RS50072B - S-nitrozotioli kao agensi za tretman cirkulatornih poremećaja - Google Patents

Abstract

S-nitrozotiolni derivati penicilamina ili glutationa i njihove farmaceutski prihvatljive soli, koje odgovaraju sledećoj opštoj formuli (I) naznačeni time što: A i B su fenil grupe ili zajedno formiraju ostatak -CH2-Q-CH2 koji čini šestočlani prsten gde Q predstavlja atom kiseonika ili sumpora ili grupu N-R3, gde je R3 vodonik ili alkil grupa C1-C4; R1 je acil ostatak, koji može biti alifatična acil grupa C1-C5 ili ostatak glutaminske kiseline vezan preko svog neaminokiselinskog karboksila; R2 je hidroksilna grupa ili glicinski ostatak vezan preko peptidne veze; pri čemu, ako je R1 alifatični acil ostatak onda je R2 hidroksilna grupa, i ako je R1 ostatak glutaminske kiseline onda je R2 glicinski ostatak. Prijava sadrži još 10 patentnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na nove S-nitrozotiolne derivate penicilamina ili glutationa koje imaju vazodilatirajući efekt i koji inhibiraju agregaciju krvnih pločica i koji su dakle, korisni za pripremu medikamenata za tretman poremećaja cirkulatornog sistema, posebno na kardiovaskularnom nivou.

Pozadina pronalaska

Poznato je da jedinjenja koja mogu oslobađati azotov oksid (NO) u organizam, pokazuju u mnogim slučajevima neki vid dejstva na vaskularni sistem, na primer vazodilatirajuće dejstvo ili inhibiciju agregacije krvnih pločica, što ih čini potencijalno korisnim za tretman različitih poremećaja povezanih sa disfunkcijama cirkulatornog sistema.

Dalje, opisano je i da određeni derivati koji sadrže S-nitrozotiolnu grupu imaju, sa medicinske tačke gledišta, prednosti pošto su sposobne da oslobađaju NO u organizam.

Radomski et al.,Br. J. Pharmacol.(1992) 107, 745 - 749, opisuje da su S-nitrozoglutationska (GSNO) jedinjenja sposobna da inhibiraju dejstvo krvnih pločica.

Golino et al.,Circulation Research.71, No 6 (1992) opisuje daje S-nitrozocistein sposoban da inhibira dejstvo krvnih pločica usled efekta antitromboze.

Smith et al..Met. Find. Exp. Gine. Pharmacy.(1994), 16, 5 opisuje da GSNO proizvodi snažan relaksirajući efekat na arteriole.

W095/12394 opisuje upotrebu S-nitrozo adukata peptida, između ostalih S-nitrozo-N-acetilpenicilamina (SNAP), kao zaštitnih agenasa protiv vaskularne upale traumatskog porekla. V/O95/07691 opisuje upotrebu različitih S-nitrozotiola, konkretno GSNO, u tretmanu i prevenciji dejstva krvnih pločica i formiranju tromboze na oštećenoj vaskularnoj površini.

WO93/09806 opisuje S-nitrozirane proteine ili aminokiselinske ostatke, sposobne za oslobađanje NO, koji imaju relaksirajući efekat na muskulaturu i inhibitorni efekt na agregaciju krvnih pločica.

EP-B1-412699 opisuje S-nitrozotiole koji odgovaraju sledećoj opštoj formuli:

i njihovu upotrebu kao terapeutske agense protiv kardiovaskularnih oboljenja, konkretno protiv hipertenzije (povišenog krvnog pritiska) i kao agense za tretman angine pektoris. Broj mogućih jedinjenja u okviru navedene formule je ogroman i opis eksplicitno opisuje samo nekoliko desetina takvih proizvoda. Staviše, prikazani su samo podaci koji se odnose na njihov opšti vazodilatirajući efekat, a ništa nije pomenuto u vezi sa dejstvom na krvne pločice.

S-nitrozotioli, opisani u prethodno pomenutim dokumentima, sami po sebi ne rešavaju sve komplikovane probleme u tretmanu vaskularnih poremećaja, posebno na kardiovaskularnom nivou. Zato je neophodno razviti nova jedinjenja koja su moćnija i efikasnija.

Suština pronalaska

Tema predmetnog pronalaska se odnosi na nove S-nitrozotiolne derivate penicilamina ili glutationa. od kojih oba imaju snažan vazodilatirajući efekat i visok inhibitorni efekat na agregaciju krvnih pločica.

Dalje, tema predmetnog pronalaska se odnosi na upotrebu novih jedinjenja za proizvodnju medikamenata za tretman poremećaja koji se odnose na disfunkcije cirkulatornog sistema, posebno na kardiovaskularnom nivou.

Detaljan opis pronalaska

Jedinjenja predmetnog pronalaska su S-nitrozotiolni derivati penicilamina ili glutationa, i njihove farmaceutski prihvatljive soli, koji odgovaraju opštoj formuli (I)

naznačenoj time:

što su A i B fenil grupe ili zajedno formiraju ostatak -CH2-Q-CH2- konstituišući šestočlani prsten u kome Q predstavlja atom kiseonika, sumpora ili grupu N-R"1, u kojoj je R<3>vodonik ili alkil grupa C1-C4; R<1>je acil ostatak koji može biti alifatična acil grupa C1-C5ili ostatak glutaminske kiseline vezan preko svojeg neaminokiselinskog karboksila; R<2>je hidroksilna grupa ili glicinski ostatak vezan preko peptidne veze; uz uslov da ako je R alifatični acil ostatak, onda je R hidroksilna grupa, i ako je R ostatak glutaminske'kiseline, onda je R2 glicinski ostatak. Shodno navedenom, jedinjenja predmetnog pronalaska odgovaraju sledećim opštim formulama (II) ili (III)

naznačenim time što A i B imaju prethodno navedena značenja, a R4 je alkil grupa C1-C4, ili farmaceutski prihvatljiva so ovoga.

Poželjni primeri jedinjenja u okviru predmeta pronalaska su sledeći: N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrozomerkaptotetrahidropiran)]sirćetna kiselina (1).

N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrozomerkapto-1 -metilpiperidin)]sirćetna kiselina (2).

N-acetil-2-amino-3-benzil-3-S-nitrozomerkapto-4-fenil-butanska kiselina (3).

N[N-Y-L-glutamil-2-amino-2-(4-(4-S-nitrozomerkapto)tetrahidropiran)acetirj-glicin (4).

N[N-y-L-glutćuiiil-2-amino-2-(4-(4-S-nitrozomerkapto-l-metiIpiperidin)acetil]-glicin (5).

N[N-Y-L-glutamil-2-amino-3-benzil-3-(S-nitrozomerkapto)-4-fenilbutanoil]-glicin (6).

