, odnosno, centar koji prima elektrone, sposoban da reaguje sa nukleofilom.
"Nukleofili" označava neki jon ili atom ili skup atoma koji mogu biti joni koji imaju nukleofilni centar, odnosno centar koji prima elektrofilni centar i sposoban je da reaguje sa nekim elektrofilom.
"Aktivni agens" kako je ovde korišćeno, uključuje bilo koji agens, lek, jedinjenja, kompoziciju supstanci ili smešu koja obezbedjuje neka farmaceutska,
često korisna delovanja koja se mogu pokazatiin- vivoiliin vitro.To uključuje hranu, prehrambene dodatke, nutrijente, nutraceutike, lekove, vakcine, antitela, vitamine i druge korisne agense. Kao što je ovde korišćeno, ovi termini dalje uključuju bilo koju fiziološki ili farmakološki aktivnu supstancu koja proizvodi lokalni ili sistemski efekat kod pacijenta.
"Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent" ili "farmaceutski prihvatljivi nosač" se odnosi na ekscipijent koji se može uključiti u kompozicije pronalaska pri čemu ne dovodi do značajnih negativnih toksikoloških efekata kod pacijenta.
"Farmaceutski efikasna količina" i "terapeutski efikasna količina" su korišćeni ovde da označe količinu konjugata PEG-aktivnog agensa prisutnog u farmaceutskom preparatu koja je potrebna da se obezbedi željeni nivo aktivnog agensa i/ili konjugata u krvotoku ili u ciljanom tkivu. Precizne količine će zavisiti od brojnih faktora, kao što su na primer, odredjeni aktivni agens, komponente i fizičke karakteristike farmaceutskih preparata, ciljna grupa pacijenata, pacijenti koji se uzimaju u obzir i slično i lako ih mogu odrediti oni koji su iskusni u oblasti, na bazi informacija dobijenih ovde i dostupnih u relevantnoj literaturi.
"Multi-funkcionalan" u kontekstu polimera iz pronalaska označava polimerni oslonac koji ima 3 ili više funkcionalnih grupa koje se tu nalaze, gde
funkcionalne grupe mogu biti iste ili različite i obično su prisutne na polimernim krajevima. Multi-funkcionalni polimeri iz pronalaska obično sadrže od oko 3 -100 funkcionalnih grupa ili od 3 - 50 funkcionalnih grupa ili od 3 - 25 funkcionalnih grupa, ili od 3 -15 funkcionalnih grupa ili od 3 do 10 funkcionalnih grupa, ili će sadržati 3, 4, 5, 6, 7, 8,9 ili 10 funkcionalnih grupa unutar polimernog oslonca.
"Difunkcionalni" polimeri označava polimere koji imaju difunkcionalne grupe koje se tu nalaze, obično na polimernim krajevima. Kada su funkcionalne grupe iste, polimer se naziva homobifunkcionalan. Kada su funkcionalne grupe različite, polimer se naziva heterodifunkcionalan.
Bazni ili kiseli reagensi opisani ovde uključuju neutralne, naelektrisane i njihove bilo koje odgovarajuće soli.
"Poliolefinski alkohol" se odnosi na polimer koji sadrži neki olefinski polimerni oslonac, kao što je polietilen, koji ima multiple viseće hidroksil grupe privezane za polimerni oslonac. Jedan primer poliolefinskog alkohola je polivinilalkohol.
Kako je ovde korišćeno, "ne-peptidni" se odnosi na polimerni oslonac znatno oslobodjen peptidnih veza. Medjutim, polimeri mogu uključiti manji broj peptidnih veza smeštenih duž ponovljenih monomernih podjedinica, kao što je na primer, ne više od oko 1 peptidne veze na oko 50 monomernih jedinica.
Kako je ovde korišćeno, "hidrat" se odnosi na hidratisani aldehid koji se dobija dodavanjem molekula vode u aldehidnu grupu, koji zamenjuje karbonilnu funkcionalnu vezu sa dve hidroksil grupe. Aldehidi dostižu ravnotežu sa odgovarajućim hidratom u vodi.
Termin" analog kalcogena" se odnosi na analoge aldehida gde je atom kiseonika zamenjen sa drugim heteroatomom, generalno, sa sumporom, selenijumom ili telurijumom.
Termin "pacijent" se odnosi na živi organizam koji pati od ili leži zbog stanja koje se može sprečiti ili lečiti primenom polimera iz pronalaska, obično, ali ne obavezno, u obliku konjugata polimer-aktivni agens i uključuje i ljude i životinje.
"Opcioni" ili "opciono" znači da se većina opisanih okolnosti mogu ili ne mogu javiti, tako da opis uključuje slučajeve gde se okolnosti javljaju i slučajeve gde se ne javljaju.
POLIMER
U prvom aspektu, pronalazak obezbedjuje vodo-rastvorni polimer koji ima reaktivnu aldehidnu grupu. Polimeri pronalaska su jedinstveni u mnogo pogleda. Oni su proizvedeni ne samo u visokom prinosu već su i stabilni tokom skladištenja zbog odsustva štetnih reakcija sporednih proizvoda koje mogu dovesti do degradacije polimernih lanaca i slabe polimerne polidisperzije. Polimeri, posebno kaptirani na završetku polimeri, su pored toga proizvedeni u visokom stepenu čistoće, sa na primer, odsustvom merljivih količina dobijenih PEG-diola i drugih polimernih nečistoća. Ova odlika je posebno zgodna za proizvodnju kaptiranih na kraju PEG-polimera sa velikom molekulskom masom, kao na primer, sa molekulskom težinom od oko 30 kDa ili više, gde količina nečistoća PEG diola u sirovom materijalu, kao što je mPEG može varirati od oko 2 % od težine do 30 % od težine ili više, u zavisnosti od dobavljača. Pored toga, u nekim rešenjima, polimeri iz pronalaska su manje reaktivni od drugih poznatih polimernih aldehida, što ih čini manje diskriminatornim u reakcijama konjugacije i stabilnijim tokom transformacije, rukovanja i reakcionih postupaka.
O<p>šte strukturalne karakteristike i alkanalni deo
Uopšteno rečeno, polimer iz pronalaska poseduje polimerni segment povezan za od oko 1 do oko 21 graničnih metilena ili supstituisanih metilena koji se završavaju sa nekom aldehidnom funkcionalnom grupom (odnosno, alkanalnim delom) preko nekog umetnutog povezujućeg dela. Generalizovana struktura koja odgovara polimeru iz pronalaska je data dole kao Struktura I.
U značenjima opisa u tekstu gore, kada je u sprezi sa strukturom I, polimerni segment je predstavljen sa POLI, povezujući deo je predstavljen saX' i granični metileni (koji formiraju alkilenski lanac) ili supstituisani metileni (formiraju supstituisani alkilenski lanac) su predstavljeni sa -C(R<X>) (R<2>)-. Odredjenije, u Strukturi I, POLI je vodo-rastvorni polimerni segment; X' je povezujući deo; i z' je jedan ceo broj od 1 do oko 21. R<1>, u svakom slučaju, je nezavisno H ili neki organski radikal kao što je alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril. R<2>, u svakom slučaju, je takodje nezavisno H ili neki organski radikal kao što je iz grupe koja sadrži alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril. Mada mnoge od struktura eksplicitno dobijenih ovde su aldehidi, treba shvatiti da te iste strukture i u stvari pronalazak u celini, je proširen na odgovarajuće aldehidne hidrate, aldehide u zaštićenom obliku i analoge kalcogena, gde je karbonilni kiseonik u strukturi I zamenjen sa sumporom, selenijumom ili telurijumom.
Ovaj pronalazak obezbedjuje značajnu fleksibilnost u odnosu na veličinu alkilenskog lanca povezanog za aldehidnu grupu. Dužinom ugljeničnog lanca se smatra karbonilni ugljenik (Cl) plus broj umešanih atoma ugljenika, (kao na primer, ukupan broj C obuhvata [-^(R1)(R2)]^ deo polimera), koji povezuju karbonilni ugljenik za povezujući deo. Dužina ugljeničnog lanca je obično 3 do oko 22 atoma ugljenika, ili uobičajenije od oko 4 do oko 13 atoma ugljenika. U značenjima za strukturu I, gore, to znači daje vrednost za z' obično u opsegu od 2 do oko 21, ili uobičajenije od oko 3 do 12. Još odredjenije, vrednost za z' je najčešće jedna od sledećih: 1,2,3,4, 5, 6,7,8,9,10,11,12, ili veća. Najpoželjnije su z' vrednosti u opsegu od 2 do oko 8. Jedan posebno poželjan polimerni alkanal iz pronalaska je onaj gde z' je 3.
U značenju za strukturu I, gore, neki tipovi alkanala su posebno poželjni. Takva jedinjenja uključuju alkanale, kako je opisano gore, koji imaju najmanje jedan organski radikal koji je pozicioniran na najmanje jednom "C" u ugljeničnom lancu. Organski radikal može biti bilo koji od organskih radikala pomenutih gore, kao na primer, alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril, sa tim daje poželjan alkil. Obično, alkilna grupa je ravan lanac nižih alkila ili razgranati niži alkil, kao što je metil, etil, propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil, pentil i dr., sa tim da je ravan lanac generalno poželjan. Jedan posebno poželjan alkil supstituent je metil.
Mada alkanalni delovi polimera mogu posedovati više od jednog organskog radikala koji je pozicioniran na jednom ili više "C" u ugljeničnom lancu, jedan tip poželjnih alkanala je onaj u kome samo jedan "C" u ugljeničnom lancu je supstituisan sa nekim organskim radikalom i svi drugi R<1>i R<2>su H. Na primer, u odnosu na dužinu alkilenskog lanca, poželjni su alkanali gde sve R<1>i R<2>promenljive su H, sa izuzetkom da: (i) jedan od R<1>ili R<2>pozicioniran na C-2 je alkil, ili (ii) jedan od R<1>ili R<2>pozicioniran na C-3 je alkil; ili (iii) jedan od R<1>ili R<2>pozicioniran na C-4 je alkil; ili (iv) jedan od R<1>ili R<2>pozicioniran na C-5 je alkil i tako dalje. Jedan posebno poželjan tp supstituenta u tom pogledu je niži alkil kao što je metil, etil, ili propil. Sinteza jednog ilustrativnog 2-metil supstituisanog alkanala iz pronalaska, mPEG-2-metilbutiraldehid, je opisan u Primeru 17.
U sadašnjem fokusiranju na alkanalni deo polimera, neki poželjni alkanali su prikazani u daljem tekstu.
Struktura I-A je jedna gde vrednost iz strukture I za z' je 3. Ova struktura, u odnosu na to da li je jedan ili više od C2, C3, ili C4 supstituisano sa alkilom ili drugim organskim radikalom, kako je opisano gore, je označena ovde kao "butiraldehid" ili kao "butanal". Ilustrativni polimerni butiraldehidi iz pronalaska uključuju one gde je alkanalni deo polimera, 2-metilbuitraldehid, 3-metil butiraldehid, ili 4-metilbutiraldehid, 2-etilbuitraldehid, 3-etilbuitraldehid, ili 4-etilbutiraldehid.
Struktura I-B je jedna gde vrednost iz strukture I za z' je 4. Ova struktura, u odnosu na to da li je jedan ili više od C2, C3, C4 ili C5 supstituisano sa alkilom ili drugim organskim radikalom, kako je opisano gore, je označena ovde kao "pentanal" ili kao "valeraldehid". Ilustrativni polimerni pentanali iz pronalaska uključuju one gde je alkanalni deo polimera, 2-metilpentanal, 3-metilpentanal, 4-metilpentanal, ili 5-metilpentanal. Dodatni polimerni pentanali uključuju one gde je alkanalni deo polimera, 2-etilpentanal, 3-etilpentanal, 4-etilpentanal, ili 5-etilpentanal.
Struktura I-C je jedna gde vrednost iz strukture I za z' je 5. Ova struktura, u odnosu na to da li je jedan ili više od C2, C3, C4, C5 ili C6 supstituisano sa alkilom ili drugim organskim radikalom, kako je opisano gore, je označena ovde kao "heksanal". Ilustrativni polimerni heksanali iz pronalaska uključuju one gde je alkanalni deo polimera, 2-metilheksanal, 3-metilheksanal, 4-metilheksanal, 5-metilheksanal, 6-metilheksanal, 2-etilpentanal, 3-etilpentanal, 4-etilpentanal, ili 5-etilpentanal.
Dodatne alkanalne komponente polimera iz pronalaska uključuju heptanale, oktanale, nonanale i slično.
POVEZUJUĆI DEO
U osvrtu na povezujući deo, povezujući deo ili jednostavno "povezivač" iz pronalaska, je predstavljen generalno sa promenljivom X'. Povezujući deo je deo globalnog polimera koji povezuje alkanalni deo polimera sa polimernim segmentom (koji će biti opisan u više detalja u daljem tekstu). Povezivač iz pronalaska može biti jedinični atom, kao što je kiseonik ili sumpor, dva atoma, ili veći broj atoma. Povezivač je obično, ali ne i obavezno, linearan u prirodi. Globalno, dužina povezivača će obično biti u opsegu izmedju 1 do oko 40 atoma, gde se pod dužinom podrazumeva broj atoma u jednom lancu, ne računajući supstituente. Na primer, -CH2- se broji kao jedan atom u odnosu na globalnu dužinu povezivača, -CH2CH20- se broji kao 3 atoma u dužini. Poželjno je da povezivač ima dužinu od oko 1 do oko 20 atoma, ili od oko 2 do oko 15 atoma.
Povezujući deo iz pronalaska može biti jedna funkcionalna grupa kao što je amid, estar, uretan, ili urea, ili može sadržati metilen ili druge alkilenske grupe bočno sa bilo koje strane jedne funkcionalne grupe. Alternativno, povezujući deo može sadržati kombinaciju funkcionalnih grupa koje mogu biti iste ili različite. Pored toga, povezujući deo može biti neki alkilenski lanac, koji opciono sadrži jedan ili više atoma kiseonika ili sumpora (odnosno, jedan etar ili tioetar). Poželjni povezivači su oni koji su hidrolitički stabilni. Kada se sagledava u kontekstu strukture I, povezivač je onaj koji se smatra delom globalnog polimera, pri tome ne dajući globalnu strukturu koja sadrži peroksidnu vezu(-0-O) ili jednu -N-O- ili -O-N- vezu.
Ilustrativni povezujući delovi, X', su oni koji odgovaraju bilo kojoj od sledećih struktura
U značenju za povezujuće strukture gore, promenljiva "c" je u opsegu od nule do 8; "D" je 0, NH, ili S; promenljiva "e" je 0 ili 1; promenljiva "f je u opsegu od nule do 8; promenljiva "p" je u opsegu od nule do 8; "M" je -NH ili 0; "K" je NH ili 0; promenljiva "q" je u opsegu od nule do 8 i promenljive "r" i "s" su svaka nezavisno 0 ili 1.
U kontekstu strukture I, povezujući deo pronalaska, X', može biti bilo koji od sledećih: -0-, -NH-, -S-, -C(0)-, C(0)-NH, NH-C(0)-NH, 0-C(0)-NH, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-,
-O-CHjrCH;,-, -CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-,
-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-,
-O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-CH2-, CH2-CH2-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH^CH^C^-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CHrC(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2CH2-C(0)-NH-CH2-,
-CHg-CH^CHa-C (O)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-,
-CH2-C (0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C (O-NH-CHz-CH^, -CH2-CH2-CH2C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-0-CHz-,CHrC(0)-0-CH2-, -CUrCHzC(0)-0-CH2-, -CCO-O-CHz-CHz-, -NH-C(0)-CH2-, -CHa-NH-C^-CH^, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-) -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-CH2, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2, -C(0)-NH-CH2-, -CCOJ-NH-CHz-CH-j-, -0-C(0)-NH-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH^, -NH-CH^CH^, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-,-C(0)-CH2, -C(0)-CH2-CH2, -CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CHyCHrNH-, -CH2-CH2-CH2-C (0)-NH-CH2-CH2-NH-C (0)-, -CH^CH^CHz-CCO-NH-CH^CHt-NH-CCOJ-CHz-, bivalentna cikloalkil grupa, -N(R6)-,-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2) j i kombinacija dva ili više od prethodnih, gde (h) je 0 do 6, (j) je 0 do 20, R<6>je H ili neki organski radikal odabran od grupe koja sadrži alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril. Drugi specifični povezivači imaju strukturu: -C(0)NH- (CH^.6NH-C(0)-, ili -NHC(0)NH-(CH2)!.6NH-C(0)- ili -OC(0)NH-(CH2)!.6NH-C(0)-, gde vrednosti u subskriptu, koje prate svaki metilen pokazuju koji je mogući broj metilena koji se nalazi u strukturi povezivača, na primer, (CH2)1.6 znači da povezivač može da sadrži 1,2,3,4,5, ili 6 metilena.
U svrhu ovog opisa, medjutim, nizovi atoma nisu uzete u obzir kao povezujući deo kada su nizovi atoma neposredno u susedstvu polimernog segmenta, POLI i kada nizovi atoma su drugi monomer tako da predloženi povezujući deo može predstavljati sam produžetak polimernog lanca. Na primer, imajući delimičnu strukturu "POLY-X'-", gde je POLI u ovom slučaju definisan kao "CH30(CH2CH20)n-", povezujući deo neće biti "-CH2CH20-<M>pošto tako definisan će samo predstavljati jedan nastavak polimera. Ne može se reći, medjutim, da povezivač pronalaska ne može posedovati jedan ili više graničnih - CH2CH20- delova. Na primer, povezivač može sadržati jednu ili više (-CH2CH20-) podjedinica, bočno na jednoj ili obe strane, sa jednom ili sa kombinacijom ilustrativnih povezivača, kako je predvidjeno gore.
Može se reći da, povezivač kako je opisan gore, može takodje uključiti neki oligomer kao što je -(CH2CH20)b- ili -(CH2CH2NH)K-, gde b i g, svaki nezavisno su u opsegu od 1 do oko 20. Podnosioci prijave su pronašli da uključivanje takvih oligomera unutar povezivača može pogodovati stabilnosti krajnjih polimernih alkanalnih proizvoda na račun produženja rastojanja izmedju aldehidne funkcionalne veze i bilo koje reaktivne grupe koja se nalazi unutar povezivača. Na taj način, intramolekularne interakcije su umanjene, što dovodi do povećanog prinosa tokom proizvodnje i poboljšane stabilnosti polimernog alkanalnog proizvoda. Poželjno je da, promenljive b i g budu u opsegu od oko 1 do 10, ili u nekim slučajevima, u opsegu izmedju oko 1 do 6. Sinteza jednog ilustrativnog polimernog alkanala koji ima četiri granične -(CH2CH20)- jedinice u povezivaču je opisana u Primeru 5.
Dodatni primeri specifičnih povezivača koji sadrže -(CH2CH20)- ili -
(CH2CH2NH)g- oligomerne segmente su prikazani dole, gde X' uključuje ili je definisan sa sledećim:
U ilustrativnim strukturama gore, P i T su, svaki nezavisno -(CH2CH20)b-ili -(CH2CH2NH)g, b i g su, svaki nezavisno 1 do 20 i ostale promenljive su, kako je definisano gore. Primeri poželjnih povezivača ove vrste su -0-C(0)-NH-(CH2CH20)b-, -C(0)-NH-(CH2CH20)b-, -NH-C(0)-NH-(CH2CH20)b-, -O-C(O)-NH-(CH2CH2NH)g-, -C(0)-NH-(CH2CH2NH)g- i -NH-C(0)-NH-(CH2CH2NH)g-.
U nekim slučajevima, na primer, kad POLI predstavlja linearni polimerni segment, tada je poželjno da ukupni broj karbonila prisutnih u polimernom alkanalu je 0 ili 2 ili veći, gde ukupan broj karbonila ne uključuje aldehidni karbonil(e). Medjutim, kada povezivač, X' uključuje jedan ili više graničnih (-CH2CH20-) segmenata, tada je poželjno da ukupan broj karbonila prisutnih u polimernom alkanalu je 0 ili 1 ili 2 ili 3 ili veći.
Vraćajući se na strukturu I, u još jednom poželjnom rešenju pronalaska, kada je X' kiseonik ili uključuje najmanje jedan (-CH2CH20-) segment i z' je u opsegu od 2 do 12, tada najmanje jedan od R<1>ili R<2>, u najmanje jednom slučaju, je neki organski radikal kako je definisano gore ili alternativno, polimer je heterobifunkcionalan.
U takvom slučaju, gde je polimer heterobifunkcionalan, polimerni segment, POLI, poželjno poseduje reaktivnu grupu najednom kraju koji nije hidroksi.
Poželjno, povezivač je hidrolitički stabilan i može sadržati jednu ili više od sledećih funkcionalnih grupa: amid, uretan, etar, tioetar ili urea. Medjutim, hidrolitički razgradljive veze, kao što su karboksilatni estar, fosfatni estar, ortoestar, anhidrid, imin, acetal, ketal, oligonukleotid ili peptid, mogu takodje biti prisutne u povezivaču iz pronalaska. Heteroatomski povezivači kao što su 0 ili S, su posebno poželjni, kao i povezivači koji sadrže oligomerne -(CH2CH20)b- ili -
(CH2CH2NH)g segmente kako je opisano gore.
