RS56984B1 - Derivati purina za upotrebu u tretmanu alergijskih, inflamatornih i infektivnih bolesti - Google Patents

Description

Opis

Poreklo pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja, procese za njihovu izradu, kompozicije koje ih sadrže, na njihovu upotrebu u tretmanu različitih poremećaja a posebno alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, na primer, alergijskog rinitisa i astme, infektivnih bolesti, kancera i kao imunopotencijatora vakcina.

[0002] Kičmenjaci su konstantno izloženi invaziji mikroorganizama i razvili su mehanizme imune odbrane za eliminisanje infektivnih patogena. Kod sisara, ovaj imuni sistem uključuje dve grane: urođeni imunitet i stečeni imunitet. Prva linija odbrane domaćina je urođeni imuni sistem, koji se ispoljava pomoću makrofaga i dendričnih ćelija. Stečeni imunitet obuhvata eliminaciju patogena u kasnijim stupnjevima infekcije i takođe omogućava generisanje imunološkog pamćenja. Stečeni imunitet je visoko specifičan zbog velikog broja limfocita sa antigen-specifičnim receptorima koji su podvrgnuti preraspodeli gena.

[0003] Prvobitno je smatrano da je urođeni imuni odgovor ne-specifičan, ali se danas zna da je sposoban da pravi razliku između sopstvenih i drugih patogena. Urođeni imuni sistem prepoznaje mikrobe preko ograničenog broja urođenih enkodiranih receptora za prepoznavanje konzervisanih struktura (PRRi) koji imaju brojne važne karakteristike.

[0004] Receptori slični tolu (TLRi) su familija deset receptora koji prepoznaju konzervisane strukture opisanih kod ljudi. TLRi se predominantno javljaju u urođenim imunim ćelijama gde je njihova uloga da prati sredinu zbog znakova infekcije i, nakon aktiviranja, da mobilišu mehanizme odbrane namenjene za eliminaciju agresivnih patogena. Rani urođeni imuni odgovori aktivirani sa TLRi ograničavaju širenje infekcije, dok pro-inflamatorni citokini i hemokini koje oni indukuju dovode do ojačavanja i aktiviranja ćelija u kojima se nalazi antigen, B ćelija i T ćelija. TLRi mogu da moduliraju prirodu adaptivnih imunih odgovora kako bi se dobila odgovarajuća zaštita preko aktiviranja dendričnih ćelija i oslobađanja citokina (Akira S. i saradnici, Nat. Immunol., 2001: 2, 675-680). Profil odgovora koji se dobija od različitih TLR agonista zavisi od tipa aktiviranih ćelija.

[0005] TLR7 je član podgrupe TLRa (TLRi 3, 7, 8 i 9), lokalizovan u endozomalnom delu ćelija koji je postao specijalizovan za detekciju nepripadajućih nukleinskih kiselina. TLR7 igra ključnu ulogu u anti-virusnoj odbrani prepoznavanjem ssRNK (Diebold S.S. i saradnici, Science, 2004: 303, 1529-1531; i Lund J. M. i saradnici, PNAS, 2004: 101, 5598-5603). TLR7 ima profil ograničene ekspresije kod ljudi i predominantno se ekspresuje preko B ćelija i plazmacitoidnih dendričnih ćelija (pDC) i u manjoj meri preko monocita.

Plazmacitoidne DCe su jedinstvena populacija dendričnih ćelija koje potiču od limfoida (0.2-0.8% mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMCe)) koje su primarni tip I interferonprodukujućih ćelija koje luče visok nivo interferon alfa (IFNα) i interferon-beta (IFNβ) kao odgovor na virusne infekcije (Liu Y-J, Annu. Rev. Immunol., 2005: 23, 275-306).

[0006] Alergijske bolesti su povezane sa imunim odgovorom na alergene baziranim na Th2. Th2 odgovori su povezani sa povećanom vrednošću IgE, koji, svojim delovanjem na mast ćelije, stvara hipersenzitivnost na alergene, što za rezultat ima simptome koji se vide, na primer, kod alergijskog rinitisa. Kod zdravih pojedinaca, imuni odgovor na alergene je mnogo više uravnotežen sa mešavinom Th2/Th1 i regulatornim odgovorom T ćelija.

Pokazano je da TLR7 ligandi redukuju Th2 citokin i pojačavaju oslobađanje Th1 citokina in vitro i da poboljšavaju Th2-tip inflamatornih odgovora na modelu alergičnih pluća in vivo (Fili L. i saradnici, J. All. Clin. Immunol., 2006: 118, 511-517; Moisan J. i saradnici, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2006: 290, L987-995; Tao i saradnici, Chin. Med. J., 2006: 119, 640-648). Prema tome, TLR7 ligandi imaju potencijal za rebalans imunog odgovora viđen kod alergičnih pojedinaca i dovodi do modifikacije bolesti.

[0007] Osnov za generisanje delovanja urođenog imunog odgovora kod sisara su mehanizmi koji dovode do indukcije interferona i drugih citokina koji deluju na ćelije da indukuju brojne efekte. Ovi efekti mogu da uključe aktivaciju ekspresije anti-infektivnog gena, aktivaciju prisustva antigena u ćelijama da se postigne jak antigen-specifični imunitet i promociju fagocitoze u fagocitnim ćelijama.

[0008] Interferon je prvo opisan kao supstanca koja može da zaštiti ćelije od virusne infekcije (Isaacs & Lindemann, J. Virus Interference. Proc. R. Soc. Lon. Ser. B. Biol. Sci. 1957: 147, 258-267). Kod ljudi, tip I interferoni su familija povezanih proteina enkodiranih genima na hromozomu 9 a koji enkodiraju najmanje 13 izooblika interferona alfa (IFNα) i jedan izooblik interferona beta (IFNβ). Rekombinantni IFNα je bio prvo odobreno biološko terapeutsko sredstvo i postao je važna terapija kod virusnih infekcija i kancera. Pored direktnog anti-virusnog delovanja na ćelije, za interferone se zna da su potentni modulatori imunog odgovora, delujući na ćelije imunog sistema.

[0009] Kao prva linija terapije za bolest izazvanu hepatitis C virusom (HCV), kombinacije interferona mogu da budu visoko efikasne u smanjenju nagomilavanja virusa a kod nekih subjekata mogu da budu efikasni u eliminaciji replikacije virusa. Međutim, mnogi pacijenti ne pokazuju kontinuiran virusni odgovor i kod ovih pacijenata nagomilavanje virusa nije kontrolisano. Pored toga, terapija injekcijom interferona može da dovede do brojnih neželjenih efekata za koje se pokazalo da utiču na rezultat terapije (Dudley T i saradnici, Gut., 2006: 55(9), 1362-3).

[0010] Primena jedinjenja male molekule koje može da stimuliše urođeni imuni odgovor, uključujući aktiviranje tip I interferona i drugih citokina, može da postane važna strategija za tretman ili prevenciju bolesti kod ljudi, uključujući virusne infekcije. Ovaj tip imunomodulatorne strategije ima potencijal za identifikaciju jedinjenja koja mogu da budu korisna ne samo kod infektivnih bolesti već takođe kod kancera (Krieg. Curr. Oncol. Rep., 2004: 6(2), 88-95), alergijskih bolesti (Moisan J. i saradnici, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2006: 290, L987-995), drugih inflamatornih stanja kao što je bolest nadraženih creva (Rakoff-Nahoum S., Cell., 2004, 23, 118(2): 229-41) i kao imunopotencijatori vakcina (Persing i saradnici Trends Microbiol.2002: 10(10 Suppl), S32-7).

[0011] Na modelima životinja, imikvimod je pokazao aktivnosti imunopotencijatora ili topično (Adams S. i saradnici, J. Immunol., 2008, 181:776-84; Johnston D. i saradnici, Vaccine, 2006, 24:1958-65) ili sistemski (Fransen F. i saradnici, Infect. Immun., 2007, 75:5939-46). Rezikvimod i drugi povezani TLR7/8 agonisti su takođe pokazali aktivnost imunopotencijatora (Ma R. i saradnici, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2007, 361:537-42; Wille-Reece U. i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102:15190-4; Wille-Reece U. i saradnici, US2006045885 A1).

[0012] Mehanizmi koji dovode do indukcije tip I interferona su samo delimično razumljivi. Jedan mehanizam koji može da dovede do indukcije interferona u brojnim tipovima ćelija je prepoznavanje dvostruko-spiralnih RNK virusa preko RNK spirala RIG-I i MDA5. Smatra se da je ovaj mehanizam primaran mehanizam kojim se interferoni indukuju u slučaju infekcije ćelija Sendai virusom.

[0013] Drugi mehanizmi za indukciju interferona su slučajevi TLR-zavisne signalizacije. Kod ljudi, plazmacitoidi dendričnih ćelija (pDCa) su profesionalne ćelije koje produkuju interferon, sposobne da stvore velike količine interferona u odgovoru na, na primer, virusnu infekciju. Pokazano je da ove pDCe preferencijalno ekspresuju TLR7 i TLR9 a stimulacija ovih receptora sa virusnom RNK ili DNK tim redom, može da indukuje ekspresiju interferona alfa.

[0014] Oligonukleotidni agonisti TLR7 i TLR9 i agonisti TLR7 na bazi male molekule purina su opisani kao moguća sredstva za indukciju interferona alfa iz ovih tipova ćelija kod životinja i ljudi (Takeda K. i saradnici, Annu. Rev. Immunol., 2003: 21, 335-76). TLR7 agonisti uključuju jedinjenja imidazokvinolina kao što su imikvimod i rezikvimod, analoge oksoadenina i takođe analoge nukleozida kao što su loksoribin i 7-tia-8-oksogvanozin za koje se dugo vremena zna da indukuju interferon alfa. Internacionalna patentna prijava broj WO 2008/114008 (AstraZeneca AB/Dainippon Sumitomo Pharma Co. Ltd.) otkriva 9-supstituisana-8-oksoadenin jedinjenja kao TLR7 modulatore.

[0015] WO2007/142755 opisuje jedinjenja analoge purina koja su TLR agonisti i njihovu upotrebu u tretmanu različitih bolesti i poremećaja.

[0016] Ostaje nerazjašnjeno kako jedinjenja male molekule slične purinu mogu da indukuju tip I interferone i druge citokine jer molekularni ciljevi ovih poznatih inducera još uvek nisu identifikovani. Međutim, razvijena je strategija ispitivanja za karakterizaciju inducera male molekule humanog interferona IFNα (nezavisno od mehanizma) koja je zasnovana na stimulaciji primarnih humanih donor ćelija sa jedinjenjima i koja je ovde otkrivena.

Kratak opis pronalaska

[0017] Za neka jedinjenja iz pronalaska je pokazano da su induceri humanog interferona i da mogu da poseduju poboljšani profil u odnosu na poznate inducere humanog interferona, na primer, pojačanu potenciju i mogu da iskažu povećanu selektivnost za IFNα u odnosu na TNFα. Na primer, neka jedinjenja iz pronalaska indukuju 1000 puta veću selektivnost za indukciju IFNα u odnosu na indukciju za TNFα. Jedinjenja koja indukuju humani interferon mogu da budu korisna u tretmanu različitih poremećaja, na primer, u tretmanu alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, na primer alergijskog ritinitisa i astme, u tretmanu infektivnih bolesti i kancera i takođe mogu da budu korisna kao imunopotencijatori vakcina.

[0018] Neka jedinjenja iz pronalaska su potentni imunomodulatori i, u skladu sa tim, prilikom njihovog rukovanja treba biti pažljiv.

Sažetak pronalaska

[0019] U prvom aspektu, obezbeđena su jedinjenja formule (I):

pri čemu;

R<1>je (1S)-1-metilbutiloksi grupa;

m je ceo broj koji ima vrednost od 3 do 6;

n je ceo broj koji ima vrednost od 0 do 4;

i njihove soli.

[0020] U još jednom otelotvorenju, m je 3.

[0021] U još jednom otelotvorenju, m je 4.

[0022] U još jednom otelotvorenju, m je 5.

[0023] U još jednom otelotvorenju, m je ceo broj koji ima vrednost od 4 do 6.

[0024] U još jednom otelotvorenju, m je 6.

[0025] U još jednom otelotvorenju, n je 0.

[0026] U još jednom otelotvorenju, n je 1.

[0027] U još jednom otelotvorenju, n je 2.

[0028] U još jednom otelotvorenju, n je 3.

[0029] U još jednom otelotvorenju, n je 4.

[0030] U još jednom otelotvorenju, n je ceo broj koji ima vrednost od 2 do 4.

[0031] U još jednom aspektu otkrića, obezbeđena su jedinjenja formule (IA):

pri čemu;

R<1A>je C1-6alkilamino ili C1-6alkoksi grupa;

mAje ceo broj koji ima vrednost od 3 do 6;

nAje ceo broj koji ima vrednost od 0 do 4;

i njihove soli.

[0032] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je n-butiloksi grupa.

[0033] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je n-butilamino grupa.

[0034] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je (1S)-1-metilbutiloksi grupa.

[0035] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je (1S)-1-metilpropiloksi grupa.

[0036] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je (1S)-1-metilpentiloksi grupa.

[0037] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je 1-metiletiloksi grupa.

[0038] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je (1R)-1-metilbutilamino grupa.

[0039] U još jednom otelotvorenju, R<1A>je (1S)-1-metilbutilamino grupa.

[0040] U još jednom otelotvorenju, mAje 4.

[0041] U još jednom otelotvorenju, mAje 5.

[0042] U još jednom otelotvorenju, mAje 6.

[0043] U još jednom otelotvorenju, nAje 0.

[0044] U još jednom otelotvorenju, nAje 1.

[0045] U još jednom otelotvorenju, nAje 2.

[0046] U još jednom otelotvorenju, nAje 3.

[0047] U još jednom otelotvorenju, nAje 4.

[0048] U još jednom aspektu otkrića, obezbeđena su jedinjenja formule (IA) i njihove soli kako je ovde prethodno definisano, pri čemu je m ceo broj koji ima vrednost od 4 do 6.

[0049] U još jednom aspektu otkrića, obezbeđena su jedinjenja formule (IA) i njihove soli kako je ovde prethodno definisano, uz uslov da je 6-amino-2-(butiloksi)-9-[3-(1-pirolidinil)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on isključen.

[0050] U narednom aspektu, obezbeđena su jedinjenja formule (I) i njihove soli uz uslov da su 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on i njegove soli isključeni.

[0051] U još jednom aspektu otkrića, obezbeđena su jedinjenja formule (IA) i njihove soli kako je ovde prethodno definisano, pri čemu je m ceo broj koji ima vrednost od 4 do 6 i 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on i njegove soli su isključeni.

[0052] U još jednom aspektu otkrića, obezbeđena su jedinjenja formule (IA) i njihove soli kako je ovde prethodno definisano, uz uslov da su 6-amino-2-(butiloksi)-9-[3-(1-pirolidinil)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on, i

6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on i njihove soli isključeni.

[0053] Primeri jedinjenja formule (I) su dati u narednoj listi i čine naredni aspekt pronalaska: 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on; 6-amino-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-7,9-dihidro-8H-purin-8-on;

6-amino-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-7,9-dihidro-8H-purin-8-on;

6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[3-(1-piperidinil)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on; i njihove soli.

[0054] U jednom aspektu otkrića, obezbeđen je 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegova so.

[0055] U još jednom otelotvorenju otkrića, obezbeđen je 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0056] U još jednom otelotvorenju otkrića, obezbeđen je 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on kao slobodna baza.

[0057] Kao naredni aspekt pronalaska je takođe obezbeđeno jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u terapiji.

[0058] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u terapiji.

[0059] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on, kao slobodna baza, za upotrebu u terapiji.

[0060] Takođe će biti jasno da, kada se jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so koristi u terapiji, koristi se kao aktivno terapeutsko sredstvo.

[0061] Ovde je takođe obezbeđeno jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera.

[0062] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera.

[0063] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on, kao slobodna baza, za upotrebu u tretmanu alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera.

[0064] Ovde je takođe obezbeđeno jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu alergijskog rinitisa.

[0065] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu alergijskog rinitisa.

[0066] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on, kao slobodna baza, za upotrebu u tretmanu alergijskog rinitisa.

[0067] Ovde je takođe obezbeđeno jedinjenje formule (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu astme.

[0068] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u tretmanu astme.

[0069] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on, kao slobodna baza, za upotrebu u tretmanu astme.

[0070] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen imunopotencijator vakcine koji uključuje jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0071] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđena imunogenična kompozicija koja uključuje antigen ili kompoziciju antigena i jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0072] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđena kompoziciona vakcina koja uključuje antigen ili kompozicioni antigen i jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0073] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen postupak za lečenje ili prevenciju bolesti koji uključuje primenu na ljudima koji boluju ili su podložni bolesti, imunogenične kompozicije koja uključuje antigen ili kompozicioni antigen i jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0074] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za lečenje ili prevenciju bolesti koji uključuje primenu na ljudima koji boluju od ili su podložni bolesti, kompozicione vakcine koja uključuje antigen ili kompozicioni antigen i jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0075] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju imunogenične kompozicije koja uključuje antigen ili kompozicioni antigen za tretman ili prevenciju bolesti.

[0076] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju kompozicione vakcine koja uključuje antigen ili kompozicioni antigen, za tretman ili prevenciju bolesti.

[0077] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera.

[0078] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera.

[0079] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona, kao slobodne baze, za proizvodnju medikamenta za tretman alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera.

[0080] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman alergijskog rinitisa.

[0081] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman alergijskog rinitisa.

[0082] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona, kao slobodne baze, za proizvodnju medikamenta za tretman alergijskog rinitisa.

[0083] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman astme.

[0084] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman astme.

[0085] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđena upotreba 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona, kao slobodne baze, za proizvodnju medikamenta za tretman astme.

[0086] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

1

[0087] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0088] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona kao slobodne baze.

[0089] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman alergijskog rinitisa, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0090] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman alergijskog rinitisa, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0091] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman alergijskog rinitisa, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona kao slobodne baze.

[0092] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman astme, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0093] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman astme, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

[0094] U skladu sa otkrićem, ovde je dalje obezbeđen postupak za tretman astme, pri čemu postupak uključuje primenu na ljudima kojima je to potrebno, terapeutski efektivne količine 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona kao slobodne baze.

[0095] U narednom aspektu, otkriće obezbeđuje kombinaciju koja uključuje jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa najmanje još jednim terapeutski aktivnim sredstvom.

[0096] U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja uključuje 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa najmanje još jednim terapeutski aktivnim sredstvom.

[0097] U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja uključuje 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on, kao slobodnu bazu, zajedno sa najmanje još jednim terapeutski aktivnim sredstvom.

[0098] Ovde je dalje obezbeđena farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0099] U skladu sa otkrićem, dalje je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja uključuje 6-amino-2-{[(1S)1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0100] U skladu sa otkrićem, dalje je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja uključuje 6-amino-2-{[(1S)1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on, kao slobodnu bazu i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0101] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen postupak za izradu farmaceutske kompozicije koji uključuje mešanje jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0102] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen postupak za izradu farmaceutske kompozicije koji uključuje mešanje 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0103] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen postupak za izradu farmaceutske kompozicije koji uključuje mešanje 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona, kao slobodne baze, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0104] Jedinjenja formule (I) i njihove soli mogu da se izrade metodologijom koja je ovde opisana, a koja čini naredni aspekt ovog otkrića.

[0105] U skladu sa otkrićem, obezbeđen je proces za izradu jedinjenja formule (I), koji uključuje deprotekciju jedinjenja formule (II):

gde su R<1>, m i n kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I) a R<2>je C1-6alkil grupa i u daljem toku se, ukoliko je potrebno, podvrgavaju jednoj ili više od sledećih opcionih faza:

(i). uklanjanju bilo koje neophodne zaštitne grupe;

(ii). izradi soli tako formiranog jedinjenja.

[0106] Ovo otkriće obuhvata sve kombinacije otelotvorenja i aspekata koji su ovde opisani.

Detaljan opis pronalaska

[0107] Ovaj pronalazak je opisan na način koji je poznat i prihvatljiv stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Ovde su definisani određeni termini kako bi se lakše razumeli. Činjenica da su neki nazivi definisani, međutim, ne bi trebalo da se smatra kao indikativno da se definisani nazivi koriste na način koji nije konzistentan sa uobičajenim značenjem ili, alternativno, da je bilo koji naziv koji nije definisan neodređen ili da se ne koristi u okviru uobičajenog i prihvaćenog značenja. Upravo, veruje se da svi termini koji su ovde korišćeni opisuju pronalazak tako da stručnjak sa uobičajenim iskustvom može da razume okvir ovog pronalaska. Naredne definicije treba da razjasne, ali ne da ograniče, definisane nazive.

[0108] Reference za ’alkil’ uključuju reference za alifatične izomere i ravnog lanca i račvastog lanca odgovarajućeg alkil radikala koji sadrži do šest atoma ugljenika, na primer, do četiri atoma ugljenika ili do dva atoma ugljenika. Ovakve reference za ’alkil’ su takođe primenljive kada je alkil grupa deo druge grupe, na primer, alkilamino ili alkoksi grupe. Primeri ovakvih alkil grupa i grupa koje sadrže alkil grupe su C1-6alkil, C1-6alkilamino i C1-

6alkoksi grupe.

[0109] Reference za "halogen" se odnose na jod, brom, hlor ili fluor, obično na brom, hlor ili fluor. Reference za "halo" se takođe odnose na jod, brom, hlor ili fluor, obično na brom, hlor ili fluor.

[0110] Treba da se razume da se ovde date reference za jedinjenja iz pronalaska odnose na jedinjenje formule (I) kao slobodnu bazu ili kao so, na primer farmaceutski prihvatljivu so.

1

[0111] Soli jedinjenja formule (I) obuhvataju farmaceutski prihvatljive soli i soli koje ne moraju da budu farmaceutski prihvatljive ali mogu da budu korisne u izradi jedinjenja formule (I) i njegovih farmaceutski prihvatljivih soli. Soli mogu da se dobiju sa nekim neorganskim ili organskim kiselinama, ili nekim neorganskim ili organskim bazama.

[0112] U okviru pronalaska su obuhvaćeni svi mogući stehiometrijski i ne-stehiometrijski oblici soli jedinjenja formule (I).

[0113] Primeri soli su farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju soli dobijene dodatkom kiseline ili soli dobijene dodatkom baze. Za pregled odgovarajućih soli videti Berge i saradnici, J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977).

[0114] Primeri farmaceutski prihvatljivih soli jedinjenja formule (I) nastale dodatkom kiseline obuhvataju hidrobromidne, hidrohloridne, sulfatne, p-toluensulfonatne, metansulfonatne, naftalensulfonatne i fenilsulfonatne soli.

