RS55979B1 - Antitela usmerena protiv her-3 i njihove upotrebe - Google Patents

Antitela usmerena protiv her-3 i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS55979B1
RS55979B1 RS20170340A RSP20170340A RS55979B1 RS 55979 B1 RS55979 B1 RS 55979B1 RS 20170340 A RS20170340 A RS 20170340A RS P20170340 A RSP20170340 A RS P20170340A RS 55979 B1 RS55979 B1 RS 55979B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
cancer
cells
human
Prior art date
Application number
RS20170340A
Other languages
English (en)
Inventor
Mike Rothe
Martin Treder
Susanne Hartmann
Dan Freeman
Bob Radinsky
Eric Borges
Original Assignee
Daiichi Sankyo Europe Gmbh
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38110697&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55979(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Daiichi Sankyo Europe Gmbh, Amgen Inc filed Critical Daiichi Sankyo Europe Gmbh
Publication of RS55979B1 publication Critical patent/RS55979B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OSNOVA PRONALASKA
1. Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela i njhove vezujuće fragmente koji se vezuju za HER-3 i polinukleotide koji ih kodiraju. Ekspresioni vektori i ćelije-domaćini koje sadrže ove vektore za proizvodnju antitela ili fragmenta antitela pronalaska su takođe obezbeđeni. Dodatno, pronalazak obezbeđuje kompozicije i postupke za dijagnostikovanje i lečenje bolesti povezanih sa HER-3-posredovanim prenosom signala i/ili njegovim ligandom heregulinom.
2. Osnova tehnologije
[0002] Receptor za humani epidermalni faktor rasta 3 (HER-3, takođe poznat kao ErbB3) je receptorska protein tirozin kinaza i pripada receptorima za epidermalni faktor rasta (EGFR), podfamiliji receptorskih protein tirozin kinaza, koja takođe uključuje HER-1 (poznat i kao EGFR), HER-2, i HER-4 (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 4905-4909; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989), 9193-9197; i Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 2900-2904). Kao prototip receptora za epidermalni faktor rasta, transmembranski receptor HER-3 se sastoji od vanćelijskog ligand-vezujućeg domena (ECD), dimerizacionog domena unutar ECD, transmembranskog domena, unutarćelijskog protein tirozin kinaznog domena (TKD) i C-terminalnog fosforilacionog domena.
[0003] Ligand Heregulin (HRG) se vezuje za vanćelijski domen HER-3 i aktivira receptorom posredovani signalni put pokretanjem dimerizacije sa drugim članovima familije receptora za humani epidermalni faktor rasta (HER) i transfosforilaciju njegovog unutarćelijskog domena. Obrazovanje dimera između članova HER familije proširuje signalni potencijal HER-3 i predstavlja način ne samo za diverzifikaciju, već i za pojačavanje signala. Na primer HER2/HER-3 heterodimer indukuje jedan od najznačajnijih mitogenih signala među članovima HER familije.
[0004] Prekomerna ekspresija HER-3 je nađena kod nekoliko tipova kancera kao što su kanceri dojke, gastrointestinalni i kanceri pankreasa. Zanimljivo je da je pokazana korelacija između ekspresije HER-2/HER-3 i napredovanja iz neinvazivne u invazivnu fazu (Alimandi et al., Oncogene 10,1813-1821; deFazio et al., Cancer 87, 487-498; Naidu et al., Br. J. Cancer 78, 1385-1390). Prema tome, sredstva koja interferiraju sa HER-3 posredovanim prenosom signala su poželjna. Mišja ili himerna HER-3 antitela su prijavljena, kao takva u US5968511, US5480968 i WO03013602. U US 2004/071696 su opisana humana monoklonska antitela usmerena protiv vanćelijskog domena HER-3 i njihova upotreba u lečenju kancera.
[0005] Za humanizovano monoklonsko antitelo protiv HER-2, Herceptin®, je nedavno pokazano da interferira sa HER-2 posredovanim prenosom signala i da je terapijski efikasno kod ljudi (Fendly et al., Hybridoma 6, 359-370; Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9, 1165-1172; Stebbing et al., Cancer Treat. Rev. 26, 287-290). Pokazano je da Herceptin® deluje putem dva različita mehanizma, tj. angažovanjem efektorskih ćelija imunskog sistema, kao i neposredno citotoksično, efektom izazivanja apoptoze.
[0006] Međutim, samo pacijenti sa visoko umnoženim HER-2 pokazuju značajan odgovor na lečenje Herceptin®-om, čime je ograničen broj pacijenata pogodnih za lečenje. Dodatno, razvijanje otprornosti na lekove ili promena u eksprimiranju ili sekvenci epitopa HER-2 na ćelijama tumora može da učini da čak i oni pristupačni pacijenti ne reaguju na antitelo i na taj način poništi njegovu terapijsku korist. Zbog toga je potrebno više lekova za ciljane terapije koje uključuju dodatne članove HER familije, kao što je HER-3.
KRATAK OPIS SLIKA
[0007]
Slika 1 prikazuje stepen ekspresije HER-3 u panelu ćelijskih linija humanog kancera i pokazuje da je HER-3 eksprimiran u raznovrsnim humanim kancerima.
Slika 2 prikazuje rezultate FACS analize vezivanja antitela na HER-3 za Ratl ćelije koje stabilno eksprimiraju različite članove HER familije ili samo prazan vektor.
Slika 3 prikazuje grupe antitela prema kompeticiji za vezivanje mapirane za HER3 domene.
Slika 4 prikazuje rezultate indirektne FACS Scatchard-ove analize afiniteta antitela izvedene sa anti-HER-3 antitelima pronalaska. Analiza ukazuje na to da anti-HER-3 antitela pronalaska poseduju visoke afinitete i velike konstante vezivanja za HER-3 eksprimiran na površini ćelije.
Slika 5 prikazuje ubrzanu endocitozu HER-3 indukovanu anti-HER-3 antitelima pronalaska.
Slike 6a-e prikazuju rezultate testa kompeticije liganda izvedenog sa anti-HER-3 antitelima pronalaska. Rezultati pokazuju da antitela pronalaska specifično smanjuju vezivanje [<125>I]-α-HRG/[125I]-β-HRG za ćelije koje eksprimiraju endogeni HER-3.
Slika 7a prikazuje rezultate HER-3 fosfotirozin ELISA testa izvedenog sa anti-HER-3 antitelima pronalaska. Antitela prema predmetnom pronalasku su bila u stanju da inhibiraju β-HRG-posredovanu aktivaciju HER-3, na šta ukazuje povećana fosforilacija receptorskog tirozina. U nastavku slika 7b prikazuje reprezentativne rezultate ovog eksperimenta sa titriranim antitelom.
Slika 8 prikazuje rezultat p42/p44 MAP-Kinaza ELISA testa izvedenog sa anti-HER-3 antitelima pronalaska. Antitela prema predmetnom pronalasku su bila u stanju da smanje β-HRG-posredovanu aktivaciju p42/p44 MAP-Kinaze, na šta ukazuje povećana fosforilacija MAP-Kinaze.
Slika 9 prikazuje rezultat fosfo-AKT ELISA testa izvedenog sa anti-HER-3 antitelima pronalaska. Antitela prema predmetnom pronalasku su bila u stanju da smanje β-HRG-posredovanu aktivaciju AKT, na šta ukazuje fosforilacija AKT.
Slika 10 prikazuje inhibiciju MCF7 ćelijske proliferacije humanim anti-HER-3 antitelima pronalaska. Antitela prema predmetnom pronalasku inhibiraju HRG-indukovani ćelijski rast u humanim ćelijama kancera.
Slika 11 prikazuje transmigraciju MCF7 ćelija inhibiranu humanim anti-HER-3 antitelima pronalaska.
Slike 12a-i prikazuju inhibiciju ćelijskog rasta nezavisnog od adhezije humanim HER-3 antitelima pronalaska.
Slika 13 prikazuje inhibiciju ksenograftskog rasta T47D ćelija humanog kancera dojke humanim anti-HER-3 antitelom pronalaska.
Slika 14 prikazuje smanjenje broja BxPC3 ćelija humanog kancera pankreasa u miševima nakon primene anti Her3 (U1-59 i U1-53) ili anti EGFR (Erbitux) antitela.
Slika 15 prikazuje smanjenje ksenograftskog rasta BxPC3 ćelija humanog kancera pankreasa primenom humanih anti-HER-3 antitela pronalaska i u kombinaciji sa anti EGFR (Erbitux) antitelima.
Slika 16 pokazuje da antitela pronalaska odlažu rast ćelija humanog melanoma (HT144) u nu/nu miševima.
Slika 17 prikazuje smanjenje ksenograftskog rasta HT-29 ćelija humanog karcinoma kolona primenom humanih HER-3 antitela pronalaska (U1-53, U1-59 i U1-7).
Slika 18 prikazuje smanjenje ksenograftskog rasta Calu-3 ćelija humanog kancera pluća primenom humanih anti-HER-3 antitela pronalaska (U1-59, U1-53 i U1-7).
Slika 19 prikazuje smanjenje ksenograftskog rasta BxPC-3 ćelija humanog kancera pankreasa primenom humanih anti-HER-3 antitela pronalaska (U1-7, U1-59 i U1-53).
Slika 20 pokazuje da antitelo pronalaska (U1-59) dovodi do supresije HER-3 u ksenograftima BxPC3 humanog kancera pankreasa.
SUŠTINA PRONALASKA
[0008] Prvi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na izolovano antitelo ili fragment antitela koje se vezuje za HER-3, koje sadrži CDR1 teškog lanca predstavljen sekvencom GGSFSGYYWS, CDR2 teškog lanca predstavljen sekvencom EINHSGSTNYNPSLKS, i CDR3 teškog lanca predstavljen sekvencom DKWTWYFDL, i CDR1 lakog lanca predstavljen sekvencom RSSQSVLYSSSNRNYLA, CDR2 lakog lanca predstavljen sekvencom WASTRES, i CDR3 lakog lanca predstavljen sekvencom QQYYSTPRT.
[0009] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, izolovano antitelo ili fragment antitela pronalaska sadrži
aminokiselinsku sekvencu teškog lanca označenu kao SEQ ID NO: 70
aminokiselinsku sekvencu lakog lanca označenu kao SEQ ID NO 72.
[0010] Prema predmetnom pronalasku, izolovano antitelo ili fragment antitela koji je sposoban da se veže za HER-3 interaguje sa najmanje jednim epitopom u vanćelijskom delu HER-3. Epitopi su poželjno smešteni u domenu L1 (aa 19-184) koji predstavlja amino-terminalni domen, u domenu S1 (aa 185-327) i S2 (aa 500-632) koji predstavljaju dva domena bogata cisteinom, ili u domenu L2 (328-499) koji je ograničen sa dva cisteinom bogata domena. Epitopi mogu takođe da obuhvataju kombinaciju domena kao što je, ali bez ograničenja na, epitop sastavljen od delova L1 i S1. Dalje je poželjno izolovano antitelo ili fragment antitela koje se vezuje za trodimenzionalnu strukturu koju obrazuju aminokiselinski ostaci 1-160, 161-358, 359-575, 1-358 i/ili 359-604 zrelog HER-3, naročito zrelog humanog HER-3.
[0011] Poželjno, anti-HER-3 antitelo je U1-59 (SEQ ID NO: 70/72) ili antitelo koje ima najmanje jedan teški ili laki lanac pomenutog antitela.
[0012] Dodatno, dalji primeri izvođenja predmetnog pronalaska obezbeđuju antitelo ili fragment antitela spojen sa obeležavajućom grupom ili efektorskom grupom. Poželjno, takvo antitelo ili fragment antitela je korisno za lečenje hiperproliferativnih bolesti, naročito onkoloških bolesti kao što je kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer ovarijuma, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, kancer tiroidne žlezde, kancer bešike, gliom, melanom, kancer testisa, sarkom mekog tkiva, kancer glave i vrata, ostali kanceri koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-3, i tvorevine metastaza tumora.
[0013] Drugi aspekti predmetnog pronalaska se odnose na izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili fragment antitela pronalaska, vektor koji nosi molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili fragment antitela pronalaska, i ćeliju-domaćina, npr. CHO ćeliju, NS/0 ćeliju mijeloma, transformisanu takvim molekulom nukleinske kiseline ili vektorom.
[0014] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na postupak za dobijanje antitela ili fragmenta antitela pronalaska pripremom pomenutog antitela ili fragmenta antitela iz ćelijedomaćina koja luči antitelo ili fragment antitela. Poželjno, antitelo ili fragment antitela pronalaska se dobija iz ćelijske linije hibridoma koja luči antitelo ili fragment antitela ili CHO ili drugog ćelijskog tipa transformisanog molekulom nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili fragment antitela pronalaska.
[0015] Drugi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na postupak za proizvodnju antitela ili fragmenta antitela pronalaska pripremom pomenutog antitela ili fragmenta antitela iz tkiva, proizvoda ili sekreta životinje, biljke ili gljive, koja je transgena za molekul nukleinske kiseline ili molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo ili fragment antitela pronalaska. Poželjno, antitelo ili fragment antitela pronalaska je pripremljeno iz tkiva, proizvoda ili sekreta transgene životinje kao što je krava, ovca, zec, pile, ili neka druga vrsta sisara ili ptica, transgene biljke kao što je kukuruz, duvan ili druga biljka, ili transgene gljive kao što je Aspergillus, Pichia ili druga vrsta gljive.
[0016] Naredni aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži kao aktivno sredstvo najmanje jedno antitelo ili fragment antitela pronalaska u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, diluentima i/ili adjuvansima. U sledećem poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutske kompozicije pronalaska dodatno sadrže najmanje jedno dodatno aktivno sredstvo, npr. najmanje jedno antineoplastično sredstvo. Još jedan aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na upotrebu najmanje jednog antitela ili fragmenta antitela pronalaska, i po slobodnom izboru, najmanje jednog dodatnog aktivnog sredstva, npr. najmanje jednog antineoplastičnog sredstva, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, diluentima i/ili adjuvansima za dobijanje farmaceutske kompozicije. Farmaceutska kompozicija je pogodna za dijagnostikovanje, sprečavanje ili lečenje hiperproliferativne bolesti, naročito onkološke bolesti kao što je kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer ovarijuma, kancer želuca, endometrijalni kancer, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer kolona, kolorektalni kancer, kancer tiroidne žlezde, kancer bešike, gliom, melanom, kancer testisa, sarkom mekog tkiva, kancer glave i vrata, ili ostali kanceri koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-3, i tvorevine metastaza tumora.
[0017] Osim toga, predmetni pronalazak se u sledećem aspektu odnosi na upotrebu antitela ili fragmenta antitela pronalaska u postupku za dijagnostikovanje bolesti ili stanja povezanih sa eksprimiranjem HER-3, gde postupak obuhvata dovođenje u dodir uzorka sa najmanje jednim antitelom ili fragmentom antitela pronalaska, pod uslovima pogodnim da se omogući vezivanje pomenutog antitela ili fragmenta antitela za HER-3 i identifikaciju vezivanja pomenutog antitela ili fragmenta antitela za HER-3. Poželjne bolesti ili stanja uključuju hiperproliferativne bolesti pomenute u prethodnom tekstu.
[0018] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je antitelo ili fragment antitela za upotrebu u postupku prevencije ili lečenja bolesti ili stanja povezanih sa eksprimiranjem HER-3 kod pacijenta kod koga postoji potreba za tim, gde postupak obuhvata primenu kod pacijenta efikasne količine najmanje jednog antitela ili fragmenta antitela pronalaska i po slobodnom izboru najmanje još jednog dodatnog aktivnog sredstva, npr. najmanje jednog neoplastičnog sredstva. Poželjno, pacijent je sisarski pacijent, još poželjnije humani pacijent. Poželjne bolesti ili stanja povezana sa eksprimiranjem HER-3 su hiperproliferativne bolesti pomenute u prethodnom tekstu.
[0019] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na kit za dijagnostikovanje, sprečavanje i lečenje bolesti ili stanja povezanih sa eksprimiranjem HER-3, koji sadrži najmanje jedno antitelo ili fragment antitela, i/ili molekul nukleinske kiseline i/ili vektor pronalaska. Po slobodnom izboru, kit pronalaska može dalje da sadrži najmanje još jedno aktivno sredstvo, npr. najmanje jedno antineoplastično sredstvo. Poželjno, bolesti ili stanja povezana sa eksprimiranjem HER-3 su hiperproliferativne bolesti pomenute u prethodnom tekstu.
DETALJAN OPIS
[0020] Prvi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na antitelo ili fragment antitela koje se vezuje za HER-3.
[0021] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, izolovano antitelo ili fragment antitela pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca označenu kao SEQ ID NO 70 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca označenu kao SEQ ID NO 72.
[0022] U skladu sa predmetnim pronalaskom, treba razumeti, da aminokiselinska sekvenca antitela ili fragmenta antitela pronalaska nije ograničena na dvadeset konvencionalnih aminokiselina (Videti, Immunology - A Synthesis (2. izdanje, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Na primer, aminokiseline mogu da uključuju stereoizomere (npr. D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, aminokiseline koje nisu prirodne kao što su α-,α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina, koje takođe mogu da budu pogodne komponente za antitelo ili fragment antitela pronalaska, uključuju: 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, Nacetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline, npr.4-hidroksiprolin.
[0023] Osim toga, u skladu sa predmetnim pronalaskom, manje varijacije u aminokiselinskim sekvencama se smatraju obuhvaćenim predmetnim pronalaskom, pod uslovom da su te varijacije u aminokiselinskoj sekvenci sačuvale najmanje 75 %, još poželjnije najmanje 80 %, 90 %, 95 %, i najpoželjnije 99 % sekvenci označenih kao SEQ ID NOs: 70 i 72. Varijacije mogu da se jave u okvirnim regionima (tj. van CDR-ova), ali ne i unutar CDR-ova. Poželjne varijacije u aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NOs: 70 i 72, tj. delecije, insercije i/ili zamene najmanje jedne aminokiseline, se javljaju blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu da se identifikuju upoređivanjem podataka o nukleotidnoj i/ili aminokiselinskoj sekvenci sa javnim ili vlasničkim bazama podataka o sekvencama. Kompjuterizovani postupci upoređivanja mogu da se koriste za identifikovanje motiva sekvence ili predviđenih domena konformacije proteina koji se javljaju u drugom antitelu ili fragmentu antitela poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikovanje proteinskih sekvenci koje se savijaju u poznate trodimenzionalne strukture su poznati. Videti npr. Bowie et al., Science 253, 164 (1991); Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et al., Nature 354, 105 (1991). Prema tome, stručnjaci upoznati sa stanjem tehnike mogu da prepoznaju motive sekvence i strukturne konformacije koje mogu da se koriste za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena u skladu sa pronalaskom.
[0024] Naročito poželjne varijacije u aminokiselinskim sekvencama prikazanim u SEQ ID NOs: 70 i 72 su one koje vode smanjenoj osetljivosti na proteolizu ili oksidaciju, menjaju obrasce glikozilacije, ili menjaju afinitete vezivanja, ili učestvuju u, ili menjaju druge fizičko-hemijske ili funkcionalne osobine antitela ili fragmenta antitela. Naročito, razmatraju se konzervativne zamene aminokiselina. Konzervativne zamene su one koje se javljaju u okviru familije aminokiselina sličnih prema vrsti bočnih lanaca. Poželjne aminokiselinske familije su sledeće: familija kiselih aminokiselina = aspartat, glutamat; familija baznih aminokiselina = lizin, arginin, histidin; familija nepolarnih aminokiselina = alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan; i familija nenaelektrisanih polarnih aminokiselina = glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Još poželjnije familije su: familija alifatičnih-hidroksi aminokiselina = serin i treonin; familija aminokiselina koje sadrže amid = asparagin i glutamin; familija alifatičnih aminokiselina = alanin, valin, leucin i izoleucin; i familija aromatičnih aminokiselina= fenilalanin, triptofan i tirozin. Na primer, razumno je očekivati da pojedinačna zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartatata glutamatom, treonina serinom, ili slična zamena jedne aminokiseline strukturno sličnom aminokiselinom neće imati veliki efekat na vezivanje ili osobine tako nastalog antitela ili fragmenta antitela, posebno ako zamena ne uključuje aminokiselinu unutar okvirnog regiona. Međutim, sve druge moguće aminokiselinske zamene su takođe obuhvaćene predmetnim pronalaskom. To da li zamena aminokiseline ima za rezultat dobijanje funkcionalnog antitela ili fragmenta antitela, tj. antitela ili fragmenta antitela koje se vezuje za HER-3 i smanjuje prenos signala od strane članova HER familije, može lako da se odredi ispitivanjem specifične aktivnosti dobijenog antitela ili fragmenta antitela u ELISA ili FACS funkcionalnom testu za vezivanje za HER-3, in vitro ili in vivo.
[0025] Prema predmetnom pronalasku, antitelo ili fragment antitela pronalaska interaguje sa najmanje jednim epitopom u vanćelijskom delu HER-3. Epitopi se poželjno nalaze u domenu L1 (aa 19-184), koji predstavlja amino-terminalni domen, u domenu S1 (aa 185-327) i S2 (aa 500-632), koji predstavljaju dva cisteinom bogata domena, u domenu L2 (328-499), koji je ograničen sa dva cisteinom bogata domena ili obuhvataju kombinaciju HER-3 domena. Epitopi takođe mogu da obuhvataju kombinaciju domena kao što je, ali bez ograničenja na, epitop koji sadrži delove L1 i S1. Osim toga, antitelo ili fragment antitela pronalaska je dalje okarakterisano time da njegovo vezivanje za HER-3 smanjuje HER-3-posredovani prenos signala. U skladu sa predmetnim pronalaskom, smanjenje HER-3-posredovanog prenosa signala može da bude, npr. izazvano nishodnom regulacijom HER-3 koja vodi do barem delimičnog nestajanja HER-3 molekula sa površine ćelije ili stabilizacijom HER-3 na površini ćelije u suštinski neaktivnom obliku, tj. obliku koji ispoljava smanjeni prenos signala u poređenju sa nestabilizovanim oblikom. Alternativno, smanjenje HER-3-posredovanog prenosa signala može takođe da bude izazvano uticajem, npr, snižavanjem ili inhibicijom vezivanja liganda ili drugog člana HER familije za HER-3, GRB2 za HER-2 ili GRB2 za SHC, putem inhibicije fosforilacije receptorskog tirozina, fosforilacije AKT, fosforilacije tirozina PYK2 ili fosforilacije ERK2, ili smanjenjem invazivnosti tumora. Alternativno, smanjenje HER-3-posredovanog prenosa signala može takođe da bude izazvano uticajem, npr, snižavanjem ili inhibicijom obrazovanja dimera koji sadrže HER-3 i neki od ostalih članova HER familije. Jedan od primera može da bude smanjenje ili inhibicija obrazovanja HER3-EGFR proteinskog kompleksa.
[0026] Izraz "antitelo" ili "anti-HER-3 antitelo", kako se ovde koristi, znači monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, humanizovano antitelo (Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525; Riechmann et al., Nature 332 (1988), 323-329; i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992), 593-596), himerno antitelo (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (1984), 6851-6855), multispecifično antitelo (npr. bispecifično antitelo) obrazovano od najmanje dva antitela, ili njihovog fragmenta antitela. Izraz "fragment antitela" sadrži bilo koji deo navedenih antitela, poželjno njihove antigen-vezujuće ili varijabilne regione. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab’)2fragmente, Fv fragmente, di-antitela (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), jednolančane molekule antitela (Plückthun u: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) i druge fragmente sve dok ispoljavaju željenu sposobnost vezivanja za HER-3.
[0027] Osim toga, izraz "antitelo" ili "anti-HER-3 antitelo", kako se ovde koristi, može da uključuje molekule slične antitelu koji sadrže projektovane sub-domene antitela ili varijante antitela koje se javljaju u prirodi. Ovi molekuli slični antitelu mogu da budu antitela sa jednim domenom kao što su antitela koja se sastoje samo od VH ili samo od VL domena dobijena ili iz prirodnih izvora kao što je familija kamelida (Muyldermans et al., Reviews in Molecular Biotechnology 74, 277-302) ili pomoću in vitro prikazanih biblioteka poreklom od čoveka, kamelida ili drugih vrsta (Holt et al., Trends Biotechnol., 21, 484-90).