Polimerni se<g>ment/<p>olieri za<p>roizvodnju<p>olimernih alkanala
Kao što je prikazano u ilustrativnim strukturama gore, polimerni alkanal iz pronalaska sadrži vodo-rastvorni polimerni segment. Reprezentativni POLI-i uključuju poli(alkilen glikole) kao što su poli(etilenglikol), poli(propilenglikol)
("PPG"), kopolimere etilenglikola i propilenglikola, poli(olefinski alkohol), poli (vinilpirolidon), poli (hidroksialkilmetakrilamid),
poli(hidroksialkilmetakrilat), poli(saharidi), poli(a-hidroksi kiseline), poli(vinilalkohol), polifosfazen, polioksazolin, poli(N-akriloilmorfolin). POLI može biti homopolimer, naizmenični kopolimer, nasumični kopolimer, blok kopolimer, naizmenični tripolimer, nasumični tripolimer, ili blok tripolimer bilo kog od navedenih gore. Vodo-rastvorni polimerni segment je poželjno, ali ne i obavezno, poli (etilenglikol) ili "PEG" ili njegovi derivati.
Polimerni segment može imati bilo koju od brojnih različitih geometrija, na primer, POLI može biti linearan, razgranat, ili račvast. Najčešće, POLI je linearan ili je razgranat, na primer, ima 2 polimerna kraka. Iako je veći deo razmatranja ovde fokusirano na PEG, kao ilustrativni POLI, diskusija i strukture prikazane ovde mogu biti lako proširene tako da obuhvate bilo koji od vodo-rastvornih polimernih segmenata opisanih gore.
Bilo koji vodo-rastvorni polimer koji ima najmanje jedan reaktivni kraj može biti koršćen za proizvodnju polimernog alkanala u saglasnosti sa pronalaskom i pronalazak nije ograničen u tom pogledu. Mada se mogu koristiti vodo-rastvorni polimeri koji nose samo jedan reaktivni kraj, polimeri koji nose dva, tri, četiri, pet šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest ili više reaktivnih krajeva, pogodni za konverziju u polimerni alkanal kao što je ovde utvrdjeno, mogu biti korišćeni. Pogodno je, kako broj hidroksil ili drugih reaktivnih delova u vodo rastvornom polimernom segmentu raste, broj dostupnih mesta za uvodjenje alkanalne grupe se povećava. Neograničavajući primeri gornjih granica broja hidroksil i/ili reaktivnih delova udruženih sa vodo-rastvornim polimernim segmentom uključuje 500,100,80,40,20 i 10.
Vratićemo se na poželjne POLI, PEG, "PEG", uključujući poli (etilenglikol) u bilo kom njihovom linearanom, razgranatom ili multi-krakastom obliku, uključujući PEG kaptiran na završetku, račvasti PEG, razgranati PEG, viseći PEG i PEG koji sadrži jednu ili više razgradljivih veza koje ih razdvajaju od monomernih podjedinica, kako bi smo ih opisali u više detalja u daljem tekstu.
Za proizvodnju polimernih alkanala iz pronalaska, jedan obično korišćen polazni PEG materijal je slobodni PEG, nelinearan polimer završen na svakom kraju sa hidroksil grupom:
Gornji polimer, alfa-, omega-dihidroksilpoli(etilenglikol), može biti prikazan u kratkom obliku kao HO-PEG-OH i takodje je naveden ovde kao PEG-diol, gde "-PEG-" u "HO-PEG-OH" odgovara:
i (n) je obično u opsegu od oko 3 do oko 4,000, ili od oko 3 do oko 3,000, ili poželjnije od oko 20 do oko 1,000. U navodu za strukturu I, POLI može na primer, da bude sa hidroksi završen PEG kao što je HO-CH2CH20-(CH2CH20)n.
i-CH2CH2-.
Još jedan tip PEG koristan za proizvodnju polimernih alkanala iz pronalaska je kaptiran na završetku PEG, gde je PEG na završetku kaptiran sa nekom inertnom kaptirajućom na završetku grupom. Poželjni kaptirani na završetku PEG su oni koji imaju, kao kaptirajući na završetku deo grupe kao što su alkoksi, supstituisani alkoksi, alkeniloksi, supstituisani alkeniloksi, alkiniloksi, supstituisani alkiniloksi, ariloksi, supstituisani ariloksi. Poželjne se kaptirajuće na završetku grupe, kao što su metoksi, etoksi i benziloksi.
Navodeći sada strukture I i I-A do I-C, POLI, u nekim rešenjima, bilo daje ili da obuhvata poli (etilenglikol) odgovara strukturi:
gde je n u opsegu od oko 3 do oko 4000, ili od oko 10 do oko 4000 i Z je ili uključuje funkcionalne grupe kao što su hidroksi, amino, estar, karbonat, aldehid, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, sulfon, tiol, karboksilna kiselina, izocijanat, izotiocijanat, hidrazid, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, alkoksi, benziloksi, silan, lipid, fosfolipid, biotin i fluorescin. Još jednom, POLI strukture prikazane neposredno gore mogu predstavljati linearan polimerni segment, ili mogu činiti deo razgranatog ili račvastog polimernog segmenta. U nekom slučaju, gde je polimerni segment razgranat, POLI strukture prikazane neposredno gore mogu, na primer, odgovarati polimernim krakovima čineći deo globalne POLI strukture. Alternativno, u primeru gde POLI poseduje račvastu strukturu, gornje POLI strukture mogu, na primer, odgovarati linearanom delu polimernog segmenta pre tačke granjanja.
POLI može takodje odgovarati razgranatom PEG molekulu koji ima 2 kraka, 3 kraka, 4 kraka, 5 krakova, 6 krakova, 7 krakova, 8 krakova ili više. Razgranati polimeri korišćeni za proizvodnju polimernih alkanala iz pronalaska, mogu posedovati bilo gde, od 2 do 300 reaktivnih krajeva. Poželjni su razgranati polimerni segmenti koji imaju 2 ili 3 polimerna kraka. Jedan ilustrativni razgranati POLI, kako je opisano u U.S. Patentu Br. 5,932,462, odgovara strukturi:
U ovom prikazu, R" je nereaktivni deo, kao što su H, metil ili PEG i P i Q su nereaktivne veze. U poželjnom rešenju, razgranati PEG polimerni segment je metoksi poli (etilenglikol) disupstituisani lizin.
U gornjoj posebnoj razgranatoj konfiguraciji, razgranati polimerni segment poseduje jedno reaktivno mesto, izvedeno iz "C" tačke granjanja, za pozicioniranje reaktivne alkanal grupe preko povezivača. Razgranati PEG, kao što su oni za korišćenje u ovom pronalasku, će obično imati manje od 4 PEG kraka i poželjnije, će imati 2 ili 3 PEG kraka. Takvi razgranati PEG imaju pogodnost, imajući jedno reaktivno mesto, udruženo sa većim, zgusnutijim polimernim oblikom nego što je njihov odgovarajući linearni PEG.
Jedan poseban tip razgranatog PEG alkanala odgovara strukturi: (MeO-PEG-)iG-X'-alkanal, gde je i jednako 2 ili 3 i G je lizin ili druga pogodna aminokiselina.
Jedan ilustrativni razgranati polimerni alkanal iz pronalaska ima strukturu prikazanu dole:
U ovom slučaju, povezivač odgovara C(0)-NH, opciono sadrži jedan oligomerni -(CH2CH20)b- ili-(CH2CH2NH)g-segment pozicioniran izmedju amidnog azota i alkanalnog dela u polimeru, kako je prikazano u Strukturi V-B dole. Oligomerni segmenti iz primera će posedovati b ili g vrednosti u opsegu od oko 1 do oko 40, ili od oko 1 do oko 30. Poželjno je da b ili g poseduju vrednosti od oko 20 ili manje. Poželjno je da b ili g imaju jednu od sledećih vrednosti: 2,3, 4, 5, 6,7, 8,9,10 ili veću. U posebno poželjnom rešenju, b ili g je u opsegu od 2 do 6 i mPEQai mPEGt, su isti ili se razlikuju.
Neka rešenja su poželjna za polimerne alkanale koji imaju razgranani strukturu. Na primer, u jednom posebnom rešenju, na primer kad POLI u Strukturi I je razgranat, tada najmanje jedan od R<1>ili R<3>, u najmanje jednom slučaju, je neki organski radikal, kako je definisano gore. U alternativnom poželjnom rešenju, na primer, kad POLI u Strukturi I je razgranat, tada X' uključuje -(CH2CH20)b- gde b je od 1 do oko 20, u slučaju gde POLI obuhvata lizinski deo. U situaciji kada POLI ima 2 polimerna kraka, poželjno je da ni jedan polimerni krak ne sadrži kiseonik kao jedini heteroatom u slučaju gde POLI obuhvata "C-H" kao tačku granjanja.
Razgranati PEG za korišćenje u proizvodnji polimernog alkanala iz pronalaska, dodatno uključuje one koji su predstavljeni opštije sa formulom G(PEG)n, gde G je centralni molekul ili jezgro iz koga se šire 2 ili više PEG kraka. Promenljiva n predstavlja broj PEG kraka, gde svaki od polimernih krakova može nezavisno biti kaptiran na završetku ili alternativno, da poseduje reaktivnu funkcionalnu grupu na svom kraju, kao što je neki alkanal ili druga reaktivna funkcionalna grupa. Razgranati PEG, kao što su ovi predstavljeni opštom formulom, G(PEG)n, gore, poseduje 2 polimerna kraka do oko 300 polimernih krakova (odnosno, n je u opsegu od 2 do oko 300). Razgranati PEG kao što su ovi, poželjno poseduju od 2 do oko 25 polimernih krakova, poželjnije od 2 do oko 20 polimernih krakova i čak poželjnije od 2 do oko 13 polimernih krakova ili manje. Najpoželjniji su multi-krakni polimeri koji imaju 3, 4, 5, 6,7 ili 8 krakova.
Poželjni jezgarni molekuli u razgranatom PEG, kako je opisano gore, su polioli. Ovakvi polioli uključuju alifatične poliole koji imaju od 1 do 10 atoma ugljenika i od 1 do 10 hidroksil grupa, uključujući etilenglikol, alkan diole, alkil glikole, alkiliden alkil diole, alkil cikloalkan diole, 1,5-dekalindiol, 4,8-bis(hidroksimetil)triciklodekan, cikloalkiliden diole, dihidroksialkane, trihidroksialkane i slično. Cikloalifatični polioli mogu se takodje upotrebiti, uključujući ravno-lančane ili šećere zatvorenog prstena i šećerne alkohole, kao što su manitol, sorbitol, inozitol, Xilitol, kvebracitol, treitol, arabitol, eritritol, adonitol, dulcitol, fakoza, riboza, arabinoza, Xiloza, liksoza, ramnoza, galaktoza, glukoza, fruktoza, sorboza, manoza, piranoza, altroza, taloza, tagitoza, piranozidi, saharoza, laktoza, maltoza, i slično. Dodatni alifatični polioli uključuju derivate gliceraldehida, glukozu, ribozu, manozu, galaktozu i srodne stereoizomere. Drugi jedarni polioli koji se mogu koristiti uključuju kron etar, ciklodekstrine, dekstrine i druge ugljene hidrate kao što su škrob i amiloza. Poželjni polioli uključuju glicerol, pentaeritritol, sorbitol i trimetilolpropan.
Multi-krakni PEG za korišćenje u proizvodnji polimernih alkanala iz pronalaska uključuju multi-krakne PEG dostupne iz Nektar, Huntsville, Alabama. U poželjnom rešenju, multi-krakni polimerni alkanal iz pronalaska odgovara sledećem, gde je specifični alkalni deo molekula opisan na drugom mestu u ovom pronalasku.
Alternativno, polimerni alkanali mogu posedovati globalnu račvastu strukturu. Jedan primer račvastog PEG odgovara strukturi: PEG-Y-CH-(X'-[CtR<1>) (R<2>)z--CHO)2, gde je PEG bilo koji od PEG opisanih ovde, Y je povezujuća grupa, poželjno hidrolitički stabilan povezivač i druge promenljive odgovaraju povezivaču i alkanalni deo je kako je definisano gore.
Dodatni ilustrativni račvasti PEG alkanal derivati odgovaraju sledećem:
gde je PEG bilo koji oblik PEG koji je opisan ovde. Q je hidrolitički stabilan povezivač, kao što su kiseonik, sumpor, ili -C(0)-NH-; m je u opsegu od 1 do 10, (tako, m može biti 1, 2, 3,4, 5, 6,7,8,9, ili 10) ali je poželjno da m je 1,2,3, ili 4; X je jedan opcioni atom i kada je prisutan, onda je 0 ili N; Y je NH ili 0; i V je jedan opcioni oligomerni segment, kao što su -(CH2CH20)b- ili (CH2CH2NH)g- kako je opisano ranije. Jedan primer razgranatog PEG koji odgovara "PEG", u gornjoj
formuli je mPEG disupstituisani lizin, gde "PEG" odgovara:
Alternativno, PEG polimerni segment za korišćenje u proizvodnji polimernog alkanala iz pronalaska, može biti PEG molekul koji ima viseću reaktivnu grupu duž cele dužine PEG lanca, pre nego na kraju (krajevima),kako bi se dobio polimerni alkanal koji ima jednu ili više visećih alkanal grupa
privezanih za PEG lanac pomoću povezivača, X'.
Dalje, polimerni segment može posedovati jedan ili više slabih ili razgradljivih povezivača, kao što je estarski povezivač, koji su podložni hidrolizi. Drugi hidrolitički razgradljivi povezivači koji se mogu naći u POLI, uključuju karbonat, imin, fosfatni estar i hidrazon.
Generalno, nominalna prosečna molekulska masa vodo-rastvornih polimernih segmenta, POLI će se razlikovati. Nominalna prosečna molekulska masa POLI obično je u jednom ili u više od sledećih opsega: oko 100 daltona do oko 100,000 daltona; od oko 500 daltona do oko 80,000 daltona; od oko 1,000 daltona do oko 50,000 daltona; od oko 2,000 daltona do oko 23,000 daltona; od oko 5,000 daltona do oko 20,000 daltona. Primeri za nominalne prosečne molekulske mase vodo-rastvornih polimernih segmenta POLI uključuju oko 1,000 daltona, oko 5,000 daltona, oko 10,000 daltona, oko 15,000 daltona, oko 20,000 daltona, oko 25,000 daltona, oko 30,000 daltona i oko 40,000 daltona. POLI male molekulske mase poseduju molekulske mase od oko 250, 500,750,1000, 2000, ili 5000 daltona.
Re<p>rezentativni<p>olimerni alkanali
Sledeći generalni opis iz teksta gore, date su neke ilustrativne strukture koje pokazuju poželjne polimerne alkanale u saglasnosti sa pronalaskom.
Na primer, polimerni alkanal iz pronalaska, kada je linearan, može posedovati homobifunkcionalnu ili heterobifunkcionalnu strukturu prema strukturi II dole. Homobifunkcionalna struktura prema strukturi dole je ona, gde su oba kraja ista.
Poželjne vrednosti za X' i -CR1!^2- su kako je utvrdjeno gore. Posebno poželjne strukture u saglasnosti sa strukturom II su one u kojima je POLI - poli(etilenglikol) iX' je -0-C(0)-NH-, -C(0)-NH-, -NH-C(0)-NH-, -0-C(0)-NH-(CH2CH20)b-, -C(0)-NH-(CH2CH20)b-, ili -NH-C(0)-NH-(CH2CH20)b- i z' je u opsegu od 2 do oko 12, a poželjnije je 2,3,4, 5, ili 6. Još odredjenije, reprezentativni polimerni alkanali iz pronalaska uključuju sledeće:
gde je PEG - poli (etilenglikol), b i g su, svaki nezavisno 0 do 20, a je 0 do 6, a ostale promenljive su kako je definisano ranije. Poželjne su strukture u kojima su b i g u opsegu od 1 do 8 ili alternativno u opsegu od 1 do oko 6. Iako je z' u opsegu od 1 do oko 21, poželjne su strukture u kojima je z' u opsegu od 2 do 6, na primer, 3 ili 4. Strukturalni predstavnici dva polimerna alkanala, gde promenljiva "a" (kao što je prikazano u strukturama neposredno gore) je nula, su prikazani dole.
Jedan ilustrativni polimer butanal poseduje strukturu:
Posebno poželjni PEG koji odgovara Strukturi III-D gore, uključuje Z-(CH2CH20)n- ili Dodatne razgranate strukture, u saglasnosti sa pronalaskom su, kako sledi, gde je b obično 0 do 20, s je obično 0 do 6 i d je 1,2 ili 3,
U Strukturama VI-A i B gore, PEG može biti linearan ili razgranat. Poželjno, R<1>i R<2>, u svakom slučaju su H i z' je u opsegu od 3 do 12 i čak poželjnije 3,4, 5 ili 6. Kao jedan primer, polimer u saglasnosti sa Strukturom VI-B je ona gde
PEG odgovara strukturi:
gde, Z je neka kaptirajuća na završetku ili funkcionalna grupa, kako je opisano ranije.
Još jedan ilustrativni polimerni alkanal iz pronalaska poseduje strukturu prikazanu dole:
U gornjem rešenju, polimerni alkanal takodje ima račvastu strukturu i pogodan je za kovalentno vezivanje za dva biološki aktivna agensa. Gornja struktura sadrži, u delu koji se širi iz -CH- tačke granjanja, povezivač koji sadrži oligomerne -(CH2CH20)- segmene, gde je broj takvih segmenata u svakom delu, 3. Broj takvih oligomernih segmenata u gornjoj strukturi može biti različit u saglasnosti sa generalizovanim opisom koji je dat gore.
Dalji primeri polimernih alkanalnih struktura uključuju sledeće, gde su promenljive ranije definisane:
Poželjno je što su, bilo koja od gornjih struktura, obezbedjene kao kompozicija koja ima jednu ili više jedinstvenih karakteristika kompozicije što je opisano u više detalja u daljem tekstu.
Karakteristike dobijenih kompozicija<p>olimernih alkanala i metode za njihovu<p>roizvodnju
Polimerni alkanali iz pronalaska poseduju nekoliko prednosti nad ranije proizvedenim polimernim aldehidima. Prvo, polimerni alkanali su proizvedeni u veoma visokom prinosu, delom zbog jednostavnosti sintetskog pristupa koji je primenjen, posebno za alkanale koji imaju kiseonik kao povezujući deo. Pored toga, u ispitivanju stabilnosti butanala iz pronalaska, otkriveno je da su ovi tipovi alkanala mnogo stabilniji pri baznim pH vrednostima nego raniji, poznati derivati polimernih aldehida (na primer, propionaldehidi, acetaldehidi) i da se dobijaju bez značajnih ili čak merljivih količina sporednih proizvoda reakcija retro-Mihaelovog tipa. Na priemer, kako je prikazano u Primeru 3, pod baznim uslovima, mPEG propionaldehid podleže reakciji retro-Mihaelovog tipa, pri čemu se dobija mPEG-OH i eliminacioni proizvod, akrolein, u značajnim količinama (nakon 24 sata na sobnoj temperaturi i pH 8, blizu 40 % PEG-propionaldehida je razgradjeno). Za razliku od toga, mPEG butiraldehid je značajno stabilniji pod baznim uslovima, ne pokazujući bitnu dekompoziciju te vrste pod primenjenim uslovima.
Dalje, derivati butanalnog polimera iz pronalaska dostižu ravnotežu u vodi sa odgovarajućim hidratom na oko 50 % hidrata, mnogo niže nego 70 % hidratna ravnoteža koja se postiže sa propionaldehidom i 100 % hidrata koja se pokazuje sa acetaldehidom. Niža reaktivnost derivata polimera iz pronalaska je takodjezapažena zbogveće stabilnosti derivata iz pronalaska pod baznim uslovima (videti Primer 3 dole). Nisu uočeni akroleinski sporedni proizvodi tokom reakcija konjugacije izmedju aldehidnih derivata iz pronalaska i proteina ili drugih molekula u baznoj pH. Niža reaktivnost aldehidnih derivata iz pronalaska ukazuje na to da su derivati iz pronalaska mnogo selektivniji, što znači da su pronadjeni derivati sposobni da reaguju sa većom selektivnošću ili specifičnošću sa specifičnim amino grupama, posebno N-terminalnim amino grupama, na proteinima ili peptidima, što je suprotno od neselektivne ili nasumične reakcije sa bilo kojim brojem amino grupa na proteinu ili peptidnom molekulu. U mnogim prijavama, selektivno N-terminalno vezivanje polimernog oslonca je poželjno zbog boljeg očuvanja proteinske konformacije i biološke aktivnosti.
Pored toga, polimerni alkanali iz pronalaska su formirani iz odgovarajućih acetalnih prekursora pomoću hidrolize pod blagim kiselim uslovima, odnosno, pod mnogo manje oštrim kiselim uslovima nego što je potrebno za bilo PEG acetaldehid ili PEG propionaldehid. Ako se želi, takvi blagi uslovi dozvoljavaju direktnuin situ konjugacijupolimernih derivata iz pronalaska sa proteinima, peptidima ili drugim ciljanim molekulima bez potrebe za upotrebom izolacionog koraka. Dalje, zbog primenjenog sintetskog pristupa, polimerni alkanali iz pronalaska su takodje dobijeni u visokom stepenu čistoće, često bez prisustva vrsta koje sadrže jod ili onih koje potpomažu dekompoziciju polimernog segmenta.
