CZ298871B6 - S-Nitrosothioly jako prostredky pro lécení obehových dysfunkcí - Google Patents

Abstract

S-Nitrosothiolové deriváty penicilaminu nebo glutathionu, které odpovídají obecnému vzorci I, ve kterém: A a B jsou fenylové skupiny nebo spolu dohromady tvorí zbytek -CH.sub.2.n.-Q-CH.sub.2.n.- dotvárející šesticlenný kruh, ve kterém Q predstavuje atom kyslíku, síry nebo skupinu N-R.sup.3.n., ve které je R.sup.3.n. vodík nebo alkylová skupina C.sub.1.n.-C.sub.4.n.; R.sup.1.n. je acylový zbytek,který muže být alifatickou acylovou skupinou C.sub.1.n.-C.sub.5.n. nebo zbytkem glutamové kyseliny vázaným prostrednictvím od aminoskupiny vzdálenejší karboxylové skupiny; R.sup.2.n. je hydroxylová skupina nebo zbytek glycinu vázaného pomocí peptidové vazby; s tou podmínkou, že je-li R.sup.1.n. alifatický acylový zbytek, je pak R.sup.2.n. hydroxylová skupina a je-li R.sup.1.n. zbytkem glutamovékyseliny, je pak R.sup.2.n. zbytkem glycinu. Novéslouceniny mají vasodilatacní úcinek a inhibují agregaci krevních desticek, což je ciní využitelné pro lécbu dysfunkcí obehového systému, zejména na kardiovaskulární úrovni.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových S-nitrosothiolových derivátů penicilaminu nebo glutathionu majících vasodilatační účinek, které i inhibují agregaci krevních destiček, a které jsou tudíž využitelné pro přípravu medikamentů pro léčení disfunkcí oběhového systému zvláště na kardiovaskulární úrovni.

Dosavadní stav techniky

Je obecně známo, že sloučeniny schopné uvolňovat do organismu oxid dusnatý (NO) v mnoha případech projevuji jistý druh aktivity na vaskulámí systém, na příklad vasodilatační účinek nebo na agregaci krevních destiček, což je činí potenciálně využitelné pro léčení různých poruch týkajících se oběhového systému.

Dále je také popsáno, že specifické deriváty, které obsahují S-nitrosothiolovou skupinu, mají z lékařského hlediska výhodnou vlastnost díky tomu, že jsou schopny uvolňovat do organismu NO.

Radomski a spol., Br. J. Pharmacol. (1992) 107, 745-749, popisuje, že sloučeniny S-nitrosoglutathionu (GSNO) jsou schopné inhibovat aktivitu krevních destiček.

Golino a spol., Circulation Research, 71, č. 6 (1992) popisuje, že S-nitrosocystein je schopen inhibovat aktivitu krevních destiček díky antitrombotickému účinku.

Smith a spol., Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. (1994), 16, 5, popisuje, že GSNO vytváří silný relaxační účinek na arterioly.

WO 95/12394 popisuje užití S-nitrosoaduktů peptidů, mezi jinými S-nitroso-N-acetyl30 penicilaminu (SNAP), jako ochranných činidel proti vaskulámímu zánětu traumatického původu.

WO 95/07691 popisuje použití různých S-nitrosothiolů, zejména GSNO, při ošetřování a prevenci působení krevních destiček a vzniku trombózy u poškozeného vaskulámího povrchu.

WO 93/09806 popisuje S-nitrosované proteiny nebo aminokyselinové zbytky schopné uvolňovat NO, které mají relaxační efekt na svalstvo a inhibiční efekt na agregaci krevních destiček.

EP-BIX12699 popisuje S-nitrosothioly, které odpovídají následujícímu obecnému vzorci:

ajejich použití jako terapeutických prostředků proti kardiovaskulárním chorobám, zejména jako antihypertenziva (zvýšený krevní tlak) a jako prostředků pro ošetřování angíny pectoris. Množství možných sloučenin podle řečeného vzorce je enormní a popis explicitně uvádí pouze několik desítek takových produktů. Dále tam jsou uvedena pouze data, která se týkají jejich obecného vasodilatačního účinku a není zmiňováno nic v souvislosti s aktivitou krevních destiček.

-1 CZ 298871 B6

S-Nitrosothioly popisované ve shora zmíněných sděleních samy o sobě neřeší všechny komplikované problémy při léčení vaskulámích poruch, zejména na kardiovaskulární úrovni. Je proto potřebné vyvíjet nové sloučeniny, kteréjsou silnější a účinnější.

Podstata vynálezu

Předmět předkládaného vynálezu se vztahuje na nové S-nitrosothiolové deriváty penicilaminu nebo glutathionu, které oboje mají silný vasodilatační účinek a vysoký inhibiční efekt na agregaci krevních destiček.

Dále se předmět předkládaného vynálezu vztahuje na použití nových sloučenin na výrobu medikamentů pro léčení poruch týkajících se dysfunkcí oběhového systému, zvláště na kardiovaskulární úrovni.

Podrobný popis vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu jsou S-nitrosothiolové deriváty penicilaminu nebo glutathionu a jejich farmaceuticky přijatelné soli, které odpovídají následujícímu obecnému vzorci (I)

0).

ve kterém:

A a B jsou fenylové skupiny nebo spolu dohromady tvoří zbytek -CH₂-Q-CH₂- dotvářející šestičlenný kruh, ve kterém Q představuje atom kyslíku, síry nebo skupinu N-R³, ve které je R³ vodík nebo alkylová skupina C]-C₄;

R¹ je acylový zbytek, který může být alifatickou acylovou skupinou Ci~C₅ nebo zbytkem 25 glutamové kyseliny vázaným prostřednictvím vzdálenější karboxylové skupiny nesousedící s ot-aminoskupinou;

R² je hydroxylová skupina nebo zbytek glycinu vázaného pomocí peptidové vazby;

s tou podmínkou, že je-li R¹ alifatický acylový zbytek, je pak R² hydroxylová skupina a je-li R¹ zbytkem glutamové kyseliny, je pak R² zbytkem glycinu.

Proto tedy sloučeniny podle vynálezu odpovídají následujícím obecným vzorcům (II) nebo (III)

ve kteiých A a B mají význam uvedený svrchu a R⁴ je alkylová skupina C]-C₄, nebo jejich 35 farmaceuticky přijatelným solím.

-2CZ 298871 B6

Preferované příklady sloučenin zahrnující předmět vynálezu jsou následující: jV-acetyl-2 amino-2-[4-(4-5^,-nitrosomerkaptotetrahydropyran)]octová kyselina (!).

#-acetyl-2-amino-2-[4-(4-ó'-nitrosomerkapto-l-methylpiperidin)]octová kyselina (2).

2V-acetyl-2-amino- 3-benzyl-3-S-nitrosomerkapto-4-fenylbutanová kyselina (3).

A^í-{A^ř-y-L-glutamyl-2-amino-2-[4-(4“S-nitrosomerkaptotetrahydropyran)Jacetyl}-glycin (4).

2V-{A^r-y-L-glutamyl-2-amino-2-[4-(4-ó'-nitrosomerkapto-l-methylpiperidin)]acetyl}-glycin (5).

