RS50249B

RS50249B - Kombinacije i kompozicije koje utiču na vegf/vegf i angiopoietin/tie receptor funkcije i njihova primena (ii)

Info

Publication number: RS50249B
Application number: YU97202A
Authority: RS
Inventors: Gerhard Siemeister; Martin Haberey; Karl-Heinz Thierauch
Original assignee: Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft,
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2009-07-15
Also published as: DK1292335T3; DE60128685D1; HRP20030041A2; KR20030036238A; NO20026152L; CA2411236A1; MEP13708A; EP1292335A2; ATE363291T1; AU784231B2; BR0111861A; WO2001097850A3; AU8576601A; US20030055006A1; PT1292335E; EP1292335B1; US20040147449A1; EE200200706A; MXPA02011897A; NZ536196A

Description

KOMBINACIJEI KOMPOZICIJE KOJE UTIČU NA VEGF/VEGFI ANGIOPOIETIN/Tie RECEPTOR FUNKCIJE I NJIHOVA PRIMENA (II)

Ovaj pronalazak obezbeđuje kombinacije supstanci koje utiču na biološku aktivnost vaskularnog endotelialnog faktora rasta (VEGF)/VEGF receptor sistema (jedinjenje I) i supstanci koje utiču na biološku funkciju angiopoeietin/Tie receptor sistema (jedinjenje II) za inhibiciju vaskularizacije i tretiranje raka.

STANJE TEHNIKE

Protein ligandi i receptor tirozin kinaze koji određeno regulišu endoletialnu ćeiijsku funkciju su suštinski uključeni u fiziološke angiogeneze kao i angiogeneze vezane za bolesti.

Ovi ligand/receptor sistemi obuhvataju vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF) i angiopoietin (Ang) familije i njihove receptore, VEGF receptor familiju i tirozin kinazu sa imunoglobulin sličnim i familijom epidermalnog faktora rasta homolgnim domenom (Tie). članovi dve familije receptor tirozin kinaze su eksprimovani prvenstveno kao endotelialne ćelije. VFGF receptor familija obuhvata Fltl (VEGF-R1), Flki/KDR (VEGF-R2) i F!t4 (VEGF-R3). Ovi receptori se prepoznaju po članovima faktora rasta povezanim sa VEGF po tome što su ligandi Fltl VEGF i faktor rasta placente (PIGF), pri čemu FIkl/KDF vezuju VEGF, VEGF-C i VEGF-D, a ligandi FU4 su VEGF-C i VEGF-D (Nicosia, AmJ.Pathol. 153,11-16,1998). Druga familija endotelialne ćelije specifične receptor kinaze je predstavljena sa Tiel i Tie2 (takođe poznata kao Tek). I dok Tiel ostaje kao „orfan" receptor, otkrivena su tri sekretovana glikoproteinska liganda Tie2, Angl, Ang2 i Ang3/Ang4 (Daviš et al., Cell 87,1161-1169,1996; Maisonpierre et al., Science 277, 55-60, 1997; Valenzuela et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96,1904-1909, 1999; Patenti US 5,521,073; US 5,650,490; US 5,814,464).

Vodeća uloga VEGF-a i njegovih receptora tokom vaskularnog razvoja je dokazana primerima u studijama inaktivacije ciljanog gena. Čak i heterozigodno cepanje VEGF gena rezultuje u fatlnom nedostatku vaskularizacije (Carmeliet et al., Nature 380, 435-439,1996; Ferrara et al., Nature 380, 439-442,1996). Miš koji ima homozigotno cepanje bilo Fltl ili Flkl/KDR gena umire tokom sredine graviditeta od akutnih vaskularnih defekata. Ipak, fenotipi se razlikuju u tome da Flkl/KDR nokaut miš nema ni endotelne ćelije ni razvoj hematopoeznog sistema (Shalabv et al., Nature 376, 62-66,1995), dok miš kome nedostaje Fltl ima normalne hematopoezne progenitore i endotelialne ćelije, koje ne uspevaju da sc spoje u funkcionalnu krvne sudove (Fong et al., Nature 376, 66-70, 1995). Cepanje Flt4 gena, čije rašireno eksprimiranje u embrionu postaje ograničeno na limfne sudove kod odraslih, otkriva esencijalnu ulogu FIt4 kod prepravljanja i sazrevanja osnovnih vaskularnih mreža u veće krvne sudove tokom ranog razvoja kardiovaskularnog sistema (Dumont et al., Science 282, 946-949, 1998). Saglasno sa eksprimiranjem u limfnom sistemu Flt4 kod odraslih, prekomerna ekspresija VEGF-C u koži transgenog miša rezultuje u limfnoj, ali ne vaskularnoj endotelialnog proliferaciji i uvećanju sudova (Jeltsch et al., Science 276, 1423-1425,1997). Šta više, za VEGF-C je objavljeno da indukuje novu vaskularizaciju rožnjače miša i embriona pileta horioalantoičnim membranskim modelom angiogeneze (Cao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14389-14394, 1998).

I za drugu grupu endotelial određenih receptora tirozin kinaze takođe je otkriveno da su kritično uključeni kod formiranja i integriteta vaskulature. Miš sa nedostatkom Tiel umire od edema i hemoragije do kojih dolazi zbog lošeg strukturnog integriteta endotelialnih ćelija mikro vaskularnih sudova (Sato et al., Nature 376, 70-74,1995; Rodewald i Sato Oncogene 12, 397-404,1996). Nokaut fenotim Tie2 je okarakterisan nezrelim krvnim sudovima kojima nedostaje granjanje i kojim nedostaju periendotelialne ćelije (Sato et al., Nature 376, 70-74,1995; Dumont et al., Genes Dev. 8, 1897-1909, 1994). Ciljana inaktivacija Angl liganda Tie2, kao i prekomerno eksprimiranje Ang2, inhibitornog liganda, rezultuje fenotipima sličnim nokaut Tie2 (Maisonpierre et al., Science 277, 55-60, 1997; Suri et al., Cell 87, 1171-1180). Suprotno, povećana vaskularizacija je zapažena tokom transgenskog prekomernog eksprimiranja Angl (Suri et al., Science 282, 468-471,1998; Thurstonene et al., Science 286,2511-2514,1999).

Rezultati studija eksprimiranja angiogenskog faktora rasta u razvoju žutog tela (Maisonpierre et al., Science 277, 55-60,1997; Goede et al., ,Lab. Invest. 78,1385-1394, 1998) studijestarenja krvnih sudova mrežnjače (Alon et al., Nature Med. 1, 1024-1028, 1995; Benjamin et al., Development 125, 1591-1598, 1998) i ciljanje gena i transgenski eksperimenti na Tie2, Angl i Ang2, skreću pažnju na odlučujuću ulogu Angiopoietin/Tie receptor sistema u kontrolisanju interakcije između endotelialnih ćelija i okolnih pericita ili glatkih mišićnih ćelija. Za Angl, koji je eskprimiran pomoću periendotelialnih ćelija i za koji se čini da se bitno eskprimira kod odraslih, misli se da stabilizuje zrele krvne sudove. Za Ang2, prirodni antagonist Angl koji se eskprimira endoteiialnim ćelijama na mestima granjanja, smatra se da posreduje u opuštanju endotelial-periendotelial kontakata čime se omogućava preoblikovanje krvnih sudova i razgranjavanje u saradnji sa inicijatorima angiogeneze kao što VEGF, ili nestajanje krvnih sudova u odsustvu VEGF (Hanahan, Science 277, 48-50,1997).

