RS57767B1 - Mutantni interleukin-2 polipeptidi - Google Patents

Mutantni interleukin-2 polipeptidi

Info

Publication number
RS57767B1
RS57767B1 RS20181250A RSP20181250A RS57767B1 RS 57767 B1 RS57767 B1 RS 57767B1 RS 20181250 A RS20181250 A RS 20181250A RS P20181250 A RSP20181250 A RS P20181250A RS 57767 B1 RS57767 B1 RS 57767B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
polypeptide
sequence
immunoconjugate
mutant
Prior art date
Application number
RS20181250A
Other languages
English (en)
Inventor
Oliver Ast
Peter Bruenker
Anne Freimoser-Grundschober
Sylvia Herter
Thomas U Hofer
Ralf Hosse
Christian Klein
Ekkehard Moessner
Valeria G Nicolini
Pablo Umana
Original Assignee
Roche Glycart Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Glycart Ag filed Critical Roche Glycart Ag
Publication of RS57767B1 publication Critical patent/RS57767B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

OPIS
Oblast pronalaska
Ovaj pronalazak se uglavnom odnosi na imunokonjugate koji sadrže mutantne IL-2 polipeptide koji pokazuju poboljšana svojstva za upotrebu kao imunoterapeutski agensi. Pored toga, pronalazak se odnosi na molekule polinukleotida koji kodiraju imunokonjugate i na vektore i ćelije domaćina koji sadrže takve molekule polinukleotida. Pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju imunokonjugata, farmaceutskih kompozicija koje sadrže iste, kao i njihove upotrebe.
Osnova
Interleukin-2 (IL-2), poznat i kao faktor rasta T-ćelija (TCGF), globalni je glikoprotein 15,5 kDa koji igra centralnu ulogu u stvaranju limfocita, preživljavanju i homeostazi. Ima dužinu od 133 aminokiseline i sastoji se od četiri antiparalelna, amfipatska α-heliksa koja formiraju kvaternarnu strukturu koja je neophodna za njegovu funkciju (Smith, Science 240, 1169-76 (1988); Bazan, Science 257, 410-413 (1992)). Sekvence IL-2 iz različitih vrsta nalaze se pod NCBI referentnim brojem NP000577 (čovek), NP032392 (miš), NP446288 (pacov) ili NP517425 (šimpanza).
IL-2 posreduje svoje delovanje vezivanjem za IL-2 receptore (IL-2R), koji se sastoje od do tri pojedinačne podjedinice, čija različita asocijacija može da proizvodi receptorske forme koje se razlikuju u njihovom afinitetu prema IL-2. Asocijacija α (CD25), β (CD122) i γ (γc, CD132) podjedinica rezultira trimernim receptorom visokog afiniteta za IL-2. Dimerni receptor IL-2 koji se sastoji od β i γ podjedinica se naziva IL-2R intermedijarnom afinitetom. Podjedinica α formira monomerni IL-2 receptor niskog afiniteta. Iako dimerni IL-2 receptor srednjeg afiniteta vezuje IL-2 sa oko 100 puta nižim afinitetom od trimerskog receptora visokog afiniteta, i dimerne i trimerne varijante receptora IL-2 mogu da prenose signal nakon vezivanja IL-2 (Minami et al., Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993)). Prema tome, α-podjedinica, CD25, nije neophodna za signalizaciju IL-2. Ona daje visoku afinitetnu vezu za njegov receptor, dok je ß podjedinica, CD122 i γpodjedinica su ključni za transdukciju signala (Krieg et al., Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010)). Trimerne IL-2 receptore, uključujući CD25, eksprimiraju (u mirovanju) CD4<+>regulatorne T (Treg) ćelije transkripcijskog faktora FoxP3<+>. Takođe su tranzitivno indukovani na konvencionalne aktivirane T-ćelije, dok u stanju mirovanja ove ćelije izražavaju samo dimerne receptore IL-2. Treg ćelije stalno izražavaju najviši nivo CD25 in vivo (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)).
IL-2 se sintetiše uglavnom aktiviranim T-ćelijama, posebno CD4<+>pomoćnim T-ćelijama. Podstiče proliferaciju i diferencijaciju T-ćelija, indukuje nastanak citotoksičnih T limfocita (CTL) i diferencijaciju limfocita periferne krvi na citotoksične ćelije i limfokin stimulisane ćelije ubice (LAK), promoviše ekspresiju citokina i citolitičkih molekula pomoću T-ćelija, olakšava proliferaciju i diferencijaciju B-ćelija i sintezu imunoglobulina pomoću B-ćelija i stimuliše generisanje, proliferaciju i aktivaciju ćelija prirodnih ubica (NK) (pregledano npr. u Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009 ), Olejniczak i Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008), Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008)).
Njegova sposobnost širenja populacija limfocita in vivo i povećanje efektorskih funkcija ovih ćelija doprinosi antitumorskim efektima na IL-2, čineći imunoterapiju IL-2 atraktivnom opcijom lečenja za određene metastatske karcinome. Shodno tome, tretman visokim dozama IL-2 je odobren za upotrebu kod pacijenata sa metastatskim karcinomom bubrežnih ćelija i malignim melanomom.
Međutim, IL-2 ima dualnu funkciju u imunološkom odgovoru jer ne posreduje samo ekspanziju i aktivnost efektorskih ćelija već je i značajno uključen u održavanje periferne imunološke tolerancije.
Glavni mehanizam, koji je u osnovi periferna samotolerancija, zapravo je indukovana ćelijska smrt indukovana aktivacijom IL-2 (AICD) u T-ćelijama. AICD je proces kojim potpuno aktivirane T-ćelije proživljavaju programiranu ćelijsku smrt putem angažovanja receptora smrti eksprimiranih na površini ćelije, kao što su CD95 (takođe poznat kao Fas) ili TNF receptor. Kada se antigen-aktivirane T-ćelije, koje eksprimiraju IL-2 receptor sa visokim afinitetom (nakon prethodnog izlaganja IL-2) tokom proliferacije, restimuliraju antigenom preko kompleksa (TCR)/CD3 T-ćelijskog receptora/, indukuje se ekspresija Fas liganda (FasL) i/ili faktora tumorske nekroze (TNF), što čini ćelije podložnim Fas-posredovanoj apoptozi. Ovaj proces je zavisan od IL-2 (Lenardo, Nature 353, 858-61 (1991)) i posredovan putem STAT5. Procesom AICD u T limfocitima ne samo da se tolerancija može uspostaviti na endogenim antigenima, nego i na perzistentnim antigenima koji očigledno ne potiču od domaćina, kao što su tumorski antigeni.
Štaviše, IL-2 je takođe uključen u održavanje perifernih CD4<+>CD25<+>regulatornih T (Treg) ćelija (Fontenot et al., Nature Immunol 6, 1142-51 (2005); D’Cruz and Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005); Maloy and Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005) koji su takođe poznati kao supresorske T-ćelije. Oni potiskuju efektorske T-ćelije da uništavaju svoj (samo-)cilj, bilo putem kontakta ćelija-ćelija, tako što inhibiraju pomoć i aktivaciju T-ćelija ili putem oslobađanja imunosupresivnih citokina kao što su IL-10 ili TGF-β. Za iscrpljivanje Treg ćelija je utvrđeno da poboljšava imunitet indukovan IL-2 protiv tumora (Imai et al., Cancer Sci 98, 416-23 (2007)).
Prema tome, IL-2 nije optimalan za inhibiranje rasta tumora jer u prisustvu IL-2 čak i proizvedeni CTL mogu prepoznati tumor kao sopstveni i podvrgnuti procesu AICD ili imuni odgovor može biti inhibiran IL-2 zavisnim Treg ćelijama.
Još jedna zabrinutost u vezi sa imunoterapijom IL-2 su neželjeni efekti koji se dobijaju rekombinantnim humanim IL-2 tretmanom. Pacijenti koji primaju visokokoncentrovane terapije IL-2 često doživljavaju teške kardiovaskularne, plućne, bubrežne, hepatične, gastrointestinalne, neurološke, kutane, hematološke i sistemske neželjene događaje, koji traže intenzivno praćenje i upravljanje pacijentom. Većina ovih neželjenih efekata može se objasniti razvojem tzv. sindroma vaskularnog (ili kapilarnog) curenja (VLS), patološkog porasta vaskularne permeabilnosti koja dovodi do ekstravazacije tečnosti u više organa (uzrokuje npr. plućni i kožni edem i oštećenje ćelija jetre) i smanjenje intravaskularne tečnosti (izazivajući pad krvnog pritiska i kompenzacijsko povećanje srčane frekvencije). Ne postoji tretman za VLS, osim povlačenja IL-2. IL-2 režimi u malim dozama su testirani kod pacijenata kako bi se izbegao VLS, međutim, na račun suboptimalnih terapijskih rezultata. Verovalo se da je VLS uzrokovan oslobađanjem proinflamatornih citokina, kao što je faktor tumorske nekroze (TNF)-α iz IL-2 aktiviranih NK ćelija, međutim nedavno je pokazano da je plućni edem izazvan IL-2 rezultat direktnog vezivanja IL-2 za plućne endotelne ćelije, koje su eksprimirale niske do srednje vrednosti nivoa funkcionalnih αβγ IL-2 receptora (Krieg et al., Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11 (2010)).
Nekoliko pristupa je preduzeto kako bi se prevazišli ovi problemi u vezi sa imunoterapijom IL-2. Na primer, utvrđeno je da kombinacija IL-2 sa određenim anti-IL-2 monoklonskim antitelima poboljšava efekte tretmana IL-2 in vivo (Kamimura et al., J Immunol 177, 306-14 (2006); Boyman et al., Science 311, 1924-27 (2006)). U alternativnom pristupu, IL-2 je mutiran na različite načine kako bi se smanjila njegova toksičnost i/ili povećala njegovu efikasnost. Hu et al. (Blood 101, 4853-4861 (2003), US Pat. No.2003/0124678) su supstituisali ostatak arginina na poziciji 38 IL-2 pomoću triptofana radi eliminacije aktivnosti vazopermeabilnosti IL-2. Shanafelt et al. (Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)) su mutirali asparagin 88 u arginin radi poboljšanja selektivnosti T-ćelija nad NK ćelijama. Heaton et al. (Cancer Res 53, 2597-602 (1993), US Patent No. 5,229,109) su uvele dve mutacije, Arg38Ala i Phe42Lys, da bi se smanjilo lučenje proinflamatornih citokina iz NK ćelija. Gillies et al. (SAD Pat. Br.2007/0036752) su zamenili tri ostatka IL-2 (Asp20Thr, Asn88Arg i Gln126Asp) koji doprinose afinitetu za IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta da smanji VLS. Gillies et al. (WO 2008/0034473) takođe su mutirali interfejs IL-2 sa CD25 aminokiselinskom supstitucijom Arg38Trp i Phe42Lys kako bi smanjili interakciju sa CD25 i aktivirali Treg ćelije radi poboljšanja efikasnosti. U istom cilju, Wittrup et al. (WO 2009/061853) proizvele su IL-2 mutante koji su poboljšali afinitet prema CD25, ali ne aktiviraju receptor, i time deluju kao antagonisti. Navedene mutacije bile su usmerene na poremećaj interakcije sa β- i/ili γ-podjedinicom receptora.
Međutim, nije pokazano da neka od poznatih mutacija IL-2 nije prevazišla sve gorenavedene probleme u vezi sa imunoterapijom IL-2, odnosno toksičnosti izazvanom indukcijom VLS, tolerancijom tumora uzrokovanog indukcijom AICD i imunosupresijom uzrokovanom aktivacijom Treg ćelija. Stoga ostaje potreba u struci da dalje poboljša terapeutsku korisnost IL-2 proteina.
Sažetak pronalaska
Sadašnji pronalazak je delimično zasnovan na prepoznavanju da je interakcija IL-2 sa αpodjedinicom trimernog receptora sa visokim afinitetom IL-2 odgovorna za probleme u vezi sa imunoterapijom IL-2.
Pronalazak se odnosi na sledeće imunokonjugate, polinukleotide, ćelije-domaćine, postupke stvaranja imunokonjugata i farmaceutskih kompozicija:
[1] Imunokonjugat koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid i antigen vezujući deo, pri čemu pomenuti mutirani polipeptid IL-2 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19; i pri čemu je navedeni antigen vezujući deo potklasa molekula imunoglobulina IgG 1 specifična za fibroblast aktivacijski protein (FAP), koji sadrži (i) varijabilni region sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 41 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 39; (ii) varijabilni region sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 51 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 49; (iii) sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 111 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 109; (iv) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 143 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 141; ili (iv) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 151 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 149.
[2] Imunokonjugat u skladu sa [1], pri čemu je pomenuti mutantni IL-2 polipeptid spojen na amino-terminalnoj aminokiselini do karboksi-terminalne aminokiseline jednog od teških lanaca imunoglobulina.
[3] Imunokonjugat u skladu sa [1] ili [2], pri čemu imunokonjugat sadrži ne više od jednog mutiranog IL-2 polipeptida.
[4] Imunokonjugat iz bilo koje od tačaka [1] do [3], pri čemu molekul imunoglobulina potklase IgG 1 sadrži u Fc domenu modifikaciju čvor u otvor, koji sadrži modifikaciju čvora u jednom od teških lanaca imunoglobulina i modifikaciju otvora u drugom teškom lancu imunoglobulina, pri čemu modifikacija čvora sadrži aminokiselinsku supstituciju T366W u jednom od dva imunoglobulinska teška lanca, a modifikacija otvora uključuje zamene aminokiselina T366S, L368A i Y407V u drugom od dva teška lanca imunoglobulina.
[5] Imunokonjugat u skladu sa [4], pri čemu teški lanac imunoglobulina koji sadrži modifikaciju čvora dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju S354C, a teški lanac imunoglobulina koji sadrži modifikaciju otvora dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju Y349C.
[6] Imunokonjugat iz bilo koje od tačaka [1] do [5], pri čemu molekul IgG 1 sadrži u svom Fc domenu mutacije aminokiselina L234A, L235A i P329G.
[7] Imunokonjugat iz bilo koje od tačaka od [1] do [6], koji sadrži (i) polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ili 100% identična SEQ ID NO: 297, polipeptidna sekvenca koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 299 i polipeptidna sekvenca koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 233; (ii) polipeptidna sekvenca koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 301, polipeptidna sekvenca koja je u najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 303 i polipeptidnom sekvencom koja je najmanje 80%, 85% %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 231; ili (iii) polipeptidna sekvenca koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 315, polipeptidna sekvenca koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 317 i polipeptidna sekvenca koja je najmanje 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 233.
[8] Imunokonjugat iz bilo koje od tačaka [1] do [7], pri čemu navedeni molekul IgG 1 specifičan za FAP sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 111 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 109.
[9] Imunokonjugatiz bilo koje od tačaka [1] do [8], koji sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 301, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 303 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 231.
[10] Imunokonjugat iz bilo koje od tačaka [1] do [9], koji se sastoji od mutantnog IL-2 polipeptida i molekula IgG 1, spojenog sa sekvencom veznika.
[11] Izolovani polinukleotid koji kodira neki od imunokonjugata iz bilo koje od tačaka [1] do [10].
[12] Ćelija-domaćin koja sadrži polinukleotid iz tačke [11].
[13] Postupak stvaranja imunokonjugata koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid i antigen vezujući deo, koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina [12] pod uslovima pogodnim za ekspresiju imunokonjugata.
[14] Imunokonjugat koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid i antigen vezujući deo, proizveden postupkom iz tačke [13], pri čemu mutantni IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19, i pri čemu je antigen vezujući deo IgG1 molekul imunoglobulina potklase specifične za FAP.
[15] Farmaceutska kompozicija koja sadrži imunokonjugat iz bilo koje od tačaka od [1] do [10] [14] i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[16] Imunokonjugat iz bilo koje od tačaka od [1] do [10] ili [14] za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinaca kojima to treba.
[17] Imunokonjugat za upotrebu u lečenju bolesti iz tačke [16], pri čemu je navedena bolest kancer.
Predmetni pronalazak obezbeđuje mutantni interleukin-2 (IL-2) polipeptid koji sadrži prvu mutaciju aminokiselina koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida do receptora visokog afiniteta IL-2 i čuva afinitet mutantnog IL- 2 polipeptida do IL-2 receptora intermedijernog afiniteta, svaki u poređenju sa nemutiranim polipeptidom IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta prva aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta prva aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina, izabrana iz grupe L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuta prva aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija L72G. U određenim primerima izvođenjima, mutantni IL-2 polipeptid sadrži drugu aminokiselinsku mutaciju koja ukida ili smanjuje afinitet mutiranog IL-2 polipeptida do IL-2 receptora sa visokim afinitetom i čuva afinitet mutiranog IL-2 polipeptida do IL-2 receptora intermedijernog afiniteta, svaki u poređenju sa nemutiranim polipeptidom IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta druga mutacija aminokiselina je u poziciji izabranoj od položaja koji odgovaraju ostatku 35, 38, 42, 43 i 45 humanog IL-2. U konkretnom primeru izvođenja, navedena druga aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuta druga aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina, odabrana iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R i F42K. U još konkretnijem primeru izvođenja, pomenuta druga aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiseline F42A. U određenim primerima izvođenja, mutantni interleukin-2 polipeptid sadrži treću aminokiselinsku mutaciju koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida do IL-2 receptora sa visokim afinitetom i čuva afinitet mutiranog IL-2 polipeptida do i IL-2 receptora intermedijarnog afiniteta, svaki u poređenju sa nemutiranim polipeptidom IL-2. U posebnom primeru izvođenja, mutantni interleukin-2 polipeptid sadrži tri aminokiselinske mutacije koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutantnog IL-2 polipeptida do IL-2 receptora sa visokim afinitetom i sačuva afinitet mutiranog IL-2 polipeptida u IL-2 receptor srednjeg afiniteta, svaki u poređenju sa nemutiranim polipeptidom IL-2, pri čemu su pomenute tri aminokiselinske mutacije na pozicijama koje odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenute tri aminokiselinske mutacije su supstitucije aminokiselina izabrane iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N , Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U konkretnom primeru izvođenja, pomenute tri mutacije aminokiselina su aminokiselinske supstitucije F42A, Y45A i L72G. U određenim primerima izvođenja, mutantni interleukin-2 polipeptid dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta aminokiselinska mutacija koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2 je aminokiselinske supstitucija izabrana iz grupe T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K i T3P. U konkretnom primeru izvođenja, mutacija aminokiselina koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2 je T3A. U određenim primerima izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid je u suštini molekul IL-2 pune dužine, naročito humani molekul IL-2 u celoj dužini.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje mutantni interleukin-2 polipeptid povezan sa neIL-2 delom. U određenim primerima izvođenja, pomenuti deo koji nije IL-2 je ciljni deo. U određenim primerima izvođenja, pomenuti deo koji nije IL-2 je antigen vezujući deo. U jednom primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je antitelo. U sledećem primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je fragment antitela. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je izabran iz Fab i scFv molekula. U posebnom primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je Fab molekula. U sledećem primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je scFv molekula. U posebnim primerima izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid je povezan sa prvim i drugim ne-IL-2 delovima. U jednom takvom primeru izvođenja, mutantni interleukin-2 polipeptid deli peptidnu vezu karboksi terminala sa pomenutim prvim ne-IL-2 delom i peptidnom vezom aminoterminala sa pomenutim drugim ne-IL-2 ostatkom. U jednom primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je molekul imunoglobulina. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je IgG klasa, naročito IgG 1 potklasa, molekul imunoglobulina. U određenim primerima izvođenja, pomenuti antigen vezujući deo je usmeren na antigen predstavljen na ćeliji tumora ili u okruženju tumorskih ćelija, naročito antigena izabranog iz grupe fibroblast aktivacijskih proteina (FAP), A1 domena Tenascin-C (TNC A1), A2 domena Tenascin-C (TNC A2), dodatni domen B fibronektina (EDB), karcinoembrionski antigen (CEA) i proteoglikan hondroitin sulfata u vezi sa melanomom( MCSP).
Takođe obezbeđeno je obelodanjivanjem imunokonjugata koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid kao što je ovde opisano i deo za vezivanje antigena. U jednom primeru izvođenja, imunokonjugata koji je ovde opisan mutantni IL-2 polipeptid deli amino ili karboksi terminalnu peptidnu vezu sa pomenutim antigen vezujućim delom. U posebnom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži kao prvi i drugi antigen vezujući deo. U jednom takvom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid koji se sastoji u imunokonjugatu koji je ovde opisan, deli peptidnu vezu amino ili karboksi terminalnu vezu sa prvim delom za vezivanje antigena i drugi deo za vezivanje antigena deli amino ili karboksi terminalnu peptidnu vezu sa i) mutantni IL-2 polipeptidom ili ii) navedenim prvim antigen vezujućim delom. U jednom primeru izvođenja, antigen vezujući deo koji je sastani deo imunokonjugata koji je ovde opisan, je antitelo, u drugom izvođenju pomenuti deo za vezivanje antigena je fragment antitela. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je izabran od Fab i scFv molekula. U posebnom primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je Fab molekul. U drugom posebnom primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je molekul imunoglobulina. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je IgG klasa, naročito IgG 1 potklasa, molekul imunoglobulina. U određenim primerima izvođenja, pomenuti antigen vezujući deo je usmeren na antigen predstavljen na ćeliji tumora ili u okruženju tumorskih ćelija, naročito antigena izabranog iz grupe fibroblast aktivacijskih proteina (FAP), A1 domena Tenascin-C (TNC A1), A2 domena Tenascin-C (TNC A2), dodatni domen B fibronektina (EDB), karcinoembrionski antigen (CEA) i proteoglikan hondroitin sulfata u vezi sa melanomom (MCSP) .
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat kao što je ovde opisano, vektore ekspresije koji sadrže navedene polinukleotide i ćelije domaćina koje sadrže polinukleotide ili vektore ekspresije.
Takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata kao što je ovde opisano, farmaceutske kompozicije koja sadrži mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugata kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač i postupci korišćenja mutantnog IL- 2 polipeptida ili imunokonjugata kao što je ovde opisano.
Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat kao što je ovde opisano za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome to treba. U posebnom primeru izvođenja, navedena bolest je kancer. U posebnom primeru izvođenja, pojedinac je čovek.
Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata kao što je ovde opisano za proizvodnju leka za lečenje bolesti kod pojedinca kome to treba.
Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na lečenje bolesti kod pojedinca, koji obuhvata davanje navedenom pojedincu terapeutski efikasne količine preparata koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat kao što je ovde opisano. Navedena bolest je poželjno kancer.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na stimulaciju imunološkog sistema pojedinca, koji obuhvata davanje navedenom pojedincu delotvornu količinu preparata koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat koji je ovde opisan u farmaceutski prihvatljivom obliku.
Detaljan opis pronalaska
Definicije
Termini se ovde koriste kao što se obično koriste u struci, osim ako nije drugačije definisano kako sledi.
Termin „interleukin-2” ili „IL-2”, U smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni IL-2 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi) ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađeni IL-2, kao i svaki oblik IL-2 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante IL-2, npr. splajsovane ili alelne varijante. Serija aminokiselina primernog humanog IL-2 je prikazana u SEQ ID NO: 1. Neobrađeni humani IL-2 dodatno sadrži N-terminal 20 aminokiselinski signalni peptid koji ima sekvencu SEQ ID NO: 272, koji je odsutan u zrelom IL-2 molekulu.
Termin „IL-2 mutant” ili „mutantni IL-2 polipeptid”, kao što je ovde korišćen, ima za cilj da obuhvati bilo koji mutantni oblik različitih oblika IL-2 molekula, uključujući IL-2, skraćene oblike IL-2 i oblike gde je IL-2 povezan sa drugim molekulom, kao što je fuzija ili hemijska konjugacija. „Puna dužina” kada se koristi u odnosu na IL-2 ima za cilj da označava zrelu molekulu IL-2 prirodne dužine. Na primer, humani IL-2 pune dužine odnosi se na molekul koji ima 133 aminokiseline (videti npr. SEQ ID NO: 1). Različiti oblici mutantnih IL-2 se karakterišu u tome što imaju najmanje jednu aminokiselinsku mutaciju koja utiče na interakciju IL-2 sa CD25. Ova mutacija može uključivati zamenu, brisanje, skraćivanje ili modifikaciju nemutiranog aminokiselinskog ostatka koji se obično nalazi na tom položaju. Mutanti dobijeni supstitucijom aminokiselina su poželjni. Osim ako nije drugačije naznačeno, mutantni IL-2 može ovde biti označen kao IL-2 mutantna peptidna sekvenca, IL-2 mutantni polipeptid, IL-2 mutantni protein ili IL-2 mutantni analog.
Oznaka različitih oblika IL-2 je ovde napravljena u odnosu na sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju. Na primer, mutacija iz fenilalanina na položaju 42 do alanina može biti označena kao 42A, A42, A 42, F42A ili Phe42Ala.
Izraz "„mutacija aminokiselina”, kako se ovde koristi, podrazumeva se da obuhvata zamene aminokiselina, brisanje, umetanje i modifikacije. Svaka kombinacija zamene, brisanja, umetanja i modifikacije može se načiniti tako da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za CD25. Brisanja i ubacivanja aminokiselinske sekvence uključuju brisanje i umetanje aminokiselina na amino i/ili karboksi terminalu. Primer brisanja terminala je brisanje ostatka alanina u poziciji 1 humanog IL-2 pune dužine. Preferirane aminokiselinske mutacije su supstitucije aminokiselina. U cilju izmene npr. karakteristika vezivanja polipeptida IL-2, naročito su poželjne nekonzervativne supstitucije aminokiselina, tj. zamena jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima različita strukturalna i/ili hemijska svojstva. Poželjne supstitucije aminokiselina uključuju zamenu hidrofobne aminokiseline hidrofilnom aminokiselinom. Zamene aminokiselina uključuju zamenu aminokiselinama koje ne nastaju prirodno ili izvedenim aminokiselinama koje nastaju prirodno, od dvadeset standardnih aminokiselina (npr.4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Mutacije aminokiseline mogu se generisati pomoću genetičkih ili hemijskih postupaka koje su dobro poznate u struci. Genetski postupci mogu obuhvatiti mutagenezu usmerenu na lokaciju, PCR, sintezu gena i slično. Smatra se da su takođe korisni postupci izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim postupcima osim genetskog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija.
U smislu ovog dokumenta, „nemutirani” oblik IL-2 je oblik IL-2 koji je inače isti kao mutantni IL-2 polipeptid, osim što nemutirani oblik ima nemutiranu aminokiselinu na svakoj pozicijj aminokiseline mutantnog IL-2 polipeptida. Na primer, ako je IL-2 mutant IL-2 u punoj dužini (tj. IL-2 nije spojen ili konjugovan sa bilo kojim drugim molekulom), nemutirani oblik ovog mutanta je nativni IL-2 pune dužine. Ako je mutantni IL-2 fuzija između IL-2 i drugog polipeptida koji je kodiran nizvodno od IL-2 (npr. lanac antitela), nemutirani oblik ovog IL-2 mutanta je IL-2 sa aminokiselinskom nemutiranog tipa sekvence spojene sa istim polipeptidom nizvodno. Pored toga, ako je IL-2 mutant skraćeni oblik IL-2 (mutirana ili modifikovana sekvenca u neskraćenom delu IL-2), onda je nemutirani oblik ovog IL-2 mutanta slično skraćeni IL -2 koji ima nemutiranu sekvencu. U cilju upoređivanja afiniteta vezivanja IL-2 receptora ili biološke aktivnosti različitih oblika mutanata IL-2 do odgovarajućeg oblika nemutiranog IL-2, termin nemutirani obuhvata oblike IL-2 koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje ne utiče na vezivanje IL-2 receptora u poređenju sa prirodnim, nativnim IL-2, kao što je npr. supstitucija cisteina na poziciji koja odgovara ostatku 125 humanog IL-2 do alanina. U nekim izvođenjima nemutirani IL-2 za potrebe predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku supstituciju C125A (videti SEQ ID NO: 3). U određenim aspektima prema otkriću nemutirani polipeptid IL-2, sa kojim se poredi mutantni IL-2 polipeptid, sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ IE NO: 1. U drugim primerima izvođenja, nemutirani polipeptid IL-2, sa kojim se poredi mutantni IL-2 polipeptid, sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3.
Termin „CD25” ili „α-podjedinica IL-2 receptora”, U smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni CD25 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodare (npr. miševe i pacove), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen, CD25 „pune dužine”, kao i svaki oblik CD25 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante CD25, npr. splajsovane ili alelne varijante. U određenim izvođenjima CD25 je humani CD25. Sekvenca aminokiselina egzemplarnog humanog CD25 (sa signalnom sekvencom, Avi-tagom i His-tagom) prikazana je u SEQ ID NO: 278.
Termin „receptor IL-2 visokog afiniteta”, kako se ovde koristi, odnosi se na heterotrimerni oblik receptora IL 2, koji se sastoji od receptorske γ-podjedinice (takođe poznate kao uobičajena γ-podjedinica za citokin receptor, γc ili CD132), receptorska β-podjedinica (takođe poznata kao CD122 ili p70) i α-podjedinica receptora (takođe poznata kao CD25 ili p55). Termin „receptor intermedijarnog afiniteta IL-2” odnosi se na receptor IL-2 koji uključuje samo γ-podjedinicu i βpodjedinicu, bez α-podjedinice (za pregled vidi npr. Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)).
„Afinitet” se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. receptora) i njegovog partnera u vezivanju (npr. liganda). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. receptora i liganda). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (KD), koja predstavlja odnos konstanti brzine disocijacije i brzine asocijacije (koff, odnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su ovde opisani.
Afinitet mutanta ili nemutiranog polipeptida IL-2 za različite oblike IL-2 receptora može se odrediti u skladu sa postupkom izloženim u Primerima površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći standardne instrumente kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare) i receptorske podjedinice, kao što se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom (videti npr. Shanafelt et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). Alternativno, afinitet vezivanja IL-2 mutanata za različite oblike IL-2 receptora može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato daeksprimiraju jedan ili drugi takav oblik receptora. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.
Pod „regulatornom T ćelijom” ili „Treg ćelijom” podrazumeva se specijalizovani tip CD4<+>T ćelija koji može potisnuti odgovore drugih T ćelija. Treg ćelije se karakterišu eksprimiranjem αpodjedinice receptora IL-2 (CD25) i transkripcionog faktora za kutiju P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) i igraju kritičnu ulogu u indukciji i održavanju periferne samotolerancije na antigene, uključujući i one izražene tumorima. Treg ćelije zahtevaju IL-2 za njihovu funkciju i razvoj i indukciju njihovih supresivnih karakteristika.
Kako se ovde koristi, termin „efektorske ćelije” odnosi se na populaciju limfocita koji posreduju citotoksične efekte IL-2. Efektorske ćelije uključuju efektorske T ćelije kao što su CD8
<+>citotoksične T ćelije, NK ćelije, limfokinom stimulisane ćelije ubice (LAK) i makrofagi/monociti.
Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući molekul” se odnosi na molekul polipeptida koji se specifično vezuje za antigenu determinantu. U jednom primeru izvođenja, antigen vezujući deo je u stanju da usmeri entitet na koji je vezan (npr. citokin ili drugi vezujući deo za vezivanje antigena) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija ili stromu tumora koji nosi antigensku determinantu. Antigen vezujuće komponente uključuju antitela i njihove fragmente kao što je ovde definisano. Poželjne antigen vezujuće komponente uključuju antigen vezujući domen antitela, koji obuhvata varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U izvesnim izvođenjima, antigen vezujuće komponente mogu uključivatiregione konstantnih antitela kao što je ovde definisano i poznato u struci. Korisni konstantni regioni teškog lanca uključuju bilo koji od pet izotipova: α, δ, ε γ ili μ. Korisni konstantni regioni lakog lanca uključuju bilo koji od dva izotipa: κ i λ.
Pod „specifičnim vezivanjem” podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može biti diskriminisano od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen vezujućeg dela da se veže na specifičnu antigensku determinantu može se meriti bilo putem enzimskog vezivanja imunosorbentnog testa (ELISA) ili drugih tehnika poznatih onima sa znanjem u struci, npr. tehnika površinske plazmonske rezonance (analizirana na BIAcore instrument) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) i tradicionalnih testova vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)).
Kako se ovde koristi, termin „antigenska determinanta” je sinonim za „antigen” i „epitop”, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnoj makromolekuli na koju se vezuje antigen vezujući deo, formirajući antigen vezujući kompleks deo-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM).
Kako se ovde koristi, pojam „polipeptid” odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) koji su linearno povezani amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Pojam „polipeptid” odnosi se na bilo koji lanac dve ili više aminokiselina i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Tako su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein”, „aminokiselinski lanac” ili bilo koji drugi izraz koji se koristi da se odnosi na lanac dve ili više aminokiselina, uključeni u definiciju „polipeptida” i izraz „polipeptid” se može koristiti umesto ili kao sinonim bilo kog od ovih izraza. Termin „polipeptid” se takođe odnosi na proizvode post-ekspresijske modifikacije polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja ili modifikacije sa ne-prirodno nastalim aminokiselinama. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući i hemijsku sintezu. Polipeptid kao što je ovde opisan može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1.000 ili više, ili 2.000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se nazivaju preklopljeni a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu usvojiti veliki broj različitih konformacija se nazivaju otvoreni.
Kao „Izolovani” polipeptid ili varijanta ili njeni derivat smatra se polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid može se ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini izraženi u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu otkrivanja, kao što su nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni odgovarajućom tehnikom.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Termin „polinukleotid” odnosi se na izolovani molekul ili strukturu nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNA), viralnu RNK ili plazmidnu DNK (pDNA). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestera ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNA). Termin „molekul nukleinske kiseline” odnosi se na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmenti DNK ili RNK, prisutni u polinukleotidu.
„Izolovanim” molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom smatra se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira terapeutski polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterolognim ćelijama domaćinima ili prečišćeni (delimično ili suštinski) polinukleotidi u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK, kao što je ovde prikazano, kao i pozitivne i negativne lančane forme i dvolančane forme. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu biti ili mogu uključiti regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.
Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu bar, na primer, 95% „identičnu” referentnoj nukleotidnoj sekvenci, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci osim kada polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim mestima referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih mesta, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. Da bi bilo praktično, klasično se pomoću poznatih kompjuterskih programa (npr. ALIGN-2)., kao što su oni gorenavedeni za polipeptide, može odrediti da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična ovde opisanoj nukleotidnoj sekvenci.
Termin „ekspresiona kaseta” odnosi se na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljanu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Obično, deo rekombinantne ekspresijske kasete ekspresionog vektora uključuje, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim rešenjima, ekspresiona kaseta opisana ovde sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju mutantne IL-2 polipeptide ili imunokonjugate kao što je ovde opisano ili njihove fragmente.
Termin „vektor” ili „vektor ekspresije” je sinonim za „konstrukt ekspresije” i odnosi se na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena na koji je operativno povezan u ciljanu ćeliju. Termin uključuje vektora kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektora ugrađenog u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ovdeopisani vektor ekspresije sadrži ekspresionu kasetu. Vektori ekspresije omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Jednom kada je vektor ekspresije unutar ciljne ćelije, molekula ribonukleinske kiseline ili proteina koji je kodiran genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednom primeru izvođenja, ekspresioni vektor koji je ovde opisan, sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju mutirane IL-2 polipeptide ili imunokonjugate kao što je ovde opisano ili njihove fragmente.
Termin „veštački” odnosi se na sintetski ili na sastav izvan ćelija domaćina, npr. hemijski sintetizovani oligonukleotid.
Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelija domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.
Termini „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” ovde se koriste naizmenično da bi se ukazalo na antitelo koje ima strukturu u suštini sličnu nativnoj strukturi antitela ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med.
9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore izd., (Springer-Verlag, New York), str.
269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2 fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, npr, EP 404,097; WO 1993/01161; et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
Termin „molekul imunoglobulina” odnosi se na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini IgG klase su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-kraja do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N-kraja do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može se svrstati u jednu od pet klasa, nazvanu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) ili μ (IgM), od kojih se neke mogu dalje deliti na podklase, npr. γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1(IgA1) i α2 (IgA2). Laki lanac imunoglobulina može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva Fab molekula i Fc domena, povezanih preko regiona zgloba imunoglobulina.
Termin „antigen vezujući domen” odnosi se na deo antitela koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Antigen vezujući domen može se dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela (takođe se zovu varijabilni regioni antitela). Poželjno, antigen vezujući domen sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koje je uključeno u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH, odnosno VL) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Videti, npr., Kindt et al., Kuby Immunology, 6<th>ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti.
Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR” kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”). Generalno, nativna četvorolančana antitela uključuju šest HVR, tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). HVR generalno sadrže ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili „regiona koji određuju komplementarnost” (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), i ti termini se ovde koriste naizmenično da ukažu na delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj konkretni region opisali su Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) i Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka u poređenju jedni sa drugima. Pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije da se ukaže na CDR antitela ili njegove varijante bude obuhvaćena terminom kao što je ovde definisan i koristi se. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR-ove kao što su definisani svakom od gore navedenih referenci dati su dole u Tabeli 1 radi poređenja. Tačan broj ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručnjaci za ovu oblast mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona antitela.
TABELA 1. Definicije CDR<1>
<1>Broj svih definicija CDR u tabeli 1 je u skladu sa konvencijama o numeraciji koje su izradili Kabat et al. (videti u nastavku).
<2>„AbM” sa malim slovom „b” kao što je korišćeno u tabeli 1 odnosi se na CDR-ove kao što je definisano pomoću softvera za modeliranje „AbM” antitela centra „Oxford Molecular”.
Kabat et al. su takođe definisali sistem numerisanja sekvenci varijabilnih regiona koji se primenjuje na bilo koje antitelo. Osoba sa uobičajenim znanjem u struci može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatove numeracije” na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim same sekvence. U smislu ovog dokumenta, „Kabat numerisanje” odnosi se na sistem numeracije koji je postavio Kabat i sar, U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.
Polipeptidne sekvence na liste sekvenci (npr. SEQ ID NOs: 23, 25, 27, 29, 31, 33. itd.) nisu numerisane prema Kabat sistemu numerisanja. Međutim, osoba sa uobičajenim znanjem u struci može da konvertuje numerisanje sekvenci iz redosleda redosleda na numeraciju Kabata.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Termin „Fc region” ovde se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG obično se definiše da se proteže od Cys226 ili Pro230 do karboksil-terminala teškog lanca. Međutim, C-terminalni lizin (Lys447) Fc regiona može, ali ne mora biti prisutan.