[0028] U skladu sa predmetnim pronalaskom, "Fv fragment" je najmanji fragment antitela koji sadrži kompletno antigen-prepoznajuće i -vezujuće mesto. Ovaj region se sastoji od dimera jednog varijabilnog domena teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji tri CDR-a svakog varijabilnog domena interaguju da bi definisali antigen-vezujuće mesto na površini VH-VLdimera. Zajednički, šest CDR-ova daju antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Međutim, čak i pojedinačni varijabilni domen (ili polovina Fv fragmenta koja sadrži samo tri CDR-a specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže se za antigen, mada često sa nižim afinitetom nego kada je u pitanju celo vezujuće mesto. "Fab fragment" takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. "Fab fragment" se razlikuje od "Fab’ fragmenta" prema nekoliko dodatih ostataka na karboksi-terminalnom kraju CH1 domena teškog lanca uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. "F(ab’)2fragment" je prvobitno proizveden kao par ’Fab’ fragmenata" koji imaju cisteine zgloba između sebe. Postupci za pripremu takvih fragmenata antitela, kao što je digestija papainom ili pepsinom, poznati su osobama upućenim u stanje tehnike.
[0029] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, anti-HER-3 antitelo pronalaska je po tipu IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM, poželjno IgG ili IgM uključujući, ali bez ograničenja na, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 i IgM2 tip. U najpoželjnijim izvođenjima, antitelo je po tipu IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0030] U drugom poželjnom primeru izvođenja pronalaska, anti-HER-3 antitelo pronalaska je anti-HER-3 antitelo usmereno protiv vanćelijskog domena (ECD) HER-3.
[0031] U određenim aspektima, npr. u vezi sa stvaranjem antitela kao terapijskih kandidata protiv HER-3, može da bude poželjno da anti-HER-3 antitelo pronalaska bude u stanju da fiksira komplement i da učestvuje u citotoksičnosti koja je zavisna od komplementa (CDC). Postoje brojni izotipovi antitela koji imaju ovu sposobnost uključujući, bez ograničenja, sledeće: mišji IgM, mišji IgG2a, mišji IgG2b, mišji IgG3, humani IgM, humani IgG1, humani IgG3 i humani IgA. Podrazumeva se da proizvedena antitela ne moraju inicijalno da poseduju takav izotip već, radije, antitelo kakvo je proizvedeno može da ima bilo koji izotip, i izotip antitela može da se promeni dodavanjem molekularno kloniranih gena V regiona ili cDNK na molekularno klonirane gene konstantnog regiona ili cDNK u odgovarajućim ekspresionim vektorima korišćenjem uobičajenih tehnika molekularne biologije koje su dobro poznate u stanju tehnike i zatim eksprimiranjem antitela u ćelijama-domaćinima korišćenjem metoda poznatih u stanju tehnike. Antitelo kome je promenjen izotip može takođe da poseduje Fc region koji je molekularno projektovan tako da ima bolju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) nego varijante koje se javljaju u prirodi (Idusogie et al., J Immunol., 166, 2571-2575) i eksprimiran rekombinantno u ćelijama-domaćinima metodama poznatim u stanju tehnike. Takve metode uključuju upotrebu rekombinantnih tehnika (videti npr. U.S. Patent br. 4,816,397), tehnike fuzije ćelije sa ćelijom (videti npr. U.S. Patente br.5,916,771 i 6,207,418), između ostalih. U okviru tehnike fuzije ćelije sa ćelijom, pripremljena je ćelijska linija mijeloma ili druga ćelijska linija kao što je CHO, koja ima teški lanac sa bilo kojim željenim izotipom i još jedna ćelijska linija mijeloma ili druga ćelijska linija kao što je CHO, koja ima laki lanac. Takve ćelije mogu, nakon toga, da budu fuzionisane i ćelijska linija koja eksprimira intaktno antitelo može da bude izolovana. U smislu primera, humanom anti-HER-3 IgG4 antitelu, koje poseduje željenu osobinu vezivanja za HER-3 antigen, može lako da se promeni izotip tako da se dobije humani IgM, humani IgG1 ili humani IgG3 izotip, pri čemu ono zadržava isti varijabilni region (koji definiše specifičnost antitela i delimično njegov afinitet). Takav molekul može onda da bude sposoban da fiksira komplement i učestvuje u CDC.
[0032] Osim toga, takođe može da bude poželjno za anti-HER-3 antitelo pronalaska da bude u stanju da se veže za Fc receptore na efektorskim ćelijama, kao što su monociti i ćelije prirodne ubice (NK), i učestvuje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC). Postoje brojni izotipovi antitela koji su sposobni za ovo, uključujući, bez ograničenja, sledeće: mišji IgG2a, mišji IgG2b, mišji IgG3, humani IgG1 i humani IgG3. Podrazumeva se da proizvedena antitela ne moraju inicijalno da poseduju takav izotip već, radije, antitelo kakvo je proizvedeno može da ima bilo koji izotip, i izotip antitela može da se promeni dodavanjem molekularno kloniranih gena V regiona ili cDNK na molekularno klonirane gene konstantnog regiona ili cDNK u odgovarajućim ekspresionim vektorima korišćenjem uobičajenih tehnika molekularne biologije koje su dobro poznate u stanju tehnike i zatim eksprimiranjem antitela u ćelijama-domaćinima korišćenjem metoda poznatih u stanju tehnike. Antitelo kome je promenjen izotip može takođe da poseduje Fc region koji je molekularno projektovan tako da ima bolju ADCC nego varijante koje se javljaju u prirodi (Shields et al. J Biol Chem., 276, 6591-6604) i eksprimiran rekombinantno u ćelijamadomaćinima metodama poznatim u stanju tehnike. Takve metode uključuju upotrebu direktnih rekombinantnih tehnika (videti npr. U.S. Patent br. 4,816,397), tehnike fuzije ćelije sa ćelijom (videti npr. U.S. Patente br.5,916,771 i 6,207,418), između ostalih. U okviru tehnike fuzije ćelije sa ćelijom, pripremljena je ćelijska linija mijeloma ili druga ćelijska linija kao što je CHO, koja ima teški lanac sa bilo kojim željenim izotipom i još jedna ćelijska linija mijeloma ili druga ćelijska linija kao što je CHO, koja ima laki lanac. Takve ćelije mogu, nakon toga, da budu fuzionisane i ćelijska linija koja eksprimira intaktno antitelo može da bude izolovana. U smislu primera, humanom anti-HER-3 IgG4 antitelu, koje poseduje osobinu željenog vezivanja za HER-3 antigen, može lako da se promeni izotip tako da se dobije humani IgG1 ili humani IgG3 izotip, pri čemu ono zadržava isti varijabilni region (koji definiše specifičnost antitela i delimično njegov afinitet). Takav molekul može onda da bude sposoban da se veže za FcyR na efektorskim ćelijama i da učestvuje u ADCC.
[0033] Osim toga, u skladu sa predmetnim pronalaskom, podrazumeva se da je anti-HER-3 antitelo pronalaska u celosti humano ili humanizovano antitelo. Humana antitela omogućavaju izbegavanje određenih problema povezanih sa ksenogenim antitelima, na primer sa antitelima koja imaju varijabilne i/ili konstantne regione poreklom od miša ili pacova. Prisustvo proteina ksenogenog porekla kao što su proteini poreklom od miša ili pacova može da vodi razvoju imunskog odgovora protiv antitela od strane pacijenta, što zatim vodi brzom klirensu antitela, gubitku terapijske koristi kroz neutralizaciju antitela i/ili ozbiljnim, čak životno-ugrožavajućim, alergijskim reakcijama.
[0034] Poželjno, anti-HER-3 antitelo pronalaska je gU1-59 antitelo.
[0035] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili fragment antitela pronalaska je spojeno sa grupom za obeležavanje. Takvo antitelo ili fragment antitela je naročito pogodno za dijagnostičke primene. Kako se ovde koristi, izraz "grupa za obeležavanje" se odnosi na marker koji se može detektovati, npr. radioaktivno obeleženu aminokiselinu ili biotinil-grupu koja može da se detektuje obeleženim avidinom (npr. streptavidin vezan za fluorescentni marker ili enzimska aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim metodama). Različite metode za obeležavanje polipeptida i glikoproteina, kao što su antitela, su poznate u stanju tehnike i mogu da se koriste u izvođenju predmetnog pronalaska. Primeri odgovarajućih grupa za obeležavanje uključuju, ali bez ograničenja, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.
3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), fluorescentne grupe (npr. FITC, rodamin, lantanid fosfor), enzimske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne grupe, biotinil grupe, ili unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaju sekundarni reporteri (npr. parovi sekvenci leucinskog rajsferšlusa, vezujuća mesta za sekundarna antitela, vezujući domeni za metal, epitop tag-ovi). U određenim aspektima, može da bude poželjno da su grupe za obeležavanje povezane “ručicama za razmicanje” različitih dužina kako bi se smanjilo moguće sterno ometanje.
[0036] Alternativno, antitelo ili fragment antitela pronalaska može da bude spojeno sa efektorskom grupom u narednom poželjnom primeru izvođenja pronalaska. Takvo antitelo ili fragment antitela je naročito pogodno za terapijske primene. Kako se ovde koristi, izraz "efektorska grupa" se odnosi na citotoksičnu grupu kao što je radioizotop ili radionuklid, toksin, terapijska grupa ili druga efektorska grupa poznata u stanju tehnike. Primeri za odgovarajuće efektorske grupe su radioizotopi ili radionuklidi (npr.3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), kaliheamicin, analozi dolastatina kao što su auristatini, i hemoterapijska sredstva kao što je geldanamicin i derivati maitansina, uključujući DM1. U određenim aspektima, može da bude poželjno da su efektorske grupe povezane “ručicama za razmicanje” različitih dužina kako bi se smanjilo moguće sterno ometanje.
[0037] Drugi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na proces pripreme izolovanog antitela ili fragmenta antitela pronalaska, koji obuhvata korak izolovanja antitela ili fragmenta antitela iz ćelije-domaćina koja sekretuje antitelo ili fragment antitela. Ćelije-domaćini, koje mogu da se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom, su hibridomi; eukariotske ćelije kao što su sisarske ćelije, npr. hrčka, zeca, pacova, svinje, miša ili druge životinjske ćelije, biljne ćelije, ćelije gljiva, npr. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; prokariotske ćelije kao što je E. coli; i druge ćelije koje se koriste u stanju tehnike za proizvodnju antitela ili fragmenata antitela. Različite metode za dobijanje i izolovanje antitela ili fragmenata antitela iz ćelija-domačina su poznate u stanju tehnike i mogu da se koriste u izvođenju predmetnog pronalaska. Osim toga, metode za dobijanje fragmenata antitela, kao što je digestija papainom ili pepsinom, moderne tehnike kloniranja, tehnike za dobijanje jednolančanih molekula antitela (Plückthun u: The Pharmacology of Monoclonal Antitela 113, Rosenburg i Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) i di-antitela (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 6444-6448), su takođe poznati stručnjacima u stanju tehnike i mogu da se koriste za izvođenje predmetnog pronalaska.
[0038] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili fragment antitela pronalaska se priprema iz hibridoma koji sekretuje antitelo ili fragment antitela. Videti npr. Köhler et al., Nature 256 (1975), 495.
[0039] U narednom poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili fragment antitela pronalaska se priprema rekombinantno optimizacijom i/ili amplifikacijom eksprimiranja antitela ili fragmenta antitela u ćeliji-domaćinu i izolovanjem antitela ili fragmenta antitela iz pomenute ćelije-domaćina. U tom cilju, ćelije-domaćini su transformisane ili transfekovane sa DNK koja kodira antitelo ili fragment antitela ili vektorom koji sadrži DNK koja kodira antitelo ili fragment antitela, i gajene pod odgovarajućim uslovima da proizvedu antitelo ili fragment antitela pronalaska. Videti npr. U.S. Patent br.4,816,567. Poželjne ćelije-domaćini mogu da budu CHO ćelije, NS/0 ćelije mijeloma, ćelije 293 bubrega humanog embriona, E. coli i Saccharomyces cerevisiae.
[0040] Antitela mogu da se dobiju iz životinja podvrgnutih genetičkom inženjeringu tako da stvaraju potpuno humana antitela ili iz biblioteke koja prikazuje antitela napravljene u bakteriofagu, kvascu, ribozomu ili E. coli. Videti npr. Clackson et al., Nature 352 (1991), 624-628, Marks et al., J. Mol. Biol.222 (1991), 581-597, Feldhaus i Siegel J Immunol Methods. 290, 69-80, Groves i Osbourn, Expert Opin Biol Ther., 5, 125-135 i Jostock i Dubel, Comb Chem High Throughput Screen.8, 127-133.
[0041] Humana antitela omogućavaju izbegavanje nekih problema povezanih sa antitelima koja imaju varijabilne i/ili konstantne regione poreklom od miša ili pacova. Prisustvo takvih proteina poreklom od miša ili pacova može da vodi brzom klirensu antitela ili može da vodi razvoju imunskog odgovora protiv antitela od strane pacijenta. U cilju izbegavanja korišćenja antitela poreklom od miša ili pacova, potpuno humana antitela mogu da budu dobijena uvođenjem funkcionalnih lokusa humanog antitela u glodara, drugog sisara ili životinju tako da glodar, drugi sisar ili životinja proizvode potpuno humana antitela.
[0042] Jedan metod za dobijanje potpuno humanih antitela je primenom XENOMOUSE® sojeva miševa koji su projektovani da sadrže 245 kb i 190 kb duge fragmente lokusa humanog teškog lanca i kapa lokusa lakog lanca u konfiguraciji klicine linije. Drugi XenoMouse sojevi miševa sadrže 980 kb i 800 kb duge fragmente lokusa humanog teškog lanca i kapa lokusa lakog lanca u konfiguraciji klicine linije. Neki drugi XenoMouse sojevi miša sadrže 980 kb i 800 kb duge fragmente lokusa humanog teškog lanca i kapa lokusa lakog lanca u konfiguraciji klicine linije zajedno sa 740 kb dugim kompletnim lambda lokusom humanog lakog lanca u konfiguraciji klicine linije. Videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green i Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998). XENOMOUSE® sojevi su dostupni kod Abgenix, Inc. (Fremont, CA).
[0043] Proizvodnja XENOMOUSE® miševa je dalje i detaljno razmatrana u U.S. Patentnim prijavama br. 07/466,008, podneta 12. januara 1990, 07/610,515, podneta 8. novembra 1990, 07/919,297, podneta 24. jula 1992, 07/922,649, podneta 30. jula 1992, 08/031,801, podneta 15. marta 1993, 08/112,848, podneta 27. avgusta 1993, 08/234,145, podneta 28 aprila 1994, 08/376,279, podneta 20. januara 1995, 08/430, 938, podneta 27. aprila 1995, 08/464,584, podneta 5. juna 1995, 08/464,582, podneta 5. juna 1995, 08/463,191, podneta 5. juna 1995, 08/462,837, podneta 5. juna 1995, 08/486,853, podneta 5. juna 1995, 08/486,857, podneta 5. juna 1995, 08/486,859, podneta 5. juna 1995, 08/462,513, podneta 5. juna 1995, 08/724,752, podneta 2. oktobra 1996 i 08/759,620, podneta 3. decembra 1996, U.S. Patentnoj objavi 2003/0217373, podnetoj 20. novembra 2002, i U.S. Patentima br. 6,833,268, 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, i 5,939,598 i Japanskim Patentima br. 3068 180 B2, 3068 506 B2, i 3 068 507 B2. Videti takođe Evropski Patent br., EP 0463 151 B1, grant objavljen 12 juna 1996, Međunarodnu Patentnu prijavu br., WO 94/02602, objavljenu 3. februara 1994, Međunarodnu Patentnu prijavu br, WO 96/34096, objavljenu 31. oktobra 1996, WO 98/24893, objavljenu 11. juna 1998, WO 00/76310, objavljenu 21. decembra 2000.
[0044] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., su koristili "minilokus" pristup. U minilokus pristupu, egzogeni Ig lokus se imitira putem uključivanja delova (pojedinačnih gena) iz Ig lokusa. Stoga, jedan ili više VHgena, jedan ili više DHgena, jedan ili više JHgena, mu konstantni region, i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) izgrađuju konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentu br.
5,545,807 za Surani et al. i U.S. Patentima br. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, i 6,255,458 svaki za Lonberg i Kay, U.S. Patentima br. 5,591,669 i 6,023.010 za Krimpenfort i Berns, U.S. Patentima br.
5,612,205, 5,721,367 i 5,789,215 za Berns et al., i U.S. Patentu br. 5,643,763 za Choi i Dunn, i GenPharm International U.S. Patentnim prijavama serijski br. 07/574,748, podneta 29. avgusta 1990, 07/575,962, podneta 31. avgusta 1990, 07/810,279, podneta 17. decembra 1991, 07/853,408, podneta 18. marta 1992, 07/904,068, podneta 23. juna 1992, 07/990,860, podneta 16. decembra 1992, 08/053,131, podneta 26. aprila 1993, 08/096,762, podneta 22. jula 1993, 08/155,301, podneta 18. novembra 1993, 08/161,739, podneta 3. decembra 1993, 08/165,699, podneta 10. decembra 1993, 08/209,741, podneta 9. marta 1994. Videti takođe Evropski Patent br. 0 546 073 B1, Međunarodne Patentne prijave br. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. Patent br. 5,981,175. Videti dalje Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), i Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).
[0045] Kirin je takođe pokazao dobijanje humanih antitela iz miševa u koje su, putem mikroćelijske fuzije, uvedeni veliki delovi hromozoma, ili celi hromozomi. Videti Evropske Patentne prijave br. 773 288 i 843 961. Dodatno, dobijeni su KM™- miševi, koji su nastali ukrštanjem Kirinovih Tc miševa sa Medarex-ovim minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi imaju HC transhromozom Kirin miševa i transgen kapa lanca Medarex miševa (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
[0046] Humana antitela mogu takođe da se dobiju in vitro metodama. Pogodni primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, prikazivanje na fagu (komercijalizovano od strane Cambridge Antibody Technology, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (ranije Proliferon), Affimed) prikazivanje na ribozomu (komercijalizovano od strane Cambridge Antibody Technology), prikazivanje na kvascu, i slično.
[0047] Antitela, kako je ovde opisano, su dobijena korišćenjem XENOMOUSE® tehnologije, kako je opisano dalje u tekstu. Takvi miševi, su tada, u stanju da proizvode humane imunoglobulinske molekule i antitela i deficijentni su u proizvodnji mišjih imunoglobulinskih molekula i antitela. Tehnologije korišćene za postizanje istog su opisane u patentima, prijavama, i referencama prikazanim ovde u odeljku Osnova pronalaska. Naročito, međutim, poželjno izvođenje transgene proizvodnje miševa i antitela od njih je obelodanjeno u U.S. Patentnoj prijavi serijski br. 08/759,620, podnetoj 3. decembra 1996. i Međunarodnoj Patentnoj prijavi br. WO 98/24893, objavljenoj 11. juna 1998. i WO 00/76310, objavljenoj 21. decembra 2000. Videti takođe Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).
[0048] Upotrebom takve tehnologije, proizvedena su potpuno humana monoklonska antitela na različite antigene. U suštini, XENOMOUSE® linije miševa su imunizovane antigenom od interesa (npr. HER-3), limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) su dobijene iz miševa koji eksprimiraju antitela, i dobijene ćelijske linije su fuzionisane sa ćelijskom linijom mijeloidnog tipa da bi se dobila besmrtna ćelijska linija hibridoma. Ove ćelijske linije hibridoma su pretražene i selektovane da bi se identifikovale ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. U tekstu su obezbeđene metode za proizvodnju ćelijskih linija hibridoma koje proizvode antitela specifična na HER-3. Osim toga, u tekstu je obezbeđena karakterizacija antitela proizvedenih u takvim ćelijskim linijama, uključujući analize nukleotidne i aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca takvih antitela.
[0049] Uglavnom, antitela koja proizvode fuzionisani hibridomi su bila teški lanci humanog IgG1 sa potpuno humanim kapa lakim lancima. Ovde opisana antitela poseduju teške lance humanog IgG4 kao i teške lance IgG1. Antitela ogu takođe da budu drugih humanih izotipova, uključujući IgG2 ili IgG3. Antitela su imala visoke afinitete, obično sa vrednošću KDod oko 10-6 do oko 10-13 M ili nižom, kada se meri tehnikama na čvrstoj fazi i tehnikama zasnovanim na ćelijama.
[0050] Naredni aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili fragment antitela pronalaska. U kontekstu predmetnog pronalaska, izraz "izolovani molekul nukleinske kiseline", kako se ovde koristi, označava polinukleotid poreklom iz genoma, cDNK, ili sintetičkog porekla ili neku njihovu kombinaciju, gde navedeni "izolovani molekul nukleinske kiseline" po svom poreklu (1) nije povezan sa celim ili delom polinukleotida u kome je " izolovani molekul nukleinske kiseline" nađen u prirodi, (2) je operativno povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (3) ne javlja se u prirodi kao deo veće sekvence. Dodatno, izraz "molekul nukleinske kiseline", kako se ovde koristi, označava polimerni oblik nukleotida dug najmanje 10 baza, ribonukleotide ili deoksinukleotide ili modifikovani oblik bilo kog od ta dva tipa nukleotida, kao što su nukleotidi sa izmenjenim ili supstituisanim grupama šećera i slično. Izraz takođe uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0051] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, molekul nukleinske kiseline pronalaska je operativno povezan sa kontrolnom sekvencom. Izraz "kontrolna sekvenca", kako se ovde koristi, se odnosi na polinukleotidne sekvence čije je dejstvo na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci sa kojima su vezane neophodno. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje zavisno od organizma-domaćina. Kod prokariota, takve kontrolne sekvence obično uključju promotore, vezujuća mesta za ribozome, i sekvence za završetak transkripcije. Kod eukariota, obično, takve kontrolne sekvence uključju promotore i sekvence za završetak transkripcije. U skladu sa predmetnim pronalaskom, izraz "kontrolna sekvenca" treba da uključuje, najmanje, sve komponente čije prisustvo je neophodno za ekspresiju i obradu, i može takođe da uključuje dodatne komponente čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, lider sekvence i sekvence za fuzione partnere. Osim toga, izraz "operativno povezan", kako se ovde koristi, označava položaj opisanih komponenti koje se nalaze u odnosu sa drugim komponentama, takav da im dozvoljava da funkcionišu na način kako je potrebno. Nadalje, u skladu sa predmetnim pronalaskom, sekvenca koja kontroliše ekspresiju, operativno povezana sa kodirajućom sekvencom, povezana je na taj način, da je ekspresija kodirajuće sekvence postignuta pod uslovima kompatibilnim sa ekspresijom kontrolne sekvence.
[0052] Naredni aspekt predmetnog pronalaska je vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili fragment antitela pronalaska. Molekul nukleinske kiseline može da bude operativno povezan sa kontrolnom sekvencom. Nadalje, vektor može dodatno da sadrži oridžin replikacije ili gen za selekcioni marker. Primeri vektora koji mogu da se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom su npr. plazmidi, kozmidi, fagi, virusi, itd.
[0053] Naredni aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na ćeliju-domaćina transformisanu molekulom nukleinske kiseline ili vektorom pronalaska. Transformacija može da bude urađena bilo kojom poznatom metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju-domaćina, uključujući na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije-domaćina virusom (ili vektorom) ili postupcima za transfekciju poznatim u stanju tehnike, kako je prikazano u U.S. Patentima br.4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Naročito, metode za uvođenje heterologih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznate u stanju tehnike i uključuju transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozome i direktnu mikroinjekciju DNK u jedra. Primeri ćelija-domaćina koje mogu da se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom su eukariotske ćelije hibridoma kao što su sisarske ćelije, npr. hrčka, zeca, pacova, svinje, miša ili druge životinjske ćelije; biljne ćelije i ćelije gljiva, npr. kukuruz, duvan, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; prokariotske ćelije kao što su E. coli; i druge ćelije korišćene u stanju tehnike za proizvodnju antitela. Naročito su sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju dobro poznate u stanju tehnike i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC), uključujući, ali bez ograničenja, ćelije ovarijuma Kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe-hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2), i brojne druge ćelijske linije.
[0054] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži kao aktivno sredstvo najmanje jedno antitelo ili fragment antitela pronalaska i farmaceutski prihvatljive nosače, diluente i/ili adjuvanse. Izraz "farmaceutska kompozicija", kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje ili kompoziciju koja je u stanju da izazove željeni terapijski efekat kada se pravilno primeni kod pacijenta (The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms, Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985). U skladu sa predmetnim pronalaskom, potencijal farmaceutske kompozicije pronalaska se zasniva na vezivanju najmanje jednog antitela ili fragmenta antitela za HER-3. Poželjno, ovo vezivanje vodi smanjenju HER-3-posredovane signalne transdukcije.