U patološkim postavkama povezanim sa započinjanjem nove vaskularizacije zapaženo je povišeno eksprimiranje angiogenskih faktora rasta i njihovih receptora. Mnogi čvrsti tumori eskprimiraju visoke nivoe VEGF-a i VEGF receptori se javljaju kao preovlađujući u endotelialnim ćelijama krvnih sudova koji okružuju ili penetriraju maligno tkivo (Plate et al., Cancer Res. 53, 5822-5827, 1993). Uticanje VEGF/VEGF receptorski sistem pomoću VEGF neutralizujućih antitela (Kim et al., Nature 362, 841-844, 1993), retrovirusno eksprimiranje dominantnih negativnih VEGF receptor varijanti (Millauer et al., Nature 367, 576-579,1994), rekombinantnih VEGF-neturalizujući receptor varijanti (Goldman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8795-8800, 1998), ili inhibitori sa malim molekulom VEGF receptor tirozin kinaze (Fong et al., Cancer Res. 59, 99-106,1999; Wedge et al., Cancer Res. 60, 970-975, 2000; Wood et al., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000), ili ciljanje citotoksičnih agenasa preko VEGF/VEGF receptorskog sistema (Arora et al., Cancer Res. 59, 183-188, 1999; EP 0696456A2) rezultuje u redukovanom rastu tumora i vaskularizacijom tumora. Ipak, iako su mnogi tumori inhibirani uticanjem na VEGF/VEGF receptorski sistem, na druge nije bilo uticaja (Millauer et al., Cancer Res. 56, 1615-1620,1996). Humani (tumori kod ljudi kao i eksperimentalni tumor ksenografti sadrže veliki broj nezrelih krvnih sudova koji se nisu još ojačali periendotelialnitn ćelijama. Udeo nezrelih krvnih sudova je u opsegu od 40% kod sporo napredujućeg raka prostate i 90% kod progresivnog (brzo razvijajućeg) glioblastoma. Selektivno nestajanje nezrelih krvnih sudova tumora je zapaženo nakon povlačenja (umanjenja) VEGF pomoću VEGF trasgenskog eksprimiranja u C6 modelu ksenografta glioblastoma. Ovaj rezultat je u skladu sa funkcijom VEGF kao faktora opstanka endotelijalne ćelije. Slično, kod raka prostate kod ljudi onemogućavanje VEGF eksprimiranje što je posledica androgen-ablacione terapiije dovodi do selektiv-apoptoične smrti endotelialnih ćelija u krvnim sudovima kojima nedostaje periendoteliaini ćelijski omotač. Kao suprotnost, delovi krvnih sudova koji su pokazali otpor povlačenju (umanjenju) VEGF-a pokazauju periendoteliaini ćelijski omotač (Benjamin et al., J. Clin. Invest. 103, 159-165,1999). Proučavanje povišenog eksprimiranje Tie receptora u endoteliumu metastaznih melanoma (Kaipainen et al., Cancer Res. 54, 6571-6577,1994), karcinoma dojke (Salven et al., Br. J. Cancer 74, 69-72,1996), i u tumornim ksenograftovima koji se razvijaju u prisustvu dominantno-negativnih VEGF receptora (Millauer et al., Cancer Res. 56,1615-1620,1996), kao i povišenog eksprimiranja Flt4 receptora u endotelijumu limfnih sudova koji okružuju limfome i karcinome dojke (Jussila et al., Cancer Res. 58, 1599-1604, 1998) i VEGF-C-a u različitim humanim uzorcima tumora (Salven et al., Am. J. Pathol. 153, 103-108, 1998), sugerišu specifično endoteliumske faktore rasta i receptore kao kandidate alternativnih puteva koji dovode do nove vaskularizacije tumora. Visoka gornja regulacija i eksprimiranje Ang2 je kod raznih faza tumora objašnjena u smislu mehanizma odbrane domaćina protiv inicijalne koopcije postojećih krvnih sudova razvijanjem tumora. U odsustvu VEGF, kooptirani krvni sudovi podležu regresiji koja vodi do nekroze u centru tumora. Suprotno tome, ,hipoksična gornja regulacija eksprimiranja VEGF u saradnji sa povišenim Ang2 spašava i pomaže vaskularizaciji tumora i tumor raste u maksimalnim granicama (Holash et al., Science 284, 1994-1998, 1999; Holash et al., Oncogene 18, 5356-5362, 1999).

Uticanje na Tie2 receptor funkciju pomoću angiopoietin-neutralizirajućih Tie2 varijanti koje se sastoje od domena ekstra ćelijskog vezivanja liganda je pokazalo da rezultuje u inhibiciji rasta i vaskularizacije eksperimentalnih tumora (Lin et al., J. Clin. Invest. 103, 159-165,1999; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829-8834, 1998; Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999). Upoređujući efekte uticanja na putanje endotelijum određenog receptora tirozin kinaze izažavanjem parakrina odgovarajućeg ekstra ćelijskog receptor domena na istu ćeiljsku osnovu pokazujući inhibiciju rasta tumora posle blokade VEGF receptor sistema i Tie2 receptor sistema, respektivno (Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185-3191,1999).

Poznato je da inhibicija VEGF/VEGF receptor sistema različitim metodama rezultuje samo u usporavanju rasta većine eksperimentalnih tumora (Millauer et al., Nature 367, 576-579,1994; Kim et al., Nature 362, 841-844,1993; Millauer et al., Cancer Res. 56, 1615-1620,1996; Goldmane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,8795-8800,1998; Fong et al., Cancer Res. 59„ 99-106,1999; Wedge et al., Cancer Res. 60, 970-975, 2000; Wood et al., Cancer Res. 60,2178-2189, 2000; Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185, 3191,1999). Čak se povećanjem terapeutske doze dostizao plato maksimalne terapeutske efikasnosti (Kim et al., Nature 362,841-844,1993; Wood et al., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000). Slični rezultati su zapaženi posle uticanja na angiopoietin/Tie2 receptor sistem (Lin et al., J. Clin. Invest. 103, 159165,1999; Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8829-8834, 1998; Siemeister et al., Cancer Res., 59, 3185-3191, 1999).

Međutim postoji velika potreba za metodom koji uvećava terapeutsku efikasnost anti-angiogeneznih jedinjenja.

Tražeći metode koje uvećavaju terapeutsku efikasnost anti-angiogeneznih jedinjenja, superiorni anti-tumorni efekti su neočekivano zapaženi posle kombinovanja inhibicije VEGF/VEGF receptor sistema i uticanja na biološke funkcije angiopoietin/Tie receptor sisteme. Način delovanja koji daje uočene funkcije angiopoietin/Tie receptor sistema destabilizuje interakciju endotelialna ćelija-periendotelialna ćelija postojećeg zrelog krvnog suda tumora čime čini osetljivim endotelijum na jedinjenja usmerena protiv VEGF/VEGF receptor sistema.

Na ovom neočekivanom otkriću, ovaj pronalazak obezbeđuje kombinaciju funkcionalnog uticanja na VEGF/VEGF receptor sisteme i na angiopoietin/Tie receptor sisteme radi inhibicije vaskularizacije i rasta tumora.

Farmaceutske kompozicije se sastoje od dve komponente: Jedinjenje I inhibira biološku aktivnost jednog ili više VEGF/VEGF receptor sistema ili se sastoji od citotoksičnog agensa koji je usmeren na endotelium preko prepoznavanja VEGF/VEGF receptor sistema. Jedinjenje II utiče na biološke funkcije jednog ili više angiopoietin-Tie receptor sistema ili se sastoji od citotoksičnog agensa koji je usmeren na endotelium preko prepoznavanja angiopoietin/Tie receptor sistema. Alternativno, jedinjenje I inhibira biološku aktivnost jednog ili više VEGF/VEGF receptor sistema ili angiopoietin/Tie receptor sistemi i jedinjenje II se sastoji od citotoksičnog agensa koji je usmeren na endotelium preko prepoznavanja jednog ili više VEGF/VEGF receptor sistema ili angiopoietin/Tie receptor sistema. Usmerenje ili modulacija bioloških aktivnosti VEGF/VEGF receptor sistema ili angiopoietin/Tie receptor sistema može da se izvede pomoću

(a) Jedinjenja koja inhibiraju aktivnost receptora tirozin kinaze,

(b) Jedinjenja koja inhibiraju vezivanje liganda za receptore,

(c) Jedinjenja koja inhibiraju aktivaciju intraćelijskih signalnih putanja receptora,

(d) Jedinjenja koja inhibiraju ili aktiviraju eksprimiranje liganda ili receptora VEGF

ili Tie receptor sistema,

(e) Sistemi za isporuku, kao što su antitela, ligandi, oligonukleotidi ili oligopeptidi visokog afiniteta vezivanja ili lipozoma, koji usmeravaju citotoksične agense ili agense koji indukuju koagulaciju u endotelium preko prepoznavanja VEGF/VEGF receptor sistema ili angiopoietin/Tie receptor sistema, (f) Sistemi za isporuku kao što su antitela, ligandi, oligonukleotidi ili oligopeptidi visokog afiniteta vezivanja ili lipozoma, koji se usmeravaju na endotelium i indukuju nekrozu ili apoptozu.