-3CZ 298871 B6

/V-{/V-y-L-glutamyl-2-amino-3-benzyl-3-(5-nitrosomerkapto)-4-fenylbutanoyl]-glycin (6).

Pro zkušeného pracovníka je zřejmé, že sloučeniny podle vynálezu obsahují chirální centra a to umožňuje rozlišovat mezi možnými izomery a/nebo jejich směsmi. Je třeba chápat, že jak směsi izomerů tak čisté izomery patří do předmětu vynálezu. Čisté izomery mohou být ze směsí izomerů získávány expertovi dobře známými konvenčními technikami nebo asymetrickou syntézou jemu rovněž dobře známou.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být získány různými způsoby a konkrétní způsob bude obvykle záviset na jejich základní struktuře. Na příklad sloučeniny obecného vzorce (II) mohou být získány sekvencí kroků ilustrovaných následujícím schématem:

Tj. vychází se z hydrochloridů aminokyselin, které lze získat podle obvyklých metod (viz např. 15 DE-A-3023830 a DE-A-2801849), s následující acylací dusíkové skupiny aminokyseliny konvenčními technikami, na příklad acylchloridem a v konečném stupni je pak zavedena nitrosová skupina na síru merkaptoskupiny, rovněž za použití běžných technik.

Pokud se týká sloučenin obecného vzorce (III) mohou být získány podle sledu kroků ilustro20 váných následujícím schématem.

-4CZ 298871 B6

Tj. vychází se z týchž hydrochloridů aminokyselin jako v případě nahoře, s následujícím ochráněním merkaptoskupiny vytvořením /?-methylbenzylthioetheru. Toto je následováno ochráněním dusíku aminokyseliny běžnou Boc technikou a potom se vytvoří tripeptid se zbytky glutamové kyseliny a glycinu (C-zakončení aminokyseliny) v pevné fázi známými metodami [viz např. Barany G. a spol., The Peptides, 2,1, Gross, E. Meienhofer, Eds. Academie Press, NY (1980); Stewart J. M. a spol., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco CA (1969); Bodanszky M. a spol., Peptide Synthesis, 2^nd ed., Wiley NY (1976)].

ío Vytvoření tripeptidu zahrnuje následující kroky:

a) Zakotvení C-zakončení aminokyseliny glycinu (Gly) ve formě Zere-butoxykarbonylderivátu (Boc) na pryskyřici p-methylbenzylhydrylamin/polystyren.

b) Odstranění Boc skupiny trifluoroctovou kyselinou a neutralizace.

c) Inkorporování přechodně chráněné modifikované aminokyseliny.

d) Zhodnocení kondenzační reakce pomocí ninhydrinu [Kaiser E. spol., Anal. Biochem. 34, 595 (1970)].

e) Opakování hořejších kroků pro zbytek γ-glutamové kyseliny (γ-Glu), která je inkorporována jako Boc-derivát nebo chráněná benzylem (Boc-Glu-OBzl).

f) Acidolýza bezvodým HF pro deprotekci tripeptidu a jeho uvolnění z pryskyřice.

g) Rafinace a charakterizace finálních produktů.

Jakmile se utvoří tripeptid, přistupuje se jako poslední stupeň knitrosaci merkaptoskupiny uvolněné od její chránící skupiny.

Provedené testy ukazují, že nové S-nitrosované sloučeniny podle vynálezu mají vasodilatační účinnost, která je při nejmenším srovnatelná s účinností GSNO a v některých případech ji vysoce převažuje. Dále mají inhibiční účinek na agregování krevních destiček, z něhož rovněž vyplývá, že je obdobný nebo lepší ve srovnání s GSNO a v některých případech podstatně lepší.

Z toho plyne, že sloučeniny podle vynálezu mohou být velmi účinným způsobem využity pro výrobu medikamentu s vasodilatačním a antitrombotickým účinkem pro léčení dysfunkcí oběhového systému, zvláště na kardiovaskulární a koronární úrovni.

Proto tedy sloučeniny obecného vzorce (I), stejně jako jejich farmaceuticky přijatelné soli, mohou být za použití obvyklých farmaceutických technik využity k přípravě léčiv, které mohou být podávány různými způsoby.

-5CZ 298871 B6

Jako příklad mohou být podávány orálně ve formě farmaceutických preparátů jako tablet, kapslí, sirupů a suspenzí. Parenterálně ve formách jako v roztocích nebo emulzích atd. Mohou být také podávány místně ve formě krémů, pomád, balzámů atd. a transdermálně na příklad aplikací náplastí nebo bandáží. Lze je také per rektum aplikovat přímo jako čípky. Přípravky mohou obsahovat fyziologicky přijatelné nosiče, excipienty, aktivátory, chelatizační činidla, stabilizátory atd. V případě injekcí mohou být začleněny jako fyziologicky přijatelné pufry, solubilizační činidla nebo isotonické roztoky. Denní dávka může být obměňována podle specifických symptomů, věku, tělesné hmotnosti pacienta, specifického způsobu administrace atd. a normální denní dávka pro dospělou osobu by měla být mezi 0,1 až 500 mg a měla by být podávána jako pouze jediná dávka nebo rozdělená na několik dávek během dne.

Zde v příkladech provedení (viz níže) jsou podrobně popsány vhodné způsoby pro získání různých sloučenin podle obecného vzorce (I). Z hlediska těchto příkladů je získávání sloučenin pomocí vhodných modifikací příkladů provedení součástí obecných znalostí odborníků a není zde dokládáno příklady explicitně.

Proto zde tedy příklady provedení nemohou být interpretovány jako omezující rozsah vynálezu, ale pouze jen jako dodatečné podrobné objasnění, které odborníka vede k hlubšímu porozumění vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

V experimentální části příkladů jsou používány následující zkratky:

AcOEt

AcOH

Boc

Bzl

DCC

DCM

DIEA

DIP-C1

DMF

DMSO-<1₆

EDTA Na₂

EtOH

EtOEt

FAB

CGMP

HPLC

MeCN

MeOH

MS

ODQ

PyAOP tBuOH

TFA ethylacetát kyselina octová

Zerc-butoxykarbonyl benzyl dicyklohexylkarbodiimid dichlormethan

A-ethyl d i izopropylamin přímo zaváděná sonda-chemická ionizace dimethylformamid hexadeutero-dimethylsulfoxid sodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové ethanol diethylether rychlé atomové bombardování cyklický guanosin-3',5' monofosfát vysokotlaká kapalinová chromatografie acetonitril methanol hmotnostní spektrometrie

A-[l,2,4]oxadiazolo[4,3-a]chinoxalin—1—on

7-azabenzotriazol-l-yl-oxytris(pyrrolidin)fosfonium hexafluorofosfát /erc-butylalkohol kyselina trifluoroctová

Hydrochloridy výchozích aminokyselin byly syntetizovány jak popisují německé patentové přihlášky DE-A-3023830 a DE-A-2821849.

Spektra nukleární magnetické rezonance byla provedena na přístroji Varian Gemini-200.