Stručnoj osoblje očigledno da jedinjenja predmetnog pronalaska sadrže hiralne centre i ovo dozvoljava razlučivanje između mogućih izomera ili/i njihovih smeša. Trebalo bi razumeti da se, kako smeše izomera, tako i čisti izomeri, nalaze uokviru predmetnog pronalaska. Poslednji navedeni se mogu dobiti iz smeša izomera putem konvencionalnih tehnika, dobro poznatih stručnjaku, ili putem, njemu takođe dobro poznate, asimetrične sinteze.

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu dobiti na različite načine, a konkretan način generalno zavisi od njegove osnovne strukture.

Na primer, jedinjenja opšte formule (II) mogu se dobiti prema sekvenci koraka ilustrovanoj na sledećoj šemi.

To jest, polazeći od hlorhidrata aminokiselina, koji se mogu dobiti prema poznatim metodama (videti npr. DE-A-3023830 i DE-A-2801849), nakon čega sledi acilacija aminokiselinske azotne grupe putem konvencionalnih tehnika, na primer, hloridom kiseline, i u poslednjem koraku se uvodi nitrozo grupa na sumpor iz merkaptanskc grupe, takođe upotrebom konvencionalnih tehnika.

Što se tiče jedinjenja opšte formule (III), ona se mogu dobiti prema sekvenci koraka ilustrovanoj na sledećoj šemi.

Dakle, polazeći od istih hlorhidrata aminokiselina kao u prethodnom slučaju, nakon čega se zaštićuje merkapto grupa formiranjem tioetra p-metilbenzila. Nakon ovoga se zaštićuje azot iz aminokiseline putem poznate tehnike Boe, a zatim se formira tripeptid sa ostacima glutaminske kiseline i glicina (C-terminal aminokiseline) u čvrstoj fazi, putem poznatih tehnika (pogledati npr. Baranv, G. et al.,The Peptides, 2, l,Gross, E. Meienhofer, Eds.Academic Press, NY (1980); Stevvart, J.M. et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,Freeman, San Francisco, CA (1969); Bodanszkv, M. et al.,Peptide Synthesis,2<nd>ed., Wiley, NY(1976)).

Dobijanje tripeptida uključuje sledeće korake:

a) vezivanje C-terminalnog glicina (Gly) aminokiseline u formi terc-butoksikarbonil (Boe) derivata u smoli p-metilbenzilhidrilamina/polistirena.

b) uklanjanje Boe grupe pomoću trifluorosirćetne kiseline i neutralizaciju.

c) inkorporiranje intermedijerne zaštićene, modifikovane aminokiseline.

d) procenu reakcije sprezanja pomoću ninhidrina (Kaiser. E. et al..Anal. Biochem.,34. 595 (1970)). e) ponavljanje prethodno navedenih koraka za ostatak y-glutaminske kiseline (y-Glu) koja se inkorporira kao Boc-derivat ili benzil zaštićena (Boc-Gly-OBzl). f) actdolizu pomoću anhidrovanog HF u cilju uklanjanja zaštite sa tripeptida i njegovog oslobađanja iz smole.

g) prečišćavanje i karakterizaciju konačnih proizvoda.

Kada se formira tripeptid, prelazi se, kao na poslednji korak, na nitroziranje merkapto

grupe oslobođene od svoje zaštitne grupe.

Izvedeni testovi pokazuju da nova S-nitrozirana jedinjenja predmetnog pronalska pokazuju vazodilatirajuću aktivnost, koja je u najmanju ruku porediva sa aktivnošću GSNO, a u nekim slučajevima značajno superiorna. Dalje, ona imaju inhibitorno dejstvo na agregaciju krvnih pločica, što takođe pokazuje slične ili superiorne rezultate u poređenju sa GSNO, a u pojedinim slučajevima, značajno superiorne.

Kao rezultat ovoga, jedinjenja predmetnog pronalska se mogu veoma efikasno koristiti za proizvodnju medikamenta sa vazodilatirajućim i antitrobotičnim dejstvom u cilju tretiranja disfunkcija cirkulatornog sistema, posebno na kardiovaskularnom i koronarnom nivou.

Shodno tome, jedinjenja opšte formule (I), kao i njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu se koristiti putem konvencionalnih farmaceutskih tehnika, za pripremu medikamenata koji se mogu davati na različite načine.

Kao primer, mogu se davati oralno, u formi farmaceutskih preparata kao što su tablete, kapsule, sirupi i suspenzije. Parenteralno, u formama kao što su rastvori ili emulzije itd. Takođe se mogu davati lokalno u formi krema, pomada, balsama itd., i transdermalno, na primer putem upotrebe flastera i zavoja. Takođe, mogu se direktno aplicirati u rektum, u vidu supozitorija. Preparati mogu sadržavati fiziološki prihvatljive nosioce, ekscipiense, aktivatore, helirajuće agense, stabilizatore itd. U slučaju injekcija, mogu biti inkorporirana kao fiziološki prihvatljivi puferi, rastvarajući agensi ili izotonici. Dnevna doza se može menjati u zavisnosti od specifičnih simptoma, starosne dobi, telesne težine pacijenata, specifičnog vida aplikacije, itd.. i dnevna normalna doza za odraslu osobu može biti između 0,1 i 500 mg, i može se davati kao samo jedna doza ili raspodeljena u više doza tokom dana.

U radnim primerima ovde( vide infra).detaljno su opisani pogodni procesi za dobijanje različitih jedinjenja koja odgovaraju opštoj formuli (I). Na osnovu ovih primera. opšte znanje stručnjaka omogućava dobijanje jedinjenja čiji primeri nisu ovde eksplicitno navedeni, i to putem modifikacije ovde navedenih radnih primera.

Shodno tome, ovde navedeni radni primeri ne treba da budu shvaćeni kao ograničavajući okvir pronalaska, već samo kao dodatna detaljna objašnjenja koja upućuju stručnjaka u dublje razumevanje pronalaska.

Primeri

U eksperimentalnom delu primera koriste se sledeće skraćenice:

AcOEt etil acetat

AcOH sirćetna kiselina

Boe terc-butoksikarbonil

Bzl benzil

DCC dicikloheksilkarbodiimid

DCM dihlorometan

DIEA N-etildiizopropilamin

DIP-CI sonda sa direktnim ubacivanjem - hemijska jonizacija DMF dimetilformamid

DMSO-dčdimetilsulfoksid heksa-deuterijum

EDTA Na2natrijumova so etilendiaminotetrasirćetne kiseline EtOH etanol

EtOEt dietil etar

FAB brzo atomsko bombardovanje

cGMP ciklični guanozin 3',5' monofosfat

HPLC tečna hromatografija pod visokim pritiskom

MeCN acetonitril

MeOH metanol

MS masena spektrometrija

ODQ [IH - [1,2,4] oksadizol [4-3a] hinoksalin-l-ona] PvAOP heksafluorofosfat 7-azabenzotriazol-l-il-oksitris (pirolidin)

fosfonijuma

tBuOH terc-butanol

TFA trifluorosirćetna kiselina

Hlorhidrati polaznih aminokiselina sintetišu se na način opisan u nemačkim patentnim prijavama DE-A-3023830 i DE-A-2801849.