Zbog blagosti primenjenog sintetskog pristupa i dalje, zbog stabilne prirode stuktura koje su ovde dobijene, polimerni alkanali iz pronalaska su dodatno dobijeni kao kompozicije koje su znatno oslobodjene proizvoda reakcija retro-Mihaelovog tipa. Zbog toga, kompozicije polimernih alkanala, dobijene ovde, su posebno stabilne tokom skladištenja i pokazuju veoma ograničenu količinu, ukoliko je uopšte ima, razgradnje polimera. Kao jedan primer zasnovan na podacima o stabilnosti, prikupljenim tokom vremena, nadjeno je da polimerni alkanali iz pronalaska pokazuju manje od oko 10 % razgradnje polimerne aldehidne grupe, kada se skladište na 40 °C u toku 15 dana. Ovaj procenat razgradnje je odredjen pomoću NMR analiza. Dodatno, dobijeni su linearni mPEG polimerni alkanali iz pronalaska koji su znatno oslobodjeni od odgovarajućih PEG-dialkanala (odnosno, nečistoće homobifunkcionalnog PEG, nastale iz prisustva neke količine PEG-diola u mPEG-OH sirovom materijalu).
Vraćamo se sada mnogo odredjenije, na metode za dobijanje polimernih alkanala iz pronalaska, polimerni alkanal je generalno dobijen pomoću reakcije vodo-rastvornog polimera koji ima najmanje jednu reaktivnu grupu, Y, sa zaštićenim alkanalnim reagensom koji sadrži reaktivnu grupu, K, koja je pogodna za dislociranje ili alternativno, za reakciju sa Y, pod uslovima koji su efikasni za formiranje vodo-rastvornog polimernog alkanala u zaštićenom obliku. Generalno, zaštićeni alkanalni reagens će posedovati od oko 2 do oko 20 atoma ugljenika. Vodo-rastvorni polimerni alkanal u zaštićenom obliku na taj način formiran, se tada obično hidrolizuje, na primer, u kiselim uslovima i formira željeni vodo-rastvorni polimerni alkanal.
Obično, reakcija kuplovanja (odnosno, kuplovanje reaktivnog polimera i zaštićenog alkanalnog reagensa) se izvodi u nekom organskom rastvaraču, kao što su toluen, hlorform, metilenhlorid, acetonitril, aceton, dioksan, metanol i etanol. Reakciju je poželjno izvoditi pod inertnom atmosferom, na temperaturama koje se kreću od oko 20 °C do oko 150 °C. Hidroliza za formiranje željenih alkanala je obično potpomognuta kiselinom i vodi se na vrednostima pH ispod 7,0, sa poželjnim opsegom pH od oko 3 do oko 6,5. Hidroliza se može izvoditi na pH od oko 3, 4, 5 ili 6, sa poželjnim nižim vrednostima pH, oko 3.
Detaljni primeri sintetskog pristupa koji je ukratko opisan gore, su dati u Primerima 1, 2, 5 i 17.
Najčešće, kuplovanje polimernog segmenta za zaštićeni alkanalni reagens se odvija preko Vilijamsove (Williamson) etarske sinteze. Odredjenije, reaktivna grupa Y polimera je hidroksil (koji se u prisustvu jake baze konvertuje do svog odgovarajućeg anjonskog ili alkoksi oblika) i reaktivna grupa K na zaštićenom alkanalnom acetalnom reagensu je dobra odlazeća grupa, kao što su halidi (poželjno Cl- ili Br-) ili metil sulfat (sulfonatni estar), koja se može lako dislocirati pomoću kiseoničnog anjona koji je pozicioniran na polimernom kraju. Dobijena poželjna veza je neka etarska veza (0-) koja povezuje POLI za alkanal.
Nakon vezivanje za POLI, zaštićeni alkanal se hidrolizuje pri kiseloj pH do formiranja odgovarajuće aldehidne ili alkanalne funkcionalne grupe. Kao što je navedeno gore, alkanalni acetali, kao što je butanalni acetal, se hidrolizuju pod blažim uslovima nego odgovarajući propanal ili etanalni acetali. Na primer, kada z' je 3 ili veći, alkanalni acetal iz pronalaska može biti hidrolizovan pri pH od oko 3 ili 4 ili višoj, posebno kada R<1>i R<2>, u svim slučajevima su H. Kako je navedeno u Primerima 2 i 4, butanalna acetalna grupa, opisana tamo, je hidrolizovana u toku oko 3 sata na pH vrednosti 3. Sposobnost da formira ovu alkanalnu funkcionalnu grupu pod blagim kiselim uslovima, je prednost pošto se time omogućavain situkorišćenje aldehid-funkcionalizovanog polimera za konjugaciju za protein ili drugi biološki aktivan molekul nakon neutralizacije rastvora koji sadrži polimerni alkanal do pogodne pH za konjugaciju (obično pH od oko 5 do oko 10). Za razliku od toga, linearni polimerni propionaldehidi zahtevaju izolaciju pre konjugacije, zbog količine baze koja je potrebna za neutralizaciju niske pH rastvora i odgovarajuće veće količine soli koja se stvara tokom takvog koraka neutralizacije.
U primenjenoj metodi, zaštićeni alkanalni reagens je obično neki acetal kao što su dimetil acetal, dietil acetal, di-izopropil acetal, dibenzil acetal, 2,2,2-trihloretil acetal, bis(2-nitrobenzil) acetal, S,S'-dimetil acetal i S,S'-dietil acetal. Alternativno, acetal može biti ciklični acetal ili ciklični tioacetal.
Još odredjenije, zaštićeni alkanal će obično posedovati strukturu kao što je sledeća:
U ovoj strukturi, z' je jedan ceo broj od 1 do oko 21. Kao i za polimerne aldehide dobijene gore, R<1>, u svakom slučaju, je nezavisno H ili neki organski radikal odabran iz grupe koja sadrži alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril; i R<2>, u svakom slučaju, je nezavisno H ili neki organski radikal odabran iz grupe koja sadrži alkil, supstituisani alkil, alkenil, supstituisani alkenil, alkinil, supstituisani alkinil, aril i supstituisani aril. W<a>i W<b>su, svaki nezavisno 0 ili S i R<3>i R<4>su, svaki nezavisno, H ili neki organski radikal odabran iz grupe koja sadrži metil, etil, izopropil, benzil, 1,1,1-trihloretil i nitrobenzil, ili kada se uzmu zajedno, su -(CH2)2ili -
(CH2)3, formirajući 5 ili 6-o člani prsten kada se uzimaju u obzir zajedno sa W<a>, C!iW<b>.
Poželjno je, K je jedna od sledećih reaktivnih grupa:
U ovoj metodi, polimerni alkanal u zaštićenom obliku je obično formiran sa više od 95 % prinosa i čak poželjnije sa više od oko 90 do 95 % prinosa.
Nakon hidrolize do dobijanja željenog aldehid-funkcionalizovanog polimera, proizvod može biti izolovan ako se želi, pomoću neutralizacije reakcione smeše, na primer, povišenjem pH do oko 6,0 do oko 7,5, nakon čega sledi ekstrakcija polimernog alkanala u nekom organskom rastvaraču i uklanjanje rastvarača, na primer, pomoću rotacionog uparavanja, liofilizacije ili destilacije.
Zbog jednostavnosti ovog pristupa, bez korišćenja direktnih oksidativnih metoda niti vrsta koje sadrže jod, za dobijanje željene aldehidne funkcije, proizvodi ovako formirani su visoke čistoće, pokazuju poboljšanu stabilnost tokom skladištenja u poredjenu sa drugim poznatim polimernim aldehidima i poseduju nisku vrednost polidisperzije (manju od oko 1,5, poželjno manje od oko 1,2 i obično polidisperziju manju od oko 1,1,1,08,1,05,1,04 i 1,03). Polimeri koji
imaju vrednosti polidisperzije 1,03,1,02 i 1,01 su tako dobijeni.
Za jedan izolovani polimerni alkanal iz pronalaska poželjno je da ima čistoću od najmanje oko 95 %, računato na polimerne kontaminante.
Primeri 1 i 2 ilustruju formiranje mPEG polimernih alkanala. U slučajevima u kojima polimerni polazni materijal je PEG-diol, jedna od PEG hidroksil grupa je generalno zaštićena pre reagovanja sa zaštićenim alkanalnim reagensom, nakon čega se vrši deprotekcija sledeći kuplovanje. Svi ilustrativni polimeri zaštićenih alkanala tako formiranih su prikazani pomoću Strukture XI-E dole.
Hidroksi kraj PEG-a se može tada, ako se želi, konvertovati u funkcionalnu grupu kako bi se dobio bilo homobifunkcionalan ili heterobifunkcionalan zaštićeni alkanal. Pogodna funkcionalna grupa uključuje amino, estar, karbonat, aldehid, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, sulfon, tiol, karboksilnu kiselinu, izocijanat, hidrazid, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid i silan. Poželjne su funkcionalne grupe kao što su N-hidroksisukcinimidil estar, benzotriazolil karbonat, amin, vinilsulfon i maleimid, N-sukcinimidil karbonat, hidrazid, sukcinimidil propionat, sukcinimidil butanoat, sukcinimidil sukcinat, sukcinimidil estar, glicidil etar, oksikarbonilimidazol, p-nitrofenil karbonat, aldehid, ortopiridil-disulfid i akrilol.
Drugi reprezentativni alkanalni reagensi su opisani sa strukturama:
U još jednom pristupu, polimerni alkanal iz pronalaska je pogodno proizveden iz hromatografski prečišćenog POLI-Y. Na taj način, polimerne nečistoće, ukoliko su prisutne, a posebno difunkcionalne nečistoće nastale iz PEG-diola, su uklonjene i omogućeno je formiranje ekstremno čistog polimernog alkanalnog proizvoda kako je ranije opisano. Ovaj pristup je prikazan u Primeru 5. Kratak opis globalnog sintetskog pristupa koji je primenjen, njegove prednosti, njegova primenljivost u generalnim metodama opisanim ovde, kao i specifični detalji izvedenih reakcija je dat u Primeru 5.
Mada se može primeniti bilo koja hromatografska separacina metoda, posebno poželjna je jonoizmenjivačka hromatografija gde Y u POLI-Y je neka jonizujuća grupa ili je derivat neke jonizujuće grupe, kao što su karboksilna kiselina, aktivni estar, amin ili slično.
Ilustrativni polimerni alkanalni acetali iz pronalaska mogu posedovati bilo koju od sledećih struktura, gde su promenljive ranije opisane:
U još jednom pristupu za proizvodnju polimernih alkanala iz pronalaska, polimerni alkanal može biti proizveden pomoću izgradnje polimernog segmenta, POLI, direktno na nekom acetalnom prekursoru, kao na primer, pomoću direktne polimerizacije. Još odredjenije, u toj metodi, neki acetalni prekursor koji ima najmanje jedno aktivno anjonsko mesto pogodno za započinjanje polimerizacije se prvo obezbedjuje. Anjonsko mesto na acetalnom prekursoru se tada dovodi u kontakt sa reaktivnim monomerom koji može da polimerizuje, kako bi na taj način započela polimerizacija reaktivnog monomera na acetalnom prekursoru. Kao rezultat kontaktnog koraka, dodatni reaktivni monomeri se dodaju acetalnom prekursoru kako bi se formirao polimerni lanac. Kontakt se održava sve dok se ne postigne željena dužina polimernog lanca, nakon čega se izvodi završna reakcija za dostizanje polimernog aldehidnog prekursora iz pronalaska.
Dobijeni polimerni aldehidni prekursor može biti dalje hidrolizovan do odgovarajućeg alkanala kao što je odredjeno gore, ako se želi. Najpoželjnije je da je reaktivni monomer etilenoksid i daje reaktivno anjonsko mesto koje se nalazi u acetalnom prekursoru neki alkoksid anjon (0-), poželjno udružen sa nekim alkalnim metalom ili drugim pogodnim suprotno naelektrisanim delom. Alkoksidna završna grupa prisutna u acetalnom prekursoru je aktivna za polimerizaciju sa otvaranjem anjonskog prstena etilenoksida do formiranja polimernog alkanala iz pronalaska.
Još odredjenije, acetalni prekursor će generalno posedovati strukturu koja odgovara sledećoj:
gde promenljive poseduju vrednosti opisane gore, sa izuzetkom da X' završava sa kiseoničnim anjonom, ili 0"(na primer, u svom neutralnom obliku, X' obično završava sa hidroksilnom grupom ili -OH, tako da se u prisustvu jake baze konvertuje do odgovarajuće alkoksidne soli). Pogodni suprotno naelektrisani delovi uključuju Na<+>, K<+>, Li<+>i Cs<+>. Završni korak generalno obuhvata reakciju neutralizacije, na primer, pomoću dodavanja kiseline. Opciono, polimerni segment može biti kaptiran pomoću dodavanja nekog alkilirajućeg reagensa ili drugog reagensa koji je pogodan da obezbedi nereaktivni kraj.
U jednom posebnom rešenju gore opisane metode, POLIT odgovara strukturi Z-(CH2CH20)nH, gde je n od oko 10 do oko 4000 i Z je odabran iz grupe koja sadrži -OCH3, -OCH2CH3i -OCH2(C6H5). U daljem rešenju, POLIT odgovara strukturi Z-(CH2CH20)nCH2CH20- M<+>, gde je POLIT proizveden pomoću polimerizacije sa otvaranjem anjonskog prstena etilenoksida na kaptiranoj na završetku alkoholatnoj soli kao što je Z-CH2CH20"M<+>, koja je proizvedena pomoću metilacije završne -OH grupe iz Z-CH2CH2OH sa jakom bazom. M<+>predstavlja metalni suprotno naelektrisani deo, kao što su Na<+>, K<+>, Li<+>, Cs<+>, Rb<+>. POLIT na taj način proizveden je tada pogodan za reakciju sa zaštićenim alkanalnim reagensom, kako je opisano gore.
Generalizovana shema koja daje kratak pregled ovog pristupa je data ovde kao SLIKA 1, a uslovi za izvodjenje takve reakcije ili serije reakcija su dati u Primeru 15.
Skladištenje<p>olimernih alkanalnih rea<g>enasa
Poželjno je da se polimerni alkanali iz pronalaska skladište pod inertnom atmosferom, kao što je atmosfera argona ili atmosfera azota, pošto aldehidna funkcionalna veza može reagovati sa atmosferskim kiseonikom i da proizvodi odgovarajuću karboksilnu kiselinu. Zbog mogućnosti reagovanja aldehidnog dela molekula sa vodom (na primer, izlaganjem vlažnoj sredini formira se odgovarajući hidrat), takodje je poželjno da se minimizira izlaganje polimernih alkanala iz pronalaska, vlažnoj sredini. Zbog toga, poželjni uslovi skladištenja su pod suvim argonom ili pod drugim inertnim gasom na temperaturama ispod oko
-15 °C. Skladištenje pod uslovima niske temperature smanjuje stepen hidrolize polimernog aldehida do odgovarajućeg hidratnog
oblika. Pored toga, u slučajevima gde polimerni segment polimernog alkanala je PEG, PEG deo alkanala može reagovati sporo sa kiseonikom i formirati perokside duž PEG dela molekula. Formiranje peroksida može na kraju dovesti do raskidanja lanca i na taj način povišenja polidisperzije PEG alkanalnog reagensa. U sagledavanju gornjeg, dodatno je poželjno skladištenje PEG alkanala iz pronalaska u mraku.
Biološko aktivnikonju<g>ati
Hemlta ku<p>lovanja
konjugaclta sa proteinima - nasumičnain-terminalno selektivna
Gore opisani polimerni alkanali su korisni za konjugaciju za biološko aktivne agense ili površine koje imaju najmanje jednu amino grupu sposbnu za reagovanje. Obično, PEG aldehid iz pronalaska je kuplovan za neku amino grupu pomoću reduktivne aminacije, što dovodi do formiranja sekundarne aminske veze izmedju polimernog segmenta i površine ili biološko aktivnog agensa. U konjugaciji polimernog alkanala iz pronalaska sa nekim biološko aktivnim agensom ili površinom koja nosi amino grupu, polimerni alkanal reaguje sa ciljanim molekulom koji nosi amino grupu u pogodnom rastvaraču i formira odgovarajući imin-vezani intermedijer, koji se tada redukuje i formira sekundarnu amino vezu izmedju polimera i biološko aktivnog agensa ili površine. Redukcija imina do odgovarajućeg amina je udružena sa dodatkom redukujućeg agensa. Primer redukujućih agenasa uključuju natrijum-cijanoborhidrid, natrijum-borhidrid, litijum-aluminijum-hidrid i slično.
Generalno, polimerni aldehidi iz pronalaska mogu biti korišćeni za selektivno ciljane modifikacije N-terminusa pod uslovima koji razlikuju reaktivnost alfa amina na N-terminalnoj aminokiselini. Neki polimerni alkanali iz pronalaska mogu da pokazuju veću selektivnost nego ranije poznati aldehidni derivati i zbog toga su pogodniji za primenu gde je poželjna selektivna modifikacija N-terminalnog proteina. Reakcioni uslovi za proizvodnju nekog N-terminalnog modifikovanog proteina ili peptida uključuju (i) rastvaranje proteina ili peptida koji treba da budu modifikovani u puferu koji ne sadrži amine (na primer, pri pH opsegu od oko 4 do oko 6,5, poželjno od oko 5 do 6,5, najpoželjnije na pH od oko 5 do 5,5), (ii) dodavanje polimernog alkanala iz pronalaska u proteinski ili peptidni rastvor, (iii) omogućavanje reakcije proteina ili peptida i polimernih alkanala do formiranja imin-kuplovanog polimernog konjugata, nakon čega sledi (iv) dodavanje redukujućeg agensa kako bi se formirao odgovarajući sekundarni amin kuplovani polimerni konjugat. Reakcioni uslovi za nasumično vezivanje polimernog alkanala su bitno identični onima koji su opisani gore, sa izuzetkom daje pH nešto viša (što će biti diskutovano u više detalja u daljem tekstu).
Za favorizovanje N-terminalnih modifikacija, pH od oko 5 do 5,5 je najpoželjnija jer se veruje da olakšava selektivnu N-terminalnu modifikaciju zbog razlika u pKa vrednostima amino grupe neke N-terminalne aminokiseline i amino grupe lizina. Generalno govoreći, uslovi koji favorizuju N-terminalnu selektivnost uključuju pH vrednosti ispod 7 i obično ne niže od oko 4. Najpoželjnije vrednosti pH za potpomaganje N-terminalne selektivnosti mogu odrediti oni koji imaju iskustva u oblasti a zavise od vrste odredjenih proteina koji se modifikuju. Pogodni puferi za izvodjenje konjugacije uključuju natrijum fosfatni, natrijum acetatni, natrijum karbonatni i slani fosfatni pufer (PBS). Obično, polimerni alkanal se dodaje u rastvor koji sadrži protein u ekvimolarnoj količini ili u molarnom višku u odnosu na ciljani protein. Polimerni alkanal se dodaje ciljanom proteinu u molarnom odnosu od oko 1:1 (polimerni alkanal: protein), 1,5 :1; 2 :1; 3 :1; 4 :1; 5 :1; 6 :1; 8 :1 ili 10 :1. Molarni višak PEG-alkanala u odnosu na ciljani protein je obično u opsegu od oko 2 do 5. Reakcija reduktivne aminacije se obično izvodi pri temperaturama od ili ispod sobne temperature (25 °C), mada temperature mogu biti u opsegu od oko -15 °C do oko 100 °C, poželjnije od oko 4 °C do 37 °C, u toku približno jednog do dvadeset četiri sata. Redukujući agens se takodje, obično dodaje u višku, može se reći, u količinama koje su u opsegu od oko 2-strukog do 30-strukog molarnog viška u odnosu na polimerno-proteinski konjugat. Poželjno je da se doda redukujući agens u količini od 10-ostrukog do 20-stukog molarnog viška u odnosu na polimerno-proteinski konjugat. Tačno reakciono vreme se odredjuje pomoću praćenja toka reakcije tokom vremena. Tok reakcije se obično prati pomoću uzimanja alikvota iz reakcione smeše u različitim vremenskim intervalima i analiziranjem reakcione smeše sa SDS-PAGE ili MALDI-TOF masene spektrometrije ili bilo kojom drugom pogodnom analitičkom metodom. Dobijeni pegilovani konjugati se dalje mogu okarakterisati korišćenjem analitičkih metoda kao što su MALDI, kapilarna elektroforeza, gel elektroforeza, i/ili hromatografija.
Još odredjenije, za kuplovanje nekog aldehidnog polimernog derivata za protein ili peptid, brojni, različiti pristupi mogu biti upotrebljeni. Jedan pristup (odnosno, pristup nasumičnog pegilovanja) je kovalentno vezivanje PEG za bilo koji broj lizinskih delova koji su dostupni na površini. Za izvodjenje takve reakcije, protein ili peptid (kao što su oni biomolekuli koji su dati kao primer u daljem tekstu) obično reaguje sa polimernim alkanalom iz pronalaska u puferu koji ne sadrži amin pri blagim uslovima pH, generalno u opsegu od oko 5 do 8.