„Promena koja promoviše heterodimerizaciju” je manipulacija okosnice peptida ili posttranslacijske modifikacije polipeptida, npr. teški lanac imunoglobulina, koji smanjuje ili sprečava povezivanje polipeptida sa identičnim polipeptidom kako bi se formirao homodimer. Modifikacija koja promoviše heterodimerizaciju koja se ovde koristi posebno obuhvata odvojene modifikacije napravljene za svaki od dva polipeptida koji su poželjni za formiranje dimera, pri čemu su modifikacije komplementarne jedni drugima, kako bi se promovisalo povezivanje dva polipeptida. Na primer, promena koja promoviše heterodimerizaciju može promeniti strukturu ili punjenje jednog ili oba polipeptida koji su željeni da formiraju dimer, kako bi njihovo povezivanje bilo prostorno ili elektrostatički povoljno. Heterodimerizacija se javlja između dva neidentična polipeptida, kao što su dva teška lanca imunoglobulina, pri čemu dalji imunokonjugatni sastojci spojeni sa svakim od teških lanaca (npr. IL-2 polipeptid) nisu isti. U imunokonjugatima predmetnog pronalaska, modifikacija koja promoviše heterodimerizaciju je u teškim lancima, posebno u domenu Fc, molekula imunoglobulina. U nekim izvođenjima modifikacija koja promoviše heterodimerizaciju uključuje aminokiselinsku mutaciju, posebno supstituciju aminokiselina. U posebnom primeru izvođenja, modifikacija koja promoviše heterodimerizaciju sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, konkretno aminokiselinsku supstituciju, u svakom od dva teška lanca imunoglobulina.
Termin „Efektorske funkcije” kada se koristi u odnosu na antitela ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); antitelo-zavisnu ćelijsku fagocitozu; sekreciju citokina, nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
„Aktivirajući Fc receptor” je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc regiona antitela izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku ćeliju da izvede efektorske funkcije. Aktivirajući Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89).
U smislu ovog dokumenta, pojmovi „inženjer, projektovano, inženjering„” smatra se da uključuju bilo kakvu manipulaciju peptidne osnove ili post-translacijskih modifikacija prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog obrasca ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.
Kako se ovde koristi, termin „imunokonjugat” se odnosi na polipeptidni molekul koji uključuje bar jedan IL-2 deo i najmanje jedan antigen-vezujući deo. U određenim primerima izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jedan IL-2 deo, a najmanje dve antigen vezujuće komponente. Posebni imunokonjugati prema predmetnom pronalasku u suštini se sastoje od jednog dela IL-2 i dva antigen vezujuće komponente spojene jednom ili više linkerskih sekvenci. Antigen vezujuća komponenta može biti spojena sa IL-2 delom različitim interakcijama i u različitim konfiguracijama kao što je ovde opisano.
U smislu ovog dokumenta, termin „kontrolni antigen vezujući deo” odnosi se na antigen vezujuću komponentu onako kako bi postojao bez drugih antigen vezujućih komponenti i komponenti efektora. Na primer, kada se porede jedan Fab-IL2-Fab imunokonjugat kao što je opisano u ovom dokumentu s kontrolnim antigen vezujućom komponentom, kontrolna antigen vezujuća komponenta je slobodan Fab, pri čemu se Fab-IL2-Fab imunokonjugat i slobodni Fab molekul mogu i specifično vezati za istu determinantu antigena.
Kao što je ovde korišćeno, termini „prvi” i „drugi” u odnosu na antigen vezujuće komponente, itd., koriste se radi pravljenja razlike kada postoji više od jedn vezujuće komponente. Upotreba ovih pojmova nije namenjena da daju određeni red ili orijentaciju imunokonjugata, osim ako to nije eksplicitno navedeno.
„Efikasna količina” agensa odnosi se na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koji se primenjuje.
„Terapeutski efikasna količina” agensa, npr. farmaceutske kompozicija, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agnesa na primer eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizira ili sprečava štetne efekte bolesti.
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Poželjno, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Termin „farmaceutska kompozicija” odnosi se na preparat, koji je u takvom obliku da omogućuje da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njemu nalazi bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome bi se kompozicija primenjivala.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač„” upućuje na sastojak farmaceutske kompozicije koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Kao što je ovde upotrebljeno, „lečenje” (i gramatičke varijacije, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali se ne ograničavaju na, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim izvođenjima, ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Detaljan opis primera izvođenja
Predmetni pronalazak ima za cilj obezbeđivanje mutantnog IL-2 polipeptida koji ima poboljšana svojstva za imunoterapiju. Konkretno, pronalazak ima za cilj uklanjanje farmakoloških osobina IL-2 koje doprinose toksičnosti, ali nisu neophodni za efikasnost IL-2. Kao što je prethodno rečeno, različiti oblici receptora IL-2 sastoje se od različitih podjedinica i pokazuju različite afinitete za IL-2. IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta , koji se sastoji od ß i γ receptorskih podjedinica, izražava se na efektorskim ćelijama u mirovanju i dovoljan je za signalizaciju IL-2. IL-2 receptor visokog afiniteta, dodatno čini α-podjedinica receptora, uglavnom izražena na regulatornim T (T reg) ćelijama, kao i na aktiviranim efektornim ćelijama u kojoj njen angažman od strane IL-2 može promovirati T reg ćelijom posredovanu imunosupresiju, odnosno aktivacijom izazvanu ćelijsku smrt (AICD). Tako, bez želje da se vezuje sa teorijom, smanjenje ili ukidanje afiniteta IL-2 na α-podjedinicu receptora IL-2 treba da smanji IL-2 indukovanu negativnu regulaciju efektorske ćelijske funkcije pomoću regulatornih T ćelija i razvoj tumorske tolerancije prema procesu AICD. Sa druge strane, održavanje afiniteta prema receptoru IL-2 intermedijarnog afiniteta treba da sačuva indukciju proliferacije i aktivaciju efektorskih ćelija poput NK i T ćelija pomoću IL-2.
Nekoliko IL-2 mutanata već postoji u struci, međutim, pronalazači su pronašli nove mutacije aminokiselina IL-2 polipeptida i njihove kombinacije koje su posebno pogodne za dodeljivanje IL-2 željenih karakteristika za imunoterapiju.
Predmetni pronalazak obezbeđuje mutantni interleukin-2 (IL-2) polipeptid koji sadrži mutaciju aminokiseline koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na αpodjedinicu IL-2 receptora i čuva afinitet mutantnog IL- 2 polipeptida za IL-2 receptora intermedijernog afiniteta, svaki u poređenju sa nemutiranim IL-2 polipeptidom. Mutanti humanog IL-2 (hIL-2) sa smanjenim afinitetom prema CD25 mogu na primer biti generisani aminokiselinskom supstitucijom na poziciji aminokiselina 35, 38, 42, 43, 45 ili 72 ili njihovih kombinacija. Primerne aminokiselinske supstitucije uključuju K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. Pojedini IL-2 mutanti opisani ovde obuhvataju mutaciju na poziciji aminokiselina koja odgovara ostatku 42, 45 ili 72 humanog IL-2 ili njihovoj kombinaciji. Ovi mutanti pokazuju suštinski sličan vezujući afinitet za IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta i imaju značajno smanjeni afinitet na α-podjedinicu receptora IL-2 i IL-2 receptora visokog afiniteta u poređenju sa oblikom nemutiranog IL-2 Druge karakteristike korisnih mutanata mogu uključivatii sposobnost indukcije proliferacije T i/ili NK receptorskih ćelija IL-2, sposobnost induciranja signalizacije IL-2 u IL-2 receptorima T i/ili NK ćelija, sposobnost da generišu interferon (IFN) -γ kao sekundarni citokin od NK ćelija, smanjenu sposobnost da indukuju izradu sekundarnih citokina – posebno IL-10 i TNF-α – mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMCs), smanjenu sposobnost aktiviranja regulatornih T ćelije, smanjena sposobnost indukcije apoptoze u T ćelijama i smanjeni profil toksičnosti in vivo.
U jednom primeru izvođenja, prema predmetnom pronalasku, aminokiselinska mutacija koja ukida ili smanjuje afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na IL-2 receptor visokog afiniteta i čuva afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na IL- 2 receptor intermedijarnog afiniteta je na poziciji koja odgovara ostatku 72 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je izabrana iz grupe L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U konkretnijem primeru izvođenja, navedena aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija L72G.
U određenom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje mutantni IL-2 polipeptid koji sadrži prvu i drugu aminokiselinsku mutaciju koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu receptora IL-2 i čuva afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na IL-2 receptora intermedijarnog afiniteta. U jednom primeru izvođenja, pomenuta prva aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta prva aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuta prva aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina izabrana iz grupe L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U još konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je L72G. Navedena druga mutacija aminokiselina je u drugačijem položaju od pomenute prve mutacije aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, navedena druga aminokiselinska mutacija je u poziciji izabranoj od položaja koji odgovara ostatku 35, 38, 42, 43 i 45 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta druga aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. U konkretnom primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je izabrana iz grupe K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U posebnom primeru izvođenja, navedena druga aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 ili 45 humanog IL-2. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuta druga aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina, izabrana iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuta druga aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija F42A ili Y45A. U posebnom izvođenju pomenuta druga mutacija aminokiselina je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuta druga aminokiselinska mutacija je zamena aminokiselina, izabrana iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R i F42K. U konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je F42A. U drugom izvođenju pomenuta druga mutacija aminokiselina je na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2. U konkretnijem primeru izvođenja, pomenuta druga aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina, odabrana iz grupe Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je Y45A. U određenim primerima izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid sadrži treću aminokiselinsku mutaciju koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu receptora IL-2 i čuva afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta, svaki u poređenju sa polipeptidom IL-2 nemutiranog tipa. Navedena treća aminokiselinska mutacija je u drugačijem položaju od pomenute prve i druge aminokiselinske mutacije. U jednom primeru izvođenja, pomenuta treća aminokiselinska mutacija je u poziciji izabranoj od položaja koji odgovara ostatku 35, 38, 42, 43 i 45 humanog IL-2. U poželjnom izvođenju pomenuta treća aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 ili 45 humanog IL-2. U jednom izvođenju pomenuta treća aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U sledećem primeru izvođenja, pomenuta treća aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta treća aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. U konkretnom primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je izabrana iz grupe K35E, K35A, R38A, R38E, R38N, R38F, R38S, R38L, R38G, R38Y, R38W, F42L, F42A, F42G, F42S, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, K43E, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je odabrana iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D , Y45R i Y45K. U još konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je F42A ili Y45A. U jednom primeru izvođenja, pomenuta supstitucija aminokiselina je F42A. U sledećem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je Y45A. U određenim izvođenjima mutantni IL-2 polipeptid ne sadrži aminokiselinsku mutaciju na poziciji koja odgovara ostatku 38 humanog IL-2.
U još posebnijem aspektu pronalaska obezbeđen je mutantni IL-2 polipeptid koji sadrži tri aminokiselinske mutacije koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na αpodjedinicu IL-2 receptora, ali čuvaju afinitet mutantnog IL-2 polipeptida do IL-2 receptora intermedijarnog afiniteta. U jednom primeru izvođenja, pomenute tri mutacije aminokiselina su na pozicijama koje odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenute tri mutacije aminokiselina su supstitucije aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, pomenute tri aminokiselinske mutacije su supstitucije aminokiselina izabrane iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N , Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U konkretnom primeru izvođenja, pomenute tri mutacije aminokiselina su supstitucije aminokiselina F42A, Y45A i L72G.
U određenim primerima izvođenja pomenuta mutacija aminokiselina smanjuje afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu IL-2 receptora za najmanje 5 puta, konkretno najmanje 10 puta, još konkretnije najmanje 25 puta. U izvođenjima u kojima postoji više od jedne aminokiseline mutacije koja smanjuje afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu IL-2 receptora, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet mutantnog IL- 2 polipeptida na α-podjedinicu receptora IL-2 najmanje 30 puta, najmanje 50 puta ili čak najmanje 100 puta. U jednom primeru izvođenja, pomenuta mutacija aminokiselina ili kombinacija aminokiselinskih mutacija ukida afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu IL-2 receptora, tako da se vezivanje ne detektuje površinskom plazmonskom rezonancom kako je ovde opisano.
Suštinski slično vezivanje za receptor intermedijarnog afiniteta, odnosno očuvanje afiniteta mutantnog IL-2 polipeptida prema navedenom receptoru, postiže se kada mutant IL-2 pokazuje više od oko 70% afiniteta oblika nemutiranog tipa mutanta IL-2 do IL-2 receptora sa intermedijarnim afinitetom. IL-2 mutanti, kao što je ovde opisano, mogu prikazati više od oko 80%, pa čak i više od oko 90% takvog afiniteta.
Pronalazači su otkrili da smanjenje afiniteta IL-2 za α-podjedinicu receptora IL-2 u kombinaciji sa eliminacijom O-glikozilacije IL-2 dovodi do proteina IL-2 sa poboljšanim svojstvima. Na primer, eliminacija lokacije O-glikozilacije dovodi do homogenijeg proizvodu kada je mutirani IL-2 polipeptid eksprimiran u ćelijama sisara kao što su CHO ili HEK ćelije.
Prema tome, u određenim primerima izvođenja mutantni IL-2 polipeptid opisan ovde sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta dodatna mutacija aminokiselina koja eliminiše mesto O-glikozilacije IL-2 na poziciji koja odgovara ostatku 3 humanog IL-2 je supstitucija aminokiselina. Primerne zamene aminokiselina uključuju T3A, T3G, T3Q, T3E, T3N, T3D, T3R, T3K i T3P. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuta dodatna aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija T3A.
u određenim primerima izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid je u suštini molekul IL-2 pune dužine. u određenim primerima izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid je humani IL-2 molekul. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1 sa najmanje jednom aminokiselinskom mutacijom koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu receptora IL-2, ali zadržava afinitet mutiranog IL-2 polipeptida prema IL-2 receptoru intermedijarnog afiniteta, u poređenju sa IL-2 polipeptidom koji sadrži SEQ ID NO: 1 bez navedene mutacije. U sledećem primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 3 sa najmanje jednom aminokiselinskom mutacijom koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu IL-2 receptora, ali zadržava afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na IL-2 receptor intermedijarnog afiniteta u odnosu na IL-2 polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 3 bez navedene mutacije.
U konkretnom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid može izazvati jedan ili više ćelijskih odgovora izabranih iz grupe koja se sastoji od: proliferacije u aktiviranoj T limfocitnoj ćeliji, diferencijacije u aktiviranoj T limfocitnoj ćeliji, citotoksične T ćelije (CTL) , proliferaciju u aktiviranoj B ćeliji, diferencijaciju aktiviranoj B ćeliji, proliferaciju u ćeliji prirodnog ubice (NK), diferencijaciju u NK ćeliji, sekreciju citokina aktiviranom T ćelijom ili NK ćelijom i NK/limfocitnim aktiviranim ubicama ( LAK) antitumorne citotoksičnosti.
U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid ima smanjenu sposobnost da indukuje IL-2 signalizaciju u regulatornim T ćelijama, u poređenju sa IL-2 polipeptidom nemutiranog tipa. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid indukuje smrt ćelije izazvane manjom aktivacijom (AICD) u T ćelijama, u poređenju sa IL-2 polipeptidom nemutiranog tipa. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid ima smanjen profil toksičnosti in vivo, u poređenju sa IL-2 polipeptidom nemutiranog tipa. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid ima produženi polu-život u serumu, u poređenju sa IL-2 polipeptidom nemutiranog tipa.
Specifični mutantni IL-2 polipeptid koji se ovde opisuje sadrži četiri aminokiselinske supstitucije na pozicijama koje odgovaraju ostacima 3, 42, 45 i 72 humanog IL-2. Specifične aminokiselinske supstitucije su T3A, F42A, Y45A i L72G. Kao što je prikazano u priloženim primerima, pomenuti četvorostruki mutantni IL-2 polipeptid ne pokazuje uočljivo vezivanje za CD25, smanjuje sposobnost indukcije apoptoze u T ćelijama, smanjuje sposobnost indukcije IL-2 signalizacije u T reg ćelijama i smanjen profil toksičnosti in vivo . Međutim, zadržava sposobnost da aktivira signalizaciju IL-2 u efektornim ćelijama, indukuje proliferaciju efektorskih ćelija i da generiše IFN-γ kao sekundarni citokin NK ćelija.
Pored toga, pomenuti mutantni IL-2 polipeptid poseduje dodatna pogodna svojstva, kao što je smanjena površinska hidrofobnost, dobra stabilnost i dobar rezultat eksprimiranja, kako je opisano u Primerima. Neočekivano, pomenuti mutantni IL-2 polipeptid takođe pruža produženi polu-život u serumu, u poređenju sa polipetidom IL-2 divljeg tipa.
IL-2 mutanti kao što je ovde opisano, pored mutacija u regionu IL-2 koji formira interfejs IL-2 sa CD25 ili lokalitetom glikozilacije, takođe može imati jednu ili više mutacija u sekvenci aminokiselina izvan ovih regiona . Takve dodatne mutacije u humani IL-2 mogu pružiti dodatne prednosti kao što su povećana ekspresija ili stabilnost. Na primer, cistein na poziciji 125 može se zameniti neutralnom aminokiselinom kao što su serin, alanin, treonin ili valin, čime se dobijaju C125S IL-2, C125A IL-2, C125T IL-2 ili C125V IL-2, kako je opisano u američkom patentu br.
4,518,584. Kao što je opisano u njemu, može se takođe izbrisati N-terminalni alaninski ostatak IL-2 koji daje takve mutante kao des1 C125S ili des1 C125A. Alternativno ili kao dopuna, mutant IL-2 može uključivati mutaciju u kojoj se metionin koji se obično javlja na položaju 104 humanog IL-2 nemutiranog tipa zamenjuje neutralnom aminokiselinom kao što je alanin (videti U.S. Patent no.5,206,344). Dobijeni mutanti, npr. des1 M104A IL-2, des1 M104A C125S IL-2, M104A IL-2, M104A C125A IL-2, des1 M104A C125A IL-2 ili M104A C125S IL-2 (ovi i drugi mutanti mogu se naći u US patentu broj 5,116,943 iu Weiger et al., Eur J Biochem 180, 295-300 (1989)) mogu se koristiti zajedno sa određenim mutacijama IL-2 kao što je ovde opisano.
Prema tome, u određenim izvođenjima mutantni IL-2 polipeptid opisan ovde sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju na poziciji koja odgovara ostatku 125 humanog IL-2. U jednom izvođenju pomenuta dodatna aminokiselinska mutacija je aminokiselinska supstitucija C125A.
Stručna osoba će moći da odredi koje dodatne mutacije mogu pružiti dodatne prednosti u svrhu pronalaska. Na primer, on će ceniti te mutacije aminokiselina u sekvenci IL-2 koja smanjuje ili ukida afinitet IL-2 do IL-2 receptora intermedijarnog afiniteta, kao što su D20T, N88R ili Q126D (videti npr. US 2007/0036752 ), možda nisu pogodni za uključivanje u mutantni IL-2 polipeptid koji je ovde opisan.
U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid opisan ovde sadrži sekvencu izabranu iz grupe SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 19. U konkretnom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid opisan ovde sadrži sekvencu SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19. U još specifičnijem obliku, mutantni IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19.
Mutantni IL-2 polipeptidi, kao što je ovde opisano, posebno su korisni u kontekstu fuzionih proteina IL-2, kao što su imunokonjugati koji nose IL-2. Takvi fuzioni proteini sadrže mutantni IL-2 polipeptid kao što je ovde opisano spojeno sa ne-IL-2 delom. Deo koji nije IL-2 može biti sintetički ili prirodni protein ili njegov deo ili varijanta. Primeri komponenata bez IL-2 uključuju albumin ili domene antitela, kao što su Fc domeni ili domeni imunosklobulina koji vezuju antigen.
IL-2 koji imaju imunokonjugate su fuzioni proteini koji sadrže antigen vezujući deo i deo IL-2. Oni značajno povećavaju efikasnost terapije IL-2 direktnim usmeravanjem IL-2, npr. u tumorsko mikrookruženje. Prema predmetnom pronalasku, deo za vezivanje antigena može biti celo antitelo ili imunoglobulin ili njegov deo ili varijanta koja ima biološku funkciju kao što je specifični antigen vezujući afinitet.
Pogodnosti imunokonjugatne terapije su očigledne. Na primer, antigen vezujući deo imunokonjugata prepoznaje tumorski specifični epitop i rezultira ciljanjem imunokonjugatnog molekula na mesto tumora. Prema tome, visoke koncentracije IL-2 mogu biti isporučene u mikrookruženju tumora, što rezultira aktivacijom i proliferacijom različitih imunih efektorskih ćelija koje su ovde navedene, koristeći mnogo nižu dozu imunokonjugata nego što bi bilo potrebno za nekonjugirani IL-2. Štaviše, pošto primena IL-2 u obliku imunokonjugata dozvoljava niže doze samog citokina, potencijal za neželjene efekte IL-2 je ograničen i ciljanje IL-2 na određenim mestom u telu pomoću imunokonjugata takođe može dovesti do smanjenja sistemske ekspozicije i time do manje neželjenih efekata nego što se dobija sa nekonjugovanim IL-2. Osim toga, povećani poluživot cirkulacije imunokonjugata u poređenju sa nekonjugiranim IL-2 doprinosi efikasnosti imunokonjugata. Međutim, ova karakteristika imunokonjugata IL-2 može ponovo pogoršati potencijalne neželjene efekte molekula IL-2: Zbog značajno dužeg cirkulišućeg poluživota imunokonjugata IL-2 u krvotoku u odnosu na nekonjugirani IL-2, povećana je verovatnoća da IL-2 ili drugi delovi molekula fuzionog proteina aktiviraju komponente koje su obično prisutne u vaskulaturi. Ista zabrinutost odnosi se na druge fuzione proteine koji sadrže IL-2 spojeni sa drugim delom kao što je Fc ili albumin, što rezultira produženim poluživotom IL-2 u cirkulaciji. Zbog toga je posebno pogodan imunokonjugat koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid kao što je ovde opisano, sa smanjenom toksičnošću u poređenju sa oblicima nemutiranih IL-2.
Shodno tome, pronalazak dalje daje mutantni IL-2 polipeptid kao što je prethodno opisano, vezan za najmanje jedan ne-IL-2 ostatak. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid i ne-IL-2 deo formiraju fuzioni protein, tj. mutantni IL-2 polipeptid deli peptidnu vezu sa ne-IL-2 delom. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid je povezan sa prvim i drugim ne-IL-2 odelom. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid deli amino-ili karboksiterminalnu peptidnu vezu sa prvim delom za vezivanje antigena, a drugi deo za vezivanje antigena deli peptidnu vezu amino ili karboksi terminala sa ili i) mutantnim IL- 2 polipeptidom ili ii) prvog antigen vezujućeg dela . U konkretnom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa pomenutim prvim ne-IL-2 delom i aminokontrolnom peptidnom vezom sa pomenutom drugim ne-IL-2 ostatkom. U jednom primeru izvođenja, pomenuti deo koji nije IL-2 je ciljni deo. U posebnom primeru izvođenja, pomenuti deo koji nije IL-2 predstavlja deo za vezivanje antigena (na taj način formira imunokonjugat sa mutantnim IL-2 polipeptidom, kako je detaljnije opisano u daljem tekstu). U određenim aspektima, antigen vezujući deo je antitelo ili fragment antitela. U jednom primeru izvođenja, antigen vezujući deo je antitelo u punoj dužini. U jednom primeru izvođenja, antigen vezujući deo je molekul imunoglobulina, naročito molekul imunoglobulina IgG klase, posebno molekul imunoglobulina potklase IgG 1. U jednom takvom obliku, mutantni IL-2 polipeptid deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa jednim od teških lanaca imunoglobulina. U sledećem primeru izvođenja, antigen vezujući deo je fragment antitela. U nekim primerima izvođenja, navedeni antigen vezujući deo sadrži domen antigenskog vezivanja antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U konkretnijem primeru izvođenja, antigen vezujući deo je molekula Fab ili scFv molekul. U posebnom primeru izvođenja, antigen vezujući deo je molekula Fab. U sledećem primeru izvođenja, antigen vezujući deo je scFv molekul. U jednom primeru izvođenja, pomenuti deo za vezivanje antigena je usmeren na antigen predstavljen na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorskih ćelija. U poželjnom primeru izvođenja pomenuti antigen je izabran iz grupe fibroblast aktivacijskih proteina (FAP), A1 domena tenascin-C (TNC A1), A2 domena tenascin-C (TNC A2), dodatnog domena B od fibronektina ( EDB), karcinoembrionskog antigena (CEA) i proteoglikana hondroitin sulfata u vezi sa melanomom (MCSP). Kada je mutantni IL-2 polipeptid povezan sa više od jednog antigen vezujućeg dela, npr. prvog i drugog vezujućeg antigena, svaki vezujući antigen može biti nezavisno izabran iz različitih oblika antitela i fragmenata antitela. Na primer, prvi antigen vezujući deo može biti Fab molekula, a drugi antigen vezujući deo može biti scFv molekula. U konkretnom primeru izvođenja, svaki je od pomenutih prvih i pomenutih drugih antigen vezujućih komponenti scFv molekul ili je svaki od pomenutih prvih i pomenutih drugih antigenskih vezova molekul Fab. U određenom izvođenju svaki je od pomenutih prvih i pomenutih drugih antigen vezujućih komponenti Fab molekul. Takođe, gde je mutantni IL-2 polipeptid vezan za više antigen vezujućih komponenti, npr. sa prvom i drugom antigen vezujućom komponentom, antigen za koji se svaki od antigen vezujućih komponenti usmeri može biti nezavisno odabrana. U jednom primeru izvođenja, pomenuta prva i druga antigen vezujuća komponenta usmerene su na različite antigene. U sledećem primeru izvođenja, pomenuta prva i druga antigen vezujuća komponenta usmerene su na na isti antigen. Kao što je prethodno opisano, antigen je posebno antigen predstavljen na tumorskoj ćeliji ili u okruženju tumorskih ćelija, a posebno antigen izabran iz grupe fibroblast aktivacijskih proteina (FAP), A1 domen Tenascin-C (TNC A1), A2 domena Tenascin-C (TNC A2), dodatni domen B fibronektina (EDB), karcinoembrionski antigen (CEA) i hondrotinsulfatni proteoglikan u vezi s melanomom (MCSP). Region za vezivanje antigena može dodatno uključiti bilo koju od osobina, pojedinačno ili u kombinaciji, opisanih ovde u odnosu na antigen vezujuće domene imunokonjugata.
Imunokonjugati
U određenom aspektu pronalazak obezbeđuje imunokonjugat koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje ukidaju ili smanjuju afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu receptora IL-2 i čuva afinitet mutiranog polipeptida IL-2 do receptora IL-2 intermedijarnog afiniteta i najmanje jednog antigen vezujućeg dela. U jednom primeru izvođenja opisanom ovde, aminokiselinska mutacija koja ukida ili smanjuje afinitet mutiranog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu receptora IL-2 i čuva afinitet mutiranog IL-2 polipeptida naIL-2 receptor intermedijarnog afiniteta je na poziciji izabranoj od položaja koji odgovara ostatku 42, 45 i 72 ljudskog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenuta aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, navedena aminokiselinska mutacija je zamena aminokiselina izabrana iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N , Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K, konkretno supstitucija aminokiselina odabrana iz grupe F42A, Y45A i L72G. U jednom primeru izvođenja, mutacija aminokiseline je na položaju koji odgovara ostatku 42 humanog IL-2. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuta mutacija aminokiselina je zamena aminokiselina odabrana iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R i F42. U konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je F42A. U sledećem primeru izvođenja, mutacija aminokiselina je na položaju koji odgovara ostatku 45 humanog IL-2. U konkretnom primeru izvođenja, navedena aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina izabrana iz grupe Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E, Y45N, Y45D, Y45R i Y45K. U konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je Y45A. U još jednom izvođenju, aminokiselinska mutacija je na položaju koji odgovara ostatku 72 humanog IL-2. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuta mutacija aminokiselina je zamena aminokiselina izabrana iz grupe L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72E, L72N, L72D, L72R i L72K. U još konkretnijem primeru izvođenja, navedena supstitucija aminokiselina je L72G. U određenim izvođenjima, mutantni IL-2 polipeptid koji je ovde opisan ne sadrži mutaciju aminokiselina na poziciji koja odgovara ostatku 38 humanog IL-2. U posebnom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid koji se sdrži u ovde opisanom imunokonjugatu, sadrži najmanje prvu i drugu aminokiselinsku mutaciju koja ukida ili smanjuje afinitet mutantnog IL-2 polipeptida na α-podjedinicu IL-2 receptora i čuva afinitet mutiranog IL-2 polipeptida do IL-2 receptora intermedijarnog afiniteta. U jednom primeru izvođenja, pomenute prve i druge mutacije aminokiselina su na dva položaja izabrana iz položaja koji odgovaraju ostatku 42, 45 i 72 humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, pomenute prve i druge mutacije aminokiselina su supstitucije aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, navedene prve i druge mutacije aminokiselina su supstitucije aminokiselina izabrane iz grupe F42A, F42G, F42S, F42T, F42Q, F42E, F42N, F42D, F42R, F42K, Y45A, Y45G, Y45S, Y45T, Y45Q, Y45E , Y45N, Y45D, Y45R, Y45K, L72G, L72A, L72S, L72T, L72Q, L72Q, L72N, L72N, L72D, L72R i L72K. U posebnom primeru izvođenja, pomenute prve i druge mutacije aminokiselina su supstitucije aminokiselina odabrane iz grupe F42A, Y45A i L72G. Mutantni IL-2 polipeptid može dodatno ujediniti bilo koju od osobina, pojedinačno ili u kombinaciji, opisan u prethodnim paragrafima u odnosu na mutantne IL-2 polipeptide pronalaska. U jednom primeru izvođenja, pomenuti mutantni IL-2 polipeptid deli amino-ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa pomenutim antigen vezujućim delom koji se sadrži u imunokonjugatu, tj. Imunokonjugat je fuzioni protein. U određenim primerima izvođenja, pomenuti antigen vezujući deo je antitelo ili fragment antitela. U nekim primerima izvođenja, navedeni antigen vezujući deo sadrži domen antigenskog vezivanja antitela koji sadrži varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. Region za vezivanje antigena može uključiti bilo koju od osobina, pojedinačno ili u kombinaciji, opisanu ovde ili iznad u odnosu na antigen vezujuće domene.
Formati imunokonjugata
Posebno pogodni imunokonjugatni formati su opisani u publikaciji PCT br. WO 2011/020783. Ovi imunokonjugati sadrže najmanje dva antigena vezujuća domena. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, imunokonjugat prema sadašnjem pronalasku sadrži najmanje prvi mutantni IL-2 polipeptid kao što je ovde opisano, i najmanje prvi i drugi antigen vezujući deo. U posebnom primeru izvođenja, pomenuti prvi i drugi antigen vezujući deo su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od Fv molekula, posebno scFv molekule i molekula Fab. U konkretnom primeru izvođenja, navedeni prvi mutantni IL-2 polipeptid deli amino-ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa pomenutim prvim antigen vezujućim delom i navedeni drugi antigen vezujući deo deli amino ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa ili i) prvim mutantnim IL-2 polipeptidom ili ii) prvim antigen vezujućim delom. U posebnom primeru izvođenja, imunokonjugat se sastoji prvenstveno od prvog mutantnog polipeptida IL-2 i prve i druge aantigen vezujuće komponente, povezanih jednom ili više linker sekvenci. Ovakvi formati imaju prednost da se vezuju sa visokim afinitetom prema ciljnom antigenu (kao što je tumorski antigen), ali samo sa monomernim vezivanjem na IL-2 receptor, čime se izbjegava ciljanje imunokonjugata na imune ćelije koje sadrže receptor IL-2 na lokacijama različitim od ciljne lokacije. U posebnom primeru izvođenja, prvi mutantni IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim delom za vezivanje antigena i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim antigen vezujućim delom. U sledećem primeru izvođenja, prvi antigen vezujući deo deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim mutantnim IL-2 polipeptidom, a dalje deli aminokontrolnu peptidnu vezu sa drugim antigen vezujućim delom. U sledećem primeru izvođenja, prvi antigen vezujući deo deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa prvim mutantnim IL-2 polipeptidom, a dalje deli karboksi-terminalni peptid sa drugim antigen vezujućim delom. U posebnom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim varijabilnim regionom teškog lanca i dalje deli aminoterminalnu vezu peptida sa drugim varijabilnim regionom teškog lanca. U sledećem primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom prvog laka lanca i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim varijabilnim regionom lakog lanca. U sledećem primeru izvođenja, prvi varijabilni region teškog ili lakog lanca spojen je karboksi-terminalnom peptidnom vezom sa prvim mutantnim IL-2 polipeptidom i dalje se povezuje aminokontrolnom peptidnom vezom sa drugim varijabilnim regionom teškog ili lakog lanca. U sledećem primeru izvođenja, prvi varijabilni region teškog ili lakog lanca spojen je aminoterminalnom peptidnom vezom sa prvim mutantnim IL-2 polipeptidom i dalje se povezuje karboksi-terminalnom peptidnom vezom sa drugim varijabilnim regionom teškog ili lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvim Fab težim ili lakim lancem i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab težim ili lakim lancem. U još jednom izvođenju, prvi Fab teški ili laki lanac deli peptidnu vezu karboksiterminala sa prvim mutantnim IL-2 polipeptidom i dalje deli amino-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim ili lakim lancem Fab. U drugim izvođenjima, prvi Fab teški ili laki lanac deli peptidnu vezu amino-terminalne grupe sa prvim mutantnim IL-2 polipeptidom i dalje deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim teškim ili lakim lancem Fab. U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži barem prvi mutantni IL-2 polipeptid koji deli amino-terminalnu vezu peptida sa jednim ili više scFv molekula i dalje deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa jednim ili više molekula scFv.
Ostali posebno pogodni imunokonjugatni formati sadrže molekul imunoglobulina kao deo za vezivanje antigena. U jednom takvom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jedan mutantni IL-2 polipeptid kao što je ovde opisano i molekul imunoglobulina, naročito IgG molekul, posebno molekul IgG 1. U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži ne više od jednog mutiranog IL-2 polipeptida. U posebnom primeru izvođenja, antitelo je humano. U jednom primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid deli amino-ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa molekulom imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat se u suštini sastoji od mutantnog IL-2 polipeptida i molekula imunoglobulina, naročito IgG molekula, a posebno molekula IgG 1, spojenog sa jednom ili više linker sekvenci. U konkretnijem primeru izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid je spojen na amino-terminalnoj aminokiselini na karboksi-terminalnu aminokiselinu jednog od teških lanaca imunoglobulina. U određenim primerima izvođenja, molekul imunoglobulina u Fc domenu sadrži modifikaciju, koja promoviše heterodimerizaciju dva neidentčna teška lanca imunoglobulina. Mesto najobimnije proteinsko-proteinske interakcije između dva polipeptidna lanca humanog IgG Fc domena nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Prema tome, u jednom izvođenju pomenuta modifikacija je u domenu CH3 domena Fc. U konkretnom primeru izvođenja, pomenuta modifikacija je modifikacija čvore u otvoru, koja sadrži modifikaciju čvora u jednom od teških lanaca imunoglobulina i modifikaciju otvora u drugom od teških lanaca imunoglobulina. Tehnologija „knob-in-hole” je opisana npr. U SAD-u 5.731.168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Uopšteno govoreći, metoda podrazumeva uvođenje protuberance (čvor) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine (“otvora”) u interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može postaviti u šupljinu da biu se unapredilo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Protuberance su načinjene zamenommalih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida sa većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujući otvori iste ili slične veličine kao protuberance stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjima (npr., alanin ili treonin). Protuberancija i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju ili sintezom peptida. U specifičnom aspektu modifikacija čvora sadrži aminokiselinsku supstituciju T366W u jednom od dva teška lanca imunoglobulina, a modifikacija otvora sadrži aminokiselinske supstitucije T366S, L368A i Y407V u drugom od dva teška lanca imunoglobulina. U daljem specifičnom izvođenju, teški lanac imunoglobulina koji sadrži modifikaciju čvora dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju S354C, a teški lanac imunoglobulina koji sadrži modifikaciju otvora dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju Y349C. Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dva teška lanca, što dodatno ojačava dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
U određenoj realizaciji mutantni IL-2 polipeptid je spojen sa karboksi-terminalnom aminokiselinom teškog lanca imunoglobulina koji sadrži modifikaciju čvora.
U alternativnom izvođenju modifikacija koja pomaže heterodimerizaciju dva neidentična polipeptidna lanca sadrži posredne modifikacione elektrostatičke efekte upravljanja, na primer kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Generalno, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dva polipeptidna lanca sa napunjenim aminokiselinskim ostacima, tako da formacija homodimera postaje elektrostatički nepovoljna ali heterodimerizacija je elektrostatički povoljna.
Fc domen daje imunokonjugatu povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dugotrajni poluživot u serumu koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom odnosu distribucije tkivo- krv. Istovremeno, može dovesti do nepoželjnog ciljanja imunokonjugata na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, koaktivacija Fc receptorskih puteva signalizacije može dovesti do otpuštanja citokina koje, u kombinaciji sa IL-2 polipeptidom i dugim poluživotom imunokonjugata, dovodi do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata na sistemsku primenu. U skladu s tim, opisani su konvencionalni IgG-IL-2 imunokonjugati koji su povezani sa reakcijama infuzije (videti npr. King et al., J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004)).
Shodno tome, u nekim izvođenjima molekul imunoglobulina koji se sastoji u imunokonjugatu koji je ovde opisan, projektovan je da ima smanjen vezujući afinitet na Fc receptor. U jednom takvom izvođenju, imunoglobulin u svom Fc domenu sadrži jednu ili više mutacija aminokiselina koje smanjuje afinitet vezivanja imunokonjugata na Fc receptor. Tipično, ta ista ili više aminokiselinskih mutacija su prisutne u svakom od dva teška lanca imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, navedena aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja imunokonjugata prema Fc receptoru za najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U izvođenjima gde postoji više od jedne aminokiseline mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja imunokonjugata na Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena na Fc receptor za najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat koji sadrži projektovan molekul imunoglobulina pokazuje manje od 20%, naročito manje od 10%, posebno manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa imunokonjugatom koji sadrži neprojektovani molekul imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, Fc receptor je aktivni Fc receptor. U konkretnijem primeru izvođenja, Fc receptor je Fcγ receptor, konkretnije i FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa receptor. Poželjno, vezivanje za svaki od ovih receptora je smanjeno. U nekim izvođenjima afinitet vezivanja na komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q, takođe je smanjen. U jednom primeru izvođenja, afinitet vezivanja na neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja imunoglobulina prema navedenom receptoru, postiže se kada imunoglobulin (ili imunokonjugat koji sadrži navedeni imunoglobulin) ima više od oko 70% veznog afiniteta neprojektovanog oblika imunoglobulina (ili imunokonjugata koji sadrži pomenuti neprojektovani oblik imunoglobulina) na FcRn. Imunoglobulini ili imunokonjugati koji sadrže pomenute imunoglobuline mogu da imaju više od oko 80% i čak i više od oko 90% takvog afiniteta. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska mutacija je supstitucija aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, imunoglobulin sadrži aminokiselinsku supstituciju na položaju P329 teškog lanca imunoglobulina (Kabat numeriranje).
U konkretnijem primeru izvođenja, supstitucija aminokiselina je P329A ili P329G, naročito P329G. U jednom primeru izvođenja, imunoglobulin sadrži dodatnu aminokiselinsku supstituciju na poziciji izabranoj od S228, E233, L234, L235, N297 i P331 teškog lanca imunoglobulina. U konkretnijem primeru izvođenja, dalja supstitucija aminokiselina je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U posebnom primeru izvođenja, imunoglobulin obuhvata aminokiselinske supstitucije na pozicijama P329, L234 i L235 teškog lanca imunoglobulina. U posebnom primeru izvođenja, imunoglobulin obuhvata mutacije aminokiselina L234A, L235A i P329G (LALA P329G). Ova kombinacija aminokiselinskih supstitucija gotovo u potpunosti ukida vezivanje Fcγ receptora na humani IgG molekul i time smanjuje efektorsku funkciju, uključujući citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC).