Spektri nuklearne magnetske rezonance realizovani su pomoću Varijan Gemini-200 aparata.

U 'H-NMR spektrima date su radna frekvencija i rastvarač korišćen za dobijanje spektra. Pozicija signala izražena je u 8 (ppm). korišćenjem signala protona rastvarača kao reference. Referentne vrednosti su 7,24 ppm za hloroform i 2,49 ppm za deuterijum dimetilsulfoksid. Unutar zagrada prikazan je broj protona koji odgovara svakom signalu merenom elektronskom integracijom, a tip signala je prikazan upotrebom sledećih skraćenica: s (singlet), d (dublet), t (triplet), dd (dublet dubleta), sb (signal širok), sc (signal kompleksan), d.e. DiO (nestaje tokom realizacije spektra nakon dodatka nekoliko kapi teške vode).

U<lj>C-NMR spektrima date su radna frekvencija i rastvarač za svaki spektar. Pozicija signala izražena je u 5 (ppm), korišćenjem signala protona rastvarača kao reference. Referentne vrednosti su 77,00 ppm za hloroform i 39,50 ppm za deuterijum dimetilsulfoksid.

Dalje, realizovani su eksperimenti nuklearne magnetske rezonance upotrebom testa priključenog protona (APT - Attached Proton Test).

Analiza putem HPLC, radi određivanja čistoće uzoraka vršena je pod sledećim uslovima:

A - Generalni gradijent

Kolona: RP-C18, Simetrija 150 x 3,9 mm, 5u, 100 A

Mobilna laza: H20 + H3PO40,1% / CH3CN + 5% H20 + 0,1% H3PO4

Temperatura: sobna temperatura

Protok 1 mL/min

Zapremina ubrizgavanja 10 uL

B - Izokratski

Kolona: RP-C18, Simetrija 150 x 3,9 mm, 5u, 100 A

Mobilna faza: 50% H20 + H3P040,1% i 50% CH3CN + 5% H20 + 0,1% H3P04Temperatura: sobna temperatura

Protok 1 mL/min

Zapremina ubrizgavanja 10 uL

U pripremi tripeptida tehnike preparativne hromatografije i HPLC su korišćene za prečišćavanje sirovog materijala, a identitet proizvoda je potvrđen masenom spektrometrijom i aminokiselinskom analizom. Čistoća tripeptida analizirana je pomoću HPLC pod sledećim uslovima: kolona tipa Cl8 Nukleozil, 250 x 4 mm, 120 A, 10 um; protok 1 mL/min; eluenti A = H20 (+0,045% TFA) i B - CH3CN (^0,036% TFA).

Ultravioletni spektri (UV) načinjeni su upotrebom Shimadzu UV-160A spektrofotometra. Za svako jedinjenje je naznačena talasna dužina (A.) u nm i molekularna apsorpcija (e) u cm"<1>mol"<1>L.

Za tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom (HPLC) korišćen je ultravioletni fotodiodni detektor Hevvlett-Packard 1040 A.

Primer 1. - Pobijanje N- acetil- 2- amino- 2-[ 4-( 4- S- nitrozomerkaptotetrahidropiran)] sirćetne

kiseline ( 1)

Korak 1)U staklenu posudu od 250 ml snabdevenu magnetskom mešalicom unesu se 4,0 g (17,6 mmol) hlorhidrata 2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahidropiran)]sirćetne kiseline i 60 ml 0,5N rastvora kalijum hidroksida. Zatim se doda 3,07 g (21,8 mmol) anhidrovanog kalijum karbonata i 60 ml MeCN. Smeša se ohladi u ledenom kupatilu i kap po kap se dodaje 1,42 ml (19,7 mmol) acetil hlorida, rastvorenog u 25 ml MeCN. Nakon ovoga dodaje se 0,5N kalijum hidroksid sve dok se ne postigne pH 9-10. Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Zatim se dodaje 2N hlorovodonična kiselina dok se ne postigne pH = 6 i rastvarač se eliminiše na sniženom pritisku. Dobijeni čvrsti proizvod se vakuumski suši iznad fosfor pentoksida i suspenduje se u 150 ml apsolutnog EtOH i meša se na sobnoj temperaturi. Nerastvorni ostatak se isfiltrira i ispere apsolutnim EtOH. Rastvarač se eliminiše na sniženom pritisku. Dobij a se 3,98 g sirovog međuproizvoda N-acetil-2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahidropiran)]sirćetne kiseline, što se podvrgava raznim reverznim preparativnim hromatografskim fazama radi dobijanja 80 mg proizvoda čistoće 90% (HPLC gradijentA, X =205 nm).

'H-NMR (200 Mhz, DMsO-d6) : 7,40 (IH, d, J=10Hz,NH), 4,13 (IH, d, J=10Hz, CH), 3,75 - 3,50 (4H, s.c, CH2). 1,90 - 1,80 (4H, s.c, CH2,), 1,65 (3H, s, CH3).

<I3>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 171.50 (CO-N), 168,90 (CO), 63,69 (CH2), 63,27 (CH2), 62, 80 (CH), 49.18 (C), 37,58 (CH2), 36,12 (CH2), 23,01 (CH3) •

Korak 2)Rastvori se 80 mg (0.34 mmol) N-acetil-2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahidropiran)]sirćetne kiseline u 4000 uL MeOH, a zatim se doda 500 uL 1N rastvora HC1 i 136 uL 5M rastvora NaNO?. Dobijeni rastvor se tretira u toku jednog minuta u ultrazvučnom kupatilu, a zatim se doda 50 uL 10N NaOH i 14 uL H20.

Iz dobijenog rastvora, odvoji se određeni deo A od 470 uL, i u ostatak se doda voda u višku, zamrzne se i liofilizuje radi dobijanja 190 mg higroskopnog čvrstog proizvoda B, koji je blago vlažan.

HPLC (gradijent A):

X220 nm: čistoća frakcije A 68%

X339 nm: čistoća frakcije A 95%.

NMR frakcije B:

'H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6) : 8,00 - 7,50 (IH, s.c, NH), 4,50 - 4,00 (IH, s.c, CH), 3,80 - 3,40 (4H, s.c, CH2), 2,40 - 1,80 (4H, s.c, CH2), 1,88 (3H, s, CH3).

<13>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 173,00 (CO), 169,52 (CO), 67,69 (CH2-0), 63,45 (CH), 53,78 (C), 32,17 (CH2), 22,80 (CH3).

