ES2206178T3 - S-nitrosotrioles como agentes para el tratamiento de trastornos circulatorios. - Google Patents
S-nitrosotrioles como agentes para el tratamiento de trastornos circulatorios.Info
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Abstract
Se describen nuevos S-nitrosotioles derivados de la penicilamina o el glutatión que responden a la fórmula general (I) en la que: A y B son grupos fenilo o bien, conjuntamente, conforman el resto -CH2 -Q-CH2 - constituyendo un anillo de seis unidades en el que Q representa un átomo de oxígeno o de azufre o un resto N-R3 à, en el que R3 à es hidrógeno o un grupo alquilo C1 -C4 ; R1 à es un resto acilo, que puede ser un acilo alifático C1 -C5 o un resto de ácido glutámico unido por medio de su carboxilo no aminoacídico; R2 à es un grupo hidroxilo o un resto de glicina unido mediante un enlace peptídico; de manera que cuando R1 à es un resto acilo alifático R2 à es un grupo hidroxilo, y cuando R1 à es un resto de ácido glutámico R2 à es un resto de glicina. Los nuevos compuestos presentan actividad vasodilatadora e inhibidora de la agregación de las plaquetas, lo que los hace útiles para el tratamiento de disfunciones del sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular.
Description
S-nitrosotrioles como agentes
para el tratamiento de trastornos circulatorios.
La presente invención se refiere a nuevos
S-nitrosotioles derivados de la penicilamina o el
glutatión, con acción vasodilatadora e inhibidora de la agregación
plaquetaria y que, en consecuencia, resultan útiles para la
preparación de medicamentos destinados al tratamiento de trastornos
del sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular.
Resulta bien conocido el hecho de que los
compuestos capaces de liberar en el organismo óxido nítrico (NO)
manifiestan en muchos casos algún tipo de actividad a nivel del
sistema vascular, por ejemplo vasodilatación o inhibición de la
agregación de las plaquetas, que los hace potencialmente
beneficiosos para el tratamiento de diferentes trastornos
relacionados con disfunciones del sistema circulatorio.
Se ha descrito también que determinados
derivados que contienen un grupo S-nitrosotiol, dado
que son capaces de liberar NO en el organismo, manifiestan también
propiedades aprovechables desde el punto de vista médico. Así,
Radomski et al., Br. J. Pharmacol. (1992) 107,
745-749, describen la actividad inhibidora de la
activación de las plaquetas del S-nitrosoglutatión
(GSNO). Golino et al, Circulation Research, 71, No 6
(1992), describen la actividad inhibidora de la activación de las
plaquetas de la S-nitrosocisteina, asignándole un
efecto antitrombótico. Smith ét al., Meth. Find. Exp. Clin.
Pharmacol. (1994), 16, 5, describen que el GSNO produce
un fuerte efecto relajante sobre las arterias. En la solicitud de
patente WO95/12394 se describe el uso de
S-nitrosoaductos de péptidos, entre ellos la
S-nitroso-N-acetilpenicilamina
(SNAP), como agentes protectores contra las inflamaciones
vasculares de origen traumático. En la solicitud de patente
WO95/07691 se describe el uso de diferentes
S-nitrosotioles, particularmente el GSNO, en el
tratamiento y prevención de la deposición de las plaquetas y la
formación de trombos en la superficie vascular dañada. En la
solicitud de patente WO93/09806 se describen proteínas o residuos
de aminoácidos S-nitrosados, capaces de liberar NO,
que manifiestan una actividad relajante de la musculatura lisa y un
efecto inhibitorio sobre la agregación plaquetaria.
En la patente europea
EP-B1-412699 se describen
S-nitrosotioles que responden a la fórmula
general
y su empleo como agentes terapéuticos para las
enfermedades cardiovasculares, en particular, como agentes
antihipertensivos y para el tratamiento de la angina pectoris. Si
bien el número de posibles compuestos asignables a dicha fórmula
general es enorme, mientras que en la descripción sólo se
encuentran descritos explícitamente unas decenas de productos, y
únicamente se aportan datos sobre su acción vasodilatadora, sin
mencionar ningún efecto relacionado con la actividad de las
plaquetas.
Los S-nitrosotioles descritos en
los documentos mencionados no resuelven por sí solos todos los
complejos problemas que plantea el tratamiento de los trastornos
vasculares, especialmente a nivel cardiovascular, siendo necesario
el desarrollo de nuevos principios activos que manifiesten acciones
más potentes y eficaces.
El objeto de la invención son unos nuevos
compuestos S-nitrosotioles, derivados de la
penicilamina o el glutatión, que presentan, simultáneamente, una
potente acción vasodilatadora y una elevada eficacia como
inhibidores de la agregación plaquetaria.
Es también objeto de la presente invención el
uso de los nuevos compuestos en la preparación de medicamentos para
el tratamiento de trastornos relacionados con disfunciones del
sistema circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular.
Los compuestos objeto de la invención son
S-nitrosotioles derivados de la penicilamina o del
glutatión, y sus sales farmacéuticamente aceptables, que responden
a la fórmula general (I)
en la
que:
A y B son grupos fenilo o bien, conjuntamente,
conforman el resto
-CH_{2}-Q-CH_{2}- constituyendo
un anillo de seis unidades en el que Q representa un átomo de
oxigeno o de azufre o un resto N-R^{3}, en el que
R^{3} es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1}-C_{4};
R^{1} es un resto acilo, que puede ser un acilo
alifático C_{1}-C_{5} o un resto de ácido
glutámico unido por medio de su carboxilo no aminoacídico;
R^{2} es un grupo hidroxilo o un resto de
glicina unido mediante un enlace peptídico;
de manera que cuando R^{1} es un resto acilo
alifático R^{2} es un grupo hidroxilo, y cuando R^{1} es un
resto de ácido glutámico R^{2} es un resto de
glicina.
Por tanto, los compuestos objeto de la invención
resultan asignables a las fórmulas generales (II) o (III)
en las que A y B tienen los valores indicados
anteriormente y R^{4} es un grupo alquilo
C_{1}-C_{4}, o a sus sales farmacéuticamente
aceptables.
Ejemplos concretos de compuestos preferidos que
forman parte del objeto de la presente invención son los
siguientes:
Ácido
N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercaptote-trahidropiran)]acético
(1).
Ácido
N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercapto-1-metilpiperidin)]acético
(2).
Ácido
N-acetil-2-amino-3-bencil-3-S-nitrosomercapto-4-fenilbutanoico
(3).
N[N-\gamma-L-glutamil-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto)tetrahidropiran))acetil]glicina
(4).
N[N-\gamma-L-glutamil-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto-1-metil-piperidin))acetil]glicina
(5).
N(N-\gamma-L-glutamil-2-amino-3-bencil-3-(4-metilbencil-S-nitro-somercapto)-4-fenilbutanoil)glicina
(6).
Para el experto resulta obvio que los compuestos
objeto de la presente invención presentan centros quiraleb y que
ello permite distinguir entre los posibles isómeros y/o las mezclas
de los mismos, debiendo entenderse que forman parte del objeto de
la invención tanto las mezclas de isómeros como los isómeros puros,
que pueden ser obtenidos a partir de dichas mezclas mediante el
empleo de técnicas convencionales, bien conocidas por el experto, o
mediante síntesis asimétricas también al alcance de dicho
experto.