U određenim primerima izvođenja, imunokonjugat sadrži jedno ili više proteolitičkih mesta cepanja koji se nalaze između mutantnog IL-2 polipeptida i antigen vezujućih komponenti.
Komponente imunokonjugata (npr.antigen vezujuće komponente i/ili mutantni IL-2 polipeptid) mogu biti direktno vezani preko različitih linkera, posebno peptidnih linkera koji sadrže jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2-20 aminokiselina, koji su ovde opisani ili su poznati u struci. Pogodno, neimunogeni linker peptidi uključuju, na primer, (G4S)n, (SG4)n ili G4(SG4)n peptide veznike, pri čemu je n obično broj između 1 i 10, po pravilu između 2 i 4.
Antigen vezujuće komponente
Antigen vezujuća komponenta ovdeopisanog imunokonjugata, obično je polipeptidni molekul koji se vezuje za specifičnu antigensku determinantu i sposoban je za usmeravanje entiteta za koji je vezan (npr . mutantni IL-2 polipeptid ili druga antigen vezujuća komponenta) na ciljnoj lokaciji, na primer, za određeni tip tumorske ćelije ili strome tumora koje nose antigenu determinantu. Imunokonjugat se može vezati za antigene determinante koje se, na primer, nalaze na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, slobodnih u krvnom serumu i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM).
Neograničavajući primeri tumorskih antigena uključuju MAGE, MART-1/Melan, gp100, Dipeptidil peptidasu IV (DPPIV), adenozin deaminazu vezujući protein (ADAbp), ciklofilin b, kolorektalni povezani antigen (CRC) -C017-1A/GA733, karcinoembrionski antigen (CEA) i njegovi imunogeni epitopi CAP-1 i CAP-2, etv6, aml1, prostata specifični antigen (PSA) i njegovi imunogeni epitopi PSA-1, PSA-2 i PSA-3, prostata-specifični membranski antigen (PSMA), receptor T ćelijar/CD3-zeta lanac, MAGE-porodica tumorskih antigena (npr.MAGE-A1, MAGEA2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), GAGE-familija tumorskih antigena (npr. GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE -6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirozinaza, p53, MUC familija, HER2/neu, p21ras, RCAS1 , α-fetoprotein, E-kaderin, α-catenin, β-catenin i γ-catenin, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, adenomatozni polipozni koli protein (APC), fodrin, Connexin 37, Ig-idiotype, p15, gp75, GM2 i GD2 gangliozidi, virusni proizvodi kao što su proteini humanog papiloma virusa, Smad porodica tumorskih antigena, lmp-1, P1A, EBV-kodirani nuklearni antigen (EBNA) -1, glikogen fosforilaza za mozak , SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX- SSX-5, SCP-1 i CT-7 i c-erbB-2.
Neograničavajući primeri virusnih antigena uključuju hemaglutinin virusa influence, Epstein-Barr virus LMP-1, hepatitis C virus E2 glikoprotein, HIV gp160 i HIV gp120.
Neograničavajući primeri ECM antigena uključuju sindekan, heparanazu, integrine, osteopontin, vezu, kaderine, laminin, laminin tip EGF, lektin, fibronektin, izrez, tenascin i matriksin.
Ovde opisani imunokonjugati mogu se vezati za sledeće specifične neograničavajuće primere antigena površine ćelija: FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2 (T-ćelijski površinski antigen), CD3 (heteromultimer povezan sa TCR), CD22 (B-ćelijski receptor), CD23 (IgE receptor niskog afiniteta), CD30 (citokinski receptor) CD33 (površinski antigen mieloidnih ćelija), CD40 (receptor faktora nekroze tumora), IL-6R (IL6 receptor), CD20, MCSP i PDGFβR (β receptor trombocitnog faktora rasta).
U jednom primeru izvođenja, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dva ili više vezujućih antigena, gde se svaki od ovih antigen vezujućih komponenti specifično vezuje za istu antigensku determinantu. U još jednom izvođenju, ovde opisani imunokonjugat sadrži dve ili više antigen vezujućih komponenti, pri čemu se svaki od ovih antigen vezujućih komponenti, specifično vezuje za različite antigenske determinante.
Antigen vezujuće komponente mogu biti bilo koji tip antitela ili njegovog fragmenta koji zadržava specifično vezivanje za antigensku determinantu. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, VH fragmente, VL fragmete, Fab fragmente, F(ab’)2 fragmente, scFv fragmente, Fv fragmentie minitela, dijatela, trijatela i tetratela (videti, npr. Hudson i Souriau, Nature Med 9, 129134 (2003)).
Posebno pogodni delovi za vezivanje antigena su opisani u publikaciji PCT br. WO 2011/020783.
U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jednu, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje su specifične za dodatni domen B fibronektina (EDB). U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži najmanje najmanje jednu, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom L19 za vezivanje za epitop EDB. Videti, npr. Publikaciju PCT WO 2007/128563 A1. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu pri čemu prvi Fab teški lanac izveden iz El9 monoklonskog antitela deli peptidnu vezu karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem izvedenim iz L19 monoklonalnog antitela. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi Fab laki lanac izveden iz L19 monoklonskog antitela delikarboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem izvedenim iz L19 monoklonalnog antitela. U daljem primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi scFv izveden iz L19 monoklonalnog antitela deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim scFv izvedenim iz L19 monoklonalnog antitela.
U konkretnijem primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 199 ili njenu varijantu koja zadržava funkcionalnost. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži Fab laki lanac izveden iz L19 monoklonskog antitela. U konkretnijem primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 201 ili njenu varijantu koja zadržava funkcionalnost. U još jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 199 i SEQ ID NO: 201 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugom konkretnom primeru izvođenja, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.
U jednom primeru izvođenja, ovde opisani imunokonjugat sadrži najmanje jednu, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje su specifične za A1 domen tenaskina (TNC-A1). U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži nnajmanje jednu, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje mogu da se takmiče sa monoklonskim antitelom F16 za vezivanje na epitop TNC1. Videti, npr. PCT Publication WO 2007/128563 A1. U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jednu, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje su specifične za A1 i/ili domen A4 tenaskina (TNC1 ili TNC4 ili TNC1/A4). U jdrugom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu gde prvi Fab teški lanac specifičan za domen A1 Tenaskina deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem specifičnim za A1 domen Tenaskina. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi Fab laki lanac specifičan za domen A1 Tenaskina deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem specifičnim za A1 domen Tenaskina. U daljem primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi scFv specifičan za domen A1 Tenaskina deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim scFv specifičnim za A1 domen Tenascina. U drugom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj teški lanac imunoglobulina koji je specifičan za TNC1 deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom.
U konkretnom primeru izvođenja, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 35 ili njihovim varijantama koji zadržavaju funkcionalnost. U drugom konkretnom primeru izvođenja, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 31 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U konkretnijem primeru izvođenja, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100 % identična SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 35 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 31 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U drugom konkretnom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 34 ili SEQ ID NO: 36. U još konkretnijem primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom ili SEQ ID NO: 34 ili SEQ ID NO: 36. U drugoj specifičnoj realizaciji, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 32. U još jednoj specifičnoj realizaciji, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 32.
U konkretnom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 203 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 205 ili SEQ ID NO: 215 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednom specifičnom izvođenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 207 ili SEQ ID NO: 237 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 205 i SEQ ID NO: 207 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 215 i SEQ ID NO: 237 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U konkretnom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 204. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 204. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NE: 206 ili SEQ ID NO: 216. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 206 ili SEQ ID NO: 216. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NE: 208 ili SEQ ID NO: 238. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 208 ili SEQ ID NO: 238.
U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, obično dve ili više antigena vezujuće komponente koje su specifične za A2 domen Tenaskina (TNC2). U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi Fab teški lanac specifičan za domen A2 Tenaskina deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa IL-mutantom IL-2 polipeptida, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem specifičnim za A2 domen Tenaskina. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi Fab lak lanac specifičan za domen A2 Tenaskina deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem specifičnim za A2 domen Tenaskina. U drugom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj teški lanac imunoglobulina koji je specifičan za TNC-A2 deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom.
U konkretnom primeru izvođenja,antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179 , SEQ ID NO: 183 i SEQ ID NO: 187 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 i SEQ ID NO: 185 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 183 and SEQ ID NO: 187 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 181 i SEQ ID NO: 185 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U drugom konkretnom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata kodirana je polipeptidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 i SEQ ID NO: 188. U još jednom specifičnom rešenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 184 i SEQ ID NO: 188. U drugom konkretnom primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata kodirana je polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 i SEQ ID NO: 186. U još jednom specifičnom rešenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata kodirana je polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 182 i SEQ ID NO: 186.
U konkretnom primeru izvođenja, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 i SEQ ID NO: 245 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 i SEQ ID NO: 251 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična odabranoj sekvenci iz grupe SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243 i SEQ ID NO: 245 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci odabranoj iz grupe SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 249 i SEQ ID NO: 251 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 241 i ili SEQ ID NO: 249 ili SEQ ID NO: 251 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednom specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 243 i ili SEQ ID NO: 247 ili SEQ ID NO: 249 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 245 i SEQ ID NO: 247 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U konkretnom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična odabranoj sekvenci iz grupe SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 i SEQ ID NO: 246. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 244 i SEQ ID NO: 246. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 i SEQ ID NO: 252. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 250 i SEQ ID NO: 252.
U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jednu, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje su specifične za fibroblastom aktivirani protein (FAP). U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu gde prvi Fab teški lanac specifičan za FAP deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem specifičnim za FAP. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj prvi Fab laki lanac specifičan za FAP deli karboksi-terminalnu vezu peptida sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem specifičnim za FAP. U drugom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj teški lanac imunoglobulina koji je specifičan za FAP deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom.
U konkretnom primeru izvođenja,antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 i SEQ ID NO: 155 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 153 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 151 i SEQ ID NO: 155 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 149 i SEQ ID NO: 153 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U jednom rešenju, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže teški lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 41 i laki lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 39. U jednom rešenju, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže teški lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 51 i laki lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 49. U jednom rešenju, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže teški lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 111 i laki lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 109. U jednom rešenju, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže teški lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 143 i laki lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 141. U jednom rešenju, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže teški lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 151 i laki lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 149.
U drugoj specifičnoj realizaciji sekvenca varijabilnog regiona teškog lancaantigen vezujućih komponenti imunokonjugata kodirana je polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152, i SEQ ID NO: 156. U još jednom specifičnom rešenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata kodirana je polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 152 i SEQ ID NO: 156. U drugoj specifičnoj realizaciji sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata kodirana je polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 i SEQ ID NO: 154. U još jednom specifičnom rešenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujućih komponenti imunokonjugata kodirana je polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine: SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 150 i SEQ ID NO: 154.
U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 i SEQ ID NO: 229 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednom specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična odabranoj sekvenci iz grupe SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 235 i SEQ ID NO: 239 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 211 ili SEQ ID NO: 219 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 233 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 227 i SEQ ID NO: 229 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu što je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnih SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 213 i SEQ ID NO: 235 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 217 i SEQ ID NO: 239 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 219 i SEQ ID NO: 233 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 221 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 223 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 225 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 227 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 229 i SEQ ID NO: 231 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. :U daljem specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži dve polipeptidne sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične SEQ ID NO: 211 i SEQ ID NO: 233 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 301 i SEQ ID NO: 315 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U još jednom specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična odabranoj sekvenci iz grupe SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 303 i SEQ ID NO: 317 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 297 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 299 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 233 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 301 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 303 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je bar oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 231 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost. U još jednom specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 315 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 317 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 233 ili njegonoj varijanti koja zadržava funkcionalnost.
U drugom rešenju, imunokonjugat se sastoji od polipeptidne sekvence kodirane polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvencama izabranim iz grupe SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 i SEQ ID NO: 230. U jednom rešenju, imunokonjugat se sastoji od polipeptidne sekvence kodirane polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 228 i SEQ ID NO: 230. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 i SEQ ID NO: 240. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 236 i SEQ ID NO: 240.
U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 i SEQ ID NO: 316. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 302 i SEQ ID NO: 316. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 i SEQ ID NO: 318. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 304 i SEQ ID NO: 318.
U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jedan, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje su specifični za hondrotin-sulfatni proteoglikan u vezi s melanomom (MCSP). U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu pri čemu prvi Fab teški lanac specifičan za MCSP deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem specifičnim za MCSP. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu pri čemu prvi Fab laki lanac specifičan za MCSP deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa IL-2 molekulom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab lakim lancem specifičnim za MCSP. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu pri čemu je teški lanac imunoglobulina specifičan za MCSP deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom.
U konkretnom primeru izvođenja, komponente za vezivanje antigena imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 189 ili SEQ ID NO: 193 ili njihovih varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, antigen vezujući delovi imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 191 ili SEQ ID NO: 197 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže niz varijabilnog regiona teškog lanca koji je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100 % identične sekvenci ili SEQ ID NO: 189 ili SEQ ID NO: 193 ili njihovih varijanti koji zadržavaju funkcionalnost i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sekvenci bilo koji SEQ ID NO: 191 ili SEQ ID NO: 197 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže niz varijabilnog regiona teškog lanca koji je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100 % identične sekvenci SEQ ID NO: 189, i varijabilnog regiona lakog lanca koji je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 191. U drugoj specifičnoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan sekvenci SEQ ID NO: 193 i sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična u sekvencu SEQ ID NO: 191.
U drugoj specifičnoj realizaciji sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata kodirana je polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 190 ili SEQ ID NO: 194. U još konkretnijem primeru izvođenja, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 190 ili SEQ ID NO: 194. U drugoj specifičnoj realizaciji, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 192 ili SEQ ID NO: 198. U još jednom specifičnom izvođenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom ili SEQ ID NO: 192 ili SEQ ID NO: 198.
U konkretnom primeru izvođenja, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 253 ili SEQ ID NO: 257 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 255 ili SEQ ID NO: 261 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 253 ili SEQ ID NO: 257 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100 % identična SEQ ID NO: 255 ili SEQ ID NO: 261 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 253 ili njihovim varijantama koji zadržavaju funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 255 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 257 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 255 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost.
Kod drugog namenskog izvođenja, imunokonjugat se sastoji od polipeptidne sekvence koja je kodirana polinukleotidnom sekvencoma koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 254 ili SEQ ID NO: 258. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 254 ili SEQ ID NO: 258. Kod drugog namenskog izvođenja, imunokonjugat se sastoji od polipeptidne sekvence koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 256 ilir SEQ ID NO: 262. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 256 ili SEQ ID NO: 262.
U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži najmanje jednu, tipično dve ili više antigen vezujućih komponenti koje su specifične za karcinoembrionski antigen (CEA).
U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu gde prvi Fab teški lanac specifičan za CEA deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem specifičnim za CEA. U još jednom izvođenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu gde prvi Fab teški lanac specifičan za CEA deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa mutantnim IL-2 polipeptidom, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa drugim Fab teškim lancem specifičnim za CEA. U jednom primeru izvođenja, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu u kojoj teški lanac imunoglobulina koji je specifičan za CEA deli peptidnu vezu karboksi-terminala sa mutantnim IL-2 polipeptidom. U konkretnom primeru izvođenja, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 313 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost. U drugoj specifičnoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 311 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, antigen vezujuće komponente imunokonjugata sadrže sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100 % identična sekvenci SEQ ID NO: 313 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 311 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost.
U drugoj specifičnoj realizaciji sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 314. U još jednom specifičnom rešenju, sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana sa polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 314. U drugoj specifičnoj realizaciji, sekvenca varijabilnog regiona antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 312. U još jednom specifičnom izvođenju, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca antigen vezujuće komponente imunokonjugata je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 312.
U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID br: 319 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost. U još jednom specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 321 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost. U još jednom specifičnom rešenju, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 323 ili njihovim varijantama koje zadržavaju funkcionalnost. U specifičnijoj realizaciji, ovdeopisani imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 319 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 321 ili njenoj varijanti koja zadržava zadržava funkcionalnost i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 323 ili njenoj varijanti koja zadržava funkcionalnost.
U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 320. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 320. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 322. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 322. U drugoj specifičnoj realizaciji, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci SEQ ID NO: 324. U još jednom specifičnom rešenju, imunokonjugat sadrži polipeptidnu sekvencu koja je kodirana polinukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 324.
Ovdeopisane antigen vezujuće komponente uključuju one koji imaju sekvence koje su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične peptidnim sekvencama navedenim u SEQ ID NOs 23-261 (neparni brojevi), 297-303 (neparni brojevi), 311 i 313, uključujući funkcionalne fragmente ili njihove varijante. Predmetni pronalazak obuhvata i antigen vezujuće komponente koje sadrže sekvence SEQ ID NOs 23-261 (neparni brojevi), 297-303 (neparni brojevi), 311 i 313 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
Polinukleotidi
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid kao što je ovde opisano.
Ovdeopisani polinukleotidi uključuju one koji su najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identični sekvencama navedenim u SEQ ID NOs 2, 4 , 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 24-262 (parni brojevi), 293-296 i 298-324 (parni brojevi), uključujući funkcionalne fragmente ili njihove varijante.
Polinukleotidi koji kodiraju mutantne IL-2 polipeptide koji nisu povezani sa ne-IL-2 komponentama generalno su izraženi kao jedan polinukleotid koji kodira celi polipeptid.
U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira mutantni IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira mutantnu IL-2 sekvencu SEQ ID NO: 7, 11, 15 ili 19. Predmetni pronalazak obuhvata i izolovani polinukleotid koji kodira mutantni IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira mutantni IL-2 polipeptid od SEQ ID NO: 7, 11, 15 ili 19 sa konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira mutantni IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296. U još jednom izvođenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira mutantni IL-2 polipeptid, pri čemu polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci izabranoj iz grupe SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz grupe SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295 i SEQ ID NO: 296.
Polinukleotidi koji kodiraju imunokonjugate kao što je ovde opisano mogu biti eksprimirani kao pojedinačni polinukleotidi koji kodiraju celokupni imunokonjugat ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotidi koji su koeksprimovani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimovani mogu se povezati putem, na primer, disulfidne veze ili drugih sredstava za stvaranje funkcionalnog imunokonjugata. Na primer, deo teškog lanca antigen vezujuće komponente može biti kodiran odvojenim polinukleotidom od dela imunokonjugata koji sadrži deo lakog lanca antigen vezujućee komponente i mutiranog IL-2 polipeptida. Kad su koeksprimovani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca kako bi formirali antigen vezujuću komponentu. Alternativno, u drugom primeru, deo lakog lanca antigen vezujuće komponente može biti kodiran zasebnim polinukleotidom iz dela imunokonjugata koji sadrži deo teškog lanca antigen vezujućee komponente i mutiranog IL-2 polipeptida. U jednom primeru izvođenja, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira fragment imunokonjugata koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid i antigen vezujuću komponentu. U jednom primeru izvođenja, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira teški lanac antigen vezujuće komponente i mutantni IL-2 polipeptid. U drugom izvođenju, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira laki lanac antigen vezujuće komponente i mutantni IL-2 polipeptid.
U konkretnom primeru izvođenja, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira fragment imunokonjugata koji sadrži najmanje jedan mutantni IL-2 polipeptid, a najmanje jedan, poželjno dve ili više antigen vezujuće komponente, pri čemu prvi mutantni IL-2 polipeptid deli aminoterminalnu ili karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa prvom antigen vezujućom komponentom i drugom antigen vezujućom komponentom koja deli peptidnu vezu amino ili karboksi-terminala sa prvim mutantnim IL-2 polipeptidom ili prvom antigen vezujućom komponentom. U jednom primeru izvođenja, antigen vezujuće komponente su nezavisno odabrane iz grupe koja se sastoji od molekula Fv, naročito scFv molekula i molekula Fab. U drugom specifičnom izvođenju, polinukleotid kodira teške lance dve antigen vezujuće komponente i jednog mutantnog IL-2 polipeptida. U drugom specifičnom izvođenju, polinukleotid kodira lake lance dve antigen vezujuće komponente i jedan mutantni IL-2 polipeptid. U drugoj specifičnoj realizaciji, polinukleotid kodira jedan laki lanac jedneantigen vezujuće komponente, jednog teškog lanca druge antigen vezujućee komponente i jednog mutantnog IL-2 polipeptida.
U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira teške lance dva Fab molekula i mutantni IL-2 polipeptid. U drugoj specifičnoj realizaciji, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira lake lance dva Fab molekula i mutantni IL-2 polipeptid. U još jednom specifičnom izvođenju, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira teški lanac jednog molekula Faba, laki lanac drugog Fab molekula i mutantnog IL-2 polipeptida.
U jednom primeru izvođenja, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira imunokonjugat koji sadrži najmanje jedan mutantni IL-2 polipeptid, spojen preko svojih amino i karboksi terminalne aminokiseline za jedan ili više molekula scFv.
U jednom primeru izvođenja, ovdeopisani izolovani polinukleotid kodira fragment imunokonjugata, pri čemu polinukleotid kodira teški lanac molekula imunoglobulina, naročito IgG molekula, a naročito molekula IgG1 i mutantnog IL-2 polipeptida. U konkretnijem primeru izvođenja, izolovani polinukleotid kodira teški lanac molekula imunoglobulina i mutantnog IL-2 polipeptida, pri čemu mutantni IL-2 polipeptid deli jednu amino-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem imunoglobulina.
U još jednom izvođenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 ili 313. U još jednom izvođenju, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 ili 323. U još jednom izvođenju, predmetni pronalazak se dalje usmerava na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 % ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 ili 324. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazane u SEQ ID NO: 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 298, 300, 302, 304, 312, 314, 316, 318, 320, 322 ili 324. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvencu varijabilnog regiona koja je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96% , 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 ili 313 . U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97 %, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 ili 323 . Predmetni pronalazak obuhvata izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira sekvence varijabilnog regiona SEQ ID NO: 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 231, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 311 ili 313 sa konzervativnim supstitucijama aminokiselina. Predmetni pronalazak obuhvata i izolovani polinukleotid koji kodira ovdeopisani imunokonjugat ili njegov fragment, pri čemu polinukleotid sadrži sekvencu koja kodira polipeptidne sekvence SEQ ID NO: 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 297, 299, 301, 303, 315, 317, 319, 321 ili 323 sa konzervativnim supstitucijama aminokiselina.
U određenim primerima izvođenja, polinukleotid ili nukleinska kiselina jeste DNK. U drugim izvođenjima, ovdeopisani polinukleotid je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNA). Ovdeopisana RNK može biti jednolančana ili dvolančana.
Rekombinantni postupci
Mutantni IL-2 polipeptidi, kao što je ovde opisano, mogu se pripremiti brisanjem, zamenom, umetanjem ili modifikacijom koristeći genetičke ili hemijske postupke dobro poznate u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem. U tom pogledu, nukleotidnu sekvencu nativnog IL-2 opisali su Taniguchi et al. (Nature 302, 305-10 (1983)) i nukleinska kiselina koja kodira humani IL-2 dostupna u javnim depozitorijumima, kao što je American Type Culture Collection (Rockville MD). Sekvenca nativnog humanog IL-2 je prikazana u SEQ ID NO: 1. Zamena ili ubacivanje može uključivatii prirodne i veštački dobijene ostatke aminokiselina. Modifikacija aminokiseline uključuje poznate postupke hemijske modifikacije, kao što je dodavanje mesta glikozilacije ili ugljovodoničnih dodataka i slično.
Mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati, kao što je ovde opisano, mogu se dobiti, na primer, putem sinteze peptida na čvrstoj podlozi ili rekombinantne proizvodnje. Za rekombinantnu proizvodnju jednog ili više polinukleotida koji kodiraju pomenuti mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat (fragment), npr. kao što je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran korišćenjem konvencionalnih procedura. U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više ovdeopisanih polinukleotida. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata (fragment), uz odgovarajuće signale transkripcione/translacione kontrole. Ti postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Pogledajte, na primer, tehnike opisane u Maniatis et al., M<OLECULAR>C<LONING>: A L<ABORATORY>M<ANUAL>, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel et al., C<URRENT>P<ROTOCOLS>I<N>M<OLECULAR>B<IOLOGY>, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Vektor ekspresije može biti deo plazmida, virusa ili može biti fragment nukleinske kiseline. Vektor ekspresije uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji kodira IL-2 mutant ili imunokonjugat (fragment) (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region” je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona transliranih u aminokiseline. Iako „stop kodon” (TAG, TGA ili TAA) nije transliran u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslirani regioni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru ili i odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Štaviše, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region ili može da sadrži dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona, npr. ovdeopisani vektor može da kodira jedan poliprotein ili više poliproteina, koji su posttranslaciono ili kotranslaciono razdvojeni u krajnji protein putem proteolitičkog sečenja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina kao što je ovde opisano, mogu kodirati heterologne kodirajuće regione sjedinjene ili nesjedinjene sa prvim ili drugim polinukleotidima koji kodiraju ovdeopisane polipeptide, njegovu varijantu ili derivat. Heterologni kodirajući regioni uključuju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Funkcionalna asocijacija se odvija kada se kodirajući region proizvodnje gena, npr. polipeptida, poveže sa jednom regulatornom sekvencom ili više regulatornih sekvenci tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (regulatornih sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) „funkcionalno su asocirani” ukoliko indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne utiče na sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci za usmeravanje ekspresije genskog proizvoda ili na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga, region promotera bi se funkcionalno asocirao sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je promoter sposoban za sprovođenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude promoter određen ćelijom koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu se funkcionalno asocirati sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koji kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnjacima za ovu oblast. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, a funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intron-A), virusa 40 viših primata (npr. rani promoter) i retrovirusa (kao što je, npr: Raus sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i βglobin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnjacima za ovu oblast. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elementi integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).
Ovdeopisani kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne polinukleotide, kao što je opisano u ovom dokumentu. Na primer, ako je poželjna sekrecija mutantnog IL-2 polipeptida, DNK koja kodira signalnu sekvencu može se postaviti uzvodno od nukleinske kiseline koja kodira zrele aminokiseline mutantnog IL-2. Isto važi za imunokonjugate opisane ovde ili njihove fragmente. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz lanca proteina rasta širom endoplazmatičnog retikuluma. Osobe sa uobičajenim znanjem u struci svesne su da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka imaju signalni peptid sjedinjen za N-kraj polipeptida, koji je isečen iz transliranog polipeptida radi proizvodnje sekretornog ili „zrelog” oblika peptida. Na primer, ljudski IL-2 je transliran sa 20 amino-kiselinskih signalnih sekvenci na N-terminusu polipeptida, koji se kasnije odvaja kako bi se proizvele zrele, 133 aminokiseline humanog IL-2. U određenim izvođenjima, izvorni signalni peptid, npr. koristi se IL-2 signalni peptid ili teški lanac imunoglobulina ili laki lanac signalnog peptida ili funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja polipeptida s kojim je funkcionalno asocirana. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, nemutirana vodeća sekvenca može se zameniti vodećom sekvencom humanog tkivnog aktivatora plazminogena (TPA) ili β-glukuronidaze miša. Primeri aminokiselinske i polinukleotidne sekvence sekretornih signalnih peptida prikazane su u SEQ ID NO 236-273.
DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju IL-2 mutanta ili imunokonjugata može biti uključena unutar ili na krajevima IL-2 mutanta ili imunokonjugata (fragmenta) kodiranih polinukleotidom.
U sledećem primeru izvođenja, obezbeđena je ovdeopisana ćelija domaćin koja sadrži jedan takav polinukleotid ili više njih. U određenim primerima izvođenja, obezbeđena je ovdeopisana ćelija domaćin koja sadrži jedan takav vektor ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima i vektorima, datim redom. U jednom konkretnom izvođenju takvog primera, ćelija domaćina sadrži (npr. prethodno je transformirana ili transfektovana) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptid. Kao što je korišćen ovde, termin „ćelija domaćin” odnosi se na bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi ovdeopisane mutantne IL-2 polipeptide ili imunokonjugate ili njihove fragmente. Ćelije domaćini koje imaju sposobnost replikacije i podržavanja ekspresije mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transfektovane ili transduktovane u skladu sa određenim vektorom ekspresije, a velike količine vektora koji sadrže ćelije mogu se uzgajati za rasejavanje velikih fermentera za dobijanje dovoljnih količina IL-2 mutanta ili imunokonjugata za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do proizvodnje polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409–1414 (2004) i Li et al., Nat Biotech 24, 210–215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanog) polipeptida, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr. US Patent br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere upotrebe ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linije iz bubrega majmuna transformirane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije iz bubrega (ćelije 293 ili 293T, kao što je opisano u npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), sertoli ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano u npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije burega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što je opisano u npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Druge primere upotrebe ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dihidropteroate reduktaze CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, videti, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sačinjene od transgenih životinja, transgenih biljaka ili gajenog biljnog ili životinjskog tkiva. U jednom primeru izvođenja, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija).
U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju mutantni-IL-2 polipeptid spojene sa teškim ili lakim lancem antigen vezujućeg domena kao što je antitelo, može se projektovati tako da takođe eksprimiraju i druge lance antitela tako da eksprimirani proizvod fuzije mutantnog IL-2 antitelo koje ima teški i laki lanac.
U jednom primeru izvođenja, obezbeđena je metoda proizvodnje ovdeopisanog mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, pri čemu se metoda sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira mutirani IL-2 polipeptid ili imunokonjugat, kako je ovde predviđeno, u uslovima pogodnim za ekspresiju mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata i opciono obnavljanje mutiranog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata iz ćelije domaćina (ili medija za uzgoj ćelija domaćina).
U određenim ovdeopisanim primerima izvođenja, mutantni IL-2 polipeptid je povezan sa najmanje jednom ne-IL-2 komponentom. IL-2 mutant se može pripremiti tamo gde je mutantni IL-2 polipeptidni segment povezan sa jednim ili više molekula poput, polipeptida, proteina, ugljenih hidrata, lipida, nukleinske kiseline, polinukleotida ili molekula koji su kombinacije ovih molekula (npr. glikoproteini, glikolipidi, itd.). Mutantni IL-2 polipeptid takođe može biti vezan za organski deo, neorganski deo ili farmaceutski lek. U smislu ovog dokumenta, farmaceutski lek je organsko jedinjenje koje sadrži oko 5000 daltona ili manje. Mutantni IL-2 polipeptid takođe može biti povezan sa bilo kojim biološkim agensom uključujući terapeutska jedinjenja, kao što su antineoplastična sredstva, antimikrobiološka sredstva, hormoni, imunomodulatori, antiinflamatorna sredstva i slično. Uključeni su i radioizotopi poput onih koji su korisni za snimanje, kao i za terapiju.
Mutantni IL-2 polipeptid takođe može biti vezan za više molekula istog tipa ili za više vrsta molekula. U određenim izvođenjima, molekul koji je povezan sa IL-2 može preneti sposobnost usmeravanja IL-2 na specifična tkiva ili ćelije u životinji, a ovde se ovde pominje kao „komponenta za usmeravanje”. U ovim primerima izvođenjima, komponenta za usmeravanje može imati afinitet prema ligandu ili receptoru u ciljanom tkivu ili ćeliji, čime usmerava IL-2 na ciljano tkivo ili ćeliju. U određenom izvođenju komponenta za usmeravanje usmerava IL-2 na tumor. Komponente za usmeravanje obuhvataju, na primer, antigen vezujuće komponente (npr. antitela i njihove fragmente) specifične za ćelijsku površinu ili intracelularne proteine, ligande bioloških receptora i slično. Takve antigen vezujuće komponente mogu biti specifične za antigene povezane s tumorom, poput onih ovdeopisanih.
Mutantni IL-2 polipeptid može biti genetski spojen za drugi polipeptid, npr. antitelo sa jednim lancem,(deo) teškog ili lakog lanca antitela ili može biti hemijski konjugovan na drugi molekul. Fuzija mutantnog IL-2 polipeptida sa delom teškog lanca antitela opisana je u Primerima. IL-2 mutant koji je fuzija između mutantnog IL-2 polipeptida i drugog polipeptida može se dizajnirati tako da je sekvenca IL-2 spojena direktno na polipeptid ili indirektno pomoću linkerske sekvence. Kompozicija i dužina linkera može se odrediti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci i njihova se efikasnost može ispitati. Primer linkerske sekvence između IL-2 i teškog lanca antitela nalazi se u prikazanim sekvencama, npr. U SEQ ID NO 209, 211, 213, itd. Dodatne sekvence mogu se takođe uključiti radi pripajanja mesta sečenja za odvajanje pojedinačnih komponenti fuzije, ako je potrebno, na primer sekvencu prepoznavanja endopeptidaze. Pored toga, IL-2 mutant ili njegov fuzioni protein takođe mogu biti hemijski sintetizovani korišćenjem postupaka sinteze polipeptida, kao što je poznato u struci (npr. sinteza na Merifildovoj smoli). Mutantni IL-2 polipeptidi mogu biti hemijski konjugovani sa drugim molekulima, npr. drugim polipeptidom, koristeći poznate metode hemijske konjugacije. Za ovu svrhu mogu se koristiti bifunkcionalni reagensi za unakrsno povezivanje, kao što su homofunkcionalni i heterofunkcionalni reagensi za unakrsno povezivanje, dobro poznati u struci. Tip unakrsnog povezivanja reagensa koji se koristi zavisi od prirode molekula koji se spaja sa IL-2 i može se odmah identifikovati od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Alternativno, ili pored toga, mutirani IL-2 i/ili molekul koji je namenjen da bude konjugiran, može biti hemijski derivatiziran tako da se ova dva mogu konjugovati u odvojenoj reakciji, što je takođe dobro poznato u struci.
U određenim aspektima, mutantni IL-2 polipeptid je povezan sa jednom ili više antigen vezujućih komponenti (tj. delom imunokonjugata) koja sadrži najmanje varijabilni region antitela sposoban za vezivanje antigenske determinante. Varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu derivati antitela koja se nalaze ili ne nalaze u prirodi ili njihovi fragmenti. Postupci proizvodnje poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznate u struci (videti, npr. Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se nalaze u prirodi mogu se izgraditi pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patent br. 4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih kolekcija koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br. 5,969,108 McCafferty). Imunokonjugati, antigen vezujuće komponente i metode za proizvodnju istih takođe su detaljno opisane u publikaciji PCT br. WO 2011/020783
Bilo koja životinjska vrsta antitela, fragment antitela, antigen vezujući domen ili varijabilni region mogu se povezati sa mutantnim IL-2 polipeptidom. Neograničavajuća antitela, fragmenti antitela, antigen vezujući domenvi ili varijabilni regioni korisni u ovom pronalasku mogu biti murinskog, primatskog ili humanog porekla. Ako je /mutantni IL-2/konjugat antitela namenjen ljudskoj upotrebi, himerski oblik antitela može da se koristi ako su konstantni regioni antitela humani. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela takođe se može dobiti u skladu sa postupcima poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br.5,565,332 to Winter). Humanizacija se može postići različitim postupcima uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje samo nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR na humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkcija antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci kritični za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju” sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i postupci njihovog dobijanja razmotreni su u, npr. Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), a dodatno su opisani u, npr. Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent br.
5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (opis SDR (a-CDR) graftovanja); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opis „vraćanja na površinu”); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opis „FR mešanja”); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opis pristupa „usmerene selekcije” FR mešanju). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) and Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu derivati humanih monoklonskih antitela dobijenih metodom ćelija hibridoma (videti, npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigen (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz kolekcija humanizovanih faga (videti, npr., Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); and McCafferty et al., Nature 348, 552– 554; Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata ili kao Fab fragmenata. Detaljan opis pripreme antigen vezujuće komponente za imunokonjugate fagnim displejem može se naći u primerima priloženim u publikaciji PCT br. WO 2011/020783.
U određenim aspektima, antigen vezujuće komponente korisne u ovom pronalasku mogu biti projektovane da imaju poboljšan afinitet vezivanja prema, na primer, postupcima koje su objavljene u publikaciji PCT br. WO 2011/020783 (videti primere koji se odnose na sazrevanje afiniteta) ili US Pat. Appl. Publ.2004/0132066. Sposobnost ovdeopisanog imunokonjugata da se veže na specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću enzimskog imunosorbent testa (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci u struci, npr. površinska plazmonska rezonanca (ispitana na BIACORE T100 sistem) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) i tradicionalni test kompetitivnog vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela, fragmenata antitela, antigen vezujućeg domena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen, npr. aAntitelo koje se takmiči sa antitelom L19 za vezivanje na dodatni domen B fibronektina (EDB). U određenim primerima izvođenja, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilizovani antigen (npr. EDB) je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen (npr. antitelo L19) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual gl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Možda je poželjna dodatna hemijska modifikacija mutiranog IL-2 mutanta ili imunokonjugata koji je ovde opisan. Na primer, problemi imunogenosti i kratkog poluživota mogu se poboljšati konjugacijom na polimere ravnog lanca, kao što su polietilen-glikol (PEG) ili polipropilen-glikol (PPG) (videti npr. WO 87/00056).
IL-2 mutanti i imunokonjugati pripremljeni u skladu sa ovdenavedenim uputstvim mogu se pročistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, hromatografija na molekularnim sitima i slično. Stvarno stanje korišćeno za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupna naelektrisanost, hidrofobicitet, hidrofilicitet itd. i biće očigledno stručnjacima iz ove oblasti. Za afinitetnu hromatografiju kojom se prečišćava antitelo može se koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat vezuje. Na primer, može se koristiti antitelo koje specifično vezuje mutantni IL-2 polipeptid. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom ovdeopisanog imunokonjugata može se koristiti matrica sa proteinom A ili proteinom G. Na primer, afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i na molekularnim sitima mogu se koristiti za izolaciju imunokonjugata onako kako je opisano u Primerima. Prečišćenost mutantnih polipeptida IL-2 i njegovih fuzionih proteina može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju i slično. Na primer, teški lanac fuzionog proteina eksprimiran prema opisu u Primerima, gde je prikazan netaknut i pravilno povezan prema demonstraciji smanjivanjem SDS PAGE (videti Sliku 14). Dve dužine su rastvorene pri približno MR 25.000 i Mr 60.000, u skladu sa predviđenim molekularnim masama imunoglobulinskog lakog lanca i fuzionog proteina teškog lanca/IL-2.