[0115] Soli mogu da se formiraju tehnikama koje su dobro poznate u praksi, na primer precipitacijom iz rastvora a nakon toga filtriranjem, ili evaporacijom rastvarača.

[0116] Uobičajeno, farmaceutski prihvatljive soli nastale dodatkom kiseline mogu da se formiraju reakcijom jedinjenja formule (I) sa pogodnom jakom kiselinom (kao što su hidrobromidna, hidrohloridna, sumporna, p-toluensulfonatna, metansulfonatna ili naftalensulfonatna kiselina), opciono u pogodnom rastvaraču kao što je organski rastvarač, da se dobije so koja se uobičajeno izdvoji, na primer, kristalizacijom i filtriranjem.

[0117] Jasno je da brojna organska jedinjenja mogu da formiraju komplekse sa rastvaračima u kojima su reagovala ili iz kojih su precipitirala ili kristalisala. Ovi kompleksi su poznati kao "solvati". Na primer, kompleks sa vodom je poznat kao "hidrat". Rastvarači sa visokom tačkom ključanja i/ili rastvarači sa izraženim osobinama da formiraju vodonične veze kao što su voda, etanol, izo-propil alkohol i N-metil pirolidinon, mogu da se koriste za formiranje solvata. Postupci za identifikaciju solvata uključuju, ali se ne ograničavaju samo na, NMR i mikroanalize. Solvati jedinjenja formule (I) su obuhvaćeni okvirom pronalaska. Kako se ovde koristi, naziv solvat obuhvata solvate i jedinjenja u obliku slobodne baze kao i bilo koje njegove soli.

[0118] Neka od jedinjenja iz pronalaska mogu da sadrže asimetrične atome i/ili višestruke veze i zbog toga mogu da egzistiraju u jednom ili više stereoizometrijskih oblika. Ovaj pronalazak obuhvata sve stereoizomere jedinjenja iz pronalaska, uključujući optičke izomere, ili kao pojedinačne stereoizomere ili kao njihove smeše, uključujući racematne modifikacije. Bilo koji stereoizomer može da sadrži manje od 10% težine, na primer manje od 5% težine ili manje od 0.5% težine bilo koji drugi stereoizomer. Na primer, bilo koji optički stereoizomer može da sadrži manje od 10% težine, na primer, manje od 5% težine ili manje od 0.5% težine, svoj antipod.

[0119] Neka od jedinjenja iz pronalaska mogu da egzistiraju u tautomernim oblicima. Jasno je da ovaj pronalazak obuhvata sve tautomere jedinjenja iz pronalaska bilo kao pojedinačne tautomere ili kao njihove smeše.

[0120] Jedinjenja iz pronalaska mogu da budu u kristalnom ili amorfnom obliku. Osim toga, neki kristalni oblici jedinjenja iz pronalaska mogu da egzistiraju kao polimorfi, koji su svi obuhvaćeni okvirom ovog pronalaska. Od posebnog interesa su polimorfni oblik ili oblici jedinjenja iz pronalaska koji su termodinamički najstabilniji.

[0121] Polimorfni oblici jedinjenja iz pronalaska mogu da se karakterišu i razlikuju pomoću brojnih uobičajenih analitičkih tehnika, uključujući ali bez ograničenja, difrakciju X-zraka praška (XRPD), infracrvenu spektroskopiju (IR), Raman spektroskopiju, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC), termogravimetrijske analize (TGA) i nuklearnu magnetnu rezonancu čvrstog stanja (ssNMR).

[0122] Iz prethodno navedenog je jasno da su okvirom pronalaska obuhvaćeni solvati, hidrati, izomeri i polimorfni oblici jedinjenja formule (I) i njihove soli i solvati.

[0123] Primeri bolesnih stanja u kojima jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli imaju potencijalno korisne efekte uključuju alergijske bolesti i druga inflamatorna stanja, na primer, alergijski rinitis i astmu, infektivne bolesti i kancer.

Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli se takođe potencijalno koriste kao imunopotencijatori vakcina.

[0124] Kao modulatori imunog odgovora, jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu korisni, ili sami ili u kombinaciji kao imunopotencijatori u tretmanu i/ili prevenciji imuno-posredovanih poremećaja, uključujući ali bez ograničenja na, inflamatorne ili alergijske bolesti kao što su astma, alergijski rinitis i rinokonjuktivitis, alergija na hranu, hipersenzitivna bolest pluća, eozinofilni pneuomitis, odloženi tip hipersenzitivnih poremećaja, ateroskleroza, pankreatitis, gastritis, kolitis, osteoartritis, psorijaza, sarkoidoze, plućne fibroze, respiratorni distres sindrom, bronhitis, hronična opstruktivna bolest pluća, sinuzitis, cistične fibroze, aktinične keratoze, displazija kože, hronična urtikarija, ekcema i svi tipovi dermatitisa.

[0125] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu korisni u tretmanu i/ili prevenciji reakcija na respiratorne infekcije, uključujući ali se ne ograničavajući samo na, pogoršanje virusne infekcije disajnih puteva i tonzilitis. Jedinjenja mogu takođe da budu korisna u tretmanu i/ili prevenciji autoimunih bolesti, uključujući ali se ne ograničavajući samo na, reumatoidni artritis, psorijatični artritis, sistemski eritematozni

1

lupus, Sjöegrens-ovu bolest, ankilozni spondilitis, sklerodermu, dermatomiozitis, dijabetes, odbacivanje grafta, uključujući bolest graft-protiv-domaćina, inflamatornu bolest creva, uključujući ali bez ogrničenja na, Kronovu bolest i ulcerativni kolitis.

[0126] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu korisni u tretmanu infektivnih bolesti uključujući, ali se ne ograničavajući samo na, bolesti izazvane virusima hepatitisa (na primer hepatitis B virus, hepatitis C virus), humanim imunodeficijentnim virusom, papilomavirusom, herpes virusom, respiratornim virusima (na primer influenca virusi, respiratorni sincitijalni virus, rinovirus, metapneumovirus, parainfluencavirus, SARS) i virus Zapadnog Nila. Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu korisni u tretmanu mikrobioloških infekcija izazvanih, na primer, bakterijama, gljivicama ili protozoama. Ovde spadaju, ali bez ograničenja na, tuberkuloza, bakterijska pneumonija, aspergiloze, histoplazmoze, kandidoze, pneumocistoze, leproza, klamidija, kriptokokna bolest, kriptosporidoze, toksoplazmoze, laišmanija, malarija i tripanosomiaze.

[0127] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu korisni u tretmanu različitih kancera, posebno u tretmanu kancera za koje se zna da reaguju na imunoterapiju i uključeni su, ali bez ograničenja na, karcinom bubrežnih ćelija, kancer pluća, kancer dojke, kancer kolorektuma, kancer bešike, melanoma, leukemija, limfomi i kancer jajnika.

[0128] Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da shvati da sve što se ovde odnosi na tretman ili terapiju može, u zavisnosti od stanja, da se proširi na profilaksu kao i na tretman utvrđenih stanja.

[0129] Kako je ovde napomenuto, jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da budu korisni kao terapeutska sredstva.

[0130] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da budu formulisani za primenu na bilo koji uobičajeni način.

[0131] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu, na primer, da budu formulisani za oralnu, topičnu, inhalacionu, intranazalnu, bukalnu, parenteralnu (na primer intravenoznu, subkutanu, intradermalnu ili intramuskularnu) ili rektalnu primenu. U jednom aspektu, jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli su formulisani za oralnu primenu. U narednom aspektu, jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli su formulisani za topičnu primenu, na primer za intranazalnu ili inhalacionu primenu.

[0132] Tablete i kapsule za oralnu primenu mogu da sadrže uobičajene ekscipijente kao što su sredstva za vezivanje, na primer, sirup, akacija, želatin, sorbitol, tragakanta, mucilaga

1

skroba, celuloza ili polivinil pirolidinon; punioci, na primer, laktoza, mikrokristalna celuloza, šećer, kukuruzni skrob, kalcijum fosfat ili sorbitol; lubrikansi, na primer, magnezijum stearat, stearinska kiselina, talk, polietilen glikol ili silicijum dioksid; sredstva za raspadanje, na primer, krompirov skrob, kroskarmeloza natrijum ili natrijum skrob glikolat; ili sredstva za vlaženje kao što je natrijum lauril sulfat. Tablete mogu da budu obložene u skladu sa postupcima koji su dobro poznati u tehnici.

[0133] Oralni tečni preparati mogu da budu u obliku, na primer, vodenih ili uljanih suspenzija, rastvora, emulzija, sirupa ili eliksira, ili mogu da budu u obliku suvog produkta za konstituciju sa vodom ili drugim pogodnim vehikulumom pre upotrebe. Ovakvi tečni preparati mogu da sadrže uobičajene aditive kao što su sredstva za suspendovanje, na primer, sorbitol sirup, metil celuloza, glukoza/šećerni sirup, želatin, hidroksimetil celuloza, karboksimetil celuloza, aluminijum stearat gel ili hidrogenizovane jestive masti; sredstva za emulgovanje, na primer, lecitin, sorbitan monooleat ili akacija; nevodene vehikulume (koji mogu da uključe jestiva ulja), na primer bademovo ulje, frakcionisano kokosovo ulje, uljani estri, propilen glikol ili etil alkohol; ili konzervanse, na primer, metil ili propil phidroksibenzoati ili sorbinska kiselina. Preparati mogu takođe po potrebi da sadrže puferne soli, korigense ukusa, sredstva za bojenje i/ili zaslađivače (na primer manitol).

[0134] Kompozicije za intranazalnu primenu uključuju vodene kompozicije koje se primenjuju u nos preko kapi ili pumpom pod pritiskom. Pogodne kompozicije za ovu svrhu sadrže vodu kao razblaživač ili nosač. Kompozicije za primenu u pluća ili nos mogu da sadrže jedan ili više ekscipijenata, na primer, jedno ili više sredstava za suspendovanje, jedan ili više konzervansa, jedan ili više surfaktanata, jedno ili više sredstava za podešavanje toničnosti, jedan ili više ko-rastvarača i mogu da uključe komponente za kontrolu pH kompozicije, na primer, sistem pufera. Osim toga, kompozicije mogu da sadrže druge ekscipijente kao što su antioksidansi, na primer, natrijum metabisulfit i sredstva za maskiranje ukusa. Kompozicije mogu takođe da se primene u nos ili druge delove respiratornog trakta nebulizacijom.

[0135] Intranazalne kompozicije mogu da omoguće jedinjenju(ima) formule (I) ili (a) njihovoj farmaceutski prihvatljivoj soli(ima) da se oslobode u svim delovima nosne šupljine (ciljano tkivo) i isto tako, mogu da omoguće jedinjenju(ima) formule (I) ili (a) njihovoj farmaceutski prihvatljivoj soli(ima) da ostanu u kontaktu sa ciljanim tkivom duži vremenski period. Odgovarajući režim doziranja za intranazalne kompozicije je da pacijent polako inhalira kroz nos sve dok nazalna šupljina ne postane čista. U toku inhalacije, komozicija se primenjuje u jednoj nozdrvi dok se druga ručno zatvara. Ova procedura se nakon toga ponovi za drugu nozdrvu. Uobičajeno, jedan ili dva spreja po nozdrvi se primeni po prethodno

1

navedenoj proceduri jedanput, dva puta ili tri puta svakoga dana, idealno jedanput dnevno. Od posebnog interesa su intranazalne kompozicije pogodne za primenu jedanput dnevno.

[0136] Ukoliko su uključena, sredstvo(a) za suspendovanje su obično prisutna u količini od 0.1 do 5% (m/m), kao što je od 1.5% do 2.4% (m/m), ukupne težine kompozicije. U primere farmaceutski prihvatljivih sredstava za suspendovanje spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, Avicel® (mikrokristalna celuloza i karboksimetilceluloza natrijum), karboksimetilceluloza natrijum, vigam, tragakanta, bentonit, metilceluloza, ksantan guma, karbopol i polietilen glikoli.

[0137] Kompozicije za primenu u pluća ili nos mogu da sadrže jedan ili više ekscipijenata za zaštitu od kontaminacije ili rasta mikroorganizama ili gljivica uključivanjem jednog ili više konzervanasa. U primere farmaceutski prihvatljivih antimikrobnih sredstava ili konzervanasa spadaju, ali bez ograničenja na, kvaternarna amonijum jedinjenja (na primer benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, cetrimid, cetilpiridinijum hlorid, lauralkonijum hlorid i miristil pikolinijum hlorid), sredstva na bazi žive (na primer fenilmerkuri nitrat, fenilmerkuri acetat i tiomersal), alkohona sredstva (na primer hlorbutanol, feniletil alkohol i benzil alkohol), antibakterijski estri (na primer estri para-hidroksibenzoeve kiseline), helatna sredstva kao što je dinatrijum edetat (EDTA) i druga anti-mikrobna sredstva kao što su hlorheksidin, hlorkrezol, sorbinska kiselina i njihove soli (kao što je kalijum sorbat) i polimiksin. Primeri farmaceutski prihvatljivih anti-fungalnih sredstava ili konzervanasa uključuju, ali se ne ograničavaju samo na, natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu, natrijum propionat, metilparaben, etilparaben, propilparaben i butilparaben. Ukoliko su prisutni, konzervans(i) mogu da budu prisutni u količini od 0.001 do 1% (m/m), kao što je od 0.015% do 0.5% (m/m) ukupne težine kompozicije.

[0138] Kompozicije (na primer kada je najmanje jedno jedinjenje u suspenziji) mogu da uključe jedan ili više surfaktanata čija je uloga da omoguće rastvaranje čestica medikamenta u vodenoj fazi kompozicije. Na primer, količina upotrebljenog surfaktanta je količina koja neće da dovede do stvaranja pene u toku mućkanja. U primere farmaceutski prihvatljivih surfaktanata spadaju alkoholi, estri i etri masti, kao što su polioksietilen (20) sorbitan monooleat (Polysorbat 80), makrogol etri i poloksameri. Surfaktant može da bude prisutan u količini između približno 0.01 do 10% (m/m), kao što je od 0.01 do 0.75% (m/m), na primer približno 0.5% (m/m), ukupne težine kompozicije.

[0139] Jedno ili više sredstava za podešavanje toničnosti mogu da se upotrebe da se postigne toničnost sa tečnostima organizma, na primer, tečnostima nosne šupljine, što za rezultat ima smanjenje nivoa nadražaja. U primere farmaceutski prihvatljivih sredstava za podešavanje toničnosti spadaju, ali bez ograničenja na, natrijum hlorid, dekstroza, ksilitol, kalcijum

1

hlorid, glukoza, glicerin i sorbitol. Ukoliko je prisutno, sredstvo za podešavanje toničnosti može da bude prisutno u količini od 0.1 do 10% (m/m), kao što je od 4.5 do 5.5% (m/m), na primer približno 5.0% (m/m), ukupne težine kompozicije.

[0140] Kompozicije iz pronalaska mogu da budu puferovane dodavanjem pogodnog sredstva za puferovanje kao što su natrijum citrat, limunska kiselina, trometamol, fosfati kao što je dinatrijum fosfat (na primer dodekahidrat, heptahidrat, dihidrat i anhidrovani oblici) ili natrijum fosfat i njihove smeše.

[0141] Ukoliko su prisutne, sredstva za puferovanje mogu da budu u količini od 0.1 do 5% (m/m), na primer 1 do 3% (m/m), ukupne težine kompozicije.

[0142] Primeri sredstava za maskiranje ukusa uključuju sukralozu, saharozu, saharin ili njegove soli, fruktozu, dekstrozu, glicerol, kukuruzni sirup, aspartam, acesulfam-K, ksilitol, sorbitol, eritrol, amonijum glicirizinat, taumatin, neotam, manitol, mentol, ulje eukaliptusa, kamfor, prirodna sredstva za korigovanje ukusa, veštačka sredstva za korigovanje ukusa i njihove kombinacije.

[0143] Jedan ili više ko-rastvarača može da se upotrebi kako bi se omogućila rastvorljivost lekovitog jedinjenja i/ili drugih ekscipijenata. U primere farmaceutski prihvatljivih korastvarača spadaju, ali se ne ograničavaju samo na, propilen glikol, dipropilen glikol, etilen glikol, glicerol, etanol, polietilen glikoli (na primer PEG300 ili PEG400) i metanol. U jednom otelotvorenju, ko-rastvarač je propilen glikol.

[0144] Ukoliko su prisutni, ko-rastvarači mogu da budu u količini od 0.05 do 30% (m/m), kao što je od 1 do 25% (m/m), na primer od 1 do 10% (m/m) ukupne težine kompozicije.

[0145] Kompozicije za inhalacionu primenu uključuju vodene, organske i vodeno/organske smeše, suve praškove ili kristalne kompozicije primenjene u respiratorni trakt preko pumpe pod pritiskom ili inhalera, na primer, inhalera sa rezervoarom suvog praška, inhalera jedinične doze suvog praška, inhalera prethodno odmerenog višedoznog suvog praška, nazalnih inhalera ili aerosol inhalera pod pritiskom, nebulizera ili insuflatora. U ovu svrhu, pogodne kompozicije sadrže vodu kao razblaživač ili nosač i mogu da budu sa uobičajenim ekscipijentima kao što su puferna sredstva, sredstva za modifikaciju toničnosti i slično. Vodene kompozicije mogu takođe nebulizacijom da se primene u nos i druge regione respiratornog trakta. Ovakve kompozicije mogu da budu vodeni rastvori ili suspenzije ili aerosoli koji se oslobađaju iz pakovanja pod pritiskom, kao što je inhaler odmerene doze, uz upotrebu pogodnog tečnog propelanta.

[0146] Kompozicije za topičnu primenu u nosu (na primer za tretma rinitisa) ili u plućima, uključuju aerosol kompozicije pod pritiskom i vodene kompozicije koje se oslobađaju u nosnim šupljinama pomoću pumpe pod pritiskom. Od posebnog interesa su kompozicije koje

1

nisu pod pritiskom i koje su pogodne za topičnu primenu u nosnu šupljinu. Pogodne kompozicije za ovu svrhu sadrže vodu kao razblaživač ili nosač. Vodene kompozicije za primenu u plućima ili nosu mogu da se izrade sa uobičajenim ekscipijentima kao što su sredstva za puferovanje, sredstva za modifikaciju toničnosti i slično. Vodene kompozicije mogu takođe nebulizacijom da se primene na nosu.

[0147] Za oslobađanje tečne kompozicije u nosne šupljine obično može da se koristi dispenzer tečnosti. Tečna kompozicija može da bude vodena ili nevodena, ali je obično vodena. Ovakav dispenzer tečnosti može da ima brizgalice za raspršivanje ili otvore za raspršivanje kroz koje se odmerena doza tečne kompozicije oslobodi nakon aplikacije, pri čemu korisnik deluje pritiskom na mehanizam pumpe dispenzera tečnosti. Ovakvi dispenzeri tečnosti su generalno snabdeveni sa rezervoarom višestruko odmerenih doza tečne kompozicije, pri čemu se doze oslobađaju nakon aktiviranja pumpe u serijama. Mlaznice ili otvori za dispenziju mogu da budu u obliku pogodnom za unošenje u nozdrve korisnika za sprej raspršivanje tečne kompozicije u nosnu šupljinu. Dispenzer tečnosti prethodno pomenutog tipa je opisan i ilustrovan u Internacionalnoj patentnoj prijavi broj WO 2005/044354 (Glaxo Group Limited). Dispenzer ima kućište na kome se nalazi uređaj za oslobađanje tečnosti snabdeven kompresionom pumpom montiranom na kontejneru u kome se nalazi tečna kompozicija. Kućište ima najmanje jednu polugu koja prstom može da se pomeri na unutra u odnosu na kućište kako bi se kontejner pomerio nagore u kučištu i time omogući pumpi kompresiju i ispumpavanje odmerene doze kompozicije iz cevčice pumpe kroz nazalne mlaznice kućišta. U jednom otelotvorenju, opšti tip dispenzera tečnosti je ilustrovan na Slikama 30-40 u WO 2005/044354.

[0148] Vodene kompozicije koje sadrže jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so mogu takođe da se oslobode pomoću pumpe kako je otkriveno u Internacionalnoj patentnoj prijavi broj WO2007/138084 (Glaxo Group Limited), na primer kako je otkriveno prema Slikama 22-46 te prijave ili kako je otkriveno u United Kingdom patentnoj prijavi broj GB0723418.0 (Glaxo Group Limited), na primer kako je otkriveno prema njihovim Slikama 7-32. Pumpa može da se aktivira preko aktivatora, kako je otkriveno na Slikama 1-6 prijave GB0723418.0.

[0149] Kompozicije suvog praška za topično oslobađanje inhalacijom u pluća mogu, na primer, da budu u obliku kapsula i kartridža, na primer od želatine, ili u obliku blistera od, na primer, laminirane aluminijumske folije, za upotrebu u inhaleru ili insuflatoru. Kompozicije praškaste smeše generalno sadrže praškastu mešavinu za inhalaciju jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli i pogodne praškaste baze (nosač/razblaživač/ekscipijent supstanca) kao što su mono-, di- ili polisaharidi (na primer

2

laktoza ili skrob). Kompozicije suvog praška mogu takođe da uključe, pored leka i nosača, dodatni ekscipijent (na primer tercijerno sredstvo kao što je šećerni estar, na primer celobioze oktaacetat, kalcijum stearat ili magnezijum stearat.

[0150] U jednom otelotvorenju, kompozicija pogodna za inhalacionu primenu može da bude smeštena u višestruke zatvorene kontejnere doze koji obezbeđuju da se pakovanja medikamenta smeste unutar odgovarajućeg inhalacionog uređaja. Kontejneri mogu da se probuše, oljušte ili na drugi način otvore jedan po jedan a doze kompozicije suvog praška se primene inhalaciojm preko piska inhalacionog uređaja, kako je poznato u tehnici. Pakovanje medikamenta može da bude u brojnim različitim oblicima, na primer, u obliku diska ili kao izdužena traka. Reprezentativni inhalacioni uređaji su DISKHALER™ i DISKUS™, proizvođača GlaxoSmithKline.

[0151] Inhalaciona kompozicija suvog praška može takođe da se nalazi u velikim rezervoarima u inhalacionom uređaju, pri čemu je uređaj opremljen sa mehanizmom za merenje doze kompozicije iz rezervoara u inhalacioni kanal odakle odmerena doza može da se inhalira od strane pacijenta preko piska na uređaju. Primeri uređaja ovoga tipa na tržištu su TURBUHALER™ (AstraZeneca), TWISTHALER™ (Schering) i CLICKHALER™ (Innovata.)