Los compuestos objeto de la presente invención
pueden obtenerse de diferentes maneras en función de su estructura
básica.
Así, los compuestos asignables a la fórmula
general (II) pueden obtenerse de acuerdo con la secuencia de etapas
que se representa en el siguiente esquema.
Es decir, partiendo de los clorhidratos de los
aminoácidos, que a su vez pueden ser obtenidos mediante métodos
conocidos, por ejemplo los descritos en las solicitudes de patente
alemanas DE-A-3023830 y
DE-A-2801849, se procede a acilar el
nitrógeno aminoacídico mediante técnicas convencionales, por
ejemplo con un cloruro de ácido, y como etapa final se introduce el
grupo nitroso en el azufre mercaptánico, también utilizando
técnicas de nitrosación convencionales.
Por su parte, los compuestos asignables a la
fórmula general (III), se pueden obtener mediante la secuencia de
etapas que se representa en el siguiente esquema.
Es decir, se parte de los mismos clorhidratos de
aminoácidos que en el caso anterior y se protege el grupo
mercaptano mediante la formación de un tioéter de
p-metilbencilo. A continuación se protege el nitrógeno
aminoacídico mediante la conocida técnica Boc y luego se forma el
tripéptido con los restos de ácido glutámico y glicina (aminoácido
C-terminal), en fase sólida, mediante técnicas bien
conocidas por el experto y descritas, por ejemplo, por: Barany, G.
et al., The Peptides, 2,1, Gross, E. Meienhofer,
Eds.Academic Press, NY (1980); Stewart, J.M. et al., Solid Phase
Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, CA (1969);
Bodanszky, M. Et al., Peptide Synthesis, 2^{nd} ed.,
Wiley, NY (1976).
La formación del tripéptido consta de las
siguientes etapas:
- a)
- Anclaje del aminoácido C-terminal glicina (Gly), en forma de terc-butoxicarbonil (Boc) derivado, a una resina de p-metilbencilhidrilamina/poliestireno.
- b)
- Desprotección del grupo Boc con ácido trifluoroacético y neutralización.
- c)
- Incorporación del aminoácido modificado intermedio protegido.
- d)
- Evaluación de la reacción de acoplamiento mediante ninhidrina (Kaiser, E. et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970)).
- e)
- Repetición de las etapas anteriores para el residuo de \gamma-glutámico (\gamma-Glu) que se incorpora como Boc-derivado O bencil protegido (Boc-Glu-OBzl).
- f)
- Acidolisis con HF anhidro para desproteger el tripéptido y liberarlo de la resina.
- g)
- Purificación y caracterización de los productos finales.
Una vez formado el tripéptido se procede, como
etapa final, a la nitrosación del grupo mercaptano ya liberado de
su grupo protector.
Los ensayos efectuados muestran que los nuevos
compuestos S-nitrosados objeto de la invención
poseen una actividad vasodilatadora comparable, como mínimo, con la
del GSNO, y en algunos casos muy superior, y además presentan un
efecto inhibidor de la agregación plaquetaria que también resulta
ser similar o superior al propio del GSNO, en alguno de los casos
considerablemente superior.
Ello hace que los compuestos objeto de la
presente invención puedan ser utilizados de manera muy eficaz en la
preparación de medicamentos con efecto vasodilatador y
antitrombótico para el tratamiento de disfunciones del sistema
circulatorio, especialmente a nivel cardiovascular y coronario.
Por ello, los compuestos de la fórmula general
(I), así como sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden ser
utilizados, mediante el empleo de las técnicas galénicas
convencionales, para preparar medicamentos que pueden ser
administrados por diferentes vías.
A modo de ejemplo se puede señalar que por vía
oral pueden administrarse en forma de preparados farmacéuticos
tales como comprimidos, cápsulas, jarabes y suspensiones. Por vía
parenteral en forma de soluciones o emulsiones, etc. Pueden
administrarse también por vía tópica en forma de cremas, pomadas,
ungüentos, etc., y también por vía transdérmica, por ejemplo por
medio de parches y apósitos. También pueden aplicarse directamente
al recto, en forma de supositorios. Las preparaciones pueden
contener transportadores aceptables fisiológicamente, excipientes,
activadores, agentes quelantes, estabilizadores, etc. En el caso de
inyectables pueden incorporarse tampones fisiológicamente
aceptables, agentes solubilizantes o isotónicos. La dosis diaria
puede variar dependiendo de la sintomatología, de la edad, del peso
corporal de los pacientes, del modo de administración, etc., y la
dosis normal diaria para una persona adulta puede estar comprendida
entre 0,1 y 500 mg, pudiendo ser administrada en una sola dosis o
dividida en varias tomas al día.
En los ejemplos que se exponen en esta
descripción se detallan los procedimientos apropiados para obtener
varios de los compuestos asignables a la fórmula general (I). A la
vista de dichos ejemplos, para el experto en la materia resulta
evidente y directa la manera de obtener los compuestos no
ejemplificados expresamente, mediante la aplicación de
modificaciones de los métodos expuestos, propias del conocimiento
común general de los expertos en la materia.
Así pues, los ejemplos que se exponen a
continuación no deben ser interpretados en el sentido de limitar el
alcance de la presente invención, sino como una explicación
adicional, más detallada, que facilite al experto en la materia una
mejor comprensión de la misma.
En los ejemplos que siguen a continuación se
utilizan las siguientes abreviaturas:
| AcOEt | acetato de etilo |
| AcOH | ácido acético |
| Boc | terc-butoxicarbonilo |
| Bzl | bencilo |
| DCC | diciclohexilcarbodiimida |
| DCM | diclorometano |
| DIEA | N-etildiisopropilamina |
| DIP-CI | sonda introducción directa-ionización química |
| DMF | dimetilformamida |
| DMSO-d_{6} | dimetilsulfóxido hexadeuterado |
| EDTA Na_{2} | ácido etilendiaminotetraacético sal sódica |
| EtOH | alcohol etílico |
| EtOEt | éter etílico |
| FAB | bombardeo átomos rápidos |
| CGMP | Guanosina 3', 5' monofosfato cíclico |
| HPLC | cromatografía líquida de alta resolución |
| MeCN | acetonitrilo |
| MeOH | alcohol metílico |
| MS | espectrometria de masas |
| ODQ | [1H-[1,2,4]oxadizol[4-3a]quinoxalin-1-ona] |
| PyAOP | hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1-il-oxitris(pirrolidino)fosfonio |
| tBuOH | alcohol terc-butílico |
| TFA | ácido trifluoroacético |
Los clorhidratos de los aminoácidos de partida
se sintetizan según los procedimientos descritos en las solicitudes
de patente alemanas DE-A-3023830 y
DE-A-2801849.
Los espectros de resonancia magnética nuclear
han sido realizados en un aparato Varian
Gemini-200.