[0055] Osim toga, izraz "nosači", kada se ovde koristi, uključuje nosače, ekscipijense, ili stabilizatore koji su netoksični za njima izložene ćelije ili sisara pri upotrebljenim dozama i koncentracijama. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni, pH puferisani rastvor ili lipozom (mala vezikula koja se sastoji od različitih tipova lipida, fosfolipida i/ili surfaktanata koja je korisna za dostavu leka kod sisara). Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine kao što je serum albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećerne alkohole kao što je manitol ili sorbitol; protiv-jone koji formiraju soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što je TWEEN™, polietilen glikol (PEG), i PLURONICS™.
[0056] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, najmanje jedno antitelo ili fragment antitela pronalaska sadržano u farmaceutskoj kompoziciji je sojeno sa efektorom, kao što je kaliheamicin, Auristatin-PE, radioizotop ili toksično hemoterapijsko sredstvo kao što je geldanamicin i maitansin. Naročito, ovi konjugati antitela ili fragmenata antitela su korisni za ciljano delovanje na ćelije koje su za eliminaciju, npr. ćelije kancera, koje eksprimiraju HER-3.
[0057] Osim toga, povezivanje antitela ili fragmenata antitela pronalaska sa radioizotopima npr. obezbeđuje izvesne prednosti u lečenju tumora. Za razliku od hemoterapije i drugih oblika lečenja kancera, radioimunoterapija ili primena kombinacije radioizotop-antitelo ili kombinacije radioizotop-fragment antitela direktno ciljano deluje na ćelije kancera sa minimalnim oštećenjem normalnog, zdravog tkiva u okruženju. Ovim "čarobnim metkom", pacijent može da bude lečen mnogo manjim količinama radioizotopa neko u drugim oblicima lečenja koji su danas dostupni. Poželjni radioizotopi uključuju itrijum<90>(<90>Y), indijum<111>(<111>In),<131>I,<99>mTc, radioaktivno srebro111, radioaktivno srebro -199, i Bizmut213. Povezivanje radioizotopa sa antitelima ili fragmentima antitela pronalaska može npr, da bude izvedeno sa uobičajenim bifunkcionalnim helatima. Budući da je srebro monovalentno, za povezivanje radioaktivnog srebra -111 i radioaktivnog srebra -199, mogu se koristiti linkeri na bazi sumpora (Hazra et al., Cell Biophys.
24-25, 1-7 (1994)). Povezivanje srebrnih radioizotopa može da uključuje redukciju imunoglobulina askorbinskom kiselinom. Dalje, tiuksetan je MX-DTPA linker helator spojen sa ibritumomabom da se dobije ibritumomab tiuksetan (Zevalin) (Witzig, T.E, Cancer Chemother. Pharmacol. 48 Suppl 1, 91-5 (2001). Ibritumomab tiuksetan može da reaguje sa radioizotopima kao što je indijum<111>(<111>In) ili<90>Y da se dobije<111>In-ibritumomab tiuksetan i<90>Y-ibritumomab tiuksetan, redom.
[0058] Pored toga, antitelo ili fragment antitela pronalaska, naročito kada se koriste za lečenje kancera, mogu da budu konjugovani sa toksičnim hemoterapijskim lekovima kao što je kaliheamicin (Hamann et al., Bioconjug. Chem.13(1), 40-6 (2002), geldanamicin (Mandler et al., J. Natl. Cancer Inst., 92(19), 1549-51 (2000)) i maitansin, na primer, lek maitansinoid DM1 (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:8618-8623 (1996)). Različiti linkeri koji oslobađaju lekove u kiselim ili redukcionim uslovima ili nakon izlaganja specifičnim proteazama mogu biti korišćeni u ovoj tehnologiji. Prema predmetnom pronalasku, antitelo ili fragment antitela pronalaska mogu da budu konjugovani kao što je opisano u stanju tehnike.
[0059] Auristatin-PE, npr. je antimikrotubularno sredstvo koje predstavlja strukturnu modifikaciju peptidnog sastojka morskog mekušca bez školjke, dolastatina 10. Auristatin-PE ima i anti-tumorsko dejstvo i anti-tumorsko vaskularno dejstvo (Otani et al., Jpn. J. Cancer Res.91(8), 837-44 (2000)). Na primer, auristatin-PE inhibira ćelijski rast i indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa i apoptozu u ćelijskim linijama kancera pankreasa (Li et al., Int. J. Mol. Med.3(6), 647-53 (1999)). Prema tome, da bi se specifično ciljano delovalo na anti-tumorsku aktivnost i antitumorsku vaskularnu aktivnost auristatina-PE na određene tumore, auristatin-PE može da bude konjugovan sa antitelom ili fragmentom antitela pronalaska.
[0060] U jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija sadži najmanje jedno dodatno aktivno sredstavo. Primeri dodatnih aktivnih sredstava, koja mogu da se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom, su antitela ili inhibitori male molekulske težine drugih receptorskih protein kinaza, kao što su EGFR, HER-2, HER-4, IGFR-1, ili c-met, receptorski ligandi kao što je vaskularni endotelijalni faktor (VEGF), citotoksična sredstva, kao što je doksorubicin, cisplatin ili karboplatin, citokini ili antineoplatična sredstva. Mnoga antineoplastična sredstva su trenutno poznata u stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja, antineoplastično sredstvo je odabrano iz grupe terapijskih proteina uključujući, ali bez ograničenja, antitela ili imunomodulatorske proteine. U drugom primeru izvođenja antineoplastično sredstvo je odabrano iz grupe malih molekula inhibitora ili hemoterapijskih sredstava koja se sastoji od inhibitora mitoze, inhibitora kinaze, alkilirajućih sredstava, antimetabolita, interkalirajućih antibiotika, inhibitora faktora rasta, inhibitora ćelijskog ciklusa, enzima, inhibitora topoizomeraze, inhibitora histon deacetilaze, sredstava protiv preživljavanja, modifikatora biološkog odgovora, anti-hormona, npr. antiandrogena i anti-angiogeneznih sredstava. Kada je anti-neoplastično sredstvo radijacija, lečenje se može sprovoditi ili upotrebom unutrašnjeg (brahiterapija BT) ili spoljašnjeg (radioterapija spoljašnjim zrakom: EBRT) izvora.
[0061] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska je posebno pogodna za dijagnozu, prevenciju ili lečenje hiperproliferativne bolesti. Hiperproliferativna bolesti može da bude, npr, povezana sa povećanom signalnom transdukcijom HER familije. Naročito, bolest može da bude, npr, povezana sa povećanom fosforilacijom HER-3 i/ili povećanim obrazovanjem kompleksa između HER-3 i drugih članova HER familije i/ili povećanom aktivnošću PI3 kinaze i/ili povećanom aktivnošću c-jun terminalne kinaze i/ili aktivnošću AKT i/ili povećanom aktivnošću ERK2 i/ili aktivnošću PYK2. Poželjno, hiperproliferativna bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, gastrointestinalnog kancera, kancera pankreasa, kancera prostate, kancera ovarijuma, kancera želuca, endometrijalnog kancera, kancera pljuvačne žlezde, kancera pluća, kancera bubrega, kancera kolona, kolorektalnog kancera, kancera tiroidne žlezde, kancera bešike, glioma, melanoma ili drugih kancera koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-3, i tvorevine metastaza tumora.
[0062] U skladu sa predmetnim pronalaskom, izraz "prevencija ili lečenje", kada se ovde koristi, odnosi se i na terapijsko lečenje i na profilaktičke ili preventativne mere, gde je potrebno sprečiti ili usporiti (smanjiti) ciljano patološko stanje ili poremećaj kod pacijenta. Pacijenti kod kojih je potrebna prevencija ili lečenje uključuju one kod kojih već postoji poremećaj, kao i one sklone da imaju poremećaj ili one kod kojih poremećaj treba da bude sprečen. Pacijent kome je potrebna prevencija ili lečenje je sisarski pacijent, tj. bilo koja životinja svrstana u sisare, uključujući ljude, domaće i životinje sa farme, i zoološkog vrta, životinje koje se koriste u sportu, ili kućne ljubimce, kao što su psi, mačke, goveda, konji, ovce, svinje, koze, zečevi, itd. Poželjno, pacijent za potrebe lečenja je humani pacijent.
[0063] Prema predmetnom pronalasku, farmaceutska kompozicija pronalaska može da bude formulisana mešanjem aktivnog sredstva(sredstava) sa fiziološki prihvatljivim nosačima, diluentima i/ili adjuvansima, i po slobodnom izboru drugim sredstvima koja su uobičajeno sastavni deo formulacija da bi se obezbedio poboljšani prenos, dostava, podnošljivost, i slično. Farmaceutska kompozicija pronalaska može da bude formulisana npr. u obliku liofilizovanih formulacija, vodenih rastvora, disperzija ili čvrstih preparata, kao što su tablete, dražeje ili kapsule. Mnoštvo pogodnih formulacija može da se nađe u knjizi formulacija poznatoj svim farmaceutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), naročito poglavlje 87 autora Block, Lawrence, u knjizi. Ove formulacije uključuju, na primer, prahove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, prenosioce leka koji sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je Lipofectin™), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, ulje-u-vodi i voda-u-ulju emulzije, karbovaks emulzije (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polu-čvrste gelove, i polu-čvrste smeše koje sadrže karbovaks. Bilo koja od gore navedenih smeša može da bude odgovarajuća u lečenjima i terapijama u skladu sa predmetnim pronalaskom, pod uslovom da aktivno sredstvo u formulaciji nije inaktivisano formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i podnošljiva u odnosu na način primene. Videti takođe Baldrick P., "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.", Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2), 210-218 (2000); Wang W., "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.", Int. J. Pharm.203(1-2), 1-60 (2000); Charman W.N., "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.", J. Pharm. Sci. 89(8), 967-978 (2000); Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52, 238-311 (1998); i u njima navedene citate za dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipiensima i nosačima dobro poznate farmaceutskim hemičarima.
[0064] Naredni aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na upotebu najmanje jednog izolovanog antitela ili fragmenta antitela pronalaska, i po slobodnom izboru najmanje još jednog dodatnog aktivnog sredstva, npr. najmanje jednog anti-neoplastičnog sredstva kako je opisano u prethodnom tekstu, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, diluentima i/ili adjuvansima, za proizvodnju farmaceutske kompozicije za dijagnostikovanje, prevenciju ili lečenje hiperproliferativne bolesti. Poželjno, farmaceutska kompozicija je farmaceutska kompozicija kako je opisano u prethodnom tekstu i hiperproliferativna bolest je hiperproliferativna bolest kao što je gore opisano.
[0065] Još jedan aspekt predmetnog pronalaska se bavi upotrebom izolovanog antitela ili fragmenta antitela u postupku za dijagnostikovanje bolesti ili stanja povezanih sa ekspresijom HER-3, i obuhvata dovođenje u kontakt uzorka sa antitelom ili fragmentom antitela pronalaska pod uslovima odgovarajućim da se dozvoli vezivanje pomenutog antitela ili fragmenta antitela za HER-3, i detektovanje prisustva HER-3 u uzorku. Uzorak može biti ćelija koja ispoljava ekspresiju HER-3, kao što je tumorska ćelija, uzorak krvi, ili drugi odgovarajući uzorak. U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, bolesti i stanja povezana sa ekspresijom HER-3 su gore definisane hiperproliferativne bolesti.
[0066] U skladu sa predmetnim pronalaskom, postupak može, npr, da se koristi za detekciju HER-3 antigena u ćeliji, za određivanje koncentracije HER-3 antigena kod pacijenata koji pate od hiperproliferativne bolesti kao što je pomenuto u prethodnom tekstu, ili za određivanje stadijuma pomenute hiperproliferativne bolesti kod pacijenta. U cilju određivanja stadijuma progresije hiperproliferativne bolesti kod subjekta u studiji, ili za karakterisanje odgovora ispitanika na tok terapije, uzorci krvi mogu, npr, da budu uzeti od ispitanika i koncentracija HER-3 antigena prisutna u uzorku može da bude određena. Tako dobijena koncentracija se koristi za utvrđivanje kom opsegu koncentracija nađena vrednost pripada. Tako definisani opseg je u korelaciji sa stadijumom progresije ili stadijumom terapije identifikovanim kod različitih populacija diagnostikovanih ispitanika, pružajući na taj način podatke o stadijumu kod ispitanika u studiji. Biopsijom obolelog tkiva, npr. kancera, tkivo dobijeno od pacijenta može da se upotrebi za procenu količine prisutnog HER-3 antigena. Količina HER-3 antigena prisutna u obolelom tkivu može da se proceni imunohistohemijski, primenom ELISA testa ili testa sa nizom antitela korišćenjem HER3 antitela pronalaska. Ostali parametri koji imaju dijagnostički značaj su stanje dimerizacije kao i dimerizacioni partneri HER3 proteina i stanje aktivacije njega i njegovih partnera. Proteinske analitičke metode za određivanje tih parametara su dobro poznate u stanju tehnike, među njima, „western blot“ i imunoprecipitacione tehnike, FACS analiza, hemijsko unakrsno vezivanje, bioluminiscentno rezonantni energetski transfer (BRET), fluorescentno rezonantni energetski transfer (FRET), i slično (npr. Price et al., Methods in Molecular Biology, 218: 255-268 (2002) ili „eTag“ tehnologija (WO0503707, WO04091384, WO04011900).
[0067] U nastavku, predmetni pronalazak se odnosi u narednom aspektu na izolovano antitelo ili fragment antitela za upotrebu u postupku za prevenciju ili lečenje bolesti ili stanja povezanih sa eksprimiranjem HER-3 kod pacijenta, gde postupak obuhvata primenu na pacijenta za potrebe lečenja efikasne količine najmanje jednog antitela ili fragmenta antitela pronalaska. Poželjno, bolesti ili stanja povezana sa eksprimiranjem HER-3 su hiperproliferativne bolesti definisane u prethodnom tekstu. Pacijent kome je potrebna prevencija ili lečenje je sisarski pacijent, tj. bilo koja životinja svrstana u sisare, uključujući ljude, domaće i životinje sa farme, i zoološkog vrta, životinje koje se koriste u sportu, ili kućne ljubimce, kao što su psi, mačke, goveda, konji, ovce, svinje, koze, zečevi, itd. Poželjno, pacijent za potrebe lečenja je humani pacijent.
[0068] U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, postupak za prevenciju ili lečenje hiperproliferativne bolesti kod pacijenta kome je ono potrebno obuhvata primenu na pacijenta efikasne količine najmanje jednog antitela ili fragmenta antitela pronalaska i pored toga najmanje jednog dodatnog aktivnog sredstva, npr., najmanje jednog antineoplastičnog sredstva kao što je gore pomenuto. Poželjno, u pitanju je postupak za inhibiciju abnormalnog ćelijskog rasta, migracije ili invazije.
[0069] Osim klasičnog načina primene potencijalno terapijskih antitela ili fragmenta antitela, npr. putem gore pomenutih formulacija, novo razvijeni načini primene mogu takođe da budu korisni u skladu sa predmetnim pronalaskom. Na primer, prijavljena je lokalna primena 131I-obeleženog monoklonskog antitela za lečenje primarnih tumora mozga nakon hirurške intervencije. Dodatno, direktna stereotaktička intracerebralna injekcija monoklonskih antitela i njihovih fragmenata se takođe prati u kliničkim i predkliničkim studijama. Intrakarotidna hiperosmolarna perfuzija je eksperimentalna strategija za ciljano delovanje kod primarnog maligniteta mozga humanim monoklonskim antitelima konjugovanim sa lekom.
[0070] U zavisnosti od tipa i ozbiljnosti stanja koje treba da se leči, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg najmanje jednog antitela ili fragmenta antitela pronalaska može da se primeni na pacijenta za potrebe lečenja, npr. u jednoj ili više odvojenih primena ili kontinuiranom infuzijom. Uobičajena dnevna doza može da bude u okviru od oko 1 µg/kg do oko 100 mg/kg ili više, zavisno od gore pomenutih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, zavisno od stanja koje treba da se leči, lečenje se nastavlja do postizanja željene supresije simptoma bolesti.
[0071] Doza najmanje jednog primenjenog antineoplastičnog sredstva zavisi od različitih faktora. To su, na primer, priroda sredstva, tip tumora ili put primene. Treba istaći da predmetni pronalazak nije ograničen na bilo koju dozu.
[0072] Konačno, predmetni pronalazak se odnosi u sledećim aspektima na kit za dijagnostikovanje, prevenciju ili lečenje hiperproliferativnih bolesti povezanih sa HER-3 posredovanom signalnom transdukcijom, koji sadrži najmanje jedno antitelo ili fragment antitela i/ili molekul nukleinske kiseline i/ili vektor pronalaska. Dodatno, kit pronalaska može dalje da sadrži najmanje jedno dodatno aktivno sredstvo, npr. najmanje jedno dodatno antineoplastično sredstvo kao što je gore pomenuto.
[0073] Dalje, predmetni pronalazak će biti objašnjen sledećim Primerima i pratećim slikama.
PRIMERI
[0074] Primeri koji slede, uključujući izvedene eksperimente i dobijene rezultate, obezbeđeni su samo u svrhu ilustracije i nisu ograničavajući za predmetni pronalazak.
PRIMER 1: HER-3 antigen i priprema ćelijske linije
[0075] U predmetnoj studiji, pripremljeni su rekombinantni HER-3 proteini. cDNK vanćelijskog domena HER-3 (ECD) je klonirana pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) iz pcDNA3-HER-3 (ekspresioni vektor sa celom dužinom humanog HER-3, C.Wallasch et al., EMBO J. 14, 4267-4275) sa prajmerima koji se zasnivaju na sekvenci HER-3 (Genebank Pristupni br. NM_001982).
[0076] Prajmeri korišćeni za amplifikaciju HER-3 su bili sledeći:
Direktni prajmer: 5’-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3’ (SEQ ID NO: 233)
Reverzni prajmer: 5’-GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAA CAGTCTTG-3’ (SEQ ID NO: 234)
[0077] Proizvod PCR reakcije je bio podvrgnut digestiji sa BamH1 i Xbal i ubačen ligacijom u pcDNA3 (Invitrogen) digestiran sa BamH1 i Xbal. Plazmidi su transfekovani u HEK293 ćelije korišćenjem postupka sa kalcijum fosfatom. Fuzioni protein HER-3-HIS je prečišćen iz prikupljenog kondicioniranog medijuma primenom Ni-NTA afinitetne hromatografije.
[0078] RatI HER-3 ćelije su proizvedene putem retroviralnog transfera gena. Ukratko, GP+E 86 ćelije (3x10<5>) su zasejane na disk za kulturu promera 60 mm i transfekovane sa 2 µg/ml plXSN vektora ili cDNK plXSN-HER-3 (C. Wallasch, PhD Thesis, Max-Planck Insitute of Biochemistry, Martinsried, Germany) korišćenjem postupka sa kalcijum fosfatom. Nakon 24 časa medijum je zamenjen svežim medijumom i GP+E 86 ćelije su inkubirane 4-8 časova. Subkonfluentne Rat1 ćelije (2x10<5>ćelija po posudi prečnika 6 cm) su zatim inkubirane sa supernatantima GP+E 86 ćelija koje oslobađaju visoki titar pLXSN ili pLXSN-HER-3, p virusa (>1 X 106 G418 c.f.u./ml; m.o.i. od 10) u vremenu od 4-12 časova u prisustvu Polibrena (4 mg/ml; Aldrich). Nakon promene medijuma, započeta je selekcija RatI ćelija sa G418. Obično, stabilni klonovi su odabirani nakon selekcije u trajanju od 21 dan.
PRIMER 2: HER-3 ekspresija u ćelijskim linijama humanog kancera
[0079] Receptorske tirozin kinaze, na primer HER-3, imaju ključnu ulogu u otpočinjanju i napredovanju hiperproliferativih bolesti kao što je prelazak iz benignog hiperplastičnog ćelijskog rasta u maligni karcinom. Kako se HER-3 ekspresija razlikuje između tumorskih ćelija i normalnog tkiva, analiza HER-3 ekspresije je kritični faktor za identifikovanje podgrupa pacijenata koji bi imali koristi od lečenja antitelima ili fragmentima antitela pronalaska. Stoga, HER-3 ekspresija je kvantifikovana u panelu ćelijskih linija humanog kancera da bi se razjasnila uloga HER-3 u obrazovanju humanog kancera. Ćelijske linije kancera su uzgajane kao što je preporučeno od strane ATCC. Detaljno, 10<5>ćelija je prikupljeno sa 10 mM EDTA u PBS-u, isprano jednom FACS puferom (PBS, 3 % FCS, 0.4 % azid) i zasejano na ploču sa 96 bunarčića okruglog dna. Ćelije su centrifugirane u vremenu od 3 minuta pri brzini od 1000 rpm da bi se uklonio supernatant, a zatim resuspendovane sa α-HER-3 antitelom 2D1D12 (WO03013602) (3 µg/ml). Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu 1 čas, isprane dvaput FACS puferom i resuspendovane sa sekundarnim antitelom (100 µl/bunarčiću), magarećim-anti-humanim-PE (Jackson) razblaženim u odnosu 1:50 u FACS puferu. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu i u mraku tokom 30 minuta, isprane dva puta FACS puferom i analizirane (FACS, Beckman Coulter). Slika 1 prikazuje reprezentativne rezultate analize i pokazuje da se HER-3 eksprimira kod različitih humanih kancera.
PRIMER 3: Imunizacija i titriranje
[0080] HER-3 ECD protein, koji je pripremljen kao što je opisano u Primeru 1 i C32 ćelije (Humani melanom; ATCC #CRL-1585) su korišćene kao antigen. Monoklonska antitela protiv HER-3 su razvijena sekvencijalnom imunizacijom XenoMouse® miševa (XenoMouse® sojevi: XMG1 i XMG4, Abgenix, Inc. Fremont, CA). XenoMouse® životinje su imunizovane preko donjeg dela šape za sve injekcije. Ukupna zapremina svake injekcije je bila 50 µl po mišu, 25 µl po donjem delu šape.
[0081] Za kohortu #1 (10 XMG1 miševa), inicijalna imunizacija je bila sa 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD® (Sigma, Oakville, ON) po mišu. Sledećih pet buster doza su bile izvedene sa 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa 100 µg aluminijum gela (Sigma, Oakville, ON) u D-PBS-u bez pirogena. Šesta buster doza se sastojala od 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD®. Sedma injekcija se sastojala od 10 µg HER-3 ECD proteina pomešanog u odnosu 1:1 zapr./zapr. sa 100 µg aluminijum gela. Poslednja buster doza je napravljena sa 10 µg HER-3 ECD proteina u DPBS-u bez pirogena, bez adjuvansa. XenoMouse® miševi su imunizovani 0, 4, 7, 11, 15, 20, 24, i 29. dana u okviru ovog protokola i fuzije su izvedene 33. dana. Dva vađenja krvi su urađena primenom RetroEP Orbital Bleed postupka 13. dana nakon četvrte buster doze, 19. dana nakon šeste buster doze. Nije bilo kohorte #2.
[0082] Za kohortu #3 (10 XMG1 miševa) i kohortu #4 (10 XMG4 miševa), prva injekcija je bila sa 107 C32 ćelija u Dulbecco’s PBS-u (DPBS) bez pirogena pomešanom u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD®, po mišu. Sledeće četiri buster doze su bile sa 10<7>C32 ćelija u DPBS-u, bez pirogena, pomešanom sa 25 µg Adju-Fos i 10 µg CpG po mišu. Šesta buster doza je bila sa 107 C32 ćelija u DPBS-u bez pirogena, pomešanom u odnosu 1:1 (zapr./zapr.) sa TITERMAX GOLD®, po mišu. Sedma, osma i deveta buster doza su bile sa 10<7>C32 ćelija u DPBS-u bez pirogena, pomešanom sa 25 µg Adju-Fos i 10 µg CpG, po mišu. Od desete do četranaeste, buster doze su bile 5 µg HER-3 ECD proteina u DPBS-u bez pirogena, pomešanom sa 25 µg Adju-Fos i 10 µg CpG, po mišu. Poslednja buster doza se sastojala od 5 µg HER-3 ECD proteina u DPBS-u bez pirogena, bez adjuvansa. I kohorta #3 i #4, XenoMouse® miševa su imunizovane 0, 3, 7, 11, 14, 17, 21, 24, 28, 33, 35, 38, 42. i 45. dana prema ovom protokolu i fuzije su izvedene 49. dana. Tri krvarenja su urađena prema Retro-Orbital Bleed proceduri 12. dana nakon četvrte buster doze, 19. dana nakon šeste buster doze i 40. dana nakon dvanaeste buster doze.