[0152] Naredni postupak oslobađanja za inhalacionu kompoziciju suvog praška je da se odmerene doze kompozicije nalaze u kapsulama (jedna doza po kapsuli) koje nakon toga, po potrebi, pacijent stavlja u inhalacioni uređaj. Uređaj ima način da probuši, oljušti ili na drugi način otvori kapsulu tako da doza može da uđe u pluća pacijenta kada se inhalira preko piska uređaja. Kao primeri ovakvih uređaja na tržištu mogu da se pomenu ROTAHALER™ (GlaxoSmithKline) i HANDIHALER™ (Boehringer Ingelheim.)

[0153] Aerosol kompozicije pod pritiskom pogodne za inhalaciju mogu da budu ili suspenzije ili rastvori i mogu da sadrže jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i odgovarajući propelant kao što su fluorougljenik ili hlorfluorougljenik koji sadrži vodonik ili njihove smeše, posebno hidrofluoroalkani, naročito 1,1,1,2-tetrafluoretan, 1,1,1,2,3,3,3-heptafluor-n-propan ili njihove smeše. Aerosol kompozicije mogu opciono da sadrže dodatne ekscipijente kompozicije koji su dobro poznati u tehnici, kao što su surfaktanti, na primer, oleinska kiselina, lecitin ili oligolaktatna kiselina ili njihovi derivati, na primer kako je opisano u WO 94/21229 i WO 98/34596 (Minnesota Mining and Manufacturing Company) i ko-rastvarače, na primer etanol. Komozicije pod pritiskom se generalno nalaze u kanisterima (na primer aluminijumski kanister) zatvorenim sa ventilom (na primer ventil za odmeravanje) i smeštenim u pokretaču opremljenim sa piskom.

[0154] Masti, kreme i geli mogu, na primer, da se formulišu sa vodenom ili uljanom podlogom uz dodatak pogodnih učvršćivača i/ili sredstava za geliranje i/ili rastvarača. Prema tome, u ovakve podloge mogu da budu uključeni, na primer, voda i/ili ulje kao što su tečni parafin ili biljno ulje kao što su ulje kikirikija ili ricinusovo ulje ili rastvarač kao što je polietilen glikol. Sredstva za učvršćivanje i sredstva za geliranje, koja mogu da se koriste u skladu sa osobinama podloge, uključuju meki parafin, aluminijum stearat, cetostearil alkohol, polietilen glikole, lanolin, pčelinji vosak, karboksipolimetilen i derivate celuloze i/ili gliceril monostearat i/ili ne-jonska emulgujuća sredstva.

[0155] Losioni mogu da se formulišu sa vodenom ili uljanom podlogom i generalno takođe sadrže jedno ili više emulgujućih sredstava, stabilizatora, disperzionih sredstava, sredstava za suspendovanje ili učvršćivača.

[0156] Praškovi za eksternu primenu mogu da se formulišu pomoću bilo koje odgovarajuće praškaste podloge, na primer, talka, laktoze ili skroba. Kapi mogu da se formulišu sa vodenom ili ne-vodenom podlogom koja takođe uključuje jedno ili više disperzionih sredstava, solubilizatora, sredstava za suspendovanje ili konzervansa.

[0157] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu, na primer, da budu formulisana za transdermalno oslobađanje u obliku kompozicije u flasterima ili drugim uređajima (na primer uređaji sa gasom pod pritiskom) kojima se oslobađa aktivna komponenta u kožu.

[0158] Za bukalnu primenu, kompozicije mogu da budu u obliku tableta ili lozengi formulisanih na uobičajeni način.

[0159] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu formulisana kao supozitorije koje, na primer, sadrže uobičajene podloge za supozitorije kao što su kakao buter ili drugi gliceridi.

[0160] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu formulisana za parenteralnu primenu kao bolus injekcija ili kontinuirana infuzija i mogu da budu u jediničnom doznom obliku, na primer kao ampule, bočice, infuzije male zapremine ili prethodno napunjeni špricevi, ili u višedoznim kontejnerima uz dodatak konzervansa.

Kompozicije mogu da budu u ovakvim oblicima kao rastvori, suspenzije ili emulzije u vodenim ili ne-vodenim vehikulumima i mogu da sadrže pomoćna sredstva za izradu formulacije kao što su anti-oksidansi, puferi, anti-mikrobna sredstva i/ili sredstva za podešavanje toničnosti. Alternativno, aktivni sastojak može da bude u obliku praška za konstituciju sa odgovarajućim vehikulumom, na primer, sterilnom apirogenom vodom, pre upotrebe. Suvi čvrst preparat može da se izradi punjenjem sterilnog praška pod aseptičnim uslovima u pojedinačne sterilne kontejnere ili punjenjem sterilnog rastvora pod aseptičnim uslovima u svaki kontejner i suši zamrzavanjem.

[0161] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da budu formulisana sa vakcinama kao imunopojačivači za moduliranje njihove aktivnosti. Ovakve kompozicije mogu da sadrže antitelo(a) ili fragment(e) antitela ili antigeničnu komponentu koja uključuje ali se ne ograničava samo na, protein, DNK, žive ili mrtve bakterije i/ili viruse ili čestice slične virusu, zajedno sa jednom ili više komponenti sa delovanjem imunopojačivača, uključujući, ali bez ograničenja na, soli aluminijuma, uljane i vodene emulzije, proteine spržene toplotom, preparate i derivate lipida A, glikolipide, druge TLR agoniste kao što je CpG DNK ili slična sredstva, citokine kao što su GM-CSF ili IL-12 ili slična sredstva.

[0162] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste sama ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima. Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli i drugo farmaceutski aktivno sredstvo(a) mogu da se primene zajedno ili odvojeno a, kada se primenjuju odvojeno, primena može da bude istovremena ili jedno za drugim, po bilo kom redosledu. Količine jedinjenja formule (I) ili (a) njihovih farmaceutski prihvatljivin soli i drugog farmaceutski aktivnog sredstva(ava) i relativan raspored primene će da budu izabrani tako da se postigne željeni kombinovani terapeutski efekat. Primena kombinacije jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli sa drugim terapeutskim sredstvima može da bude zajednička u jednoj farmaceutskoj kompoziciji koja uključuje oba jedinjenja ili u odvojenim farmaceutskim kompozicijama od kojih svaka uključuje jedno od jedinjenja. Alternativno, kombinacija može da se primeni odvojeno, po redu, pri čemu se jedno terapeutsko sredstvo primenjuje prvo a drugo drugo, ili obrnuto. Ova primena po redu može da bude u kratkom vremenskom razmaku ili sa dužim pauzama.

[0163] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više sredstava korisnih u prevenciji ili lečenju virusnih infekcija. U primere ovakvih sredstava spadaju, ali bez ograničenja, inhibitori polimeraze kao što su oni otkriveni u WO 2004/037818-A1, kao i oni otkriveni u WO 2004/037818 i WO 2006/045613; JTK-003, JTK-019, NM-283, HCV-796, R-803, R<1>728, R<1>626, kao i oni otkriveni u WO 2006/018725, WO 2004/074270, WO 2003/095441, US2005/0176701, WO 2006/020082, WO 2005/080388, WO 2004/064925, WO 2004/065367, WO 2003/007945, WO 02/04425, WO 2005/014543, WO 2003/000254, EP 1065213, WO 01/47883, WO 2002/057287, WO 2002/057245 i slična sredstva; inhibitori replikacije kao što su aciklovir, famciklovir, ganciklovir, cidofovir, lamivudin i slična sredstva; inhibitori proteaze kao što su

2

inhibitori HIV proteaze, sakvinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, fosamprenavir, brekanavir, atazanavir, tipranavir, palinavir, lazinavir i inhibitori HCV proteaze BILN2061, VX-950, SCH503034; i slična sredstva; inhibitori nukleozid i nukleotid reverzne transkriptaze kao što su zidovudin, didanozin, lamivudin, zalcitabin, abakavir, stavidin, adefovir, adefovir dipivoksil, fozivudin, todoksil, emtricitabin, alovudin, amdoksovir, elvucitabin i slična sredstva; inhibitori non-nukleozid reverzne transkriptaze (uključujući sredstvo koje ima anti-oksidaciono delovanje kao što su imunokal, oltipraz, itd.) kao što su nevirapin, delavirdin, efavirenz, lovirid, imunokal, oltipraz, kapravirin, TMC-278, TMC-125, etravirin i slična sredstva; inhibitori ulaza kao što su enfuvirtid (T-20), T-1249, PRO-542, PRO-140, TNX-355, BMS-806, 5-Helix i slična sredstva; inhibitori integraze kao što su L-870,180 i slična sredstva; inhibitori vezivanja kao što su PA-344 i PA-457 i slična sredstva; inhibitori hemokin receptora kao što su vikrivirok (Sch-C), Sch-D, TAK779, maraviroj (UK-427,857), TAK449, kao i oni otkirveni u WO 02/74769, WO 2004/054974, WO 2004/055012, WO 2004/055010, WO 2004/055016, WO 2004/055011 i WO 2004/054581 i slična sredstva; inhibitori neuraminidaze kao što su CS-8958, zanamivir, oseltamivir, peramivir i slična sredstva; blokeri jonskog kanala kao što su amantadin ili rimantadin i slična sredstva; i umetnute RNK i antisens oligonukleotidi i kao što su ISIS-14803 i slična sredstva; antivirusna sredstva sa neodređenm mehanizmom delovanja, na primer ona otkrivena u WO 2005/105761, WO 2003/085375, WO 2006/122011, ribavirin i slična sredstva. Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više drugih sredstava koja mogu da budu korisna u prevenciji ili tretmanu virusnih infekcija, na primer imunim terapijama (na primer interferon ili drugi citokini/hemokini, modulatori citokin/hemokin receptora, agonisti ili antagonisti citokina i slična sredstva); i terapeutske vakcine, anti-fibrozna sredstva, anti-inflamatorna sredstva kao što su kortikosteroidi ili NSAIDa (ne-steroidna anti-inflamatorna sredstva) i slična sredstva.

[0164] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više drugih sredstava koja mogu da budu korisna u prevenciji ili tretmanu alergijskih bolesti, inflamatornih bolesti, autoimunih bolesti, na primer, sa antigen imunoterapijom, antihistaminima, steroidima, NSAID-ima, bronhodilatatorima (na primer beta 2 agonistima, adrenergičnim agonistima, antiholinergičnim sredstvima, teofilinom), metotreksatom, modulatorima leukotriena i sličnim sredstvima; u terapiji sa monoklonalnim antitelom, kao što su anti-IgE, anti-TNF, anti-IL-5, anti-IL-6, anti-IL-12, anti-IL-1 i sličnim sredstvima; u terapiji receptorima, na primer, entanereceptorom i sličnm sredstvima; u antigen ne-specifičnim imunoterapijama (na primer interferon ili drugim citokinima/hemokinima, modulatorima citokin/hemokin receptora, agonistima ili antagonistima citokina, TLR agonistima i sličnim sredstvima).

[0165] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu da se koriste u kombinaciji sa jednim ili više drugih sredstava koja mogu da budu korisna u prevenciji ili tretmanu kancera, na primer hemoterapeuticima kao što su alkilirajuća sredstva, inhibitori topoizomeraze, antimetaboliti, antimitotična sredstva, inhibitori kinaze i slična sredstva; u terapiji monoklonalnim antitelom kao što su trastuzumab, gemtuzumab i druga slična sredstva; i hormonskoj terapiji kao što su tamoksifen, goserelin i slična sredstva.

[0166] Farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom mogu takođe da se koriste same ili u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim sredstvom u drugim terapeutskim oblastima, na primer, kod gastrointestinalnih bolesti. Kompozicije u skladu sa pronalaskom mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa terapijom zamene gena.

[0167] U narednom aspektu, pronalazak otkriva kombinaciju koja uključuje jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, zajedno sa najmanje jednim dodatnim terapeutski aktivnim sredstvom.

[0168] Kombinacije koje se odnose na prethodno navedeno mogu uobičajeno da se za upotrebu nalaze u obliku farmaceutske kompozicije a ovakve farmaceutske kompozicije uključuju kombinaciju kako je prethodno definisano, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim rablaživačem ili nosačem, što predstavlja naredni aspekt otkrića.

[0169] Terapeutski efektnivna količina jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli će da zavisi od brojnih faktora. Na primer, u faktore koji se razmatraju spadaju vrsta, starost i težina primaoca, precizno stanje koje zahteva tretman i njegova ozbiljnost, priroda kompozicije i način primene. Određivanje terapeutski efektivne količine bi trebalo da bude diskreciono pravo ordinirajućeg lekara. Nezavisno od toga, efektivna količina jedinjenja iz ovog pronalaska za tretman ljudi koji boluju od slabosti, generalno bi trebalo da bude u rasponu od 0.0001 do 100 mg/kg telesne težine primaoca po danu. Mnogo češće, efektivna količina bi trebalo da bude u rasponu od 0.001 do 10 mg/kg telesne težine po danu. Prema tome, za odraslu osobu težine 70 kg primer primenjene količine po danu bi uobičajeno bio od 7 do 700 mg. Za intranazalni i inhalacioni način primene, uobičajene doze za odraslu osobu težine 70 kg bi trebalo da budu u rasponu od 1 mikrogram do 1 mg po danu. Ova količina može da se da u jednoj dozi dnevno ili u više (kao što su dve, tri, četiri ili više) sub-doza dnevno tako da je ukupna dnevna doza ista. Efektivna količina farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule (I) može da se odredi kao odnos efektivne količine jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli per se. Slične doze bi trebalo da budu odgovarajuće za tretman drugih stanja koja su ovde navedena.

2

[0170] Jedinjenja formule (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli mogu takođe da se primene po bilo kom odgovarajućem rasporedu, na primer, 1-7 puta nedeljno. Precizan režim doziranja će naravno da zavisi od faktora kao što su terapeutska indikacija, starost i stanje pacijenta i posebno od izabranog načina primene.

[0171] Farmaceutske kompozicije mogu da budu u obliku jediničnih doza koje sadrže prethodno određenu količinu aktivnog sastojka po jedinici doze. Ovakva jedinica može da sadrži, kao ne-ograničavajući primer, 0.5 mg do 1 g jedinjenja formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u zavisnosti od stanja koje se tretira, načina primene i starosti, težine i stanja pacijenta. Preferirane jedno-dozne kompozicije su one koje sadrže dnevnu dozu ili sub-dozu, kako je ovde prethodno navedeno ili njihovu odgovarajuću frakciju aktivnog sastojka. Ovakve farmaceutske kompozicije mogu da se izrade bilo kojim postupkom dobro poznatim u farmaceutskoj tehnici.

[0172] Prema tome, ovde je dalje obezbeđena farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0173] U skladu sa otkrićem, ovde je takođe obezbeđen postupak za izradu ovakve farmaceutske kompozicije koji uključuje mešanje jedinjenje formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili nosača.

[0174] U celom opisu i patentnim zahtevim koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, izraz ̎uključuje̎ i varijacije kao što su ̎obuhvata̎ i ̎uključujući̎, će se razumeti kao da implicitno obuhvata navedeni ceo broj ili fazu ili grupu celih brojeva ali ne isključuje bilo koji drugi ceo broj ili fazu ili grupu celih brojeva ili faza.

[0175] Jedinjenja formule (I) i njihove soli mogu da se izrade po metodologiji koja je ovde opisana, što čini naredne aspekte ovog otkrića.

[0176] U skladu sa otkrićem, obezbeđen je proces za izradu jedinjenja formule (I), koji uključuje deprotekciju jedinjenja formule (II):

2

gde su R<1>, m i n kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I) i R<2>je C1-6alkil grupa i koja nakon toga, ukoliko je potrebno, obuhvata jednu ili više od sledećih opcionih faza:

(i). uklanjanje bilo koje potrebne zaštitne grupe;

(ii). izradu soli tako formiranog jedinjenja.

[0177] Na primer, jedinjenje formule (II) se rastvori u pogodnom rastvaraču u prisustvu rastvora odgovarajuće kiseline, na primer rastvora vodonik hlorida u 1,4-dioksan i meša na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine odgovarajući vremenski period, na primer 12-24 sata. Rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom i ostatak se rastvori u pogodnom rastvaraču, na primer metanolu i prenese na nosač jonskih izmenjivača, na primer aminopropil SPE nosač. Nosač se eluira sa pogodnim rastvaračem, na primer metanolom i rastvarač ukloni da se dobije jedinjenje formule (I).

[0178] Jedinjenje formule (II) može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (III):

pri čemu su R<1>i m kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I), R<2>je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (II) i X je odlazeća grupa, na primer halo grupa kao što su brom ili hlor, sa jedinjenjem formule (IV):

gde je n kako je definisano za jedinjenje formule (I).

[0179] Na primer, jedinjenje formule (III), jedinjenje formule (IV) i odgovarajuća baza, na primer N,N-diizopropiletilamin, se rastvore u pogodnom rastvaraču, na primer DMF i zagrevaju na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 46-50 sati. Ukoliko je potrebno, dodaju se nove količine jedinjenja formule (IV) i baze i reaktivna smeša zagreva na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C odgovarajući vremenski period, na primer 46-50 sati. Produkt se nakon toga ekstrahuje iz reakcije koristeći uobičajene načine, na primer podelom između pogodnog organskog

2

rastvarača i vode, a nakon toga izdvajanjem organske faze i uklanjanjem rastvarača a zatim, ukoliko je potrebno, prečišćavanjem.

[0180] Jedinjenje formule (III)‚ može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (V), na primer jedinjenja formule (V) u obliku soli, kao što je trifluoracetatna so:

pri čemu je R<1>kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I) i R<2>je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (II), sa jedinjenjem formule (VI):

gde je m kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I) a X je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (III).

[0181] Na primer, trifluoracetatna so jedinjenja formule (V) i odgovarajuća baza, na primer kalijum karbonat, se suspenduju u pogodnom rastvaraču, na primer DMF i zagrevaju na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C, u odgovarajućoj atmosferi, na primer u atmosferi azota, odgovarajući vremenski period, na primer 20-120 minuta. Smeša se ohladi na odgovarajuću temperaturu, na primer temperaturu sredine i doda se jedinjenje formule (VI) i mešanje nastavi na temperaturi sredine odgovarajući vremenski period, na primer 18-24 sata. Rastvarač se upari pod sniženim pritiskom i ostatak podeli između pogodnog rastvarača, na primer DCM i vode. Sirovi produkt se nakon toga izdvoji iz organske faze i prečisti uobičajenim tehnikama kao što je hromatografija na koloni.

[0182] Alternativno, jedinjenje formule (II) može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (V), na primer jedinjenja formule (V) u obliku soli, kao što je trifluoracetatna so, sa jedinjenjem formule (VI) gde je X brom i jedinjenjem formule (IV) kao jednofaznim procesom.

[0183] Na primer, trifluoracetatna so jedinjenja formule (V) se rastvori u pogodnom rastvaraču, na primer DMF i doda se odgovarajuća baza, na primer kalijum karbonat.

Reaktivna smeša se meša na odgovarajućoj temperaturi, na primer 45-60°C u odgovarajućoj atmosferi, na primer u atmosferi azota, odgovarajući vremenski period, na primer 1-2 sata a nakon toga ohladi na odgovarajuću temperaturu, na primer temperaturu sredine. Nakon toga se doda jedinjenje formule (VI) gde je X brom i nakon mešanja odgovarajući vremenski

2

period, na primer 40-60 minuta, se dodaju jedinjenje formule (IV) i odgovarajuća baza, na primer trietilamin, u pogodnom rastvaraču, na primer DMF. Reaktivna smeša se nakon toga meša odgovarajući vremenski period, na primer 12-24 sata. Rastvarač se ukloni i ostatak podeli između odgovarajućeg organskog rastvarača, na primer dihlormetana i vode. Sirovi produkt formule (II) se izdvoji uobičajenim postupcima i prečisti, na primer, hromatografijom.

[0184] So jedinjenja formule (V) može da se izradi deprotekcijom jedinjenja formule (VII):

pri čemu je R<1>kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I), R<2>je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (II) i P je zaštitna grupa, na primer tetrahidro-2H-piran-2-il grupa, u prisustvu pogodne kiseline, na primer trifluorosirćetne kiseline.

[0185] Na primer, pogodna kiselina, na primer trifluorosirćetna kiselina, se doda u rastvor jedinjenja formule (VII) u pogodnom rastvaraču, na primer metanolu. Smeša se meša na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine, odgovarajući vremenski period, na primer 48-72 sata. Reaktivna smeša se nakon toga koncentruje pod sniženim pritiskom a nakon toga razblaži sa pogodnim rastvaračem, na primer etil acetatom. Dobijena smeša se filtrira i ispere sa malom zapreminom odgovarajućeg rastvarača, na primer etil acetata sve dok filtrat ne postane bezbojan. Ostatak se suši na vazduhu a nakon toga pod sniženim pritiskom, da se dobije so jedinjenja formule (V). Filtrat može da se koncentruje i koncentrat razblaži sa malom zapreminom odgovarajućeg rastvarača, na primer etil acetata a nakon toga filtrira i suši da se dobije druga količina soli jedinjenja formule (V).

[0186] So jedinjenja formule (V), na primer trifluoracetana so, može takođe da se izradi reakcijom jedinjenja formule (IX):

2

pri čemu je R<1>kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I) i P je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (VII), sa odgovarajućim sredstvom za halogenizaciju, na primer N-bromosukcinimidom, a nakon toga reakcijom sa alkoksidnim anjonom, na primer metoksidnim anjonom a nakon toga izdvoji u prisustvu odgovarajuće kiseline, na primer trifluorosirćetne kiseline.

[0187] Na primer, u rastvor sirovog jedinjenja formule (IX) u odgovarajućem bezvodnom rastvaraču, na primer bezvodnom hlorformu, na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine, se doda odgovarajuće sredstvo za halogenizaciju, na primer N-bromosukcinimid, u porcijama i u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 5 minuta. Rastvor se meša na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine, odgovarajući vremenski period, na primer 25-35 minuta. Reaktivna smeša se nakon toga ispere sa vodom i organska faza suši, na primer, propuštanjem kroz hidrofobni frit i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dobijena čvrsta supstanca se rastvori u odgovarajućem bezvodnom rastvaraču, na primer bezvodnom metanolu i doda se odgovarajući alkoksid, na primer rastvor natrijum metoksida u metanolu, na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine, u inertnoj atmosferi, na primer u atmosferi azota. Reaktivna smeša se zagreva na odgovarajućoj temperaturi, na primer 60-70°C, uz dodatak kondenzatora, odgovarajući vremenski period, na primer 12-18 sati. Reaktivna smeša se nakon toga ohladi i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se nakon toga prenese u pogodan rastvarač, na primer etil acetat i sipa u pogodan vodeni medijum, na primer zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida. Organski sloj se izdvoji i zatim ispere sa vodom, suši, na primer preko magnezijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. U rastvor ovog materijala u odgovarajućem bezvodnom rastvaraču, kao što je bezvodni metanol, na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine, se doda odgovarajuća kiselina, na primer trifluorosirćetna kiselina.

