RS20050263A - Polimerni konjugati smanjene antigenosti, postupci za njihovo dobijanje i korišćenje - Google Patents

Polimerni konjugati smanjene antigenosti, postupci za njihovo dobijanje i korišćenje

Info

Publication number
RS20050263A
RS20050263A YUP-2005/0263A YUP20050263A RS20050263A RS 20050263 A RS20050263 A RS 20050263A YU P20050263 A YUP20050263 A YU P20050263A RS 20050263 A RS20050263 A RS 20050263A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
conjugate
group
polyalkylene glycol
kda
peg
Prior art date
Application number
YUP-2005/0263A
Other languages
English (en)
Inventor
Alexa Martinez
Merry Sherman
Mark Saifer
David Williams
Original Assignee
Mountain View Pharmaceuticals Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mountain View Pharmaceuticals Inc., filed Critical Mountain View Pharmaceuticals Inc.,
Publication of RS20050263A publication Critical patent/RS20050263A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

Obezbeđeni supostupci za dobijanje konjugata, raznih biološki aktivnih komponenata, posebno proteina sa polimerima rastvorljivim u vodi, (npr., sa poli(etilen glikolom) i njegovim derivatima), pri čemu konjugati poseduju smanjenu antigenost i imunogenost u poređenju sa sličnim konjugatima, dobijenim korišćenjem poli(etile glikola), koji sadrži metoksil ili drugu alkoksil grupu. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje konjugate koji su dobijeni ovim postupcima, preparate koji sadrže takve konjugate, komplete koji sadrže takve konjugate ili preparate i postupke za upotrebu preparta ili konjugata u dijagnostičkim i terapijskim protokolima.

Description

POLIMERNIKONJUGATI SMANJENE ANTIGENOSTI, POSTUPCI ZA
NJIHOVO DOBIJANJE I KORIŠĆENJE
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak spada u oblast biohemije proteina, kao i farmacije i medicinskih nauka. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za dobijanje konjugata polimera rastvorljivih u vodi, (npr., poli(etilen glikola) i njigovih derivata) i biološki aktivnih komponenti, pri čemu ti konjugati poseduju smanjenu imunogenost i antigenost u poređenju sa standardnim konjugatima polimera i biološki aktivnih komponenti. Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje konjugate koji se dobijaju ovim postupcima, preparate koji sadrže takve konjugate, komplete koji sadrže takve konjugate ili preparate i postupke za upotrebu preparata u sprečavanju, dijagnostikovanju i lečenju brojnih medicinskih i veterinarskih stanja.
Stanje tehnike
Dva glavna faktora su ometala razvoj rekombinantnih proteina kao terapijskih sredstava - njihovi kratki poluživoti u cirkulaciji i njihov potencijal za antigenost i imunogenost. Kao što se ovde i generalno u struci koristi, pojam, "antigenost" označava sposobnost molekula da se veže za prethodno postojeća antitela, pojam "imunogenost" označava sposobnost izazivanja imunog odgovora in vivo, bilo da taj odgovor uključuje stvaranje antitela ("humoralni odgovor") ili stimulaciju ćelijskih imunih odgovora. Prilikom primene rekombinantnih terapeutskuih proteina, često je poželjna intravenska
(i.v.) primena u cilju postizanja najvećih aktivnosti u cirkulaciji i minimalizovanja, problema biološke raspoloživosti i razgradnje. Međutim, poluživoti malih proteina, nakon i.v. primene su obično ekstremno kratki (videti primere u Mordenti, J., et al., 1991, Pharm. Res. 8: 1351 - 1359; Kuvvabara, T.. et al., 1995, Pharm. Res. 12: 1466-1469). Zdravi bubrezi generalno zadržavaju u krvotoku proteine sa hidrodinamskim radijusima. koji su veći od istih kod serumskog albumina. koji poseduje Stokes-ov radijus od oko 36 A i molekulsku masu oko 66 000 Da (66 kDa). Međutim, manji proteini kao što su faktor stimulacije kolonija granulocita ("G - CSF") i ribonukleaza, brzo se izbacuju iz krvotoka, pomoću glomerularne filtracije (Brener, B.M., et al, 1978. Am. J. Phvsiol. 234: F455 - F460; Venkatachalam, M.A., et al., 1978, Circ. Res. 43:337 - 347; Wilson, G., 1979., J. Gen. Phvsiol. 74: 495 - 509). Kao rezultat ovoga, održavanje terapijski korisnih koncentracija malih proteina u cirkulaciji je problematično nakon i.v. primene. Stoga, moraju se primeniti, veće koncentracije takvih proteina, kao i veća učestalost injektiranja. Velika brzina davanja doze povećava troškove terapije, smanjuje verovatnoću saradnje pacijenta i povećava rizik neželjenih efekata, npr., imunih reakcija. Ćelijski i humoralni imuni odgovori mogu da smanje cirkulišuće koncentracije injektovanih rekombinantnih proteina, do te mere da onemoguće primenu efikasne doze ili da dovedu do događaja koji ograničavaju tretman, kao što je anafilaksa (Pui, C. H., et al., 2001, J. Clin. Oncol. 19: 697 - 704).
Alternativnim načinima primene kao što su subkutane (s.c.) ili intramuskularne (i.m.) injekcije, mogu da se prevaziđu neki od ovih problema tako što se obezbeđuje postepenije otpuštanje rekombinantnih proteina u cirkulaciji. Međutim, biološka raspoloživost može biti veoma mala, što otežava postizanje efikasnih koncentracija takvih lekova u cirkulaciji. Dalji problem koji može biti povezan sa lošom biološkom raspoloživošću lekova primenjenih s.c. ili i.m. jeste povećana verovatnoća razgradnje terapeutskog proteina na mestu injektiranja.
Kao način prevazilaženja gore navedenih nedostataka opširno je ispitivana modifikacija rekombinantnih proteina, kovalentnim povezivanjem derivata, poli(etilen glikola), ("PEG") (revijski prikazano u Sherman, M. R. Et al., 1997, u Poly(ethylen glvcol): Chemsstrv and Biological Applications, Harris, J. M., et al., urednici, American Chemical Societv, Washington, D.C., str. 155 - 169; Roberts, M.J., et al., 2002, Adv. Drug. Deliv. Res. 54: 459 - 476). Pokazano je da povezivanje PEG derivata za proteine stabilizuje proteine, povećava njihovu biološku raspoloživost i/ili smanjuje njihovu imunogenost in vivo. (Kovalentno povezivanje PEG derivata za protein ili drugi supstrat se ovde, kao i u struci označava kao "pegilacija"). Dodatno, pegilacija može da poveća hidrodinamski radijus proteina u značajnoj meri. Kada se mali protein kao što je citokin ili polipeptidni hormon, poveže za jedan dugački lanac PEG (npr., koji poseduje molekulsku masu od najmanje 18 kDa), dobijeni konjugat poseduje veći hidrodinamski radijus od istog kod serumskog albumina, a njegov klirens, putem renalnih glomerula je dramatično smanjen. Kombinovani efekti pegilacije - smanjenje proteolize, smanjeno imunološko prepoznavanje i smanjena brzina renalnog klirensa - obezbeđuju značajne prednosti pegiliranih proteina kao terapijksih sredstava.
Još od 1970 - tih godina, pravljeni su pokušaji za upotrebom kovalentnog vezivanja polimera u cilju poboljšavanja sigurnosti i efikasnosti različitih proteina za farmaceutsku upotrebu (videti npr., U. S. Patent broj 4,179,337). Neki primeri obuhvataju vezivanje PEG ili poli(etilen oksida) (PEO) za adenozin deaminazu (EC 3.5.4.4) radi upotrebe u tretmanu ozbiljne kombinovane imunodeficijentne bolesti (Daviš, S., et al., 1981, Clin. Exp. Immunol. 46: 649 - 652; Hershfield, M.S., et al., 1987, N. Engl. J. Med. 316: 589 - 596). Drugi primeri obuhvataju vezivanje PEG za superoksid dismutazu (EC 1.15.1.1) radi tretmana inflamatornih stanja (Saifer, M., et al., U.S. patenti br. 5,006,333 i 5,080,891) i za urat oksidazu (EC 1.7.3.3) radi eliminacije viška mokraćne kiseline iz krvi i urina (Inada, Y., japanska patentna prijava 55 - 099189; Kelly, S.J. et al., 2001, J. Am. Soc. Nephrol. 12: 1001 - 1009; Williams, L.D., et al, PCT publikacija WO 00/07629 A3, koja je u vezi sa U.S. patentom 6,576,235; Sherman, M.R., et al., PCT publikacija WO 01/59078 A2).
PEO-ovi i PEG-ovi su polimeri koji su sastavljeni od kovalentno povezanih etilen oksid jedinica. Ovi polimeri imaju sledeću opštu strukturalnu formulu:
R1-(OCH2CH2),1-R2
pri čemu R2može biti hidroksilna grupa ili njen reaktivni derivat, aR\može biti vodonih kao u "PEG diolu", metil grupi kao u monometoksi PEG ("mPEG") ili u drugoj nižoj alkil grupi, npr., kao u izo - propoksiPEG ili t - butoksiPEG. Parametar n u opštoj strukturnoj formuli PEG predstavlja broj etilen oksid jedinica u polimeru i ovde i u struci
se označava kao "stepen polimerizacije". PEG-ovi i PEO-ovi mogu biti linearni, razgranati (Fuke, I., et al., 1994., J. Control Release 30: 27 - 34) ili u obliku zvezde (Merrill, E.W. 1993, J. Biometer. Sci. Polym. ED. 5: 1-11). PEG-ovi i PEO-ovi si antifatični, tj., rastvaraju se i u vodi i u nekim organskim rastvaračima i mogu da adheriraju za materijale koji sadrže lipide. uključujući omotače virusa i membrane životinjskih i bakterijskih ćelija. Određeni nasumični ili blok ili alternirajući kopolimerietilen oksida (OCH2CH2) i propilen oksida, koji imaju sledeću strukturnu formulu:
poseduju svojstva koja su dovoljno slična svojstvima PEG, tako da se smatra da ovi kopolimeri mogu biti odgovarajuće zamene za PEG u određenim primenama (videti, npr., U.S. patente br. 4,609,546 i 5,283,317). Pojam "polialkilen oksidi" i skraćenica "PAO"-ovi se ovde koristi da označi takve kopolimere, kao i PEG i PEO i poli(oksietilen - oksimetilen), kopolimer (U.S. patent broj 5,476,653). Kao što se ovde koristi pojam, "polialkilen glikoli" i skraćenica "PAG"-ovi se ovde koristi da generički označi polimere koji su pogodni za upotrebu prema predmetnom pronalasku, posebno na PEG-ove, veoma posebno na PEG-ove koji sadrže jednu reaktivnu grupu ("monofunkcionalno aktivirani PEG-ovi").
Uobičajeno, nekoliko (npr., 5 do 10) lanaca jednog ili više PAG-ova, npr., jedan ili više mPEG-ova sa molekulskom masom od oko 5 kDa do oko 10 kDa, povezuje se sa ciljnim proteinom putem primarnih amino grupa (epsilon aminogrupe lizinskih ostataka i a aminogrupe N - terminalne aminokiseline). U skorije vreme, sintetišu se konjugati koji sadrže jedan lanac mPEG, velike molekulske mase, npr., 12 kDa, 20 kDa ili 30 kDa. Pokazana je direktna korelacija između poluživota konjugata u plazmii povećanja molekulske mase i/ili povećanja broja lanaca povezanih sa PEG (Clark, R., et al., 1996., J. Biol. Chem. 271: 21969 - 21977). Sa druge strane kako se broj lanaca PEG povećava, tako se povećava i verovatnoća da amino grupa na regionu biološki aktivne komponente koji je od ključnog značaja , (posebno ako je biološki aktivna komponenta protein) bude modifikovana, što vodi oštećenju njene biološke funkcije (npr., kataliza putem enzima ili vezivanje za receptor nekog citokina). Za veće proteine kojisadrže mnogo amino grupa kao i za enzime sa supstratima malih molekulskih masa, ovo podešavanje između povećanja trajanja dejstva i smanjenja specifične aktivnosti može biti prihvatljiva jer se tako proizvodi ukupni povećanje biološke aktivnosti konjugata koji sadrže PEG in vivo. Za manje proteine, kao što su polipeptidni hormoni i citokini, relativno visok stepen supestitucije verovatno umanjuje funkcionalnu aktivnost do tačke pri kojoj se poništava prednost produžavanja poluživota u krvotoku (Clark, R., et al., gore navedeno).
Neki od predlagača predmetnog pronalaska su prvi otkrili mnoštvo strategija za pegilaciju i primenili su ih na nekoliko proteina u cilju postizanja željene kombinacije, poželjne farmakokinetike i povećanja biološke aktivnosti in vivo. U ove proteine spadaju faktor stimulacije kolonija granulocita - makrofaga ("GM - CSF") (Saifer, M.G.P., et al., 1997, Polym. Preprints 38: 576 - 577; Sherman, M.R. et al, 1997, gore navedeno) i rekombinantna sisarska urikaza (videti, PCT publikaciju WO 00/07629 i WO 01/59078; Kelly, S.J., et al, gore navedeno; U. S. Patent broj 6,576,235). Korišćenjem GM - CSF kao modela za citokin, neki od predlagača predmetnog pronalaska su pokazali da je vezivanje jednog ili dva lanca mPEG visoke molekulske mase (oko 36 kDa) dovoljno da se dramatično poveća biološka aktivnost rekombinantnog mišijeg GM - CSF in vivo (Saifer, M.G.P., et al., 1997, gore navedeno, Sherman, M.R., et al., 1997, gore navedeno).
Takođe, izvedena su ispitivanja u kojima je rekombinantna sisarska urat oksidaza (urikaza) modifikovana i ispitana kao mogi tretman za izraženi giht (videti, PCT publikaciju WO 00/07629, koja je u vezi sa U. S. patentom broj 6,576,235 i WO 01/59078, čiji su opisi ovde inkorporirani u potpunosti, prema referenci). Kada se PEG - urikaza koristi za lečenje miševa koji su deficijentni za urikazu( onx-/-) koji imaju izaraženu nefropatiju indukovanu mokraćnom kiselinom, otkriveno je da se ona dobro toleriše, daje efikasna i praktično neimunogena. Tretirani miševi su pokazali poboljšanje bubrežne funkcije u toku trajanja tretmana (10 nedelja) i imali su značajno manje oštećenja bubrega povezanih sa mokraćnom kiselinom od ne tretiranihonx - I-miševa, što je pokazano mikroskopskim snimanjem magnetnom rezonancom (Kelly, S.j., et al., 2001, gore navedeno).
Kovalento povezivanje niti PAG za molekul polipeptida je opisano u U. S. patentu 4,179,337 čiji je podnosilac Daviš, F.F., et al., kao i Abuchovvski, A., et al., 1981, u knjizi: Enzvmes as Drugs, Holcenberg, J.S.. et al., urednici, John Wiley and Sons, New York, str., 367 - 383. U ovim referencama se opisuje da enzimi i drugi proteini koji su modifikovani sa mPEG - ovima poseduju smnjenu imunogenost i antigenost i da imaju duže vreme poluživota u krvotoku u poređenju sa odgovarajućim ne modifikovanim proteinima. Dobijena poželjna svojstva ne modifikovanih konjugata su korisna u raznim terapijskim primenama.
Da bi se pospešilo kovalentno vezivanje PEG ili polialkilen oksida za protein, najmanje jedna terminalna hidroksilna grupa polimera mora prvo da se prevede u reaktivnu funkcionalnu grupu. Ovaj proces se često označava kao "aktivacija" a proizvod se naziva "aktivirani PEG" ili aktivirani polialkilen oksid. Monometoksi PEG koji se blokira na jednom kraju sa nereaktivnim hemijski stabilnim metil etrom ("metoksil grupa") a na drugom kraju sa funkcionalnom grupom koja je reaktivna prema aminogrupama na molekulu proteina, najčešće se koristi u takvim pristupima. Rede se koriste takozvani "razgranati" mPEG-ovi, koji sadrže 2 ili više metoksil grupa na distalnom položaju od aktivirane funkcionalne grupe. Primer, toga je di - mPEG - lizin, u kome je karboksilna grupa lizina najčešće aktivirana esterifikacijom sa N - hidroksisukcinimidom (Harris, J. M., et al., U.S. patent broj 5,932,462).
Aktivirani polimeri reaguju sa terapijskim sredstvom koje poseduje nukleofilne funkcionalne grupe koje služe kao mesta vezivanja. Jedna nukleofilna funkcionalna grupa koja se uobičajeno koristi kao mesto vezivanja jeste epsilon aminogrupa lizinskih ostataka. Kao mesta vezivanja se takođe koriste slobodne karboksilne grupe, pogodno aktivirane karbonilne grupe,oksidirane ugljeno hidratne grupe i tiol grupe.
Hidroksil grupa mPEG je aktivirana cijanourat hloridom a dobij eno jedinjenje se zatim vezuje sa proteinom (Abuchovvski, A., et al., 1977., J. Biol. Chem. 252: 3582 - 3586; Abuchowski, A., et al., 1981, gore navedeno). Međutim, ovaj postupak poseduje nedostatke, kao što su toksičnost cijanourat hlorida i njegova ne specifična reaktivnost prema proteinima koji poseduju funkcionalne grupe koje se razlikuju od aminskih grupa, kao što su cistein, koji je dostupan rastvaraču ili tirozinski ostaci koji mogu biti od ključne važnosti za funkciju.
Kako bi se prevazišli ovi i drugi nedostaci uvedena je upotreba alternativno aktiviranih PEG - ova, npr., sukcinimidil sukcinatnih derivata mPEG ("SS - PEG")
(Abuchowski, A., et al.. 1984., Cancer Biochem. Biophvs. 7: 175 - 186). U blagim uslovima SS - PEG brzo reaguje sa proteinima (za 30 minuta), pri čemu se dobijaju aktivni i značajno modifikovani konjugati. M.Saifer,et al., u U. S. patentu broj 5,468,478, opisuje polialkilen gliko-mono-N-sukcinimidil karbonate i konjugate koji su od njih dobijeni. S. Zalipskv u U.S. patentu broj 5,612.460, opisuje postupke za dobijanje poli(etilen glikol) - N - sukcinimidil karbonata. Ovaj oblik polimera, ("SC - PEG") lako reaguje sa aminogrupama proteina kao i peptida male molekulske mase, ako i sa drugim amterijalima koji sadrže slobodne aminogrupe, sa kojima stvara uretanske veze.
Za uretanske ili karbamatne veze između amino grupa proteina i PEG u struci se takođe zna da mogu biti proizvedene upotrebom drugih PEG - karbonatnih derivata (Beauchamp, C, et al., 1983, Anal. Biochem. 1331: 25 - 33; Veronese, F. M, et al., 1985, Appl. Biochem. Biotechnol. 11: 141 - 152). U struci su takođe poznati reaktivni mPEG intermedijeri i postupci za njihovu upotrebu pri sintezi PEG konjugata, biološki aktivnih komponenti povezanih putem amidnih veza, estarskih veza, sekundarnih aminskih i tioestarskih veza, između ostalih.
T. Suzuki et al.,(1984., Biochim. Biophvs. Acta 788: 248 - 255) je kovalentno povezao imunoglobulin G ("IgG") za mPEG koji je prethodno aktiviran cijanurat hloridom. Ispitivana su biološka i fiziko - hemijska svojstva, kao što su aktivnost vezivanja antigena i molekulska struktura, ponašanje pri hromatograflji sa ekskluzijom po veličini, površinska aktivnost, sposobnost agregacije pri kontaktu faza i sposobnost agregacije pri zagrevanju, kojima se indukuje ne specifična aktivacija komplementa, putem PEG - IgG konjugata. Povezivanje PEG za IgG povećava Stokes - ov radijus i površinsku aktivnost IgG i stabilizuje IgG pri zagrevanju i/ili prilikom izlaganja spoljnim površinama, pri čemu nije primećena strukturna denaturacija IgG. Supresija ne specifične sposobnosti agregacije se uglavnom pripisuje steričnoj inhibiciji grupisanja između pegiliranih IgG molekula. Ovi rezultati pokazuju korisnost IgG povezanog sa mPEG, kao intravenskog preparata i takođe sugerišu korisnost PEG kao aditiva za dtabilizaciju ne modifikovanog IgG za intravensku primenu.
K.A.Sharp et al.,(1986., Anal. Biochem. 154: 110 - 117) su ispitivali mogućnost proizvodnje biološki specifičnih afinitetnih liganada za razdvajanje ćelija u vodenim dvofaznim polimernim sistemima na bazi antigena sa površine ćelija. Zečiji anti-humani eritrocitni IgG reaguje sa mPEG - ovima koji su aktivirani cijanurat hloridom molekulskih masa od oko 0,2. 1.9 i 5 kDa pri različitim molarnim odnosima PEG prema lizinskim grupama proteina. Koeficijent podele proteina u dvofaznom sistemu koji sadrži dekstran i PEG se povećava sa povećanjem stepena modifikacije i povećanjem molekulske mase mPEG. Primećen je prateći gubitak sposobnosti aglutinacije humanih eritrocita.
R. H. Tullis,u U. S. patentu broj 4,904.582, opisuje oligonukleotidne konjugate u kojima su iligonukleotidi povezani preko veznika sa hidrofobnom grupom koja može biti polioksialkilen grupa. Dobijeni konjugati su efikasniji u membranskom transportu, tj., sposobni su za prolazak ktoz membranu i efikasno modulišu sistem za transkripciju. Na ovaj način, preparati mogu da se koriste in vitro i in vivo za ispitivanje ćelijskih procesa, za zaštitu sisara od patogena,za pospešivanje genske terapije i slično.
Preterana konjugacije polimera i/ili konjugacija koja zauzima aktivno mesto terapeutske podjedinice, na kojoj se nalaze grupe koje su udružene sa biološkom aktivnošću, međutim, često može da dovede do gubitka aktivnosti i tako do gubitka terapijske efikasnosti. Ovo je često slučaj sa peptidima male molekulske mase koji poseduju nekoliko mesta za vezivanje koja nisu udružena sa biološkom kativnošću. Na primer, I. Benhar et al., (1994., Bioconjug. Chem. 5: 321 - 326) je primetio da pegilacija rekombinantnog jednolančanog imunotoksina dovodi do gubitka specifične ciljne imunoreaktivnosti imunotoksina. Gubitak aktivnosti imunotoksina je rezultat vezivanja PEG za dva lizinska ostatka u okviru regiona koji se vezuje za antigen imunotoksina, u okviru kombinujućeg regiona antigena imunotoksina.
Iako je cilj da kovalentno vezivanje PEG - ova i PAO - ova (npr., PEG - ova, PEO
- ova i drugih) za terapijske proteine eliminiše njihovu imunoreaktivnost, pegilirani proteini zadržavaju slabu imunogenost. Ova imunogenost izgleda da nastaje usled, barem delimično, činjenice da PEG i PAO polimeri sami po sebi poseduju antigena i imunogena svojstva. Na primer, zečevi su imunizovani na različite PEG - ove injektiranjem u životinje konjugata u kojima je PEG povezan sa imunogenim proteinom nosiocem (Richter, A. W., et al., 1983, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 70: 124- 131). Dodatno, razvijeno je monoklonsko natitelo koje reaguje sa polietarskom osovinom PEG tako što
je miševima injektiran mPEG konjugat (3 - glukuronidaze i tako što je izabran hibridonski klon koji sekretuje anti - PEG antitelo (Cheng. T. -L., et al., 1999., Bioconjug. Chem, 10: 520 - 528; Cheng, T. -L.. et al, 2000. Bioconjug. Chem. 11: 258 - 266; Tsai, N. -M. et al.. 2001., Biotechniques 30: 396 - 402: Roffler, S., et al.. U. S. patent broj 6,596,849 i 6,617.118; čiji su opisi ovde inkorporirani u celosti prema referenci). Drugo monoklonsko antitelo koje reaguje sa polietarskom osovinom PEG je u skorije vreme opisano u Roberts, M.J., et al., u U. S. patentnoj prijavi broj 2003/001704 Al.
Brojni istraživači su opisali dobijanje linearnih ili razgranatih "neantigenih" PEG polimera i njihovih derivata ili konjugata (videti, npr., U. S. patente br. 5,428,128; 5,621,039; 5,622,986; 5,643,575; 5,728,560; 5,730,990; 5,738,846; 5,811,076; 5,824,701; 5,840,900; 5,880,131; 5,900,402; 5,902,588; 5,919,455; 5,951,974; 5,965,119; 5,965,566; 5,949,040; 5,981,709; 6,011,042; 6,042822; 6,113,906; 6,127,355; v6,132,713; 6,177,087 i 6.180.095; videti takođe PCT publikaciju WO 95/13090 i objavljenu U. S. patentne prijave br. 2002/0052443, 2002/0061307 i 2002/0098192). Većina primera u napred navedenim patentima i patentnim prijavama koristi polimere koji sadrže jednu ili više niti mPEG, npr., di - mPEG - lizin. Međutim, sve do danas nije opisan mehanizam kojim bi se PEG u takvim polimerima i konj ugarima uči nio ne antigen.
Stoga, postoji potreba za identifikacijom postupaka za proizvodnju konjugata koji sadrže PAO, npr., koji sadrže PEG i/ili PEO, posebno konjugata između takvih polimera rastvorljivih u vodi i terapeutskih proteina sa smanjenom, zančajno smanjenom ili sa nedetektabilnom antigenošću. Takvi konjugati bi imali prednost koju omogućava polimerna komponenta u smislu povećanja stabilnosti i biološke raspoloživosti in vivo, ali ne bi mogli da izazovu značajniji imuni odgovor u životinjskom organizmu u koji se takvi konjugati uvode u terapeutske ili dijagnostičke svrhe.