(Puferi koji ne sadrže amin su poželjni pošto se amino-grupa u puferu može biti konkurent proteinskoj amino grupi za kuplovanje za polimerni alkanal). Pogodan pufer koji ne sadrži amin se odabira od onih koji imaju odgovarajuću pK za željeni pH opseg za izvodjenje hernije konjugacije. Za reakciju kuplovanja je generalno potrebno od minuta do nekoliko sati (na primer, od 5 minuta do 24 sata ili više) i u prošeku, kuplovanje se postiže za izmedju 0,2 i 4 sata do formiranja imin-kuplovanog konjugata. U reakcionu smešu se tada dodaje bilo koji od brojnih pogodnih redukujućih agenasa, kako je opisano gore (na primer, natrijum-cijanoborhidrid). Dobijenoj smeši se tada generalno omogućava da reaguje pod uslovima niske do sobne temperature, na primer, 4 °C do 37 °C u toku oko jedan sat do 48 sati. Poželjno je da se reakcija redukcije završi za manje od oko 24 sata. Nasumično kuplovanje je favorizovano na pH oko 7 do 7,5 ili bliskoj, dok je kuplovanje na N-terminalu favorizovano na niskim pH (na primer, oko 5,5 ili bliskoj).
Za povećanje stepena modifikacije, to jest, za potpomaganje povećanja broja PEG koji su kovalentno vezani na dostupnim mestima na ciljanom molekulu, bilo jedan ili više od gore opisanih uslova (na primer, molarni odnos polimerni alkanal za protein ili peptid, temperatura, vreme reakcije, pH, itd.) se mogu povećati, bilo nezavisno ili istovremeno. Poželjno je ali ne i neophodno, u odnosu na molekulsku težinu primenjenog PEG alkanala, da se dobijena proizvodna smeša prečisti kako bi se odvojili reagensi u višku, nepegilovani protein (ili bilo koji ciljani molekul), multi-pegilovani konjugati i slobodni ili neizreagovani PEG alkanal.
Nasumično pegilovanje ilustrativnih proteina je prikazano u Primerima 4 i 6. Mesto selektivnog pegilovanja ilustrativnih proteina je opisano u Primerima 7 do 13.
Karakterizacija/opciono izdvajanje PEG-mera
Opciono, konjugati proizvedeni pomoću reakcije PEG aldehida iz pronalaska sa biološko aktivnim agensom su prečišćeni kako bi se dobile/izolovale različite PEGilovane vrste. Alternativno i poželjnije za PEG sa manjom molekulskom masom, na primer, koji imaju molekulske mase manje od oko 20 kilodaltona, poželjno manje od ili jednako oko 10 kilodaltona, je da se proizvodna smeša prečisti kako bi se postigla raspodela oko odredjenog broja PEG po molekulu proteina. Na primer, proizvodna smeša se može prečistiti tako da se dobije prosečno izmedju od jedan do pet PEG po proteinu, obično prosečno od oko 3 PEG po proteinu. Strategija za prečišćavanje finalne reakcione smeše konjugata će zavisiti od brojnih faktora - molekulske mase upotrebljenog polimera, odredjenog proteina, željenog režima doziranja i rezidualne aktivnosti iin vivosvojstava pojedinačnih konjugovanih vrsta.
Ukoliko se želi, PEG konjugati koji imaju različite molekulske mase se mogu izolovati korišćenjem gel filtracione hromatografije. Može se reći, gel filtraciona hromatografija se koristi za frakcionisanje različitih PEG-mera (1-mer, 2-mer, 3-mer, itd.) na osnovu njihovih različitih molekulskih masa (gde razlika u osnovi odgovara prosečnoj molekulskoj masi PEG lanaca). Na primer, u primeru reakcije gde je protein od 100 kDa nasumično konjugovan sa PEG alkanalom koji ima molekulsku masu od oko 20 kDa, dobijena reakciona smeša će verovatno sadržati nemodifikovani protein (MM 100 kDa), mono-pegilovani protein (MM 120 kDa), di-pegilovani protein (MM 140 kDa) itd. Dok se ovaj pristup može koristiti za razdvajanje PEG konjugata koji imaju različite molekulske mase, ovaj pristup je generalno neefikasan za razdvajanje pozicionih izomera koji imaju različita mesta pegilovanja unutar proteina. Na primer, gel filtraciona hromatografija se može koristiti da razdvoji jedne od drugih, iz smeše PEG, 1-mere, 2-mere, 3-mere, itd., mada svaka od dobijenih PEG-mernih kompozicija može sadržati PEG privezane za različite reaktivne amino grupe (na primer, lizinske ostatke) unutar proteina.
Gel filtracione kolone pogodne za izvodjenje ovog tipa razdvajanja uključuju Superdeks™ i Sephadeks™ kolone dostupne iz Amersham Biosciences. Selekcija odredjenih kolona će zavisiti od željenih opsega frakcionisanja. Eluiranje se generalno izvodi korišćenjem pufera koji nisu na bazi amina, kao što su fosfatni, acetatni ili slično. Sakupljene frakcije se mogu analizirati pomoću brojnih metoda, na primer, (i) OD na 280 nm za sadržaj proteina, (ii) BSA analiza proteina, (iii) jodni test za sadržaj PEG (Sims G. E. C isar.. Anal. Biochem,107, 60 - 63,1980) ili alternativno, (iv) pomoću nanošenja na SDS PAGE gel, nakon čega sledi bojenje sa barijum jodidom.
Razdvajanje pozicionih izomera se izvodi pomoću reverzno fazne hromatografije korišćenjem RP-HPLC C18 kolone (Amersham Biosciences ili Vydac) ili pomoću jonoizmenjivačke hromatografije, korišćenjem jonoizmenjivačke kolone, na primer, Sepharose™ jonoizmenjivačke kolone dostupne iz Amersham Biosciences. Bilo koji pristup se može koristiti za izdvajanje PEG-biomolekulskih izomera koji imaju istu molekulsku masu (pozicionih izomera).
Skladištenje
U zavisnosti od namene dobijenih PEG-konjugata, nakon konjugacije i opciono dodatnih koraka razdvajanja, konjugovana smeša se može koncentrovati, sterilisati filtracijom i skladištiti na niskim temperaturama od oko -20 °C do oko -80 °C. Alternativno, konjugat može biti liofilizovan, zajedno sa ili bez rezidualnog pufera i skladištiti kao liofilizovani prah. U nekim slučajevima, poželjno je da se zameni pufer koji je koršćen za konjugaciju, kao što je natrijum-acetat, sa isparljivim puferom, kao što je amonijum karbonat ili amonijum acetat, tako da se može lako ukloniti tokom liofilizacije, tako daje liofilizovana proteinska konjugovana praškasta formulacija oslobodjena rezidualnog pufera. Alternativno, korak razmene pufera se može koristiti primenom formulacionog pufera, tako da je liofilizovani konjugat u obliku koji je pogodan za rekonstituciju u formulacionom puferu i na kraju za primenu kod sisara.
KONJUGACUA MALIH MOLEKULA
Konjugacija PEG-alkanala iz pronalaska za male molekule, kao što su amfotericin B se generalno izvodi kako je opisano u Primeru 14, mada precizni reakcioni uslovi mogu varirati prema malom molekulu koji se modifikuje. Obično se konjugacija izvodi korišćenjem neznatnog molarnog viška PEG reagensa u odnosu na mali molekul, na primer, oko 1,2 -1,5, do oko 5 do 10-struki molarni višak. U nekim slučajevima, u zavisnosti od molekula, mali molekuli leka mogu u stvari biti korišćeni u višku, kada PEG - konjugovani mali molekuli precipitiraju u reakcionom rastvaraču, na primer, etru, dok neizreagovani lek ostaje u rastvoru.
Ciljani molekuli i<p>ovršine
Reaktivni polimerni alkanali iz pronalaska mogu biti vezani, bilo kovalentno ili nekovalentno, za brojne entitete uključujući filmove, hemijske površine za razdvajanje i prečišćavanje, čvrste podupirače, površine metala/metalnih oksida, kao što su zlato, titanijum, tantal, niobijum, aluminijum, čelik i njihovi oksidi, silicijum oksid, makromolekuli i mali molekuli. Pored toga, polimeri iz pronalaska mogu se takodje koristiti za biohemijske senzore, bioelektronske prekidače i ulazna kola. Polimerni alkanali iz pronalaska se mogu takodje primeniti kao nosači za sinteze peptida, za pripremu polimerno-premazanih površina i polimernih graftova, za pripremu polimernih-ligand konjugata za afinitetnu podelu, za pripremu unakrsno vezanih ili unakrsno nevezanih hidrogelova i za pripremu polimer-kofaktor adukta za bioreaktore.
Biološko aktivni agens za korišćenje u kuplovanju za polimer iz pronalaska može biti bilo jedan ili više od sledećih. Pogodni agensi mogu biti odabrani od, na primer, hipnotika i sedativa, psihičkih energetika, sredstava za smirenje, respiratornih lekova, antikonvulzanata, mišićnih relaksanata, antiparkinsonskih agenasa (dopamin antagnonisti), analgetika, antiinflamatorika, antianksioznih lekova (anksiolitici), supresora apetita, antimigrenskih agenasa, mišićnih kontraktanata, antiinfektivnih lekova (antibiotici, antiviralni, antifungalni, vakcine), antiartritičnih lekova, antimalarika, antiemetika, anepileptika, bronhodilatatora, citokina, faktora rasta, antikarcinogenih agenasa, antitrombotičnih agenasa, antihipertenziva, kardiovaskularnih lekova, antiaritmika, antioksikanata, antiastmatičnih agenasa, hormonalnih agenasa uključujući kontraceptive, simpatomimetika, diuretika, agenasa za regulaciju lipida, antiandrogenih agenasa, antiparazitika, antikoagulanata, neoplastika, antineoplastika, hipoglikemika, nutritivnih agenasa i dodataka, dodataka za rast, antienteričnih agenasa, vakcina, antitela, dijagnostičkih agenasa i kontrasnih agenasa.
Još odredjenije, aktivni agens može pripadati jednoj od brojnih strukturalnih klasa, uključujući, bez ograničavanja, male molekule (poželjno nerastvorne male molekule), peptide, polipeptide, proteine, polisaharide, steroide, nukleotide, oligonukleotide, polinukleotide, masti, elektrolite i slično. Poželjno je da aktivni agens za kuplovanje za polimerni alkanal iz pronalaska poseduje prirodnu amino grupu ili alternativno, daje modifikovan da sadrži najmanje jednu reaktivnu amino grupu pogodnu za kuplovanje za polimerni alkanal iz pronalaska.
Specifični primeri aktivnih agenasa pogodnih za kovalentno vezivanje za polimer iz pronalaska uključuju, bez ograničavanja, aspariginazu, amdoksovir (DAPD), antid, bekaplermin, kalcitonine, cijanovirin, denileukin diftitoks, eritropoetin (EPO), EPO agoniste (na primer, peptide od oko 10 - 40 aminokiselina u lancu koji obuhvataju posebnu jezgarnu sekvencu, kako je opisano u WO 96/40749), dornazu alfa, eritropoetični stimulišući protein (NESP), koagulišuće faktore kao što su Faktor V, Faktor VII, Faktor Vila, Faktor VIII, Faktor LX, Faktor X, Faktor XII, Faktor XIII, fon Vilebrandov (Willebrand) Faktor; ceredazu, cerezim, alfa-glukozidazu, kolagen, ciklosporin, alfa defenzine, beta defenzine, eksedin-4, Faktor stimulacije granulocitnih kolonija (GCSF), trombopoetin (TPO), inhibitor alfa-1 proteinaze, elkatonin, Faktor stimulacije granulocitnih makrofagnih kolonija (OMCSF), fibrinogen, filgrastim, hormone rasta, humani hormon rasta (hGH), hormon za otpuštanje hormona rasta (CHRH), GRO-beta, GRO-beta antitela, koštane morfogene proteine kao što su koštani morfogeni protein-2, koštani morfogeni protein-6, OP-1; faktor rasta kiselog fibroblasta, faktor rasta baznog fibroblasta, CD-40 ligand, heparin, humani serum albumin, heparin male molekulske mase (LMWH), interferone kao što su interferon alfa, interferon beta, interferon gama, interferon omega, interferon tau, konsenzus interferon; interleukine i interleukinske receptore kao što su interleukin-1 receptor, interleukin-2, interleukin-2 fuzioni proteini, interleukin-1 receptor antagonist, interleukin-3, interleukin-4, interleukin-4 receptor, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-12, interleukin-13 receptor, interleukin-17 receptor; laktoferin i laktoferinske fragmente, hormon za otpuštanje hormona luteinizacije (LHRH), insulin, pro-insulin, analoge insulina (na primer, mono-acilovani insulin, kako je opisano u US. Patentu Br. 5,922,675), amilin, C- peptid, somatostatin, analoge somatostatina uključujući oktreotid, vazopresin, hormon stimulacije folikula (FSH), vakcinu influence, insulinu sličan Faktor rasta (IGF), insulintropin, Faktor stimulacije makrofagnih kolonija (M-CSF), plazminogen aktivatore kao što su alteplaze, urokinaze, reteplaze, streptokinaze, pamiteplaze, lanoteplaze i teneteplaze; faktor rasta nerava (NGF), osteoprotegerin, faktor rasta iz krvnih pločica, faktore rasta tkiva, transformišući faktor rasta -1, faktor rasta vaskularnog endotela, faktor inhibicije leukemije, faktor rasta keratinocita (KGF), glijalni faktor rasta (GGF), receptore T ćelija, CD molekule/antigene, tumor nekrotični Faktor (TNF), monocitni hemoatraktivni protein-1, faktore rasta endotela, paratiroidni hormon (PTH), glukagonu-slične peptide, somatotropin, timozin alfa 1, timozin alfa 1 Ilb/IIIa inhibitor, timozin beta 10, timozin beta 9, timozin beta 4, alfa-1 antitripsin, fosfodiestarazna (PDE) jedinjenja, VLA-4 (veomakasni antigen-4), VLA-4 inhibitore, bisfosfonate, antitela respiratornog sincitilnog virusa, regulatorni gen transmembrane cistične fibroze (CFTR), deoksiribonukleazu (Dnaza), protein za povećanje baktericidnosti/permeabilnosti (BPI) i anti-CMV antitela. Primeri monoklonih antitela uključuju etanercept (dimerični fuzioni protein koji se sastoji od ekstracelularnog ligand-vezanog dela humanog 75 kD TNF receptora vezanog za Fc deo na IgGl), abciksimab, afeliomomab, baziliksimab, daklizumab, infliksimab, ibritumomab tiueksetan, mitumomab, muromonab-CD3, jod 131 tozitumomab konjugat, olizumab, rituksimab i trastuzumab (herceptin).
Dodatni agensi pogodni za kovalentno vezivanje za polimer iz pronalaska uključuju, bez ograničavanja, amifostin, amiodaron, aminokapronsku kiselinu, aminohipurat natrijum, aminoglutetimid, aminolevulinsku kiselinu, aminosalicilnu kiselinu, amsakrin, anagrelid, anastrozol, asparaginazu, antracikline, beksaroten, bikalutamid, bleomicin, buserelin, busulfan, kabergolin, kapecitabin, karboplatin, karmustin, hlorambucin, cilastatin natrijum, cisplatin, kladribin, klodronat, ciklofosfamid, ciproteron, citarabin, kamptotecin, 13-cis retinolnu kiselinu, sve trans retinolne kiseline; dakarbazin, daktinomicin, daunorubicin, deferoksamin, deksametazon, diklofenak, dietilstilbestrol, docetaksel, doksorubicin, epirubicin, estramustin, etopozid, eksemestan, feksofenadin, fludarabin, fludrokortizon, fluoruracil, fluoksimesteron, flutamid, gemcitabin, epinefrin, L-Dopa, hidroksiurea, idarubicin, ifosfamid, imatinib, irinotekan, itrakonazol, goserelin, letrozol, leukovorin, levamizol, lizinopril, lovotiroksin natrijum, lomustin, mehloretamin, medroksiprogesteron, megestrol, melfalan, merkaptopurin, metaraminol bitartrat, metotreksat, metoklopramid, meksiletin, mitomicin, mitotan, mitoksantron, nalokson, nikotin, nilutamid, oktreotid, oksaliplatin, pamidronat, pentostatin, pilkamicin, porfimer, prednizon, prokarbazin, prohlorperazin, ondansetron, raltitreksed, sirolimus, streptozocin, takrolimus, tamoksifen, temozolomid, tenipozid, testosteron, tetrahidrokanabinol, talidomid, tioguanin, tiotepa, topotekan, tretinoin, valrubicin, vinblastin, vinkristin, vindezin, vinorelbin, dolazetran, granizetron; formoterol, flutikazon, leuprolid, midazolam, alprazolam, amfotericin B, podofilotoksini, nukleozidni antiviremici, aroil hidrazoni, sumatriptan; makrolidi kao što su eritromicin, oleandomicin, troleandomicin, roksitromicin, klaritromicin, davercin, azitromicin, fluritromicin, diritromicin, jozamicin, spiromicin, midekamicin, leukomicin, miokamicin, rokitamicin, andazitromicin i svinolid A; fluorkinoloni kao što su ciprofloksacin, ofloksacin, levofloksacin, trovafloksacin, alatrofloksacin, moksifloksicin, norfloksacin, enoksacin, grepafloksacin, gatifloksacin, lomefloksacin, sparfloksacin, temafloksacin, pefloksacin, amifloksacin, fleroksacin, tosufloksacin, prulifloksacin, irloksacin, pazufloksacin, klinafloksacin i sitafloksacin; aminoglikozidi kao što su gentamicin, netilmicin, paramecin, tobramicin, amikacin, kanamicin, neomicin i streptomicin, vankomicin, teikoplanin, rampolanin, mideplanin, kolistin, daptomicin, gramicidin, kolistimetat; polimiksini kao što su polimiksin B, kapreomicin, bacitracin, penems; penicilini uključujući penicilinaza-osetljive agense kao što su penicilin G, penicilin V; penicilinaza -rezistentne agense kao što su meticilin, oksacilin, kloksacilin, dikloksacilin, floksacilin, nafcilin; aktivni agensi protiv gram negativnih mikroorganizama, kao što su ampicilin, amoksicilin i hetacilin, cilin i galampicilin; antipseudomonalne peniciline kao što su karbenicilin, tikarcilin, azlocilin, mezlocilin i piperacilin; cefalosporine kao što su cefpodoksim, cefprozil, ceftbuten, ceftizoksim, ceftriakson, cefalotin, cefapirin, cefaleksin, cefradrin, cefoksitin, cefamandol, cefazolin, cefaloridin, cefaklor, cefadroksil, cefaloglicin, cefuroksim, ceforanid, cefotaksim, cefatrizin, cefacetril, cefepim, cefiksim, cefonicid, cefoperazon, cefotetan, cefmetazol, ceftazidim, lorakarbef i moksalaktam, monobaktami kao aztreonam; i karbapenemi kao što su imipenem, meropenem, pentamidin izetiouat, albuterol sulfat, lidokain, metaproterenol sulfat, beklometazon diprepionat, triamcinolon acetamid, budezonid acetonid, flutikazon, ipratropium bromid, flunizolid, kromolin natrijum i ergotamin tartrat; taksane kao što su paklitaksel; SN-38 i tirfostini.
Poželjni mali molekuli za kuplovanje za polimerni alkanal iz pronalaska su oni koji imaju najmanje jednu amino grupu. Poželjni molekuli uključuju aminohipurat natrijum, amfotericin B, doksorubicin, aminokapronsku kiselinu, aminolevulinsku kiselinu, aminosalicilnu kiselinu, metaraminol bitartrat, pamidronat dinatrijum, daunorubicin, levotiroksin natrijum, lizinopril, cilastatin natrijum, meksiletin, cefaleksin, deferoksamin i amifostin.
Poželjni peptidi ili proteini za kuplovanje za polimerni alkanal iz pronalaska uključuju EPO, IFN-a, IFN-p, IFN-y, konsenzus IFN, Faktor VII, Faktor VIII, Faktor LX, IL-2, remikad (infliksimab), Rituksan (rituksimab), Enbrel (etanercept), Sinagis (palivizumab), Reopro (abciksimab), Herceptin (trastuzimab), tPA, Cerizim (imigluceraza), Hepatitis-B vakcina, rDNAza, alfa-1 proteinaza inhibitor, GCSF, GMCSF, hGH, insulin, FSH i PTH.
Gore dati primeri za biološko aktivne agense obuhvataju, gde se može primeniti, njihove analoge, agoniste, antagoniste, inhibitore, izomere i farmaceutski prihvatljive soli. U vezi peptida i proteina, u pronalasku se obuhvataju njihovi sintetički, rekombinantni, prirodni, glikozilovani i neglikozilovani oblici kao i njihovi biološko aktivni fragmenti. Gornji biološko aktivni proteini dodatno obuhvataju varijante koje imaju jednu ili više aminokiselina supstituisanih, izbačenih ili slično, sve dok dobijeni varijetetni protein poseduje najmanje neki stepen aktivnosti u odnosu na roditeljski (nativni) protein.