Reakcija se meša odgovarajući vremenski period, na primer 25-35 sati i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje formule (V).

[0188] Jedinjenje formule (VII) može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (VIII):

pri čemu je R<1>kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (I), P je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (VII) i Q je atom halogena, na primer atom broma, sa alkoksidnim anjonom, na primer metoksidnim anjonom.

[0189] Na primer, rastvor jedinjenja formule (VIII) u pogodnom rastvaraču, na primer metanolu, se zagreva pod refluksom sa rastvorom odgovarajućeg alkoksida, na primer natrijum metoksida, u pogodnom rastvaraču, na primer metanolu, odgovarajući vremenski period, na primer 4-5 sati. Reaktivna smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom i podeli između pogodnog organskog rastvarača, na primer etil acetata i pogodnog vodenog medijuma, na primer zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida. Organska faza se izdvoji, ispere, na primer sa slanim rastvorom i suši, na primer propuštanjem kroz hidrofobni frit. Rastvarač se nakon toga ukloni pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje formule (VII).

[0190] Jedinjenje formule (VIII) može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (IX) sa odgovarajućim sredstvom za halogenizaciju, kao što je N-bromosukcinimid.

[0191] Na primer, jedinjenje formule (IX) se rastvori u pogodnom rastvaraču, na primer hlorformu i ohladi na odgovarajućoj temperaturi, na primer 0-0.5°C. U ovaj rastvor se doda odgovarajuće sredstvo za halogenizaciju, kao što je N-bromosukcinimid, održavajući temperaturi ispod približno 3°C. Rastvor se meša na odgovarajućoj temperaturi, na primer 2-3°C, odgovarajući vremenski period, na primer 30-45 minuta a nakon toga ostavi da se zagreje na odgovarajuću temperaturu, na primer temperaturu sredine i meša odgovarajući vremenski period, na primer 5-7 sati. Reaktivna smeša se nakon toga ispere sa vodom i organska faza suši i razdvoji od vodene faze koristeći, na primer, hidrofobni frit. Organski rastvarač se nakon toga ukloni i sirovi produkt prečisti, na primer, hromatografijom, da se dobije jedinjenje formule (VIII).

[0192] Jedinjenje formule (IX), gde je R<1>C1-6alkoksi grupa može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (X):

gde je P kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (VII) i T je pogodna odlazeća grupa, na primer atom halogena, na primer atom hlora ili atom fluora, sa rastvorom jedinjenja formule (XIII):

1

R<1>-M (XIII)

pri čemu je R<1>C1-6alkoksi grupa a M je odgovarajući ligand alkalnog metala kao što je natrijum, izrađen u rastvaraču formule (IIIS):

R<1>-H (XIIIS)

pri čemu je R<1>grupa u jedinjenju formule (XIII) ista kao R<1>grupa u rastvaraču formule (XIIIS).

[0193] Na primer, jedinjenje formule (XIII) kao što je natrijum t-butoksid, se doda u rastvarač formule (XIIIS). Smeša se meša dok ne postane homogena, a nakon toga se doda jedinjenje formule (VII). Reaktivna smeša se zagreva na odgovarajućoj temperaturi, na primer 100°C, odgovarajući vremenski period, na primer 12-18 sati. Rastvarač se kontinuirano ukloni pod sniženim pritiskom i podeli između pogodnog rastvarača, na primer dietil etra i vode. Organska faza se izdvoji i vodena faza ponovo ekstrahuje sa novom količinom rastvarača. Organski slojevi se nakon toga izdvoje, kombinuju, suše preko odgovarajućeg sredstva za sušenje, na primer anhidrovanog magnezijum sulfata. Sredstvo za sušenje se ukloni filtriranjem i rastvarač pod sniženim pritiskom ukloni iz produkta da se dobije jedinjenje formule (IX) gde je R<1>C1-6alkoksi grupa.

[0194] Jedinjenje formule (IX) gde je R<1>C1-6alkilamino grupa, može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (X) sa jedinjenjem formule (XIV):

R<1>-H (XIV)

pri čemu je R<1>C1-6alkilamino grupa.

[0195] Na primer, jedinjenje formule (XIV) se doda u rastvor jedinjenja formule (X) u odgovarajućem bezvodnom rastvaraču, na primer bezvodnom etilen glikolu, na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine, u odgovarajućoj inertnoj atmosferi, na primer u atmosferi azota. Reaktivna smeša se zagreva na odgovarajućoj temperaturi, na primer 110-130°C, odgovarajući vremenski period, na primer 12-18 sati. Reakcija se nakon toga ohladi na odgovarajuću temperaturu, na primer temperaturu sredine, razblaži sa pogodnim rastvaračem, na primer etil acetatom i ispere sa vodom. Organski sloj se suši sa odgovarajućim sredstvom za sušenje, na primer anhidrovanim magnezijum sulfatom, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje formule (IX) gde je R<1>C1-6alkilamino grupa.

[0196] Jedinjenje formule (X) može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (XI):

2

gde je P kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (VII) i T je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (X) a V je pogodna odlazeća grupa, na primer atom halogena, na primer atom hlora, sa alkoholnim rastvorm amonijaka, na primer rastvorom amonijaka u izo-propil alkoholu.

[0197] Na primer, jedinjenje formule (XI) se zagreva sa alkoholnim rastvorom amonijaka, na primer 2M rastvorom amonijaka u izo-propil alkoholu, na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C, odgovarajući vremenski period, na primer 5-6 sati. Reaktivna smeša se nakon toga ostavi da stoji na odgovarajućoj temperaturi, na primer temperaturi sredine, odgovarajući vremenski period, na primer 12-18 sati. Doda se nova količina alkoholnog rastvora amonijaka, na primer 2M rastvor amonijaka u izo-propil alkoholu, da se razbije nastala pogača i reaktivna smeša zagreva dodatni vremenski period, na primer 8-10 sati, dok se reakcija ne završi. U reaktivnu smešu se doda voda i čvrsta supstanca ukloni filtriranjem, ispere sa odgovarajajućim sredstvom za ispiranje, na primer smešom izo-propil alkohola i vode a nakon toga suši, na primer na vazduhu uz sukciju da se dobije prva količina jedinjenja formule (X). Filtrat se ostavi da stoji dodatni vremenski period, na primer 12-18 sati i dobijena druga količina jedinjenja formule (X) se izdvoji filtriranjem i suši.

[0198] Jedinjenje formule (X) može takođe da se izradi reakcijom jedinjenja formule (XII):

gde je T kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (X) i V je kako je ovde prethodno definisano za jedinjenje formule (XI), sa jedinjenjem formule (XV):

P<U>-H (XV)

gde je P<U>odgovarajući prekursor za zaštitnu grupu P, na primer 3,4-dihidro-2H-piranil grupu, a nakon toga reakcijom sa alkoholnim rastvorom amonijaka, na primer rastvorom amonijaka u izo-propil alkoholu.

[0199] Na primer, p-toluensulfonska kiselina monohidrat se doda u rastvor jedinjenja formule (XII) u odgovarajućem bezvodnom rastvaraču, na primer bezvodnom etil acetatu. Reaktivna smeša se zagreva na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C i doda se jedinjenje formule (XV). Reakcija se meša na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C, odgovarajući vremenski period, na primer 1-2 sata i rastvarač ukloni pod sniženim pritiskom. Suspenzija dobijene čvrste supstance u alkoholnom rastvoru amonijaka, na primer 2M rastvoru amonijaka u izo-propil alkoholu se zagreva u odgovarajućoj inertnoj atmosferi, na primer u atmosferi azota, na odgovarajućoj temperaturi, na primer 60-70°C, odgovarajući vremenski period, na primer 4-5 sati uz dodatak kondenzatora. Reaktivna smeša se sipa u vodu i ostavi da se hladi odgovarajući vremenski period, na primer 12-18 sati. Dobijeni precipitat je izdvoji filtriranjem i suši da se dobije jedinjenje formule (X).

[0200] Jedinjenje formule (X) može takođe da se izradi reakcijom jedinjenja formule (XIA):

gde je T atom fluora, sa odgovarajući zaštitnim sredstvom, na primer sredstvom za sililaciju, kao što je N,O-bis(trimetilsilil)acetamid, a nakon toga reakcijom zaštićenog jedinjenja formule (XIA) sa jedinjenjem formule (XVE):

P<U>-E (XVE)

gde je P<U>odgovarajući prekursor za zaštitnu grupu P, na primer 3,4-dihidro-2H-piranil grupu i E je aciloksi grupa, na primer acetatna grupa.

[0201] Na primer, odgovarajuće zaštitno sredstvo, na primer N,O-bis(trimetilsilil)acetamid se doda u izmešanu suspenziju jedinjenja formule (XIA), na primer 2-fluor-1H-purin-6-amin, u pogodnom anhidrovanom rastvaraču, na primer anhidrovanom acetonitrilu i dobijena smeša zagreva pod refluksom odgovarajući vremenski period, na primer 2-3 sata. Reaktivna smeša se nakon toga ohladi na odgovarajuću temperaturu, na primer 0-5°C. Nakon toga se polako doda rastvor jedinjenja formule (XVE), na primer tetrahidropiranil acetat, u pogodnom anhidrovanom rastvaraču, na primer anhidrovanom acetonitrilu, a nakon toga se u kapima doda Lewis-ova kiselina, na primer trimetilsilil trifluormetansulfonat. Temperatura reakcije se podesi na odgovarajuću temperaturu, na primer 8-15°C i mešanje održava dodatni vremenski period, na primer 1-2 sata. Smeša se nakon toga neutrališe dodavanjem 1M rastvora natrijum karbonata. Organski sloj se ohladi na 0°C, uz mešanje. Precipitirana čvrsta supstanca se nakon toga sakupi, na primer, filtriranjem i suši.

4

[0202] Jedinjenje formule (XI) može da se izradi reakcijom jedinjenja formule (XII) sa jedinjenjem formule (XV).

[0203] Na primer, u jedinjenje formule (XII) se doda odgovarajući organski rastvarač, na primer etil acetat, a nakon toga p-toluensulfonska kiselina. Smeša se zagreva na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C, a nakon toga se doda 3,4-dihidro-2H-piran. Reaktivna smeša se nakon toga zagreva na odgovarajućoj temperaturi, na primer 50-60°C, odgovarajući vremenski period, na primer 4-5 sati. Rastvarač se nakon toga ukloni iz reaktivne smeše pod sniženim pritiskom da se dobije jedinjenje formule (XI).

Skraćenice

[0204] Naredna lista pokazuje definicije nekih skraćenica kako su ovde korišćene. Jasno je da lista nije definitivna i da će značenja onih skraćenica koje u daljem tekstu nisu definisane biti jasne stručnjaku sa iskustvom u tehnici.

DCM Dihlormetan

DMF N,N-Dimetilformamid

DMSO Dimetilsulfoksid

EtOAc Etil acetat

Et2O Dietil etar

HCI Hlorovodonična kiselina

HPLC Visoko efikasna tečna hromatografija

ISCO Companion Automatizovan uređaj za flash hromatografiju sa analizama frakcija apsorpcijom UV, proizvođača Presearch Limited, Basingstoke, Hants., RG24 8PZ, UK

MDAP HPLC Reverznbo fazna HPLC na C18 koloni uz korišćenje gradijenta dva rastvarača i analiza frakcija elektrosprej masenom spektroskopijom. SPE Ekstrakcija čvrste faze

MeOH Metanol

min minut

Uklanjanje Uklanjanje rastvarača pod sniženim pritiskom

TFA Trifluorosirćetna kiselina

iPr izo-Propil

t-Bu terc-Butil

Ms Mesil

Ac Acetil

n-Bu n-Butil

Ph Fenil

rt sobna temperatura

[0205] Ovde opisani postuci sinteze su sumirani u Šemi 1.

[0206] Tipični uslovi reakcije za svaku fazu sinteze u Šemi 1 su niže dati:

A Dihidropiran/paratoluen sulfonska kiselina, na primer 3-6 sati na 50°C.

A1 Dihidropiran/paratoluen sulfonska kiselina, na primer 1 sat na 50°C, nakon toga amonijak/iPrOH, na primer 4 sata na 60°C, nakon toga se doda voda i ohladi na temperaturu sredine u toku 12-18 sati.

A2 BSA u MeCN, pod refluksom, ohladi na 0°C, nakon toga THP acetat u MeCN, zagreje na 10°C, nakon toga NaHCO3(aq.)

B Amonijak/iPrOH, na primer 5 sati na 50°C, nakon toga na temperaturi sredine u toku 12-18 sati, nakon toga 9 sati na 50°C.

C Za X = NH, R<A>= C1-6alkil: R<A>NH2/etilen glikol na primer 12-18 sati na 120°C. Za Z = O, R<A>= C1-6alkil: R<A>ONa/BuOH/dimetoksietan na primer 12-18 sati na 93-110°C.

C1 NBS u CHCl3na primer 30 minuta na 0-5°C, nakon toga 0.5-1 sat na temperaturi sredine, nakon toga na primer NaOMe/metanol u atmosferi N2/60-70°C/12-18 sati, nakon toga TFA/MeOH na primer na temperaturi sredine u toku 18-65 sati.

D NBS u CHCl3na primer 30 minuta na 0-5°C, nakon toga na temperaturi sredine u toku 36-48 sati.

E NaOMe/MeOH na primer 4-6 sati pod refluksom.

F TFA/MeOH na primer 18-65 sati na temperaturi sredine.

G K2CO3/DMF, nakon toga na 50°C u toku 1-1.5 sat, nakon toga se doda (VI), meša 40 min, nakon toga se doda (IV)/Et3N, nakon toga 18 sati na temperaturi sredine.

G1 K2CO3/DMF, nakon toga 30 minuta na 50°C u atmosferi N2, nakon toga 20 sati na temperaturi sredine, doda se (VI), meša.

G2 Rastvor u DMF sa N,N-diizopropiletilaminom, nakon toga 48 sati na 50°C, nakon toga se doda još (IV), nakon toga još 48 sati na 50°C.

H HCl/metanol, nakon toga 18 sati na temperaturi sredine.

[0207] Jedinjenja formula (IV), (VI), (XIA), (XII), (XIII), (XIV) i (XV) su ili poznata u literaturi ili su raspoloživa na tržištu, na primer od Sigma-Aldrich, UK ili mogu da se izrade analogno poznatim procedurama, na primer onima koje su otkrivene u tekstu standardnih referenci za metodologiju sinteze kao što su J. March, Advanced Organic Chemistry, 6th Edition (2007), WileyBlackwell or Comprehensive Organic Synthesis (Trost B.M. and Fleming I., (Eds.), Pergamon Press, 1991).

[0208] Primeri drugih zaštitnih grupa koje mogu da se koriste u toku ovde opisanih sinteza i načini za njihovo uklanjanje mogu da se nađu u T. W. Greene ’Protective Groups in Organic Synthesis’, 4th Edition, J. Wiley and Sons, 2006.

[0209] Za bilo koju od prethodno opisanih reakcija ili procesa mogu da se upotrebe uobičajeni postupci zagrevanja i hlađenja, na primer uljana kupatila sa regulisanom temperaturom ili topli blokovi sa regulisanom temperaturom i kupatila led/so ili kupatila suvi led/aceton, tim redom. Mogu da se koriste uobičajeni postupci za izdvajanje, na primer ekstrakcija iz ili u vodene ili ne-vodene rastvarače. Mogu da se koriste uobičajeni postupci sušenja organskih rastvarača, rastvora ili ekstrakta, kao što je mućkanje sa anhidrovanim magnezijum sulfatom ili anhidrovanim natrijum sulfatom ili propuštanje kroz hidrofobni frit. Ukoliko je potrebno, mogu da se koriste uobičajeni postupci prečišćavanja, na primer kristalizacojom i hromatografijom, na primer hromatografijom na silika gelu ili reverznofaznom hromatografijom. Kristalizacija može da se izvrši korišćenjem uobičajenih rastvarača kao što su etil acetat, metanol, etanol ili butanol ili njihove vodene smeše. Jasno je da vreme i temperature specifičnih reakcija mogu obično da se odrede tehnikama praćenja reakcije, na primer hromatografijom na tankom sloju ili LC-MS.

[0210] Kada su potrebni pojedinačni izomerni oblici jedinjenja iz pronalaska, mogu da se izrade kao pojedinačni izomeri korišćenjem uobičajenih procedura kao što su frakciona kristalizacija diastereoizomernih derivata ili asimetrična visoko efikasna tečna hromatografija (asimetrična HPLC).

[0211] Apsolutna stereohemija jedinjenja može da se odredi korišćenjem uobičajenih postupaka kao što je kristalografija X-zracima.

[0212] Aspekti pronalaska su ilustrovani referencama za niže date primere, ali ni na koji način nisu time ograničeni.

Opšti eksperimentalni detalji

[0213] Jedinjenja su imenovana koršćenjem ACD/Name PRO 6.02 softvera za hemijske nazive od Advanced Chemistry Developments Inc., Toronto, Ontario, M5H2L3, Canada.

[0214] Eksperimentalni detalji LCMS sistema A-D koji su ovde označeni su sledeći:

Sistem A

[0215]

Kolona: 50mm x 2.1 mm ID, 1.7m Acquity UPLC BEH C18

Brzina protoka: 1mL/min.

Temp.: 40°C

opseg UV detekcije: 210 do 350nm

Maseni spektar: beleži se na masenom spektrometru korišćenjem alternativnog-sken pozitivnog i negativnog modela elektrosprej jonizacije.

Rastvarači:

A: 0.1% v/v mravlja kiselina u vodi

B: 0.1% v/v mravlja kiselina u acetonitrilu

Gradijent: Vreme (min.) A% B%

0 97 3

0.1 97 3

1.4 0 100

1.9 0 100

2.0 97 3

Sistem B

[0216]

Kolona: 30mm x 4.6mm ID, 3.5µm Sunfire C18kolona

Brzina protoka: 3mL/min.

Temp: 30°C

opseg UV detekcije: 210 do 350nm

Maseni spektar: beleži se na masenom spektrometru korišćenjem alternativnog-sken pozitivnog i negativnog modela elektrosprej jonizacije

Rastvarači:

A: 0.1% v/v rastvor mravlje kiseline u vodi

B: 0.1% v/v rastvor mravlje kiseline u acetonitrilu

Gradijent: Vreme (min.) A% B%

0 97 3

0.1 97 3

4.2 0 100

4.8 0 100

4.9 97 3

5.0 97 3

Sistem C

Kolona: 50mm x 2.1mm ID, 1.7µm Acquity UPLC BEH C18

Brzina protoka: 1mL/min.

Temp: 40°C

opseg UV detekcije: 210 do 350nm

Maseni spektar: beleži se na masenom spektrometru korišćenjem alternativnog-sken pozitivnog i negativnog modela elektrosprej jonizacije

Rastvarači:

A: 10mM amonijum bikarbonat u vodi podešen na pH10 sa rastvorom amonijaka B: acetonitril

Gradijent: Vreme (min.) A% B%

0 99 1

1.5 3 97

1.9 3 97

2.0 0 100

Sistem D

[0218]

Kolona: 50mm x 4.6mm ID, 3.5µm XBridge C18kolona

Brzina protoka: 3mL/min.

Temp: 30°C

opseg UV detekcije: 210 do 350nm

Maseni spektar: beleži se na masenom spektrometru korišćenjem alternativnog-sken pozitivnog i negativnog modela elektrosprej jonizacije

Rastvarači:

A: 10mM amonijum bikarbonat u vodi podešen na pH10 sa rastvorom amonijaka B: acetonitril

Gradijent: Vreme (min.) A% B%

0 99 1

0.1 99 1

4.0 3 97

5.0 3 97

4

[0219] Hromatografsko prečišćavanje se obično izvodi korišćenjem prethodno upakovanih nosača silika gela. Flashmaster II je automatski višestruki sistem flash hromatografije, nabavljen od Argonaut Technologies Ltd, koji koristi jednokratne, normalno fazne, nosače za ekstrakciju čvrste faze (SPE) (2 g do 100 g). To obezbeđuje kvaternarno on-line mešanje rastvarača čime se omogućava sprovođenje postupka gradijenta. Uzorci se poređaju korišćenjem multi-funkcionalnog softvera slobodnog pristupa, koji reguliše rastvarače, brzine protoka, profil gradijenta i uslove sakupljanja. Sistem je opremljen sa Knauer UV-detektorom promenljivih talasnih dužina i sa dva Gilson FC204 sakupljača frakcija koji omogućavaju automatsko isecanje pika, sakupljanje i praćenje.

[0220] Uklanjanje rastvarača pomoću struje azota se vrši na 30-40°C na GreenHouse Blowdown sistemu nabavljenom od Radleys Discovery Technologies Saffron Walden, Essex, CB11 3AZ, UK.

[0221]<1>H NMR spektar se beleži ili u CDCl3ili DMSO-d6*ili na Bruker DPX 400 ili Bruker Avance DRX ili Varian Unity 400 spektrometru koji svi rade na 400 MHz. Korišćeni unutrašnji standard je ili tetrametilsilan ili ostatak protonskog rastvarača na 7.25 ppm za CDCl3ili 2.50 ppm za DMSO-d6.

[0222] Usmerena masena autopreparativna HPLC se sprovodi pod uslovima koji su niže dati. UV detekcija je uprosečen signal za talasne dužine od 210nm do 350nm a maseni spektar se beleži na masenom spektrometru koristeći alternativni-sken pozitivnog i negativnog modela elektrosprej jonizacije.

Postupak A

[0223] Postupak A se izvodi na XBridge C18koloni (obično 150mm x 19mm i.d.5µm promer pakovanja) na temperaturi sredine. Korišćeni rastvarači su:

A = 10 mM vodeni rastvor amonijum bikarbonata podešen na pH 10 sa rastvorom amonijaka. B = acetonitril.

Postupak B

[0224] Postupak B se izvodi na Sunfire C18koloni (obično 150mm x 30mm i.d.5µm promer pakovanja) na temperaturi sredine. Korišćeni rastvarači su:

A = 0.1% v/v rastvor mravlje kiseline u vodi

B = 0.1% v/v rastvor mravlje kiseline u acetonitrilu.

Postupak C

[0225] Postupak C se izvodi na Sunfire C18koloni (obično 150mm x 30mm i.d.5µm promer pakovanja) na temperaturi sredine. Korišćeni rastvarači su:

A = 0.1% v/v rastvor trifluorosirćetne kiseline u vodi

B = 0.1% v/v rastvor trifluorosirćetne kiseline u acetonitrilu.

Postupak D

[0226] Postupak D se izvodi na Atlantis C18koloni (obično 100mm x 30mm i.d.5µm promer pakovanja) na temperaturi sredine. Korišćeni rastvarači su:

A = 0.1% v/v rastvor mravlje kiseline u vodi

B = 0.1% v/v rastvor mravlje kiseline u acetonitrilu.

Postupak E

[0227] Postupak E se izvodi na Supelcosil ABZ+Plus koloni (obično 100mm x 21.2mm i.d.

5µm promer pakovanja) na temperaturi sredine. Korišćeni rastvarači su:

A = 0.1% v/v rastvor mravlje kiseline u vodi

B = acetonitril:voda 95:5 0.05% mravlja kiselina

Primeri

Međuproizvod 1: 2,6-Dihlor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin

[0228]

[0229] U 2,6-dihlorpurin (25.0g) (nabavljen od, na primer, Aldrich, UK) se doda etil acetat (260ml), a nakon toga p-toluensulfonska kiselina (0.253g). Smeša se zagreje na 50°C a nakon toga se doda 3,4-dihidro-2H-piran (16.8g). Reaktivna smeša se nakon toga zagreva 4 sata na 50°C. Reaktivna smeša se upari pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (36.9g).

<1>H NMR (CDCl3): 8.35 (1H, s), 5.77 (1H, dd), 4.20 (1H, m), 3.79 (1H, m), 2.20-1.65 (6H, m).

Međuproizvod 2: 2-hlor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0230]

[0231] 2,6-Dihlor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin (36.9g) se zagreva 5 sati na 50°C sa 2M rastvorom amonijaka u izopropanolu (250ml). Nakon stajanja na temperaturi sredine u toku noći, doda se nova količina 2M rastvora amonijaka u izopropanolu (100ml) da se razori dobijena pogača i reaktivna smeša se zagreva dodatnih 9 sati dok se ne završi reakcija. U reaktivnu smešu se doda voda (70ml) i žuta čvrsta supstanca se izdvoji filtriranjem. Čvrsta supstanca se ispere sa smešom izopropil alkohol:voda (5:1 (v/v), 60ml) a nakon toga suši na vazduhu uz sukciju, da se dobije prva količina. Filtrat se ponovo filtrira nakon stajanja u toku noći da se izdvoji precipitat i obe čvrste supstance se suše pod vakuumom. Prva količina je čista a materijal iz druge pokazuje veoma malu nečistoću (izdvojeni široki signal 3.5 ppm nije viđen u prvoj količini) ali je inače identična. Čvrsta supstanca u prvoj količini (28.4g), čvrsta supstanca u drugoj količini (3.42g).

<1>H NMR (CDCl3): 8.01 (1H, s), 5.98 (2H, široko s), 5.70 (1H, dd), 4.16 (1H, m), 3.78 (1H, m), 2.15-1.60 (6H, preklapa se m).

Međuproizvod 2 (alternativni postupak): 2-hlor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0232]

4

[0233] U rastvor 2,6-dihlorpurina (25g) (nabavljen od, na primer, Aldrich, UK) u bezvodnom etil acetatu (200ml) se doda p-toluensulfonska kiselina monohidrat (235mg). Reakcija se zagreje na 50°C i odjednom se doda 3,4-dihidro-2H-piran (18.1ml). Reakcija se ostavi 1 sat uz mešanje na 50°C i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Ovako se dobija žuta čvrsta supstanca. Suspenzija ove čvrste supstance (~36g) u 2.0M rastvoru amonijaka u izopropanolu (460ml) se zagreva 4 sata u atmosferi azota na 60°C uz dodatak kondenzatora. Reakcija se sipa u vodu (50ml) i ostavi da se hladi u toku noći. Precipitat se filtrira i suši 30 min na rotacionom evaporatoru (60°C) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca, 31g (93%, 2 faze).

MS izračunato za (C10H12ClN50)<+>= 254, 256

MS nađeno (elektrosprej): (M)<+>= 254, 256 (3:1)

<1>H NMR ((CD3)2SO): δ 8.43 (1H, s), 7.82 (2H, s), 5.55 (1H, dd), 4.00 (1H, m), 3.69 (1H, m), 2.21 (1H, m), 1.95 (2H, m), 1.74 (1H, m), 1.56 (2H, m).

Međuproizvod 3: 2-(Butiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0234]

[0235] U butan-1-ol (76 mL) se u porcijama doda natrijum terc-butoksid (15.2g) (Napomena: reaktivna smeša se zagreva). Ova smeša se meša dok ne postane homogena (ca.15min) a nakon toga se doda 2-hlor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (10.0g) da se dobije svetlo žuti rastvor. Reaktivna smeša se nakon toga zagreva na 100°C u toku noći. Reaktivna smeša se izdeli da se ukloni butan-1-ol koliko god je moguće a nakon toga podeli između dietil etra i vode. Dietil etar faza se izdvoji i vodena faza ponovo ekstrahuje sa dietil etrom. Kombinovani organski slojevi se suše preko magnezijum sulfata (anhidrovani). Magnezijum sulfat se izdvoji filtriranjem i filtrat izdeli da se dobije braon viskozno ulje koje se azeotropira sa toluenom (3 puta) i ostavi pod visokim vakuumom u toku noći, prenese u novu bocu sa dihlormetanom i izdeli, stavi pod visoki vakuum da se dobije naslovljeno jedinjenje kao braon staklo (9.45g).

<1>H NMR (CDCl3): 7.85 (1H, s), 5.92 (2H, široko s), 5.64 (1H, d), 4.32 (2H, t), 4.14 (1H, m), 3.75 (1H, m), 2.10-1.95 (3H, preklapa se m), 1.81-1.58 (5H, preklapa se m), 1.50 (2H, m), 0.97 (3H, t).

Međuproizvod 4: 8-Bromo-2-(butiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0236]

[0237] 2-(Butiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (9.45g) se rastvori u hloroformu (50ml) i ohladi na 0°C (ledeno kupatilo). U ovaj rastvor se u porcijama doda N-bromosukcinimid (6.07g), održavajući temperaturu ispod 3°C. Ovako se dobija tamno zeleni rastvor koji se meša 30 minuta na 2.5°C a zatim ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu a nakon toga meša 6 sati. Reaktivna smeša se nakon toga ispere sa vodom (100ml, dva puta). Organska faza se suši/izdvoji koristeći hidrofobni frit i upari da se dobije tamno braon guma koja se prečisti hromatografijom na silika gelu (120g) (ISCO) koristeći gradijent eluacije 0-50 % etil acetat: cikloheksan da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo žuta čvrsta supstanca (8.37g).

<1>H NMR (CDCl3): 5.61 (1H, dd), 5.49 (2H, široko s), 4.32 (2H, m), 4.17 (1H, m), 3.71 (1H, m), 3.04 (1H, m), 2.11 (1H, široko d), 1.89 -1.45 (6H, preklapa se m), 1.50 (2H, m), 0.97 (3H, t).

Međuproizvod 5: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0238]

4

[0239] 8-Bromo-2-(butiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (8.37g) se zagreva 4.5 sata pod refluksom sa 25% natrijum metoksidom u metanolu (14.4ml) i metanolu (65ml). Reaktivna smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom i podeli između etil acetata i zasićenog rastvora amonijum hlorida. Organska faza se izdvoji i ponovo ekstrahuje u etil acetat. Organske faze se kombinuju i isperu sa slanim rastvorom (dva puta). Organska faza se propusti kroz hidrofobni frit nakon izdvajanja vodene faze i upari da se dobije svetlo braon guma koja se stavi pod visoki vakuum da se dobije pena (7.52g) koja prelazi u gumu (7.34g) na pritisku sredine i očvrsne u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta amorfna čvrsta supstanca.

MS izračunato za (C15H23N5O3)<+>= 321 MS nađeno (elektrosprej): (M+H)<+>= 322

<1>H NMR (CDCl3): 5.50 (1H, dd), 5.17 (2H, široko s), 4.29 (2H, t), 4.12 (3H, s i 1H, m), 3.70 (1H, m), 2.77 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.82-1.63 (6H, preklapa se m), 1.50 (2H, m), 0.97 (3H, t).

Međuproizvod 6: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifluoracetatna so [0240]

[0241] U rastvor 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (7.34g) u metanolu (100ml) se doda trifluorosirćetna kiselina (10ml). Smeša se meša na temperaturi sredine preko vikenda da se dobije suspenzija. Reaktivna smeša se koncentruje do male zapremine (gusta žitka masa) a nakon toga razblaži sa etil acetatom (50ml).

Dobijena žitka masa se filtrira i ispere sa malom zapreminom etil acetata sve dok filtrat ne postane bezbojan. Čvrsta supstanca se ostavi da se suši na vazduhu a nakon toga pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (6.20g). Prethodno dobijeni filtrat se koncentruje da se dobije žitka masa koja se razblaži sa malom zapreminom

4

etil acetata (10ml) a nakon toga filtrira i suši kao gore. Druga serija se izdvoji kao bela čvrsta supstanca (0.276g). Obe serije su identične prema NMR.

MS izračunato za (C10H15N5O2)<+>= 237

MS nađeno (elektrosprej): (M+H)<+>= 238

<1>H NMR (CD3OD): 4.47 (2H, t), 4.15 (3H, s), 1.80 (2H, m), 1.50 (2H, m), 0.99 (3H, t) (promenljivi NH2, NH i COOH protoni nisu uočeni).

Međuproizvod 7: N<2>-Butil-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamin

[0242]

[0243] U rastvor 2-hlor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (10g) u bezvodnom etilen glikolu (50ml) se odjednom, na sobnoj temperaturi i u atmosferi azota doda nbutilamin (16ml). Reakcija se zagreva na 120°C u toku noći. Reakcija se ohladi na sobnu temperaturu, razblaži sa etil acetatom (150ml) i ispere sa vodom (2 x 50ml). Organski sloj se suši preko MgSO4, filtrira i koncentruje pod vakuumom. Ovako se dobija naslovljeno jedinjenje kao viskozno zeleno ulje (10.2g) koje se koristi u narednoj fazi bez naknadnog prečišćavanja.

MS izračunato za (C14H22N6O)<+>= 290

MS nađeno (elektrosprej): (M+H)<+>= 291

<1>H NMR ((CD3)2SO): δ 7.8 (1H, s), 6.6 (2H, s), 6.2 (1H, t), 5.4 (1H, dd), 4.0 (1H, m), 3.6 (1H, m), 3.2 (2H, m), 2.2 (1H, m), 1.9 (1H, m), 1.8 (1H, m), 1.7 (1H, m), 1.5 (2H, m), 1.4 (2H, m), 1.3 (2H, m), 0.9 (3H, t).

Međuproizvod 8: N<2>-Butil-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin so trifluorosirćetne kiseline

4

[0245] U rastvor sirovog N<2>-butil-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamina (ca.10.2 g) u bezvodnom hlorform (100ml) se na sobnoj temperaturi u porcijama, u toku 5 minuta, dodaje N-bromosukcinimid (6.3g). Tamni rastvor se ostavi 30. minuta uz mešanje na sobnoj temperaturi. Reaktivna smeša se ispere sa vodom (20ml). Organska faza se propusti kroz hidrofobni frit i koncentruje pod vakuumom. Ovako se dobija bež čvrsta supstanca koja se rastvori u bezvodnom metanolu (100ml) i na sobnoj temperaturi se u atmosferi azota odjednom doda rastvor natrijum metoksida (25 mt.% u metanolu, 24ml). Reakcija se zagreva na 65°C, uz dodati kondenzator, u toku noći. Reakcija se ohladi i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni narandžasti ostatak se prenese u etil acetat (150ml) i sipa u zasićeni vodeni rastvor amonijum hlorida (50ml). Organski sloj se izdvoji a zatim ispere sa vodom (50ml). Organski sloj se suši preko MgSO4, filtrira i koncentruje pod vakuumom. U ovaj materijal u bezvodnom metanolu (70ml) se na sobnoj temperaturi odjednom doda trifluorosirćetna kiselina (7ml). Reakcija se meša 30 sati i koncentruje pod vakuumom da se dobije tamno braon čvrsta supstanca. Supstanca se prenese u dietil etar (20ml) i triturira. Čvrsta supstanca se filtrira da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bež čvrsta supstanca (3.3g, 35%, 4 faze).

MS izračunato za (C10H16N6O)<+>= 236

MS nađeno (elektrosprej): (M+H)<+>= 237

<1>H NMR ((CD3)2SO): δ 13.3-12.3 (1H, br.m), 8.6-7.3 (2H, m), 4.05 (3H, s), 3.28 (2H, m), 1.52 (2H, m), 1.33 (2H, m), 0.89 (3H, t) (preostali promenljivi protoni nisu jasni).

Međuproizvod 9: 2-{[(1S)-1-Metilbutil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0246]

4

Postupak A

[0247] Natrijum t-butoksid (48.5g, 505mmol) se na sobnoj temperaturi u porcijama doda u (S)-2-pentanol (185ml) (nabavljen od, na primer, Julich Chiral Rastvors, Germany) i meša dok ne postane homogen (napomena: reakcija je egzotermna). Doda se 2-hlor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (32g, 126mmol) i reaktivna smeša zagreva 72 sata na 70°C. Reakcija se ohladi na sobnu temperaturu i podeli između etil acetata (500ml) i vode (500ml). Organska faza se ispere sa zasićenim rastvorom natrijum hlorida (100ml), suši (MgSO4), filtrira i upari. Ostatak se triturira sa etrom i čvrsti materijal filtrira. Precipitat se ponovo ispere sa etrom i filtrati kombinuju i upare. Sirovi materijal (ca.30g) se rastvori u smeši DMSO:metanol (1:1) i prečisti hromatografijom na reverzno faznoj (C18) koloni (330g) koristeći kao gradijent 25-65% acetonitril (+ 0.1%TFA)-voda (+ 0.1%TFA) u količini od 8 zapremina kolone, a frakcije se odmah neutrališu sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum karbonata. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i podele između dihlormetana i zasićenog vodenog rastvora natrijum hidrogen karbonata. Organska faza se suši propuštanjem kroz hidrofobni frit, filtrira i upari da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bleda krem pena (14.97g). LCMS (Sistem B): tRET= 2.21 min; MH<+>306

Postupak B

[0248] Natrijum t-butoksid (206g, 2.144mol) se doda u (S)-2-pentanol (720ml, 6.58mol) (nabavljen od, na primer, Julich Chiral Solutions, Germany) u boci okruglog dna zapremine 2L. Smeša se meša na 50°C sve dok se sav natrijum t-butoksid ne rastvori. Nakon toga se u porcijama u toku 5 minuta dodaje 2-fluoro-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (130g, 548mmol). Nakon 3 sata, LCMS analize ukazuju da je početni materijal u potpunosti utrošen i smeša se sipa u ledenu vodu (3L) a nakon toga ekstrahuje sa metil t-butil etrom. Ovo za rezultat ima formiranje emulzije i smeša se filtrira kroz Celite a organska faza se izdvoji. Vodeni sloj se nakon toga tretira sa čvrstim NaCl a nakon toga ponovo ekstrahuje sa metil t-butil etrom. Organski ekstrakti se kombinuju i isperu sa slanim rastvorom, suše preko magnezijum sulfata, filtriraju a nakon toga upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo braon guma (158.59g).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.65 min; MH<+>306

Međuproizvod 10: 8-Bromo-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

4

[0250] N-Bromosukcinimid (12.16g, 68.3mmol) se u porcijama u toku 5 minuta dodaje u promešani rastvor 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (14.9g, 48.8mmol) u hloroformu (80ml) na <5°C u atmosferi azota. Reaktivna smeša se meša 5 sati na <5°C, nakon toga ispere sa zasićenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (80ml) a nakon toga sa vodom (80ml). Pena se rastvori u DCM (50ml) i ispere sa vodom (50ml) a nakon toga sa slanim rastvorom (50ml). Kombinovane vodene faze se isperu sa DCM (50ml). Kombinovani organski slojevi se suše propuštanjem kroz hidrofobni frit i rastvarač ukloni pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao kao narandžasta pena (18.5g).

LCMS (Sistem D): tRET= 3.06min; MH<+>384/386

Međuproizvod 11: 2-{[(1S)-1-Metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0251]

[0252] 8-Bromo-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (7.1g, 18.48mmol) se rastvori u anhidrovanom metanolu (70ml) i u kapima se u atmosferi azota doda rastvor natrijum metoksid (25%) u metanolu (8ml). Rastvor se zagreva 4 sata pod refluksom na 90°C u atmosferi azota. Doda se nova količina natrijum metoksida u metanolu (25% rastvor, 3ml) i reakcija se meša još 16 sati na 60°C. Doda se još jedna porcija natrijum metoksida u metanolu (25% rastvor, 5ml) i reakcija se meša još 7 sati na 90°C. Rastvarač se ukloni na rotacionom evaporatoru i sirovi produkt se podeli između EtOAc (75ml) i zasićenog rastvora amonijum hlorida (75ml). Organski sloj se ispere sa slanim rastvorom (75ml). Rastvarač se ukloni na rotacionom evaporatoru da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo narandžasta pena (6g). LCMS (Sistem C): tRET= 1.14 min; MH<+>336, 337

Međuproizvod 12: 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifluoracetatna so

[0253]

[0254] 2-{[(1S)-1-Metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (6g, 17.89mmol) se rastvori u metanolu (50ml). U kapima se doda trifluorosirćetna kiselina (20.67ml, 268mmol) i smeša meša 72 sata na 20°C u atmosferi azota. Rastvarač se ukloni pod vakuumom i dobijena čvrsta supstanca ispere sa etil acetatom i filtrira. Filtrat se izdvoji i ostatak ispere sa etil acetatom. Kombinovani čvrsti ostaci se suše 2 sata u vakuumskoj pećnici da se dobije naslovljeno jedinjenje kao kao beličasta čvrsta supstanca (5.3g). LCMS (Sistem C): tRET= 0.76 min; MH<+>252, 253

Međuproizvod 13: 2-(Butiloksi)-9-(3-hlorpropil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0255]

[0256] 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifluoracetat (4.7g, 13.38mmol) i kalijum karbonat (4.62g, 33.4mmol) u bezvodnom DMF (50ml) se mešaju i zagrevaju 75 minuta na 50°C, u atmosferi azota. Smeša se ostavi na sobnu temperaturu da se hladi a nakon toga ohladi na 0°C i doda se 1-brom-3-hlorpropan (2.106g, 13.38mmol). Smeša se meša na 0 do 10°C približno 5 sati, nakon toga ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša još približno 40 sati kada LCMS pokaže da je dobijeno približno 70% traženog produkta. Smeša

1

se ostavi da miruje i supernatant izdvoji pipetom a rastvarač upari na rotacionom evaporatoru koristeći pumpu visokog vakuuma na približno 23°C. U kombinovani ostatak se dodaju hlorform i voda koji se mešaju i faze razdvoje koristeći hidrofobni frit. Vodeni sloj se ponovo ekstrahuje sa dodatnim porcijama hlorforma a kombinovani hloroform ekstrakti se upare pod visokim vakuumom na 23°C da se dobije žuta čvrsta supstanca (2.798g). Ovaj sirovi materijal se kombinuje sa sličnim materijalom dobijenim iz dve slične izrade (0.56g i 0.995g) i prečisti flash hromatografijom na koloni silika gela koristeći kao eluent 2:1 etil acetat/hlorform da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca. (3.011g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.79min; MH<+>314, 316

Međuproizvod 14: 2-(Butiloksi)-9-(4-hlorbutil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0257]

[0258] 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifluoracetat (2g, 5.69mmol) i kalijum karbonat (1.967g, 14.23mmol) se suspenduju u DMF (20ml) i zagrevaju 30 minuta na 50°C, u atmosferi azota. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, doda se 1-brom-4-hlorbutan (0.656ml, 5.69mmol) i mešanje nastavi 20 sati na sobnoj temperaturi. Rastvarač se upari pod sniženim pritiskom i ostatak se podeli između DCM (40ml) i vode (40ml). Slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit i vodeni sloj ispere sa DCM (10ml). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju pod vakuumom da se dobije sirovi materijal koji se prečisti hromatografijom na silika gelu koristeći Flash Master (70g nosač) i eluira 30 minuta sa gradijentom cikloheksan:etil acetat 0-100%. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (1.4g).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.92min; MH<+>= 328, 330

Međuproizvod 15: 2-(Butiloksi)-9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

2

[0260] 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifluoracetat (2g, 5.69mmol) i kalijum karbonat (1.967g, 14.23 mmol) se suspenduju u DMF (20ml) i zagrevaju 1 sat na 50°C, u atmosferi azota. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, doda se 1-brom-5-hlorpentan (0.75ml, 5.69mmol) i mešanje se nastavi 18 sati na sobnoj temperaturi. Reaktivna smeša se podeli između DCM (40ml) i vode (40ml) i slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit. Vodeni sloj se ponovo ekstrahuje sa DCM (10ml) i kombinovani organski slojevi se isperu sa zasićenim rastvorom litijum hlorida, razdvoje (hidrofobni frit) i koncentruju pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (1.946g). LCMS (Sistem B): tRET= 2.58min; MH<+>= 342, 344

Međuproizvod 16: 2-(Butiloksi)-9-(5-hlorheksil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0261]

[0262] U rastvor 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifuoroacetatne soli (3g, 8.54mmol) u DMF (30ml) se doda kalijum karbonat (2.95g, 21.35mmol) i smeša meša 1 sat na 60°C u atmosferi azota. Smeša se nakon toga ohladi na sobnu temperaturu, doda se 1-brom-6-hlorheksan (1.27ml, 8.54mmol) i reakcija zagreva na 50°C i meša u toku noći u atmosferi azota. Reaktivna smeša se razblaži sa vodom (ca.50ml) i ekstrahuje sa etil acetatom (2 x 70 ml). Kombinovani organski ekstrakti se suše (MgSO4), filtriraju i filtrat koncentruje da se dobije narandžasto ulje (ca.3.5g). Ovaj materijal se rastvori u dihlormetanu i prečisti na Flashmaster II (70g aminopropil nosač) koristeći gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu u toku 60 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje koje očvrsne kao bledo žuta čvrsta supstanca (1.2g). LCMS (Sistem D): tRET= 3.59min; MH<+>= 356, 358

Međuproizvod 17: N<2>-Butil-9-(3-hlorpropil)-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin

[0263]

[0264] N<2>-Butil-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin trifluoracetat (701 mg, 2.001 mmol) i kalijum karbonat (690 mg, 4.99 mmol) se suspenduju u DMF (10ml) i smeša zagreva 2 sata na 50°C u atmosferi azota. Smeša se ostavi da se hladi a nakon toga se doda 1-brom-3-hlorpropan (198µl, 2.002mmol) i reaktivna smeša meša na temperaturi sredine u toku noći. Nakon 16 sati, reaktivna smeša se podeli između vode i DCM (25ml od svakog). Vodena faza se ekstrahuje sa još DCM (2 x 20ml). Kombinovani DCM ekstrakti se suše preko magnezijum sulfata i koncentruju pod vakuumom da se dobije onečišćeno naslovljeno jedinjenje kao bledo žuto ulje sa malo prisutne čvrste supstance (0.76g) koja se koristi bez naknadnog prečišćavanja.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.75min; MH<+>= 313, 315

Međuproizvod 18: N<2>-Butil-9-(4-hlorbutil)-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin

[0265]

4

[0266] N<2>-Butil-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin trifluoracetat (5g, 14.27mmol) i kalijum karbonat (4.93g, 35.7mmol) se suspenduju u DMF (40ml) i zagrevaju 30 minuta na 50°C u atmosferi azota. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu, doda se 1-brom-4-hlorbutan (1.645ml, 14.27mmol) i mešanje se nastavi 20 sati na sobnoj temperaturi. Rastvarač se koncentruje pod vakuumom i ostatak podeli između DCM (100ml) i vode (100ml). Slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit i vodena faza ponovo ekstrahuje sa DCM (100ml).

Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju pod vakuumom i ostatak prečisti hromatografijom koristeći FlashMaster aparaturu (100g silicijum dioksid nosač) i koristeći gradijent DCM:metanol 0-25% u toku 40 minuta. Očekivane frakcije se kombinuju i koncentruju pod vakuumom da se dobije onečišćeno naslovljeno jedinjenje kao žuto ulje (5.1g).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.88min; MH<+>= 327, 329

Međuproizvod 19: 9-(5-hlorpentil)-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0267]

[0268] 2-{[(1S)-1-Metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifluoracetat (600mg, 1.642 mmol) i kalijum karbonat (567mg, 4.11mmol) se mešaju 1 sat na 60°C u DMF (10ml) u atmosferi azota. Reakcija se ohladi na sobnu temperaturu kada se dodaju 1-brom-5-hlorpentan (0.216ml, 1.642mmol) i trietilamin (0.343ml, 2.464mmol) i smeša meša 16 sati na 20°C u atmosferi azota. Smeša se nakon toga razblaži sa vodom (10ml) i slanim rastvorom (10ml) i ekstrahuje sa DCM (2 x 10ml). Kombinovani organski ekstrakti se upare i ostatak rastvori u DCM i prečisti hromatografijom na koloni koristeći Flashmaster II (70g aminopropil nosač) sa gradijentom 0-100% etil acetat u cikloheksanu u toku 40 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta guma (430mg). LCMS (Sistem D): tRET= 4.15min; MH<+>= 356, 358 Međuproizvod 20: 9-[3-(1-Azetidinil)propil]-2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0269]

[0270] 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetat (100mg, 0.285mmol) se rastvori u DMF (1ml) i doda se kalijum karbonat (98mg, 0.712mmol). Reaktivna smeša se meša 1 sat na 50°C u atmosferi azota a nakon toga ohladi na sobnu temperaturu. Doda se 1,3-dibrompropan (0.029ml, 0.285mmol) i nakon dodatnih 40 minuta mešanja dodaju se azetidin (0.038ml, 0.569mmol) i trietilamin (0.079ml, 0.569mmol) u DMF (1ml). Reaktivna smeša se nakon toga meša dodatnih 18 sati. Rastvarač se ukloni i ostatak se podeli između dihlormetana (2ml) i vode (2ml). Slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit i vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM (2ml). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju i ostatak se rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (1 ml) i prečisti pomoću MDAP (Postupak A).

Frakcije koje sadrže produkt se upare u struji azota da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (13mg). LCMS (Sistem B): tRET= 1.07min; MH<+>= 335

Međuproizvod 21: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[3-(1-pirolidinil)propil]-9H-purin-6-amin

[0271]

[0272] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 20 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1,3-dibrompropana i pirolidina.

LCMS (Sistem C): tRET= 0.60min; MH<+>= 349

Međuproizvod 22: 2-(Butiloksi)-9-[3-(heksahidro-1H-azepin-1-il)propil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0273]

[0274] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 20 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1,3-dibrompropana i heksahidro-1H-azepina. LCMS (Sistem B): tRET= 1.24min; MH<+>= 377

Međuproizvod 23: 9-[4-(1-Azetidinil)butil]-2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6 amin

[0275]

[0276] 2-(Butiloksi)-9-(4-hlorbutil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin (100mg, 0.305mmol), azetidin (0.021ml, 0.305mmol) i N,N-diizopropiletilamin (0.107ml, 0.610mmol) se rastvore u DMF (2ml) i zagrevaju 48 sati na 50°C. LCMS pokazuje da reakcija nije završena i dodaju se nove količine azetidina (0.021 ml, 0.305mmol) i N,N-diizopropiletilamina (0.107ml, 0.610mmol) i reaktivna smeša zagreva još 48 sati na 50°C. Smeša se nakon toga podeli između DCM (4ml) i vode (4ml) i slojevi razdvoje koristeći hidrofobni frit. Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM (4ml) i kombinovani organski ekstrakti se koncentruju a ostatak prečisti pomoću MDAP (Postupak A). Frakcije koje sadrže produkt se upare u struji azota da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bezbojna guma (7.6mg). LCMS (Sistem B): tRET= 1.15min; MH<+>= 349

Međuproizvod 24: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[4-(1-pirolidinil)butil]-9H-purin-6-amin so mravlje kiseline

[0277]

[0278] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 20 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1,4-dibrombutana i pirolidina ali sa masom usmerenom autoizradi koristeći Postupak D.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.19min; MH<+>= 363

Međuproizvod 25: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-6-amin so mravlje kiseline

[0279]

[0280] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 20 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1,4-dibrombutana i piperidina ali sa masom serijski usmerenom autoizradi koristeći Postupak A a nakon toga Postupak D. LCMS (Sistem B): tRET= 1.22min; MH<+>= 377

Međuproizvod 26: 2-(Butiloksi)-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-8-(metiloksi) 9H-purin-6-amin

[0281]

[0282] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 20 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1,4-dibrombutana i heksahidro-1H-azepina. LCMS (Sistem B): tRET= 1.30min; MH<+>= 391

Međuproizvod 27: 9-[5-(1-Azetidinil)pentil]-2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin [0283]

[0284] 2-(Butiloksi)-9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin (100mg, 0.293mmol), azetidin (0.020ml, 0.293mmol) i N,N-diizopropiletilamin (0.102ml, 0.585mmol) se rastvore u DMF (2ml) i zagrevaju 72 sata na 50°C. Rastvarač se ukloni pod vakuumom i ostatak podeli između DCM (5ml) i vode (5ml) a slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit. Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM (5ml) a kombinovani organski ekstrakti koncentruju i ostatak rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (1ml) i prečisti pomoću MDAP (Postupak A). Frakcije koje sadrže produkt se upare u struji azota da se dobije naslovljeno jedinjenje kao providna guma (6.8mg).

LCMS (Sistem B): tRET= 1.26min; MH<+>= 363

Međuproizvod 28: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[5-(1-pirolidinil)pentil]-9H-purin-6-amin

[0286] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 27 od 2-(butiloksi)-9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i pirolidina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.27min; MH<+>= 377

Međuproizvod 29: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amin

[0287]

[0288] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 27 od 2-(butiloksi)-9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.33min; MH<+>= 391

Međuproizvod 30: 2-(Butiloksi)-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0289]

[0290] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 27 od 2-(butiloksi)-9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i heksahidro-1H-azepina ali se serijski prečiste pomoću MDAPs koristeći Postupak A a nakon toga Postupak E. LCMS (Sistem B): tRET= 1.38min; MH<+>= 405

Međuproizvod 31: 2-(Butiloksi)-9-[5-(heksahidro-1(2H)-azocinil)pentil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0291]

[0292] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 38 od 2-(butiloksi)-9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i oktahidroazocina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.45min; MH<+>= 419

Međuproizvod 32: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[6-(1-pirolidinil)heksil]-9H-purin-6-amin

[0293]

1

[0294] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 38 od 2-(butiloksi)-9-(6-hlorheksil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i pirolidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.97min; MH<+>= 391

Međuproizvod 33: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[6-(1-piperidinil)heksil]-9H-purin-6-amin

[0295]

[0296] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 38 od 2-(butiloksi)-9-(6-hlorheksil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 3.12min; MH<+>= 405

Međuproizvod 34: 2-(Butiloksi)-9-[6-(heksahidro-1H-azepin-1-il)heksil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

2

[0298] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 38 od 2-(butiloksi)-9-(6-hlorheksil)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i heksahidro-1H-azepina.

LCMS (Sistem D): tRET= 3.20min; MH<+>= 419

Međuproizvod 35: N<2>-Butil-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-2,6-diamin

[0299]

[0300] N<2>-Butil-8-(metiloksi)-3H-purin-2,6-diamin trifluoracetat (192mg, 0.547mmol) i kalijum karbonat (189mg, 1.368mmol) se suspenduju u DMF (3ml) i zagrevaju 1 sat na 60°C. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu, doda se 1-brom-4-hlorbutan (0.063ml, 0.547mmol) i reakcija meša dodatnih 18 sati. Dodaju se piperidin (0.054ml, 0.547mmol) i trietilamin (0.076ml, 0.547mmol) i reaktivna smeša zagreva 72 sata na 60°C. Rastvarač se ukloni pod vakuumom i ostatak podeli između DCM (2ml) i vode (2ml). Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM (2ml) a kombinovani organski ekstrakti se koncentruju. Ostatak (ca.200mg) se rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (1ml) i prečisti pomoću MDAP (Postupak A). Frakcije koje sadrže produkt se upare pod vakuumom da se dobije onečišćeno naslovljeno jedinjenje kao žuta guma (106mg) koja se koristi bez naknadnog prečišćavanja.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.11 min; MH<+>= 376

Međuproizvod 36: N<2>-Butil-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin

[0301]

[0302] N<2>-Butil-8-(metiloksi)-3H-purin-2,6-diamin trifluoracetat (192mg, 0.547mmol) i kalijum karbonat (189mg, 1.368 mmol) se suspenduju u DMF (3ml) i zagrevaju 1 sat na 60°C. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu, doda se 1-brom-4-hlorbutan (0.063ml, 0.547mmol) i reakcija meša dodatnih 18 sati. Dodaju se heksahidro-1H-azepin (54.2mg, 0.547mmol) i trietilamin (0.076ml, 0.547mmol) i reaktivna smeša zagreva 18 sati na 60°C. Rastvarač se ukloni pod vakuumom a ostatak se podeli između DCM (5ml) i vode (5ml). Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa DCM (5ml) i kombinovani organski ekstrakti se koncentruju pod vakuumom. Ostatak se rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (2ml) i prečisti u 2 pujenja pomoću MDAP (Postupak B). Ovakao se dobija materijal (74mg) koji još uvek nije čist i koji se ponovo prečisti pomoću MDAP (Postupak A). Frakcije koje sadrže produkt se upare u struji azota da se dobije naslovljeno jedinjenje kao providna guma (13mg). LCMS (Sistem B): tRET= 1.12min; MH<+>= 390

Međuproizvod 37: 9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil-2-{[(1S)-1-metilbutiloksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0303]

4

[0304] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 36 od 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1-brom-4-hlorbutana i heksahidro-1H-azepina ali sa tri serije MDAPs koristeći Postupak B a nakon toga Postupak A (x2).

LCMS (Sistem B): tRET= 1.41min; MH<+>= 405

Međuproizvod 38: 2-{[(1S)-1-Metilbutil]oksil-8-(metiloksi)-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amin

[0305]

[0306] 9-(5-hlorpentil)-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin (80mg, 0.225mmol), trietilamin (0.031ml, 0.225mmol) i piperidin (0.045ml, 0.45mmol) se suspenduju u DMF (3ml) i smeša zagreva 18 sati na 70°C. Rastvarač se ukloni i ostatak podeli između DCM (4ml) i zasićenog rastvora natrijum bikarbonata (4ml). Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa još DCM i kombinovani organski ekstrakti se koncentruju i ostatak rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (1ml) i prečisti pomoću MDAP (Postupak A). Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i upare u struji azota da se dobije naslovljeno jedinjenje (47.2mg). LCMS (Sistem D): tRET= 3.11 min; MH<+>= 405

Međuproizvod 39: 2-Fluoro-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0308] N,O-bis(trimetilsilil)acetamid (975mL, 3.988mol) se doda u izmešanu suspenziju 2-fluor-1H-purin-6-amina (200g, 1.306mmol) (nabavljenu od, na primer, AlliedSignal, US) u anhidrovanom acetonitrilu (4L) u laboratorijski kontrolisanom reaktoru zapremine 10L i dobijena smeša zagreva pod refluksom i održava 2 sata na ovoj temperaturi. Cirkulator se nakon toga ponovo programira i reaktivna smeša ohladi na 0°C. Nakon toga se polako pomoću levka za ukapavanje doda rastvor tetrahidropiranil acetata (izrada opisana u Tetrahedron Letters 2006, 47(27), 4741) (282g, 1.959mol) u anhidrovanom acetontrilu (500ml) a nakon toga se u kapima pomoću levka za ukapavanje doda trimetilsilil trifluormetansulfonat (283mL, 1.567mol). Ne uočava se značajna egzotermija. Temperatura cirkulatora se ponovo podesi na 10°C i mešanje održava dodatnih 1 sat. Smeša se nakon toga neutrališe dodavanjem 1M rastvora natrijum karbonata (4L). Uočava se čvrsti precipitat iprovera pH pokazuje da je bazi. Doda se još vode u suspenzija (1L) i stajanjem se slojevi razdvoje pri čemu vodeni sloj sadrži značajnu količinu neorganskih čvrstih čestica. Izdvoji se najveći deo vodene i neorganske čvrste supstance. Organski sloj još uvek sadrži značajnu količinu čvrste supstance i ohladi se na 0°C uz mešanje da se potpomogne precipitacija. Čvrsta supstanca se sakupi filtriranjem i ploča se dobro ispere sa vodom a nakon toga suši pod vakuumom na 40°C u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje kao čvrsta supstanca krem boje (152.8g). LCMS (Sistem D): tRET= 1.71 min; MH<+>= 238

Međuproizvod 40: 2-{[(1S)-1-Metilpropil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0309]

[0310] Natrijum terc-butoksid (3.24g, 33.7mmol) se u porcijama, uz mešanje, doda u (2S)-2-butanol (10g, 135mmol). U dobijenu suspenziju se doda 2-fluoro-9-(tetrahidro-2H-piran-2il)-9H-purin-6-amin (2g, 8.43mmol) i smeša zagreva 6 sati na 50 °C kada LCMS pokazuje da je reakcija završena. Nakon hlađenja, smeša se razblaži sa etil acetatom (100ml) i ispere sa vodom (50ml) a vodeni sloj ekstrahuje sa etil acetatom (50ml). Kombinovani organski ekstrakti se isperu sa slanim rastvorom, suše koristeći hidrofobni frit i upare pod vakuumom (na 62°C da se ukloni višak alkohola). Ostatak (2.52g) se rastvori u dihlormetanu i prečisti na aminopropil kartridžu (110g) koristeći Flashmaster II aparaturu i eluira 60 minuta sa gradijentom 0-100% etil acetat u cikloheksanu. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (1.935g).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.41 min; MH<+>= 292

Međuproizvod 41: 8-Bromo-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0311]

[0312] N-Bromosukcinimid (1.182g, 6.64mmol) se na 0-5°C u porcijama doda u rastvor 2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (1.935g, 6.64mmol) u hloroformu (50ml). Dobijeni zeleni rastvor se meša 1 sat na 0-5°C za koje vreme postaje crven a smeša se nakon toga ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša u toku noći. Dobijeni zeleni rastvor se ispere sa vodom (2x20ml), razdvoji koristeći hidrofobni frit i koncentruje. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti pomoću hromatografijom na silika gelu (100g nosač) koristeći Flashmaster II aparaturu i gradijent 0-100% etil acetat-cikloheksan u toku 60 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta pena (1.79 g).

LCMS (Sistem B): tRET= 2.58min; MH<+>= 370/372

Međuproizvod 42: 8-(Metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran 2-il)-9H-purin-6-amin

[0314] 8-Bromo-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (1.79g, 4.83mmol) se rastvori u metanolu (15ml), doda se 25% natrijum metoksid u metanolu (3.2ml, 4.83mmol) i smeša zagreva 2.5 sata pod refluksom. Reaktivna smeša se ostavi na sobnoj temperaturi u toku noći a nakon toga koncentruje pod vakuumom i ostatak podeli između dihlormetana (40ml) i zasićenog rastvora amonijum hlorida (40ml). Slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit i vodena faza se ponovo ekstrahuje sa dihlormetanom (40ml). Kombinovani organski ekstrakti se koncentruju pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta pena (1.65g). LCMS (Sistem B): tRET= 2.11 min; MH<+>= 322

Međuproizvod 43: 8-(Metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksil-1H-purin-6-amin trifluoracetat

[0315]

[0316] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 12 od 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran2-il)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.19min; MH<+>= 238

Međuproizvod 44: 9-(4-hlorbutil)-8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9H-purin-6-amin

[0318] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 18 od 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-1H-purin-6-amin trifluoracetata i 1-brom-4-hlorbutana sa prečišćavanjem na aminopropil (NH2) kartridžu koristeći gradijent 0-100% etil acetat - cikloheksan.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.83min; MH<+>= 328/330

Međuproizvod 45: 2-{[(1S)-1-Metilpentil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0319]

[0320] Natrijum t-butoksid (4.86g, 50.6mmol) se u porcijama doda u izmešanu smešu (S)-2-heksanola (12g, 117mmol) i 1,2-dimetoksietana (12ml). Dobijena smeša se zagreje na 50°C u atmosferi azota a nakon toga se doda 2-fluor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (3g, 12.65mmol). Dobijena smeša se 20 sati održava na 50°C kada LCMS pokaže da je reakcija završena. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu i podeli između etil acetata (100ml) i vode (100ml). Organska faza se ispere sa vodom (100ml), nakon toga sa zasićenim slanim rastvorom (50ml), suši preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrira i upari. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti na aminopropil (NH2) kartridžu (100g) eluira sa gradijentom 0-100% etil acetat u cikloheksan u toku 40 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (1.665g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.88min; MH<+>= 320

Međuproizvod 46: 8-Bromo-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0322] N-Bromosukcinimid (1.504g, 8.45mmol) se u porcijama doda u izmešani rastvor 2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (2.453g, 7.68mmol) u hloroformu (40ml) u atmosferi azota ohlađenom u ledenom kupatilu. Nakon 3 sata, LCMS pokazuje da reakcija 80% završena i doda se još N-bromosukcinimida (0.68g) i mešanje nastavi dodatnih 2 sata. Doda se voda (40ml) i faze razdvoje koristeći hidrofobni frit. Organska faza se upari i ostatak rastvori u dihlormetanu i prečisti na aminopropil (NH2) kartridžu (100g) koristeći gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu a nakon toga gradijent 0-20% metanol (+1% trietilamin) u toku 60 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (2.38g). LCMS (Sistem D): tRET= 3.24min; MH<+>= 398/400

Međuproizvod 47: 8-(Metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran 2-il)-9H-purin-6-amin

[0323]

[0324] Rastvor natrijum metoksida u metanolu (0.5M, 20ml, 10mmol) se doda u rastvor 8-brom-2-{[(1S)1-metilpentil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (2.368g, 5.95mmol) u metanolu (10ml) i smeša zagreva 5 sati pod refluksom. Doda se još natrijum metoksida u metanolu (4ml, 2mmol) i smeša refluksuje dodatnih 2 sata a nakon toga ohladi i upari. Ostatak se podeli između etil acetata (100ml) i vode (100ml). Organska faza se izdvoji, ispere sa zasićenim slanim rastvorom, suši preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrira i upari. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti na aminopropil (NH2) kartridžu (100g) koristeći gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu u toku 40 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (1.725g). LCMS (Sistem D): tRET= 3.06min; MH<+>= 350

Međuproizvod 48: 8-(Metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-1H-purin-6-amin trifluoracetat

[0325]

[0326] Trifluorosirćetna kiselina (2.3ml, 3.40g, 29.9mmol) se doda u izmešani rastvor 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (1.479g, 4.23mmol) u metanolu (25ml). Dobijena smeša se meša 66 sati u atmosferi azota a nakon toga upari i suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (1.65g).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.14min; MH<+>= 266

Međuproizvod 49: 9-(4-hlorbutil)-8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-9H-purin-6-amin

[0327]

[0328] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-1H-purin-6-amin trifluoroacetata i 1-brom-4-hlorbutana. LCMS (Sistem D): tRET= 3.22min; MH<+>= 356/358

Međuproizvod 50: 2-[(1-Metiletil)oksi]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

1

[0330] Natrijum t-butoksid (1.30 g, 13.53 mmol) se u porcijama uz mešanje u toku 5 minuta doda u 2-propanol (16.95 ml, 220 mmol). Doda se 2-fluoro-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (2 g, 8.43 mmol) i reaktivna smeša zagreva i meša 4 sata na 50°C a nakon toga ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu. Reaktivna smeša se nakon toga razblaži sa etil acetatom (75 ml), ispere sa vodom (3x25 ml) a kombinovani vodeni slojevi ponovo ekstrahuju sa etil acetatom (2x25 ml). Kombinovani organski slojevi se suše propuštanjem kroz hidrofobni frit, filtriraju i upare da se dobije beličasta čvrsta supstanca (2.30g). Ovaj materijal se rastvori u dihlormetanu i prečisti koristeći aminopropil SPE nosač (70g) uz eluiranje sa gradijentom 0-100% etil acetat u cikloheksanu. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare da se dobije bela čvrsta supstanca (1.6g) koja se još prečisti hromatografijom na koloni koristeći reverzno fazni (C18) Flashmaster II sistem napunjensa smešom 1:1 MeOH/DMSO i eluira sa gradijentom 0-50% acetonitril (+ 0.1%TFA) u vodi (+ 0.1%TFA) u toku 40 minuta, frakcije se sakupe u bočicama koje sadrže ca.2 mL zasićenog vodenog rastvora natrijum bikarbonata. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i ekstrahuju sa dihlormetanom (3x100 mL). Kombinovani organski ekstrakti se suše propuštanjem kroz hidrofobni frit i upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (888 mg). LCMS (Sistem B): tRET= 1.76min; MH<+>= 278

Međuproizvod 51: 8-Bromo-2-[(1-metiletil)oksi]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0331]

[0332] N-Bromosukcinimid (604 mg, 3.39 mmol) se na 0-5°C u atmosferi azota doda u rastvor 2-[(1-metiletil)oksi]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (888 mg, 3.20

2

mmol) u hloroformu (30 ml). Smeša se meša 1 sat na 0-5°C za koje vreme dobija crvenkasto braon boju a nakon toga se zagreje na sobnu temperaturu i meša dodatnih 4 sata. LCMS pokazuje da reakcija nije završena i doda se još N-bromosukcinimida (114 mg, 0.641 mmol) i reaktivna smeša meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Reaktivna smeša se nakon toga razblaži sa hloroformom (30 ml), ispere sa vodom (2 x 20ml) i slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit a organski sloj se upari da se dobije crvena čvrsta supstanca (1.16 g). Ovaj materijal se rastvori u dihlormetanu i prečisti pomoću hromatografije na silika gelu na SPE kartridžu (50g) koristeći kao eluent gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu.

Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo žuta čvrsta supstanca 712mg.

LCMS (Sistem B): tRET= 2.36min; MH<+>= 356/358

Međuproizvod 52: 2-[(1-Metiletil)oksi]-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0333]

[0334] U izmešanu suspenziju 8-brom-2-[(1-metiletil)oksi]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (690 mg, 1.937 mmol) u metanolu (15 ml) se doda natrijum metoksid (30% m/v rastvor u metanolu, 2.4 ml) i reaktivna smeša zagreva 2 sata na 50°C. Reaktivna smeša se nakon toga zagreva i meša 2.5 sata na 70°C. Rastvarač se upari i ostatak podeli između zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (15 ml) i etil acetata (20 mL). Slojevi se razdvoje, vodena faza se ekstrahuje sa dodatnom količinom etil acetata (2x10 mL) i organski ekstrakti se kombinuju, suše propuštanjem kroz hidrofobni frit i upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (573 mg).

LCMS (Sistem B): tRET= 1.92min; MH<+>= 308

Međuproizvod 53: 2-[(1-Metiletil)oksi]-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetat

[0336] Trifluorosirćetna kiselina (1ml, 12.98mmol) se doda u izmešani rastvor 2-[(1-metiletil)oksi]-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (568mg, 1.848mmol) u metanolu (10ml) i smeša se meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Doda se još trifluorosirćetne kiseline (0.2ml) i reaktivna smeša meša na sobnoj temperaturi dodatnih 1.5 sat a nakon toga upari pod vakuumom. Čvrsti ostatak se triturira sa etil acetatom, sakupi filtriranjem, ispere sa etil acetatom i suši pod vakuumom u toku noći da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (405mg). LCMS (Sistem B): tRET= 1.02min; MH<+>= 224

Međuproizvod 54: 9-(5-hlorpentil)-2-[(1-metiletil)oksi]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0337]

[0338] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od 2-[(1-metiletil)oksi]-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata i 1-brom-5-hlorpentana.

LCMS (Sistem A): tRET= 0.93min; MH<+>= 328/330

Međuproizvod 55: 2-(Ciklobutiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0339]

4

[0340] Natrijum t-butoksid (3.31g, 34.2mmol) se u porcijama na sobnoj temperaturi doda u ciklobutanol (10ml). Smeša postaje veoma gusta i zagreje se na 50°C. Doda se 2-fluoro-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (2g, 8.43mmol) a nakon toga 1,2-dimetoksietan (3ml) i smeša meša 90 minuta na 50°C a nakon toga ohladi i podeli između etil acetata (50ml) i vode (50ml). Precipitat koji je ostao nerastvoran nakon obe faze se ukloni filtriranjem. Organska faza se izdvoji, ispere sa zasićenim slanim rastvorom, suši preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrira i upari da se dobije krem pena. Ovaj materijal se rastvori u dihlormetanu i prečisti na aminopropil (NH2) kartridžu (110g) koristeći gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu a nakon toga gradijent 0-20% metanol (+1% trietilamin) u toku 40 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (0.655g). LCMS (Sistem B): tRET= 1.98min; MH<+>= 290

Međuproizvod 56: 8-Bromo-2-(ciklobutiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0341]

[0342] N-Bromosukcinimid (1.152g, 6.47mmol) se na 0°C doda u izmešani rastvor 2-(ciklobutiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (1.248g, 4.31 mmol) u hloroformu (15ml). Smeša se zagreje na sobnu temperaturu i ostavi u toku noći kada se doda voda (15ml) i faze razdvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje sa dihlormetanom i organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog magnezijum sulfata i upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao narandžasta pena (1.79g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.72min; MH<+>= 368/370

Međuproizvod 57: 2-(Ciklobutiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0344] 8-Bromo-2-(ciklobutiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (1.79g, 4.86mmol) se rastvori u anhidrovanom metanolu (25ml) i u atmosferi azota se doda 25% natrijum metoksid u metanolu (2.274ml, 9.72mmol). Smeša se zagreva 24 sata na 67°C a nakon toga ohladi na sobnu temperaturu. Dodaju se etil acetat i voda i slojevi razdvoje. Vodeni sloj se ekstrahuje još dva puta sa etil acetatom i organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog magnezijum sulfata i upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao krem pena (1.27g).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.53min; MH<+>= 320

Međuproizvod 58: 2-(Ciklobutiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetat

[0345]

[0346] Trifluorosirćetna kiselina (3ml, 38.9mmol) se doda u rastvor 2-(ciklobutiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (1.27g, 3.98mmol) u metanolu (50ml) i smeša meša 21 sat na 20°C u atmosferi azota. Rastvarač se ukloni pod vakuumom a preostala čvrsta supstanca triturira sa 1,1-dimetiletil metil etrom a nakon toga sakupi filtriranjem i suši pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao krem čvrsta supstanca (1.0922g).

LCMS (Sistem D): tRET= 1.17min; MH<+>= 236

Međuproizvod 59: 9-(4-hlorbutil)-2-(ciklobutiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0348] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od 2-(ciklobutiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata i 1-brom-4-hlorbutana.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.76min; MH<+>= 326/328

Međuproizvod 60: 2-(Ciklopentiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin [0349]

[0350] Ciklopentanol (25ml, 275mmol) se doda u natrijum terc-butoksid (4.05g, 42.2mmol) da se dobije gusta suspenzija koja se razblaži sa 1,2-dimetoksietanom (35ml) i zagreje na 50°C. U dobijeni rastvor se doda 2-fluoro-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (2.5g, 10.54mmol) koji se nakon toga meša 20 sati u atmosferi azota na 50°C. Smeša se ohladi i dodaju se voda i etil acetat. Slojevi se razdvoje i vodeni sloj ponovo ispere sa etil acetatom. Organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog magnezijum sulfata i koncentruju pod sniženim pritiskom na 40°C. Ostatak se prenese u cikloheksan (50ml) na nosač 330g silicijum dioksida i eluira prvo sa gradijentom 0-100% etil acetat u cikloheksanu sa 10 zapremina kolone a nakon toga sa gradijentom 0-30% metanol u etil acetatu. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i upare da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (2.51g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.51min; MH<+>= 304

Međuproizvod 61: 8-Bromo-2-(ciklopentiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0352] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 56 od 2-(ciklopentiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina. LCMS (Sistem D): tRET= 2.88min; MH<+>= 382/384

Međuproizvod 62: 2-(Ciklopentiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0353]

[0354] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 57 od 8-brom-2-(ciklopentiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem C): tRET= 1.11min; MH<+>= 334

Međuproizvod 63: 2-(Ciklopentiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetat

[0355]

[0356] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 58 od 2-(ciklopentiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.27min; MH<+>= 250

Međuproizvod 64: 9-(4-hlorbutil)-2-(ciklopentiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0357]

[0358] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od 2-(ciklopentiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata i 1-brom-4-hlorbutana.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.90min; MH<+>= 340/342

Međuproizvod 65: 2-(Cikloheksiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0359]

[0360] Natrijum terc-butoksid (3.29g, 34.2mmol) se na sobnoj temperaturi u porcijama doda u cikloheksanol (15ml). Smeša postaje veoma gusta i doda se još cikloheksanola (10ml) a smeša zagreje na 50°C. Doda se 2-fluoro-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin (2g, 8.43mmol) i smeša zagreva 1 sat na 50°C a nakon toga zagreje na 60°C i zagreva narednih 2 sata na toj temperaturi kada LCMS pokazuje da je reakcija završena. Smeša se ohladi na sobnu temperaturu i podeli između etil acetata (150ml) i vode (150ml). Organska faza se izdvoji, ispere sa zasićenim slanim rastvorom, suši preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrira i upari u vodenom kupatilu na 60°C. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti na 70g aminopropil (NH2) kartridžu koristeći gradijentu 0-100% etil acetat u cikloheksanu a nakon toga gradijent 0-20% metanol (+1% trietilamin) u toku 30 minuta. Neke frakcije koje sadrže produkt su kontaminirane sa cikloheksanolom i one se ponovo prečiste na 70g silicijum dioksid kartridžu koristeći gradijent 0-100% etil acetat-cikloheksan u toku 40 minuta. Frakcije koje sadrže produkt iz dva prečišćavanja se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bledo žuta pena (1.59g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.65min; MH<+>= 318

Međuproizvod 66: 8-Bromo-2-(cikloheksiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0361]

[0362] N-Bromosukcinimid (0.214g, 1.2mmol) se na 0°C doda u izmešani rastvor 2-(cikloheksiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (0.254g, 0.80mmol) u hloroformu (5ml). Dobijena smeša se meša 1.5 sat na 0°C a nakon toga zagreje na sobnu temperaturu i meša dodatnih 2 sata. Doda se voda (5ml) i faze razdvoje koristeći hidrofobni frit. Organska faza se upari i ostatak rastvori u dihlormetanu i prečisti na 70g aminopropil (NH2) kartridžu, eluira sa gradijentom 0-100% etil acetat u cikloheksanu u toku 40 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (0.252g).

LCMS (Sistem B): tRET= 2.83min; MH<+>= 396/398

Međuproizvod 67: 2-(Cikloheksiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amin

[0363]

[0364] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 57 od 8-brom-2-(cikloheksiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.86min; MH<+>= 348

Međuproizvod 68: 2-(Cikloheksiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetat

[0365]

[0366] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 58 od 2-(cikloheksiloksi)-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.43min; MH<+>= 264

Međuproizvod 69: 9-(4-hlorbutil)-2-(cikloheksiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0367]

[0368] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od 2-(cikloheksiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata i 1-brom-4-hlorbutana.

LCMS (Sistem D): tRET= 3.05min; MH<+>= 354/356

Međuproizvod 70: N<2>-[(1R)-1-Metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamin

[0369]

1

[0370] Sirovi uzorak (2R)-2-pentanamina koji sadrži dihlormetan (11.12g sadrži ca.3.1g, 35.6mmol amina) se doda u suspenziju 2-fluor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina (5.00g, 21.08mmol) u etilen glikolu (50ml). Smeša se zagreva 20 sati na 110°C a nakon toga ohladi na sobnu temperaturu i podeli između vode (200ml) i etil acetata (200ml). Organska faza se izdvoji, ispere sa zasićenim slanim rastvorom, suši preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrira i upari. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti na 110g aminopropil (NH2) kartridžu koristeći gradijent 0-100% etil acetat - cikloheksan u toku 40 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom i ostatak triturira sa dietil etrom a nešto nerastvornog početnog materijala se ukloni filtriranjem. Isparavanjem etarskog filtrata dobija se naslovljeno jedinjenje kao beličasta pena (2.34g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.63min; MH<+>= 305

Međuproizvod 71: 8-Bromo-N<2>-[(1R)-1-metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamin

[0371]

[0372] N-Bromosukcinimid (2.08g, 11.69mmol) se u porcijama na 0°C, u atmosferi azota, doda u izmešani rastvor N<2->[(1R)-1-metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamina (2.27g, 7.46mmol) u hloroformu (30ml). Reaktivna smeša se ostavi da se meša 1.5 sat kada se dodaju hlorform (20ml) i voda (50ml). Nakon mešanja, slojevi se razdvoje koristeći hidrofobni frit, vodeni sloj se ispere sa dodatnom količinom hlorforma i kombinovani organski ekstrakti se upare. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti na 110g aminopropil (NH2) kartridžu koristeći gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu u toku 40 minuta. Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta pena (0.846g). LCMS (Sistem D): tRET= 3.05min; MH<+>= 383/385

Međuproizvod 72: N<2->[(1R)-1-Metilbutil]-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamin

2

[0374] Rastvor natrijum metoksida u metanolu (0.5M, 9ml, 4.5mmol) se doda u rastvor 8-brom-N<2>-[(1R)1-metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamina (0.844g, 2.20mmol) u metanolu (12ml) i dobijeni rastvor zagreva 23.5 sati pod refluksom. Nakon toga se doda još natrijum metoksida u metanolu (0.5M, 4.5ml) i refluks nastavi još 4 sata. Ponovo se doda još natrijum metoksida u metanolu (0.5M, 4.5ml) i refluks nastavi dodatnih 16.5 sati kada LCMS pokazuje da reakcija završena. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu, upari i ostatak podeli između etil acetata (75ml) i vode (75ml). Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa etil acetatom (75ml) a kombinovane organske faze se isperu sa zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtriraju i upare. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti na 100g aminopropil (NH2) kartridžu koristeći gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu a nakon toga gradijent 0-20% metanol (+1% trietilamin) u toku 15 minuta. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (0.614g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.83min; MH<+>= 335

Međuproizvod 73: N<2>-[(1R)-1-Metilbutil]-8-(metiloksi)-3H-purin-2,6-diamin trifluoracetat

[0375]

[0376] Trifluorosirćetna kiselina (1ml, 1.48g, 7.08mmol) se doda u izmešani rastvor N<2>-[(1R)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamina (0.613g, 1.833mmol) u metanolu (10ml). Dobijena smeša se meša 66 sati u atmosferi azota a nakon toga upari da se dobije naslovljeno jedinjenje kao beličasta čvrsta supstanca (0.690g).

LCMS (Sistem D): tRET= 1.89min; MH<+>= 251

Međuproizvod 74: 9-(4-hlorbutil)-N<2>-[(1R)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin

[0377]

[0378] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od N<2>-[(1R)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-3H-purin-2,6-diamin trifluoracetata i 1-brom-4-hlorbutana. LCMS (Sistem D): tRET= 3.02min; MH<+>= 341/343

Međuproizvod 75: N<2>-[(1S)-1-Metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamin

[0379]

[0380] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 70 od 2-fluor-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-6-amina i (2S)2-pentanamina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.63min; MH<+>= 305

Međuproizvod 76: 8-Bromo-N<2>-[(1S)-1-metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamin

[0381]

4

[0382] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 71 od N<2>-[(1S)-1-metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamina.

LCMS (Sistem D): tRET= 3.05min; MH<+>= 383/385

Međuproizvod 77: N<2>-[(1S)-1-Metilbutil]-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamin

[0383]

[0384] Rastvor natrijum metoksida u metanolu (0.5M, 13ml, 6.5mmol) se doda u rastvor 8-brom-N<2>-[(1S)1-metilbutil]-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamina (1.26g, 3.29mmol) u metanolu (10ml) i dobijeni rastvor zagreva 4 sata pod refluksom. Nakon toga se doda još natrijum metoksida u metanolu (0.5M, 12ml, 6mmol) i refluks nastavi dodatnih 18 sati. Smeša se ohladi i upari a ostatak podeli između etil acetata (75ml) i vode (75ml).

Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa etil acetatom (75ml) a kombinovane organske faze se isperu sa zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog magnezijum sulfata i upare. Ostatak se rastvori u dihlormetanu i prečisti na 100g aminopropil (NH2) kartridžu koristeći gradijent 0-100% etil acetat u cikloheksanu a nakon toga gradijent 0-20% metanol (+1% trietilamin) u toku 15 minuta. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i upare pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela pena (0.848g). LCMS (Sistem D): tRET= 2.83min; MH<+>= 335

Međuproizvod 78: N<2>-[(1S)-1-Metilbutil]-8-(metiloksi)-3H-purin-2,6-diamin trifluoracetat

[0385]

[0386] Izrađuje se slično kao Me metilbutil]-8-(metiloksi)-9-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-9H-purin-2,6-diamina.

LCMS (Sistem D): tRET= 1.89min; MH<+>= 251

Međuproizvod 79: 9-(4-hlorbutil)-N<2>-[(1S)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamin

[0387]

[0388] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od N<2>-[(1S)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-3H-purin-2,6-diamin trifluoracetata i 1-brom-4-hlorbutana. LCMS (Sistem D): tRET= 3.02min; MH<+>= 341/343

Međuproizvod 80: 9-(3-hlorpropil)-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin

[0389]

[0390] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 44 od 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin trifluoracetata i 1-brom-3-hlorpropana.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.90min; MH<+>= 328/330

Međuproizvod 81: 9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil}oksi}-9H-purin-6-amin

[0391]

[0392] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 14 od 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-1H-purin-6-amin trifluoracetata i 1-brom-5-hlorpentana. LCMS (Sistem A): tRET= 1.00min; MH<+>= 342/344

Međuproizvod 82: 8-(Metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amin

[0393]

[0394] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 38 od 9-(5-hlorpentil)-8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9H-purin-6-amina i piperidina ali sa prečišćavanjem na silika gelu koristeći gradijent 0-25% metanola u dihlormetanu. LCMS (Sistem A): tRET= 0.61 min; MH<+>= 391

Međuproizvod 83: 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[3-(1-piperidinil)propil]-9H-purin-6-amin, so mravlje kiseline

[0396] Izrađuje se slično kao Međuproizvod 20 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1,3-dibrompropana i piperidina ali se serijski prečiste pomoću MDAP koristeći Postupak A a nakon toga Postupak D. LCMS (Sistem B): tRET= 1.16min; MH<+>= 363

Referentni Primer 1: 6-Amino-9-[3-(1-azetidinil)propil]-2-(butiloksi)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0397]

[0398] 9-[3-(1-Azetidinil)propil]-2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amin (13mg, 0.039mmol) se rastvori u metanolu (3ml) i doda se 4M rastvor vodonik hlorida u 1,4-dioksanu (0.243ml, 0.972mmol) i smeša meša 18 sati na sobnoj temperaturi. Rastvarač se ukloni pod vakuumom i ostatak se rastvori u metanolu i prenese na aminopropil SPE nosač (2g). Nosač se eluira sa metanolom i rastvarač ukloni da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (13mg). LCMS (Sistem B): tRET= 1.12min; MH<+>= 321

Referentni Primer 2: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[3-(1-pirolidinil)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0399]

[0400] 2-(Butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[3-(1-pirolidinil)propil]-9H-purin-6-amin (49mg, 0.141mmol) se rastvori u metanolu (5ml) i doda se 4M rastvor vodonik hlorida u 1,4-dioksanu (0.879ml, 3.52mmol) i smeša meša 5 sati na sobnoj temperaturi. Rastvarač se ukloni pod vakuumom da se dobije krem čvrsta supstanca koja se rastvori u metanolu i prenese na aminopropil SPE nosač (2g) i eluira sa metanolom. Rastvarač se upari da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (43mg).

LCMS (Sistem C): tRET= 0.70min; MH<+>= 335

Referentni Primer 3: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[3-(heksahidro-1H-azepin-1-il)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0401]

[0402] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-9-[3-(heksahidro-1H-azepin-1-il)propil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.33min; MH<+>= 363

Referentni Primer 4: 6-Amino-9-[4-(1-azetidinil)butil]-2-(butiloksi)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0403]

[0404] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 9-[4-(1-azetidinil)butil]-2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.16min; MH<+>= 335

Referentni Primer 5: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[4-(1-pirolidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0405]

[0406] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od soli mravlje kiseline 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[4-(1-pirolidinil)butil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.23min; MH<+>= 349

Referentni Primer 6: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0407]

[0408] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od soli mravlje kiseline 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.29min; MH<+>= 363

Referentni Primer 7: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0409]

[0410] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.37min; MH<+>= 377

Referentni Primer 8: 6-Amino-9-[5-(1-azetidinil)pentil]-2-(butiloksi)-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0411]

[0412] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 9-[5-(1-azetidinil)pentil]-2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.25min; MH<+>= 349

1

Referentni Primer 9: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[5-(1-pirolidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0413]

[0414] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[5-(1-pirolidinil)pentil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.28min; MH<+>= 363

Referentni Primer 10: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0415]

[0416] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.35min; MH<+>= 377

Referentni Primer 11: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

2

Postupak A

[0418] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 2 od 2-(butiloksi)-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.55min; MH<+>= 391

Postupak B

[0419] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 19 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1-brom-5-hlorpentana i heksahidro-1H-azepina. LCMS (Sistem B): tRET= 1.54min; MH<+>= 391

Referentni Primer 12: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[5-(heksahidro-1(2H)-azocinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0420]

[0421] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-9-[5-(heksahidro-1(2H)-azocinil)pentil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem D): tRET= 3.17min; MH<+>= 405

Referentni Primer 13: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[6-(1-pirolidinil)heksil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0422]

[0423] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[6-(1-pirolidinil)heksil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.47min; MH<+>= 377

Referentni Primer 14: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[6-(1-piperidinil)heksil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0424]

4

[0425] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[6-(1-piperidinil)heksil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.68min; MH<+>= 391

Referentni Primer 15: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[6-(heksahidro-1H-azepin-1-il)heksil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0426]

[0427] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-9-[6-(heksahidro-1H-azepin-1-il)heksil]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.76min; MH<+>= 405

Referentni Primer 16: 6-Amino-2-(butilamino)-9-[3-(1-piperidinil)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0428]

[0429] Smeša N<2>-butil-9-(3-hlorpropil)-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamina (250mg, 0.8mmole), piperidina (340mg, 4 mmola) i natrijum jodida (360mg, 2,4mmole) u THF (8ml) se zagreva 48 sati pod refluksom. Rastvarač se upari i ostatak prečisti pomoću preparative TLC nakon toga rastvori u metanolu (5ml). Doda se vodonik hlorid u metanolu (0.5ml) i smeša meša 16 sati na sobnoj temperaturi. Rastvarač se nakon toga upari i pH ostatka se podesi na 7-8 dodavanjem rastvora natrijum bikarbonata. Produkt se ekstrahuje u etil acetatu i ekstrakt se upari a ostatak prečisti preparativnom HPLC da se dobije naslovljeno jedinjenje (16mg).

LCMS (Sistem A): tRET= 0.55min; MH<+>= 348

Referentni Primer 17: 6-Amino-2-(butilamino)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0430]

[0431] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od N<2>-butil-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-2,6-diamina.