Primer 2. - Pobijanje N- acetil- 2- amino- 2-[ 4- f4- S- nitrozomerkapto- l- metilpiperidin^] sirćetne

kiseline ( 2 )

Korak 1)U staklenu posudu od 250 ml snabdevenu magnetskom mešalicom unesu se 3,69 g (13 mmol) dihlorhidrata 2-amino-2-[4-(4-merkapto-l-metilpiperidin)]sirćetne kiseline i 30 ml 0.5N rastvora kaliium hidroksida. Zatim se doda 2.2<q>(16 n-imoH anliidrnvanop knliinm karbonata i 30 ml MeCN. Smeša se ohladi u ledenom kupatilu i kap po kap se dodaje 1,0 ml (14 mmol) acetil hlorida, rastvorenog u 10 ml MeCN. Nakon ovoga dodaje se 0,5N kalijum hidroksid sve dok se ne postigne pH 9-10. Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Zatim se dodaje 2N hlorovodonična kiselina dok se ne postigne pH = 6 i rastvarač se eliminiše na sniženom pritisku. Dobijeni čvrsti proizvod se vakuumski suši iznad fosfor pentoksida i suspenduje se u 150 ml apsolutnog EtOH i meša se na sobnoj temperaturi. Nerastvomi ostatak se isfiltrira i ispere apsolutnim EtOH i rastvarač se eliminiše na sniženom pritisku. Dobija se 2,8 g sirovog međuproizvoda N-acetil-2-amino-2-[4-(4-merkaptometilpiperidin)]sirćetne kiseline, što se podvrgava raznim reverznim preparativnim hromatografskim fazama radi dobijanja 0,5 g proizvoda čistoće 99% (HPLC gradijent A,X =210 nm).

'H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6) : 8,35 (IH, d, J=10Hz, NH), 4,43 (IH, d, J=10Hz, CH), 3,35 - 3,00 (4H, s.c ., CH2), 2,70 (3H, s, CH3), 2,20 - 1,90 (4H, s.c, CH2), 1,85 (3H, s, CH3).

<I3>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 170,55 (CO-N), 170,05 (CO), 61,77 (CH), 49,33 (CH2), 49,28 (CH2), 46,38 (C), 42,26 (CH3), 33,05 (CH2), 33,14 (CH2), 22,42 (CH3).

Korak 2)Rastvori se 50 mg (0,20 mmol) N-acetil-2-amino-2-[4-(4-merkapto-l-metilpiperidin)]sirćetne kiseline u 800 uL 1N HC1, a zatim se doda 80 uL 5M rastvora NaN02. Dobijeni rastvor se tretira u toku jednog minuta u ultrazvučnom kupatilu, a zatim se doda 80 uL 10N NaOH i 40 uL H20.

Iz dobijenog rastvora, odvoji se određeni deo A od 100 uL, a ostatak se zamrzne i liofilizuje. radi dobijanja 190 mg čvrstog proizvoda B.

HPLC (gradijent A):

X230 nm: čistoća frakcije A 90%; čistoća frakcije B 93%

X334 nm: čistoća frakcije A 98%; čistoća frakcije B 98%.

NMR frakcije B:

'H-NMR (200 Mhz, D20) : 4,71 (IH. s. CH), 2,70 - 2,20 (8H, sc, CH2), 1,95 (3H, s„ CH3-N), 1,71 (3H.s. CH3-CO).

<13>C-NMR (50 Mhz, D20) : 172.51 (CO). 171,52 (CO), 61,08 (CH), 58,18 (C), 48,09 (CH2-N), 48,01 (CH2-N), 42,18 (CH3-N). 30.44 (CH2), 29,85 (CH2), 20,17 (CH3-CO).

Primer 3, - Pobijanje N- acetil- 2- amino- 3- benzil- 3- S- nitrozomerkapto- 4- fenil- butanske

kiseline ( 3)

Korak 1)U staklenu posudu od 100 ml snabdevenu magnetskom mešalicom unesu se 2,0 g (5,9 mmol) 2-amino-3-benzil-3-merkapto-4-fenil-butanske kiseline i 20 ml 0,5N rastvora kalijum hidroksida. Zatim se doda 1,0 g (7,2 mmol) anhidrovanog kalijum karbonata i 20 ml MeCN. Smeša se ohladi u ledenom kupatilu i kap po kap se dodaje 0,5 ml (6,5 mmol) acetil hlorida, rastvorenog u 8 ml MeCN. Nakon ovoga, dodaje se 0,5N kalijum hidroksid sve dok se ne postigne pH 12-13. Smeša se meša na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Zatim se dodaje 2N hlorovodonična kiselina dok se ne postigne pH = 6 i rastvarač se eliminiše na sniženom pritisku. Dobijeni čvrsti proizvod se suspenduje u 100 ml apsolutnog EtOH i meša se na sobnoj temperaturi. Nerastvorni ostatak se isfiltrira i ispere apsolutnim EtOH. Rastvarač se eliminiše na sniženom pritisku. Ostatak se rekristališe u vodi. Nerastvorni deo se isfiltrira i odbaci. Filtrat se zamrzne i liofilizuje. Pobija se 1,64 g međuproizvoda, N-acetil-2-amino-3-benzil-3-merkapto-4-fenil-butanske kiseline. Prinos: 81%.

'H-NMR (200 Mhz, PMSO-d6) : 7,68 (IH, d, J=8Hz, NH), 7,35 - 7,05 (10H, sc, CHar), 4,36 (IH, d, J=8Hz, CH), 3,42 - 3,02 (2H, sc, CH2-Car), 2,95 - 2,55 (2H, sc, CH2), 1,82 (3H, s, CH3).

,<3>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 172,94 (CO-N), 169,08 (CO), 138,55 (Car), 138,16 (Car), 132,36 (2CHar), 131,89 (2CHar), 127,78 (2CHar), 127,53 (2CHar), 126,44 (CH ar), 126,26 (CHar), 60,16 (CH), 55,62 (C), 43,70 (CH2), 42,94 (CH2), 23,14 (CH3).

Korak 2)Rastvori se 0,62 g (1,8 mmol) N-acetil-2-amino-3-benzil-3-merkapto-4-fenil-butanske kiseline u 25 mL MeOH, a zatim se doda 25 mL 1N HC1 i rastvor 250 mg NaN02u 25 mL H20. Dobijeni rastvor se meša tokom 35 minuta na sobnoj temperaturi, isfiltrira i ispere vodom. Nakon sušenja na sniženom pritisku u prisustvu P2C>5 dobija se 0,33 g čvrstog proizvoda.