Suština predmetnog pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na gore identifikovane potrebe i obezbeđuje postupke za dobijanje konjugata polimera rastvorljivih u vodi, (npr., poli(etilen glikola) i njegovih derivata) i biološki aktivnih komponenti posebno terapeutski biološki aktivnih komponenti kao što su proteini. Predmetni pronalazak takođe, obezbeđuje, polimere i konjugate koji se dobijajuovim postupcima, pričemu ti polimeri i konjugati poseduju smanjenu antigenost i imunogenost. u poređenju sa polimerima koji sadrže alkoksil grupe i konjugatima iste biološki aktivne komponente koji se dobijaju sa alkoksi PEG - ovima, npr.. sa mPEG. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje preparate koji sadrže takve konjugate, komplete koji sadrže takve konjugate i preparate i postupke za upotrebu tih preparata i konjugata u raznim terapeutskim ili dijagnostičkim režimima.
U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat koji se sastoji od jedne ili od više biološki aktivnih komponenti koje su kovalentno povezane sa najmanje jednim linearnim ili razgranatim monofunkcionalno aktiviranim polialkilen glikolom, pri čemu monofunkcionalni aktivirani polialkilen glikol ne sadrži metoksil grupu, neku drugu alkoksi grupu ili ariloksil grupu na nekom od svojih terminala. U nekim određenim takvim rešenjima konjugati poseduju smanjenu ili značajno smanjenu antigenost u poređenju sa konjugatom dobijenim korišćenjem alkoksipoli(etilen glikola), npr., mPEG ili sa razgranatim polimerom koji sadrži mPEG kao stoje di - mPEG - lizin.
Polialkilen glikoli koji su posebno pogodni za upotrebu u sintezi konjugata prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bez ograničenja, poli(etilen glikole) i kopolimere etilen oksida i propilen oksida; posebno su poželjni PEG - ovi a izrazito su poželjni monofunkcionalno aktivirani PEG - ovi (npr., PEG - ovi koji su aktivirani samo na jednom terminalu, uključujući hidroksiPEG - monoaldehide, hidroksiPEG - monovinil - sulfonate, reaktivne estre hidroksiPEG - monokarboksilnih kiselina i hidroksiPEG - monofenil karbonatni derivati). Drugi intermedijeri koji mogu biti od koristi pri sintezi reaktivnih polimernih derivata obuhvataju druge hidroksiPEG - mono kiseline i hidroksiPEG - mono acetale.
U određenim rešenjima polialkilen glikol poseduje molekulsku masu od oko 1000 Da do oko 100 kDa, poželjno oko 2 kDa do oko 60 kDa; od oko 2 kDa do oko 30 kDa, od oko 5 kDa do oko 20 kDa; od oko 10 kDa do oko 30 kDa; od oko 10 kDa do oko 20 kDa; koji poseduju dve grane od kojih svaka ima molekulsku masu od oko 2 kDa do oko 30 kDa; a posebno poželjno koji poseduju 2 grane od kojih svaka ima od oko 18 kDa do oko 20 kDa. Konjugati prema ovom rešenju predmetnog pronalaska mogu da sadrže jednu ili više niti polialkilen glikola, u određenim rešenjim apoželjno od oko jedne do oko 10 niti, od oko 1 do oko 5 niti, poželjnije od oko 1 do ok 3 niti, a najpoželjnije od 1 do 2 niti. U drugim rešenjima poželjno od 5 do oko 100 niti, od 10 do oko 50 niti a još poželjniej od 6 do oko 20 niti po podjedinici proteina enzima velike molekulske mase. U posebno poželjnom rešenju polialkilen glikol koji se koristi u konjugatu sadrži jednu ili dve niti monofunkcionalno aktiviranog poli(etilen glikola) (npr., reaktivni estar hidroksiPEG - monokiseline, hidroksiPEG - monoaldehid, hidroksiPEG - monovinilsulfon ili hidroksiPEG - monofenil karbonatni derivat) koji poseduju molekulsku masu od oko 18 kDa do oko 22 kDa ili od oko 27 kDa do oko 33 kDa.
Odgovarajući biološki aktivne komponente za upotrebu u preparatima i konjugatima, prema predmetnom pronalasku, obuhvataju,bez ograničenja, mnoštvo peptida, protreina, glikoproteina, organskih jedinjenja, jedinjenja koja sadrže amin, karboksil jedinjenja, jedinjenja koja sadrže hidroksil grupu i jedinjenja koja sadrže tiol grupu.
Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju konjugata između biološki aktivnog jedinjenja i monofunkcionalno aktiviranog polialkilen glikola, koji na primer obuhvataju: (a) dobijanje ili pripremanje linearnog ili razgranatog polialkilen glikola, koji sadrži najmanje jednu ne reaktivnu blokirajuću grupu koja naknadno može biti uklonjena, kao što je to jedna ili više trifenil metil grupa ("tritil grupe"); (b) proizvodnju derivata polialkilen glikola putem njegove reakcije sa najmanje jednim jedinjenjem za derivatizaciju u uslovima u kojima se polialkilen glikol derivira jednom grupom za derivaciju (kao na primer. sa jednom karboksilnom grupom ) na onom kraju na kome nema blokirajuće grupe (blokirajućih grupa); (c) uklanjanje blokirajuće grupe (blokirajućih grupa) bez uklanjanja grupe za derivaciju, čime se dobija, tokom jednog ili više koraka, monofunkcionalno aktivirani polialkilen glikol; i (d) reakciju monofunkcionalno aktiviranog polialkilen glikola sa najmanje jednom biološki aktivnom komponentom u uslovima koji pospešuju kovalentno vezivanje biološki aktivne komponente za monofunkcionalno aktivirani polialkilen glikol. Poželjno, konjugati koji se dobijaju takvim postupcima, poseduju smanjenu, značajno smanjenu ili ne detektabilnu antigenost i imunogenost, kada se porede sa konjugatima deriviranim u istom stepenu sa mPEG slične veličine strukture i tipa veze sa biološki aktivnim sredstvom. Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje konjugate koji se dobijaju takvim postupcima.
Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje farmaceutske ili veterinarske preparate, koji sadrže konjugate, prema predmetnom pronalasku i najmanje jedan ekscipijent ili nosilac koji je prihvatljiv za farmaceutsku ili veterinarske upotrebu. U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za sprečavanje nastanka, dijagnostikovanje ili tretiranje fizičkih poremećaja kod životinja (kao što su sisari, uključujući ljude) korišćenjem preparata ili konjugata prema predmetnom pronalasku. Jedan takav postupak obuhvata, npr., primenu kod životinje koja boluje od ili koja je predisponirana za razvoj fizičkog poremećeja (kao što je anemija, artritis, kanceri, Alchajmerova bolest, enzimske deficijencije, kardiovaskularne bolesti, hipertenzija, infektivne bolesti, metaboličke bolesti, neurološke bolesti,neutropenija, hiperurikemija, i njene manifestacije, (npr., giht), bolesti ili poremećaji genetskih deficijencija i slično) efikasne količine preparata ili konjugata, prema predmetnom pronalasku, koji može da se primeni kod životinje posebno kod sisara a izuzetno posebno kod ljudi, oralno, topijski ili parenteralno, na primer intravenski, intramuskularno ili subkutano.
U dodatnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje preparate koji sadrže jedan ili više konjugata smanjene antigenosti, prema predmetnom pronalasku, koji dalje mogu da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti li reagenasa, kao što su jedna ili više puferskih soli, jedan ili više ugljenohidratnih ekscipijenata, jedan ili više nosilaca proteina, jedan ili više enzima, jedan ili više detergenata, jednu ili više nukleinskih kiselina, jedan il iviše polimera, kao što su PEG i si. Predmetni pronalazak, dalje obezbeđuje komplete koji sadrže konjugate smanjene antigenosti i/ili preparate prema predmetnom pronalasku.
U dodatnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje PEG lipozome smanjene imunoreaktivnosti dobijene korišćenjem monofnkcionalno aktivniranih polialkilen glikola koji ne sadrže metoksil ili drugu alkoksil grupu, pre nego monofunkcionalno aktivirani mPEG. Druga poželjna rešenja prema predmetnom pronalasku biće jasna stručnjaku u svetlu sledećih crteža i opisa predmetnog pronalaska, kao i na osnovu patentnih zahteva.
Kratak opis crteža
Slika 1 prikazuje rezultate anlize sa enzimom povezanog imunosorbentnog testa ("ELISA"). U ovom testu mPEG konjugat jednog proteina je vezan na ploče za testiranje od 96 polja, nakon čega je merena inhibicija vezivanja zečijih antitela prema mPEG konjugatu drugog proteina ponoću rastvora mPEG ili t - butoksiPEG.
Slika 2a prikazuje rezultate kompetitivnog ELISA izvedenog kao što je opisano za SLiku 1 korišćenjem PEG - ova različitih veličina i struktura koji sadrže jednu ili dve metoksil grupe. Rezultati vezivanja antitela su prikazani u vidu grafikona kao funkcija molarne koncentracije metoksil grupa u svakom od uzoraka.
Slika 2b prikazuje iste podatke kao Slika 2a koji su prikazani u vidu grafikona kao funkcija masene koncentracije PEG (ug/ml) umesto molarne koncentracije metoksil grupa.
Slika 3 prikazuje neke od podataka iz Slika 1, 2, 2b u obliku koji prikazuje direktnu zavisnost antigenosti od broja metoksil grupa po molekulu PEG. Ovi uzorci obuhvataju PEG - ove od 10 kDa, pri čemu jednom ne dostaje metoksi grupa (t - metoksiPEG), jedan sadrži jednu metoksil grupu (mPEG) a jedan sadrži dve metoksil grupe (Di - (5-kDa) mPEG - lizin).
Slika 4 prikazuje kompetitivni ELISA, kao što je opisano za Sliku 1 u kome se mPEG od 4,8 kDa upoređuje sa tri PEG prema predmetnom pronalasku, koji nemaju metoksil grupe na krajevima linearnog polimera (obeleženih kao "PharmaPEG"). Pomak između krivih na horizontalnoj osi prikazuje da antigenost sva tri PEG - a, prema predmetnom pronalasku, jeste oko 100x niža od antigenosti mPEG, kada se koristi test sa anti - mPEG antitelima.
Slika 5a prikazuje rezultate ispitivanja u kojima su uzorci izomera ugljene anhidraze ("CA II") i iste ugljene anhidraze povezane sa u prošeku 3-4 lanca mPEG od 5 kDa analizirani pomoću poliakrilamid gel elektroforeze u prisustvu natrij um dodecil sulfata (SDS - PAGE). Trake jedan i dva na gelu pokazuju rezultate dobijene bojenjem na protein korišćenjem SYPRO® marku Ruby boje, uz fotografisanje u tamnoj komori sa osvetljenjem od 320 nm. Trake 3 i 4 pokazuju rezultate VVestern blot analize mPEG konjugata i nepegiliranog enzima, respektivno. u kojoj su kao primarna antitela korišćena poliklonalna zečija anti - mPEG antitela. Traka 5 prikazuje položaje proteinskih standarda pre bojenja.
Slika 5b prikazuje kvantifikaciju intenziteta traka u gelu i Western blot analizi prikazanim na Slici 5a, korišćenjem Kodak fotoaparata i softvera za digitalno snimanje. Horizontalna osa predstavlja rastojanje migracije u odnosu na front boje, a vertikalna osa predstavlja relativne intenzitete boje na protein ili anti - mPEG boje. Donji prikaz predstavlja trake standarda proteina pre bojenja sa približnim molekulskim masama, sa leva na desno, od 203, 8; 110, 9; 68.8; 51,5; 40,2; 28,9; 20.7 i 14,9 kDa. Drugi zapis od dole predstavlja bojenje anti - mPEG antitelom pegilirane ugljene anhidraze. Treći zapis od dole predstavlja traku ugljene anhidraze obojene na prisustvo rpoteina, a gornji zapis predstavlja trake mPEG konjugata ugljene anhidraze obojenih na protein.
Slike 6a i 6b prikazuju rezultate ELISA analiza seruma dobijenih od grupa od po tri zeca koji su imunizovani konjugatima svinjske urikaze koja sadrži u prošeku oko 2 lanca mPEG ili hidroksi mPEG (PharmaPEG), po pdjedinici urikaze. Antitela prema urikazi su merena korišćenjem test ploča obloženih svinjskom urikazom. Antitela protiv PEG su određivana korišćenjem prloča obloženih konjugatima, nevezanog proteina koji je povezan sa mPEG. Slika 6a prikazuje podatke dobijene nakon drugog uzimanja krvi od zečeva koji su primili četiri injekcije PEG - urikaze u nekompletnom Freund - ovom adjuvansu. Slika 6b prikazuje podatke dobijene od istih zečeva tokom trećeg uzimanja krvi nakon što su primili 5 injekcija PEG - urikaze u nekompletnom Freund - ovom adjuvansu.
Detaljni opis predmetnog pronalaska
Usim ukoliko nije definisano drugačije, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste poseduju ista značenja koja su uobičajena kod stručnjaka kojima je ovaj pronalazak i namenjen. Iako u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalaska može biti upotrebljen bilo koji od postupaka i materijala koji su slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde, poželjni postupci i materijali su opisani u tekstu koji sledi.
Definicije
"Oko", "Otprilike". Kao što se ovde koristi kada se odnosi na bilo koju numeričku vrednost, pojam "oko" označava vrednost od ±10 navedene vrednosti (npr., "oko" 50 °C, obuvata opseg temperatura od 45 do 55 °C, inkluzivno; slično tome "oko 100 mM" obuhvata opseg koncentracija od 90 do 110 mM, inkluzivno).
"Biološki aktivna komponenta". Kao što se ovde koristi, pojam "biološki aktivna komponenta", označava jedinjenje, molekul, grupu ili kompleks koji poseduje posebno biološku aktivnost in vivo, in vitro, ex vivo, u odnosu na ćeliju, tkivo, organ ili organizam, a sposobna je da se veže za jedan ili za više polialkilen glikola kako bi nastali konjugati prema predmetnom pronalasku. Poželjne biološki aktivne komponente su detaljno opisane u tekstu koji sledi.
"Vezan/vezana". Kao što se ovde koristi, pojam "vezan/vezana", označava vezivanje ili prikačinjanje koje može biti kovalentno, npr., hemijskim vezivanjem ili ne kovalentno, npr., jonskim interakcijama, hidrofobnim interakcijama, vodoničnim vezama, itd. Kovalentne veze mogu biti, na primer, estarske, etarske, fosfoestarske, tioestarske, tioetarske, uretanske, amidne, peptidne, lipidne, ugljenik - sumporne veze,ugljenik - fosforne veze i slične. Pojam "vezan/vezana" je širi od i uključuje pojmove kao što su "povezan", "privezan" i "prikačen".
"Privezan (eng., coupled)". Kao što se ovde koristi, pojam "privezan", označava prikačinjanje pomoću kovalentnih veza ili pomoću jakih ne kovalentnih interakcija, tipično i poželjno prikačinjanje kovalentnim vezama. U predmetnom pronalasku može da se upotrebi bilo kojipostupak koji se koristi od strane stručnjaka za vezivanje biološki aktivnih materijala.
"Oboljenje, poremećaj, stanje". Kao što se ovde koriste, pojmovi "oboljenje" ili "poremećaj" označavaju bilo koje ne željeno stanje kod čoveka ili kod životinje uključujući tumore, kancere, alergije, zavisnost, autoimunost, trovanje, ili oštećenje optimalne mentalne ili telesne funkcije. Kao što se ovde koristi, pojam "stanja" obuhvata
oboljenja i poremećaje, ali se takođe odnosi i na fiziološka stanja. Na primer, fertilnost je fiziološko stanje, a ne bolest ili poremećej. Preparati prema predmetnom pronalasku koji su pogodni za sprečavanje trudnoće, smanjivanjem fertilnosti tako mogu da se opišu kao tretman za stanje (fertilnost), a ne kao tretman poremećaja ili bolesti. Primeri drugih stanja su jasni stručnjacima.
"Efikasna količina". Kao što se ovde koristi, pojam "efikasna količina", označava količinu datog konjugata ili preparata koji je potreban ili dovoljan da se postigne željeni fiziološki efekat. Efikasna količina datog preparata ili konjugata prema predmetnom pronalasku bila bi količina kojom se postiže ovaj željeni irezultat, a takva količina može da se odredi rutinski od strane stručnjaka. Na primer, efikasna količina za lečenje deficijencije imunog sistema bila bi ona količina koja je potrebna da izazove aktivaciju imunog sistema, što vodi razvoju antigen specifičnog imunog odgovora, nakon izlaganja antigena. Ovaj pojam je takođe sinonim za dovoljnu količinu. Efikasna količina za bilo koju posebnu primenu može da varira u zavisnosti od faktora kao što su aoboljenje ili stanje koje se tretira, određeni preparat koji se primenjuje, veličina subjekta i/ili ozbiljnost oboljenja ili stanja. Stručnjak može empirijski da odredi određenu količinu konjugata ili preparata, prema predmetnom pronalasku, bez nepotrebne dodatne eksperimentacij e.
"Imuni odgovor". Kao što se ovde koristi, pojam "imuni odgovor" označava, humoralni imuni odgovor, tj., stvaranje antitela i/ili ćelijski imuni odgovor koji vodi aktivaciji i proliferaciji B- ili T - limfocita i/ili antigen prezentujućih ćelija. U nekim slučajevima, međutim, imuni odgovor može biti niskog intenziteta i može se jedino detektovati upotrebom jedne supstance prema predmetnom pronalasku. Pojam "imunogenost" označava da je određeno sredstvo sposobno da stimuliše imuni sistem živog organizna, tako da je jedna ili više funkcija imunog sistema povišena i usmerena prema sredstvu koje je izazvalo imunogenost.
"Jedan/jedna/jedno". Kada se pojmovi "jedan/jedna/jedno" koriste u ovom opisu oni označavaju "najmanje jedan" ili "najmanje jedna", osim ukoliko drugačije nije naznačeno.
"Polipeptid". Kao što se ovde koristi, pojam "polipeptid" označava molekul koji je sastavljen od monomera (aminokiselina) koji su linearno povezani amidnim vezama
(takođe poznatim kao peptidne veze) označava molekulski lanac aminokiselina, a ne označava specifičnu dužinu proizvoda. Zato dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, peptidi ne specifikovane dužine, i proteini jesu obuhvaćeni definicijom pojma polipeptid. Ovaj pojam se takođe odnosi na proizvose post ekspresionih modifikacija polipeptida, npr., glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i si. Polipeptid možće biti rekombinantan ili dobijen iz prirodnog biološkog izvora, ali nije neophodno da bude transliran za označene sekvence nukleinskih kiselina. On može da nastane na bilo koji način uključujući hemijsku sintezu.
"Protein" i "glikoprotein". Kao što se ovde koristi, pojam "protein" označava polipeptid koji generalno ima veličinu iznad 5 ili više. 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više. 200 ili više. 500 ili više. 1000 ili više ili 2000 ili više aminokiselina. Proteini generalno imaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako nije neophodno da budu savijeni, a često se označavaju kao da su savijeni, nasuprot peptidima il ipolipeptidima, obično ne poseduju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već pre mogu da usvoje veliki broj različitih konformacija i koji se zato označavaju kao ne savijeni.Peptidi mogu, međutim da poseduju takođe definisanu trodimenzionalnu strukturu. Kao što se ovde koristi pojam "glikoprotein" označava protein koji sadrži najmanje jednu šećernu podjedinicu koja je prikačena za protein putem bočnog lanca aminokiseline koji sadrži kiseonik ili azot, npr., putem serina ili asparagina.
"Prečišćen". Kada se pojam 'prečišćen" koristi da označi molekul onda znači da je koncentracija molekula koji je prečišćen povećana u odnosu na molekule koji su sa njim udruženi u svom prirodnom okruženju ili u okruženju u kome je proizveden ili pronađen ili sintetisan. Prirodni udruženi molekuli uključuju proteine, nukleinske kiseline lipide i šećere, a generalno ne obuhvataju vodu, pufere, i reagenske koji su dodati da održavaju integritet ili da pospeše prečišćavanje molekula koji se prečišćava. Na primer, čak ukoliko se dati protein u sirovom ekstraktu razblaži vodenim rastvaračem tokom hromatografije na koloni, molekuli proteina se smatraju prečišćenim ovom hromatografijom ako prirodno udružene nukleinske kiseline ne željeni proteini i drugi biološki molekuli bivaju razdvojeni od navedenih proteinskih molekula. Prema ovoj definiciji, supstanca može posedovati čistoću od 5 % ili više, 10% ili više, 20% ili više, 30% ili više, 40% ili više, 50% ili više, 60% ili više, 70 % ili više, 80 % ili više, 90%
ili više, 95 % ili više. 98% ili više, 99 % ili više, ili 100% kada se upoređuje u odnosu na sadržaj kontaminanata.
"Ostatak". Kao što se ovde koristi, pojam "ostatak" označava specifičnu aminokiselinu, obično dehidratisanu kao rezultat toga što je uključena u stvaranje jedne ili više peptidnih veza, što je uključena u polipeptidni skelet ili bočni lanac.
"Tretman". Kao što se ovde koriste, pojmovi "tretman", "tretirati", "tretiran" ili "tretiranje" odnose se na profilaksu i/ili terapiju. Kada se ovi pojmovi koriste u odnosu na infektivnu bolest oni mogu da označavaju profilaktički tretman kojim se povećava otpornost subjekta na infekciju određenim patogenom ili, drugim rečima odnosi se na smanjenje verovatnoće da će subjekat biti inficiran patogenom ili da će pokazati znakove bolesti koji se pripisuju infekciji a takođe se odnose i na tretman nakon što je subjekat inficiran u cilju borbe protiv infekcije, npr., smanjenja ili eliminisanja infekcije, ili pogoršanja.
Stanje tehnike
Brojni raniji istraživači su opisali dobijanje linearnih ili razgranatih ne antigenih PEG polimera ili njegovih konjugata (videti, npr., U. S. patente br. 5,428,128; 5,621,039; 5,622,986; 5,643,575; 5,728,560; 5,730,990; 5,738,846; 5,811,076; 5,824,701; 5,840,900; 5,880,131; 5,900,402; 5,902,588; 5,919,455; 5,951,974; 5,965,119; 5,965,566; 5,949,040; 5,981.709; 6,011,042; 6,042822; 6,113,906; 6,127,355; v6,132,713; 6,177,087 i 6,180,095; videti takođe PCT publikaciju WO 95/13090 i objavljenu U. S. patentne prijave br. 2002/0052443, 2002/0061307 i 2002/0098192, čiji su opisi ovde inkorporirani po referenci u celosti). Međutim, PEG i konjugati u ovim prethodnim izveštajima ostaju makar slabo imunogeni što može da dovede do neželjenih posledica u smislu razvoja antitela na PEG komponentu konjugata onda kada se konjugati uvedu u organizam životinje u profilaktičku dijagnostičku ili terapeutsku svrhu. Takva antitela mogu da dovedu do brzog čišćenja biološki aktivnih konjugata koji sadrže PEG, čime se smanjuje biološka raspoloživost terapeutskih preparata (Cheng. T. -L. et al., 1999., gore navedeno), takođe je moguće indukovanje poremećaja posredovanog imunim kompleksima. Štaviše, do sada nije postojao opis mehanizma kojim bi se navedeni PEG - ovi ili njihovi konjugati praktično učinili ne antigenim ili ne imunogenim.
Predmetni pronalazak je prevazišao ova ograničenja u struci. Generalno predmetni pronalazak obezbeđuje stabilne preparate i postupke koji su korisni u sprečavanju nastanka, dijagnozi i tretmanu brojnih fizičkih poremećaja. Posebno, predmetni pronalaza obezbeđuje postupke za dobijanje reaktivnih polimera smanjene antigenosti i stabilizovanih polimernih konjugata proteina, posebno terapeutskih proteina, koji poseduju smanjenu ili značajno smanjenu antigenost ili koji ne poseduju detektabilnu antigenost. U drugim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate dobijene ovim postupcima prema predmetnom pronalasku, kao i prepatrate,posebno farmaceutske preparate koji sadrže takve konjugate. U dodatnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za upotrebu takvih preparata i konjugata u sprečavanju nastanka, dijagnostikovanju i tretiranju raznih fizičkih poremećaja. Predmetni pronalazak obezbeđuje, takođe i komplete koji sadrže jedan ili više konjugata i/ili preparata prema predmetnom pronalasku.
Dobijanje konjugata smanjene antigenosti
U jednom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje postupke z a dobijanje konjugata smanjene antigenosti, značajno smanjene antigenosti ili ne detektabilne antigenosti kovalentnim povezivanjem polimera rastvorljivih u vodi sa jednim ili sa više biološki aktivnih jedinjenja ili komponenti, na primer sa jednim ili sa više proteina, a posebno sa jednim ili sa više terapeutskih proteina. U takvim konjugatima, izabrani polimeri sami po sebi imaju smanjenu antigenost, značajno smanjenu natigenot, ili ne detektabilnu antigenost, u poređenju sa standardnim polimerima koji se tipično koriste za dobijanje konjugata, proteina i polimera. Kao što se ovde koristi, pojam "smanjena antigenost" označava polimer (npr., PAO ili PAG, posebno PEG a izuzetno monofunkcionalno aktivirani PEG) ili na konjugat ili na preparat koji sadrži ili koji je sintetisan korišćenjem takvog polimera, pri čemu je sposobnost polimera da reaguje sa antitelima specifičnim za polimere veće antigenosti (npr., mPEG) smanjena za bilo koju meru. Poželjno, antigenost je smanjena za najmanje oko 30%, poželjnije je smanjena za najmanje oko 50%, a najpoželjnije je smanjena za više od 75% u poređenu sa polimerom veće antigenosti. Zatim, polimer (ili konjugat ili preparat koji sadrži ili koji je sintetisan korišćenjem takvog polimera) je označen kao onaj koji ima "značajno smanjenu natigenost" ukoliko polimer (ili konjugat ili preparat) poseduje antigenost koja je manja od 20%, poželjnije manja od oko 15 %, još poželjnije manja od oko 10 %, a najpoželjnije manja od oko 1 %, u odnosu na antigenost odgovarajuće antigenog polimera (npr., mPEG). Konačno, polimer (ili konjugat ili preparat koji sadrži ili je sintetisan korišćenjem takvog polimera) označava da je be "detektabilne antigenosti" ukoliko polime, konjugat ili preparat ne poseduje detektabilnu antigenost kada se ispituje postupcima poznatim u struci (npr., upotrebom ELISA ili drugih postupaka za detekciju antigenosti kao što su oni koji su poznati u struci i koji su opisani u primerima u tekstu koji sledi).