Jedinjenje je naznačeno time što obuhvata kompozicije iz ovog pronalaska i mogu biti supstance male molekulske mase, oligonukleotid, oligopeptid, rekombinantni protein, antitelo, ili konjugati ili fuzioni protieni istih. Primer inhibitora je mali molekul molekulske mase koji inhibira receptor tirozin kinaze vezujući se za i okupirajući katalitičko mesto tako daje biološka aktivnost receptora umanjena. Inhibitori kinaze su poznati u struci (Suge: SU5416, SU6668; Fong et al., (1999), Cancer Res. 59, 99-106; Vajkoczv et al., Proc. Am. Associ. Cancer Res. San Francisko (2000), Apstrakt ID 3612; Zeneca: ZD4190, UD6474; Wedge et al., (2000), Cancer Res. 60, 970-975; Parke-Davis PD0173073, PD0173074; Johnson et al., Proc. Am. Associ. Cancer Res., San Francisko

(2000), Apstrakt ID'3614; Dimitroff et al., (1999), Invest. New Drugs 17, 121-135). Primer antagonista je rekombinantni protein ili antitelo koje se vezuje za ligand lako da je sprečena aktivacija receptora ovim Ugandom. Drugi primer antagonista je antitelo koje se vezuje za receptor tako daje sprečena aktivacija receptora. Primer modulatora eksprimiranja je antisensna RNK ili ribozim koji kontroliše eksprimiranje liganda ili receptora. Primer usmerenog citotoksičnog agensa je fuzioni protein liganda sa bakterijskim ili biljnim toksinom kao što je Pseudomonas axotoxin A, Diphtheria toxin, ili Ricin A. Primer agensa koji indukuje koagulaciju je konjugat od antitela jednostrukog lanca i faktora tkiva. Ligand vezujući inhibitori kao što su neutralizaciona antitela koja su poznata u struci su opisana od strane Genentech (rhuMAbVEGF) i od strane Presta et al., (1997), Cancer Res. 57, 4593-4599. Ligand vezujući domeni su opisani od strane Kendall and Thomas (1993), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90, 10705-10709; od strane Goldman et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95, 8795-8800 i od strane Lin et al.,

(1997), J. Clin . Invest. 100, 2072-2078. Dalje, dominantni negativni receptori su opisani od strane Millauer et al., (1994), Nature 367, 567-579.

Receptor blokirajuća antitela su opisana od strane imclone (c-plcl 1, US 5,874,542). Dalje su poznati antagonistični ligand mutanti (Siemeister et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 95, 4625-4629). Ligandi visokog afiniteta ili receptor vezujući oligonukleotidi su opisani od strane NeXstar (NX-244) i Drolet et al., (1996), Nat. Biotech 14,1021-1025. Dalje, opisani su mali molekuli i peptidi.

Regulatori eksprimiranja su opisani kao anti-sensni i oligo nukleotidi i kao ribozimi (RPI, Angiozyme™, Videti RPI Homepage).

Primeri sistema za isporuku/usmeravanje su opisani kao ligand/antitelo/toksin-fuzioni proteini ili konjugati (Arora et al. (1999), Cancer Res. 59, 183-188 i Olson et al., (1997), Int. J. Cancer 73, 865-870), kao ciljanje endotelnih ćelija lipozomima (Spragg et al..

(1997), Prog. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 94, 8795-8800) i kao ciljanje endotelnih ćelija plus indukcija koagulacije (Ran et al., (1998), Cancer Res. 58,4646-4653).

OPIS PRONALASKA

Mali molekuli koji inhibiraju receptor tirozin kinaza aktivnost su na primer molekuli opšte formule I

u kojoj

r ima značenje od 0 do 2,

n ima značenje od 0 do 2;

R3i R4a) svaki nezavisno od drugog imaju značenje za niži alkii,

b) zajedno obrazuju most opšte parcijalne formule II,

gde je vezivanje preko dva terminalna C-atoma, i

m ima značenje od 0 do 4; ili

c) zajedno obrazuju most parcijalne formule 111

u kojoj jedan ili dva od članova prstena T|, T2, T3, T4označava azot, a svaki

drugi ima značenje za CH, i vezivanje je preko atoma T| i T4;

G ima značenje za CrC6-alkil, C2-Cfi-alkilen ili C2-C6-alkenilen; ili C2-Cfi-alkilen ili CrC6-alkenilen, koji su supstituisani sa aciloksi ili hidroksi; -

CH2-0-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-0-CH2-, -CH2-S-CH2-, -CH2-NH-CH2-, oksa (-O-), tia (-S-) ili imino (-NH-),

A,B,D,E i T nezavisno od svako drugog imaju značenje za N ili CH, pod uslovom što ne

više od tri od ovih supstituenata imaju značenje N,

Q označava niži alkil, niži alkiloksi, ili halogen,

Rii R2nezavisno od svakog drugog označavaju H ili niži alkil,

X ima značenje za iinino, oksa, ili tia;

Y ima značenje za vodonik, nesupstituisan ili supstituisan aril, heteroaril, ili

nesupstituisan ili supstituisan cikloalkil; i

Z ima značenje za aroino, mono- ili disupstituisani amino, halogen, alkil,

supstituisani alkil, hidroksi, eterifikovanu ili esterifikovanu hidroksi grupu, nitro, cijano, karboksi, esterifikovanu karboksi grupu, alkanoil, karbamoil, N-mono- ili N,N-đisupstituisani karbamoil. amidino, gvanadino, merkapto, sulfo, feniltio, fenil-niži-alkil-tio. alkil-fenil-tio, fenil-sulflnil, fenil-niži-alkil-sulfinil, alkil-fenilsulfinil, fenilsulfonil, fenil-niži-alkansulfonil, ili alkilfenilsulfonil, dok, ako više od jednog ostatka Z je prisutno (m<>>2), supstituenti Z su istovetni ili različiti jedan od drugoga, i gde označene veze sa sterilicom su proste ili dvogube veze; ili N-oksid gornjeg jedinjenja, gde jedan ili više N-atoma nose atomm kiseonika, ili so istog.

So koja ima prednost je sa sa organskom kiselinom, posebno je sukcinat.

Ova jedinjenja imaju prednost i mogu biti upotrebljena kao jedinjenje I ili II inventivnim farmaceutskim kompozicijama.

Jedinjenja koja stopiraju Tirozin fosforilovanje, ili upornu angiogenezu, respektivno, koja rezultira kod sprečavanja rasta tumora i širenja tumora, na primer su Derivati antranilne kiseline opšte formule IV

u kojoj

A označava grupu =NR<2>,

W označava kiseonik, sumpor, dva atoma vodonika ili grupu =NR ,

Z označava grupu =NR<HI>ili =N-, -N(R<10>)-(CH2)q-, račvastog ili normalnog niza C].6-alkil grupu ili je grupa

Ili A. Z i R<1>zajedno obrazuju grupu

m, n i o ima značenje od 0-3,

q ima značenje od 1-6,

Ra,R.b, R?,

Rd, Re,Rfnezavisno jedan od drugoga imaju značenje za vodonik, C |.4 alkil ili grupu =NR<10>, i/ili Rai/ili Rbzajedno sa Rci ili R^ili R^. zajedno sa R<. i/ili Rrobrazuju vezu. ili do dve od grupa R;i-Rrobrazuju most pri čemu svaka ima do 3C-atoma sa R<1>ili R<2>,

X označava gruppu =NR<9>ili =N-,

Y označava grupu -(CH2)p,

p označava ceo broj 1 -4,

R<1>označava nesupstituisan ili opciono supstituisan sa jednim ili više halogena,

C|-6-alkil, ili C|.6-alkil ili C|.6-alkoksi, koji je opciono supstituisan sa jednim ili više halogena, ili je nesupstituisan ili supstituisan aril ili heteroaril,

R<2>označava vodonik ili C]-C6 -alkil, ili obrazuje most sa do 3 atoma u prstenu

sa Ra-Rf zajedno sa Z ili R1?

R<3>označava monociklični ili biciklični aril ili heteroaril koji je nesupstituisan ili opciono supstituisan sa jednim ili više halogena, Ci.6-alkil, Ci.6-alkoksi ili hidroksi,

R<4>,R<5>,R<6>

i R<7>nezavisno jedan od drugoga označavaju vodonik, halogen ili Cu>-alkoksi,

C|.6-alkil, ili C,.6-karboksialkil, koji su nesupstituisani ili opciono supstituisani sa jednim ili više halogena, ili R<5>i R6 zajedno obrazuju grupu

R<8>,R<9>i R<10>nezavisno jedan od drugoga označavaju vodonik ili C,.<,-alkil,

kao i njihovi izomeri i soli.

Ova jedinjenja koja imaju prednost takođe se mogu upotrebiti kao jedinjenje I ili II u inventivnoj farmaceutskoj kompoziciji.

Jedinjenja koja imaju naročitu prednost su jedinjenja opšte formule V

gde R<1>označava grupu gde R^ je hloro, bromo ili grupa -OCH3, gde R7je-CH3ili hloro.

gde R<8>je -CH3, fluoro gde R<4>je fluoro, gde R<6>je hloro ili -CF3hloro, bromo, -CF3-CH3ili hloro

-N=C, -CH3, -OCF3ili

-CH2OH

R<2>označava piridil ili grupu

R<J>označava vodonik ili fluoro, kao i njihovi izomeri i soli koji se mogu upotrebiti kao jedinjenje I ili II u inventivnoj farmaceutskoj kompoziciji.

Ova jedinjenja imaju iste osobine kao već pomenuta gore za jedinjenje IV i mogu se upotrebiti za tretiranje angiogenoznih bolesti. Kompozicije sadrže jedinjenja formula I, IV i V, sama ili u kombinaciji.

Gore pomenuta jedinjenja su takođe zaštićene materije unutar inventivnih kombinacija.

Dalji primer za ligand vezujuće inhibitore su peptidi ii DNK sekvence kodirajuće za takeve peptide, koji su upotrebljeni za tretiranje angiogenoznih bolesti. Takvi peptidi i

DNK sekvence su iznete u Seq. ID No. 1 do 59 u protokolu za sekvence. Pokazano je u Seq. ID No. 34 i 34a da su od osnovnog interesa.

Zaštićene materije prema ovom pronalasku su prema tome farmaceutske kompozicije koje

a) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje I koje modulira biološku funkciju za jedan ili više VEGF/VEGF receptor sistema, i sadržavajući jedan ili više agenasa kao

jedinjenje II koje modulira biološku funkciju za jedan ili više angiopoietin/Tie receptor sistem,

b) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje I koji su usmereni na endotelium preko jednog ili više VEGF/VEGF receptor sistema, i sadrže jedan ili više agenasa kao

c) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje I koje modulira biološku funkciju jednog ili nekoliko VEGF/VEGF receptor sistema ili jednog ili nekoliko angiopoietin/Tie

receptor sistema i sadrži jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje II koji su usmereni na endotelium,

d) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje 1 koje modulira biološku funkciju za jedan ili nekoliko VEGF/VEGF receptor sistem, i sadrži jedan ili nekoliko agenasa kao

jedinjenje II koji su usmereni na endotelium preko jednog ili nekoliko angiopoietin/Tie receptor sistema,

c) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje i koji su usmereni na endotelium preko jednog ili nekoliko VEGF/VEGF receptor sistema, i sadrže jedan ili nekoliko

agenasa kao jedinjenje II koji su usmereni na endotelium preko jednog ili nekoliko angiopoietin/Tie receptor sistemai,

f) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje I koji moduliraju biološku funkciju jednog ili nekoliko VEGF/VEGF receptor sistema, i sadrže jedan ili nekoliko

agenasa kao jedinjenje II koji su usmereni na endotelium preko jednog ili nekoliko VEGF/VEGF receptor sistema,

g) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa kao jedinjenje I koji moduliraju biološku

• funkciju jednog ili nekoliko angiopoietin/Tie Receptor sistema, i sadrže jedan ili nekoliko

agenasa kao jedinjenje II koji su usmereni na endotelium preko jednog ili nekoliko angiopoietin/Tie receptor sistema, i h) Sadrže jedan ili nekoliko agenasa koji utiču i na funkciju jednog ili nekoliko VEGF/VEGF receptor sistema i na funkciju jednog ili nekoliko angiopoietin/Tie receptor

sistema.

Za sekvencijalnu terapeutsku aplikaciju inventivne farmaceutske kompozicije mogu biti aplicirane simultano ili separatno.

Inventivne kompozicije sadrže kao jedinjenje I ili kao jedinjenje II najmanje jedno od jedinjenja

a) Jedinjenja koja inhibiraju aktivnost receptor tirozin kinaze,

b) Jedinjenja koja inhibiraju vezivanje liganda za receptore,

c) Jedinjenje koja inhibiraju aktivaciju intraćelijskih signalnih putanja receptora,

d) Jedinjenje koja inhibiraju ili aktiviraju isražavanje liganda ili receptora VEGF ili

Tie receptor sistema,

c) Sistemi za isporuku, kao što su antitela, ligandi, oligonukleotidi ili oligopeptidi visokog afiniteta vezivanja ili lipozomi. koji usmeravaju citotoksične agense ili agense koji indukuju koagulaciju u endoteliumu preko prepoznavanja VEGF/VEGF receptor sistema ili angiopoietin/Tie receptor sistema,

f) Sistemi za isporuku, kao što su antitela, ligandi, oligonukleotidi ili oligopeptidi visokog afiniteta vezivanja ili lipozomi, koji se usmeravaju na endotelium i

indukuju nekrozu ili apoptozu.

Ove kompozicije su takođe predmet za koji se traži zaštita iz ovog pronalaska.

Takođe su predmet za koji se traži zaštita farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska koje sadrže kao jedinjenje 1 i/ili II najmanje jednu od Seq. ID Nos. 1-59. Od najveće vrednosti su farmaceutske kompozicije koje sadrže kao jedinjenje I i/ili II Seq. ID No. 34a i farmaceutske kompozicije prema zahtevima koje sadrže kao jedinjenje I i/ili II najmanje jedan od sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili L19 scFv-tTF konjugat.

Dalji pretpostavljeni predmet ovog pronalaska su farmaceutske kompozicije koje sadrže kao jedinjenje I i/ili II najmanje jedan mali molekul generalne formule I, generalne formule IV i/ili generalne formule V.

Najpogodnije jedinjenje koje se može upotrebiti kao jedinjenje I ili II u inventivnoj kompoziciji je (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetiI)-ftaIazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat.

Prema tome, prema ovom pronalasku su takođe farmaceulkse kompozicije, koje kao jedinjenje I sadrže (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili L19 scFv-tTF konjugat, a kao jedinjenje II (4-hIorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili L19 scFv-tTF konjugat, pod uslovom da jedinjenje I nije identično sa jedinjenjem II, i najpogodnije farmaceutske kompozicije koje sadrže kao jedinjenje I (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat i kao jedinjenje II sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili L19 scFv-tTF konjugat; farmaceutske kompozicije koje sadrže kao jedinjenje I mAB 4301-42-35 i kao jedinjenje II sTie2 i/ili scFv-tTF konjugat; farmaceutske kompozicije koje sadrže kao jedinjenje I scFv-tTF konjugat i kao jedinjenje II sTie2 i/ili mAB 4301-42-35; farmaceutske kompozicije koje sadrže kao jedinjenje I L19 scFv-tTF konjugat i kao jedinjenje II sTie2.

Mali molekuli kao jedinjenje, proteini i DNK eskprimirajući proteini, kao što je gore pomenuto se mogu upotrebiti kao lek, sami, ili u obliku formulacija za tretiranje tumora, kancera, psorijaze, artritisa, kao što je reumatoidni artritis, hemangioma, angiofibroma, bolesti očiju, kao što je dijabetska retinopatija, neovaskularni glaukom, bolesti bubrega, kao što je glomerulonefritis, dijabetska nefropatija, maligna nefroskleroza, trombični mikroangiopatični sindrom, transplantacionih odbacivanja i glomerulopatije, fibrotičnih bolesti, kao što je ciroza jetre, bolesti proliferacije mesangijalnih ćelija, aretrioskleroze i oštećenja nervnih tkiva.

Tretiranje oštećenih nervnih tkiva sa inventivnom kombinacijom ometa brzo obrazovanje ožiljaka na oštećenom položaju. Tako. ne postoji obrazovanje ožiljaka pre prenošenja aksona na svaki drugi. Prema tome rekonstrukcija nervnih vezivanja je u velikoj meri olakšana.

Dalje, inventivne kombinacije mogu biti upotrebljene za ugušenje obrazovanja ascita kod pacijenata. Isto je takođe moguće za ugušivanje VEGF edema. Za upotrebu inventivnih kombinacija kao leka jedinjenja će biti formulisana kao farmaceutska kompozicija. Takve formulacije sadrže pored aktivnog jedinjenja ili više jedinjenja prihvatljive farmaceutske, organske ili neorganske inertne nosače, kao stoje voda, želatin, gumarabika, laktoza, škrob, magnezijum stearat, talk, biljna ulja, polialkilen glikoli itd. Pomenuti farmaceutski preparati mogu se primeniti u čvrstom obliku, kao što su tablete, pilule, supozitorije, kapsule, ili se mogu upotrebiti u fluidnom obliku, kao što su rastvori, suspenzije ili emulzije.

Po potrebi, kompozicije dodatno mogu sadržavati aditive, kao što su zaštitna sredstva, stabilizatori, deterdženti ili emulgatori, soli za alternaciju osmotskog pritiska i/ili pufere.

Ove upotrebe su takođe zaštićene prema ovom pronalasku, isto kao i formulacije koje sadrže aktivna jedinjenja.

Za parenteralno davanje posebno su pogodni rastvori za injekcije kao i suspenzije, posebno vodeni rastvori aktivnog jedinjenja u polihidroksietoksilovanom ricinusovom ulju.

Kao nosač takođe s emogu upotrebiti aditivi, kao što su soli galijumove kiseline ili životinjski ili biljni fosfolipidi, kao i njihove smese, i lipozomi ili ingredijenti istih.

Za oralno davanje posebno pogodne su tablete, pilule ili kapsule sa talkom i/ili ugljovodonični nosači ili veziva, kao što je laktoza, kukuruzni ili krompirov škrob.

Za oralnu primenu takođe se mogu primeniti tečnosti, kao što jc na primer sok koji opciono može da sadrži zasladivač.

Doze aktivnog jedinjenja se razlikuju zavisno od primenc jedinjenja, starosti i teiesne težine pacijenta, kao i od vrste i progresa bolesti.

Dnevna doza aktivnog jedinjenja je 0,5-1000 mg, posebno 50-200 mg. Doze se mogu upotrebiti kao jedinična doza ili kao dve ili više dnevnih doza.

Ove formulacije i oblici formulacija su takode deo ovog pronalaska.

Povezani funkcionalni uticaj sa VEGF/VEGF receptor sistemima i sa anliopoietin/Tie receptor sistemima se može izvršiti istovremeno, ili sekvencijalno tako da se biološki odgovor na uticaj na jedan ligand/receptor sistem preklapa sa biološkim odgovorom na uticaj na drugi ligand/receptor sistem. Alternativno, povezani funkcionalni uticaj na VEGF/VEGF receptor sisteme ili na antiopoietin/Tie receptor sisteme i usmeravanja citotoksičnih agenasa preko VEGF/VEGF receptor sistema ili preko angiopoietin/Tie receptor sistema se može vršiti istovremeno, ili na sekvencijalni način tako da se biološki odgovor na funkcionalni uticaj sa ligand/receptor sistemom preklapa pravovremeno sa usmeravanjem citotoksičnih agenasa.

Pronalazak se takođe odnosi na supstancu koja funkcionalno utiče i na VEGF/VEGF receptor sisteme i na angiopoietin/Tie receptor sisteme, ili koji su usmereni preko oba VEGF/VEGF receptor sistema ili angiopoietin/Tie receptor sistema.

VEGF/VEGF receptor sistemi uključuju ligande VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, i receptor tirozin kinaze VEGF-Rl (Fltl), VEGF-R2 (KDR/Flkl), VEGF-R3 (Flt4), i njihove ko-receptore (odnosno neuropilin-1). Agniopoietin/Tie receptor sistemi uključuju Angl, Ang2, Ang3/Ang4, i angiopoietin slične polipeptide koji se vezuju za Tiel ili za Tie2, i receptor tirozin kinaze Tiel i Tie2.

Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku se mogu upotrebiti za medicinske svrhe. Takve bolesti su, na primer, kancer, metastaze kancera, angiogeneze uključujući relinopatiju i psorijazu. Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku se mogu upotrebiti oralno, parenteralno, ili preko gen terapeutskih metoda.

Prema tome ovaj pronalazak takođe se odnosi na upotrebu farmaceutskih kompozicija za proizvodnju lekova za tretiranje tumora, raka, psorijaze, artritisa, kao što je reumatoidni artritis, hemangioma, angiofibroma, bolesti očiju, kao što je dijabetska retionopatija, neovaskularni glaukom, bolesti bubrega, kao što je glomerulonefritis, dijabetska nefropatija, maligna nefroskleroza, trombični mikroangiopatični sindrom, transplantaciona odbacivanja i glomerulopatija, fibrotičnih bolesti, kao što je ciroza jetre, bolesti proliferacije mesangijalnih ćelija, arelrioskleroze, oštećenja nervnih tkiva, potiskivanje obrazovanja ascita kod pacijenata i potiskivanje VEGF edema.

Primeri koji slede pokazuju mogućnost izvođenja pronalaska u pitanju, bez ograničenja samog pronalaska u iznetim primerima.

Primer 1

Superioran efekat na inhibiciju rasta tumora preko kombinacije inhibicije VEGF A/VEGF receptor sistema zajedno sa funkcionalnim uticajem na angiopoietin/Tie2 receptor sistem u odnosu na separatne načine intervenisanja je prikazan na A375v humanom melanom ksenograft modelu.

Humana melanom ćelijska linija A375v je stabilno transfektovana za prekomerno eksprimiranje ekstraclular-ligand-neutralizirajući domen humanog Tie2 receptor tirozin kinaze (sTie2; jedinjenje II)(Siemeister et al., Cancer Res. 59, 3185-3191, 1999). Za kontrolu, A375v ćelije su stabilno transfektovane na bez sadržaja vektor eksprimiranja (A375v/pCEP). Švajcarski ni/nu miševi su s.c. injektovani sa lxlOh transfektovanih A375v/sTie2 odnosno A375v/pCEP tumornih ćelija. Životinje koje su primile jedinjenje I su tretirane do 38 dana.sa dnevnim oralnim dozama od 50 mg/kg VEGF receptr tirozin kinaza inhibitora (4-hlorofeni))[4-(4-piridilmetiI)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat (Wood et al., Cancer Res. 60,2178-2189, 2000). Različiti načini tretiranja su opisani u Tabeli 1. Rast tumora je određen pomoću kaliper merenja najvećeg prečnika i njegove upravnosti.

Tumori poreklom iz A375c/pCEP kontrolnih ćelija dosežu površinu od oko 250 mm<2>(srednja površina) u toku 24 dana (slika 1) bez tretiranja (grupa 1). Izdvojeno tretiranje sa VEGF receptor inhibitorom (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinatom (jedinjenje I, grupa za tretiranje 2) ili izdvojen uticaj na angiopoietin/Tie2 receptor sistem pomoću eksprimiranja sTie2 (jedinjenje II, grupa za tretiranje 3) usporava rast tumora do površine od oko 250 mm<2>za 31 dan, respektivno. Kombinacija uticaja na angiopoietin/Tie2 sistem eksprimiranjem sTie2 i za uticaj na VEGF/VEGF receptor sistem pomoću inhibitora kinaze (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetiI)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinala (jedinjenje I + jedinjenje II, grupa za tretiranje 4) usporava rast tumora na površinu od oko 250 mm<2>za 38 dana.

Ovaj rezultat jasno pokazuje superiorni efekat kombinacije uticaja na VEGF-A/VEGF receptor sistem i angiopoictin/Tie2 receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije.

Primer 2

Kombinacija funkcionalnog uticaja na angiopoietin/Tie2 receptor sistem i neutralizacija VEGF-A je superiorana u odnosu na izdvojene načine intervencije u inhibiranju rasta tumora.

Tumori poreklom iz A375c/sTie2 ćelija i A375v/pCEp su indukovani kod nagih miševa kao stoje opisano u primeru 1. Životinje koje su primile jedinjenje I tretirane su dva puta u nedclju dana sa intrperitoenalnim dozama od 200u,g VEGF-A-neutralizovanog monoklonalnog antitela (mAb) 4301-42-35 (Schlaeppi et al., Cancer Res. Clin. Oncol. 125, 336-342, 1999). Različiti načini tretiranja su opisani u Tabeli 2. Životinje su žrtvovane iz etičkih razloga kada tumori iz grupe 1 prevazi laze zapreminu od oko 1000 mm<7>. Rast tumora je određen pomoću kaliper meranja najvećeg prečnika i njegove upravnosti.

Tumori poreklom iz A375v/pCEP kontrolnih ćelija dosežu zapreminu od otprilike 1000 mm<3>u toku 28 dana (slika 2) bez grupe za tretiranje 1. Tumori tretiranji sa VEGF-A-neutralizovanim mAb 4301-42-35 (jedinjenje I, grupa za tretiranje 2) porasli su do zapremine od oko 450 mm<3>u toku 28 dana. Uticaj na angiopoietin/Tie2 receptor sistem pomoću eksprimiranja sa sTie2 (jedinjenje II, grupa za tretiranje 3) redukuje rast tumora . u toku 28 dana do zapremine od oko 600 mm<3>, respektivno. Kombinacija uticaja na angiopoietin/Tie2 sistem pomoću eksprimiranja sa sTic2 i neutralizovanje VEGF-A pomoću mAb 4301-42-35 (jedinjenje I + jedinjenje II, grupa za tretiranje 4) dovodi do inhibicije rasta tumora do zapremine od oko 250 mm<3>u toku 28 dana.

Superiorane efekat kombinacije neutralizacije VEGF-A i funkcionalnog uticaja na angiopoictin/Tie2 receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije je jasno prikazan.

Primer 3

Kombinacija funkcionalnog uticaja na angiopoietin/Tie2 receptor sistem i usmeravanje koagulaciono-indukujećeg proteina preko VEGF/VEGF receptor sistema je superiorna u odnosu na izdvojene načine intervencije u inhibiciji rasta tumora.

Tumori poreklom iz A375v/sTie2 ćelija i iz A375v/pCEP ćelija indukovani su kod nagih miševa kao što je opisano u primeru 1. Antitelo sa jednostrukim lancem (scFv) specifično prepoznavajućeg VEGF-A/VEGF receptor I kompleksa (WO 99/19361) je eksprimirano u E. Coli i konjugovano sa koagulaciono-indukujućim rekombinantnim humanim kratkog niza tkivnim faktorom (tTF) pomoću metoda koji su opisani od strane Ran et al. (Cancer Res. 58, 4646-4653, 1998). Kada tumori dosegnu zapreminu od oko 200 mm3 životinje koje su primile jedinjenje I tretirane su dana 0 i dana 4 sa intravenoznim dozama od 20 ug scFv-tTF konjugata. Različliti načini tretiranja su kao što je opisano u Tabeli 3. Životinje su žrtvovane iz etičkih razloga kada tumori iz grupe 1 prevazilaze zapreminu od oko 1000 mm"<1>. Rast tumora je određen pomoću kaliper merenja najvećeg prečnika i njegove upravnosti.

Tumori poreklom iz A375v/pCEP kontrolnih ćelija dosežu do zapremine od oko 1000 nim3 u toku 28 dana (slika 3) bez tretiranja (grupa 1). Tumori tretirani sa koagulaciono indukujućim tTF usmerenim na VEGF-A/VEGF recptor I kompleks preko scFv-tTF konjugata (jedinjenje I, grupa za tretiranje 2) porastu do zapremine od oko 500 mm<3>za 28 dana. Uticaj na ajngiopoietin/Tie2 receptor sistem pomoću eksprimiranja sa sTie2 (jedinjenje II, grupa za tretiranje 3) redukuje rast tumora u toku 28 dana do zapremine od oko 600 mm\ respektivno. Kombinacija uticaja na angiopoietin/Tie2 sistem pomoću eksprimiranja sa sTie2 i usmeravanje na VEGF receptor kompleks (jedinjenje I + jedinjenje II, grupa za tretiranje 4) rezultuje u inhibiciji rasta tumora do zapremine od oko 300 m<3>za 28 dana.

Superiorni efekat kombinacije usmeravanja koagulaciono-indukujećeg tTFna VEGF-A/VEGF receptor I kompleks i funkcionalni uticaj na angiopoielin/Tie2 receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije je jasno prikazan. Slični efekti se mogu očekivati posle usmeravanje citotoksičnih agenasa na VEGF/VEGF receptor sisteme.

Primer 4

Kombinacija uticaja na VEGF/VEGF receptor sistem i usmeravanja koagulaciono-indukujućag proteina preko VEGF/VEGF receptor sistema je superiorna u odnosu na izdvojene načine intervencije u inhibiciji rasta tumora.

Tumori poreklom iz A375v/pCEP ćelija su indikovani u nagim miševima kao što je opisano u primeru 1. Životinje koje su primile jedinjenje I su tretirane u toku 28 dana sa dnevnim dozama od 50 mg/kg VEGF receptor tirozin kinaze inhibitorom (4-hlorofeniI)[4-(4-piridilmetil)-ftaiazin-l-ij]amonijum hidrogen sukcinatom (VVood et al., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000). Jedinjenje 11 sastoji se od antitela prostog niza (scFv) specifično prepoznavajući humani VEGF-A/VEGF receptor I kompleks (WO 99/19361) koji je eksprimiran u E. Coli i konjugovan sa koagulaciono-indukujućim rekombinaninim humanim kratkim tkivnim faktorom (tTF) pomoću metoda koji su opisani od strane Ran ci al., (Cancer Res. 58, 4646-4653,1998). Kada tumori dosegnu zapreminu od oko 200 mm'1 životinje koje su primile jedinjenje II tretirane su dana 0 i dana 4 sa intravenoznim dozama od 20 |ig scFv-tTF konjugata. Različliti načini tretiranja su kao što je opisano u Tabeli 4. Životinje su žrtvovane iz etičkih razloga kada tumori iz grupe 1 prevazilaze zapreminu od oko 1000 mm<3>. Rast tumora je određen pomoću kaliper merenja najvećeg prečnika i njegove upravnosli.

Tumori poreklom iz A375v/pCEP kontrolnih ćelija dosežu zapreminu od oko 1000 mm3 u toku 28 dana (slika 4) bez tretmana (grupa 1). Izdvojeno tretiranje sa VEGF receptor inhibitorom (4-hIorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinatom (jedinjenje I, grupa za tretiranje 2) rezultuje u redukciji zapremine tumora od oko 550 mm<3>. Tumori tretirani sa koagulaciono-indukujućim tTF usmerenim na VEGF-A/VEGF receptor I kompleks preko scFv-tTF konjugata (jedinjenje II, grupa za tretiranje 3) dostiže zapreminu od oko 500 mm<3>u toku 28 dana. Kombinacija inhibicije VEGF receptor tirozin kinaze pomoću (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinata i usmeravanja na VEGF receptor kompleks (jedinjenje I + jedinjenje II, grupa za tretiranje 4) rezultuje u inhibiciji rasta tumora do zapremine od oko 400 mm<3>u toku 28 dana.

Superiorni efekat kombinacije usmeravanja koagulaciono-indukujećeg tTF na VEGF-A/VEGF receptor I kompleks i funkcionalnog uticaja na VEGF/VEGF receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije je jasno prikazan. Slični efekti mogu se očekivati posle usmeravanja citotoksičnih agenasa na angiopoietin/Tie receptor sisteme.

Primer 5

Kombinacija funkcionalnog uticaja na angiopoietin/Tie2 receptor sistem i endotelijum-specifičnog usmeravanja koagulaciono-indukujućeg proteina je superiorna u odnosu na izdvojene načine intervencije u inhibiciji rasta tumora.

Tumori poreklom iz A375v/sTie2 ćelija i A375v/pCEP ćelija su indikovani u nagim miševima kao što je opisano u primeru 1. Fuzioni protein (L19 scFv-tTF) koji se sastoji od 1.19 jednostrukog niza antitela specifično prepoznavajući onkofetalni ED-B domen fibronektina i ekstracelularni domen tkivnog faktora eskprimiran je u u E. Coli kao što je opisano ođ sirane Nilsson el al., (Nal. Med., u štampi). Dalje, L19 scFv-tTF podaci su predstavljeni od strane D.Neri i F.Nilsson-a (Meeting "Advances in the applicalion of iuonoclonal antibodies in ciinical oncologv", Samos, Greece, 31. May 2. June 2000). Kada tumori dosegnu zapreminu od oko 200 mm<3>životinje koje su primile jedinjenje I tretirane su sa pojedinačnom dozom od 20 ug LI9 scFv-tTF u 200 u.L slanog rastvora. Različliti načini tretiranja su opisani u Tabeli 5. Životinje su žrtvovane iz etičkih razloga kada tumori iz grupe 1 prevazilaze zapreminu od oko 1000 mm<3.>Rast tumora je određen pomoću kaliper merenja najvećeg prečnika i njegove upravnosli.

Tumori poreklom iz A375v/pCEP ćelija su dostigli veličinu od oko 1000 mm<3>u toku 28 dana (slika 5) bez tretmana (grupa 1). Tumori tretirani sa koagulaciono LI 9 scFv-tTF (jedinjenje I, grupa za tretiranje 2) dostižu zapreminu od oko 450 mm<3>u toku 28 dana. Uticaj na angiopoietin/Tie2 receptor sistem pomoću eksprimiranja sTie2 (jedinjenje II, grupa za tretiranje 3) smanjuje rast tumora u toku 28 dana do zapremine od oko 600 mm<3>, respektivno. Kombinacija uticaja na angiopoietin/Tie2 sistema eksprimiranjem pomoću sTie2 i usmeravanja endotelijuma sa L19 scFv-tTF (jedinjenje I + jedinjenje II, grupa za tretiranje 4) reazultuje u inhibiciji rasta tumora do zapremine od oko 250 mm<3>u toku 28 dana.

Superiorni efekat kombinacije usmeravanja LI 9 scFv-tTF na endotelijum i funkcionalni uticaj na angiopoietin/Tie2 receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije je jasno prikazan.

Primer 6

Kombinacija funkcionalnog uticaja na VEGF/VEGF receptor sistem i endotelijum-specifičnog usmeravanja koagulaciono-indukujućeg proteina je superiorna u odnosu na izdvojene načine intervencije u inhibiciji rasta tumora.