En los espectros de ^{1}H-RMN
se indica la frecuencia de trabajo y el disolvente utilizado para
llevar a cabo el espectro. La posición de las señales se indica en
\delta (ppm), utilizando como referencia la señal de los protones
del disolvente. Se toman como valores de referencia 7.24 ppm para
el cloroformo y 2.49 ppm para el dimetilsulfóxido deuterado. Entre
paréntesis se indica el número de protones correspondientes a cada
señal medidos por integración electrónica y el tipo de señal usando
las siguientes abreviaturas: s (singulete), d (doblete), t
(triplete), dd (doblete de dobletes), sa (señal ancha), sc (señal
compleja), d.e. D_{2}O (desaparece al realizar el espectro tras
añadir unas gotas de agua deuterada).
En los espectros de ^{13}C-RMN
se indica la frecuencia de trabajo y el disolvente utilizado en
cada espectro. La posición de las señales se indica en \delta
(ppm), utilizando como referencia la señal de los protones del
disolvente. Se toman como valores de referencia 77.00 ppm para el
cloroformo y 39.50 ppm para el dimetilsulfóxido deuterado.
También se han realizado experimentos de
resonancia magnética nuclear usando la secuencia de pulsos
APT
(Attached Proton Test).
(Attached Proton Test).
Cuando se realizan análisis por HPLC para
determinar la pureza de algunas muestras, las condiciones
utilizadas son las siguientes:
Columna: RP-C18, Symmetry 150x3,9
mm, 5 \mu, 100 A
Fase móvil: H_{2}O+H_{3}PO_{4}
0.1%/CH_{3}CN + 5% H_{2}O + 0.1% H_{3}PO_{4}
Temperatura: ambiente
Flujo 1 mL/min
Volumen inyección: 10 \muL
Columna: RP-C18, Symmetry 150x3,9
mm, 5 \mu, 100 A
Fase móvil: 50% de H_{2}O+H_{3}PO_{4} 0.1%
y 50% de CH_{3}CN + 5% H_{2}O + 0.1% H_{3}PO_{4}
Temperatura: ambiente
Flujo 1 mL/min
Volumen inyección: 10 \muL
En la preparación de los tripéptidos se emplean
técnicas de cromatografía preparativa y HPLC para purificar el
crudo y la identidad del producto se confirma por espectrometría de
masas y el análisis de aminoácidos. La pureza de los tripéptidos
se analiza mediante HPLC en las siguientes condiciones: columna de
tipo C18 Nucleosil, 250 x 4 mm, 120 \ring{A}, 10 \mum; flujo de
1 mL/min; eluyentes A = H_{2}O (+0.045% TFA) y B = CH_{3}CN
(+0.036% TFA).
Los espectros de ultravioleta (UV) se han
registrado en un espectrofotómetro Shimadzu UV-160A.
Para cada uno de los compuestos se indica la longitud de onda
(\lambda) expresada en nm, y la absortividad molar (\varepsilon)
de cada una de ellas expresada en cm^{-1} mol^{-1} L.
En la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) se ha utilizado un detector de ultravioleta de fotodiodos de
Hewlett-Packard 1040 A.
Etapa
1
En un matraz de 250 mL provisto de agitación
magnética se introducen 4.0 g. (17.6 mmol) del clorhidrato del
ácido
2-amino-2-[4-(4-mercaptotetrahidropiran)]acético,
y 60 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5N. A continuación de
añaden 3.07 g. (21.8 mmol) de carbonato potásico anhidro y 60 mL
de MeCN. La mezcla se enfría con un baño de hielo y se adiciona
gota a gota 1.42 mL (19.7 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en
25 mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico
0.5 N hasta pH 9-10. Se agita la mezcla a
temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido
clorhídrico 2N hasta pH=6 y se elimina el disolvente a presión
reducida. El sólido obtenido se seca a vacío sobre pentóxido de
fósforo. Se suspende eri 150 mL de EtOH absoluto y se agita a
temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con
EtOH absoluto. Se elimina el disolvente a presión reducida. Se
obtienen 3.98 g de crudo del producto intermedio, ácido
N-acetil-2-amino-2-[4-(4-mercaptotetrahidropiran)]acético,
que se somete a varias cromatografías preparativas de fase reversa
para obtener 80 mg de producto del 90% de pureza (HPLC gradiente A,
\lambda=205 nm).
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 7.40 (1H, d, J=10Hz, NH), 4.13 (1H,
d, J=10Hz, CH), 3.75-3.50 (4H, s.c., CH_{2}),
1.90-1.80 (4H, s.c., CH_{2}), 1.65 (3H, s,
CH_{3}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 171.50 (CO-N), 168.90
(CO), 63.69 (CH_{2}), 63.27 (CH_{2}), 62.80 (CH), 49.18 (C),
37.58 (CH_{2}), 36.12 (CH_{2}), 23.01 (CH_{3}).
Etapa
2
Se disuelven 80 mg (0.34 mmol) del ácido
N-acetil-2-amino-2-(4-(4-mercaptotetrahidropiran))
acético en 4000 \muL de MeOH. Se añaden 500 \muL de disolución
de HCl 1 N y 136 \muL de disolución de NaNO_{2} 5 M. Se trata
la disolución resultante durante 1 minuto en un baño de
ultrasonidos y se añaden a continuación 50 \muL de disolución de
NaOH 10 N y 14 \muL de H_{2}O.
De la disolución resultante se separa una
alícuota A de 470 \muL y al resto se le añade agua abundante, se
congela y se liofiliza para obtener 190 mg de un sólido B
higroscópico ligeramente humedecido.
- \lambda 220 nm: pureza fracción A 68%
- \lambda 339 nm: pureza fracción A 95%.
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 8.00-7.50 (1H, s.c.,
NH), 4.50-4.00 (1H, s.c., CH),
3.80-3.40 (4H, s.c., CH_{2}),
2.40-1.80 (4H, s.c., CH_{2}), 1.88 (3H, s,
CH_{3}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 173.00 (CO), 169.52 (CO),
67.69(CH_{2}-O), 63.45 (CH), 53.78 (C),
32.17 (CH_{2}), 22.80 (CH_{3}).
Etapa
1
En un matraz de 250 mL provisto de agitación
magnética se introducen 3.69 g. (13 mmol) del diclorhidrato del
ácido
2-amino-2-[4-(4-mercapto-1-metilpiperidin)]acético,
y 30 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5 N. A continuación
de añaden 2.2 g. (16 mmol) de carbonato potásico anhidro y 30 mL
de MeCN. La mezcla se enfría con un baño de hielo y se adiciona
gota a gota 1.0 mL (14 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 10
mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico 0.5 N
hasta pH 9-10. Se agita la mezcla a temperatura
ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico
2N hasta pH=6 y se elimina el disolvente a presión reducida. El
sólido obtenido se seca a vacío sobre pentóxido de fósforo. Se
suspende en 100 mL de EtOH absoluto y se agita a temperatura
ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con EtOH
absoluto. Se elimina el disolvente a presión reducida. Se obtienen
2.8 g de crudo del producto intermedio, ácido
N-acetil-2-amino-2-[4-(4-mercapto-1-metilpiperidin)]acético,
que se somete a varias cromatografías preparativas de fase reversa
para obtener 0.5 g de producto del 99% de pureza (HPLC gradiente A,
\lambda=210 nm).