Testovi
Ovdenavedeni mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
Testovi za merenje afiniteta
Afinitet mutantnog ili nemutiranog polipeptida IL-2 za različite oblike IL-2 receptora može se odrediti u skladu sa postupkom izloženim u Primerima putem: površinske plazmonske rezonance (SPR) pomoću standardnih instrumenata kao što su instrumenti BIAcore (GE Healthcare), a takve receptorske podjedinice se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom (videti, npr. Shanafeit et al., Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)). Rekombinantni heterodimer receptora IL-2 β/γ-podjedinice /može se dobiti fuzijom svake od podjedinica antitela u Fc domenu monomera modifikovanim pomoću tehnologije čvor u otvor (knobs-into-holes) (videti, npr. US Patent No. 5,731,168) radi promovisanja heterodimerizacije odgovarajuće podbjedinice receptora/Fc fuzionih proteina (videti SEQ ID NOs 102 i 103). Alternativno, afinitet vezivanja IL-2 mutanata za različite oblike IL-2 receptora može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju jedan ili drugi takav oblik receptora. Specifično ilustrativan i egzemplaran primer izvođenja za merenje vezivnog afiniteta nalazi se u daljem tekstu i u Primerima. Prema jednom izvođenju, KD se meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25° C sa IL-2 receptorima koji su imobilisani na CM5 čipovima. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid-hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Rekombinantni IL-2 receptor se razblaži sa 10 mM natrijum-acetatom, pH 5,5, do 0,5 μg/ml – 30 μg//ml pre injektiranja s brzinom protoka od 10 μl/min, da se dobije otprilike 200–1000 (za IL-2R α-podjedinicu) ili 500– 3000 (za IL-2R βγ otvor u čvor heterodimer) jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja IL-2 receptora, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neizreagovale grupe. Za kinetička merenja, u HBS-EP+(GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) ubrizgava se trostruki serijski rastvor mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata (raspon od ~ 0,3 nM do 300 nM) na 25° C pri protoku od oko 30 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol.293:865-881 (1999).
Vezivanje imunokonjugata kao što je ovde opisano za Fc receptore može se lako odrediti npr. ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) koristeći standardne instrumente kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili imunokonjugata koji sadrže Fc domen za Fc receptore mogu se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju Fcγllla receptor. Prema jednom izvođenju, K<D>se meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25° C sa Fc receptorima koji su imobilisani na CM5 čipovima. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Rekombinantni Fc receptor je razblažen 10 mM natrijum-acetata, pH 5,5, do 0,5 μg/ml – 30 μg/ml pre injektovanja pri stopi protoka od 10 μl/minutu da bi se dobilo oko 100–5000 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja Fc receptora, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neizreagovale grupe. /Za kinetička merenja, u HBS-EP+(GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) ubrizgava se torstruki do petostruki serijski rastvor imunokonjugata (raspon od ~ -0,01 nM do 300 nM) na 25° C pri protoku od oko 30 μl/min – 50 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® Evaluation Software verzija 1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999).
Testovi za merenje aktivnosti
Sposobnost mutantnog IL-2 da se veže na IL-2 receptore može se indirektno meriti ispitivanjem efekata imunološke aktivacije koja se javlja nizvodno od vezivanja receptora.
U jednom primeru izvođenja, dati su testovi za identifikaciju mutantnih IL-2 polipeptida koji imaju biološku aktivnost. Biološke aktivnosti mogu uključivati, na primer, sposobnost indukcije proliferacije T i/ili NK ćelija sa receptorima IL-2, sposobnost indukcije signalizacije IL-2 u IL-2 receptorskim T i/ili NK ćelijama, sposobnost da generišu interferon (IFN)-γ kao sekundarni citokin od NK ćelija, smanjenu sposobnost da indukuje izradu sekundarnih citokina, posebno IL-10 i TNF-α, mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMCs), smanjenu sposobnost indukcije apoptoze u T ćelijama, sposobnost indukcije regresije tumora i/ili poboljšanja preživljavanja i smanjenog profila toksičnosti, naročito smanjene vazopermeabilnosti, in vivo. Mutantni IL-2 polipeptidi koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su data.
U pojedinim otelotvorenjima, ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptid je ispitan na takvu biološku aktivnost. Raznovrsni postupci su dobro poznate u struci za određivanje bioloških aktivnosti IL-2, a detalji o mnogim od ovih postupaka otkriveni su u ovdepriloženim Primerima. Primeri pružaju odgovarajući test za ispitivanje ovdeopisanih mutantnih IL-2 i njihove sposobnosti da generišu IFN-γ NK ćelijama. Uzgojene NK ćelije se inkubiraju sa mutantnim IL-2 polipeptidom ili imunokonjugatima opisanim ovde, a koncentracija IFN-γ u medijumu za ćelijsku kulturu naknadno se meri pomoću testa ELISA.
Signalizacija indukovana IL-2 indukuje nekoliko signalnih puteva i uključuje JAK (Janus kinaza) i STAT (signalni transduktor i aktivator transkripcije) signalnih molekula. Interakcija IL-2 sa receptorskim β i γ podjedinicama dovodi do fosforilacije receptora i JAK1 i JAK3, koji su povezani sa β i γ podjedinicom, datim redosledom. STAT5 se zatim udružuje sa fosforiliranim receptorom i fosforiluje se na ključni ostatak tirozina. Ovo dovodi do disocijacije STAT5 iz receptora, dimerizacije STAT5 i prenosa STAT5 dimera na jezgro gde promoviše transkripciju ciljanih gena. Sposobnost mutantnih IL-2 polipeptida da indukuju signalizaciju putem receptora IL-2 mogu se tako proceniti, na primer, merenjem fosforilacije STAT5. Detalji ovog postupka su objavljeni u Primerima. PBMC se tretiraju mutantnim IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatima kako je ovde opisano, a nivoi fosforilisane STAT5 su određeni protočnom citometrijom.
Širenje T ćelija ili NK ćelija u odgovoru na IL-2 može se meriti inkubiranjem T ćelija ili NK ćelija izolovanih iz krvi sa mutantnim IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatiima kako je ovde opisano, nakon čega sledi određivanje sadržaja ATP u lizatima tretiranih ćelije. Pre lečenja, T ćelije mogu biti unapred stimulisane fitohemaglutininom (PHA-M). Ovaj test, opisan u Primerima, omogućava osetljivu kvantitativnost broja vitalnih ćelija, međutim postoje brojni odgovarajući alternativni testovi poznati u struci (npr. [<3>H]-timidin inkorporiranje testa, ćelijski titer Glo ATP test, Alamar Blue test, WST-1 test, MTT test).
Analiza za određivanje apoptoze T ćelija i AICD takođe je data u Primerima, gde T ćelije tretiraju antitelo koje indukuje apoptozu nakon inkubacije sa mutantnim IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatima koji su ovde opisani, a apoptične ćelije se kvantifikuju pomoću detekcije citometrijskog protoka izlaganjem fosfatidil serinu/aneksinu. Druge analize su poznate u struci.
Uticaji mutantnog IL-2 na rast i preživljavanje tumora mogu se procijeniti u različitim modelima tumora na životinjama poznatim u ovoj oblasti. Na primer, ksenografti humanih karcinoma ćelija raka mogu se implantirati na imunodeficijentne miševe i tretirati ovdeopisanim mutantnim IL-2 polipeptidima ili imunokonjugatima, kako je opisano u Primerima.
Toksičnost ovdeopisanih mutantnih IL-2 polipeptida i imunokonjugata in vivo može se odrediti na osnovu mortaliteta, zapažanja tokom života (vidljivi simptomi neželjenih efekata, npr. ponašanje, telesna težina, telesna temperatura) i kliničke i anatomske patologije (npr. merenje biohemijskih vrednosti u krvi i/ili histopatološke analize).
Vazopermeabilnost izazvana tretmanom IL-2 može se ispitati na životinjskom modelu predtretmana vazopermeabilnosti. Generalno, IL-2 mutant ili imunokonjugat koji je ovde opisan, primenjuje se na pogodne životinje, npr. na miševe, a kasnije se u životinjui ubrizgava reporterski molekul vaskularnog curenja čija diseminacija iz vaskulature odražava obim vaskularne permeabilnosti. Reporterski molekul vaskularnog curenja je poželjno dovoljno veliki da otkrije propusnost sa oblikom nemutiranog IL-2 koji se koristi za prethodni tretman. Primer reporterskog molekula vaskularnog curenja može biti serumski protein kao što je albumin ili imunoglobulin. Poželjno je da je reporterski molekul vaskularnog curenja označen kao radioizotop, kako bi se olakšalo kvantitativno određivanje distribucije u tkivu molekula. Vaskularna propustljivost se može meriti zakrvne sudove prisutne u bilo kojim od različitih unutrašnjih organa tela kao što su jetra, pluća i slično, kao i tumor, uključujući tumor koji se ksenograftuje. Pluća su preferirani organ za merenje vazopropustnosti mutantskih IL-2 punih dužine.
Kompozicije, formulacije i načini primene
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih mutantnih-IL-2 polipeptida, npr. za upotrebu u bilo kojoj od donjih terapeutskih postupaka. U posebnom primeru izvođenja, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata i farmaceutski prihvatljiv nosač. U sledećem primeru izvođenja, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Dodatno se daje postupak za proizvodnju mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata kao što je ovde opisano u obliku pogodnom za in vivo primenu, postupak koji sadrži (a) dobijanje mutiranog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata kao što je ovde opisano, i (b ) formulisanje mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu se za in vivo primenu formuliše preparat mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata.
Ovdeopisane farmaceutske kompozicije sadrže dovoljnu količinu jednog ili više mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata rastvorenih ili disperzovanih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekularne entitete i kompozicije koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama ili ljudima, po potrebi. Preparat farmaceutske kompozicije koja sadrži barem jedan mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat i, po potrebi, dodatni aktivni sastojak biće poznata stručnjacima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ed . Mack Printing Company, 1990. Pored toga, za primenu na životinjama (npr. ljudima), podrazumevaće se da preparati treba da ispune standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima FDA Kancelarije za biološke standarde ili odgovarajućeg autoriteta u drugim zemljama. Poželjne kompozicije su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Primeri kompozicija IL-2 opisani su u US patentima 4,604,377 i 4,766,106. U smislu ovog dokumenta, termin „farmaceutski prihvatljivi nosač” podrazumeva sve rastvarače, pufere, disperzione medije, premaze, surfaktante, antioksidante, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungicidne agense), izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije, soli, konzervanse, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijente, dezintegratore, lubrikante, zaslađivače, arome, boje, slične materijale i njihove kombinacije, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, str.1289-1329. Osim ako se ne ukaže da je neki od konvencionalnih nosača nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim kompozicijama je razmotrena.
Ova kompozicija može da sadrži različite vrste nosača u zavisnosti od toga da li treba da se primeni u čvrstom, tečnom ili u obliku aerosola i da li je potrebno da budu sterilni za takvu vrstu primene u obliku injekcije. Ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati (i sva dodatni lekovita sredstva) mogu se primenjivati intravenozno, intradermalno, intraarterijski, intraperitonealno, intralezioni, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intrasplenikalno, intrarenalno, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intravaginalno, intrarektalno, intratumoralno, intramuskularno, intraperitonealno, supkutano, supkonjuktivalno, intravezikularno, mukozalno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, topički, lokalno, inhalacijom (npr. inhalacija aerosola), injekcijama, infuzijom, neprekidnom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom ciljanih ćelija direktno putem katetera, ispiranja, u kremama, lipidnim kompozicijama (npr. lipozomima) ili drugom metodom ili kombinacijom prethodnonavedenog, kao što je poznato stručnjacima iz ove oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Parenteralna primena, posebno intravenozna injekcija, najčešće se koristi za primenu molekula polipeptida kao što su ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati.
Parenteralna kompozicija uključuje one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. U pogledu injekcija, ovdeopisani mutirani IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu biti formulisani kao vodeni rastvori, poželjno fiziološki kompatibilni puferi, kao što su Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može da sadrži agense za formuliranje, kao što su agensi suspenzije, stabilizacije i/ili disperzije. Umesto toga, mutanti IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni rastvori za ubrizgavanje pripremljeni su mešanjem ovdeopisanih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim niženavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom vehikulumu koji sadrži osnovni disperzioni medij i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjna metoda pripreme je vakuumsko sušenje ili suvo zamrzavanje kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medija. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferiran, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima proizvodnje i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. /Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil-alkohol ili benzil-alkohol; alkilne parabene, kao što je metilparaben ili propil-paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Injekcije vodene suspenzije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijumkarboksimetil-celuloza, sorbitol, dekstran i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visokokoncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih injekcija uljane suspenzije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikuli uključuju masna ulja, kao što su susamovo ulje ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil-kleat ili triglideridi ili lipozomi.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnom primeru izvođenja, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agenasa za odlaganje apsorpcije, kao što su aluminijum-monostearat, želatin ili njihove kombinacije.
Pored prethodnoopisanih kompozicija, imunokonjugati mogu se formulisati i kao depo preparat. Takve dugodelujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga, na primer, mutirani IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu se formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju), jonoizmenjivačkim smolama ili slabo rastvorljivim derivatima, na primer, slabo rastvorljiva so.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže ovdeopisane mutirane IL-2 polipeptide i imunokonjugate mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulziranja, inkapsuliranja ili liofilizovanja. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane na konvencionalne načine pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenata ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.
Mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu se formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju dodaci kiselih soli, npr. onih formiranih sa jednom amino grupom proteinske kompozicije ili onih formiranih sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organske kiseline poput sirćetne, oksalne, vinske ili mandelinske kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: hidroksidi natrijuma, kalijuma, amonijaka, kalcijuma ili gvožđa, ili organskih baza izopropilamina, trimetilamina, histidina ili prokaina. Farmaceutske soli uglavnom budu rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.
Terapeutski postupci i kompozicije
Svaki od ovdeopisanih mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata može biti upotrebljen u terapeutskim postupcima. Ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu se koristiti kao imunoterapeutski agensi, na primer u lečenju kancera.
Za upotrebu u terapeutskim postupcima, ovdeopisani mutirani IL-2 polipeptidi i imunokonjugati formulišu se, doziraju i primenjuju na način saglasan sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima.
Ovdepisani mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati korisni su u lečenju bolesti kod kojih je stimulacija imunog sistema domaćina korisna, posebno uslovi u kojima je poželjan poboljšani ćelijski imunološki odgovor. Ovo može uključivati bolesti gde imuni odgovor domaćina nije dovoljan ili je deficijentan. Bolesti na koje se ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati mogu primeniti obuhvataju, na primer, tumor ili infekciju gde bi ćelijski imuni odgovor bio kritičan mehanizam za specifičan imunitet. Specifična stanja bolesti za koja se mogu koristiti ovdeopisani IL-2 mutanti, uključuju kancer, na primer karcinom bubrežnih ćelija ili melanom; imunološki nedostatak, posebno kod HIV-pozitivnih pacijenata, imunosupresovanih pacijenata, hronične infekcije i slično. Mutantni IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati opisani ovde mogu se primenjivati per se ili u bilo kojem pogodnom farmaceutskom sastavu.
U jednom primeru izvođenja, obezbeđeni su mutirani IL-2 polipeptidi i imunokonjugati kao što je ovde opisano za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeni su mutirani IL-2 polipeptidi i imunokonjugati kako je ovde opisano za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim izvođenjima, obezbeđeni su mutirani IL-2 polipeptidi i imunokonjugati kako su ovde opisani za upotrebu u postupku lečenja. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat kao što je ovde opisano za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca koji to treba. U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-IL-2 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine mutantnih-IL-2 polipeptida ili imunokonjugata. U određenim aspektima oboljenja koja se tretiraju predstavljaju proliferativni poremećaj. U poželjnom izvođenju bolest je rak. U određenim primerima izvođenja, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerozni agens, ako je lečena bolest karcinom. U daljem izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje mutant IL-2 polipeptid ili imunokonjugat za primenu u stimulaciji imunog sistema. U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat za primenu u postupku stimulisanja imunog sistema kod pojedinca koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata radi stimulacije imunog sistema. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „pojedinac” je sisar, poželjno čovek. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „stimulacija imunog sistema” može uključivati bilo koje jedno ili više opšte povećanje imunološke funkcije, povećanje funkcije T ćelije, povećanje funkcije B ćelije, restauraciju funkcije limfocita, povećanje u ekspresiji IL-2 receptora, povećanje T ćelijske reakcije, povećanje aktivnosti ćelija prirodnih ubica ili aktivnosti ćelija aktiviranih limfokinom (LAK) i slično.
U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata kao što je ovde opisano u proizvodnji ili pripremi leka za lečenje bolesti kod pojedinca kom to treba. U jednom primeru izvođenja, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti koji uključuje davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efikasne količine leka. U određenim primerima izvođenja, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U poželjnom izvođenju bolest je rak. U jednom primeru izvođenja, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerozni agens, ako je lečena bolest karcinom. U daljem izvođenju, lek je za stimulisanje imunološkog sistema. U sledećem otelotvorenju, lek je za upotrebu u postupku za stimulaciju imunog sistema pojedinca, koji uključuje davanje pojedincu terapeutski efikasne količine leka potrebne za stimulaciju imunog sistema. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „pojedinac” može da bude sisar, poželjno čovek. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „stimulacija imunog sistema” može uključivati bilo koje jedno ili više opšte povećanje imunološke funkcije, povećanje funkcije T ćelije, povećanje funkcije B ćelije, restauraciju funkcije limfocita, povećanje u ekspresiji IL-2 receptora, povećanje T ćelijske reakcije, povećanje aktivnosti ćelija prirodnih ubica ili aktivnosti ćelija aktiviranih limfokinom (LAK) i slično.
U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje bolesti kod pojedinca koji obuhvata davanje pomenute pojedinačne terapeutski efikasne količine mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata, kao što je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, kompozicija se daje pomenutom pojedincu, koja sadrži ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim primerima izvođenja, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U poželjnom izvođenju bolest je rak. U određenim primerima izvođenja, metoda se dalje sastoji od primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerozni agens, ako je lečena bolest karcinom. U daljem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za stimulaciju imunog sistema kod pojedinca, koji obuhvata davanje pojedincu efektivne količine mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata radi stimulacije imunološkog sistema. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „pojedinac” može da bude sisar, poželjno čovek. Prema svim gorenavedenim primerima izvođenja „stimulacija imunog sistema” može uključivati bilo koje jedno ili više opšte povećanje imunološke funkcije, povećanje funkcije T ćelije, povećanje funkcije B ćelije, restauraciju funkcije limfocita, povećanje u ekspresiji IL-2 receptora, povećanje T ćelijske reakcije, povećanje aktivnosti ćelija prirodnih ubica ili aktivnosti ćelija aktiviranih lymfokinom (LAK) i slično.
Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umestomutantnih IL-2 polipeptida ili kao njihovih dodataka.
U određenim primerima izvođenja, bolest koja se tretira je proliferativni poremećaj, poželjno kancer. Neograničavajući primeri karcinoma uključuju karcinom bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, materice, grlića materice, endometrijalni karcinom, karcinom jednjaka, debelog creva, kolorektalni karcinom, rektalni karcinom, karcinom želuca, karcinom prostate, kože, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom kostiju i bubrega. Ostali poremećaji proliferacije ćelija koji se mogu lečiti pomoću mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata uključuju, bez ograničenja, neoplazme locirane u: stomaku, kostima, dojkama, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoeumu, endokrinim žlezdama (adrenalinskoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajnicima, grudnoj, tiroidnoj žlezdi), očima, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, grudnom košu ili urogenitalnom sistemu. Obuhvaćena su i predkancerozna stanja ili lezije i metastaze. U određenim primerima izvođenja, karcinom se bira iz grupe koja obuhvata renalni karcinom, kolorektalni karcinom, karcinom kože, pluća, dojke, mozga glave i vrata. Slično tome, drugi poremećaji proliferacije ćelija takođe mogu biti tretirani mutantnim IL-2 polipeptidima i imunokonjugati opisanim ovde. Primeri takvih poremećaja proliferacije ćelija uključuju, bez ograničenja: hipergamaglobulinemiju, limfoproliferativne poremećaje, paraproteinemije, purpuru, sarkoidozu, Sezari sindrom, Waldenstronovu makroglobulinemiju, Gaucherovu bolest, histiocitozu i bilo koju drugu bolest proliferacije ćelija, pored neoplazije, koja se nalazi u gorenavednom sistemu organa. U sledećem primeru izvođenja, bolest se odnosi na autoimunitet, odbacivanje transplantacije, posttraumatske imune odgovore i zarazne bolesti (npr. HIV). Preciznije, mutirani IL-2 polipeptidi i imunokonjugati mogu se koristiti u eliminaciji ćelija uključenih u poremećaje posredovane imunim ćelijama, uključujući limfom; autoimunost, odbacivanje transplantacije, bolest transplantata protiv domaćina, ishemija i moždani udar. Obučeni stručnjak zna da u mnogim slučajevima mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim primerima izvođenja, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim primerima izvođenja, količina mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata koji obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „efikasnom količinom” ili „terapeutski efikasnom količinom”. Ispitanik, pacijent ili pojedinac kome treba lečenje obično je sisar, konkretnije čovek.
Ovdeopisani imunokonjugati su takođe korisni kao dijagnostički reagensi. Vezivanje imunokonjugata za antigensku determinantu lako se može detektovati korišćenjem sekundarnog antitela specifičnog za polipeptid IL-2. U jednom primeru izvođenja, sekundarno antitelo i imunokonjugat olakšavaju detekciju vezivanja imunokonjugata za antigenskuu determinantu koja se nalazi na površini ćelije ili tkiva.
U nekim primerima izvođenja,, efikasna količinaovdeopisanih mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata daje se u ćeliju. U drugim izvođenjima, terapeutski efikasna količina mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata koji su ovde opisani, daju se pojedincu za lečenje bolesti.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza ovdeopisanog mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste primene, telesne težine pacijenta, vrste polopetida (npr. nekonjugovani IL-2 ili imunokonjugat), težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili konkurentne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnih sastojaka u kompoziciji i odgovarajuću dozu (odgovarajuće doze) za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Jedna administracija nekonjugiranog IL-2 može da varira od oko 50.000 /IU/kg do oko 1.000.000 /IU/kg ili više, više tipično oko 600.000 /IU/kg IL-2. Ovo se može ponoviti nekoliko puta dnevno (npr. 2–3), tokom nekoliko dana (npr. oko 3–5 uzastopnih dana), a zatim se može ponoviti jednom ili više puta nakon perioda odmora (npr. oko 7–14 dana ). Prema tome, terapeutski efikasna količina može sadržavati samo jednu primenu ili mnoge administracije tokom određenog vremenskog perioda (npr. Oko 20–30 pojedinačnih administracija od oko 600.000 /IU/kg IL-2 od kojih je svaki dati više od 10–20 dana). Kada se primenjuje u obliku imunokonjugata, terapeutski efikasan mutantni IL-2 polipeptid može biti niži nego kod nekonjugiranog mutiranog IL-2 polipeptida.
Slično tome, imunokonjugat se pogodno primenjuje na pacijenta jednokratno ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) imunokonjugata može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorenavedenih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza imunokonjugata navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. /////////////////////////////////U drugim neograničavajućim primerima, doza može da sadrži i od približno 1 mikrogram/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine, približno 10 mikrograma/kg telesne težine, približno 50 mikrograma/kg telesne težine, približno 100 mikrograma/kg telesne težine, približno 200 mikrograma/kg telesne težine, približno 350 mikrograma/kg telesne težine, približno 500 mikrograma/kg telesne težine, približno 1 milligram/kg telesne težine, približno 5 milligrama/kg telesne težine, približno 10 milligrama/kg telesne težine, približno 50 milligrama/kg telesne težine, približno 100 milligrama/kg telesne težine, približno 200 milligrama/kg telesne težine, približno 350 milligrama/kg telesne težine, približno 500 milligrama/kg telesne težine, do približno 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, a svaki raspon se dobija iz toga. ////////U neograničavajućim primerima rasponi dobijeni iz ovdenavedenih brojeva, raspon od približno 5 mg/kg telesne težine do približno 100 mg/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine do približno 500 mikrograma/kg telesne težine, itd. može se primeniti, na osnovu goreopisanih brojeva. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od približno dve do približno dvadeset, ili npr. približno šest doza imunokonjugata). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati uglavnom se koriste u količinama dovoljnim za postizanje nameravanih svrha. Za lečenje ili prevenciju bolesti, ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati ili njihove farmaceutske kompozicije, primenjuju se u terapeutski efikasnim količinama. Određivanja terapeutski efikasne količine poznato je stručnjacima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.
U pogledu sistemske administracije, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi kulture ćelija. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao kružni raspon koncentracije koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.
Inicijalne doze mogu se takođe proceniti na osnovu in vivo podataka, npr. životinjski modeli, koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu brzo da optimizuju administraciju namenjenu ljudima na osnovu životinjskih podataka.
Doza i interval primene mogu se pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi plazme mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. ////Uobičajena doza primene za pacijente putem injekcija ima raspon od 0,1 mg/kg/dnevno do 50 mg/kg/dnevno, obično od približno 0,5 mg/kg/dnevno do 1 mg/kg/dnevno. Terapeutski efikasni nivoi plazme mogu se dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi mogu se meriti, na primer, hromatografijom HPLC.
U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, efikasna lokalna koncentracija imunokonjugata ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efikasnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Terapeutski efikasna doza ovdeopisanih mutantnih IL-2 polipeptida ili imunokonjugata uglavnom obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost IL-2 mutanta ili imunokonjugata mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili eksperimentalnim životinjama (videti npr. Primere 8 i 9). Testovi kulture ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50 (doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski efikasna za 50% populacije). /Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su mutantni IL-2 polipeptidi ili imunokonjugati koji pokazuju visoke terapeutske indekse. U jednom primeru izvođenja, ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptid ili imunokonjugat pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u kružnom rasponu koncentracija koji uključuje ED50 sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze, način primene, stanje ispitanika i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon osvrta na stanje pacijenta. (Videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1).
Lekar zadužen za pacijente koji se leče ovdeopisanim IL-2 mutantima ili imunokonjugatima znaju kada i kako treba da okončaju, prekinu ili podese primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa i slično. S druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načinom primene i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim metodama prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.
Maksimalna terapeutska doza mutantnog polipeptida IL-2 ili imunokonjugata koji sadrži navedeni polipeptid može se povećati od onih koji se koriste za nemutirani IL-2 ili imunokonjugata koji sadrže nemutirani IL-2, datim redosledom.
Drugi agensi i tretmani
Ovdeopisani mutantni IL-2 polipeptidi i imunokonjugati opisani ovde mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim ili više drugih sredstava u terapiji. Na primer, antitelo kao što je ovde opisano može biti primenjeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens” obuhvata sve agense za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim primerima izvođenja, dodatni terapeutski agens je imunomodulatorni agens, citostatički agens, inhibitor ćelijske adhezije, citotoksični agens, aktivator ćelijske apoptoze ili agens koji povećava senzitivitet ćelija na apoptičke induktore. U posebnom primeru izvođenja, dodatni terapeutski agens je antikancerozni agens, na primer, mikrotubule, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, DNK interkalator, alkilirajući agens, hormonska terapija, inhibitor kinaze, antagonist receptora, aktivator apoptoze tumorske ćelije ili angiogenski agens.
Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine mutantnog IL-2 polipeptida ili imunokonjugata koji se koriste, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Mutantni IL-2 i imunokonjugati se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Takve kombinovane terapije koje su pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u istu kompoziciju ili u različite kompozicije) i odvojenu primenu, u kom slučaju primena mutantnog IL-2 i imunokonjugata kako je ovde opisano može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Mutantni IL-2 polipeptidi kako su ovde opisani mogu se takođe primeniti u kombinaciji sa radijacionom terapijom.
Proizvodi
U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo kao što je ovde opisano. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži mutantni IL-2 polipeptid, kao što je ovde opisano; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom primeru izvođenja predmetnog pronalaska može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da svaki od proizvoda pomenutih u prethodnom tekstu može da sadrži imunokonjugat iz pronalaska, kao što je opisano, umesto ili pored mutantnog IL-2 polipeptida.
Kratak opis slika
Slika 1. Šematski prikaz Fab-IL-2-Fab (A) i IgG-IL-2 (B) imunokonjugatnih formata, koji sadrže mutantni IL-2 polipeptid.
Slika 2. Prečišćavanje golih IL-2 nemutiranih vrsta konstrukata. (A) hromatogram His tag nemutiranog IL-2; (B) SDS PAGE pročišćenog proteina (8%–12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES pufera).
Slika 3. Prečišćavanje golih IL-2 nemutiranih vrsta konstrukata. (A) hromatogram analitičke hromatografije na molekularnim sitima za nemutirani IL-2; (B) SDS PAGE pročišćenog proteina (8%–12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES pufera).
Slika 4. Analitička hromatografija na molekularnim sitima za nemutirani IL-2, kao što je utvrđeno na Superdex 75, 10/300 GL. Bazen 1 sadrži 74% od 23 kDa vrsta i 26% od 20 kDa vrsta, Pool 2 sadrži 40% od 22 kDa vrsta i 60% od 20 kDa vrsta.
Slika 5. Prečišćavanje golog IL-2 četvorostrukog mutantnog konstrukta. (A) hromatogram purifikacije His tag za četvorostruki mutant IL-2; (B) SDS PAGE prečišćenog proteina (8%–12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES pufera).
Slika 6. Prečišćavanje golog IL-2 četvorostrukog mutantnog konstrukta. (A) hromatogram hromatografije na molekularnim sitima za četvorostruki mutant IL-2; (B) SDS PAGE pročišćenog proteina (8%–12% Bis-Tris (NuPage, Invitrogen), MES pufera).
Slika 7. Analitička hromatografija na molekularnim sitima za četvorostruki mutant IL-2 kao što je određeno na Superdex 75, 10/300 GL (Pool 2, 20 kDa).
Slika 8. Istovremeno vezivanje za IL-2R i humani FAP od Fab-IL-2-Fab baziranog na 29B11 ciljanom FAP, koji obuhvata nemutirane IL-2 ili četvorostruke mutante. (A) Postavljanje SPR testa; (B) SPR senzorgram.
Slika 9. Indukcija IFN-γ oslobađanja od NK92 ćelija Fab-IL-2-Fab baziranim na FAP-orijentisanom 4G8 Fab-IL-2-Fabu koji sadrži nemutirane ili mutirane IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 10. Indukcija proliferacije izolovanih NK ćelija (donjeg) FAP-ciljanog Fab-IL-2-Fab baziranog na FAP, koji sadrži nemutirane ili mutirane IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 11. Indukcija proliferacije aktiviranih CD3<+>T ćelija Fab-IL-2-Fab baziranim na FAP, koji sadrži nemutirane ili mutirane IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 12. Indukcija aktivnošću indukovane ćelijske smrti (AICD) previše stimulisanih T ćelija Fab-IL-2-Fab baziranog na FG 4G8 koji sadrži nemutirane ili mutirane IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru.
Slika 13. Fosfo-STAT5 FACS test u rastvoru sa Fab-IL-2-Fab baziranim na FAP 4G8, koji sadrži nemutirane ili četvorostruke mutirane IL-2, u poređenju sa proleukinom, u rastvoru. (A) regulatorne T ćelije (CD4<+>CD25<+>FOXP3<+>); (B) CD8<+>T ćelije (CD3<+>CD8<+>); (C) CD4<+>T ćelije (CD4<+>CD25-CD127<+>); (D) NK ćelije (CD3-CD56<+>).
Slika 14. Prečišćavanje imunokonjugata qm-Fab Fab-IL-2 baziranog na 28Hl ciljanim FAP. (A) Profil elucije proteina G kolone. (B) Profil elucije kolone na molekularnim sitima Superdex 200. (C) Novex Tris-Glicin 4-20% SDS-PAGE krajnjeg proizvoda sa neredukovanim i smanjenim uzorkom.
Slika 15. Prečišćavanje imunokonjugata qm-Fab Fab-IL-2 FAP ciljane na 4G8. (A) Profil elucije proteina A kolone. (B) Profil elucije kolone na molekularnim sitima Superdex 200. (C) NuPAGE Novex Bis-Tris Mini gel (Invitrogen), MOPS radni pufer krajnjeg proizvoda sa neredukovanim i smanjenim uzorkom.
Slika 16. Prečišćavanje imunokonjugata Fab-IL2QM-Fab ciljanog MHLG1 KV9 MCSP. (A) Profil elucije proteina A kolone, B) Profil elucije kolone na molekularnim sitima Superdex 200. C) NuPAGE Novex Bis-Tris Mini gel, Invitrogen, MOPS radni pufer krajnjeg proizvoda sa ne-redukovanim i smanjenim uzorkom.
Slika 17. Ciljno vezivanje konstrukta Fab-IL-2-Fab na HEK 293-ljudskim FAP ćelijama. Slika 18. Ciljno vezivanje konstrukta Fab-IL-2-Fab na HEK 293-ljudskim FAP ćelijama. Slika 19. Vezivna specifičnost fab-Fab-IL-2-Fab konstrukata utvrđena na HEK 293-humanim DPPIV i HEK 293 lažno-transfektovanih ćelija. Vezivanje specifičnog DPPIV (CD26) antitela je prikazano sa desne strane.
Slika 20. Analiza FAP internalizacije nakon vezivanja Fab-IL-2-Fab konstrukata na FAP na fibroblastima GM05389.
Slika 21. IL-2 izaziva IFN-γ oslobađanje od NK92 ćelija u rastvoru.
Slika 22. IL-2 izaziva IFN-γ oslobađanje od NK92 ćelija u rastvoru.
Slika 23. IL-2 je izazvao proliferaciju NK92 ćelija u rastvoru.
Slika 24. Procena Fab-IL-2-Fab klonova 28H1 naspram 29B11 naspram 4G8 u STAT5 fosforilaciji asasy sa PBMCs u rastvoru. (A) NK ćelije (CD3-CD56<+>); (B) CD8<+>T ćelije (CD3<+>CD8<+>); (C) CD4<+>T ćelije (CD3<+>CD4<+>CD25-CD127<+>); (D) regulatorne T ćelije (CD4<+>CD25<+>FOXP3<+>).
Slika 25. Efikasnost FAP-ciljanih 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata u ćelijskoj liniji ACHN ćelijske linije adenokarcinoma bubrega.
Slika 26. Efikasnost FAP-ciljanih 4G8 FAP-IL-2 qm-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata u ćelijskoj liniji karcinoma pluća Lewis LLC1.
Slika 27. Efikasnost 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab ciljanih 28H1 imunokonjugata u ćelijskoj liniji karcinoma pluća miševa Lewis LLC1.
Slika 28. Malo uvećanje (100x) pluća miševa tretiranih kontrolom vehikuluma (A) ili 9 μg/g wt IL-2 (B) ili qm IL-2 (C). Pluća miševa tretiranih sa 9 μg/g wt IL-2 pokazuju vazocentrični mononuklearni infiltrat koji se preselio u alveolarne prostore. Edem i krvarenje takođe su prisutni. Marginalni infiltrat se primećuje kod miševa tretiranih sa qm IL-2 oko nekoliko sudova.
Slika 29. Veće uvećanje (200x) pluća prikazano na slici 28. Marginacija i infiltracija mononuklearnih ćelija u krvnim sudovima i oko njih je teža kod miševa tretiranih sa wt IL-2 (A) u odnosu na miševe tretirane sa qm IL-2 (B i C).
Slika 30. Malo uvećanje (100x) jetre miševa tretiranih kontrolom vehikuluma (A) ili 9 μg/g wt IL-2 (B) ili qm IL-2 (C). Vasocentrična infiltracija se vidi kod miševa tretiranih sa IL-2.
Slika 31. IFN-γ sekreciju NK92 ćelija nakon inkubacije sa različitim IL-2 nemutiranim (wt) i četvorostrukim mutantnim (qm) preparatima za 24 (A) ili 48 sati (B).
Slika 32. Proliferacija NK92 ćelija nakon inkubacije sa različitim IL-2 nemutiranim (wt) i četvorostrukim mutantnim (qm) preparatima tokom 48 sati.
Slika 33. Proliferacija NK92 ćelija nakon inkubacije sa različitim IL-2 nemutiranim (wt) i četvorostrukim mutantnim (qm) preparatima tokom 48 sati.
Slika 34. Proliferacija NK ćelija nakon inkubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima ili Proleukinom za 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana.
Slika 35. Proliferacija CD4 T-ćelija nakon inkubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatma ili Proleukinom za 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana.
Slika 36. Proliferacija CD8 T-ćelija nakon inkubacije sa različitim FAP-ciljanim 28H1 IL-2 imunokonjugatima ili Proleukinom za 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana.
Slika 37. Proliferacija NK ćelija (A), CD4 T-ćelija (B) i CD8 T-ćelija (C) nakon inkubacije sa različitim imunokonjugatima IL-2 ili Proleukinom tokom 6 dana.
Slika 38. STAT fosforilacija u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelijama (B), CD4 T-ćelijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30 min inkubacije sa Proleukinom, nemutiranim IL-2 i četvorostrukim mutiranim IL-2 proizvedenim u okviru kompanije.
Slika 39. STAT fosforilacija u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelijama (B), CD4 T-ćelijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30 min inkubacije sa Proleukinom, IgG-IL-2 koji sadrži nemutirani IL- 2 ili IgG-IL-2 koji sadrži četvorostruki mutiranit IL-2.
Slika 40. Preživljavanje crnih 6 miševa nakon primene (jednom dnevno sedam dana) različitih doza imunokonjugata IL-2 koji sadrže nemutirani ili četvorostruki mutirani IL-2.
Slika 41. Koncentracije IL-2 imunokonjugata u serumu nakon pojedinačne i.v. primene FAP-ciljanih (A) i neraspoređenih (B) IgG-IL-2 konstrukata koji sadrže bilo nemutirane (wt) ili četvorostruke mutirane (qm) IL-2.
Slika 42. Koncentracije IL-2 imunokonjugata u serumu nakon pojedinačne i.v. primene neciljanih Fab-IL-2-Fab konstrukata koji se sastoje od nemutiranog (wt) ili četvorostrukog mutiranog (qm) IL-2.
Slika 43. Pročišćavanje četvorostrukog mutiranog IL-2. (A) Jonska hromatografija imobilizovanog metala; (B) hromatografija na molekularnim sitima; (C) SDS PAGE pod neredukovanim uslovima (NuPAGE Novex Bis-Tris gel (Invitrogen), MES pufer); (D) hromatografija na molekularnim sitima (Superdex 7510/300 GL).
Slika 44. Širenje predaktiviranih CD8 (A) i CD4 (B) T ćelija nakon šest dana inkubacije sa različitim imunokonjugatima IL-2.
Slika 45. Aktivacija je indukovala ćelijsku smrt CD3<+>T ćelija nakon šest dana inkubacije sa različitim imunokonjugatima IL-2 i tokom noći tretiranjem anti-Fas antitela.
Slika 46. Prečišćavanje imunokonjugata četvorostrukog mutanta (qm) IgG-IL-2 baziranog na 4G8 baziranom na FAP. A) Eluacijski profil proteina A afinitetne hromatografije. B) Profil elucije šema hromatografije na molekularnim sitima. C) Analitička SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini gel, Invitrogen, MOPS pufer) finalnog proizvoda. D) Hromatografija na molekularnim sitima finalnog proizvoda na koloni Superdex 200 (97% sadržaja monomera).
Slika 47. Prečišćavanje FAP ciljanog imunokonjugata IgG-IL-2 qm baziranog na 28H1. A) Eluacijski profil proteina A afinitetne hromatografije. B) Profil elucije šema hromatografije na molekularnim sitima. C) Analitička SDS-PAGE (smanjena: NuPAGE Novex Bis-Tris Mini gel, Invitrogen, MOPS radni pufer; ne smanjeni: NuPAGE Triscetat, Invitrogen, triscetatni pufer) konačnog proizvoda. D) Hromatografija na molekularnim sitima finalnog proizvoda na koloni Superdex 200 (100% sadržaj monomera).
Slika 48. Vezivanje FAP ciljanog IgG-IL-2 qm imunokonjugata baziranog na 4G8, eksprimiranim na stabilno transfektovanim HEK 293 ćelijama, mereno FACS-om, u poređenju sa odgovarajućim Fab-IL-2 qm-Fab konstruktom.
Slika 49. Interferon (IFN) -γ oslobađa NK92 ćelije indukovane FAP-ciljanim imunokonjugatom IgG-IL-2 qm baziranim na 4G8 u rastvoru, u poređenju sa Fab-IL-2 qm-Fab konstruktom Fab-IL-2 baziranim na 28H1.
Slika 50. Detekcija fosforilisanog STAT5 FACS-om u različitim tipovima ćelija posle stimulacije u trajanju od 20 minuta sa FAP-ciljanim IgG-IL-2 qm imunokonjugatom na bazi 4G8 u rastvoru, u poređenju sa Fab-IL-2-Fab baziranim na 28H1 i Fab-IL-2-qm-Fab konstruktima kao i sa Proleukinom. (A) NK ćelije (CD3-CD56<+>); (B) CD8<+>T ćelije (CD3<+>CD8<+>); (C) CD4<+>T ćelije (CD3<+>CD4<+>CD25-CD127<+>); (D) regulatorne T ćelije (CD4<+>CD25<+>FOXP3<+>).
Primeri
U nastavku su dati primeri postupaka i kompozicija iz pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjeni razni druge pronalasci, na osnovu opisa koje su gore dati.
Primer 1
Opšte metode
Tehnike rekombinantne DNK
Za manipulaciju DNK korišćene su standardne metode kao što je opisano u radu Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača. Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242.
Sekvenciranje DNK
Sekvence DNK su određene pomoću sekvenciranja dvostrukog lanca.
Genska sinteza
Željeni segmenti gena, po potrebi, dobijeni su polimerazom PCR pomoću odgovarajućih obrazaca ili su sintetizovani pomoću uređaja Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR produkata automatizovane genske sinteze. U slučajevima kada nije bila dostupna tačna sekvenca gena, prajmeri polinukleotida su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa i geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koja potiče iz odgovarajućeg tkiva. /Segmenti gena okruženi restrikcionim mestima sečenja singularne endonukleaze klonirani su u standardne klonirane /sekvencirane vektore. DNK plazmida je prečišćena iz transformisane bakterije i koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranog genskog fragmenta je potvrđena sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima da bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Svi su konstrukti dizajnirani DNK sekvencom na 5' kraju koja kodira vodeći peptid koji cilja proteine za izlučivanje u eukariotske ćelije. SEQ ID NOs 263-273 daju primere vodećih peptida i polinukleotidnih sekvenci koje ih kodiraju.
Priprema IL-2R βγ podjedinice-Fc fuzijei IL-2R α podjedinice Fc fuzije
Za proučavanje afiniteta vezivanja IL-2 receptora, napravljen je alat koji je omogućio ekspresiju heterodimernog IL-2 receptora; β-podjedinica receptora IL-2 spojena je sa Fc molekulom koji je bio projektovan za heterodimerizaciju (Fc (otvor)) (videti SEQ ID NO 274 i 275) koristeći tehnologiju „knobs-in-holes” (Merchant et al.., Nat Biotech, 16, 677-681 (1998)). γ-podjedinica IL-2 receptora je zatim spojena sa varijantom Fc (čvor) (vidi SEQ ID NO 276 i 277), koji su heterodimerizovani sa Fc (otvor). Ovaj heterodimerni Fc-fuzioni protein je zatim korišćen kao podloga i za analizu interakcije IL-2/IL-2 receptora. IL-2R α-podjedinica je izražena kao monomerni lanac sa mestom cepanja AcTev i Avi His tag (SEQ ID NOs 278 i 279). Odgovarajuće IL-2R podjedinice su tranzitivno izražene u HEK EBNA 293 sa serumom za konstrukciju IL-2R βγ subjedinice i bez seruma za konstrukciju α-podjedinica. IL-2R βγ podjedinni konstrukt je pročišćen na proteinu A (GE Healthcare), nakon čega je sledila hromatografija na molekularnim sitima (GE Healthcare, Superdex 200). IL-2R α-podjedinica je prečišćena preko His tag na koloni NiNTA (Qiagen) praćene hromatografijom na molekularnim sitima (GE Healthcare, Superdex 75).
Priprema imunokonjugata
Detalji o pripremi i prečišćenju Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, uključujući stvaranje i afinitetno sazrevanje antigen vezujuće komponente mogu se naći u Primerima dodanim PCT publikaciji br. WO 2011/020783. Kao što je opisano u njemu, različite antigen vezujuće komponente usmerene na FAP generisani su fagnim prikazom, uključujući one naznačene 4G8, 3F2, 28H1, 29B11, 14B3 i 4B9 korišćene u sledećim primerima. Klon 28H1 je zrelo afinitetno antitelo zasnovano na roditeljskom klonu 4G8, a klonovi 29B11, 14B3 i 4B9 su zrela afinitetna antitela zasnovana na matičnom klonu 3F2. Antigen vezujući domen označen MHLG1 KV9 koji se ovde koristi usmeren je na MCSP.
Sekvence imunokonjugata koje sadrže nemutirani tip IL-2 koji su korišćeni u sledećim primerima mogu se naći iu publikaciji PCT br. WO 2011/020783. Sekvence koje odgovaraju imunokonjugatima koji sadrže četvorostruke mutirane IL-2 koji su korišćeni u sledećim primerima su: 4G8: SEQ ID NO 211 i 233; 3F2: SEQ ID NO 209 i 231; 28H1: SEQ ID NO 219 i 233; 29B11: SEQ ID NO 221 i 231; 14B3: SEQ ID NO 229 i 231; 4B9: SEQ ID NO 227 i 231; MHLG1-KV9: SEQ ID NO 253 i 255. DNK sekvence su generisane sintezom gena i/ili tehnikama klasične molekularne biologije i subklonirane u vektore ekspresionog sisara (jedna za laki lanac i jedna za fuzioni protein teškog lanca/IL-2) pod kontrolom MPSV promotera i uzvodno od sintetičke polyA lokacije, svaki vektor koji nosi EBV OriP sekvencu. Imunokonjugati, kao što se primenjuju u dolenavedenim primerima, proizvedeni su kotransfekcijom eksponencijalno rastućih HEK293-EBNA ćelija sa vektorima ekspresije sisara koristeći transfekciju kalcijum-fosfata. Alternativno, HEK293 ćelije koje rastu u suspenziji transfektovane su polietilenimin (PEI) sa odgovarajućim ekspresionim vektorima. Alternativno, stabilno transfektovani bazeni CHO ćelija ili klonovi CHO ćelija korišćeni su za proizvodnju u medijumima bez seruma. Dok Fab-IL-2-Fab konstruisani Fab-IL-2-Fab konstruisani FAP ciljani FAP ciljani IL-2 ili 4-mutirani mutanti mogu biti prečišćeni pomoću afinitetne hromatografije koristeći matricu proteina A, FAP-ciljani Fab-IL2-Fab konstrukti bazirani na 28H1 su prečišćeni afinitetnom hromatografijom na matrici proteina G u malom opsegu.
Ukratko, 28H1 Fab-IL-2-Fab ciljani FAP, koji se sastoji od nemutiranog IL-2 ili (četvorostrukog) mutanta, prečišćen je od supernatanta ćelija za jedan stepen afiniteta (protein G) praćen hromatografijom na molekularnim sitima (Superdex 200, GE Healthcare). Kolona proteina G je uravnotežena u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum-citratu pH 7.5, supernatant je postavljen i kolona je isprana sa 20 mM natrijum-fosfatom, 20 mM natrijum-citratom pH 7.5. Fab-IL-2-Fab je eluiran sa 8.8 mM mravlje kiseline pH 3. Eluirane frakcije su bile udružene i polirane hromatografijom na molekularnim sitima u puferu za finalnu formulaciju: 25 mM kalijum-fosfata, 125 mM natrijum-hlorida, 100 mM glicin pH 6,7. Primeri rezultata pročišćavanja i analitike dati su u nastavku.
FAP-ciljani 3F2 Fab-IL-2-Fab ili 4G8 Fab-IL-2-Fab, koji sadrže ili (četvorostruki) nemutantni IL-2, su prečišćeni sličnim postupkom koji se sastoji od jednog afinitetnog koraka koristeći protein A praćenim hromatografijom na molekularnim sitima, (Superdex 200, GE Healthcare). Ukratko, kolona je ekvilibrisana sa 20 mM natrijum-fosfatom, 20 mM natrijumcitratom pH 7,5, nanet je ćelijski supernatant, a zatim je usledilo prvo ispiranje sa 20 mM natrijumfosfatom, 20 mM natrijum- citratom pH 7,5, i drugo ispiranje sa 13,3 mM natrijum-fosfatom, 20 mM natrijum-citratom, 500 mM natrijum-hloridom pH 5,45. Treće ispiranje opciono je izvedeno sa 10 mM MES, 50 mM natrijumhlorida pH 5. Fab-IL-2-Fab je eluiran sa 20 mM natrijum-citrata, 100 mM natrijum-hlorida, 100 mM glicina, pH 3. Eluirane frakcije su bile udružene i polirane hromatografijom na molekularnim sitima u puferu za finalnu formulaciju: 25 mM kalijum fosfata, 125 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina pH 6,7. Primeri detaljnih postupaka prečišćavanja i rezultata su dati za izabrane konstrukcije ispod.
FAP ciljani IgG-IL-2 qm fuzioni proteini su generisani na bazi FAP-antitela 4G8, 4B9 i 28H1, pri čemu je jedan pojedinačni četvorostruki mutirani IL-2 (qm) spojen na C-terminusu jednog heterodimernog teškog lanca, kao što je prikazano na slici IB. Usmeravanje na stromu tumora gdje se FAP selektivno izražava postiže se putem Fab regije bivalentnog antitela (efekt avidnosti). Heterodimerizacija koja rezultira prisustvom jedinstvenog četvorostrukog mutanta IL-2 postiže se primenom tehnologije "knob-into-hole". Kako bi se minimizirala generacija homodimernih fuzija IgG-citokina, citokin je spojen sa C-terminusom (uklanjanjem ostatkaLys C-terminala ) teških lanaca koji sadrže čvor preko G 4 SG 4 ) 2 ili (G 4 S) 3 -linker. Fuzija antitela i citokina ima osobine slične IgG-u. Da bi se smanjila funkcija FcγR vezivanja/efektora i sprečila koaktivacija FcR, uvedene su mutacije P329G L234A L235A (LALA) u domenu Fc. Sekvence ovih imunokonjugata date su u SEQ ID NO 297, 299 i 233 (28H1), SEQ ID NO 301, 303 i 231 (4B9) i SEQ ID NO 315, 317 i 233 (4G8)). Osim toga, generisan je CEA ciljani IgG-IL-2 qm fuzioni protein i kontrolni DP47GS neciljani IgG-IL-2 qm fuzioni protein pri čemu se IgG ne vezuje za određenu metu. Sekvence ovih imunokonjugata date su u SEQ ID NOs 305, 307 i 309 (DP47GS) i SEQ ID NOs 319, 321 i 323 (CH1A1A).
Konstrukcije IgG-IL-2 generisane su tranzijentnom ekspresijom u HEK293 EBNA ćelijama i prečišćene suštinski kao što je gore opisano za konstrukte Fab-IL-2-Fab. Ukratko, fuzioni proteini IgG-IL-2 su prečišćeni sa jednim afinitetnim korakom sa proteinom A (HiTrap ProtA, GE Healthcare) uravnoteženom u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum citrata pH 7.5. Nakon punjenja supernatanta, kolona je prvo isprana sa 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, pH 7,5, a zatim isprana sa 13,3 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 500 mM natrijumhlorida, pH 5,45. IgG-fuzijski protein citokina je eluiran sa 20 mM natrijum citratom, 100 mM natrijum hloridom, 100 mM glicinom pH 3. Frakcije su neutralizovane i objedinjene i prečišćene hromatografijom na molekularnim sitima (HiLoad 16/60 Superdex 200, GE Healthcare) u finalnom formulacijskom puferu: 25 mM kalijum fosfata, 125 mM natrijum hlorida, 100 mM glicin pH 6,7. Primeri detaljnih procedura prečišćavanja i rezultata su date za izabrane konstrukte ispod. Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa imunokonjugata su analizirane pomoću SDS-PAGE u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (5 mM 1,4-ditiotreitol) i bojenjem sa Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain kompanije Invitrogen). Gel sistem NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen) korišćen je prema uputstvu proizvođača (4-20% Tris-glicin gelovi ili 3-12% Bis-Tris). Ukupan sadržaj imunokonjugatnih uzoraka analiziran je pomoću analitičke hromatografije na molekularnim sitima Superdex 20010/300GL (GE Healthcare) u 2 mM MOPS, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3, radnim puferom pH 7,3 na 25° C.
FAP vezujući afinitet
FAP vezujuća aktivnost razdvojenih Fab fragmenata korišćenih u ovim primerima kao antigen vezujuće komponente vezuju se na površinsku plazmonsku rezonancu (SPR) na Biacore mašini. Ukratko, anti-His antitelo (Penta-His, Qiagen 34660) je imobilisano na CM5 čipovima da bi zauzelo 10 nM čoveka, glodavca ili cinomolgusa FAP-His (20 s). Temperatura je bila 25° C, a HBS-EP je korišćen kao pufer. Koncentracija fab analita bila je 100 nM do 0,41 nM (duplikati) s brzinom protoka od 50 μl/min (asocijacija: 300 s, disocijacija: 600 s (4B9, 14B3, 29B11, 3F2) ili 1200 s (28H1, 4G8), regeneracija: 60 s 10 mM glicin pH 2). Podešavanje je izvršeno na bazi 1: 1 veznog modela, RI = 0, Rmax = lokalni (zbog formata za snimanje). Tabela 2 daje monovalentne afinitete određene SPR-om.
TABELA 2. Afinitet (K D ) FAP-ciljanih fragmenata Faba u FAP kao što je određeno SPR-om.
Analize biološke aktivnosti sa ciljanim imunokonjugatima IL-2
Biološku aktivnost FAP ili MCSP imunokonjugata Fab-IL-2-Fab i FAP-ciljanih IgG-IL-2 imunokonjugata, koji uključuju nemutirane ili četvorostruke mutirane IL-2, ispitani su u nekoliko ćelijskih testova u poređenju sa komercijalno dostupnim IL-2 (Proleukin, Novartis, Chiron).
Oslobađanje IFN-γ od strane NK ćelija (u rastvoru)
IL-2 izgladnele NK92 ćelije (100000 ćelija/bunar u ploči sa 96-U-bunarčića) su inkubirane sa različitim koncentracijama imunokonjugata IL-2, koje sadrže nemutirani ili četvorostruki mutirani IL-2, tokom 24 časa u NK mediju MEM alfa iz Invitrogena (# 22561-021) dopunjena sa 10% FCS, 10% konjskog seruma, 0,1 mM 2-merkaptoetanola, 0,2 mM inositola i 0,02 mM folne kiseline). Supernatanti su sakupljeni i IFN-y oslobađanje je analizirano pomoću anti-humanog IFN-y ELISA Kit II od Becton Dickinson (# 550612). Proleukin (Novartis) služio je kao pozitivna kontrola za aktivaciju ćelija posredovanom IL-2.
Proliferacija NK ćelija
Krv iz zdravih dobrovoljaca uzeta je u špricu koji sadrži heparin, a PBMC su izolovani. Netaknute NK ćelije su izolovane iz PBMC korišćenjem II Kompleta za izolaciju NK ćelija (Human NK Cell Isolation Kit II) proizvođača Miltenyi Biotec (# 130-091-152). CD25 ekspresija ćelija je proverena protočnom citometrijom. Za ispitivanja proliferacije, 20000 izolovanih humanih NK ćelija je inkubirano tokom 2 dana u vlažnom inkubatoru na 37° C, 5% CO2 u prisustvu različitih imunokonjugata IL-2, koji uključuju nemutirane ili četvorostruke mutirane IL-2 . Proleukin (Novartis) je služio kao kontrola. Nakon 2 dana, sadržaj ATP ćelijskih lizata je meren korišćenjem CellTiter-Glo luminescentnog testa preživljavanja ćelija iz Promega (# G7571/2/3). Procenat rasta je izračunat postavljanjem najveće koncentracije Proleukina na 100% proliferacije i neobrađenih ćelija bez stimulusa IL-2 do 0% proliferacije.
STAT5 test fosforilacije
Krv iz zdravih dobrovoljaca uzeta je u špricu koji sadrži heparin, a PBMC su izolovani. PBMCs su tretirani imunokonjugatima IL-2, koji sadrže nemutirane ili četvorostruke mutante IL-2, u naznačenim koncentracijama ili sa Proleukinom (Novartis) kao kontrolom. Nakon 20 min inkubacije na 37° C, PBMC su fiksirani sa prethodno zagrejanim Cytofixpuferom (Becton Dickinson # 554655) tokom 10 min na 37° C, nakon čega sledi permeabilizacija sa Phosflow Perm Buffer III (Becton Dickinson # 558050) tokom 30 min na 4° C. Ćelije su isprane dva puta sa PBS koji sadrži 0,1% BSA pre nego što je FACS bojenje obavljeno korišćenjem mešavina protočnih citometrijskih antitela za detekciju različitih ćelijskih populacija i fosforilacije STAT5. Uzorci su analizirani korišćenjem FACSCantoII sa HTS-om iz Becton Dickinsona.
NK ćelije su definisane kao CD3-CD56<+>, CD8 pozitivne T ćelije su definisane kao CD3<+>CD8<+>, CD4 pozitivne T ćelije su definisane kao CD4<+>CD25-CD127<+>i Treg ćelije su definisane kao CD4<+>CD25<+>FoxP3<+>.
Proliferacija i AICD T ćelija
Krv iz zdravih dobrovoljaca uzeta je u špricu koji sadrži heparin, a PBMC su izolovani. Nedirnute T ćelije su izolovane pomoću Pan T Cell Kit II iz Miltenyi Biotec (# 130-091-156). T ćelije su prethodno stimulisane sa 1 μg/ml PHA-M (Sigma Aldrich # L8902) 16 h pre dodavanja Proleukina ili Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, koji sadrže nemutirani ili (četvorostruki) mutant IL-2, na oprane ćelije još 5 dana. Nakon 5 dana, ATP sadržaj ćelijskih lizata je meren korišćenjem testa preživljavanja CellTiter-Glo Luminescent Cell od Promega (# G7571/2/3). Izračunata je relativna proliferacija koja određuje najveću koncentraciju Proleukina na 100% proliferaciju.
Izloženost fosfatidilserinu (PS) i ćelijska smrt T ćelija su analizirani protočnom citometrijskom analizom (FACSCantoII, BD Biosciences) aneksina V (Annexin-V-FLUOS Staining Kit, Roche Applied Science) i propiridijum jodidom (Pl) obojene ćelije. Za indukovanje ćelijske smrti izazvane aktivacijom (AICD), T ćelije su tretirane anti-Fas antitelom koji izaziva apoptozu (Millipore clone Chll) tokom 16 h nakon 16 h PHA-M i 5 dana tretmana sa Fab-IL-2 -Fab imunokonjugatima. Bojenje Aneksinom V vršeno je u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, ćelije su isprane Ann-V vezujućim puferom (1x zaliha: 0,01 M HEPES/NaOH pH7,4, 0,14 M NaCl, 2,5 mm CaCl 2) i obojene za 15 min na RT u mraku sa Annexin V FITC (Roche). Ćelije su ponovo oprane u Ann-V vezivnom puferu pre dodavanja 200 μl/bunarčić Ann-V vezivnog pufera koji sadrži PI (0,3 μg/ml). Ćelije su odmah analizirane protočnom citometrijom.
Vezivanje FAP eksprimirajućih ćelija
Vezivanje FAP-ciljanih IgG-IL-2 qm i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata za humani FAP-u izraženom na stabilno transfektovanim HEK293 ćelijama mereno je FACS. Ukratko, 250000 ćelija po bunariću inkubirano je sa navedenom koncentracijom imunokonjugata na ploči sa 96 bunarića sa okruglim dnom, inkubirano je tokom 30 min na 4°C, i jednom isprano pomoću PBS/0,1% BSA. Vezani imunokonjugati sudetektovani nakon inkubacije tokom 30 min na 4°Cpomoću FITC-konjugovanog AffiniPure F(ab')2 fragmenta kozjeg anti-humanog F(ab')2 specifičnog (Jackson Immuno Research Lab br. 109-096-097, radni rastvor: 1:20 razblažen u PBS/0,1% BSA, sveže pripremljeno) na 4°C pomoću FACS CantoII (softver FACS Diva).
Analiza FAP internalizacije nakon vezivanja putem FACS
Za nekoliko FAP antitela poznatih u struci opisano je da oni indukuju FAP intervenciju nakon vezivanja (opisano npr. Baum et al., J Drug Target 15, 399-406 (2007); Bauer et al., Journal of Clinical Oncology, 2010 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition), vol. 28 (May 20 Supplement), abstract no. 13062 (2010); Ostermann et al., Clin Cancer Res 14, 4584-4592 (2008)). Stoga smo analizirali osobine internalizacije Fab-IL-2-Fab imunokonjugata. Ukratko, GM05389 ćelije (fibroblasti humanih pluća) uzgajane u EMEM medijumu sa 15% FCS su odvojene, oprane, prebrojane, proverena je njihovaodrživost, i zasejane su sa gustinom od 2xl0<5>ćelija/bunariću, na ploče sa 12 bunarića. Sledećeg dana, FAP-ciljani imunokonjugati Fab-IL-2-Fab razblaženi su na hladnom medijumu i dopušteno je da se vežu na površinu ćelija 30 minuta na ledu. Višak nevezanog antitela je ispran korišćenjem hladnog PBS, a ćelije su dalje inkubirane u 0,5 ml potpunog prethodno zagrejanog medijuma na 37° C za naznačene vremenske periode. Kada su dostignute različite vremenske tačke, ćelije su prenete na led, jednom isprane hladnim PBS i inkubirane sa sekundarnim antitelom (FITC-konjugovani AffiniPure F(ab’)2 Fragment-kozji antihumani F(ab’)2 specifičan, Jackson Immuno Research Lab # 109-096-097, rastvor 1:20 ) tokom 30 min na 4°C. Ćelije su zatim dva puta isprane sa PBS/0,1% BSA, prenete na ploču sa 96 bunarića, centrifugirane 4 min na 4°C, 400 x g, i ćelijski peleti su ponovo suspendovani pomoću vorteksa. Ćelije su fiksirane pomoću 100 µl 2% PFA. Za merenja FACS, ćelije su ponovo suspendovane u 200 µl/uzorku PBS/0,1 % BSA, i merene po protokolu za ploče u uređaju FACS CantoII (softver FACS Diva).
Primer 2
Mi smo dizajnirali mutirane verzije IL-2 koje su obuhvatile jednu ili više od sljedećih mutacija (u poređenju sa IL-2 sekvencom nemutiranih vrsta prikazanim u SEQ ID NO: 1):
1. T3A - nokaut predviđenog mesta O-glikozilacije
2. F42A - nokaut interakcije IL-2/IL-2R α
3. Y45A - nokaut interakcije IL-2/IL-2R α
4. L72G - nokaut interakcija IL-2/IL-2R α
5. C125A - ranije opisana mutacija za izbegavanje disulfidno premošćenih IL-2 dimera
Mutantni IL-2 polipeptid koji sadrži sve mutacije 1-4 ovde se označava kao četvorostruki mutant IL-2 (qm). On dalje može sadržati mutaciju 5 (videti SEQ ID NO: 19).
Pored tri mutacije F42A, Y45A i L72G dizajniranih da ometaju vezivanje na CD25, odabrana je T3A mutacija da bi se eliminisalo mesto O-glikozilacije i dobio proteinski proizvod sa većom homogenošću i čistoćom kada se IL-2 qm polipeptid ili imunokonjugat izražava u eukariotskim ćelijama kao što su CHO ili HEK293 ćelije.
Za potrebe prečišćavanja, His6 tag je uveden na C-terminus povezan preko VD sekvence. Za upoređivanje generisana je nemutirana analogna verzija IL-2 koja sadrži samo C145A mutaciju kako bi se izbegli neželjeni intermolekularni disulfidni mostovi (SEQ ID NO: 3). Odgovarajuće molekularne težine bez signalne sekvence bile su 16423 D za gole IL-2 i 16169 D za gole IL-2 qm. Nemutirani i četvorostruki mutant IL-2 sa His tagom transfektovani su u HEK EBNA ćelijama u medijumu bez seruma (F17 medijum). Filtrirani supernatant je bio zamenjen puferom preko unakrsnog protoka, pre učitavanja na NiNTA Superflow Kertridž (5 ml, Qiagen). Kolona je isprana puferom za pranje: 20 mM natrijum fosfata, 0,5 M natrijum-hlorida pH 7,4 i eluirano puferom za eluiranje: 20 mM natrijum-fosfata, 0.5 M natrijum-hlorida 0.5 M imidazola pH 7.4. Nakon utovara, kolona je isprana sa 8 pufera za ispiranje kolone (CV), puferom za eluiranje od 10 CV 5 (odgovara 25 mM imidazola), a zatim eluirano sa gradientom do 0,5 M imidazola. Bazirani eluat je poliran hromatografijom na molekularnim sitima HiLoad 16/60 Superdex75 (GE Healthcare) u 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hloridu, 0,02% natrijum azidu pH 7,3. Na slici 2 prikazan je hromatogram His tag purifikacije za nemutirani goli IL-2. Bazen 1 je napravljen iz frakcija 78-85, bazen 2 iz frakcija 86-111. Slika 3 prikazuje hromatogram hromatografije na molekularnim sitima za IL-2 nemutiranog tipa, za svaki bazen frakcije od 12 do 14 su obedinjene. Na slici 4 prikazana je hromatografija na molekularnim sitima za IL-2 nemutiranog tipa, kao što je utvrđeno na koloni Superdex 75, 10/300 GL (GE Healthcare) u 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hloridu, 0,02% natrijum azidu pH 7,3. Bazeni 1 i 2 su sadržali 2 proteina od ca.22 i 20 kDa. Bazen 1 je imao više od većeg proteina, a bazen 2 je imao više od malog proteina, a to je zbog razlika u O-glikozilaciji. Prinosi su bili ca. Supernatant 0.5 mg/L za bazen 1 i ca.1,6 mg/L supernatant za bazen 2. Na slici 5 prikazan je hromatogram purifikacije His tag-a za četvorostruki mutant IL-2. Bazen 1 je napravljen iz frakcija 59-91, bazen 2 iz frakcija 92-111. Na slici 6 prikazan je hromatogram hromatografije na molekularnim sitima za četvorostruki mutant IL-2, ovde su zadržane samo 2 frakcije od 12 do 14. Na slici 7 prikazana je hromatografija na molekularnim sitima za četvorostruki mutant IL-2 kao što je utvrđeno na koloni Superdex 75, 10/300 GL (GE Healthcare) u 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hloridu, 0,02% natrijum azid pH 7,3. Priprema za goli četvorostruki mutant IL-2 sadrži samo jedan protein od 20 kD. Ovaj protein ima izbačeno mesto O-glikozilacije. Alikvoti golog IL-2 nemutiranog i četvorostrukog mutanta su pohranjeni zamrznuti na -80° C. Prinos je bio oko 0,9 mg/L supernatant.
Druga serija His-označenog četvorostrukog mutanta IL-2 je prečišćena kao što je opisano u prethodnom tekstu pomoću imobilizovane afinitetne hromatografije od metala (IMAC) i praćene hromatografijom na molekularnim sitima (SEC). Puferi koji su korišćeni za IMAC su bili 50 mM Tris, 20 mM imidazola, 0.5 M NaCl pH 8 za uravnoteženje kolone i pranje, i 50 mM Tris, 0.5 M imidazola, 0.5 M NaCl pH 8 za eluiranje. Pufer koji se koristi za SEC i završni formulacioni pufer je bio 20 mM histidin, 140 mM NaCl pH 6. Slika 43 prikazuje rezultat tog prečišćavanja. Prinos je bio 2,3 ml/L supernatant.
Nakon toga, afinitet za IL-2R βγ heterodimer i IL-2R α-podjedinicu su određeni površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Ukratko, ligand - bilo humane IL-2R αpodjedinice (Fc2) ili humanog IL2-R β čvora u otvoru heterodimera (Fc3) - je imobilisana na CM5 čipu. Posle toga, goli nemutirani tip (bazen 1 i 2) ili četvorostruki mutant IL-2 i Proleukin (Novartis/Chiron) nanošeni su na čip kao analiti na 25° C u HBS-EP puferu u koncentracijama u rasponu od 300 nM do 1,2 nM (1: 3 dil.). Stopa protoka je bila 30 μl/min i primenjeni su sledeći uslovi za asocijaciju: 180-ih, disocijacija: 300 s i regeneracija: 2 x 30 s 3M MgCl 2 za IL2-R β čvor γ otvor heterodimera, 10 s 50 mM NaOH za IL-2R α-podjedinicu. 1: 1 vezivanje je primenjeno za podešavanje (1: 1 vezivanje RI O, Rmax = lokalno za IL-2R βγ, očigledno K D , vezivanje 1: 1 RI = 0, Rmax = lokalno za IL-2R α). U tabeli 3 prikazane su odgovarajuće vrijednosti K D za vezivanje ljudskog nemutiranog i četvorostrukog mutanta IL-2, kao i Proleukina na IL-2R βγ i IL-2R α-podjedinicu.
TABELA 3. Afinitet mutanta IL-2 polipeptida za intermedijarni afinitet IL-2R i αpodjedinice IL-2R.
Podaci pokazuju da goli IL-2 četvorostruki mutant pokazuje željeno ponašanje i izgubio je vezivanje za α-podjedinicu IL-2R, dok je vezivanje za IL-2R βγ zadržano i uporedivo sa odgovarajućim IL-2 konstruktom nemutiranogeg tipa i Proleukinom. Razlike između bazena 1 i 2 nemutiranog tipa IL-2 verovatno se mogu pripisati razlikama u O-glikozilaciji. Ova varijabilnost i heterogenost su prevladali u IL-2 četvorostrukom mutantu uvođenjem T23A mutacije.
Primer 3
Tri mutacije L42A, Y45A i L72G i mutacija T3A su uvedene u Fab-IL-2-Lab formatu (Slika 1A) koristeći anti-LAP antitelo 4G8 kao model ciljanog domena ili kao pojedinačni mutanti: 1) 4G8 IL-2 T3A, 2) 4G8 IL-2 F42A, 3) 4G8 IL-2 Y45A, 4) 4G8 IL-2 L72G ili su kombinovani u Fab-IL-2 mt-Fab konstrukte kao: 5) trostruki mutant F42A/Y45A/L72G ili kao: 6) četvorostruki mutant T3A/F42A/Y45A/L72G za inaktiviranje mesta O-glikozilacije. Fab-IL-2 wt-Fab na bazi 4G8 služi za upoređivanje. Svi konstrukti sadržali su mutaciju C145A da bi izbegli disulfidno premošćene IL-2 dimere. Različiti Fab-IL 2-Fab konstrukti su ekspresovani u HEK 293 ćelijama i prečišćeni kao što je gore opisano preko proteina A i hromatografije na molekularnim sitima, kako je gore navedeno. Nakon toga afinitet odabranih IL 2 varijanti za humani i murinski IL 2R βγ heterodimer i za humanu i murinsku IL-2R α-podjedinicu određen je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) (Biacore) koristeći rekombinantni IL-2R βγ heterodimer i monomernu IL-2R α-podjedinicu pod sledećim uslovima: IL-2R α-podjedinica je imobilisana u dvije gustine i protočna ćelija sa višom imobilizacijom je korišćena za mutante koji su izgubili vezivanje CD25. SKorišćeni su sledeći uslovi: hemijska imobilizacija: humani IL-2R βγ heterodimer 1675 RU; mišiji IL-2R βγ heterodimer 5094 RU; humana IL-2R α-podjedinica 1019 RU; humana IL-2R α -podjedinica 385 RU, murinska IL-2R α -podjedinica 1182 RU; murinska IL-2R α -podjedinica 378 RU, temperatura: 25° C, analiti: 4G8 Fab-IL 2 varijante-Fab konstrukti 3,1 nM do 200 nM, protok 40 μl/min, asocijacija: 180 s, disocijacija: 180 s, regeneracija: 10 mM glicin pH 1,5, 60 s, 40 μl/min. Podešavanje: dva modela reakcije države (konformacione promene), RI = 0 Rmax = lokalno. Rezultati kinetičke analize dati su u Tabeli 4.
TABELA 4. Afinitet FAP-ciljanih imunokonjugata koji sadrže mutante IL-2 polipeptide intermedijarnog afiniteta IL-2R i IL-2R α-podjedinice (K D ).
Istovremeno vezivanje za IL 2R βγ heterodimer i FAP pokazao je SPR. Ukratko, humani IL 2R βγ "knob-in-hole" konstrukt je bio hemijski imobilisan na CM5 čipu, a 10 nM Fab-IL-2-Fab konstrukti su zauzeti 90 s. Humani FAP je služio kao analit u koncentracijama od 200 nM do 0,2 nM. Uslovi su bili: temperatura: 25° C, pufer: HBS-EP, protok: 30 μl/min, asocijacija: 90 s, disocijacija: 120 s. Regeneracija je obavljena za 60 s sa 10 mM glicina pH 2. Montaža je izvedena sa modelom za vezivanje 1: 1, RI 0, Rmax = globalno. Ispitivanje premošćavanja SPR pokazalo je da Fab-IL-2-Fab konstrukti, kako nemutiranih, tako i četvorostrukih mutanata, kao i na osnovu afiniteta zrelog FAP veziva 28H1 ili roditeljskih 3F2 ili 4G8 antitela, mogu vezati u koncentraciji od 10 nM istovremeno sa heterodimerom IL 2R βγ imobilizovanom na čipu, kao i sa humanim FAP-om koji se koristi kao analit (Slika 8). Određeni afiniteti su prikazane u Tabeli 5.
TABELA 5. Afinitet FAP-ciljanih imunokonjugata, koji sadrže mutante IL-2 polipeptide i vezani za IL-2R intermedijarni afinitet , za FAP (K D ).
Uzeti zajedno SPR podaci pokazali su da i) mutacija T3A ne utiče na vezivanje za CD25, ii) tri mutacije F42A, Y45A i L72G ne utiču na afinitet za IL 2R βγ heterodimer dok smanjuju afinitet za CD25 u ovom redu: wt = T3A> Y45A (približno 5x niže)> L72G (približno 10x niže)> F42A (približno 33x niže); iii) kombinacija tri mutacije F42A, Y45A i L72G sa ili bez mutanta T3A na mestu glikozilacije dovodi do potpunog gubitka vezivanja CD25 kao što je utvrđeno u uslovima SPR, iv) iako afinitet humanog IL-2 za mišji IL- 2R βγ heterodimer i IL-2R αpodjedinica se smanjuju približno za faktor od 10 u poređenju sa humanim receptorima IL-2 odabrane mutacije ne utiču na afinitet za mišićni IL-2R βγ heterodimer, već ukidaju vezivanje za IL-2R α mišiju-podjedinicu shodno tome. To pokazuje da miš predstavlja validan model za proučavanje farmakoloških i toksikoloških efekata IL-2 mutanata, iako ukupni IL-2 pokazuje manju toksičnost kod glodara nego kod ljudi.
Pored gubitka O-glikozilacije, jedna dodatna prednost kombinacije četiri mutacije T3A, F42A, Y45A, L72G je niža površinska hidrofobičnost IL-2 četvorostrukog mutanta zbog razmene površinskih izloženih hidrofobnih ostataka kao što su fenilalanin, tirozin ili leucin od alanina. Analiza temperature agregacije dinamičkom rasprostranjenošću svetlosti pokazala je da je temperatura agregacije za imunokonjugate Fab-IL-2-Fab koji su ciljani FAP-om imali IL-2 nemutirani ili četvorostruki mutant u istom rasponu: ca.57-58° C za 3F2 roditeljski Fab-IL-2-Fab i za afinitet sazreli 29B113F2-derivat; i u opsegu 62-63° C za roditelje Fab-IL-2-Fab 4G8 i zrelih 28H1, 4B9 i 14B34G8 derivata, što pokazuje da kombinacija četiri mutacije nije imala negativnog utjecaja na stabilnost proteina. Kao podrška povoljnim osobinama izabranog četvorostrukog mutanta IL-2, prinosi transientne ekspresije ukazuju na to da četvorostruki mutant u Fab-IL-2 qm-Fab formatu može dovesti do povećanja izraženih prinosau odnosu na one koje su posmatrane za odgovarajuće Fab-IL -2 wt-Fab konstrukte. Na kraju, farmakokinetička analiza pokazuje da oba Fab-IL-2 Fab-IL-2 qm-Fab baziran na 4G8 i Fab-IL-2 wt-Fab imaju uporedive osobine PK (vidi primer 9 u nastavku). Na osnovu ovih podataka i ćelijskih podataka opisanih u primeru 4 ispod četvorostrukog mutanta T3A, F42A, Y45A, L72G izabrana je kao idealna kombinacija mutacija za ukidanje CD25 vezivanja IL-2 u ciljanom Fab-IL-2-Fab imunokonjugatu.
Primer 4
FAP ciljani Fab-IL 2-Fab imunokonjugati na bazi 4G8, koji sadrže nemutirane IL-2 ili pojedinačne mutante 4G8 IL-2 T3A, 4G8 IL-2 F42A, 4G8 IL-2 Y45A, 4G8 IL-2 L72G ili odnosni trojni (F42A/Y45A/L72G) ili četvorostruki mutant (T3A/F42A/Y45A/L72G) IL-2 su naknadno testirani u ćelijskim testovima u poređenju sa Proleukinom kao što je gore opisano.
IL-2 izazvano IFN-γ oslobađanje je mereno nakon inkubacije NK ćelijske linije NK92 sa konstruktima (slika 9). NK92 ćelije izražavaju CD25 na svojoj površini. Rezultati pokazuju da je Fab-IL-2-Fab imunokonjugat koji sadrži nemutirani IL-2 bio slabiji u induciranju IFN-γ oslobađanja od Proleukina, što se može očekivati od ca. 10-tostruko nižeg afiniteta Fab-IL-2 wt-Fab za IL-2R βγ heterodimera. Uvođenje pojedinačnih mutacija koje ometaju vezivanje CD25 kao i kombinaciju tri mutacija koje ometaju CD25 vezivanje u trostrukom mutantu IL-2 rezultirale su Fab-IL-2-Fab konstruktima koji su uporedivi sa IL-2 nemutiranim tipom konstrukta u smislu potencije i apsolutne indukcije IFN-y oslobađanja unutar greške postupka.
TABELA 6. Indukcija IFN-y oslobađanja od NK ćelija Fab-IL-2-Fab imunokonjugata koji sadrže mutirane IL-2 polipeptide.
Posle toga, indukcija proliferacije izolovanih humanih NK ćelija NK Fab-IL-2-Fab imunokonjugata je procenjena u analizi proliferacije (Cell Titer Glo, Promega) (Slika 10). Za razliku od NK92 ćelija, sveže izolovane NK ćelije ne izražavaju CD25 (ili samo vrlo niske količine). Rezultati pokazuju da je Fab-IL-2-Fab imunokonjugat koji sadrži IL-2 nemutiranog tipa, 10 puta manje potenan u induciranju proliferacije NK ćelija od Proleukina, što se može očekivati od desetostruko nižeg afiniteta Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata za IL-2R βγ heterodimer. Uvođenje pojedinačnih mutacija koje ometaju CD25 vezivanje, kao i kombinacija tri mutacije koje ometaju CD25 u trostrukom mutantu IL-2 rezultirale su Fab-IL-2-Fab konstruktima koji su uporedivi sa IL-2 konstruktom nemutiranog tipa u smislu potencije i apsolutne indukcije proliferacije; postojalo je samo malo mijenjanje potencijala za Fab-IL-2-Fab trojni mutant. U drugom eksperimentu indukcija proliferacije PHA aktiviranih T ćelija je procenjena nakon inkubacije sa različitim količinama Proleukina i Fab-IL-2-Fab imunokonjugata (Slika 11). Kako aktivirane T ćelije izražavaju CD25, jasno se smanjuje proliferacija T ćelija nakon inkubacije sa imunokonjugatima koji sadrže pojedinačne mutante IL-2 F42A, L72G ili Y45A; sa F42A pokazujući najjače smanjenje praćeno L72G i Y45A, dok je kod upotrebe Fab-IL-2 wt-Fab ili Fab-IL-2 (T3A) -Fab aktivacija skoro zadržana u odnosu na Proleukin. Ovi podaci odražavaju smanjenje afiniteta za CD25 kao što je utvrđeno SPR (primer gore). Kombinacija tri mutacije koje ometaju vezivanje CD25 u trostrukom mutantu IL-2 dovele su do imunokonjugata koji je posredno značajno umanjio indukciju proliferacije T ćelija u rastvor. U skladu s ovim nalazima, izmerili smo ćelijsku smrt T ćelija, kako je određeno pomoću dodatka Anexin V/PI nakon previše stimulacije indukovane prvom stimulacijom 16 h sa 1 μg//ml PHA, drugom stimulacijom 5 dana sa Proleukinom ili odgovarajućim Fab-IL-2-Fab imunokonjugatima, praćena trećom stimulacijom sa 1 μg/ml PHA. U ovom okruženju smo primetili da je aktivirana indukovana ćelijska smrt (AICD) u previše-stimulisanim T ćelijama snažno smanjena sa Fab-IL-2-Fab imunokonjugatima koji sadrže pojedinačne mutante IL-2 F42A, L72G i Y45A koje ometaju CD25 vezivanje, sa F42A i L72G pokazujući najjaču redukciju, koja je bila slična redukciji ostvarenom kombinacijom tri mutacije u imunokonjugatu koji sadrži IL-2 trostruki mutant (Slika 12). U poslednjem setu eksperimenata proučavali smo efekte Fab-IL-2 qm-Fab na indukciju STAT5 fosforilacije u poređenju sa Fab-IL-2 wt-Fab i Proleukinom na ljudskim NK-ćelijama, CD4<+>T ćelijama, CD8<+>T ćelijama i T reg ćelijama iz humanih PBMC (slika 13). Za NK ćelije i CD8<+>T ćelije koji ne pokazuju ili pokazuju veoma nisku ekspresiju CD25 (što znači da je IL-2R signalizacija posredovana putem IL-2R βγ heterodimera), rezultati pokazuju da Fab-IL-2-Fab format koji sadrži nemutirane vrste IL-2 je bio ca. 10 puta manje potentan u induciranju STAT5 fosforilacije od Proleukina, a Fab-IL-2 qm-Fab je uporediv sa Fab-IL-2 wt-Fab konstruktom. Na CD4<+>T ćelijama, koji pokazuju brzu regulaciju CD25 nakon stimulacije, Fab-IL-2 qm-Fab je bio manje potentniji nego Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugat, ali je ipak pokazao uporedivu indukciju IL- 2R signalizacije u zasićenim koncentracijama. Ovo je u suprotnosti sa T reg ćelijama gdje je potencija Fab-IL-2 qm-Fab značajno smanjena u odnosu na Fab-IL-2 WT-Fab imunokonjugata zbog visokog eksprimiranja CD25na T reg ćelijama i kasnijem visokom vezujućem afinitetu imunokonjugata wt-Fab Fab-IL-2 sa CD25 na T reg ćelijama. Kao posledica ukidanja vezivanja CD25 u imunokonjugatu qm-Fab Fab-IL-2, signalizacija IL-2 u T reg ćelijama se aktivira samo preko IL-2R βγ heterodimera u koncentracijama gde se aktivira IL-2R signalizacija na CD25 - negativne efektorske ćelije preko IL-2R βγ heterodimera. Uzeto zajedno, IL-2 četvorostruki mutant koji je ovde opisan, u stanju je da aktivira IL-2R signalizaciju kroz heterodimer IL-2R βγ, ali ne rezultira ni AICD niti preferencijalnom stimulacijom T reg ćelija u odnosu na druge efektorske ćelije.
Primer 5
Bazirajući se na podacima opisanim u Primerima 2 i 3 FAP-ciljani Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati sa zrelim afinitetom na bazi klonova 28H1 ili 29B11 su generisani i prečišćeni kao što je gore opisano u odeljku opštih metoda. Detaljnije, FAP-ciljani 28H1 ciljani Fab-IL-2 qm-Fab pročišćen je jednim afinitetnim korakom (protein G), praćen hromatografijom na molekularnim sitima (Superdex 200). Ekvilibracija kolone izvršena je u PBS, a supernatant iz stabilnog CHO bazena (CDCHO medijum) je natovaren na kolonu proteina G (GE Healthcare), kolona je isprana sa PBS i uzorci su naknadno eluirani sa 2,5 mM HC1 i frakcije su odmah neutralizovane sa 10x PBS. Hromatografija na molekularnim sitima izvršena je u puferu za finalnu formulaciju: 25 mM natrijum fosfata, 125 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina pH 6,7 na koloni Superdex 200. Na slici 14 prikazani su eluacijski profili iz prečišćavanja i rezultati analitičke karakterizacije proizvoda od strane SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel 4-20%, Invitrogen, MOPS aktivni pufer, smanjeni i ne smanjeni). S obzirom na niski kapacitet vezivanja 28H1 Fab fragmenta na protein G i protein A dodatni koraci hvatanja mogu rezultirati većim prinosima.
FAP-ciljani 4G8, 3F2 i 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab i MCSP-ciljani MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su prečišćeni sa jednim stepenom afiniteta (protein A) praćene hromatografijom na molekularnim sitima (Superdex 200) . Ujednačavanje kolone izvršeno je u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum citrata pH 7.5, a supernatant je natovaren na kolonu proteina A. Prvo pranje je izvedeno u 20 mM natrijum fosfatu, 20 mM natrijum citrata, pH 7.5, a zatim sledi drugo pranje: 13.3 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 500 mM natrijum hlorida, pH 5 .45. Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su eluirani sa 20 mM natrijum citratom, 100 mM natrijum hloridom, 100 mM glicinom pH 3. Hromatografija na molekularnim sitima izvršena je u puferu za finalnu formulaciju: 25 mM kalijum fosfata, 125 mM natrijum hlorida, 100 mM glicin pH 6,7. Na slici 15 prikazani su profili elucije iz prečišćavanja i rezultati analitičke karakterizacije proizvoda od strane SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris Mini Gel 4-20%, Invitrogen, MOPS aktivni pufer, smanjeni i ne smanjeni) za 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i slika 16 za MHLG1 KV9 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugate.
FAP-ciljani proteini fuzije IgG-IL-2 qm na bazi FAP-antitela 4G8, 4B9 i 28H1 i kontrolni DP47GS neciljani IgG-IL-2 qm fuzioni protein generisani su kao što je gore opisano u odeljku opštihpostupaka. Na slikama 46 i 47 prikazani su odgovarajući hromatogrami i profili elucije za prečišćavanje (A, B), kao i analitičke SDS-PAGE i hromatografije na molekularnim sitima finalnih prečišćenih konstrukata (C, D) za konstrukte zasnovane na 4G8 i 28Hl . Prinosi transientne ekspresije su bili 42 mg/L za bazirane na 4G8 i 20 mg/L za imunokonjugat IgG-IL-2 qm baziranim na 28Hl.
FAP vezujuća aktivnost IgG-IL-2 qm imunokonjugata na bazi anti-FAP antitela 4G8 i 28H1 određena je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) na Biacore mašini u poređenju sa odgovarajućim neizmenjenim IgG antitelima. Ukratko, anti-His antitelo (Penta-His, Qiagen 34660) je imobilisano na CM5 čipovima da bi zauzelo 10 nM His-označenog humanog FAP (20 s). Temperatura je bila 25° C, a HBS-EP je korišćen kao pufer. Koncentracija analita bila je 50 nM do 0,05 nM pri stopi protoka od 50 μl/min (asocijacija: 300 s, disocijacija: 900 s, regeneracija: 60 s sa 10 mM glicina pH 2). Podešavanje je izvršeno na bazi 1: 1 veznog modela, RI = 0, Rmax = lokalni (zbog formata za snimanje). Tabela 7 daje procenjene očigledno bivalentne affinities (pM avidity), kao što je određeno SPR vezivanjem 1: 1 RI = 0, Rmax = lokalno.
TABELA 7.
Podaci pokazuju da je u okviru greškeafinitet postupka za humani FAP zadržan iza munokonjugat zasnovan na 28H1 ili je samo malo smanjen za imunokonjugat zasnovan na 4G8 u poređenju sa odgovarajućim neizmijenjenim antitelima.
Primer 6
Afinitet FAP-ciljanih Fab-IL-2-Fab imunokonjugata baziranih na 28H1 i 29B11 sa zrelim afinitetom, od kojih svaki sadrži IL-2 sa nemutiranim ili četvorostrukim mutantom, i Fab-IL-2 Fab-based Fab-IL-2 zasnovan na 3F2 određeni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) za humani, murinski i cinomolgus IL-2R βγ heterodimer koristeći rekombinantni IL-2R βγ heterodimer u sledećim uslovima: ligand: humani, murinski i cinomolgus IL-2R β čvor γ heterodimer otvor imobilisana na CM5 čip, analit: 28H1 ili 29B11 Fab-IL-2-Fab (koji sadrži nemutantni ili četvorostruki mutant IL-2), 3F2 Fab-IL-2-Fab (sadrži IL-2 nemutiranog tipa), temperatura: 25° C ili 37° C, pufer: HBS-EP, koncentracija analita: 200 nM do 2,5 nM, protok: 30 μl/min, asocijacija: 300 s, disocijacija: 300 s, regeneracija: 60 s 3M MgCl 2 , podešavanje: 1: 1 vezivanje, Rmax = globalno. Afinitet FAP-ciljanijh Fab-IL-2-Fab imunokonjugata na bazi 28H1 i 29B11 sa zrelim afinitetom, od kojih je svaki sadržavao nemutirani ili četvorostruki mutant IL-2 i Fab-IL-2 wt-Fab baziran na 3F2. je određen površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) za humanu, murinsku i cinomolgnu IL-2R α-podjedinicu koristeći rekombinantnu monomernu IL-2R α-podjedinicu pod sledećim uslovima: ligand: humana, murinska i cinomolgus IL-2R αpodjedinica imobilisana na CM5 čip, analit: 28H1 ili 29B11 Fab-IL-2-Fab (sadrži nemutirane ili mutirane IL-2), 3F2 Fab-IL-2-Fab (sadrži IL-2 nemutiranog tipa), temperatura: 25° C ili 37° C, pufer: HBS-EP, koncentracija analita 25 nM do 0,3 nM, protok: 30 μl/min, asocijacija: 120 s, disocijacija: 600 s, regeneracija: nema, podešavanje: 1: 1 vezivanje, RI = 0, Rmax = globalno.
Rezultati kinetičke analize sa IL-2R βγ heterodimerom dati su u Tabeli 8.
TABELA 8. Vezivanje Fab-IL-2-Fab imunokonjugata koji sadrže Fab i mutant IL-2 sa zrelim afinitetom do IL-2R βγ heterodimera.
Dok je afinitet humanog IL-2 na humani IL 2R βγ heterodimer opisan na oko 1 nM, imunokonjugati Fab-IL-2-Fab (koji sadrže nemutirani ili četvorostruki mutant IL-2) oba imaju smanjene afinitete između 6 i 10 nM, a kao što je pokazano za goli IL-2 iznad, afinitet za mišji IL-2R je oko 10 puta slabiji nego kod humanog i cinomolgus IL-2R.
Rezultati kinetičke analize sa IL-2R α-podjedinicom dati su u Tabeli 9. U odabranim uslovima ne postoji vezivanje koje se može detektovati od imunokonjugata koji sadrže četvorostruki mutant IL-2 na humanoj, murinskoj ili cyno IL-2R α-podjedinici.
TABELA 9. Vezivanje Fab-IL-2-Fab imunokonjugata koji sadrže afinitet sazrele Fab i mutant IL-2 sa zrelim afinitetom na IL-2R α-podjedinice.
Afinitet MCSP-ciljanih MHLG1-KV9 Fab-IL-2-Fab imunokonjugata, koji obuhvata IL-2 nemutirane ili četvorostruke mutante, određeni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) za humani IL-2R βγ heterodimer koristeći rekombinantni IL-2R βγ heterodimer u sledećim uslovima: heterodimer humanog IL-2R β čvor γ otvor imobilisan je na CM5 čipu (1600 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab su korišćeni kao analit na 25° C u HBS-P puferu. Koncentracija analita bila je 300 nM do 0,4 nM (1: 3 dil.) Za IL-2R βγ pri protoku od 30 μl/min (vreme asocijacije 180 s, vreme disocijacije 300 s). Regeneracija je obavljena za 2x30 s sa 3M MgCl 2 za IL-2R βγ. Podaci su podešeni koristeći vezu 1: 1, , Rmax = lokalni za IL-2R βγ.
Afinitet MCSP-ciljanih imunokonjugata Fab-IL-2-Fab MHLG1-KV9, koji se sastoje od nemutiranihh ili četvorostrukih mutanata IL-2, određeni su površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) za humanu IL-2R α-podjedinicu pomoću rekombinantne monomerne IL-2R αpodjedinice pod sledećim uslovima: humana IL-2R α-podjedinica je imobilisana na CM5 čipu (190 RU). MHLG1-KV9 Fab-IL-2 wt-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab su korišćeni kao analit na 25° C u HBS-P puferu. Koncentracija analize iznosila je 33,3 nM do 0,4 nM (1: 3 dil.) Za IL-2R α pri protoku od 30 μl/min (vreme asocijacije 180 s, vreme disocijacije 300 s). Regeneracija je obavljena 10 s s 50 mM NaOH za IL-2R α. Podaci su podešeni koristeći vezu 1: 1, RI = 0, Rmax = globalni za IL-2R α.
Rezultati kinetičke analize sa IL-2R βγ heterodimerom dati su u Tabeli 10.
TABELA 10.
Podaci potvrđuju da je MCSP-ciljani MHLG1-KV9 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat zadržao afinitet za IL-2R βγ receptor, dok je afinitet vezivanja za CD25 ukinut u odnosu na imunokonjugat koji sadrži IL-2 nemutiranog tipa.
Nakon toga, afinitet IgG-IL-2 qm baziranog na 4G8 i 28H1 imunokonjugira na IL-2R βγ heterodimer i IL-2R α-podjedinicu određenen je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) u direktnom poređenju sa formatom Fab- IL-2 qm-Fab imunokonjugata. Ukratko, ligandi - ili humana IL-2R α-podjedinica ili humani IL-2R βγ heterodimer - su imobilisani na CM5 čipu. Nakon toga imunokonjugati IgG-IL-2 qm na bazi 4G8 i 28H1 i Fab-IL-2 qm-Fab na bazi 4G8 i 28H1 nanošeni su na čip kao analiti na 25° C u HBS-EP puferu u koncentracijama u rasponu od 300 nM do 1,2 nM (1: 3 dil.). Stopa protok aje bila 30 μl/min i primenjeni su sledeći uslovi za asocijaciju: 180 s, disocijacija: 300 s i regeneracija: 2 x 30 s sa 3 M MgCl 2 za IL-2R βγ heterodimer, 10 s sa 50 mM NaOH za IL-2R α-podjedinicu. 1: 1 vezivanje je primenjeno za podešavanje (1: 1 vezivanje Rmax = lokalno za IL-2R βγ, očigledno K D , vezivanje 1: 1 RI = 0, Rmax = lokalno za IL-2R α). R<ELEVANTNE>vrednosti K<D>date su u tabeli 11.
TABELA 11.
Podaci pokazuju da se iimunokonjugati IgG-IL-2 bazirani na 4G8 i 28H1 vezuju sa najmanje isto tako dobrim afinitetom kao Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati na IL-2R βγ heterodimer, dok se ne vezuju za IL-2R α-podjedinicu zbog uvođenja mutacija koje ometaju vezivanje CD25. U poređenju sa odgovarajućim Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatima, afinitet proteina fuzije IgG-IL-2 qm izgleda malo poboljšan u okviru greške postupka.
Primer 7
U prvom setu eksperimenata potvrdili smo da su FAB-ciljani imunokonjugati Fab-IL-2-Fab koji se sastoje od IL-2 nemutiranog ili mutanta, mogli su se vezati za FAP-eksprimirajuće HEK 293-FAP ćelije sa FACS-om (slika 17 ) i da ćelijska mutacija četvorostrukih IL-2 nije uticala na vezivanje za FAP-eksprimirajuće ćelije (Slika 18).
TABELA 12. Vezivanje Fab-IL-2-Fab imunokonjugata na FAP-ekspresiju HEK ćelija.
Konkretno, ovi eksperimenti vezivanja pokazali su da su FAP veznici 28H1, 29B11, 14B3 i 4B9 sa zrelim afinitetom kao Fab-IL-2 qm-Fab pokazuju superiorno apsolutno vezivanje za ciljne ćelije HEK 293-FAP u poređenju sa Fab-IL-2- Fab imunokonjugatima na bazi matičnih FAP veznika 3F2 (29B11, 14B3, 4B9) i 4G8 (28H1) (Slika 17), dok zadržavaju visoku specifičnost i ne vezuju za HEK 293 ćelije transfektirane sa DPPIV, bliskim homologom FAP ili HEK 293 lažno transfektirane ćelije. Za upoređivanje klona M261 mišijeg anti-humanog CD26-PE DPPIV antitela (BD Biosciences, # 555437) je korišćen kao pozitivna kontrola (Slika 19). Analiza internalizaciskih osobina pokazala je da vezivanje Fab-IL-2-Fab imunokonjugata ne dovodi do indukcije FAP-ove internalizacije (slika 20).
U daljem eksperimentu, FACS je izmerio vezivanje FAP-ciljanih IgG-IL-2 qm na bazi 4G8 i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata humanom FAP-u izraženim na stabilno transfektovanim HEK293 ćelijama. Rezultati su prikazani na Slici 48. Podaci pokazuju da se IgG-IL-2 qm imunokonjugat vezuje za FAP-eksprimirajuće ćelije sa vrijednošću EC50 od 0,9 nM, slično onoj sa odgovarajućim Fab-IL-2 qm-Fab konstruktom na bazi 4G8(0,7 nM).
Anti-FAP Fab-IL-2-Fab imunokonjugati zrelog afiniteta koji sadrže nemutirani IL-2 ili četvorostruki mutant su naknadno testirani u ćelijskim testovima u poređenju sa Proleukinom kako je opisano u gore navedenim primerima.
IL-2 izazvano IFN-γ oslobađanje je mereno u supernatantu pomoću ELISA nakon inkubacije NK ćelijske linije NK92 sa ovim imunokonjugatima (slika 21) tokom 24 h. NK92 ćelije izražavaju CD25 na svojoj površini. Rezultati pokazuju da je Fab-IL-2-Fab imunokonjugat koji sadrži IL-2 nemutiranog tipa bio slabiji u induciranju IFN-γ oslobađanja od Proleukina, što se može očekivati od ca. desetostruko nižeg afiniteta Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugata za IL-2R βγ heterodimer. Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati bili su prilično uporedivi sa odgovarajućim konstruktom nemutiranog tipa za izabrani klon u smislu potencije i apsolutne indukcije IFN-γ oslobađanja uprkos činjenici da NK92 ćelije izražavaju izvesnu količinu CD25. Međutim, moglo bi se primetiti da je 29B11 Fab-IL-2 qm-Fab indukovao manje otpuštanje citokina u odnosu na Fab-IL-2 wt-Fab 29B11, kao i konstrukte 28H1 i 4G8, kod kojih se javila samo malo promena u potentnosti zabeležena za Fab-IL-2 qm-Fab preko Fab-IL-2 wt-Fab.
Pored toga, MCSP-ciljani imunokonjugat Fab-IL-2 qm-Fab baziran na MHLGl-KV9 u poređenju sa imunokonjugatima Fab-IL-2 qm-Fab na bazi 28H1 i 29B11 i analize oslobađanja IFN-γ na ćelijama NK92. Slika 22 pokazuje da je MCSP-ciljani imunokonjugat Fab-IL-2 qm-Fab baziran na MHLGl-KV9 prilično uporediv u inducivanju IFN-y oslobađanja u FAP-ciljane imunokonjugate Fab-IL-2 qm-Fab.
Nakon toga, indukcija proliferacije NK92 ćelija sa IL-2 tokom perioda od 3 dana je procenjena u analizi proliferacije postupkom ATP merenja koristeći CellTiter Glo (Promega) (Slika 23). S obzirom na to da NK92 ćelije izražavaju niske količine CD25, razlike između Fab-IL-2-Fab imunokonjugata koji sadrže IL-2 nemutiranog tipa i imunokonjugate koji sadrže četvorostruki mutant IL-2 mogu se otkriti u analizi proliferacije, međutim, u uslovima zasićivanja oba su postigla sličnu apsolutnu indukciju proliferacije.
U daljem eksperimentu proučavali smo efekte FAP-usmerenog Fab-IL-2 qm-Fab 28H1 imunokonjugata sa zrelim afinitetom na indukciju STAT5 fosforilacije u poređenju sa 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i Proleukinom na humanim NK ćelijama, CD4<+>T ćelijama, CD8<+>T ćelijama i T reg ćelijama iz humanih PBMC (slika 24). Za NK ćelije i CD8<+>T ćelije, koji ne pokazuju malo ili pokazuju vrlo nisko CD25 eksprimiranje (što znači da je IL-2R signalizacija posredovana preko IL-2R βγ heterodimera), rezultati su pokazali da je Fab-IL-2-Fab imunokonjugat koji sadrži nemutirani tip IL-2 jbio ca. > 10 puta manje potentan u izazivanju IFN-γ oslobađanja od Proleukina, i da je Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat bio vrlo malo manje potentan od Fab-IL-2 wt-Fab konstrukta. Na CD4<+>T ćelijama koje pokazuju brzu regulaciju CD25 nakon stimulacije, Fab-IL-2 qm-Fab je bio znatno manje snažan od imunokonjugata wt-Fab Fab-IL-2, ali je ipak pokazao uporedivu indukciju IL- 2R signalizacija u zasićenim koncentracijama. Ovo je u suprotnosti sa T
reg ćelijama, gde je potencija Fab-IL-2 qm-Fab značajno smanjena u poređenju sa Fab-IL-2 wt-Fab konstruktom zbog visoke CD25 ekspresije na T reg regijama i naknadnim visokim vezujućim afinitetom Fab-IL-2 wt-Fab konstrukta na CD25 na T reg ćelijama. Kao posledica ukidanja vezivanja CD25 u imunokonjugatu Fab-IL-2 qm-Fab, signalizacija IL-2 u T reg ćelijama se aktivira samo preko heterodimera IL-2R βγ u koncentracijama gde se aktivira IL-2R signalizacija na CD25 negativne efektorske ćelije kroz IL-2R βγ heterodimer. Relevantne vrednosti pM EC50 date su u Tabeli 13.
TABELA 13. Indukcija IFN-γ oslobađanja od NK ćelija pomoću 28H1 FAP ciljanih Fab-IL-2-Fab imunokonjugata koji sadrže mutirane IL-2 polipeptide.
U drugom setu eksperimenata, biološka aktivnost FGT ciljanih IgG-IL-2 qm i Fab-IL-2 imunokonjugata qm-Fab 4G8 ispitana je u nekoliko ćelijskih testova.
IgG-IL-2 qm i 28H1-bazirani imunokonjugati Fab-IL-2 qm-Fab ciljaju se na FAP ciljani 4G8 za indukciju IFN-γ oslobađanja od NK92 ćelija indukovane aktivacijom signala IL-2R βγ. Slika 49 pokazuje da je imunokonjugat IgG-IL-2 qm na bazi 4G8 podjednako efikasan u indukciji IFN-γ oslobađanja kao afinitet sazrevan Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugat Fab-IL-2 baziran na 28H1.
Proučavali smo i efekte imunokonjugata IgG-IL-2 qm imunokonjugata IgG-IL-2 baziranog na 4G8 na indukciju STAT5 fosforilacije u poređenju sa Fab-IL-2 wt-Fab i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati Fab-IL-2 kao i Proleukin na ćelijama NK, CD4<+>T ćelijama, CD8<+>T ćelijama i T reg ćelijama iz humanih PBMC. Rezultati ovih eksperimenta prikazani su na Slici 50. Za ćelije NK i CD8<+>T ćelije imunokonjugat IgG-IL-2 qm na bazi 4G8 bio je desetostruko manje potentan u induciranju STAT5 fosforilacije nego Proleukin, ali je nešto snažniji od Fab-IL-2 wt-Fab baziranog na 28H1 i Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati. Na CD4<+>T ćelijama imunokonjugat IgG-IL-2 qm koji je baziran na 4G8 bio je manje potentan od imunokonjugata Fab-IL-2 wt-Fab 28H1, ali nešto jači od 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata i i dalje je postojala indukcija signala IL-2R pri zasićujućim koncentracijama uporedivim sa Proleukinom i 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab. Ovo je u suprotnosti sa T reg ćelijama gdje potenciju 4G8-baziranih IgG-IL-2 qm i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatima značajno je smanjen u odnosu na Fab-IL-2 WT-Fab immunoconjugate.
Uzeto zajedno, IL-2 četvorostruki mutant opisan ovde je u mogućnosti da aktivira IL-2R signalizaciju preko IL-2R βγ heterodimera sličan IL-2 nemutiranog tipa, ali ne rezultira preferencijalnom stimulacijom T reg ćelija u odnosu na druge efektorske ćelije .
Primer 8
Antitumoralni efekti FAP-ciljanih imunookonjugata Fab-IL-2 qm-Fab procenjeni su in vivo u poređenju sa FAP-ciljanim imunokonjugatima Fab-IL-2 u ACHN ksenograftu i LLC1 singeničnim modelima. Svi Fab-IL-2-Fab imunokonjugati Fab-IL-2-Fab (koji sadrže nemutirani ili četvorostruki mutant IL-2) prepoznaju FAP miš i IL-2R murine. Dok je ACHN ksenograft model kod SCID-humanih FcγRIII transgenskih miševa snažno pozitivan za FAP u IHC-u, to je imunološki kompromitovan model i može odražavati samo imunološke efektore mehanizme posredovanih NK ćelijama i/ili makrofagima/monocitima, ali mu nedostaje imunitet posredovan T-ćelijama i tako ne može odražavati AICD ili efekte posredovane kroz T reg ćelije. Singenični LLC1 model, u kontrastu sa potpuno imunokompetentnim mišem, može odražavati i imunološke efektorne mehanizme posredovane adaptivnim T ćelijama, ali pokazuje prilično nisku ekspresiju FAP u mišui stromu. Svaki od ovih modela tako delimično odražava situaciju koja se sreće kod tumora čoveka.
ACHN model ksenografta karcinoma bubrežnih ćelija
FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su testirani korišćenjem ćelijske linije ACHN humanih renalnih ćelija adenokarcinoma, intra-renalno injektirane u SCID-humane transgene miševe FcγRIII. ACHN ćelije originalno su dobijene od ATCC (American Type Culture Collection) i posle ekspanzije deponirane u unutrašnjoj banci ćelija Glycart. ACHN ćelije su kultivisani u DMEM-u koji sadrži 10% FCS na 37°C u atmosferi zasićenoj vodom sa 5% C0. In vitro prolaz 18 korišćen je za intrarenalnu injekciju, pri održivosti od 98,4%. Mali rez (2 cm) napravljen je na desnom boku i peritonealnom zidu anesteziranih SCID miševa. Pedeset μl suspenzije ćelija (1x10<6>ACHN ćelija u AimV medijumu) ubrizgane su 2 mm subkapsularno u bubreg. Rane kože i peritonealni zid su zatvoreni pomoću obujmica. 62 SCID-FcγRIII ženke miševa (GLYCART-RCC); starosti od 8-9 nedelja na početku eksperimenta (uzgajane u kompaniji Švicarska) su održavane u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne stude pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2008016). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje. Miševi su injektirani intrarenalno 0. dana studije sa 1x10<6>ACHN ćelijama, randomizirane i merene. Jedne nedelje nakon injekcije tumorskih ćelija, miševi su injektirani i.v. sa 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab tri puta nedeljno tri nedelje. Svi miševi su injektirani i.v. sa 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi vehikuluma su ubrizgane PBS i grupe za tretman sa 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab ili 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugatom. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, rastvori na zalihu su razblaženi sa PBS kada je potrebno. Slika 25 pokazuje da su oba 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati posredovali superiornu efikasnost u smislu poboljšanja prosečnog preživljavanja u odnosu na grupu vehikuluma sa prednostima za 4G8 Fab-IL-2 wt -Fab u odnosu na 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugata u smislu efikasnosti.
TABELA 14.
LLC1 Lewis sinergijski model karcinoma pluća
FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su testirani pomoću ćelijske linije karcinoma pluća Lewis Lewis LLC1, i.v .ubrizgavane u Black 6 miševe. LLC1 Lewis ćelije karcinoma pluća originalno su dobijene od ATCC i posle ekspanzije deponirane u unutrašnjoj banci ćelija Glycart. Linija ćelija tumora je rutinski kultivisana u DMEM-u i sadrži 10% FCS (Gibco) na 37°C u atmosferi zasićenoj vodom sa 5% CO2. Prelazak 10 korišćen je za transplantaciju, pri održivosti od 97,9%.2xl0<5>ćelija na životinju ubrizgane su i.v. u venu repa u 200 μl medijuma ćelijske kulture Aim V (Gibco). Black 6 miševi; starosti od 8-9 nedelja na početku eksperimenta su održavane u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne stude pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2008016). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje. Miševi su injektirani i.v. 0. dana studijee sa 2x10<5>LLC1 ćelijama, randomizirani i mereni. Jedne nedelje nakon injekcije tumorskih ćelija, miševi su injektirani i.v. sa 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, tri puta nedeljno tri nedelje. Svi miševi su injektirani i.v. sa 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi vehikuluma ubrizgani su PBS, a kod tretirane grupe ubrizgani su 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab konstrukti. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, rastvori na zalihi su razblaženi sa PBS kada je potrebno. Slika 26 pokazuje da su 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab konstrukti sa zrelim afinitetom posredovali superiornu efikasnost u smislu poboljšanja prosečnog preživljavanja u poređenju sa grupom vehikuluma.
TABELA 14-B.
U drugom eksperimentu, FAP-ciljani 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati su testirani u istoj mišijoj ćelijskoj liniji Lewis karcinoma pluća LLC1, i.v. ubrizgani u Black 6 miševe. Prelazak 9 korišćen je za transplantaciju, pri održivosti od 94,5%.
2x10<5>ćelija po životinji ubrizgane su i.v. u venu repa u 200 μl medijuma ćelijske kulture Aim V (Gibco). Miševi su injektirani i.v. 0. dana studije sa 2x10<5>LLC1 ćelijama, randomizirani i mereni. Jedne nedelje nakon injekcije tumorskih ćelija, miševi su injektirani i.v. sa 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab, tri puta nedeljno tri nedelje. Svi miševi su injektirani i.v. sa 200 μl odgovarajućeg rastvora. Miševima u grupi vehikuluma je ubrizgano PBS, a grupi za tretman su ubrizgane 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab ili 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab konstrukti. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, rastvori na zalihi su razblaženi sa PBS kada je potrebno. Slika 27 pokazuje da su 28H1 Fab-IL-2 wt-Fab i 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugati posredovali superiornu efikasnost u smislu poboljšanog prosečnog preživljavanja u poređenju sa grupom vehikuluma sa malom prednošću za 28H1 Fab-IL- 2 wt-Fab u odnosu na 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab imunokonjugate u smislu efikasnosti.
TABELA 14-C.
Primer 9
FAP-ciljani Fab-IL-2 qm-Fab na bazi 4G8 je naknadno upoređen sa Fab-IL-2 wt-Fab imunokonjugatom na bazi 4G8 u sedmodnevnoj studiji intravenske toksičnosti i toksikokinetičnosti kod Black 6 miševa. Tabela 15 prikazuje dizajn studije toksičnosti i toksikokinetičnosti.
TABELA 15. Dizajn studije
Svrha ove studije je bila da se karakterišu i uporede profili toksičnosti i toksikokinetičnosti FAP-ciljanog 4G8 Fab-IL2-Fab nemutiranog tipa (wt) interleukin-2 (IL-2) i FAP-ciljanog G48 Fab-IL-2-Fab četvorostrukog mutanta IL-2 (qm) nakon jintravenske primene kod muških miševa bez tumora jednom dnevno u trajanju od 7 dana. Za ovu studiju, 5 grupa od 5 muških miševa/grupa dato je intravenozno 0 (kontrola vehikuluma), 4,5 ili 9 μg/g/dnevno IL-2 ili 4,5 ili 9 μg/g/dan qm IL-2. Dodatnim 4 grupama od 6 muških miševa/grupa primenjeno je 4.5 ili 9 μg/g/dnevno IL-2 ili 4.5 ili 9 μg/g/dan qm IL-2 u cilju procene toksikokinetike. Trajanje studije je promenjeno sa 7 dana na 5 dana zbog kliničkih znakova zabeleženih kod životinja dobijenih 4,5 i 9 μg/g/dan wt IL-2. Procena toksičnosti bazirana je na mortalitetu, posmatranju tokom života, telesnoj težini i kliničkoj i anatomskoj patologiji. Krv je sakupljena na različitim vremenskim tačkama od životinja u toksikokinetičkim grupama za toksikokinetičku analizu. Toksikokinetički podaci pokazali su da su miševi tretirani sa wt IL-2 ili qm IL-2 imali izmerljive nivoe plazme do poslednjeg vremena krvarenja, što ukazuje na to da su miševi izloženi odgovarajućim jedinjenjima tokom trajanja terapije. Vrednosti AUC0-inf Dana 1. sugerišu uporedivu izloženost IL-2 i qm IL-2 na oba nivoa doze. Određeni uzorci su uzeti na dan 5, i prikazali su ekvivalentne koncentracije u plazmi sa danom 1. što ukazuje na to da se nakon 5. dana doziranja bilo kojeg jedinjenja nije pojavila akumulacija. Detaljnije su primatrani sledeći nalazi.
Toksikokinetika
Tabela 16 sumira srednje toksikokinetičke parametre plazme za FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i FAP-ciljani 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, kao što je utvrđeno pomoću WinNonLin Verzija 5.2.1 i komercijalni kappa-specifični ELISA (Human Kappa ELISA Quantitation Set, Bethyl Laboratories).
TABELA 16.
* TK parametri su izračunati u WinNonIin verziji 5.2.1 korišćenjem neizdvojene analize Individualne koncentracije seruma date su u sledećem:
Dan Vrijeme Serum conc. Srednja konc Grupa (doza) krvarenja (h) Životinja (ng/ml) (ng/ml)
Ovi podaci pokazuju da su i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab i 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab pokazali uporedive farmakokinetičke osobine sa malo veće izloženosti za 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab.
Smrtnost
U 9 μg/g FAP ciljanoj 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi, smrtnost koja se odnosi na lečenje dogodila se kod jedne životinje pre obdukcije na dan 5. dan. Hipoaktivnost, hladna koža i loše držanje su zabeleženi pre smrti. Ova životinja je verovatno umrla zbog kombinacije ćelijske infiltracije u plućima koja je bila praćena edemom i krvarenjem i izrazitom nekrozom koštane srži. Smrtnost je rezimirana u Tabeli 17.
TABELA 17. Dan smrtnosti 5.
* poslato na autopsiju
** studija je planirana sedam dana, ali svi miševi tretirani nemutiranim imunokonjugatom IL-2 imali su zbiljne posledicei Dana 5. i žrtvovani su jer se nije očekivalo da će preživeti.
Klinička opažanja
Opažanja o hipoaktivnosti, hladnoj koži i savijenom položaju primećene su kod životinja koji su primili 4,5 i 9 μg/g/dnevno IL-2. Klinička opažanja su sumirana u Tabeli 18.
TABELA 18. Klinička opservacija dan 5.
Telesna težina
Umereno smanjenje telesne težine bilo je primećeno nakon 5 dana lečenja kod životinja koje su primale 4,5 i 9 (9% i 11%, respektivno) μg/g/dan wt IL-2. Slabo smanjenje telesne težine bilo je primećeno nakon 5 dana lečenja kod životinja koje su primale 4,5 ili 9 (2% i 1%, respektivno) μg/g/dan qm IL-2. Umereno (9%) smanjenje telesne težine takođe je primećeno u kontrolama vehikuluma nakon 5 dana lečenja. Međutim, smanjenje procenta bi bilo 5% ako je isključen potencijalni izuzetak (Životinjalbr. 3). Gubitak telesne težine u grupi vehikuluma može se pripisati stresu.
Hematologija
Kod životinja koje su primale 4,5 (~ 4,5 puta) i 9 μg/g/dan (~ 11 puta) 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab primećeno je smanjenje broja trombocita, koje je u korelaciji sa smanjenim megakariocitima u koštanoj srži, kao i sa sistemskim potrošnim efektima (fibrin) u slezini i plućima ovih životinja (pogledajte odeljak Histopatologija ispod). Ovi nalazi pokazuju da su smanjeni tromboci verovatno rezultat kombinovanih efekata potrošnje i smanjenja proizvodnje /okupljanja koštane srži zbog povećanja proizvodnje limfocita/mieloidnih ćelija kao direktan ili indirektan efekat IL-2.
Hematološki nalazi koji nisu sigurno povezani sa primenom jedinjenja sadrže smanjenje apsolutnog broja limfocita sa 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab pri 4,5 (~ 5 puta) i 9 μg/g (~ 3 puta) u poređenju sa srednjom vrijednošću kontrolne grupe vehikuluma. Ovi nalazi nisu imali jasnu zavisnost od doze, ali se mogu smatrati sekundarnim u odnosu na efekte koji su povezani sa stresom koji se primećuje u posmatranju tokom života ili prekomernoj farmakologiji jedinjenja (limfociti koji migriraju u tkiva). Nije bilo hematoloških promena vezanih za tretman koji se pripisuju primeni 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab. Nekoliko izolovanih hematoloških nalaza statistički su različite od njihovih odgovarajućih kontrola. Međutim, ovi nalazi su bili nedovoljnog opsega da bi ukazali na patološku relevantnost.
Brza patologija i histopatologija
Bruto nalazi vezani za lečenje obuhvataju povećanu slezinu koja se nalazi kod 5/5 i 4/5 miševa sa 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupa, odnosno u 1/5 kod obe 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab tretmanske grupe.
Nalazi histopatologije vezane za lečenje bili su prisutni u grupama koje su primali 4.5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4.5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab u plućima, koštanoj srži, jetri, slezini, i timusu, sa razlikama u učestalosti, stepenu težine ili prirodi promena, kako je navedeno u nastavku.
Nalazi histopatologije vezane za lečenje u plućima sastoje se od mononuklearne infiltracije sa blagim ili ozbiljnim napretkom kod 5/5 miševa sa 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupa i marginalno kod 5/5 miševa sa 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Mononuklearna infiltracija se sastojala od limfocita (od kojih su neki imali granule citoplazme), kao i reaktivne makrofage. Ove ćelije su najčešće primećene da imaju vazocentrične obrasce, često sa marginacijom koja se primećuje unutar sudova u plućima. Ove ćelije su takođe zabeležene oko sudova, ali u težim slučajevima, šablon je bio difuzniji. Krvavljenje se smatra marginalno do lagano kod 5/5 miševa sa 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe i marginalno kod 2/5 miševa u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm- Fab grupa. Iako je krvarenje najčešće bilo perivaskularno, u težim slučajevima zabeleženo je u alveolarnim prostorima. Primećen je edem male do umerene veličine kod 5/5 miševa u 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi i marginalno kod 5/5 miševa u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm- Fab grupa. Iako je edem često viđen perivaskularno, u težim slučajevima, zabeležen je iu alveolarnim prostorima. Marginalna celularna degeneracija i karioreksa su zabeleženi kod 2/5 i 5/5 miševa u 4.5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupa, odnosno sastoje se od degeneracije infiltrativnih ili reaktivnih leukocita. Odabrane životinje sa mrljama MSB bile su pozitivne za fibrin koji je pronađeni u plućima životinja kod obe 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe koji delimično korelira sa smanjenim trombocitima zabeleženim u ovim životinjama.
Promene povezane sa lečenjem u koštanoj srži uključili su marginalno do blago povećanje celokupnosti ćelije srca kod 5/5 miševa i 2/5 miševa i 4,5 i 5/5 miševa i 2/5 miševa oba 9 μg/g 4G8 Fab-IL- 2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe, respektivno. Ovo se karakteriše povećanjem marginalne do umerene hiperplazije limfocita i mijelocita u onim grupama koje su, djelimično, podržane povećanim brojem CD3 pozitivnih T ćelija unutar koštane srži i sinusa (posebno T-limfocita, potvrđenih imunohistohemijom sa pan-T- ćelijski markerom CD3 uradjen na odabranim životinjama). Povećanje CD3 pozitivnih T ćelija bilo je umereno u obe 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe i marginalno do blago kod obe 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe Marginalno do blago smanjenje megakariocita bilo je primećeno kod 2/5 miševa u 4,5 i 5/5 miševa u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupa i marginalno do umereno smanjenje eritroidnih prekursora primećeno je kod 3/5 miševa u 4,5 i 5/5 miševa u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Nekroza koštane srži zabeležena je kod 1/5 miševa u 4,5 (minimalna) i 5/5 miševa u 9 (blago do ozbiljno) μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe. Smanjen broj megakariocita u koštanoj srži korelirao je sa smanjenim trombocitima koji bi mogli biti usled direktnog naginjanja koštane srži povećanim limfocitima/mieloidnim prekursorima i/ili nekrozo koštane srži i/ili konzumacijom trombocita usled zapaljenja u različitim tkivima (vidi slezinu i pluća). Smanjeni eritroidni prekursori koji su primećeni u koštanoj srži, nisu u korelaciji sa nalazima hematologije periferne krvi, verovatne zbog vremenskih efekata (viđenih u koštanoj srži pre periferne krvi) i duži poluživot perifernih eritrocita (u poređenju sa trombocitima). Mehanizam nekroze koštane srži u koštanoj srži može biti sekundarni usled očigledne prenatrpanosti šupljine koštane srži (zbog proizvodnje i rasta limfocita/mieloidnih ćelija), sistemskog ili lokalnog oslobađanja citokina iz tipova proliferativnih ćelija, eventualno povezanih sa lokalnim uticajem na hipoksiju ili druge farmakološke efekte jedinjenja.
Nalazi vezani za lečenje u jetri se sastoje od blagog do umerenog prevashodno vazocentričnog infiltrata u mononuklearne ćelije i marginalne do blage nekroze pojedinačnih ćelija kod 5/5 miševa 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe. Marginalna nekroza jedne ćelije bila je primećena kod 2/5 i 4/5 miševa u 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe, respektivno.
Mononuklearni infiltrat se sastojao prvenstveno od limfocita (posebno T-limfocita, potvrđenim imunohistohemijom sa pan-T ćelijskim markerom CD3 obavljenim na odabranim životinjama), koji su najčešće bilježeni vazocentričnom, kao i marginiranim unutar centralnih i portalskih posuda. Odabrane životinje za imunohistohemijsko bojenje za F4/80 pokazale su povećane brojeve i veličinu (aktiviranih) makrofaga/Kupffer ćelija tokom jetrenih sinusoida u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe.
Nalazi vezani za lečenje u slezini su se sastojali od umerene do obeležene limfoidne hiperplazije/infiltracije i blage do umerene makrofagne hiperplazije/infiltracije kod 5/5 miševa u 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe i blage do umerene limfoidnea hiperplazije/infiltracija sa marginalnom do blagom makrofagnom hiperplazijom/infiltracijom kod 5/5 miševa u 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Imunohistohemija za 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab pokazala je različite obrasce pomoću pan-T ćelijskog markera CD3, kao i makrofagnog markera F4/80. Za 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab, uzorak imunoreaktivnosti T-ćelija i makrofaga ostao je prvenstveno unutar područja crvene pulpe, pošto je arhitektura primarnih folikula izmenjena limfocitolizom i nekrozom (opisana u daljem tekstu) . Za 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, specijalne mrlje su pokazale uzorak sličan onom kod kontrole vehikuluma, ali sa ekspresijom bele pulpe periarteriolarne limfoidne obloge (PALS), pomoću populacije T-ćelija i veće, prošireno područje crvena pulpe. T-ćelijska i makrofagna pozitivnost su takođe evidentne unutar crvene pulpe, sa sličnim obrascem kontrolne grupe vehikuluma, ali proširena. Ovi nalazi su u saglasnosti sa bruto nalazima povećane slezine. Nekroza je uočena marginalno kod 3/5 miševa i marginalno do blago kod 5/5 miševa u 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupeama, respektivno. Nekroza se obično nalazila oko površine primarnih folikula, a odabrane životinje korišćenjem MSB mrlja bile su pozitivne za fibrin u obe 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe koje delimično koreliraju sa smanjenim trombocitima zabeleženim kod ovih životinja. Limfocitoliza je primećena u 4,5 μg/g (minimalno do blago) i 9 μg/g (umereno do značajno) 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe.
Nalazi vezani za tretman u timusu su uključivali minimalno do blago povećanje limfocita kod obe 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fabu i u 4.5 ug/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Kod 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe nisu bili evidentni korteks i medulla, ali imunohistohemija za pan T ćelijski marker (CD3) na odabranim životinjama u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe pokazale su snažnu pozitivnost za većinu ćelija unutar timusa. Povećani limfociti u timusu smatrani su direktnom farmakološkom posledicom oba jedinjenja gde je IL-2 indukovao proliferaciju limfocita koji migriraju u timus (T ćelije) iz koštane srži radi dalje diferencijacije i klonalne ekspanzije. Ovo se dogodilo u svim grupama, osim u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab, što je verovatno privremeni efekat. Limfocitoliza je bila blaga u 4,5 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi i bila je umerena do značajna u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Umerena limfoidna deplecija primečena je kod obe 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupe. Iako se ovi rezultati javljaju kao robusniji u 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupama ove životinje su opisane kao potpuno iscrplene na dan 5, a blaga do primetna limfocitoliza, kao i umerena limfocitna deplecija mogu biti povezane na ovo posmatranje tokom života (stresni efekti zbog lošeg fizičkog stanja).
Histopatološki nalazi koji nisu sigurno povezani sa primenom jedinjenja u jetri sastoje se od marginalnih mešanih ćelija (limfociti i makrofagi) infiltrat/aktivacije naznačene kao male žarišta/mikrogranuloma raspršene nasumično kroz jetru kod 5/5 miševa u obe 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Ova marginalna promena je takođe viđena u kontrolnoj grupi vehikuluma, ali sa manjom incidencijom i ozbiljnošću. Dilatacija žlezda i atrofija želuca uočeni su marginalno do blago kod 5/5 miševa, a vilozna atrofija ileuma je uočena marginalno kod 3/5 miševa u 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi. Ovaj nalaz najverovatnije se pripisuje lošem fizičkom stanju viđenom kod ovih miševa, kao što je smanjena telesna težina, naročito u 9-gg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab grupi koja je primećena u posmatranju u životu.
Nalazi na mestu infekcije uključivali su infiltraciju mešavih ćelija, perivaskularni edem i moodegeneraciju koja je jednako zabilježena u kontroli vozila, 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupe. Jedna životinja imala je epidermalnu nekrozu. Ovi nalazi nisu pripisani samom tretmanu, već svakodnevnim i.v. injektiranjem i rukovanjem repom. Druga životinja imala je makrofagnu infiltraciju skeletnih mišića (zabeleženo na histološkom preseku tkiva pluća) koja je povezana sa miodegeneracijom i mioregeneracijom verovatno zbog hronične lezije i nije bila pripisana tretmanu. Marginalna limfoidna deplecija zabeležena je kod 3/5 i 4/5 miševa u 4,5 i 9 μg/g 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab grupa, respektivno i najverovatnije se pripisuje normalnim fiziološkim promenama viđenim u timusu kako miševi stare (koja se takođe vidi u sličnoj incidenci, 4/5 miševa i jačini kod kontrolnih životinja).
UKao zaključak, dnevna intravenska primena 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab ili 4G8 Fab-IL-2 qm-Fab u dozama od 4,5 ili 9 μg/g/dnevno do 5 dana kod muških miševa rezultirala je sličnim histološkim nalazima povezanih tretmanom nkod oba jedinjenja. Međutim, rezultati su uglavnom bili preovlađujući i ozbiljniji sa FAP-om 4G8 Fab-IL-2 wt-Fab u plućima (Slika 28 i 29) (mononuklearna infiltracija koja se sastoji od limfocita i reaktivnih makrofaga, hemoragije i edema), koštane srži (limfo-mišićne hiperplazije i povećane celularnosti) jetra (slika 30) (nekroza jedne ćelije, povećanje broja i aktivacija Kupfferove ćelije/makrofaga), slezina (grubo uvećana infiltracija makrofaga i limfocita/hiperplazija) i timusa (povišeni limfociti). Osim toga, smrtnost, limfocitoliza, nekroza ili ćelijska degeneracija u plućima, slezini, koštanoj srži i timusu, kao i smanjeni megakariociti i eritrociti u koštanoj srži i smanjeni trombociti u perifernoj krvi, vidjeli su se samo kod životinja koji su primili IL-2. Na osnovu kliničkih i anatomskih patoloških nalaza, kao i kliničkih opažanja i uporedive sistemske izloženosti oba jedinjenja, qm IL-2 u uslovima ove stude pokazao je znatno manju sistemsku toksičnost nakon 5 doza nego wt IL-2.
Primer 10
Indukcija IFN-γ sekrecije NK ćelija nemutiranim i četvorostrukim mutantom IL-2 Ćelije NK-92 su bile izgladnjene 2 sata prije zasejavanja 100000 ćelija/bunara u ploču sa 96 ploča sa F-dnom. IL-2 konstrukti su titrirani na ćelije NK-92. Posle 24h ili 48h, ploče su centrifugirale pre sakupljanja supernatanta da bi se odredila količina humanog IFN-γ koristeći komercijalni IFN-γ ELISA (BD # 550612).
Dva različita preparata IL-2 nemutiranog tipa (verovatno malo različita u svojim O-glikozilacionim profilima, vidi Primer 2), komercijalno dostupni IL-2 (Proleukin) nemutiranog tipa i u kapacitetu pripremljeni četvorostruki mutant IL-2 (prva serija) su testirani.
Slika 31 pokazuje da je četvorostruki mutant IL-2 jednako snažan kao komercijalno dobijen (Proleukin) ili u kapacitetu proizveden IL-2 nemutiranog tipa u induciranju IFN-γ sekrecije NK ćelijama tokom 24 (A) ili 48 sati (B) .
Primer 11
Indukcija proliferacije NK ćelija nemutiranim i četvorostrukim mutantom IL-2 NK-92 ćelije su izgladnjene 2 h pre zasejavanja 10000 ćelija/bunara u ploče sa 96 bunarčića sa F-prozirnim dnom. IL-2 konstrukti su titrirani na zasejane ćelije NK-92. Nakon 48 sati, ATP sadržaj je meren kako bi se odredio broj održivih ćelija pomoću "CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay" kompleta Promega u skladu sa uputstvima proizvođača.
Isti IL-2 preparati kao u Primeru 10 su testirani.
Slika 32 pokazuje da su svi testirani molekuli mogli da indukuju proliferaciju NK ćelija. U niskim koncentracijama (<0,01 nM), četvorostruki mutant IL-2 je bio nešto manje aktivan od interno proizvedenog IL-2 nemutiranog tipa, a svi interni preparati bili su manje aktivni od komercijalno dobijenog IL-2 nemutiranih vrsta (Proleukin).
U drugom eksperimentu testirani su sledeći IL-2 preparati: IL-2 nemutiranog tipa (bazen 2), četvorostruki mutant IL-2 (prva i druga serija).
Slika 33 pokazuje da su svi testirani molekuli bili slično aktivni u induciranju proliferacije NK ćelija, pri čemu su dva mutantna preparata IL-2 bila samo minimalno manje aktivna od preparata IL-2 nemutiranog tipa pri najnižim koncentracijama.
Primer 12
Indukcija humane PBMC proliferacije imunokonjugatima koji sadrže nemutirani ili četvorostruki mutant IL-2
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene korišćenjem Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO, SAD). Ukratko, venska krv iz zdravih dobrovoljaca je izvučena u heparinizirane špriceve. Krv je razblažena 2: 1 sa PBS bez kalcijuma i magnezijuma, i slojevito na Histopaque-1077. Gradient je centrifugiran na 450 x g tokom 30 min na sobnoj temperaturi (RT) bez pauza. Interfaza koja sadrži PBMC-e je sakupljena i isprana tri puta sa PBS (350 x g praćeno 300 x g u toku 10 min na RT).
Kasnije, PBMCs su označeni sa 40 nM CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estar) tokom 15 min na 37° C. Ćelije su isprane sa medijumom od 20 ml pre obnove obeleženih PBMC u trajanju od 30 min na 37° C. Ćelije su isprane, prebrojane, a 100000 ćelija je zasejano u ploče sa 96 bunarčića sa U-dnom. Pre-razređeni Proleukin (komercijalno dostupni IL-2 nemutiranog tipa) ili IL2-imunokonjugati su titrirani na zasejane ćelije koje su inkubirane za navedene vremenske tačke. Posle 4-6 dana, ćelije su isprane, obojane za odgovarajuće markere površine ćelija, i analizirane pomoću FACS koristeći BD FACSCantoII. NK ćelije su definisane kao CD3 -/CD56<+>, CD4 T ćelije kao CD3<+>/CD8<->i CD8 T ćelije kao CD3<+>/CD8<+>.
Slika 34 pokazuje proliferaciju NK ćelija nakon inkubacije sa različitim FAP-ciljanim imunokonjugatima 28H1 IL-2 za 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana. Svi ispitivani konstrukti indukovali su proliferaciju NK ćelija na način koji zavisi od koncentracije. Proleukin je bio efikasniji od imunokonjugata u nižim koncentracijama, međutim ova razlika više nije postojala u većim koncentracijama. Na ranijim vremenskim tačkama (4. dan), konstrukti IgG-IF2 bili su malo snažniji od Fab-IF2-Fab konstrukata. Na kasnijim tačkama (dan 6), svi konstrukti su imali uporedivu efikasnost, pri čemu je Fab-IF2 qm-Fab constmct najmanji potencijal u niskim koncentracijama.
Na slici 35 prikazana je proliferacija CD4 T-ćelija nakon inkubacije sa različitim 28H1 IF-2 imunokonjugatima ciljanim FAP-om za 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana. Svi testirani konstrukti indukovali su proliferaciju CD4 T ćelija na način koji zavisi od koncentracije. Proleukin je imao veću aktivnost od imunokonjugata, a imunokonjugati koji sadrže nemutirani tip IF-2 bili su malo snažniji od onih koji čine četvorostruki mutant IF-2. Što se tiče NK ćelija, Fab-IF2 qm-Fab konstrukt je imao najmanju aktivnost. Najverovatnije proliferirajuće CD4 T ćelije su delimično regulatorne T ćelije, bar za IF-2 konstrukte nemutiranog tipa.
Slika 36 prikazuje proliferaciju CD8 T-ćelija nakon inkubacije sa različitim imunokonjugatima 28H1 IL-2 ciljanih na FAP za 4 (A), 5 (B) ili 6 (C) dana. Svi testirani konstrukti su indukovali proliferaciju CD8 T ćelija na način zavisano od koncentracije. Proleukin je imao veću aktivnost od imunokonjugata, a imunokonjugati koji sadrže nemutirani tip IL-2 bili su malo snažniji od onih koji čine četvorostruki mutant IL-2. Što se tiče NK i CD4 T ćelija, Fab-IL2 qm-Fab konstrukt je imao najmanju aktivnost.
Na slici 37 prikazani su rezultati drugog eksperimenta, pri čemu su upoređeni 28H1 IgG-IL-2 ciljani FAP-om, koji se sastoji od IL-2 nemutiranog ili četvorostrukog mutanta IL-2 i Proleukina. Vreme inkubacije je trajalo 6 dana. Kao što je prikazano na slici, sva tri IL-2 konstrukta indukuju proliferaciju NK (A) i CD8 T-ćelija (C) na način zasnovan na dozama sa sličnim potencijalom. Za CD4 T-ćelije (B), imunokonjugat IgG-IL2 qm ima nižu aktivnost, naročito u srednjim koncentracijama, što može biti zbog nedostatka aktivnosti na CD25-pozitivnim (uključujući i regulatorne) T ćelije koje su podskup CD4 T ćelije.
Primer 13
Aktivacija efektorske ćelije pomoću nemutiranih i četvorostrukih mutiranih IL-2 (pSTAT5 analiza)
PBMC su pripremljeni kako je gore opisano. 500000 PBMCs/bunari su zasejane u ploče sa 96 bunarčića sa U-dnom i počivale su 45 minuta na 37° C u RPMI medijumu koji sadrži 10% FCS i 1% Glutamax (Gibco). Nakon toga, PBMC su inkubirane sa Proleukinom, interno proizvedenom IL-2 nemutiranog tipa ili četvorostrukim mutantom IL-2 u navedenim koncentracijama tokom 20 min na 37° C da bi izazvali fosforilaciju STAT5. Nakon toga, ćelije su odmah fiksirane (BD Cytofix Buffer) tokom 10 min na 37° C i isprane jednom, nakon čega sledi korak permeabilizacije (BD Phosflow Perm Buffer III) tokom 30 min na 4° C. Nakon toga, ćelije su isprane sa PBS/0,1% BSA i obojene mešavinama FACS antitela za detekciju NK ćelija (CD3 -/CD56<+>), CD8<+>T ćelija (CD3<+>/CD8<+>), CD4<+>T ćelija (CD3<+>/CD4<+>/CD25 -/CD127<+>) ili T reg ćelije (CD4<+>/CD25<+>/CD127 -/FoxP3<+>), kao i pSTAT530 minuta na RT u mraku. Ćelije su isprane dva puta sa PBS/0,1% BSA i resuspendovane u 2% PFA pre citometrijske analize protoka (BD FACSCantoII). Slika 38 prikazuje STAT fosforilaciju u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelijama (B), CD4 T-ćelijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30 min inkubacije sa Proleukinom, interno proizvedenim nemutiranim IL-2 (bazen 2) i četvorostruki mutant IL-2 (serija 1). Sva tri IL-2 preparata su jednako snažna u induciranju STAT fosforilacije u NK kao i CD8 T-ćelijama. U CD4 T-ćelijama i još više u regulatornim T-ćelijama, četvorostruki mutant IL-2 je imao nižu aktivnost od preparata IL-2 nemutiranog tipa.
Primer 14
Aktivacija efektorskih ćelija pomoću nemutiranih i četvorostrukih mutiranih IgG-IL-2 (pSTAT5 analiza)
Eksperimentalni uslovi bili su kako je gore opisano (videti Primer 13).
Slika 39 prikazuje STAT fosforilaciju u NK ćelijama (A), CD8 T-ćelijama (B), CD4 T-ćelijama (C) i regulatornim T-ćelijama (D) nakon 30 min inkubacije sa Proleukinom, IgG- tipa IL-2 koji sadrži nemutirani IL-2 ili IgG-IL-2 koji sadrži četvorostruki mutant IL-2. Na svim tipovima ćelija Proleukin je bio snažniji u induciranju STAT fosforilacije od IgG-IL-2 imunokonjugata. IgG-IL-2 nemutiranog tipa i četvorostruki mutirani konstrukti su jednako potentni u NK kao i u CD8 T-ćelijama. U CD4 T-ćelijama i još više u regulatornim T-ćelijama, četvorostruki mutant IgG-IL-2 imao je nižu aktivnost od imunokonjugata nemutiranog tipa IgG-IL-2.
Primer 15
Maksimalno tolerisana doza (MTD) FAP-ciljanih Fab-IL2 wt-Fab i Fab-IL2 qm-Fab imunokonjugata
Eskalirajuće doze FAP-ciljanih imunokonjugata Fab-IL2-Fab, koji se sastoje od nemutiranog tipa (wt) ili četvorostrukog mutanta (qm) IL-2, testirani su u tumoru bez imunokompetentnih Black 6 miševa. Ženkie Black 6 miševa (nabavljene od Charles River, Nemačka),; starosti 8-9 nedelje na početku eksperimenta održavane su pod specifičnim uslovima bez patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h tame prema dobijenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne stude pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2008016). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Miševi su injektirani i.v. jednom dnevno 7 dana sa 4G8 Fab-IL2 wt-Fab u dozama od 60, 80 i 100 μg/miš ili 4G8 Fab-IL2 qm-Fab u dozama od 100, 200, 400, 600 i 1000 μg/miš. Svi miševi su injektirani i.v. sa 200 μl odgovarajućeg rastvora. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, rešenja na zalihi su razblažena sa PBS po potrebi.
Slika 40 pokazuje da je MTD (maksimalno tolerisana doza) za Fab-IL2 qm-Fab 10 puta veća nego za Fab-IL2 wt-Fab, odnosno 600 μg/miša dnevno tokom 7 dana za Fab-IL2 qm-Fab vs 60 μg/miš dnevno za 7 dana za Fab-IL2 wt-Fab.
TABELA 19.
Primer 16
Farmakokinetika jedinačne doze FAP-ciljanih i neciljanih IgG-IL2 wt i qm Studija farmakokinetike jedinačne doze (PK) izvedena je kod imunokompetentnihm 129 miševa bez tumora za imunokonjugate IgG-IL2 ciljane na FAP, koji se sastoje od nemutiranih ili četvorostrukih mutantnih IL-2, i neciljanih imunokonjugata IgG-IL2 koji sadrže bilo nemutirane ili četvorostruke mutante IL -2.
129 ženki miševa (Harlan, Ujedinjeno Kraljevstvo); starosti 8-9 nedelje na početku eksperimenta održavane su pod specifičnim uslovima bez patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h tame prema dobijenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2008016). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Miševima su jednom i.v. ubrizgavani FAP-ciljani 28H1 IgG-IL2 wt (2,5 mg/kg) ili 28H1 IgG-IL2 qm (5 mg/kg) ili neciljanii DP47GS IgG-IL2 wt (5 mg/kg) ili DP47GS IgG- IL2 qm (5 mg/kg). Svi miševi su injektirani i.v. sa 200 μl odgovarajućeg rastvora. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, rastvori na zalihi su razblažena sa PBS po potrebi.
Miševima je puštana krv na 1, 8, 24, 48, 72, 96 h; i svakih 2 dana nakon toga 3 sedmice. Seumi su ekstrahovani i skladišteni na -20° C do ELISA analize. Koncentracije imunokonjugata u serumu određene su korišćenjem ELISA za kvantifikaciju antitela IL2-imunokonjugata (Roche-Penzberg). Apsorpcija je merena primenom merne talasne dužine od 405 nm i referentne talasne dužine od 492 nm (VersaMax programabilni čitač mikroploča, Molekularni uređaji).
Slika 41 prikazuje farmakokinetiku ovih IL-2 imunokonjugata. Oba FAP ciljana (A) i neciljana (B) IgG-IL2 qm konstrukta imaju duži poluživot u serumu (oko 30 h) od odgovarajućih konstrukta IgG-IL2 wt (oko 15 h).
TABELA 20.
Primer 17
Farmakokinetika jedinačne doze neciljanih Fab-IL2 wt-Fab i Fab-IL2 qm-Fab Studija farmakokinetike ojedinačne doze (PK) izvedena je kod imunokompetentnih 129 miševa bez tumora za neciljane imunokonjugate Fab-IL2-Fab, koji se sastoje od nemutiranog ili četvorostrukog mutanta IL-2.
129 ženki miševa (Harlan, Ujedinjeno Kraljevstvo); starosti 8-9 nedelje na početku eksperimenta, održavane su pod specifičnim uslovima bez patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h tame prema dobijenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne stude pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2008016). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Miševi su ubrizgani iv jednom sa DP47GS Fab-IL2 wt-Fab u dozi od 65 nmol/kg ili DP47GS Fab-IL2 qm-Fab u dozi od 65 nM/kg. Svi miševi su injektirani iv sa 200 μl odgovarajućeg rastvora. Da bi se dobila odgovarajuća količina imunokonjugata na 200 μl, rastvori na zalihi su razblažena sa PBS po potrebi.
Miševima je puštana krvi na 0.5, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 96 sati, a zatim na 2 dana u trajanju od 3 nedelje. Serumi su ekstrahovani i skladišteni na -20° C do ELISA analize. Koncentracije imunokonjugata u serumu određene su korišćenjem ELISA za kvantifikaciju antitela IL2-imunokonjugata (Roche-Penzberg). Apsorpcija je merena primenom merne talasne dužine od 405 nm i referentne talasne dužine od 492 nm (VersaMax programabilni čitač mikroploča, Molekularni uređaji).
Slika 42 prikazuje farmakokinetiku ovih IL-2 imunokonjugata. Fab-IL2-Fab wt i qm konstruktti imaju približan, poluživot u serumu od 3-4 h. Razlika u poluživotu seruma između konstrukata koji sadrže nemutirani ili četvorostruki mutant IL-2 je manje izražena za konstrukte Fab-IL2-Fab nego za imunokonjugate slične IgG-u, koje per se imaju duži poluživot.
TABELA 21.
Primer 18
Aktivacijom indukovana ćelijska smrt IL-2 aktiviranih PBMC
Sveže izolovane PBMC od zdravih donora su prethodno aktivirane preko noći sa PHA-M na 1 μg/ml u RPMI1640 sa 10% FCS i 1% glutamina. Nakon predaktivacije, PBMC se sakupljaju, obeležene sa 40 nM CFSE u PBS i zasejane na pločama sa 96 bunarčića na 100000 ćelija/bunar. Prektivirani PBMC su stimulisani različitim koncentracijama imunokonjugata IL-2 (4B9 IgG-IL-2 wt, 4B9 IgG-IL-2 qm, 4B9 Fab-IL-2 wt-Fab i 4B9 Fab-IL-2 qm- Fab). Posle šest dana lečenja IL-2, PBMCs su lečeni sa 0.5 μg/ml aktiviranjem anti-Fas antitela preko noći. Proliferacija CD4 (CD3<->CD8<->) i CD8 (CD3<+>CD8<+>) T ćelija analizirano je nakon šest dana rastvaranjem CFSE. Procenat živih T ćelija nakon anti-Fas tretmana određen je gatingom na CD3<+>negativnim živim ćelijama Annexin V.
Kao što je prikazano na slici 44, svi konstrukti su indukovali proliferaciju predaktiviranih T ćelija. U niskim koncentracijama konstrukti koji sadrže nemutirani tip IL-2 wt bili su aktivniji od konstrukata koji sadrže IL-2 qm. IgG-IL-2 wt, Fab-IL-2 wt-Fab i Proleukin su imali sličnu aktivnost. Fab-IL-2 qm-Fab je bio nešto manje aktivan od IgG-IL-2 qm. Konstrukti koji sadrže nemutirani tip IL-2 bili su aktivniji na CD4 T ćelijama nego na CD8 T ćelijama, najverovatnije zbog aktivacije regulatornih T ćelija. Konstrukti koji sadrže četvorostruki mutant IL-2 bili su slično aktivni na CD8 i CD4 T ćelijama.
Kao što je prikazano na slici 45, T ćelije stimulisane visokim koncentracijama IL-2 nemutiranog tipa su osetljive na anti-Fas indukovanu apoptozu nego T ćelije tretirane sa četvorostrukim mutantom IL-2.

Claims (17)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Imunokonjugat koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid i antigen vezujuću komponentu, pri čemu pomenuti mutirani IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19; i pri čemu je navedena antigen vezujuća komponenta molekul imunoglobulina IgG 1 specifičnog za fibroblast aktivacijski protein (FAP), koji sadrži (i) varijabilni region sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 41 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 39; (ii) varijabilni region sekvence teškog lanca SEQ ID NO: 51 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 49; (iii) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 111 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 109; (iv) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 143 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 141; ili (iv) sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 151 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 149.
2. Imunokonjugat prema zahtevu 1, pri čemu je pomenuti mutantni IL-2 polipeptid spojen na amino-terminalnom kraju aminokiseline do karboksi-terminalnog kraja aminokiseline jednog od teških lanaca imunoglobulina.
3. Imunokonjugat prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu imunokonjugat sadrži ne više od jednog mutiranog IL-2 polipeptida.
4. 3. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je molekul imunoglobulina podklasa IgG1 u Fc domenu sadrži modifikaciju čvor u otvor, koji sadrži modifikaciju čvora u jednom od teških lanaca imunoglobulina i modifikaciju otvora u drugom od teških lanaca imunoglobulina, pri čemu modifikacija čvora sadrži aminokiselinsku supstituciju T366W u jednom od dva teška lanca imunoglobulina, a modifikacija otvora sadrži aminokiselinske supstitucije T366S, L368A i Y407V u drugom od dva teška lanca imunoglobulina.
5. Imunokonjugat prema zahtevu 4, pri čemu teški lanac imunoglobulina koji sadrži modifikaciju čvora dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju S354C, a teški lanac imunoglobulina koji sadrži modifikaciju otvora dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju Y349C.
6. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu molekul IgG1 sadrži u svom Fc domenu mutacije aminokiselina L234A, L235A i P329G.
7. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 6, koji sadrži (i) polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 297, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 299 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 233; (ii) polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 301, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 303 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85% %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 231; ili (iii) polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 315, polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 317 i polipeptidnu sekvencu koja je najmanje 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična SEQ ID NO: 233.
8. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu navedeni molekul IgG1 specifičan za FAP sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 111 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 109.
9. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 8, koji sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 301, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 303 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 231.
10. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 9, koji se sastoji od mutantnog IL-2 polipeptida i molekula IgG1, spojenim veznikom.
11. Izolovani polinukleotid koji kodira imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 10.
12. Ćelija domaćin koja obuhvata polinukleotid prema zahtevu 11.
13. Postupak stvaranja imunokonjugata koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid i antigen vezujuću komponentu, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina prema zahtevu 12 pod uslovima pogodnim za ekspresiju imunokonjugata.
14. Imunokonjugat koji sadrži mutantni IL-2 polipeptid i antigen vezujuću komponentu, proizveden postupkom prema zahtevu 13, pri čemu mutantni IL-2 polipeptid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 19 i pri čemu je antigen vezujuća komponenta IgG1 molekul podklase imunoglobulina specifičnog za FAP.
15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 10 ili 14 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
16. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 1 do 10 ili 14 za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kom to treba.
17. Imunokonjugat za upotrebu u lečenju bolesti prema zahtevu 16, pri čemu je navedena bolest kancer.
RS20181250A 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi RS57767B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11153964 2011-02-10
EP11164237 2011-04-29
EP16164244.2A EP3075745B1 (en) 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57767B1 true RS57767B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=45560919

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160397A RS54802B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polipeptidi
RS20210996A RS62238B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi
RS20181250A RS57767B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160397A RS54802B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutant interleukin-2 polipeptidi
RS20210996A RS62238B1 (sr) 2011-02-10 2012-02-07 Mutantni interleukin-2 polipeptidi

Country Status (35)

Country Link
US (5) US9266938B2 (sr)
EP (4) EP3489255B1 (sr)
JP (2) JP5878182B2 (sr)
KR (2) KR101667096B1 (sr)
CN (3) CN103492411B (sr)
AR (1) AR085335A1 (sr)
AU (2) AU2012215573B2 (sr)
BR (1) BR112013018932B1 (sr)
CA (1) CA2824253C (sr)
CL (1) CL2013001987A1 (sr)
CO (1) CO6741186A2 (sr)
CR (1) CR20130314A (sr)
CY (1) CY1117842T1 (sr)
DK (3) DK3489255T3 (sr)
EA (1) EA033369B1 (sr)
EC (1) ECSP13012815A (sr)
ES (3) ES2694564T3 (sr)
HR (3) HRP20160917T1 (sr)
HU (3) HUE040326T2 (sr)
IL (3) IL269687B (sr)
LT (2) LT3075745T (sr)
MA (1) MA35803B1 (sr)
MX (2) MX340671B (sr)
MY (1) MY190604A (sr)
PE (2) PE20181077A1 (sr)
PH (2) PH12013501657A1 (sr)
PL (3) PL3489255T3 (sr)
PT (3) PT3489255T (sr)
RS (3) RS54802B1 (sr)
SG (2) SG192673A1 (sr)
SI (3) SI2673294T1 (sr)
TW (2) TWI666027B (sr)
UA (2) UA117294C2 (sr)
WO (1) WO2012107417A1 (sr)
ZA (1) ZA201305282B (sr)

Families Citing this family (291)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US8637641B2 (en) 2010-07-29 2014-01-28 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
EA034742B1 (ru) 2010-08-13 2020-03-16 Роше Гликарт Аг Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения
LT3075745T (lt) 2011-02-10 2018-11-26 Roche Glycart Ag Mutavę interleukino-2 polipeptidai
EP2681244B1 (en) 2011-03-02 2017-11-29 Roche Glycart AG Cea antibodies
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
ES2676877T3 (es) 2011-06-01 2018-07-25 Intrexon Actobiotics Nv Sistema de expresión policistrónica para bacterias
BR112014004168A2 (pt) 2011-08-23 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, método de produção de anticorpo e invenção
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
AR092044A1 (es) 2012-08-07 2015-03-18 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
CA2887486A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Roche Glycart Ag Removal of cancer cells by circulating virus-specific cytotoxic t-cells using cancer cell targeted mhc class i comprising multi-function proteins
RU2015129640A (ru) 2012-12-21 2017-01-26 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Связанные дисульфидом мультивалентные многофункциональные белки, содержащие молекулы гкгс класса 1
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
LT2943511T (lt) 2013-01-14 2019-11-11 Xencor Inc Nauji heterodimeriniai baltymai
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
EP2945969A1 (en) 2013-01-15 2015-11-25 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EP2961773B1 (en) 2013-02-26 2019-03-20 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
DK2961771T3 (da) * 2013-02-26 2020-03-02 Roche Glycart Ag Bispecifikke, T-celle-aktiverende, antigenbindende molekyler, der er specifikke for CD3 og CEA
US9546203B2 (en) 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10544187B2 (en) 2013-03-15 2020-01-28 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
DK3041854T3 (da) 2013-08-08 2020-03-02 Scripps Research Inst En fremgangsmåde til stedspecifik enzymatisk mærkning af nukleinsyrer in vitro gennem inkorporering af unaturlige nukleotider
RS58149B1 (sr) 2014-02-06 2019-02-28 Hoffmann La Roche Fuzioni proteini interleukina-2 i njihova upotreba
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
AU2015237184B2 (en) 2014-03-28 2020-11-26 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to CD38 and CD3
HUE056155T2 (hu) 2014-04-09 2022-01-28 Scripps Research Inst Nem-természetes vagy módosított nukleozid-trifoszfátok sejtekbe importálása nukleinsav-trifoszfát transzporterekkel
ES2779977T3 (es) 2014-07-10 2020-08-21 Univ Zuerich Anticuerpos monoclonales inmunoestimuladores contra interleucina 2 humana
JP6768633B2 (ja) * 2014-07-21 2020-10-14 デリニア， インコーポレイテッド 自己免疫疾患を治療するために調節性ｔ細胞を選択的に活性化する分子
SI3608337T1 (sl) 2014-08-04 2024-07-31 F. Hoffmann - La Roche Ag Biospecifične molekule za aktivacijo celic T in antigensko vezavo
ES2807260T3 (es) * 2014-08-11 2021-02-22 Delinia Inc Variantes de IL-2 modificadas que activan selectivamente las células T reguladoras para el tratamiento de enfermedades autoinmunes
ES2774380T3 (es) * 2014-08-29 2020-07-20 Hoffmann La Roche Politerapia de inmunocitocinas de variante de IL-2 dirigida a tumor y anticuerpos frente a PD-L1 humano
EA037557B1 (ru) 2014-11-14 2021-04-14 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антигенсвязывающие молекулы, содержащие тримерный лиганд семейства tnf
DK3789402T3 (da) 2014-11-20 2022-09-19 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler og PD-1-aksebindende antagonister
CN107207609B (zh) 2014-11-20 2022-07-19 豪夫迈·罗氏有限公司 共同轻链和使用方法
PL3221356T3 (pl) 2014-11-20 2021-01-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Wiążące antygen dwuswoiste cząsteczki przeciwko folr1 i cd3 aktywujące limfocyty t
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
KR102689285B1 (ko) 2014-11-26 2024-07-31 젠코어 인코포레이티드 Ｃｄ3 및 종양 항원과 결합하는 이종이량체 항체
MA41019A (fr) 2014-11-26 2021-05-05 Xencor Inc Anticorps hétérodimériques se liant aux antigènes cd3 et cd38
HUE055460T2 (hu) 2014-12-15 2021-11-29 Univ Washington Készítmények és módszerek a célzott citokin bejuttatására
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
JP6996979B2 (ja) 2015-03-31 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 三量体ｔｎｆファミリーリガンドを含む抗原結合分子
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
MY192202A (en) 2015-10-02 2022-08-06 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
BR112018000835A2 (pt) 2015-10-02 2018-09-11 Hoffmann La Roche molécula, um ou mais polinucleotídeos, um ou mais vetores, célula, método de produção da molécula, composição, uso da molécula, método de tratamento de uma doença e método para induzir a lise de uma célula-alvo
MY198560A (en) 2015-10-02 2023-09-05 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
US11702477B2 (en) 2015-11-06 2023-07-18 Orionis Biosciences BV Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
CA3006477A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Novartis Ag Antibody cytokine engrafted compositions and methods of use for immunoregulation
WO2017100372A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and psma
IL313608A (en) 2015-12-09 2024-08-01 Hoffmann La Roche Antibody against CD20 type II to reduce the formation of antibodies against drugs
EP3178848A1 (en) 2015-12-09 2017-06-14 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
WO2017106767A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Scripps Research Institute Production of unnatural nucleotides using a crispr/cas9 system
AU2017205089B2 (en) 2016-01-08 2023-10-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating CEA-positive cancers using PD-1 axis binding antagonists and anti-CEA/anti-CD3 bispecific antibodies
HK1257518A1 (zh) 2016-01-11 2019-10-25 Novartis Ag 针对人白介素-2的免疫刺激性人源化单克隆抗体及其融合蛋白
EP3402499B1 (en) 2016-01-14 2021-07-21 Intrexon Actobiotics NV Compositions and methods for the treatment of type 1 diabetes
US20170204154A1 (en) 2016-01-20 2017-07-20 Delinia, Inc. Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases
CN108883180B (zh) 2016-02-05 2023-07-07 奥里尼斯生物科学私人有限公司 Clec9a结合剂及其用途
CN109071679B (zh) 2016-02-05 2023-07-28 华盛顿大学 用于靶向的细胞因子递送的组合物和方法
US11248057B2 (en) 2016-03-07 2022-02-15 Vib Vzw CD20 binding single domain antibodies
ES2947230T3 (es) 2016-03-22 2023-08-03 Hoffmann La Roche Moléculas biespecíficas para linfocitos T activadas por proteasa
CA3023883A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
EP3455245A2 (en) 2016-05-13 2019-03-20 Orionis Biosciences NV Therapeutic targeting of non-cellular structures
KR20190015345A (ko) 2016-05-25 2019-02-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 용량 용법 디자인에 관한 재료 및 방법
KR102838691B1 (ko) 2016-06-14 2025-07-25 젠코어 인코포레이티드 이중특이적 체크포인트 억제제 항체
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
EP4163293A1 (en) 2016-06-24 2023-04-12 The Scripps Research Institute Novel nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
CN116063545A (zh) 2016-06-28 2023-05-05 Xencor股份有限公司 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体
CN110267977A (zh) 2016-08-10 2019-09-20 亚洲大学校产学协力团 细胞因子免疫球蛋白Fc融合异二聚体和包含其的药物组合物
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CN110087681A (zh) 2016-09-28 2019-08-02 佐马美国有限公司 结合白细胞介素-2的抗体和其用途
PL3519437T3 (pl) 2016-09-30 2022-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała dwuswoiste przeciwko p95HER2
US10550185B2 (en) 2016-10-14 2020-02-04 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing IL-15-IL-15Rα Fc-fusion proteins and PD-1 antibody fragments
CN109952370B (zh) * 2016-10-19 2023-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于产生免疫缀合物的方法
ES2917000T3 (es) 2016-10-24 2022-07-06 Orionis Biosciences BV Interferón-gamma mutante diana y usos del mismo
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CN110167957A (zh) * 2016-11-08 2019-08-23 德里尼亚公司 用于治疗自身免疫疾病的il-2变体
CU24483B1 (es) * 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
KR102669762B1 (ko) 2016-12-19 2024-05-30 에프. 호프만-라 로슈 아게 표적화된 4-1bb(cd137) 작용물질과의 병용 요법
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
CN110325205B (zh) 2016-12-22 2023-08-15 库尔生物制药有限公司 T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法
US10906985B2 (en) 2017-02-06 2021-02-02 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
MX2019009255A (es) 2017-02-06 2019-11-05 Orionis Biosciences Nv Proteínas quiméricas dirigidas y sus usos.
BR112019018915A2 (pt) 2017-03-15 2020-04-14 Pandion Therapeutics Inc imunotolerância direcionada
CN111010875B (zh) * 2017-03-15 2024-04-05 库尔生物制药有限公司 用于调节免疫应答的方法
EP3606947B1 (en) * 2017-04-03 2022-12-21 F. Hoffmann-La Roche AG Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
KR102461885B1 (ko) 2017-04-03 2022-11-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-pd-1 항체와 돌연변이 il-2 또는 il-15의 면역접합체
KR102364599B1 (ko) 2017-04-04 2022-02-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 Cd40 및 fap에 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 이중특이적 항원 결합 분자
US11285207B2 (en) 2017-04-05 2022-03-29 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specifically binding to PD1 and LAG3
JP6928668B2 (ja) 2017-04-11 2021-09-01 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 増大した熱安定性を有する変異型逆転写酵素、ならびにそれに関する生成物、方法および使用
AU2018250875A1 (en) 2017-04-13 2019-10-03 F. Hoffmann-La Roche Ag An interleukin-2 immunoconjugate, a CD40 agonist, and optionally a PD-1 axis binding antagonist for use in methods of treating cancer
JP7791642B2 (ja) * 2017-05-24 2025-12-24 ノバルティス アーゲー 抗体－サイトカイングラフト化タンパク質及び癌の治療における使用方法
SG11201909949XA (en) 2017-05-24 2019-11-28 Pandion Therapeutics Inc Targeted immunotolerance
JOP20190271A1 (ar) 2017-05-24 2019-11-21 Novartis Ag بروتينات مطعّمة بسيتوكين- الجسم المضاد وطرق الاستخدام للاضطرابات المتعلقة بالمناعة
CN111107868A (zh) * 2017-05-24 2020-05-05 诺华股份有限公司 抗体细胞因子移植蛋白及使用方法
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
CA3069321A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 The Scripps Research Institute Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
KR20250145137A (ko) * 2017-08-03 2025-10-13 신톡스, 인크. 자가면역 질환의 치료를 위한 사이토카인 접합체
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
PH12020550661A1 (en) 2017-11-21 2021-04-19 Univ Leland Stanford Junior Partial agonists of interleukin-2
USRE50550E1 (en) 2017-12-06 2025-08-26 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
IL275426B2 (en) 2017-12-19 2025-03-01 Xencor Inc Engineered il-2 fc fusion proteins
US11970537B2 (en) * 2017-12-26 2024-04-30 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Fusion protein dimer using antibody Fc region as backbone and use thereof
CN112105627B (zh) 2017-12-29 2024-07-02 斯克利普斯研究所 非天然碱基对组合物及使用方法
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
WO2019148089A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Orionis Biosciences Inc. Xcr1 binding agents and uses thereof
KR102877915B1 (ko) 2018-02-05 2025-10-29 오리오니스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 섬유아세포 결합제 및 이의 용도
PE20211116A1 (es) 2018-02-08 2021-06-23 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso
JP7515412B2 (ja) * 2018-03-09 2024-07-12 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 新規のサイトカインプロドラッグ
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
KR20200139730A (ko) * 2018-03-28 2020-12-14 아센디스 파마 온콜로지 디비전 에이/에스 Il-2 접합체
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
WO2019204665A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
JP7554742B2 (ja) 2018-07-03 2024-09-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
JP7550745B2 (ja) * 2018-07-24 2024-09-13 バイオエヌテック エスエー Ｉｌ２アゴニスト
EP3827079A1 (en) 2018-07-25 2021-06-02 Askgene Pharma, Inc. Novel il-21 prodrugs and methods of use thereof
IL314189A (en) 2018-08-01 2024-09-01 Immunitybio Inc A QUADRICISTRONIC SYSTEM COMPRISING A HOMING RECEPTOR OR A CYTOKINE, AND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR GENETIC MODIFICATION OF IMMUNOTHERAPIES- Expedited Examination
EP3849614B1 (en) * 2018-09-11 2023-12-20 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
CN111971295B (zh) * 2018-09-17 2024-08-02 Gi医诺微新 包含il-2蛋白和cd80蛋白的融合蛋白及其用途
AR114732A1 (es) 2018-09-18 2020-10-07 Hoffmann La Roche Utilización de un inhibidor de catepsina s contra la formación de anticuerpos antifármaco
TWI791894B (zh) * 2018-09-21 2023-02-11 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 新型白介素２及其用途
TWI801664B (zh) * 2018-09-21 2023-05-11 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 新型白介素２及其用途
CA3112989A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Xilio Development, Inc. Masked cytokine polypeptides
JP7612571B2 (ja) 2018-10-03 2025-01-14 ゼンコア インコーポレイテッド Ｉｌ－１２ヘテロ二量体ｆｃ－融合タンパク質
TWI891611B (zh) * 2018-10-23 2025-08-01 美商蜻蜓醫療公司 異二聚體fc融合蛋白
KR20210087965A (ko) * 2018-10-29 2021-07-13 1글로브 바이오메디칼 씨오., 엘티디. 신규 합리적으로 디자인된 단백질 조성물
CA3118892A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Orionis Biosciences, Inc. Modulation of dendritic cell lineages
WO2020130300A1 (ko) * 2018-12-21 2020-06-25 한미약품 주식회사 신규 면역 억제 인터루킨 2
SG11202105093RA (en) 2018-12-21 2021-06-29 Hoffmann La Roche Tumor-targeted agonistic cd28 antigen binding molecules
EP3875475A4 (en) * 2018-12-21 2022-12-07 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. VARIANT OF HUMAN INTERLEUKIN-2 OR ITS DERIVATIVE
JP7797198B2 (ja) 2018-12-21 2026-01-13 オーエスイー・イミュノセラピューティクス ヒトｐｄ－１に対する二機能性分子
AR117770A1 (es) * 2019-01-07 2021-08-25 Inhibrx Inc Polipéptidos que comprenden polipéptidos con il-2 modificada y usos de los mismos
WO2020148612A1 (en) * 2019-01-14 2020-07-23 Ignite Immunotherapy, Inc. Recombinant vaccinia virus and methods of use thereof
SG11202107354WA (en) 2019-02-06 2021-08-30 Synthorx Inc Il-2 conjugates and methods of use thereof
AU2020226893B2 (en) 2019-02-21 2025-02-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
BR112021016955A2 (pt) 2019-03-01 2021-11-23 Xencor Inc Composição, composição de ácido nucleico, composição de vetor de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produção de um domínio de ligação de membro de família 3 de pirofosfatase/fosfodiesterase de ectonucleotídeo e de tratamento de um câncer, anticorpo anti-enpp3, e, anticorpo heterodimérico
CN111647068A (zh) * 2019-03-04 2020-09-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素2变体或其衍生物
WO2020198665A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast activation protein binding agents and use thereof
CN111944008A (zh) * 2019-05-14 2020-11-17 上海盖浦生物科技有限公司 一种突变蛋白的方法以及得到的突变体蛋白
CN111944036B (zh) * 2019-05-14 2024-09-06 上海盖浦生物科技有限公司 一种增殖免疫细胞的突变体蛋白
US20220241375A1 (en) 2019-05-20 2022-08-04 Cytune Pharma Il-2/il-15r beta gamma agonist dosing regimens for treating cancer or infectious diseases
US11739146B2 (en) 2019-05-20 2023-08-29 Pandion Operations, Inc. MAdCAM targeted immunotolerance
JP7676329B2 (ja) 2019-06-12 2025-05-14 アスクジーン・ファーマ・インコーポレイテッド 新規ｉｌ－１５プロドラッグおよびその使用方法
CN114728040A (zh) * 2019-06-14 2022-07-08 科优基因公司 新型白介素-2变体及其双功能融合分子
TWI874408B (zh) 2019-06-14 2025-03-01 美商史基普研究協會 於半合成生物體中複製、轉錄及轉譯之試劑及方法
TW202115105A (zh) * 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
CN114051500A (zh) 2019-07-02 2022-02-15 豪夫迈·罗氏有限公司 包含白细胞介素-2突变体和抗cd8抗体的免疫缀合物
AR119382A1 (es) * 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AU2020315800A1 (en) 2019-07-19 2022-03-03 Seneca Therapeutics, Inc. Second generation seneca valley virus oncolytic therapy: compositions and methods thereof
AU2020316002A1 (en) * 2019-07-25 2022-03-03 The University Of Chicago Compositions and methods comprising protease-activated therapeutic agents
AU2020323893A1 (en) 2019-07-26 2022-02-17 Visterra, Inc. Interleukin-2 agents and uses thereof
AU2020329216A1 (en) * 2019-08-12 2022-02-24 AskGene Pharma, Inc. IL-2 fusion proteins that preferentially bind ILl-2ralpha
US20230002466A1 (en) * 2019-08-13 2023-01-05 Elpis Biopharmaceuticals Engineered interleukin-2 receptor beta agonists
JP2022544405A (ja) 2019-08-15 2022-10-18 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 免疫刺激性多量体型結合分子
US12234271B2 (en) 2019-09-10 2025-02-25 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use to treat autoimmune diseases
US20220378933A1 (en) * 2019-09-19 2022-12-01 Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited Il-2 compositions and methods of use thereof
CN114761028A (zh) 2019-09-27 2022-07-15 英特瑞克斯顿阿克图比奥帝克斯有限公司 乳糜泻的治疗
KR20220093363A (ko) * 2019-11-05 2022-07-05 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. N-말단 scFv 다중특이적 결합 분자
CA3152351A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Myoung Ho Jang Composition for culturing regulatory t cells and use thereof
BR112022009521A2 (pt) 2019-11-20 2022-08-16 Gi Cell Inc Composição de meio para cultura de células t e método para cultura de células t usando a mesma
CN114867847A (zh) 2019-11-20 2022-08-05 吉爱希公司 用于培养自然杀手细胞的组合物及使用其来生产自然杀手细胞的方法
WO2021107689A1 (ko) * 2019-11-27 2021-06-03 (주)지아이이노베이션 Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 면역관문 억제제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
BR112022010063A2 (pt) 2019-11-27 2022-09-06 Gi Cell Inc Composição para tratamento anticâncer, compreendendo células nk e proteína de fusão que compreende proteína il-2 e proteína cd80
US20230014358A1 (en) * 2019-11-27 2023-01-19 Gi Cell, Inc. Composition for anticancer treatment, comprising nk cells and fusion protein which comprises il-2 protein and cd80 protein
MX2022007712A (es) 2019-12-17 2022-09-26 Amgen Inc Agonista doble de interleucina-2/receptor de tnf para uso en terapia.
CN111018961B (zh) * 2019-12-17 2022-03-18 北京志道生物科技有限公司 白介素-2衍生物
KR20220116513A (ko) 2019-12-20 2022-08-23 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 신규 il2 작용제 및 이의 사용 방법
GB2609554B (en) 2020-01-03 2025-08-20 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
KR20220125806A (ko) * 2020-01-09 2022-09-14 화이자 인코포레이티드 재조합 백시니아 바이러스
AU2021206449A1 (en) 2020-01-10 2022-07-21 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
JP2023511274A (ja) 2020-01-14 2023-03-17 シンセカイン インコーポレイテッド Ｉｌ２オルソログおよび使用法
EP4090674A4 (en) 2020-01-14 2024-01-24 Synthekine, Inc. Biased il2 muteins methods and compositions
US11230699B2 (en) 2020-01-28 2022-01-25 Immunitybio, Inc. Chimeric antigen receptor-modified NK-92 cells targeting EGFR super-family receptors
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
TWI839476B (zh) * 2020-02-26 2024-04-21 大陸商北京泰德製藥股份有限公司 介白素-2多肽共軛物及其用途
JP2023525200A (ja) * 2020-03-05 2023-06-15 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 設計されたｉｌ－２変異型
JP7697959B2 (ja) 2020-03-18 2025-06-24 ジーアイ イノベーション， インコーポレイテッド Ｉｌ－２タンパク質とｃｄ８０タンパク質を含む融合タンパク質製剤
TWI905155B (zh) * 2020-03-18 2025-11-21 南韓商Ｇｉ醫諾微新股份有限公司 包含 il-2蛋白及cd80蛋白片段或其變異體的融合蛋白及其用途
TWI855242B (zh) 2020-03-18 2024-09-11 南韓商Ｇｉ醫諾微新股份有限公司 包含含有il-2蛋白與cd80蛋白之融合蛋白及抗癌藥物的用於治療癌症的藥學組成物
JP2023518443A (ja) 2020-03-19 2023-05-01 イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド インターロイキン２変異体およびその使用
AU2021239225B2 (en) * 2020-03-19 2024-08-15 Fortvita Biologics (Singapore) Pte.Ltd. Interleukin-2 mutant and use thereof
KR20220161404A (ko) * 2020-04-01 2022-12-06 실리오 디벨럽먼트, 인크. 마스킹된 il-2 사이토카인 및 이들의 절단 산물
CR20220512A (es) 2020-04-15 2022-11-07 Hoffmann La Roche Inmunoconjugados
WO2021216488A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-2 variants with reduced binding to il-2 receptor alpha and uses thereof
EP4139340A1 (en) 2020-04-22 2023-03-01 Merck Sharp & Dohme LLC Human interleukin-2 conjugates biased for the interleukin-2 receptor beta gammac dimer and conjugated to a nonpeptidic, water-soluble polymer
WO2021216916A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 Dragonfly Therapeutics, Inc. Formulation, dosage regimen, and manufacturing process for heterodimeric fc-fused proteins
CR20220576A (es) 2020-05-11 2022-12-07 Hoffmann La Roche Tratamiento conjunto con pbmc modificadas y un inmunoconjugado
EP4149534A4 (en) 2020-05-12 2024-09-04 Cue Biopharma, Inc. MULTIMERIC POLYPEPTIDES MODULATING T CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
CN116323647A (zh) 2020-05-13 2023-06-23 博纳姆治疗公司 蛋白质复合物的组合物及其使用方法
CN113667004A (zh) * 2020-05-14 2021-11-19 上海盖浦生物科技有限公司 一种白介素2突变体
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
IL298642A (en) 2020-06-03 2023-01-01 Ascendis Pharma Oncology Div A/S il-2 sequences and uses thereof
KR102373965B1 (ko) 2020-06-05 2022-03-15 (주)지아이이노베이션 Ｉｌ-２ 단백질 및 ｃｄ８０ 단백질을 포함하는 융합단백질을 포함하는 방사선 치료 증진용 약학적 조성물
JP2023529981A (ja) 2020-06-19 2023-07-12 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫活性化Ｆｃドメイン結合分子
TWI811703B (zh) 2020-06-19 2023-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｃｄ３及ｃｄ１９結合之抗體
CN115916831A (zh) 2020-06-30 2023-04-04 Gi 医诺微新 包含抗lag-3抗体和il-2的融合蛋白及其用途
CN115768788A (zh) * 2020-07-09 2023-03-07 Eutilex股份有限公司 Il-2变体
KR20220014531A (ko) * 2020-07-29 2022-02-07 (주)메디톡스 헤테로이량체 Ｆｃ 융합 단백질, 및 관련 조성물, 용도 및 방법
TW202221031A (zh) 2020-07-30 2022-06-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 血清半衰期延長之pd-l1抑制多肽
KR20230166150A (ko) 2020-08-19 2023-12-06 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
IL301027A (en) * 2020-09-04 2023-05-01 Shandong Simcere Biopharmaceutical Co Ltd Mutant AI 2 and its application
JP2023541366A (ja) 2020-09-09 2023-10-02 キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド １型真性糖尿病（ｔ１ｄ）を治療するためのｍｈｃクラスｉｉ ｔ細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法
JPWO2022059794A1 (sr) * 2020-09-18 2022-03-24
CN114369153A (zh) * 2020-10-18 2022-04-19 北京志道生物科技有限公司 一种白介素-2突变体
CN118598976A (zh) * 2020-10-18 2024-09-06 北京志道生物科技有限公司 经修饰的il-2分子及其用途
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
JP2023550685A (ja) 2020-10-26 2023-12-05 サイチューン ファーマ 扁平上皮癌を治療するためのＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβγアゴニスト
CA3195276A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 Stefano FERRARA Il-2/il-15rb?? agonist for treating non-melanoma skin cancer
CA3195260A1 (en) 2020-10-29 2022-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Fusion proteins for the treatment of disease
CN114437228B (zh) * 2020-10-30 2024-02-06 中国科学院生物物理研究所 一种il-2与抗体亚单位构成的双功能融合蛋白
MX2023005458A (es) 2020-11-13 2023-05-23 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Composicion farmaceutica que comprende una variante de la interleucina humana 2 o un derivado de la misma y uso de la misma.
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
EP4251187A4 (en) 2020-11-25 2025-09-10 Xilio Dev Inc TUMOR-SPECIFIC CLASSIBLE LINKERS
TW202237171A (zh) 2020-12-04 2022-10-01 美商威特拉公司 使用介白素-2藥劑之方法
JP2023551563A (ja) 2020-12-04 2023-12-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ｐＨ依存性変異体インターロイキン－２ポリペプチド
WO2022148853A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Immunoconjugates
WO2022159508A1 (en) * 2021-01-19 2022-07-28 Seneca Therapeutics, Inc. Armed seneca valley virus oncolytic therapy compositions and methods thereof
JP2024511319A (ja) 2021-03-09 2024-03-13 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｃｌｄｎ６に結合するヘテロ二量体抗体
US20240092856A1 (en) 2021-03-09 2024-03-21 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
JP2024512382A (ja) 2021-03-09 2024-03-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ－１標的化ｉｌ－２バリアント免疫コンジュゲートと抗ｔｙｒｐ１／抗ｃｄ３二重特異性抗体の併用療法
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
IL305847A (en) 2021-03-26 2023-11-01 Innate Pharma Multispecific proteins that contain a binding site for NKP46, a binding site for a cancer antigen that is fused to a cytokine to attract NK cells
JP2024512709A (ja) 2021-03-30 2024-03-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト プロテアーゼ活性化ポリペプチド
IL304365B2 (en) * 2021-03-31 2025-04-01 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd A novel conjugate of an IL2 immunostimulatory analog and method of preparation thereof
EP4320155A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
CN113321722A (zh) * 2021-04-13 2021-08-31 苏州复融生物技术有限公司 白介素2突变体及其应用
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
AU2022288123A1 (en) 2021-06-09 2023-11-30 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
MX2023014645A (es) 2021-06-09 2024-01-31 Innate Pharma Proteinas acopladoras de celulas nk de union a nkp46 especificas de cd20.
TW202317623A (zh) 2021-06-14 2023-05-01 美商再生元醫藥公司 基於il2之治療劑及其使用方法
WO2022266467A2 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Recombinant histone polypeptide and uses thereof
WO2023281482A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Bright Peak Therapeutics Ag Cd20-targeted il-2 and its uses
US20230201364A1 (en) 2021-07-09 2023-06-29 Bright Peak Therapeutics Ag Antibody conjugates and manufacture thereof
KR20240041378A (ko) 2021-07-09 2024-03-29 브라이트 피크 테라퓨틱스 아게 체크포인트 억제제와 il-2의 접합체 및 이의 용도
EP4366781A1 (en) 2021-07-09 2024-05-15 Bright Peak Therapeutics AG Checkpoint inhibitors conjugated to il-2, and uses thereof
CA3223427A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-02 Minghui Dong Human interleukin-2 variant and use thereof
CA3225815A1 (en) 2021-08-13 2023-02-16 Cytune Pharma Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer
US20250051467A1 (en) 2021-08-24 2025-02-13 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Fap/cd40 binding molecule and medicinal use thereof
WO2023046156A1 (en) * 2021-09-26 2023-03-30 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Il-2 variants and fusion proteins thereof
JP2024537096A (ja) 2021-10-14 2024-10-10 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がんの治療のための代替的なＰＤ１－ＩＬ７ｖイムノコンジュゲート
CR20240155A (es) 2021-10-14 2024-05-10 Hoffmann La Roche Nuevos inmunoconjugados de interleucina-7
CU24763B1 (es) 2021-12-21 2025-07-09 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteína agonista de interleucina 2
KR20230095612A (ko) * 2021-12-22 2023-06-29 한미약품 주식회사 신규 면역 억제 인터루킨 2 (Interleukin 2) 아날로그
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023141555A2 (en) * 2022-01-21 2023-07-27 Aetio Biotherapy, Inc. Immunoconjugates of interleukin-2 mutant polypeptides with antibodies
KR20230121685A (ko) * 2022-02-11 2023-08-21 주식회사 카나프테라퓨틱스 Il-12 및 항-fap 항체를 포함하는 융합단백질 및 항암제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
CA3189227A1 (en) * 2022-02-21 2023-05-01 Ctcells, Inc. A fusion protein comprising an antigen binding domain and a cytokine trimer domain
WO2023161857A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Bright Peak Therapeutics Ag Bifunctional cytokine compositions
CN116769013A (zh) * 2022-03-10 2023-09-19 广东菲鹏制药股份有限公司 白细胞介素2突变体以及含有其的复合物
US20250222027A1 (en) 2022-04-01 2025-07-10 Sana Biotechnology, Inc. Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies
PE20250753A1 (es) 2022-06-16 2025-03-13 Cephalon Llc Inmunoconjugados de il-2 atenuada-anticuerpo anti-pd-1 y usos de los mismos
WO2024002363A1 (en) * 2022-07-01 2024-01-04 Beijing Neox Biotech Limited Il-2 polypeptides and methods of use
EP4556493A1 (en) 2022-07-11 2025-05-21 Genuv Inc. Cytokine fusion protein
US11773160B1 (en) 2022-08-05 2023-10-03 Anaveon AG Immune-stimulating IL-2 fusion proteins
TWI875131B (zh) * 2022-08-16 2025-03-01 國立陽明交通大學 介白素-2變異體及其於治療癌症的用途
CN119948048A (zh) 2022-09-29 2025-05-06 豪夫迈·罗氏有限公司 蛋白酶活化的多肽
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物
WO2024119193A2 (en) 2022-12-02 2024-06-06 AskGene Pharma, Inc. Mutant il-2 polypeptides and il-2 prodrugs
US20240417436A1 (en) 2023-01-11 2024-12-19 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated immunocytokines and methods of use
WO2024150175A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated proteins and methods of use
KR20250135861A (ko) 2023-01-20 2025-09-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 재조합 Fc 도메인 - IL2 변이체 폴리펩타이드 및 막 고정 항원 결합 폴리펩타이드와의 조합 요법
KR20250153216A (ko) 2023-02-24 2025-10-24 상하이 맙젠 바이오텍 리미티드 Fap/cd40 결합 분자의 약학적 조성물 및 이의 의약적 용도
CN120958026A (zh) 2023-03-01 2025-11-14 江苏恒瑞医药股份有限公司 Fap/4-1bb/cd40结合分子及其医药用途
WO2024215989A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Sotio Biotech Inc. ENGINEERED IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-2/IL-15 RECEPTOR βγ AGONISTS
WO2024238537A1 (en) 2023-05-16 2024-11-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Pd-1 -regulated il-2 immunocytokine and uses thereof
WO2024251884A1 (en) 2023-06-09 2024-12-12 Innate Pharma Nk cell engager proteins comprising anti-cd20 and ant-nkp46 antibody, linked to il-2 in treatment of r/r b-nhl
TW202508641A (zh) 2023-08-16 2025-03-01 大陸商上海邁晉生物醫藥科技有限公司 一種包含免疫綴合物的醫藥組成物及其用途
WO2025137093A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Cephalon Llc Uses for attenuated il-2 immunoconjugates
WO2025202147A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukin-7 immunoconjugates
WO2025242835A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of cancer
WO2025242836A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of auto-immune or inflammatory diseases and disorders

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7802170A (nl) 1977-04-18 1978-10-20 Hitachi Metals Ltd Sierraad.
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4604377A (en) 1984-03-28 1986-08-05 Cetus Corporation Pharmaceutical compositions of microbially produced interleukin-2
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
WO1987000056A1 (en) 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
EP0625200B1 (en) 1992-02-06 2005-05-11 Chiron Corporation Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE19607751A1 (de) 1996-02-29 1997-09-04 Henkel Kgaa Neue Aminophenol-Derivate und deren Verwendung
KR100628846B1 (ko) 1996-10-18 2006-09-29 제넨테크, 인크. 항-ＥｒｂＢ２ 항체
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
EP1071700B1 (en) 1998-04-20 2010-02-17 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6455677B1 (en) 1998-04-30 2002-09-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh FAPα-specific antibody with improved producibility
EP0953639A1 (en) 1998-04-30 1999-11-03 Boehringer Ingelheim International GmbH FAPalpha-specific antibody with improved producibility
US6955807B1 (en) * 1998-05-15 2005-10-18 Bayer Pharmaceuticals Corporation IL-2 selective agonists and antagonists
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
DK1156823T3 (da) 1999-02-12 2009-01-19 Scripps Research Inst Fremgangsmåder til behandling af tumorer og metastaser ved anvendelse af en kombination af anti-angiogene terapier og immunoterapier
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
AU2001256325A1 (en) 2000-03-17 2001-09-24 Boehringer Ingelheim Pharma Kg Human and humanized fap-alpha-specific antibodies
JP4936299B2 (ja) 2000-08-21 2012-05-23 メレクシス・テクノロジーズ・ナムローゼフェンノートシャップ 磁場方向検出センサ
US7396917B2 (en) 2000-12-05 2008-07-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Rationally designed antibodies
ES2347532T3 (es) 2001-04-13 2010-11-02 Biogen Idec Ma Inc. Anticuerpos contra vla-1.
NZ581474A (en) 2001-08-03 2011-04-29 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
AU2002355955A1 (en) * 2001-08-13 2003-03-03 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
AU2002357784B2 (en) 2001-12-04 2008-07-31 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
ES2346205T3 (es) * 2002-12-17 2010-10-13 Merck Patent Gmbh Anticuerpo humanizado (h14.18) del anticurpo 14.18 de raton que se enlaza con gd2 y su fusion con la il-2.
ATE475708T1 (de) 2003-01-22 2010-08-15 Glycart Biotechnology Ag Fusionskonstrukte und deren verwendung zur produktion von antikörpern mit erhöhter fc rezeptor bindungsaffinität und effektorfunktion
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
WO2005062929A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 Chiron Coporation Use of fc receptor polymorphisms as diagnostics for treatment strategies for immune-response disorders
WO2005091956A2 (en) * 2004-03-05 2005-10-06 Chiron Corporation In vitro test system for predicting patient tolerability of therapeutic agents
CN1930300A (zh) * 2004-03-05 2007-03-14 希龙公司 预测患者治疗药物耐受性的体外试验系统
NZ550217A (en) 2004-03-31 2009-11-27 Genentech Inc Humanized anti-TGF-beta antibodies
ES2341126T3 (es) * 2005-05-11 2010-06-15 Philogen S.P.A. Proteina de fusion del anticuerpo l19 contra fibronectina ed-b e interleucina 12.
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
JP2009536170A (ja) 2006-05-08 2009-10-08 フィロジェン・エッセペア 治療用の抗体標的指向サイトカイン
AU2007271398B2 (en) * 2006-07-06 2013-06-20 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for enhancing the efficacy of IL-2 mediated immune responses
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
ATE514785T1 (de) 2006-09-20 2011-07-15 Mt Biomethan Gmbh Verfahren und vorrichtung zur trennung von methan und kohlendioxid aus biogas
KR101248252B1 (ko) 2006-11-28 2013-03-27 한올바이오파마주식회사 변형된 에리스로포이에틴 폴리펩티드와 이의 치료용 용도
WO2009126558A1 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (dnl) technology
US20090252729A1 (en) * 2007-05-14 2009-10-08 Farrington Graham K Single-chain Fc (scFc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
AU2008278803A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binging agents directed to KDR and uses thereof - 035
EP2018877A1 (en) 2007-07-27 2009-01-28 The Procter and Gamble Company Absorbent article comprising water-absorbing polymeric particles and method for the production thereof
US8906356B2 (en) 2007-11-05 2014-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
JP2011507519A (ja) 2007-12-19 2011-03-10 セントコア・オーソ・バイオテツク・インコーポレーテツド ｐＩＸ又はｐＶＩＩへの融合を介したヒトデノボｐＩＸファージディスプレイライブラリの設計及び作製、ベクター、抗体、及び方法
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2085095B1 (en) 2008-01-17 2012-03-07 Philogen S.p.A. Combination of an anti-EDb fibronectin antibody-IL-2 fusion protein, and a molecule binding to B cells, B cell progenitors and/or their cancerous counterpart
AU2009248105B2 (en) 2008-05-13 2013-10-31 Molmed S.P.A. Conjugates for the treatment of mesothelioma
MX2011007647A (es) 2009-01-21 2011-09-01 Amgen Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
WO2010088444A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Medimmune, Llc Human anti-il-6 antibodies with extended in vivo half-life and their use in treatment of oncology, autoimmune diseases and inflammatory diseases
EP2411416A1 (en) 2009-03-24 2012-02-01 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Anti-mesothelin antibodies
WO2010117448A2 (en) 2009-04-05 2010-10-14 Provenance Biopharmaceuticals Corp. Chimeric immunocytokines and methods of use thereof
WO2011001276A1 (en) 2009-06-30 2011-01-06 Philogen S.P.A. Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer
RU2583876C2 (ru) 2009-08-17 2016-05-10 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты направленного действия
SG178567A1 (en) 2009-08-31 2012-04-27 Roche Glycart Ag Affinity-matured humanized anti cea monoclonal antibodies
MX2012003598A (es) 2009-09-29 2012-04-20 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos agonistas de receptores de muerte.
EA034742B1 (ru) 2010-08-13 2020-03-16 Роше Гликарт Аг Антитела к fap, полинуклеотид, вектор и клетка для их получения и их применения
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
LT3075745T (lt) 2011-02-10 2018-11-26 Roche Glycart Ag Mutavę interleukino-2 polipeptidai
EP2681244B1 (en) 2011-03-02 2017-11-29 Roche Glycart AG Cea antibodies
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
AR092044A1 (es) 2012-08-07 2015-03-18 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
SG11201408526SA (en) 2012-08-08 2015-03-30 Roche Glycart Ag Interleukin-10 fusion proteins and uses thereof
US20140044675A1 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Roche Glycart Ag Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
HK1222182A1 (zh) 2013-05-07 2017-06-23 F. Hoffmann-La Roche Ag 三聚体抗原结合分子
ES2774380T3 (es) 2014-08-29 2020-07-20 Hoffmann La Roche Politerapia de inmunocitocinas de variante de IL-2 dirigida a tumor y anticuerpos frente a PD-L1 humano

Also Published As

Publication number Publication date
CN103492411B (zh) 2016-12-07
CY1117842T1 (el) 2017-05-17
TWI577801B (zh) 2017-04-11
US11111312B2 (en) 2021-09-07
TWI666027B (zh) 2019-07-21
PH12013501657A1 (en) 2013-10-07
LT3489255T (lt) 2021-08-25
PT3075745T (pt) 2018-11-14
KR101667096B1 (ko) 2016-10-18
BR112013018932A2 (pt) 2017-05-02
HRP20181736T1 (hr) 2018-12-28
IL269687A (en) 2019-11-28
SI3489255T1 (sl) 2021-11-30
IL252230A0 (en) 2017-07-31
UA113729C2 (xx) 2017-03-10
TW201718029A (zh) 2017-06-01
CR20130314A (es) 2013-08-09
MX356675B (es) 2018-06-08
MX340671B (es) 2016-07-20
AU2012215573B2 (en) 2015-11-26
US20120244112A1 (en) 2012-09-27
US9266938B2 (en) 2016-02-23
SI2673294T1 (sl) 2016-08-31
CN112210000A (zh) 2021-01-12
RS62238B1 (sr) 2021-09-30
IL252230B (en) 2019-10-31
BR112013018932B1 (pt) 2020-11-17
PL3075745T3 (pl) 2019-07-31
EP3971206A1 (en) 2022-03-23
ES2694564T3 (es) 2018-12-21
EP3075745B1 (en) 2018-09-05
AU2015249085B2 (en) 2017-12-14
AU2015249085A1 (en) 2015-11-12
EP3075745A1 (en) 2016-10-05
HUE029139T2 (hu) 2017-02-28
JP2015229676A (ja) 2015-12-21
PH12017500954B1 (en) 2020-06-03
NZ611749A (en) 2015-08-28
MA35803B1 (fr) 2014-12-01
DK3075745T3 (en) 2018-11-26
CN105440123A (zh) 2016-03-30
HRP20211318T1 (hr) 2021-11-26
PT3489255T (pt) 2021-08-13
PT2673294T (pt) 2016-07-07
IL227095B (en) 2018-06-28
KR20150092367A (ko) 2015-08-12
ECSP13012815A (es) 2013-10-31
IL269687B (en) 2022-08-01
JP5878182B2 (ja) 2016-03-08
AR085335A1 (es) 2013-09-25
EA033369B1 (ru) 2019-10-31
PH12017500954A1 (en) 2017-11-27
KR101852245B1 (ko) 2018-04-25
US20160208017A1 (en) 2016-07-21
CL2013001987A1 (es) 2014-01-31
SG10201604160WA (en) 2016-07-28
PL2673294T3 (pl) 2016-11-30
DK2673294T3 (en) 2016-05-30
JP2014506793A (ja) 2014-03-20
EP3489255A1 (en) 2019-05-29
HK1217020A1 (zh) 2016-12-16
EA201300896A1 (ru) 2014-02-28
HUE040326T2 (hu) 2019-03-28
AU2012215573A1 (en) 2013-05-02
HRP20160917T1 (hr) 2016-09-23
CA2824253C (en) 2019-09-17
LT3075745T (lt) 2018-11-26
MY190604A (en) 2022-04-27
EP2673294B1 (en) 2016-04-27
CA2824253A1 (en) 2012-08-16
CN103492411A (zh) 2014-01-01
WO2012107417A1 (en) 2012-08-16
US20180142037A1 (en) 2018-05-24
SG192673A1 (en) 2013-09-30
US20190077881A1 (en) 2019-03-14
UA117294C2 (uk) 2018-07-10
MX2013009226A (es) 2013-12-06
TW201237165A (en) 2012-09-16
CN105440123B (zh) 2020-10-09
DK3489255T3 (da) 2021-08-23
US10323098B2 (en) 2019-06-18
ES2579987T3 (es) 2016-08-18
EP2673294A1 (en) 2013-12-18
KR20130118363A (ko) 2013-10-29
PE20140303A1 (es) 2014-03-22
RS54802B1 (sr) 2016-10-31
US10184009B2 (en) 2019-01-22
NZ710742A (en) 2017-04-28
HUE055284T2 (hu) 2021-11-29
ZA201305282B (en) 2016-07-27
ES2883371T3 (es) 2021-12-07
EP3489255B1 (en) 2021-06-16
CO6741186A2 (es) 2013-08-30
PE20181077A1 (es) 2018-07-05
PL3489255T3 (pl) 2021-11-22
US20190322765A1 (en) 2019-10-24
JP6155300B2 (ja) 2017-06-28
SI3075745T1 (sl) 2018-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11111312B2 (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
US20240092853A1 (en) Ph-dependent mutant interleukin-2 polypeptides
NZ611749B2 (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
NZ710742B2 (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
HK1217020B (zh) 突变体白介素-2多肽
EA040858B1 (ru) Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
HK1189901B (en) Mutant interleukin-2 polypeptides
HK1189901A (en) Mutant interleukin-2 polypeptides