HPLC (izokratski B):

A 220 nm:čistoća 91%

X342 nm: čistoća 100%

1 H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6) : 8,77 (IH, d, J=10Hz, NH), 7,28 - 7,00 (10H, sc, CHar), 5,33 (IH, d, J=10Hz, CH), 4,12 - 3,90 (2H, sc, CH2), 3,88 - 3,38 (2H, sc, CH2), 1,86

(3H, s, CH3)

<13>C-NMR(50 Mhz, DMSO-d6): 171,55 (CO-N), 169,67 (CO-O), 135,51 (Car), 135,27 (Car), 131,52 (CHar), 131,.41 (CHar), 128,15 (CHar), 128,05 (CHar), 127,04 (CH^), 65,13 (CH), 56,11 (CH), 40, 91 (CH2), 40,15 (CH2), 22,29 (CH3).

Primer 4. - Pobijanje N[ N- Y- L- ghitamil- 2- amino- 2-( 4-( 4- S- nitrozomerkapto^ tetrahidropiran)

acetil] glicina ( 4)

Korak 1)U staklenoj posudi od 250 ml snabdevenoj magnetskom mešalicom. umešaju se 5.8 g (25,5 mmol) hlorhidrata 2-amino-2-(4-(4-merkaptotetrahidropiran))sirćetne kiseline. 4.7 g načini se argonska atmosfera i smeša se meša 18 časova na sobnoj temperaturi. Još 50 mL I-LO/EtOH 3:1 se doda i smeša se meša još dva sata. Dobijena suspenzija se filtrira i ispere sa 100 mL vode i 50 mL EtOH. Dobija se čvrsti proizvod koji se osuši na sniženom pritisku. Preko čvrstog proizvoda se doda 300 mL koncentrovane hlorovodonične kiseline i rastvarač se eliminiše na sniženom pritisku. Ovaj tretman kiselinom se još jednom ponovi i dobija se čvrsti proizvod koji se suši na sniženom pritisku. Dobija se 1,59 g željenog međuproizvoda. 1 H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6) : 8,80 - 8,30 (3H, sb, H3N+), 7,26 (2H, d, J=8 HZ, CHar), 7,12 (2H, d, J=8 HZ , CHar), 4,03 (IH, s, CH-N), 3,85 - 3,55 (6H, sc, CH2-Car, CH2-0), 2,26 (3H, s, CH3), 2,05 - 1,08 (4H, sc, CH2).

<13>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 168,98 (CO), 136,64 (Car), 133,80 (Car), 129,55 (CHar), 129,29 (CH«), 62,36 (CH2-0), 59,85 (CH-N), 49,15 (C), 32,03 (CH2), 31,19 (CH2), 30, 84 (CH2), 20,69 (CH3).

Korak 2)1004 mg hlorhidrata 2-amino-2-(4-(4-p-metilbenzilmerkapto)tetrahidropiran) sirećetne kiseline (3,029 mmol) suspenduje se u 20 mL tBuOH/H20 2:1 i dodaje se 5% NaOH dok se ne postigne pH = 9. Zatim se doda tri ekvivalenta Boc20 i smeša se ostavi da reaguje u toku 30 minuta nakon čega se pH ponovo podesi na pH = 9. Reakcija se produži još 30 minuta i pH se ponovo koriguje. Poređenjem sa polaznom aminokiselinom korišćenjem tankoslojne hromatografije (TLC - Thin Layer Chromatography) potvrđuje se daje reakcija završena.

Proizvod se izoluje u dve uzastopne ekstrakcije pomoću 50 mL heksana i tečna faza se tretira sa 1N HC1 do pH = 2. Zatim se izvrše tri ekstrakciona koraka pomoću 60 mL AcOEt u svakom. Rastvor AcOEt se suši pomoću anhidrovanog MgS04i nakon eliminacije rastvarača isparavanjem, proizvod se ponovo rastvori u DCM i ponovo upari. Ovaj korak se ponavlja još dva puta da bi se dobilo 1191 mg (3,015 mmol) N-Boc zaštićenog međuproizvoda.

Proizvod je karakterisan sledećim:

a) TLC, sa CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5 kao mobilnom fazom. El Rf = 0,48, neopservirajući signal početnog materijala. b) HPLC u gradijentu od 10% do 100% MeCN tokom 30 minuta + izokratski na 100% MeCN u toku 5 minuta. Rezultujuća čistoća je 96% (220 nm). c) Masena spektrometrija FAB tehnikom: M izračunato = 395, (M + H<+>) eksperimentalno = 396,0 d) NMR (CDCI3) : 7,18 (2H, d, J=8 Hz) 7.09 (2H, d, J=8 Hz). 5,54 (IH, d, J=l 1,2 Hz), 4,44 (IH, d, J=8.3 Hz). 3,69 (IH, d. J=11.2 Hz), 3.57 (IH. d, J-11,2 Hz), 3,75 - 3,98 (4H, sb),

2,32 (3H, s), 1,26 - 2,19 (4H, sb), 1,46 (9H. s).

Korak 3)Tripeptid se priprema tehnikama sinteze u čvrstoj fazi, polazeći od 1595 mg Boc-Gly-OCH2-Pam-smole (Neosystem, ref. Br. RP00801) 0,63 mmol/g sustitucije. Radni opseg je 1,005 mmol.

Opšti protokol za adiciju amino ostatka je sledeći:

1) Nadizanje smole sa 5 ispiranja od 0,5 min sa DCM.

2) Uklanjanje Boe grupe pomoću TFA u DCM, 1 x 1 min + 1 x 20 min.

3) Ispiranje sa DCM 5 x 0,5 min.

4) Testiranje putem ninhidrina.

5) Ispiranje sa DMF 3x1 min.

6) Sprezanje tokom 1,5 sati.

7) Ispiranje sa DMF 3x1 min.

8) Ispiranje sa DCM 5 x 0,5 min.

9) Testiranje putem ninhidrina.

U slučaju da test putem ninhidrina u konačnom koraku bude pozitivan, pristupa se ponovnom povezivanju ponavljanjem koraka 5-8.

Sprezanje je realizovano pomoću 6 ekvivalenata (eq) DIEA, 3 eq. Boc-aminokiseline i 3 eq. aktivnog agensa, koji je u ovom slučaju PyAOp (heksafluorofosfat 7-azabenzotriazol-l-il-oksitris (pirolidino) fosfonijum). Za sprezanje y-Glu korišćen je Boc-Glu-(oc-OBzl).

Nakon završene sekvence sprezanja, dobij ena peptidil-smola podvrgava se acidolizi pomoću HF/p-krezola (9:1) u toku jednog sata na 0 °C. Nakon isparavanja čvrsti ostatak se ekstrahuje anhidrovanim EtOEt-om a zatim se peptid izoluje ekstrakcijom pomoću AcOH 10%. Kada se zapremina smanji isparavanjem, sirovi materijal se liofilizuje i karakteriše pomoću:

a) HPLC u gradijentu od 5% do 65% MeCN tokom 30 min.

b) MS tehnikom Electrospray:Mca|C=377, (M+H<+>)exp=378,2

Količina peptida se kvanitifikuje aminokiselinskom analizom: m = 329 mg (0.873 mmol).

U svim peptidnim kvantifikacijama koristi se peptidna analiza dodavanjem eksterne šarže Ile (izoleucina) uzorku za hidrolizu.

Prečišćavanje tripeptida (u dve šarže) vrši se pomoću HPLC u preparativnim razmerama. Korišćen je sledeći sistem:

- Kolona: Cl8 Nukleozil, 200 x 20 mm, 120 A, 10 pm.

- Eluenti: A = H20 (+0,1% TFA), B = MeCN (+0,1% TFA).

- Gradijent: Izokratski 0% B tokom 40 min + gradijent od 0% do 10% B tokom 40 min.

Protok: 25 mL/min.

Dobija se ukupna količina od 227 mg (0,602 mmol) tripeptidnog međuproizvoda koji je karakterisan sledećim: a) HPLC u gradijentu od 5% do 45% MeCN tokom 20 min. Dobijena čistoća iznosi 95% (220 nm). Mali pik na 8,4 min smanjuje se relativno, dok ne nestane, progresivnim razblaživanjem primenjenog uzorka. Prema tome, zaključuje se da on odgovara agregaciji tripeptida (a ne oksidaciji) i zato se smatra validnim proizvodom.

b) MS Electrospray: Mca,c=377 (M+H<+>)exp=378,2

Korak 4)Rastvoru 14,2 mg (0,38 mmol) tripeptida, dobijenog u koraku 3, u 800 uL 1N HC1,

doda se 76 uL rastvora 0,5M NaN02. Agitacija se vrši u ultrazvočnom kupatilu, na sobnoj temperaturi u toku jednog minuta, a zatim se doda 80 uL 10N rastvora NaOH. Dobijeni rastvor se zamrzne i liofilizuje, a dobijeni čvrsti proizvod je karakterisan sledećim: 'H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6): 8,90 - 8,50 (2H, sb, NH), 5,35 (IH, d, J=10 Hz, CH), 4,10 - 3,00 (3H, sc, CH2, CH), 1,95 - 1,65 (4H, sc, 2CH2).

<13>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 172,18 (CO-N), 171,21 (CO-N), 168,40 (CO-O), 63,03 (CH2), 62,31 (C), 59,56 (CH), 53,19 (CH), 41,20 (CH2), 32,94 (CH2), 31,71 (CH2), 31,41 (CH2), 27,12 (CH2).

HPLC (Metod A):X220 nm (čistoća 94%);X334 nm (čistoća 95%)

UV:X346 nm e (H20) 502 cm"<1>mol"<1>L

Primer 5. - Pobijanje N[^- Y- L- glutamil- 2- amino- 2-( 4- f4- S- nitrozornerkapto- l- metil-

piperidinlacetil] glicina ( 51

Korak 1)U staklenoj posudi od 100 ml snabdevenoj magnetskom mešalicom, umešaju se 6,4 g (23 mmol) dihlorhidrata 2-amino-2-(4-(4-merkapto-l-metilpiperidin))sirćetne kiseline, 4,3 g (23 mmol) a-bromo-p-ksilena i 40 ml smeše H20/EtOH 1:1. Poda se 13 mL trietilamina, načini se argonska atmosfera i smeša se meša 42 časa na sobnoj temperaturi. Iz dobijenog rastvora, eliminiše se rastvarač, na sniženom pritisku, i dobijenom sirovom materijalu se doda 20 mL apsolutnog EtOH. Pobijeni čvrsti materijal se filtrira i ispira sukcesivno pomoću apsolutnog EtOH i EtOEt, pa se osuši na sniženom pritisku. Pobija se 2,11 g međuproizvoda, hlorhidrata 2-amino-2-(4-(4-(p-metilbenzilmerkapto)-l -metilpiperidin))sirćete kiseline. Prinos: 29,6%.

NMR spektar je registrovan u P2O, a kao referenca je uzeto 4,75 ppm za HPO.

'H-NMR (200 Mhz, P20) : 7,28 (2H, d, J=8 Hz, CHar), 7,15 (2H, d, J=8 HZ , CHar), 3,64 - 3,74 (2H, sc, CH2-Car), 3,62 (IH, s, CH-N), 3,4-3,1 (4H, sc, CH2-N), 2,76 (3H, s, CH3-N), 2,24 (3H, s, CH3), 2,15 - 1,92 (4H, sc, CH2).

<13>C-NMR (50 MhZ, P20) : 173,15 (CO), 141,00 (Car), 136,39 (Car), 132,58 (CHar), 131, 95 (CHar), 63,57 (CH-N), 52,48 (CH2)<+>, 50,65 (C), 45,66 (CH3-N), 34,05 (CH2), 32,35 (CH2), 31,28 (CH2), 22,.77 (CH3).

Korak 2)Polazeći od 1016 mg (2,958 mmol) međuproizvoda dobijenog u prethodnom koraku i nastavljajući na način opisanom u koraku 2, primera 4, dobija se 1016 mg (2,490 mmol) N-Boc zaštićenog intermedijera, karakterisanog sledećim: a) CCF (mobilna faza CHCI3/MeOH/AcOH 85:10:5). R, = 0,32, uočava se bez signala početnog proizvoda. b) HPLC gradijent od 10% do 100% MeCN u toku 30 min. Čistoća je 96% (220 nm).

c) MS,tehnikom FAB: Maxlc = 408 (M+H+)exp = 408,9

d) MS, tehnikom Electrosprav: (M+H<+>)exp = 409,3

Korak 3)Tripeptidni međuproizvode se dobija upotrebom metode opisane u koraku 3,

primera 4, polazeći od 794 mg prethodno pomenute smole. Radni opseg je 0,5 mmol. Usled poteškoća u solubilizaciji Boc-derivata, odabrana je upotreba N-metilmorfolina kao baze (3 ekvivalenta) umesto DIEA u prethodno navedenoj reakciji sprezanja. Nakon inkorporacije yGlu, tripeptid se sklapa i veza peptid-smola se raskida acidolizom na isti način kao što je ranije opisano. Konačno, dobija se sirov materijal u 10% AcOH, koji se zatim liofilizuje i kvantifikuje. Dobija se 137 mg (0,351 mmol) intermedijarnog tripeptida koji je karakterisan sledećim: a) HPLC, izokratski gradijent 0% u toku 10 min + 5%-*65% MeCN u toku 30 min.

Primećuje se da injektovani proizvod u sirćetnom rastvoru eluira sa frontom, zbog

čega je neophodno liofilizovati činioce u cilju eliminisanja kiseline i ponovno rastvoriti liofilizat u lmM HC1. Na ovaj način, peptid može biti hromatografski uočen i eluira na 6,8 min u upotrebljenom gradijentu.

b) MS, tehnikom Electrospray: McaIc= 390, (M+H<+>)exp = 391,2

Prečišćavanje sirovog materijala obavlja se putem HPLC u preparativnim razmerama

sa parametrima koji su već opisani u primeru 4. I ovde se primenjuje izokratski od 0% B u toku 40 minuta, a zatim gradijent od 0% do 10% B u toku 40 minuta. Na ovaj način dobija se 107 mg (0,274 mmol) proizvoda karakterisanog sledećim: a) HPLC, gradijent od 0% do 0% u toku 10 min plus 0% do 30% u toku 20 min. Čistoća je 94% (220 nm). Potvrđuje se da dodatni pik na 8,0 min i u ovom slučaju

odgovara agregaciji i to se u skladu sa time pripisuje ispravnom proizvodu.

b) MS tehnikom Electrospray: Mcaic=390, (M+H<T>)exP= 391,1

Korak 4)Polazeći od 10,0 mg (0,026 mmol) tripeptidnog međuproizvoda, dobijenog u prethodnom koraku, nitroziranje se obavlja na način opisan u koraku 4. primera 4, upotrebom 52 uL 0.5M NaN02. Dobijeni proizvod je karakterisan sledećim:<13>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 171,57 (CO-N), 170,99 (CO-N), 170,76 (CO-N), 168,20 (CO-0), 60,23 (C), 59,53 (CH). 51,57 (CH), 49.02 (CH2), 42.20 (CH3), 41,59 (CH2), 30,49 (CH2), 29,75 (CH2), 29,31 (CH2), 26,05 (CH2).

HPLC (Metod B):X220 nm (čistoća 74%);X334 nm (čistoća 88%).

UV:X346 nm s (H20) 198 cm"<1>mol"<1>L.

Primer 6. - Pobijanje N[ N- y- L- glutamil- 2- amino- 3- benzil- 3-( S- nitrozomerkapto)- 4-

fenilbutanoil] glicina ( 6)

Korak 1)U staklenoj posudi od 100 ml snabdevenoj magnetskom mešalicom, umešaju se 1,25 g (3,7 mmol) hlorhidrata 2-amino-3-benzil-3-merkapto-4-fenilbutanske kiseline, 0,68 g (3,7 mmol) a-bromo-p-ksilena i 40 ml smeše H20/EtOH 1:1. Poda se 1,6 mL trietilamina i najveći deo suspendovanog čvrstog materijala se rastvori. Formira se argonska atmosfera i smeša se meša 24 časa na sobnoj temperaturi. Etanol i deo trietilamina se eliminišu na sniženom pritisku. Pobijena tečna suspenzija se filtrira i dobija se bela čvrsta supstanca. Ona se prečišćava putem reverzno fazne hromatografije na koloni sa CH3CN-H20. Preko HoKiipnna r.vr^tno mnt<p>riinln HnHn se 100 ml. MrOH/HC1! 1*1 i rn«?tvnrfip <!P<p>liminiS<p>nii sniženom pritisku. Dobija se 0.5 g međuproizvoda, hlorhidrata 2-amino-3-benzil-3-(4-metilbenzilmerkapto)-4-fenilbutanske kiseline.

1 H-NMR (200 Mhz, DMSO-d6) : 8,95 - 8.50 (3H, sb, H3N+). 7.45 - 7,25 (10H, sc. CH«), 7.08 (2H, d, J=10 Hz, CHar), 6,98 (2H, d, J=10 Hz, CHar), 4,05 (IH, s. CH-N), 3, 55 - 3,0 (4H , sc, CH2-C6H5, CH2-Car), 290 - 2,60 (2H, sc, CH2), 2,20 (3H, s, CH3)

<13>C-NMR (50 Mhz, DMSO-d6) : 168,70 (CO), 136,53 (Car), 136,00 (Car), 134,94 (Car), 132,50 (Car), 131,18 (CHar), 129,169 (CHar), 128,90 (CHar), 128,26 (CH«.), 128,02 (CHar), 127,07 (CHar), 57,06 (CH-N), 53,64 (C), 42,22 (CH2), 41,65 (CH2), 31,90 (CH2-S), 20,48 (CH3).

Korak 2)Polazeći od dve frakcije dobijene u prethodnom koraku (180 mg, čistoće 83% i 530 mg, čistoće 94%) i nastavljajući na način opisan u koraku 2, primera 4, dobija se 733 mg (1,45 mmol) N-Boc zaštićenog međuproizvoda, karkaterisanog sledećim:

a) CCF (CHCl3-MeOH-HOAc 85:10:5), Rf = 0,63.

b) HPLC gradijent od 10% do 100% MeCN, 30 min, izokratski 100%, 5 min, čistoća 91% (220 nm) c) EM-MALDI-TOF (maseni spektar): Matrica dihidroksibenzoeve kiseline, Mcaic= 505, (M+H<+>)exP=528,585 (M+Na)

d) NMR: Prisustvo Boe grup je potvrđeno.

Korak 3)Tripeptidini međuproizvod se dobija upotrebom metode opisane u koraku 3, primera

4, polazeći 0,43 mmol gore pomenute smole. Nakon acidolitičkog koraka, izoluje se sirov materijal koji sadrži 14,4 mg (29,96 umol) tripeptidnog međuproizvoda koji je karkaterisan sledećim: a) HPLC analitički gradijent od 5% do 65% u toku 30 min, približna čistoća 95%.

b) EM-electrospray Mca!c=487 (M+H<+>), Mexp=488,3

Korak 4)Polazeći od 5,7 mg (0,012 mmol) tripeptidnog međuproizvoda, dobijenog u

prethodnom koraku, nitroziranje se obavlja na način opisan u koraku 4, primera 4, upotrebom 24 uL 0.5M NaN02. Dobijeni proizvod je karakterisan sledećim:

HPLC (Metod A):X220 nm čistoća 68%;X334 nm čistoća 86%.

UV:X345 nm s (H20) 368 cm"<1>mol"<1>L.

Primer 7 - Testovi za in vitro vazodilataciju

Metod korišćen u probama je suštinski isti poput opisanog u sledećim referencama:

* Furchgot. R.F. "'Methods in nitric oxide research". Feelisch & Stamler eds. John Wiley & Sons. Chicester. England. pp 567/581.

* Trongvanichnam, K, et al. Jpn J. Pharmacol. 1996; 71:167-173.

* Salas, E., et al. Eur. J. Pharmacol. 1994; 258:47-55.

Jedinjenja su testirana u pet različitih koncentracija, u opsegu koncentracija od 0,001 do 10 mM, upotrebom od 6 do 9 arterijskih prstenova za svako jedinjenje. Dobijeni rezultati su upoređeni sa rezultatima za S-nitrozoglutation (GSNO), koji je korišćen kao referentni proizvod.

Rezultati su prikazani ispod, u tabeli 1, i dati su kao CE50(efektivna koncentracija 50), stoje koncentracija svakog od testiranih jedinjenja pri kojoj se dobija vazodilatacija od 50% arterijskog prstena, prethodno kontrahovanog pomoću 1 uM norepinefrina.

Kao što se može videti, sva testirana jedinjenja pokazuju snažno vazodilatirajuće dejstvo, slično ili superiorno u odnosu na dejstvo referentnog jedinjenja (GSNO), a jedinjenje 2 pokazuje vazodilatirajuće dejstvo koje je značajno superiorno u odnosu na dejstvo referentnog proizvoda.

Primer 8 - In vitro testovi inhibicije agregacije krvnih pločica

Metod korišćen u probama je suštinski isti poput opisanog u sledećim referencama:

* Loscalzo J, et al. En: Methods in nitric oxide research (Feelisch M, Stamler JS, eds.), John Wiley & Sons, Chichester, England, pp 583 - 591.

* Radomski MW, et al. Br J Pharmacol 1987;92:181-187.

* Salas E, et al. BrJ Pharmacol 1994;112:1071-1076.

Jedinjenja su testirana u četiri različite koncentracije, korišćenjem krvnih pločica od 5 do 23 različitih donora. Dobijeni rezultati su upoređeni sa rezultatima za S-nitrozoglutation (GSNO), koji je korišćen kao referentni proizvod.

Rezultati su prikazani ispod, u tabeli 2, i dati su kao CI50(koncentracija inhibicije 50), što je koncentracija svakog od testiranih jedinjenja pri kojoj se ostvaruje inhibicija 50% agregacije dobijene sa sub-maksimalnom koncentracijom kolagena (1 pg/mL).

Kao što se može videti iz tabele 2, sva testirana jedinjenja pokazuju snažno inhibitorno dejstvo na agregaciju krvnih pločica, slično ili superiorno u odnosu na dejstvo referentnog jedinjenja (GSNO), a jedinjenja 1 i 5 imaju inhibitorno dejstvo na agregaciju krvnih pločica koje je značajno superiorno u odnosu na dejstvo referentnog proizvoda.

Primer 9 - In vitro testovi povećanja nivo cGMP unutar krvnih pločica

Jedinjenje dobijeno u primeru 5 (5) testirano je in vitro da se proveri njegova sposobnost da poveća nivo cGMP unutar krvnih pločica u preparatu humanih ispranih krvnih pločica.

Metod korišćen u testu je suštinski isti poput opisanog u referencama citiranim u primeru 8.

Jedinjenja su testirana u četiri različite koncentracije, korišćenjem krvnih pločica od 5 različitih donom. Dobijeni rezultati su upoređeni sa rezultatima dobijenim sa GSNO (referentni proizvod) i sa bazalnim vrednostima.

Rezultati su prikazani u tabeli 3. izraženi kao pmol/10<9>krvnih pločica.

Jedinjenje 5 povećava nivo GMP unutar krvnih pločica na sličan način kao GSNO referenca. Treba pomenuti da za vrednosti bliske Ciso, jedinjenje 5 indukuje nivoe cGMP niže od onih koje indukuje GSNO kada se koristi u koncentracijama bliskim svojem CI50.

Primer 10 - In vitro test blokiranja inhibicije agregacije krvnih pločica

Metod korišćen u testu je suštinski isti puput opisanog u referencama citiranim u primeru 8, kompletiran sa referencom:

• Moro MA, et al. Pr Nat Acad Sc USA. 1996; 93:1480-5.

ODQ je testiran in vitro u cilju blokiranja inhibicije agregacije krvnih pločica, postignute dobijenim proizvodima kod preparata humanih, ispranih krvnih pločica.

Jedinjenje dobijeno u primeru 5 (5) je testirano u tri različite koncentracije, u prisustvu i odsustvu ODQ (1 uM) korišćenjem krvnih pločica od 5 različitih donora. Dobijeni rezultati su upoređeni sa rezultatima dobijenim sa GSNO (referentni proizvod) i sa vrednostima u odsustvu ODQ.

Rezultati su prikazani u tabelama 4 i 5, i predstavljeni kao procenti inhibicije maksimalne agregacije.

ODQ (1 uM) je sposoban da blokira inhibitorni efekat GSNO i jedinjenja 5, kada je korišćena CI50doza jedinjenja. Pri višim dozama od CI50, efekat inhibicije agregacije je bolje blokiran u slučaju jedinjenja 5 u odnosu na slučaj referentnog proizvoda.

Claims (1)

1. S-nitrozotiolni derivati penicilamina ili glutationa i njihove farmaceutski prihvatljive soli, koje odgovaraju sledećoj opštoj formuli (I) naznačeni time što: A i B su fenil grupe ili zajedno formiraju ostatak -CH2-Q-CH2- koji čini šestočlani prsten gde Q predstavlja atom kiseonika ili sumpora ili grupu N-R<3>, gde je R<3>vodonik ili alkil grupa C1-C4; R<1>je acil ostatak, koji može biti alifatična acil grupa Ci-Csili ostatak glutaminske kiseline vezan preko svog neaminokiselinskog karboksila; R<2>je hidroksilna grupa ili glicinski ostatak vezan preko peptidne veze; pri čemu, ako je R<1>alifatični acil ostatak onda je R<2>hidroksilna grupa, i ako je R<1>ostatak glutaminske kiseline onda je R<2>glicinski ostatak.

2. S-nitrotiazoli prema zahtevu 1, koji odgovaraju sledećoj opštoj formuli (II) naznačeni time što A i B imaju prethodno navedena značenja, a R4 je alkil grupa C1-C4.

3. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, naznačeno time što je N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrozomerkaptotetrahidropiran)]sirćetna kiselina (1).

4. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, naznačeno time što je N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrozomerkapto-l -metilpiperidin)]sirćetna kiselina (2).

5. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, naznačeno time što je N-acetil-2-amino-3-benzil-3-S-nitrozomerkapto-4-fenil-butanska kiselina (3). naznačeni time što A i B imaju prethodno navedena značenja.

7. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 6, naznačeno time što je N[N-y-L-glutamil-2-amino-2-(4-(4-S-nitrozomerkapto)tetrahidropiran)acetil]-glicin (4).

8. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 6, naznačeno time što je N[N-y-L-glutamil-2-amino-2-(4-(4-S-nitrozomerkapto-1 -metilpiperidin))acetil]-glicin (5).

9. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 ili 6, naznačeno time što je N[N-y-L-glutamil-2-amino-3-benzil-3-(S-nitrozomerkapto)-4-fenilbutanoil]-glicin (6).

10. Upotreba S-nitrozotiola prema bilo kome od prethodno navedenih zahteva naznačena time što se koristi za proizvodnju medikamenta za tretman cirkulatornih disfunkcija.

11. Upotreba prema zahtevu 10 naznačena time što se koristi za proizvodnju medikamenta za tretman disfunkcija kardiovaskularnog sistema.