Farmaceutskekompozicije
Ovaj pronalazak takodje uključuje farmaceutske preparate koji se sastoje od konjugata kako su dobijeni ovde, u kombinaciji sa farmaceutskim ekscipijentom. Generalno, sami konjugati su u čvrstom obliku (na primer, precipitat), koji se može kombinovati sa pogodnim farmaceutskim ekscipijentom koji može biti bilo u čvrstom ili tečnom obliku.
Primeri ekscipijenata uključuju, bez ograničavanja, one koji su odabrani iz grupe koja sadrži ugljene hidrate, neorganske sole, antimikrobne agenase, antioksidante, površinski aktivne supstance, pufere, kiseline, baze i njihove kombinacije.
Ugljeni hidrati kao što su šećeri, derivatizovani šećeri kao što su alditol, aldonska kiselina, esterifikovani šećeri i/ili polimerni šećeri mogu biti prisutni kao ekscipijenti. Specifični ugljenohidratni ekscipijenti uključuju, na primer: monosaharide, kao što su fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-manoza, sorboza i slično; disaharide, kao što su laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza i slično; polisaharide, kao što su rafinoza, melezitoza, maltodekstrini, dekstrani, škrobovi i slično; i alditole, kao što su manitol, ksilitol, maltitol, laktitol, ksilitol, sorbitol (glucitol), piranozil sorbitol, mioinozitol i slično.
Ekscipijenti mogu takodje uključivati neorganske soli ili pufera kao što su limunska kiselina, natrijum-hlorid, kalijum-hlorid, natrijum-sulfat, kalijum-nitrat, natrijum fosfat monobazni, natrijum fosfat dibazni i njihove kombinacije.
Preparat takodje može da uključuje neki antimikrobni agens za sprečavanje ili onemogućavanje mikrobnog rasta. Neograničavajući primeri antimikrobnih agenasa pogodnih za ovaj pronalazak uključuju benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, cetilpiridinijum hlorid, hlorbutanol, fenol, feniletil alkohol, fenilmerkuri nitrat, timerzol i njihove kombinacije.
Neki antioksidans može takodje biti prisutan u preparatu. Antioksidansi se koriste da spreče oksidaciju i na taj način spreče razgradnju konjugata ili drugih komponenti preparata. Pogodni antioksidansi za korišćenje u ovom pronalasku uključuju, na primer, askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, hipofosfornu kiselinu, monotioglicerol, propil galat, natrijum bisulfit, natrijum formaldehid sulfoksilat, natrijum metabisulfit i njihove kombinacije.
Površinski aktivne supstance mogu biti prisutne kao neki ekscipijent. Primeri za površinski aktivne supstance uključuju: polisorbate, kao što su "Tween 20" i "Tween 30," i pluronike kao što su F68 i F88 (oba su dostupna iz BASF, Mount Olive, New Jersev); sorbitan estre; lipide, kao što su fosfolipidi kao što su lecitin i drugi fosfatidilholini, fosfatidiletanolamini (mada je poželjno da ne budu u lipozomalnom obliku), masne kiseline i masni estri; steroidi, kao što su holesterol; i helatni agensi, kao što su EDTA, cink i drugi pogodni kationi.
Kiseline ili baze mogu biti prisutne kao ekscipijent u preparatu. Neograničavajući primeri kiselina koje se mogu koristiti uključuju one kiseline koje su odabrane iz grupe koja sadrži hlorovodoničnu kiselinu, sirćetnu kiselinu, fosfornu kiselinu, limunsku kiselinu, maleinsku kiselinu, mlečnu kiselinu, mravlju kiselinu, trihlorsirćetnu kiselinu, azotnu kiselinu, perhlornu kiselinu, fosfornu kiselinu, sumpornu kiselinu, fumarnu kiselinu i njihove kombinacije. Primeri za pogodne baze uključuju, bez ograničenja, baze odabrane iz grupe koja sadrži natrijum hidroksida natrijum acetat, amonijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum acetat, kalijum acetat, natrijum fosfat, kalijum fosfat, natrijum citrat, natrijum format, natrijum sulfat, kalijum sulfat, kalijum fumarat i njihove kombinacije.
Farmaceutski preparati obuhvataju sve tipove formulacija i posebno onih koje su pogodne za injekcije, na primer, prahovi koji se mogu rekonstituisati kao i suspenzije i rastvori. Količina konjugata (odnosno, konjugata formiranih izmedju aktivnog agensa i polimera opisanih ovde) u kompoziciji će se razlikovati u zavisnoti od brojnih faktora, ali će optimalno biti terapeutski efikasna doza kada se kompozicija skladišti u posudi za jediničnu dozu (na primer, bočici). Pored toga, farmaceutski preparat može biti smešten u brizgalici. Terapeutski efikasna doza može biti odredjena eksperimentalno pomoću ponovljenih primena povećavajućih količina konjugata u cilju da se odredi koja količina daje klinički željnu krajnju tačku.
Količina bilo kog pojedinačnog ekscipijenta u kompoziciji će se razlikovati u zavisnosti od aktivnosti ekscipijenta i posebnih potreba kompozicije. Obično, optimalna količina bilo kog pojedinačnog ekscipijenta se odredjuje preko rutinskih ispitivanja, odnosno, pomoću pripreme kompozicije koja sadrži različite količine ekscipijenta (polazeći od niskih do visokih) i ispitivanja stabilnosti i drugih parametara i odredjivanja opsega u kojima se postižu optimalne performanse bez značajnih štetnih efekata.
Generalno, medjutim, ekscipijenti su prisutni u kompoziciji u količini od oko 1 % do oko 99 % računato na težinu, poželjno od oko 5 % - 98 % računato na težinu, poželjnije od oko 15 - 95 % računato na težinu ekscipijenta, najpoželjnije sa koncentracijama od 30 % računato na težinu.
Ovi prethodni farmaceutski ekscipijenti, zajedno sa drugim ekscipijentima su opisani u "Remington: The Science & Practice of Pharmacv", 19* ed., Williams c&Williams, (1995), "Phvsician's Desk Reference", 52<nd>ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998) i Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3<rd>Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Farmaceutski preparati iz ovog pronalaska se obično, mada ne obavezno, primenjuju putem injekcija i zbog toga su generalno, tečni rastvori ili suspenzije, neposredno pre primene. Farmaceutski preparat može takodje imati druge oblike kao što su sirupi, kremovi, masti, tablete, prahovi i slično. Drugi načini primene su takodje uključeni, kao što su pulmonarni, rektalni, transdermalni, transmukozalni, oralni, intratekalni, subkutani, intra-arterijalni i tako dalje.
Kao što je ranije opisano, konjugati mogu biti primenjeni ubrizgavanjem parenteralno pomoću intravenoznih injekcija, ili manje poželjno, pomoću intramuskularnih ili pomoću subkutanih injekcija. Pogodni tipovi formulacije za parenteralnu primenu uključuju rastvore spremne za ubrizgavanje, suve prahove za kombinovanje sa rastvaračem pre upotrebe, suspenzije spremne za ubrizgavanje, suve nerastvorne kompozicije za kombinovanje sa prenosiocem pre upotrebe i emulzije i tečne koncentrate za razblaživanje pre upotrebe, medju ostalima.
Metode za<p>rimenu
Pronalazak takodje obezbedjuje metod za primenu konjugata, koji su dobijeni ovde, kod pacijenta koji pati od onih stanja koja reaguju na tretman sa konjugatom. Metod obuhvata primenu, generalno putem injekcija, terapeutski efikasnu količinu konjugata (poželjno je da bude deo farmaceutskog preparata). Metod primene može biti korišćen za tretman bilo kog stanja koje može biti izlečeno ili koje se može prevenirati primenom odredjenog konjugata. Onima sa iskustvom u oblasti je poznato koja stanja odredjeni konjugat može efikasno lečiti. Tačna doza za primenu će zavisiti od starosne dobi, težine i opšteg stanja subjekta kao i od ozbiljnosti stanja koje se leči, procene zdravstvenog radnika i od konjugata koji se primenjuje. Terapeutski efikasne količine su poznate onima sa iskustvom u oblasti i/ili su opisane u značajnim referentnim tekstovima i literaturi. Generalno, terapeutski efikasna količina je u opsegu od oko 0,001 mg do 100 mg, poželjno u dozama od 0,01 mg/dnevno do 75 mg/dnevno i poželjnije u dozama od 0,10 mg/dnevno do 50 mg/dnevno.
Jedinična doza bilo kog datog konjugata (ponovo, poželjno je da budu deo farmaceutskog preparata) može biti primenjena u različitim doznim rasporedima, u zavisnosti od procene kliničara, potreba pacijenta i tako dalje. Specifični dozni raspored je poznat onima sa iskustvom u oblasti ili može biti odredjen eksperimentalno korišćenjem rutinskih metoda. Primeri za dozne rasporede uključuju, bez ograničavanja, primenu pet puta dnevno, četiri puta dnevno, tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, dva puta mesečno i bilo koju njihovu kombinaciju. Kada se dostigne klinički rezultat, doziranje kompozicije se završava.
Prednost primene konjugata iz ovog pronalaska je to što se individualni vodo-rastvorni polimerni deo može raskinuti. To daje prednost kada je klirens iz tela potencijalni problem zbog veličine polimera. Optimalno, raskidanje svakog vodo-rastvornog polimernog dela se olakšava korišćenjem fiziološki raskidive i/ili enzimski razgradljive veze kao što je uretan, amid, karbonat ili veze koja sadrži estar. Na taj način, klirens konjugata (preko raskidanja individualnih vodo-rastvornih polimernih delova) može biti moduliran pomoću izbora molekulske veličine polimera i tipa funkcionalnih grupa koje će obezbediti željena svojstva klirensa. Oni koji su sa iskustvom u oblasti, mogu odrediti podesnu veličinu molekula polimera kao i raskidivu funkcionalnu grupu. Na primer, onaj koji je sa iskustvom u oblasti, korišćenjem rutinskih ispitivanja, može odrediti pogodnu molekulsku veličinu i raskidivu funkcionalnu grupu tako što će prvo pripremiti različite polimerne derivate sa različitm težinama polimera i raskidivim funkcionalnim grupama i zatim odredjivati profile klirinsa (na primer, kroz periodično uzorkovanje krvi ili urina) u zavisnosti od primenjenih polimernih derivata kod pacijenta i periodičnog uzimanaja uzoraka krvi i/ili urina. Kada se uspostavi profil klirensa za svaki testirani konjugat, može se identifikovati pogodan konjugat.
Svi članci, knjige, patenti, patentne publikacije i druge publikacije navedene ovde su inkorporisane referencama u njihovoj celosti.
PRIMERI
Treba se shvatiti da, da dok je pronalazak opisan zajedno sa nekim njegovim specifičnim rešenjima, prethodni opisi, kao i primeri koji slede, treba da ilustruju bez ograničenja, oblast pronalaska. Drugi aspekti, prednosti i modifikacije u okviru pronalaska će biti očigledni onima koji imaju iskustva u oblasti na koju se pronalazak odnosi.
Materijali i Metode.
Svi PEG reagensi koji su navedeni u dodatim primerima su komercijalno dostupni, osim ako nije drugačije navedeno. Svi NMR podaci su dobijeni pomoću 300 MHz NMR spektrometra koji je proizveo Bruker.
Lizozim je dobijen iz Sigme.
PrimerI
Sinteza MPEG ( 2K)- Butiraldehida
A. Proizvodnja PEG ( 2 KDa)- Butiraldehida. dietil acetala
Smeša sa mPEG (2 KDa) (2,0g) i toluenom (30 mL) je azeotropski osušena pomoću destilacije toluena pod sniženim pritiskom. Osušeni mPEG, sa molekulskom masom, 2 kilodaltona, je rastvoren u bezvodnom toluenu (15 mL) u koji je dodat 1,0 M rastvor kalijum terc-butoksida u terc-butanolu (4,0 mL, 0,004 mola) i 4-hlorbuitraldehid dietil acetala (0,5 g, 0,00277 mola) (Alfa Aesar). Smeša je mešana na 100 -105 °C preko noći u atmosferi argona. Nakon hladjenja do sobne temperature, smeša je filtrirana i dodata u 150 mL etiletra na 0 - 5 °C. Precipitirani proizvod je odfiltriran i osušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 1,6 g. Reakcija je izvedena do bitno kvantitativnog prinosa. Može se reći daje sav mPEG polazni materijal bitno konvertovan do odgovarajućeg dietil acetala, računajući prema odsustvu hidroksilnih protona koji odgovaraju mPEG-OH polaznom materijalu prema<1>H NMR.
NMR (d^DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-C-), 1,52 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,24 ppm (s, - OCH3), 3,51 ppm (s, PEG oslonac), 4,46 ppm (t, -CH, acetal).
B. Proizvodnja mPEG ( 2kD)- Buitraldehida
Smeša sa mPEG (2KDa) butiraldehidom dietil acetalom (1,0 g) iz A. gore, dejonizovanom vodom (20 mL), odredjenom količinom 5 %-tne fosforne kiseline za podešavanje pH do 3,0, je mešana u toku 3 sata na sobnoj temperaturi. U tu smešu je dodat natrijum hlorid (1,0 g) i pH je podešen do 6,8 dodatkom 0,1 M natrijum-hidroksida. Proizvod, mPEG (2kD) butiraldehid, je ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom do dobijanja mPEG butiraldehidnog proizvoda u izolovanom obliku. Prinos: 0,72g.
Reakcija je izvedena do bitno kvantitativnog prinosa. Može se reći daje sav mPEG butiraldehid dietil acetal bitno konvertovan do odgovarajućeg aldehida, računajući prema odsustvu hidroksilnih protona koji odgovaraju dietil acetalu prema<1>H NMR.
NMR (d^DMSO): 1,75 ppro (p, -CiIrCHrCHO-) 2,44 ppm (dt, -CH2-CHO), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, PEG oslonac), 9,66 ppm (t, -CHO).
Primer 2
Sinteza MPEG ( 30 kDa)- BuTiRALDEHiPA
A. Proizvodnja mPEG ( 30 KDa)- Butiraldehida. dietil acetala
Smeša sa mPEG (30 kD) (60 %-tni rastvor u toluenu, 3,30g), toluenom (30 mL) i BHT (butilovanim hidroksitoluenom, 0,004 g) je azeotropno osušen pomoću destilacije rastvarača pod sniženim pritiskom. Osušeni mPEG 30K je rastvoren u bezvodnom toluenu (15 mL) i u taj rastvor je dodato 1,0 M kalijum terc-butoksidau terc-butanolu (4,0mL, 0,004 mola), 4-hlorbutiraldehid dietil acetala (0,5 g, 0,00277 mola) (Alfa Aesar) i kalijum-bromida (0,05g). Dobijena smeša je mešana preko noći na 105 °C pod atmosferom argona. Smeša je filtrirana, koncentrovana do suva pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod je rastvoren u 20 mL dihlormetana. Ovaj rastvor koji sadrži proizvod je dodat u etiletar (300 mL) na sobnoj temperaturi da bi se proizvod precipitirao. Precipitirani proizvod je izolovan pomoću filtracije i osušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 1,92 g.
NMR (de-DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-C-) 1,52 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,24 ppm (s, - OCH3), 3,51 ppm (s, PEG oslonac), 4,46 (t, -CH, acetal).
Računajući na prinose i analizom proizvoda, supstitucija acetalnog reagensa na hidroksi-terminusu mPEG-OH reagensa je išla do veoma visoke efikasnosti, može se reći, do 100 %-tne supstitucije. Dobijeni proizvod, bez potrebe za daljim prečišćavanjem, je proizveden sa visokom čistoćom, bez merljivih ili značajnih količina neizreagovanog mPEG-OH. Obično, alkanalni ili acetalni polimeri pronalaska su proizvedeni sa visokom čistoćom - može se reći, obično, željeni alkanalni proizvod je prisutan u krajnjoj kompoziciji sa najmanje 85 % čistoće, poželjno najmanje 90 % čistoće i čak poželjnije, sa najmanje 95 % čistoće.
B. Proizvodnja mPEG ( 30 KDa)- Butiraldehida,
mPEG30K-O-CH2(CH2)z-C(O)H
Smeša sa mPEG (30 KDa) butiraldehida, dietil acetala (1,0 g) iz A. gore, dejonizovanom vodom (20 mL) i odredjenom količinom 5 %-tne fosforne kiseline za podešavanje pH do 3,0 je mešana u toku 3 sata na sobnoj temperaturi. U tu smešu je dodat natrijum hlorid (1,0 g) i pH je podešen do 6,8 dodatkom 0,1 M natrijum-hidroksida. Proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen pomoću destilacije. Vlažan proizvod je osušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 0,82 g.
NMR (d6-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-) 2,44 ppm (dt, -CrLrCHO), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, PEG oslonac), 9,66 ppm (t, -CHO).
Supstitucija: -100 %.
Konverzija do odgovarajućeg aldehida je izvedena do bitno kvantitativnog prinosa.
Primer 3
KOMPARATIVNA STABILNOST MPEG- PROPIONALDEHIDA I
MPEG- BUTIRALDEHIDA PRI BAZNIM<p>H
Metoksi-PEG-propionaldehid i mPEG-butiraldehid su svaki izloženi uslovima visoke pH za duže vreme kako bi se uporedila relativna stabilnost svakog polimera pod baznim pH uslovima. Kao što je navedeno dole, značajne količine propionaldehidnog PEG reaguju pod tim uslovima i formiraju mPEG-OH i oslobadjaju akrolein (zbog reakcija retro-Mihaelovog tipa), dok se ne detektuje gubitak PEG butiraldehidnih jedinjenja. Detalji ovog eksperimenta su izloženi dole.
A. Stabilnost mPEG( 2 KDaVButiraldehida u baznim pH
mPEG(2 KDa)-butiraldehid (iz Primera 1) (0,5g) je rastvoren u 10 mL 5mM fosfatnog pufera (pH = 8,0) i dobijeni rastvor je mešan u toku 24 h na sobnoj temperaturi. NaCl (0,5g) je dodat i proizvod je ekstrahovan sa metilen hloridom (3 x 10 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom na 25 °C.
Na osnovu<X>H NMR analiza, proizvod je ostao nepromenjen. Može se reći, da nije detektovana dekompozicija PEG-butanala, čak i nakon produženog vremena pod ovim baznim pH uslovima.
B. Stabilnost mPEG( 5 KDa)- Propionaldehida u baznim pH
mPEG(5 KDa)-Propionaldehid (Sheanvater Corporation, sa aldehidnom supstitucijom od 82 %) (0,5g), je rastvoren u 10 mL 5mM fosfatnog pufera (pH = 8,0). Dobijeni rastvor je mešan u toku 24 h na sobnoj temperaturi. Analiza gasne hedspejs hromatografije je pokazala da rastvor sadrži akrolein (CH2=CH-CHO), koji je dobijeni iz reakcije eliminacije pod baznim uslovima kao što su oni koji se obično primenjuju za konjugaciju proteina. NaCl (0,5g) je dodat i proizvod je ekstrahovan sa metilen hloridom (3 x 10 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom na 25 °C.
Na osnovu<:>H NMR analiza, ustanovljeno je da supstitucija mPEG(5 KDa)-propionaldehida opada do 62 % (može se reći, 38 % PEG-propanala je razgradjeno) i proizvod sadrži značajne količine mPEG-OH, koji je nastao zbog gubitka C-3 segmenta koji odgovara propanalnom delu PEG-propanala.
Primer 4
Pe<g>ilovante Lizozima
("Lizozim-NH2" se misli da označi molekul lizozima sa prikazanom jednom od njegovih reaktivnih amino grupa).
A. Nasumično<p>e<g>ilovanie korišćenjem 2 kD PEG alkanala.
Model protein, lizozim, jedan sekretorni enzim sa 129 aminokiselina, je korišćen za prikaz kuplovanja alkanalnog polimera iz pronalaska za jedan ilustrativni protein. Lizozim sadrži šest lizin delova kao potencijalna mesta za pegilovanje.
Lizozim (2,1 mg) je rastvoren u 1 mL 50 mM fosfatnog pufera (pH 7,6) u koji je dodat mPEG (2kD)-butiraldehida (iz Primera 1,1,5 mg). U taj rastvor je dodat redukujući agens, NaCNBH3(natrijum-cijanoborhidrid) i rastvor je mešan u toku 24 h na sobnoj temperaturi. Dobijeni lizozimski konjugat poseduje PEG lance kuplovane sa lizozimskom amino grupom pomoću invervnog -(CH2)4-lanca.
Reakcioni proizvod je analiziran pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije i prikazani pikovi odgovaraju trima PEGilovanim vrstama lizozima na 16208 Da, 18422 Da i 20520 Da, koji se razlikuju u masi za prosečno 2000 Da (što odgovara veličini PEG butanalnog reagensa), kao i nemodifikovanom proteinu. Masa nemodifikovanog (nativnog) lizozima odredjena pomoću MALDI-TOF je bila 14153. Tako, formirani konjugat je u stvari smeša koja sadrži monopegilovani protein, di-pegilovani protein i tri-pegilovani protein (1-mer, 2-mer i 3-mer).