Polimeri
Polialkilen glikoli koji su posebno korisni za upotrebu u dobijanju konjugata prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bez ograničenja, poli(etilen glikoli9, i kopolimeri etilen oksida i propilen oksida; posebno poželjno PEG - ovi i još poželjnije monofunkcionalno aktivirani hidroksiPEG - ovi (npr., hidroksiPEG - ovi aktivirani na jednom terminusu, uključujući reaktivne estre hidroksiPEG - monokarboksilne kiseline, hidroksiPEG - monoaldehide, hidroksiPEG - monoamine, hidroksiPEG - monohidrazide, hidroksiPEG - monokarbazate, hidroksiPEG - monojodoacetamide, hidroksiPEG - monomaleimide, hidroksiPEG - monoortopiridil disulfide, hidroksiPEG - monooksime, hidroksiPEG - monofenil karbonate, hidroksiPEG - monofenil glioksale, hidroksiPEG - monotiazolidin - 2- tione, hidroksiPEG - monotioestre, hidroksiPEG - monotiole, hidroksiPEG - monotriazine i hidroksiPEG - monovinilsulfone).
Posebno poželjni polimeri za upotrebu pri dobijanju konjugata prema predmetnom pronalasku, koji poseduju smanjenu antigenost, značajno smanjenu natigenot, ili ne detektabilnu antigenost su monofunkcionalno aktivirani PEG - ovi, koji ne sadrže metoksil grupe, druge alkoksil grupe ili ariloksil grupe. Supstitucija monofunkcionalno aktiviranih mPEG sa takvim monofunkcionalno aktiviranim PEG - ovima u sintezi konjugata prema predmetnom pronalasku, dovodi do toga da nastali konjugati poseduju neočekivano smanjenu antigenost, tj., smanjenu sposobnost da interaguju sa antitelima koja su razvijena prema mPEG konjugatima iste biološki aktivne komponente. Dobijeni konjugati takođe poseduju smanjenu imunogenost, tj., smanjenu sposobnost da izazovu imuni odgovor.
U jednom rešenju predmetnog pronalaska mofunkcionalno aktivirani PEG - ovi mogu da sintetišu korišćenjem odgovarajućih reverzibilno blokiranih derivata grupe koja se aktivira kao inicijatora za polimerizaciju etilen oksida (Akivama, Y., et al, 2000., Bioconjug. Chem., 11: 947 - 950). Akivama et al., obezbedili su uslove za sintezu monohidroksil, monoacetal derivata PEG upotrebom kalijum 3,3 - dietoksipropanolata kao inicijatora polimerizacije etilen oksida. S obzirom da Akivama et al., nisu prepoznali najpoželjniju smnjenu antigenost ili imunogenost ovog intermedijera, oni su nastavili sa prevođenjem terminalne hidroksil grupe u tiol grupu pomoću terminacije polimerizacije dodavanjem metansulfonil hlorida, čime se dobij a heterobifunkcionalni PEG, umesto PEg deriva prema predmetnom pronalasku. Kao dalji dokaz da ova grupa istraživača nije prepoznala upotrebljivost monofunkcionalno aktiviranog PEG koji se završava hidroksilnom grupom, oni su objavili i patentirali postupke za sintezu alternativnih heterobifunkcionalnih PEG - ova od monohidroksilnih, monofunkcionalno aktiviranih PEG - ova, a u nekim slučajevima su čak "na kraj" hidroksiPEG - ova stavljali metoksil grupe. Slično tome, Bentlev, M. D., et al., u objavljenoj U. S. patentnoj prijavi broj 2002/0072573 Al, opisuju polimerne preparate i postupke koji oslikavaju neprepoznavanje imunološke prednosti monofunkionalno aktiviranih polimera koji se završavaju hidroksilnom grupom i opisuju poželjnost prevođenja terminalnih i hidroksilnih grupa takvih polimera u metoksil grupe.
U alternativnom rešenju prema predmetnom pronalasku, monofunkcionalno aktivirani PEG - ovi mogu da se sintetišu kontrolisanjem stepena aktivacijelinearnih PEG
- ova koji sadrže hidroksilne grupe na oba svoja kraja (PEG dioli), kako bi se ograničila količina dis - aktiviranih PEG do prihvatljivo niskog nivoa, npr., do nivoa manjeg od 5%, popoželjno manje od 2%, ili još poželjnije manje od 1%, kao alternativa postupku prikazanom u Primeru 5. U posebno poželjnom rešenju, monofunkcionalno aktivirani PEG - ovi mogu biti sintetisani iz mono funkcionalnih PEG - ova sa kojih nereaktivna
blokirajuća grupa može biti uklonjena nakon derivatizacije PEG, bez uklanjanja derivirajuće grupe. Primer deriviranog PEG jeste PEG karboksilna kiselina i primeri nereaktivnih blokirajućih grupa koje mogu biti uklonjene nakon derivatizacije jesu ariloksi grupe (Bentlev, M. D., et al, PCT publikacija WO 01/26692 Al), tritil grupe (Kocienski, P. J., 1994, Protecting Groups, georg Thieme Verlag, Stuttgart, str., 54 - 58) i t - butoksil grupe, t - butoksiPEG - karboksilna kiselina može biti aktivirana, npr., sa N - hidroksisukcinimidom. Na kraju t - butoksil grupa može da se ukloni pomoću anhidridne acidolize, čime se dobija aktivirani derivat PEG - karboksilne kiseline koji poseduje hidroksilnu grupu umesto metoksil grupe na distalnom kraju polimera. U poželjnijem rešenju t - butoksiPEG - karboksilna kiselina može da se prevede u hidroksiPEG - karboksilnu kiselinu acidolizom pre aktivacije karboksilne grupe sa N - hidroksisukcinimidom. U drugom rešenju, prema predmetnom pronalasku, t - butoksiPEG - acetali se sintetišu pomoću reakcije t - butoksiPEG sa haloacetalom, nakon čega se proizvod prevodi u hidroksiPEG acetal ili hidroksiPEG aldehid, selektivnom anhidridnom acidolizom, kako bi se otklonila t - butoksil grupa. Acetal može da se prevede u aldehid (ili aldehid hidrat) prilikom njegove pripreme za vezivanje sa jedninjenjem koje sadrži amin putem reduktivne alkilacije (Bentlev, M. D., et al., U. S. patent broj 5,990,237). U drugom rešenju, ariloksil zaštitna grupa koja se nalazi distalno u odnosu na reaktivni terminal polimera može da se ukloni pomoću katalitiček hidrogenolize, čime se dobija monoaktivirani hidroksiPAG prema predmetnom pronalasku. Alternativno, reverzibilno blokiranje svih izuzev jedne terminalne hidroksilne grupe, kao što je opisano u Primeru 6, može da se koristi pri sintezi monofunkcionalno aktiviranih hidroksiPAG - ova.
PAG polimeri koji se koriste u dobijanju konjugata, prema predmetnom pronalasku, mogu biti linearni polimeri ili mogu biti razgranati na jednoj ili na više tačaka u okviru molekula polimera. Dodatno, polimeri koji se koriste za dobijanje konjugata prema predmetnom pronalasku, mogu biti homopolimeri, u kojima su multiple podjedinice jednog istog monomernog tipa povezane zajedno kako bi formirale polimer, (kao u slučaju polietilen glikola) ili mogu biti hetero polimeri ili kopolimeri (u kojima su monomerne podjedinice dve ili više struktura povezane zajedno kako bi se dobio polimer, što je kopolimer etilen oksida i propilen oksida). Takvi kopolimeri mogu biti nasumični kopolimeri, blok kopolimeri ili alternirajući kopolimeri.
Polimeri koji se koriste prema predmetnom pronalasku mogu biti nereaktivni polimeri ili reaktivni polineri. Kao što se ovde koristi pojam "nereaktivni polimeri" označava one polimere koji se ne vezuju kovalentno sa proteinom. Primeri takvih nereaktivnih polimera obuhvataju mPEG, koji je linearni polimer etilen oksidnih jedinica sa hidroksil grupom najednom kraju i metoksil grupom na drugom kraju, kao i PEG diol koji je linearni polimer etilen oksidnih podjedinica sa hidroksilnim grupama na oba kraja. Kao što se ovde koristi pojam "reaktivni polimeri" označava one polimere koji mogu da reaguju sa nukleofilnim grupama koje su dostupne rastvaraču, npr., sa diol grupama ili aminogrupama na biološki aktivnoj komponenti (kao što je to protein) uključujući bez ograničenja a - aminogrupu ili epsilon aminogrupe lizinskih ostataka.Primeri "reaktivnih polimera" obuhvataju, bez ograničenja, PEG - ove u kojima je krajnja hidroksilan grupa prevedena ili zamenjena sa elektrofilnom grupom kao što je sukcinimidil propionska kiselina (kao u "SPA - PEG") ili p - nitrofenil karbonat (kao u "NPC - PEG") ili aldehid, kao u PEG - aldehidu. Kao dodatak polialkilen oksidima, odgovarajući polimeri mogu da sadrže polivinil alkohole, poli(oksietilen - oksimetilen) kopolimere, poliamide (npr., Rose, K., PCT publikacija WO 00/12587), polikarboksilate, poli(vinilpirolidine) (von Specht, B. -U., et al., 1973, Hoppe - Sevler's Z. Phvsiol. Chem 354: 1659 - 1660), poli D - aminokiseline i/ili poli L - aminokiseline, poliakriloil - morfolin (Rocca, M., et al., 1996., Int. J. Artif. Organs 19: 730 - 734) i dekstrane (Iakunitsjva, L. M. et al., 1980., Prikl. Biochim. Mikrobiol. 16: 232 - 237). Derivati PEG - ova, PEO - ova i drugih PAO - ova koji reaguju više ili manje selektivno sa različitim mestima na ciljanim biološki aktivnim komponentama su dobro poznati u struci i mogu da se naruče od snabdevača kao što su Fluka (Milvvaukee, WI); NOF Corporation (Tokyo, Japan); Sheanvater Corporation (Huntsville, AL), podružnica Nektar Therapeutics (San Carlos, CA); Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) ili SunBio, Inc. (Anyang City, Južna Koreja).
Aktivirani oblici polimera koji su pogodni za upotrebu u preparatima prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bilo koji od monofunkcionalno aktiviranih oblika polimera sa terminalnom hidroksilnom grupom koji su poznati u struci. Na primer, pogodni su linearni ili razgranati PAO - ovi različitih veličina uključujući i one sa molekulskim masama (ne uzimajući u obzir masu grupe za aktivaciju) u opsegu od oko 1 kDa do oko 100 kDa. Poželjni opsezi molekulskih masa obuhvataju, bez ograničenja one od oko 2 kDa do oko 60 kDa. od oko 2 kDa do oko 30 kDa, od oko 5 kDa do oko 20 kDa, od oko 10 kDa do oko 20 kDa, od oko 18 kDa do oko 60 kDa, od oko 2o kDa ili oko 30 kDa. U slučaju linearnih PEG - ova. opseg molekulske mase od oko 20 kDa do oko 30 kDa, odgovara stepenu polimerizacije (n) u opsegu od oko 460 do oko 680 monomernih podjedinica etilen oksida. Treba napomenuti da su prednosti vezivanja terapeutskog proteina sa polimerima koji poseduju ovaj poslednji navedeni, relativno visoki opseg molekulskih masa (tj., više od 20 - 30 kDa), prvo primećeni dosta pre nego što je prepoznata imunogenost mPEG (Saifer, M., et al., PCT publikacija WO 89/01033, objavljena februara 1989., čiji je opis ovde inkorporiran u celosti).
Opciono, linearni polimer može da poseduje linearnu grupu na jednom svom kraju ili na oba svoja kraja, pri čemu nastaje reaktivni polimer.U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku može biti poželjno da se upotrebi sukcinimidil estar derivata PEG sa monopropionskom kiselinom, kao što je opisano u Harris, J.M., et al., U. S. patent broj 5,672,662, čiji je opis ovde inkorporiran prema referenci u celosti, ili neke druge sukcinimidom aktivirane karboksilne kiseline. U određenim drugim rešenjima može biti poželjno da se upotrebe ili derivati PEG sa sukcinimidil karbonatom ("SC - PEG"), kao što je opisano u Saifer, M, et al, U. S. patentni brojevi 5,006,333; 5,080, 891; 5,283, 217 i 5,468,478 ili p - nitrofenil karbonat derivat PEG, kao što je opisano u Kelly, S. J., et al., 2001, gore navedeno; PCT publikaciji WO 00/07629 A2, gore navedeno i u vezi sa U. S. patentom broj 6,576,235 i PCT publikacija WO 01/59078 A2 gore navedeno. Staviše, drugi tipovi reaktivnih grupa mogu da se iskoriste za sintezu reaktivnih konjugata proteina. Ovi derivati obuhvataju bez ograničenja, aldehidne derivate PEG - ova (Rover, G. P. U.S. patent broj 4,002,531; Harris, J. M, et al., U. S. patent 5,252,714), amin, bromofenil karbonat, karbonilimidazol, hlorofenil karbonat, fluorofenil karbonat, hidrazid, karbazat, jodoacetamin, maleimid, ortopirisil disulfid, oksim, fenilglioksal, tiazolidin - 2 - tion, tioestar, tiol, triazin, i vinilsulfon derivate PEG - ova.
U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku poželjno je da se na minimum svede formiranje intramolekulskih ili intermolekulskih ukrštenih veza pomoću polimera kao što je PEG, tokom reakcije u kojoj se polimer povezuje sa biološki aktivnom komponentom kako bi se dobili konjugati prema predmetnom pronalasku. Ovo može da se postigne upotrebom polimera koji su aktivirani samo najednom kraju (ovde se označavaju kao monofunkcionalno aktivirani PEG - ovi ili monofunkcionalno aktivirani PAG - ovi) ili upotrebom polimernih preparacija u kojima je procenat bifunkcionalno aktiviranih polimera (označenih u slučaju linearnih PEG - ova kao "bis - aktivirani dioli") je manji od 30% ili poželjnije manji od 10% ili najpoželjnije manji od 2% (w/w). Upotreba aktiviranih polimera koji su predominantno monofunkcionalni može da se svede na minimum formiranje svih sledećih stvari: intramolekulskih ukrštenih veza unutar pojedinačnih molekula proteina, struktura "oblika tega", u kojima jedan lanac polimera povezuje dva proteinska molekula , kao i većih agregata i gelova. Kada se koriste aktivirani polimeri koji reaguju sa aminogrupama teoretski maksimalni broj lanaca polimera koji mogu biti prikačeni za jedan molekul proteina odgovara ukupnom broju aminogrupa. Stvarni broj aminogrupa koje su dostupne na površini proteina pod bilo kojim određenim uslovima vezivanja polimera može biti manji od teoretskog maksimalnog broja.
Konjugati prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže jedan ili više lanaca polialkilen glikola, poželjno od oko 1 do oko 100 lanaca, od oko 1 do oko 20 lanaca po podjedinici terapeutskog enzima i oko 1 do oko 3 lanca, a poželjnije od jednog do 2 lanca po podjedinici citokina, haktora rasta proteinskih hormona, i faktora stimulacije kolonija koje se vezuju za receptor. U posebno poželjnom takvom rešenju polialkilen glikol koji se koristi u dobijanju konjugata sadrži jedan ili dva lanca poli(etilen glikola) (posebno karboksi PEG, hidroksi PEG, dihidroksi PEG ili PEG - acetal). U određenim takvim rešenjima linearni ili razgranati polialkilen glikol poseduje molekulsku masu od oko 1 kDa do oko 100 kDa, poželjno od oko 2 kDa do oko 60 kDa, od oko 5 kDa do oko 20 kDa, od oko 10 kDa do oko 20 kDa, od oko 18 kDa do oko 60 kDa i najpoželjnije od oko 18 kDa do oko 22 kDa ili od oko 27 kDa do oko 33 kDa, ukoliko je linearan, a ukupno oko 36 kDa do oko 44 kDa ukoliko polimer poseduje dve grane jednake mase.
Biološki aktivne komponente
Kao što je gore navedeno konjugati prema predmetnom pronalasku sadrže jedan ili više PEG - ova ili PAO - va, posebno jedan ili više lanaca PEG, koji su kovalentno povezani sa jednom ili više biološki aktivnih komponenti. Biološki aktivne komponente sa kojima je jedan ili više polimera (ili njihovih niti) kovalentno povezan, ovde se označavaju različito i ekvivalentno kao "konjugirane biološki aktivne komponente" ili "modifikovane biološki aktivne komponente". Ove pojmove ovde treba razlikovati od pojmova "nekonjugovane biološki aktivne komponente", "inicijalne biološki aktivne komponente" ili "nemodifikovane biološki aktivne komponente", pri čemu svi ovi pojmovi označavaju biološki aktivne komponente koje ne oseduju ni jedan polimer koji je kovalentno vezan za njih. U drugom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje postupke i preparate za stabilizovanje rastvora biološki aktivnih komponenti, njihovim mešanjem sa polimerima. treba, međutim razumeti da "nekonjugovana", "nemodifikovana" i "inicijalna" biološki aktivna komponenta može da sadrži druge ne polimerne konjugate i modifikacije u poređenju sa molekulom divljeg tipa ili sa nativnim molekulom, a da se pri tome još uvek smatra ne konjugovanom, nemodifikovanom ili inicijalnom shodno predmetnom pronalasku, zato što je biološki aktivna komponenta i dalje nekonjugovana, nemodifikovana ili inicijalna u odnosu na prikačinjanje polimera.
Pojam "stabilizovanje" biološki aktivne komponente (ili pojam "postupci stabilizacije" ili "stabilizovana biološki aktivna komponenta") označava da je biološki aktivna komponenta stabilizovana shodno postupcima prema predmetnom pronalasku (tj., biološki aktivna komponenta za koju je polimer kovalentno prikačen ili sa kojom je poveza shodno postupcima prema predmetnom pronalasku). Takve stabilizovane biološki aktivne komponente pokazuju određene izmenjene biohemijske i biofizičke karakteristike u poređenju sa biološki aktivnom komponentom koja nije stabilizovana (sa biološki aktivnom komponentom za koju polimer nije kovalentno prikačen ili pomešan). U takve izmenjene biohemijske i biofizičke parametre, posebno za proteine kao što su enzimi, spadaju smanjena autoliza i posebno održavanje enzimske aktivnosti proteina tokom inkubacije u određenim teškim uslovima sredine ili eksperimenta. U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, u izmenjene biohemijske i biofizičke parametre spadaju, na primer, povećani poluživot u cirkulaciji in vivo, povećana biološka raspoloživost i slično.
Bilo koja komponenta, tipično molekul ili makromolekulski kompleks koja poseduje biološku; fiziološku; biohemijsku ili farmaceutsku aktivnost može biti pogodno upotrebljena kao inicijalna komponenta prema predmetnom pronalasku. Takve biološki aktivne komponente obuhvataju, bez ograničenja, proteine, polipeptide, peptide, terapeutske vituse, organska jedinjenja i slično. Biološki aktivne komponente takođe obuhvataju fragmente verijante takvih proteina, polipeptida, peptida, terapeutskih virusa i slično, posebno one fragmente, varijante i derivate koji poseduju biološku, (npr., fiziološku, biohemijsku ili farmaceutsku) aktivnost.
Odgovarajuća organska jedinjenja koja su korisna kao biološki aktivne komponente prema predmetnom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, podjedinice kao što su taksani, antraciklin, jedinjenja u koja spadaju daunorubicin, doksorubicin, p - aminoanilin mustard, melfalan, citozin arabinozid ("Ara - C") i druga anti - metabolička jedinjenja, npr., gencitabin itd. Alternativno, biološki aktivna komponenta može biti kardiovaskularno sredstvo, anti - neoplastično, anti - infektivno, anati - fungalno sredstvo kao što su nistatin i amfotericin B, anti - anksiozno sredstvo, gastrointestinalno sredstvo, sredstvo koje je aktivno u centralnom nervnom sistemu, analgetik, sredstvo koje utiče na fertilnost, kontraceptivno sredstvo, anti - inflamatorno sredstvo, steroidno sredstvo, sredstvo sa dejstvom protiv mokraćne kiselin, vazodilatatorno sredstvo, vazokonstriktivno sredstvo i slično.
Odgovarajući peptidi, polipeptidi, enzimi i drugi proteini, glikoproteini i slični,
koji su korisni kao biološki aktivne komponente u predmetnom pronalasku obuhvataju bilokoji peptid, polipeptid, enzim ili drugi protein itd., koji opseduje najmanje jednu dostupnu aminogrupu, tiol grupu ili drugu grupu za koju mogu da se prikače polimeri. Takve komponente obuhvataju materijale koji poseduju fiziološke ili farmakološke aktivnosti, kao i one koji su sposobni da katalizuju reakciju u organskim rastvaračima.Peptidi,polipeptidi i proteini od interesa obuhvataju, bez ograničenja, hemoglobin, serumske proteine kao što su faktori zgrušavanja krvi, npr., Faktore, VII,
VIII i IX, imunoglobuline, insulin, citokine, (kao što su interleukini, npr., IL - 1 do IL -
18), interferone (npr., IFN - a, IFN - p\IGN -yi konsenzus IFN), faktore stimulacije kolonija, uključujući bez ograničenja GM - CSF, G - CSF, faktor stimučlacije kolonija makrofaga, trombopoetin, faktor rasta i razvoja megakariocita, eritropoetin, faktor rasta poreklom iz trombocita, fosfolipaza - aktivirajući protein ("PLAP"), faktor inhibicije leukemije ("LIF", takođe poznat "čelični faktor"), neurotropne faktore i faktor matične ćelije i njihove peptidne mimetike. Antagonisti koji se vezuju za receptor biološki aktivnih sredstava su sami po sebi pogodni za upotrebu kao biološki aktivne komponente prema predmetnom pronalasku. Drugi proteini od opšteg biološkog ili terapeutskog interesa, obuhvataju insulin, proteine biljaka, kao što su lecitini i ricini, faktore nekroze tumora i sa njima povezane proteine, faktore rasta kao što su transformišući faktori rasta npr., TGF - a ili TGF - p, faktore rasta fibroblasta, faktore rasta epiderma, hepatocitne faktore rasta, hormone, somatomedine, eritropoetin, pigmentne hormone, hipotalamusne faktore otpuštanja, antitiuretske hormone, prolaktin, horionski gonadotropin, folikulo - stimulirajući hormon, tiroidno - stimulirajući hormon, prolaktin, tkivni aktivator plazminogena, njihove proteinske antagoniste vezivanja za receptor i slično. Mnogi takvi proteini postoje i u glikoziliranom i u neglikoziliranom obliku. Ne glikozilirani oblici mogu da budu posledica njihove proizvodnje upotrebom rekombinantnih tehnika u prokariotima. Takvi ne glikozilirani proizvodi spadaju među peptide i proteini koje su pogodne biološki aktivne komponente prema predmetnom pronalasku.
Enzimi od interesa obuhvataju enzime specifične za ugljene hidrate, proteolitičke enzime, oksidoreduktaze, transferaze, hidrolaze, liaze, izomeraze i ligaze. Bez ograničavanja na bilo koji poseban enzim preimeri enzima od interesa obuhvataju asparaginazu, arginazu, arginin deiminazu, adenozindeaminazu, superoksid dismutazu, endotoksinazu, katalazu, himotripsin, lipazu. urikazu, adenozin difosfataze, tirosinaze i bilirubin oksidazu. Enzimi specifični za ugljene hidrate, koji su od interesa obuhvataju: oksidazu glukoze, glukozidaze, galaktozidaze, glukocerebrozidaze, glukuronidaze i slično.
Takođe, za upotrebu kao biološki aktivna komponenta u konjugatima prema predmetnom pronalasku pogodno je bilo koje jedinjenje koje pokazuje biološku aktivnost in vivo. Takva jedinjenja obuhvataju bez ograničenja aminokiselinske sekvence, nukleinske kiseline, (DNK, RNK), nukleinske kiseline peptida ("PNK"), fragmente antitela, jednolančane vezujuće proteine (videti npr., Lander, R.C., et al., U.S. patent broj 4,946,778, čiji je opis ovde uključen prema referenci), vezujuće molekule uključujući rastvorljive receptore, poliklonska antitela, monoklonska antitela, katalitička antitela, i proizvode fuzije antitela i njihovih fragmenata.
Proteini ili njihovi delovi mogu da se pripreme ili izoluju upotrebom tehnika koje su poznate u struci, kao što su hemijska sinteza, kultura ćelije, tkiva ili organa, ekstrakcija iz životinjskih izvora, ili upotreba rekombinantne DNK metodologije. Transgeni izvori aminokiselinskih sekvenci, polipeptida i proteina su takođe obuhvaćeni ovim. Takvi materijali mogu da se dobiju iz transgenih životinja, npr., iz miševa, zečeva, svinja, koza i krava, čiji proteini su eksprimirani u mesu. mleku ili tkivima,ili jajima transgenih ptivca. Transgeni insekti i gljive ili ekspresioni sistemi bakulovirusa su takođe ovim obuhvaćeni kao izvori. Štaviše, obimom zaštite prema predmetnom pronalasku obuhvaćene su mutantne verzije proteina.