Selekcija životinja za prikupljanje antitela prema titru
[0083] Za kohortu #1, titar anti-HER-3 antitela u serumu imunizovanih XenoMouse® miševa je određen primenom ELISA testa protiv HER-3 ECD proteina. Specifični titar za svaku XenoMouse® životinju je određen iz optičke gustine na 650 nm i prikazan u tabeli 1 u nastavku teksta. Vrednost titra je recipročna najvećem razblaženju seruma sa očitanom OD vrednošću dvostrukom u odnosu na pozadinski šum. Dakle, što je veća brojčana vrednost, veći je bio humoralni imunski odgovor na HER-3 ECD.
TABELA 1
[0084] Za kohorte #3 i #4, titar anti-HER-3 antitela u serumu imunizovanih XenoMouse® miševa je određen primenom FACS metode, korišćenjem Rat1/HER-3 ćelija (antigen pozitivna ćelijska linija) i Rat1/pLSXN ćelija (antigen negativna ćelijska linija). Podaci su prikazani kao geometrijska sredina (GeoMean) fluorescentnog intenziteta ćelijskog anti-HER-3 bojenja ćelija serijskim razblaženjima uzoraka seruma.
TABELA 2
TABELA 3
PRIMER 4: Ponovno dobijanje limfocta, izolovanja B-ćelija, fuzije i stvaranje hibridoma
[0085] Imunizovani miševi su žrtvovani i limfni čvorovi su sakupljeni i objedinjeni iz svake kohorte posebno. Limfoidne ćelije su razdvojene mlevenjem u DMEM-u da bi se ćelije oslobodile iz tkiva i ćelije su suspendovane u DMEM-u. Ćelije su izbrojane, i 0.9 ml DMEM na 100 milliona limfocita je dodato ćelijskom talogu da bi ćelije bile pažljivo, ali u potpunosti resuspendovane. Korišćenjem 100 µl CD90+ magnetnih perli na 100 milliona ćelija, ćelije su obeležene inkubacijom ćelija sa magnetnim perlama na temperaturi od 4°C tokom 15 minuta. Magnetno-obeležena ćelijska suspenzija koja sadrži do 10<8>pozitivnih ćelija (ili do 2x10<9>ćelija ukupno) je naneta na LS+ kolonu i kolona je isprana DMEM-om. Ukupni efluent je sakupljen kao CD90-negativna frakcija (očekivano je da su većina ovih ćelija B ćelije).
[0086] Fuzija je izvedena mešanjem ispranih obogaćenih B ćelija dobijenih kao u prethodnom tekstu i ćelija P3X63Ag8.653 nesekretornog mijeloma nabavljenih iz ATCC (Kat. br. CRL 1580) (Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) u odnosu 1:1. Smeša ćelija je pažljivo istaložena centrifugiranjem na 800 g. Nakon potpunog uklanjanja supernatanta, ćelije su tretirane sa 2 do 4 ml rastvora pronaze (CalBiochem, Kat. br. 53702; 0.5 mg/ml u PBS-u) tokom ne više od 2 minuta. Zatim je 3 do 5 ml FBS-a dodato da bi se zaustavila aktivnost enzima i suspenzija je dopunjena do 40 ml ukupne zapremine korišćenjem rastvora za elektrofuziju ćelija, ECFS (0.3 M saharoza, Sigma, Kat. br. S7903, 0.1 mM magnezijum acetat, Sigma, Kat. br. M2545, 0.1 mM kalcijum acetat, Sigma, Kat. br. C4705). Supernatant je uklonjen nakon centrifugiranja i ćelije su resuspendovane u 40 ml ECFS-a. Ovaj korak ispiranja je ponovljen i ćelije su ponovo resuspendovane u ECFS-u do koncentracije od 2x106 ćelija/ml.
[0087] Elektrofuzija ćelija je izvedena korišćenjem fuzionog generatora, model ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. Veličina upotrebljene fuzione komore je bila 2.0 ml, primenom sledećih podešavanja instrumenta: Uslov poravnanja:
napon: 50 V, vreme: 50 sec; pucanje membrane na: naponu: 3000 V, vreme: 30 µsec; vreme zadržavanja posle fuzije: 3 sec.
[0088] Nakon ECF, ćelijske suspenzije su pažljivo uklonjene iz fuzione komore pod sterilnim uslovima i prenete u sterilnu epruvetu koja sadrži istu zapreminu medijuma Hybridoma Culture Medium (DMEM (JRH Biosciences), 15 % FBS (Hyclone), obogaćenog L-glutaminom, pen/strep, OPI (oksaloacetat, piruvat, goveđi insulin) (sve Sigma) i IL-6 (Boehringer Mannheim). Ćelije su inkubirane tokom 15 do 30 minuta na temperaturi od 37°C, a zatim centrifugirane na 400 g tokom pet minuta. Ćelije su pažljivo resuspendovane u maloj zapremini medijuma Hybridoma Selection Medium (Hybridoma Culture Medium obogaćen sa 0.5x HA (Sigma, Kat. br. A9666)), i zapremina je podešena na odgovarajući način sa još medijuma „Hybridoma Selection Medium“, na osnovu konačnog zasejavanja 5x10<6>B ćelija ukupno po ploči sa 96 bunarčića i 200 µl po bunarčiću. Ćelije su pažljivo izmešane i pipetirane u ploče sa 96 bunarčića i ostavljene da rastu. Polovina medijuma je uklonjena 7. ili 10. dana, i ćelije su ponovo nahranjene medijumom „Hybridoma Selection Medium“.
PRIMER 5: Selekcija antitela-kandidata primenom ELISA testa
[0089] Nakon 14 dana kultivacije, primarni skrining supernatanta hibridoma iz kohorte #1 (miševi u kohorti jedan su proizvoljno podeljeni na fuziju #1 i #2) za HER-3-specifična antitela je izveden primenom ELISA testa korišćenjem prečišćenog, histidinom obeleženog HER-3 ECD i protiv-skrining protiv irelevantnog proteina obeleženog histidinom primenom ELISA testa, korišćenjem kozjeg anti-huIgGFc-HRP (Caltag Inc., Kat. br. H10507, korišćena koncentracija je bila razblaženje 1:2000) da bi se detektovao humani IgG koji se vezuje za HER-3 ECD imobilisan na ELISA-pločama. Supernatanti stare kulture iz bunarčića sa pozitivnim rastom ćelija hibridoma na osnovu primarng skrininga su uklonjeni i HER-3 pozitivne ćelije hibridoma su suspendovane sa svežim medijumom za kulture hibridoma i prenete u ploče sa 24 bunarčića. Nakon 2 dana u kulturi, ovi supernatanti su bili spremni za drugostepeni konfirmacioni skrining. U drugostepenom konfirmacionom skriningu za potpuno humana IgGk antitela specifična za HER-3, supernatanti pozitivni u prvom skriningu su podvrgnuti skriningu primenom ELISA testa sa dva seta antitela za detekciju: kozje anti-huIgGFc-HRP (Caltag Inc., Kat. br. H10507, korišćena koncentracija je bila razblaženje 1:2000) za detekciju humanog gama lanca i kozje antihlg kappa-HRP (Southern Biotechnology, Kat. br. 2060-05) za detekciju humanog kapa lakog lanca. Nađeno je 91 potpuno humano IgG/kapa HER-3 specifično monoklonsko antitelo koje je dobijeno iz kohorte #1.
PRIMER 6: Selekcija antitela-kandidata pomoću FMAT/FACS
[0090] Nakon 14 dana kultivacije, supernatanti kulture hibridoma iz kohorte #3 i #4 (fuzija #3 i #4) su podvrgnuti skriningu na HER-3-specifična monoklonska antitela pomoću FMAT. U primarnom skriningu, supernatanti kulture hibridoma u finalnom razblaženju 1:10 su inkubirani sa Rat1-Her3 ćelijama koje eksprimiraju humani HER-3 i 400 ng/ml Cy5-konjugovanog kozjeg F(ab’)2 anti-humanog IgG, antitela specifičnog za Fc fragment (Jackson ImmunoResearch, Kat. br. 109-176-098) na sobnoj temperaturi tokom 6 časova. Vezivanje antitela i kompleksa antitela za detekciju sa ćelijama je mereno primenom FMAT (Applied Biosystems). Nespecifično vezivanje antitela za ćelije je određeno preko njihovog vezivanja za parentalne Rat1 ćelije. Ukupno 420 hibridoma koji proizvode HER-3-specifična antitela je selektovano iz primarnog skrininga fuzije #3. Supernatanti iz ovih umnoženih kultura su ispitani ponovo korišćenjem istog FMAT protokola i za 262 od njih je potvrđeno da se specifično vezuju za ćelije koje eksprimiraju HER-3. Ukupno 193 hibridoma koji proizvode HER-3 specifična antitela je odabrano iz primarnog skrininga fuzije #4. Supernatanti iz ovih umnoženih kultura su ispitivani pomoću FACS metode i za 138 od njih je potvrđeno da se specifično vezuju za ćelije koje eksprimiraju HER-3. U konfirmacionom testu urađenom primenom FACS metode, Rat1-Xher3 ćelije i parentalne Rat1 ćelije (kao negativna kontrola) su inkubirane sa supernatantantima hibridoma razblaženim u odnosu 1:2 tokom 1 časa na temperaturi od 40C u PBS-u koji sadrži 2%-tni FBS. Nakon ispiranja PBS-om, vezivanje antitela za ćelije je detektovano pomoću 2.5 µg/ml Cy5-konjugovanog kozjeg F(ab’)2 anti-humanog IgG, antitela specifičnog za Fc fragment (JIR#109-176-098) i 5 µg/ml PE-konjugovanog kozjeg F(ab’)2 anti-humanog antitela specifičnog za kapa lanac (SB# 2063-09). Nakon uklanjanja nevezanih antitela ispiranjem PBS-om, ćelije su fiksirane citofiksom (BD# 51-2090KZ) u razblaženju 1:4 i analizirane pomoću FACSCalibur aparata.
PRIMER 7: Selekcija hibridoma za kloniranje
[0091] Antitela iz kohorti 1 i 2 su selektovana za kloniranje hibridoma na osnovu specifičnosti prema HER-3 u odnosu na HER1 (EGFR), HER-2 i HER-4 pomoću ELISA testa korišćenjem prečišćenih rekombinantnih vanćelijskih domena dostupnih kod, na primer R&D Biosystems, i analiza zasnovanih na FACS metodi ćelijskih linija humanog tumora koje eksprimiraju druge članove HER familije, i a > 5-ostrukog porasta srednje vrednosti intenziteta fluorescencije pri FACS bojenju za HER-3 pozitivne ćelije u odnosu na pozadinski šum. Na osnovu ovog kriterijuma, ukupno 23 linije hibridoma su selektovane za kloniranje zasejavanjem ćelija postupkom graničnog razblaženja.
[0092] Antitela iz kohorti 3 i 4 su selektovana za kloniranje hibridoma na osnovu specifičnosti prema HER-3 u odnosu na HER-1 (EGFR), HER-2 i HER-4 i još tri dodatna kriterijuma. Prvi kriterijum je bio skrining ELISA testom na antitela sa epitopima koji su sadržani unutar L2 domena HER-3 (videti Primer "Strukturna analiza anti-HER-3 antitela u Pronalasku).
[0093] Drugi kriterijum je bio neutralizacija vezivanja biotinilovanog heregulina-alfa za ćelije koje eksprimiraju HER-3 u testu zasnovanom na FACS. SKBR-3 ćelije su sakupljene, isprane medijumom za kultivaciju, istaložene centrifugiranjem i resuspendovane u medijumu za kultivaciju. Alikvoti resuspendovanih ćelija su preneti u ploče sa 96 bunarčića. Ploče su centrifugirane da bi se istaložile ćelije. Test-antitela u prikupljenim supernatantima hibridoma su dodata u količini od 25µl/bunarčiću i inkubirana tokom 1 časa na ledu da se dozvoli vezivanje antitela. Pedeset µl 10 nM rastvora heregulina-alfa (R&D Biosystems, Minneapolis, MN) je dodato u svaki bunarčić do finalne koncentracije od 5 nM i inkubirano na ledu tokom 1,5 časova. Ćelije su isprane sa 150 µl PBS-a, istaložene centrifugiranjem i supernatant je uklonjen. Ćelije su resuspendovane u 50 µl kozjeg anti-HRG-alfa poliklonskog antitela u koncentraciji od 10 µg/ml i inkubirane tokom 45 minuta na ledu. Ćelije su isprane sa 200 µl PBS-a, istaložene centrifugiranjem i supernatant je uklonjen. Pedeset µl rastvora zečjeg Cy5-obeleženog antikozjeg poliklonskog antitela u koncentraciji od 5 µg/ml i 7AAD u koncentraciji od 10 µg/ml je dodato i inkubirano na ledu tokom 15 minuta. Ćelije su isprane sa 200 µl PBS-a, istaložene centrifugiranjem i supernatant je uklonjen. Ćelije su resuspendovane u 100 µl FACS pufera i očitane u FACS aparatu. Ispitivana HER-3 antitela koja su smanjila vezivanje heregulina-alfa su bila ona koja su imala najniži intenzitet fluorescencije. Kao pozitivne kontrole korišćena su serijska razblaženja sa korakom od 1:5 od 10.000 ng/ml do 16 ng/ml mišjeg HER-3 mAb (105.5) ili humanog IgG1 HER-3 mAb, U1-49. Negativne kontrole su bile sam heregulin-alfa, same ćelije, samo kozje anti-heregulin-alfa poliklonsko antitelo i samo zečje Cy5-obeleženo anti-kozje poliklonsko antitelo.
[0094] Treći kriterijum je bio relativno rangiranje prema afinitetu i/ili viša relativna srednja vrednost intenziteta fluorescencije u FACS testu korišćenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju HER-3. Relativno rangiranje prema afinitetu je izvedeno normalizovanjem koncentracija HER-3-specifičnnog antitela i njihovim postavljanjem na grafikon nasuprot podataka iz ELISA testa sa ograničavajućim antigenom kao što sledi u tekstu.
Normalizovanje koncentracija antigen-specifičnog antitela korišćenjem visoko-antigenog ELISA testa
[0095] Korišćenjem ELISA metode, normalizovane su koncentracije antigen-specifičnog antitela u supernatantima. Upotrebom dva anti-HER-3 humana IgG1 antitela iz kohorte 1, poznate koncentracije titrirane paralelno, konstruisana je standardna kriva i količina antigen-specifičnog antitela u supernatantima ispitivanog hibridoma iz kohorti 3 i 4 je upoređena sa standardom. Na ovaj način je procenjena koncentracija humanog HER3 IgG antitela u svakoj kulturi hibridoma.
[0096] Neutravidin ploče su napravljene oblaganjem neutravidinom u koncentraciji od 8 µg/ml u 1XPBS/0.05% natrijum azidu, Costar 3368 medijum-vezujućih ploča sa 50 µl/bunarčiću, inkubacijom preko noći na temperaturi od 4°C. Sledećeg dana, ploče su blokirane sa 1XPBS/1% obranog mleka. Fotobiotinilovani HER-3 ECD obeležen His-tag sekvencom koncentracije 500 ng/ml u 1XPBS/1% obranom mleku je vezan za ploče obeležene neutravidinom inkubacijom u toku 1 časa na sobnoj temperaturi. Supernatant hibridoma, serijski razblažen u onosu 1:2.5, od početnog razblaženja od 1:31 do finalnog razblaženja od 1:7568 u 1XPBS/1% obranom mleku/0.05% azidu, je dodat u količini od 50 µl/bunarčiću, i zatim inkubiran 20 časova na sobnoj temperaturi. Serijska razblaženja su korišćena da bi se osiguralo dobijanje OD očitavanja za svaku nepoznatu u linearnom opsegu testa. Zatim, sekundarno antitelo za detekciju, kozji anti humani IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml u 1XPBX/1% obranom mleku je dodato u količini od 50 µl/bunarčiću. Nakon 1 časa na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane 5 puta vodom i 50µL jednokomponentnog TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić. Reakcija je zaustavljena nakon 30 minuta dodavanjem 50 µl 1M hlorovodonične kiseline u svaki bunarčić i ploče su očitane na talasnoj dužini od 450nm. Konstruisana je standardna kriva za dva IgG1 HER-3 mAb antitela iz kohorte 1, serijski razblažena u odnosu 1:2, od 1000 ng/ml do 0.06 ng/ml i ispitana ELISA testom korišćenjem protokola opisanog u prethodnom tekstu. Za svaku nepoznatu, OD očitavanja u linearnom opsegu testa su korišćena za procenu koncentracije humanog HER-3 IgG u svakom uzorku.
[0097] Analiza sa ograničenim antigenom je postupak koji rangira afinitet antigen-specifičnih antitela pripremljenih u supernatantima kultura B-ćelija u odnosu na sva druga antigen-specifična antitela. U prisustvu veoma tankog sloja antigena, samo antitela sa najvišim afinitetom bi trebalo da mogu da se vežu na bilo kom detektabilnom nivou u ravnotežnom stanju (Videti, npr, PCT objavu WO/03048730A2 pod naslovom "IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING" objavljenu 12. juna 2003). U ovom slučaju su korišćena, kao reperi u testu, dva mAb iz kohorte 1 poznate koncentracije i poznate KD vrednosti.
[0098] Neutravidin ploče su napravljene oblaganjem neutravidinom u koncentraciji od 8 µg/ml u 1XPBS/0.05% natrijum azidu, Costar 3368 medium-vezujućih ploča sa 50 µl/bunarčiću inkubacijom preko noći na temperaturi od 4°C. Sledećeg dana, ploče su blokirane sa 1XPBS/1% obranog mleka. Biotinilovani HER-3 ECD obeležen His-tag sekvencom (50 µl/bunarčiću) je vezan za neutravidin ploče sa 96 bunarčića u pet koncentracija: 125, 62.5, 31.2, 15.6 i 7.8 ng/ml u 1XPBS/1% obranom mleku tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Svaka ploča je isprana 5 puta vodom. Supernatanti hibridoma razblaženi u odnosu 1:31 u 1XPBS/1% obranom mleku/0.05% azidu su dodati u količini od 50 ul/bunarčiću. Nakon 20 časova inkubacije na sobnoj temperaturi na šejkeru, ploče su ponovo isprane 5 puta destilovanom vodom. Zatim, sekundarno antitelo za detekciju, kozji anti humani IgG Fc HRP (Peroksidaza rena) u koncentraciji od 400 ng/ml u 1XPBX/1% obranom mleku je dodato u količini od 50 µl/bunarčiću. Nakon 1 časa na sobnoj temperaturi, ploče su ponovo isprane 5 puta destilovanom vodom i 50µL jednokomponentnog TMB supstrata je dodato u svaki bunarčić. Reakcija je zaustavljena nakon 30 minuta dodavanjem 50 µl 1M hlorovodonične kiseline u svaki bunarčić i ploče su očitane na talasnoj dužini od 450nm. OD očitavanja koncentracije antigena koja su dala OD vrednosti u linearnom opsegu su korišćena za analizu podataka.
[0099] Postavljanje na grafik podataka za antigen prisutan u velikoj količini, koji daju relativnu procenu koncentracije specifičnog antitela (videti prethodni tekst za detalje), naspram OD za ograničeni antigen, grafički je prikazalo antitela relativno višeg afiniteta, npr, ona koja su vezana imala višu OD vrednost u testu sa ograničenim antigenom, dok su imala manje količine IgG HER-3 antitela u supernatantu.
[0100] Hibridomi iz kohorti 3 i 4 za 33 antitela koja su dala najbolje rezultate u ovim setovima testova su prosleđena na kloniranje zasejavanjem hibridoma postupkom graničnog razblaženja.
[0101] Alternativno, FACS analiza HER-3 ekspresije u Ratl/pLXSN i RatI/HER-3 ćelijama je pokazala slične rezultate (nema ukrštene reaktivnosti sa endogenim epitopima pacova) (slika 2).
[0102] Detaljno, 1x105 ćelija je sakupljeno korišćenjem 10 mM EDTA u PBS-u, isprano jednom FACS puferom (PBS, 3 % FCS, 0.4 % azid) i zasejano na ploču sa 96 bunarčića okruglog dna. Ćelije su centrifugirane tokom 3 minuta na 1000 rpm da bi se uklonio supernatant i zatim resuspendovane sa specifičnim antitelima HER-familije (3 µg/ml). Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu tokom 45 minuta, isprane dva puta FACS puferom i resuspendovane sa sekundarnim antitelom (100 µl/bunarčiću) magarećim-antihumanim-PE (Jackson Immunoresearch, PA) razblaženim u odnosu 1:50 u FACS puferu. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu i u mraku tokom 30 minuta, isprane dva puta FACS puferom i analizirane (FACS, Beckman Coulter).
PRIMER 8: Strukturna analiza anti-HER-3 antitela
[0103] U narednoj diskusiji, obezbeđene su informacije o strukturi koje se odnose na antitela pripremljena u skladu sa pronalaskom. Predmet pronalaska su antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima, naročito antitelo U1-59. Dodatna antitela su obezbeđena samo kao primeri za poređenje. U cilju analiziranja struktura antitela proizvedenih u skladu sa predmetnim pronalaskom, umnoženi su geni koji kodiraju fragmente teškog i lakog lanca određenog hibridoma. Sekvenciranje je urađeno kao u nastavku teksta:
Transkripti VH i VL su umnoženi iz pojedinačnih klonova hibridoma na ploči sa 96 bunarčića korišćenjem lančane reakcije polimeraze kojoj prethodi reverzna transkripcija (RT-PCR). Poly(A)+-iRNK je izolovana iz približno 2x10<5>hibridoma ćelija korišćenjem Fast-Track kita (Invitrogen). Četiri PCR reakcije su izvedene za svaki od hibridoma: dve za laki lanac (kapa (κ), i dve za gama teški lanac (y). Za umnožavanje je korišćen QIAGEN OneStep room temperature-PCR kit (Qiagen, Catalog No.210212). U povezanim PCR reakcijama na sobnoj temperaturi, cDNK su sintetisane uz pomoć mešavine enzima koji deluju na sobnoj temperaturi (Omniscript i Sensiscript) korišćenjem specifičnog prajmera za antisens sekvencu koji je odgovarao C-κ, ili konsenzus sekvenci CH1 regiona C-y gena. Reverzna transkripcija je izvedena na temperaturi od 50°C tokom 1 časa što je praćeno PCR amplifikacijom cDNK pomoću HotStarTaq DNK polimeraze za visoku specifičnost i osetljivost. U svakoj PCR reakciji korišćena je smeša 5’-sens prajmera; sekvence prajmera su bile zasnovane na lider sekvencama VH i VK dostupnim na Vbase vebsajtu (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
[0104] PCR reakcije su izvedene na temperaturi od 94°C tokom 15 minuta, inicijalno na povišenoj temperaturi, praćeno sa 40 ciklusa na temperaturi od 94°C tokom 30 sekundi (denaturacija), temperaturi od 60°C tokom 30 sekundi (aniling) i temperaturi od 72°C tokom 1 minuta (elongacija).
[0105] PCR proizvodi su prečišćeni i direktno sekvencirani korišćenjem direktnih i reverznih PCR prajmera upotrebom „ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing ready reaction“ kita (Perkin Elmer). Oba lanca su bila sekvencirana korišćenjem „Prism dye-terminator sequencing“ kitova i ABI 377 aparata za sekvenciranje.
Analiza sekvence
[0106] Analize humanih cDNK sekvenci za V region teškog lanca i V region kapa lanca HER3 antitela su ostvarene poravnanjem HER-3 sekvenci sa sekvencama V regiona teškog lanca i V regiona kapa lanca humane klicine linije korišćenjem Abgenix in-house softvera (5AS). Softver je identifikovao korišćenje V gena, D gena J gena kao i nukleotidne insercije na rekombinacionim spojevima i somatske mutacije. Aminokiselinske sekvence su takođe stvorene in silico da bi se identifikovale somatske mutacije. Slični rezultati mogu da se dobiju sa komercijalno dostupnim softverom za analizu sekvenci i iz javno dostupnih informacija o sekvenci humanih V, D i J gena, npr, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
Molekularno kloniranje mAb U1-59
[0107] Ukupna RNK je ekstrahovana iz bunarčića za kulturu tkiva koji sadrži višestruke linije hibridoma, uključujući liniju hibridoma koja izlučuje antitelo U1-59. Varijabilni region teškog lanca je umnožen korišćenjem 5’-lider prajmera specifičnih za VH familiju, sa 3’-C-gama prajmerom. Glavna traka je umnožena korišćenjem VH4 prajmera, druge trake nisu bile vidljive. VH4-34 gama fragment je kloniran u pCDNA ekspresioni vektor u isti okvir čitanja sa humanim gama 1 genom za konstantni region.
[0108] Varijabilni region teškog lanca IgM je umnožen korišćenjem 5’ specifičnih prajmera VH familije sa 3’ prajmerom mu konstantnog regiona. Glavna traka je umnožena korišćenjem VH2 prajmera, druge trake nisu bile vidljive. VH2-5 mu fragment je kloniran u pCDNK ekspresioni vektor u isti okvir čitanja sa humanim genom za mu konstantni region. V kapa lanci su umnoženi i sekvencirani. Identifikovana su četiri proizvoda RT-PCR kapa lanca. Proizvodi su sekvencirani i nakon analize sekvence putem in silico translacije, samo tri od njih su imala otvorene okvire čitanja. Ova tri funkcionalna kapa lanca su klonirana iz bunarčića sa oligoklonskim U1-59 hibridomom, identifikovanim na osnovu korišćenja V kapa gena, kao (1) VK1 A3-JK2, (2) VK1 A20-JK3 i (3) B3-JK1. Svi V-kapa su klonirani u pCDNK ekspresioni vektor u isti okvir čitanja sa humanim genom za konstantni region kapa lakog lanca.
Transfekcije:
[0109] Svaki teški lanac je bio transfekovan sa svakim od kapa lanaca u tranzijentnim transfekcijama za ukupno 6 parova teški lanac/kapa laki lanac. Transfekcija gama lanca sa A20 kapa lancem je dala slabu ekspresiju antitela, dok ni jedno antitelo nije sekretovano ili detektovano kada je A20 kapa lanac kotransfekovan sa mu lancem. Ukupno tri IgG podtipa i dva IgM podtipa su bila dostupna za test vezivanja za HER-3.
[0110] Aktivnost vezivanja za HER-3+ ćelijske linije je detektovana pomoću FACS metode sa IgG1 mAb koje se sastoji od VH4-34 i B3 kapa lanca. Nijedna druga VH/Vk kombinacija nije dala signal fluorescencije iznad pozadinskog šuma u FACS analizi korišćenjem HER-3+ ćelijskih linija.
Kompeticija za vezivanje anti-HER-3 antitela
[0111] Mnogostruki kompetitivni bining antitela (svrstavanje epitopa) je izveden kao što je objavljeno u Jia et al. J Immunol Methods. 288, 91-98 (2004) da bi se procenili klasteri HER-3 antitela koji su u kompeticiji za vezivanje za HER-3. Testirana HER-3 antitela iz kohorte 1 su se grupisala u 5 binova na osnovu kompeticije za vezivanje.
Karakterizacija epitopa anti-HER-3 antitela
[0112] Okarakterisani su epitopi humanih anti-HER-3 antitela. Prvo je dot blot analiza redukovanog, denaturisanog His-tag-obeleženog HER-3 prečišćenog ECD proteina pokazala odsustvo vezivanja od strane testiranih anti-HER-3 antitela (U1-59, U1-61, U1-41, U1-46, U1-53, U1-43, U1-44, U1-47, U1-52, U1-40, U1-49)) pokazujući da su sva ona imala epitope osetljive na redukciju disulfidnih veza, sugerišući da su sva imala diskontinuirane epitope. Potom, antitela su bila mapirana u definisanim domenima u molekulu HER-3 projektovanjem različitih himernih molekula humani-pacovski HER-3, zasnovano na podeli vanćelijskog domena HER-3 na četiri domena:
1) L1 (D1): manji ligand-vezujući domen,
2) S1 (D2): prvi cisteinom-bogati domen,
3) L2 (D3): veći ligand-vezujući domen, i
4) S2 (D4): drugi cisteinom-bogati domen.
[0113] cDNK za vanćelijski domen (ECD) humanog HER-3 je umnožena iz ćelija RAT1-HER-3. Pacovske cDNK za HER-3 su umnožene pomoću RT-PCR iz RNK jetre pacova i potvrđene sekvenciranjem. cDNK koje eksprimiraju ECD humanog i pacovskog Her3 su klonirane u sisarske ekspresione vektore kao V5-His fuzioni proteini. Domeni iz humanog HER-3 ECD su razmenjeni u nosaču koji obezbeđuje pacovski HER-3 ECD korišćenjem Mfe1, BstX1 i DraIII internih restrikcionih mesta. Na ovaj način, različiti himerni pacovski/humani HER-3 ECD HIS fuzioni proteini (aminokiseline 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604) su konstruisani i eksprimirani putem tranzijentne transfekcije HEK 293T ćelija. Ekspresija konstrukata je bila potvrđena korišćenjem pacovskog poliklonskog antitela protiv humanog HER-3. Humana monoklonska antitela su ispitana ELISA testom za vezivanje za sekretovane himerne ECD-ove.
[0114] Dva od humanih antitela, uključujući antitelo U1-59, su unakrsno reagovala sa pacovskim HER-3. Da bi se odredili vezujući domeni, ova mAb antitela su testirana protiv nepotpunog oblika HER-3 koji se sastoji od L1-S1-V5his-tag proteina, prečišćenog iz supernatanta HEK 293T ćelija transfekovanih plazmidnom DNK koja kodira ekspresiju L1-S1 vanćelijskih domena HER3. mAb U1-59 se vezalo za L1-S1 protein u ELISA testu, nagoveštavajući da je njegov epitop u L1-S1. mAb 2.5.1 se nije vezalo za L1-S1 protein, nagoveštavajući da je njegov epitop u L2-S2. Dalje mapiranje antitela U1-59 je postignuto korišćenjem SELDI (Surface enhanced laser desorption / ionization) masene spektroskopije u kojoj se meri vreme leta jona, sa proteolitičkim digestijama kompleksa mAb-HER-3 ECD na čipu.
Mapiranje U1-59 epitopa korišćenjem SELDI metode
[0115] Dalje mapiranje antitela U1-59 je postignuto korišćenjem SELDI masene spektroskopije u kojoj se meri vreme leta jona sa proteolitičkim digestijama kompleksa mAb-HER-3 ECD na čipu. Protein A je kovalentno vezan za PS20 proteinski čip i korišćen za „hvatanje“ mAb U1-59. Zatim je kompleks PS20 proteina na čipu i monoklonskog antitela inkubiran sa HER-3-His prečišćenim antigenom. Zatim je kompleks antitelo-antigen digestiran visokim koncentracijama Asp-N. Čip je ispran, čime je zadržan samo HER-3 peptid vezan za antitelo na čipu. Epitop je određen pomoću SELDI metode i identifikovan prema masi fragmenta. Identifikovani 6814 D fragment ima veliku sličnost sa dva očekivana peptida dobijena delimičnom digestijom HER-3-his ECD. Oba preklapajuća peptida mapiraju u domen S1. Povezivanjem rezultata SELDI testa sa vezivanjem za HER-3 delecioni konstrukt, epitop je mapiran između ostatka 251 i 325.
[0116] Položaj vezujućih domena u vanćelijskom delu HER-3 koji su prepoznati od strane humanih anti-HER-3 mAb antitela pronalaska je prikazan u tabeli 4. Rezultati mapiranja domena epitopa su bili konzistentni sa rezultatima kompeticionih binova u kompetitivnom vezivanju antitela, sa antitelima koja stupaju u unakrsnu kompeticiju jedna sa drugim za vezivanje za HER-3 koja takođe mapiraju u istom domenu na HER-3 (slika 3).
TABELA 4
PRIMER 9: Određivanje kanonskih klasa antitela
[0117] Chothia i saradnici su opisali strukturu antitela u pogledu "kanonskih klasa" za hipervarijabilne regione svakog lanca imunoglobulina (J. Mol. Biol., 20. avgust 1987, 196(4):901-17). Atomske strukture Fab i VL fragmenata različitih imunoglobulina su analizirane kako bi se odredila veza između njihovih aminokiselinskih sekvenci i trodimenzionalnih struktura njihovih antigen-vezujućih mesta. Chothia i saradnici su otkrili da postoji relativno malo ostataka koji su, kroz svoje pakovanje, vodonične veze ili sposobnost da zauzmu neuobičajene fi, psi ili omega konformacije, primarno odgovorni za konformacije glavnog lanca hipervarijabilnih regiona. Nađeno je da se ovi ostaci pojavljuju na mestima unutar hipervarijabilnih regiona i u konzervisanoj okvirnoj sekvenci β naborane ploče. Ispitivanjem sekvenci imunoglobulina koji imaju nepoznatu strukturu, Chothia i saradnici su pokazali da mnogi imunoglobulini imaju hipervarijabilne regione koji su slične veličine onima sa poznatim strukturama i uz to sadrže identične ostatke na mestima odgovornim za zapaženu konformaciju.
[0118] Njihovo otkriće je sugerisalo da ovi hipervarijabilni regioni imaju konformacije bliske onim u poznatim strukturama. Za pet hipervarijabilnih regiona, izgleda da je repertoar konformacija ograničen na relativno mali broj odvojenih strukturnih klasa. Ove konformacije glavnog lanca hipervarijabilnih regiona koje se uobičajeno javljaju nazvane su "kanonske strukture." Dalji rad Chothia i saradnika (Nature, 1989 Dec 21-28, 342(6252):877-83) i drugih (Martin, et al. J. Mol. Biol., 1996 Nov 15, 263(5):800-15) je potvrdio da postoji mali repertoar konformacija glavnog lanca za najmanje pet od šest hipervarijabilnih regiona antitela.
[0119] CDR-ovi svakog antitela opisani u prethodnom tekstu su ispitivani da bi se odredila njihova kanonska klasa. Kao što je poznato, kanonske klase su dodeljene samo CDR1 i CDR2 regionima teškog lanca antitela, uporedo sa CDR1, CDR2 i CDR3 regionima lakog lanca antitela. Tabele u nastavku rezimiraju rezultate analize. Podatak o kanonskoj klasi je u obliku HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, gde se "HCDR" odnosi na CDR teškog lanca a "LCDR" se odnosi na CDR lakog lanca. Stoga, na primer, kanonska klasa 1-3-2-1-5 se odnosi na antitelo koje ima CDR1 koji pripada kanonskoj klasi 1, HCDR2 koji pripada kanonskoj klasi 3, LCDR1 koji pripada kanonskoj klasi 2, LCDR2 koji pripada kanonskoj klasi 1 i LCDR3 koji pripada kanonskoj klasi 5.
[0120] Oznake su dodeljene određenoj kanonskoj klasi kada je postojalo 70% ili više identičnosti aminokiselina u antitelu sa aminokiselinama definisanim za svaku kanonsku klasu. Aminokiseline definisane za svako antitelo mogu da se nađu, na primer, u člancima Chothia i saradnika, na koje se poziva u prethodnom tekstu. Tabela 5 i tabela 6 objavljuju podatke o kanonskoj klasi za svako od HER-3 antitela. Tamo gde ima manje od 70 % identičnosti, dodeljena kanonska klasa je označena zvezdicom ("*") da ukaže na to da je napravljena najbolja procena ispravne kanonske klase, zasnovana na dužini svakog CDR i ukupnim podacima. Tamo gde nije bilo poklapanja kanonske klase sa istom dužinom CDR-a, dodeljivanje oznake kanonskoj klasi je označeno slovom „s“ i brojem, kao što je "s18", što znači da veličina CDR-a iznosi 18. Tamo gde nema dostupnih podataka o sekvenci za jedan od teških ili lakih lanaca, kanonska klasa je označena sa "Z".
TABELA 5
[0121] Tabela 7 predstavlja analizu broja antitela po klasi. Broj antitela koja pripadaju određenoj kanonskoj klasi označenoj u levoj koloni prikazan je u desnoj koloni. Četiri mAb antitela kojima nedostaju podaci o sekvenci jednog lanca i zbog toga imaju "Z" kao oznaku za kanonsku klasu nisu uključena u ovaj obračun.
[0122] Najčešće viđana struktura je 3-1-2-1-1: Dvadeset jedno od četrdeset jednog mAb antitela koja imaju sekvence i teškog i lakog lanca je imalo ovu kombinaciju.
TABELA 6
PRIMER 10: Određivanje afiniteta antitela
[0123] Merenja afiniteta anti-HER-3 antitela su izvedena indirektnom FACS Scatchard analizom. Dakle, 105 ćelija od interesa ili SK-Br 3 ćelija je sakupljeno sa 10 mM EDTA u PBS-u, isprano jednom FACS puferom (PBS, 3 % FCS, 0.4 % azid) i zasejano u ploču sa 96 bunarčića okruglog dna. Ćelije su centrifugirane tokom 3 minuta na 1000 rpm da se ukloni supernatant i zatim resuspendovane sa α-HER-3 antitelom (3 µg/ml) ili sa razblaženjima antitela (100 µl/bunarčiću) počevši sa 20 µg/ml humanog monoklonskog antitela u FACS puferu, razblaženog u koracima 1:2. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu tokom 1 časa, isprane dva puta FACS puferom i resuspendovane sa sekundarnim antitelom (100 µl/bunarčiću) magarećim anti-humanim-PE antitelom (Jackson) razblaženim u odnosu 1:50 u FACS puferu. Ćelijske suspenzije su inkubirane na ledu i u mraku tokom 30 minuta, isprane dva puta FACS puferom i analizirane (FACS, Beckman Coulter). Prema FACS Scatchard analizi, srednja vrednost fluorescencije je izračunata za svako merenje. Pozadinski šum bojenja (= bez prvog antitela) je oduzet od svake srednje vrednosti fluorescencije. Konstruisan je Scatchard dijagram na kome je x-vrednost = srednja vrednost fluorescencije i y-vrednost = srednja vrednost fluorescencije /koncentracija mAb (nM). KD je uzeta kao apsolutna vrednost od 1/m linearne jednačine. Na slici 4 je prikazana kinetička analiza korišćenjem U1-59 antitela pronalaska. U sledećoj tabeli 8 su obezbeđena merenja afiniteta za određena antitela odabrana na ovaj način.
TABELA 7
PRIMER 11: Anti-HER-3 antitela indukuju endocitozu HER-3 receptora
[0124] HER-3 je identifikovan kao faktor koji može da utiče na otpočinjanje i napredovanje hiperproliferativnih bolesti na taj način što služi kao važan „čuvar kapije“ ćelijskog signalnog puta posredovanog HER familijom. Stoga, ukoliko se HER-3 efikasno ukloni sa ćelijske površine/membrane putem internalizacije receptora, ćelijski prenos signala i time i transformacija i/ili održavanje ćelija u stanju malignosti može na kraju da bude umanjeno ili potisnuto.
[0125] U cilju ispitivanja da li su anti-HER-3 antitela pronalaska i uporedna antitela sposobna da indukuju ubrzanu endocitozu HER-3, upoređene su relativne količine HER-3 molekula na površini ćelije nakon 0.5 časova i 4 časa inkubacije ćelija sa anti-HER-3 antitelima pronalaska.
3x105 ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast u posudu sa 24 bunarčića i ostavljeno da raste preko noći. Ćelije su preinkubirane sa 10 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela u normalnom medijumu za rast tokom navedenih vremenskih perioda na temperaturi od 37°C. Ćelije su odvojene od podloge sa 10 mM EDTA i inkubirane sa 10 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela u puferu za ispiranje (PBS, 3 % FCS, 0.04 % azid) tokom 45 minuta na temperaturi od 4°C. Ćelije su isprane dva puta puferom za ispiranje, inkubirane sa magarećim-anti-humanim-PE sekundarnim antitelom (Jackson) razblaženim u odnosu 1:100 tokom 45 minuta na temperaturi od 4°C, isprane dva puta puferom za ispiranje i analizirane pomoću FACS aparata (BeckmanCoulter, EXPO).
[0126] Podaci prikazani na slici 5 pokazuju da tretman ćelija anti-HER-3 antitelima vodi internalizaciji receptora. Podaci su prikazani kao % internalizacije i odnose se na smanjenje srednjeg intenziteta fluorescencije uzoraka tretiranih sa anti-HER3 u odnosu na kontrolne uzorke.
PRIMER 12: Inhibicija vezivanja liganda za ćelije humanog kancera SKBr3 pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0127] Eksperimenti kompeticije radioaktivno obeleženog liganda su izvedeni u cilju kvantitativnog određivanja sposobnosti anti-HER-3 antitela pronalaska i uporednih antitela da spreče vezivanje liganda za HER-3 u testu zasnovanom na ćelijama. Dakle, test vezivanja za HER-3 receptor je izveden sa 4x105 SK-BR-3 ćelija koje su inkubirane sa različitim koncentracijama antitela tokom 30 min na ledu. Dodat je 1.25 nM [I125]-α-HRG/[<125>I]-β-HRG u svaki bunarčić i inkubacija je nastavljena tokom 2 časa na ledu. Ploče su isprane pet puta, osušene na vazduhu i izbrojane u scintilacionom brojaču. Slike 6a-e prikazuju rezultate ovih eksperimenata izvedenih sa reprezentativnim anti-HER-3 antitelima i pokazuju da je antitelo pronalaska U1-59 sposobno da specifično smanji vezivanje [<125>I]-α-HRG/[<125>I]-β-HRG za ćelije koje eksprimiraju endogeni HER-3.
PRIMER 13: Inhibicija ligandom indukovane fosforilacije HER-3 humanim anti-HER-3 antitelima
[0128] Eksperimenti ELISA testom su izvedeni u cilju istraživanja da li su antitela pronalaska i uporedna antitela sposobna da spreče aktivaciju HER-3 posredovanu ligandom β-HRG. Aktivacija HER-3 posredovana ligandom je detektovana pomoću povećane fosforilacije receptorskog tirozina.
[0129] 1. dan: Sud sa 1 x 96 bunarčića je obložen sa 20 µg/ml kolagena I u 0,1 M sirćetnoj kiselini tokom 4 časa na temperaturi od 37 °C.2.5x10<5>ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast. 2. dan: Ćelije su izgladnjivane u 100 µl medijuma bez seruma tokom 24 časa.
[0130] 3. dan: Ćelije su preinkubirane sa 10 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela tokom 1 časa na temperaturi od 37 °C i zatim tretirane sa 30 ng/ml β-HRG-EGF domena (R&D Systems) tokom 10 minuta. Medijum je odliven uz lagano lupkanje i ćelije su fiksirane 4%-tnim rastvorom formaldehida u PBS-u tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Rastvor formaldehida je uklonjen i ćelije su isprane puferom za ispiranje (PBS/0.1 % Tween 20). Ćelije su kvenčovane dodatkom 1% H2O2, 0.1 % NaN3u puferu za ispiranje i inkubirane tokom 20 min na sobnoj temperaturi, zatim blokirane sa NET-Gelantin-om tokom 5 časova na temperaturi od 4°C. Primarno antitelo fosfo-HER-3 (Tyr1289) (poliklonsko zečje; ćelijski prenos signala #4791; 1:300) je dodato preko noći na temperaturi od 4°C.
[0131] 4. dan: Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje, zatim inkubirana sa anti-zečjim-POD antitelom razblaženim u odnosu 1:3000 u PBS-u - 0.5 % BSA je dodat u svaki bunarčić i inkubiran tokom 1.5 časa na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje i jednom PBS-om. Tetrametilbenzidin (TMB, Calbiochem) je dodat i praćen na 650 nm. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 250 nM HCl i apsorbanca je očitana na 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 650 nm korišćenjem Vmax čitača ploča (Thermo Lab Systems).
[0132] Slika 7a prikazuje reprezentativne rezultate ovog eksperimenta, pokazujući da su anti-HER-3 antitela bila sposobna da smanje aktivaciju HER-3 posredovanu ligandom što pokazuje smanjena fosforilacija receptorskog tirozina. Podaci su prikazani kao procentualno smanjenje pomoću terapijskih antitela u odnosu na kontrolno antitelo.
[0133] Da bi se testirao potencijal mAb U1-53 da inhibira aktivaciju HER-3 posredovanu ligandom, MCF-7 ćelije su izgladnjivane tokom 24 časa, inkubirane sa mAb U1-53 tokom 1 časa na temperaturi od 37°C i stimulisane sa 10 nM HRG-β tokom 10 minuta. Lizati su prebačeni u ploče za ELISA test obložene sa 1 B4 (mišje anti-HER-3 mAb) i fosforilacija HER-3 je analizirana sa antitelom 4G10. Kao što je prikazano na slici 7b fosforilacija HER-3 je skoro u potpunosti inhibirana na dozno-zavisni način pri IC50 od 0.14 nM.
PRIMER 14: Inhibicija ligandom indukovane fosforilacije p42/p44 MAP-Kinaze pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0134] Sledeći eksperimenti primenom ELISA testa su izvedeni u cilju istraživanja da li su antitela pronalaska i uporedna antitela sposobna da spreče aktivaciju p42/p44 MAP-Kinaze posredovanu ligandom β-HRG. Aktivacija HER-3 posredovana ligandom je detektovana preko povećane fosforilacije proteina (Thr202/Tyr204).
1. dan: Sud sa 1 x 96 bunarčića je obložen sa 20 µg/ml kolagena I u 0,1 M sirćetnoj kiselini tokom 4 časa na temperaturi od 37 °C. 3x10<5>ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast.
2. dan: Ćelije su izgladnjivane u 100 µl medijuma bez seruma tokom 24 časa.
3. dan: Ćelije su preinkubirane sa 5 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela tokom 1 časa na temperaturi od 37 °C i zatim tretirane sa 20 ng/ml β-HRG-EGF domena (R&D Systems) tokom 10 minuta. Medijum je odliven uz lagano lupkanje i ćelije su fiksirane 4%-tnim rastvorom formaldehida u PBS-u tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Rastvor formaldehida je uklonjen i ćelije su isprane puferom za ispiranje (PBS/0.1 % Tween 20). Ćelije su kvenčovane dodatkom 1% H2O2, 0.1 % NaN3u puferu za ispiranje i inkubirane tokom 20 min na sobnoj temperaturi, zatim blokirane sa PBS/ 0.5% BSA tokom 5 časova na temperaturi od 4°C. Primarno antitelo fosfo-p44/p42 MAP Kinaza (Thr202/Tyr204) (poliklonsko zečje; ćelijski prenos signala #9101; 1:3000) je dodato preko noći na temperaturi od 4°C.
4. dan: Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje, zatim inkubirana sa anti-zečjim-HRP antitelom razblaženim u odnosu 1:5000 u PBS-u - 0.5 % BSA je dodato u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1.5 časa na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje i jednom PBS-om. Tetrametilbenzidin (TMB, Calbiochem) je dodat i praćen na 650 nm. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 250 nM HCl i apsorbanca očitana na 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 650 nm korišćenjema Vmax čitača ploča (Thermo Lab Systems).
[0135] Slika 8 prikazuje reprezentativne rezultate ovog eksperimenta. Antitela pronalaska su bila u stanju da smanje aktivaciju p42/p44 MAP-Kinaze posredovanu ligandom što pokazuje smanjena fosforilacija. Podaci su prikazani kao procentualno smanjenje pomoću terapijskih antitela u odnosu na kontrolno antitelo.
PRIMER 15: Inhibicija β-HRG-indukovane fosforilacije fosfo-AKT pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0136] U sledećem eksperimentu izvedenom ELISA testom istraživali smo da li su anti-HER-3 antitela pronalaska i uporedna antitela sposobna da spreče aktivaciju AKT-Kinaze posredovanu β-HRG ligandom. Aktivacija AKT posredovana ligandom je detektovana preko povećane fosforilacije proteina (Ser473).
1. dan: Sud sa 1 x 96 bunarčića je obložen sa 20 µg/ml kolagena I u 0,1 M sirćetnoj kiselini tokom 4 časa na temperaturi od 37°C. 3x10<5>ćelija je zasejano u normalnom medijumu za rast.
2. dan: Ćelije su izgladnjivane u 100 µl medijuma bez seruma tokom 24 časa.
3. dan: Ćelije su preinkubirane sa 5 µg/ml anti-HER-3 mAb antitela tokom 1 časa na temperaturi od 37°C i zatim tretirane sa 20 ng/ml β-HRG-EGF domena (R&D Systems) tokom 10 minuta. Medijum je odliven uz lagano lupkanje i ćelije su fiksirane 4%-tnim rastvorom formaldehida u PBS-u tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Rastvor formaldehida je uklonjen i ćelije su isprane puferom za ispiranje (PBS/0.1 % Tween 20). Ćelije su kvenčovane dodatkom 1% H2O2, 0.1 % NaN3u puferu za ispiranje i inkubirane tokom 20 min na sobnoj temperaturi, zatim blokirane sa PBS/ 0.5% BSA tokom 5 časova na temperaturi od 4°C. Primarno antitelo fosfo-Akt (Ser473) (poliklonsko zečje; ćelijski prenos signala #9217; 1:1000) je dodato preko noći na temperaturi od 4°C.
4. dan: Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje, zatim inkubirana sa anti-zečjim-HRP antitelom razblaženim u odnosu 1:5000 u PBS-u - 0.5 % BSA je dodato u svaki bunarčić i ploča inkubirana tokom 1.5 časa na sobnoj temperaturi. Ploča je isprana 3 puta puferom za ispiranje i jednom PBS-om. Tetrametilbenzidin (TMB, Calbiochem) je dodat i praćen na 650 nm. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µl 250 nM HCl i apsorbanca očitana na 450 nm sa referentnom talasnom dužinom od 650 nm korišćenjema Vmax čitača ploča (Thermo Lab Systems).
[0137] Slika 9 prikazuje reprezentativne rezultate ovog eksperimenta. Anti-HER3 antitela pronalaska su bila u stanju da smanje aktivaciju AKT posredovanu β-HRG-om što pokazuje smanjena fosforilacija. Podaci su prikazani kao procentualno smanjenje pomoću terapijskih antitela u odnosu na kontrolno antitelo.
PRIMER 16: Inhibicija proliferacije MCF7 ćelija posredovane α-HRG/β-HRG-om pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0138] In vitro eksperimenti su izvedeni u cilju određivanja sposobnosti antitela pronalaska i uporednih antitela da inhibiraju proliferaciju ćelija stimulisanu posredstvom HRG. 2000 MCF7 ćelija je zasejano u medijum koji sadrži FCS na ploču sa 96 bunarčića preko noći. Ćelije su preinkubirane u četiri ponavljanja sa antitelom razblaženim u medijumu sa 0.5 % FCS tokom 1 časa na temperaturi od 37°C. Ćelije su stimulisane sa 30 ng/ml α- ili 20 ng/ml β-HRG (R&D Systems) dodavanjem liganda direktno u rastvor antitela i zatim ostavljene da rastu tokom 72 časa. AlamarBlue™ (BIOSOURCE) je dodat i ćelije su inkubirane na temperaturi od 37°C u mraku. Apsorbanca je merena na 590 nm svakih 30 minuta. Podaci su uzeti 90 minuta nakon dodavanja alamar plave. Rezultati pokazuju, kao što je prikazano na slici 10, da antitela inhibiraju HRG-indukovani ćelijski rast u ćelijama humanog kancera. Podaci su prikazani kao procentualno smanjenje pomoću terapijskih antitela u odnosu na kontrolno antitelo.
PRIMER 17: Inhibicija β-HRG-indukovane migracije MCF7 ćelija pomoću humanih anti-HER-3 antitela
[0139] Eksperimenti transmigracije su izvedeni u cilju istraživanja da li antitela pronalaska i uporedna antitela sprečavaju migraciju ćelija. MCF7 ćelije lišene seruma su preinkubirane dodavanjem naznačene količine antitela ćelijskoj suspenziji i njihovim inkubiranjem tokom 45 minuta na temperaturi od 37°C. 500 µl ćelijske suspenzije (50.000 ćelija) je zatim smešteno u gornju komoru trans-bunarčića obloženih kolagenom I (BD Falcon, pore 8 mm). 750 µl medijuma (MEM, aminokiseline, Na-piruvat, Pen.-Strept., 0,1 % BSA, bez fetalnog telećeg seruma), samog ili koji sadrži ligande β-HRG-EGF domen (R&D Systems) je korišćeno u donjoj komori. Ćelije su ostavljene da migriraju tokom 8 časova na temperaturi od 37°C i obojene sa DAPI.
[0140] Obojena jedra su brojana ručno; procenat inhibicije je izražen kao inhibicija u odnosu na kontrolno antitelo.
[0141] Slika 11 prikazuje rezultat eksperimenta pokazujući da anti-HER-3 antitela smanjuju ćelijsku migraciju indukovanu HRG-om.
PRIMER 18: Test obrazovanja kolonija (test na mekom agaru)
[0142] Testovi na mekom agaru izvedeni su u cilju istraživanja sposobnosti anti-HER-3 antitela pronalaska da inhibiraju ćelijski rast nezavisan od adhezije. Test obrazovanja kolonija na mekom agaru je standardni in vitro test za ispitivanje transformisanih ćelija, budući da samo takve transformisane ćelije mogu da rastu u mekom agaru.
[0143] 750 do 2000 ćelija (zavisno od ćelijske linije) je preinkubirano sa naznačenim antitelima u koncentraciji od 10 µg/ml u IMDM medijumu (Gibco) tokom 30 minuta i resuspendovano u 0.4%-tnom Difco noble agaru. Ćelijska suspenzija je zasejana na formirani sloj od 0.75%-tne agaroze koja sadrži 20 %-tni FCS u četiri ponavljanja na ploču sa 96 bunarčića. Kolonije su ostavljene da se formiraju tokom 14 dana i zatim obojene sa 50 ml MTT (0.5 mg/ml u PBS-u) preko noći. Slike 12a-i prikazuju rezultate ovih eksperimenata izvedenih sa tri antitela. Ovi rezultati pokazuju da anti-HER-3 antitela smanjuju ćelijski rast nezavisan od adhezije MDA-MB361 i NCI-ADR ćelija kancera dojke (slika 12a,b), MKN-28 kancera želuca (slika 12c), HT144 melanoma ćelija (slika 12d), Skov3 ćelija karcinoma jajnika (slika 12e), PPC-1 ćelija kancera prostate (slika 12f), BX-PC3 ćelija kancera pankreasa (slika 12g), A431 ćelija epidermoidnog karcinoma (slika 12h) i ćelija karcinoma pluća (slika 12i). Kolonije su brojane pomoću Scanalyzer HTS kamera sistema (Lemnatec, Wuerselen).
PRIMER 19: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast humanog karcinoma dojke u nude miševima
[0144] Anti-tumorska efikasnost terapijskih antitela se često procenjuje u studijama humanog ksenograft tumora. U ovim studijama, humani tumori rastu kao ksenografti u imunokompromitovanim miševima i terapijska efikasnost se meri stepenom inhibicije rasta tumora. U cilju određivanja da li anti-HER-3 antitela pronalaska i uporedna antitela interferiraju sa tumorskim rastom ćelija humanog kancera dojke u nude miševima, 5x10<6>T47D ćelija je implantirano u ženke NMRI nude/nude miševa. Tumori su bili subkutani, izrasli na leđima životinje. Tretmani su počinjali kada tumori dostignu srednju zapreminu od 20 mm<3>; osam dana nakon implantacije. Pre prvog tretmana, miševi su razvrstani po slučajnom izboru i statistički testovi su izvedeni da bi se osigurala ravnomernost početnih zapremina tumora (srednja vrednost, medijana i standardna devijacija) između tretmanskih grupa. Tretman je započet početnom dozom od 50 mg/kg praćenom injekcijama od 25 mg/kg jednom nedeljno, intraperitonealnim injektovanjem. Kontrolna grupa je primila doksorubicin (farmaceutske čistoće). Sve životinje su dopunski primale 0.5 mg/kg/nedeljno estrogena injektovanog i.p.
[0145] Detalji tretmanskih grupa su dati u nastavku teksta.
[0146] Podaci za medijanu zapremine tumora (slika 13) su pokazali da primena anti-HER-3 antitela ima za rezultat smanjenje rasta tumora.
PRIMER 20: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast humanog tumora pankreasa u SCID miševima
[0147] Da bi se ispitao terapijski potencijal anti-HER3 antitela u drugim tipovima solidnih tumora anti-HER-3 antitela, U1-53 i U1-59 su ispitana u miševima sa uspostavljenim tumorima izvedenim iz ćelijske linije BxPC3 humanog tumora pankreasa. Kao kontrole, uključene su grupe miševa tretiranih vehikulumom, PBS-om, ili ustanovljenim terapijskim antitelom, Erbitux-om.
5x106 BxPC3 ćelija je inokulisano subkutano bez Matrigela u CB17 SCiD miševe. Miševi koji nose uspostavljene tumore sa srednjom zapreminom od 140mm2 su primili 50mg/kg U1-53, U1-59, Erbitux-a ili odgovarajuću zapreminu PBS-a putem intraperitonealne injekcije. Posle toga miševi su primali jednom nedeljno injekcije sa 25mg/kg tokom trajanja studije.
[0148] Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na slici 14. U1-53 i U1-59 su smanjili rast humanih tumora pankreasa na citostatički način. Značajno, u ovom eksperimentu, U1-53 i U1-59 su bili efikasniji od antitela koje ciljano deluje na EGFR, Erbitux-a, u odlaganju rasta tumora. Ovi podaci su pokazali terapijsku efikasnost anti-HER-3 antitela u poređenju sa terapijskim sredstvom koje predstavlja reper.
PRIMER 21: Kombinovanje humanih anti-HER-3 antitela sa anti-EGFR antitelima povećava anti-tumorsku aktivnost
[0149] Monoterapija hiperproliferativnih bolesti ciljanim antitelima je često otežana problemima kao što je, sa jedne strane, razvoj otpornosti na lekove, a sa druge strane, promena antigenosti. Na primer, gubitak antigenosti nakon produženog tretmana može da učini tumorske ćelije neosetljivim na terapijska antitela, budući da one tumorske ćelije koje ne eksprimiraju ili su izgubile ciljani antigen imaju selektivnu prednost rasta. Ovi problemi mogu da budu izbegnuti korišćenjem antitela pronalaska u kombinaciji sa terapijskim antitelom koje ciljano deluje na različiti receptor na tumorskim ćelijama, ili drugim antineoplastičnim sredstvima. Intervenisanje u višestrukim signalnim putevima ili čak srodnim putevima, ali sa višestrukim koracima intervencije, može takođe da obezbedi terapijsku korist. Ovi kombinovani modaliteti lečenja su verovatno efikasniji, jer kombinuju dva anti-kancerska sredstva, od kojih svaki deluje putem drugačijeg mehanizma delovanja.
[0150] Da bi se pokazala izvodljivost primene anti-HER-3 antitela U1-53 i U1-59, kao pogodne kombinacija sredstava, uporedili smo monoterapijsku primenu U1-53 ili U1-59 sa primenama u kojima su ili U1-53 ili U1-59 kombinovani sa anti-EGR specifičnim antitelom, Erbitux-om.
5x106 BxPC3 ćelija je inokulisano subkutano sa Matrigelom u CB17 SCID miševe. Nakon što je zapremina tumora dostigla 200 mm<3>, miševi su razvrstani po slučajnom izboru u pojedinačne tretmanske grupe. Jednom nedeljno su intraperitonealno primenjivani U1-53, U1-59 i Erbitux, kao pojedinačnih sredstava, ili kombinacija anti-HER3 antitela sa Erbitux-om ili koktel dva anti HER-3 antitela. Sva antitela su dozirana u pojedinačnim početnim dozama od 50 mg/kg/nedeljno, praćenim injekcijama od 25 mg/kg, jednom nedeljno, tokom šest nedelja. Kontrolne grupe su primale jednom u dve nedelje gemcitabin (120 mg/kg), jednom nedeljno objedinjeni humani IgG ili jednom nedeljno vehikulum (PBS) injekcije. Terapijski režimi su detaljno opisani u nastavku teksta.
[0151] Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na slici 15. Antitela U1-53 i U1-59, kada se primene kao pojedinačna sredstva, odlagala su rast humanih tumora pankreasa u istom stepenu kao gemcitabin, koji se često koristi kao standardna hemoterapija protiv kancera pankreasa. Koadministracija erbituksa sa U1-53 ili U1-59 je za rezultat imala značajno veće smanjenje rasta tumora nego što je primećeno kod pojedinačne primene U1-53, U1-59 ili erbituksa. Stoga, koristan terapijski odgovor može da se postigne kombinovanjem anti-HER-3 antitela sa odgovarajućim antitelima koja ciljano deluju na zasebne antigene tumora.
[0152] Ukratko, anti-HER-3 antitela pronalaska imaju moćnu terapijsku efikasnost protiv humanih tumora in vivo. Ona mogu efikasno da se kombinuju sa drugim antineoplastičnim terapeuticima za povećanu anti-tumorsku aktivnost.
PRIMER 22: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju tumorski rast humanog melanoma u nu/nu miševima
[0153] Članovi erbB familije receptora, uključujući Her3, su abnormalno eksprimirani u velikom broju epitelijalnih kancera i poznato je da imaju važne uloge u rastu i preživljavanju mnogih od ovih solidnih tumora. Ovi tumori uključuju melanome, kancere skvamoznih ćelija glave i vrata, ne-sitnoćelijske kancere pluća i kancere prostate, gliom, kancere želuca, dojke, kolorektalne kancere, kancere pankreasa i jajnika. U cilju potvrde da anti-Her3 antitela pronalaska nisu ograničena u svom antikancerskom delovanju na pojedinačne tipove tumora, npr. kancere pankreasa (videti Primer 21), već mogu da se koriste kao terapeutici protiv mnogih HER-3-zavisnih tumora, ispitali smo U1-53 (uporedno antitelo) i U1-59 u dodatnim ksenograftskim studijama. Jedan primer je prikazan na slici 16. 5 x 105 ćelija humanog melanoma, HT144, je injektovano subkutano u CB17 SCID miševe, praćeno neposredno nakon toga intraperitonealnom injekcijom 50mg/kg U1-53 i U1-59, odgovarajuće zapremine PBS-a ili Dacarbacin-a (DITC) u dozi od 200mg/kg. Posle toga, miševi su primali 25mg/kg U1-53 ili U1-59 jednom nedeljno, dok je DITC davan jednom na svake dve nedelje u dozi od 200mg/kg.
[0154] Vrednosti medijane zapremina tumora iz svake tretmanske grupe su prikazane na slici 16. Primena antitela je dovela do smanjenja rasta humanih melanoma u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani sa vehikulumom kao kontrolom. Ovi rezultati pokazuju da antitela nisu ograničena u svom terapijskom potencijalu i ciljano deluju na veliki broj kancera koji eksprimiraju HER-3.
PRIMER 23: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast ksenograft karcinoma kolona u miševima
[0155] HT-29 ćelije humanog karcinoma kolona su suspendovane u medijumu koji sadrži Matrigel u odnosu 2:1, do finalne koncentracije od 10 x 106 ćelija/ml. 0.2 ml ćelijske suspenzije je injektovano s.c. u desni bok 4-5 nedelja starih CD1 nu/nu miševa. Ukupno 95 miševa je korišćeno.
[0156] Miševi su po slučajnom izboru svrstani u kontrolne i tretmanske grupe. Tretman je započet istog dana. Trajanje tretmana je bilo 29 dana. Nakon završetka studije, tri tumora po grupi je sakupljeno 3 časa nakon primene tretmana. Tumori su podvrgnuti brzom smrzavanju i čuvani na temperaturi od -80 °C.
[0157] Sledeći protokoli tretmana su izvedeni:
Kontrolna grupa: nespecifični humani IgG 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa: antitelo U1-53, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa: antitelo U1-7, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa: antitelo U1-59, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa: 5-FU: 5-fluorouracil, 50 mg/kg, 9d x 5, intraperitonealno
[0158] Vrednosti medijane zapremina tumora svake grupe su prikazane na slici 17. Primena antitela je rezultirala smanjenjem rasta HT-29 tumora karcinoma kolona u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani nespecifičnim humanim IgG1.
RIMER 24: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast kancera pluća u miševima
[0159] Ćelije Calu-3 humanog ne-sitnoćelijskog kancera pluća su suspendovane u medijumu koji sadrži Matrigel u odnosu 1:1, do finalne koncentracije od 5 x 10<1>ćelija/ml. 0.05 ml ćelijske suspenzije je injektovano s.c. u desni bok 9 nedelja starih ženki CB17 scid miševa. Ukupno 60 miševa je korišćeno.
[0160] Miševi su po slučajnom izboru svrstani u kontrolne i tretmanske grupe. Tretman je započet istog dana. Trajanje tretmana je bilo 32 dana.
[0161] Sledeći protokoli tretmana su izvedeni:
PBS - vehikulum grupa
hG kontrolna grupa: nespecifični humani IgG: 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa antitelo U1-53, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa antitelo U1-7, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa antitelo U1-59, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
[0162] Vrednosti medijane zapremina tumora svake grupe su prikazane na slici 18. Primena antitela je rezultirala smanjenjem rasta ksenograft humanog ne-sitnoćelijskog kancera pluća u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani PBS-om kao kontrolom vehikuluma ili nespecifičnim humanim IgG.
PRIMER 25: Humana anti-HER-3 antitela inhibiraju rast humanog tumora pankreasa u Balb/C-miševima
[0163] BxPC3 ćelije humanog tumora pankreasa su suspendovane u medijumu koji sadrži Matrigel u odnosu 2:1, do finalne koncentracije od 5 x 106 ćelija/ml.0.2 ml ćelijske suspenzije je injektovano s.c. u desni bok 5-7 nedelja starih ženki BalbC nu/nu miševa. Ukupno 100 miševa je korišćeno.
[0164] Miševi su po slučajnom izboru svrstani u kontrolne i tretmanske grupe. Tretman je započet istog dana. Trajanje tretmana je bilo 27 dana.
[0165] Sledeći protokoli tretmana su izvedeni:
hIgG kontrolna grupa: nespecifični humani IgG2, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa antitelo U1-53, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa antitelo U1-7, 25 mg/kg, dva puta nedeljno, intraperitonealno
Tretmanska grupa antitelo U1-59, 25 mg/kg, nedeljno, intraperitonealno
Gemzar tretmanska grupa, gemcitabin, 80 mg/kg, nedeljno, intraperitonealno
[0166] Vrednosti medijane zapremina tumora svake kontrolne i tretmanske grupe su prikazane na slici 19. Primena antitela je rezultirala smanjenjem rasta humanih tumora pankreasa u poređenju sa tumorima koji su bili tretirani nespecifičnim humanim IgG ili Gemzar-om.
[0167] Inhibicija HER-3 u humanim tumorima pankreasa bi takođe mogla da bude pokazana u farmakodinamskom eksperimentu. Ksenografti BxPC3 tumora su gajeni kao što je opisano u prethodnom tekstu. 3 miša su tretirana sa 500 µg IgG1 kontrolnog antitela i 3 miša su tretirana sa 500 µg anti-HER-3 antitela U1-59. Miševi su tretirani 1. i 4. dana i zatim žrtvovani 5. dana da bi se izmerila inhibicija fosforilacije HER-3 zavisna od antitela (pHER-3).
[0168] Tumori su homogenizovani u standardnom RIPA puferu sa inhibitorima proteaze. 50 µg bistrog lizata je razdvojeno na 4-20%-tnom Tris-glicin gelu, preneto na nitroceluloznu membranu i blokirano u 3%-tnom goveđem serum albuminu (BSA). Imunobloting je izveden korišćenjem anti-pHER-3 antitela (antitelo 21D3, tehnologija ćelijskog prenosa signala). Anti-aktin antitelo (AB a-2066, Sigma) je korišćeno kao kontrola.
[0169] Ekspresija je detektovana pojačanom hemiluminiscencijom (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Slike su snimane pomoću Versadoc 5000 Imaging System (BioRad, Hercules, CA).
[0170] Rezulti su prikazani na slici 20. Nakon primene humanog anti-HER-3-antitela U1-59 fosforilacija HER-3 više nije bila detektabilna. Stoga, antitela pronalaska su sposobna za značajno smanjenje aktivacije HER-3 u ćelijama humanog tumora pankreasa.
PRIMER 26: Upotreba anti-HER-3 antitela kao dijagnostičkog sredstva
[0171] Anti-HER-3 mAb mogu da se koriste u dijagnostici malignih bolesti. HER-3 je eksprimiran na tumorskim ćelijama na vrlo poseban način u poređenju sa normalnim tkivom i, zbog toga bi analiza eksprimiranja HER-3 pomogla u postavljanju primarne dijagnoze solidnih tumora, određivanju stadijuma i stepena solidnih tumora, proceni prognostičkih kriterijuma za proliferativne bolesti i neoplazije i upravljanje rizikom kod pacijenata sa HER-3 pozitivnim tumorima.
A. Detekcija HER-3 antigena u uzorku
[0172] Razvijen je enzimski imunosorbentni test (ELISA) za detekciju HER-3 antigena u uzorku. U testu, bunarčići mikrotitarske ploče, kao što je mikrotitarska ploča sa 96 bunarčića ili mikrotitarska ploča sa 384 bunarčića, su adsorbovani tokom nekoliko časova prvim potpuno humanim monoklonskim antitelom usmerenim protiv HER-3 antigena. Imobilisano antitelo služi kao „hvatajuće“ antitelo za bilo koji od HER-3 antigena koji mogu da budu prisutni u uzorku. Bunarčići su isprani i tretirani sredstvom za blokiranje kao što je protein mleka ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0173] Nakon toga su bunarčići tretirani ispitivanim uzorkom za koji se pretpostavlja da sadrži HER-3 antigen, ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu HER-3 antigena. Takav uzorak je, na primer, uzorak seruma ispitanika za koga se pretpostavlja da ima određeni nivo cirkulišućeg HER-3 antigena što se smatra pokazateljem patologije. Nakon uklanjanja ispiranjem test uzorka ili standarda, bunarčići su tretirani drugim potpuno humanim monoklonskim anti-HER-3 antitelom koje je obeleženo konjugovanjem sa biotinom. Obeleženo anti-HER-3 antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nakon uklanjanja ispiranjem viška sekundarnog antitela, bunarčići su tretirani peroksidazom rena (HRP) konjugovanom sa avidinom i odgovarajućim hromogenim supstratom. Koncentracija HER-3 antigena u test uzorcima se određuje poređenjem sa standardnom krivom proizašlom iz standardnih uzoraka.
B. Imunohistohemijska (IHC) detekcija HER3-antigena
[0174] U cilju određivanja HER3-antigena u isečcima tkiva pomoću IHC, sa tkiva ukalupljenih parafinom prvo je uklonjen parafin delovanjem ksilena tokom 2 x 5 minuta, a zatim su tkiva hidrirana 100%-tnim etanolom 2 x 3 minuta, 95%-tnim etanolom 1 minut i isprana destilovanom vodom. Antigeni epitopi maskirani fiksacijom formalinom i kalupljenjem parafinom su izloženi demaskiranjem epitopa, enzimskom digestijom ili saponinom. Za demaskiranje epitopa parafinski isečci su zagrevani u aparatu koji proizvodi paru, vodenom kupatilu ili mikrotalasnoj rerni tokom 20-40 minuta u rastvoru za demaskiranje epitopa, kao što je na primer rastvor 2N HCl (pH 1.0). U slučaju enzimske digestije, isečci tkiva su inkubirani na temperaturi od 37°C tokom 10-30 minuta u različitim rastvorima enzima kao što je protienaza K, tripsin, pronaza, pepsin itd.
[0175] Nakon uklanjanja ispiranjem rastvora za demaskiranje enzima ili viška enzima, isečci tkiva su tretirani puferom za blokiranje da bi se sprečile nespecifične interakcije. Primarno antitelo je inkubirano u odgovarajućim razblaženjima u puferu za razblaživanje tokom 1 časa na sobnoj temperaturi ili preko noći. Višak primarnog antitela je uklonjen ispiranjem i isečci su inkubirani u rastvoru za blokiranje peroksidaze tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon još jednog koraka ispiranja, isečci tkiva su inkubirani sa sekundarnim antitelom obeleženim grupom koja može da posluži za učvršćivanje enzima. Primeri za to su sekundarna antitela obeležena biotinom koja prepoznaje peroksidaza rena vezana za streptavidin. Detekcija pomenutog kompleksa antitelo/enzim se postiže inkubiranjem sa pogodnim hromogenim supstratom.
C. Određivanje koncentracije HER-3 antigena u serumu pacijenata
[0176] Sendvič ELISA test je razvijen za kvantifikovanje nivoa HER-3 u humanom serumu. Dva potpuno humana monoklonska anti-HER-3 antitela, korišćena u sendvič ELISA testu, su prepoznala različite domene na HER-3 molekulu i nisu u kompeticiji za vezivanje, na primer videti Primer 8. ELISA test je izveden kao što sledi: ELISA ploče (Fisher) su obložene sa 50 µl „hvatajućeg“ anti-HER-3 antitela u puferu za oblaganje (0.1 M NaHCO3, pH 9.6) u koncentraciji od 2 µg/ml. Nakon inkubacije na temperaturi od 4°C preko noći, ploče su tretirane sa 200 µl pufera za blokiranje (0.5 % BSA, 0.1 % Tween 20, 0.01 % timerosal u PBS-u) tokom 1 časa na temperaturi od 25°C. Ploče su isprane (3x) korišćenjem 0.05%-tnog Tween 20 u PBS-u (pufer za ispiranje, WB). Normalni ili serumi pacijenata (Clinomics, Bioreclaimation) su razblaženi u puferu za blokiranje koji sadrži 50% humanog seruma. Ploče su inkubirane sa uzorcima seruma preko noći na temperaturi od 4°C, isprane sa WB, a zatim inkubirane sa 100 µl/bunarčiću anti-HER-3 antitela za detekciju obeleženog biotinom tokom 1 časa na temperaturi od 25°C. Nakon ispiranja, ploče su inkubirane sa HRP-Streptavidinom tokom 15 minuta, isprane kao u prethodnom koraku, a zatim tretirane sa 100 µl/bunarčiću o-fenilendiamina u H2O2(Sigma rastvor za razvijanje) za stvaranje boje. Reakcija je zaustavljena sa 50 µl/bunarčiću H2SO4(2 M) i analizirana korišćenjem čitača ploča za ELISA test na 492 nm. Koncentracija HER-3 antigena u uzorcima seruma je izračunata u poređenju sa razblaženjima prečišćenog HER-3 antigena korišćenjem četvoroparametarskog programa za fitovanje krive.
Utvrđivanje stadijuma kancera kod pacijenta
[0177] Na osnovu rezultata prikazanih i diskutovanih u tačkama A, B. i C, kroz upotrebu predmetnog pronalaska, moguće je utvrditi stadijum kancera kod ispitanika na osnovu nivoa ekspresije HER-3 antigena. Za dati tip kancera, uzeti su uzorci krvi od ispitanika kod kojih su dijagnostikovani različiti stadijumi progresije bolesti, i/ili se nalaze na različitim tačkama lečenja kancera. Koncentracija HER-3 antigena prisutna u uzorcima krvi se određuje korišćenjem postupka koji specifično određuje količinu antigena koja je prisutna. Takav postupak uključuje ELISA test, kao što je test opisan u tačkama A. i B. Korišćenjem populacije uzoraka koji obezbeđuju statistički značajne rezultate za svaki stadijum progresije ili terapije, određen je opseg koncentracija HER-3 antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stadijum.
[0178] U cilju određivanja stadijuma progresije kancera kod ispitanika u studiji, ili karakterisanja odgovora ispitanika na tok terapije, uzima se uzorak krvi ispitanika i određuje se koncentracija HER-3 antigena prisutna u uzorku. Tako dobijena koncentracija se koristi za utvrđivanje kom opsegu koncentracija nađena vrednost pripada. Tako identifikovani opseg je u korelaciji sa stadijumom progresije ili stadijumom terapije identifikovanim u različitim populacijama dijagnostikovanih ispitanika, pružajući na taj način informaciju o stadijumu kod ispitanika u studiji.
PRIMER 27: Upotrebe anti-HER-3 antitela i konjugata antitela u lečenju ili prevenciji hiperproliferativnih bolesti
[0179] Mnogi solidni tumori su pod kontrolom prenosa signala posredovanog HER familijom i pokazano je da je HER-3 presudni partner u obrazovanju kompleksa između HER-1, HER-2 i HER-4. Dakle, smanjenje ili isključivanje prenosa signala posredovanog sa HER-3 bi uticalo na sve druge članove HER familije i narušilo ćelijski prenos signala što vodi širokom opsegu terapijskih intervencija i mogućnostima za kombinovanu terapiju sa drugim ciljanim sredstvima, biološkim i citotoksičnim sredstvima. Stoga, anti-HER-3 antitela pronalaska mogu da se koriste za lečenje određenih hiperproliferativnih poremećaja ili poremećaja povezanih sa HER-3, koji se zasnivaju na mnogim faktorima kao što je na primer ekspresija HER-3. Tipovi tumora kao što su kancer dojke, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, kancer jajnika, kancer želuca, kancer endometrijuma, kancer pljuvačne žlezde, kancer pluća, kancer bubrega, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, kancer tiroidne žlezde, kancer mokraćne bešike, gliom, melanom, drugi kanceri koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-3, izgleda da predstavljaju poželjne indikacije, ali indikacije nisu ograničene na one na prethodnom spisku. Uz to, sledeće grupe pacijenata će imati korist od lečenja pomoću mAb usmerenog protiv HER-3:
- Pacijenti rezistentni na lečenje sa anti-HER-2 mAb
- Pacijenti koji ne ispunjavaju uslove za lečenje sa anti-HER-2 mAb
- Pacijenti rezistentni na anti-HER-1 mAb ili mali molekul anti-EGFR inhibitora
- Pacijenti sa ne-sitnoćelijskim kancerom pluća rezistentni na erlotinib ili gefitinib.
[0180] Anti-HER-3 antitela pronalaska bi se koristila ili kao monoterapija ili u kombinaciji sa jednim ili više sredstava u takozvanoj "kombinovanoj terapiji". Pomenuta kombinovana terapija može da uključuje, ali bez ograničenja, sredstva prethodno pomenuta u pronalasku. Kombinovana terapija sa anti-HER3 antitelima i drugim sredstvima može da produži preživljavanje pacijenta, vreme do progresije tumora ili poboljša kvalitet života pacijenta. Protokol i plan primene će se odnositi na terapijsku efikasnost kao i na mogućnost smanjivanja uobičajenih doza standardnih terapija, kao što je na primer hemo- ili radio-terapija.
Lečenje ljudi anti-HER-3 antitelima pronalaska
[0181] Da bi se odredili in vivo efekti lečenja anti-HER-3 antitelom kod humanih pacijenata sa tumorima, takvi humani pacijenti, tokom određenog vremena primaju injekcije sa efikasnom količinom anti-HER-3 antitela pronalaska. Periodično tokom tretmana, humani pacijenti se prate da bi se odredilo da li njihovi tumori napreduju, naročito, da li tumori rastu i metastaziraju.
[0182] Pacijent sa tumorom lečen anti-HER-3 antitelima pronalaska ima niži nivo rasta tumora i/ili metastaza u poređenju sa nivoom rasta tumora i metastaza kod pacijenata sa tumorom lečenih važećim standardom zaštitnih terapeutika.
Lečenje konjugatima anti-HER-3 antitela pronalaska
[0183] Da bi se odredili in vivo efekti konjugata anti-HER-3 antitela pronalaska, humani pacijenti ili životinje koje ispoljavaju tumore, tokom određenog vremena primaju injekcije sa efikasnom količinom konjugata anti-HER-3 antitela pronalaska. Na primer, primenjeni konjugat anti-HER-3 antitela je konjugat DM1-anti-HER-3 antitela, konjugat auristatin-anti-HER-3 antitela ili konjugat radioizotop-anti-HER-3 antitela. Periodično tokom tretmana, humani pacijenti ili životinje se prate da bi se odredilo da li njihovi tumori napreduju, naročito, da li tumori rastu i metastaziraju.
[0184] Humani pacijent ili životinja koja ispoljava tumore i podvrgnuta je lečenju sa, na primer, konjugatima DM1-anti-HER-3 antitelo ili konjugatima radioizotop-anti-HER-3 antitelo ima niži nivo rasta tumora i/ili metastaza u poređenju sa kontrolnim pacijentom ili životinjom koja ispoljava tumore i podvrgnuta je lečenju alternativnom terapijom. Kontrolna DM1-antitela koja mogu da se koriste kod životinja uključuju konjugate koji sadrže DM1 vezan za antitela istog izotipa kao anti-HER-3 antitela pronalaska, ali konkretno, koja nemaju mogućnost da se vežu za HER-3 tumorski antigen. Kontrolna radioizotop-antitela koja mogu da se koriste u testovima na životinjama uključuju konjugate koji sadrže radioizotop vezan za antitela istog izotipa kao anti-HER-3 antitela pronalaska, ali konkretno, koja nemaju mogućnost da se vežu za HER-3 tumorski antigen. Zabeleška: kontrolni konjugati se neće primenjivati na ljude.
OPŠTE NAPOMENE
[0185] Prethodno napisana specifikacija se smatra dovoljnom da omogući stručnjaku upoznatom sa stanjem tehnike da praktično izvede pronalazak. Predmetni pronalazak nije ograničen obimom deponovanih konstrukcija, budući da je deponovani primer izvođenja namenjen da predstavlja pojedinačnu ilustraciju određenih objekata pronalaska. Ovde deponovani materijal ne predstavlja priznanje da ovde sadržan pisani opis nije dovoljan da omogući praktično izvođenje bilo kog predmeta pronalaska, uključujući njegove najbolje načine, niti treba da se smatra ograničavajućim za obim patentnih zahteva na specifične ilustracije koje on predstavlja.
[0186] Prethodno napisani opis i Primeri detaljno opisuju određene poželjne primere izvođenja pronalaska i opisuju najbolji način po mišljenju pronalazača. Podrazumeva se, međutim da, bez obzira koliko je detaljan opis u prethodnom tekstu, pronalazak može praktično da se izvede na mnogo načina i pronalazak treba tumačiti u saglasnosti sa njegovim priloženim patentnim zahtevima.
[0187] Dalje, ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi korišćeni u vezi sa predmetnim pronalaskom će imati značenja koja uobičajeno podrazumevaju oni koji su prosečno upoznati sa stanjem tehnike. Osim toga, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, izrazi u jednini će uključivati množinu i izrazi u množini će uključivati jedninu. Uopšteno, nomenklature korišćene u vezi sa, i tehnike kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, i hemije i hibridizacije proteina i oligo- ili polinukleotida, koje su ovde opisane, su dobro poznate i uobičajeno korišćene u stanju tehnike. Standardne tehnike su korišćene za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i gajenje i transformaciju tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvedene prema specifikacijama proizvođača, ili kako se obično izvode u stanju tehnike, ili kao što je ovde opisano. Prethodno pomenute tehnike i procedure su uopšteno izvedene u skladu sa konvencionalnim metodama dobro poznatim u stanju tehnike i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane kroz predmetnu specifikaciju. Videti npr, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)).
[0188] Nomenklature korišćene u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetske organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije, ovde opisane, su dobro poznate i uobičajeno korišćene u stanju tehnike. Standardne tehnike su korišćene za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutska preparativna dobijanja, formulaciju i dostavu leka i za lečenje pacijenata.
SPISAK SEKVENCI
[0189]
Antitelo U1-39
1 DNK teškog lanca:
3 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-40
5 DNK teškog lanca:
7 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-38
9 DNK teškog lanca:
11 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-41
13 DNK teškog lanca:
15 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-42
17 DNK teškog lanca:
18 Protein teškog lanca:
19 DNK lakog lanca:
20 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-43
21 DNK teškog lanca:
23 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-44
25 DNK teškog lanca:
27 DNK lakog lanca:
Antitelo (U1-45)
29 DNK teškog lanca:
31 DNK lakog lanca:
Antitelo (U1-46)
33 DNK teškog lanca:
34 Protein teškog lanca:
Antitelo U1-47
35 DNK teškog lanca:
37 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-48
39 DNK teškog lanca:
Antitelo U1-49
41 DNK teškog lanca:
43 DNK lakog lanca:
44 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-50
45 DNK teškog lanca:
47 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-51
49 DNK teškog lanca:
51 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-53
53 DNK teškog lanca:
55 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-55
57 DNK lakog lanca:
Antitelo (U1-55.1)
59 DNK teškog lanca:
60 Protein teškog lanca:
Antitelo (U1-57)
61 DNK teškog lanca:
Antitelo U1-57.1
63 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-58
65 DNK teškog lanca:
67 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-59
69 DNK teškog lanca:
71 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-52
73 DNK teškog lanca:
75 DNK lakog lanca:
76 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-61
77 DNK teškog lanca:
Antitelo U1-61.1
79 DNK teškog lanca:
81 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-62 (2.9.1)
83 DNK teškog lanca:
85 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-2
87 DNK teškog lanca:
89 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-7
91 DNK teškog lanca:
92 Protein teškog lanca:
94 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-9
95 DNK teškog lanca:
97 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-10
99 DNK teškog lanca:
101 DNK lakog lanca:
102 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-12
103 DNK teškog lanca:
105 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-13
107 DNK teškog lanca:
109 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-14
111 DNK teškog lanca:
113 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-15
115 DNK teškog lanca:
117 DNK lakog lanca:
118 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-19
119 DNK teškog lanca:
Antitelo U1-20
121 DNK teškog lanca:
123 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-21
125 DNK teškog lanca:
127 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-22
129 DNK teškog lanca:
131 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-23
133 DNK teškog lanca:
134 Protein teškog lanca:
136 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-24
137 DNK teškog lanca:
139 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-25
141 DNK teškog lanca:
143 DNK lakog lanca:
144 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-26
145 DNK teškog lanca:
147 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-27
149 DNK teškog lanca:
151 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-28
153 DNK teškog lanca:
154 Protein teškog lanca:
156 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-31
157 DNK teškog lanca:
159 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-32
161 DNK teškog lanca:
163 DNK lakog lanca:
164 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-35
165 DNK teškog lanca:
167 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-36
169 DNK teškog lanca:
171 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-37
173 DNK teškog lanca:
174 Protein teškog lanca:
176 Protein lakog lanca:
Antitelo U1-34
177 DNK teškog lanca:
179 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-1
181 DNK teškog lanca:
183 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-3
185 DNK teškog lanca:
187 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-4 H3_133_1N1G1
189 DNK teškog lanca:
191 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-5
193 DNK teškog lanca:
195 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-6
197 DNK teškog lanca:
199 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-8
201 DNK teškog lanca:
203 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-11
205 DNK teškog lanca:
207 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-16
209 DNK teškog lanca:
211 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-17
213 DNK teškog lanca:
215 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-18
217 DNK teškog lanca:
219 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-33
221 DNK teškog lanca:
223 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-29
225 DNK teškog lanca:
227 DNK lakog lanca:
Antitelo U1-30
229 DNK teškog lanca:
231 DNK lakog lanca:
SPISAK SEKVENCI
[0190]
Prajmer (SEQ ID NO: 233): CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC
Prajmer (SEQ ID NO: 234): GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGTTGTCCTAAA Tabela CDR sekvenci

Claims (17)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Izolovano antitelo ili fragment antitela koje se vezuje za HER-3, naznačeno time što sadrži CDR1 teškog lanca predstavljen sekvencom GGSFSGYYWS, CDR2 teškog lanca predstavljen sekvencom EINHSGSTNYNPSLKS i CDR3 teškog lanca predstavljen sekvencom DKWTWYFDL, i CDR1 lakog lanca predstavljen sekvencom RSSQSVLYSSSNRNYLA, CDR2 lakog lanca predstavljen sekvencom WASTRES i CDR3 lakog lanca predstavljen sekvencom QQYYSTPRT.
  2. 2. Izolovano antitelo ili fragment antitela prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:70 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:72.
  3. 3. Izolovano antitelo ili fragment antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što predstavlja monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment antitela, naznačen time što je fragment antitela poželjno Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab’)2fragment, Fv fragment, di-antitelo, ili jednolančani molekul antitela.
  4. 4. Izolovano antitelo ili fragment antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što pomenuto izolovano antitelo predstavlja IgG1-, IgG2-, IgG3- ili IgG4-tip.
  5. 5. Izolovano antitelo ili fragment antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time što je antitelo vezano za grupu za obeležavanje, koja je poželjno radioizotop ili radionuklid, fluorescentna grupa, enzimska grupa, hemiluminiscentna grupa, biotinil grupa, ili unapred određeni polipeptidni epitop.
  6. 6. Izolovano antitelo ili fragment antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time što je antitelo ili fragment antitela vezano za efektorsku grupu, koja je poželjno radioizotop ili radionuklid, toksin, ili terapijska ili hemoterapijska grupa, naznačena time što je terapijska ili hemoterapijska grupa npr. izabrana iz grupe koja se sastoji od kaliheamicina, auristatina-PE, geldanamicina, maitansina i njihovih derivata.
  7. 7. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili fragment antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što je molekul nukleinske kiseline poželjno operativno povezan sa kontrolnom sekvencom.
  8. 8. Vektor, naznačen time što sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 7.
  9. 9. Ćelija-domaćin, naznačena time što je transformisana vektorom prema patentnom zahtevu 8.
  10. 10. Postupak za pripremanje izolovanog antitela ili fragmenta antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što obuhvata korak izolovanja pomenutog antitela ili fragmenta antitela iz ćelije-domaćina, naznačen time što je ćelija-domaćin poželjno sisarska ćelija, biljna ćelija, ćelija gljive, ili prokariotska ćelija.
  11. 11. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što sadrži kao aktivno sredstvo najmanje jedno izolovano antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, i farmaceutski prihvatljiv nosač, diluent ili adjuvans.
  12. 12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11 pogodna za terapijsku upotrebu.
  13. 13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11 pogodna za dijagnostičku upotrebu.
  14. 14. Upotreba antitela ili fragmenta antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-6 u postupku za dijagnostikovanje bolesti povezane sa HER-3, posebno hiperproliferativne bolesti, koja je poželjno odabrana iz grupe koja se sastoji od kancera dojke, gastrointestinalnog kancera, kancera pankreasa, kancera prostate, kancera jajnika, kancera želuca, kancera endometrijuma, kancera pljuvačne žlezde, kancera pluća, kancera bubrega, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, kancera tiroidne žlezde, kancera mokraćne bešike, glioma, melanoma, drugih kancera koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju HER-3, kancera testisa, sarkoma mekog tkiva, kancera glave i vrata i formiranja metastaza tumora, naznačena time što postupak obuhvata: (a) dovođenje u kontakt uzorka i antitela ili fragmenta antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pod uslovima pogodnim da omoguće vezivanje pomenutog antitela za HER-3; i (b) identifikovanje vezivanja pomenutog antitela za HER-3.
  15. 15. Upotreba prema patentnom zahtevu 14, naznačena time što je pomenuta hiperproliferativna bolest povezana sa povećanom fosforilacijom HER-3, povećanom heterodimerizacijom HER-2/HER-3 ili povećanom aktivnošću PI3-kinaze, c-junterminalne kinaze, AKT, ERK2 i/ili PYK2.
  16. 16. Kit, naznačen time što sadrži izolovano antitelo ili fragment antitela prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-6.
  17. 17. Kit prema patentnom zahtevu 16, naznačen time što sadrži dodatno terapijsko sredstvo, naznačeno time što je dodatno terapijsko sredstvo poželjno antineoplastično sredstvo, npr. anti-tumorsko antitelo ili hemoterapijsko sredstvo.
RS20170340A 2005-12-30 2006-12-29 Antitela usmerena protiv her-3 i njihove upotrebe RS55979B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US75510305P 2005-12-30 2005-12-30
EP06841231.1A EP1984402B1 (en) 2005-12-30 2006-12-29 Antibodies directed to her-3 and uses thereof
PCT/EP2006/012632 WO2007077028A2 (en) 2005-12-30 2006-12-29 Antibodies directed to her-3 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55979B1 true RS55979B1 (sr) 2017-09-29

Family

ID=38110697

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170340A RS55979B1 (sr) 2005-12-30 2006-12-29 Antitela usmerena protiv her-3 i njihove upotrebe
RS20191019A RS59100B1 (sr) 2005-12-30 2006-12-29 Antitela usmerena protiv her-3 i njihove upotrebe

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191019A RS59100B1 (sr) 2005-12-30 2006-12-29 Antitela usmerena protiv her-3 i njihove upotrebe

Country Status (32)

Country Link
US (6) US7705130B2 (sr)
EP (4) EP3196213B1 (sr)
JP (3) JP5207979B2 (sr)
KR (1) KR101418606B1 (sr)
CN (3) CN102174105B (sr)
AR (1) AR056857A1 (sr)
AU (1) AU2006332065B2 (sr)
BR (1) BRPI0620803B8 (sr)
CA (1) CA2633222C (sr)
CL (1) CL2014001334A1 (sr)
CR (1) CR10082A (sr)
CY (2) CY1118979T1 (sr)
DK (2) DK2993187T3 (sr)
EA (1) EA015782B1 (sr)
ES (3) ES2881886T3 (sr)
HR (2) HRP20170558T1 (sr)
HU (2) HUE044756T2 (sr)
IL (2) IL225372A (sr)
LT (2) LT2993187T (sr)
MX (1) MX2008008248A (sr)
MY (2) MY162624A (sr)
NO (1) NO346160B1 (sr)
NZ (3) NZ607711A (sr)
PL (2) PL1984402T3 (sr)
PT (2) PT2993187T (sr)
RS (2) RS55979B1 (sr)
SG (2) SG174017A1 (sr)
SI (1) SI2993187T1 (sr)
TW (2) TWI432452B (sr)
UA (1) UA97473C2 (sr)
WO (1) WO2007077028A2 (sr)
ZA (1) ZA200805474B (sr)

Families Citing this family (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002051438A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of repulsive guidance molecule (rgm) and its modulators
EP1228766A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PYK2 phosphorylation by HER3 induces tumor invasion
US8505468B2 (en) * 2002-11-19 2013-08-13 Sharp Kabushiki Kaisha Substrate accommodating tray
EP1868647A4 (en) * 2005-03-24 2009-04-01 Millennium Pharm Inc OV064 BINDING ANTIBODIES AND METHOD FOR THEIR USE
US8759490B2 (en) 2005-03-24 2014-06-24 Millennium Pharamaceuticals, Inc. Antibodies that bind OV064 and methods of use therefor
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
AU2015201263B2 (en) * 2005-12-30 2017-01-12 Amgen Inc. Material and methods for treating or preventing her-3 associated diseases
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
AU2007324868B2 (en) 2006-11-28 2014-03-20 Daiichi Sankyo Europe Gmbh Activated HER3 as a marker for predicting therapeutic efficacy
WO2008100624A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
JP5779350B2 (ja) 2007-03-27 2015-09-16 シー レーン バイオテクノロジーズ， エルエルシー 抗体代替軽鎖配列を含む構築物およびライブラリー
EP1997830A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
AU2009241589B2 (en) 2008-04-29 2013-10-10 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
BRPI0911451A2 (pt) * 2008-05-25 2019-09-24 Wyeth Llc biomarcadores para eficácia medicamentosa de egfr/her/erb
UY31861A (es) 2008-06-03 2010-01-05 Abbott Lab Inmunoglobulina con dominio variable dual y usos de la misma
EP2138511A1 (en) * 2008-06-27 2009-12-30 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. HER3 as a determinant for the prognosis of melanoma
WO2010006060A2 (en) 2008-07-08 2010-01-14 Abbott Laboratories Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013202410B2 (en) * 2008-07-16 2014-10-09 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neautralizing antibodies and use thereof
ES2433424T3 (es) * 2008-08-15 2013-12-11 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Métodos y sistemas para predecir respuesta de células frente a un agente terapéutico
MX2011004467A (es) * 2008-10-31 2011-07-28 Biogen Idec Inc Moleculas de objetivo light y usos de las mismas.
WO2010085845A1 (en) * 2009-01-28 2010-08-05 The University Of Queensland Cancer therapy and/or diagnosis
ES2434017T3 (es) * 2009-02-24 2013-12-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Utilización del s-ErbB-3 como marcador de cáncer
WO2010108127A1 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Genentech, Inc. Bispecific anti-her antibodies
BRPI1012589A2 (pt) 2009-04-07 2016-03-22 Roche Glycart Ag anticorpos bi-específicos anti-erbb-3/anti-c-met
AU2010242914B2 (en) 2009-04-29 2014-11-13 Trellis Bioscience, Llc Improved antibodies immunoreactive with heregulin-coupled HER3
EP2430047B1 (en) 2009-05-13 2018-03-28 i2 Pharmaceuticals, Inc. Neutralizing molecules to influenza viruses
WO2011004899A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cancerous disease modifying antibodies
SG178602A1 (en) 2009-09-01 2012-04-27 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2775573A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-her 3 antibodies
KR20140015139A (ko) 2009-10-15 2014-02-06 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US8785600B2 (en) * 2009-10-23 2014-07-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-GCC antibody molecules and related compositions and methods
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011051333A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Novartis Ag Universal fibronectin type iii bottom-side binding domain libraries
MX358013B (es) * 2009-11-13 2018-08-01 Amgen Inc Materiales y metodos para el tratamiento o prevencion de enfermedades asociadas al her-3.
BR112012013734A2 (pt) 2009-12-08 2017-01-10 Abbott Gmbh & Co Kg anticorpos monoclonais contra a proteína rgm a para uso no tratamento da degeneração da camada de fibras nervosas da retina.
HUE029026T2 (en) * 2009-12-22 2017-01-30 Roche Glycart Ag ANTI-HER3 Antibodies and uses thereof
CA2791652C (en) 2010-03-02 2018-06-12 Kyowa Kirin Co., Ltd. Modified antibody composition
EP2544680B1 (en) 2010-03-11 2015-01-14 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Use of erbb3 inhibitors in the treatment of triple negative breast cancer
PH12012502022B1 (en) 2010-04-09 2019-03-08 Aveo Pharmaceuticals Inc Anti-erbb3 antibodies
EP2571901B1 (en) * 2010-05-20 2019-01-02 Ablynx N.V. Biological materials related to her3
AR084469A1 (es) 2010-07-09 2013-05-22 Exelixis Inc Combinaciones de inhibidores de quinasas para el tratamiento del cancer
RU2013108962A (ru) 2010-07-30 2014-09-10 Новартис Аг Молекулы фибронектина, содержащие карман, и их библиотеки
CA2807014A1 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012019024A2 (en) * 2010-08-04 2012-02-09 Immunogen, Inc. Her3-binding molecules and immunoconjugates thereof
CA2815154A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
AU2011290672B2 (en) * 2010-08-20 2015-07-09 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (HER3)
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
TW201302793A (zh) * 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
IT1402149B1 (it) * 2010-10-04 2013-08-28 Ist Fisioterap Ospitalroma Uso di un fosfopeptide in grado di bloccare l interazione her3/p85 per il trattamento dei tumori iperesprimenti her2.
ES2632486T3 (es) * 2010-10-18 2017-09-13 Mediapharma S.R.L. Anticuerpo de unión a ErbB3
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
EP2635604B1 (en) 2010-11-01 2016-11-30 Symphogen A/S Pan-her antibody composition
ITRM20100577A1 (it) * 2010-11-02 2012-05-03 Takis Srl Immunoterapia contro il recettore erbb-3
KR102058658B1 (ko) 2010-12-15 2019-12-24 다이가쿠쿄도리요우키칸호우진 죠우호우시스테무 겡큐키코우 단백질의 생산 방법
EP2658868B1 (en) * 2010-12-29 2019-07-17 Expression Pathology, Inc. Her3 protein srm/mrm assay
KR20140044796A (ko) 2011-03-11 2014-04-15 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 호르몬 무반응 유방암의 치료에서 ｅｇｆｒ-패밀리 수용체의 저해제의 용도
EA201301025A1 (ru) 2011-03-15 2014-01-30 Мерримак Фармасьютикалс, Инк. Преодоление устойчивости к ингибиторам пути erbb
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
ES2657862T3 (es) * 2011-05-13 2018-03-07 Gamamabs Pharma Anticuerpos contra HER3
CN103890010B (zh) 2011-05-19 2017-04-19 法国国家健康医学研究院 抗‑人‑her3抗体及其用途
EP2722343A4 (en) * 2011-06-20 2014-12-17 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ANTI-ERBB3 ANTIBODIES
US10300140B2 (en) 2011-07-28 2019-05-28 I2 Pharmaceuticals, Inc. Sur-binding proteins against ERBB3
JP2015527869A (ja) 2011-08-26 2015-09-24 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド タンデムＦｃ二重特異性抗体
US9273143B2 (en) 2011-09-30 2016-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody
SG11201400150TA (en) 2011-09-30 2014-03-28 Regeneron Pharma Anti-erbb3 antibodies and uses thereof
AU2012318541B2 (en) 2011-10-06 2018-04-12 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Predicting tumor response to anti-ERBB3 antibodies
CN104053670A (zh) 2011-10-31 2014-09-17 百时美施贵宝公司 具有降低的免疫原性的纤连蛋白结合域
CA2855298A1 (en) 2011-11-09 2013-05-16 The Uab Research Foundation Her3 antibodies and uses thereof
ES2745684T3 (es) 2011-11-23 2020-03-03 Medimmune Llc Moléculas de unión específicas para HER3 y usos de las mismas
AU2012349739A1 (en) * 2011-12-05 2014-06-26 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (HER3) directed to domain III and domain IV of HER3
CA2857601A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-13 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (her3) directed to domain ii of her3
US9192663B2 (en) * 2011-12-05 2015-11-24 Novartis Ag Antibodies for epidermal growth factor receptor 3 (HER3)
EP2793940B1 (en) 2011-12-22 2018-11-14 i2 Pharmaceuticals, Inc. Surrogate binding proteins
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
RS57603B1 (sr) 2012-01-27 2018-11-30 Abbvie Deutschland Sastav i metod za dijagnozu i tretiranje bolesti povezanih sa degeneracijom neurita
CN104136464A (zh) 2012-02-23 2014-11-05 U3制药有限公司 用于调节放射敏感性的her3抑制剂
AU2013240261A1 (en) 2012-03-27 2014-09-18 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to HER3 inhibitors
CA2871614C (en) 2012-04-27 2021-08-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-gcc antibody molecules and use of same to test for susceptibility to gcc-targeted therapy
CA2872226A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
EP2900696A1 (en) 2012-09-25 2015-08-05 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
US9346890B2 (en) * 2012-10-25 2016-05-24 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind ErbB3
PE20151179A1 (es) 2012-11-01 2015-09-12 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual anti-vegf/dll4 y usos de las mismas
MA38164B1 (fr) 2012-11-08 2018-11-30 Hoffmann La Roche Protéines de liaison à l'antigène anti-her3/her4 se liant à la boucle en épingle à cheveux beta
AU2013343667A1 (en) 2012-11-08 2015-04-02 F. Hoffmann-La Roche Ag HER3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of HER3
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9180185B2 (en) 2013-01-11 2015-11-10 Hoffman-La Roche Inc. Combination therapy of anti-HER3 antibodies
KR20150143458A (ko) 2013-03-06 2015-12-23 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 항-C-MET 탠덤 Fc 이중특이적 항체
EP2970494B1 (en) * 2013-03-14 2017-12-13 The Board of Regents of The University of Texas System Her3 specific monoclonal antibodies for diagnostic and therapeutic use
BR112015022576A2 (pt) 2013-03-14 2017-10-24 Genentech Inc produto farmacêutico e seu uso, kit e método para tratar uma disfunção hiperproliferativa
US9062108B2 (en) 2013-03-15 2015-06-23 Abbvie Inc. Dual specific binding proteins directed against IL-1 and/or IL-17
WO2014144817A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to wnt inhibitors
EP2821071A1 (en) 2013-07-04 2015-01-07 Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) Compounds for breast cancer treatment
TW201605896A (zh) * 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
CA2923145C (en) 2013-09-05 2025-09-16 Amgen Inc. MOLECULES CONTAINING FCS AND EXHIBITING PREDICTABLE, UNIFORM AND REPRODUCIBLE GLYCOFORM PROFILES
US11305012B2 (en) 2013-09-24 2022-04-19 Medimmune, Llc Binding molecules specific for HER3 and uses thereof
US10519247B2 (en) * 2013-11-01 2019-12-31 Board Of Regents,The University Of Texas System Targeting HER2 and HER3 with bispecific antibodies in cancerous cells
US10196455B2 (en) 2013-11-07 2019-02-05 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Neuregulin allosteric anti-HER3 antibody
EP3087394A2 (en) 2013-12-27 2016-11-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarker profiles for predicting outcomes of cancer therapy with erbb3 inhibitors and/or chemotherapies
NZ724229A (en) 2014-03-11 2023-06-30 Regeneron Pharma Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
CN111228511B (zh) 2014-04-10 2024-06-18 第一三共株式会社 抗her3抗体-药物偶联物
WO2015157634A1 (en) 2014-04-11 2015-10-15 Kolltan Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbb antibodies and methods of use thereof
FR3020063A1 (fr) 2014-04-16 2015-10-23 Gamamabs Pharma Anticorps humain anti-her4
MX2016014416A (es) 2014-05-14 2017-02-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-her3 que se unen a la horquilla beta de her3.
WO2015175861A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Amgen Inc. Assay for detecting th1 and th2 cell populations
WO2016059602A2 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Glaxo Group Limited Methods of treating cancer and related compositions
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
CA2978631C (en) * 2015-03-09 2023-06-27 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (adc) that bind to flt3 proteins
EP3091033A1 (en) 2015-05-06 2016-11-09 Gamamabs Pharma Anti-human-her3 antibodies and uses thereof
US10184006B2 (en) 2015-06-04 2019-01-22 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for predicting outcomes of cancer therapy with ErbB3 inhibitors
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
JP6787890B2 (ja) 2015-06-29 2020-11-18 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートの選択的製造方法
TW201716439A (zh) 2015-07-20 2017-05-16 美國禮來大藥廠 Ｈｅｒ３抗體
US20220313841A1 (en) * 2015-09-02 2022-10-06 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Compositions and methods for treating nervous system injuries
AU2016366521A1 (en) 2015-12-11 2018-06-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to EGFR and/or ErbB3 blockade
CA3011949A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating er+, her2-, hrg+ breast cancer using combination therapies comprising an anti-erbb3 antibody
CN108778274A (zh) 2016-03-18 2018-11-09 新泽西鲁特格斯州立大学 用通过可体内裂解的连接部分与抗蛋白裂解酶抗体缀合的化学治疗剂靶向肿瘤细胞
SG11201903785TA (en) 2016-12-09 2019-05-30 Seattle Genetics Inc Bivalent antibodies masked by coiled coils
TWI862473B (zh) * 2016-12-12 2024-11-21 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與免疫檢查點抑制劑之組合、以及醫藥組成物之用途
TWI780104B (zh) 2017-01-17 2022-10-11 日商第一三共股份有限公司 抗ｇｐｒ２０抗體及抗ｇｐｒ２０抗體-藥物結合物、以及其製造方法及用途
WO2018159582A1 (ja) 2017-02-28 2018-09-07 学校法人近畿大学 抗ｈｅｒ３抗体－薬物コンジュゲート投与によるｅｇｆｒ－ｔｋｉ抵抗性の非小細胞肺癌の治療方法
US12503700B2 (en) 2017-03-14 2025-12-23 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
TWI855528B (zh) 2017-05-15 2024-09-11 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
WO2019039483A1 (ja) 2017-08-23 2019-02-28 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの製剤及びその凍結乾燥方法
US11318212B2 (en) 2017-08-31 2022-05-03 Daiichi Sankyo Company, Limited Method for producing antibody-drug conjugate
AU2018327171B2 (en) 2017-08-31 2023-03-09 Daiichi Sankyo Company, Limited Improved method for producing antibody-drug conjugate
EP3758751A4 (en) 2018-02-28 2021-11-17 Wuxi Biologics Ireland Limited. MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST HUMAN LAG-3, METHOD OF MANUFACTURING AND USING THEREOF
CN120173101A (zh) 2018-03-22 2025-06-20 表面肿瘤学有限责任公司 抗il-27抗体及其用途
JP2021519068A (ja) 2018-03-26 2021-08-10 アムジェン インコーポレイテッド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォーム
WO2019210144A1 (en) * 2018-04-27 2019-10-31 Vanderbilt University Broadly neutralizing antibodies against hepatitis c virus
SMT202300227T1 (it) 2018-05-18 2023-09-06 Glycotope Gmbh Anticorpo anti-muc1
US20210283269A1 (en) 2018-07-25 2021-09-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
IL280296B2 (en) 2018-07-27 2025-03-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Drug recognition protein of an antibody-drug conjugate
AU2019315177A1 (en) 2018-07-31 2021-02-25 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment of metastatic brain tumor by administration of antibody-drug conjugate
EP3834843A4 (en) 2018-08-06 2022-05-11 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATE AND TUBULIN INHIBITOR
CN112739826A (zh) 2018-08-23 2021-04-30 第一三共株式会社 抗体-药物缀合物的敏感性标志物
IL281344B2 (en) 2018-09-10 2025-09-01 Mirati Therapeutics Inc Combination of adagrasib and cetuximab for cancer treatment
EP3854418A4 (en) 2018-09-20 2022-07-27 Daiichi Sankyo Company, Limited TREATMENT OF HER3 MUTANT CANCER BY ADMINISTRATION OF ANTI-HER3 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
CN111289748A (zh) * 2018-12-08 2020-06-16 惠州市中大惠亚医院 ErbB3蛋白在制备膀胱癌无创诊断产品中的应用
TW202034959A (zh) 2018-12-11 2020-10-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與parp抑制劑之組合
WO2020119719A1 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Anti-tim-3 antibodies and uses thereof
BR112021011393A2 (pt) 2018-12-13 2021-08-31 Surface Oncology, Inc. Anticorpos anti-il-27 e usos dos mesmos
JPWO2020130125A1 (ja) 2018-12-21 2021-11-04 第一三共株式会社 抗体−薬物コンジュゲートとキナーゼ阻害剤の組み合わせ
KR20220069982A (ko) 2019-09-26 2022-05-27 암젠 인크 항체 조성물의 생산 방법
MX2022005249A (es) 2019-11-01 2022-07-12 Magenta Therapeutics Inc Anticuerpos anti-cd45 y conjugados de los mismos.
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
PH12022551810A1 (en) * 2020-01-24 2024-02-19 Regeneron Pharma Protein-antiviral compound conjugates
US11896619B2 (en) * 2020-03-10 2024-02-13 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for immunotherapy of NPM1c-positive cancer
CN111282165B (zh) * 2020-03-18 2025-03-21 核工业总医院 放射治疗定位显影液及定位显影标记敷贴
EP4162257A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
AU2021360625A1 (en) 2020-10-14 2023-06-01 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Anti-her3 antibody and anti-her3 antibody-drug conjugate and medical use thereof
EP4229080A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 Amgen Inc. Relative unpaired glycans in antibody production methods
BR112023008845A2 (pt) 2020-11-11 2023-10-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Composição farmacêutica, e, método de tratamento
MX2023005940A (es) * 2020-11-20 2023-07-27 Actinium Pharmaceuticals Inc Radioinmunoterapia con her3 para el tratamiento de canceres solidos.
US12551584B1 (en) 2020-12-07 2026-02-17 Actinium Pharmaceuticals, Inc. Lewis Y radioimmunotherapy for the treatment of cancer
EP4317549A4 (en) 2021-03-31 2025-03-26 Ddbio. Co, Ltd., (Shang Hai) Vector and method for screening functional antigen-binding protein
JP2024522389A (ja) 2021-04-29 2024-06-19 ハイスリンク セラピューティクス 抗体薬物複合体の調製方法および使用
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas
EP4355787A4 (en) * 2021-06-15 2025-04-30 Beijing Sinotau Bio-Pharmaceuticals Technology Co., Ltd. Anti-her3 antibody, antibody drug conjugate containing the same, and use thereof
WO2023024949A1 (zh) 2021-08-24 2023-03-02 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种由可断裂连接子偶联的抗体偶联药物
WO2023059607A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023103854A1 (zh) 2021-12-09 2023-06-15 昆山新蕴达生物科技有限公司 一种亲和力改善的抗体-药物偶联物、其制备方法及应用
CN118434453A (zh) 2022-01-28 2024-08-02 映恩生物制药（苏州）有限公司 Her3抗体药物偶联物及其用途
WO2023165475A1 (zh) * 2022-03-03 2023-09-07 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 Her3结合蛋白及其用途
US20250276079A1 (en) 2022-04-27 2025-09-04 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATE WITH EZH1 and/or EZH2 INHIBITOR
WO2023208216A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugates and preparation methods and use thereof
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
EP4522658A1 (en) 2022-05-11 2025-03-19 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
AR131815A1 (es) 2023-02-09 2025-05-07 Beigene Ltd Conjugados de enlace autoestabilizantes
WO2024220916A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
JPWO2024248123A1 (sr) 2023-06-02 2024-12-05
CN116444672B (zh) 2023-06-13 2023-11-03 上海偌妥生物科技有限公司 人表皮生长因子3的抗体、其制备方法及其应用
TW202500198A (zh) 2023-06-29 2025-01-01 瑞士商百濟神州瑞士有限責任公司 生物活性偶聯物、其製備方法及用途
TW202500197A (zh) 2023-06-29 2025-01-01 瑞士商百濟神州瑞士有限責任公司 生物活性結合物、其製備方法及其用途
TW202508639A (zh) 2023-06-30 2025-03-01 日商第一三共股份有限公司 包含使用活性碳材料之純化步驟的抗體-藥物結合物之製造方法
AU2024325342A1 (en) 2023-08-14 2026-02-26 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2025190404A1 (zh) * 2024-03-14 2025-09-18 珠海普米斯生物科技有限公司 双特异性抗体、抗体药物偶联物及其应用

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
JPS58166634A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
JPS58166633A (ja) 1982-03-29 1983-10-01 Toshiba Corp 有機溶媒電池用正極
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
JPS62170639A (ja) 1986-01-22 1987-07-27 株式会社システムメンテナンス 防蟻板の取付け工法
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
FR2625508B1 (fr) 1987-12-30 1992-05-22 Charbonnages Ste Chimique Compositions polymeres ignifugees et leur application au revetement de cables electriques
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5183884A (en) * 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
EP0546091B1 (en) 1990-08-29 2007-01-24 Pharming Intellectual Property BV Homologous recombination in mammalian cells
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU4541093A (en) 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
CA2175893C (en) * 1993-11-23 2010-06-22 Paul J. Godowski Protein tyrosine kinases named rse
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5837815A (en) * 1994-12-15 1998-11-17 Sugen, Inc. PYK2 related polypeptide products
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1997007671A1 (en) 1995-08-29 1997-03-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for constructing the same
US5968511A (en) 1996-03-27 1999-10-19 Genentech, Inc. ErbB3 antibodies
CA2246429C (en) 1996-03-27 2007-07-24 Genentech, Inc. Erbb3 antibodies
US6114595A (en) * 1996-04-11 2000-09-05 The Procter & Gamble Company Stretchable, extensible composite topsheet for absorbent articles
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
JP2001505779A (ja) 1996-12-11 2001-05-08 スージェン・インコーポレーテッド Ｐｙｋ２関連産物および方法
US6235883B1 (en) * 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
EP1141722A1 (en) 1998-12-31 2001-10-10 Sugen, Inc. Pyk2 (raftk) and inflammation
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
AUPQ105799A0 (en) * 1999-06-18 1999-07-08 Victor Chang Cardiac Research Institute, The Cell growth inhibition
US6949245B1 (en) * 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
ES2329437T3 (es) 1999-06-25 2009-11-26 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-erbb2 humanizados y tratamiento con anticuerpos anti-erbb2.
TR200200472T2 (tr) 1999-08-27 2002-06-21 Genentech, Inc. Anti-Erb B2 antikorları ile tedavi için dozajlar
FR2817258B1 (fr) * 2000-11-27 2003-01-10 Atofina Procede de sulfochloration photochimique d'alcanes gazeux
WO2003011897A1 (en) * 2001-07-27 2003-02-13 The Regents Of The University Of California Modulation of heregulin and her3 interaction
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
EP1438583B1 (en) * 2001-09-20 2009-09-16 Board of Regents, The University of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using elisa assays
ES2645563T3 (es) 2001-11-30 2017-12-05 Amgen Fremont Inc. Animales transgénicos que portan genes de cadena ligera de Ig humana
CA2478547C (en) 2001-12-03 2011-09-20 Abgenix, Inc. Identification of high affinity molecules by limited dilution screening
CN1219882C (zh) 2002-03-18 2005-09-21 上海泽生科技开发有限公司 以erbb－3为基础的用于肿瘤治疗的方法和组合物
EP2400021B1 (en) 2002-03-26 2016-11-30 Zensun (Shanghai) Science & Technology, Co., Ltd. ErbB3 based methods and compositions for treating neoplasms
US7332580B2 (en) * 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The University Of California Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
PL374875A1 (en) 2002-07-25 2005-11-14 Aclara Biosciences, Inc. Detecting receptor oligomerization
ES2347239T3 (es) * 2002-12-02 2010-10-27 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos dirigidos al factor de necrosis tumoral y usos de los mismos.
AU2004225439A1 (en) 2003-04-01 2004-10-14 Monogram Biosciences, Inc. Intracellular complexes as biomarkers
JP2005024385A (ja) 2003-07-02 2005-01-27 Matsushita Electric Ind Co Ltd 感圧センサ
AR056857A1 (es) * 2005-12-30 2007-10-24 U3 Pharma Ag Anticuerpos dirigidos hacia her-3 (receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-3) y sus usos
MX358013B (es) * 2009-11-13 2018-08-01 Amgen Inc Materiales y metodos para el tratamiento o prevencion de enfermedades asociadas al her-3.
CA2815154A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 U3 Pharma Gmbh Use of her3 binding agents in prostate treatment
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
JP7372920B2 (ja) * 2017-12-29 2023-11-01 セレクティス Ｃａｒ ｔ細胞の作製を改良するための方法
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Also Published As

Publication number Publication date
JP5207979B2 (ja) 2013-06-12
EP1984402B1 (en) 2017-02-08
LT2993187T (lt) 2019-09-10
PL2993187T3 (pl) 2019-11-29
SG174017A1 (en) 2011-09-29
CA2633222A1 (en) 2007-07-12
US20190263930A1 (en) 2019-08-29
IL191852A (en) 2013-09-30
CN102633881B (zh) 2014-08-13
EP2993187A2 (en) 2016-03-09
JP2009521913A (ja) 2009-06-11
US9249230B2 (en) 2016-02-02
AU2006332065A1 (en) 2007-07-12
EP3196213B1 (en) 2021-07-14
HUE032209T2 (en) 2017-09-28
UA97473C2 (ru) 2012-02-27
CA2633222C (en) 2017-07-11
HRP20170558T1 (hr) 2017-06-16
BRPI0620803B1 (pt) 2020-12-29
IL225372A (en) 2016-07-31
US20100183631A1 (en) 2010-07-22
SI2993187T1 (sl) 2019-09-30
NZ569005A (en) 2012-02-24
DK2993187T3 (da) 2019-08-26
EP2993187A3 (en) 2016-06-01
HRP20191462T1 (hr) 2019-11-15
NZ607711A (en) 2014-09-26
US20120058122A1 (en) 2012-03-08
CN102633881A (zh) 2012-08-15
AU2006332065B2 (en) 2012-04-12
HK1173158A1 (en) 2013-05-10
ES2743229T3 (es) 2020-02-18
EP3950715A1 (en) 2022-02-09
PT2993187T (pt) 2019-06-27
TWI523865B (zh) 2016-03-01
CY1122250T1 (el) 2020-11-25
CY1118979T1 (el) 2018-12-12
MX2008008248A (es) 2008-11-26
MY153751A (en) 2015-03-13
CN102174105A (zh) 2011-09-07
EP2993187B1 (en) 2019-05-22
ES2621546T3 (es) 2017-07-04
US7705130B2 (en) 2010-04-27
PT1984402T (pt) 2017-04-27
CR10082A (es) 2008-11-18
HK1133266A1 (en) 2010-03-19
US20230059353A1 (en) 2023-02-23
JP5551222B2 (ja) 2014-07-16
WO2007077028A2 (en) 2007-07-12
US10100124B2 (en) 2018-10-16
TW201431881A (zh) 2014-08-16
HUE044756T2 (hu) 2019-11-28
EP3196213A3 (en) 2017-11-08
JP2013056884A (ja) 2013-03-28
RS59100B1 (sr) 2019-09-30
NZ596317A (en) 2013-04-26
CN102174105B (zh) 2013-09-25
TWI432452B (zh) 2014-04-01
EP1984402A2 (en) 2008-10-29
PL1984402T3 (pl) 2017-08-31
NO20083268L (no) 2008-09-19
NO346160B1 (no) 2022-03-28
KR101418606B1 (ko) 2014-07-17
CN101365723A (zh) 2009-02-11
DK1984402T3 (en) 2017-05-15
EA200801621A1 (ru) 2008-12-30
LT1984402T (lt) 2017-04-10
EA015782B1 (ru) 2011-12-30
JP5806263B2 (ja) 2015-11-10
US8771695B2 (en) 2014-07-08
BRPI0620803B8 (pt) 2021-05-25
WO2007077028A3 (en) 2007-09-07
SG10201500533QA (en) 2015-03-30
TW200804420A (en) 2008-01-16
ZA200805474B (en) 2009-05-27
AR056857A1 (es) 2007-10-24
IL191852A0 (en) 2008-12-29
BRPI0620803A2 (pt) 2011-11-22
ES2881886T3 (es) 2021-11-30
US11267900B2 (en) 2022-03-08
EP3196213A2 (en) 2017-07-26
JP2014012006A (ja) 2014-01-23
US20160168264A1 (en) 2016-06-16
IL225372A0 (en) 2013-06-27
MY162624A (en) 2017-06-30
CL2014001334A1 (es) 2014-12-19
KR20080099235A (ko) 2008-11-12
CN101365723B (zh) 2012-05-02
US20080124345A1 (en) 2008-05-29
HK1160151A1 (en) 2012-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230059353A1 (en) Antibodies directed to her-3 and uses thereof
AU2012204099A1 (en) Antibodies directed to HER-3 and uses thereof
HK1173158B (en) Antibodies directed to her-3 and uses thereof
HK1133266B (en) Antibodies directed to her-3 and uses thereof
HK1160151B (en) Antibodies directed to her-3 and uses thereof