Tumori poreklom iz A375v/pCEP ćelija indukvani su u nagim miševima kao što je opisano u primeru 1. Životinje koje su primile jedinjenje I tretirane su u toku 28 dana sa dnevnim oralnim dozama od 50 mg/kg VEGF receptor tirozin kinaze inhibitorom (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinatom (Wood et al., Cancer Res. 60, 2178-2189, 2000). Jedinjenje II se sastoji od L19 scFv-tTF fuzionog proteina kao što je opisano u primeru 5. Kada tumori dostignu zapreminu od oko 200 mm<3>životinje koje su primile jedinjenje II tretirane su sa pojedinačnom intravenoznom dozom od 20 \ ig L19 scFv-tTF u 200 uL slanog rastvora. Različiti načini tretiranja su opisani u Tabeli 6. Životinje su žrtvovane iz etičkih razloga kada tumori iz grupe 1 prevazilaze zapreminu od oko 1000 mm*'. Rast tumora je određen pomoću kaliper merenja najvećeg prečnika i njegove upravnosti.

Tumori poreklom iz A375v/pCEP kontrolnih ćelija dosežu zapreminu od oko 1000 mm<3>u toku 28 dana (slika 6) bez tretmana (grupa 1). Izdvojeno tretiranje sa VEGF receptor inhibilorom (4-hlorofeniI)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il|amonijum hidrogen sukcinatom (jedinjenje I, grupa za tretiranje 2) razultuje u redukciji zapremine tumora do oko 550 mm<1>. Tumori tretirtani sa koagulaciono-indukujućim L19 scFv-tTF usmereni na endotelijum (jedinjenje II, grupa za tretiranje 3) dosežu zapreminu od oko 450 mm<3>u toku 28 dana. Kombinacija inhibicije VEGF receptor kinaze pomoću (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinala i usmeravanja VEGF recdeptor kompleksa (jedinjenje I + jedinjenje II, grupa za tretiranje 4) rezultuje u inhibiciji rasta tumora do zapremine od oko 200 mm u toku 28 dana.

Superioran efekat kombinacije usmeravanja L19 scFv-tTF na endotelium i funkcionalnog uticaja na VEGF/VEGF receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije je jasno prikazan.

Opis slika

Slika 1 pokazuje superioran efekat kombinacije uticaja na VEGF/VEGF receptor sistem pomoću specifičnog tirozin kinaze inhibitora i na angiopoietin/Tie2 receptor sistem pomoću rastvornog receptorskog domena na inhibiciju rasta tumora (načini tretiranja grupa 1-4 dati su u Tabeli 1).

Skraćenice imaju sledeća značenja:

mock, con = grupa za tretiranje 1

mock+VEGF-A = grupa za tretiranje 2

sTIE2-cll3 = grupa za tretiranje 3

sTlE2-cl 13+VEGF-A = grupa za tretiranje 4

Slika2 pokazuje superioran efekat inhibicije rasta tumora kombinacije VEGF-neutralizacija i funkcionalni uticaj na angiopoietin/Tie2 receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije (načini tretiranja grupa 1-4 dati su u Tabeli 2).

Slika 3 pokazuje superioran efekat inhibicije rasta tumora kombinacije usmeravanja koagulaciono-indukujućeg tTF na VEGF/VEGF receptor I kompleks preko scFv-tTF konjugata i funkcionalnog uticaja na angiopoietin/Tie2 receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije (načini tretiranja grupa 1-4-dati su u Tabeli 3).

Slika 4 pokazuje superioran efekat inhibicije rasta tumora kombinacije usmeravanja koagulaciono-indukujućeg tTF na VEGF/VEGF receptor I kompleks preko scFv-tTF konjugata i funkcionalnog uticaja na VEGF/VEGF receptor sistem pomoću VEGF receptor tirozin kinaze inhibitora (4-hIorofeniI)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-I-il]amonijum hidrogen sukcinata u odnosu na izdvojene način intervencije (načini tretiranja grupa 1-4 dati su u Tabeli 4).

Slika 5 pokazuje superioran efekat inhibicije rasta tumora kombinacije usmeravanja koagulaciono-indukujućeg LI9 scFv-tTF fuzionog proteina na endotelium i funkcionalnog uticaja na angiopoietin/Tie2 receptor sistem u odnosu na izdvojene načine intervencije (načini tretiranja grupa 1-4 dati su u Tabeli 5).

Slika 6 pokazuje superioran efekat inhibicije rasta tumora kombinacije usmeravanja koagulaciono-indukujućeg LI 9 scFv-tTF fuzionog proteina na endotelium i funkcionalnog uticaja na VEGF/VEGF receptor sistem pomoću receptor tirozin kinaze inhibitora (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftaIazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinata u odnosu na izdvojene intervencije (načini tretiranja grupa 1-4 dati su u Tabeli 6).

Claims

1. Farmaceutske kompozicije koje sadrže kombinaciju jedinjenja I i jedinjenja II, naznačeno time, što jedinjenje I i jedinjenje II sadrže bar jedno od (i) jedinjenja generalne formule I u kojoj r ima značenje od 0 do 2, n ima značenje od 0 do 2;

R.3i R4a) svaki nezavisno od drugog imaju značenje za niži alkil, b) zajedno obrazuju most opšte parcijalne formule II, gde je vezivanje preko dva terminalna C-atoma, i m ima značenje od 0 do 4; ili c) zajedno obrazuju most parcijalne formule III u kojoj jedan ili dva od članova prstena Ti, T2, T3, T4označava azot, a svaki drugi ima značenje za CH, i vezivanje je preko atoma T i T4; G ima značenje za CrC(,-alkil, C2-CValkilen ili C2-C6-alkenilen; ili C2-C6- alkilen ili C3-C6-aIkenilen, koji su supstituisani saaciloksi ili hidroksi; - CH2-0-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-0-CH2-, -CH2-S-CH2-, -CH2-NH-CH2-, oksa (-0-). tia (-S-) ili imino (-NH-), A,B,D,E i T nezavisno od svako drugog imaju značenje za N ili CH, pod uslovom što ne više od tri od ovih supstituenata imaju značenje N, Q označava niži alkil, niži alkiloksi, ili halogen, Rii R2nezavisno od svakog drugog označavaju H ili niži alkil, X ima značenje za imino, oksa, ili tia; Y ima značenje za vodonik. nesupstituisan ili supstituisan aril, heteroaril, ili nesupstituisan ili supstituisan cikloalk.il; i Z ima značenje za amino, mono- ili disupstituisani amino, halogen, alkil, supstituisani alkil, hidroksi, eterifikovanu ili esterifikovanu hidroksi grupu, nitro, cijano, karboksi, esterifikovanu karboksi grupu, alkanoil, karbamoil, N-mono- ili N,N-disupstituisani karbamoil, amidino, gvanadino, merkapto, sulfo, feniltio, fenil-niži-alkil-tio, alkil-fenil-tio, fenil-sulfmil, fenil-niži-alkil-sulfinil, alkil-fenilsulfinil, fenilsulfonil, fenil-niži-alkansulfonil, ili alkilfenilsulfonil, dok, ako više od jednog ostatka Z je prisutno (m<>>2), supstituenti Z su istovetni ili različiti jedan od drugoga, i gde označene veze sa sterilicom su proste ili dvogube veze; ili N-oksid gornjeg jedinjenja, gde jedan ili više N-atoma nose atomm kiseonika, ili so istog. i/ili (ii) jedinjenje generalne formule IV u kojoj A označava grupu -NR<2>, VV označava kiseonik, sumpor, dva atoma vodonika ili grupu -NR<8>, Z označava grupu =NR<10>ili =N-, -N(R<10>)-(CH2)q-, račvastog ili normalnog niza C|.6-alkil grupu ili je grupa Ili A, Z i R1 zajedno obrazuju grupu m, n i o ima značenje od 0-3, q ima značenje od 1-6, Ra>Rtn Rd. Re,Rfnezavisno jedan od drugoga imaju značenje za vodonik, C,.4alkil ili grupu =NR<I>(). i/ili RMi/ili R(, zajedno sa Rci ili Rdili Ruzajedno sa R,. i/ili R| obrazuju vezu. ili do dve od grupa Ra-R| obrazuju most pri čemu svaka ima do 3C-atoma sa R<1>ili R<2>, X označava gruppu =NR<9>ili =N-, Y označava grupu -(CH2)P, p označava ceo broj 1-4, R<1>označava nesupstituisan ili opciono supstituisan sa jednim ili više halogena, C|.6-alkil, ili C|.6-alkil ili C|.6-alkoksi, koji je opciono supstituisan sa jednim ili više halogena, ili je nesupstituisan ili supstituisan aril ili heteroaril, R<2>označava vodonik ili C|-C6-alkil, ili obrazuje most sa do 3 atoma u prstenu sa Ra-Rfzajedno sa Z ili R|, R<3>označava monociklični ili biciklični aril ili heteroaril koji je nesupstituisan ili opciono supstituisan sa jednim ili više halogena, C|.6-alkil, C|.6-alkoksi ili hidroksi, R ,R"\R^ i R<7>nezavisno jedan od drugoga označavaju vodonik, halogen ili Cj-ć-alkoksi, C|.6-alkil, ili Cj.6-karboksialkil, koji su nesupstituisani ili opciono supstituisani sa jednim ili više halogena, ili R<5>i R<6>zajedno obrazuju grupu R<8>,R<9>i R<10>nezavisno jedan od drugoga označavaju vodonik ili C|.6-alkil, kao i njihovi izomeri i soli. i/ili (iii) jedinjenje generalne formule V gde R1 označava grupu gde R<5>je hloro, bromo ili grupa -OCH3, gde R7je-CH3 ili hloro. gde R<8>je -CH3, fluoro gde R<4>je fluoro, gde R<6>je hloro ili -CF3hloro, bromo, -CF3-CH3ili hloro -N=C, -CH3, -OCF3ili -CH2OH R<2>označava piridil ili grupu R<3>označava vodonik ili fluoro, kao i njihovi izomeri i soli; i/ili (iv) Seq. ID Nos. 1-59, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili scFv-tTF konjugat, pod uslovom da jedinjenje I nije identično jedinjenju II.

2. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevu 1, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I i/ili II bar jednu od Seq. ID Nos. 1-59.

3. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevima 1 -2, nazačene time, što sadrže kao jedinjenje I i/ili II Seq. ID Nos. 34a.

4. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevima 1-3, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I i/ili II bar jedno od sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili L19 scFv-tTF konjugat..

5. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevima 1-4, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I i/ili II bar jedno jedinjenje generalne formule I u kojoj r ima značenje od 0 do 2. n ima značenje od 0 do 2; R3i R4a) svaki nezavisno od drugog imaju značenje za niži alkil, b) zajedno obrazuju most opšte parcijalne formule II, gde je vezivanje preko dva terminalna C-atoma, i m ima značenje od 0 do 4; ili c) zajedno obrazuju most parcijalne formule III u kojoj jedan ili dva od članova prstena Th T2, T3, T4označava azot, a svaki drugi ima značenje za CH, i vezivanje je preko atoma T| i T4; G ima značenje za CrC6-alkil, C2-C6-alkilen ili C2-C($-alkenilen; ili C2-C6- alkilen ili C3-C6-alkenilen, koji su supstituisani sa aciloksi ili hidroksi; - CH2-0-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-0-CH2-, -CH2-S-CH2-, -CH2-NH-CH2-, oksa (-0-), tia (-S-) ili imino (-NH-), A,B,D.E i T nezavisno od svako drugog imaju značenje za N ili CH, pod uslovom što ne više od tri od ovih supstituenata imaju značenje N, Q označava niži alkil, niži alkiloksi, ili halogen, Rii R2nezavisno od svakog drugog označavaju H ili niži alkil, X ima značenje za imino, oksa, ili tia; Y ima značenje za vodonik, nesupstituisan ili supstituisan aril, heteroaril, ili nesupstituisan ili supstituisan cikloalkil; i Z ima značenje za amino, mono- ili disupstituisani amino, halogen, alkil, supstituisani alkil, hidroksi, eterifikovanu ili esterifikovanu hidroksi grupu, nitro, cijano, karboksi, esterifikovanu karboksi grupu, alkanoil, karbamoil, N-mono- ili N,N-disupstituisani karbamoil, amidino, gvanadino, merkapto, sulfo, feniltio, fenil-niži-alkil-tio, alkil-fenil-tio, fenil-sulfinil, fenil-niži-alkil-sulfinil, alkil-fenilsulfinil, fenilsulfonil, fenil-niži-alkansulfonil, ili alkilfenilsulfonil, dok, ako više od jednog ostatka Z je prisutno (m>2), supstituenti Z su istovetni ili različiti jedan od drugoga, i gde označene veze sa sterilicom su proste ili dvogube veze; ili N-oksid gornjeg jedinjenja, gde jedan ili više N-atomanose atomm kiseonika, ili so istog. i/ili jedinjenje generalne formule IV u kojoj A označava grupu =NR<2>, W označava kiseonik, sumpor, dva atoma vodonika ili grupu =NR<8>, Z označava grupu =NR<10>ili =N-, -N(R,<0>)-(CH2)q-, račvastog ili normalnog niza Ci.6-alk.il grupu ili je grupa Ili A, Z i R<1>zajedno obrazuju grupu m, n i o ima značenje od 0-3. q ima značenje od 1 -6, R-a.Rb. Re. R<j. Rc,Rfnezavisno jedan od drugoga imaju značenje za vodonik, CM alkil ili grupu =NRI(1, i/ili Rai/ili Rj, zajedno sa R«i ili Rdili Rczajedno sa R,. i/ili R, obrazuju vezu, ili do dve od grupa Ra-Rr obrazuju most pri čemu svaka ima do 3C-atoma sa R<1>ili R<2>, X označava gruppu =NR<9>ili =N-, Y označava grupu -{CH2)p, p označava ceo broj 1 -4, R<1>označava nesupstituisan ili opciono supstituisan sa jednim ili više halogena, C|.6-alkil, ili Cj^-alkil ili C|_6-alkoksi, koji je opciono supstituisan sa jednim ili više halogena, ili je nesupstituisan ili supstituisan aril ili heteroaril, R označava vodonik ili C.-C6-alkil, ili obrazuje most sa do 3 atoma u prstenu sa Ra-Rf zajedno sa Z ili R], R<3>označava monociklični ili biciklični aril ili heteroaril koji je nesupstituisan ili opciono supstituisan sa jednim ili više halogena. C|.6-alkil, Ci^-a'koksi ili hidroksi, R4,R5,R6iR7 nezavisno jedan od drugoga označavaju vodonik, halogen ili C].<>-alkoksi, Ci_6-alkil, ili Ci.6-karboksialkil, koji su nesupstituisani ili opciono supstituisani sa jednim ili više halogena, ili R<5>i R<6>zajedno obrazuju grupu R8,R9 i R<10>nezavisno jedan od drugoga označavaju vodonik ili C|.(,-alkil, kao i njihovi izomeri i soli. i/ili jedinjenje generalne formule V gde R1 označava grupu gde R5 je hloro, bromo ili grupa -OCH3, gde R7je-CH3 ili hloro. gde R<8>je -CH3, fluoro ■ gde R<4>je fluoro, gde R<6>je hloro ili -CF3hloro, bromo, -CF3-CH3ili hloro -N=C, -CH3, -OCF3ili -CH2OH R označava piridil ili grupu R<3>označava vodonik ili fluoro, kao i njihovi izomeri i soli.

6. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevima 1-5, naznačene time što sadrže kao jedinjenje I i/ili II (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat.

7. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevima 1-6, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat, Seq. ID Nos. 1-59, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili LI9 scFv-tTF konjugat, i kao jedinjenje II (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftalazin-l-il]amonijum hidrogen sukcinat. Seq. ID Nos. 1-59, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili L19 scFv-tTF konjugat, pod uslovom da jedinjenje I nije identično sa jedinjenjem II.

8. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevima 1-7, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I (4-hlorofenil)[4-(4-piridilmetil)-ftaIazin-l-iI]amonijum hidrogen sukcinat, i kao jedinjenje II Seq. ID Nos. 1-59, sTie2, mAB 4301-42-35, scFv-tTF i/ili LI 9 scFv-tTF konjugat.

9. Farmaceutske kompozicije prema Zahtevima 1-7, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I mAB 4301-42-35, i kao jedinjenje II sTie2 i/ili L19 scFv-tTF konjugat.

10. Farmaceutske kompozicije prema zahtevima 1 -7, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I scFv-tTF konjugat, i kao jedinjenje II sTie2 i/ili mAB 4301-42-35.

11. Farmaceutske kompozicije prema zahtevima I -7, naznačene time, što sadrže kao jedinjenje I LI 9 scFv-tTF konjugat, i kao jedinjenje II sTie2.

12. upotreba farmaceutskih kompozicija prema zahtevima 1-11. za proizvodnju leka za tretiranje tumora, raka, psorijaze, artritisa, kao što je reurnaloidni artritis, hemangioma, angioftbroma, bolesti očiju, kao što je dijabetska retionopalija, neovaskularni glaukom, bolesti bubrega, kao što je glomerulonefritis, dijabetska ncfropatija, maligna nefroskieroza, trombićni mikroangiopatični sindrom, transplantaciona odbacivanja i glomerulopatija, fibrotičnih bolesti, kao što je ciroza jetre, boiesti proliferacije mesangijalnih ćelija, aretrioskleroze, oštećenja nervnih tkiva, potiskivanje obrazovanja ascita kod pacijenata i potiskivanje VEGF edema.