Drugi proteini od interesa jesu alergeni proteini kao što su ambrozija, Antigen E, otvor medonosne pčele, alergen grinje i slično. Napred navedeni proteini su ilustrativni proteini koji su pogodni za upotrebu prema predmetnom pronalasku. Takođe treba razumeti da se u okviru obima zaštite predmetnog pronalaska nalaze i drugi peptidi, polipeptidi ili proteini ili njihovi fragmenti, koji nisu specifično pomenuti ovde, ali koji poseduju jednu ili više dostupnih aminogrupa ili tiol grupa koje su pogodne za povezivanje sa jednim ili više polimera prema predmetnom pronalasku.
U poželjnom rešenju prema predmetnom pronalasku, jedinjenje koje je sposobno za vezivanje polimera jeste biološki aktivno jedinjenje koje je pogodno za medicinsku ili dijagnostičku upotrebu u tretmanu životinja, npr., sisara, uključujući ljude, zbog stanja usled kojih je takav tretman potreban. Napred navedena lista je samo ilustrativne prirode i nema ograničavajući karakter u odnosu na jedinjenja koja mogu biti modifikovana. Prosečni stručnjak shvata da druga takva jedinjenja mogu na sličan način biti modifikovana bez nepotrebne eksperimentacije.Takođe, treba razumeti da oni biološki aktivni materijali koji nisu specifično pomenuti ali koji poseduju jednu ili više dostupnih nukleotidnih grupa, kao što su aminogrupe ili tiol grupe, koje su dostupne za povezivanje sa jednim ili sa više polimera prema predmetnom pronalasku, takođe se nalaze u okviru obima zaštite predmetnog pronalaska.
Treba napomenuti da biološki aktivne komponente koje su pogodne za inkorporaciju u konjugate prema predmetnom pronalasku, mogu biti supstance ili jedinjenja koja sama po sebi nisu aktivna, dok su u konjugatu ili neposredno nakon hidrolitičkog otpuštanja od konjugata. ali mogu da postanu aktivna nakon prolaska kroz dalju hemijsku obradu ili reakciju. Na primer, antikancerski lek koji se doprema u krvotok u obliku konjugata prema predmetnom pronalasku, može da ostane neaktivan sve do ulaska u kancersku ili tumorsku ćeliju.nakon čega biva aktiviran hemijskim procesom koji se javlja unutar kancerske ili tumorske ćelije, npr., usled enzimske reakcije koja je jedinsktvena za ili posebno efikasna u toj ćeliji.
Druga jedinjenja koja su pogodna za upotrebu kao biološki aktivna jedinjenja u preparatima i konugatima prema predmetnom pronalasku, obuhvataju jedinjenja koja sadrže hidroksilne grupe kao što su kamptotecin i sa njim povezani inhibitori topoizomeraze I. Kamptotecin je u vodi rastvorljivi citotoksični alkaloid koji proizvodi drvoCamptotheca accuminata,koje raste isključivo u Kini, kao i drvećeNothapodytes foetida ,koje raste samo u Indiji. Kamptotecin i povezana jedinjenja i analozi su takođe poznati kao potencijalna antikancerska iiantitumorska sredstva i za njih je pokazano da ispoljavaju ove aktivnosti in vitro i in vio (videti npr., U. S. patente br. 4,943,579; 5,004,758 i Re 32,518, čiji je sadržaj ovde inkorporiran prema referenci). Takva jedinjenja i njihovi derivati mogu da se dobiju korišćenjem poznatih sintetskih tehnika bez nepotrebne eksperimentacije. Poželjni derivati kamptotecina za upotrebu ovde obuhvataju one koji sadrže 20 - OH ili drugu hidroksilnu grupu koja je sposobna za direktnu reakciju sa aktiviranim oblicima polimera kao što su monofunkcionalno aktivirani PEG - ovi prema predmetnom pronalasku.
Dodatna jedinjenja koja sadrže hidroksilnu grupu za upotrebu kao biološki aktivne komponente u predmetnim konjugatima obuhvataju taksane i derivate paklitaksela. Za upotrebu u predmetnom pronalasku pojam "taksan" obuhvata sva jedinjenja u okviru taksanske porodice terpena. Tako, Taxol (paklitaksel), 3' - supstituisani t - butoksikarbonil - aminski derivati (taksoteri) i slični, kao i drugi analozi koji se lako mogu sintetisati korišćenjem standardnih tehnika organske hernije ili koji su dostupni iz komercijalnih iozvora, kao što je Sigma (St. Louis, MO) obuhvaćeni su obimom zaštite prema predmetnom pronalasku. Primećeno je da su ova jedinjenja i njihovi derivati efikasna antikancerska sredstva. Brojne studije ukazuju da ova sredstva poseduju aktivnost protiv brojnih maligniteta i drugih kancera.
Kao što je jasno prosečnom stručnjaku bilo koja biološki aktivna komponenta koja je već poznata i lako dostupna u struci pogodna je za konjugaciju sa monofunkcionalnim polimerima koji poseduju smanjenu antigenost, zančajno smanjenu antigenost ili nedetektabilnu antigenost, shodno predmetnom pronalasku. Shodno određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, ove inicijalne biološki aktivne komponente se koriste za dobijanje konjugata u kojima je jedan ili više PAG - ova ili PAO - va kovalentno povezano sa biološki aktivnim molekulom. Mesta na kojima molekuli inicijalne biološki aktivne komponente mogu biti povezane sa polimerima poželjno obuhvataju lizinske ostatke na peptidnim molekulima od kojih svaki poseduje dve aminogrupe. Jedna od ovih mainogrupa. a - aminogrupa, učestvuje u stvaranju peptidne veze, (izuzev onda kada je lizin aminoterminalni ostatak na proteinu), što čini drugu aminogrupu (epsilon aminogrupu) dostupnom za vezivanje sa polimerom. Druga mesta na molekulima proteina ili peptida za koja polimeri poželjno mogu biti vezani obuvataju, između ostalih a - aminogrupu na aminoterminalnom ostatku polipeptida; sulfhidrilne grupe cisteinskih ostataka na proteinu ili peptidu (Braxton, S. M., U.S. patent broj 5,766,897), sa kojima mogu biti vezani polimeri aktivirani vinilsulfonom, maleimidom, jodoacetamidom, bromoacetamidom, ili ortopiridil disulfidom, između drugih tiol - reaktivnih grupa koje su poznate u struci; guanidino grupe argininskih ostataka na proteinu ili peptidu (Sano, A., et al., U.S. patent broj 5,093,531), koje mogu biti vezani polimeri aktiviranifenilglioksalom; a - karboksilnu grupu na C - terminalnom ostatku, p - karboksilne grupe aspartatskih ostataka na proteinu ili peptidu i y - karboksilne grupe glutamatskih ostataka na proteinu ili peptidu (Sakane, T., et al., 1997., Pharm. Res. 14: 1085 - 1091), za koje mogu da se vežu amino ili hidrazidni derivati polimera. Naravno, prosečnom stručnjaku će biti jasno da postoje i druga pogodna mesta na proteinu ili molekulu peptida za koj apoželjno može da se veže jedan ili više polialkilen oksida, posebno nakon razmatranja primarnih i tercijalnih struktura peptida i ovde navedenih opisa.
Pre vezivanja polimera za ciljnu biološki aktivnu komponentu, npr., protein, može biti poželjno da se komponenta prečisti kako bi se uklonili kontaminanti; u supotnom slučaju analiza stepena modifikacije intaktne komponente može biti komplikovana stvaranjem polimernih konjugata fragmenata komponente i drugih kontaminanata. Prečišćavanje biološki aktivne komponente može biti poželjno bez obzira da li je protein koji treba da se konjuguje dobijen iz prirodnih izvora ili je dobijen rekombinantnim postupcima, jer se pojava kontaminanata u preparatima može očekivati u oba slučaja. Prečišćavanje date biološki aktivne komponente, može da se postigne pomoću bilo koje u struci poznate metode, sa kojom je upoznat prosečan stručnjak, uključujući bez ograničenja, elektroforezu, dijalizu, ekstrakciju soli (kao što je precipitacija sa amonijum sulfatom), hromatografiju (kao što su afinitetna, jonoizmenjivačka, sa ekskluzijom po veličini, tečna hromatografija visokih performansi ("HPLC"), brza proteinska tečna hromatografija ("FPLC") i slične), ili njihove kombinacije, treba razumeti, međutim da prečišćavanje date biološki aktivne komponente nije neophodno za dobijanje konjugata polimera i biološki aktivne komponente prema predmetnom pronalasku, jer biološki aktivne komponente (posebno proteini) u sirovim preparatima takođe mogu biti poželjno konjugovani sa polimerima shodno postupcima prema predmetnom pronalasku.
Vezivanje polimera za biološki aktivne komponente
PAG - ovi koji se koriste u praksi prema predmetnom pronalasku, koji su kao što je gore naznačeno poželjno aktivirani reakcijom sa vezujućom grupom mogu da se prikače za bilo koju od nekoliko grupa koje mogu biti prisutne na molekulu biološki aktivne komponente, npr., za karboksilne ili amino grupe koje nisu uključene u stvaranje peptidnih veza, za tiola grupe i fenolne hidroksilne grupe. Za određene peptide ili proteine poželjno je da aktivirani PAG - ovi budu vezani za N - terminalnu a aminogrupu i/ili za aminogrupe lizinskih ostataka i/ili za sulfhidrilne grupe cisteinskih ostataka.
Sirova ili prečišćena biološki aktivna komponenta (npr., protein), može da se inkubira sa aktiviranim polimerom u puferu čija je pH vrednost u opsegu od oko 11 ili više, pri čemu bilo koja inaktivacija proteina izazvana alkalnošću može da se otkloni, do oko pH vrednosti od 5 ili niže, pri kojoj bilo koja inaktivacija proteina izazvana kiselošću može da se otkloni (videti, Arakavva, T., et al., 1990., Biopolvmers 29: 1065 - 1068). Kao št oje poznato u struci i kao šro prosečan stručnjak jasno zna, upotreba niske pH vrednosti za vezivanje polimera za proteine može biti poželjna za određene proteine ili za herniju određenih veza. Međutim, upotreba veće pH vrednosti može biti poželjna za određene druge proteine i određene druge hernije vezivanje, što zavisi od efekata pH vrednosti na rastvorljivost i stabilnost proteina i na brzinu inaktivacije aktiviranog polimera (bilo daje spontana ili katalizovana od strane samog proteina) u odnosu na brzinu vezivanja polimra za ciljni protein shodno postupcima koji su poznati u struci.
Reakcija između PAG i biološki aktivne komponente se normalno izvodi u rastvoru, poželjno u vodenom puferskom rastvoru, kojim se obezbeđuje pH vrednost od oko 5 do 11. Posebno poželjno za vezivanje PAG za proteinski biološki aktivnu komponentu (npr., za polipeptid, peptid, protein ili njihove fragmente) jesu pH vrednosti od oko 7 do oko 9, najpoželjnije od oko 7 do oko 8. U drugim rešenjima pH vrednosti od oko 4,5 do oko 6,5 su poželjne. Primeri puferskih rastvora koji obezbeđuju pH vrednosti u ovim opsezima na 25 °C obuhvataju, ali nisu ograničeni na: 50 ml 0,1 M kalijum dihidrogen fosfat + 5,6 do 46,1 ml 0,1 M NaOH, razblaženo do 100 ml
50 ml 0,025 M borata +2,0 do 20,5 ml 0,1 M HC1, razblaženo do 100 ml
50 ml 0,025 M borata + 0,9 do 18,3 ml 0,1 M NaOH, razblaženo do 100 ml
50 ml 0,05 M natrijum bikarbonata +0,5 do 10,7 ml 0,1 M NaOH, razblaženo do 100 ml 50 ml 0,05 M sirćetne kiseline + 5,0 do 30 ml 0,1 M NaOH, razblaženo do 100 ml 50 ml 0,05 M Tris HC1 + 10 do 50 ml 0,1 M Tris baze, razblaženo do 100 ml.
Precizno podešavanje količine kiseline ili baze koja treba da se upotrebi kako bi se obezbedila određena željena pH vrednost može lako da se odredi od strane stručnjaka.
Ukoliko u datom slučaju bude potrebna upotreba biološkog pufera, moguće je koristiti sledeće:
Hidroksietilpiperazin - etan sulfonska kiselina ("HEPES")
3 - (N-morfolino)propan sulfonska kiselina ("MOPS")
3 - (N-morfolino) - 2 - hidroksipropan sulfonska kiselina ("MOPSO")
Piperazin - N,N' - bis(2 - hidroksipropan sulfonska kiselina) ("POPSO").
Reakcija između PAG i biološki aktivne komponente poželjno se normalno odvija u uslovima koji ne dovode do inaktivacije ili denaturacije, npr., pri temperaturama na kojima biološki aktivna komponenta zadržava najveći deo biološke aktivnosti i na kojoj nije podložna većoj agitaciji od one koja je potrebna da bi se obezbedilo adekvatno mešanje reaktanata. Reakcije između PAG i biološki aktivnih proteina se poželjno izvodi u opsegu temperature od 4 °C do oko 40 °C. Još poželjnije, reakcija se izvodi na temperaturi od oko 4°C do oko 8 °C ili na sobnoj temperaturi, tj., na temperaturi od oko 20 °C do oko 25 °C. Reakcije između PAG i neproteinskih biološki aktivnih sredstava, npr..peptida i biološki aktivnih organskih hemikalija, mogu da se izvode na nižim ili na višim temepraturama koje su kompatibilne sa stabilnošću određene biološki aktivne organske hemikalije koja se vezuje za PAG.
Stručnjacima je jasno da količina PAG koja se koristi u odnosu na količinu biološki aktivne komponente, zavisi od željenog stepena vezivanja polimera za biološki aktivne komponente. Na primer, onda kada je poželjno da PAg reaguje sa određenom frakcijom lizinskih ostataka koji su dostupni rastvaraču (u slučajevima gde je biološki aktivna komponenta polipeptid), potrebna je molarna koncentracija PAG koja je najmanje jednaka onoj lizina sa kojim treba da se poveže. Jasno je da ukoliko treba da bude derivirano manje, a ne sva reakciona mesta koja su dostupna rastvaraču na molekulu biološki aktivne komponente, biće potrebno u odgovarajućoj meri manje PAG. Generalno, onda kada se koriste PAG - ovi u molarnom višku, podnosioci predmetnog pronalaska su odredili daje poželjan molarni višak reda od 2 do 10.
Vreme koje je neophodno za reakciju zavisi od brojnih faktora kao što je temperatura reakcije, koncentracija reaktanata i stepen derivatizacije koji treba da se postigne. Tok reakcije može da se prati na konvencionalne načine, kao što su periodična analiza uzoraka hromatografijom sa ekskluzijom po veličini ili gel elektroforeza. Reakcija treba da bude okončana onda kada je to poželjno dodavanjem jedinjenja male molekulske mase koja poseduje reaktivnu grupu (npr., glicina), koje bi pokupilo višak sa aminom reaktivnih PAG ili može biti okončana hromatografskim frakcioniranjem. Na sobnoj temperaturi, tipično je potrebno reakciono vreme od oko 15 minuta do oko 24 Čada, kako bi PAG reagovao sa veznim grupama najvećeg dela biološki aktivnih komponenti (npr., sa lizinskim gumama polipeptidnih lanaca). Pri nižim temperaturama, mogu biti potrebna duža vremena reakcije. Iskusni stručnjak razume da vreme potrebno za konjugaciju kao i količine i tip PAG ne srne biti takvo da se inaktivira biološki aktivna komponenta koja se koristi, tj., ne srne doći do pojave značajnog gubitka biološke aktivnosti biološki aktivne komponente. Fraza "koji ne dovodi do značajnog gubitka biološke aktivnosti biološki aktivne komponente" označava da biološki aktivna komponenta koja je konjugovana sa PAG pokazuje najmanje oko 10%, poželjno najmanje oko 20 %, 35 %, 50 %, 75 %. 90 %. 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% ili veći nivo biološke aktivnosti (npr.. enzimske aktivnost; sposobnosti vezivanja za receptor, anti - neoplastične aktivnosti itd.) koji pokazuje in vitro ili in vivo u odnosu na istu biološki aktivnu komponentu koja nije konjugovana sa PAG.
Prečišćavanje biološki aktivne komponente povezane sa polimerom može da se izvede upotrebom konvencionalnih tehnika od strane stručnjaka, kao što su npr., hromatografija sa ekskluzijom po veličini, jonoizmenjivačka hromatografija, ultrafiltracija, dijačiza i slični. Rastvori sa proizvodom reakcije mogu ukoliko je to potrebno biti koncentrovani upotrebom rotacionog isparivača a sam proizvod može da se dobije u obliku suve supstance pomoću liofilizacije.
U zavisnosti od vrste biološki aktivne komponente i stepena u kome je ona reagovala sa PAG, očekuje se da dobijeni adukt bude koristan dijagnostički ili terapeutski, i da pokazuje u poređenju sa ne promenjenom biološki aktivnom komponentom smanjenu aktivnost i imunogenost, povećanje poluživota u cirkulaciji i povećanu stabilnost, uz održavanje korisnog nivoa biološke aktivnosti.
Biološki aktivna komponenta može da reaguje da monofunkcionalno aktiviranim razgranatim poli(tilen glikolni) polimerima koji su opisani gore (posebno sa jednim ili sa više monofunkcionalno aktiviranih, razgranatih dihidroksiPEG - ova sa dihidroksiPEG lizinom) u vodenoj reakcionoj podlozi koja može biti puferovana u zavisnosti od pH vrednosti koju zahteva nukleofil i aktivirani polimer. Optimalna pH vrednost za ovu reakciju se generalno nalazi između 5,5 i 8,5, a poželjno je oko 7,4, za održavanje rastvorljivosti i stabilnosti većine polipeptida. Optimalna pH vrednost za vezivanje aktivirano PAG, npr., NPC - PEG, za sisarsku urikazu je oko 10, dok je optimalana pH vrednost za selektivno vezivanje određenih aktiviranih PAG - ova za N - terminalnu alfa aminogrupu proteina ili peptida u opsegu od 4 do 7. Određivanje optimalnih uslova reakcije koji su potrebni za održavanje stabilnosti biološki aktivne komponente, efikasnosti reakcije itd., nalazi se u kompetenciji prosečnog stručnjaka. Poželjni opseg temperature jeste između 4 °C i 40 °C. Reakciona temepratura ne srne da pređe onu vrednost pri kojoj nukleofil može da se denaturiše ili razloži. Poželjno je da nukleofil reaguje sa viškom aktiviranog razgranatog polimera. Nakon reakcije konjugat se izdvaja i prečišćava, dijafiltracijom, hromatografijom na koloni, kombinacijom prethodnih tehnika i slično.
Upotreba molekulskog modelovanja može da olakša strategiju za optimizaciju vezivanja polimera za protein. Na primer podaci dobij eni kristalografijom rengenskim znacima mogu da se upotrebe za generisanje kompjuterizovanih slika površina proteina koje su dostupne rastvaraču (Sayle. R. A., et al., 1995., Trends Biochem. Sci. 20: 374 - 376). Strukturne analize koje se zasnivaju na merenjima nuklearnom magnetnom rezonancom takođe mogu biti korisne u ovom smislu. Udeo dostupnih mesta na površini sa kojima određeni aktivirani polimer može da reaguje, kao i distribucija polimernih lanaca između različitih mesta može da se moduliše izborom odgovarajuće aktivirajuće grupe, molarnog udela polimera u odnosu na protein i odgovarajućim uslovima reakcije vezivanja (npr., pH vrednosti, temperature, koncentracije reaktanata, trajanja inkubacije). U određenim slučajevima poželjno je da se polimer poveže sa ostacima koji se nalaze na dovoljnoj udaljenosti od aktivnog mesta enzima kako bi se na minimum sveli bilo koji neželjeni efekti na biološku aktivnost. Na primer, površina Proteinaze K sadrži mnoga potencijalna mesta za vezivanje polimera koja su aktivirana različitim hemijskim postupcima. Međutim, ranije je otkriveno od strane predlagača predmetnog pronalaska da je najveći udeo lizinskih ostataka koji su dostupni rastvaraču, na Proteinazi K locirano isključivo u regionu enzima koji je relativno udaljen od katalitičkog mesta, što upotrebu polimera koji su reaktivni prema aminima čini posebno poželjnom za ovaj određeni enzim (videti važeću U. S. patentnu prijavu broj 10/183,607, podnetu juna 2002, čiji je opis ovde inkorporiran u celosti, prema referenci).
U određenim rešenjima, npr., u slučaju enzima čiji kaktalitički domen sarži aminogrupe (kao što su one opisane gore, sa kojima aktivirani polimer može da reaguje) može biti poželjno da se aktivno mesto zaštiti od kontakta sa aktiviranim polimerom. U takvim slučajevima, enzim može biti čvrsto, ali reverzibilno vezan za analog supstrata ili kompetitivni inhibitor koji je dovoljno veliki da sterično spreči pristup aktiviranog polimera reaktivnim ostacima koji se nalaze unutar ili u blizini aktivnog mesta (videti npr., Nahri, L. O., et al., 1991., J. Protein. Chem. 10: 385 - 389). Alternativno, takvi analozi ili inhibitori mogu da se vežu za čvrsti matriks na koji protein naknadno može da bude adsorbovan. Dok je vezan za nastali afinitetni matriks, protein može da reaguje sa aktiviranim polimerom. Ovom strategijom je moguće na minimum svesti vezivanjereaktivnih polimera za mesta na kojima takvo vezivanje može da dovede do inhibicije katalize. Selektivno modifikovani protein može da bude otpušten sa afinitetnog matriksa, postupcima koji su poznati stručnjacima (videti Wilchek, M., et al., 1984., Methods Enzvmol. 104: 3 - 55). Rezultantni konjugati mogu da obuhvataju proteinske molekule na koje je polimer preferencijalno vezan na mestima na kojim ane interferira sa biološkom aktivnošću proteina.
Nakon reakcije vezivanja konjugati koji su derivirani u različitom stepenu mogu da budu razdvojeni jedan od drugog korišćenjem hromatografije sa ekskluzijom po veličini i/ili jonoizmenjivačke hromatografije. kao što je opisano odSherman, M. R., et al., 1997., gore navedeno. NA primer. hromatografija na koloni Superdex® 75 marka HR 10/30 ili na koloni Superdex® 200 marka HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ) omogućava razdvajanje molekula proteina koji su pegilirani u različitom stepenu, kao i njihovo razdvajanje od rezidualnog slobodnog PEG i od najvećeg dela sporednih proizvoda reakcije vezivanja (videti važeću U. S. patentnu prijavu broj 10/183,607, gore navedeno).
Preparati
Predmetni pronalazak obezbeđuje stabilizovane konjugate pegiliranih biološki aktivnih komponenti smanjene antigenosti koji su dobije postupcima prema predmetnom pronalasku. U vezanim rešenjima, oredmetnipronalazak takođe obezbeđuje preparate koji sadrže jedan ili više takvih konjugata. Preparati shodno ovom rešenju predmetnog pronalaska, sadrže jedan ili više, (npr., jedan, dva, tri, četiri, pet, deset, itd., ) gore opisanih konjugata prema predmetnom pronalasku. U takvim određenim rešenjima preparati mogu da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti, kao što su jedna ili više puferskih soli, jedno ili više haotrofnih sredstava, jedan ili više detergenata, jedan il iviše proteina (npr., jedan ili više enzima), jedan ili više polimera i slično. Preparati prema ovom rešenju predmetnog pronalaska mogu da se nalaze u bilo kom obliku, uključujući čvrti oblik, suvi prah, ili rastvor (posebno u obliku fiziološki kompatibilnog puferovanog sonog rastvora, koji sadrži jedan ili više konjugata prema predmetnom pronalasku).
Farmaceutski preparati
Određeni preparati prema predmetnom pronalasku su posebno formulisani kao farmacutski preparati za upotrebu u profilaktičke, dijagnostičke ili terapijske svrhe. Takvi preparati tipičnio sadrže jeadan ili više konjugata prema predmetnom pronalasku i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosilaca ili ekscipijenata. Pojam "farmaceutski prihvatljiv nosilac ili ekscipijent", kao što se ovde koristi, ozančava netoksični čvrsti, polučvrsti ili tečni punilac, diluent, materijal za enkapsulaciju ili pomoćno sredstvo za formulisanje bilo kog tipa koje može biti tolerisano od strane recipijentne životinje, uključujući čoveka ili drugog sisara u čiji se organizam uvodi farmaceutski preparat, bez neželjenih efekata koji mogu da rezultuju njegovim davanjem.
Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se primene kod recipijenta putem bilo kog pogodnog načina primene, kao što je oralni, rektalni, parenteralni, intrasistemski, vaginalni, intraperitonealni, topijski (u vidu praškova, masti, kapljica ili transdermalnih flastera), bukalni način primene, npr., u vidu oralnog ili nazalnog spreja ili inhalacijom. Pojam "parenteralno", kao što se ovde koristi, označava načine primene koji obuhvataju intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, intraperitonealnu, intracisternalnu. subkutanu i intra-artikularnu injekciju i infuziju.
Farmaceutski preparati koji su obezbeđeni predmetnim pronalaskom za parenteralnu injekciju, mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive sterilne vodene ili nevodene raastvore, disperzije, suspenzije ili emulzije, kao i sterilne praškove za rekonstituciju u sterilne injektibilne rastvore ili disperzije neposredno pre upotrebe. Primeri odgovarajućih vodenih i nevodenih nosilaca, diluenata, rastvarača ili vehikuluma uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, poli(etilen glikol) i slični), karboksimetilcelulozu i odgovarajuće njene smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje), kao i injektibilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer. upotrebom oblagajućih materijala kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
Takvi farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku mogu takođe da sadrže adjuvanse, kao što su sredstva za vlaženje. emulgujuća sredstva i dispergujuća sredstva. Sprečavanje nastanka dejstva mikroorganizama može da se osigura uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, npr., parabena, benzil alkohola, hlorobutanola, fenola, sorbinske kiseline i sličnih. Takođe može biti poželjno da budu uključena osmotska sredstva kao što su šećeri, natrijum hlorid i slična. Produžena apsorpcija injektibilnih farmaceutskih oblika može da se ostvariuključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat, hidrogelovi, gelatin.