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 8.35 (1H, d, J=10Hz, NH), 4.43 (1H,
d, J=10Hz, CH), 3.35-3.00 (4H, s.c., CH_{2}),
2.70 (3H, s, CH_{3}), 2.20-1.90 (4H, s.c.,
CH_{2}), 1.85 (3H, s, CH_{3}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 170.55 (CO-N), 170.05
(CO), 61.77 (CH), 49.33 (CH_{2}), 49.28 (CH_{2}), 46.38 (C),
42.26 (CH_{3}), 33.05 (CH_{2}), 33.14 (CH_{2}), 22.42
(CH_{3}).
Etapa
2
Se disuelven 50 mg (0.20 mmol) del ácido
N-acetil-2-amino-2-[4-(4-mercapto-1-metilpiperidin))acético
en 800 \muL de disolución de HCl 1 N. Se añaden 80 \muL de
disolución de NaNO_{2} 5 M. Se trata la disolución resultante
durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos y se añaden a
continuación 80 \muL de disolución de NaOH 10 N y 40 \muL de
H_{2}O.
De la disolución resultante se separa una
alícuota A de 100 \muL y el resto se congela y se liofiliza para
obtener 79 mg de un sólido B.
- \lambda 230 nm: pureza fracción A 90%; pureza fracción B 93%
- \lambda 334 nm: pureza fracción A 98%; pureza fracción B 98%
^{1}H-RMN (200 Mhz, D_{2}O):
4.71 (1H, s, CH), 2.70-2.20 (8H, sc, CH_{2}),
1.95 (3H, s., CH_{3}-N), 1.71 (3H, s,
CH_{3}-CO).
^{13}C-RMN (50 Mhz, D_{2}O )
: 172.51 (CO), 171.52 (CO), 61.08 (CH), 58.18 (C), 48.09
(CH_{2}-N), 48.01 (CH_{2}-N),
42.18 (CH_{3}-N), 30.44 (CH_{2}), 29.85
(CH_{2}), 20.17 (CH_{3}-CO).
Etapa
1
En un matraz de 100 mL provisto de agitación
magnética se introducen 2.0 g. (5.9 mmol) del ácido
2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico,
y 20 mL de disolución de hidróxido potásico 0.5N. A continuación
de añaden 1.0 g. (7.2 mmol) de carbonato potásico anhidro y 20 mL
de MeCN. La mezcla se enfría con un baño de hielo y se adiciona
gota a gota 0.5 mL (6.5 mmol) de cloruro de acetilo disuelto en 8
mL de MeCN. Finalizada la adición se añade hidróxido potásico 1N
hasta pH 12-13. Se agita la mezcla a temperatura
ambiente durante 2 horas. A continuación se añade ácido clorhídrico
2N hasta pH=6 y se elimina el disolvente a presión reducida. El
crudo obtenido se suspende en 100 mL de EtOH absoluto y se agita a
temperatura ambiente. El residuo insoluble se filtra y se lava con
EtOH absoluto. Se elimina el disolvente a presión reducida. El
residuo se recristaliza de agua. La parte insoluble se filtra y se
descarta. El filtrado se congela y se liofiliza. Se obtienen 1.64 g
del producto intermedio,
N-acetil-2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico.
Rendimiento: 81%.
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 7.68 (1H, d, J=8Hz, NH),
7.35-7.05 (10H, sc, CH_{ar}), 4.36 (1H, d, J=8Hz,
CH), 3.42-3.02 (2H, sc,
CH_{2}-C_{ar}), 2.95-2.55 (2H,
sc, CH_{2}), 1.82 (3H, s, CH_{3}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}) : 172.94 (CO-N),
169.08 (CO), 138.55 (C_{ar}), 138.16 (C_{ar}), 132.36
(2CH_{ar}), 131.89 (2CH_{ar}), 127.78 (2CH_{ar}), 127.53
(2CH_{ar}), 126.44 (CH_{ar}), 126.26 (CH_{ar}), 60.16 (CH),
55.62 (C), 43.70 (CH_{2}), 42.94 (CH_{2}), 23.14 (CH_{3}).
\newpage
Etapa
2
Se disuelven 0.62 g (1.8 mmol) del ácido
N-acetil-2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico
en 25 mL de MeOH. Se añaden 25 mL de disolución de HCl 1 N y una
disolución de 250 mg de NaNO_{2} en 25 mL de H_{2}O. Se agita
la disolución resultante durante 35 minutos a temperatura ambiente,
se filtra y se lava con agua. Tras secar a presión reducida en
presencia de P_{2}O_{5} se obtienen 0.33 g de un sólido.
- \lambda 220 nm: pureza 91%
- \lambda 342 nm: pureza 100%
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 8.77 (1H, d, J=10Hz, NH),
7.28-7.00 (10H, sc, CH_{ar}), 5.33 (1H, d, J=10Hz,
CH), 4.12-3.90 (2H, sc, CH_{2}),
3.88-3.38 (2H, sc, CH_{2}), 1.86 (3H, s,
CH_{3}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 171.55 (CO-N), 169.67
(CO-O), 135.51 (C_{ar}), 135.27 (C_{ar}),
131.52 (CH_{ar}), 131.41 (CH_{ar}), 128.15 (CH_{ar}), 128.05
(CH_{ar}), 127.04 (CH_{ar}), 65.13 (CH), 56.11 (CH), 40.91
(CH_{2}), 40.15 (CH_{2}), 22.29 (CH_{3}).
Etapa
1
En un matraz de 250 mL provisto de agitación
magnética se mezclan 5.8 g (25.5 mmol) de clorhidrato del ácido
2-amino-2-(4-(4-mercaptotetrahidropiran))acético,
4.7 g (25.5 mmol) de
\alpha-bromo-p-xileno
y 100 mL de una mezcla H_{2}O/EtOH 3:1. Se añaden 11 mL de
trietilamina, se crea una atmósfera de argon y se agita la mezcla
durante 18 h a temperatura ambiente. Se añaden 50 mL más de
H_{2}O/EtOH 3:1 y se agita durante 2 h más. La suspensión
resultante se filtra y se lava con 100 mL de agua y 50 mL de EtOH.
Se obtiene un sólido que se seca a presión reducida. Se añaden 300
mL de ácido clorhídrico concentrado sobre el sólido y se elimina
el disolvente a presión reducida. Se repite el mismo tratamiento
ácido una segunda vez, obteniendo un sólido que se seca a presión
reducida. Se obtienen 1.59 g del producto intermedio de
interés.
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 8.80-8.30 (3H, sa,
H_{3}N+), 7.26 (2H, d, J=8 Hz, CH_{ar}), 7.12 (2H, d, J=8 Hz,
CH_{ar}), 4.03 (1H, s, CH-N),
3.85-3.55 (6H, sc,
CH_{2}-C_{ar}, CH_{2}-O), 2.26
(3H, s, CH_{3}), 2.05-1.08 (4H, sc,
CH_{2}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 168.98 (CO), 136.64 (C_{ar}),
133.80 (C_{ar}), 129.55 (CH_{ar}), 129.29 (CH_{ar}) 62.36
(CH_{2}-O), 59.85 (CH-N),
49.15(C) 32.03 (CH_{2}), 31.19 (CH_{2}), 30:84
(CH_{2}), 20.69 (CH_{3}).