Gornje prikazuje nasumično pegilovanje ilustrativnog proteina iz pronalaska pri čemu se dobija distribucija pegilovanih proizvoda. Ukoliko se želi, reakciona smeša se može dalje razdvajati kako bi se izolovali pojedinačni PEG konjugati, odnosno, lizozim koji ima jedan PEG molekul vezan za njega, lizozim koji ima dva vezana PEG i lizozim koji ima tri vezana PEG. Unutar svakog konjugata sa kompozicijama opisanim gore (1-mer, 2-mer, 3-mer), PEG molekul može biti privezan za različito reaktivno amino mesto unutar molekula lizozima.
B. Pe<g>ilovanje korišćenjem 5 kD PEG alkanala. mPEG- 2-
metilbutiraldehida.
Konjugacija model proteina, lizozima, je ponovljena korišćenjem alfa razgranatog PEG reagensa, mPEG5kD-2-metilbutiraldehida. Lizozim (3 mg) je rastvoren u približno 1 mL natrijum fosfatnog pufera u pH opsegu od oko 5,5 do 7,5. Dvostruki do petostruki molarni višak PEG reagensa, mPEG5kD-2-metilbutiraldehida, je dodat u rastvor lizozima i dobijeni rastvor je stavljen u rotirajući mikser i reakcija je tekla na sobnoj temperaturi. Nakon približno 15 minuta, 20-o struki molarni višak NaCNBH3je dodat i reakcija je nastavljena. Alikvoti su uzimani u različitim vremenskim intervalima (4 sata, 8 sati, 12 sati, 16 sati, itd.) a tok reakcije je praćen pomoću SDS-PAGE i MALDI-TOF masene spektrometrije.
Nakon završetka reakcije, dobijena smeša konjugata je koncentrovana, sterilisana filtracijom i skladištena pod uslovima niske temperature (-20 °C do
-80 °C) do daljeg korišćenja.
Primer 5
Proizvodnja raz<g>ranato<g>PEG2( 40. 3 KDa)- Butiraldehida
Primer proizvodnje polimernog alkanala koji ima razgranati PEG segment je opisan dole.
Rezime. Globalno, sinteza uključuje prvo kuplovanje tetra(etilenglikol) spejsera za reaktivni alkanalni prekursor, 4-hlorbutiraldehid dietil acetal. Uvodjenje nekog oligomernog etilenglikol spejsera obezbedjuje veću stabilnost dobijenog proizvoda produženjem dužine lanca izmedju reaktivne aldehidne (ili acetalne) grupe i reaktivne grupe koja se može nalaziti u povezujućem delu, X', pri čemu se minimizuje pojava potencijalnih sporednih reakcija i poboljšavaju prinosi.
Korišćenje nekog oligomernog spejsera, kao što je tetraetilenglikol, takodje obezbedjuje reaktivnu funkcionalnu grupu, u ovom slučaju, hidroksi, koja se može konvertovati, ukoliko je potrebno, za kuplovanje za polimerni segment koji je hromatografski prečišćen radi uklanjanja polimernih nečistoća kao što su PEG-diol, mPEG-OH i slično. Na taj način, neželjene funkcionalizovane polimerne nečistoće, kao što su PEG-dialdehid (dobijen iz PEG diola) i slično, su uklonjene iz PEG segmenta pre kuplovanja za alkanalni prekursor za dobijanje krajnjeg proizvoda, vodo-rastvornog polimernog alkanala koji je potpuno oslobodjen polimernih nečistoća.
Vraćajući se na specifične reakcije dole, kuplovanje tetra(etilenglikolnog) spejsera za 4-hlorbuitraldehid dietil acetal, vodi do formiranja željenog mono-alkanalnog proizvoda kontaminiranog sa di-alkanalnim proizvodom i polaznim tetra(etilenglikolom). Medjutim, istrajnim radom u kome se koriste razlike u rastvorljivosti svih komponenti u reakcionoj smeši omogućava se siguran preparat sa monoalkanalnim proizvodom visoke čistoće, može se reći, koji ima alkanalnu (acetalnu) funkciju supstituisanu samo na jednoj reaktivnoj hidroksi grupi na tetra(etilenglikolnom) molekulu. (ReakcuaA.). Proizvod iz REAKCIJE A se tada konvertuje do odgovarajućeg mezilata pomoću reakcija sa metansulfonil hloridom, odnosno, slobodna hidroksi grupa na tetra(etilenglikolu) se konvertuje prvo do mezilata (Reakcija B), nakon čega se mezilat konvertuje do primarne amino grupe (Reakcija C). Reaktivna amino grupa na acetalnom reagensu se tada kupluje za ilustrativni razgranati polimerni oslonac segmenta koji ima reaktivni karbonilni ugljenik pogodan za reagovanje sa amino grupom na acetalnom reagensu. Prekursor za PEG reaktant, mPEG-disupstituisani lizin, je prečišćen pomoću jonoizmenjivačke hromatografija pre konverzije do odgovarajućeg aktiviranog estra kako bi se ukonile polimerne nečistoće. N-hidroksisukcinimidil estar sa mPEG-disupstituisanog lizina tada reaguje sa amino-alkanal acetalom, putem formiranja neke amidne veze, pri čemu se formira razgranati PEG-spejser-alkanal acetal. Acetal se tada lako hidrolizuje u reakciji katalizovanoj kiselinom i formira odgovarajući alkanal i posebno, 2-okraki razgranati PEG (40 KDa) butiraldehid.
Sintetski pristup nije ograničen na razgranate polimerne segmente već može biti iskorišćen za polimerne segmente koji imaju bilo koju od ovde opisanih geometrija.
Kratak pregled<g>lobalnih sinteza:
A. Tetra ( etilenglikol) mono- butiraldehid. dietil acetal.
Smeša sa tetra(etilenglikolom) (97,1 g, 0,500 mola) i toluenom (200 mL) je azeotropno osušena pomoću uklanjanja toluena destilacijom pod sniženim pritiskom (rotacioni uparivač). Osušeni tetra(etilenglikol) je rastvoren u bezvodnom toluenu (180 mL) i 1,0 M rastvoru kalijum terc-butoksida u terc-butanolu (120,0 mL, 0,120 mola) i dodat je 4-hlorbuitraldehid dietil acetal (18,1 g, 0,100 mola) (Alfa Aesar). Smeša je mešana na 95 -100 °C preko noći pod atmosferom argona. Nakon hladjenja do sobne temperature, smeša je filtrirana i rastvarači su uklonjeni destilacijom pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je rastvoren u 1000 mL dejonizovane vode i dobijeni rastvor je filtriran kroz aktivni ugalj. Natrijum hlorid (10 g) je dodat i proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (250,200 i 150 mL). Ekstrakt je osušen (preko MgS04) i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom (pomoću rotacionog uparivača).
Sirovi proizvod je rastvoren u 300 mL 10 %-tnog fosfatnog pufera (pH = 7,5) i nečistoće su ekstrahovane sa etil acetatom (2 x 50 mL). Proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (200,150 i 100 mL). Ekstrakt je osušen (preko MgS04) i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom (pomoću rotacionog uparivača).
Prinos: 20,3 g. NMR (d6-DMSO): l.lOppm (t, CH3-C-) 1,51 ppm (m, C-CH2-CH2-), 3,49 ppm (bm, -OCH2CH20-), 4,46 ppm (t, -CH, acetal), 4,58 ppm (t, -OH). Čistoća:~100 % (bez znakova neizreagovanog polaznog materijala).
B. Tetra( etilenglikol)- a- mezilat-( o- butiraldehid. dietil acetal.
Smeša sa tetra (etilenglikol) mono-butiraldehid, dietil acetalom (12,5g, 0,037 mola) i toluenom (120 mL) je azeotropno osušena pomoću uklanjanja toluena destilacijom pod sniženim pritiskom (rotacioni uparivač). Osušeni tetra (etilenglikol) mono-butiraldehid, dietil acetal je rastvoren u bezvodnom toluenu (100 mL) i u rastvor je dodato 20 mL bezvodnog dihlormetana i 5,7 mL trietilamina (0,041 mola). Tada je dodato 4,5 g metansulfonil hlorida (0,039 mola) u kapima. Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi pod atmosferom azota, preko noći. Nakon toga je dodat natrijum-karbonat (5 g), smeša je mešana 1 h. Tada je rastvor filtriran i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom (rotacioni uparivač).
1,10 ppm (t, CH3-C-) 1,51 ppm (m,C- CU^ CR^),3,17 ppm (s, CH3-metansulfonat), 3,49 ppm (bm, -OCH2CH20-), 4,30 ppm (m, -CH^metansulfonat), 4,46 ppm (t, -CH, acetal).
Čistoća: ~ 100 %.
C. Tetra ( etilenglikol) - a- amino- co- butiraldehid. dietil acetal
Smeša sa tetra(etilenglikol)-a-mezilat-co-butiraldehid, dietil acetalom (14,0
g), koncentrovanim amonijum hidroksidom (650 mL) i etil alkoholom (60 mL) je mešana 42 h na sobnoj temperaturi. Nakon toga, sve isparljive materije su
uklonjene destilacijom pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je rastvoren u 150 mL dejonizovane vode i pH rastvora je podešen do 12 sa 1,0 M NaOH. Proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 100 mL). Ekstrakt je osušen (MgS04) i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom (rotacioni uparivač). Prinos: 10,6 g. NMR (D20): 1,09 ppm (t, CH3-C-) 1,56 ppm (m, C-CH^CH^), 2,69 ppm (t, CH.2-N), 3,56 ppm (bm, -OCH2CH20-), 4,56 ppm (t, -CH, acetal). Čistoća: ~ 100 %.
P.Razgranati PEG2C40. 3 KDaVbutiraldehid. dietil acetal
PEG2 (40 KDa)-N-hidroksisukcinimid je proizveden iz odgovarajućeg PEG2-lizina, kako je opisano u U.S. Patentu Br. 5,932,462 (Harris, J. i sar.). Prekursor PEG-2 lizina, razgranati PEG koji ima jonizujuću karboksil grupu, je prečišćen pomoću jonoizmenjivačke hromatografije, kako je takodje opisano u U.S. Patentu Br. 5,932,462.
U rastvor sa PEG2 (40 KDa)-N-hidroksisukcinimidom (5,0 g, 0,000125 mola) (Shearvvater Corporation) u metilen hloridu (100 mL), dodato je tetra(etilenglikol)-a- amino-co-butiraldehid, dietil acetala (0,50 g, 0,000148 mola) i trietilamina (0,035 mL) i reakciona smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi u atmosferi argona. Rastvarač je uparen do suva korišćenjem rotacionog uparivača. Sirovi proizvod je rastvoren u metilen hloridu i precipitiran sa izopropil alkoholom. Vlažan proizvod je osušen pod sniženim pritiskom. Prinos 4,8 g.
NMR (d6-DMSO): 1,10 ppm (t, CH3-C), 1,51 ppm (m, C-CH^CH^), 3,24 ppm (s,
-OCH3), 3,51 ppm (s, PEG oslonac), 4,46 ppm (t, -CH-, acetal).
Supstitucija: ~ 100 %.
E. Razgranati PEG2C40. 3 KDa)- butiraldehid
Razgranati PEG2(40,3 KDa)-butiraldehid, dietil acetal (4,8 g) je rastvoren u 100 mL vode i pH rastvora je podešen na 3 sa rastvorom fosforne kiseline. Rastvor je mešan u toku 3 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je dodato 0,5 M natrijum-hidroksida što je dovoljno za podešavanje pH rastvora na oko 7. Proizvod je ekstrahovan sa metilen hloridom i ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom. Rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom. Prinos: 4,2 g. NMR (de-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-) 2,44 ppm (dt, -CH2-CHO), 3,24 ppm (s, -OCH3), 3,51 ppm (s, PEG oslonac), 9,66 ppm (t, -CHO). Supstitucija: ~ 100 %.
Gore je ilustrovano još jedno rešenje pronalaska, proizvodnja reprezentativnog razgranatog PEG alkanala. Gore je takodje ilustrovano jedno rešenje pronalaska gde polimerni alkanal sadrži kratku oligomernu grupu, u tom slučaju, tetraetilenglikol je umetnut izmedju polimernog oslonca i alkanalnog segmenta molekula. Dalje, ovaj primer ilustruje korišćenje prekursornog polimernog segmenta koji sadrži jonizujuću grupu tako da takav polimerni segment može biti prečišćen pomoću jonoizmenjivačke hromatografije pre kuplovanja za alkanal-acetalni reagens, čime se efikasno uklanjaju polimerne nečistoće na početku reakcione sheme. U tom slučaju, formirani proizvod je oslobodjen od difunkcionalnih polimernih nečistoća kao što su oni koji su nastali iz reakcija PEG-diola ili mPEG, ili mono-pegilovanog lizina ili slično, koji mogu biti prisutni u mPEG2-lizinskom prekursoru ali su uklonjeni pomoću hromatografije.
Primer 6
Proizvodnja polimer- alkanal proteinskogkontugata
Nasumično<p>e<g>ilovanje EPO
Rekombinantni EPO (proizveden uE. coli,ćelijama sisara (na pr., CHO ćelije) ili drugim mikrobnim izvorima) je kuplovan za mPEG-buitraldehid 30 kDa (proizveden kako je opisano u Primeru 2).
EPO (~ 2 mg) je rastvoren u 1 mL 50 mM fosfatnog pufera (pH 7,6) i dodat je mPEG (30 kDa)-buitraldehid u 5X molarnoj EPO koncentraciji. Redukujući agens, NaCNBH3, je dodat i rastvor je mešan u toku 24 h na sobnoj temperaturi do kuplovanja PEG-butanalnog reagensa za protein preko neke amino veze.
Reakciona smeša je analizirana sa SDS-PAGE za odredjivanje stepena PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri, itd. je izvedena pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane vrste su se razlikovale za približno 30,000 Da. Dobijena reakciona smeša sadrži smešu nativnih i monopegilovanih proteina. Povećanjem odnosa PEG reagensa u odnosu na protein povećava se stepen poliPEGilovanja, može se reći, formiranje 2-mera, 3-mera, itd.
Korišćenje PEG alkanala sa velikom molekulskom masom koji ima molekulsku masu veću od oko 20 kDa favorizuje formiranje mono-PEGilovanih vrsta. PEG alkanali sa manjom molekulskom masom, kada se kupluju za protein, su podložniji formiranju poli-PEGilovanih vrsta pod tim uslovima.
Gornje pokazuje nasumično pegilovanje ilustrativnog proteina iz pronalaska za postizanje raspodele pegilovanih EPO proizvoda. Ukoliko se želi, reakciona smeša može biti dalje razdvajana kako bi se izolovali pojedinačni izomeri, kako je opisano u daljem tekstu.
PEG konjugati koji imaju različite molekulske mase se tada razdvajaju pomoću gel filtracione hromatografije. Različiti PEG konjugati (1-meri, 2-meri, 3-meri, itd.) su frakcionisani na osnovu njihove različite molekulske mase (u ovom slučaju, variraju približno 30 kDa). Odredjenije, razdvajanje je izvedeno korišćenjem serije sistema kolona koji je pogodan za efikasno razdvajanje proizvoda sa molekulskim masama u opsegu koji je uočen, na primer, Superdeks™200 kolona (Amersham Biosciences). Proizvodi su eluirani sa 10 mL acetatnog pufera pri protoku od 1,5 ml/min. Sakupljene frakcije (1 mL) su analizirane pomoću OD na 280 nm za sadržaj proteina i takodje, korišćenjem jodnog testa za PEG sadržaj (Sims G. E. C isar. Anal. Biochem, 107,60- 63, 1980). Alternativno, rezultati su vizualizovani pomoću nakapavanja na SDS PAGE gel, koji je nakon toga bojen sa barijum jodidom. Frakcije koje odgovaraju eluiranim pikovima su sakupljene, koncentrovane pomoću ultrafiltracije korišćenjem 10 - 30 kD membrane i liofilizovane. Ovim metodom je postignuto razdvajanje/prečišćavanje konjugata koji imaju istu molekulsku masu ali ne i razdvajanje konjugata koji imaju istu molekulsku masu ali se razlikuju po mestima pegilovanja (odnosno, pozicioni izomeri).
Razdvajanje pozicionih izomera je izvedeno pomoću reverzno fazne hromatografije korišćenjem RP-HPLC C18 kolona (Amersham Biosciences ili Vydac). Ovaj postupak je efikasan za razdvajanje PEG-biomolekulskih izomera koji imaju istu molekulsku masu (pozicionih izomera). Reverzno-fazna hromatografija je izvedena korišćenjem RP-HPLC C18 preparativne kolone i eluiranjem sa gradijentom voda/0,05 % TFA (Eluent A) i acetonitril/0,05 % TFA (EluentB).
Frakcije koje odgovaraju eluiranim pikovima su sakupljene, uparene kako bi se uklonio acetonitril i TFA, nakon čega je uklonjen rastvarač kako bi se izolovali pojedinačni pozicioni PEG-izomeri.
Primer 7
Proizvodnja polimer- alkanal<p>roteinsko<g>konju<g>ata
n- terminalno pegilovante epo
Rekombinantni EPO (proizveden uE. coli,ćelijama sisara (kao što su CHO bez ograničenja) ili drugim mikrobnim izvorima) je kuplovan za mPEG-butiraldehid, 30 kDa (Primer 2).
EPO (~ 2 mg) je rastvoren u 1 mL 0,1 mM natrijum-acetata (pH 5) i dodato je mPEG(30 kDa)-butiraldehida (iz Primera 2) u 5X molarnoj EPO koncentraciji. Redukujući agens, NaCNBH3, je dodat i rastvor je mešan u toku 24 h na 4 °C do kuplovanja PEG-butanalnog reagensa za protein preko neke aminske veze.
Reakciona smeša je analizirana sa SDS-PAGE za odredjivanje stepena PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri itd., je izvedena pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane vrste su se razlikovali približno za 30,000 Da. Dobijena reakciona smeša primarno sadrži smešu nativnog i monopegilovanog proteina. Mono-PEGilovane vrste su prečišćene pomoću kolonske hromatografije kako bi se uklonio slobodan EPO i vrste sa većom molekulskom masom.
Potvrda N-terminalnog PEGilovanja je izvedena pomoću mapiranja peptida. Povećanjem odnosa PEG na protein, povećava se stepen PEGilovanja, dajući poli-pegilovani protein.
Gornje pokazuje pegilovanje jednog ilustrativnog proteina iz pronalaska za dobijanje predominirajućeg N-terminalnog jedno-pegilovanog proteina.
Primer 8
N- TERMINALNO PEGILOVANTE GCSF
Rekombinantni GCSF (proizveden uE. coli.,ćelijama sisara (kao što su CHO ćelije) ili drugim mikrobnim izvorima) je kuplovan za mPEG-butiraldehid, 30 kDa.
GCSF (~2 mg) je rastvoren u 1 mL 0,1 raM natrijum acetata (pH 5) i dodat je mPEG(30 kDa)-butiraldehid (iz Primera 2) u 5X molarnoj GCSF koncentraciji. Redukujući agens, NaCNBH3, je dodat i rastvor je mešan u toku 24 h na 4 °C do kuplovanja PEG-butanalnog reagensa za protein preko neke aminske veze.
Dobijena reakciona smeša je analizirana sa SDS-PAGE za odredjivanje stepena PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri, itd. je izvedena pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane vrste su se razlikovali približno za 30,000 Da. Dobijena reakciona smeša primarno sadrži smešu nativnog i monopegilovanog GCSF. Mono-PEGilovane vrste su prečišćene pomoću kolonske hromatografije kako bi se uklonio slobodan GCSF i vrste sa većom molekulskom masom. Potvrda N-terminalnog PEGilovanja je izvedena pomoću mapiranja peptida. Povećanjem odnosa PEG na protein, povećava se stepen PEGilovanja, dajući poli-pegilovani protein.
Primer 9
n- terminalno<p>e<g>ilovante interferona a
Rekombinantni IFN-cc (proizveden uE. coli,ćelijama sisara (kao što su CHO bez ograničavanja) ili drugim mikrobnim izvorima) je kuplovan za mPEG-butiraldehid, 30 kDa.
Interferon-a (~ 2 mg) je rastvoren u 1 mL 0,1 mM natrijum acetata (pH 5) i mPEG(30 kDa)-butiraldehid (iz Primera 2) je dodat u 5X molarnoj IFN koncentraciji. Redukujući agens, NaCNBH3je dodat i rastvor je mešan u toku 24 h na 4 °C do kuplovanja PEG-butanalnog reagensa za protein preko neke aminske veze.
Reakciona smeša je analizirana sa SDS-PAGE za odredjivanje stepena PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri, itd. je izvedena pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane vrste su se razlikovali približno za 30,000 Da. Dobijena reakciona smeša primarno sadrži smešu nativnog i monopegilovanog proteina. Mono-PEGilovane vrste su prečišćene pomoću kolonske hromatografije kako bi se uklonio slobodan interferon-a i vrste sa većom molekulskom masom. Potvrda N-terminalnog PEGilovanja je izvedena pomoću mapiranja peptida. Povećanjem odnosa PEG na protein, povećava se stepen PEGilovanja, dajući poli-pegilovani
IFN.
Konjugacija proteina hGH, IFN-(3 i FSH za drugi ilustrativni PEG-alkanal, mPEG-2-metil butiraldehid, 20 kDa je izvedena u osnovi na način opisan u gornjim primerima.
Primer 10
n- terminalno pegilovantehumanog hormona rasta
Rekombinantni humani hormon rasta (proizveden uE. coli,ćelijama sisara (kao što su CHO bez ograničavanja) ili drugim mikrobnim izvorima) je kuplovan za mPEG-2-metil butiraldehid, 20 kDa.
Humani hormon rasta (~2 mg) je rastvoren u 1 mL 0,1 mM natrijum acetata (pH 5) i mPEG-2-metil butiraldehid, 20 kDa je dodat u 5X molarnoj hGH koncentraciji. 5 do 20-o struki molarni višak redukujućeg agensa, NaCNBH3 je dodat i rastvor je mešan u toku 24 h na 4 °C do kuplovanja PEG-
a metilbutanalnog reagensa za protein preko neke aminske veze.
Tok reakcije je analiziran pomoću SDS-PAGE ili MALDI-TOF masene spektrometrije za odredjivanje stepena PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri, itd. je izvedena pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane i druge vrste su se razlikovali približno za 20,000 Da. Dobijena reakciona smeša primarno sadrži smešu nativnog i monopegilovanog proteina. Mono-PEGilovane vrste su prečišćene pomoću kolonske hromatografije kako bi se uklonio slobodan hGH i vrste sa većom molekulskom masom. Potvrda N-terminalnog PEGilovanja je izvedena pomoću mapiranja peptida. Povećani odnos PEG aldehida na protein, povećava stepen PEGilovanja, dajući populaciju poli-pegilovanog hGH.
Primer 11
n- terminalno pegilovante interferona-[ 3
Rekombinantni interferon-p (proizveden uE. coli,ćelijama sisara (kao što su CHO bez ograničavanja) ili drugim mikrobnim izvorima) je kuplovan za mPEG-2-metil butiraldehid, 20 kDa.
Interferon-p (~2 mg) je rastvoren u 1 mL 0,1 mM natrijum acetata (pH 5) i mPEG-2-metil butiraldehid, 20 kDa je dodat u 5X molarnoj IFN-p koncentraciji. 5 do 20-o struki molarni višak redukujućeg agensa, NaCNBH3je dodato i rastvor je mešan u toku 24 h na 4 °C do kuplovanja PEG-a metilbutanalnog reagensa za protein preko neke aminske veze.
Tok reakcije je analiziran pomoću SDS-PAGE ili MALDI-TOF masene spektrometrije za odredjivanje stepena PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri, itd. je izvedena pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane i druge vrste su se razlikovali približno za 20,000 Da. Dobijena reakciona smeša primarno sadrži smešu nativnog i monopegilovanog proteina. Mono-PEGilovane vrste su prečišćene pomoću kolonske hromatografije kako bi se uklonio slobodan IFN-p i vrste sa većom molekulskom masom. Potvrda N-terminalnog PEGilovanja je izvedena pomoću mapiranja peptida. Povećanjem odnosa PEG na protein, povećava se stepen PEGilovanja, dajući populaciju poli-pegilovanog IFN-p.
Primer 12
n- terminalno pegilovante fsh
Rekombinantni folikul stimulišućeg hormona (proizveden uE. coli,ćelijama sisara (kao što su CHO bez ograničavanja) ili drugim mikrobnim izvorima) je kuplovan za mPEG-2-metil butiraldehid, 20 kDa.
Folikul stimulišući hormon (~ 2 mg) je rastvoren u 1 mL 0,1 mM natrijum acetata (pH 5) i mPEG-2-metil butiraldehid, 20 kDa je dodat u 5X molarnoj FSH koncentraciji. 5 do 20-o struki molarni višak redukujućeg agensa, NaCNBH3 je dodato i rastvor je mešan u toku 24 h na 4 °C do kuplovanja PEG-a-metilbutanalnog reagensa za protein preko neke aminske veze.
Tok reakcije je analiziran pomoću SDS-PAGE ili MALDI-TOF masene spektrometrije za odredjivanje stepena PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri, itd. je izvedena pomoću Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane i druge vrste su se razlikovali približno za 20,000 Da. Dobijena reakciona smeša primarno sadrži smešu nativnog i monopegilovanog proteina. Mono-PEGilovane vrste su prečišćene pomoću kolonske hromatografije kako bi se uklonio slobodan FSH i vrste sa većom molekulskom masom. Potvrda N-terminalnog PEGilovanja je izvedena pomoću mapiranja peptida. Povećanjem odnosa PEG na protein, povećava se stepen PEGilovanja, dajući populaciju poli-pegilovanog FSH.
Primer 13
n- terminalno<p>e<g>ilovante humano<g>hormona rasta
Rekombinantni hGH (proizvedenu E. coli,ćelijama sisara (kao što su CHO bez ograničavanja) ili drugim mikrobnim izvorima) je kovalentno vezan za razgranati PEG2(40,3 KDa)-butiraldehid, (Primer 5E).
Humani hormon rasta (~2 mg) je rastvoren u 1 mL 0,1 mM natrijum acetata (pH 5) i razgranati PEG2(40,3 KDa)-buitraldehid je dodat u 5X molarnoj hGH koncentraciji. 5 do 20-o struki molarni višak redukujućeg agensa, NaCNBH3je dodato i rastvor je mešan u toku 24 h na 4 °C do kuplovanja razgranatog PEG2(40,3 KDa)-butiraldehidnog reagensa za protein preko neke aminske veze.
Tok reakcije je analiziran pomoću SDS-PAGE ili MALDI-TOF masene spektrometrije za odredjivanje obima PEGilovanja. Potvrda stepena PEGilovanja, 1-mer, 2-meri (ako ih ima) itd. je izvedena pomoću Matrk Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) masene spektrometrije. Dobijeni pikovi za nativne i mono-PEGilovane i druge vrste su se razlikovali približno za 40,000 Da. Dobijena reakciona smeša primarno sadrži smešu nativnog i monopegilovanog proteina, posebno zbog veličine i geometrije razgranatog PEG alkanalnog reagensa. Mono-PEGilovane vrste su prečišćene pomoću kolonske hromatografije kako bi se uklonio slobodan hGH i vrste sa većom molekulskom masom. Potvrda N-terminalnog PEGilovanja je izvedena pomoću mapiranja peptida.
Primer 14
Pe<g>ilovanie amfotericina B
Amino grupa malog molekula, amfotericina B, je modifikovana pomoću vezivanja polimernog alkanala.
U rastvor amfotericina B.HC1 u dejonizovanoj vodi je dodat 2-ostruki molarni višak mPEG2k-butiraldehida (Primer 1) rastvoren u 0,1 M fosfatnom puferu na pH 6,5. U tu smešu je dodat rastvor NaCNBH3(u 1,5 do 10-ostrukom molarnom višku) u fosfatnom puferu na pH 6,5 i dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noći u atmosferi argona. Alikvoti reakcione smeše su uzimani u različitim vremenskim intervalima za praćenje toka reakcije pomoću<!>H NMR. Na završetku, reakciona smeša je dalje razblažena dodatkom vode i NaCl je dodat za postizanje zasićenja. Proizvod je tada ekstrahovan sa dihlormetanom i kombinovani organski ekstrakti su osušeni preko bezvodnog natrijum-sulfata, filtrirani kako bi se uklonio agens za sušenje a rastvarač je uparen pomoću rotacionog uparivača. Proizvod je tada precipitiran dodatkom dietiletra i osušen pod vakuumom, preko noći. Dobijeni proizvod je analiziran sa gel permeacionom hromatografijom za odredjivanje obima konjugacije.
Sirovi proizvod je prečišćen pomoću katjonizmenjivačke hromatografije korišćenjem Poros 50 HS katjon izmenjivačke smole (PerSeptive BioSvstems, Framingham, MA). Nakon ispiranja kolone sa dejonizovanom vodom, proizvod je eluiran sa 1N NaCl rastvorom. Konjugati koji sadrže ekstrakte su kombinovani i proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom. Organski rastvor je osušen preko bezvodnog natrijum sulfata, filtriran i rastvarač je uparen pomoću rotacionog uparivača. Prečišćeni konjugat je prečišćen dodatkom dietiletra.
Ako je potrebno, proizvod se dalje prečišćava pomoću reverzno fazne HPLC hromatografije korišćenjem Betazil C18 kolone (Kevstone Scientific).
Primer 15
Proizvodnja PEG ( 3500 Da)- a- HiDROKSi- co- BUTiRALDEHiDA pomoću
POLIMERIZACITE SA OTVARANTEM PRSTENA KOD ETILEN OKSIDA DIREKTNO NA
ANTONSKOM ACETALNOM PREKURSORU
U ovom primeru, jedan acetalni prekursor, koji ima mesto pogodno za inicijaciju polimerizacije sa otvaranjem prstena etilen oksida je proizveden pomoću reakcije 4-hlor-butiraldehid dietil acetala sa di-alkohol, etilenglikolom. Na taj način, halo-acetal je konvertovan u hidroksilom završeni acetal. Hidroksil grupa, kada se konvertuje u odgovarajući alkoksid anjon, obezbedjuje mesto za inicijaciju polimerizacije etilen oksida (EO), čime se formira polimerni alkanalni prekursor. Polmerni alkanalni prekursor (acetal) se hidrolizom konvertuje u željeni polimerni alkanal.
Generalizovana shema ovog sintetskog pristupa za proizvodnju polimernog alkanala iz pronalaska je prikazana na SLICI 1.
A. Proizvodnja 2-( 4. 4- dietoksi- butoksi) etanol ( Tedinienie 15A).
Smeša sa bezvodnim etilenglikolom (120 g, 1,93 mola), 1,0 M rastvorom kalijum terc-butoksida u terc-butanolu (70 mL, 0,07 mola) i 4-hlorbutiraldehid dietil acetalom (11 g, 0.061 mola) je mešana preko noći na 100 °C u atmosferi argona. Nakon hladjenja do sobne temperature, reakciona smeša je dodata u 600 mL destilovane vode. Proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (150,125 i 125 mL). Kombinovani ekstrakti su tada osušeni sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom. Nakon toga, proizvod je podvrgnut vakuum destilaciji (kugelrohr, t = 90 -110 °C, 0,10 mm Hg).
Prinos 5,5 g.
NMR (dff-DMSO): 1,11 ppm (t, 6H), 1,53 ppm (m, -CH2CH, 2H), 1,64 ppm (m, - CH2-CH2-CH, 2H), 3,37 ppm (t, -O-CHgCHgCHgCH, 2H), 3,53 ppm (t, HO-
CH^CHgO-, 2H), 3,62 ppm (q, -CH2CH3,4H), 3,70 ppm (t, HO-CH2-, 2H), 4,38 ppm (t, -CH acetal, IH), 4,54 ppm (t, IH, -OH).
B. Proizvodnja PEG ( 3. 500 Da)- a- hidroksi-( o- butiraldehid dietil acetala
Jedinjenje 15A (0,51 g, 0,00247 mola), THF 200 ml i kalijum naftalid (0,3 mol/L-tetrahidrofuran rastvor, 20 mL, 0,006 mola) su dodati u stakleni reaktor i mešani u toku 3 minuta u atmosferi argona. Etilen oksid (8,8 g 0,20 mola) je dodat u taj rastvor i reakciona smeša je mešana u toku 44 h na sobnoj temperaturi. Nakon toga smeša je pročišćena sa argonom i dodat je 0,1M fosfatni pufer (pH = 8,100 mL). THF sloj je izdvojen i odbačen. Naftalen je uklonjen iz rastvora pomoću ekstrakcije etil etrom. Proizvod je ekstrahovan iz ostatka sa dihlorometanom (3 x 50 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim natrijum sulfatom i koncentrovan na oko 30 ml. Nakon toga dodat je etiletar (250 mL) i smeša je mešana 15 min na 0 °C. Precipitovani proizvod je odfiltriran i osušen pod sniženim pritiskom.
Prinos 7,2 g.
NMR (d^DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-, 3H) 1,52 ppm (m, C-CH2-CH2 -, 4H), 3,51 ppm (s, polimerni oslonac), 4,46 ppm (t, -CH, acetal, IH), 4,57 ppm (t, -OH, IH).
C. PEG( 3. 500 Da)- a- hidroksi- co- butiraldehid
Smeša sa PEG(3,500)-a-hidroksi-co-buitraldehid dietil acetalom (1,0 g), dejonizovanom vodom (20 mL) i 5 %-tnom fosfornom kiselinom za podešavanje pH do 3,0 je mešana u toku 3 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, natrijum hlorid (1,0 g) je dodat i pH je podešena na 6,8 sa 0,1 M natrijum-hidroksidom. Proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen destilacijom. Vlažan proizvod je osušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 0,82 g.
NMR (d^DMSO): 1,75 ppm (p, -CHg-CH^CHO-) 2,44 ppm (dt, -CH2-CHO), 3,51 ppm (s, polimerni oslonac), 4,57 ppm (t, -OH), 9,66 ppm (t, -CHO).
Primer 16
Proizvodnta metoksi- PEG( 3500 Da)butiraldehida
Ovaj primer prikazuje proizvodnju ilustrativnog kaptiranog na završetku PEG-alkanala iz PEG a-hidroksi-co-alkanal acetala.
A. mPEG ( 3. 500 DaVbutiraldehid dietil acetal
Smeša sa PEG(3,500 Da)-a-hidroksi-co-butiraldehid dietil acetalom (3,5 g, 0,001 mola), toluenom (50 mL), 1,0 M rastvorom kalijum terc-butoksida u terc-butanolu (5mL, 0,005 mola) i metil p-toluen sulfonatom (0,75 g, 0,004 mola) je mešana preko noći na 45 °C. Nakon toga, rastvarači su uklonjeni destilacijom pod sniženim pritiskom (rotacioni uparivač). Sirovi proizvod je rastvoren u dihlormetanu i dodat u hladni etiletar. Precipitovani proizvod je odfiltriran i osušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 3,1 g.
NMR (dg-DMSO): 1,09 ppm (t, CH3-, 3H) 1,52 ppm (m, C-CH^CH^, 4H), 3,24 ppm (s, CH3O-, 3H), 3,51 ppm (s, polimerni oslonac), 4,46 ppm (t, -CH, acetal,
IH).
B. mPEG ( 3. 500 Da)- butiraldehid
Smeša sa mPEG(3,500)-butiraldehid dietil acetalom (1,0 g), dejonizovanom vodom (20 mL) i 5 %-tnom fosfornom kiselinom za podešavanje pH do 3,0 je mešana u toku 3 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, natrijum- hlorid (1,0 g) je dodat i pH je podešena na 6,8 sa 0,1 M natrijum-hidroksidom. Proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen destilacijom. Vlažan proizvod je osušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 0,85 g.
NMR (dg-DMSO): 1,75 ppm (p, -CH2-CH2-CHO-, 2H) 2,44 ppm (dt, -CHrCHO, 2H), 3,24 ppm (s, -OCH3,3H), 3,51 ppm (s, polimerni oslonac), 9,66 ppm (t, -
CHO, IH).
Primer 17
Proizvodnja metoksi- PEG( 2 KDa)- 2- metilbutiraldehida
Ovaj primer opisuje sintezu ilustrativnog polimernog 2-alkilsupstituisanog alkanala iz pronalaska. Ovaj polimer, umesto da poseduje ravan alkilenski lanac koji odvaja aldehidni ugljenik od povezivača, poseduje metil supstituent u C-2 poziciji.
Rezime: Zaštićeni acetalni reagens, 17-A, je proizveden iz komercijalno dostupnog polaznog materijala, 2-metil-4-hlorbutanoata, prvo, redukcijom butanoatnog ugljenika do odgovarajućeg alkohola, a zatim oksidacijom butiraldehida. Butiraldehid je tada zaštićen kao i odgovarajući acetal kako bi se dobio zaštićeni acetalni reagens za kuplovanje za PEG. Nakon kuplovanja za PEG, dobijeni polimerni acetal je hidrolizovan u kiselini kako bi se dobio željeni polimerni alkanal.
A. Proizvodnja 4- hlor- 2- metilbutiraldehid dietil acetala
Proizvodnja 4- hlor- 2- metilbutanol- l
Rastvor 2-metil 4-hlorbutanoata (TCI America) (22,0 g, 0,146 mola) u etiletru (80 mL) je dodat u kapima tokom 30 min u mešani rastvor litijum-aluminijum-hidrida (4,55 g, 0,12 mola) u etiletru (360 mL) na 0 °C pod atmosferom argona. Nakon toga dodat je metanol (12 mL) u kapima u toku 30 minuta i tada je dodata ledom ohladjena 2N HC1 (420 mL) u kapima, u toku 20 minuta. Reakciona smeša je prebačena u separacioni levak i etarski sloj koji sadrži 4-hlor-2-meitlbutanol-l, je izdvojen. Dodatno proizvod je ekstrahovan iz vodenog sloja sa etil etrom (3 x 200 mL). Etarki ekstrakti su kombinovani, osušeni sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je destilovan pod sniženim pritiskom. Prinos 18,6 g.
NMR (đVDMSO): 0,84 ppm (d, -CH3,3H), 1,50 ppm (m, -CH2CH2C1, IH), 1,68 ppm (m, -CH-, IH), 1,82 ppm (m, -CH2CH2C1, IH) 3,26 ppm (t, -CH2OH, 2H), 3,66 ppm (m, -CH2C1,2H), 4,50 ppm (t, -OH, IH).
4- Hlor- 2- metilbutiraldehid
Piridinijum hlorhromat (23,6 g, 0,110 g) je dodat postepeno u mešani
rastvor sa 4-hlor-2-metilbutanol-l (8,80 g, 0,078 mola) u bezvodnom dihlormetanu (470 mL). Smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi u atmosferi argona. Suvi etar (820 mL) je dodat; smeša je mešana u toku 20 minuta i zatim je filtrirana da se ukloni višak oksidujućeg agensa. Rastvor je zatim filtriran kroz kolonu
ispunjenu sa 400 g Florizila i rastvarači su uklonjeni destilacijom pod sniženim pritiskom. Prinos 6,0 g.
NMR (dfrDMSO): 1,06 ppm (d, -CH3,3H), 1,74 ppm (m, -CH2CH2C1, IH), 2,14 ppm (m, -CH2CH2C1, IH), 2,56 ppm (m,-CH, IH), 3,69 ppm (m, -CH2C1,2H), 9,60 ppm (t,-CHO, IH).
4- Hlor- 2- metilbutiraldehid dietil acetal
Smeša sa 4-hlor-2-metilbutiraldehidom (4,8 g, 0,040 mola), trietil ortoformijatom (6,48 g, 0,044 mola), etil alkoholom (3,0 g) i p-toluensulfonskom monohidratnom kiselinom (0,0144 g, 0,000757 mola) je mešana na 45 °C preko noći, u atmosferi argona. Zatim je, nakon hladjenja do sobne temperature, dodat Na2C03(0,40 g) i smeša je mešana u toku 15 min. Reakciona smeša je filtrirana i etil alkohol i rezidualni trietil ortoformijat su uklonjeni destilacijom pod sniženim pritiskom. Deo je podvrgnut frakcionoj vakuum destilaciji nakon čega je dobijeno 3,2 g čistog 4-hlor-2-metilbutiraldehid dietil acetala.
NMR (d6-DMSO): 0,85 ppm (d, -CH3, 3H) 1,13 ppm (m, -CH3, 6H), 1,52 ppm (m, -CH-, IH), 1,87 ppm (m, -CH2CH2C1,2H), 3,35- 3,75 ppm (bm,-OCH2CH3.4H i - CH2C1,2H), 4,22 ppm (d,-CH acetal, IH).
B. mPEG ( 2 KDa)- 2- Metilbutiraldehid. dietil acetal
Rastvor sa mPEG (2 KDa) (2,0g, 0,001 mola) u toluenu (30 mL) je azeotropno osušen uklanjanjem toluena destilacijom pod sniženim pritiskom. Osušeni mPEG 2K je rastvoren u bezvodnom toluenu (15 mL) i 1,0 M rastvoru kalijum terc-butoksida u terc-butanolu (4,0 mL, 0,004 mola) i dodat je 4-hlor-2-metilbutiraldehid dietil acetal iz A, gore (0,5 g, 0,00277 mola). Nakon toga, dodat je litijum-bromid (0,05 g) i smeša je mešana na 100 °C preko noći, u atmosferi argona. Nakon hladjenja do sobne temperature, smeša je filtrirana i dodata u 150 mL etiletra na 0 - 5 °C. Precipitovani proizvod je odfiltriran i osušen pod sniženim pritiskom. Prinos: 1,5 g.
NMR (dfrDMSO): 0,83 ppm (d, -CH3,3H) 1,10 ppm (m, -CH30, 6H), 1,24 ppm (m, -CH-, IH), 1,72 ppm (m, PEG-O-CH2-CH2-, 2H), 3,24 ppm (s, -OCH3,3H), 3,51 ppm (s, polimerni oslonac), 4,18 ppm (d, -CH acetal, IH).
Supstitucija: ~ 100 %.
C. mPEG ( 2 KDaV2- metilbutiraldehid
Smeša koja sadrži mPEG (2KDa)-2-metilbutiraldehid, dietil acetal iz B, gore (1,0 g), dejonizovanu vodu (20 mL) i 5 %-tnu fosfornu kiselinu za podešavanje pH do 3,0 je mešana u toku 3 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, natrijum hlorid (1,0 g) je dodat i pH je podešena na 6,8 sa 0,1 M natrijum-hidroksidom. Proizvod je ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Ekstrakt je osušen sa bezvodnim magnezijum sulfatom i rastvarač je uklonjen destilacijom pod sniženim pritiskom. Prinos: 0,83 g.
NMR (dg-DMSO): 1,01 ppm (d, -CH3, 3H) 1,56 ppm (m, -CH, IH), 1,90 ppm (m, PEG-0-CH2-CH2-, IH), 2,45 ppm (m, PEG-O-CH2-CH2-, IH), 3,24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3,51 ppm(s, polimerni oslonac), 9,56 ppm (d, -CH aldehid, IH). Supstitucija: ~ 100 %.

Claims (51)

1. Jedinjenje koje ima strukturu: gde hGH predstavlja ljudski hormon rasta koji uključuje N-terminalnu aminokiselinu; i gde svaki mPEG predstavlja metoksi-polietilen glikol grupu koja ima molekulsku masu između 18,000 do oko 22,000 daltona.
2. Jedinjenje iz zahteva 1, gde svaki mPEG ima nominalnu srednju molekulsku masu od oko 20,000 daltona.
3. Jedinjenje iz zahteva 2, gde jedinjenje, isključivo od hGH, ima polidisperzitet manji od oko 1,2.
4. Jedinjenje iz zahteva 2, gde jedinjenje, isključivo od hGH, ima polidisperzitet manji od oko 1,1.
5. Jedinjenje iz zahteva 2, gde jedinjenje, isključivo od hGH, ima polidisperzitet manji od oko 1,05.
6. Jedinjenje prema nekom od zahteva 1,2,3,4 ili 5, gde je hGH kovalentno vezano preko sekundarnog amina za N-terminalnu aminokiselinu hGH-a.
7. Jedinjenje iz zahteva 1,2,3,4, 5 ili 6, gde je jedinjenje mono-PEGilovano.
8. Jedinjenje iz zahteva 7, gde je hGH mono-PEGilovan prvobitno na N-terminalnu aminokiselinu hGH.
9. Jedinjenje prema nekom od zahteva 1,2,3,4, 5, 6,7 ili 8, gde je hGH rekombinovani hGH.
10. Jedinjenje iz zahteva 9, gde je rekombinovani hGH proizveden u E. coli.
11. Jedinjenje prema nekom od zahteva 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, gde je jedinjenje, prečišćeno jedinjenje.
12. Jedinjenje iz zahteva 11, gde je jedinjenje prečišćeno hromatografijom.
13. Jedinjenje iz zahteva 12, gde je jedinjenje prečišćeno hromatografskom kolonom jonske zamene.
14. Konjugat obrazovan reakcijom polimera sa ljudskim hormonom rasta (hGH) uključujući N-terminalnu aminokiselinu, gde polimer ima strukturu: gde svaki mPEG predstavlja metoksi-polietilen glikol grupu koji ima molekulsku masu između 18,000 i 22,000 daltona; (Primer 13, Primer 5 (polimerni deo), Zahtev90, strana 11, redovi 14-16), strana 37 - Struktura V-B, strana 40, redovi 10-12.
15. Konjugat iz zahteva 14, gde svaki mPEG ima nominalnu srednju molekulsku masu oko 20,000 daltona.
16. Konjugat iz zahteva 14, gde polimer ima nominalnu srednju molekulsku masu oko 40,300 daltona.
17. Konjugat prema nekom od zahteva 14,15 ili 16, gde polimer ima polidisperzitet manji od oko 1,2.
18. Konjugat prema nekom od zahteva 14,15 ili 16, gde polimer ima polidisperzitet manji od oko 1,1.
19. Konjugat prema nekom od zahteva 14,15 ili 16, gde polimer ima polidisperzitet manji od oko 1,05.
20. Konjugat prema nekom od zahteva 14,15,16,17,18 ili 19, gde je konjugat prvobitno mono-PEGilovani konjugat.
21. Konjugat iz zahteva 20, gde je konjugat prvobitno mono-PEGilovan na N-terminu hGH.
22. Konjugat prema nekom od zahteva 14 do 21, gde je hGH rekombinovani hGH.
23. Konjugat iz zahteva 22, gde je rekombinovani hGH proizveden u E. coli.
24. Konjugat prema nekom od zahteva 14,15,16,17,18,19,20,21,22 ili 23, gde je konjugat obrazovant reakcijom polimera sa hGH u reakcijonoj mešavini pod smanjenim aminacionim uslovima.
25. Konjugat iz zahteva 24, gde je u reakcijonoj mešavini, početni molarni odnos polimera prema hGH manja od ili jednak oko 5.
26. Konjugat iz zahteva 25, gde je konjugat odvojen od reakcijone mešavine.
27. Konjugat iz zahteva 26, gde je konjugat hromatografski odvojen od reakcijone mešavine.
28. Konjugat iz zahteva 25, gde je hromatografsko odvajanje vršeno jonskom izmenom.
29. Sastav uključuje jedinjenje prema nekom od zahteva 1 do 13, i farmaceutski ekscipijent.
30. Sastav iz zahteva 29, gde je farmaceutski ekscipijent selektovan iz grupe koja sadrži ugljene hidrate, neorganske soli, antimikrobna sredstva, antioksidanse, površinski aktivne supstance, pufere, kiseline i baze.
31. Sastav iz zahteva 29 ili 30, gde je sastav u tečnom obliku.
32. Sastav iz zahteva 29 ili 30, gde je sastav u čvrstom obliku.
33. Sastav iz zahteva 32, gde je čvrsti oblik liofilizovani puder.
34. Sastav prema nekom od zahteva 29,30,31,32 ili 33, u obliku dozne jedinice.
35. Sastav iz zahteva 34, gde je sastav čuvan u posudi dozne jedinice.
36. Sastav iz zahteva 35, gde je posuda špric.
37. Upotreba jedinjenja prema nekom od zahteva 1 do 13, za proizvodnju lekova za lečnje stanja tretirani primenom hGH.
38. Sastav uključuje konjugat prema nekom od zahteva 14 do 28, i farmaceutski ekscipijent.
39. Sastav iz zahteva 38, gde je farmaceutski ekscipijent selektovan iz grupe koja sadrži ugljene hidrate, neorganske soli, antimikrobna sredstva, antioksidanse, površinski aktivne supstance, pufere, kiseline i baze.
40. Sastav iz zahteva 38 ili 39, gde je sastav u tečnom obliku.
41. Sastav iz zahteva 38 ili 39, gde je sastav u čvrstom obliku.
42. Sastav iz zahteva 41, gde je čvrsti oblik liofilizovani puder.
43. Sastav prema nekom od zahteva 38, 39,40,41 ili 42, u obliku dozne jedinice.
44. Sastav iz zahteva 43, gde je sastav čuvan u posudi dozne jedinice.
45. Sastav iz zahteva 44, gde je posuda špric.
46. Upotreba konjugata prema nekom od zahteva 14 do 28, za proizvodnju lekova za lečnje stanja tretirani primenom hGH.
47. Upotreba konjugata prema nekom od zahteva 14 do 28, za lečenje stanja tretirani primenom hGH.
48. Upotreba konjugata prema nekom od zahteva 1 do 13, za lečenje stanja tretirani primenom hGH.
49. Postupak pripreme konjugata prema nekom od zahteva 14 do 28, uključuje korak reakcije hGH sa polimerom u reakcijonoj mešavini pod sniženim aminacionim stanjem; i opcionog odvajanja konjugata od reakcijone mešavine.
50. Postupak iz zahteva 49, gde reakcijona mešavina ima pH između 5 do oko 8.
51. Postupak iz zahteva 49, gde reakcijona mešavina ima pH između 7 do oko 7,5.
YUP-2005/0203A 2002-09-09 2005-03-07 Vodo-rastvorni polimerni alkanali RS20050203A (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40925102P 2002-09-09 2002-09-09
US45658003P 2003-03-19 2003-03-19
PCT/US2003/028221 WO2004022630A2 (en) 2002-09-09 2003-09-09 Water-soluble polymer alkanals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20050203A true RS20050203A (sr) 2007-08-03

Family

ID=31981629

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0202A RS20050202A (sr) 2002-09-09 2003-09-09 Vodo-rastvorni polimerni alkanali
YUP-2005/0203A RS20050203A (sr) 2002-09-09 2005-03-07 Vodo-rastvorni polimerni alkanali

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0202A RS20050202A (sr) 2002-09-09 2003-09-09 Vodo-rastvorni polimerni alkanali

Country Status (22)

Country Link
US (5) US7157546B2 (sr)
EP (1) EP1546235B1 (sr)
JP (2) JP4764630B2 (sr)
KR (2) KR20050093856A (sr)
AP (2) AP2005003249A0 (sr)
AU (1) AU2003270454B2 (sr)
BR (1) BR0314172A (sr)
CA (1) CA2498167C (sr)
EA (1) EA200500475A1 (sr)
EC (1) ECSP055654A (sr)
ES (1) ES2897470T3 (sr)
GE (1) GEP20074193B (sr)
HR (2) HRP20050320A2 (sr)
IS (1) IS7789A (sr)
MA (1) MA27401A1 (sr)
MX (1) MXPA05002620A (sr)
NO (2) NO20051077L (sr)
NZ (2) NZ540490A (sr)
PL (1) PL375883A1 (sr)
RS (2) RS20050202A (sr)
UA (1) UA80838C2 (sr)
WO (1) WO2004022630A2 (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
EE05509B1 (et) 2002-01-18 2012-02-15 Biogen@Idec@Ma@Inc Aktiveeritud polalkleenglkoolpolmeer ja seda sisaldavad kompositsioonid
DE10209822A1 (de) * 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung niedermolekularer Substanzen an ein modifiziertes Polysaccharid
DE10209821A1 (de) 2002-03-06 2003-09-25 Biotechnologie Ges Mittelhesse Kopplung von Proteinen an ein modifiziertes Polysaccharid
NZ540490A (en) 2002-09-09 2007-10-26 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanal conjugates with human growth hormone
BR0314106A (pt) * 2002-09-11 2005-07-19 Fresenius Kabi De Gmbh Polipeptìdeos hasilados, especialmente eritropoietina hasilada
NZ541122A (en) * 2002-12-26 2008-09-26 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
EA008866B1 (ru) * 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
WO2004075923A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor viii moiety conjugates
US7947261B2 (en) 2003-05-23 2011-05-24 Nektar Therapeutics Conjugates formed from polymer derivatives having particular atom arrangements
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
WO2005014655A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein
US20080274948A1 (en) * 2003-08-08 2008-11-06 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugates of Hydroxyalkyl Starch and G-Csf
TWI417303B (zh) 2004-03-11 2013-12-01 Fresenius Kabi De Gmbh 經由還原胺化作用製得之羥烷基澱粉及蛋白質的接合物
ES2390885T3 (es) * 2004-03-11 2012-11-19 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína
JP4805911B2 (ja) * 2004-03-15 2011-11-02 ネクター セラピューティクス Ｈｉｖ侵入阻害剤のポリマー系組成物及び複合体
JP2007530569A (ja) * 2004-03-23 2007-11-01 アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾タンパク質組成物及び方法
CA2573262C (en) * 2004-07-16 2015-02-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of a gm-csf moiety and a polymer
JP2008511610A (ja) * 2004-08-31 2008-04-17 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー グリセロール分岐のポリエチレングリコール−ヒト成長ホルモン結合体、それらの製造方法及び使用方法
CA2584510C (en) * 2004-10-25 2013-05-28 Intezyne Technologies, Incorporated Heterobifunctional poly(ethylene glycol) and uses thereof
AU2006222187A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
WO2007010552A2 (en) * 2005-03-17 2007-01-25 Serum Institute Of India Limited N- terminal peg conjugate of erythropoietin
WO2006102659A2 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation CONJUGATES OF AN hGH MOIETY AND A POLYMER
EP1762250A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-14 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Conjugates of hydroxyalkyl starch and an active substance, prepared by chemical ligation via thiazolidine
JP5096363B2 (ja) 2005-12-16 2012-12-12 ネクター セラピューティックス Ｇｌｐ−１のポリマ複合体
EP1834963A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-19 Siegfried Ltd. Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation
US7560588B2 (en) * 2006-04-27 2009-07-14 Intezyne Technologies, Inc. Poly(ethylene glycol) containing chemically disparate endgroups
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
EP2070950A1 (en) 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Hydroxyalkyl starch derivatives and process for their preparation
EP2070951A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-17 Fresenius Kabi Deutschland GmbH Method for producing a hydroxyalkyl starch derivatives with two linkers
JP5704925B2 (ja) 2008-02-08 2015-04-22 ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション オリゴマー−カンナビノイドコンジュゲート
KR100967833B1 (ko) * 2008-05-20 2010-07-05 아이디비켐(주) 고순도의 폴리에틸렌글리콜 알데하이드 유도체의 제조방법
MY156568A (en) 2008-07-31 2016-03-15 Pharmaessentia Corp Peptide-polymer conjugates
US8492503B2 (en) 2008-09-11 2013-07-23 Nektar Therapeutics Polymeric alpha-hydroxy aldehyde and ketone reagents and conjugation method
WO2010033220A2 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Modified therapeutics peptides, methods of their preparation and use
EP2341942A1 (en) 2008-09-19 2011-07-13 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
GB0823309D0 (en) * 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
AU2010273570B2 (en) * 2009-07-14 2014-07-03 Novartis Ag Mesenchymal stem cell differentiation
CA2798518A1 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Cebix, Inc. Pegylated c-peptide
RU2447083C1 (ru) * 2010-07-20 2012-04-10 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NαH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ
WO2012054822A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Nektar Therapeutics Pharmacologically active polymer-glp-1 conjugates
ES2866674T3 (es) * 2010-11-12 2021-10-19 Nektar Therapeutics Conjugados de una fracción de IL-2 y un polímero
US8765113B2 (en) 2011-06-27 2014-07-01 Greatbatch Ltd. Peptide based antimicrobial coating
EP2592103A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-15 Adriacell S.p.A. Polymer aldehyde derivatives
JP5999659B2 (ja) * 2011-12-14 2016-09-28 国立大学法人 筑波大学 新規分岐ポリエチレングリコール及びその用途
JO3564B1 (ar) 2013-03-08 2020-07-05 Novartis Ag ببتيدات وتركيبات لعلاج ضرر المفاصل
US9301971B2 (en) 2013-03-08 2016-04-05 Novartis Ag Peptides and compositions for treatment of joint damage
JP6106103B2 (ja) * 2014-01-16 2017-03-29 信越化学工業株式会社 末端にアミノ基を有する狭分散ポリアルキレングリコール誘導体の製造方法、並びにこれに用いる新規なアセタール基含有アルコール化合物及びそのアルカリ金属塩
JP6106104B2 (ja) 2014-01-16 2017-03-29 信越化学工業株式会社 末端にアミノ基を有する狭分散ポリアルキレングリコール誘導体の製造方法
GB201419108D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Glythera Ltd Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
US11559567B2 (en) 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon
AU2016335860B2 (en) 2015-10-08 2023-08-10 Nektar Therapeutics Combination of an IL-2Rbeta-selective agonist and a long-acting IL-15 agonist
AR116566A1 (es) 2018-10-03 2021-05-19 Novartis Ag Administración sostenida de polipéptidos similares a la angiopoyetina 3

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
JPS5695142A (en) * 1979-12-28 1981-08-01 T Hasegawa Co Ltd Preparation of aliphatic aldehyde
US5037969A (en) * 1986-07-03 1991-08-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Glycosyl derivatives and use thereof
JPS63152393A (ja) * 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5510418A (en) 1988-11-21 1996-04-23 Collagen Corporation Glycosaminoglycan-synthetic polymer conjugates
JPH04502011A (ja) 1988-11-23 1992-04-09 ジェネンテク，インコーポレイテッド ポリペプチド誘導体
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
JPH06233816A (ja) 1993-02-12 1994-08-23 Toyobo Co Ltd 血液浄化吸着材
US5840900A (en) 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5627662A (en) * 1994-04-28 1997-05-06 Xerox Corporation Digital imaging system using two-dimensional input sensor array and output light valve
FR2724459B1 (fr) 1994-09-14 1997-05-09 Univ Compiegne Tech Electrophorese capillaire d'affinite, matrice d'affinite pour la mise en oeuvre de cette electrophorese et son procede de fabrication
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5736543A (en) * 1996-04-03 1998-04-07 The Regents Of The University Of California Benzoxazines for enhancing synaptic response
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
JPH11322916A (ja) 1998-05-11 1999-11-26 Kazunori Kataoka ビオチン残基を片末端に有するヘテロテレケリツクポリマー
US6420555B1 (en) * 1998-06-16 2002-07-16 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques, S.A.S. Imidazolyl derivatives
US6465694B1 (en) 1998-10-26 2002-10-15 University Of Utah Research Foundation Method for preparation of polyethylene glycol aldehyde derivatives
WO2000032772A2 (en) 1998-11-30 2000-06-08 Eli Lilly And Company Erythropoietic compounds
JP2000303090A (ja) * 1999-04-20 2000-10-31 T Hasegawa Co Ltd 香料組成物
AU781839B2 (en) 1999-12-22 2005-06-16 Nektar Therapeutics Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
AU2002352524B2 (en) 2001-11-07 2007-10-04 Nektar Therapeutics Branched polymers and their conjugates
AP2004003050A0 (en) 2001-11-20 2004-06-30 Pharmacia Corp Chemically modified human growth hormone conjugates
US20030171285A1 (en) 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
US6956135B2 (en) 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
AU2002357806A1 (en) * 2001-12-11 2003-06-23 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes
EE05509B1 (et) 2002-01-18 2012-02-15 Biogen@Idec@Ma@Inc Aktiveeritud polalkleenglkoolpolmeer ja seda sisaldavad kompositsioonid
WO2003091987A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-06 Idemitsu Kosan Co., Ltd. Sound absorbing body, sound absorbing structural body, and method of manufacturing these bodies
DK1539857T3 (da) * 2002-07-24 2007-03-12 Hoffmann La Roche Polyethylenglycol-aldehydderivater
NZ540490A (en) * 2002-09-09 2007-10-26 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanal conjugates with human growth hormone
TWI281864B (en) 2002-11-20 2007-06-01 Pharmacia Corp N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation
US20040142870A1 (en) 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US6961962B1 (en) * 2004-09-09 2005-11-08 Morning Pride Manufacturing, L.L.C. Combined closure and liner zippers employing common zipper tapes and protective garment employing said combined zippers
JP5084245B2 (ja) 2006-06-07 2012-11-28 関西ペイント株式会社 澱粉系塗料組成物

Also Published As

Publication number Publication date
AP2005003249A0 (en) 2005-03-31
US20090234070A1 (en) 2009-09-17
JP2005538224A (ja) 2005-12-15
NZ538624A (en) 2007-01-26
EP1546235B1 (en) 2021-10-20
HRP20050320A2 (en) 2006-12-31
ES2897470T3 (es) 2022-03-01
HRP20050319A2 (en) 2006-12-31
GEP20074193B (en) 2007-09-10
NO20051077L (no) 2005-04-08
EP1546235A2 (en) 2005-06-29
US20110034737A1 (en) 2011-02-10
US8853325B2 (en) 2014-10-07
US20040116649A1 (en) 2004-06-17
AU2003270454A1 (en) 2004-03-29
US20120065429A1 (en) 2012-03-15
US8076412B2 (en) 2011-12-13
US7511094B2 (en) 2009-03-31
MXPA05002620A (es) 2005-05-05
WO2004022630A3 (en) 2004-04-15
AU2003270454B2 (en) 2010-05-20
PL375883A1 (en) 2005-12-12
ECSP055654A (es) 2005-05-30
KR20050093856A (ko) 2005-09-23
KR100974843B1 (ko) 2010-08-11
WO2004022630A2 (en) 2004-03-18
US20060194940A1 (en) 2006-08-31
MA27401A1 (fr) 2005-06-01
IS7789A (is) 2005-04-08
EA200500475A1 (ru) 2005-10-27
US7157546B2 (en) 2007-01-02
BR0314172A (pt) 2005-07-26
UA80838C2 (en) 2007-11-12
US7838595B2 (en) 2010-11-23
AP2005003246A0 (en) 2005-03-31
JP2005350470A (ja) 2005-12-22
JP4764630B2 (ja) 2011-09-07
KR20050057281A (ko) 2005-06-16
CA2498167A1 (en) 2004-03-18
NO20051078L (no) 2005-04-08
RS20050202A (sr) 2007-08-03
NZ540490A (en) 2007-10-26
CA2498167C (en) 2012-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7838595B2 (en) Water-soluble polymer alkanals
US8182801B2 (en) Method for preparing water-soluble polymer derivatives bearing a terminal carboxylic acid
US9308274B2 (en) Stabilized polymeric thiol reagents
EP1581260A2 (en) Polymeric reagents comprising a ketone or a related functional group
EP1591467A1 (en) Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
CN1329427C (zh) 水溶性聚合物链烷醛
HK1079229A (en) Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
AU2005202019A1 (en) Water-soluble polymer alkanals