U nekim slučajevima, kako bi se produžilo dejstvo lekova, poželjno je da se uspori apsorpcija iz subkutane ili intramuskulame injekcije. Ovo može da se postigne korišćenjem tečnih suspenzija, kristalnog ili amorfnog materijala sa malom rastvorljivošću u vodenim telesnim tečnostima. Brzina apsorpcije leka tada zavisi od njegove brzine rastvaranja, koja, sa svoje strane, može da zavisi od njegovog fizičkog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog leka može da se postigne rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljastom vehikulumu.
Injektibilni depo oblici se dobijaju formiranjem mikroenkapsuliranih matrica leka u biološki razgradljivim polimerima, kao što je poliaktid-poliglikolid. U zavisnosti od udela leka i polimernog nosioca, kao i prirode određenog polimernog nosioca koji se koristi, može da se kontroliše brzina otpuštanja leka. Primeri drugih biološki razgradljivih polimera obuhvataju biokompatibilne poli(ortoestre) i poli(anhidride). Injektibilne depo formulacije se takođe dobijaju zatvaranjem leka u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.
Injektibilne formulacije mogu biti stabilizovane, npr., filtracijom kroz filtere koji zadržavaju bakterije, ili inkorporacijom sredstava za formulaciju u obliku sterilnih čvrstih preparata koji mogu biti rastvoreni ili dispegovani u sterilnoj vodi ili u drugim sterilnim injektibilnim podlogama neposredno pre upotrebe.
Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu obuhvataju kapsule, tablete, pilule, praškove i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivna jedinjenja se mešaju sa najmanje
jednim farmaceutski prihvatiljivim ekscipijentom ili nosiocem, kao što su natrijum citrat ili dikalcijum fosfat i/ili sa (a) puniocima ili ekstenderima kao što su škrobovi, laktoza, sukroza, glukoza, manitol i slicijumska kiselina, (b) sa veznicima kao što su, npr., karboksimetilceluloza, alginati, gelatin, polivinilpirolidon, sukroza i guma akacije, (c) sa humektantima kao što je glicerol, (d) sa sredstvima za dezintegraciju, kao što su agar-agar, kalcijum karbonat, škrob krompira ili tapioke, algininska kiselina, određeni silikati i natrijum karbonat, (e) sa sredstvima za održavanje rastvora kao što je parafin, (f) sa akceleratorima apsorpcije, kao što su kvaternerna amonijum jedinjenja, (g) sa sredstvima za vlaženje kao što su, npr., cetil alkohol i glicerol monostearat, (h) sa adsorbentima kao što su kaolin i bentonit glina, kao i (i) sa lubrikantima kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti PEG-ovi, natrijum lauril sulfat, i njihove smeše. U slučaju kapsula tableta i pilula, dozni oblik takođe može da sadrži sredstva za puferovanje.
Čvrsti preparati sličnog tipa mogu da se koriste kao punioci u mekim i čvrstim gelatinskim kapsulama, korišćenjem ekscipijenata kao što je laktoza (mlečni šećer), kao i PEG-ovi visokih molekulskih masa i slično.
Čvrsti dozni oblici tableta, dražeja, kapsula, pilula i granula, mogu da se pripreme sa oblogama i omotačima kao što su enterične ili hronomodulišuće obloge, kao i sa drugim oblogama koje su dobro poznate u struci farmaceutske formulacije. Oni opciono mogu da sadrže sredstva za opacifikaciju, takođe, mogu biti takvog sastava da otpuštaju samo aktivni sastojak ili poželjno da otpuštaju aktivni sastojak u određenom delu gastrointestinalnog trakta, opciono, na odloženi način. Primeri preprata za oblaganje koji mogu da se koriste obuhvataju polimerne supstance i voskove. Aktivna jedinjenja takođe mogu da se nalaze u mikroinkapsuliranom obliku, ukoliko je to poželjno sa jednim ili sa više gore pomenutih ekscipijenata.
Tečni dozni oblici za oralnu primenu obuhvataju farmaceutski prihvatljive emulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Kao dodatak aktivnim jedinjenjima, tečni dozni oblici mogu da sadrže inertne diluente koji se uobičajeno koriste u struci, kao što su na primer, voda ili drugi rastvarači, sredstva za solubilizaciju i emulzifikatori, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetil formamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, masline, ricinusa i sušama), glicerol, tetrahidrofluril alkohol, poli(etilen glikoli) i estri masnih kiselina sorbitana i njihove smeše.
Kao dodatak inertnim diluentima. oralni preparati takođe mogu da sadrže adjuvanse, kao što su sredstva za vlaženje. sredstva za emulgaciju i suspendovanje, zaslađivače, veštačke arome i parfemska sredstva.
Suspenzije, kao dodatak aktivnim jedinjenjima, mogu da sadrže sredstva za suspendovanje, kao što su, na primer, etoksilirani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol, i sorbitan estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar, tragakant, i njihove smeše.
Topijska primena obuhvata primenu na kožu ili sluzokožu, uključujući i površi pluća i oka. Preparati za topijsku primenu, uključujući i one za inhalaciju, mogu da se pipreme kao suvi prašak koji može da bude pod pitiskom ili bez pritiska. U preparatima sa praškom bez pritiska, aktivni sastojski u fino podeljenom obliku mogu da se koriste u smeši sa farmaceutski prihvatljivim inertnim nosiocem sa česticama većeg promera, koji sadrži čestice veličeine do, npr., 100 um u prečniku. Odgovarajući inertni nosioci obuhvataju šećere, kao što su laktoza i sukroza.Poželjno, najmanje 95% (masenih) čestica aktivnog sastojka ima efektivnu veličinu čestica u opsegu od 0,01 do 10 mikrometara.
Alternativno, farmaceutski preparat može biti pod pritiskom i sadržati komprimovani gas kao što je azot ili gasni propelant u tečnom stanju. Podloga propelanta u tečnom stanju, a i ukupni preparat mogu, poželjno, biti takvi da aktivni sastojci ne budu rastvoreni u njima u nekom značajnom stepenu. Preparat pod pritiskom takođe može da sadrži povrđinski ktivno sredstvo. Površinski aktivno sredstvo može biti tečno ili čvrsto ne jonsko, površinski aktivno sredstvo ili može biti čvrsto anjonsko površinsko aktivno sredstvo. Poželjno je da se koristi čvrsto anjonsko površinski aktivno sredstvo u obliku natrijumove soli.
Dalji oblik topijske primene jeste primena na oko. U ovom načinu primene, konjugati i preparati prema predmetnom pronalasku se dopremaju u farmaceutski prihvatljivom oftalmičkom vehikulumu, tako da se aktivna jedinjenja održavaju u kontaktu sa očnom površinom tokom dovoljno dugog vremenskog perioda, da bi se jedinjenjima omogućilo da penetriraju konjuktivu ili rožnjaču i da dospeju do unutrašnjih regiona oka, npr., do prednje komore, zadnje komore, staklastog tela, očne vodice, tečnosti u staklastom telu, do rožnjače, do dužice/ciljanog tela, do sočiva, do sudovnjače / mrežnjače, i do beonjače. Farmaceutski prihvatljivi oftalmički vehikulum može biti, na primer, mast, biljno ulje ili inkapsulirajući materijal.
Preparati za rektalnu ili vaginalnu primenu su poželjno supozitorije koje mogu da se pripreme mešanjem konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku sa odgovarajućim neiritirajućim ekscipijentima ili nosiocima, kao što su buter kakaoa, PEG ili vosak za supozitorije, koji su u čvrstom stanju na sobnoj temperaturi, ali prelaze u tečno stanje na temperaturi tela i stoga se tope u šupljini rektuma ili vagine i otpuštaju lekove.
Farmaceutski preparati koji se koriste u terapijskim postupcima prema predmetnom pronalasku, takođe, mogu da se primene u obliku lipozoma. Kao što je poznato u struci, lipozomi se generalno izvode iz fosfolipida i drugih lipidnih supstanci. Lipozomi se formiraju pomoću mono- ili multi-lamelarnih hidriranih tečnih kristala koji se disperguju u vodenoj podlozi. Može da se upotrebi bilo koji netoksični, fiziološki prihvatljivi lipid koji može da se metaboliše i koji je sposoban da stvara lipozome. Kao dodatak, jednom ili većem broju konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku u obliku lipozoma takođe mogu da sadrže jedan ili više stabilizatora, konzervanasa, ekscipijenata i slično. Poželjni lipidi su fosfolipidi i fosfatidil holini (lecitini), kako prirodni tako i sintetski. Postupci za dobijanje lipozoma su poznati u struci (videti, npr., Zaplinskv, S. et al., U.S. patent broj 5,395,619). Lipozomi koji sadrže fosfolipide koji su konjugovani sa PEG, najčešće sa fosfatidil etanolaminom koji je povezan sa monometoksi-PEG, imaju poželjna svojstva, ukjlučujući produženo vreme poluživota u cirkulaciji sisara (Fisher, D., U.S. patent broj 6,132,763). Još poželjnije, hidroksiPEG-ovi prema predmetnom pronalasku mogu se supstituisati sa mPEG-ovima pri dobijanju takvih PEG-lipozoma. Najpoželjnije, monofukcionlano aktivirani hidroksiPEG-ovi prema predmetnom pronalasku mogu se supstitusati sa aktiviranim mPEG-ovima pri sintezi PEG-diacilglicerola koji treba da bude inkorporiran u PEG-lipozome.
Dozni režimi
Konjugati ili preparati prema predmetnom pronalasku, mogu da se primene in vitro, ex vivo ili in vivo na ćelije kako bi se pospešio ćelijski odgovor na aktivna jedinjenja. Stručnjak zna da efikasne količine datog aktivnog jedinjenja, konjugata ili preparata mogu da se odrede empirijski ili mogu da se odrede u čistom obliku ili, tamo gde takav oblik postoji, u obliku farmaceutski prihvatljive formulacije ili prekursora leka. Jedinjenja, konjugati ili preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se primene kod životinje ili čoveka koji je pacijent i kome su potrebni veterinarski ili farmaceutski preparati u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Treba napomenuti da je prilikom primene kod humanog pacijenta, ukupna dnevna, nedeljna ili mesečna upotreba jedinjenja i preparata prema predmetnom pronalasku određena od strane ordinirajućeg lekara, na osnovu racionalnog medicinskog rasuđivanja. Nivo terapijski efikasne doze za bilo kog određenog pacijenta zavisi od mnoštva činilaca uključujući tip i stepen ćelijskog odgovora koji treba da se postigne; identitet i/ili aktivnost specifičnih jedinjenja, konjugata ili preparata koji se koriste; starosnu dob, telesnu masu ili površinu tela, opšte zdravstveno stanje, pol, način ishrane i nivo aktivnosti pacijenta; vreme primene, način primene i brzinu ekskrecije aktivnih jedinjenja; trajanje tretmana; primene drugih lekove koji se koriste u kombinaciji ili zajedno sa specifičnim jedinjenjima, konjugatima ili preparatima; kao i druge slične faktore koji su dobro poznati prosečnom stručnjaku u farmaceutskoj i medicinskoj struci. Na primer, u okviru kompetencije stručnjaka jeste da se počne sa nivoima doza datog jedinjenja, konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, koji su manji od onih koji su potrebni za postizanje željenog terapijskog efekta, i da se postepeno povećavaju doze do postizanja željenog efekta.
Dozni režimi, takođe mogu da budu organizovani na način koji je specifičan za pacijenta, kako bi se obezbedila prethodno određena koncentracija datog aktivnog jedinjenja u krvi, što se određuje tehnikama koje su prihvaćene i koje su rutinske u struci, npr., upotrebom hromatografije sa ekskluzijom po veličini, jonoizmenjivačke hromatografije ili HPLC reverzne faze. Stoga, dozni režimi kod pacijenata mogu da se podese tako da se postignu relativno konstantni nivoi jedinjenja u krvi, što se određuje upotrebom HPLC, shodno postupcima koji su rutinski i poznati prosečnom stručnjaku u medicinskoj, farmaceutskoj i/ili farmakološkoj struci.
Dijagnostičke i terapijske upotrebe
Dijagnostička upotreba konjugata prema predmetnom pronalasku može da obuhvati lociranje antigenih molekula, npr., kancera, koji se nalazi u telu životinje, posebno čoveka, primenom antitela konjugovanog sa polimerom prema predmetnom pronalasku, pri čemu je konjugat obeležen bilo na proteinskoj ili polimernoj komponenti kako bi se omogućila detekcija, npr., optička, radiometrijska, fluoroscentna ili rezonantna detekcija, kao što je opisano ispod.
Očekuje se da konjugati PAG i biološki aktivne komponente (koji su poželjno primenjeni u vidu preparata koji sadrže takve konjugate) prema predmetnom pronalasku poseduju mnogo duže poluživote u cirkulaciji i smanjenu antigenost i imunogenost in vivo. Ova svojstva umanjuju ili ublažavaju brzi klirens iz cirkulacije koji je primećen onda kada se brojna terapijska jedinjenja (posebno biološki aktivna jedinjenja, kao što su ona koja se koriste kao komponente u konjugatima prema predmetnom pronalasku) unose u organizam životinje, posebno u organizam čoveka ili sisara, u terapijske svrhe. Upotreba konjugata i preparata prema predmetnom pronalasku takođe umanjuje ili eliminiše strepnje u vezi ponavljane primene određenog biološki aktivnog jedinjenja ili komponente, koje inače izaziva imuni odgovor kod pacijenta. Imuni odgovori od značaja obuhvataju one koji neutrališu biološku aktivnost i/ili koji povećavaju brzinu klirensa biološki aktivnog jedinjenja iz cirkulacije (čime se smanjuje efikasnost dijagnostičkog ili terapijskog postupka), kao i one koji izazivaju neželjene efekte kod pacijenta.
Stoga, u drugom aspektu predmetnog pronalaska, konjugati i preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u dijagnostičkim ili terpijskim postupcima, na primer, u dijagnostikovanju, tretiranju ili sprečavanju nastanka mnoštva fizičkih poremećaja kod životinje, posebno kod sisara kao što je čovek, koja je predisponirana za nastanak ili koja pati od takvog poremećaja. U takvim pristupima, cilj terapije jeste da se uspori ili spreči pojava razvoja poremećaja i/ili da se izleći ili indukuje remisija poremećaja i/ili da se smanje ili minimalizuju sporedni efekti drugih terapijskih režima. Stoga, konjugati i preparati PAG i biološki aktivne komponente prema predmetnom pronalasku mogu da se upotrebljavaju za zaštitu od, supresiju ili tretman fizičkih poremećaja, kao što su infekcije ili bolesti. Pojam "zaštita" od fizičkog poremećaja, kao što se ovde koristi, obuhvata pojmove "sprečavanje nastanka", "supresija", "tretman". Pojam "sprečavanje nastanka" podrazumeva primenu konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku pre indukcije oboljenja ili fizičkog poremećaja, dok pojam "supresija" podrazumeva primenu konjugata ili preparata pre kliničke pojave oboljenja; stoga, pojmovi "sprečavanje nastanka" i "supresija" fizičkog poremećaja se tipično koriste kod životinje koja je predisponirana ili podložna razvoju poremećaja, ali koja još uvek ne boluje od njega. Pojam "tretman" fizičkog poremećaja, međutim, obuhvata primenu terapeutskog konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku nakon pojave oboljenja. Treba napomenuti da kod čoveka, kao i u veterinarskoj medicini, nije uvek moguće praviti razliku između "sprečavanja nastanka" i "supresije" fizičkog poremećaja. U mnogim slučajevima, krajnji induktivni događaj ili događaji mogu biti nepoznati ili latentni, tako da ni pacijent, ni lekar ne moraju biti svesni induktivnog događaja, sve do pojave oboljenja. Stoga, uobičajeno je da se koristi pojam "profilaksa", koji se razlikuje od pojma "tretman", kako bi se obuhvatili pojmovi "sprečavanje nastanka" i "supresija", na način na koji su definisani ovde. Zato pojam "zaštita", koji se koristi shodno postupcima prema predmetnom pronalasku, ima značenje koje obuhvata pojam "profilaksa".
Postupci prema ovom rešenju predmetnog pronalaska, mogu da sadrže jedan ili više koraka koji dozvoljavaju lekaru da postigne gore opisane terapijske ciljeve. Jedan takav postupak prema predmetnom pronalasku, obuhvata, na primer: (a) identifikaciju životinje (poželjno sisara, kao što je čovek), koji pati od ili koji je predisponiran za nastanak fizičkog poremećaja; i (b) primenu kod životinje efikasne količine jednog ili više jedinjenja ili preparata prema predmetnom pronalasku koji su opisani ovde, posebno jednog ili više konjugata PAG sa biološki aktivnom komponentom (ili jednog ili više farmaceutskih preparata koji sadrže takve konjugate), tako da ta primena jedinjenja ili preparata sprečava nastanak, odlaže ili dijagnostikuje razvoj, ili leči ili indukuje remisiju fizičkog poremećaja kod životinje.
Kao što se ovde koristi, životinja koja je "predisponirana za razvoj" fizičkog poremećaja, po definiciji jeste životinja koja ne pokazuje mnoštvo ispoljenih fizičkih simptoma poremećaja, ali koja je genetski, fiziološki ili na neki drugi način pod rizikom za razvoj poremećaja. U postupcima prema predmetnom pronalasku, identifikacija životinje (kao što je sisar, uključujući čoveka) koja je predisponirana za razvoj, koja ima rizik za razvoj ili koja pati od datog fizičkog poremećaja, može da se postigne upotrebom standardnih u struci poznatih opstupaka koji su poznati prosečnom lekaru, uključujući, na primer, radiološke testove, biohemijske testove (npr., testove relativnih vrednosti određenih peptida, proteina, elektrolita itd., u uzorku kojije dobijen od životinje), hirurške postupke, genetske pretrage, porodičnu anamnezu, fizičku palpaciju, patološke ili histološke testove (npr., mikroskopsku procenu tkiva ili uzoraka telesnih tečnosti ili briseva, zatim imunološki testovi, itd.,), ispitivanje telesnih tečnosti (npr., krvi, seruma, plazme, cerebralne tečnosti, urina, pluvačke, sperme i si.,), tehnike slikanja (npr., radiološkog, fluoroscentnog, optičkog, rezonantnog slikanja, (npr., korišćenjem nuklearne magnetne rezonance (NMR) ili rezonance elektronskog spina (ESR)), itd. Kada je životinja identifikovana primenom jednog ili više ovih postupaka, ona se može agresivno i/ili proaktivno tretirati da bi se sprečio nastanak, suprimirao, odložio ili izlečio fizički poremećaj.
Fizički poremećaji, čiji nastanak može da se spreči, koji mogu da se dijagnostikuju ili leče konjugatima, preparatima i postupcima prema predmetnom pronalasku, obuhvataju sve fizičke poremećaje kod kojih biološki aktivna komponenta konjugata može da se koristi u sprečavanju njihovog nastanka, u njihovoj dijagnozi ili tretmanu. Ovi poremećaji obuhvataju, bez ograničenja, različite kancere (npr., kancere dojke, kancere materice, kancere jajnika, kancere prostate, kancere testisa, leukemije, limfome, kancere pluća, neurološke kancere, kancere kože, kancere glave i vrata, kancere kosti, kancere debelog creva i druge gastrointestinalne kancere, kancere pankreasa, kancere mokraćne bešike, kancere bubrega i druge karcinome, sarkome, adenome i mijelome); infektivna oboljenja (npr., bakterijska oboljenja, gljivična oboljenja, virusna oboljenja (uključujući hepatitis i HIV/SIDA), parazitska oboljenja i slična); genetske poremećaje
(npr.. cističnu fibrozu, amiotrofičnu lateralnu sklerozu, mišićnu distrofiju, Gošeovu bolest, Pompovu bolest, ozbiljni kombinovani imunodeficijentni poremećaj i slično), anemiju, neutropeniju, hemofiliju i druge poremećaje krvi; neurološke poremećaje (npr., multiplu sklerozu i Alchajmerovu bolest); enzimske poremećaje (npr., giht, uremiju, hiperholesterolemiju i slične); poremećaje neodređene (npr., kardiovaskularne bolesti, hipertenziju i slične); kao i druge poremećaje od medicinskog značaja, sa kojima je upoznat prosečan stručnjak. Preparati i postupci prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se upotrebe u sprečavanju nastanka progresije bolesti, kao, na primer, u hemoprevenciji progresije premalignih lezija u maligne lezije.
Terapeutski postupci prema predmetnom pronalasku, stoga, koriste jedan ili više konjugata prema predmetnom pronalasku, ili jedan ili više farmaceutskih preparata prema predmetnom pronalasku, koji mogu da se primene kod životinje koja ima potrebu za njihovom upotrebom na mnogo načina, uključujući oralnu, rektalnu, parenteralnu (uključujući intravensku, intra-muskularnu, intra-peritonealnu, intra-cistenalnu, subkutanu, i intra-artikularnu injekciju i infuziju), intrasistemsku, vaginalnu, intraperitonealnu, topijsku (u vidu praškova, masti, kapljica, ili transdermlnih flastera), bukalnu primenu, kao i primenu oralnih ili nazalnih sprejeva ili inhalaciju. Prema predmetnom pronalasku, efikasna količina konjugata ili preparata, može da se primeni in vitro, ex vivo, ili in vivo na ćelije ili na životinje koje pate od ili su predisponirane za nastanak određenog poremećaja, čime se sprečava nastanak, odlaže, dijagnostikuje ili leči poremećaj kod životinja. Kao što se ovde koristi pojam "efikasna količina konjugata (ili preparata)" odnosi se na količinu koja omogućava da konjugat ispoljava biološku aktivnost biološki aktivne komponente konjugata, čime se sprečava nastanak, odlaže, dijagnostikuje, tretira ili leči fizički poremećaj kod životinje kojoj je dat konjugat prema predmetnom pronalasku. Stručnjak razume da efikasne količine konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, mogu da se odrede empirijski, upotrebom standardnih postupaka, koji su dobro poznati prosečnom stručnjaku u farmaceutskoj ili medicinskoj struci; videti, na priemer, Beers, M.H., et al., urednici, 1999, Merck Manual of Diagnosis and Therapv, 17. izdanje, Merck and Co., Rahway, NJ; Hardman, J.G., et al., urednici, 2001, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10. izdanje, McGraw-Hill Medical Publishing Division, Nju Jork; Speight, T.M., et al., urednici, 1997, Averv's Drug Treatment, 4. izdanje, Aids International, Auckland, Novi Zeland; Katzung, B.G., 2000, Basic and Clinical Pharmacologv, 8. izdanje, Lange Medical Books/McGraw-hill, Nju Jork; koje su sa sve svojim referencama ovde inkorporirane u celosti. prema referenci.
Treba razumeti da kada se primeni kod humanog pacijenta, ukupna dnevna, nedeljna ili mesečna doza konjugata i preparata prema predmetnom pronalasku, određena je od strane ordinirajućeg lekara na osnovu racionalnog medicinskog rasuđivanja. Na primer, zadovoljavajući rezultari se dobijaju primenom određenih konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, u odgovarajućim dozama koje zavise od specifičnog biološki aktivnog jedinjenja koje se koristi, pri čemu su doze poznate ordinirajućem stručnjaku ili se mogu lako odrediti empirijski korišćenjem samo rutinske eksperimentacije. Shodno ovom aspektu predmetnog pronalaska, konjugati ili preparati mogu da se primene jednom ili u podeljenim dozama, npr., jednom ili dva puta dnevno, jednom ili dva puta nedeljno ili jednom ili dva puta mesečno. Odgovarajući dozni režimi za različite načine primene (npr., za parenteralnu, subkutanu, intramuskularnu, intraokularnu, intranazalnu primenu, itd.) mogu takođe lako da se odrede empirijski, korišćenjem samo rutinske eksperimentacije ili su već poznati ordinirajućem lekaru, a u zavisnosti od identiteta biološki aktivne komponente.
U dodatnim rešenjima, konjugati i preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste da bi specifično usmerili dijagnostičko ili terapeutsko sredstvo do ćelije, tkiva, organa ili organizma, koji eksprimira receptor, koji vezuje, inkorporira ili na drugi način preuzima biološki aktivnu komponentu konjugata. Postupci prema ovom rešenju predmetnog pronalaska obuhvataju, na primer, uspostavljanje kontakta ćelije, tkiva, organa ili organizma sa jednim ili više konjugata prema predmetnom pronalasku, pri čemu ti konjugati dodatno sadrže još jedno ili više dijagnostičkih ili terapeutskih sredstava (koja su poželjno kovalentno povezana sa PAO ili PEG komponentom konjugata), tako da konjugat budu preuzet od strane ćelije, tkiva, organa ili organizma bilo kojim mehanizmom (npr., receptorski posredovanom endocitozom, pinocitozom, fagocitozom, diguzijom, itd.), čime se doprema dijagnostičko ili terapeutsko sredstvo do ćelije, tkiva, organa ili organizma. Dijagnostičko ili terapijsko sredstvo koje se koristi shodno ovom rešenju predmetnog pronalaska može, biti bez ograničenja, najmanje jedno sredstvo koje je izabrano iz grupe koju čine nukleinska kiselina, organsko jedinjenje, protein, antitelo, enzim, glikoprotein. lipoprotein, neki element, lipid, saharid, izotop, ugljeni hidrat. kontrastno sredstvo, detektabilna proba ili bilo koja njihova kombinacija, koje može biti obeleženo na detektibilan način, kao što je ovde opisano. Terapijsko sredstvo koje se koristi u ovom aspektu predmetnog pronalaska može da ispolji terapijski efekat na ciljnu ćeliju (ili tkivo, organ ili organizam), pri čemu je efekat izabran iz grupe koju čine, bez ograničenja, korekcija defektnog gena ili proteina, dejstvo leka, toksični efekat. efekat stimulacije rasta, efekat inhibicije rasta, metabolički efekat, katabolički efekat, anabolički efekat, antivirusni efekat. antifungalni efekat, antibakterijski efekat, hormonski efekat, neurohumoralni efekat, stimulatorni efekat na diferencijaciju ćelije, inhibitorni efekat na diferencijaciju ćelije, neuromodulatorni efekat, antineoplastični efekat, anti - tumorski efekat, efekat stimulacije ili inhibicije insulina, efekat stimulacije koštane srži, efekat stimulacije pluripotentne matične ćelije, efekat stimulacije imunog sistema, kao i bilo koje drugi poznati terapijski efekat koji može da bude obezbeđen terapijskim sredstvom koje se dopremi do ćelije (ili tkiva, organa ili organizma) putem sistema za dopremanje shodno ovom rešenju prema predmetnom pronalasku.