-6CZ 298871 B6

U ’Η-NMR spekter jsou udávány pracovní frekvence a rozpouštědla použitá k provedení spektra. Poloha signálů je udávána v δ (ppm) za použití signálů protonů rozpouštědla jako reference. Referenční hodnoty jsou 7,24 ppm pro chloroform a 2,49 ppm pro deuteriumdimethylsulfoxid. V závorkách je udáván počet protonů odpovídajících každému signálu naměřený elektronickou integrací a typ signálu je udán za použití následujících zkratek: s (singlet), d (dublet), t (triplet), dd (dublet dubletů), sb (široký signál), sc (komplexní signál), d.e. D₂O (zmizí při měření spektra po přidání několika kapek těžké vody).

U ^l3C-NMR spekter jsou udávány pracovní frekvence a rozpouštědlo pro každé spektrum, ío Poloha signálů je udávána v δ (ppm) za použití signálů protonů rozpouštědla jako reference.

Referenční hodnoty jsou 77,00 ppm pro chloroform a 39,50 ppm pro deuteriumdimethylsulfoxid.

Dále byly uskutečňovány experimenty nukleární magnetické rezonance za použití testu interakcí připojených protonů (ATP).

HPLC analýzy k určení čistoty vzorků byly prováděny za následujících podmínek:

A- Obvyklá gradientová eluce

Kolona: RP-C18, symetrie 150 x 3,9 mm, 5 μ, 100 Á

Mobilní fáze: H₂O + H₃PO₄ 0,1 % / CH₃CN + 5% H₂O + 0,1 % H₃PO₄

Teplota: teplota místnosti Průtok: 1 ml / min Objem vstřiku: 10 ml

A- Izokratická eluce

Kolona: RP-C18, symetrie 150 x 3,9 mm, 5 μ, 100 A

Mobilní fáze: 50 % H₂O + H₃PO₄ 0,1 % a 50 % CH₃CN + 5% H₂O + 0,1 % H₃PO₄ Teplota: teplota místnosti Průtok: 1 ml / min

Objem vstřiku: 10 ml

Při přípravě tripeptidů byly pro rafinaci surových produktů použity preparativní chromatografie i HPLC a identifikace produktu byla ověřena hmotnostní spektrometrií a aminokyselinovou analýzou. Čistota tripeptidů se analyzovala HPLC za následujících podmínek: kolona typu Cl8

Nucleosyl, 250 x 4 mm, 120 , 10 pm; průtok 1 ml / min; eluenty A= H₂O (+ 0,045 % TFA) a B= CH₃CN (+ 0,036 % TFA).

Ultrafialová spektra byla provedena na spektrofotometru Shimadzu UV-160A. Pro každou ze sloučenin je udána vlnová délka (λ) v nm a molekulární absorpce (ε) v cm'¹, mol¹.1.

Pro vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC) byla jako detektor užita ultrafialová fotodioda Hewlett-Packard 1040 A.

Příklad 1

Příprava A-acetyl-2-amino-2-[4-(4-,S-nitrosomerkaptotetrahydropyran)]octové kyseliny (1).

-7CZ 298871 B6

Krok 1)

Do skleněné 250 ml baňky opatřené magnetickým mícháním se vložily 4,0 g (17,6 mmol) hydrochloridu 2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahydropyran)octové kyseliny a 60 ml 0,5 N roztoku hydroxidu draselného. Potom se přidalo 3,07 g (21,8 mmol) bezvodého uhličitanu draselného a

60 ml MeCN. Směs byla zchlazena v ledové lázni a po kapkách se přidávalo 1,42 ml (19,7 mmol) acetylchloridu rozpuštěného v 25 ml CH₃CN. Po skončení se přidal 0,5 N hydroxid draselný až do pH 9-10. Směs byla míchána při teplotě místnosti 2 hodiny. Potom se až do pH 6 přidala 2 N chlorovodíková kyselina a rozpouštědla bylo odstraněno za sníženého tlaku. Získaná tuhá látka byla sušena ve vakuu nad oxidem fosforečným, suspendována ve 150 ml absolutního EtOH a ío míchána při teplotě místnosti. Nerozpustný zbytek byl odfiltrován a promyt absolutním EtOH. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Získalo se 3,98 g surového intermediátního produktu, kyselina A-acetyl-2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahydropyran)octová, který byl podroben různým fázím reverzní preparativní chromatografie a získalo se 80 mg produktu 90% čistoty (HPLC gradientová eluce A, λ = 205 nm).

'H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 7,40 (1H, d, J = 10 Hz, NH), 4,13 (1H, d, J = 10 Hz, CH), 3,75-3,50 (4H, s.c., CH₂), 1,90- 1,80 (4H, s.c., CH₂), 1,65 (3H, s, CH₃).

¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 171,50 (CO-N), 168,90 (CO), 63,69 (CH₂), 63,27 (CH₂), 62,80 (CH), 49,18 (C), 37,58 (CH₂), 36,12 (CH₂), 23,01 (CH₃).

Krok 2) mg (0,34 mmol) kyseliny A-acetyl-2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahydropyran)octové bylo rozpuštěno ve 4000 μΐ MeOH a potom bylo přidáno 500 μΐ 1 N roztoku HC1 a 136 μΐ 5 M roztoku NaNO₂. Vzniklá směs byla 1 minutu sonifikována v ultrazvukové lázni a potom bylo přidáno 50 μΐ 10N NaOH a 14 μΐ H₂O.

Ze vzniklé směsi bylo odděleno 470 μΐ alikvotní části A a ke zbytku byl přidán přebytek vody, byl zmrazen a lyofilizován a tak bylo získáno 190 mg hygroskopické tuhé látky B, která je poněkud vlhká.

HPLC (gradientová eluce A):

λ 220 nm: čistota frakce A 68 %; λ 339 nm: čistota frakce A 95 %.

NMR frakce B:

‘H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,00- 7,50 (1H, s.c., NH), 4,50- 4,00 (1H, s.c., CH), 3,80 - 3,40 (4H, s.c., CH₂), 2,40 - 1,80 (4H, s.c., CH₂), 1,86 (3H, s, CH₃).

¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 173,00 (CO), 169,52 (CO), 67,69 (CH₂-O), 63,45 (CH), 53,78 (C), 32,17 (CH₂), 22,80 (CH₃).

Příklad 2

Příprava A-acetyl-2-amino-2-[4-(4-₁S’-nitrosomerkapto-l-methylpiperidin)]octové kyseliny (2).

-8CZ 298871 B6

Krok 1)

Do skleněné 250 ml baňky opatřené magnetickým mícháním byly vloženy 3,69 g (13 mmol) dihydrochloridu 2-amino-2-[4-(4-merkapto-l-methylpiperidin)octové kyseliny a 30 ml 0,5 N roztoku hydroxidu draselného. Potom se přidalo 2,2 g (16 mmol) bezvodého uhličitanu draselného a 30 ml MeCN. Směs se zchladila v ledové lázni a po kapkách se přidávalo 1,0 ml (14 mmol) acetylchloridu rozpuštěného v 10 ml CH₃CN. Po skončení se přidal 0,5 N hydroxid draselný až do pH 9-10. Směs byla míchána při teplotě místnosti 2 hodiny. Potom se až do pH 6 přidala 2 N chlorovodíková kyselina a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Získaná tuhá látka byla sušena ve vakuu nad oxidem fosforečným a vysušená tuhá látka byla suspendována ve 100 ml absolutního EtOH a míchána při teplotě místnosti. Nerozpustný zbytek byl odfiltrován a promyt absolutním EtOH a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Získalo se 2,8 g surového intermediátního produktu, kyseliny V-acetyl-2-amino-2-[4-(4-merkapto-l-methylpiperidin)octové, který byl podroben různým fázím reverzní preparativní chromatografie a bylo získalo 0,5 g produktu 99% čistoty (HPLC gradientová eluce A, λ = 210 nm).

'H-NMR (200 MHz, DMSO-dé): 8,35 (1H, d, J= 10 Hz, NH), 4,43 (1H, d, J = 10 Hz, CH), 3,35 - 3,00 (4H, s.c., CH₂), 2,70 (3H, s, CH₃), 2,20 - 1,90 (4H, s.c., CH₂), 1,85 (3H, s, CH₃).

¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 170,55 (CO-N), 170,05 (CO), 61,77 (CH), 49,33 (CH₂), 49,28 (CH₂), 46,38 (C), 42,26 (CH₃), 33,05 (CH₂), 33,14 (CH₂), 22,42 (CH₃).

Krok 2) mg (0,20 mmol) kyseliny V—acetyl-2-amino—2-[4—(4-methylpiperidin)octové bylo rozpuštěno ve 800 μΐ 1 N roztoku HC1 a potom bylo přidáno 80 μΐ 5 M roztoku NaNO₂. Vzniklá směs byla 1 minutu sonifikována v ultrazvukové lázni a potom bylo přidáno 80 μΐ 10N NaOH a 40 μΐ H₂O.

Ze vzniklé směsi bylo odděleno 100 μΐ alikvotní části A a zbytek byl zmrazen a lyofilizován a tak bylo získáno 190 mg tuhé látky B.

HPLC (gradientová eluce A):

λ 230 nm: čistota frakce A 90 %; čistota frakce B 93 %; λ 334 nm: čistota frakce A 98 %; čistota frakce B 98 %.

NMR frakce B:

'H-NMR (200 MHz, D₂O): 4,71 (1H, s, CH), 2,70 - 2,20 (8H, s.c., CH₂), 1,95 (3H, s„ CH₃-N), 1,71 (3H, s, CH₃-CO).

’³C-NMR (50 MHz, D₂O): 172,51 (CO), 171,52 (CO), 61,08 (CH), 58,18 (C), 48,09 (CH₂-N), 48,01 (CH₂-N), 42,18 (CH₃-N), 30,44 (CH₂), 29,85 (CH₂), 20,17 (CH₃-CO).

Příklad 3

Příprava V-acetyl-2-amino—3—benzyl-3-5—nitrosomerkapto-4-fenylbutanové kyseliny (3).

-9CZ 298871 B6

Krok 1)

Do skleněné 100 ml baňky opatřené magnetickým mícháním byly vloženy 2 g (5,9 mmol) 2-amino-3-benzyl-3-merkapto-4-fenylbutanové kyseliny a 20 ml 0,5 N roztoku hydroxidu draselného. Potom se přidal 1,0 g (7,2 mmol) bezvodého uhličitanu draselného a 20 ml MeCN. Směs se zchladila v ledové lázni a po kapkách bylo přidáváno 0,5 ml (6,5 mmol) acetylchloridu rozpuštěného v 8 ml CH₃CN. Po skončení se přidal 0,5 N hydroxid draselný až do pH 12-13. Směs byla 2 hodiny míchána při teplotě místnosti. Potom se až do pH 6 přidala 2 N chlorovodíková kyselina a rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Získaný surový produkt byl suspendován ve 100 ml absolutního EtOH a míchán při teplotě místnosti. Nerozpustný zbytek byl ío odfiltrován a promyt absolutním EtOH. Rozpouštědlo bylo odstraněno za sníženého tlaku. Zbytek byl rekrystalizován z vody. Nerozpuštěná část byla odfiltrována a zahozena. Filtrát byl zmražen a lyofilizován. Získalo se 1,64 g intermediátního produktu 2V-acetyl-2-amino-3-benzyl-3merkapto-4-fenylbutanové kyseliny. Výtěžek 81 %.

'H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 7,68 (IH, d, J = 8 Hz, NH), 7,35 - 7,05 (10H, sc, CHJ, 4,36 (IH, d, J = 8 Hz, CH), 3,42 - 3,02 (2H, sc, CH₂-CJ, 2,95 - 2,55 (2H, sc, CH₂), 1,82 (3H, s, CH₃).

’³C-NMR (50 MHz, DMSO-ds): 172,94 (CO-N), 169,08 (CO), 138,55 (CJ, 138,16 (CJ, 132,36 (2CHJ, 131,89 (2CHJ, 127,78 (2CHJ, 127,53 (2CHJ, 126,44 (CHJ, 126,26 (CHJ, 60,16 (CH), 55,62 (C), 43,70 (CH₂), 42,94 (CH₂), 23,14 (CH₃).

Krok 2)

0,62 g (1,8 mmol) kyseliny 2V-acetyl-2-amino-3-benzyl-3-merkapto-4-fenylbutanová bylo rozpuštěno v 25 ml 1 N roztoku HCI a potom bylo přidáno 250 mg roztoku NaNO₂ ve 25 ml vody. Vzniklý roztok byl 35 minut míchán při teplotě místnosti, zfiltrován a promyt vodou. Po vysušení za sníženého tlaku v přítomnosti P₂O₅ bylo získáno 0,33 g tuhé látky.

HPLC (izokratická eluce B): λ 220 nm: čistota 91 %; λ 342 nm: čistota 100 %.

’Η-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,77 (IH, d, J = 10 Hz, NH), 7,28 - 7,00 (10H, sc, CHJ, 5,33 (IH, d, J = 10 Hz, CH), 4,12 - 3,90 (2H, sc, CH₂-CJ, 3,88- 3,38 (2H, sc, CH₂), 1,86 (3H, s, CH₃).

’³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 171,55 (CO-N), 169,67 (CO-O), 135,51 (CJ, 135,27 (CJ, 131,52 (CHJ, 131,41 (CHJ, 128,15 (CHJ, 128,05 (CHJ, 127,04 (CHJ, 65,13 (CH), 56,11 (CH), 40,91 (CH₂), 40,15 (CH₂), 22,29 (CH₃.

Příklad 4

Příprava V{/V-Y-L-glutamyl-2—amino-2-[4—(4-S-nitrosomerkapto)tctrahydropyran)]acetyl}glycinu (4).

- 10CZ 298871 B6

Krok 1)

Do skleněné 250 ml baňky opatřené magnetickým mícháním se smísilo 5,8 g (25,5 mmol) hydrochloridu 2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahydropyran)octové kyseliny, 4,7 g (25,5 mmol) a-brom5 p-xylenu a 10 ml směsi H₂O/EtOH 3:1. Přidalo se 11 ml triethylaminu, vytvořila se argonová atmosféra a směs byla míchána 18 hodin při teplotě místnosti. Přidalo se dalších 50 ml směsi H₂O/EtOH 3:1a směs byla dále míchána 2 hodiny. Vzniklá suspenze byla zfíltrována a promyta 100 ml vody a 50 ml EtOH. Byla získána tuhá látka, která byla sušena za sníženého tlaku. Tuhá látka byla přelita 300 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a za sníženého tlaku bylo odío straněno rozpouštědlo. Toto působení kyselinou bylo podruhé opakováno a získala se tuhá látka, která byla sušena při sníženém tlaku. Bylo získáno 1,59 g žádaného intermediátního produktu.

’Η-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,80 - 8,30 (3H, sb, NH₃ ⁺), 7,26 (2H, d, J = 8 Hz, CHJ, 7,12 (2H, d, J = 8 Hz, CHJ, 4,03 (1H, s, CH-N), 3,85 - 3,55 (6H, se, CH₂-C_ar, CH₂-O), 2,26 (3H, s, CH₃), 2,05 - 1,08 (4H, se, CH₂).

¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 168,98 (CO), 136,64 (CJ, 133,80 (CJ, 129,55 (CHJ, 129,29 (CHJ, 62,36 (CH₂-O), 59,85 (CH-N), 49,15 (C), 32,03 (CH₂), 31,19 (CH₂), 30,84 (CH₂), 20,69 (CH₃).

Krok 2)

1004 mg hydrochloridu 2-amino-2-[4-(4-merkaptotetrahydropyran)octové kyseliny (3,029 mmol) bylo suspendováno ve 20 ml tBuOH/H₂O 2:1 a do pH = 9 byl přidáván 5 % NaOH. Potom byly přidány 3 ekvivalenty Boc₂O a směs se nechala reagovat 30 minut, kdy pak bylo ještě jednou pH upraveno na pH = 9. Reakce byla prodloužena na dalších 30 minut a pH bylo znovu opraveno na srovnání s výchozí aminokyselinou. Ve srovnání s výchozí aminokyselinou pomocí chromatografie na tenké vrstvě (TLC) bylo potvrzeno, že reakce proběhla úplně.

Produkt byl izolován dvěma následnými extrakcemi s 50 ml hexanu a k vodné fázi byla přičiněna 1 N HC1 pH = 2. Potom byly provedeny tři extrakění kroky s 60 ml AcOEt. Roztok AcOEt byl vysušen s bezvodým MgSO₄ a po odstranění rozpouštědla odpařením byl produkt znovu rozpouštěn v DCM a opět odpařen. Tento krok byl ještě dvakrát opakován a takto bylo získáno 1191 mg (3,015 mmol) V-Boc chráněného intermediátního produktu.

Produkt byl charakterizován:

a) TLC s CHCl₃/MeOH/AcOH 85:10:5 jako mobilní fází. Rf= 0,48, signál výchozího materiálu nezaznamenán.

a) HPLC gradientovou elucí od 10 do 100 % MeCN po 30 min + isokratickou elucí při 100 % MeCN po 5 min. Výsledná čistota je 96 % (220 nm).

a) Hmotnostní spektrometrie FAB technikou: M vypočteno = 395, (M+H⁺) nalezeno = 396,0

a) NMR (CDC1₃): 7,18 (2H, d, J = 8 Hz), 7,09 (2H, d, J = 8 Hz), 5,54 (1H, d, J = 11,2 Hz), 4,44 (1H, d, J = 8,3 Hz), 3,69 (1H, d, J= 11,2 Hz), 3,57 (1H, d, J = 11,2 Hz), 3,75- 3,98 (4H, sb), 2,32 (3H, s), 1,26-2,19 (4H, sb), 1,46 (9H, s).

Krok 3

Tripeptid byl připraven technikou syntézy v tuhé fázi, vycházeje z 1595 mg Boc-Gly-OCH₂Pam-pryskyřice (Neosystem odkaz č. RP00801) substituované 0,63 mmol/g. Pracovním měřítkem je 1,005 mmol.

Obecný protokol pro adici zbytku amino je následující:

1) Nabobtnání pryskyřice s DCM 5 promytími po 0,5 min.

- 11 CZ 298871 B6

1) Odstranění Boc skupiny 40 % TFA v DCM 1 x 1 min + 1 x 20 min.

1) Promývání s DCM, 5 x 0,5 min.

1) Testování pomocí ninhydrinu.

1) Promývání s DMF, 3 x 1 min.

1) Vytváření vazby v časové periodě 1,5 hodiny.

1) Promývání s DMF, 3 x 1 min.

1) Promývání s DCM, 5 x 0,5 min.

1) Testování pomocí ninhydrinu.

ίο V případě, že test pomocí ninhydrinu je ve finálním kroku pozitivní, provádí se znova vytváření vazby opakováním kroků 5-8.

Tvorba vazby se provádí 6 ekvivalenty (eq) Boc-aminokyseliny a 3 eq aktivního činidla, kterým je v tomto případě PyAOp (7-azabenzotriazol-l-yl-oxytris(pyrrolidin)fosfonium hexafluor15 fosfát. Pro zkopulování γ-Glu se používá Boc-Glu-(a-Bzl).

Pro finalizaci kopulovací sekvence byla vznikající peptidylová pryskyřice 1 hodinu při 0 °C podrobena acidolýze sHF/ p-kresolem (9:1). Po odpaření se tuhý zbytek extrahoval bezvodým EtOEt a potom se peptid izoloval extrakcí s 10 % AcOH. Jakmile se odpařením zmenšil objem, byl surový produkt lyofilizován a charakterizován:

a) HPLC při gradientově eluci od 5 % do 65 % MeCN po 30 min. a) MS technikou elektrospreje: M^č = 377, (M + Ff) _naiez. ⁼ 378,2.

Množství peptidu bylo kvantifikováno aminokyselinovou analýzou: m = 329 mg (0,873 mmol).

Při všech kvantifikacích peptidu byla používána peptidová analýza přidáváním vnější podpory Ile (isoleucin) ke vzorku k hydrolýze.

Rafinace tripeptidu byla provedena pomocí HPLC v preparativním měřítku ve dvou dávkách. Použitý systém byl následující:

- Kolona: Cl8 Nucleosyl, 200 x 20 mm, 120 Á, 10 pm.

- Eluenty: A = H₂O (+0,1 % TFA), B = MeCN (+0,1 % TFA).

- Gradient: Izokratický 0 % B po 40 min + gradientový od 0 % do 10 % B ve 40 min.

- Průtok: 25 ml/min.

Intermediátní tripeptid byl získán v celkovém množství 227 mg (0,602 mmol) a byl charakterizován:

a) HPLC s gradientovou elucí od 5 do 45 % MeCN ve 20 min. Výsledná čistota je 95 % (220 nm). Minoritní pík při 8,4 min se snižuje v relativních proporcích dokud nezmizí při progresivním zředění použitého vzorku. Podle toho se usuzuje, že odpovídá agregaci tripeptidu (a nikoliv oxidaci), a je proto považován za platný produkt,

a) MS elektrosprejem: Mvyp_0Č = 377, (M + H⁺) _na|_ez = 378,2.