LCMS (Sistem B): tRET= 0.96min; MH<+>= 362

Referentni Primer 18: 6-Amino-2-(butilamino)-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0432]

[0433] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od N<2>-butil-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.12min; MH<+>= 376

Referentni Primer 19: 6-Amino-2-(butilamino)-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0434]

[0435] N<2>-Butil-8-(metiloksi)-3H-purin-2,6-diamin trifluoracetat (192mg, 0.547mmol) i kalijum karbonat (189mg, 1.368mmol) se suspenduju u DMF (3ml) i zagrevaju 1 sat na 60°C. Reaktivna smeša se ohladi na sobnu temperaturu i doda se 1-brom-5-hlorpentan (0.072ml, 0.547mmol) i reakcija meša dodatnih 18 sati. Dodaju se heksahidro-1H-azepin (54.2mg, 0.547mmol) i trietilamin (0.076ml, 0.547mmol) i reaktivna smeša zagreva 24 sata na 70°C. LCMS pokazuje da je glavni pik sa MH<+>404 konzistentan sa formiranjem N<2>-butil-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamina. Rastvarač se ukloni pod vakuumom i ostatak podeli između DCM (2ml) i vode (2ml). Vodeni sloj se ponovo ekstrahuje sa DCM (2ml) i kombinovani organski ekstrakti se koncentruju i ostatak se rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (2ml) i prečisti pomoću MDAP (Postupak C).

Isparavanjem frakcija koje sadrže produkt dobija se rezidualna TFA so za koju LCMS pokazuje da aje podvrgnuta hidrolizi 8-metoksi grupe, verovatno pri koncentraciji u prisustvu TFA. Ovaj

sirovi materijal se još jedanput rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (2ml) i ponovo prečisti pomoću MDAP (Postupak A). Frakcije koje sadrže produkt se upare u struji azota da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (39mg). LCMS (Sistem B): tRET= 1.18min; MH<+>= 390

Primer 1: 6-Amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0436]

[0437] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 19 od 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1-brom-4-hlorbutana i piperidina. LCMS (Sistem B): tRET= 1.38min; MH<+>= 377

Primer 2: 6-Amino-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0438]

[0439] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.48min; MH<+>= 391

Primer 3: 6-Amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0440]

[0441] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-{[(1S)-1-Metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amina kako sledi:

Rastvor vodonik hlorida u dioksanu (4M, 0.71ml) se doda u rastvor 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amina (0.046g, 0.126mmol) u metanolu (3ml). Dobijena smeša se ostavi u toku noći na sobnoj temperaturi a nakon toga izdvoji u atmosferi azota. Ostatak se rastvori u metanolu i prenese na 2g aminopropil SPE nosač (pripremljen sa metanolom), uz eluiranje sa metanolom i dobijeni rastvor se upari u atmosferi azota da se dobije naslovljeno jedinjenje kao žuta čvrsta supstanca (40.97mg). LCMS (Sistem D): tRET= 2.70min; MH<+>= 391

[0442] Slično izrađen primere (1.7g) se rekristališe iz etil acetata (ca 50ml). Kristali se sakupe, isperu sa ledeno hladnim etil acetatom (15ml) i suše 3 sata pod vakuumom na 50°C da se dobije naslovljeno jedinjenje kao krem kristalna čvrsta supstanca (1.33g).

Tačka topljenja na početku (DSC): 207.4°C (videti Sliku 2)

XRPD: (videti Sliku 1 i Tabelu 1)

Primer 4: 6-Amino-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0443]

[0444] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 19 od 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-1H-purin-6-amin trifluoracetata, 1-brom-5-hlorpentana i heksahidro-1H-azepina. LCMS (Sistem B): tRET= 1.54min; MH<+>= 405

Referentni Primer 20: 6-Amino-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0445]

[0446] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(4-hlorbutil)-8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.27min; MH<+>= 363

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-6-amina je takođe izolovan.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.56min; MH<+>= 377

Referentni Primer 21: 6-Amino-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

1

[0448] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(4-hlorbutil)-8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.72min; MH<+>= 391

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpentil]oksi}-9-[4-(1-piperidinil)butil]9H-purin-6-amina je takođe izolovan.

LCMS (Sistem D): tRET= 3.01 min; MH<+>= 405

Referentni Primer 22: 6-Amino-2-[(1-metiletil)oksi]-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0449]

[0450] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(5-hlorpentil)-2-[(1-metiletil)oksi]-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.18min; MH<+>= 363

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata 2-[(1-metiletil)oksi]-8-(metiloksi)-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amina je takođe izolovan.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.43min; MH<+>= 377

1 1

Referentni Primer 23: 6-Amino-2-(ciklobutiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9 dihidro-8H-purin-8-on

[0451]

[0452] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(4-hlorbutil)-2-(ciklobutiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.24min; MH<+>= 361

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata 2-(ciklobutiloksi)-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-6-amina je takođe izolovan.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.49min; MH<+>= 375

Referentni Primer 24: 6-Amino-2-(ciklopentiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0453]

[0454] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(4-hlorbutil)-2-(ciklopentiloksi)-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.38min; MH<+>= 375

1 2

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata 2-(ciklopentiloksi)-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-6-amin je takođe izolovan.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.64min; MH<+>= 389

Referentni Primer 25: 6-Amino-2-(cikloheksiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0455]

[0456] Natrijum jodid (0.006g, 0.04mmol) se doda u izmešanu smešu 9-(4-hlorbutil)-2-(cikloheksiloksi)8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina (0.103g, 0.303mmol), N,N-diizopropiletilamina (0.105ml, 0.079g, 0.609mmol) i piperidina (0.120ml, 0.103g, 1.215mmol) u DMF (1.5ml). Dobijena smeša se zagreva 20 sati na 80°C kada

LCMS pokazuje formiranje dva produkta, jedan koji odgovara razmeštaju hlorida u piperidinu i drugi koji odgovara istovremenoj hidrolizi 8-metoksi radikala. Reaktivna smeša se podeli između dihlormetana (6ml) i vode (6ml) i faze razdvoje koristeći hidrofobni frit. Rastvarač se ukloni iz organske faze u struji azota u jedinici za izdvajanje a ostatak se rastvori u smeši 1:1 MeOH:DMSO (2ml) i razdvoji autopreparacijom na bazi mase (Postupak A) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (16.6mg).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.53min; MH<+>= 389

Međuproizvod 2-(cikloheksiloksi)-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-6-amin se takođe izdvoji kao bezbojna čvrsta supstanca (55.2mg).

LCMS (Sistem D): tRET= 2.80min; MH<+>= 403

Referentni Primer 26: 6-Amino-2-{[(1R)-1-metilbutil]amino}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

1

[0458] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(4-hlorbutil)-N<2>-[(1R)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamina i piperidina. LCMS (Sistem D): tRET= 2.47min; MH<+>= 376.

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata N<2>-[(1R)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]9H-purin-2,6-diamina je takođe izolovan.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.76min; MH<+>= 390

Referentni Primer 27: 6-Amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]amino}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0459]

[0460] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(4-hlorbutil)-N<2>-[(1S)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-9H-purin-2,6-diamina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.47min; MH<+>= 376

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata N<2>-[(1S)-1-metilbutil]-8-(metiloksi)-9-[4-(1-piperidinil)butil]-9H-purin-2,6-diamina je takođe izolovan.

1 4

LCMS (Sistem D): tRET= 2.76min; MH<+>= 390

Primer 5: 6-Amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[3-(1-piperidinil)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0461]

[0462] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 25 od 9-(3-hlorpropil)-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9H-purin-6-amina i piperidina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.52min; MH<+>= 363

Uzorak međuproizvoda 8-metoksi derivata 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-8-(metiloksi)-9-[3-(1-piperidinil)propil]9H-purin-6-amina je takođe izolovan.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.87min; MH<+>= 377

Referentni Primer 28: 6-Amino-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0463]

[0464] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 8-(metiloksi)-2-{[(1S)-1-metilpropil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem D): tRET= 2.39min; MH<+>= 377

1

Referentni Primer 29: 6-Amino-2-(butiloksi)-9-[3-(1-piperidinil)propil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on

[0465]

[0466] Izrađuje se slično kao Referentni Primer 1 od 2-(butiloksi)-8-(metiloksi)-9-[3-(1-piperidinil)propil]-9H-purin-6-amina.

LCMS (Sistem B): tRET= 1.23min; MH<+>= 349

Polimorfizam

[0467] Difrakcija X-zraka praškastog uzorka (XRPD) i diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) su izvršene sa 6-amino 2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-onom u skladu sa sledećim postupcima.

XRPD

[0468] XRPD su dobijene na PANalytical X’Pert Pro difraktometru praška, opremljenim sa X’Celerator detektorom. Uslovi izvođenja su: radijacija Cu Kα, generator pritiska: 40 kV, strujni generator: 45 mA, početni ugao: 2.0° 2θ, završni ugao: 40.0° 2θ, veličina razmaka: 0.0167° 2θ. Vreme po razmaku je 31.750s. Uzorak je pripremljen stavljanjem nekoliko miligrama uzorka na Si tanku ploču (nulta pozadina), što za rezultat ima tanak sloj praška.

[0469] Pozicije karakterističnog pika i izračunate d-vrednosti su sumirani u Tabeli 1.

Rezultati su izračunati iz originalnih vrednosti korišćenjem Highscore softvera.

Eksperimentalna greška u pozicijama pika je približno 60.1° 2θ. Relativni intenziteti pika će da variraju zbog preferirane orijentacije.

Tabela 1

1

[0470] Reprezentativni XRPD difraktogram 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-ona je pokazan na Slici 1.

DSC

[0471] DSC termogram je dobijen pomoću TA Instruments kalorimetra. Uzorci su odmereni u aluminijumskoj posudi, poklopac posude se stavi na vrh i blago uvije berz hermetičkog zatvaranja posude. Eksperiment se izvodi pri brzini zagrevanja od 10°C min<-1>.

[0472] Reprezentativni DSC termogram za 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[5-(1-piperidinil)pentil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on je pokazan na Slici 2.

Biološke vrednosti

[0473] Jedinjenja iz otkrića su testirana na in vitro biološku aktivnost u skladu sa narednim ispitivanjima ili sličnim ispitivanjima:

1

Analiza indukcije Interferona-α koristeći kriokonzervisane humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCe)

Priprema jedinjenja

[0474] Jedinjenja se rstvore u DMSO. Izrade se dvostruka razblaženja sa DMSO i po 0.25µl se prense u providne Greiner polipropilenske ploče sa 384 otvora.

Priprema PBMCa

[0475] Uzorci krvi do 200ml su dobijeni od zdravih humanih donora. Ukupna krv u zapremini od 25ml se nanese na 15ml Ficoll gradijente u Leucosep epruvetama i centrifugira 20 minuta na 1000 obrtaja. Ćelije grupisane na mestu spajanja plazma/histopak se pažljivo uklone i dva puta isperu sa PBS (centrifugiraju 5 minuta na 400 obrtaja da se prikupe).

Finalna peleta se resuspenduje u medijumu za zamrzavanje (90% serum inaktiviran toplotom, 10% DMSO) u koncentraciji ćelija od 4x107 ćelija/ml. Resuspendovane ćelije se nakon toga kriokonzerviraju (zamrznu) koristeći zamrzivač sa kontrolisanom brzinom i čuvaju do 4 meseca na -140°C.

Inkubacija i analiza za Interferon-α

[0476] Neposredno pre analize, bočice kriokonzervisanih (zamrznutih) PBMCa se brzo otope na 37°C u vodenom kupatilu. Izradi se 1:10 razblaženje ćelija u tripan plavom i ćelije broje. PBMCe se nakon toga razblaže u medijumu za rast [RPMI 1640 koji sadrži 10% seruma fetusa govečeta (Invitrogen), Penicillin+Streptavidin (Gibco cat. # 25030-024, 1:50), L-Glutamin 2mM i 1000 jedinica/ml rekombinantnog humanog IFN-gama (Preprotech katalog #300-02)] do gustine od 1x106 ćelija/ml i 50ul/otvor se prenese u Greiner polipropilen ploče sa 384 otvora u kojima se nalazi 0.25µl DMSO ili test jedinjenje u 0.25µl DMSO. Konačna finalna koncentracija jedinjenja je obično 50uM ili 5uM (da se dobije kriva za visoko aktivna jedinjenja). Ploče se inkubiraju 24h na 37°C 5% CO2.

[0477] Multi-izoform imunoanaliza se koristi za kvantifikaciju IFN-α u PBMC supernatantima. Poliklonalno antitelo zeca nasuprot humanom IFN-α (kataloški broj 31101, Stratech Scientific) se razblaži u odnosu 1:10000 u puferu za analizu (RPMI 1640 koji sadrži 10% seruma fetusa govečeta, Invitrogen) i 20 µl se doda u svaki otvor u MSD (Meso-Scale Discovery) pojedinačno pozicionirane GAR ploče (obložene kozijim anti-zečijim antitelom)

1

sa 384 otvora. Ploča se inkubira 1h na sobnoj temperaturi uz intenzivno mućkanje. Nakon tri ispiranje sa PBS, 20 µl isupernatanta ćelija se doda u svaki otvor ploče. Ploča se nakon toga inkubira 1h na sobnoj temperaturi uz intenzivno mućkanje. Par monoklonalnih antitela za IFNα (Kataloški brojevi 21100 i 21112, Stratech Scientific) se obeleži sa sulfo-TAG (MSD), razblaži u odnosu 1:1000 u puferu za analizu i po 20 µl se doda u svaki otvor ploče. Ploča se ponovo inkubira 1h na sobnoj temperaturi uz intenzivno mućkanje. Nakon tri ispiranja sa PBS, u svaki otvor se doda po 30 µl x2 T pufera (MSD) i ploča se očitava na MSD Sector 6000 čitaču ploča.

[0478] Vrednosti su usklađene sa unutrašnjim kontrolama ploče sa 1uM rezikvimoda (n=16) i DMSO (n=16). pEC50 vrednosti su dobijene sa krive od 4 prametra dobijene sa IRLS u ActivityBase, od 11-tačaka, dvostrukog serijskog razblaženja test jedinjenja.

Rezultati

[0479] Referentni Primeri 1 do 30 i Primeri 1 do 4 imaju srednju pEC50>5.5.

Ispitivanje indukcije Interferon-α i TNF-α koristeći sveže mononuklearne ćelije humane periferne krvi (PBMCe)

Izrada jedinjenja

[0480] Jedinjenja se rastvore i serijski razblaže u DMSO da se dobije opseg tražene koncentracije od 100x koristeći Biomek 2000.1ul test jedinjenja se prenese u ploče za kulturu tkiva sa 96 otvora koristeći Biomek FX. Svako jedinjenje se ispituje u duplikatu za svakog donora. Svaka ploča sadrži serije razblaženja od TLR7/8 agonista rezikvimoda kao standard a Kolona 11 sadrži 1 µl od 200µM rezikvimoda (dobija se finalna koncentracija od 2µM i koristi za definisanje približnog maksimalnog odgovora na rezikvimod).

Priprema PBMCa

[0481] Uzorci krvi od dva humana donora se sakupe u natrijum heparinu (10U/ml).

Zapremine od 25ml ukupne krvi se nanesu na Histopaque u Leucosep epruvetama zapremine 15ml koje se centrifugiraju 20 minuta na 800 obrtaja a ćelije grupisane na mestu spajanja plazma/histopak se pažljivo uklone. Sakupljene ćelije se centrifugiraju 10 minuta na 2500 obrtaja i peleta resuspenduje u 10ml medijuma (RPMI 1640 (nizak sadržaj endotoksina)

1

obogaćenim sa 10% v/v serumom fetusa govečeta (FCS, nizak sadržaj endotoksina) 100U/ml penicilina G, 100µg/ml streptomicina, 10mM L-glutamina i 1x ne-esencijalnom amino kiselinom). Izradi se razblaženje ćelija od 1:20 sa tripan plavim i ćelije broje pomoću hemocitometra. PBMCe se razblaže da se dobije finalna koncentracija od 2x10<6>/ml a 100µl ove ćelijske suspenzije se doda u otvore u kojima se nalazi 1µl razblaženog test jedinjenja.

Inkubacija i analize za Interferon-α i TNF-α

[0482] Pripremljene ćelije se inkubiraju 24h (37°C, 95% vazduha, 5% CO2) nakon čega se uzorak supernatanta ukloni pomoću Biomek FX i ispituje za IFN-α i TNF-α koristeći MSD (Mesoscale Discovery) platformu za elektro-hemiluminescentnu analizu. Ispitivanje IFN-α se izvodi na sličan način kako je prethodno opisano. Analiza TNFα se izvodi po instrukcijama datim uz kit (Cat No K111BHB).

[0483] Oslobođeni citokin se izražava kao procenat kontrole sa 2µM rezikvimoda (kolona 11). Ovaj procenat se stavlja u odnos sa koncentracijom jedinjenja i dobija se pEC50 za odgovor određen najmanjim kvadratom dobijene ne-linearne krive. Za odgovore IFN-α generalno je izabran logistički model sa 4 parametra. Za TNF odgovore je dobijen jasan maksimum odgovora (to jest, dobijen je jasno definisan plato u odgovoru) a nakon toga se generalno koristi model od 4 parametra. Ukoliko gornja asimptota krive nije dobro definisana, tada je izrada krive generalno ograničena na maksimalni odgovor od 100% (to jest, odgovor na 2µM rezikvimoda) ili na odgovor na najveću testiranu koncentraciju ukoliko je on veći nego odgovor na rezikvimod. Neke krive su u obliku zvona za jedan ili oba citokina a vrednosti citokina na padajućem delu odgovora u obliku zvona (to jest, koncentracije iznad koncentracija koje daju maksimalni odgovor) su generalno isključene iz razmatranja, obično sa izuzetkom koncentracije neposredno iznad pika odgovora. Prema tome, kriva se dobija od koncentracija na uzlaznom delu krive odgovora na dozu.

Rezultati

[0484] Referentni Primeri 5 i 9 pokazuju prosečne pEC50za indukciju IFN-α i TNF-α od >7.5 i <5.5 tim redom. Referentni Primeri 6, 7, 10 do 12, 14 i 18 pokazuju prosečne pEC50za indukciju IFN-α i TNF-α od ≥8 i <6 tim redom. Referentni Primeri 13 i 15 i Primeri 1 do 4 pokazuju prosečnu pEC50za indukciju IFN-α i TNF-α od ≥9 i ≤ 6 tim redom.

Ispitivanje citokina izazvanih alergenom koristeći mononuklearne ćelije sveže humane periferne krvi (PBMC) dobijene od atopičnih dobrovoljaca

11

[0485] Razvijena je analiza sa alergenom i test jedinjenjima zasnovana na ko-kulturi mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) dobijenih od atopičnih humanih donora.

Nakon 5-6 dana kulture, supernatanti ćelija se ispituju na nivo citokina.

Priprema jedinjenja

[0486] Jedinjenja se rastvore u DMSO, a nakon toga serijski razblaže u medijumu za rast (RPMI 1640 medijum obogaćen sa 100U/ml penicilina G, 100µg/ml streptomicina, 10mM L-glutamina) da se dobije 4x opseg tražene koncentracije u prisustvu 0.04% DMSO. Svako jedinjenje se ispituje u triplikatu za sve koncentracije.

Izrada PBMCa

[0487] Defibrilisana humana krv od dobrovoljaca za koje se zna da su alergični na Timothy travu se centrifugira 15 minuta na 2500 opm. Gornji sloj seruma se sakupi i 30 minuta inaktivira toplotom na 56°C (HI-autologni serum). Donji sloj ćelija se resuspenduje u 50ml PBS (+Ca Mg), 25ml razblažene krvi se prenese u 20ml Lymphoprep u epruvetama zapremine 50ml a nakon toga centrifugira 20 minuta pri 2500opm na RT. Ćelije grupisane na mestu spajanja serum/Lymphoprep se pažljivo uklone. Sakupljene ćelije se isperu a PBS i resuspenduju sa 4x10<6>/ml medijuma za rast sa HI-autolognim serumom. PBMCe se zaseju u količini od 0.4x10<6>ćelija /otvor u pločama sa 96 otvora ravnog dna u prisustvu 10ug/ml antigena Timothy trave (Alk Abello) i odgovarajućih koncentracija test jedinjenja u ukupnoj zapremini od 200ul.

Inkubacija i analiza citokina

[0488] Ploče se inkubiraju do 6 dana na 37°C u 5%CO2. Ćelijski medijum iz svakog otvora se sakupi i čuva na -20°C pre analize. Citokini i hemokini u supernatantima se detektuju koristeći Meso Scale Discovery ploče sa 10 pozicija za humane TH1/Th2 citokine.

[0489] U prethodnoj analizi, vrednosti iz odvojenih studija sa PBMCa od tri alergična donora pokazuju da Primer 3 smanjuje produkciju Th2 citokina IL-5 i IL-13 za ≥50% kao odgovor na dozu u odnosu na uočeno za 0.04µM, u poređenju sa alergenskom kontrolom.

[0490] Primeri 2 i 3 iz otkrića su takođe testirani na in vivo biološku aktivnost u sledećem modelu:

Ispitivanje indukcije interferona-α nakon intranazalnog doziranja kod miševa.

[0491] Jedinjenja se rastvore u 0.2% Tween 80 u fiziološkom rastvoru i primene intranazalno (5µl ukupno u obe nozdrve) na ženkama BALB/c miševa (n=6) pod opštom anestezijom. Životinje se eutanaziraju 2 sata nakon doziranja i uzme se uzorak terminalne krvi a vrednosti Interferona-α u serumu se mere pomoću ELISA testa.

[0492] U ovom modelu, Primer 2 pokazuje prosečne vrednosti Interferona-α u serumu od 20326 pg/ml a Primer 3 pokazuje prosečne vrednosti Interferona-α u serumu od 21029 pg/ml. U kontrolama tretiranih vehikulumom nije detektovan Interferon-α.

Claims (9)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (I):

   naznačeno time što: R<1>je (1S)-1-metilbutiloksi grupa; m je ceo broj koji ima vrednost od 3 do 6; n je ceo broj koji ima vrednost od 0 do 4; ili njegova prihvatljiva so.
2. 2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili njegova so, naznačeno time što je izabrano iz grupe koja sadrži: 6-amino-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-9-[4-(1-piperidinil)butil]-7,9-dihidro-8H-purin-8-on; 6-amino-9-[4-(heksahidro-1H-azepin-1-il)butil]-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-7,9-dihidro-8H-purin-8-on; i 6-amino-9-[5-(heksahidro-1H-azepin-1-il)pentil]-2-{[(1S)-1-metilbutil]oksi}-7,9-dihidro-8H-purin-8-on; i njihove soli.
3. 3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je u obliku farmaceutski prihvatljive soli.
4. 4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je u obliku slobodne baze.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
6. 6. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu alergijskih bolesti i drugih inflamatornih stanja, infektivnih bolesti i kancera.
7. 7. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu alergijskog rinitisa.
8. 8. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu astme.
9. 9. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili patentnim zahtevom 2, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više farmaceutski prihvatljiv razblaživač ili nosač.