Takva dodatna terapijska sredstva, koja dalje mogu da sadrže biološki aktivni konjugat ili preparat prema perdmetnom pronalasku, mogu da se izaberu iz grupe koju čine, bez ograničenja, poznata ili nova jedinjenja ili preparati uključujući antibiotike, steroide, citotoksična sredstva, vazoaktivne lekove, antitela i druga terapijska sredstva. Neograničavajući primeri takvih sredstava obuhvataju antibiotike i druge lekove koji se koriste u tretmanu bakterijskog šoka, kao što su gentamicin, tobramicin, nafcilin, parenteralni cefalosporini, itd.; adrenalne kortikosteroide i njihove analoge, kao što je deksametazon, koji sprečava ćelijsku ozledu izazvanu endotoksinima; vazoaktivne lekove, kao što su blokatori a-adrenergičnih receptora (npr., fenoksibenzamin), agonisti (3-adrenergičkih receptora (npr., izoproterenol) i dopamin.
Konjugati, kompleksi i preparati prema predmetnom pronalasku mogu takođe da se koriste za dijagnozu oboljenja i za praćenje terapijskog odgovora. U određenim takvim postupcima, konjugati prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže jednu ili više detektabilnih oznaka (kao što su one koje su opisane na drugom mestu ovde). U takvim specifičnim postupcima ovi detektabilno obeleženi konjugati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za detekciju ćelija, tkiva, organa ili organizama, koji eksprimiraju receptore ili koji na drugi način preuzimaju biološki aktivnu komponentu konjugata. U jednom primeru takvog postupka, ćelija, tkivo, organ ili organizam uspostavlja kontakt sa jednim ili sa više detektibilno obeleženih konjugata prema predmetnom pronalasku, u uslovima koji pospešuju preuzimanje konjugata od strane ćelije, tkiva, organa ili organizma (npr., vezivanjem konjugata za receptor na površini ćelija ili pinocitozom ili difuzijom konjugata u ćeliju), a zatim se detektuje konjugat koji je vezan ili inkorporiran u ćeliju korišćenjem načina za detekciju koji je specifičan za oznaku koja je upotrebljena (npr., fluoroscentna detekcija za fluorescentno obeležene konjugate; snimanje magnetnom rezonancom za magnetno obeležene konjugate; radio snimanje za radio obeležene konjugate; itd.). Druge upotrebe takvih detektabilno obeleženih konjugata mogu da obuhvate, na primer, snimanje ćelije, tkiva, organa ili organizma ili unutrašnje strukture životinje (uključujući čoveka) primenom efikasne količine obeleženog oblika jednog ili više konjugata prema predmetnom pronalasku i merenjem detektabilne radijacije koja je udružena sa ćelijom, tkivom, organom ili organizmom (ili životinjom). Postupci detekcije različitih tipova oznaka i njihova upotreba pri dijagnostičkim i terapijskim snimanjima je dobro poznata prosečnom stručnjaku i opisana je na drugom mestu ovde.
U drugom rešenju, konjugati i preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u postupcima za modulaciju koncentracije ili aktivnosti specifičnih receptora za biološki aktivnu komponentu konjugata na površini ćelije koja eksprimira takav receptor. Pod pojmom "moduliranje" aktivnosti datog receptora podrazumeva se da konjugat nakon vezivanja za receptor ili aktivira ili inhibira fiziološku aktivnost (npr., intracelularnu signalnu kaskadu) koja je posredvana receptorom. Iako nije namera da se vezujemo za bilo koje posebno mehanicističko objašnjenje regulatorne aktivnosti konjugata prema predmetnom pronalasku, navedeni konjugati mogu da antagonizuju fiziološku aktivnost ćelijskog receptora vezivanjem za receptor putem biološki aktivne komponente konjugata, čime se blokira vezivanje prirodnog agoniste (npr., nekonjugovane biološki aktivne komponente) i čime se sprečava aktivacija receptora prirodnim agonistom, pri čemu ne dolazi do indukcije značajne aktivacije fiziološke aktivnosti samog receptora. Postupci prema ovom rešenju predmetnog pronalaska mogu da obuhvate jedan ili više koraka, na primer, uspostavljanje kontakta ćelije sa jednim ili sa više konjugata prema predmetnom pronalasku (što može da se uradi in vitro ili in vivo), u uslovima u kojima se taj konjugat (tj., biološki aktivna komponenta konjugata) vezuje za receptor biološki aktivne komponente na ćelijskoj površini, ali ne dovodi do značajne aktivacije receptora. Takvi postupci su korisni u brojnim dijagnostičkim i terapijskim primenama, što je poznato prosečnom stručnjaku.
Kompleti
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete koji sadrže konjugate i/ili preparate prema predmetnom pronalasku. Takvi kompleti obično sadrže nosilac, kao što je kutija, kartonska kutija, tuba ili slično, u kome je dobro zatvoren jedan ili više kontejnera, kao što su bočice, tube, ampule, boce i slično, pri čemu prvi kontejner sadrži jedan ili više konjugata i/ili preparata prema predmetnom pronalasku. Kompleti koji su obuhvaćeni ovim rešenjem prema predmetnom pronalasku, mogu dalje da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti (npr., reagense i jedinjenja) koji su neophodni za izvođenje jedne ili više posebnih primena konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, tako da je jedna ili više tih komponenti od koristi za dijagnostikovanje, tretman ili sprečavanje nastanka određenog jedinjenja ili fizičkog poremećaja (npr., sadrži jedno ili više dodatnih terapijskih jedinjenja ili preparata, jedan ili više dijagnostičkih reagenasa, jedan ili više nosilaca ili ekscipijenata, i tome slično), jedan ili više dodatnih konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, i tome slično.
Prosečnom stručnjaku je jasno da druge odgovarajuće adaptacije i modifikacije postupaka i primena koje su ovde opisane mogu da se naprave bez odstupanja od obima zaštite predmetnog pronalaska ili bilo kog njegovog rešenja. Pošto je sada detaljno opisan predmetni pronalazak, isti će biti jasnije shvaćen referenciranjem na primere koji slede, koji su ovde ukjlučeni isključivo u cilju ilustracije i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.
Primeri
Primer 1: Dobijanje i ispitivanje antitela za monometoksiPEG
Ranije je saopšteno da zegevi mogu biti imunizovani na različite PEG - ove, imunizacijom životinja konjugatima u kojima je PEG povezan sa imunogenim proteinom nosiocem (Richter, A. W., et al., 1983, Int. Arch. Allergv Appl. Immunol. 70: 124 - 131). Monoklonalano antitelo koje reaguje sa monoetarskim skeletom PEG razvijeno je injektiranjem u organizam miševa. mPEG konjugata (3 - glukuronidaze i izborom hibridonskih klonova koji proizvodi antitela specifična za PEG (Cheng, T. -L. et al., 1999. gore navedeno; Cheng T. -L. et al., 2000, gore navedeno; Tsai, N. M. et al., 1999., gore navedeno; Roffler, S., et al., objavljena U. S. patentna prijava broj 2001/0028881 Al i U. S. patenti broj 6,596,849 i 6.617,118; čiji su opisi ovde uključeni u celosti, prema referenci). Drugo monoklonalno antitelo koje reaguje sa monoetarskim skeletom PEG je u skorije vreme opisano od strane Roberts, M. J. et al., u U. S. patentnoj prijavi broj 2003/001704 Al.
U cilju razvijanja senzitivnih postupaka za detekciju PEG u konjugatima proteina i PEG, dobijena su poliklonska antitela protiv PEG, kao što je opisano u tekstu koji sledi. S obzirom da skoro svi PEG konjugati terapeutskih proteina koji su opisani u struci jesu sintetisani sa mPEG, predlagači predmetnog pronalaska su ispitivali ulogu metoksil grupe u imunoreaktivnosti konjugata koji sadrže PEG. p - nitrofenil derivat mPEG od 10 kDa je obično sintetisan od strane Shearwaters Corporation (Huntsville, AL) koja je podružnica kompanije Nektar Therapeutics (San Carlos, CA). mPEG konjugat povezan uretanom rekombinantne sisarske urikaze dobij en je tako da sadrži minimalni broj lanaca ovog mPEG od 10 kDa koji su potrebni da se protein rastvori pri fiziološkoj pH vrednosti (otprilike dva lanca PEG ili mPEG po podjedinici urikaze od 35 kDa). Ova količina PEG nije bila dovolkjna da se suprimira neobično visoka imunogenost urikaze (videti Sherman, M. R., et al., PCT publikacija WO 01/59078 A2 i Kelly, S. J., et al., 2001, gore navedeno, čiji je opis ovde inkorporiran prema referenci u celosti). Ovaj preparat PEG - urikaza je injektiran više puta u tri zeca sa dodatkom Freund - ovog adjuvansa, nakon čega su iz zečeva uzimani uzorci krvi radi dobijanja seruma koji sadrži poliklonska antitela protiv urikaze, PEG - urikaza konjugata i protiv PEG.
Svakom zecu je injektiran preparat PEG - urikaza po jednom u kompletnom Freund - ovom adjuvansu, kao i pet puta u intervalima od jedne do četiri nedelje u nekompletnom Freund - ovom adjuvansu. Uzorci krvi su uzimani otprilike dve nedelje nakon svake od poslednje tri injekcije. Serum je dobijen iz svakog od devet uzoraka krvi, a male zapremine seruma su ispitivane na prisustvo natitela protiv PEG, upotrebom sa enzimom povezanog imunosorbentnog testa (ELISA), korišćenjem ploča od 96 polja koje su obložene sa mPEG konjugatima proteina koji strukturno nije povezan sa urikazom.
Pri svakom uzimanju uzoraka krvi dobijen je antiserum koji je reagovao sa PEG u ELISA analizama. Svaki od tri zeca je reagovao na imunizaciju sa PEG sa kvalitativno sličnom kinetikom i sa sličnom specifičnošću za krajnju metoksil grupu mPEG, što je mereno upotrebom kompetitivnog ELISA. Inicijalno, dot blot analiza je izvedena kako bi se ispitala senzitivnost anti - PEG antitela u serumima zečeva. RAstvori PEG - ova, različitih veličina i struktura i rastvor PEG urikaze koji je korišćen za imunizaciju zečeva naneti su na poliviniliden difluoridnu blotting membranu (Invitrogen, Carlsbad, CA; kataloški broj LS2002). Posle blokranja membrane rastvorom od 2% (w/w) nemasnog suvog mlečnog praha membrana je inkubirana sa razblaženjem zečijeg seruma prema PEG - urikazi, koji je dobijen kao što je opisano gore. Tada je kao sekundarno antitelo primenjeno razblaženje anti - zečijih antitela, dobijenih u kozama koja su povezana sa alkalnom fosfatazom (Calbiochem, San Diego, CA; kataloški broj 401371). Aktivnost alkalne fosfataze u toku analize je detektovana korišćenjem kombinacije 5 - bromo - 4 - hloro - 3 - idolil fosfata i azot - plavo - tetrazolijuma (Sigma, kataloški broj B - 1911) kao što je prethodno opisano (Blake, M. S. et al., 1984. Anal. Biochem. 136: 175 - 190, čiji je opis ovde inkorporiran prema referenci u celosti). Zečija anti - PEG - antitela su detektovala sa visokom senzitivnošću i specifičnošću PEG rastvore i mPEG proteinske konjugate koji su ispitivani.
Primer 2: Pokazivanje uloge metoksil grupe u antigenosti mPEG
Neočekivano, predlagači predmetnog pronalaska su pronašli sa anti - PEG antitela koja su dobijena kao što je opisano u Primeru 1, predominantno su usmerena protiv krajnje metoksil grupe na mPEG komponenti antigena. Slika 1 opisuje rezultate dobijene kompetitivnim ELISA testom u kome su ploče sa 96 polja obložene sa mPEG konjugatom proteina koji je strukturno ne povezan sa urikazom. Nakon blokiranja ploče sa dvoprocentnim kozijim serumom dodavani su rastvori sa rastućom koncentracijom mPEG od 4,8 kDa (Polymer Laboratories, kataloški broj 6570 - 5010), mPEG od 10 kDa (Union Carbide, kataloški broj MPEG - 10000) ili t - butoksiPEG od 10 kDa (Polvmer Laboratories, kataloški broj 2999 - 9997) nakon čega je usledila inkubacija sa razblaženjem od 1/1000 zečijeg antiseruma dobijenog imunizacijom na konjugata mPEG urikaze. Nakon uklanjanja rastvora, stepen anti - PEG antitela koje je vezano za konjugat mPEG protein na ploči meren je spektrofotometrijski korišćenjem sekundarnog antitela koje je konjugovano sa peroksidazom (koziji anti - zečiji IgG, Calbiohem®, San Diego, CA., kataloški broj 401393), nakon čega je dodat supstrat za peroksidazu 0 - fenilendiamin dihidrohlorid (Sigma, St. Louis, MO; kataloški broj P - 9781). Za svaki od uzoraka inicijalna brzina reakcije (izražena u milijedinicama apsorbancije po minuti) koja je primećena u odsustvu kompetitora, označena je kao 100%. Preklapajuće krive dva rastvora mPEG sugerišu da dužina skeleta PEG nije odlučujuća determinanta njegove antigenosti. Kriva t - butoksiPEG je pomerena u desno za otprilike 2 log jedinice, što pokazuje da t - butoksi PEG poseduje oko 100x niži afinitet za antitela dobijena protiv mPEG proteinskog konjugata. U ranijim neobjavljenim eksperimentima nekih predlagača predmetnog pronalaska, nađeno je da t - butoksiPEG pokazuje značajnu imunogenost kada je konjugovana sa imunogenim proteinaom. Stoga, iako Slika 1 pokazuje veoma malu ulaštenu reaktivnost t - butoksiPEG sa antitelima specifičnim prema mPEG, upotreba te PEG umesto mPEG u dobijanju pegiliranih terapeutskih proteina ne bi rešila problem imunogenosti PEG komponente.
Rezultati koji su prikazani na Slici 1 sugerišu da je metoksil grupa na PEG glavna antigena grupa na molekulu polimera. Da bi se potvrdilo ovo mišljenje antitela koja su bobijena kao što je opisano u Primeru 1, podvrgnute su kompetitivnoj ELISA analizi koja je izvedena kao što je opisano na Slici 1. korišćenjem PEG - ova različitih veličina i struktura koje sadrže jednu ili dve metoksil grupe. Slika 2a pokazuje rezultate vezivanja antitela u vidu grafikona koji je u funkciji molorne koncentracije metoksil grupa u svakom uzorku. Koncentracija kompetitora koja je dovela do inhibicije od 50% u vezivanju (IC50) je izračunata korišćenjem jednačine za petoparametarsku sigmoidnu krivu programa SigmaPlot® (SPSS Science. Chicago. IL).
Kao što je prikazano u Slici 2a. sci sledeći PEG - ovi su imali sličnu antigenost na molarnoj osnovi: linearni PEG - ovi sa jednom metoksil grupom (mPEG od 10 kDa, dobijeni hidrolizom mPEG - NPC (PEG - Shop) i "mono - 20 kDa mPEG - lizin", koji je sintetisan vezivanjem lizina za NPC - PEG od 20 kDa (Sheanvater, kataloški broj M - NPC - 20000); linearni PEG sa dve metoksil grupe ("bis - (2-kDa) mPEG" (Sigma - Aldrich, kataloški broj 81314)) i veliki "razgranati" PEG koji sadrži dve metoksil grupe ("di - (20 - kDa) mPEG - lizin" (Shearvvater, kataloški broj PEG2 - NHS - 40K)). Nasuprot ovome, kriva za manji razgranati PEG sa dve metoksil grupe ("di - (5 - kDa) mPEG - Lizin" (Shearvvater, kataloški broj 2Z3X0L01)) je bila pomerena ulevo od srednje vrednosti rezultata za druge uzorke za 0,5 do 0,6 log jedinica, što pokazuje daje ovaj oblik razgranatog mPEG poseduje tri do četiri puta veću antigenost u odnosu na druge ispitivane uzorke u ovom eksperimentu. Slika 2b prikazuje podatke iz Slike 2a u funkciji masene koncentracije mPEG ( ug/ml) umesto u funkciji molarne koncentracije metoksil grupa, što podržava zaključak da je metoksi grupa ona koja je kritičana za interakciju mPEG sa anti - mPEG antitelima.
Slika 3 prikazuje podgrupu podataka sa Slika 1, 2a i 2b u obliku koji prikazuje direktnu zavisnost antigenosti od broja metoksil grupa po molekulu PEG. Ovi uzorci predstavljaju PEG - ove od 10 kDa bez metoksil grupe (t - butoksiPEG od 10 kDa), sa jednom metoksil grupom (mPEG od 10 kDa) ili sa dve metoksil grupe (di - (5kDa) mPEG - lizin). Rezultati pokazuju da je antigenost datog polimera, a samim tim i konjugata prema predmetnom pronalasku, koji je dobijen sa ovim polimeru u direktoj zavisnosti od broja metoksil grupa koje se nalaze na molekulu PEG polimera. Što je veći broj metoksil grupa, veći je afinitet polimera za antitela, specifična za mPEG proteinski konjugat.
Posmatrani svi zajedno, ovi rezultati pokazuju da se kompletna inhibicija vezivanja zečijih antitela za mPEG konjugat može postići kompeticijom sa rastvorima PEG, a posebno mPEG. Šta više, sposobnost rastvora mPEG da blokitaju vezivanje zečijih - PEG antitela za mPEG konjugate, ne povezanih proteina u korelaciji je sa sadržajem metoksil grupa u njima. Na osnovu masenih koncentracija mPEG - ovi manjihmolekulskih masa su potentniji kompetitori od mPEG - ova viših molekulskih masa kao što je prikazano na Slici 2b. Ovaj zaključak je konzistentan sa činjenicom da je udeo mase metoksil grupa prema ukupnoj masi polimera smanjen kako se molekulska masa polimera povećava. Među PEG - ovima koji su testirani, najpotentniji antigeni (na molarnoj osnovi) su razgranati PEG - ovi, koji sadrže dve metoksil grupe koji se poenkad označavaju kao slični kišobranu ili "U - PEG - ovi" (Martinez. A., et al., U. S. patent broj 5,643,5775) ili kao "Y - PEG - ovi" (Greemvald, R. B. et al., objavljena U. S. patentma prijava broj 2002/ 0052443 Al).
Primer 3: Ispitivanje anti - PEG antitela sa PEG-ovima kojima nedostaju metoksil grupe.
Pojam "PharmaPEG" se ovde koristi da označi linearne ili razgranate PEG - ove kojima nedostaju antigene grupe na terminalu ili na terminalima, koji su distalno od terminala koji je aktiviran ili koji može biti aktiviran. Iz prethodnih primera može se zaključiti da je antigenost polimera, a samim tim i polimernog konjugata biološki aktivnog sredstva funkcija sadržaja metoksil grupa u polimeru. Kako bi se dalje ispitalo ovo mišljenje izvedene su kompetitivne ELISA analize kao što je opisano za Sliku 1 u kojima su poređene sposobnosti mPEG ("4, 8 kDa mPEG") i PharmaPEG - ova od 12 kDa, 20 kDa i 35 kDa, koji ne poseduju metoksil grupe ili druge alkoksil grupe na krajevima linearnih polimera, da se vežu za anti - mPEG antitela. Ruzultati su prikazani na Slici 4. Pomak krivih tri PharmaPEG u odnosu na krivu mPEG koji je prikazan na Slici 4 pokazuje daje antigenost PharmaPEG otprilike 100x manja od aktivnosti mPEG kada se ispitivanje vrši sa anti - mPEG antitelima. Stoga, polimeri kojima ne dostaju metoksil grupe (npr., PharmaPEG) poseduju smanjenu ili značajno smanjenu antigenost u poređenju sa polimerima koji se tradicionalno koriste za biokonjugaciju lekova, npr., mPEG.
Kao što je gore naznačeno, na masenoj osnovi kompetitivne sposobnosti mPEG - ova su obrnuto proporcionalne njihovim molekulskim masama. Međutim, PEG - ovi kojima nedostaju metoksil grupe poseduju samo oko 1 % kompetitivne sposobnosti mPEG - ova, nezavisno od njihove molekulske mase. Ovi rezultati potvrđuju zaključak da su monofunkcionalno reaktivni polimeri kojima nedostaju metoksil grupe posebno pogodni za upotrebu za dobijanje polimernih konjugata sa biološki kativnim sredstvima i koji poseduju smanjenu, značajno smanjenu, ili koji ne poseduju antigenost u poređenju sa konjugatima dobijenim korišćenjem mPEG - ova, posebno razgranatih mPEG - ova, akošto je di - mPEG - lizin.
Primer 4: Detekcija pegiliranih proteinskih konjugata upotrebom Western
blot analize sa anti - mPEG antitelima.
Monometoksi PEG konjugati ugljene anhidraze (EC 4.2.1.1; "CA II") su korišćeni kao modeli u ispitivanju sposobnosti anti - mPEG antitela da detektuju pegilirane proteinske konjugate nakon elektroforeze u poliakrilamidnom gelu u prisustvu natrijum dodecil sulfata (SDS - PAGE). Gelovi su elektroblotirani na poliviniliden difluoridnu membranu, pa su blotovi inkubirani sa zečijim anti - mPEG antitelima (razblaženje 1/200) nakon čega je usledila inkubacija sa sekundarnim antitelom (koziji anti - zečiji IgG) koje je konjugovano sa alkalnom fosfatazom i izloženo supstratu sa kojim se dobija obojeni precipitat. Ovaj postupak imunološke detekcije proteina ili polimer - proteinskih konjugata koji su prebačeni sa elektroforetskog gela na membranu se uobičajeno označaba kao Western blot analiza (Tsang, V. C. W. et al., 1984 Anal. Biochem. 143: 304 - 307). Postupak detekcije i reagensi su isti kao oni koji su opisani za dot blot analize u Primeru 1. Rezultati su prikazani na Slici 5a. Trake 1 i 2 pokazuju gel koji je obojen na prisustvo proteina korišćenjem SYPRO® marka Ruby boje (Molecular Probes, Eugene, OR, kataloški broj S - 12000) koje su fotografisane Kodakovom digitalnom kamerom, upotrebom filtera za narandžastu/crvenu, vidljivu svetlost (Molecular Probes, kataloški broj S - 6655) u tamnoj komori uz iluminaciju na 302 nm. Trake 3 i 4 prikazuju rezultate Western blot analize istih uzoraka. Anti - mPEG antitela su primećena u položajima svih pegiliranih vrsta (Traka 3), ali ne i u položaju ne modifikovane ugljene anhidracije (Traka 4).
Slika 5b prikazuje kvantifikaciju intenziteta trake u gelu i Western blot analizi koja je prikazana na Slici 51, korišćenjem Kodak 1D Imaging Analvsis softvera (Koda, Rochester, NY). Horizontalna osa predstavlja distancu migracije u odnosu na front boje, a vertikalna osa predstavlja relativne intenzitete bojenja na proteinili bojenja na anti - mPEG. Donji zapis prikazuje trake standardnih proteina prethodno obojenih sa SeeBlue2 ™ bojom (Invitrogen Corporation. Carlsbad, CA; kataloški broj LC 5625), u kojima maksimalne vrednosti sa brojevima 1 do 8 identifikuju proteina sa sledećim prividnim molekulskim masama (u kDa): 204, 111, 68,8, 51,1, 40,2, 28,9, 20,7 i 14,9 respektivno. Drugi zapis odozdo predstavlja anti - mPEG antitelo obojene pegilirane ugljene anhidraze. Treći zapis odozdo predstavlja traku obojenu na proteine ugljene anhidraze, a gornji zapis prikazuje mPEG konjugate ugljene anhidraze obojene na protein. Brojevi iznad maksimalnih vrednosti na Slici 5b ukazuju na broj mPEG lanaca koji su povezani sa ugljenom anhidrazom u konjugatima koji odgovarajutoj maksimalnoj vrednosti. PEGopredstavlja položaj ugljene anhidraze na kome nema vezivanja sa PEG.
Sve zajedno, ovi rezultati ukazuju da su anti - mPEG antitela sposobna da lako formiraju komplekse sa pegiliranim proteinima dobijenim sa reaktivnim oblikom mPEG, čime se omogućava njihova senzitivna i selektivna detekcija. Kada se takvi konjugati uvedu u organizam životinje u profilaktičke ili terapeutske svrhe, indukcija anti - mPEG antitela će doprineti ubrzanom klirensu sredstva iz krvotoka, čime se ograničava efikasnost ovih konjugata što potencijalno dovodi do ne željenih efekata posredovanih formiranjem imunih kompleksa.