Krok 4)

K roztoku 14,2 mg (0,38 mmol) tripeptidu získaného v kroku 3 v 800 μΐ 1 HC1, bylo přidáno 76 μΐ roztoku 0,5 M NaNO₂. Při teplotě místnosti bylo 1 minutu mícháno v ultrazvukové lázni a potom bylo přidáno 80 μΐ 10N roztoku NaOH. Získaný roztok byl zmrazen a lyofilizován a získaná tuhá látka byla charakterizována:

- 12CZ 298871 B6 ’Η-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,90- 8,50 (2H, sb, NH), 5,35 (1H, d, J = 10 Hz, CH), 4,10 - 3,00 (3H, sc, CH₂, CH), 1,95 - 1,65 (4H, sc., 2CH₂).

¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 172,18 (CO-N), 171,21 (CO-N), 168,40 (CO-O), 63,03 (CH₂), 62,31 (C), 59,56 (C-H), 53,19 (C-H), 41,20 (CH₂), 32,94 (CH₂), 31,71 (CH₂), 31,41 (CH₂),

27,12 (CH₂).

HPLC (metoda A): λ 220 nm (čistota 94 %); λ 334 nm (čistota 95 %).

UV: λ 336 nm, ε (H₂O) 502 cm¹, mol¹ .1.

Příklad 5 io

Příprava /V{jV-y-L-glutamyl-2-amino-2-[4-(4-S^í glycinu (5).

Krok 1)

Do skleněné 100 ml baňky opatřené magnetickým mícháním bylo smíseno 6,4 g (23 mmol) dihydrochloridu 2-amino-2-[4-(4-merkapto-l-methylpiperidin)octové kyseliny, 4,3 g (23 mmol) α-brom-p-xylenu a 40 ml směsi H₂O/EtOH 1:1. Přidalo se 13 ml triethylaminu, byla vytvořena argonová atmosféra a směs byla míchána 42 hodin při teplotě místnosti. Ze vzniklého roztoku bylo za sníženého tlaku odstraněno rozpouštědlo a k získanému surovému produktu bylo přidáno 20 ml absolutního EtOH. Získaná tuhá látka byla odfiltrována a promyta postupně absolutním EtOH a EtOEt a za sníženého tlaku byla vysušena. Získalo se 2,11 g intermediátního produktu, hydrochloridu 2—amino—2— {4—[4—(p—methylbenzylmerkapto)— 1—methylpiperidin]}octové kyseliny. Výtěžek 29,6 %.

NMR spektrum bylo snímáno v D₂O a jako referenční standard bylo 4,75 ppm pro HDO.

'H-NMR (200 MHz, D₂O): 7,28 (2H, d, J = 8 Hz, CH_ar), 7,15 (2H, d, J = 8 Hz, CH_ar), 3,64 - 3,74 (2H, sc, CHr-CaA 3,62 (1H, s, CH-N), 3,4 - 3,1 (4H, sc. CH₂-N), 2,76 (3H, s, CH₂-N), 2,24 (3H, s, CH₂), 2,15-1,92 (4H, sc, CH₂).

¹³C-NMR(50 MHz, D₂O): 173,15 (CO), 141,00 (C_ar), 139,39 (C_ar), 132,58 (CH^), 131,95 (CH_ar), 30 52,48 (CH₂), 50,65 (C), 45,66 (CH₃-N), 34,05 (CH₂), 32,35 (CH₂), 31,28 (CH₂), 22,77 (CH₃).

Krok 2)

Vycházeje z 1016 mg (2,958 mmol) intermediátů získaného v předešlém kroku a zpracovaném jak je popisováno v kroku 2 příkladu 4, bylo získáno 1016 mg (2,490 mmol) V-Boc chráněného intermediátů, který byl charakterizován:

- 13CZ 298871 B6

a) TLC (mobilní fáze CHCl₃/MeOH/AcOH 85:10:5). Rf= 0,32, signál výchozího materiálu nezaznamenán.

b) HPLC s gradientovou elucí od 10 do 100 % MeCN ve 30 min. Čistotaje 96 % (220 nm).

c) Hmotnostní spektrometrie FAB technikou: M_vypoč = 408, (M+H ) _nalez = 408,9.

d) Hmotnostní spektrometrie technikou elektrospreje: (M+H⁺)„_ai_ez. = 409,3.

Krok 3

Tripeptidový intermediát byl připraven metodou popisovanou v kroku 3 příkladu 4 vycházeje to z 794 mg pryskyřice zmíněné shora. Pracovním měřítkem bylo 0,5 mmol. Vzhledem k nesnázím se solubilizací Boc-derivátu, byl při shora zmíněné kopulovací reakci jako báze (3 ekvivalenty) zvolen V-methylmorfolin namísto DIEA. Po inkorporaci γ-Glu byl zkompletován tripeptid a vazba peptid-pryskyřice byla rozštěpena acidolýzou stejným způsobem jak popsáno shora. Nakonec byl získán v 10 % AcOH surový produkt, který byl lyofilizován a potom kvantifikován. Bylo získáno 137 mg (0,351 mmol) peptidového intermediátů, který byl charakterizován:

a) HPLC, isokratický gradient 0 % pro 10 min + od 5 do 65% MeCN ve 30 min. Lze pozorovat, že injektovaný produkt je eluován na čele v roztoku kyseliny octové, což činí nezbytné, aby se alikvotní podíly lyofilizovaly a lyofilizát znovu rozpustil v 1 mM HC1. Tímto způsobem může být peptid zaznamenán chromatograficky a při použitém gradientu je eluován při

6,8 min.

b) MS technikou elektrospreje: = 390, (Μ + H⁺)_nai_ez. - 391,2.

Rafinace tripeptidu byla provedena pomocí HPLC v preparativním měřítku s parametry již popsanými v příkladu 4. Byla zde rovněž aplikována izokratická eluce 0 % B po 40 min následo25 váná gradientovou elucí od 0 % do 10 % B ve 40 min. Tímto způsobem bylo získáno 107 mg (0,274 mmol) produktu, který byl charakterizován:

a) HPLC s gradientovou elucí od 0 % do 0 % po 10 min plus 0 do 30 % po 20 min. Čistotaje 94 % (220 nm). Bylo potvrzeno, že dodatečný pík při 8,0 min odpovídá také v tomto případě agregaci aje podle toho přičítán pravému produktu.

b) MS elektrosprejem: M^et. = 90, (M + H⁺) _nai_ez =391,1.

Krok 4)

Vycházeje z 10,0 mg (0,026 mmol) tripeptidového intermediátů získaného v předchozím kroku, 35 byla s 76 μΐ roztoku 0,5 M NaNO₂ provedena nitrosace, jakje popsáno v kroku 4 z příkladu 4.

Získaný produkt byl charakterizován pomocí:

¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 171,57 (CO-N), 170,99 (CO-N), 170,76 (CO-N), 168,20 (CO-O), 60,23 (C), 59,53 (CH), 51,57 (CH), 49,02 (CH₂), 42,20 (CH₂), 41,59 (CH₂), 30,49 (CH₂), 29,75 (CH₂), 29,31 (CH₂), 26,05 (CH₂).

HPLC (metoda Β): λ 220 nm (čistota 74 %); λ 334 nm (čistota 88 %).

UV: λ 346 nm, ε (H₂O) 198 cm’¹, mol“¹.1.

Příklad 6 45

Příprava A[N-y-L-glutamyl-2-amino-3-benzyl-3-(5-nitrosomerkapto)-4-fenylbutanoyl]glycinu (6).

- 14CZ 298871 B6

Krok 1)

Do skleněné 100 ml baňky opatřené magnetickým mícháním bylo smíseno 1,25 g (3,7 mmol) hydrochloridu 2-amino-3-benzyl-3-merkapto-4-fenylbutanové kyseliny, 0,68 g (3,7 mmol) α-brom-p-xylenu a 40 ml směsi H₂O/EtOH 1:1. Přidalo se 1,6 ml triethylaminu a větší část suspendované tuhé látky se rozpustila. Byla vytvořena argonová atmosféra a směs byla míchána 24 h při teplotě místnosti. Ethanol a část triethylaminu byly odstraněny za sníženého tlaku. Vzniklá vodná suspenze byla zfíltrována a byla získána bílá tuhá látka. Byla vyčištěna sloupco10 vou chromatografií na reverzních fázích s CH₃CN-H₂O. Tuhá látka byla přelita 100 ml MeOH/HCl 1:1 a za sníženého tlaku byla vysušena. Získalo se 0,5 g intermediátů, hydrochloridu 2-amino-3-benzyl-3-merkapto-4-fenylbutanové kyseliny.

'H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,95 - 8,50 (3H, sb, NH₃ ⁺), 7,45 - 7,25 (10H, sc, CH_ar), 7,08 (2H, d, J = 10 Hz, CH^), 6,98 (2H, d, J = 10 Hz, CHar), 4,05 (1H, s, CH-N), 3,55 - 3,0 (4H, sc,

CH₂-C₆H₅, CH₂-C_ar), 2,90 - 2,60 (2H, sc, CH₂), 2,20 (3H, s, CH₃).

¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 168,70 (CO), 136,53 (Car), 136,00 (C_ar), 134,94 (Car), 132,50 (Car), 131,18 (CHar), 129,169 (CHar), 128,90 (CHar), 128,26 (CHar), 128,02 (CHar), 127,07 (CHar), 57,06 (CH-N), 53,64 (C), 42,22 (CH₂), 41,65 (CH₂), 31,90 (CH₂-S), 20,48 (CH₃).

Krok 2)

Vycházeje ze dvou frakcí získaných v předešlém kroku (180 mg 83%-ní čistoty a 530 mg 94%-ní čistoty) a zpracovaných jak je popisováno v kroku 2 příkladu 4, bylo získáno 733 mg (1,45 mmol) V-Boc chráněného intermediátního produktu, který byl charakterizován:

a) TLC (CHCl₃/MeOH/AcOH 85:10:5). Rf = 0,63.

b) HPLC s gradientovou elucí od 10 do 100 % MeCN ve 30 min, s isokratickou 100%, 5 min, čistota: 91 % (220 nm).

c) EM-MALDI-TOF (hmotnostní spektrum): matrice z dihydroxybenzoové kyseliny, Mvypoč. - 505, (MMf) _nalez - 528,585 (M + Na)

d) NMR potvrzena přítomnost Boc skupiny.

Krok 3

Tripeptidový intermediát byl připraven metodou popisovanou v kroku 3 příkladu 4, vycházeje z 0,43 mmol pryskyřice zmíněné shora. Po kroku acidolýzy byl izolován surový produkt, který obsahuje 14,4 mg (29,96 prnol) tripeptidového intermediátů, který byl charakterizován: a) HPLC, analytický gradient od 5 % do 65 % MeCN po 30 min, přibližná čistota 95 %.

-15CZ 298871 B6

b) MS elektrosprejem: Μ_ΧΎροί, = 487 (M + H⁺), M_nai_ez. = 488,3.

Krok 4)

Vycházeje z 5,7 mg (0,012 mmol) tripeptidového intermediátu získaného v předchozím kroku, byla s 24 μΐ 0,5 M NaNO₂ uskutečněna nitrosace, jak je popsáno v kroku 4 z příkladu 4. Získaný produkt byl charakterizován pomocí:

HPLC (metoda A): λ 220 nm čistota 68 %; λ 334 nm čistota 86 %.

UV: λ 345 nm, ε (H₂O) 368 cm^-1, mor¹.1. io

Příklad 7

Testy pro vasodilataci in vitro

Metoda použitá při analýzách je v podstatě stejná jak je popisováno v následujících odkazech:

• Furchgot R, F., „Methods in nitric oxide research“; vyd. Feelish & Stamler, John Wiley & Sons, Chichester, England, str. 567-581.

• Trongvanichnam K. a spol., Jpn. J. Pharmacol. 1996; 71: 167-173.

• Salaš E. a spol., Eur. J. Pharmacol. 1994; 258: 47-55.

Sloučeniny byly testovány při 5 různých koncentracích, v koncentračním rozsahu od 0,001 do 10 mM za použití od 6 do 9 arteriálních okruhů pro každou sloučeninu. Získané výsledky jsou srovnávány s výsledky S-nitrosoglutathinu (GSNO), který byl použit jako referenční produkt.

Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce 1 a jsou udávány jako CE₅₀ (efektivní koncentrace 50), což je koncentrace každé z testovaných sloučenin, při níž je vyvolávána 50 %-ní vasodilatace arteriálního okruhu, před tím kontrahovaného vlivem 1 μΜ norepinefrinu.

Tabulka 1

Test na vasodilataci
Sloučenina	CE50 μΜ (průměr ± SD)
GNSO	1,56 ±0,55
Produkt z příkladu 1	0,375 ± 0,05
Produkt z příkladu 2	0,024 ± 0,003
Produkt z příkladu 3	0,63 ± 0,21
Produkt z příkladu 4	1,73 ±0,27
Produkt z příkladu 5	1,89 ±0,82

Jak lze pozorovat, všechny testované sloučeniny mají silnou vasodilatační účinnost, podobnou nebo lepší než je účinnost referenční sloučeniny (GSNO) a sloučenina 2 má vasodilatační účinnost vysoce převažující nad účinností referenčního produktu.

-16CZ 298871 B6

Příklad 8

Testy pro inhibici agregace krevních destiček in vitro 5

Metoda použitá při analýzách je v podstatě stejná jak je popisována v následujících odkazech:

• Loscalzo J. a spol., „Methods in nitric oxide research“ (vyd. Feelish M., Stamlerj. S.), John Wiley & Sons, Chichester, England, str. 583-591.

ío · Radomski M. W. a spol., Br.. J. Pharmacol. 1987; 62: 181-187.

• Salaš E. a spol., Br. J. Pharmacol. 1994; 112: 1071-1076.

Sloučeniny byly testovány při čtyřech rozdílných koncentracích a byly použity krevní destičky od 5 do 23 různých dárců. Získané výsledky jsou srovnávány s výsledky S-nitrosoglutathionu (GSNO), který byl použit jako referenční produkt.

Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2 a jsou vyjádřeny jako IC₅₀ (koncentrace inhibice 50), což je koncentrace každé z testovaných sloučenin, při níž je vyvolávána 50 %-ní inhibice agregace získané při sub-maximální koncentraci kolagenu (1 pg/ml).

Tabulka 2

Test na inhibici agregace krevních destiček
Sloučenina	IC50 pM (průměr ± SD)
GNSO	0,48 ±0,19
Produkt z příkladu 1	0,07±0,02
Produkt z příkladu 2	0,19 ±0,02
Produkt z příkladu 3	0,24 ± 0,027
Produkt z příkladu 4	0,20 ±0,12
Produkt z příkladu 5	0,047 ±0,011
Produkt z příkladu 6	0,35 ±0,11

Jak lze z Tabulky 2 zaznamenat, všechny testované sloučeniny mají silnou inhibiční účinnost na 25 krevní destičky, podobnou nebo lepší než je účinnost referenční sloučeniny (GSNO) a sloučeniny i a 5 mají inhibiční účinnost na krevní destičky vysoce převažující nad účinností referenčního produktu.

Příklad 9

Testy na vzrůst infra-hladin GMPc v krevních destičkách in vitro

Sloučenina získaná v příkladu 5 (5) byla in vitro testována na svoji kapacitu zvyšovat infra-hladiny GMPc v krevních destičkách u preparátu lidských promytých krevních destiček.

Při testu použitá metoda je v podstatě stejná jako se popisuje v odkazech citovaných v příkladu 8.

- 17CZ 298871 B6

Sloučeniny byly testovány při čtyřech různých koncentracích za použití různých krevních destiček od 5 dárců. Získané výsledky jsou porovnávány s výsledky GNSO (referenční produkt) a s bazálními hodnotami. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3 a vyjádřeny jako pmol / 10⁹ krevních destiček.

Tabulka 3

Test na vzrůst infra-hladín GMPc v krevních destičkách
[μΜ]	GMPc (pmol /109 krevních destiček)
	GSNO	Sloučenina 5
3	27,6 ± 6,0	—
1	24 ± 0,5	21,1 ±0,5
0,3	6,6 ±0,6	6,50 ±0,5
0,1	1 ±0,5	1,50 ±0,4
0,03	—	1,60 ±0,5
0	1,33 ±0,38	1,33 ±0,38

Sloučenina 5 zvyšuje infra-hladiny GMP v krevních destičkách podobným způsobem jako to činí ío referenční GSNO. Je třeba poznamenat, že pro hodnoty blízké k IC₅₀ ovlivňuje sloučenina 5 hladiny GMPc níže než činí GSNO, když se použije při koncentracích blízkých k jejímu IC₅o.

Příklad 10

Test na blokádu inhibice agregace krevních destiček in vitro

Při testu použitá metoda je v podstatě stejná jako se popisuje v odkazech citovaných v příkladu 8, doplněná o odkaz:

· Moro M. A. a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1996; 93: 1480-5.

ODQ byl testován in vitro na blokování inhibice agregace krevních destiček dosaženou produkty získanými u přípravků lidských promytých krevních destiček.

Sloučenina získaná v příkladu 5, (5), byla testována při třech různých koncentracích v přítomnosti a bez přítomnosti ODQ (1 μΜ) při použití krevních destiček od 5 různých dárců. Získané výsledky byly srovnávány s výsledky GSNO (referenční produkt) a s hodnotami bez přítomnosti ODQ. Výsledky jsou uvedeny v Tabulkách 4 a 5 a jsou vyjádřeny v procentuálních hodnotách inhibice maximální agregace.

Tabulka 4

Referenční produkt
[mM]	% inhibice bez ODQ	% inhibice s ODQ
1	92,65 ± 0,9	32,65 ±0,9
0,3	79,33 ±17	3,3 ±3
0,1	34,2 ±25	0

-18CZ 298871 B6

Tabulka 5

Sloučenina 5
[mM]	% inhibice bez ODQ	% inhibice s ODQ
0,3	96	0
0,1	96	0
0,03	83 ± 1,4	0
0,01	17	0
0,003	0	0

ODQ (1 μΜ) je schopen blokovat inhibiční efekt GSNO a sloučeninu 5, když je použita IC₅₀ dávka sloučeniny. Při vyšších dávkách nad IC₅₀ je účinek na inhibici agregace lépe blokován v případě sloučeniny 5 jak plyne ze srovnání s případem referenčního produktu.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. S-Nitrosothiolové deriváty penicilaminu nebo glutathionu a jejich farmaceuticky přijatelné soli, které odpovídají následujícímu obecnému vzorci (I) ve kterém:

   15 A a B jsou fenylové skupiny nebo spolu dohromady tvoří zbytek -CH₂-Q-CH₂- dotvářející šestičlenný kruh, ve kterém Q představuje atom kyslíku, síry nebo skupinu N-R³, ve které je R³ vodík nebo alkylová skupina Ci-C₄;

   R¹ je acylový zbytek, který může být alifatickou acylovou skupinou C]-C₅ nebo zbytkem glutamové kyseliny vázaným prostřednictvím od aminoskupiny vzdálenější karboxylové

   20 skupiny;

   R² je hydroxylová skupina nebo zbytek glycinu vázaného pomocí peptidové vazby;

   s tou podmínkou, že je-li R¹ alifatický acylový zbytek, je pak R² hydroxylová skupina a je-li R¹ zbytkem glutamové kyseliny, je pak R² zbytkem glycinu.
2. 2. S-Nitrosothioly podle nároku 1, které odpovídají následujícímu obecnému vzorci (II)

   -19CZ 298871 B6 ve kterém A a B mají význam uvedený svrchu a R⁴ je alkylová skupina C]-C₄.
3. 3. Sloučenina podle některého z nároků 1 nebo 2, kterou je N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-S nitrosomerkaptotetrahydropyran)]octová kyselina (1).

   5 “
4. 4. Sloučenina podle některého z nároků 1 nebo 2, kterou je N-acetyl-2-amino-2-[4-(4-S nitrosomerkapto-l-methylpiperidin)]octová kyselina (2).
5. 5. Sloučenina podle některého z nároků 1 nebo 2, kterou je N-acetyl-2-amino-3-benzyl-3-S 10 nitrosomerkapto-4-fenylbutanová kyselina (3).
6. 6. Sloučenina podle nároku 1, které odpovídají následujícímu obecnému vzorci (lil) ve kterém A a B mají význam uvedený svrchu.
7. 7. Sloučenina podle některého z nároků 1 nebo 6, kterou je N-{N-y-L-glutamyl-2-amino-[4 (4-S-nitrosomerkaptotetrahydropyran)]acetyl}-glycin (4).

   -20CZ 298871 B6
8. 8. Sloučenina podle některého z nároků 1 nebo 6, kterou je N-{N-y-L-glutamyl-2-amino-[4(4-S-nitrosomerkapto-l-methylpiperidin)]acetyl}-glycin (5).

   5
9. 9. Sloučenina podle některého z nároků 1 nebo 6, kterou je N-{N-y-L-glutamyl-2-amino-3benzyl-3-(S-nitrosomerkapto)-4-fenylbutanoyl]-glycin (6).
10. 10. Použití S—nitrosothiolů podle některého ze shora uvedených nároků pro výrobu medikamentu pro léčbu oběhových dysfunkcí.
11. 11. Použití podle nároku 10 pro výrobu medikamentu pro léčbu dysfunkcí kardiovaskulárního systému.