Etapa
2
Se suspenden 1004 mg del clorhidrato del ácido
2-amino-2-(4-(4-(p-metilbencilmercapto)tetrahidropiran))
acético (3.029 mmol) en 20 ml de tBuOH/H_{2}O 2:1 y se adiciona
NaOH al 5% hasta pH=9. A continuación se añaden 3 equivalentes de
Boc_{2}O y se deja reaccionar por espacio de 30 min, transcurridos
los cuales se ajusta de nuevo el pH a 9. La reacción se prolonga
30 min más y se vuelve a corregir el pH. Se comprueba que la
reacción se ha completado por cromatografía en capa fina (CCF)
comparando con el aminoácido de partida.
El producto se aisla realizando dos tratamientos
consecutivos de extracción con 50 mL de hexano. La fase acuosa se
acidifica con HCI 1N hasta pH=2. A continuación se realizan tres
etapas de extracción con 60 mL de AcOEt cada una. La solución de
AcOEt se seca con MgSO_{4} anhidro y, tras la eliminación del
disolvente por evaporación, se redisuelve el producto en DCM y se
vuelve a evaporar. Esta etapa se repite dos veces más, tras las
cuales se obtienen 1191 mg (3.015 mmol) del producto intermedio
N-Boc protegido.
El producto se caracteriza por:
- a)
- CCF, con CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5 como fase móvil. El Rf=0.48, no observándose señal del producto de partida.
- b)
- HPLC en gradiente de 10% a 100% de MeCN en 30 min + isocrático al 100% de MeCN durante 5 min. La pureza resultante es del 96% (220 nm).
- c)
- Espectrometría de masas (MS) por técnica FAB: Mcalculado=395, (M+H^{+}) experimental=396.0
- d)
- RMN (CDCl_{3}) : 7.18 (2H, d, J=8 Hz) 7.09 (2H, d, J=8 Hz), 5.54 (1H, d, J= 11.2 Hz), 4.44 (1H, d, J=8.3 Hz), 3.69 (1H, d, J=11.2 Hz), 3.57 (1H, d, J=11.2 Hz), 3.75-3.98 (4H, sa), 2.32 (3H, s), 1.26-2.19 (4H, sa), 1.46 (9H, s).
Etapa
3
El tripéptido se prepara por técnicas de
síntesis en fase sólida, partiendo de 1595 mg de una
Boc-Gly-OCH_{2}-Pam-resina
(Neosystem, n° ref. RP00801) de sustitución 0.63 mmol/g. La escala
de trabajo es de 1.005 mmol.
El protocolo general para la adición de los
restantes aminoácidos es el siguiente:
- 1)
- Se hincha la resina con 5 lavados de 0.5 min con DCM.
- 2)
- Desprotección del grupo Boc con TFA al 40% en DCM, 1x1 min + 1x20 min.
- 3)
- Lavados con DCM, 5x 0.5 min.
- 4)
- Test de ninhidrina
- 5)
- Lavados con DMF, 3x1 min.
- 6)
- Acoplamiento por espacio de 1.5 horas.
- 7)
- Lavados con DMF, 3x1 min.
- 8)
- Lavados con DCM, 5x0.5 min.
- 9)
- Test de ninhidrina.
En caso de que el test de ninhidrina resulte
positivo en la última etapa, se procede a reacoplar, repitiendo los
pasos 5-8.
El acoplamiento se realiza con 6 equivalentes
(eq) de DIEA, 3 eq. de Boc-aminoácido y 3 eq. de
agente activante, que en nuestro caso es PyAOp (hexafluorofosfato
de
7-azabenzotriazol-1-il-oxitris
(pirrolidino) fosfonio). Para el acoplamiento de
\gamma-Glu se utilizó
Boc-Glu-(\alpha-OBzl).
Finalizado el ensamblaje de la secuencia, la
peptidilresina resultante se somete a acidolisis con
HF/p-cresol (9:1) durante 1 hora a 0ºC. Tras la
evaporación, el residuo sólido se extrae con éter anhidro y a
continuación se aísla el péptido por extracción con AcOH 10%. Una
vez reducido el volumen por evaporación, el crudo se liofiliza y se
caracteriza por:
a) HPLC en gradiente de 5% a 65% de MeCN en 30
min.
b) MS por técnica Electrospray:M_{calc}=377,
(M+H^{+})_{exp}=378.2
Se cuantifica el péptido contenido en el crudo
por análisis de aminoácidos: m=329 mg (0.873 mmol). En todas las
cuantificaciones peptídicas se utiliza el análisis de aminoácidos,
añadiendo un patrón externo de Ile (Isoleucina) a la muestra a
hidrolizar.
Se procede a la purificación del tripéptido (en
dos lotes) mediante HPLC a escala preparativa. El sistema utilizado
es el siguiente:
- Columna: C18 Nucleosil, 200x20 mm, 120
\ring{A}, 10 \mum.
- Eluyentes: A=H_{2}O (+0.1% TFA), B=MeCN (+0.
1% TFA).
- Gradiente: Isocrático 0% B durante 40 min +
gradiente de 0% a 10% B en 40 min.
- Flujo: 25 ml/min.
Se obtienen en total 227 mg (0.602 mmol) del
tripéptido intermedio que se caracterizan por:
- a)
- HPLC en gradiente de 5% a 45% de MeCN en 20 min. La pureza resulta ser del 95% (220 nm). El pico minoritario a 8.4 min disminuye en proporción relativa, hasta extinguirse, al diluir progresivamente la muestra aplicada. Por dicho motivo se concluye, que corresponde a agregación del tripéptido (y no a oxidación) y por tanto se considera como producto válido.
- b)
- MS por técnica Electrospray: M_{calc}=377 (M+H^{+})_{exp} 378.2
Etapa
4
A una disolución de 14.2 mg (0.38 mmol) del
tripéptido obtenido en la etapa 3 en 800 \muL de HCl 1N se le
añaden 76 \muL de una disolución de NaNO_{2} 0.5M. Se mantiene
la agitación en baño de ultrasonidos a temperatura ambiente durante
1 minuto. A continuación se adicionan 80 \muL de una disolución
de NaOH 10N. La disolución obtenida se congela y se liofiliza. El
sólido obtenido se caracteriza por:
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 8.90-8.50 (2H, sa,
NH), 5.35 (1H, d, J=10 Hz, CH), 4.10-3.00 (3H, sc,
CH_{2}, CH), 1.95-1.65 (4H, sc, 2CH_{2}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 172.18 (CO-N),
171.21 (CO-N), 168.40 (CO-O), 63.03
(CH_{2}), 62.31 (C), 59.56 (CH), 53.19 (CH), 41.20 (CH_{2}),
32.94 (CH_{2}), 31.71 (CH_{2}), 31.41 (CH_{2}), 27.12
(CH_{2}).
HPLC (Método A): \lambda 220 nm (pureza 94%);
\lambda 334 nm (pureza 95%)
UV: \lambda 346 nm \varepsilon (H_{2}O) 502
cm^{-1} mol^{-1} L
Etapa
1
En un matraz de 100 mL provisto de agitación
magnética se mezclan 6.4 g (23 mmol) de diclorhidrato del ácido
2-amino-2-(4-(4-mercapto-1-metilpiperidin))
acético, 4.3 g (23 mmol) de
\alpha-bromo-p-xileno
y 40 mL de una mezcla H_{2}0/EtOH 1:1. Se añaden 13 mL de
trietilamina, se crea una atmósfera de argon y se agita la mezcla
durante 42 h a temperatura ambiente. De la disolución resultante se
elimina el disolvente a presión reducida y al crudo obtenido se le
añaden 20 mL de EtOH absoluto. Se obtiene un sólido que se filtra y
se lava con EtOH absoluto y EtOEt sucesivamente. Se seca a presión
reducida. Se obtienen 2.11 g del producto intermedio, clorhidrato
del ácido
2-amino-2-(4-(4-(p-metilbencilmercapto)-1-metilpiperidin))
acético. Rendimiento: 29.6.
El espectro NMR se registra en D_{2}O y se toma
como referencia 4.75 ppm para HDO.
^{1}H-RMN (200 Mhz, D_{2}O):
7.28 (2H, d, J=8 Hz, CH_{ar}), 7.15 (2H, d, J=8 Hz, Ch_{ar}),
3.64-3.74 (2H, sc,
CH_{2}-C_{ar}), 3.62 (1H, s,
CH-N), 3.4-3.1 (4H, sc,
CH_{2}-N), 2.76 (3H, s,
CH_{3}-N), 2.24 (3H, s, CH_{3}),
2.15-1.92 (4H, sc, CH_{2}).
^{13}C-RMN (50 Mhz, D_{2}O) :
173.15 (CO), 141.00 (C_{ar}), 136.39 (C_{ar}), 132.58
(CH_{ar}) 131.95 (CH_{ar}), 63.57 (CH-N), 52.48
(CH_{2})+, 50.65(C), 45.66 (CH_{3}-N),
34.05 (CH_{2}), 32.35 (CH_{2}), 31.28 (CH_{2}), 22.77
(CH_{3}).
Etapa
2
Se parte de 1016 mg (2.958 mmol) del intermedio
obtenido en la etapa anterior y se procede de la manera ya descrita
en la etapa 2 del ejemplo 4. Se obtienen 1016 mg (2.490 mmol) del
intermedio N-Boc protegido que se caracteriza
por:
- a)
- CCF (fase móvil CHCI_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5). R_{f}=0.32, sin observarse señal del producto de partida.
- b)
- HPLC en gradiente de 10% a 100% de MeCN en 30 min. La pureza es del 96% (220 nm).
- c)
- MS por técnica FAB: M_{calc}=408 (M+H^{+})_{exp}=408.9
- d)
- MS por técnica Electrospray: (M+H^{+})_{exp}=409.3
Etapa
3
El intermedio tripéptido se obtiene, utilizando
el método descrito en la etapa 3 del ejemplo 4, partiendo de 794 mg
de la resina ya mencionada. La escala de trabajo es de 0.5 mmol.
Debido a las dificultades de solubilización que presenta el
Boc-derivado se opta por utilizar
N-metilmorfolina como base (3 equivalentes) en
lugar de DIEA en el acoplamiento del mencionado aminoácido. Después
de la incorporación de \gammaGlu, el tripéptido queda ensamblado
y se procede a la escisión del enlace
péptido-resina por acidolisis al igual que en los
casos anteriores. Se obtiene finalmente un crudo en AcOH 10% que se
liofiliza y se cuantifica posteriormente, obteniendo un resultado de
137 mg (0.351 mmol) del tripéptido intermedio, que se caracteriza
por:
- a)
- HPLC, gradiente isocrático 0% durante 10 min + 5%\rightarrow65% de MeCN en 30 min. Se constata que el producto inyectado en disolución acética elude con el frente, así pues, se hace necesario liofilizar alícuotas para eliminar este ácido y redisolver el liofilizado en HCl 1mM. De esta forma puede observarse cromatográficamente el péptido, que elude a 6.8 min en el gradiente utilizado.
- b)
- MS por técnica Electrospray: Mcalc=390 (M+H^{+})_{exp}=391.2
Se procede entonces a la purificación del crudo,
mediante HPLC a escala preparativa con los parámetros ya descritos
en el ejemplo 4. Se aplica también un isocrático al 0% de B durante
40 min seguido de un gradiente de 0% a 10% de B en 40 min. De esta
forma se obtiene la cantidad de 107 mg (0.274 mmol) de producto,
caracterizado mediante:
- a)
- HPLC en gradiente de 0% a 0% en 10 min mas 0% a 30% en 20 min. La pureza es del 94% (220 nm). Se comprueba que el pico adicional a 8.0 min corresponde también en este caso a agregación, asignándose por ello como producto correcto.
- b)
- MS por técnica Electrospray: Mcalc=390 (M+H^{+})_{exp}=391.1
Etapa
4
Partiendo de 10.0 mg (0.026 mmol) del intermedio
tripéptido obtenido en la etapa anterior, se efectúa la
nitrosación, de la manera ya descrita en la etapa 4 del ejemplo 4,
utilizando 52 \muL de NaNO_{2} 0.5 M. El producto obtenido se
caracteriza por:
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 171.57 (CO-N),
170.99 (CO-N), 170.76 (CO-N), 168.20
(CO-O), 60.23 (C), 59.53 (CH), 51.57 (CH), 49.02
(CH_{2}), 42.20 (CH_{3}), 41.59 (CH_{2}), 30.49 (CH_{2}),
29.75 (CH_{2}), 29.31(CH_{2}), 26.05 (CH_{2}).
HPLC (Método B) : \lambda 220 nm (pureza 74%);
\lambda 334 nm (pureza 88%).
UV: \lambda 346 nm \varepsilon (H_{2}O) 198
cm^{-1} mol^{-1} L
Etapa
1
En un matraz de 100 mL provisto de agitación
magnética se mezclan 1.25 g (3.7 mmol) de clorhidrato del ácido
2-amino-3-bencil-3-mercapto-4-fenilbutanoico,
0.68 g (3.7 mmol) de
\alpha-bromo-p-xileno
y 40 mL de una mezcla H_{2}O/EtOH 1:1. Se añaden 1.6 mL de
trietilamina y se disuelve la mayor parte del sólido en suspensión.
Se crea una atmósfera de argon y se agita la mezcla durante 24 h a
temperatura ambiente. Se elimina el etanol y parte de la
trietilamina a presión reducida. La suspensión acuosa resultante se
filtra obteniéndose un sólido blanco. Se purifica mediante
cromatografía de columna en fase reversa con
CH_{3}CN-H_{2}O. Se añaden 100 mL de McOH-ácido
clorhídrico concentrado 1:1 sobre el sólido obtenido y se elimina
el disolvente a presión. Se obtienen 0.5 g del producto intermedio,
clorhidrato del ácido
2-amino-3-bencil-3-(4-metilbencilmercapto)-4-fenilbutanóico.
^{1}H-RMN (200 Mhz,
DMSO-d_{6}): 8.95-8.50 (3H, sa,
H_{3}N+), 7.45-7.25 (10H, sc, CH_{ar}), 7.08
(2H, d, J=10 Hz, CH_{ar}), 6.98 (2H, d, J=10 Hz, CH_{ar}), 4.05
(1H, s, CH-N), 3.55-3.0 (4H, sc,
CH_{2}-C_{6}H_{5},
CH_{2}-C_{ar}), 2.90-2.60 (2H,
sc, CH_{2}), 2.20 (3H, s, CH_{3}).
^{13}C-RMN (50 Mhz,
DMSO-d_{6}): 168.70 (CO), 136.53 (C_{ar}),
136.00 (C_{ar}), 134.94 (C_{ar}), 132.50 (C_{ar}) 131.18
(CH_{ar}); 129.169 (CH_{ar}), 128.90 (CH_{ar}), 128.26
(CH_{ar}), 128.02 (CH_{ar}), 127.07 (CH_{ar}), 57.06
(CH-N), 53.64 (C), 42.22 (CH_{2}), 41.65
(CH_{2}), 31.90 (CH_{2}-S), 20.48
(CH_{3}).
Etapa
2
Se parte de dos fracciones del intermedio
obtenido en la etapa anterior (180 mg del 83% de pureza y 530 mg
del 94% de pureza) y se procede de la manera ya descrita en la
etapa 2 del ejemplo 4. Se obtienen 733 mg (1.45 mmol) del
intermedio N-Boc protegido que se caracteriza
por:
- a)
- CCF (CHCl_{3}-MeOH-HOAc 85:10:5), Rf=0.63.
- b)
- HPLC Gradiente de 10% a 100% MeCN, 30 min, isocrático 100%, 5 min, pureza: 91% (220 nm)
- c)
- EM-MALDI-TOF (Espectro de masas): Matriz de ácido dihidroxibenzoico, M_{calc}=505 (M+H^{+})_{exp}=528.585 (M+Na)
- d)
- RMN: Se confirma la presencia del grupo Boc.
Etapa
3
El intermedio tripéptido se obtiene, utilizando
el método descrito en la etapa 3 del ejemplo 4, partiendo de 0.43
mmol de la resina ya mencionada. Tras la etapa de escisión
acidolítica se aísla un crudo que contiene 14.4 mg (29.96 \mumol)
de intermedio tripéptido que se caracteriza por:
- a)
- HPLC analítica gradiente de 5% a 65% en 30 min, pureza aproximada 95%.
- b)
- EM-electrospray M_{calc}=487 (M+H^{+}), M_{exp}=488.3
\newpage
Etapa
4
Partiendo de 5.7 mg (0.012 mmol) del intermedio
tripéptido obtenido en la etapa anterior, se efectúa la
nitrosación, de la manera ya descrita en la etapa 4 del ejemplo 4,
utilizando 24 \muL de NaNO_{2} 0.5 M. El producto obtenido se
caracteriza por:
HPLC (Método A): \lambda 220 nm pureza 68%;
\lambda 334 nm pureza 86%.
UV: \lambda 345 nm
\varepsilon(H_{2}0) 368 cm^{-1} mol^{-1} L.
La metodología seguida en los ensayos es
substancialmente coincidente con la descrita en las siguientes
referencias bibliográficas:
- *
- Furchgot, R.F. "Methods in nitric oxide research". Feelisch & Stamler eds. John Wiley & Sons, Chichester, England, pp 567-581.
- *
- Trongvanichnam, K, et al. Jpn J. Pharmacol. 1996; 71:167-173.
- *
- Salas, E., et al. Eur. J. Pharmacol. 1994; 258:47-55.
Los diferentes compuestos se ensayan a cinco
concentraciones diferentes, en un rango de concentraciones
comprendido entre 0,001 y 10 mM, utilizando de 6 a 9 anillos
arteriales para cada compuesto. Los resultados obtenidos se
comparan con los proporcionados por el
S-nitrosoglutatión (GSNO), usado como producto de
referencia.
Los resultados se exponen a continuación en la
tabla 1, y se expresan en CE_{50} (concentración efectiva 50), es
decir la concentración de cada compuesto ensayado que produce una
vasodilatación de un 50% en el anillo arterial previamente
contraído con 1 \muM de norepinefrina.
| Ensayos de vasodilatación | |
| Compuesto | CE_{50} \muM (media \pm SD) |
| GSNO | 1.56 \pm 0.55 |
| Producto obtenido en el ejemplo 1 | 0.375 \pm 0.05 |
| Producto obtenido en el ejemplo 2 | 0.024 \pm 0.003 |
| Producto obtenido en el ejemplo 3 | 0.63 \pm 0.21 |
| Producto obtenido en el ejemplo 4 | 1.73 \pm 0.27 |
| Producto obtenido en el ejemplo 5 | 1.89 \pm 0.82 |
Como se observa en la tabla, todos los
compuestos ensayados manifiestan una potente actividad
vasodilatadora, similar o superior a la del producto de referencia
GSNO, siendo de destacar que el compuesto 2 muestra una
actividad vasodilatadora muy superior a la de dicho producto de
referencia.
La metodología seguida en los ensayos es
substancialmente coincidente con la descrita en las siguientes
referencias bibliográficas:
- *
- Loscalzo J, et al. En: Methods in nitric oxide research (Feelisch M, Stamler JS, eds.) John Wiley & Sons, Chichester, England, pp 583-591.
- *
- Radomski MW, et al. Br J Pharmacol 1987; 92:181-187.
- *
- Salas E, et al. Br J Pharmacol 1994; 112:1071-1076.
Los compuestos se ensayan a cuatro
concentraciones distintas, utilizando de 5 a 23 donantes de
plaquetas diferentes. Los resultados obtenidos se comparan con los
proporcionados por el S-nitrosoglutatión (GSNO),
usado como producto de referencia.
Los resultados se exponen a continuación en la
tabla 2, y se expresan en CI_{50} (concentración inhibitoria 50),
es decir la concentración de cada compuesto ensayado que inhibe en
un 50% la agregación obtenida con una concentración submaximal de
colágeno (1 \mug/mL).
| Ensayos de inhibición de la agregación de las plaquetas. | |
| Compuesto | IC_{50} \muM (media \pm SD) |
| GSNO | 0.48 \pm 0.19 |
| Producto obtenido en el ejemplo 1 | 0.07 \pm 0.02 |
| Producto obtenido en el ejemplo 2 | 0.19 \pm 0.02 |
| Producto obtenido en el ejemplo 3 | 0.24 \pm 0.027 |
| Producto obtenido en el ejemplo 4 | 0.20 \pm 0.12 |
| Producto obtenido en el ejemplo 5 | 0.047 \pm 0.011 |
| Producto obtenido en el ejemplo 6 | 0.35 \pm 0.11 |
Como se observa en la tabla 2, todos los
compuestos ensayados manifiestan una potente actividad inhibitoria
de la agregación de las plaquetas, similar o superior a la del
producto de referencia GSNO, siendo de destacar que los compuestos
1 y 5 muestran una actividad inhibidora muy superior
a la de dicho producto de referencia.
El compuesto obtenido en el ejemplo 5 (5)
se ensaya in vitro para comprobar su capacidad de
incrementar los niveles intraplaquetarios de GMPc en una
preparación de plaquetas lavadas humanas.
La metodología seguida en los ensayos es
substancialmente coincidente con la descrita en las referencias
bibliográficas citadas en el ejemplo 8.
El compuesto se ensaya a cuatro concentraciones
diferentes, utilizando 5 donantes de plaquetas distintos. Los datos
obtenidos se comparan con los proporcionados por el GSNO (producto
de referencia) y con los valores basales. Los resultados
obtenidos, que se muestran en la tabla 3, se expresan en
pmol/10^{9} plaquetas.
| Ensayos de incremento de los niveles intraplaqueta de GMPc. | ||
| [\muM] | GMPc (pmol/10^{9} plaquetas) | |
| GSNO | Compuesto 5 | |
| 3 | 27.6 \pm 6.0 | - - - |
| 1 | 24 \pm 0.5 | 21.1 \pm 0.5 |
| 0.3 | 6.6 \pm 0.6 | 6.50 \pm 0.5 |
| Ensayos de incremento de los niveles intraplaqueta de GMPc. | ||
| [\muM] | GMPc (pmol/10^{9} plaquetas) | |
| GSNO | Compuesto 5 | |
| 0.1 | 1 \pm 0.5 | 1.50 \pm 0.4 |
| 0.03 | - - - | 1.60 \pm 0.5 |
| 0 | 1.33 \pm 0.38 | 1.33 \pm 0.38 |
El compuesto 5 aumenta los niveles
intraplaquetarios de GMP de manera similar a la del GSNO de
referencia. Es de destacar que para valores próximos a la
IC_{50}, el compuesto 5 induce unos niveles de GMPc más
bajos que el GSNO cuando se utilizan concentraciones próximas a su
IC_{50}.
La metodología seguida en los ensayos es
substancialmente coincidente con la descrita en las referencias
bibliográficas citadas en el ejemplo 8, completada con la
referencia:
- *
- Moro MA, et al. Pr Nat Acad Sc USA. 1996; 93:1480-5.
El ODQ se ensaya in vitro para bloquear la
inhibición de la agregación de las plaquetas en una preparación de
plaquetas lavadas humanas lograda por los compuestos obtenidos.
El compuesto obtenido en el ejemplo 5 (5)
se ensaya a tres concentraciones diferentes, en presencia o
ausencia de ODQ (1 \muM), utilizando 5 donantes de plaquetas
diferentes. Los resultados obtenidos se comparan con los
proporcionados por el producto de referencia (GSNO) y con los
valores en ausencia de ODQ. Los resultados obtenidos, que se
muestran en las tablas 4 y 5, se expresan como porcentaje de
inhibición sobre la agregación máxima.
| Producto de referencia (GSNO) | ||
| [\muM] | % inhibición sin ODQ | % inhibición con ODQ |
| 1 | 92.65\pm0.9 | 32.65\pm0.9 |
| 0.3 | 79.33\pm17 | 3.3\pm3 |
| 0.1 | 34.2\pm25 | 0 |
| Compuesto 5 | ||
| [\muM] | % inhibición sin ODQ | % inhibición con ODQ |
| 0.3 | 96 | 0 |
| 0.1 | 96 | 0 |
| 0.03 | 83\pm1.4 | 0 |
| 0.01 | 17 | 0 |
| 0.003 | 0 | 0 |
El ODQ (1 \muM) es capaz de bloquear el efecto
inhibidor del GSNO y del compuesto 5 cuando se utiliza la
dosis IC_{50} de los compuestos. A dosis superiores a las de la
IC_{50}, el efecto inhibidor de la agregación es mejor bloqueado
en el caso del compuesto 5 que en el caso del compuesto de
referencia.
Claims (12)
1. S-nitrosotioles derivados de
la penicilamina o del glutatión, y sus sales farmacéuticamente
aceptables, que responden a la fórmula general (I)
en la
que:
A y B son grupos fenilo o bien, conjuntamente,
conforman el restó
-CH_{2}-Q-CH_{2}- constituyendo
un anillo de seis unidades en el que Q representa un átomo de
oxigeno o de azufre o un resto N-R^{3}, en el que
R^{3} es hidrógeno o un grupo alquilo
C_{1}-C_{4};
R^{1} es un resto acilo, que puede ser un acilo
alifático C_{1}-C_{5} o un resto de ácido
glutámico unido por medio de su carboxilo no aminoacídico;
R^{2} es un grupo hidroxilo o un resto de
glicina unido mediante un enlace peptídico;
de manera que cuando R^{1} es un resto acilo
alifático R^{2} es un grupo hidroxilo, y cuando R^{1} es un
resto de ácido glutámico R^{2} es un resto de
glicina.
2. S-nitrosotioles, de acuerdo
con la reivindicación 1, que responden a la fórmula general
(II)
en la que A y B tienen los valores indicados
anteriormente y R^{4} es un grupo alquilo
C_{1}-C_{4}.
3. El compuesto, de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, ácido
N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomer-captotetrahidropiran)]acético
(1).
4. El compuesto, de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, ácido
N-acetil-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomer-capto-1-metilpiperidin)]acético
(2).
5. El compuesto, de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, ácido
N-acetil-2-amino-3-bencil-3-S-nitroso-mercapto-4-fenilbutanoico
(3).
6. S-nitrosotioles, de acuerdo
con la reivindicación 1, que responden a la fórmula general
(III)
en la que A y B tienen los valores indicados
anteriormente.
7. El compuesto, de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 6,
N[N-\gamma-L-glutamil-2-amino-2-(4-(4-S-nitroso-mercapto)tetrahidropiran))acetil]-glicina
(4).
8. El compuesto, de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 6,
N[N-\gamma-L-glutamil-2-amino-2-(4-(4-S-nitroso-mercapto-1-metilpiperidin))acetil]-glicerina
(5)
9. El compuesto, de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 6,
N[N-y-L-glutamil-2-amino-3-bencil-3-(4-metilbencil-S-nitrosomercapto)-4-fenil-butanoil]glicina
(6).
10. Composiciones farmacéuticas que comprenden
uno o más de los compuestos de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 como ingrediente(s)
activo(s), opcionalmente junto con vehículos, excipientes,
activadores, agentes quelantes y/o estabilizadores fisiológicamente
aceptables.
11. La utilización de los
S-nitrosotioles de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para preparar un medicamento para el
tratamiento de disfunciones circulatorias.
12. La utilización, de acuerdo con la
reivindicación 11, para preparar un medicamento para el tratamiento
de disfunciones del sistema cardiovascular.
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| EP1393723A3 (en) * | 1993-09-17 | 2004-10-20 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Use of nitric oxide-adducts to prevent thrombosis on artificial and vascular surfaces |
| US5728705A (en) | 1993-10-04 | 1998-03-17 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of inducing vasorelaxation to treat pulmonary hypertension |
| JPH09508097A (ja) | 1993-11-02 | 1997-08-19 | アメリカ合衆国 | 虚血再灌流傷害における保護剤としての酸化窒素放出化合物の使用 |
| GB9423868D0 (en) | 1994-11-25 | 1995-01-11 | Wellcome Found | Compounds for use in medicine |
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-
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