Primer 5: Sinteza PharmaPEG - mononitrofenil karbonata
Zahtev u dobijanju monofunkcionalno aktiviranog PharmaPEG iz PEG diola je taj da u nekom od koraka sinteze, jedna od terminalnih grupa PEG mora da poseduje karakteristike koje dozvoljavaju razdvajanje PEG - ova koji sadrže različiti broj te terminalne grupe. Takva grupa može biti više hidrofobna od PEG ili aktiviranog PEG, što omogućava razdvajanje upotrebom hromatografije reverzne faze (RP hromatografija). Alternativno, takva grupa može biti naelektrisana što dozvoljava razdvajanje upotrebom jonoizmenjivačke hromatografije. Takva grupa može biti deo čvrste faze, što omogućava razdvajanje faza u tečnosti u kojoj je nevezani PEG rastvoriv. Ukoliko aktivirajuća grupa može da se koristi kao osnosva za separaciju. kao u slučaju NPC - PEG, koji je opisan u ovom primeru, tada je vezivanje aktivirajuće grupe, jedina reakcija sinteze koja je potrebna. Ukoliko je blokirajuća grupa koja se može ukloniti, npr., t - butil ili trifenilmetil (tritil) grupa, predstavlja osnosvu za razdvajanje, blolkirajuća grupa može da se doda ili pre ili nakon vezivanja aktivirane grupe ili grupe koja se može aktivirati, kao što je opisano u Primeru 6. Teoretski, korak prečišćavanja koji se koristi za izolovanje PEG, koji sadrži željeni broj blokirajućih grupa, može da se izvede u bilo koje vreme nakon vezivanja blokirajuće grupe. Praktično, realtivna nestabilnost veza između polimerne osnove i blokirajuće grupe,kao i između polimerne osnove i aktiviraj uće grupe, ili grupe koja se može aktivirati, može da diktira optimalni redosled koraka.
Sinteza monofuncionalno aktiviranog NPC - PEG iz dihidroksiPEG je sažeto prikazana u dijagramu koji sledi na kome Ph označava fenil grupu a malo n označava broj etilen oksidnih jedinica u polimeru, a to je oko 227 za PEG od 10 kDa.
Kod PEG diola dobij enih od nekoliko nabavljača, pri čemu su svi obeleženi da poseduju molekulsku masu od 10 kDa ispitivanje stepen čistoće i homogenost. Nijedan od njih ne sadrži više od 90% PEG molekulske mase od oko 10 kDa. Stoga, PEG diol ok 10 kDa (Fluka Chemical Corp., Milwaukee. WI, kataloški broj 81280) je izdvojen od kontaminanata manje molekulske mase upotrebom hromatografije reverzne faze na Amberchrom MD - P CG - 300 SD koloni (7,5 mm x 15 cm, TosoHaas, Montgomervville, PA). PEG je nanet na kolonu kao rastvor u 5% (v/v) acetonitrilu u vodi i eluiran je linearnim gradijentom od 5% do 35 % acetonitrila u vodi. Frakcije su anlizirane upotrebom hromatografije sa ekskluzijom prema veličini na Superdex 200 HR 10/30 koloni (Amersham Pharmacia Biotech. Piscataway, NJ) u 20 mM natrijum acetatu, koji sadrži 150 mM NaCl, ph vrednosti 4,6. Frakcije iz Anbershrom kolone u kojoj je više od 98 % refraktivnog indeksa ("RI") signala usled prisustva PEG bilo pridruženo maksimalnoj vrednosti koja odgovara PEG od oko 10 kDa, prikupljene su i liofilizirane.
Prečišćeni, isušeni PEG diol (530 mg) je pomešan sa 61,4 mg p - nitrofenil hloroformata (Aldrich, Milvvaukee, WI, kataloški broj 16,021 - 0) i rastvoreno je u 4 ml acetonitrila u staklenoj tubi dimenzija 13 x 100 mm koja je zatvorena zatvaračem na šrafljenje, čime su dobijene krajnje koncentracije od oko 12,5 mM PEG diola i oko 75 mM p - nitrofenil hloroformata. Dodat je piridin (0,25 g) pa je reaktivna smeša inkubirana tokom noći na temperaturi od oko 36 °C. Reakcija je prekinuta mešanjem smeše sa 33 ml ledeno hloadne 0,1 M hlorovodonične kiseline. Rastvor je filtriran kako bi se uklonila mala količina precipitata p - nitrofenola, pa je dializiran tokom jednog dana na hladnom, nasuprot četiri 1 - L promena vode. Acetonitril je dodat u dijalizirani rastvor kako bi se koncentracija podesila na 5% (v/v). Polovina smeše koja je dobijena u Koraku 1 (24 ml), koja ssadrži oko 265 mg prečišćenog PEG diola od 10 kDa, naneta je na Amberchrom kolonu, pa su vezane PEG vrste eluirane uz gradijent od 5% do 65% acetonitrila u vodi. Frakcije su analizirane upotrebom hromatografije sa ekskluzijom prema veličini kao i ranije pri čemu je praćen i refraktivni indeks i apsorbancija na 280 nm. Prvo je eluiran dihidroksiPEG, koji nije pokazao absorbanciju na 280 nm, nakon toga PEG koji je deriviran sa jednom p - nitrofenil grupom ("mono - NPC PEG"), a nakon toga di - NPC PEG, za koga je odnos absorbancije na 280 nm prema refraktivnom indeksu, bio dvostruko veći od odnosa koji je pokazao mono - NPC PEG. Dve frakcije u centru mono - NPC PEG opsega eluiranja su kombinovane, čime je dobij eno oko 110 mg mono - NPC PEG, što odgovara prinosu od oko 42 %. Proizvod iz Koraka 2 može biti isušen radi čuvanja u desikatoru i/ili zamrzivaču ili može biti upotrebljen direktno za vezivanje sa biološki aktivnim jedinjenjem koje sadrži amin ili sa veznikom koji sadrži dve ili više aminogrupe radi dobijanja razgranatih PEG - ova, npr., diPEG - lizina, koji ne sadrži alkoksi grupe.
Primer 6: Sinteza PharmaPEG - monoaldehidnog oblika PEGdiola
Sinteza monopropion aldehid derivata PharmaPEG je skraćeno prikazana na sledećem dijagramu na kome KOtBu označava kalij um t - butoksid a DEP označava 3,3
- dietoksipropil grupu.
Poželjno, dihidroksiPEG koji se koristi kao početni materijal u Koraku 1 poseduje molekulsku masu koja se nalazi u okviru 10 % njegove nominalne molekulske mase i ima poludisperzitet manji od 1,05. Polidisperzitet se definiše kao odnos prosečne molekulske mase (Mw) u odnosu na prosečan broj molekulske mase (Mn). Oba ova parametra, mogu da se mere upotrebom hromatografije sa ekskluzijom prema veličini, korišćenjem PEG - ova za koje su precizno poznate molekulske mase kao standarda i softvera za hromatografiju sa gel propustljivošću kao što je EZChrom Elite Client/Server Softvvare, Version 2.8.3 (Scientific Softvvare, Inc., Pleasanton, CA). Alternativno, polidisperzitet PEG - ova može da se meri korišćenjem MALDI - TOF (matrix-asisted laser desorption/ionisation time of flight) masene spektroskopije (Marie, A., et al., 2000. Anal. Chem. 72: 5106 - 5114), korišćenjem softvera kao što je Vovager Softvvare (Applied Biosvstems, Foster City, CA). Za dobijanje farmaceutskih proizvoda koji sadrže kovalentno povezani PEG, početni materijal PEG poželjno poseduje polidisperzitet manji od 1.02, a još poželjnije manji od 1,01, kada se meri upotrebom MALDI - TOF masene spektrometrije. Početni materijal može da se dobije od Aldrich Chemical Co., Fluka Chemicals (Buchs. Svvitzerland), Shearvvater Corporation ili od Sigma Chemicals Co., između ostalih dobavljača koji su poznati stručnjacima. Ukoliko početni materijal nije dovoljno homogen, može biti frakcioniran adaptacijom postupka opisanog u Primeru 5.
Smeša monopropion aldehida i dipropionaldehida dietil acetalnih derivata PEG diola može da se sintetiše korišćenjem 3 - hloro - propionaldehid dietil acetala (Aldrich, kataloški broj C6, 900 - 4), kao što je opisano za acetaldehid dietil acetal, od strane Harris, J. M., et al., (1984, J. Polym. Sci. 22: 341 - 352) (videti Korak 1). Slični postupci su takođe opisani od strane Bentley, M. D., et al., (1998., J. Pharm. Sci. 87: 1446 - 1449) koji su nakon toga patentirani od strane Bentley, M. D., et al., U. S. patent broj 5,990,237).
U smešu koja je dobijena u Koraku 1 dodata je dovoljna količina trimetilfenil hlorida (hlorotrifenil - metan ili tritil hlorid. Ph3CCl, npr., Aldrich kataloški broj T8, 380 - 1) koja je rastvorena u piridinu. tako da u uslovima reakcije PI13CCI reaguje sa svim hidroksilnim grupama PEG početnog materijala koje nisu povezane sa propionaldehid dietil acetalom (Kociensi, P. J., gore navedeno). Da bi se okončao Korak 2, smeša se prikuplja nakon precipitacije dodavanjem siromašnog rastvarača za PEG (npr., etra) ili evaporacijom rastvarača ili upotrebom drugih postupaka koji su poznati u struci.
Smeša koja je dobijena u Koraku 2 se rastvara u vodi, pre ili nakon dodavanja 5%
(v/v) acetonitrila pa se rastvor nanosi na kolonu reverzne faze za koju se na osnovu principa koji su poznati u struci, očekuje daje sposobna da veže tritil derivate PEG. Ona može da sadrži alkil ili aril derivate silika ili polimernog supstrata, ili može biti sačinjena od polimera koji se zasniva na stirenu (npr.. Amberchrom MD - P CG - 300), kao u Primeru 5. PEG diol i tritil derivati mogu biti eluirani na način reverzne faze uz rastući gradijent organskog rastvarača kao u Primeru 5 ili na način pomeranja uzorka nastavljen]em nanošenja na kolonu, sve dotle dok se barem deo željene vrste ne eluira (Agner, E., et al., PCT publikacija WO 00/23789 Al) ili na način pomeranja (Cramer, S. M, U.S. patent broj 6,239,262) ili upotrebom kombinacije ovih postupaka. Generalno, PEG derivat koji ne poseduje tritil grupu biće eluiran prvi, monotritil derivat će biti
eluiran kao drugi a ditritil PEG biće eluiran kao treći. Optimalni prinos željenog proizvoda se dobija kada je odnos te tri vrste 1:2:1. Kako bi se poboljšao prinos i/ili stepen čistoće željenog monotritil PEG proizvoda, može biti poželjno da se deo efluenta kolone podvrgne reciklažnoj hromatografiji kao što je dobro poznato u hromatografskoj struci. Da bi se okončao Korak 3, deo eluata koji sadrži barem deo monotritil derivata, biva izdvojen, koncentrovan i isušen postupcima koji su poznati u struci.
U blago kiselim uslovima i pri niskoj temperaturi acetal može da se prevede u aldehid, uz očuvanje najvećeg dela tritil veza na distalnom kraju PEG. U nekim primenama ovog primera, može biti poželjno da monotritil PEG monoaldehid reaguje sa ciljnom podjedinicom pre uklanjanja tritil grupe. Takva rešenja su obuhvaćena obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Primer 7: Dokazivanje smanjene imunogenosti konjugata dobijenih sa hidroksiPEG u odnosu na konjugate dobijene sa metoksiPEG
Nastavljajući kao što je opisano za imunizacije sa mPEG konjugatima urikaze, kao u Primeru 1, grupe od po tri zeca su imunizovane ili sa mPEG konjugatima ili sa hidroksiPEG konjugatima istog preparata svinjske urikaze, pri čemu svaki sadrži u prošeku po dva lanca PEG od 10 kDa po podjedinici urikaze. Prosečan broj lanaca polimera koji su prikačeni za svaki preparat konjugata je potvrđen upotrebom HPLC sa ekskluzijom po veličini i upotrebom SDS - PAGE, u kojima su gelovi obojeni i na prisustvo proteina (kao u Primeru 4) i na prisustvo PEG, korišćenjem postupka opisanog u važećoj U. S. patentoj prijavi 10/183,607, podnesenoj juna 2002, čiji je opis ovde inkorporiran prema referenci u celosti. Svakom zecu je ubrizgan jedan od PEG - urikaza preparata jednom u kompletnom Freund - ovom adjuvansu i pet puta u intervalim od jedne do četiri nedelje u ne kompletnom Freund - ovom adjuvansu. Uzorci krvi su uzeti dve nedelje nakon četvrte i pete injekcije u nekompletnom Freund - ovom adjuvansu, a serumi su ekstrahovani. Kada su serijska četvorostruka razblaženja seruma iz ovih zečeva ispitivana upotrebom ELISA analize, kao u Primeru 2, koncentracija anti - PEG antitela koja je indukovana konjugatima dobijenim sa hidroksi PEG je bila manja od 5% od one koja je indukovana konjugatima dobijenim sa mPEG (videti Slike 6a i 6b). Nasuprot ovome, indukcija anti - urikaza antitela, od strane konjugata dobijenih sa dva tipa PEG je bila slična u dve grupe zečeva. Ni jedan od seruma ovih zečeva pre imunizacije nije sadržao detekstabilne nivoe anti - PEG antitela.
Diskusija i zaključci
U struci je poznato da PEG koji se završava metoksil grupom (mPEG) i PEG koji se završava hidroksilnom grupom (bis - hidroksiPEG ili PEG diol) imaju eksivalentne karakteristike pri upotrebi u biokonjugaciji ili češće da su mPEG - ovi i drugi niži alkoksil PEG - ovi superiorni u odnosu na PEG diole. Štaviše, bis - aktivirani dioli mogu da deluju kao sredstva za ukršteno vezivanje, što može biti poželjno za proizvodnju rastvorljivih dugodelujućih bioloških konjugata male imunogenosti i antigenosti. Iznenađujuće, rezultati predmetnih istraživanja ukazuju da su mPEG - ovi u značajnoj meri antigeni, kao i da antitela koja su indukovana protiv metoksil grupe mPEG vezuju pegilirane proteinske konjugate dobijene korišćenjem mPEG. Stoga, neočekivano i nasuprot ranijim nalazima, mPEG nema ekvivalentne karakteristiku u odnosu na hidroksiPEG i mPEG nije poželjniji za dobijanje polimernih konjugata biološki aktivnih komponenti (kao što su proteini), kojima želi da se poveća biološka raspoloživost, stabilnost u cirkulaciji i kojima želi da se na minimum svede imunogenost.
Na osnovu predmetnih rezultata jasno je da je upotreba monofunkcionalno aktiviranog PEG koji ne sadrži metoksil grupu ili drugu alkoksil grupu za sintezu proteinskih konjugata, rezultuje dobijanjem konjugata sa smanjenom imunoreaktivnošću. Za rezultantne konjugate je pokazano da poseduju smanjenu antigenost, tj., amnjenu sposobnost interakcije sa antitelima koja deluju protiv mPEG konjugata istog proteina, kao i smanjenu imunogenost, tj., smanjenu sposobnost da izazovu imuni odgovor protiv PEG komponente. Na osnovu ovoga očekuje se da konjugati koji su dobijeni sa razgranatim PEG - ovima koji sadrže dve ili više metoksil grupe, budu imunogeniji od konjugata dobijenih upotrebom razgranatih PEG - ova kojima nedostaju alkoksil grupe.
Konačno, na osnovu predmetnih nalaza, očekuje se da upotreba monofunkcionalno aktiviranih PEG koji ne sadrži metoksil grupu ili drugu alkoksil grupu, pre nego upotreba monofunkcionalno aktiviranog mPEG za sintezu PEG - lipozoma, dovede do toga da nastali PEG lipozomi poseduju smanjenu imunoreaktivnost uključujući smanjenu tendenciju da započnu aktivaciju komplementa u cirkulaciji, kao i smanjenu tendenciju da indukuju ukupni respiratorni distres ili anafilaktoidne ili pseudo - alergijske reakcije.
Predmetni pronalazak je opisan uz referenciranje na njegova određena rešenja. Postupci prema predmetnom pronalasku, su na sličan način primenjljivi na druge tipove proteina,druga biološki aktivna sredstva i na druga sredstva za konjugaciju. Stoga, obim zaštite predmetnog pronalaska nije ograničen rešenjima koja su opisana, već je ograničen jedino obimom zaštite patentnih zahteva i/ili njihovih ekvivalenata. Prosečni stručnjaci shvataju da je moguće praktikovanje drugih rešenja bez odstupanja od obima zaštite predmetnog pronalaska. Sve takve varijacije su obuhvaćene kao deo predmetnog pronalaska.
Sve publikacije, patenti i patentne prijave koji su pomenute u ovoj specifikaciji su indikativne za nivo veštine stručnjaka kojima je ovaj pronalazak i namenjen i ovde su inkorporirane prema referenci kao da su svaka pojedinačna publikacija, patent ili patentna prijava specifično i pojedinačno naznačeni kao inkorporirani prema referenci.

Claims (100)

1. Konjugat naznačen time što koji sadrži jednu ili više biološki aktivnih komponenti koje su kovalentno povezane sa barem jednim linearnim ili razgranatim polialkilen glikolom, pri čemu navedeni polialkilen glikol ne sadrži alkoksil grupu ni na jednom terminalu i gde je navedeni polialkilen glikol povezan sa jednom biološki aktivnom komponentom najednom mestu na polialkilen glikolu.
2. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni konjugat poseduje smanjenu ili značajno smanjenu antigenost u poređenju sa konjugatom koji sadrži istu biološki aktivnu komponentu (komponente) koja je povezana na istom mestu ili mestima na biološki aktivnoj komponenti (komponentama) sa istim brojem polialkilen glikola iste veličine i linearne ili razgranate strukture i koji sadrži jednu ili više terminalnih alkoksil grupa.
3. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni linearni ili razgranati polialkilen glikol izabran iz grupe koju čine poli(etilen glikol) i kopolimer etilen oksida i propilen oksida.
4. Konjugat prema zahtevu 3, naznačen time što navedeni linearni ili razgranati polialkilen glikol jeste poli(etilen glikol) ("PEG").
5. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što se vezivanje navedenog polialkilen glikola za navedenu biološki aktivnu komponentu (komponente) izvodi korišćenjem reaktivnog derivata barem jednog polialkilen glikola koji je izabran iz grupe koju čine linearni dihidroksiPEG-ovi ("PEG dioli"), hidroksiPEG-monoacetali i hidroksiPEG-monokiseline.
6. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što se vezivanje navedenog polialkilen glikola za navedenu biološki aktivnu komponentu (komponente) izvodi korišćenjem reaktivnog derivata hidroksiPEG izabranog iz grupe koju čine monoaldehid, monoestar monokiseline, monoamin, monotiol, monodisulfid, monobromofenil karbonat, monohlorofenil karbonat, monofluorofenil karbonat, mononitrofenil karbonat, monokarbonilimidazol, monohidrazid, monokarbazat, monojodoacetamid, monomaleimid. monoortopiridil disulfid, monooksim, monofenil glioksal, monotiazolidin-2-tion, monotioestar, monotriazin i monovinilsulfon.
7. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 1000 Daltona (1 kDa) do oko 100000 Daltona (100 kDa).
8. Konjugat prema zahtevu 7, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 2 kDa do oko 60 kDa.
9. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima dve grane, od kojih svaka ima molekulsku masu od oko 2 kDa do oko 30 kDa.
10. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima dve grane, od kojih svaka ima molekulsku masu od oko 5 kDa do oko 20 kDa.
11. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 10 kDa do oko 20 kDa.
12. Konjugat prema zahtevu 11, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 12 kDa.
13. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 18 kDa do oko 60 kDa.
14. Konjugat prema zahtevu 13, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 18 kDa do oko 22 kDa.
15. Konjugat prema zahtevu 14, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 20 kDa.
16. Konjugat prema zahtevu 13, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 27 kDa do oko 33 kDa.
17. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko jednog do oko 100 lanaca navedenog polialkilen glikola.
18. Konjugat prema zahtevu 17. naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko jednog do oko pet lanaca navedenog polialkilen glikola.
19. Konjugat prema zahtevu 18. naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko jednog do oko dva lanca navedenog polialkilen glikola.
20. Konjugat prema zahtevu 17, naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko pet do oko 100 lanaca navedenog polialkilen glikola.
21. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol izabran iz grupe koju čine monohidroksiPEG-kiselina i dihidroksiPEG-kiselina, kao što je dihidroksiPEG-lizin.
22. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni polialkilen glikol, ukoliko je linearan, ima hidroksilnu grupu na terminalu koji nije povezan sa biološki aktivnom komponentom (komponentama) ("distalni terminal"), ili, ukoliko je razgranat, ima hidroksilnu grupu na svakom od distalnih terminala.
23. Konjugat prema zahtevu 5, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol reaktivni derivat navedenog linearnog dihidroksiPEG.
24. Konjugat prema zahtevu 5, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol reaktivni derivat navedene hidroksiPEG-monokarboksilne kiseline.
25. Konjugat prema zahtevu 1. naznačen time što je navedena biološki aktivna komponenta izabran iz grupe koju čine peptid. protein, glikoprotein, organsko jedinjenje, jedinjenje koje sadrži aminsku grupu, jedinjenje koje sadrži karboksilnu grupu, jedinjenje koje sadrži hidoksilnu grupu i jedinjenje koje sadrži tiol grupu.
26. Konjugat prema zahtevu 25, naznačen time što je navedena biološki aktivna komponenta izabrana iz grupe koju čine peptid, protein i glikoprotein.
27. Konjugat prema zahtevu 26, naznačen time što je navedeni peptid ili protein ili glikoprotein izabran iz grupe koju čine enzim, serumski protein, serumski glikoprotein, protein ćelije krvi, pigmentni protein, hemoglobin, virusni protein, peptidni hormon, proteinski hormon, glikoproteinski hormon, oslobađajući faktor hipotalamusa, citokin, faktor rasta i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo koje od gore navedenih grupa.
28. Konjugat prema zahtevu 27, naznačen time što je navedeni serumski protein izabran iz grupe koju čine albumin, imunoglobulin, faktor zgrušavanja krvi i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih serumskih proteina.
29. Konjugat prema zahtevu 27, naznačen time što je navedeni peptidni hormon ili proteinski hormon ili glikoproteinski hormon izabran iz grupe koju čine antidiuretski hormon, horionski gonadotropin, luteinizirajući hormon, folikul-stimulirajući hormon, insulin, prolaktin, somatomedin, hormon rasta, tireo-stimulirajući hormon, placentni laktogen i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih hormona.
30. Konjugat prema zahtevu 27, naznačen time što je navedeni faktor rasta izabran iz grupe koju čine faktor stimulacije kolonija, epidermalni faktor rasta, fibroblastni faktor rasta, insulinu sličan faktor rasta, transformišući faktor rasta, iz trombocita derivirani faktor rasta, faktor rasta nerva, faktor rasta hepatocita, neurotrofni faktor, cilijarni neurotrofni faktor, iz mozga derivirani neurotrofni faktor, iz glije derivirani neurotrofni faktor ili morfogenetski peptid kosti i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih faktora rasta.
31. Konjugat prema zahtevu 27. naznačen time što je navedeni citokin izabran iz grupe koju čine eritropoetin, limfokin, interleukin. interferon, faktor nekroze tumora, faktor inhibicije leukemije i trombopoetin, kao i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih citokina.
32. Konjugat prema zahtevu 27, naznačen time što je navedeni enzim izabran iz grupe koju čine enzim specifičan za ugljene hidrate, proteolitički enzim, oksidoreduktaza, transferaza, hidrolaza, liaza, izomeraza i ligaza.
33. Konjugat prema zahtevu 32, naznačen time što navedeni enzim oksidoreduktaza jeste urikaza.
34. Konjugat prema zahtevu 32, naznačen time što navedeni proteolitički enzim jeste aktivator plazminogena.
35. Konjugat prema zahtevu 26, naznačen time što navedeni peptid, protein ili glikoprotein jeste alergen.
36. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što navedeno biološki aktivno jedinjenje jeste taksan ili njegov derivat.
37. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što navedeno biološki aktivno jedinjenje jeste antibiotik ili njegov derivat.
38. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži konjugat iz zahteva 1 i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent ili nosilac.
39. Postupak sprečavanja nastanka, dijagnostikovanja ili tretiranja fizičkog poremećaja kod životinje, naznačen time što obuhvata primenu kod navedene životinje efikasne količine konjugata iz zahteva 1 ili preparata iz zahteva 38.
40. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što je navedena životinja sisar.
41. Postupak prema zahtevu 40, naznačen time što je navedeni sisar čovek.
42. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što je fizički poremećaj izabran iz grupe koju čine kancer, artritis, infektivna bolest, genetski poremećaj, neurološki poremećaj, metabolički poremećaj, enzimski poremećaj, kardiovaskularna bolest i hipertenzija.
43. Postupak prema zahtevu 42, naznačen time što je kancer izabran iz grupe koju čine kancer dojke, kancer materice, kancer jajnika, kancer prostate, kancer testisa, kancer pluća, leukemija, limfom, kancer debelog creva, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, kancer kosti, neurološki kancer, kancer glave i vrata, kancer kože i drugi karcinomi, sarkomi, adenomi i mijelomi.
44. Postupak prema zahtevu 42, naznačen time što je navedena infektivna bolest izabrana iz grupe koju čine bakterijska bolest, gljivična bolest, virusna bolest i parazitska bolest.
45. Postupak prema zahtevu 44, naznačen time što je navedena virusna bolest izabrana iz grupe koju čine HIV/SIDA i hepatitis.
46. Postupak prema zahtevu 42, naznačen time što je navedeni genetski poremećaj izabran iz grupe koju čine amiotrofična lateralna skleroza, cistična fibroza, Gošeova bolest, hemofilija i drugi nasledni poremećaji krvi, Pompeova bolest i ozbiljna kombinovana imunodeficijentna bolest ("SCID - severe combined irrrmunodeficiency disease").
47. Postupak prema zahtevu 42. naznačen time što je navedeni neurološki poremećaj izabran iz grupe koju čine Alchajmerova bolest i multipla skleroza.
48. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što je navedena primena parenteralna.
49. Postupak prema zahtevu 48, naznačen time što je navedena parenteralna primena intravenska.
50. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što je navedena primena oralna.
51. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što je navedena primena topijska.
52. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što je navedena primena putem inhalacije.
53. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što je navedena primena rektalna.
54. Postupak za proizvodnju konjugata između biološki aktivnog jedinjenja i polialkilen glikola aktiviranog samo na jednom terminalu ("monoaktivirani polialkilen glikol"), naznačen time što obuhvata: (a) dobijanje polialkilen glikola koji ne sadrži ni jednu stabilno povezanu alkoksi grupu kao terminalnu grupu; (b) opciono, pre prevođenja polialkilen glikola iz koraka (a) u monofunkcionalno aktivirani polialkilen glikol, zaštićivanje svih terminalnih grupe izuzev jedne dodavanjem jedne ili više blokirajućih grupa koje se mogu ukloniti, kao što su t-butoksil grupa (grupe), ariloksil grupa (grupe) ili trifenilmetil grupa (grupe) ("tritil grupa (grupe)"); (c) dobijanje monofunkcionalno aktiviranog derivata navedenog polialkilen glikola reakcijom navedenog polialkilen glikola sa jedinjenjem ili jedinjenjima za derivaciju u uslovima u kojima se navedeni polialkilen glikol derivira jednom grupom za derivaciju na terminalu koji ne sadrži navedenu blokirajuću grupu ili grupe koje se mogu ukloniti; (d) ukoliko se blokirajuća grupa dodaje da zaštiti terminalnu grupu (grupe), kao što je opisano u koraku (b) gore, uklanjanje navedene blokirajuće grupe, u toku jednog ili više koraka, bez uklanjanja aktiviraj uće grupe povezane kao što je opisano u koraku (c) gore, kako bi se dobio monofunkcionalno aktivirani polialkilen glikol kod koga distalni terminal ili distalni terminali jesu hidroksilne grupe; i (e) uspostavljanje kontakta između navedenog monofunkcionalno aktiviranog polialkilen glikola sa najmanje jednom biološki aktivnom komponentom, u uslovima koji pospešuju kovalentno vezivanje navedenog monofunkcionalno aktiviranog polialkilen glikola sa navedenom biološki aktivnom komponentom, ili (f) alternativno, izvođenje koraka (e) pre izvođenja koraka (d).
55. Postupak prema zahtevu 54, naznačen time što je navedena grupa za derivaciju izabrana iz grupe koju čine aldehidna ili karboksilna grupa.
56. Postupak prema zahtevu 54, naznačen time što je navedena blokirajuća grupa izabrana iz grupe koju čine tritil grupa, ariloksil grupa i t-butoksil grupa.
57. Postupak za razdvajanje linearnog monohidroksiPEG-monoaldehida od odgovarajućeg PEG-dialdehida, naznačen time što obuhvata: (a) prevođenje svih hidroksilnih grupa na PEG-aldehidu u tritil derivate; (b) razdvajanje monotritilPEG-monoaldehida od PEG-dialdehida i bilo kog ditritilPEG pomoću hromatografije reverzne faze, i (c) prevođenje monotritilPEG-monoaldehida u monohidroksiPEG-monoaldehid hidrolitičkim uklanjanjem tritil grupe u kiseloj sredini.
58. Postupak prema zahtevu 57, naznačen time što se navedeni aldehid nalazi, ili što se navedeni dialdehidi nalaze u obliku acetal derivata.
59. Konjugat naznačen time što je dobijen postupkom iz zahteva 54.
60. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što navedeni konjugat poseduje smanjenu ili značajno smanjenu antigenost u poređenju sa konjugatom koji sadrži istu biološki aktivnu komponentu povezanu za isto mesto ili za ista mesta na biološki aktivnoj komponenti sa istim brojem molekula polialkilen glikola iste veličine i linearne ili razgranate strukture koji sadrži alkoksil grupu na distalnom terminalu, ukoliko je polialkilen glikol linearan, ili koji sadrži dve ili više alkoksil grupa na distalnim terminalima, ukoliko je polialkilen glikol razgranat.
61. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol izabran iz grupe koju čine poli(alkilen glikol) i kopolimer etilen oksida i propilen oksida.
62. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što je polialkilen glikolna komponenta izabrana iz grupe koju čine linearni poli(etilen glikol) i razgranati poli(etilen glikol).
63. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što svaki od navedenih polialkilen glikola ima molekulsku masu od oko 1 kDa do oko 100 kDa.
64. Konjugat prema zahtevu 63. naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 2 kDa do oko 60 kDa.
65. Konjugat prema zahtevu 64, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima dve grane, od kojih svaka ima molekulsku masu od oko 2 kDa do oko 30 kDa.
66. Konjugat prema zahtevu 65, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima dve grane od kojih svaka ima molekulsku masu od oko 5 kDa do oko 20 kDa.
67. Konjugat prema zahtevu 64, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 10 kDa do oko 20 kDa.
68. Konjugat prema zahtevu 67. naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 12 kDa.
69. Konjugat prema zahtevu 64, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 18 kDa do oko 60 kDa.
70. Konjugat prema zahtevu 69, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 18 kDa do oko 22 kDa.
71. Konjugat prema zahtevu 70. naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 20 kDa.
72. Konjugat prema zahtevu 69. naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 27 kDa do oko 33 kDa.
73. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko jednog do oko 100 lanaca navedenog polialkilen glikola.
74. Konjugat prema zahtevu 73, naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko jednog do oko pet lanaca navedenog polialkilen glikola.
75. Konjugat prema zahtevu 74. naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko jednog do oko dva lanaca navedenog polialkilen glikola.
76. Konjugat prema zahtevu 73, naznačen time što navedeni konjugat sadrži od oko pet do oko 100 lanaca navedenog polialkilen glikola.
77. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što je monofunkcionalno aktivirani polialkilen glikol koji se koristi u sintezi navedenog konjugata izabran iz grupe koju čine hidroksiPEG-monoaldehid i reaktivni estar hidroksiPEG-monokiseline.
78. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što monofunkcionalno aktivirani polialkilen glikol koji se koristi u sintezi navedenog konjugata ima hidroksilnu grupu na svom distalnom terminalu, ukoliko je linearan, ili ima hidroksilnu grupu na svakom distalnom terminalu, ukoliko je razgranat.
79. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što je monofunkcionalno aktivirani polialkilen glikol koji se koristi u sintezi deriviran iz linearnog dihidroksiPEG.
80. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što je biološki aktivna komponenta izabrana iz grupe koju čine peptid, protein, glikoprotein, organsko jedinjenje, jedinjenje koje sadrži aminsku grupu, jedinjenje koje sadrži karboksilnu grupu, jedinjenje koje sadrži hidoksilnu grupu i jedinjenje koje sadrži tiol grupu.
81. Konjugat prema zahtevu 80, naznačen time što je navedena biološki aktivna komponenta izabrana iz grupe koju čine peptid, protein i glikoprotein.
82. Konjugat prema zahtevu 81, naznačen time što je navedeni peptid ili protein ili glikoprotein izabran iz grupe koju čine enzim, serumski protein, serumski glikoprotein, protein ćelije krvi, pigmentni protein, hemoglobin, virusni protein, peptidni hormon, proteinski hormon, glikoproteinski hormon, oslobađajući faktor hipotalamusa, citokin, faktor rasta i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili fiinkcionišu kao antagonisti bilo koje od gore navedenih grupa.
83. Konjugat prema zahtevu 82, naznačen time što je navedeni serumski protein izabran iz grupe koju čine albumin, imunoglobulin, faktor zgrušavanja krvi i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih serumskih proteina.
84. Konjugat prema zahtevu 82, naznačen time što je navedeni peptidni hormon ili proteinski hormon ili glikoproteinski hormon izabran iz grupe koju čine antidiuretski hormon, horionski gonadotropin, luteinizirajući hormon, folikul-stimulirajući hormon, insulin, prolaktin, somatomedin, hormon rasta, tireo-stimulirajući hormon, placentni laktogen i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih hormona.
85. Konjugat prema zahtevu 82, naznačen time što je navedeni faktor rasta izabran iz grupe koju čine faktor stimulacije kolonija, epidermalni faktor rasta, fibroblastni faktor rasta, insulinu sličan faktor rasta, transformišući faktor rasta, iz trombocita derivirani faktor rasta, faktor rasta nerva, faktor rasta hepatocita. neurotrofni faktor, cilijarni neurotrofni faktor, iz mozga derivirani neurotrofni faktor, iz glije derivirani neurotrofni faktor ili morfogenetski peptid kosti i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih faktora rasta.
86. Konjugat prema zahtevu 82, naznačen time što je navedeni citokin izabran iz grupe koju čine eritropoetin, limfokin, interleukin, interferon, faktor nekroze tumora, faktor inhibicije leukemije i trombopoetin, kao i peptidi i proteini i glikoproteini koji oponašaju ili funkcionišu kao antagonisti bilo kog od gore navedenih citokina.
87. Konjugat prema zahtevu 82, naznačen time što je navedeni enzim izabran iz grupe koju čine enzim specifičan za ugljene hidrate, proteolitički enzim, oksidoreduktaza, transferaza, hidrolaza, liaza, izomeraza i ligaza.
88. Konjugat prema zahtevu 87, naznačen time što navedeni enzim oksidoreduktaza jeste urikaza.
89. Konjugat prema zahtevu 87, naznačen time što navedeni proteolitički enzim jeste aktivator plazminogena.
90. Konjugat prema zahtevu 81, naznačen time što navedeni peptid, protein ili glikoprotein jeste alergen.
91. Konjugat prema zahtevu 59. naznačen time što navedeno biološki aktivno jedinjenje jeste taksan ili njegov derivat.
92. Konjugat prema zahtevu 59, naznačen time što navedeno biološki aktivno jedinjenje jeste antibiotik ili njegov derivat.
93. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži konjugat iz zahteva 59 i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent ili nosilac.
94. Komplet naznačen time što sadrži konjugat iz zahteva 1.
95. Komplet naznačen time što sadrži farmaceutski preparat iz zahteva 38.
96. Komplet naznačen time što sadrži konjugat iz zahteva 59.
97. Preparat PEG - lizozom, naznačen time što PEG komponenta ne sadrži alkoksil grupu ni najednom terminalu, a svaki od molekula PEG je povezan sa jednim molekulom lipida najednom mestu na molekulu lipida i na navedenom molekulu PEG.
98. Preparat prema zahtevu 97, naznačen time što je navedeno mesto vezivanja amino grupa fosfatidil etanolamina.
99. Preparat prema zahtevu 97, naznačen time što je navedeno mesto vezivanja hidroksilna grupa diacilglicerola.
100. Preparat prema zahtevu 97, naznačen time što navedeni preparat poseduje smanjenu ili značajno smanjenu imunogenost u poređenju sa preparatom PEG - lizozom koji sadrži barem jedan alkoksiPEG ili PEG koji je povezan sa lipidom na više nego na jednom mestu ili sa više nego sa jednim molekulom lipida.
YUP-2005/0263A 2002-09-30 2003-09-25 Polimerni konjugati smanjene antigenosti, postupci za njihovo dobijanje i korišćenje RS20050263A (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US41442402P 2002-09-30 2002-09-30
US10/317,092 US20040062748A1 (en) 2002-09-30 2002-12-12 Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
PCT/US2003/029989 WO2004030617A2 (en) 2002-09-30 2003-09-25 Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20050263A true RS20050263A (sr) 2007-08-03

Family

ID=32033300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0263A RS20050263A (sr) 2002-09-30 2003-09-25 Polimerni konjugati smanjene antigenosti, postupci za njihovo dobijanje i korišćenje

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20040062748A1 (sr)
EP (2) EP1572728B1 (sr)
JP (2) JP5366352B2 (sr)
KR (1) KR101022577B1 (sr)
CN (2) CN1997661A (sr)
AU (1) AU2003275176B8 (sr)
BR (1) BRPI0314831B8 (sr)
CA (2) CA2500389C (sr)
CR (1) CR7776A (sr)
DK (1) DK1572728T3 (sr)
EA (1) EA009122B1 (sr)
EC (1) ECSP055717A (sr)
ES (1) ES2504165T3 (sr)
GE (1) GEP20074016B (sr)
HR (1) HRP20050353B1 (sr)
IL (1) IL167723A (sr)
IS (1) IS2944B (sr)
MA (1) MA27521A1 (sr)
MX (1) MXPA05003394A (sr)
NO (1) NO20052089L (sr)
NZ (1) NZ539133A (sr)
PT (1) PT1572728E (sr)
RS (1) RS20050263A (sr)
TW (1) TWI362942B (sr)
WO (1) WO2004030617A2 (sr)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
PT2298278E (pt) 2002-06-07 2016-02-25 Dyax Corp Prevenção e redução da perda de sangue e resposta inflamatória
US20060002935A1 (en) * 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
GEP20084486B (en) * 2002-12-26 2008-09-25 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
RS20050501A (sr) * 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polimerni konjugati citokina,hemokina,faktora rasta, polipeptidnih hormona i njihovih antagonista sa očuvanom aktivnošću vezivanja receptora
AU2004221824B2 (en) 2003-03-14 2009-08-27 Ratiopharm Gmbh Branched water-soluble polymers and their conjugates
CA2522345A1 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
PL1625156T3 (pl) 2003-05-12 2013-03-29 Affymax Inc Peptydy wiążące się do receptora erytropoetyny
CN1849141A (zh) 2003-05-12 2006-10-18 阿费麦克斯公司 用于聚(乙二醇)修饰的肽的间隔臂部分
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
CA3050564A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
NZ548123A (en) 2004-01-08 2010-05-28 Novo Nordisk As O-linked glycosylation of peptides
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
EP1814573B1 (en) 2004-10-29 2016-03-09 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
CA2593682C (en) 2005-01-10 2016-03-22 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US7365127B2 (en) * 2005-02-04 2008-04-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Process for the preparation of polymer conjugates
US9187546B2 (en) 2005-04-08 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
US7858080B2 (en) 2005-05-20 2010-12-28 Agency For Science, Technology And Research Aldehyde conjugated flavonoid preparations
US20080255026A1 (en) 2005-05-25 2008-10-16 Glycopegylated Factor 1X Glycopegylated Factor Ix
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
DE602007008074D1 (de) * 2006-02-28 2010-09-09 Reddy S Lab Eu Ltd Dr Verfahren zur herstellung von polyethylen-glycol-carbonaten
WO2007102562A1 (ja) * 2006-03-01 2007-09-13 Keio University 新規抗血栓薬
CA2653748A1 (en) * 2006-05-02 2007-11-15 Allozyne, Inc. Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
DK2101821T3 (da) 2006-12-15 2014-10-06 Baxter Healthcare Sa Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo
EP2144923B1 (en) 2007-04-03 2013-02-13 BioGeneriX AG Methods of treatment using glycopegylated g-csf
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
WO2009026334A2 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
JP2013516389A (ja) 2009-01-06 2013-05-13 ダイアックス コーポレーション カリクレイン阻害剤による粘膜炎治療
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP3081233B1 (en) 2009-07-27 2020-12-23 Baxalta GmbH Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
BR112012001814A8 (pt) 2009-07-27 2018-02-06 Baxalta GmbH Conjugados de proteína de coagulação sanguínea
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
ES2905545T3 (es) 2010-01-06 2022-04-11 Takeda Pharmaceuticals Co Proteínas de unión a calicreína plasmática
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
AU2011342896A1 (en) 2010-12-13 2013-07-04 Quiapeg Pharmaceuticals Ab Functionalized polymers
ES2800983T3 (es) 2010-12-22 2021-01-07 Baxalta GmbH Materiales y métodos para conjugar un derivado de ácido graso soluble en agua con una proteína
KR102011156B1 (ko) 2011-01-06 2019-08-16 다이액스 코포레이션 혈장 칼리크레인 결합 단백질
JP5949037B2 (ja) 2011-03-30 2016-07-06 日油株式会社 末端に複数の水酸基を有するポリオキシエチレン誘導体
AU2013276219B2 (en) 2012-06-12 2018-03-08 Quiapeg Pharmaceuticals Ab Conjugates of biologically active molecules to functionalized polymers
SG11201506937RA (en) * 2013-03-05 2015-10-29 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Improved preparation method for high-yield production of physiologically active polypeptide conjugate
IL247942B (en) 2014-03-27 2022-09-01 Dyax Corp Compositions and methods for drops in macular edema as a result of diabetes
EP3151796A4 (en) * 2014-06-04 2018-01-10 Zim Biosciences, Inc. Compositions and methods for improving skin quality
IL296875A (en) 2014-12-31 2022-12-01 Lantheus Medical Imaging Inc Fat-wrapped gas microsphere preparations and related methods
US11286307B2 (en) 2015-12-11 2022-03-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack
CA3022698A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Lantheus Medical Imaging, Inc. Methods and devices for preparation of ultrasound contrast agents
US9789210B1 (en) 2016-07-06 2017-10-17 Lantheus Medical Imaging, Inc. Methods for making ultrasound contrast agents
CN110545850A (zh) 2017-03-10 2019-12-06 奎亚培格制药公司 可释放的缀合物
EP3849660A1 (en) 2018-09-12 2021-07-21 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Releasable glp-1 conjugates
US20210352892A1 (en) * 2019-04-10 2021-11-18 University Of Utah Research Foundation Macromolecular and nonparticulate agrochemicals to reduce vapor drift
CN110376369B (zh) * 2019-07-30 2022-02-15 重庆派金生物科技有限公司 一种抗聚乙二醇抗体的抗原区免疫原性分析方法
CN114667281B (zh) 2019-10-29 2025-10-24 国立大学法人熊本大学 具有抗hiv活性的cd4模拟物化合物
AU2021209045A1 (en) 2020-01-13 2022-07-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating pediatric hereditary angioedema attack
TWI922495B (zh) * 2020-09-23 2026-04-21 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
CN114392237B (zh) * 2021-12-28 2024-02-02 上海允英生物医药科技有限公司 一种冻干病毒制剂及其制备方法

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2433883C2 (de) * 1973-07-20 1986-03-27 Research Corp., New York, N.Y. Verwendung von physiologisch aktiven Polypeptiden
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
JPS5599189A (en) 1979-01-22 1980-07-28 Mihama Hisaharu Modified uricase free from antigenicity and its preparation
US4399282A (en) * 1979-07-10 1983-08-16 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Camptothecin derivatives
US4902506A (en) * 1983-07-05 1990-02-20 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4434228A (en) * 1982-04-20 1984-02-28 Genex Corporation Immobilization of biological materials in condensed polyalkyleneimine polymers
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
IE64284B1 (en) 1987-08-03 1995-07-26 Ddi Pharmaceuticals Conjugates of superoxide dismutase
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4943579A (en) * 1987-10-06 1990-07-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Water soluble prodrugs of camptothecin
US5004758A (en) * 1987-12-01 1991-04-02 Smithkline Beecham Corporation Water soluble camptothecin analogs useful for inhibiting the growth of animal tumor cells
JP2958019B2 (ja) * 1988-05-06 1999-10-06 住友製薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体、修飾ペプチドおよびその製造方法
US6132763A (en) * 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5013556A (en) * 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6552170B1 (en) * 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5364612A (en) * 1991-05-06 1994-11-15 Immunomedics, Inc. Detection of cardiovascular lesions
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US6180134B1 (en) * 1993-03-23 2001-01-30 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced ciruclation effector composition and method
US6326353B1 (en) * 1993-03-23 2001-12-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced circulation effector composition and method
EP0699051A4 (en) * 1993-05-20 1998-11-25 Univ California MACROMOLECULAR CONTRAST FOR IMAGE GENERATION BY MEANS OF MAGNETIC CORE RESONANCE
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
AU7113594A (en) * 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5824701A (en) * 1993-10-20 1998-10-20 Enzon, Inc. Taxane-based prodrugs
WO1995011020A1 (en) * 1993-10-20 1995-04-27 Enzon, Inc. 2'- and/or 7- substituted taxoids
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5840900A (en) * 1993-10-20 1998-11-24 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
HUT75533A (en) 1993-11-10 1997-05-28 Schering Corp Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5728560A (en) * 1996-06-14 1998-03-17 Enzon, Inc. Method of treating CD4+ T cell lymphopenia in immuno-compromised patients
US5804183A (en) * 1997-01-31 1998-09-08 Enzon, Inc. Arginine deminase derived from mycoplasma arthritidis and polymer conjugates containing the same
AU740207B2 (en) * 1997-02-06 2001-11-01 Novozymes A/S Polypeptide-polymer conjugates having added and/or removed attachment groups
US6323322B1 (en) * 1997-04-30 2001-11-27 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US5900402A (en) * 1997-05-29 1999-05-04 Enzon, Inc. Method of reducing side effects associated with administration of oxygen-carrying proteins
US6011042A (en) * 1997-10-10 2000-01-04 Enzon, Inc. Acyl polymeric derivatives of aromatic hydroxyl-containing compounds
US6448369B1 (en) * 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US6180095B1 (en) * 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) * 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
US6239262B1 (en) * 1998-01-07 2001-05-29 Rensselaer Polytechnic Institute Low molecular weight displacers for protein purification in hydrophobic interaction and reversed phase chromatographic systems
US5880225A (en) * 1998-02-18 1999-03-09 Arco Chemical Technology, L.P. Process for making polyetherester resins having high aromatic diester
US6783965B1 (en) 2000-02-10 2004-08-31 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates
ATE298251T1 (de) 1998-08-06 2005-07-15 Mountain View Pharmaceuticals Peg-uricase konjugate und verwendung davon
PL202799B1 (pl) 1998-08-06 2009-07-31 Mountain View Pharmaceuticals Sposób izolowania urykazy w postaci tetramerycznej oraz wyizolowana tetrameryczna urykaza
DE69914611T2 (de) 1998-08-28 2004-12-23 Gryphon Therapeutics, Inc., South San Francisco Verfahren zur herstellung von polyamidketten von genauer länge und deren konjugate mit proteinen
DK1656952T3 (da) * 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
GB9822963D0 (en) 1998-10-20 1998-12-16 Agner Erik Improvements in or relating to chromatography
US6596849B1 (en) 1999-05-28 2003-07-22 Academia Sinica Monoclonal-antibody for analysis and clearance of polyethylene glycol and polyethylene glycol-modified molecules
MXPA02003540A (es) 1999-10-08 2003-09-12 Nektar Therapeutics Al Corp Derivados de poli(etilenglicol) heterobifuncionales y los metodos para su preparacion.
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
WO2002080207A1 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Arizona State University Micro-machined radio frequency switches and method of operating the same
ATE414711T1 (de) * 2001-06-28 2008-12-15 Mountain View Pharmaceuticals Polymerstabilisierte proteinasen
US6913915B2 (en) * 2001-08-02 2005-07-05 Phoenix Pharmacologics, Inc. PEG-modified uricase
US7495116B2 (en) * 2002-03-29 2009-02-24 Nof Corporation Phospholipid derivative
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR101022577B1 (ko) 2011-03-16
JP5366352B2 (ja) 2013-12-11
HRP20050353A2 (en) 2006-06-30
DK1572728T3 (da) 2014-09-22
EP2535347A1 (en) 2012-12-19
IL167723A (en) 2013-01-31
WO2004030617A2 (en) 2004-04-15
AU2003275176B8 (en) 2009-01-08
HRP20050353B1 (hr) 2013-07-31
JP2006510601A (ja) 2006-03-30
EP1572728B1 (en) 2014-06-25
BRPI0314831B1 (pt) 2021-01-19
EA009122B1 (ru) 2007-10-26
AU2003275176A1 (en) 2004-04-23
CA2500389C (en) 2015-03-10
PT1572728E (pt) 2014-09-19
CN1997661B (zh) 2013-12-04
ECSP055717A (es) 2005-08-11
MA27521A1 (fr) 2005-09-01
WO2004030617A3 (en) 2005-07-21
CN1997661A (zh) 2007-07-11
NZ539133A (en) 2008-03-28
ES2504165T3 (es) 2014-10-08
AU2003275176B2 (en) 2008-12-18
TW200416035A (en) 2004-09-01
IS7778A (is) 2005-03-30
BRPI0314831B8 (pt) 2021-05-25
HK1083190A1 (en) 2006-06-30
CA2836959A1 (en) 2004-04-15
EA200500519A1 (ru) 2005-12-29
CR7776A (es) 2007-10-07
GEP20074016B (en) 2007-01-10
JP2011157379A (ja) 2011-08-18
TWI362942B (en) 2012-05-01
BR0314831A (pt) 2005-08-16
US20040062748A1 (en) 2004-04-01
NO20052089L (no) 2005-04-28
KR20050083702A (ko) 2005-08-26
IS2944B (is) 2016-04-15
CA2836959C (en) 2017-06-06
EP1572728A2 (en) 2005-09-14
JP5603823B2 (ja) 2014-10-08
CA2500389A1 (en) 2004-04-15
MXPA05003394A (es) 2005-10-05
EP1572728A4 (en) 2010-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8129330B2 (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
CA2500389C (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
JP2006510601A5 (sr)
CA2978330C (en) Conjugates of an il-7 moiety and a polymer
JP2002508400A (ja) アミノ及びヒドロキシル含有生物活性剤のポリマープロドラッグ
CN101389354A (zh) 用于与蛋白质和肽缀合的四个支链的树枝状大分子peg
JP2022058911A (ja) 非血液凝固タンパク質の糖ポリシアル酸化
JP2003516366A (ja) 両親媒性ポリマーとこれを含有するポリペプチドコンジュゲート
US20060239960A1 (en) Polymer-based compositions and conjugates of antimicrobial agents
CN101627056B (zh) Y型聚乙二醇修饰的g-csf及其制备方法和应用
JP2017205120A (ja) コリンエステラーゼ部分とポリマーとのコンジュゲート
AU2005224078B2 (en) Methods for increasing protein polyethylene glycol (PEG) conjugation
US20090208480A1 (en) Long half-life recombinant butyrylcholinesterase
ZA200502707B (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
HK1083190B (en) Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof