RS57840B1 - Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS57840B1
RS57840B1 RS20181085A RSP20181085A RS57840B1 RS 57840 B1 RS57840 B1 RS 57840B1 RS 20181085 A RS20181085 A RS 20181085A RS P20181085 A RSP20181085 A RS P20181085A RS 57840 B1 RS57840 B1 RS 57840B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
antibody
seq
amino acid
binding
Prior art date
Application number
RS20181085A
Other languages
English (en)
Inventor
Petrus Johannes Simons
Louis Boon
Jinquan Luo
Randall Brezski
Monica Goldberg
Original Assignee
Biocerox Prod Bv
Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47891522&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57840(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biocerox Prod Bv, Janssen Pharmaceuticals Inc filed Critical Biocerox Prod Bv
Publication of RS57840B1 publication Critical patent/RS57840B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
[0001] Sadašnja prijava zahteva prioritet iz prijave EP13159794.0 podnete 18. marta, 2013.
Oblast pronalaska
[0002] Pronalazak se odnosi na antitela, upotrebu takvih antitela i posebno na humanizovana antitela koja se vezuju za CD134, za lečenje raka.
Pozadina pronalaska
[0003] Poboljšanje antitumorske funkcije T-ćelija predstavlja jedinstven pristup u lečenju raka. Postoje značajni dokazi da tumorske ćelije "izbegavaju" imunološki sistem indukcijom aktivne imunološke tolerancije, uglavnom posredovane pomoću regulatornih T limfocita (Tregs; Quezda i sar. Immunol Rev 2011; 241:104-118). Stoga, izgleda da je ravnoteža između efektornih T limfocita (Teffs) (tj. direktnog ili indirektnog uklanjanja tumorskih ćelija) i tolerantnih Tregs (tj., suzbijanje efektorne funkcije Tefek-a i preživljavanje) ključna u efikasnoj imunoterapiji protiv tumora. Drugim rečima, efikasan antitumorski imunološki odgovor, može biti dobijen poboljšanjem efektorne funkcije tumor-specifičnih Tefek-a i/ili ublažavanjem supresivne funkcije tumor-specifičnih Treg-a. Ključni receptor koji se pokazao da posreduje u ovim odgovorima je CD134 (OX40) receptor. (Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Terapijsko ciljanje efektornog T-ćelijskog ko-stimulatornog molekula OX40. Nature Rev Imm 2004; 4: 420-431).
[0004] CD134 (takođe poznat kao OX40, TNFRSF4 i ACT35) je član superfamilije receptora faktora nekroze tumora. Ovaj površinski ko-stimulatorni receptor CD134 je izražen na aktiviranim T limfocitima i igra važnu ulogu u njihovom preživljavanju i funkciji. Prisustvo T limfocita koji eksprimiraju CD134 je pokazano kod različitih humanih malignih tumora i u drenažnim limfnim čvorovima kod pacijenata sa rakom (Ramstad i sar. Am J Surg 2000; 179: 400-406; Vetto i sar. Am J Surg 1997; 174: 258-265).
[0005] In vivo ligacija mišjeg CD134 receptora (bilo sa rastvorljivim mišjim OX40 ligandom (OX40L)-immunoglobulinskim fuzionim proteinima ili mišjim OX40L mimeticima, kao što su anti-mišja CD134-specifična antitela) kod miševa kod kojih je prisutan tumor, poboljšava imunitet protiv tumora, vodi preživljavanju bez tumora na mišjim modelima različitih mišjih malignih tumorskih ćelijskih linija, npr. limfoma, melanoma, sarkoma, raka debelog creva, raka dojke i glioma (Sugamura i sar., Nature Rev Imm 2004, 4: 420- 431).
[0006] Predloženo je poboljšanje imunološkog odgovora sisara prema antigenu, angažovanjem OX40R upotrebom agensa za vezivanje OX40R (Međunarodna patentna objava br. WO 99/42585). Iako se dokument generalno odnosi na sredstva za vezivanje OX40, naglasak je na upotrebi OX40L ili njihovih delova, otkrivanje anti-OX40 antitela je u kontekstu njihove ekvivalentnosti sa ligandom OX40L. Zaista, kada je Weinbergov tim (Weinberg i sar. J Immunther 2006; 29: 575-585) preveo istraživanje u studiju sa primatima koji nisu humani, oni su ponovo namerno izabrali antitelo koje se vezuje za mesto vezivanja OX40L i generalno imitira OX40L.
[0007] Al-Shamkhani i sar. (Eur J Chem 1996; 26: 1695- 1699) su koristili anti-OX40 antitelo nazvano OX86, koje nije blokiralo vezivanje OX40L, kako bi se istražila diferencijalna ekspresija OX40 na aktiviranim T-ćelijama miša i Hirschhorn-Cymerman i sar. (J Exp Med 2009; 206: 1103-1116) su koristili na mišjem modelu OX86 zajedno sa ciklofosfamidom kao potencijalnu hemoimunoterapiju. Međutim, neće biti očekivano da OX86 vezuje humani OX40 i pri odabiru antitela koje bi bilo efikasno kod ljudi, neko bi, u svetlu Weinbergovog rada, odabrao antitelo koje se vezuje za mesto vezivanja OX40L.
[0008] In vivo ligacija humanog CD134 receptora (od strane anti-humanih CD134 specifičnih antitela koja stupaju u interakciju sa domenom vezivanja OX40L na humanom CD134; US 2009/0214560 A1), kod kombinovanih teško imunodeficijentnih (SCID) miševa poboljšava imunitet protiv tumora, što dovodi do inhibicije rasta tumora različitih humanih malignih tumorskih ćelijskih linija, npr limfoma, raka prostate, raka debelog creva i raka dojke, WO2012/027328 i WO2013/028231 opisuju antitela protiv OX40 i njihovu upotrebu u autoimunim bolestima i u lečenju raka.
[0009] Tačan mehanizam vezivanja humanog CD134 posredovan antitumorskim imunskim odgovorima kod ljudi još uvek nije razjašnjen, ali se smatra da je posredovan preko CD134 transmembranskog signalnog puta koji je stimulisan interakcijom sa OX40L. Ova interakcija je posredovana vezivanjem trimernog OX40L za CD134. U sadašnjim terapijama protiv raka, predložena je upotreba trimerizovanog OX40 liganda kao efikasnijeg agensa od antitela protiv OX40 (Morris i sar. Mol Immunol 2007; 44: 3112-3121).
Suština pronalaska
[0010] Sadašnji pronalazak opisuje vezivni molekul koji sadrži
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0011] Pronalazak dalje obezbeđuje vezivni molekul koji sadrži
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 26 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 26 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0012] U nekim realizacijama izolovanog vezivanja, molekuli se vezuju za humani CD134. Molekuli za vezivanje prema pronalasku ne mogu sprečiti vezivanje humanog CD134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L).
[0013] Takvi molekuli za vezivanje uključuju, pogodna antitela protiv CD134, fragmente za vezivanje antigena od anti-CD134 antitela i derivate antitela protiv CD134. U nekim realizacijama vezivni molekul se vezuje za humani CD134 sa Kdod 1 x 10<-7>M ili manje. Molekul za vezivanje ima agonističku aktivnost na humanom CD134 na T-efektornim ćelijama i / ili antagonističku aktivnost na humanom CD134 na T-regulatornim ćelijama. U nekim daljim izvođenjima, molekul za vezivanje je humano monoklonsko antitelo koje specifično vezuje humani CD134 sa Kdod 100 nM ili manje, na primer manje od 50 nM ili manje od 20 nM.
[0014] Predmetni pronalazak takođe, obezbeđuje preparat koji sadrži jedan ili više molekula za vezivanje i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim realizacijama, vezujući molekul je humano monoklonsko anti-CD134 antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena. Preparat može dalje da sadrži dodatne farmaceutske agense, kao što su imunoterapijski agensi, hemioterapijski agensi i hormonski terapijski agensi.
[0015] Sadašnji pronalazak dalje obezbeđuje, dijagnostičke i terapeutske postupke korišćenja molekula za vezivanje. U nekim izvođenjima, pronalazak opisuje postupak za lečenje ili sprečavanje raka kod sisara, koji obuhvata primenu kod sisara terapeutski efikasne količine vezivnog molekula ili preparata koji sadrži vezivni molekul, kako je ovde obelodanjeno. U nekim drugim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje postupak za poboljšanje imunološkog odgovora kod sisara, koji obuhvata primenu kod sisara terapeutski efikasne količine vezivnog molekula ili preparata koja sadrži molekul za vezivanje. U nekim izvođenjima, vezivni molekul koji se koristi u postupcima je humano monoklonsko anti-CD134 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, koji se vezuje za humani CD134, pri čemu antitelo ne sprečava vezivanje humanog CD134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L).
[0016] Sadašnji pronalazak dalje obezbeđuje, molekule nukleinske kiseline koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu molekula za vezivanje, vektore koji sadrže takve nukleinske kiseline, ćelije domaćina koje sadrže vektore i postupke za pripremu molekula za vezivanje.
[0017] Pronalazak takođe obezbeđuje druge aspekte, koji će biti očigledni iz celokupnog opisa, uključujući zahteve.
Opis slika
[0018]
Slika 1. Vremenski tok i dozni efekat od izlaganja PHA-M na površinsku ekspresiju humanog CD134 od strane humanih T limfocita.
Slika 2. Ekspresija humanog CD134 u mirovanju i na aktiviranim humanim CD4 T limfocitima aktiviranim od strane PHA-M.
Slika 3. Vezivne karakteristike mišjih anti-humanih CD134 antitela klona ACT35, klona 12H3 i klona 20E5 na PHA-M-stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 4. Vezivanje mišjih anti-humanih CD134 antitela klona 12H3 i klona 20E5 na PHA-M-stimulisanim CD4 T limfocitima i CD8 T limfocitima koji izražavaju humani CD 134.
Slika 5. Unakrsna-kompeticija neobeleženih mišjih anti-humanih CD134 antitela klona 12H3 ili klona 20E5 sa PE-konjugovanim komercijalnim mišjim anti-CD134 antitelima klona ACT35 ili klona L106 na PHA-M-stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 6. Simultano vezivanje mišjih anti-humanih CD134 antitela klona 12H3 ili klona 20E5 sa humanim OX40L na PHA-M-stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 7. Efekat vremenskog toka od izlaganja stimulatornim granulama anti-humanih CD3/anti-humanih CD28 antitela na površinsku ekspresiju humanog CD134 od strane humanih efektornih T limfocita (Teffs) i regulatornih T limfocita (Tregs).
Slika 8. Dozni efekat izlaganja mišjim anti-humanim CD134 antitelima klona 12H3 ili klona 20E5 ili humanom OX40L na proliferaciju PHA-M-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 9. Efekat kombinovanja mišjih anti-humanih CD134 antitela klona 12H3 sa humanim OX40L ili mišjih anti-humanih CD134 antitela klona 20E5 sa humanim OX40L na proliferaciju PHA-M-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD134.
Slika 10. Efekat izlaganja mišjim antitelima klona 12H3 ili klona 20E5 protiv humanog CD134, ili humanom OX40L na proliferaciju humanih efektornih T limfocita koji eksprimiraju humani CD134 stimulisanih sa granulama stimulatora anti-humanog CD3/anti-humanog CD28 antitela.
Slika 11. Efekat izlaganja mišjim anti-humanim CD134 antitelima klona 12H3 ili klona 20E5 ili humanom OX40L na proliferaciju humanih regulatornih T limfocita koji eksprimiraju humani CD134 stimulisanih sa granulama stimulatora anti-humanog CD3/anti-humanog CD28 antitela.
Slika 12. Efekat mišjeg anti-humanog CD134 klona antitela 12H3 na proliferaciju posredovanu humanim OX40L, anti-humanim CD3/anti-humanim CD28 stimulatornim zrnima antitela-stimulisanim humanim efektornim (A) i regulatornim (B) T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 13. Efekat izlaganja mišjim anti-humanim CD134 antitelima klona 12H3 ili klona 20E5, ili humanom OX40L na supresiju posredovanu humanim regulatornim T limfocitima koji izražavaju humani CD134 od proliferacije humanih efektornih T limfocita koji izražavaju humani CD 134.
Slika 14. Vezivanje himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD134 antitela klona 20E5 na (minus i plus IL-2) CD3/CD28 granulama-stimulisanim CD4 T limfocitima i CD8 T limfocitima koji izražavaju humani CD134.
Slika 15. Efekat himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD134 antitela klona 20E5 ili humanog OX40L na proliferaciju PHA-M-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD134.
Slika 16. Dozni efekat izlaganja himernom humanom IgG4κ anti-humanom CD 134 antitelu klona 20E5 ili humanom OX40L na proliferaciju PHA-M-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 17. Efekat kombinovanja himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 sa humanim OX40L na proliferaciju PHA-M-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 18. Efekat himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 ili humanog OX40L na proliferaciju (minus i plus IL-2) CD3/CD28 zrnima-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134.
Slika 19. Vezivanje mišjih anti-humanih CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 sa neredukovanim i redukovanim rekombinantnim humanim CD134:humanim Fcγ fuzionim proteinom. (A) Ispitani ne-redukcioni (a, b) i redukcioni (c, d) uslovi. (B) Elektroforetski migracioni modeli rekombinantnog humanog CD134 : humanog Fcγ fuzionog proteina (rhuCD134) pod ne-redukcionim (a, b) i redukcionim (c, d) uslovima, korišćenjem Coomassie brilijantnog plavog bojenja. (C) Western blot ne-redukcionog (a, b) i redukcionog (c, d) rekombinantnog humanog CD134 : humanog Fcγ fuzionog proteina izloženog mišjem kontrolnom antitelu IgG1κ izotipa (mIgG1) ili klonovima mišjih antitela 12H3 i 20E5 (m12H3 i m20E5, respektivno) protiv humanog CD 134.
Slika 20. Šematski prikaz domena bogatih cisteinom (CRD) u humanom CD 134 u punoj dužini (označen kao 'CRD1') i u različitim skraćenim humanim CD 134 oblicima (označenim kao 'CRD2', 'CRD3', 'CRD4' i 'skraćeni (tc) CRD4 ').
Slika 21. Vezivanje mišjih anti-humanih CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 na ćelijskoj liniji 293-F prolazno transfektovanoj sa humanim CD 134 konstruktom pune dužine (oznacenom 'CRD1') ili sa raznim skraćenim humanim CD 134 konstruktima (označenim kao 'CRD2', 'CRD3', 'CRD4' i 'skraćeni (tc) CRD4 ').
Slika 22. Vezivanje himernih humanih IgG4κ i / ili IgG1κ anti-humanih CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 na ćelijskoj liniji 293-F prolazno transfektovanoj sa humanim CD 134 konstruktom u punoj dužini (oznacenom 'CRD1') ili sa raznim skraćenim humanim CD 134 konstruktima (označenim 'CRD2', 'CRD3', 'CRD4' i 'skraćeni (tc) CRD4').
Slika 23. Vezivanje mišjeg anti-humanog CD 134 klona antitela 12H3 (A) i himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 (B) sa humanim CD134-izvedenim peptidom, koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci skraćenog CRD3 A1-modula-CRD4 poddomena A1-modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683).
Slika 24. Varijabilni regioni monoklonskog antitela 20E5. Mišji varijabilni regioni (m20E5VH i m20E5VL); humanizovani 20E5 varijabilni teški lanci (hu20E5_h1, hu20E5_h2 i hu20E5_h3) i humanizovani 20E5 varijabilni laki lanci (hu20E5_l1 i hu20E5_l2). m20E5VH: SEK ID BR: 4; m20E5VL: SEK ID BR 5.
Slika 25. Varijabilni regioni monoklonskog antitela 12H3. Mišji varijabilni regioni (m12H3VH i m12H3VL); humanizovani 12H3 varijabilni teški lanci (hu12H3_h1, hu12H3_h2 i hu12H3_h3) i humanizovani 12H3 varijabilni laki lanci (hu12H3_ll i hul2H3_l2). M12H3VH: SEK ID BR: 12; m12H3VL: SEK ID BR: 13.
Slika 26. Humanizovani varijabilni regioni 20E5.
Slika 27. Humanizovani varijabilni regioni 12H3.
Slika 28. Vezivne karakteristike humanizovanog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) i VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) prema rekombinantnom humanom CD 134 vezanom za ploču.
Slika 29. Karakteristike vezivanja humanizovanih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) i VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) prema rekombinantnom humanom CD 134 koji je vezan za ploču.
Slika 30. Karakteristika vezivanja biotinilovanog antitela roditeljskog miša protiv humanog CD 134 klona 12H3 protiv rekombinantnog humanog CD 134 vezanog za ploču.
Slika 31. Kompetitivne karakteristike humanizovanog humanog IgG4κ anti-humanog CD134 antitela klona 12H3 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) i VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) sa biotinilovanim roditeljskim mišjim klonom antitela 12H3 protiv humanog CD 134 (pri EC50od 20 ng / mL) za vezivanje za rekombinantni humani CD134 koji je vezan na ploči.
Slika 32. Nivoi ekspresije humanog CD 134 pune dužine na stabilno transfektovanoj 293-F ćelijskoj liniji klona br.5 (A) i na klonu br.23 (B).
Slika 33. Karakteristike vezivanja humanizovanih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 20E5 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) i VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) prema površinskom humanom CD 134 na stabilno transfektovanoj ćelijskoj liniji 293-F klona br.5.
Slika 34. Karakteristike vezivanja humanizovanih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) i VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) prema površinskom humanom CD 134 na stabilno transfektovanoj 293-F ćelijskoj liniji klona br.5.
Slika 35. Karakteristike vezivanja humanizovanih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (A) i VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) prema površinskom humanom CD 134 na stabilno transfektovanoj 293-F ćelijskoj liniji klona br.23.
Slika 36. Vezivanje humanizovanog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3, VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 na ćelijskoj liniji 293-F prolazno transfektovanoj sa humanim CD 134 konstruktom pune dužine (oznacenom 'CRD1') ili sa raznim skraćenim humanim CD 134 konstruktima (označenim 'CRD3' i 'CRD4').
Slika 37. Vezivanje humanizovanog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 verzije VL1H1 na ćelijskoj liniji 293-F prolazno transfektovanoj sa humanim CD 134 konstruktom pune dužine (oznacenom 'CRD1') ili sa raznim skraćenim humanim CD 134 konstruktima (označenim kao 'CRD3' i 'CRD4').
Slika 38. Karakteristika vezivanja biotinilovanog roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 prema površinskom humanom CD 134 na stabilno transfektovanoj 293-F ćelijskoj liniji klona br.5.
Slika 39. Kompetitivne karakteristike humanizovanog humanog IgG4κ anti-humanog CD134 antitela klona 12H3 verzija VL1H1, VL1VH2, VL1VH3 (V) i VL2H1, VL2VH2, VL2VH3 (B) sa biotinilovanim roditeljskim mišjim anti-humanim CD 134 klonom antitela 12H3 (pri EC50od 700 ng / mL) za vezivanje za površinski humani CD 134 na stabilno transfektovanoj 293-F ćelijskoj liniji klona br.5.
Slika 40. Nishodna regulacija ekspresije FOXP3 u proširenim Tregs (CD4 CD25 CD 127 dim/-) pomoću rastvorljivog OX40L i rastvorljivog mišjeg anti-humanog CD 134 12H3 IgG1 antitela, pri naznačenim koncentracijama. Y osa pokazuje FOXP3 geometrijsku sredinu intenziteta fluorescencije (GeoMFI) detektovanu korišćenjem anti-FOX3P antitela kuplovanih sa PE. m12H3 = mišji 12H3 IgG1. Podaci predstavljaju uzorak triplikata iz jednog donora.
Slika 41. Histogram FACS analiza koji pokazuje smanjen inhibitorni efekat Tregs na T efektornu proliferaciju pomoću humanizovanog anti-humanog CD 134 12H3 VL1VH1 antitela vezanog za ploču u poređenju sa izotipskom kontrolom. Tefektorne ćelije su detektovane sa bojom Celltrace ™ Violet. Odnos Treg:Tefek je bio 1:2.
Slika 42. Efekat indikovanih anti-humanih CD 134 antitela vezanih za ploču na proliferaciju Tefekt ćelija pri odnosu Treg:Tefek od 0: 1 (bez Tregs) (Slika 42A) ili 1: 4 (Slika 42B) izolovanih od donora 7015, prikazan dijagramom kao funkcija indeksa replikacije. M = miš; ch = himerno; h = čovek. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 u poređenju sa kontrolom mIgG1 izotipa. Humani OX40L je korišćen sa (OX40L) ili bez (OX40L bez His) anti-His antitela.
Slika 43. Poravnjanje varijabilnih regiona humanizovanog teškog lanca (VH) izvedenih iz antitela anti-humanog CD 134 20E5 roditeljskog miša. SEK ID Br-a: su prikazane za svaku sekvencu na kraju naziva sekvence (20E5_VH1_64 = aminokiselinska sekvenca SEK ID BR: 64 itd.).
Slika 44. Poravnjanje varijabilnih regiona humanizovanog teškog lanca (VH) izvedenih iz anti-humanih CD 134 12H3 antitela roditeljskog miša. SEK ID BR-a: su prikazane za svaku sekvencu na kraju naziva sekvence (12H3VH1_69 = aminokiselinska sekvenca SEK ID BR: 69 itd.).
Opis pronalaska
[0019] T-ćelijska aktivacija je posredovana ne samo antigenskom stimulacijom preko receptora T-ćelija, već i putem ko-stimulatornih signala preko ko-stimulatornih molekula. Među nekoliko ko-stimulatornih molekula, član familije receptora faktora nekroze tumora (TNF), OX40 (CD 134) igra ključnu ulogu u preživljavanju i homeostazi efektornih i memorijskih T-ćelija. Prema konvencionalnom shvatanju ko-stimulacije OX40, interakcija između OX40 i liganda OX40 (OX40L) se javlja kada se aktivirane T-ćelije vezuju za profesionalne antigen-predstavljajuće ćelije (APCs). T-ćelijske funkcije, uključujući produkciju citokina, proširenje i preživljavanje, su potom poboljšane pomoću OX40 ko-stimulatornih signala. Interakcija između OX40 i OX40L se javlja tokom interakcije T-ćelije-dendritske ćelije (DC), 2-3 dana nakon prepoznavanja antigena. T-ćelija koja eksprimira OX40 može takođe da stupi u interakciju sa ćelijom koja eksprimira OX40L, koja nije DC i prima OX40 signal iz ćelije, što može obezbediti ključne signale za generisanje memorijskih T-ćelija, poboljšanje Th2 odgovora i produženje inflamatornih odgovora. Tako se optimalna interakcija između OX40 i OX40L, može obrazovati u dva koraka: OX40L izražen na aktiviranim CD4 T-ćelijama intereaguje sa OX40 eksprimiranom na drugim CD4 T-ćelijima odgovora, što dovodi do optimalnog nastanka memorijskih CD4 T ćelija (Soroosh i sar. J Immunol 2006; 176: 5975-87) ili OX40L eksprimiranom na dopunskim ćelijama CD4 može promovisati preživljavanje Th2 ćelija kroz interakciju sa OX40 na Th2 ćelijama (Kim i sar. Immunity 2003; 18: 643-54). Pored toga, ekspresija OX40L na B ćelijama je neophodna za in vivo razvoj Th2, ali ne i za razvoj Th1 (Linton i sar. J Exp Med 2003; 197: 875-83) i OX40L-eksprimirajuće ćelije mastocita direktno poboljšavaju efektornu T-ćelijsku funkciju kroz interakciju između OX40 na T-ćelijama i
1
OX40L na mastocitima (Kashiwakura i sar. J Immunol 2004; 173: 5247-5257; Nakae i sar. J Immunol 2006; 176: 2238-2248). Dodatno, pošto endotelne ćelije takođe izražavaju OX40L (Imura i sar. J Exp Med 1996; 183: 2185-95), vezivanje OX40 za endotelne ćelije, može biti uključeno u vaskularnoj inflamaciji. Prekomerni OX40 signali, na obe T-ćelije odgovora i T-regulatorne ćelije, suzbijaju Treg-posredovanu imuno supresiju. OX40 signali koji prolaze kroz Treg ćelije koje reaguju, čine ih otpornim na supresiju posredovanu od strane Treg. S druge strane, OX40 signali koji prolaze kroz Treg ćelije direktno inhibiraju Treg-supresivnu funkciju, iako je kontroverzno da li OX40 signali mogu kontrolisati nivo ekspresije Foxp3 u Treg ćelijama. Pored toga, namerna stimulacija OX40 inhibira TGF-beta-zavisnu diferencijaciju iTreg ćelija (inducibilne Treg ćelije). Inhibicija može delimično biti posredovana efektornim citokinima, kao što su IL-4 i IFN-gama proizvedenim od strane efektornih T-ćelija stimulisanih sa OX40. Važno je da blokiranje OX40L izrazito promoviše iTreg diferencijaciju i indukuje toleranciju grafta, koja bi mogla biti posredovana pomoću Treg ćelija. Zbog toga, OX40 je moguća molekularna meta za kontrolisanje T-ćelijski posredovane autoimunosti. Štaviše, najnovije studije su objavile da interakcija između OX40L, eksprimiranog od strane mastocita i OX40 eksprimiranog od strane Treg ćelija, može međusobno potisnuti funkciju mastocitnih ćelija i Treg ćel.-supresivnu funkciju (Gri i sar., Immunity 2008; 29: 771-81; Piconese i sar., Blood 2009; 114: 2639-48).
[0020] Miševi su eksperimentalno sredstvo od izbora za imunologe, a proučavanje njihovih imunoloških odgovora je omogućilo izuzetan uvid u rad ljudskog imunološkog sistema. Izgleda da je opšta struktura miša i ljudskog sistema prilično slična; međutim, postoje i značajne razlike. Na primer, kod miševa, CD 134 je izražen na Tefektorima nakon aktivacije, dok Tregs konstitutivno izražavaju CD 134 (Piconese i sar. J Exp Med 2008; 205: 825-839). Kod ljudi, CD 134 je izražen i na Teffs i Treg, ali samo pri aktivaciji (videti u daljem tekstu, npr. Primer 2 (g), 'Ekspresija CD 134 na humanim efektornim i regulatornim T limfocitima nakon stimulacije sa stimulatornim granulama anti-humanih CD3/anti-humanih CD28 antitela'). Osim toga, Tregs miša indukuju apoptozu mišjih Teffs radi postizanja supresije (Pandiyan i sar. Nat Immunol 2007; 8: 1353; Scheffold i sar. Nat Immunol 2007; 8: 1285-1287), dok humani Tregs ne indukuju apoptozu u humanim Teffs radi postizanja supresije (Vercoulen i sar. Plos ONE 2009; 4- e7183). Zajedno, ovi podaci ukazuju na različite uloge CD 134 u supresivnoj funkciji Treg-a između imunoloških sistema čoveka i miša.
[0021] Izraz "vezivni molekul" obuhvata (1) antitelo, (2) antigen-vezujući fragment antitela, i (3) derivat antitela, svaki kao što je ovde definisano. Izraz "vezuje se za CD 134" ili "vezivanje na CD 134" odnosi se na vezivanje vezivnog molekula, kao što je ovde definisano, za CD 134 receptor u in vitro testu, kao što je BIAcore test ili Octet (površinska plazmonska rezonanca). Vezivni molekul ima afinitet vezivanja (Kd) od oko 1 x 10<-6>M ili manje, na primer oko 5 x 10<-7>M ili manje, oko 1 x 10<-7>M ili manje, oko 1 x 10<-8>M ili manje, oko 1 x 10<-9>M ili manje, oko 1 x 10<-10>M ili manje, oko 1 x 10<-11>M ili manje, ili oko 1 x 10<-12>M ili manje.
[0022] Izraz "izolovano antitelo" ili "izolovani vezivni molekul" se odnosi na antitelo ili vezivni molekul koji: (1) nije povezan sa prirodno povezanim komponentama koje ga prate u njegovom prirodnom stanju; (2) oslobođen je od drugih proteina iz iste vrste; (3) izražen je pomoću ćelije iz različite vrste; ili (4) ne nalazi se u prirodi. Primeri izolovanih antitela uključuju anti-CD134 antitelo koje je afinitetno prečišćeno pomoću CD134, antitela anti-CD 134 koja su generisana od strane hibridoma ili drugih ćelijskih linija in vitro, humanizovana anti-CD 134 antitela i humano anti-CD134 antitelo izvedeno iz transgene životinje.
[0023] Izraz "agonist" se odnosi na vezivni molekul, kako je ovde definisan, koji nakon vezivanja za CD134, (1) stimuliše ili aktivira CD134, (2) poboljšava, promoviše, indukuje, povećava ili produžava aktivnost, prisustvo ili funkciju CD134 , ili (3) poboljšava, promoviše, povećava ili indukuje ekspresiju CD134. Izraz "antagonist" se odnosi na vezivni molekul, kako je ovde definisan, koji nakon vezivanja za CD134, (1) inhibira ili sprečava CD134, (2) inhibira ili potiskuje aktivnost, prisustvo ili funkciju CD134, ili (3) inhibira ili potiskuje ekspresiju CD134.
[0024] Izraz "antitelo" se odnosi na imunoglobulinski molekul koji se obično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "teški" (H) lanac i jedan "laki" (L) lanac. Humani laki lanci su klasifikovani kao kappa (κ) i lambda (λ). Teški lanci su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, respektivno. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (skraćeno ovde kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni regioni teškog lanca od IgD, IgG i IgA su sastavljeni od tri domena, CH1, CH2 i CH3, a konstantni regioni teškog lanca IgM-a i IgE-a su sastavljeni od četiri domena, CH1, CH2, CH3 i CH4. Svaki laki lanac je sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (skraćeno ovde kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca je sastavljen od jednog domena, CL. Konstantni regioni antitela mogu posredovati vezivanje imunoglobulina u tkivima domaćina ili faktorima domaćina, uključujući, različite ćelije imunog sistema (npr. efektorne ćelije). Regioni VH i VL, mogu biti dalje podeljeni na regione hipervarijabilnosti, označenim regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), koji su rasuti sa više konzervisanim regionima, označenim kao okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-završetka do karboksi-završetka, prema sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni svakog para teškog / lakog lanca (VH i VL), respektivno, tipično obrazuju mesto vezivanja antitela. Dodeljivanje aminokiselina svakom regionu ili domenu je u skladu sa definicijama Kabat-ovih sekvenci proteina od imunološkog interesa (Nacionalni instituti zdravlja, Bethesda, MD (1987 i 1991)) ili u skladu sa definicijama Chothia i sar. Konformacije hipervarijabilnih regiona imunoglobulina (Nature 1989; 342 (6252): 877-83). Izraz "antitelo" obuhvata mišja, humanizovana, humana i himerna antitela i antitelo koje je multimerni oblik antitela, kao što su dimeri, trimeri ili multimeri višeg reda od monomernih antitela. Antitelo takođe obuhvata monospecificna, bispecifična ili multipecifična antitela i svaku drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koji sadrži mesto prepoznavanja antigena sa potrebnom specifičnošću. Takođe obuhvata antitelo koje je vezano ili prikačeno za ostatak koji nije antitelo. Nadalje, izraz "antitelo" nije ograničen bilo kojim posebnim postupkom proizvodnje antitela. Na primer, on uključuje monoklonska antitela, rekombinantna antitela i poliklonska antitela.
[0025] Izraz "derivat antitela" ili "derivat" antitela se odnosi na molekul koji je sposoban za vezivanje za isti antigen (tj. humani CD134) za koji se vezuje antitelo i sadrži aminokiselinsku sekvencu antitela povezanu sa dodatnim molekularnim entitetom. Aminokiselinska sekvenca antitela koja je sadržana u derivatu antitela, može biti antitelo u punoj dužini, ili može biti bilo koji deo ili delovi antitela u punoj dužini. Dodatni molekularni entitet, može biti biološki ili hemijski molekul. Primeri dodatnih molekularnih entiteta uključuju, hemijske grupe, peptide, proteine (kao što su enzimi, antitela), aminokiseline i hemijska jedinjenja. Dodatni molekularni entitet, može biti korišćen kao sredstvo za detekciju, obeležavanje markerom, terapijski ili farmaceutski agens. Aminokiselinska sekvenca antitela, može biti vezana ili povezana sa dodatnim entitetom pomoću nekovalentne asocijacije, hemijskog spajanja, genetske fuzije ili na drugi način. Izraz "derivat antitela" takođe obuhvata himerna antitela, humanizovana antitela i molekule koji su izvedeni od modifikacija aminokiselinskih sekvenci CD134 antitela, kao što su održavane aminokiselinske supstitucije, umetanja i dodavanja.
[0026] Izraz "antigen-vezujući fragment" antitela se odnosi na jedan ili više delova od antitela pune dužine koji zadržava sposobnost da se veže za isti antigen (tj., humani CD 134) za koji se vezuje antitelo. Izraz "antigen-vezujući fragment" takođe, obuhvata deo antitela koji je deo većeg molekula formiranog nekovalentnim ili kovalentnim udruživanjem ili od dela antitela sa jednim ili više dodatnih molekularnih entiteta. Primeri dodatnih molekularnih entiteta uključuju, aminokiseline, peptide ili proteine, kao što je region streptavidinskog jezgra, koji
1
može biti korišćen za izradu tetramernog scFv molekula (Kipriyanov i sar. Hum Antibodies Hybridomas 1995; 6(3): 93-101). Primerni antigen-vezujući fragment je VH i / ili VL antitela.
[0027] Izraz "himerno antitelo" se odnosi na antitelo koje obuhvata aminokiselinske sekvence izvedene iz dve različite vrste, kao što su čovek i miš, tipično kombinaciju mišjih varijabilnih regiona (od teških i lakih lanaca) i humanih konstantih regiona (teški i laki lanci) .
[0028] Izraz "epitop" se odnosi na deo antigena koji je sposoban za specifično vezivanje za antitelo ili T-ćelijski receptor ili na drugi način stupa u interakciju sa molekulom. "Epitop" se takođe u struci naziva "antigenskom determinantom". Epitop se generalno sastoji od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula, poput aminokiselina ili ugljenih hidrata ili bočnih lanaca šećera. Epitop može biti "linearan" ili "nelinearan / konformacioni". Kada je određen željeni epitop (na primer, mapiranjem epitopa), mogu se generisati antitela za taj epitop. Generisanje i karakterizacija antitela, mogu takođe pružiti informacije o poželjnim epitopima. Iz ovih informacija, moguće je da se onda prikažu antitela za ona koja se vezuju za isti epitop, npr. sprovodeći unakrsne kompetitivne studije, kako bi se pronašla antitela koja se kompetitivno vezuju jedna s drugima, tj. antitela se takmiče za vezivanje za antigen.
[0029] Izraz "ćelija domaćina" se odnosi na ćeliju u koju je uveden ekspresioni vektor. Izraz obuhvata ne samo određenu ćeliju subjekta, već i potomstvo takve ćelije. S obzirom na to da se određene modifikacije mogu desiti u narednim generacijama bilo zbog uticaja životne sredine ili mutacije, takvo potomstvo možda neće biti identično sa roditeljskom ćelijom, ali su i dalje obuhvaćena u okviru izraza "ćelija domaćina".
[0030] Izraz "humano antitelo" se odnosi na antitelo koje se sastoji od aminokiselinskih sekvenci isključivo humanih imunoglobulinskih sekvenci. Humano antitelo, može da sadrži mišji ugljenohidratni lanac ako je proizvodeno u mišu, u ćeliji miša ili u hibridomu koji potiče iz ćelije miša. Humana antitela mogu biti pripremljena na različite načine poznate u struci.
[0031] Izraz "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži neke ili sve CDR-ove od antitela ne-humanih životinja, dok okvir i konstantni regioni antitela sadrže aminokiselinske ostatke izvedene iz sekvenci humanih antitela. Humanizovana antitela su tipično proizvedena presađivanjem CDR-ova iz antitela miša u humane okvirne sekvence praćene pozadinskom supstitucijom određenih humanih okvirnih ostataka za odgovarajuće mišje ostatke iz izvornog antitela. Izraz "humanizovano antitelo" takođe se odnosi na antitelo koje nije humanog porekla u kome je, tipično u jednom ili više varijabilnih regiona, uklonjen jedan ili više epitopa koji imaju visoku sklonost da konstituišu humane epitope T-ćelija i / ili B-ćelija, radi smanjenja imunogenosti. Aminokiselinska sekvenca epitopa, može biti uklonjena u potpunosti ili delimično. Međutim, obično se aminokiselinska sekvenca menja supstituisanjem jedne ili više aminokiselina koji čine epitop za jednu ili više drugih aminokiselina, čime se menja aminokiselinska sekvenca u sekvencu koja ne sačinjava humani T-ćelijski i / ili B-ćelijski epitop. Aminokiseline su supstituisane aminokiselinama koje su prisutne u odgovarajućem položaju(ima) u odgovarajućem humanom varijabilnom teškom ili varijabilnom laku lancu, u zavisnosti od slučaja.
[0032] Izraz "sisar" se odnosi na bilo koje vrste životinja iz klase sisara. Primeri sisara uključuju: ljude; laboratorijske životinje kao što su pacovi, miševi, simijani i morska prasad; domaće životinje kao što su zečevi, goveda, ovce, koze, mačke, psi, konji i svinje i slično.
[0033] Izraz "izolovana nukleinska kiselina" se odnosi na molekul nukleinske kiseline cDNK, ili sintetičkog porekla ili njihove kombinacije, koji je odvojen od drugih molekula nukleinske kiseline, prisutnih u prirodnom izvoru nukleinske kiseline.
[0034] Izraz "Kd" se odnosi na konstantu ravnoteže disocijacije određene interakcije antitela i antigena i koristi se za opisivanje afiniteta vezivanja između liganda (kao što je antitelo) i proteina (kao što je CD134). Što je manja konstanta ravnoteže disocijacije, to je čvršće vezan ligand, ili je veći afinitet između liganda i proteina. Kdse može meriti površinskom plazmonskom rezonancom, na primer korištenjem BIACORE 1 ili Octet sistema. Izraz "anti-CD134 antitelo" se odnosi na antitelo, kao što je ovde definisano, sposobno za vezivanje za humani CD134.
[0035] Izrazi "OX40 receptor", "CD134 receptor" i "CD134" se koriste zamenjivo u sadašnjoj prijavi i uključuju humani CD134, kao i varijante, izoforme i homologe tih vrsta. Shodno tome, molekuli za vezivanje humanog CD134 koji su ovde obelodanjeni, mogu u određenim slučajevima, takođe da se vezuju za CD134 od vrsta koje nisu humane. Na primer, vezivni molekuli iz pronalaska, mogu imati unakrsnu aktivnost prema drugim srodnim antigenima, na primer za CD134 od drugih vrsta, kao što su čovek ili majmun, na primer Macaca fascicularis (cinomolgus, cino) ili Pan troglodytes (šimpanze, šimp). U drugim slučajevima, vezivni molekuli, mogu biti potpuno specifični za humani CD134 i mogu da ne pokazuju vrste ili druge tipove unakrsne reaktivnosti. Na primer, oni se neće vezati za CD134 miša ili pacova.
[0036] Izraz "specifično se vezuje za humani CD134" označava da je Kdvezivnog molekula za vezivanje za humani CD134, manja od oko 10 puta, 50 puta ili 100 puta Kdza njegovo vezivanje, na primer, humani CD40, kao što je određeno korišćenjem testa ovde opisanog ili poznatog stručnjaku u struci (npr. BIAcore test).
[0037] Određivanje da se određeni agens specifično vezuje za OX40 receptor, može biti alternativno lako urađeno, korišćenjem ili prilagođavanjem rutinskih procedura. Jedan pogodan in vitro test čini korišćenje procedure Western blotting (opisane u mnogim standardnim
1
tekstovima, uključujući "Antitela, laboratorijski priručnik" od strane Harlow i Lane). Da bi se utvrdilo da se dati OX40 receptorno vezujući agens specifično vezuje za humani OX40 protein, ukupni ćelijski protein je ekstrahovan iz ćelija sisara koje ne izražavaju OX40 antigen, kao što je ne-limfocitna ćelija (npr. COS ćelija ili CHO ćelija), transformisana sa molekulom nukleinske kiseline koja kodira OX40. Kao negativna kontrola, ukupan ćelijski protein je takođe ekstrahovan iz odgovarajućih neizmenjenih ćelija. Ovi proteinski preparati zatim podležu elektroforezi na ne-denaturisanom ili denaturisanom poliakrilamidnom gelu (PAGE). Nakon toga, proteini se prenose na membranu (na primer, nitrocelulozu) pomoću Western blottinga, a agens za testiranje je inkubiran sa membranom. Nakon ispiranja membrane da bi se uklonio nespecifično vezani agens, prisustvo vezanog agensa je detektovano upotrebom antitela potstaknutog protiv ispitivanog agensa koji je konjugovan sa agensom detekcije, kao što je enzim alkalna fosfataza; nanošenje supstrata 5-bromo-4-hloro-3-indolil fosfat/nitro plavog tetrazolijuma rezultira proizvodnjom gustog plavog jedinjenja pomoću imuno-lokalizovane alkalne fosfataze. Agensi koji se specifično vezuju za humani OX40 pomoću ove tehnike biće prikazano da se vezuju za humani OX40 pojas (koji će biti lokalizovan na datom položaju na gelu, određenom njegovom molekulskom masom) u ekstraktu od transformisanih ćelija OX40, dok će malo ili neće biti primećeno vezivanje u ekstraktu od ćelija koje nisu transformisane. Može doći do nespecifičnog vezivanja agensa na druge proteine i može se detektovati kao slab signal na Western blotu. Nespecifična priroda ovog vezivanja biće prepoznata od strane stručnjaka u tehnici pomoću slabog signala dobijenog na Western blotu u odnosu na jak primarni signal koji proističe iz vezivanja specifičnog agensa/humanog OX40 proteina. U idealnom slučaju, agens za vezivanje receptora OX40 se ne bi vezao za proteine ekstrahovane iz ne-transformisanih ćelija. Pored analiza vezivanja korišćenjem ekstrahovanih proteina, mogu se testirati navodni agensi za vezivanje OX40 receptora da bi se potvrdila njihova sposobnost da se u suštini vezuju samo za OX40 receptor in vivo pomoću konjugovanjem agensa sa fluorescentnom oznakom (kao što je FITC) i analiziranjem njegovog vezivanje za CD4+ T-ćeliju aktiviranu antigenom i neaktiviranu populaciju T-ćelija pomoću Fluorescentno aktiviranog sortiranja ćelija (FACS). Agens koji suštinski vezuje samo OX40 receptor će bojiti samo aktivirane CD4+ T-ćelije.
[0038] Izraz "vektor" se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban za transportovanje drugog molekula nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Primeri vektora uključuju plazmide, virusne vektore, vektore kozmida ili faga i gole DNK ili RNK ekspresione vektore. Neki vektori su sposobni za autonomne replikacije u ćeliji domaćina u koju su uvedeni. Neki vektori mogu biti integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i na taj način su
1
replikovani zajedno sa genomom domaćina. Određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani, i stoga se mogu nazvati kao "ekspresioni vektori".
[0039] "Kao što se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu.
[0040] Pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje vezuje humani CD134, koje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) od SEK ID BR: 100 i varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži regione za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR)e HCDR1, HCDR2 i HCDR3, opciono sa 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VL-u od SEK ID BR: 100. SEK ID BR: 100:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPK LLIYWASTRHTGVPX11RFSGX12GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTF GG GTKVEIKR; pri čemu
X11je D ili S; i
X12je G ili S.
[0041] U nekim realizacijama koje su ovde opisane, izolovano antitelo sadrži VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 152, koje opciono ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 152.
SEK ID BR: 152:
QVQLVQSGAEX1KKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWWRQAPGQGLEWX2GGI YPNX3GGSTYNQNFKDRX4TX5TX6DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARX7GYH GPHLDFDVWGQGTTVTVSS;
pri čemu
X1je V ili L;
X2je M ili I;
X3je N, Q, A ili E;
X4je V ili A;
X5je I ili L;
X6je A ili V; i
X7je M, L ili I.
[0042] U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 99, koje opciono ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 99.
SEK ID BR: 99:
1
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWX7GGIYPN NGGS TYNQNFKDRX8TX9TX10DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVW GQG TTVTVSS; pri čemu
X7je I ili M;
X8je A ili V;
X9je L OR I; i
X10je V ili A.
[0043] U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži VL SEK ID BR: 100 i VH SEK ID BR: 152.
[0044] U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži HCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 16, 144 ili 145.
[0045] U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži HCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 15, 141, 142 ili 143. U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži HCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 14.
[0046] U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži
a) VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 67 ili 68; i VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 69, 70, 71, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 146, 147 ili 148, po izboru imajući 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije na VH linearnim položajima aminokiselinskih ostataka 11, 55 ili 99; ili
b) VL i VH koji sadrže aminokiselinske sekvence od
i. SEK ID BR-a: 67 i 69, respektivno;
ii. SEK ID BR-a: 67 i 70, respektivno;
iii. SEK ID BR-a: 67 i 71, respektivno;
iv. SEK ID BR-a: 68 i 69, respektivno;
v. SEK ID BR-a: 68 i 70, respektivno; ili
vi. SEK ID BR-a: 68 i 71, respektivno.
[0047] U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži VL i VH od SEK ID BR-a: 67 i 119, 67 i 120, 67 i 121, 67 i 122, 67 i 123, 67 i 124, 67 i 125, 67 i 126, 67 i 127, 67
1
i 128, 67 i 129, 67 i 130, 67 i 131, 67 i 132, 67 i 133, 67 i 146, 67 i 147.67 i 148, 68 i 119, 68 i 120, 68 i 121, 68 i 122, 68 i 123, 68 i 124, 68 i 125, 68 i 126, 68 i 127, 68 i 128, 68 i 129, 68 i 130, 68 i 131, 68 i 132, 68 i 133, 68 i 146, 68 i 147 ili 68 i 148, respektivno.
[0048] U nekim realizacijama, ovde opisanim, antitelo je agonist CD 134.
[0049] U nekim realizacijama, ovde opisanim, antitelo sadrži supstituciju u Fc regionu.
[0050] U nekim realizacijama, ovde opisanim, supstitucija sadrži supstituciju S267E/L328F, supstituciju E233D/G237D/H268D/P271G/A330R, supstituciju V234A/G237A/P238S/ H268A/V309L/A330S/P331S, ili supstituciju M252Y/S254T/T256E, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU Indeksu.
[0051] Antitela čiji se teški lanac, laki lanac, VH ili VL aminokiselinske sekvence bez osnova razlikuju od onih koje su ovde opisane su obuhvaćena unutar obima pronalaska. Nestandardne razlike su supstitucije od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina u sekvenci varijabilnog regiona antitela koje ne utiču negativno na svojstva antitela. Aminokiselinske sekvence suštinski identične sa sekvencama varijabilnog regiona, koje su ovde prikazane, su u okviru obima pronalaska. U nekim realizacijama, identičnost sekvence može biti oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više. Procenat identičnosti se može odrediti na primer parnim poravnavanjem korišćenjem standardnih postavki AlignX modula Vektora NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proteinske sekvence prema sadašnjem pronalasku, mogu se koristiti kao sekvence upita za izvođenje pretrage prema javnim ili patentnim bazama podataka, na primer, za identifikaciju srodnih sekvenci. Primeri programa koji se koriste za izvođenje takvih pretraga su XBLAST ili BLASTP programi (http_// www_ncbi_nlm/nih_gov), ili GenomeQuest ™ (GenomeQuest, Westborough, MA) nastavak korišćenjem standardnih postavki.
[0052] Tipično, ovo uključuje jednu ili više konzervativnih supstitucija aminokiselina sa aminokiselinom koja ima slični naboj, hidrofobne ili stereohemijske karakteristike na mestu vezivanja antigena ili u okviru, bez nepovoljnih promena svojstava antitela. Konzervativne supstitucije, mogu takođe biti napravljene kako bi se poboljšale osobine antitela, na primer stabilnost ili afinitet.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih supstitucija se može izvršiti u VH ili VL sekvenci. U nekim realizacijama, 1, 2 ili 3 supstitucije su napravljene na VH ili VL antitela, ovde opisanog. Primerne konzervativne supstitucije aminokiselina su prikazane u Tabeli 1. Osim toga, bilo koji prirodni ostatak u polipeptidu takođe, može biti supstituisan sa alaninom, kao što je prethodno opisano za mutagenezu skeniranja alanina (MacLennan i sar. (1998) Act Physiol. Scand. Suppl.643:55-67; Sasaki i sar. (1998) Adv. Biopsy’s. 35: 1-24).
1
[0053] Anti-CD 134 antitela, ovde opisana, koja su modifikovana da se poboljšaju njihova stabilnost, selektivnost, unakrsna reaktivnost, afinitet, imunogenost ili druge poželjne biološke ili biofizičke osobine, su u okviru obima pronalaska. Na stabilnost antitela utiču brojni faktori, uključujući (1) pakovanje jezgra pojedinačnih domena koji utiču na njihovu unutrašnju stabilnost, (2) međuvezne interakcije između proteina i proteina koje utiču na HC i LC uparivanje, (3) ukopavanje polarnih i naelektrisanih ostataka, (4) H-vezna mreža za polarne i naelektrisane ostatke; i (5) površinski naboj i distribuciju polarnih ostataka među ostalim intrai intermolekulskim silama (Worn i sar., J. Mol. Biol., 305: 989- 1010, 2001). Potencijalna struktura destabilizirajućih ostataka, može biti identifikovana na osnovu kristalne strukture antitela, a efekat ostataka na stabilnost antitela, može biti ispitan stvaranjem i ocenjivanjem varijanti koje imaju mutacije u identifikovanim ostacima.
[0054] U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije na položajima linearnih ostataka VH 11, 55 ili 99.
[0055] U nekim realizacijama ovde opisanim, 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije na položajima linearnih ostataka VH su V11L, N55Q, N55A, N55E, M99L ili M99I.
[0056] Zamene na položajima linearnih ostataka VH 11, 55 ili 99, mogu poboljšati stabilnost antitela i / ili povećati njegovu agonističku aktivnost.
[0057] Supstitucije aminokiselina, mogu se vršiti npr. pomoću PCR mutageneze (US patent br.
4,683,195). Biblioteke varijanti, mogu biti generisane korišćenjem dobro poznatih metoda, na primer korišćenjem slučajnih (NNK) ili kodona koji nisu slučajni, na primer DVK kodone, koji kodiraju 11 aminokiselina (Ala, Cis, Asp, Glu, Gli, Liz, Asn, Arg , Ser, Tir, Trp) i skeniranje biblioteka za varijante sa željenim osobinama.
[0058] Iako realizacije prikazane u Primerima sadrže parove varijabilnih regiona, jedan od teškog lanca i jedan od lakog lanca, kvalifikovani stručnjak će prepoznati da alternativna rešenja, mogu da sadrže pojedinačne varijabilne regione teškog ili lakog lanca. Pojedinačni varijabilni region se može koristiti za prikazivanje varijabilnih domena sposobnih za formiranje antigen vezujućeg fragmenta specifičnog za dva domena koji je sposoban, na primer, da se vezuje za humani CD 134 koji ima sekvencu SEK ID BR: 1. Skrining može biti postignut metodoma skrininga prikaza faga korišćenjem na primer, hijerarhijskog dvostruko kombinatornog pristupa otkrivenog u Međ. Pat. Obj. Br. WO 1992/01047. U ovom pristupu, pojedinačna kolonija koja sadrži ili klon H ili L lanca, koristi se za infekciju kompletne biblioteke klonova koji kodiraju drugi lanac (L ili H), a rezultujući dvolančano specifični antigen-vezujući domen je odabran u skladu sa tehnikama prikaza faga, kao što je opisano. Stoga, pojedinačni VH i VL polipeptidni lanci su korisni za identifikovanje dodatnih antitela
2
koja specifično vezuju humani CD 134 koji ima sekvencu SEK ID BR: 1 korišćenjem postupaka koji su otkriveni u Međ. Pat. Obj. Br. WO1992/01047.
[0059] U nekim realizacijama, ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinske sekvence
a. SEK ID BR-a: 14, 15 i 144, respektivno;
b. SEK ID BR-a: 14, 15 i 145, respektivno;
c. SEK ID BR-a: 14, 141, i 16, respektivno;
d. SEK ID BR-a: 14, 141 i l44, respektivno;
e. SEK ID BR-a: s 14, 141 i 145, respektivno;
f. SEK ID BR-a: 14, 142 i 16, respektivno;
g. SEK ID BR-a: 14, 142 i 144, respektivno;
h. SEK ID BR-a: 14, 142 i 145, respektivn;
i. SEK ID BR-a: 14, 143 i 16, respektivno;
j. SEK ID BR-a: 14, 143 i 144, respektivno; ili
k. SEK ID BR-a: 14, 143 i 145, respektivno.
U nekim realizacijama, ovde opisanim, antitela koja sadrže određene CDR sekvence teškog lanca i lakog lanca, kao što je ovde opisano, su humanizovana, humana ili deimunizovana antitela.
[0060] Humana ili deimunizovana antitela mogu biti izrađena, kako je ovde opisano. Humanizovana antitela se tipično odnose na antitelo u kome je mesto za vezivanje antigena izvedeno iz ne-humanih vrsta, a okviri varijabilnog regiona potiču iz humanih imunoglobulinskih sekvenci. Humanizovana antitela, mogu uključivati supstitucije u regionima okvira, tako da okvir možda nije tačna kopija izraženih genskih sekvenci humanog imunoglobulina ili germinalne linije. Humanizovana antitela protiv CD 134, mogu biti generisana, na primer, kod Balb/c miševa korišćenjem standardnih metoda. Antitela napravljena u Balb/c miševima ili drugim ne-humanim životinjama, mogu se humanizovati korišćenjem različitih tehnologija kako bi se generisale sekvence koje su više nalik humanim. Primerne tehnike humanizacije, uključujući izbor humanih akceptorskih okvira, su poznate stručnjacima u struci i uključuju CDR grafting (US Patent br. 5,225,539), SDR grafting (US Patent br. 6,818,749), ponovno pojavljivanje na površini (Palin, Mol Immunol 28: 489-499, 1991), Specifičnost određivanja ponovnog površinskog pojavljivanja ostataka (US Pat. Publ. Br. 2010/0261620), humano prilagođavanje (ili prilagođavanja humanog okvira) (US Pat. Publ.
Br. US2009/0118127), Super humanizaciju (U.S. Patent Br.7,709,226) i vođeni izbor (Osborn i sar., Metode 36: 61-68, 2005; US Patent Br.5,565,332).
[0061] Humanizovana antitela, mogu biti dalje optimizovana da bi se poboljšala njihova selektivnost ili afinitet prema željenom antigenu, ugradnjom izmenjenih ostataka oslonca okvira da se sačuva afinitet vezivanja (pozadinske mutacije), tehnikama kao što su one otkrivene, kao što je opisano u Međ. Pat. Publ. Br. WO 1990/007861 i Međ. Pat. Publ. Br. WO 1992/22653.
[0062] Imunološka efektorna svojstva antitela prema pronalasku, mogu biti modulisana preko Fc modifikacija, tehnikama koje su poznate stručnjacima u struci. Na primer, Fc efektorske funkcije, kao što je C1q vezivanje, citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), fagocitoza, nishodna regulacija receptora na površini ćelija (npr. B ćelijski receptor; BCR), itd., mogu biti modulisane modifikacijom ostataka u Fc odgovornom za ove aktivnosti, vezivanjem za aktivaciju Fc gama receptora (FcγR) FcγRI, FcγRIIa ili FcγRIII ili za inhibitorni receptor FcγRIIb. Farmakokinetička svojstva se takođe mogu poboljšati mutiranjem ostataka u Fc domenu koji produžavaju polu-život antitela modulisanjem afiniteta vezivanja Fc za neonatalni Fc receptor FcRn. Primeri Fc modifikacija su IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252Y/S254T/T256E (Dall'Acqua i sar., J Biol Chem 281:23514-24, 2006); ili IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268Q, H268A/V309L/A330S/P331 ili V234A/G237A/P238S/H268A/ V309L/A330S/P331S (Međ. Pat. Publ. Br. WO2011/066501), ili one opisane u US. Pat. Br.
6,737,056 (brojenje ostataka prema EU indeksu). Fc afinitet antitela na inhibitorni FcγRIIb može se povećati kako bi se poboljšalo unakrsno povezivanje antitela i agonističkih signala. Primerne Fc modifikacije koje poboljšavaju Fc vezivanje za FcγRIIb su S267E/L328F i E233D/G237D/H268D/P271G/ A330R (numeracija ostataka prema EU Indeksu).
[0063] Druga realizacija pronalaska je izolovano antitelo koje vezuje humani CD 134, koje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) od SEK ID BR: 98 i varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata regione za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR)e HCDR1, HCDR2 i HCDR3, koji opciono imaju 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VL SEK ID BR: 98.
SEK ID NO: 98:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAX5KLLIYYTSRL HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYX6CQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR gde X5je V ili P; i
X6je F ili Y.
[0064] U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 134, koje opciono ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 134.
SEK ID BR: 134
QVQLVQSGAEX1KKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWX2GYI NPYNX3GTKYNEKFKGRX4TX5TSDX6SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSS LSX7DYWGQGTLVTVSS;
gde
X1je V ili L;
X2je M ili I;
X3je D, G, A, S ili E;
X4je V ili A;
X5je L ili I;
X6je T ili K; i
X7je M, L ili I.
[0065] U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 97, koje opciono ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 97.
SEK ID BR: 97:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWX1GYIN PYNDGTKYNEKFKGRX2TX3TSDX4SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSL SMDYWGQGTLVTVSS;
pri čemu
X1je I ili M;
X2je A ili V;
2
X3je L ili I; i
X4je K ili T;
[0066] U izvesnoj realizaciji koja je ovde opisana, izolovano antitelo sadrži VL od SEK ID BR: 99 i VH od SEK ID BR: 134.
U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži HCDR3 koji sadrži amino aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 8, 139 ili 140.
U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži HCDR2 koji sadrži amino aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 7, 135, 136, 137 ili 138.
U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži HCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 6.
U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži
a. VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 62 ili 63; i
VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 64, 65, 66, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 149, 150 ili 151, koje opciono ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije na položajima linearnih aminokiselinskih ostataka VH 11, 56 ili 106; ili
b. VL i VH koji sadrže aminokiselinske sekvence od
i. SEK ID BR-a: 62 i 64, respektivno;
ii. SEK ID BR-a: 62 i 65, respektivno;
iii. SEK ID BR-a: 62 i 66, respektivno;
iv. SEK ID BR-a: 63 i 64, respektivno;
v. SEK ID BR-a: 63 i 65, respektivno; ili
vi. SEK ID BR-a: 63 i 66, respektivno.
U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži VL i VH od SEK ID BR-a: 62 i 64, 62 i 65, 62 i 66, 62 i 101, 62 i 102, 62 i 103, 62 i 104, 62 i 105, 62 i 106, 62 i 107, 62 i 108, 62 i 109, 62 i 110, 62 i 111, 62 i 112, 62 i 113, 62 i 114, 62 i 115 , 62 i 116, 62 i 117, 62 i 118, 62 i 149, 62 i 150, 62 i 151, 63 i 64, 63 i 65, 63 i 66, 63 i 101, 63 i 102, 63 i 103, 63 i 104, 63 i 105, 63 i 106, 63 i 107, 63 i 108, 63 i 109, 63 i 110, 63 i 111, 63 i 112, 63 i 113, 63 i 114, 63 i 115, 63 i 116, 63 i 117, 63 i 118, 63 i 149, 63 i 150, 63 i 151.
[0067] U nekim realizacijama ovde opisanim, izolovano antitelo sadrži 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselina na VH linearnim položajima ostataka 11, 56 ili 106.
[0068] U nekim realizacijama ovde opisanim, 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije na VH linearnim položajima ostataka su V11L, D56G, D56A, D56S, D56E, M106L ili M106I.
[0069] Supstitucije 1, 2 ili 3 aminokiselina na položajima linearnih ostataka VH 11, 55 ili 99, mogu poboljšati stabilnost antitela i / ili povećati njegovu agonističku aktivnost.
[0070] Pronalazak obezbeđuje vezivni molekul koji sadrži
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27 (SEK ID BR: 99), ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27 (SEK ID BR: 100) ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0071] Pronalazak takođe obezbeđuje vezivni molekul koji sadrži
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 26 (SEK ID BR: 97), ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 26 (SEK ID BR: 98) ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0072] U nekim realizacijama, vezivni molekul se vezuje za humani CD 134. U nekim realizacijama vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L).
[0073] U nekim realizacijama, efekat vezivanja OX40L za CD 134 je smanjen za ne više od 50% na T-ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134, pri ili iznad koncentracije u kojoj je vezivanje za navedeni CD 134 molekul zasićeno.
[0074] U nekim realizacijama, pri koncentraciji molekula za vezivanje od 70 nM, efekat vezivanja OX40L na CD 134 je smanjen za ne više od 70% na T-ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134.
[0075] U nekim realizacijama, vezivni molekul se vezuje za epitop ekstracelularnog domena humanog CD 134 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 34, SEK ID BR: 35; SEK ID BR: 36, SEK ID BR: 38 i / ili SEK ID BR: 92.
[0076] U nekim realizacijama, vezivni molekul je Fab-fragment, pojedinačni lančani Fv (scFv) fragment ili antitelo.
[0077] U nekim realizacijama antitelo je IgG, IgA, IgD, IgE ili IgM antitelo, kao što su IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitela. U nekim realizacijama antitelo je IgG1 ili IgG4 antitelo.
2
[0078] Pronalazak dalje obezbeđuje, molekul nukleinske kiseline koji kodira molekul za vezivanje ili antitelo prema pronalasku. Dalje je obezbeđen molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region teškog lanca, teški lanac, varijabilni region lakog lanca ili laki lanac humanizovanog antitela prema pronalasku. Primerna humanizovana antitela su humanizovana 12H3 ili humanizovana 20E5 antitela iz pronalaska.
[0079] U nekim realizacijama molekul nukleinske kiseline kodira jedan
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27 (SEK ID BR: 99), ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27 (SEK ID BR: 100), ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0080] U drugoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline kodira varijabilni region humanizovanog antitela od antitela 12H3 roditeljskog miša. Varijabilni region je izabran iz varijabilnih regiona antitela 12H3_VL1VH1; 12H3_VL1VH2; 12H3_VL1VH3; 12H3_VL2VH1; 12H3_VL2VH2; ili 12H3_VL2VH3. Aminokiselinske sekvence primernih varijabilnih regiona su prikazane u SEK ID BR: 67, 68, 69, 70 i 71.
[0081] U drugoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu humanizovanog varijabilnog regiona 12H3 teškog lanca prikazanog u SEK ID BR-a: 69, 70 i 71. U drugoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu humanizovanog varijabilnog regiona 12H3 lakog lanca prikazanog u SEK ID BR-a: 67 i 68.
[0082] U drugoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline kodira varijabilni region humanizovanog antitela od antitela 20E5 roditeljskog miša. Primeri varijabilnih regiona su varijabilni regioni antitela 20E5_VL1VH1; 20E5_VL1VH2; 20E5_VL1VH3; 20E5_VL2VH1; 20E5_VL2VH2; i 20E_VL2VH3. Aminokiselinske sekvence primernih varijabilnih regiona su prikazane u SEK ID BR: 62, 63, 64, 65 i 66.
[0083] U drugoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu humanizovanog varijabilnog regiona teškog lanca 20E5 prikazanog u SEK ID BR: 64, 65 i 66. U drugoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu humanizovanog varijabilnog regiona lakog lanca 20E5 prikazanog u SEK ID BR-a: 62 ili 63.
[0084] Pronalazak takođe obezbeđuje, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela koji sadrži
2
humanizovani varijabilni region izabran iz humanizovanih varijabilnih regiona antitela 12H3_VL1VH1; 12H3_VL1VH2; 12H3_VL1VH3; 12H3_VL2VH1; 12H3_VL2VH2; 12H3_VL2VH3; 20E5_VL1VH1; 20E5_VL1VH2; 20E5_VL1VH3; 20E5_VL2VH1; 20E5_VL2VH2; ili 20E5_VL2VH3 (kao što je navedeno u prethodnom paragrafu i primerima).
[0085] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teške ili lake lance humanizovanih antitela ili varijabilne regione teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac humanizovanog 12H3 antitela od SEK ID BR: 90 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") ili humanizovani teški lanac od SEK ID BR: 87 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC").
[0086] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 12H3 laki lanac od SEK ID BR: 90 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") ili humanizovani teški lanac od SEK ID BR: 88 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC").
[0087] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 12H3 laki lanac od SEK ID BR: 90 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") ili teški lanac od SEK ID BR: 89 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC").
[0088] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 12H3 laki lanac od SEK ID BR: 91 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") ili teški lanac od SEK ID BR: 87 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC").
[0089] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 12H3 laki lanac od SEK ID BR: 91 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") ili teški lanac SEK ID BR: 88 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC".
[0090] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 12H3 laki lanac od SEK ID BR: 91
2
(minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") ili teški lanac od SEK ID BR: 89 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC".
[0091] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 20E5 laki lanac od SEK ID BR: 85 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS") ili teški lanac SEK ID BR: 82 (minus signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS").
[0092] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 20E5 laki lanac od SEK ID BR: 85 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS") ili teški lanac SEK ID BR: 83 (minus signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS").
[0093] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani laki lanac 20E5 od SEK ID BR: 85 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS") ili teški lanac SEK ID BR: 84 (minus signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS").
[0094] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani laki lanac 20E5 od SEK ID BR: 86 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS") ili teški lanac SEK ID BR: 82 (minus signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS").
[0095] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira teški ili laki lanac humanizovanog antitela ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani laki lanac 20E5 od SEK ID BR: 86 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS") ili teški lanac SEK ID BR: 83 (minus signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS").
[0096] U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani teški ili laki lanac ili varijabilni region teškog ili lakog lanca humanizovanog antitela je molekul nukleinske kiseline koji kodira humanizovani 20E5 laki lanac od SEK ID BR: 86 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS") ili teški lanac SEK ID BR: 84 (minus signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLSVTAGVHS").
2
[0097] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju sekvence aminokiselina prikazane u SEK ID BR: 62-71 i / ili SEK ID BR: 82-91 su molekuli nukleinske kiseline koji imaju sekvencu kao što je prikazano u SEK ID BR: 72-81.
[0098] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 72 kodira za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 82. Nukleinske kiseline 58 - 414 SEK ID BR: 72 kodiraju za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 64.
[0099] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 73 kodira za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 83. Nukleinske kiseline 58 - 414 SEK ID BR: 73 kodiraju za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 65.
[0100] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 74 kodira za aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 84. Nukleinske kiseline 58 - 414 SEK ID BR: 74 kodiraju za aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 66.
[0101] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 75 kodira sekvence aminokiselina prikazane u SEK ID BR: 85. Nukleinske kiseline 58 - 381 SEK ID BR: 75 kodiraju za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 62.
[0102] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 76 kodira za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 86. Nukleinske kiseline 58 - 381 SEK ID BR: 76 kodiraju za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 63.
[0103] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 77 kodira za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 87. Nukleinske kiseline 58 - 420 od SEK ID BR: 77 kodiraju za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 69.
[0104] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 78 kodira za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 88. Nukleinske kiseline 58 - 420 od SEK ID BR: 78 kodiraju za aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 70.
[0105] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 79 kodira za aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 89. Nukleinske kiseline 58 - 420 od SEK ID BR: 79 kodiraju za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 71.
[0106] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 80 kodira za aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 90. Nukleinske kiseline 67 - 390 SEK ID BR: 80 kodiraju za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 67.
[0107] Sekvenca nukleinske kiseline prikazana u SEK ID BR: 81 kodira za sekvencu aminokiselina prikazanu u SEK ID BR: 91. Nukleinske kiseline 67 - 390 SEK ID BR: 81 kodiraju za aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 68.
2
[0108] Neke realizacije prema pronalasku, obezbeđuju molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazanu u SEK ID BR: 72, SEK ID BR: 73, SEK ID BR: 74, SEK ID BR: 75, SEK ID BR: 76, SEK ID BR : 77, SEK ID BR: 78, SEK ID BR: 79, SEK ID BR: 80 i / ili SEK ID BR: 81. U poželjnoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu bez sekvence nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid. To je zato što se mogu koristiti različiti signalni peptidi. Pronalazak stoga obezbeđuje, molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prikazanu u SEK ID BR: 72, SEK ID BR: 73, SEK ID BR: 74, SEK ID BR: 75, SEK ID BR: 76, SEK ID BR: 77 , SEK ID BR: 78, SEK ID BR: 79, SEK ID BR: 80 i / ili SEK ID BR: 81, gde je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira signalni peptid odsutna ili zamenjena sekvencom nukleinske kiseline koja kodira različiti signalni peptid pogodan za usmeravanje izlučivanja kodiranog polipeptida.
[0109] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji sadrži ostatke nukleinske kiseline 58 - 414 SEK ID BR: 72;
ostatke nukleinske kiseline 58 - 414 SEK ID BR: 73;
ostatke nukleinske kiseline 58 - 414 SEK ID BR: 74;
ostatke nukleinske kiseline 58-381 SEK ID BR: 75;
ostatke nukleinske kiseline 58-381 SEK ID BR: 76;
ostatke nukleinske kiseline 58-420 SEK ID BR: 77;
ostatke nukleinske kiseline 58-420 SEK ID BR: 78;
ostatke nukleinske kiseline 58-420 SEK ID BR: 79;
ostatke nukleinske kiseline 67 - 390 SEK ID BR: 80; ili
ostatke nukleinske kiseline 67 - 390 SEK ID BR: 81
[0110] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 101-133 ili 146-148.
[0111] Pronalazak dalje obezbeđuje, nosač za isporuku gena ili vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku.
[0112] Dalje je obezbeđena izolovana ili rekombinantna ćelija, ili in vitro ćelijska kultura ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor prema pronalasku. Ćelija je poželjno ćelija domaćina, kao što je ovde definisano. U nekim realizacijama, ćelija je jedna ćelija koja se obično koristi za proizvodnju antitela, kao što je CHO ćelija, ćelija CHO-K1SV ćelija (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 ćelija (ATCC CRL-61), NSO ćelija (Evropska kolekcija ćelijskih kultura (ECACC), Salisbury, Wilthsire, UK, ECACC N. 85110503), SP2/0 ćelija (Kolekcija kulture Američkog tipa (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), HEK 293-F ćelija, PER.C6 ćelija, FO ćelija (ATCC CRL-1646) Ag653 ćelija (ATCC CRL-1580), ili hibridom. U drugoj realizaciji ćelija je ćelija insekta.
[0113] Pronalazak dalje obezbeđuje, postupak za proizvodnju vezivnog molekula koji je karakterisan time što je proizveden molekul za vezivanje prema patentnim zahtevima ili antitelo prema patentnim zahtevima. Proizvedeno antitelo se sakuplja iz ćelijske kulture, supernatanta / medijuma ćelijske kulture ili njihove kombinacije. Sakupljeno antitelo se prečišćava i pakuje u kontejner, poželjno kontejner za skladištenje ili transport.
[0114] Pronalazak dalje obezbeđuje, vezivni molekul ili antitelo prema pronalasku, za upotrebu u lečenju pojedinca kome je potrebno poboljšanje imunološkog odgovora.
[0115] Takođe je obezbeđen, vezivni molekul ili antitelo prema pronalasku, za upotrebu u sprečavanju ili lečenju raka kod pojedinca kome je to potrebno.
[0116] Dalje je obezbeđen, vezivni molekul ili antitelo prema pronalasku, za upotrebu u lečenju pojedinca koji boluje od ili je pod rizikom da boluje od hronične virusne i / ili intracelularne bakterijske infekcije.
[0117] Pronalazak dalje obezbeđuje, farmaceutski preparat koji sadrži vezivni molekul ili antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0118] Sadašnji pronalazak obezbeđuje, izolovane vezivne molekule koji se vezuju za humani CD134, uključujući anti-CD134 antitela, fragmente koji vezuju antigene anti-CD134 antitela i derivate anti-CD134 antitela. Vezivni molekuli su karakterisani najmanje jednom od sledećih funkcionalnih osobina: (a) vezuju se za humani CD134 sa Kdod 1 x 10<-6>M ili manje i (b) ne sprečavaju vezivanje humanog CD134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L); (c) imaju agonističku aktivnost na humanom CD134 na T-efektornim ćelijama i / ili antagonističku aktivnost na humanom CD134 na T-regulatornim ćelijama; (d) ne vezuju se za CD40 receptor pri koncentraciji do 500 nM; (e) ne vezuju se za CD137 receptor pri koncentracijama do 500 nM; (f) ne vezuju se za CD271 receptor pri koncentracijama do 500 nM; (g) sposobni su da poboljšaju proizvodnju IL-2 pomoću izolovanih humanih T ćelija; (h) sposobni su da poboljšaju imunološki odgovor; (i) sposobni su da inhibiraju rast tumorskih ćelija; i (j) imaju terapijski efekat na kancer. U nekim realizacijama, vezivni molekul se vezuje za humani CD134 sa Kdod 1 x 10<-7>M ili manje, ili 1 x 10<-8>M ili manje, ili 5 x 1 x 10<-9>M ili manje.
[0119] Antitela i drugi vezivni molekuli prema pronalasku, mogu biti pripremljeni konvencionalnim tehnikama, a zatim ekranizovani da bi se identifikovali i dobili vezivni molekuli koji ne sprečavaju vezivanje OX40L na CD134. Na primer, mogu se odabrati molekuli za vezivanje koji vezuju CD134 čak i kada je CD134 bio izložen koncentraciji zasićenja OX40L.
1
[0120] Neke realizacije sadašnjeg pronalaska obezbeđuju mišje, humano ili humanizovano antitelo koje se vezuje za humani CD134. U nekim izvođenjima, mišje, humano ili humanizovano antitelo je monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za humani CD134 sa Kdod 100 nM ili manje ili 10 nM ili manje, i / ili ima agonističku aktivnost na humanom CD134, rezultirajući stimulacijom T-efektornih ćelija i / ili supresijom T-regulatornih ćelija. Primerno takvo antitelo je monoklonsko antitelo klona 12H3. Aminokiselinska sekvenca celog varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinske sekvence tri CDR-a iz varijabilnog regiona teškog lanca (VH) antitela klona 12H3 su prikazane u SEK ID BR-a: 12 i 14-16, respektivno. Aminokiselinska sekvenca čitavog varijabilnog regiona lakog lanca i aminokiselinske sekvence tri CDR-a od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) antitela klona 12H3 su prikazane u SEK ID BR-a: 13 i 17-19, respektivno. Drugo primerno antitelo je monoklonsko antitelo klona 20E5. Aminokiselinska sekvenca celog varijabilnog regiona teškog lanca i aminokiselinske sekvence tri CDR-a varijabilnog regiona teškog lanca (VH) od antitela klona 20E5 su prikazane u SEK ID BR-a: 4 i 6-8, respektivno. Aminokiselinska sekvenca celog varijabilnog regiona lakog lanca i aminokiselinske sekvence tri CDR-a varijabilnog regiona lakog lanca (VL) od antitela klona 20E5 su prikazane u SEK ID BR-a: 5 i 9-11, respektivno. Štaviše, druga primerna antitela su humanizovana antitela 12H3_VL1VH1, 12H3_VL1VH2, 12H3_VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2, 12H3_VL2VH3 i humanizovana antitela 20E5_VL1VH1, 20E5_VL1VH2, 20E5_VL1VH3, 20E5_VL2VH1, 20E5_VL2VH2, 20E5_VL2VH3 i optimizovane varijante onih koje sadrže varijabilne regione teškog lanca, kao što je opisano u Primeru 14. Ova antitela sadrže sekvence varijabilnog regiona od SEK ID BR: 67 (12H3_VL1), SEK ID BR: 68 (12H3_VL2), SEK ID BR: 69 (12H3_VH1), SEK ID BR: 70 (12H3_VH2), SEK ID BR: 71 (12H3_VH3), SEK ID BR: 62 (20E5_VL1), SEK ID BR: 63 (20E5_VL2), SEK ID BR: 64 (20E5_VH1), SEK ID BR: 65 (20E5_VH2), SEK ID BR: 66 (20E5_VH3) i varijabilne regione prikazane u tabelama 6 i 9 koji imaju aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR-a: 101-133 i 146-151.
[0121] Pronalazak takođe obezbeđuje, antitela koja sadrže humanizovani varijabilni region izabran od humanizovanih varijabilnih regiona antitela 12H3_VL1VH1; 12H3_VL1VH2; 12H3_VL1VH3; 12H3_VL2VH1; 12H3_VL2VH2; 12H3_VL2VH3; 20E5_VL1VH1; 20E5_VL1VH2; 20E5_VL1VH3; 20E5_VL2VH1; 20E5_VL2VH2; ili 20E_VL2VH3 (kao što je navedeno u prethodnom paragrafu i primerima) ili varijabilnih regiona teškog lanca od SEK ID BR-a: 101-133 i 146-151.
[0122] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano 12H3 antitelo koje sadrži laki lanac od SEK ID BR: 90 (minus N-terminalna signalna sekvenca
2
"MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") i teški lanac od SEK ID BR: 87 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC".
[0123] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano 12H3 antitelo koje sadrži laki lanac od SEK ID BR: 90 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") i teški lanac od SEK ID BR: 88 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC ".
[0124] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano 12H3 antitelo koje sadrži laki lanac od SEK ID BR: 90 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") i teški lanac od SEK ID BR: 89 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC".
[0125] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano 12H3 antitelo koje sadrži laki lanac od SEK ID BR: 91 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") i teški lanac od SEK ID BR: 87 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC".
[0126] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano 12H3 antitelo koje sadrži laki lanac od SEK ID BR: 91 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") i teški lanac od SEK ID BR: 88 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC ".
[0127] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano 12H3 antitelo koje sadrži laki lanac SEK ID BR: 91 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC") i teški lanac SEK ID BR: 89 (minus signalna sekvenca "MELGLSWIFLLAILKGVQC".
[0128] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano antitelo 20E5 koje sadrži laki lanac SEK ID BR: 85 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS") i teški lanac SEK ID BR: 82 (minus signal sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS".
[0129] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano antitelo 20E5 koje sadrži laki lanac SEK ID BR: 85 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS") i teški lanac SEK ID BR: 83 (minus signal sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS".
[0130] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano antitelo 20E5 koje sadrži laki lanac SEK ID BR: 85 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS") i teški lanac SEK ID BR: 84 (minus signalna sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS".
[0131] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano antitelo 20E5 koje sadrži laki lanac SEK ID BR: 86 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS") i teški lanac SEK ID BR: 82 (bez signalne sekvence "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS".
[0132] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano antitelo 20E5 koje sadrži laki lanac SEK ID BR: 86 (bez N-terminalne signalne sekvence "MEWSGVFMFLLS VTAGVHS") i teški lanac SEK ID BR: 83 (minus signalna sekvenca "MEWSGVFMFLLS VTAGVHS".
[0133] U nekim realizacijama, humanizovano antitelo je humanizovano antitelo 20E5 koje sadrži laki lanac SEK ID BR: 86 (minus N-terminalna signalna sekvenca "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS") i teški lanac SEK ID BR: 84 (bez signalne sekvence "MEWS GVFMFLLSVTAGVHS".
[0134] Antitela prema pronalasku, mogu da sadrže jedan ili više ovih CDR regiona ili jedan ili više ovih CDR regiona sa 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije po CDR-u. Supstitucije mogu biti "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline su dobro poznate u struci i opisane su na primer u Tabeli 1 WO 2010/019702. Primerne konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1. Amino kiseline su naznačene korišćenjem dobro poznatog koda od tri slova.
Tabela 1.
4
[0135] S obzirom da se klon 12H3 i klon 20E5 vezuju za humani CD134, VH i VL sekvence svakog od njih mogu se "mešati i upariti" sa drugim anti-CD134 antitelima za stvaranje dodatnih antitela. Vezivanje takvih "mešanih i uparenih" antitela sa humanim CD134, može biti testirano korišćenjem analiza vezivanja poznatih u stanju tehnike, uključujući analizu opisanu u Primerima. U jednom slučaju, kada su VH i VL regioni mešani i upareni, VH sekvenca iz određenog VH / VL uparivanja je zamenjena sa strukturno sličnom VH sekvencom. Isto tako, u drugom slučaju, VL sekvenca iz određenog VH / VL uparivanja zamenjuje se sa strukturno sličnom VL sekvencom.
[0136] Molekuli koji sadrže samo jedan ili dva CDR regiona (u nekim slučajevima, čak i samo jedan CDR ili njegov deo, naročito CDR3), sposobni su da zadrže aktivnost vezivanja antigena od antitela iz koga potiču CDR regioni. Videti, na primer, Laune i sar. JBC 1997; 272: 30937-44; Monnet i sar. JBC 1999; 274: 3789-96; Qiu i sar. Nature Biotechnology 2007; 25: 921-9; Ladner i sar. Nature Biotechnology 2007; 25: 875-7; Heap i sar. J Gen Virol 2005; 86: 1791-1800; Nicaise i sar. Protein Science 2004; 13: 1882-91; Vaughan i Sollazzo Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2001; 4:417-430; Quiocho Nature 1993; 362: 293-4; Pessi i sar. Nature 1993; 362: 367-9; Bianchi i sar. J Mol Biol 1994; 236: 649-59; i Gao i sar. J Biol Chem 1994; 269: 32389-93.
[0137] Shodno tome, jedna realizacija predmetnog pronalaska je izolovano anti-humano CD 134 antitelo koje obuhvata: (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 12; (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13.
[0138] U daljoj realizaciji prema pronalasku, obezbeđen je izolovani molekul za vezivanje CD134 koji sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 14; i / ili (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 15; i / ili (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 16.
[0139] U daljoj realizaciji prema pronalasku, obezbeđen je izolovani molekul za vezivanje CD134 koji sadrži (a) CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 17; i / ili (b) CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18; i / ili (c) CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19.
[0140] Prema tome, jedna realizacija predmetnog pronalaska je izolovano anti-humano CD 134 antitelo koje obuhvata: (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4; (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 5.
[0141] U daljoj realizaciji prema pronalasku, obezbeđen je izolovani molekul za vezivanje CD134 koji sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 6; i / ili (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 7; i / ili (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 8.
[0142] U daljoj realizaciji prema pronalasku, obezbeđen je izolovani CD134 vezivni molekul koji sadrži (a) CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9; i / ili (b) CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10; i / ili (c) CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 11.
[0143] S obzirom na to da se klon 12H3 i klon 20E5 vezuju za humani CD134 i da je specifičnost vezivanja antigena obezbeđena najpre pomoću CDR1, CDR2 i CDR3 regiona, VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence i VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence mogu biti "mešane i uparene" kako bi se stvorila dodatna anti-CD134 antitela. Na primer, CDR regioni različitih anti-CD134 antitela, mogu biti mešani i upareni, mada će svako antitelo obično sadržati VH CDR1, CDR2 i CDR3 i VL CDR1, CDR2 i CDR3. Vezivanje takvih "mešanih i uparenih" antitela sa CD134, može biti ispitano korišćenjem testova vezivanja gore opisanih i u Primerima (npr., ELISA, Biacore analiza). U jednom slučaju, kada su VH CDR sekvence mešane i uparene, CDR1, CDR2 i / ili CDR3 sekvenca iz određene VH sekvence zamjenjuje se sa strukturno sličnom CDR sekvencom(ama). Isto tako, kada se VL CDR sekvence mešaju i uparuju, CDR1, CDR2 i / ili CDR3 sekvenca iz određene VL sekvence obično se zamenjuju strukturno sličnom CDR sekvencom(ama). Biće očigledno za prosečnog stručnjaka da nove VH i VL sekvence, mogu nastati zamenom jedne ili više sekvenci VH i / ili VL CDR regiona sa strukturno sličnim sekvencama od CDR sekvenci, ovde otkrivenih.
[0144] Klasa (npr. IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD) i podklasa (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) anti-CD134 antitela, može biti određena bilo kojom pogodnom metodom, kao što je ELISA ili Western Blot, kao i drugim tehnikama. Alternativno, klasa i podklasa se mogu odrediti sekvenciranjem svih ili delova konstantnih domena teških i / ili lakih lanaca antitela, upoređujući njihove sekvence aminokiselina sa poznatim aminokiselinskim sekvencama različitih klasa i podklasa imunoglobulina, i određivanjem klase i podklase antitela. Anti-CD134 antitela, mogu biti IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD molekul. Na primer, anti-CD134 antitela, mogu biti IgG koji je podklase IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Tako, drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje metod za pretvaranje klase ili podklase antitela protiv CD 134 u drugu klasu ili podklasu.
[0145] U nekim realizacijama, anti-CD134 antitelo je izotipa IgG4. Vezujući molekuli prema jednoj realizaciji iz pronalaska uključuju, monoklonska antitela, njegove fragmente, peptide i druge hemijske entitete. Monoklonska antitela, mogu biti izrađena konvencionalnim metodom imunizacije sisara, praćenom izolovanjem plazmatskih B ćelija koje proizvode monoklonska antitela od interesa i fuziju sa ćelijom mijeloma.
[0146] U različitim realizacijama, umesto da bude pravo antitelo, ostatak za vezivanje može biti imitirajuće antitelo (na primer, na osnovu skele ne-antitela), RNK aptamer, mali molekul ili CovX-telo.
[0147] Biće prihvaćeno da mimičko antitelo (na primer, strukture skela ne-antitela koje imaju visok stepen stabilnosti i omogućavaju varijabilnost da se uvode na određenim položajima), može biti korišćeno za stvaranje molekularnih biblioteka iz kojih se mogu izvesti vezujući ostaci. Stručnjaci u biohemiji će biti upoznati sa mnogim takvim molekulima. Takvi molekuli, mogu biti korišćeni kao vezujući deo u agensu prema predmetnom pronalasku.
[0148] Primeri mimika antitela su razmatrani od strane Skerra i sar. (2007, Curr. Opin. Biotech., 18: 295-304) i uključuju: afitela (takođe nazvana Trinektini; Nygren i sar., 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLD-ove (takođe nazvani Tetranektini; Thogersen i sar., Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27-30; adnektine (takođe nazvani monotelima; Koide i sar., Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109); antikaline (Schlehuber i sar., Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); DARPine (ankirini; Binz i sar., Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); avimere (Silverman i sar., Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561); mikrotela (Krause i sar., FEBS J, (2007), 274, 86-95); peptidne aptamere (Borghouts i sar., Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797); Kunitzove domene (Attucci i sar., J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809); afiline (Hey i sar., Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522).
[0149] Prema tome, poželjno je da se mimičko antitelo odabere iz grupe koja sadrži ili se sastoji od afitela, tetranektina (CTLD-ova), adnektina (monotela), antikalina, DARPina (ankirina), avimera, iMabsa, mikrotela, peptidnih aptamera, Kunitz domena, aptamera i afilina.
[0150] Pod "malim molekulom" podrazumeva se organsko jedinjenje male molekulske mase od 900 daltona ili manje. Iako veliki biopolimeri, kao što su nukleinske kiseline, proteini i polisaharidi (kao što su skrob ili celuloza) nisu uključeni kao "mali molekuli", uključeni su njihovi konstituentni monomeri (ribo- ili deoksiribonukleotidi, aminokiseline i monosaharidi, respektivno) i oligomeri (tj. kratki polimeri kao što su dinukleotidi, peptidi poput antioksidantnog glutationa i disaharidi poput saharoze). Proizvodnja malih molekula je opisana u Mayes & Whitcombe, 2005, Adv. Drug Deliv. Rev.57: 1742-78 i Root-Bernstein & Dillon, 2008, Curr. Pharm. Des. 14:55-62.
[0151] CovX-tela nastaju kovalentnim spajanjem farmakofora preko linkera za mesto vezivanja specijalno dizajniranog antitela, efikasno reprogramiranjem antitela (Tryder i sar., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett., 17: 501-6). Rezultat je nova klasa hemijskih entiteta koja je formirana, gde svaka komponenta doprinosi željenim crtama u netaknutom CovX-telunaročito, entitet ima biološka dejstva peptida i produženi poluživot antitela.
[0152] Humana antitela, mogu biti izrađena pomoću nekoliko različitih metoda, uključujući upotrebu biblioteka ekspresije humanih imunoglobulina (Stratagene Corp., La Jolla, Kalifornija, Cambridge Antibody Technology Ltd., London, Engleska) za proizvodnju fragmenata humanih antitela (VH, VL, Fv , Fd, Fab ili (Fab') 2) i korišćenje ovih fragmenata za izgradnju celokupnih humanih antitela fuzijom odgovarajućeg dela, koristeći tehnike slične onima za proizvodnju himernih antitela. Na primer, humana antitela mogu biti izolovana iz biblioteka prikaza faga koje izražavaju varijabilne regione teškog i lakog lanca kao fuzione proteine sa bakteriofagnim pIX obloženim proteinom, kao što je opisano od strane Shi i sar. (2010) J. Mol. Biol.397: 385-96 i PCT Međ. Obj. Br WO09/085462). Humana antitela, mogu takođe biti proizvedeni u transgenim miševima sa humanim imunoglobulinskim genomom. Takvi miševi su dostupni od npr. Abgenix, Inc., Fremont, Regeneron (http://_ www_regeneron_com), Harbour antitela (http://_www_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net), KyMab (http://_ www_kymab_com), Trianni (http://_www.trianni_com) i Ablexis (http:_//_ www_ablekis.com). Pored povezivanja Fv regiona teških i lakih lanaca za formiranje peptida sa jednim lancem, Fab se može konstruisati i izraziti sličnim sredstvima (M. J. Evans i sar. J Immunol Meth 1995; 184: 123-138).
[0153] DeImmunized ™ antitela su antitela u kojima su eliminisani potencijalni imunogeni T-ćelijski epitopi, kako je opisano u Međunarodnoj patentoj prijavi WO1998052976. Prema tome, očekuje se da će se imunogenost kod ljudi eliminisati ili značajno smanjiti kada se ona primenjuju in vivo. Vezujući molekuli na bazi imunoglobulina prema pronalasku, mogu imati eliminisane njihove imunogene T-ćelijske epitope (ako su prisutni) pomoću takvih postupaka.
[0154] Sva od gore opisanih, celokupnih i delimičnih humanih antitela su manje imunogena nego potpuno mišje ili antitela koja nisu izvedena iz čoveka, kao i fragmenti i antitela sa jednim lancem. Stoga je manje verovatno da svi ovi molekuli (ili njihovi derivati) izazivaju imunološki ili alergijski odgovor. Shodno tome, oni su pogodniji za in vivo primenu kod ljudi od potpuno ne-humanih antitela, posebno kada je potrebna ponovljena ili dugotrajna primena.
[0155] Bispecifična antitela, mogu biti korišćena kao unakrsno-vezujući agensi između humanog CD 134 iste humane ciljne ćelije ili humanog CD 134 na dve različite humane ciljne ćelije. Takva bispecifična antitela imaju specifičnost za svaki od dva različita epitopa na humanom CD 134. Ova antitela i način njihove izrade su opisani u U.S. patentu broj 5,534,254 (Creative Biomolecules, Inc.). Različite realizacije bispecifičnih antitela, opisane u patentu uključuju, povezivanje pojedinačnog lanca Fv sa peptidnim spojnicama, uključujući Ser-Cis, (Gli)4-Cis, (His)6-(Gli)4-Cis, helatne agense i hemijska ili disulfidna kuplovanja, uključujući, bismaleimidoheksan i bismaleimidokaproil.
[0156] VL i / ili VH regioni antitela prema pronalasku, mogu biti konstruisati u drugim izvođenjima bispecifičnih antitela u punoj dužini, gde svaki deo antitela vezuje različiti antigen ili epitop. Takva bispecifična antitela, mogu biti izrađena na primer, modulovanjem CH3 interakcija između dva teška lanca antitela da bi se formirala bispecifična antitela korišćenjem tehnologija, kao što su one opisane u US Pat. Br. 7,695,936; Međ. Pat. Obj. Br. WO2004/111233; U.S. Pat. Publ. Br. US2010/0015133; U.S. Pat. Publ. Br. US2007/ 0287170; Međ. Pat. Publ. Br. WO2008/119353; U.S. Pat. Publ. Br. US2009/0182127; U.S. Pat. Publ. Br. US2010/0286374; U.S. Pat. Publ. Br. US2011/0123532; Međ. Pat. Publ. Br. WO2011/131746; Međ. Pat. Publ. Br. WO2011/143545; ili U.S. Pat. Publ. Br. US2012/ 0149876. Dodatne bispecifične strukture u koje se mogu inkorporirati VL i / ili VH regioni antitela prema pronalasku su, na primer, imunoglobulini sa dva varijabilna domena (Međ. Pat. Publ. Br. WO2009/134776), ili strukture koje uključuju različite dimerizacijske domene za povezivanje dva dela antitela sa različitom specifičnošću, kao što su leucinski patent zatvarač ili domeni dimerizacije kolagena (Međ. Pat. Publ. Br. WO2012/022811, U.S. Pat. Br.5,932,448; U.S. Pat. Br. 6,833,441).
[0157] Molekuli koji nisu antitela, mogu biti izolovani ili prikazani iz biblioteka jedinjenja konvencionalnim sredstvima. Automatski sistem za generisanje i skrining biblioteke jedinjenja je opisan u U.S. patentima br-a 5,901,069 i 5,463,564. Fokusiraniji pristup uključuje, trodimenzionalno modelovanje vezujućeg mesta, a zatim generisanje porodice molekula koji odgovaraju modelu. Ovi se zatim prikazuju za one sa optimalnim karakteristikama vezivanja.
[0158] Drugi pristup je generisanje biblioteka rekombinantnih peptida, a zatim prikazivanjem za one koji se vezuju za epitop humanog CD 134 od interesa. Videti, na primer, U.S. patent br.
5,723,322. Ovaj epitop je isti kao onaj vezan monoklonskim antitelima, opisanim u dole navedenim primerima. Molekuli se mogu generisati ili izolovati relativno lako u skladu sa tehnikama koje su dobro poznate u struci kada je epitop poznat.
[0159] Sledeća realizacija obezbeđuje derivate bilo kojeg anti-CD134 antitela, kao što je gore opisano. U jednom posebnom aspektu, derivat antitela je izveden iz modifikacija aminokiselinskih sekvenci klona 12H3 i / ili klona 20E5. Aminokiselinske sekvence bilo kog regiona iz lanaca antitela, mogu biti modifikovane, kao što su okvirni regioni, CDR regioni ili konstantni regioni. Modifikacije mogu biti uvedene standardnim tehnikama poznatim u stanju tehnike, kao što su mutageneze usmerene na mesto i slučajne mutageneze posredovane PCR-om, a mogu sadržati i prirodne kao i aminokiseline koje nisu prirodne. Vrste modifikacija uključuju umetanja, brisanja, supstitucije, ili njihove kombinacije, od jedne ili više aminokiselina anti-CD134 antitela. U nekim realizacijama, derivat antitela sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije u CDR-ovima teškog lanca i / ili jednu aminokiselinsku supstituciju u CDR-ovima lakog lanca. U nekim realizacijama, derivat anti-CD134 antitela sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na aminokiselinsku sekvencu začetne linije humanog gena. U posebnoj realizaciji, jedna ili više tih supstitucija iz matične linije je u CDR2 regionu teškog lanca. U drugoj posebnoj realizaciji, supstitucije aminokiselina u odnosu na matičnu liniju su na jednom ili više istih položaja kao i supstitucije u odnosu na začetnu liniju u antitelima klona 12H3 i klona 20E5. U drugoj realizaciji, aminokiselinska supstitucija je za promenu jednog ili više cisteina u antitelo sa drugim ostatkom, kao što je, bez ograničenja, alanin ili serin. Cistein može biti kanonski ili ne-kanonski cistein. Supstitucija može biti napravljena u CDR ili okvirnom regionu varijabilnog domena ili u konstantnom domenu antitela. Druga vrsta aminokiselinske supstitucije je za uklanjanje asparagin-glicinskih parova, koji formiraju potencijalne deamidacione lokacije, izmenom jednog ili oba ostatka. U još nekim realizacijama, aminokiselinska supstitucija je konzervativna aminokiselinska supstitucija. U jednoj realizaciji, derivat antitela ima 1, 2, 3 ili 4 konzervativne aminokiselinske supstitucije u CDR regionima teškog lanca u odnosu na aminokiselinske sekvence klona 12H3 i / ili klona 20E5. Druga vrsta modifikacije anti-CD 134 antitela je promena originalnog šablona glikozilacije antitela. Izraz "promena" se odnosi na brisanje jednog ili više ugljeno-hidratnih
4
ostataka nađenih u antitelu i / ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koji nisu prisutni u antitelu.
[0160] Glikozilacija antitela je tipično N-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenohidratnog ostatka za bočni lanac asparaginskog ostatka. Primeri drugih modifikacija uključuju acilaciju, amidaciju, acetilaciju, unakrsno-vezivanje, ciklizaciju, formilaciju, hidroksilaciju, jodinaciju, metilaciju, miristoilaciju, formiranje disulfidnih veza, demetilaciju, stvaranje kovalentnih unakrsnih veza, formiranje cisteina, oksidaciju, fosforilaciju, prenilaciju, pegilaciju, proteolitičku obradu i sulfaciju.
[0161] Dalja realizacija, obezbeđuje derivat antitela koji sadrži antitelo protiv CD134, ili njegov fragment za vezivanje antigena, kao što je ovde opisano, povezan sa dodatnim molekularnim entitetom. Primeri dodatnih molekularnih entiteta uključuju, farmaceutska sredstva, peptide ili proteine i sredstva za detekciju ili markere. Specifični primeri farmaceutskih sredstava koji mogu biti povezani sa antitelom protiv CD134, uključuju citotoksične agense ili druge terapijske agense za rak i radioaktivne izotope. Specifični primeri peptida ili proteina koji mogu biti povezani sa antitelom protiv CD134 uključuju, antitela, koja mogu biti ista anti-CD134 antitela ili različita antitela. Specifični primeri detekcionih sredstava ili obeleživača koji mogu biti povezani sa antitelom protiv CD 134, uključuju (1) fluorescentna jedinjenja, kao što su fluorescein, fluorescein izotiocijanat, fikoeritrin, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalen-sulfonil hlorid i lantanidni fosfor; (2) enzime, kao što su peroksidaza rena, alkalna fosfataza, luciferaza i glukozna oksidaza, (3) biotin; (4) prethodno određeni polipeptidni epitop prepoznat od strane sekundarnog reportera, kao što su sekvence para zubaca leucina, domeni vezivanja metala, oznake epitopa i mesta vezivanja za sekundarna antitela. Sledeća realizacija obezbeđuje derivat antitela koji je multimerni oblik antitela protiv CD 134, kao što su dimeri antitela, trimeri ili multimeri višeg reda monomernih antitela. Pojedinačni monomeri unutar multimera antitela, mogu biti identični ili različiti, tj. mogu biti heteromerni ili homomerni multimeri antitela. Multimerizacija antitela može biti ostvarena prirodnom agregacijom. Na primer, izvestan procenat prečišćenih preparata antitela (npr., prečišćenih IgG1 molekula) spontano formira proteinske agregate koji sadrže homodimere antitela i druge multimere antitela višeg reda. Alternativno, homodimeri antitela, mogu biti formirani pomoću tehnika hemijskog vezivanja poznatih u stanju tehnike. Pogodni unakrsni linkeri uključuju one koji su heterobifunkcionalni, kao što su m-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimidski estar, N-sukcinimidil S-acetiltioacetat i sukcinimidil 4- (maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat) ili homobifunkcionalni (kao što je disukcinimidil suberat). Takvi linkeri su komercijalno dostupni. Antitela takođe mogu biti izrađena da multimerizuju preko tehnike rekombinantne DNK poznate u struci.
[0162] Još jedna dalja realizacija, obezbeđuje derivat antitela koje je himerno antitelo, koje sadrži aminokiselinsku sekvencu anti-humanog CD 134 antitela, ovde gore opisanog. U drugom primeru, svi CDR regioni himernog antitela su izvedeni od anti-humanih CD 134 antitela. U drugom primeru, CDR regioni iz više od jednog anti-humanog CD 134 antitela su kombinovani u himernom antitelu. Nadalje, himerno antitelo može obuhvatati okvirne regione izvedene iz jednog anti-humanog CD 134 antitela i jednog ili više CDR regiona iz jednog ili više različitih humanih antitela. Himerna antitela, mogu biti generisana korišćenjem konvencionalnih metoda poznatih u struci. U nekim konkretnim izvođenjima, himerno antitelo sadrži jedan, dva ili tri CDR regiona iz varijabilnog regiona teškog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca antitela odabranog od antitela klona 12H3 i / ili klona 20E5.
[0163] Primeri drugih derivata antitela koji su obezbeđeni sadašnjim pronalaskom, uključuju antitela sa jednim lancem, diatela, domenska antitela, nanotela i unitela. U nekim realizacijama, monoklonska antitela mogu biti himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, DeImuunized ™ antitela, bispecifična antitela, antitela sa jednim lancem, fragmenti, uključujući Fab, F(ab')2, Fv ili druge fragmente koji zadržavaju antigen vezujuću funkciju roditeljskog antitela. Antitela sa jednim lancima ("ScFv") i postupak njihove konstrukcije su opisani u US patentu br.4,946,778.
[0164] "Antitelo sa jednim lancem" (scFv) se sastoji od pojedinačnog polipeptidnog lanca koji sadrži VL domen povezan sa VH domenom, gde su VL domen i VH domen upareni da formiraju monovalentni molekul. Jednolančano antitelo, može biti dobijeno prema postupku poznatom u struci (videti, na primer, Bird i sar., (1988) Science 242: 423-426 i Huston i sar., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). "Diatelo" se sastoji od dva lanca, svaki lanac koji obuhvata varijabilni region teškog lanca povezan je sa varijabilnim regionom lakog lanca na istom polipeptidnom lancu koji je povezan pomoću kratkog peptidnog linkera, pri čemu se dva regiona u istom lancu ne uparuju jedan s drugim, već sa komplementarnim domenima na drugom lancu da bi se formirao bispecifičan molekul. Metode pripreme diatela su poznate u struci (videti, npr. Holliger P. i sar., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, i Poljak R. J. i sar., (1994) Structure 2: 1121- 1123). Antitela domena (dAt-a) su male funkcionalne jedinice vezivanja od antitela, koje odgovaraju varijabilnim regionima bilo teških ili lakih lanaca antitela. Domenska antitela su dobro izražena u ćelijskim sistemima bakterija, kvasaca i sisara. Dalji detalji domenskih antitela i postupaka njihove proizvodnje su poznati u struci (videti, na primer, US patent br-a. 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; WO04/ 003019 i WO03/002609). Nanotela su izvedena iz teških lanaca antitela. Nanotelo obično sadrži pojedinačni varijabilni domen i dva konstantna domena (CH2 i CH3) i zadržava sposobnost vezivanja antigena prvobitnog antitela. Nanotela mogu biti pripremljena metodama poznatim u stanju tehnike (videti npr. U.S. Patent br.6,765,087, U.S. Patent br.6,838,254, WO 06/079372). Unitela se sastoje od jednog lakog lanca i jednog teškog lanca IgG4 antitela. Unitela mogu biti napravljena uklanjanjem zglobnog regiona IgG4 antitela. Dalji detalji unitela i postupaka njihove pripreme, mogu se naći u WO2007/059782.
[0165] Pored vezujućeg dela, molekuli prema pronalasku, mogu dalje da sadrže deo za in vivo povećanje poluživota molekula, kao što su, ali bez ograničenja, polietilen glikol (PEG), humani serumski albumin, glikozilacione grupe, masne kiseline i dekstran. Takve dalje grupe mogu biti konjugovane ili na drugi način kombinovane sa vezivnim delom, korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici.
[0166] Dalji aspekt pronalaska, obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu vezivnog molekula CD134 u skladu sa prvim aspektom pronalaska. Sekvenca aminokiselina kodirana molekulom nukleinske kiseline, može biti bilo koji deo intaktnog antitela, kao što je CDR, sekvenca koja sadrži jedan, dva ili tri CDR regiona ili varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca, ili može biti teški lanac ili laki lanac u punoj dužini. U nekim realizacijama, molekul nukleinske kiseline kodira sekvencu aminokiselina koja sadrži (1) CDR3 region, posebno CDR3 region teškog lanca, antitela klona 12H3 i / ili klona 20E5; (2) varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca antitela klona 12H3 i / ili klona 20E5; ili (3) teški lanac ili laki lanac antitela klona 12H3 i / ili klona 20E5. U drugim realizacijama, molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEK ID Br-a: 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ili 19 ili iz grupe koju čine SEK ID br-a: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11.
[0167] Molekuli nukleinske obezbeđeni pronalaskom, mogu biti dobijeni iz bilo kojeg izvora koji proizvodi CD 134 antitelo u skladu sa pronalaskom. mRNK iz ćelija koje proizvode anti-CD134 antitelo, može biti izolovana standardnim tehnikama, klonirana i / ili amplifikovana pomoću PCR-a i tehnika konstrukcije biblioteke, a prikazana pomoću standardnih protokola za dobijanje molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu anti-CD 134 antitela. mRNK se može koristiti za proizvodnju cDNK za upotrebu u polimeraznoj lančanoj reakciji (PCR) ili cDNK kloniranju gena antitela. U jednoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline se dobija iz hibridoma koji eksprimira anti-CD134 antitelo, kao što je prethodno opisano, poželjno je hibridom koji ima kao jedan od njegovih fuzionih partnera ne-humanu transgenu životinjsku ćeliju koja izražava humane imunoglobulinske gene. U još jednoj realizaciji, hibridom je izveden iz životinje koja nije humana i nije transgena.
4
[0168] Molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac anti-CD134 antitela, može biti konstruisan spajanjem molekula nukleinske kiseline koji kodira teški varijabilni region sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira konstantni region teškog lanca. Slično tome, molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac anti-CD134 antitela, može se konstruisati fuzijom molekula nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region lakog lanca sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira konstantni region lakog lanca. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju VH i VL lanac, mogu biti pretvoreni u gene antitela pune dužine njihovim umetanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog lanca i lakog lanca, respektivno, tako da je VH segment operativno povezan sa segmentom(ima) konstantnog regiona teškog lanca (CH) unutar vektora i VL segment je operativno povezan sa segmentom konstantnog regiona lakog lanca (CL) unutar vektora. Alternativno, molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju VH ili VL lance su prevedeni u gene antitela pune dužine povezivanjem, na primer, vezivanjem, molekula nukleinske kiseline koji kodira VH lanac sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira CH lanac, koristeći standardne molekularne biološke tehnike. Isto se može postići korišćenjem molekula nukleinske kiseline koji kodiraju VL i CL lance. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju teške i / ili lake lance u punoj dužini, mogu zatim biti izraženi iz ćelije u koju su uvedeni i izolovana anti-CD 134 antitela.
[0169] Molekuli nukleinske kiseline, mogu biti korišćeni za rekombinantnu ekspresiju velikih količina anti-CD 134 antitela, kao što je opisano u nastavku. Molekuli nukleinske kiseline se takođe mogu koristiti za proizvodnju drugih vezivnih molekula obezbeđenih pronalaskom, kao što su himerna antitela, antitela sa jednim lancem, imunoadhezini, diatela, mutirana antitela, bispecifična antitela i derivati antitela, kao što je drugde ovde opisano. U jednoj realizaciji, molekul nukleinske kiseline je korišćen kao probni ili PCR prajmer za specifične sekvence antitela. Na primer, proba molekula nukleinske kiseline, može biti korišćena u dijagnostičkim metodama ili molekul nukleinske kiseline PCR prajmer, može biti korišćen za amplifikaciju regiona DNK koji se mogu koristiti, između ostalog, za izolovanje sekvenci nukleinskih kiselina za upotrebu u proizvodnji varijabilnih regiona anti-CD 134 antitela.
[0170] Kada su dobijeni molekuli DNK koji kodiraju VH i VL segmente anti-CD 134 antitela, ovi molekuli DNK mogu dalje biti manipulisani pomoću tehnika rekombinantne DNK, na primer za pretvaranje gena varijabilnih regiona u gene lanca antitela pune dužine, u Fab fragmentne gene, u scFv gene, ili mogu biti inkorporirani u bispecifična antitela.
[0171] Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje vektor, koji sadrži molekul nukleinske kiseline prethodno ovde opisan. Molekul nukleinske kiseline, može da kodira deo lakog lanca ili teškog lanca (kao što je CDR ili varijabilni region), laki ili teški lanac u punoj dužini, polipeptid koji sadrži deo ili teški ili laki lanac u punoj dužini, ili aminokiselinsku sekvencu derivata antitela ili fragmenta koji vezuje antigen.
[0172] Primer pogodnog ekspresionog vektora je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu humanu CH ili CL imunoglobulinskuu sekvencu, sa odgovarajućim mestima ograničenja koja su projektovana tako da se bilo koja VH ili VL sekvenca može ubaciti i izraziti. Ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju aminokiselinske sekvence iz lanca antitela od ćelije domaćina. DNK koja kodira aminokiselinsku sekvencu lanca antitela može biti klonirana u vektor tako da je signalni peptid povezan u okviru sa amino završetkom aminokiselinske sekvence lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz proteina koji nije imunoglobulinski). Pored sekvence nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu anti-CD134 antitela (antitela VH, VL, geni teškog / ili lakog lanca pune dužine), ekspresioni vektori nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćina. Dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će biti transformisana, nivo ekspresije željenog proteina i tako dalje. Regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina sisara uključuju, virusne elemente koji usmeravaju visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i / ili poboljšači dobijeni iz retrovirusnih LTR-a, citomegalovirus (CMV) (kao što je CMV promoter / pojačivač), Simijan Virus 40 (SV40) (kao što je SV40 promoter / pojačivač), adenovirus, (npr. adenovirusni glavni kasni promoter (AdMLP)), polioma i jaki promoteri sisara, kao što su prirodni imunoglobulin i promoteri aktina.
[0173] Ćelija domaćina, može biti ćelija sisara, insekta, biljna, bakterijska ili ćelija kvasca. Primeri ćelijskih linija sisara koji su pogodni kao ćelije domaćina uključuju, ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO), NS0 ćelije, PER-C6 ćelije, SP2/0 ćelije, HEK-293T ćelije, NIH-3T3 ćelije, HeLa ćelije, bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK), bubrežne ćelije Afričkog zelenog majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr. Hep G2), humane ćelije pluća, A549 ćelije i niz drugih ćelijskih linija. Primeri ćelijskih linija insekata uključuju Sf9 ili Sf21 ćelije.
[0174] Primeri biljnih ćelija domaćina, uključuju Nicotiana, Arabidopsis, vodene biljke roda Lemna, kukuruz, pšenicu, krompir i tako dalje. Bakterijske ćelije domaćina uključuju vrste E. coli i Streptomyces.
[0175] Primeri ćelija domaćina kvasca, uključuju Saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris.
[0176] Aminokiselinske sekvence vezivnog molekula, izražene pomoću različitih ćelijskih linija ili kod transgenih životinja, mogu imati različitu glikozilaciju. Međutim, svi vezivni
4
molekuli kodirani molekulima nukleinske kiseline koji su ovde obezbeđeni, ili koji sadrže aminokiselinske sekvence ovde obezbeđene su deo sadašnjeg pronalaska, bez obzira na glikozilaciju vezivnih molekula.
[0177] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje postupak za proizvodnju vezivnog molekula CD 134, kao što je prethodno definisano korišćenjem prikaza faga. Metoda obuhvata (a) sintetisanje biblioteke humanih antitela na fag, (b) skrining biblioteke sa CD 134 ili njegovim delom, (c) izolovanje faga koji vezuje CD 134 ili njegov deo, i (d) dobijanje antitela iz faga. Jedan od primera metode za pripremu biblioteke antitela obuhvata korak od: (a) imunizovanja nehumane životinje koja sadrži humane imunoglobulinske položaje sa CD134 ili njegov antigenski deo da bi se stvorio imuni odgovor; (b) ekstrahovanja ćelija za proizvodnju antitela od imunizovane životinje; (c) izolovanja RNK koja kodira teške i lake lance anti-CD 134 antitela iz ekstrahovanih ćelija; (d) reverzne transkripcije RNK za proizvodnju cDNK; (e) amplifikovanje cDNK; i (f) ubacivanje cDNK u vektor prikaza faga tako da su antitela izražena na fagu. Rekombinantna antitela protiv humanog CD 134 ili njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen, mogu biti izolovani skriningom biblioteke rekombinantnih kombinatornih antitela. Biblioteka može biti biblioteka scFv prikaza faga, generisana korišćenjem humanih VL i VH cDNK, pripremljenih iz mRNK izolovanih iz B ćelija. Metode za pripremu i skrining takvih biblioteka su poznate u struci. Kompleti za generisanje biblioteka prikaza faga su komercijalno dostupni.
[0178] U nekim realizacijama pronalaska obezbeđen je preparat, na primer, farmaceutski preparat koji sadrži jedan ili kombinaciju vezivnih molekula, kao što je ovde opisano, i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač. Preparati mogu biti pripremljeni konvencionalnim metodama poznatim u struci. U nekim realizacijama, preparat sadrži anti-CD134 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U posebnoj realizaciji, preparat sadrži antitelo klona 12H3 i / ili klona 20E5, ili fragment za vezivanje antigena od bilo kojeg antitela. U još nekim realizacijama, preparat sadrži derivat antitela klona 12H3 i / ili klona 20E5. U drugim realizacijama, farmaceutski preparat sadrži humanizovano antitelo 12H3_VL1VH1, 12H3_VL1VH2, 12H3_VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2, 12H3_VL2VH3, 20E5_VL1VH1, 20E5_VL1VH2, 20E5_VL1VH3, 20E5_VL2VH1, 20E5_VL2VH2 ili 20E5_VL2VH3. U drugim realizacijama, farmaceutski preparat sadrži varijantu humanizovanih antitela, gore opisanih, koja obuhvata varijabilni region teškog lanca od SEK ID BR-a: 101-133 ili 146-151. Izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na bilo koju neaktivnu supstancu koja je pogodna za upotrebu u formulaciji za isporuku vezivnog molekula. Nosač može biti antiadherens, vezivno sredstvo, sredstvo za oblaganje, sredstvo za dezintegraciju, punioc ili razblaživač, konzervans (kao što
4
su antioksidans, antibakterijski ili antifungalni agens), zaslađivač, agens za odlaganje apsorpcije, sredstvo za vlaženje, sredstvo za emulgovanje, pufer i slično.
[0179] Molekuli prema pronalasku koji nisu peptidi, mogu biti primenjeni oralno, uključujući pomoću suspenzije, tablete i slično. Tečne formulacije, mogu biti primenjene inhalacijom liofilizovanih ili aerosolizovanih mikrokapsula. Takođe, mogu biti korišćene supozitorije. Dodatni farmaceutski vehikulumi, mogu biti korišćeni za kontrolisanje trajanja dejstava molekula iz pronalaska. Doziranje i raspored formulacije, koji je odabran, može se odrediti standardnim procedurama, dobro poznatim u tehnici. Ovakvi postupci uključuju, ekstrapolaciju procenjenog rasporeda doziranja sa životinjskih modela, a zatim određivanje optimalne doze u humanoj kliničkoj studiji raspona doze.
[0180] Preparati mogu biti u bilo kojim pogodnim oblicima, kao što su tečni, polučvrsti i čvrsti dozni oblici. Različiti dozni oblici preparata, mogu se pripremiti konvencionalnim tehnikama poznatim u struci.
[0181] Relativna količina vezivnog molekula u sastavu preparata variraće u zavisnosti od brojnih faktora, kao što su željeno oslobađanje i farmakodinamičke karakteristike korišćenog specifičnog vezivnog molekula i nosača i doznog oblika. Količina vezivnog molekula u pojedinačnom doznom obliku će generalno biti ona količina koja proizvodi terapeutski efekat, ali takođe može biti i manja količina. Generalno, ova količina će se kretati od oko 0,001% do oko 99%, od oko 0,1% do oko 70%, ili od oko 1% do oko 30% u odnosu na ukupnu težinu doznog oblika.
[0182] Pored vezivnog molekula, može biti uključen jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa u preparatu ili odvojeno kao deo istog režima lečenja. Primeri dodatnih terapeutskih agenasa su ovde opisani u nastavku. Pogodna količina dodatnog terapeutskog sredstva u sastavu preparata, može biti lako odabrana od strane stručnjaka u stanju tehnike i variraće u zavisnosti od više faktora, kao što je određeni agens i nosači, oblik doziranja i željeno oslobađanje i farmakodinamičke karakteristike. Količina dodatnog terapeutskog agensa uključenog u pojedinačnom doznom obliku će uopšteno biti ona količina sredstva koja daje terapeutski efekat, ali može biti i manja količina.
[0183] Vezivni molekuli i farmaceutski preparati koji sadrže vezivni molekul, obezbeđeni sadašnjim obelodanjivanjem su korisni za terapeutske, dijagnostičke ili druge svrhe, kao što su poboljšanje imunološkog odgovora, lečenje raka, povećanje efikasnosti druge terapije u lečenju raka ili povećanje efikasnosti vakcine, i imaju brojne koristi, kao što su za upotrebu kao lekovi ili dijagnostički agensi. Prema tome, u poželjnom aspektu prema pronalasku su obezbeđeni postupci korišćenja vezivnih molekula ili farmaceutskih preparata.
4
[0184] Dalji aspekt pronalaska, obezbeđuje postupak za modulaciju antitumorskih imunskih odgovora posredovanih humanim CD 134, uključujući poboljšanje efektorne funkcije humanih Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 i / ili slabljenje supresivne funkcije humanih Treg-a koji eksprimiraju humani CD 134, korišćenjem vezivnog molekula koji se vezuje za humani CD134, uključujući i anti-humana CD134 antitela, koji (1) zaobilazi interakciju prirodnog humanog OX40L sa humanim CD 134 receptorom i / ili (2) ne blokira ćelijsku signalizaciju posredovanu humanim CD 134 nakon zauzimanja sa njegovim prirodnim humanim ligandom OX40L.
[0185] Dalji aspekt pronalaska, obezbeđuje postupak za modulaciju antitumorskih imunskih odgovora posredovanih humanim CD 134, uključujući poboljšanje efektorne funkcije humanih Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 i / ili slabljenje supresivne funkcije humanih Trega koji eksprimiraju humani CD 134, koristeći vezivne molekule koji se vezuju za humani CD 134, ovde opisan.
[0186] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje postupak modulacije antitumorskih imunskih odgovora posredovanih humanim CD 134, pri čemu navedena metoda ne uključuje vezivne molekule koji se vezuju za humani CD 134, uključujući anti-humana CD 134 antitela, kao što su humani mimetici OX40L, koji stupaju u interakciju sa humanim OX40L vezivnim domenom na humanom CD 134 receptoru i / ili blokiraju ćelijsku signalizaciju humani OX40L-humani CD 134.
[0187] Sadašnji pronalazak otkriva vezivne molekule koji se vezuju za humani CD 134, uključujući antitela protiv humanog CD 134, za antitumorske terapijske svrhe. Antitela protiv humanog CD 134 se vezuju za ekstracelularni domen humanog CD 134. U nekim realizacijama, antitela protiv humanog CD 134 se vezuju za regione koji nisu vezujući za OX40L "(tj. antihumana CD 134 antitela ne blokiraju u potpunosti vezivanje humanog OX40L za humani CD 134) na ekstracelularnom domenu humanog CD 134 na aktiviranim humanim Tefek-a i humanim Treg-a.
[0188] U jednom posebnom aspektu, obezbeđene su metode za poboljšanje imunskog odgovora kod sisara, obuhvatajući primenu terapeutski efikasne količine vezivnog molekula kod sisara, kao što je ovde opisano. U nekim realizacijama, vezivni molekul je anti-CD 134 antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena i sisar je čovek. U daljoj realizaciji, molekul za vezivanje je antitelo klona 12H3 i / ili klona 20E5, ili fragment za vezivanje antigena bilo kojeg antitela, humanizovanog 12H3 ili humanizovanog 20E5 antitela. Izraz "poboljšanje imunološkog odgovora" podrazumeva podsticanje, izazivanje, povećanje, poboljšanje ili augmentiranje bilo kojeg odgovora imunološkog sistema sisara. Imunski odgovor može biti celularni odgovor (tj.
4
ćelijski posredovan, kao što je posredovan citotoksičnim T-limfocitima) ili humoralni odgovor (tj. odgovor posredovan antitelom) i može biti primarni ili sekundarni imunski odgovor. Primeri poboljšanja imunskih odgovora, uključuju povećanu aktivnost CD4+ pomoćnih T ćelija i generisanje citolitičkih T ćelija. Povećanje imunskog odgovora, može biti procenjeno pomoću brojnih in vitro ili in vivo merenja poznatih stručnjacima u ovoj oblasti tehnike, uključujući, ali ne ograničavajući se na, testove citotoksičnih T limfocita, oslobađanje citokina (na primer, proizvodnja IL-2), regresiju tumora, preživljavanje životinja koje imaju tumor, proizvodnju antitela, proliferaciju imunih ćelija, ekspresiju markera površine ćelija i citotoksičnost. U jednoj realizaciji, metoda povećava ćelijski imuni odgovor, naročito citotoksični T ćelijski odgovor.
[0189] Jedan aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu na ili iznad koncentracije zasićenja navedenog vezivnog molekula, efekat vezivanja OX40L za CD 134 je smanjen za ne više od 70% na humanim T-ćelijama koje eksprimiraju CD 134, mereno pomoću testa protočne citometrije na bazi fluorescencije, kao što je opisano u Primeru 2 (f). Poželjnije, efekat vezivanja OX40L za CD 134 je smanjen za ne više od oko 60%, ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje, ili poželjno uopšte nema smanjenja vezivanja.
[0190] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul, pri čemu pri koncentraciji vezivnog molekula od 70 nM, efekat vezivanja liganda OX40L na CD134 je smanjen za ne više od 70% na humanim T-ćelijama koje eksprimiraju CD 134, kao što je mereno pomoću testa protočne citometrije na bazi fluorescencije, kako je opisano u Primeru 2 (f). Poželjnije, efekat vezivanja OX40L na CD 134 je smanjen za ne više od oko 60%, ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje, ili poželjno uopšte nema smanjenja vezivanja.
[0191] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se takmiči za vezivanje humanog CD 134 sa antitelom koje sadrži (1) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 12 i (2) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13, kao što je prikazano unakrsnom kompeticijom između navedenog neobeleženog vezivnog molekula i navedenog fluorescentno obeleženog antitela na PHA-stimulisanim humanim CD134-eksprimirajućim T-limfocitima, mereno protočnom citometrijom (dalje opisano u Primeru 2 (e)). Vezivanje navedenog antitela, na ili iznad koncentracije zasićenja, smanjeno je za najmanje oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90% ili više, ili je ukinuto, kada se analizira pomoću unakrsne kompeticije prema pomenutom vezivnom molekulu.
[0192] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se takmiči za vezivanje humanog CD 134 sa antitelom koje sadrži (1) varijabilni region teškog lanca koji sadrži
4
aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4 i (2) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 5, kao što je prikazano unakrsnom kompeticijom između navedenog neobeleženog vezivnog molekula i fluorescentno označenog navedenog antitela na PHA-stimulisanim T-limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134, mereno protočnom citometrijom (dalje opisano u Primeu 2 (e)). Vezivanje navedenog antitela, na ili iznad koncentracije zasićenja, smanjuje se za najmanje oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90% ili više, ili je ukinuto, kada se analizira putem unakrsne konkurencije prema pomenutom vezivnom molekulu.
[0193] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu je efekat vezivanja OX40L na CD 134 na T-ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134, smanjen za ne više od oko 70%, ili oko 60%, ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje pomoću vezivnog molekula, i gde pomenuti vezivni molekul dalje ne sprečava imunostimulatorne i / ili proliferativne odgovore humanog OX40L na T-efektornim ćelijama koje eksprimiraju humani CD134.
[0194] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L) i gde pomenuti vezivni molekul dalje ne sprečava imunostimulatorne i / ili proliferativne odgovore humanog OX40L na T-efektornim ćelijama koje eksprimiraju humani CD134.
[0195] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu je efekat vezivanja OX40L za CD 134 na humanim T-ćelijama koje eksprimiraju CD 134 smanjen za ne više od oko 70%, ili oko 60%, ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje pomoću vezivnog molekula, i gde pomenuti vezivni molekul poboljšava imunostimulatorne i / ili proliferativne odgovore humanog OX40L na humanim T-efektornim ćelijama koje eksprimiraju CD 134.
[0196] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L) i gde pomenuti vezivni molekul poboljšava imunostimulatorne i / ili proliferativne odgovore humanog OX40L na humanim T-efektornim ćelijama koje eksprimiraju CD 134.
[0197] Još jedan aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu je efekat vezivanja OX40L za CD 134 na humanim T ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134 smanjen za ne više od oko 70% ili oko 60% ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje pomoću vezivnog molekula, a gde pomenuti vezivni molekul dalje ne sprečava odgovore supresorske funkcije humanog OX40L na humanim CD 134 eksprimirajućim T-regulatornim ćelijama.
[0198] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L) i gde pomenuti vezivni molekul dalje ne sprečava supresorske funkcije odgovora humanog OX40L na humanim CD 134 eksprimirajućim T-regulatornim ćelijama.
[0199] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu je efekat vezivanja OX40L za CD 134 na humanim CD 134 eksprimirajućim humanim T ćelijama smanjen za ne više od oko 70%, ili oko 60% ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje pomoću vezivnog molekula, a gde pomenuti vezivni molekul poboljšava supresorske funkcije odgovora humanog OX40L na humanim CD 134 eksprimirajućim T- regulatornim ćelijama.
[0200] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L) i gde pomenuti vezivni molekul poboljšava supresorske funkcije odgovora humanog OX40L na humanim CD134 eksprimirajućim T-regulatornim ćelijama.
[0201] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu je efekat vezivanja OX40L za CD 134 na T-ćelijama koje izražavaju humani CD 134, smanjen za ne više od oko 70%, ili oko 60%, ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje od strane vezivnog molekula, a pri čemu pomenuti vezivni molekul dalje ne sprečava proliferativne odgovore humanog OX40L na T regulatornim ćelijama koje izražavaju humani CD 134.
[0202] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne inhibira ili sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L) i gde pomenuti vezivni molekul dalje ne sprečava proliferativne odgovore humanog OX40L na humanim T regulatornim ćelijama koje izražavaju CD 134.
[0203] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu je efekat vezivanja OX40L za CD 134 na T-ćelijama koje izražavaju humani CD 134, smanjen za ne više od oko 70%, ili oko 60%, ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje pomoću vezivnog molekula, a pri čemu pomenuti vezivni molekul inhibira proliferativne odgovore humanog OX40L na humanim T regulatornim ćelijama koje izražavaju CD 134.
[0204] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne inhibira ili sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora
1
za ligand OX40 (OX40L) i gde pomenuti vezivni molekul inhibira proliferativne odgovore humanog OX40L na humanim T regulatornim ćelijama koje izražavaju CD 134.
[0205] Pogodna metoda za merenje istovremenog vezivanja OX40L i anti-CD134 antitela je opisana u nastavku. FITC fluorescentni signal (geosredina ili srednji fluorescentni intenzitet (MFI) vezivanja humanog OX40L na PHA-stimulisanim PBMC-ima koje izražavaju humani CD 134 u odsustvu anti-humanog CD134 antitela je podešen na 100%. PE fluorescentni signal (MFI) vezivanja anti-humanog CD 134 antitela na PHA-stimulisanim humanim CD 134 eksprimirajućim PBMC-ima u odsustvu humanog OX40L je podešen na 100%. Smanjenje ovog FITC fluorescentnog signala i PE fluorescentnog signala kada se istovremeno dodaju i humani OX40L i anti-humana CD 134 antitela na PHA-stimulisanim humanim CD 134 eksprimirajućim PBMC-ima poželjno ne prelazi oko 70%, ili oko 60%, ili oko 50%, ili oko 40%, ili oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje.
[0206] Pogodna metoda za merenje nedostatka u sprečavanju proliferativnih odgovora T efektora posredovanih sa ligandom OX40L je kao što sledi. Inkorporiranje triciranog timidina ili BrdU u humanim Tefektorima koji eksprimiraju CD 134, nakon tretmana sa humanim OX40L je podešeno na 100%. Promena (tj. smanjenje ili povećanje) ugradnje ovog triciranog timidina ili BrdU, kada su istovremeno dodati i humani OX40L i anti-humana CD134 antitela na aktiviranim (npr. PHA-stimulisanim ili anti-CD3 / anti-CD28 zrncima-stimulisanim) humanim Tefek-a koji izražavaju CD 134, poželjno ne prelazi oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje.
[0207] Pogodna metoda za merenje poboljšanja proliferativnih odgovora T efektora posredovanih sa ligandom OX40L je sledeća. Inkorporiranje triciranog timidina ili BrdU u Tefek-ima koji izražavaju humani CD 134, nakon tretmana sa humanim ligandom OX40L je podešeno na 100%. Povećanje ugradnje ovog triciranog timidina ili BrdU kada se istovremeno dodaju humani OX40L i anti-humano CD 134 antitelo na aktiviranim (npr. PHA-stimulisanim ili anti-CD3 / anti-CD28 zrncima-stimulisanim) Tefek-ima koji eksprimiraju humani CD134 je poželjno veće od oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70% ili više.
[0208] Pogodna metoda za merenje nedostatka u sprečavanju supresivne funkcije Treg-a posredovane sa ligandom OX40L je sledeća. Inkorporiranje triciranog timidina ili BrdU u Tefek-ima koji izražavaju humani CD 134, koji su zajedno kultivisani sa Treg-ima koji eksprimiraju humani CD 134 (npr., odnos Tefek/Treg = 1 : 1), nakon tretmana sa humanim OX40L je podešeno na 100%. Promena (tj. smanjenje ili povećanje) ugradnje ovog triciranog timidina ili BrdU kada se istovremeno dodaju oba humani OX40L i anti-humana CD134 antitela aktiviranim (npr. stimulisanim sa PHA ili stimulisanim sa anti-CD3 / anti-CD28
2
zrncima) Tefek-ima koji eksprimiraju humani CD 134, koji su zajedno kultivisani sa Treg-ima koji eksprimiraju humani CD 134 (npr., odnos Tefek/Treg = 1 : 1), poželjno ne prelazi oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje.
[0209] Pogodna metoda za merenje poboljšanja supresivne funkcije Treg-a posredovane sa OX40L je sledeća. Inkorporiranje triciranog timidina ili BrdU u Tefek-ima koji izražavaju humani CD 134 koji su zajedno kultivisani sa Treg-ima koji eksprimiraju humani CD 134 (npr., odnos Tefek/Treg = 1 : 1), nakon tretmana sa humanim OX40L je podešeno na 100%. Poboljšanje ugradnje ovog triciranog timidina ili BrdU kada se istovremeno dodaju oba humani OX40L i anti-humana CD134 antitela aktiviranim (npr. stimulisanim sa PHA ili stimulisanim sa anti-CD3 / anti-CD28 zrncima) Tefek-ima koji eksprimiraju humani CD 134, koji su zajedno kultivisani sa Treg-ima koji eksprimiraju humani CD 134 (npr., odnos Tefek/Treg = 1 : 1), je poželjno veće od oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70% , ili više.
[0210] Pogodna metoda za merenje nedostatka u sprečavanju proliferativnih odgovora Treg-a posredovanih sa ligandom OX40L je sledeća. Inkorporiranje triciranog timidina ili BrdU u Treg-a koji izražavaju humani CD 134, nakon tretmana sa humanim OX40L je podešeno na 100%. Promena (tj. smanjenje ili povećanje) ugradnje ovog triciranog timidina ili BrdU kada se istovremeno dodaju humani OX40L i anti-humano CD134 antitelo na aktiviranim (npr. PHA-stimulisanim ili anti-CD3 / anti-CD28 zrncima-stimulisanim) Treg-a koji eksprimiraju humani CD134 poželjno ne prelazi oko 30%, ili oko 20%, ili oko 10% ili manje.
[0211] Pogodna metoda za merenje inhibicije proliferativnih odgovora Treg-a posredovanih sa ligandom OX40L je sledeća. Inkorporiranje triciranog timidina ili BrdU u Treg-ima koji izražavaju humani CD 134, nakon tretmana sa humanim OX40L je podešeno na 100%. Redukcija ugradnje ovog triciranog timidina ili BrdU kada se istovremeno dodaju oba humani OX40L i anti-humano CD 134 antitelo na aktiviranim (npr., PHA-stimulisanim ili anti-CD3 / anti-CD28 zrncima-stimulisanim) Treg-ima koji eksprimiraju humani CD134 je poželjno veća od oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70% ili više.
[0212] Drugi aspekt pronalaska, obezbeđuje postupak za lečenje raka kod sisara, koji obuhvata primenu kod sisara terapeutski efikasne količini vezivnog molekula, kao što je ovde opisano.
[0213] U nekoj realizaciji prema pronalasku, vezivni molekul je antitelo klona 12H3 i / ili klona 20E5, ili fragment za vezivanje antigena od bilo kojeg antitela. U daljoj realizaciji, sisar je čovek.
[0214] U nekim realizacijama prema pronalasku, vezivni molekul je antitelo 12H3_VL1VH1 koje ima VH od SEK ID BR: 69 i VL od SEK ID BR: 67.
[0215] U nekim realizacijama prema pronalasku, vezivni molekul je antitelo 12H3_VL1VH2 koje ima VH od SEK ID BR: 70 i VL od SEK ID BR: 67.
[0216] U drugoj poželjnoj realizaciji prema pronalasku, obezbeđen je postupak za sprečavanje raka kod sisara, koji obuhvata primenu kod sisara terapeutski efikasne količine vezivnog molekula, kao što je ovde opisano.
[0217] Izraz "sprečavanje raka" ili "prevencija raka" se odnosi na odlaganje, inhibiranje ili sprečavanje pojave kancera kod sisara kod kojeg nije evidentiran početak onkogeneze ili tumorogeneze, ali je identifikovana predispozicija za rak, bilo da je određena genetskim skriningom, na primer, ili na drugi način. Izraz takođe obuhvata lečenje sisara sa premalignim uslovima za zaustavljanje progresije ili izazivanje regresije premalignih stanja prema malignitetu. Primeri premalignih stanja, uključuju hiperplaziju, displaziju i metaplaziju. U nekim realizacijama, vezivni molekul je anti-CD134 antitelo ili njegov fragment, kao što je ovde opisano. U daljoj realizaciji prema pronalasku, obezbeđen je vezivni molekul odabran od antitela klona 12H3 i / ili klona 20E5, ili fragmenta za vezivanje antigena od bilo kojih antitela. U daljem ostvarenju, sisar je čovek.
[0218] Izrazi "leči" ili "lečenje" se odnose i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere, pri čemu je cilj sprečavanje ili usporavanje (smanjenje) neželjenih fizioloških promena ili poremećaja, kao što su razvoj ili širenje tumora ili tumorskih ćelija. Korisni ili željeni klinički rezultati, uključuju ublažavanje simptoma, umanjenje stepena bolesti, stabilizovano stanje bolesti (tj. bez pogoršanja), odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, poboljšanje ili palijaciju stanja bolesti i remisiju (bilo delimičnu ili totalnu), bez obzira na to da li se može otkriti ili se ne može otkriti. "Lečenje" takođe može značiti produženje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem, ako osoba nije dobila lečenje. Oni kojima je potrebno lečenje, uključuju, one koji već imaju stanje ili poremećaj, kao i one koji su skloni da imaju stanje ili poremećaj ili one u kojima se sprečava stanje ili poremećaj. Bilo koje od antitela prema pronalasku, može biti korišćeno u postupcima pronalaska.
[0219] Druga realizacija prema pronalasku je postupak za lečenje raka, koji obuhvata primenu kod pacijenta kome je to potrebno anti-CD 134 antitela koje sadrži VH od SEK ID BR: 152 i VL od SEK ID BR: 100 tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za lečenje raka.
[0220] Druga realizacija prema pronalasku je postupak za lečenje raka, koji obuhvata primenu kod pacijenta kome je to potrebno anti-CD 134 antitela koje sadrži VH od SEK ID BR: 134 i VL od SEK ID BR: 98 tokom vremenskog perioda koji je dovoljan za lečenje raka.
[0221] Druga realizacija prema pronalasku je postupak za lečenje raka, koji obuhvata primenu kod pacijenta kome je to potrebno anti-CD 134 antitela koje sadrži
4
VH od SEK ID BR: 67 i VL od SEK ID BR: 69;
VH od SEK ID BR: 67 i VL od SEK ID BR: 70;
VH od SEK ID BR: 67 i VL od SEK ID BR: 71;
VH od SEK ID BR: 68 i VL od SEK ID BR: 69;
VH od SEK ID BR: 68 i VL od SEK ID BR: 70; ili
VH od SEK ID BR: 68 i VL od SEK ID BR: 71;
za vreme koje je dovoljno za lečenje raka.
[0222] Različiti karcinomi, uključujući maligne ili benigne i / ili primarne ili sekundarne, mogu biti tretirani ili sprečeni metodom prema pronalasku. Primeri takvih karcinoma su poznati stručnjacima u struci i navedeni su u standardnim udžbenicima kao što je Merkov priručnik za dijagnozu i terapiju (objavljen od strane Merck-a). U nekim realizacijama, kancer je rak koji obično odgovara na imunoterapiju, ali i rak koji do sada nije bio povezan sa imunoterapijom. Primeri raka su melanom (npr., metastatski maligni melanom), bubrežni karcinom (na primer, čisti ćelijski karcinom), rak prostate (npr. hormonski refraktorni adenokarcinom prostate), adenokarcinom pankreasa, rak dojke, rak debelog creva, rak pluća (npr. nesitnoćelijski karcinom pluća), rak jednjaka, karcinomom skvamoznih ćelija glave i vrata, rak jetre, rak jajnika, cervikalni karcinom, rak štitne žlezde, glioblastom, gliom, leukemija, limfom i drugi neoplastični maligniteti. Rak može biti refraktorni ili recidivni maligni karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemija, karcinom skvamoznih ćelija, rak pluća (uključujući mikrocelularni karcinom pluća, nemikrocelularni karcinom pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća), rak peritoneuma, hepatocelularni karcinom, gastrični ili stomačni karcinom (uključujući, gastrointestinalni kancer), rak pankreasa, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, rak mokraćne bešike, hepatom, rak dojke, rak debelog creva, kolorektalni kancer, endometrijalni ili karcinom materice, rak pljuvačne žlezde, bubrežni ili renalni karcinom, rak jetre, rak prostate, karcinom vulve, karcinom tiroidne žlezde, hepatični karcinom i razne vrste karcinoma glave i vrata, kao i limfom B-ćelija (uključujući niskog stepena/folikularni ne-Hočkinov limfom (NHL), mali limfocitni (SL) NHL; srednjeg stepena / folikularni NHL; srednjeg stepena difuzni NHL; imunoblastni NHL visokog stepena; limfoblastni NHL visokog stepena; neprodirući sitnoćelijski NHL visokog stepena; krupna bolest NHL; limfom mantle ćelija; limfom povezan sa AIDS-om; i Waldenstromova maakroglobulinemija); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); Leukemija vlaknastih ćelija; hronična mjieloblastna leukemija; multipli mijelom i posttransplantacioni limfoproliferativni poremećaj (PTLD).
[0223] U drugoj realizaciji prema pronalasku, molekuli za vezivanje mogu biti primenjivani samostalno kao monoterapija ili se primenjuju u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava ili terapija. Stoga, u drugoj realizaciji prema pronalasku, obezbeđen je postupak za lečenje ili sprečavanje raka kombinovanom terapijom, čiji postupak sadrži primenu vezivnog molekula kako je ovde obelodanjeno, u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapija ili terapijskih sredstava. Izraz "dodatna terapija" se odnosi na terapiju koja ne angažuje vezivni molekul koji je obezbeđen obelodanjivanjem, kao terapeutski agens. Izraz "dodatni terapeutski agens" se odnosi na bilo koji terapeutski agens drugačiji od vezivnog molekula koji je obezbeđen pronalaskom. U nekim realizacijama, vezivni molekul je anti-humano CD 134 antitelo klona 12H3 i / ili klona 20E5, fragment antitela koji se vezuje za antigen od bilo kojeg antitela ili humanizovano 12H3 ili humanizovano 20E5 antitelo. U jednom posebnom aspektu, sadašnje obelodanjivanje obezbeđuje kombinovanu terapiju za lečenje raka kod sisara, koja obuhvata primenu kod sisara terapeutski efikasne količine vezivnog molekula koji je obezbeđen obelodanjivanjem u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa. U daljem ostvarenju, sisar je čovek.
[0224] U nekim realizacijama, rak je rak prostate, rak debelog creva, rak pluća, hematološki malignitet, melanom ili rak mokraćne bešike.
[0225] U nekim realizacijama, kancer je rak prostate.
[0226] U nekim realizacijama, kancer je rak debelog creva.
[0227] U nekim realizacijama, kancer je rak pluća.
[0228] U nekim realizacijama, kancer je hematološki malignitet.
[0229] U nekoj realizaciji, kancer je melanom.
[0230] U nekim realizacijama, kancer je rak mokraćne bešike.
[0231] U nekim realizacijama, karcinom pluća je sitnoćelijski karcinom pluća, nesitnoćelijski karcinoma pluća, adenokarcinom pluća ili skvamozni karcinom pluća.
[0232] Široka raznovrsnost terapijskih agenasa za rak se može koristiti u kombinaciji sa molekulom za vezivanje. Prosečan stručnjak će prepoznati prisustvo i razvoj drugih karcinomskih terapija koje se mogu koristiti u kombinaciji sa metodama i vezivnim molekulima sadašnjeg objelodanjivanja i neće biti ograničena na one oblike terapije koje su ovde navedene. Primeri kategorija dodatnih terapijskih sredstava koja se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji za lečenje raka uključuju: (1) hemioterapeutska sredstva, (2) imunoterapeutska sredstva i (3) hormonska terapeutska sredstva.
[0233] Izraz "hemioterapeutski agens" se odnosi na hemijsku ili biološku supstancu koja može izazvati smrt ćelija raka ili ometati podelu, popravku, rast i / ili funkciju kancerogenih ćelija. Primeri hemioterapeutskih agenasa obuhvataju one koji su opisani u WO 2006/088639, WO 2006/129163 i US 20060153808.
[0234] Izraz "imunoterapetski agensi" se odnosi na hemijsku ili biološku supstancu koja može poboljšati imunski odgovor kod sisara. Primeri imunoterapeutskih agenasa uključuju: bacillus Calmette-Guerin (BCG); citokine kao što su interferoni; vakcine kao što su MyVax personalizovana imunoterapija, Onyvax-P, Oncophage, GRNVAC1, Favld, Provenge, GVAX, Lovaxin C, BiovaxID, GMXX i NeuVax; i antitela kao što su alemtuzumab (CAMPATH<®>), bevacizumab (AVASTIN<®>), cetuksimab (ERBITUX<®>), gemtuzunab ozogamicin (MYLOTARG<®>), ibritumomab tiuksetan (ZEVALIN<®>), panitumumab (VECTIBIX<®>), rituksimab (RITUXAN<®>, MABTHERA<®>), trastuzumab (HERCEPTIN<®>),
tositumomab (BEXXAR<®>), tremelimumab, CAT-3888 i antitela agonista za CD40 receptor koja su opisana u WO2003/040170.
[0235] Izraz "hormonski terapeutski agens" se odnosi na hemijsku ili biološku supstancu koja inhibira ili uklanja proizvodnju hormona ili inhibira ili sprečava dejstvo hormona na rast i / ili preživljavanje kancerogenih ćelija. Primeri takvih agenasa pogodnih za metode, ovde uključuju one koji su opisani u US20070117809. Primeri određenih hormonskih terapijskih agenasa, uključuju tamoksifen (NOLVADEX<®>), toremifen (Fareston), fulvestrant (FASLODEX<®>), anastrozol (ARIMIDEX<®>), eksemestan (AROMASIN<®>), letrozol (FEMARA<®>), megestrol acetat (MEGACE<®>), goserelin (ZOLADEX<®>) i leuprolid (LUPRON<®>). Vezivni molekuli ovog obelodanjivanja, mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa hormonskim terapijama koje ne koriste lekove kao što su (1) hirurške metode koje uklanjaju sve ili deo organa ili žlezdi koji učestvuju u proizvodnji hormona, kao što su jajnici, testisi, nadbubrežna žlezda i hipofiza, i (2) terapije zračenjem, u kojoj su organi ili žlezde pacijenta izložene zračenju u količini koja je dovoljna da spreči ili eliminiše proizvodnju ciljnog hormona.
[0236] U drugoj realizaciji prema pronalasku, obezbeden je postupak za lečenje ili prevenciju raka kombinovanom terapijom, čija metoda obuhvata primenjivanje vezivnog molekula, kao što je ovde obelodanjeno i operacije za uklanjanje tumora. Vezivni molekul se može primeniti kod sisara pre, tokom ili nakon pomenute operacije.
[0237] Kombinovana terapija za lečenje raka, takođe obuhvata kombinaciju vezivnog molekula koji je obezbeđen pronalaskom sa radioterapijom, kao što je jonizujuća (elektromagnetna) radioterapija (npr. rendgenski ili gama zraci) i terapija zračenjem snopom čestica (npr. zračenje visoko linearne energije). Izvor zračenja može biti spoljašnji ili unutrašnji za sisara. Vezivni molekul se može primenjivati kod sisara pre, tokom ili nakon terapije zračenjem.
[0238] Vezivni molekuli i preparati koji su obezbeđeni sadašnjim opisom, mogu biti primenjeni putem bilo kog pogodnog enteralnog puta ili parenteralnog puta primene. Izraz "enteralni put" primene se odnosi se na primenu preko bilo kojeg dela gastrointestinalnog trakta. Primeri enteralnih puteva, uključuju oralni, mukozni, bukalni i rektalni put, ili intragastrični put. "Parenteralni način" primene odnosi se na način primene drugačiji od enteralnog načina. Mogu se razlikovati odgovarajući način i postupak primene u zavisnosti od brojnih faktora, kao što su specifično antitelo koje se koristi, željene brzine apsorpcije, specifične formulacije ili korišćenog doznog oblika, vrste ili težine lečenog poremećaja, specifičnog mesta delovanja, i pacijentovog stanja, i stručnjak u struci ih lako može izabrati.
[0239] Izraz "terapeutski efikasna količina" vezivnog molekula se odnosi na količinu koja je efikasna za planiranu terapijsku svrhu. Na primer, u kontekstu poboljšanja imunološkog odgovora, "terapeutski efikasna količina" je bilo koja kolicina koja je efikasna u stimulisanju, izazivanju, povećanju, poboljšanju ili augmentovanju bilo kojeg odgovora imunskog sistema sisara. U kontekstu lečenja karcinoma, "terapeutski efikasna količina" je bilo koja količina koja je dovoljna da izazove poželjan ili koristan efekat kod sisara koji se leči, kao što je inhibicija daljeg rasta ili širenja kancerogenih ćelija, smrt kancerogenih ćelija, inhibicija ponovnog pojavljivanja raka, smanjenja bolova povezanih sa rakom, ili poboljšanje preživljavanja kod sisara. U postupku sprečavanja raka, "terapeutski efikasna količina" je bilo koja kolicina koja je efikasna u odlaganju, inhibiranju ili sprečavanju početka raka kod sisara kojem se primenjuje vezivni molekul.
[0240] Terapeutski efikasna količina vezivnog molekula je obično u opsegu od oko 0,001 do oko 500 mg/kg, a obično oko 0,05 do oko 100 mg/kg telesne težine sisara. Na primer, količina može biti oko 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 50 mg/kg ili 100 mg/kg telesne težine sisara. U nekim realizacijama, terapeutski efikasna količina antitela protiv humanog CD 134 je u opsegu od oko 0,1-30 mg/kg telesne težine sisara. Precizni nivo doze za primenu, može biti lako određen od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike i zavisiće od više faktora, kao što su vrsta i težina poremećaja koji treba lečiti, upotrebljeni poseban vezivni molekul, način primene, vreme primene, trajanje lečenja, određena dodatna terapija koja je angažovana, starost, pol, težina, stanje, opšte zdravlje i prethodna medicinska istorija pacijenta koji se leči, kao i slični faktori koji su dobro poznati u ovoj oblasti.
[0241] Vezivni molekul ili preparat je obično primenjen u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti, na primer, nedeljni, mesečni, na svaka tri meseca ili godišnje.
Primeran režim lečenja podrazumeva primenu jednom nedeljno, jednom na svake dve nedelje, jednom na svake tri nedelje, jednom na svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka 3 meseca ili jednom u tri do šest meseci. Tipični dozni režimi antitela protiv humanog CD 134, uključuju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine putem intravenozne primene, korišćenjem jednog od sledećih rasporeda doziranja (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg / kg telesne mase, nakon čega sledi 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.
[0242] Pronalazak obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L). U nekim realizacijama, na ili iznad koncentracije zasićenja pomenutog molekula, uticaj na vezivanje OX40L za CD 134 je smanjen za ne više od 50% na humanim T ćelijama koje izražavaju CD 134. U nekim realizacijama, pri koncentraciji vezivnog molekula od 70 nM, efekat vezivanja OX40L za CD 134 je smanjen za ne više od 70% na T-ćelijama koje izražavaju humani CD 134. Pronalazak dalje obezbeđuje vezivni molekul koji sadrži:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 12 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0243] U nekim realizacijama vezivni molekul sadrži
(a) CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 14 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije;
(b) CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 15 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(c) CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 16 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
U poželjnoj realizaciji vezivni molekul sadrži
(a) CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 17 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije;
(b) CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(c) CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 19 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0244] Pronalazak dalje obezbeđuje molekul za vezivanje koji se takmiči za vezivanje humanog CD 134 sa antitelom koji sadrži:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 12; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 13.
[0245] Takođe je obezbeđen vezivni molekul koji sadrži:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 5 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiseline supstitucije.
U jednoj realizaciji, vezivni molekul prema pronalasku sadrži
(a) CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 6 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije;
(b) CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 7 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(c) CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 8 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0246] U jednoj realizaciji, vezivni molekul prema pronalasku sadrži
(a) CDR1 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 9 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije;
(b) CDR2 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 10 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(c) CDR3 lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 11 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
[0247] U jednoj realizaciji, vezivni molekul se takmiči za vezivanje humanog CD 134 sa antitelom obuhvatajući:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 5.
[0248] U jednoj realizaciji, vezivni molekul se specifično vezuje za epitop u aminokiselinskoj sekvenci ekstracelularnog domena humanog CD 134. U nekim realizacijama, vezivni molekul se vezuje za epitop ekstracelularnog domena humanog CD 134 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od:
(a) SEK ID BR: 34;
(b) SEK ID BR: 35;
(c) SEK ID BR: 36;
(d) SEK ID BR: 38; i / ili
(e) SEK ID BR: 92.
[0249] U nekim realizacijama, vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 receptora na ligand OX40 (OX40L) na humanim imunokompetentnim ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134 (npr. aktivirani Tefek i / ili aktivirani Treg) koje su uključene u inhibiciju rasta humanih tumorskih ćelija.
U nekim realizacijama, vezivni molekul poboljšava vezivni i / ili imunostimulatorni odgovor humanog OX40 liganda (OX40L) na humanim imunokompetentnim ćelijama koje izražavaju humani CD 134 (npr. aktivirani Tefek i / ili aktivirani Treg) koje su uključene u inhibiciju rasta humanih tumorskih ćelija.
[0250] U nekim realizacijama, vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 za ligand OX40 (OX40L) i ne ometa imunostimulatorne i / ili proliferativne odgovore humanog OX40L na humanim CD 134 eksprimirajućim T-efektornim ćelijama.
[0251] Pronalazak takođe obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 na ligand OX40 (OX40L) i
1
poboljšava imunostimulatorne i / ili proliferativne odgovore humanog OX40L na T-efektornim ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134.
[0252] Pronalazak dalje obezbeđuje vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 za ligand OX40 (OX40L) i ne ometa odgovore supresorske funkcije humanog OX40L na humanim CD 134 eksprimirajućim T regulatornim ćelijama.
[0253] Takođe je obezbeđen vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 za ligand OX40 (OX40L) i poboljšava odgovore supresorske funkcije humanog OX40L-a na T-regulatornim ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134.
[0254] Takođe je obezbeđen vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 za ligand OX40 (OX40L), ali ne ometa proliferativne odgovore humanog OX40L-a na T-regulatornim ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134.
[0255] Još dalje je obezbeđen vezivni molekul koji se vezuje za humani CD 134, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 za ligand OX40 (OX40L), ali inhibira proliferativne odgovore humanog liganda OX40L na T-regulatornim ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134.
[0256] Vezivni molekul prema pronalasku je poželjno vezivni molekul, gde je pri ili iznad koncentracije zasićenja pomenutog molekula, efekat vezivanja OX40L za CD 134 smanjen za ne više od 50% na humanim CD 134 eksprimirajućim T-regulatornim ćelijama.
[0257] Vezivni molekul prema pronalasku je poželjno vezivni molekul, gde je pri koncentraciji vezivnog molekula od 70 nM, efekat vezivanja OX40L za CD 134 smanjen za ne više od 70% na T-ćelijama koje eksprimiraju humani CD 134.
[0258] U jednoj realizaciji, vezivni molekul prema pronalasku je humanizovano antitelo. U drugoj realizaciji molekul vezivanja prema pronalasku je himerno, humanizovano ili DeImmunized ™ antitelo, ili njegov fragment.
[0259] U još jednom izvođenju, vezivni molekul prema pronalasku je antitelo, mimik antitela (na primer, na bazi ne-antitelske skele), RNK aptamer, mali molekul ili CovX-telo.
[0260] U nekim realizacijama, vezivni molekul prema pronalasku je IgG, IgA, IgD, IgE ili IgM antitelo, kao što su IgGl, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitela.
[0261] U nekim realizacijama, vezivni molekul je IgG4 antitelo.
[0262] U nekim realizacijama, antitelo je fragment antitela koji se vezuje za antigen, na primer izabran iz grupe koja se sastoji od: Fv fragmenata (npr. jednolančani Fv i disulfidno-vezani Fv);
2
fragmenti poput Fab (npr. Fab fragmenti, Fab' fragmenti i F(ab')2 fragmenti); i domenska antitela. U nekim izvođenjima, antigen vezujući fragment ili vezujući deo je scFv. U nekim realizacijama, vezujući deo je rekombinantno antitelo. U nekim realizacijama, vezujući deo je monoklonsko antitelo.
[0263] Pronalazak takođe obezbeđuje, molekul nukleinske kiseline koji kodira vezivni molekul prema bilo kom od prethodnih zahteva, pod uslovom da je vezujući deo polipeptid.
[0264] Takođe je obezbeđen vektor koji sadrži najmanje jedan molekul nukleinske kiseline prema pronalasku.
[0265] Dalje obezbeđena je ćelija domaćina koji sadrži vektor ili nukleinsku kiselinu prema pronalasku. Ćelija domaćina je poželjno izvedena od sisara ili insekta.
[0266] Pronalazak dalje daje postupak za pripremu vezivnog molekula prema pronalasku, koji obuhvata korake (i) pripreme molekula za vezivanje za CD134 i (ii) skrining pomenutih molekula kako bi se identifikovali i dobili vezivni molekuli koji ne sprečavaju vezivanje OX40L za CD 134. Korak (ii) poželjno sadrži identifikaciju vezujućih molekula koji vezuju CD 134 nakon izlaganja CD 134 do koncentracije zasićenja OX40L. Kada je vezivni molekul monoklonsko antitelo, postupak za pripremu vezivnog molekula obuhvata imunizaciju životinje sa humanim CD 134, pripremu hibridoma koji izlučuju anti-CD 134 antitela i skrining hibridoma koji proizvodi anti-CD 134 antitela. Pronalazak dalje obezbeđuje vezivni molekul prema pronalasku ili proizveden prema pronalasku, za upotrebu u sprečavanju ili lečenju raka kod subjekta kome je potreban. U nekim realizacijama, rak je rak pluća, rak prostate, rak dojke, rak glave i vrata, rak jednjaka, rak želuca, rak debelog creva, kolorektalni karcinom, rak mokraćne bešike, rak grlića materice, rak materice, rak jajnika, rak jetre, hematološki rak, melanom ili bilo koja druga bolest ili poremećaj karakterisan nekontrolisanim rastom ćelija.
[0267] Dalje je obezbeđen postupak poboljšanja imunskog odgovora kod humanog subjekta, koji obuhvata primenu kod humanog subjekta terapeutski efikasne količine vezivnog molekula prema pronalasku ili proizvedenog prema pronalasku i opciono, farmaceutski prihvatljivog nosača. Poboljšani imunski odgovor, može obuhvatiti povećanje imunostimulatorne / efektorne funkcije T-efektornih ćelija, opciono kao rezultat proliferacije ovih ćelija i / ili nishodne regulacije imunosupresorske funkcije T-regulatornih ćelija, opciono bez ekspanzije broja ovih ćelija.
[0268] Takođe je obezbeđen, postupak lečenja raka kod humanog subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata primenu kod humanog subjekta terapeutski efikasne količine vezivnog molekula prema pronalasku ili proizvedenog prema pronalasku. U nekim realizacijama, rak je rak pluća, rak prostate, rak dojke, rak glave i vrata, rak jednjaka, rak želuca, rak debelog creva, kolorektalni karcinom, rak mokraćne bešike, rak grlića materice, rak materice, rak jajnika, rak jetre, hematološki rak, melanom ili bilo koja druga bolest ili poremećaj karakterisan nekontrolisanim rastom ćelija.
[0269] Takođe je obezbeđen, postupak za smanjenje veličine tumora ili inhibiciju rasta ćelija raka kod subjekta ili smanjenje ili inhibiciju razvoja metastatskog karcinoma kod subjekta koji boluje od raka, koji obuhvata primenu vezivnog molekula kod humanog subjekta prema pronalasku ili proizvedenog prema pronalasku.
[0270] Pronalazak dalje obezbeđuje, upotrebu vezivnog molekula prema pronalasku ili proizvedenog prema pronalasku u pripremi leka za lečenje ili prevenciju raka.
[0271] Takođe je obezbeđen, farmaceutski preparat koji sadrži ostatak za vezivanje prema pronalasku ili proizveden prema pronalasku, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača ili ekscipijenasa. Preparat je poželjno, pogodan za parenteralnu primenu u ljudskom telu, na primer intravenoznom, intramuskularnom, intradermalnom, intraperitonealnom, intratumorskom, intravezikalnom, intra-arterijskom, intratekalnom, intrakapsularnom, intraorbitalnom, intrakardijalnom, transtrahealnom, intra-artikularnom, subkapsularnom, subarahnoidnom, intraspinalnom, epiduralnom, intrasternalnom ili subkutanom primenom.
Dalje realizacije prema pronalasku
[0272] Niže postavljene su određene dalje, numerisane realizacije pronalaska u skladu sa obelodanjivanjima na drugim mestima ovde. Karakteristike realizacija prema pronalasku iznad opisanih, kao što se odnose na pronalazak koji je ovde obelodanjen, takođe se odnose na svako od ovih daljih numerisanih realizacija.
1. Izolovano antitelo koje vezuje humani CD 134, koje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) od SEK ID BR: 100 i varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata regione za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR)i HCDR1, HCDR2 i HCDR3, opcionalno sa 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VL od SEK ID BR: 100.
2. Antitelo prema realizaciji 1, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 152, opcionalno sa 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 152.
3. Antitelo prema realizacijama 1 ili 2, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 99, opcionalno sa 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 99.
4
4. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1-3, pri čemu HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 16, 144 ili 145.
5. Antitelo prema realizaciji 4, pri čemu HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 15, 141, 142 ili 143.
6. Antitelo prema realizaciji 5, pri čemu HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 14.
7. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1-6, pri čemu:
a. VL sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 67 ili 68; i
b. VH sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 69, 70, 71, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 146, 147 ili 148, koje opciono imaju supstitucije na linearnim položajima aminokiselinskih ostataka 11, 55 ili 99; ili
c. VL i VH sadrže aminokiselinske sekvence od
i. SEK ID BR-a: 67 i 69, respektivno;
ii. SEK ID BR-a: 67 i 70, respektivno;
iii. SEK ID BR-a: 67 i 71, respektivno;
iv. SEK ID BR-a: 68 i 69, respektivno;
v. SEK ID BR-a: 68 i 70, respektivno; ili
vi. SEK ID BR-a: 68 i 71, respektivno.
8. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1-7, pri čemu su supstitucije na linearnim položajima aminokiselinskih ostataka V11L, N55Q, N55A, N55E, M99L ili M99I.
9. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1-8, pri čemu se vezivni molekul vezuje za epitop ekstracelularnog domena humanog CD 134 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34, SEK ID BR: 35; SEK ID BR: 36, SEK ID BR: 38 ili SEK ID BR: 92.
10. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1-9, gde je antitelo humanizovano ili deimunizovano.
11. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1-10, gde je antitelo agonist CD 134.
12. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1- 11, gde je antitelo IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa.
13. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1- 12, pri čemu antitelo sadrži supstituciju u Fc regionu.
14. Antitelo prema realizaciji 13, pri čemu supstitucija moduliše vezivanje antitela za Fc gama receptor (FcγR) ili za neonatalni Fc receptor (FcRn).
15. Antitelo prema realizaciji 14, pri čemu supstitucija sadrži supstituciju S267E/L328F, supstituciju E233D/G237D/H268D/P271G/A330R, supstituciju V234A/G237A/P238S/ H268A/V309L/A330S/P331S ili supstituciju M252Y/S254T/T256E, gde je numerisanje ostataka prema EU indeksu.
16. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira VH ili VL bilo koje od realizacija 1-3 ili 7.
17. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz realizacije 16.
18. Ćelija domaćina koja sadrži vektor izvođenja 17.
19. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1- 15, 23-37, 41-45 ili 49, za upotrebu u lečenju subjekta kome je potrebno poboljšanje imunskog odgovora.
20. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 1- 15, 23-37, 41-45 ili 49, za upotrebu u lečenju raka.
21. Antitelo prema realizaciji 20 za primenu u lečenju raka, pri čemu je rak rak prostate, rak debelog creva, rak pluća, hematološki malignitet, melanom ili rak mokraćne bešike.
22. Farmaceutski preparat koji sadrži antitelo od bilo kojih od realizacija 1- 15, 23-37 ili 41-45 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
23. Izolovano antitelo koje vezuje humani CD 134, koje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) od SEK ID BR: 98 i varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata regione za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR)e HCDR1, HCDR2 i HCDR3, opciono ima 1, 2 ili 3 aminokiseline supstitucije u VL od SEK ID BR: 98.
24. Antitelo prema realizaciji 23, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 134, opciono sa 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 134. 25. Antitelo prema realizacijama 23 ili 24, pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 97, opciono sa 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 97.
26. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-25, pri čemu HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 8, 139 ili 140.
27. Antitelo prema realizaciji 26, pri čemu HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 7, 135, 136, 137 ili 138.
28. Antitelo prema realizaciji 27, pri čemu HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 6.
29. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-29, pri čemu:
a. VL sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 62 ili 63; i b. VH sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 64, 65, 66, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 117, 118, 149, 150 ili 151, opciono imajući supstitucije na linearnim položajima aminokiselinskih ostataka 11, 56 ili 106; ili
c. VL i VH sadrže aminokiselinske sekvence od
i. SEK ID BR-a: 62 i 64, respektivno;
ii. SEK ID BR-a: 62 i 65, respektivno;
iii. SEK ID BR-a: 62 i 66, respektivno;
iv. SEK ID BR-a: 63 i 64, respektivno;
v. SEK ID BR-a: 63 i 65, respektivno; ili
vi. SEK ID BR-a: 63 i 66, respektivno.
30. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-29, pri čemu su supstitucije na linearnim položajima aminokiselinskih ostataka V11L, D56G, D56A, D56S, D56E, M106L ili M106I.
31. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-30, pri čemu se antitelo vezuje za epitop ekstracelularnog domena humanog CD 134 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34, SEK ID BR: 35; SEK ID BR: 36, SEK ID BR: 38 ili SEK ID BR: 92.
32. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-31, pri čemu je antitelo humanizovano ili deimunizovano.
33. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-32, gde je antitelo agonist CD 134.
34. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-33, pri čemu je antitelo IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa.
35. Antitelo prema bilo kojoj od realizacija 23-34, pri čemu antitelo sadrži supstituciju Fc regiona.
36. Antitelo prema realizaciji 35, pri čemu zamena moduliše vezivanje antitela na Fc gama receptor (FcγR) ili za neonatalni Fc receptor (FcRn).
37. Antitelo prema realizaciji 36, pri čemu supstitucija sadrži supstituciju S267E/L328F, supstituciju E233D/G237D/H268D/P271G/A330R, supstituciju V234A/G237A/P238S/ H268A/V309L/A330S/P331S ili supstituciju M252Y/S254T/T256E, gde je numerisanje ostataka prema EU indeksu.
38. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira VH ili VL bilo kojih od realizacija 23-37.
39. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema realizaciji 38.
40. Ćelija domaćina koja sadrži vektor u skladu sa izvođenjem 39.
41. Izolovano agonističko antitelo koje vezuje humani CD 134, koje obuhvata varijabilni region lakog lanca (VL) i varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata regione za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR)e HCDR1, HCDR2 i HCDR3 i regione za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR)e LCDR1, LCDR2 i LCDR3, pri čemu
a. HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 14;
b. HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 15, 141, 142 ili 143; c. HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 16, 144 ili 145;
d. LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 17;
e. LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 18; i
f. LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 19;
pod uslovom da antitelo ne sadrži VH koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 14, 15 i 16; i VL koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 17, 18 i 19.
42. Izolovano antitelo prema realizaciji 41, pri čemu antitelo sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 sekvence od
a. SEK ID BR-a: 14, 15, 144, respektivno,
b. SEK ID BR-a: 14, 141, 16, respektivno;
c. SEK ID BR-a: 14, 142, 16, respektivno;
d. SEK ID BR-a: 14, 141, 144, respektivno; ili
e. SEK ID BR-a: 14, 142, 144, respektivno.
43. Izolovano antitelo u skladu sa realizacijama 41 ili 42, pri čemu je antitelo humanizovano, deimunizovano ili humano.
44. Izolovano antitelo prema bilo kojoj od realizacija 41-43, pri čemu je antitelo IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipa.
45. Izolovano antitelo prema bilo kojem od izvođenja 41-44, pri čemu antitelo sadrži supstituciju u Fc regionu koja moduliše vezivanje antitela za Fc gama receptor (FcγR) ili za neonatalni Fc receptor (FcRn), pri čemu supstitucija sadrži S267E/L328F supstituciju, supstituciju E233D/G237D/H268D/P271G/A330R, supstituciju V234A/G237A/P238S/ H268A/V309L/A330S/P331S, ili supstituciju M252Y/S254T/T256E, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU Indeksu.
46. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira VH ili VL realizacije 41.
47. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema realizaciji 46.
48. Ćelija domaćina koja sadrži vektor prema realizaciji 47.
49. Izolovano antitelo agoniste koje vezuje humani CD 134, koje obuhvata varijabilni region lakog lanca (VL) i varijabilni region teškog lanca (VH) koji obuhvata regione za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR)e HCDR1, HCDR2 i HCDR3 i regione za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR)e LCDR1, LCDR2 i LCDR3, pri čemu
a. HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 6;
b. HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 7, 135, 136, 137 ili 138; c. HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 8, 139 ili 140;
d. LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 9;
e. LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 10; i
f. LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 11;
g. pod uslovom da antitelo ne sadrži VH koji sadrži HCDR1, HCDR2 i HCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 6, 7 i 8; i VL koji sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 aminokiselinskih sekvenci od SEK ID BR-a: 9, 10 i 11.
[0273] Pronalazak dalje obezbeđuje realizacije
Z1. Vezivni molekul koji sadrži
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27, ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 27, ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
Z2. Vezivni molekul koji sadrži
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 26, ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije; i / ili
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu na slici 26 ili varijantu te sekvence koja ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije.
Z3. Vezivni molekul prema realizaciji Z1 ili realizaciji Z2, koji se vezuje za humani CD 134.
Z4. Vezivni molekul prema bilo kom od izvođenja Z1-3, pri čemu vezivni molekul ne sprečava vezivanje humanog CD 134 (OX40) receptora za ligand OX40 (OX40L).
Z5. Vezivni molekul prema bilo kojem od izvođenja Z1-4, pri čemu je pri ili iznad koncentracije u kojoj je vezivanje za navedeni molekul CD 134 zasićeno, efekat vezivanja OX40L na CD 134 je smanjen za ne više od 50% na T-ćelijama koje eksprimiraju humani CD134.
Z6. Vezivni molekul prema bilo kom od izvođenja Z1-5, pri čemu je pri koncentraciji vezivnog molekula od 70 nM, efekat vezivanja OX40L na CD134 smanjen za ne više od 70% na T-ćelijama koje eksprimiraju humani CD134.
Z7. Vezivni molekul prema bilo kom od izvođenja Z1-6, pri čemu se vezivni molekul vezuje za epitop ekstracelularnog domena humanog CD 134 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 34, SEK ID BR: 35; SEK ID BR: 36, SEK ID BR: 38 i / ili SEK ID BR: 92. Z8. Vezivni molekul prema bilo kojoj od realizacija Z1-7, koji je Fab-fragment, pojedinačni lanac Fv (scFv) fragment ili antitelo.
Z9. Antitelo prema realizaciji Z8, koje je humanizovano ili deimunizovano IgG, IgA, IgD, IgE ili IgM antitelo, kao što su IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitelo.
Z10. Molekul nukleinske kiseline koji kodira vezivni molekul ili antitelo prema bilo kom od izvođenja Z1-9.
Z11. Nosač za isporuku gena ili vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema realizaciji Z10.
Z12. Izolovana ili rekombinantna ćelija ili ćelija in vitro ćelijske kulture koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor prema realizaciji Z10 ili Z11.
Z13. Postupak za proizvodnju vezivnog molekula, karakterisan time što je proizveden vezivni molekul prema bilo kom od izvođenja Z1-8 ili antitelo prema izvođenju Z9.
Z14. Vezivni molekul ili antitelo prema bilo kom od izvođenja Z1-9, za upotrebu u lečenju pojedinca kome je potrebno poboljšanje imunskog odgovora.
Z15. Vezivni molekul ili antitelo prema bilo kom od izvođenja Z1-9, za upotrebu u sprečavanju ili lečenju raka kod pojedinca kome je to potrebno.
Z16. Farmaceutski preparat koji sadrži vezivni molekul ili antitelo prema bilo kom od izvođenja Z1-9, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0274] Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima, koji se na bilo koji način ne mogu tumačiti kao nametanje ograničenja njegovog obima. Naprotiv, mora se jasno shvatiti da se pribežište može primeniti na različite druge realizacije, modifikacije i ekvivalente koji, nakon čitanja opisa u ovom tekstu, mogu sami sugerisati onima koji su stručni u struci, bez odstupanja od duha sadašnjeg pronalaska i / ili obima priloženih zahteva.
Primeri
Primer 1. Generisanje mišjih anti-humanih CD134 (= OX40) monoklonskih antitela
(a). Generisanje Sf9 ćelija insekata koji izražavaju površinski CD134
[0275] Kodirajuća cDNK za humani CD 134 protein (GenBank ref CAB96543.1; videti SEK ID BR: 1) je optimizovana za ekspresiju insektnih ćelija Sf9 (Spodotera frugiperda) i sintetisana od strane GENEART, Regensburg, Nemačka (videti SEK ID BR: 2; kat.br.0904551 (BC interni kod V076)). Ova cDNK je subklonirana u bakulovirusni transferni plazmid pVL1393 (BD transfekcioni komplet kat. br.560129; BD Biosciences). Nakon toga, ćelije Sf9 insekata (ATCC) su ko-transfektovane sa transfer plazmidom pVL1393 koji sadrži cDNK koja kodira humani CD 134 zajedno sa BaculoGold Baculovirus DNA (BD transfekcioni kit), a zatim su inkubirane na 27 ° C tokom 4-5 dana. Nakon ovog koraka ko-transfekcije, supernatant je sakupljen i skladišten na 4 ° C i korišćen za infekciju više Sf9 insektnih ćelija za amplifikaciju virusa. Za ovu svrhu, ćelije Sf9 insekata su transfektovane sa amplifikovanim rekombinantnim bakulovirusom, a zatim su inkubirane na 27 ° C tokom 3-5 dana. Ove ćelije Sf9 insekata su sakupljene, isprane sterilnim PBS-om i alikvotirane na ≈ 2 x 10<6>ćelija / 250 μl u PBS-u i čuvane na -80 ° C da bi se dobili lizati ćelija. Pre skladištenja, površinska ekspresija humanog CD 134 na transfektovanim Sf9 ćelijama insekata je potvrđena korišćenjem 1: 10 fikoeritrin (PE)-konjugovani mišji anti-humani CD 134 (klon ACT35; BD Biosciences) i protočnom citometrijom.
1
(b). Imunizacija i stvaranje mišjih anti-humanih CD134 monoklonskih antitela
[0276] BALB/c miševima (ženke, starosti 6 nedelja; Charles River Laboratories) je subkutano injektovano ≈ 400 μL humanih CD134-transfektovanih lizata ćelija Sf9 insekata (250 μL alikvot ćelijskog lizata 250 μL kompletnog Freundovog adjuvansa, Sigma) na dan 0. Slične subkutane injekcije korišćenjem humanih CD134-transfektovanih lizata ćelija Sf9 insekata i nekompletnog Freundovog adjuvansa (Sigma) su date dana 21. i dana 42. Intraperitonealne injekcije pojačivača sa humanim CD134-transfektovanim lizatima ćelija Sf9 insekta (250 μL/miš) bez adjuvansa su date dana 61. i dana 62. U 65-om danu, splenociti iz imunizovanih miševa su spojeni sa ćelijama mijeloma SP2/0 (DSMZ) koristeći standardnu tehnologiju hibridoma koju su prvobitno opisali Kohler i Milstein (Nature 1975; 256: str. 495-497). Ukratko, imunizovani miševi su žrtvovani. Splenociti su odvojeni od slezina i isprani u opti-MEM I bez seruma sa GlutaMax medijumom (SF medijum; Invitrogen). Logaritmički rastuće mijelomske ćelije SP2/0-Ag14 su isprane u SF medijumu i dodate splenocitima, dajući odnos splenocita prema ćelijama mijeloma od 5: 1. Ćelije su zatim peletirane, a supernatant je uklonjen. Jedan ml 37% rastvora (v/v) polietilenglikola 4000 (Merck) je zatim dodat u kapima tokom perioda od 60 sekundi, nakon čega su ćelije inkubirane još 60 sekundi na 37 ° C. Osam ml SF medijuma, a nakon toga 5 ml opti-MEM I sa glutamaksom/10% (v/v) fetalnim telećim serumom (FCS; Bodinco), je zatim polako dodato uz nežno mešanje. Nakon 30 minuta na sobnoj T, ćelije su peletirane, oprane u opti-MEM I sa GlutaMax/10% FCS-om za uklanjanje rezidualnog polietilenglikola i konačno nanesene pri koncentraciji od 10<5>ćelija/200 μl po bazenčiću u opti-MEM I sa GlutaMax/10% FCS/ 50x Hybri-Max ™ aminopterinom (de novo inhibitor DNK sinteze; Sigma). Od 7. dana, medijum za selekciju aminopterina je bio dopunjen svakih 2-3 dana, a u 14. Danu je zamenjen od strane opti-MEM I sa GlutaMax/ 10% FCS. Hibridomi, koji su proizveli antitela (mišja IgG klase) protiv humanog CD 134 (prikazana sa konvencionalnim ELISA i protočnim citometrijskim tehnikama pomoću rekombinantnog humanog CD134: humanog Fcγ fuzionog proteina (R&D Systems; pogledati Primer 11 (a) niže) i PHA (Roche)-stimulisani blasti CD4 T ćelija koji eksprimiraju humani CD 134 (pogledati Primer 2 (a) niže) kao ciljeve, respektivno) su prošireni, krioprezervisani i subklonirani ograničavajućim razblaženjem. Specifična monoklonska antitela protiv humanog CD 134 su prečišćena korišćenjem proteinskih G kolona (GE Healthcare), a rezultirala su mišjim antihumanim CD 134 monoklonskim antitelima klona 12H3 i klona 20E5.
2
Primer 2. Karakterizacija protočnom citometrijom mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5
(a). Ekspresija CD 134 na humanim T-limfocitima stimulisanim sa PHA
[0277] Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) od zdravih donora (informisani pristanak) su izolovane centrifugiranjem gustine na Lymphoprepu (1,077 g/ml, Nycomed). Nakon toga, 1-2x10<6>PBMC/mL u medijumu kulture RPMI-1640 (Gibco) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (Bodinco) i 50 μg/ml gentamicina (Gibco), stimulisano je sa 0, 0,1, 1,0 ili 10,0 μg/mL fitohemaglutinina-M (PHA-M; Roche) na 37 ° C/5% CO2tokom 1-3 dana. Nakon kulture, PBMC su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni fiziološki rastvor puferovan sa fosfatom koji sadrži 0,1% goveđeg serumskog albumina (Sigma)/0,05% NaN3(PBS/BSA/NaNs) dopunjenog sa 10% humanog objedinjenog seruma (HPS, blokirajući Fcγ receptore; BioWhittaker). Ćelije su inkubirane sa 10 μg/mL komercijalno dostupnim mišjim anti-humanim CD 134 antitelima klona ACT35 (mišji IgG1 izotip; BD Biosciences, Alphen aan de Rijn, Holandija) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su naknadno inkubirane sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG antitelima (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su inkubirane sa 1:20 razblaženim Fluorescein izotiocijanatom (FITC) konjugovanim mišjim anti-humanim CD3 antitelom (BD Biosciences) za otkrivanje T limfocita tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su fiksirane u 2% formaldehidu u PBS/BSA/NaN3-u tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno protočnom citometrijom (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0278] Kao što je prikazano na slici 1 (n = 1 od svakog donora), humanizovani T-limfociti koji nisu stimulisani / dobijeni iz periferne krvi nisu izrazili bilo koji CD 134, međutim, PHA doznozavisno stimuliše humane T limfocite CD3<pozitivne>da izraze površinski CD 134. Kada su izloženi 10 μg/mL PHA, činilo se da nivoi ekspresije CD 134 na aktiviranim humanim CD3<pozitivnim>T limfocitima dostižu plato između ’dana 1’ i ’dana 2’, međutim, procenat humanih CD134<pozitivnih>/CD3<pozitivnih>T limfocita je povećan u zavisnosti od vremena, tokom eksperimentisanja.
(b). CD 134 ekspresija na PHA-stimulisanoj humanoj CD4 T limfocitnoj subpopulaciji
[0279] Generisani su PHA-stimulisani (pri 0 i 10 μg/mL tokom 1 dana; videti gore) T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134. Ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3koji je dopunjavan sa 10% HPS-a (koji blokira Fcγ receptore; BioWhittaker). Ćelije su inkubirane sa 1: 10 razblaženim FITC-konjugovanim mišjim antihumanim CD4 antitelima (BD Biosciences) ili 1: 10 razblaženim FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD8 antitelima (BD Biosciences) u kombinaciji sa 1: 10 razblaženim komercijalno dostupnim PE konjugovanim mišjim anti-humanim CD 134 klonom ACT35 (BD Biosciences) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su fiksirane u 2% formaldehidu u PBS/BSA/NaN3-u tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0280] Kao što je prikazano na slici 2, ekspresija CD 134 je primećena na PHA stimulisanim humanim CD4<pozitivnim>T limfocitima i ne na CD4<pozitivnim>T limfocitima u mirovanju. Niska ekspresija CD 134 je pronađena na PHA-aktiviranim humanim CD8<pozitivnim>T limfocitima, a ne na humanim CD8<pozitivnim>T limfocitima u mirovanju (podaci nisu prikazani).
(c). Vezivanje mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 na PHA-stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134. Generisani su PHA-stimulisani (pri 10 μg/mL tokom 2 dana; videti iznad) T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134. Ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2 x 10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3dopunjavan sa 10% HPS-a (koji blokira Fcγ receptore; BioWhittaker). Ćelije su inkubirane sa 0, 0,007, 0,02, 0,07, 0,2, 0,6, 1,9, 5,6, 16,7, 50,0 μg/mL komercijalno dostupnim mišjim anti-humanim CD134 antitelima klona ACT35 (izotip miša IgG1; BD Biosciences) i mišjim anti-humanim CD 134 antitelima klona 12H3 ili klona 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su zatim inkubirane sa PE-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG antitelima (Jackson ImmunoResearch) razblaženim 1: 200, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su inkubirane sa razblaženim 1: 20 FITC-konjugovanim mišjm anti-humanim CD3 antitelom (BD Biosciences) za otkrivanje T limfocita, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su fiksirane u 2% formaldehidu u PBS/BSA/NaN3-u tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je izmereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0281] Kao što je prikazano na slici 3 (srednja vrednost ± SD, rezultati posmatrani od dva donora), mišja anti-humana CD 134 antitela klona ACT35, klona 12H3 i klona 20H5 zasićenih
4
površinskih molekula humanog CD 134 na PHA-stimulisanim CD3<pozitivnim>T limfocitima pri približno 5,0-10,0 μg/mL. Korišćenjem ova dva donora, polu maksimalno vezivanje je primećeno pri ≈ 0,5 μg/mL za mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3, a pri ≈ 2,5 μg/mL za mišja anti-humana CD 134 antitela klona ACT35 i klona 20E5.
(d). Vezivanje mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 na PHA-stimulisanim CD4 pozitivnim i CD8 pozitivnim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134
[0282] Generisani su PHA-stimulisani (pri 20 μg/mL tokom 1 dana; videti gore) T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134. Ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3, dopunjavan sa 10% HPS-a (blokirajući Fcγ receptore; BioWhittaker). Ćelije su inkubirane sa 20,0 μg/mL kontrolnog izotipa mišjeg IgG1κ (BD Biosciences) ili sa 20,0 μg/mL mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3 ili klona 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su zatim inkubirane sa PE-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG antitelima razblaženim 1: 100 (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su inkubirane 30 minuta na 4 ° C sa FITC-konjugovanim mišjim antihumanim CD4 antitelom razblaženim 1: 20 (BD Biosciences) ili FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD8 antitelom razblaženim 1: 20 (BD Biosciences) za otkrivanje subpopulacija T limfocita. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je izmereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0283] Kao što je prikazano na slici 4, mišja anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 i klona 20E5 su pokazala pozitivno bojenje na aktiviranoj humanoj subpopulaciji CD4<pozitivnih>T limfocita i nisko pozitivno bojenje na aktiviranoj humanoj subpopulaciji CD8<pozitivnih>T limfocita .
(e). Unakrsna-kompeticija ne-obeleženih mišjih anti-humanih CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 sa PE-konjugovanim komercijalnim mišjim anti-CD 134 antitelima na PHA-stimulisanim T limfocitima koji izražavaju humani CD 134
[0284] Generisani su T limfociti stimulisani sa PHA (pri 10 μg/mL ili pri 20 μg/mL, tokom 4 dana ili tokom 1 dana, respektivno; videti gore) koji eksprimiraju humani CD 134 Ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3, dopunjavan sa 10% HPS-a (blokirajući Fcγ receptore; BioWhittaker). Ćelije su inkubirane sa 20 μg/mL neobeleženog mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 ili sa 10 μg/ mL neobeleženog klona 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Ćelije su zatim inkubirane sa razblaženim 1:20 PE-konjugovanim komercijalno dostupnim mišjim anti-humanim CD 134 antitelima klona ACT35 (BD Biosciences) ili klona L106 (BD Biosciences; takođe videti Godfrey patent), tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje PE-konjugovanih komercijalnih dostupnih anti-CD134 antitela je izmereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0285] Kao što je prikazano na slici 5, prethodna inbunkcija sa neobeleženim mišjim antihumanim CD134 antitelima klona 12H3 je delimično blokirala vezivanje komercijalnog PE-konjugovanog mišjeg anti-humanog CD 134 antitela klona L106 protiv humanog CD 134 na PHA-stimulisanim T limfocitima. Prethodna inkubacija sa neobeleženim mišjim anti-humanim CD 134 antitelima klona 20E5 je neznatno blokirala vezivanje komercijalnog PE-konjugovanog mišjeg anti-humanog CD 134 antitela klona L106 protiv humanog CD 134 na PHA stimulisanim T limfocitima. Prethodna ininkubacija sa neobeleženim mišjim antihumanim CD 134 klonom antitela 12H3 i klonom 20H5 nije pokazala nikakav uticaj na vezivanje komercijalnog PE-konjugovanog mišjeg anti-humanog CD134 antitela klona ACT35 protiv humanog CD 134 na PHA-stimulisanim T limfocitima.
[0286] Ovi rezultati su pokazali da je klon 12H3 mišjeg anti-humanog CD 134 antitela specifično prepoznao humani CD 134 (delimično blokirajući vezivanje klona L106) na PHA-stimulisanim T limfocitima, a vezao se (ii) za neidentični epitop na humanom CD134, koji je bio prepoznatljiv od komercijalnog mišjeg anti-humanog CD134 antitela klona L106. Ovi rezultati su takođe pokazali da je klon 20E5 mišjeg anti-humanog CD134 antitela (i) specifično prepoznao humani CD134 (neznatno blokirajući vezivanje klona L106) na PHA- stimulisanim T limfocitima, i (ii) vezao za neidentičan epitop koji je bio prepoznat od komercijalnog mišjeg anti-humanog CD134 antitela klona L106. Štaviše, ovi rezultati su pokazali da se činilo da mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i klona 20E5 prepoznaju humane CD 134 epitope na PHA-stimulisanim T limfocitima, koji su bili različiti od epitopa prepoznatog od strane komercijalnog mišjeg anti-humanog CD 134 antitela klona ACT35. Pored toga, ovi rezultati su pokazali da se činilo da mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i klona 20E5 prepoznaju različite epitope humanog CD 134 (dokazano delimičnim blokiranjem vs neznatnim blokiranjem vezivanja L106) na PHA-stimulisanim T limfocitima.
(f). Istovremeno vezivanje rekombinantnog humanog liganda OX40 i mišjih anti-humanih CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 na PHA-stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134
[0287] Generisani su T limfociti stimulisani sa PHA (pri 10 μg/mL tokom 1 dana; videti iznad) koji eksprimiraju humani CD 134. Ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3, dopunjavan sa 10% HPS-a (blokirajući Fcγ receptore; BioWhittaker). Ćelije su inkubirane sa rekombinantnim humanim ligandom OX40 obeleženim sa polihistidinom (OX40L; R&D sistemi) od 10,0 μg/mL u kombinaciji sa anti-polihistidinskim antitelom (mišji IgG1, klon AD 1.1.10; R & D sistemi) od 50,0 μg/mL, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su zatim inkubirane sa FITC-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG antitelima razblaženim 1:100 (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/ NaN3-u, ćelije su inkubirane sa biotinilovanim (korišćenjem N-hidroksisukcinimido-biotina od Pierca) mišjim anti-humanim CD 134 monoklonskim antitelima klona 12H3 ili klona 20E5 od 10,0 μg/mL, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su inkubirane sa PE-konjugovanim streptavidinom razblaženim 1: 100 (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta na 4 ° C. Posle znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3-u, tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje humanog OX40L i anti-humanih CD 134 antitela je mereno pomoću protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0288] Kao što je prikazano na slici 6, oba klona, klon 12H3 mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela i klon 20E5 mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela su vezana istovremeno sa humanim OX40L na PHA-stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134. Ovo je pokazalo da mišja anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 i i klona 20E5 ne stupaju u interakciju sa epitopima unutar regiona za vezivanje OX40L na humanim CD 134 receptorima. Ovo otkrivanje je u suprotnosti sa komercijalno dostupnim mišjim anti-humanim CD 134 monoklonskim antitelima klona L106 (Stanford University/Godfrey patent EP 0726952 B1), koji je prepoznao epitop unutar humanog OX40L vezujućeg regiona humanih CD 134 receptora (Taylor i Schwarz. J Immunol Methods 2001; 255: 67-72; Institut Kirin & La Jolla/ Patent Croft WO 2007/062235 A2).
(g). Ekspresija CD 134 na humanim efektornim i regulatornim T limfocitima nakon stimulacije sa stimulatornim granulama anti-humanog CD3/anti-humanog CD28 antitela
[0289] Humani CD4 T limfociti su prečišćeni iz PBMC-a pomoću pozitivne selekcije korišćenjem mikrozrnaca-konjugovanih mišjih anti-humanih CD4 antitela (Miltenyi Biotec) i VarioMACS™ Magnet/LS kolona (Miltenyi Biotec). Naknadno su ovi CD4 T limfociti obojeni sa FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD4 antitelima (Dako) i PE konjugovanim mišjim anti-humanim CD25 antitelima (BD Biosciences). CD4<pozitivni>/CD25<negativni>konvencionalni efektorni T limfociti (Tefek) i CD4<pozitivni>/CD25<visoko>regulatorni T limfociti (Treg) su sortirani korišćenjem Altra protočnog citometrijskog ćelijskog sortera (Beckman Coulter). Ovo je rezultiralo obogaćivanjem od > 95% Tefek-a i >95% Treg-a. Tefek-i i Treg-i su stavljeni pri 2,5x10<5>ćelija/mL u medijumu kulture RPMI-1640/glutamax (Gibco) dopunjenom sa 0,02 mM piruvata (Gibco), 100 U/mL penicilina (Gibco), 100 μg/mL streptomicina (Gibco) i 10% HPS-a inaktiviranog toplotom (HPSi; iz LMI). Zatim su ćelije zasejane pri 2,5x10<4>ćelija/200 μL/bazenčić u pločama sa okruglim dnom sa 96 bazenčića (Greiner) i stimulisane sa stimulatornim zrnima mišjeg anti-humanog CD3/mišjeg antihumanog CD28 antitela (CD3/CD28 zrnima; Invitrogen) na 1 zrno/2 ćelije u prisustvu rekombinantnog humanog interleukina-2 od 25 U/mL (Proleukin® od Novartis Pharmaceuticals UK Ltd) na 37 ° C/5% CO2, u toku 2-8 dana. Nakon kulture, ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/0,2% BSA i istovremeno su obojene sa FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD4 antitelima razblaženim 1:50 (Dako), PE-konjugovanim mišjim anti-humanim CD25 antitelima razblaženim 1:10 (BD Biosciences), ECD™-konjugovanim mišjim anti-humanim CD3 antitelima razblaženim 1:50 (Beckman-Coulter), PE-Cy™ 5-konjugovanim mišjim anti-humanim CD134 antitelima razblaženim 1:10 (klon ATC35; BD Biosciences) i PE-Cy™ 7-konjugovanim mišjim antihumanim CD127 antitelima razblaženim 1:10 (eBiosciences). Vezivanje antitela je mereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0290] Kao što je prikazano na slici 7 (n = 1 od svakog donora), prečišćeni iz periferne krvi nestimulisani/u mirovanju (dan 0) humani Tefek-i i humani Treg-i nisu izrazili bilo koji CD134, međutim, humani Tefek-i i humani Treg-i stimulisani sa zrnima CD3/CD28 su izrazili površinski CD 134. Ekspresija CD 134 na aktiviranim humanim Tefek-ima i humanim Tregma je dostigla pik nakon 2 dana u kulturi i oslabila je nakon 5 i 8 dana u kulturi.
Primer 3. Biološka karakterizacija miših anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5
(a). Proliferacija T limfocita koji eksprimiraju humani CD134 stimulisana sa PHA nakon tretmana sa mišjim anti-humanim CD 134 antitelima klonova 12H3 i 20E5
[0291] Generisani su T limfociti stimulisani sa PHA (pri 0 i 10 μg/mL tokom 1 dana; videti iznad) koji eksprimiraju humani CD 134. Ćelije su sakupljene i suspendovane pri 2x10<6>ćelija/ ml u medijumu RPMI kulture (Gibco) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (Bodinco) i 50 μg/ml gentamicina (Gibco). Ćelije su zasejane pri 0,1x10<6>ćelija/100 μL/bazenčić (tj. 1x10<6>ćelija/ml) u pločama sa ravnim dnom sa 96 bazenčića (Corning) i izložene mišjem antihumanom CD 134 monoklonskom antitelu klona 12H3 ili mišjem anti-humanom CD 134 monoklonskom antitelu klona 20E5 od 0, 0,025, 0,25, 2,5 ili 25,0 μg/mL i/ili u kombinaciji sa 0, 0,01, 0,1 ili 1,0 μg/mL rekombinantnog humanog OX40L obeleženog sa polihistidinom (u prisustvu molarnog odnosa 1:5 anti-polihistidinskog antitela miša; R & D Systems) na 37 ° C /5% CO2tokom 6 dana. Nakon 6 dana, proliferacija ćelija je merena pomoću kolorimetrijske (BrdU inkorporacije) ćelijske proliferacije ELISA™ (Roche) i ELISA čitača (BioRad) na A450 nm.
[0292] Kao što je prikazano na slici 8 (srednja vrednost ± SD, n = 4 korišćenjem jednog donora), klon 12H3 mišjeg monoklonskog antitela protiv humanog CD 134, klon 20E5 mišjeg monoklonskog antitela protiv humanog CD134 indukuju dozno zavisnu proliferaciju u PHA stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134. Mišja anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 su indukovala proliferaciju pri 0,25, 2,5 i 25 μg/mL. Klon 12H3 monoklonskog antitela miša protiv humanog CD 134 je izazvao proliferaciju pri 2,5 i 25 μg / mL. Osim toga, humani OX40L takođe, indukuje dozno zavisnu proliferaciju kod PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134. Humani OX40L indukuje proliferaciju pri 0,1 i 1,0 μg/mL. U mirovanju (bez PHA stimulacije) humani CD134<negativni>T limfociti nisu pokazali bilo kakve proliferativne odgovore nakon tretmana sa klonom 12H3 monoklonskskog antitela miša protiv humanog CD 134, klonom 20E5 monoklonskog antitela miša protiv humanog CD 134 ili humanim OX40L (podaci nisu prikazani).
[0293] Kao što je prikazano na slici 9 (srednja vrednost ± SD, n = 2 korišćenjem jednog donora), mišja anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 (pri 2,5 i 25 μg/mL), mišja antihumana CD 134 monoklonska antitela klona 20E5 (pri 2,5 i 25 μg/mL) i humani OX40L (pri 1,0 μg/mL) indukuju proliferaciju PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134 . Netretirani (samo medijum) ili tretman sa kontrolnim mišjim izotipom IgG1κ (pri 2,5 i 25 μg/mL; BD Biosciences) nije pokazao nikakav efekat na proliferaciju PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134. Kombinacija mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3 pri 2,5 i 25 μg/mL (ili pri nižim koncentracijama; podaci nisu prikazani)) ili mišjih anti-humanih CD134 monoklonskih antitela klona 20E5 pri 2,5 i 25 μg/mL (ili pri nižim koncentracijama; podaci nisu prikazani) sa humanim OX40L pri 1,0 μg/mL (ili pri nižim koncentracijama; podaci nisu prikazani) nije pokazala bilo kakve recipročne (tj., sinergističke ili aditivne, ili čak inhibitorne) efekte na proliferaciju kod PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134.
(b). Proliferacija T efektornih i T regulatornih limfocita koji izražavaju humani CD 134 stimulisanih sa zrnima anti-humanog CD3/anti-CD28 nakon tretmana sa mišjim anti-humanim CD 134 antitelima klonova 12H3 i 20E5
[0294] Humani CD4 T limfociti su prečišćeni iz PBMC-a negativnom selekcijom pomoću koktela mišjih antitela (BD Biosciences) usmerenih protiv humanog CD8 (klon RPA-T8), CD14 (klon M5E2), CD16 (klon 3G8), CD19 (klon 4G7), CD33 (klon P67.6), CD56 (klon B159) i CD235a (HIR2). Nakon inkubacije sa Dynabeads®-konjugovanim ovčijim anti-mišjim IgG (Invitrogen), nevezani CD4 T limfociti su sakupljeni iz Dynal Magnetnog Koncentratora čestica, MPC™ -6 (Invitrogen). Od ovih obogaćenih CD4 T limfocita, CD25<visoko>Treg-i i CD25<negativni>Tefek-i su razdvojeni pomoću MACS-sortiranja korišćenjem 10 μL mišjih antihumanih CD25 antitela konjugovanih sa mikrozrnima (Miltenyi Biotec)/10<7>ćelija i MiniMACS ™ Magnet/MS kolona (Miltenyi Biotec VarioMACS ™ Magnet/LS kolone (Miltenyi Biotec). Ovo je rezultiralo obogaćivanjem od >90% Tefek-a i > 90% Treg-a. Tefek-i i Treg-i su stavljeni pri 0,25x10<6>ćelija/mL u medijumu kulture RPMI-1640/ glutamax (Gibco), dopunjenog sa 0,02 mM piruvata (Gibco), 100 U/mL penicilina (Gibco), 100 μg/mL streptomicina (Gibco) i 10% HPS-a. Zatim su zasejani Tefek-i i Treg-i pri 2,5x10<4>ćelija/200 μL/bazenčić (tj. 0,125x10<6>ćelija/mL) u pločama sa okruglim dnom sa 96 bazenčića (Greiner) i stimulisani sa zrnima CD3/CD28 (Invitrogen), na 1 zrno/5 ćelija sa ili bez 5,0 μg/mL mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3, 5,0 μg/mL mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 20E5, 1,0 μg/mL rekombinantnog humanog OX40L obeleženog polihistidinom (u prisustvu molarnog odnosa od 1:5 anti-polihistidinskog antitela miša R & D Sistemi), kombinacije mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3 5,0 μg/mL sa rekombinatnim humanim OX40L obeleženim sa polihistidinom 1,0 μg/mL (u prisustvu molarnog odnosa od 1:5 anti-polihistidinskog antitela miša) ili kombinacija mišjih antihumanih CD 134 monoklonskih antitela klona 20E5 od 5,0 μg/mL sa rekombinantnim humanim OX40L obeleženim polihistidinom od 1,0 μg/mL (u prisustvu molarnog odnosa od 1:5 anti-polihistidinskog antitela miša) na 37 ° C/5% CO2, tokom 4 ili 5 dana. Nakon 4 ili 5 dana, proliferacija ćelija je merena korišćenjem ugradnje 0,5 μCi triciranog timidina (Perkin & Elmer) i β-brojača (Canberra-Packard).
[0295] Kao što je prikazano na slici 10 (srednja vrednost ± SD), iako su CD3/CD28 stimulatorska zrna sama izazvala značajnu proliferaciju u Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 (tj. medijum), klon 12H3 mišjih monoklonskih antitela protiv humanog CD 134 ili humani OX40L indukuju dodatnu proliferaciju Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisanih sa zrnima CD3/CD28. Klon 20E5 mišjih anti-humanih CD134 monoklonskih antitela nije indukovao dodatnu proliferaciju Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisanih sa zrnima CD3/CD28.
[0296] Kao što je prikazano na slici 11 (srednja vrednost ± SEM od 5 donora), klon 12H3 mišjeg monoklonskog antitela protiv humanog CD134 i klon 20E5 mišjeg monoklonskog antitela protiv humanog CD134 nije indukovao ili je indukovao nisku proliferaciju Treg-a koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisanih sa zrnima CD3/CD28, dok je humani OX40L indukovao vrlo snažnu proliferaciju Treg-a koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisanih sa zrnima CD3/CD28.
[0297] Kao što je prikazano na slici 12A (srednja vrednost ± SD), klon 12H3 monoklonskih antitela miša protiv humanog CD 134 u kombinaciji sa humanim OX40L nije pokazao bilo kakve recipročne (tj. inhibitorne, sinergijske ili aditivne) efekte na Tefek koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisane sa zrnima CD3/CD28. Osim toga, klon 20E5 mišjih monoklonskih antitela protiv humanog CD 134 u kombinaciji sa humanim OX40L nije pokazao bilo kakve recipročne (inhibitorne, sinergističke ili aditivne) efekte u Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisanim sa zrnima CD3/CD28 (podaci nisu prikazani).
[0298] Kao što je prikazano na slici 12B (srednja vrednost ± SD), za razliku od (nedostatka bilo kakvih) efekata posmatranih sa humanim OKS40L-posredovanim proliferativnim odgovorima u Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisanim sa zrnima CD3/CD28, anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 snažno potiskuju proliferativne odgovore posredovane sa humanim OX40L kod Treg-a koji eksprimiraju humani CD 134 stimulisanih sa zrnima CD3/CD28.
1
(c). Supresivna funkcija T regulatornih limfocita koji eksprimiraju humani CD134 stimulisanih sa granulama anti-humanog CD3/anti-CD28 nakon tretmana sa mišjim anti-humanim CD 134 antitelima klonova 12H3 i 20E5
[0299] Humani CD4 T limfociti su prečišćeni od PBMC-a, a Tefek-i i Treg-i su obogaćeni kao što je opisano u Primeru 3 (b) gore. Tefek-i i Treg-i su stavljeni pri 0,25x10<6>ćelija/mL u medijumu kulture RPMI 1640/glutamax (Gibco), dopunjenom sa 0,02 mM piruvata (Gibco), 100 U/mL penicilina (Gibco), 100 μg/mL streptomicina (Gibco) i 10% HPSi. Zatim su Tefek-i zasejani pri 2,5x10<4>ćelija/200 μL/bazenčić (tj. 0,125x10<6>Tefek/mL) i zajedno kultivisani sa 2,5x10<4>supresivnim Treg/200 μL/bazenčić (tj.0,125x10<6>Treg-a/mL); odnos Tefek/Treg = 1:1) u pločama sa okruglim dnom sa 96 bazenčića (Greiner). Ove ko-kulture Tefek/Treg su stimulisane sa zrnima CD3/CD28 (Invitrogen) na 1 zrno/10 ćelija sa ili bez 5,0 μg/mL mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3, 5,0 μg/ml mišjeg anti-humanog CD134 monoklonskog antitela klona 20E5 i 1,0 μg/mL rekombinantnog humanog OX40L obeleženog polihistidinom (u prisustvu molarnog odnosa mišjeg anti-polihistidinskog antitela od 1:5; R & D Systems) na 37 ° C/5% CO2 tokom 5 dana. Nakon 5 dana, proliferacija ćelija je merena korišćenjem inkorporiranjem 0,5 μCi triciranog timidina (Perkin & Elmer) i β-brojača (Canberra-Packard).
[0300] Kao što je prikazano na slici 13 (srednja vrednost ± SD), humani Treg-i su potisnuli proliferativne odgovore humanih Tefek-a (tj., medijuma) indukovane CD3/CD28 perlama. Ova supresivna funkcija humnih Treg-a je bila prigušena u prisustvu klona 12H3 mišjih monoklonskih antitela protiv humanog CD 134 ili u prisustvu humanog OX40L. Klon 20E5 mišjih monoklonskih antitela protiv humanog CD 134 nije pokazao efekat na supresivnu funkciju humanih Treg-a.
Primer 4. Molekularna genetička karakterizacija mišjih anti-humanih CD134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3
(a). Izotipska i Edmanova degradacija
[0301] Mišja imunoglobulinska klasa, izotip i tip lakog lanca Protein-G-prečišćenih mišjih antihumanih CD134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3 su određeni pomoću Isostrip ™ izotipskog kompleta mišjeg monoklonskog antitela (Roche) i pokazano je da se oba mišja anti-
2
humana CD134 monoklonska antitela klonova 20E5 i 12H3 sastoje od IgG1 teških lanaca i kappa (κ) lakih lanaca.
[0302] Nakon standardne SDS-PAGE elektroforeze, korišćenjem prethodno izlivenog gela NuPage® Novex® sistem (Invitrogen), pod redukcionim uslovima (DTT i zagrevanje 70 ° C), mišja anti-humana CD134 monoklonska antitela klona 20E5 su pomoću elektroforeze odvojena i prebačena na poliviniliden fluoridnu (PDVF/Immobilon-P) transfer membranu (Millipore) i obojena Coomassie brilijantnim plavim (BioRad). Zatim su iz PVDF membrane isečene trake teških i lakih lanaca (50 kDa i 25 kDa, respektivno) i korišćene su za analizu Edmanove degradacije (izvedena od strane EuroSequence, Groningen, Holandija) za određivanje N-terminalnih aminokiselinskih sekvenci. Rezultati su prikazani u SEK ID BR.3 i SEK ID BR.
61 za mišja anti-humana CD134 monoklonska antitela klona 20E5. Određeno je jedanaest amino kiselina N-terminusa od teških lanaca i 11 aminokiselina N-terminusa od lakih lanaca.
(b). RT PCR
[0303] Ćelije hibridoma klona 20E5 i 12H3 su sakupljene iz ćelijske kulture. Ćelije su isprane sa PBS-om, alikvotirane u bočice koje sadrže 5 x 10<6>ćelija i skladištene kao pelete na -80 ° C. Ćelijske pelete su korišćene za izolovanje RNK korišćenjem RNeasy Mini Isolation kompleta (QIAGEN). Utvrđena je koncentracija RNK (A260 nm) i RNK je čuvana na -80 ° C. Ukupan prinos izolovane RNK: 27,3 μg i 58,4 μg za klon 20E5 i klon 12H3, respektivno (odnos A260/A280 za oba 1,9). Pomoću reverzne transkriptaze, sintetisana je cDNK od 1 μg RNK korišćenjem RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit-a (Fermentas) i skladištena na -20 ° C.
[0304] Na osnovu izotipa (kappa/IgG1 miša) i analize Edmanove degradacije mišjih antihumanih CD 134 monoklonskih antitela klona 20E5, dizajnirani su sledeći prajmeri za amplifikaciju V-regiona mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 20E5:
Prajmer br. * Sekvenca ** SEK ID Br. Pravac Gen 201 GACAGTTGGTGCAGCATCAG 39 antismisaona mkappa 266 CACTGGATGGTGGGAAGATG 40 antismisaona mkappa 203 GGCCAGTGGATAGACAGATG 41 antismisaona mIgG1 204 TGGACAGGGATCCAGAGTTC 42 antismisaona mIgG1 259 GCGAAGTACAAYTNCARCARWSNGG 43 smisaona 20E5HC 260 GCGTACAATTACARCARWSNGGNCC 44 smisaona 20E5HC 265 GCGATATACARATGACNCARAC 45 smisaona 20E5LC ___________________________________________________________________________ * br. prema sistemu unutrašnjeg kodiranja Bioceros;
** degenerisani prajmeri: N = A, C, G ili T, Y = C ili T, R = A ili G, W = A ili T i S = G ili C. ___________________________________________________________________________
[0305] Na osnovu izotipa (kappa/IgG1 miša) mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 i smisaonih prajmera kaljenih do cDNK kodirajućih signalnih peptida miša (delimično bazirani na izd. Antibody Engineering Volume 1 Kontermann, Roland E.; Dubel, Stefan (Eds.), Springer Lab Priručnici, 2. izdanje, 2010), dizajnirani su sledeći prajmeri za amplifikaciju V-regiona mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3:
Prajmer br.* Sekvenca ** SEK ID Br. Pravac Gen 416 CAGTGGATAGACAGATGGGGG 46 antismisaona mIgG1 394 ACTGGATGGTGGGAAGATGG 47 antismisaona mkappa 405 ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT 48 smisaona sign. peptid 410 ATGGRATGGAGCKGGGTCTTTMTCTT 49 smisaona sign.peptid 389 ATGGGCWTCAAAGATGGAGTCACA 50 smisaona sign. peptid ___________________________________________________________________________ * br. prema sistemu Bioceros unutrašnjeg kodiranja;
** degenerisani prajmeri: N = A, C, G ili T, Y = C ili T, R = A ili G, W = A ili T i S = G ili C, M = C ili A i K = G ili T.
___________________________________________________________________________
[0306] Prajmeri 201 i 266 su antismisaoni dizajnirani za zagrevanje na visokoj temperaturi unutar konstantnog regiona mišjeg kappa gena na položajima 214-232 i 236-255 respektivno (na osnovu pristupnog broja V00807 [verzija V00807.1]).
[0307] Prajmeri 203 i 204 su antismisaoni dizajnirani za zagrevanje na visokoj temperaturi u konstantnom regionu mišjeg IgG1 na položajima 115-134 i 221-240 respektivno (na osnovu pristupnog broja J00453 [verzija J00453.1]).
[0308] Prajmeri 259 i 260 su smisaoni degenerisani prajmeri (degeneracija od respektivno 512 i 256) za zagrevanje na visokoj temperaturi na N-terminusu (aminokiselina 1-8 i 2-9 respektivno) teškog lanca mišjeg anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 na bazi Edmanove degradacije.
4
[0309] Prajmer 265 je smisaoni degenerisani prajmer (degeneracija od 16) žarenjem na N-terminusu (aminokiselina 1-7) lakog lanca mišjeg anti-humanog CD134 antitela klona 20E5 na bazi Edmanove degradacije.
[0310] Prajmer 416 je antismisaoni dizajniran za zagrevanje na visokoj temperaturi u konstantnom regionu IgG1 miša na položajima 111-131 (na osnovu pristupnog broja J00453 [verzija J00453.1]).
[0311] Prajmer 394 je antismisaoni dizajniran za zagrevanje na visokoj temperaturi unutar konstantnog regiona mišjeg kappa gena na položaju 235-254 (na osnovu pristupnog broja V00807 [verzija V00807.1]).
[0312] Prajmeri 389, 405 i 410 su degenerisani prajmeri (degeneracija, respektivno 2, 8 i 8) žarenja sa signalnim peptidnim sekvencama mišjih antitela. Prajmer 389 je dizajniran za lake lance, prajmeri 405 i 410 za teški lanac.
[0313] Prajmeri 201, 266, 203, 204, 259, 260 i 265 su korišćeni u različitim kombinacijama za amplifikaciju varijabilnih regiona mišjeg anti-humanog CD 134 antitela 20E5, a prajmeri 416, 394, 405, 410 i 389 su korišćeni u različitim kombinacijama za amplifikaciju varijabilnih regiona mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3. Razne različite tehnike PCR-a su izvršene korišćenjem generisane cDNK oba klona kao templejta.
[0314] Accuprime™ Pfk DNK polimeraza (Invitrogen) je korišćena za amplifikaciju varijabilnih regiona teških i lakih lanaca oba klona, anti-humanog mišjeg CD134 antitela klona 20E5 i klona 12H3. Proizvodi PCR-a su analizirani na 1% agaroznom gelu. Proizvodi PCR reakcija su prečišćeni gelom i klonirani u vektor pCR-Blunt II-TOPO® za analizu sekvence. Od plazmida koji sadrže PCR umetak, klonirani dodaci su analizirani DNK sekvencioniranjem (izvedenim od strane ServicXS B.V., Leiden, Holandija ili Macrogen, Amsterdam, Holandija) koristeći T7 za dobijanje konsenzus sekvence za V-regione mišjih anti-humanih CD 134 antitela klonova 20E5 i 12H3. Jedanaest reakcija informativnih sekvenci teškog lanca i 3 reakcije informativne sekvence lakog lanca su dobijene za klon 20E5 mišjih anti-CD134 antitela. Pet reakcija informativnih sekvenci teškog lanca i 3 reakcije informativnih sekvenci lakog lanca su dobijene za mišja anti-CD134 antitela klona 12H3. Na osnovu ove informacije utvrđene su konsenzus sekvence V-regiona oba antitela (videti SEK ID BR 4, 5, 12 i 13).
Primer 5. Generisanje himernog humanog IgG4/kappa i/ili humanog IgG1/kappa (tj. zamenjivanje konstantnih domena miša za konstantne humane IgG/kappa domene) antihumanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3
[0315] Na osnovu utvrđenih V-regiona glodara (videti Primer 4 (b) iznad) mišjih anti-CD134 antitela klonova 20E5 i 12H3, napravljen je dizajn za generisanje verzija himernih humanih antitela. U tom cilju, optimizovane cDNK sekvence CHO ćelija (videti SEK ID BR: 20 (kodirajuću za himerni humani teški IgG4 lanac klona 20E5), SEK ID BR: 21 (kodirajuću za himerni humani laki κ lanac klona 20E5), SEK ID BR.22 (kodirajuću za himernu humani teški IgG1 lanac klona 20E5), SEK ID BR 23 (kodirajuću za himerni humani teški IgG4 lanac klona 12H3) i SEK ID BR 24 (kodirajuću za himerni humani laki κ lanac klona 12H3)) su naručene u GENEART (Regensburg, Nemačka), koje su kodirale mišji signalni peptid praćen ili varijabilnim lakim lancem vezanim za konstantni region humanog kappa, ili praćen varijabilnim teškim lancem vezanim za konstantni region humanog IgG. Ovaj dizajn je napravljen za oba antitela; za klon 20E5, varijabilni teški lanac je povezan sa humanim IgG4 ili sa konstantnim regionom humanog IgG1; za klon 12H3, varijabilni region teškog lanca je povezan sa konstantnim regionom humanog IgG4. Koristeći pogodne restrikcione enzime, generisane cDNK su subklonirane u pcDNA3.1-izvedenim ekspresionim plazmidima. Himerna antitela su izražena korišćenjem FreeStyle ™ MAX CHO (CHO-S ćelije) sistema ekspresije (Invitrogen). Izražena antitela su prečišćena korišćenjem kolona afinitetne hromatografije proteina A (GE Healthcare). Za himerne aminokiselinske sekvence, videti SEK ID BR.25, 26, 27, 28 i 29.
Primer 6. Vezivna karakterizacija himernog humanog IgG4/kappa i/ili IgG1/kappa antihumanog CD 134 monoklonskog antitela klona 20E5
(a). Vezivne karakteristike humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 20E5 na PHA-stimulisanim CD4 pozitivnim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134
[0316] Generisani su T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisani sa PHA (pri 10 μg/mL tokom 1 dana; videti iznad). Ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađenom PBS/BSA/NaN3-u. Ćelije su inkubirane sa 0, 0,007, 0,02, 0,07, 0,2, 0,6, 1,9, 5,6, 16,7, 50,0 μg/mL himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitelima klona 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su zatim inkubirane sa 1:50 razblaženim FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim IgG4 antitelima (Sigma) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su inkubirane sa 1:10 razblaženim PE-konjugovanim mišjim anti-humanim CD4 antitelom (BD Biosciences) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su bile fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3-u tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno protočnom citometrijom (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0317] Himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 zasićenih površinskih molekula humanog CD 134 na PHA-stimulisanim CD4<pozitivnim>T limfocitima, pri približno 5,0-10,0 μg/mL (podaci nisu prikazani). Polovina maksimalnog vezivanja je primećena pri ≈ 1,0 μg/mL za himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 (podaci nisu prikazani).
(b). Vezivanje himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 20E5 na PHA-stimulisanim CD4 pozitivnim i CD8 pozitivnim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134
[0318] Generisani su T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisani sa PHA (pri 10 μg/mL tokom 1 dana; videti iznad). Ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3. Ćelije su inkubirane sa ili bez 20,0 μg/mL himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su naknadno inkubirane tokom 30 minuta na 4 ° C sa razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima 1:200 (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog ispiranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su inkubirane sa 1-10 razblaženim FITC-konjugovanim mišjim antihumanim CD4 antitelom (BD Biosciences) ili sa 1-10 razblaženim FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD8 antitelom (BD Biosciences) za otkrivanje subpopulacija T limfocita. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3-u tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0319] Klon 20E5 himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela je pokazao pozitivno bojenje na PHA-aktiviranoj subpopulaciji humanih CD4-pozitivnih T limfocita i nisko pozitivno bojenje na PHA-aktiviranoj subpopulaciji humanih CD8-pozitivnih T limfocita (podaci nisu prikazani).
(c). Vezivanje himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 20E5 na CD4 pozitivnim i CD8 pozitivnim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisanim sa zrnima stimulatora anti-humanih CD3/anti-humanih CD28 antitela
[0320] Mononuklearne ćelije humane periferne krvi (PBMC) od zdravih donora (informisani pristanak) su izolovane centrifugiranjem u medijumu gustine Limfoprep-u (1,077 g/ml; Nycomed). Naknadno, 1x10<6>PBMC/mL u medijumu za kulturu RPMI-1640 (Gibco) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (Bodinco) i 50 μg/ml gentamicina (Gibco) je stimulisano sa stimulatornim zrnima mišjih anti-humanih CD3/mišjih anti-humanih CD28 antitela (CD3/ CD28 zrna; Invitrogen) pri 1 zrno/4 ćelije u odsustvu ili prisustvu 25 U/mL rekombinantnog humanog interleukina-2 (PeproTech) na 37 ° C/5% CO2tokom 1 dana. Nakon kulture, PBMC su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3. Ćelije su inkubirane sa ili bez 20,0 μg/mL himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su naknadno inkubirane sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch) tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su inkubirane tokom 30 minuta na 4 ° C sa 1-10 razblaženim FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD4 antitelom (BD Biosciences) ili sa 1-10 razblaženim FITC-konjugovanim mišjim anti-humanim CD8 antitelom (BD Biosciences) za otkrivanje subpopulacija T limfocita. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/ NaN3-u, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3,tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0321] Kao što je prikazano na slici 14, klon 20E5 himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela je pokazao pozitivno bojenje na aktiviranoj subpopulaciji humanih CD4<pozitivnih>T limfocita sa CD3/CD28 granulama, a nisko pozitivno bojenje na humanoj subpopulaciji CD8<pozitivnih>T limfocita aktiviranoj sa CD3/CD28 granulama. Nije uočen očigledan efekat korišćenjem suplementa rekombinantnog humanog IL-2.
Primer 7. Biološka karakterizacija himernog humanog IgG4/kappa anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 20E5
(a). Proliferacija PHA-stimulisanih humanih CD 134 eksprimirajućih T limfocita nakon terapije himernim humanim IgG4κ anti-humanim CD 134 monoklonskim antitelima klona 20E5
[0322] Generisani su T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisani sa PHA (pri 10 μg/mL tokom 1 dana; videti iznad). Ćelije su sakupljene i suspendovane pri 2x10<6>ćelija/mL u medijumu za kulturu RPMI (Gibco) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (Bodinco) i 50 μg/ml gentamicina (Gibco). Ćelije su zasejane pri 0,1x10<6>ćelija/100 μL po bazenčiću (tj.1x10<6>ćelija/mL) u pločama ravnog dna sa 96 bazenčića (Corning) i izložene himernom humanom IgG4κ anti-humanom CD 134 antitelu klona 20E5 pri 25,0 μg/mL ili kontrolnom humanom IgG4κ anti-humanom CD40 antitelu pri 25,0 μg/mL (PG102; Pangenetics) ili rekombinantnom humanom ligandu OX40L obeleženom polihistidinom pri 1 μg/mL (u prisustvu molarnog odnosa 1:5 mišjeg anti-polihistidinskog antitela; R & D sistemi) na 37 °C /5% CO2tokom 6 dana. Nakon 6 dana, proliferacija ćelija je merena pomoću kolorimetrijske (BrdU ugradnje) ćelijske proliferacije ELISA ™ (Roche) i ELISA čitača (BioRad) na A450 nm.
[0323] Kao što je prikazano na slici 15 (srednja vrednost ± SD), klon 20E5 himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD134 antitela (hu20E5) i humani OX40L indukuju proliferaciju kod PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134. Netretirani (samo medijum) ili tretman sa kontrolnim humanim IgG4κ anti-humanim CD40 antitelom (huIgG4) nije pokazao nikakav efekat na proliferaciju T limfocita stimulisanih sa PHA koji eksprimiraju humani CD 134.
(b). Proliferacija PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD134 nakon terapije sa himernim humanim IgG4κ anti-humanim CD 134 monoklonskim antitelom klona 20E5 u kombinaciji sa rekombinantnim humanim OX40L
[0324] Generisani su T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisani sa PHA (pri 10 μg/mL tokom 1 dana; videti iznad). Ćelije su sakupljene i suspendovane pri 2x10<6>ćelija/mL u medijumu za kulturu RPMI (Gibco) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (Bodinco) i 50 μg/ml gentamicina (Gibco). Ćelije su zasejane pri 0,1x10<6>ćelija/100 μL po bazenčiću (tj.1x10<6>ćelija/mL) u pločama ravnog dna sa 96 bazenčića (Corning) i izložene himernom humanom IgG4κ anti-humanom CD 134 antitelu klona 20E5 pri 0, 0,025, 0,25, 2,5, ili 25,0 μg/mL i/ili u kombinaciji sa 0, 0,01, 0,1 ili 1,0 μg/mL rekombinantnog humanog OX40L obeleženog polihistidinom (u prisustvu molarnog odnosa od 1:5 mišjeg anti-polihistidinskog antitela: R & D sistemi) na 37 ° C/5% CO2tokom 6 dana. Nakon 6 dana, proliferacija ćelija je merena pomoću kolorimetrijske (BrdU inkorporacije) ćelijske proliferacije ELISA ™ (Roche) i ELISA čitača (BioRad) na A450 nm.
[0325] Kao što je prikazano na slici 16 (srednja vrednost ± SD), himerna humana IgG4κ antihumana CD134 antitela klona 20E5 (hu20E5) i humani OX40L indukuju proliferaciju u zavisnosti od doze kod PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134. Himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 zavisno od donora dovode do proliferacije bilo pri 2,5 ili 25 μg/mL (donor 1) ili pri 0,25, 2,5 i 25 μg/mL (donor 2). Osim toga, donor humanog OX40L indukuje zavisnu proliferaciju pri 0,1 i 1,0 μg/ mL (donor 1) ili pri 0,01, 0,1 i 1,0 μg/mL (donor 2).
[0326] Kao što je prikazano na slici 17 (srednja vrednost ± SD), kombinacija himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 (hu20E5) pri 2,5 i 25 μg/mL (ili pri nižim koncentracijama; podaci nisu prikazani) sa humanim OX40L pri 0,1 i 1,0 μg/mL (ili pri nižim koncentracijama; podaci nisu prikazani) nije pokazala bilo kakve recipročne (tj., sinergističke ili aditivne, ili čak inhibitorne) efekte na proliferaciju kod PHA-stimulisanih T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134.
(c). Proliferacija T limfocita koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisanih sa granulama stimulatora antihumanog CD3/anti-humanog CD28 antitela, nakon tretmana sa himernim humanim IgG4κ anti-humanim CD 134 monoklonskim antitelom klona 20E5
[0327] Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) od zdravih donora (informisani pristanak) su izolovane centrifugiranjem u medijumu gustine Limfoprep-u (1,077 g/ml, Nycomed). Nakon toga, PBMC su zasejane pri 0,1x10<6>ćelija/100 μL/bazenčić (tj. 1x10<6>ćelija/mL) u pločama sa ravnim dnom sa 96 bazenčića (Corning), u medijumu za kulturu RPMI-1640 (Gibco) koji sadrži 10% fetalnog telećeg seruma (Bodinco) i 50 μg/mL gentamicina (Gibco) i stimulisane su sa granulama stimulatora mišjih anti-humanih CD3/mišjih antihumanih CD28 antitela (CD3/CD28 zrna; Invitrogen) pri 1 zrno/2 ćelije u odsustvu ili prisustvu rekombinantnog humanog interleukina-2 (PeproTech) od 25 U/mL na 37 ° C/5% CO2. Nakon 1 dana ili nakon 2 dana, ovi (minus i plus interleukin-2) T limfociti koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisani sa CD3/CD28 zrnima su izloženi himernom humanom IgG4κ antihumanom CD134 antitelu klona 20E5 pri 25,0 μg/mL ili polihistidinski-označenom rekombinantnom humanom OX40L pri 1,0 μg/mL (u prisustvu molarnog odnosa od 1:5 mišjeg anti-polihistidinskog antitela; R & D Systems) na 37 ° C/5% CO2,tokom 6 dana ili 5 dana, respektivno. Ćelije, koje su početno stimulisane sa kombinacijom granula CD3/CD28 plus rekombinantni humani interleukin-2, ponovo su stimulisane 1 dan pre merenja ćelijske proliferacije sa 25 U / mL rekombinantnog humanog interleukina-2. Nakon 6 dana ili nakon 5 dana izlaganja himernom humanom IgG4κ anti-humanom CD 134 antitelu klona 20E5 ili humanom OX40L, proliferacija ćelija je merena korišćenjem kolorimetrijske (ugradnje BrdU) ćelijske proliferacije ELISA ™ (Roche) i ELISA ™ čitača (BioRad ) na A450 nm.
[0328] Kao što je prikazano na slici 18 (srednja vrednost ± SD, n = 3 korišćenjem jednog donora), iako stimulatorska zrna CD3/CD28 samostalno indukuju značajnu proliferaciju kod humanih CD134 eksprimirajućih T limfocita (tj. medijum), himerna humana IgG4κ antihumana CD 134 antitela klona 20E5 (hu20E5) i humani OX40L indukuju dodatne proliferacije T limfocita koji eksprimiraju CD 134, stimulisanih sa zrnima CD3/CD28. Izgleda da dodavanje interleukina-2 povećava bazalnu (tj., srednju) proliferaciju u T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134, stimulisanih sa zrnima CD3/CD28.
(d). Imunostimulatorni odgovori kod majmuna rhesus macaque nakon tretmana sa humanim (himernim) antitelima protiv humanog CD 134 klonova 12H3 i 20E5
[0329] Ne-humani primati majmuna rhesus macaque, mogu biti imunizovani sa proteinima virusa imunodeficijencije simijana, gp130, kao što je opisano od strane Weinberg ei sar. ( J Immunother 2006; 29: 575-585).
[0330] Drenažni limfni čvorovi kod imunizovanih majmuna tretirani sa humanim (npr. himernim ili humanizovanim ili deimunizovanim; npr., podklase humanog IgG1 ili IgG4) antihumanim CD 134 antitelima klonova 12H3 i 20E5, su očekivani da pokažu uvećane limfne čvorove u poređenju sa kontrolnim imunizovanim majmunima. Očekuje se da će životinje tretirane sa mišjim ili humanizovanim antitelima 12H3 ili 20E5 pokazivati povećane titre antitela specifične za gp130 i povećati dugotrajne T-ćelijske odgovore u poređenju sa kontrolama. Kod tretiranih majmama ne bi trebalo da postoje očevidni znaci toksičnosti.
Primer 8. Karakterizacija humanih CD 134 domena i epitopa prepoznatih od strane mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5
(a). Vezivanje mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 sa neredukovanim i redukovanim rekombinantnim humanim CD134: humanim Fcγ fuzionim proteinom (Western blotting).
[0331] Trinaest stotina ili 650 ng/traka (za Coomassie brilijantno plavo bojenje) ili 250 ng/ traka (za Western bloting) rekombinantnog humanog CD134: humanom Fcγ (IgG1) fuzionom proteinu (R & D Systems) je elektroforizovano korišćenjem 4-12% Tris-Bis gela i MOPS protočnog pufera (Invitrogen) pod različitim neredukcionim i redukcionim uslovima (videti sliku 19-A) u prethodnoj LDS-PAGE denaturacionoj elektroforezi NuPage® Novex® sistema.
1
Zatim, rekombinantni humani CD134: humani Fcγ fuzioni protein je bio ili obojen Coomassie brilijantnim plavim (BioRad) ili elektro-blotovan na transfer membranu od poliviniliden fluorida (PDVF) (Millipore). Nakon blokiranja sa PBS/0,05% Tween 20/1% BSA frakcijom V (Roche) tokom 20 min na sobnoj T, PDVF membrane su inkubirane sa 100 ng/mL mišjeg antihumanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 ili 20E5, tokom 1 sata na sobnoj T . Paralelno, kontrolno antitelo mišjeg IgG1κ izotipa od 100 ng/mL (BD Biosciences) je korišćeno kao negativna kontrola. Nakon opsežnog pranja u PBS/0,05% Tween 20, vezivanje mišjih antihumanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3 ili 20E5 je određeno sa razblaženim 1:5000 konjugovanim kozjim anti-mišjim Fcγ-specifičnim antitelima sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch), tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, praćeno rastvorom TMB substrata spremnim za upotrebu (Sigma), za kolorimetrijsku detekciju.
[0332] Kao što je prikazano na slici 19-B, rekombinantni humani CD134 : humani Fcγ fuzioni protein pod neredukcionim uslovima (i LDS denaturisanjem bez i sa toplotnim denaturisanjem, uslovi a i b, respektivno) pokazuje molekulsku masu od ≈ 130-140 kDa. Nema redukcije bez grejanja (stanje a) pokazuje dve trake u neposrednoj blizini, što sugeriše da je frakcija rekombinantnog humanog CD134 : humanom Fcγ fuzionom proteinu nepotpuno denaturisana/ razvijena. Nema redukcije sa grejanjem (stanje b) ukazuje na jedan opseg, što je sugerisalo da je rekombinantni humani CD134: humanom Fcγ fuzionom proteinu u potpunosti denaturisan/neotvoren. Rekombinantni humani CD134: humani Fcγ fuzioni protein pod redukcionim (i denaturisanje LDS-om bez i sa toplotnim denaturisanjem, uslovi c i d, respektivno) uslovima su rezultirali trakama na ≈ 110 kDa (stanje c) i na ≈60-65 kDa (uslov d). Prethodno posmatranje predlaže nepotpunu redukciju rekombinantnog humanog CD134: humanom Fcγ fuzionom proteinu, a poslednje posmatranje predlaže potpunu redukciju/ cepanje disulfidnih mostova koji povezuju dva humana IgG1-izvedena Fcγ-fragmenta unutar svakog rekombinantnog humanog CD134: humanog Fcγ fuzionog proteinskog molekula.
[0333] Kao što je prikazano na slici 19-C, oba mišja anti-humana CD134 antitela klona 12H3 i klona 20E5 prepoznaju rekombinantni humani CD134 : humanom Fcγ fuzionom proteinu pod ne-redukcionim (i LDS denaturisanjem bez i sa toplotnim denaturisanjem, uslovi a i b, respektivno) uslovima na pretežno ≈ 130 kDa. Za razliku od toga, mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 pokazuju samo neznatno vezivanje sa rekombinantnim humanim CD134: humanim Fcγ fuzionim proteinom pri redukcionim (i LDS denaturisanjem bez i sa toplotnim denaturisanjem, uslovi c i d, respektivno) uslovima, dok je mišji anti-humanih CD 134 antitela klon 20E5 pokazao jako vezivanje za rekombinantni humani CD134: humani Fcγ fuzioni
2
protein pod redukcionim (i LDS denaturisanjem bez i sa toplotnom denaturisanjem, uslovi c i d, respektivno) uslovima.
[0334] Ovi rezultati su pokazali da mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i klon 20E5 specifično prepoznaju humani CD 134. Štaviše, ovi rezultati su pokazali da izgleda da mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i klona 20E5 prepoznaju različite epitope humanog CD 134, što dokazuje odgovarajuće neznatno vezivanje (klona 12H3) naspram jakog vezivanja (klon 20E5) sa rekombinantnim humanim CD134 : humanim Fcγ fuzionim proteinom pod redukcionim uslovima (i LDS denaturisanjem sa i bez toplotnim denaturisanjem). Ovi rezultati sugerišu da klon 12H3 anti-humanog CD 134 antitela miša prepoznaje epitop na humanom CD 134, koji nije osetljiv na denaturaciju (LDS i toplotni tretman) i osetljiv na redukciju (tj. cepanje disulfidnog mosta(ova) - najverovatnije, domenima bogatim cisteinom vezanim za (CRD) -pomoću DTT-a). Ovi rezultati sugerišu da klon 20E5 anti-humanih CD 134 antitela miša prepoznaje epitop na humanom CD 134, koji nije osetljiv na denaturaciju (LDS i toplotni tretman) i nije osetljiv na redukciju (tj. cepanje disulfidnog mosta (ova) - najverovatnije, vezano za CRD - od strane DTT-a).
(b). Vezivanje mišjih anti-humanih CD134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 sa konstruktom humanog CD 134 u punoj dužini i različitim skraćenim konstruktima CD134 izraženim na 293-F ćelijskoj liniji (mapiranje domena)
[0335] Da bi se analizirala fina specifičnost mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5, lokacija epitopa koji su prepoznati od strane mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 je određena mapiranjem domena. Sposobnost mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 da se vezuju za skraćene humane CD 134 konstrukte, izražene na površini 297-F ćelija (izvedenih iz HEK-a), utvrđena je FACS analizom.
[0336] Na osnovu literature (Swiss-Prot: P43489.1; Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677 -683; Bodmer i sar. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26; Compaan i sar. Struktura 2006; 14: 1321-1330; US Patent Publ. Br.2011/0028688 A1), identifikovani su domeni bogati cisteinom (CRD) i struktura nalik zglobu u ekstracelularnom regionu humanog CD 134. CRD su kodirani CRD1, CRD2, (skraćeni) CRD3, (skraćeni) CRD4 (videti sliku 20). CRD domeni sadrže topološki različite tipove modula, nazvane A-modulom i B-modulom (videti takođe, sliku 20). A moduli su strukture oblika C, a B-moduli su strukture oblika S. Tipičan CRD je obično sastavljen od A1-B2 modula ili A2-B1 modula (ili, ređe, različitog para modula, poput A1-B1) sa 6 očuvanih ostataka cisteina, pri čemu broj označava broj disulfidnih mostova unutar svakog modula (videti takođe, sliku 20). Kao što je prikazano na slici 20, generisano je 5 različitih konstrukata humanog CD 134 i izraženo: (1) konstrukt humanog CD 134 u punoj dužini, koji počinje sa N-terminalnim CRD1 (tj. CRD1 A1-B2-modul obuhvata aminokiseline 29-65) i stoga je označen kao 'CRD1' i sadrži aminokiseline 1-277 (videti SEK ID BR: 1), (2) konstrukt 'CRD2', koji počinje sa N-terminalnim CRD2 (tj. CRD2 A1-B2-modul obuhvata aminokiseline 66-107) i sadrži aminokiseline 66-277 povezane sa signalnim peptidnim aminokiselina 1-28 (videti SEK ID BR 30), (3) konstrukt 'CRD3', koji počinje sa N terminalnim CRD3 (tj. CRD3 A1-B1-modul obuhvata aminokiseline 108-146 (prema Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330) ili skraćeni CRD3 A1-modul obuhvata aminokiseline 108-126 (prema Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)) i sadrži aminokiseline 108-277 vezane za signalne peptide aminokiselina 1-28 (videti SEK ID BR 31), (4) konstrukt 'CRD4', koji se sastoji od N-terminalnog CRD4 ili CRD3 poddomena B1 modula/skraćenog CRD4 A1-modula (tj. CRD4 A1-B1-modul pokriva aminokiseline 127-167 (Latza i sar., Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) ili kombinaciju (nije prikazana na slici 20) CRD3 subdomena B1-modula sa skraćenim CRD4 A1-modulom pokriva aminokiseline 127-146 sa aminokiselinama 147-167, respektivno (Compaan i sar. Struktura 2006; 14: 1321-1330)) i sadrže aminokiseline 127-277 vezane za aminokiseline 1-28 signalnog peptida (videti SEK ID BR 32), i (5) konstrukt ’skraćenog (tc) CRD4’ koji se sastoji od N-terminalnog skraćenog CRD4 ili CRD4 poddomena B1-modula (tj. skraćeni CRD4 A1 modul obuhvata aminokiseline 147-167 (Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330) ili CRD4 poddomena B1-modula (nije prikazan na slici 20; Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) pokrivaju amino kiseline 147-167), a sadrže aminokiseline 147-277 vezane za signalne peptidne aminokiseline 1-28 (videti SEK ID BR: 33). Udruživanjem PCR-a korišćenjem Accuprime ™ Pfk DNK polimeraze (Invitrogen), generisano je ovih 5 konstrukata humanog CD 134, korišćenjem prajmera prikazanih u sledećoj tabeli:
Prajmer br. * Sekvenca SEK ID Br. Pravac Gen 362 CTCGGATCCGCCACCATGTGCGTG 51 smisaona CD 134 vođa 363 AGAATTCTTATTAGATCTTGGCCA 55 antismisaona CD 134 kraj 364 ACTGTCACTGGACCCTGCGGTCCC 52 smisaona CRD2 365 GGGACCGCAGGGTCCAGTGACAGT 53 antismisaona CRD2 366 ACTGTCACTGGAAGGTGCAGGGCT 54 smisaona CRD3 367 AGCCCTGCACCTTCCAGTGACAGT 56 antismisaona CRD3 368 ACTGTCACTGGACCCTGCCCCCCT 57 smisaona CRD4
4
369 AGGGGGGCAGGGTCCAGTGACAGT 58 antismisaona CRD4 370 ACTGTCACTGGATGCACCCTGGCT 59 smisaona skrać.CRD4 371 AGCCAGGGTGCATCCAGTGACAGT 60 antismisaona skrać.CRD4 ___________________________________________________________________________ * Prajmer br. prema sistemu Bioceros unutrašnjeg kodiranja ___________________________________________________________________________
[0337] Ukratko, cDNK koja kodira aminokiseline 1-28 signalnog peptida i cDNK koja kodira aminokiseline 66-277 humanog CD 134, su amplifikovane korišćenjem odgovarajućeg para prajmera 362/365 i 364/363 u PCR reakciji sa humanim CD 134 u punoj dužini kao templejt. Naknadno, konstrukt 'CRD2' je generisan korišćenjem ova dva proizvoda PCR-a u PCR sklopu koristeći par prajmera 362/363. cDNK koja kodira konstrukt 'CRD2' je subklonirana u ekspresionom plazmidu izvedenom iz pcDNA3.1 korišćenjem odgovarajućih restrikcionih mesta. Slično tome, konstrukt 'CRD3' (aminokiseline 1-28 signalnog peptida povezanog sa aminokiselinama 108-277 humanog CD 134), konstrukt 'CRD4' (aminokiseline 1-28 signalnog peptida povezanog sa aminokiselinama 127-277), i konstrukt ’skraćenog CRD4’ (aminokiseline 1-28 signalnog peptida povezanog sa aminokiselinama 147-277) su generisani i subklonirani u ekspresionim plazmidima izvedenim iz pcDNA3.1, koristeći odgovarajuće prajmere prikazane u gore pomenutoj tabeli. Pored toga, humani CD134 u punoj dužini (SEK ID BR: 1) je takođe ponovo kloniran u ekspresionom plazmidu iz pcDNA3.1.
[0338] Korišćenjem FreeStyle ™ 293 Ekpresionog sistema (Invitrogen), FreeStyle ™ 293 F ćelije (Invitrogen) su prolazno transfektovane sa 5 generisanih varijanti humanog CD134. Nakon 48-72h, ekspresija površinskog humanog CD134 na transfektovanim ćelijama je analizirana FACS analizom. U tu svrhu, transfektovane ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3. Ćelije su inkubirane sa 20,0 μg/mL antihumanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Paralelno, kao negativna kontrola korišćeno je 20,0 μg/ml mišjeg IgG1κ izotipskog kontrolnog antitela (BD Biosciences). Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3-u, ćelije su zatim inkubirane sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0339] Kao što je prikazano na slici 21, oba mišja anti-humana CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 prepoznaju punu dužinu (označenog kao konstrukt 'CRD1') humanog CD134 na transfektovanim 293-F ćelijama, dok oba mišja anti-humana CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 nisu pokazala vezivanje na lažno-transfektovanim 293-F ćelijama. Štaviše, mišja antihumana CD134 antitela klonova 12H3 i 20E5 prepoznaju varijantu skraćenog humanog CD134 kome nedostaje CRD1 i CRD1-CRD2 (označeni kao konstrukt ’CRD2’ i konstrukt ’CRD3’, respektivno) na transfektovanim 293-F ćelijama. Nasuprot tome, vezivanje mišjih anti-humanih CD134 antitela klona 12H3 prema varijanti skraćenog humanog CD134 kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul (označen kao konstrukt ’CRD4’) je bilo veoma slabo, a vezivanje mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 za varijantu skraćenog humanog CD134 kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul-CRD4 subdomen A1-modula (prema definiciji od strane Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) ili alternativno CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1 modul (prema definiciji Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330; označen kao konstrukt ’tcCRD4’) je potpuno odsutno, dok mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 pokazuju snažno vezivanje za varijantu skraćenog humanog CD 134 kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul (označen kao konstrukt ’CRD4’) i protiv skraćene humane CD134 varijante kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul-CRD4 subdomen A1-modul (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) ili alternativno CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-modul (prema definiciji Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330; označen kao 'tcCRD4' konstrukt).
[0340] Ovi rezultati su pokazali da mišja anti-humana CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 specifično prepoznaju humani CD 134 (upoređivanje transfekcije humanog CD 134 u punoj dužini u odnosu na lažnu transfekciju). Štaviše, ovi rezultati su pokazali da izgleda da mišja anti-humana CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5 prepoznaju različite epitope humanog CD 134, što dokazuje odgovarajuće odsustvo vezivanja (korišćenjem klona 12H3) prema snažnom vezivanju (korišćenjem klona 20E5) sa varijantom skraćenog humanog CD 134 kojoj nedostaje CRD1 CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul (označen kao konstrukt 'CRD4') i sa varijantom skraćenog humanog CD 134 kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul-CRD4 poddomen A1-modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) ili alternativno CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1 modul (prema definiciji Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330; označen kao konstrukt 'tcCRD4'). Ovi rezultati pokazuju da mišja antihumana CD 134 antitela klona 12H3 ne izgledaju da prepoznaju humani CD 134 epitop u CRD1 i CRD2, a mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 ne izgledaju da prepoznaju humani CD 134 epitop u CRD1, CRD2 i skraćenom CRD3 A1-modulu-CRD4 subdomenu A1 modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) ili alternativno CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1 modul (prema definiciji Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330). Ovi rezultati pokazuju da izgleda da mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 prepoznaju linearni ili nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1 modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) sa aminokiselinskom sekvencom 108-126 (tj.
19-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVD CA; videti SEK ID BR: 34) na ekstracelularnom humanom CD 134 ili aminokiselinskoj sekvenci 108-126 (tj. 19-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; videti SEK ID BR: 34) formiraju deo za vezivanje za nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1-modulu/CRD4 A1-B1 modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), i eventualno u strukturi sličnoj šarki, sa aminokiselinskom sekvencom 108-214 (videti SEK ID BR: 35) na ekstracelularnom humanom CD 134. Ovi rezultati pokazuju da izgleda da mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 prepoznaju linearni ili nelinearni/ konformacioni epitop u skraćenom CRD4 A1-modulu (prema definiciji Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330), i eventualno u strukturi sličnoj šarki, sa aminokiselinskom sekvencom 147-214 (SEK ID BR: 36) na ekstracelularnom humanom CD 134.
[0341] Koristeći kristalografiju, Compaan i sar. (Structure 2006; 14: 1321-1330) su nedavno otkrili kritično uključivanje CRD1, CRD2 (posebno A1 petlja i momentalnim praćenjem ostataka) i CRD3 (prvenstveno A1 petlja) na humanom CD 134 tokom interakcije OX40 Ligand (CD252)/CD134 (=OX40). Ovo otkriće je u dobroj saglasnosti sa našim nalazima da (1, videti iznad) mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 ne izgledaju da prepoznaju humani CD 134 epitop u CRD1, CRD2 i skraćenom CRD3 A1-modulu-CRD4 poddomenu A1 modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) ili alternativno CRD1-CRD2-CRD3 A1-B1-modulu (prema definiciji Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330) na ekstracelularnom humanom CD 134 i (2, videti iznad) klon 20E5 mišjih anti-humanih CD 134 antitela je vezan istovremeno sa humanim ligandom OX40L na PHA stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134. Ovo je sugerisalo da je klon 20E5 mišjih antihumanih CD 134 antitela prepoznao epitop na humanom CD 134, koji nije bio kritički uključen u interakciju humanog CD 134 sa humanim OX40L. Štaviše, naši nalazi koji su pokazali (1, videti iznad) da izgleda da mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 prepoznaju linearni ili nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1 modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) sa aminokiselinskom sekvencom 108-126 (tj.19-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; videti SEK ID BR: 34) na ekstracelularnom humanom CD 134 ili aminokiselinskom sekvencom 108-126 (tj., 19-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; videti SEK ID BR: 34), formirala su deo za vezivanje za nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1-modulu/CRD4 A1-B1 modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), i eventualno u strukturi sličnoj šarki, sa aminokiselinskom sekvencom 108-214 (videti SEK ID BR: 35) na ekstracelularnom humanom CD 134 i (2, videti iznad) mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 su vezana istovremeno sa humanim OX40L na PHA stimulisanim T limfocitima koji eksprimiraju humani CD 134, potvrđena je ideja da epitop (kao što je gore opisano) na humanom CD 134 koji je prepoznat od strane klona 12H3 mišjih anti-humanih CD 134 antitela, nije bio kritički uključen u interakciju humanog CD 134 sa humanim OX40L.
(c). Mapiranje epitopa (1) mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3 korišćenjem peptida ELISA izvedenog od humanog CD 134
[0342] Da bi se dalje analizirala fina specifičnost mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3, lokacija epitopa prepoznatog od strane mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3 je određena mapiranjem epitopa. Sposobnost anti-humanog CD 134 mišjeg monoklonskog antitela klona 12H3 da se vezuje sa peptidom koji je izveden od humanog CD134, što odgovara aminokiselinoj sekvenci skraćenog CRD3 A1-modula-CRD4 poddomena A1-modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), utvrđeno je pomoću tehnike ELISA.
[0343] Devedeset šest bazenčića ELISA ploča sa ravnim dnom (Corning) je obloženo sa peptidom koji je proizveden od humanog CD 134, pri 10 ng/bazenčić (sintetisan od strane Pepscan Presto, Lelystad, Holandija), što odgovara aminokiselinoj sekvenci skraćenog CRD3 A1-modula-CRD4 poddomena A1 modula (videti SEK ID BR: 38) ili sa kontrolnim peptidom izvedenim od humanog fibronektina od 10 ng/bazenčić (sintetisan od strane Pepscan Presto, Lelystad, Holandija), koji odgovara aminokiselinoj sekvenci strukturnog domena ekstra tipa III (videti SEK ID BR: 37) u PBS o/n na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/0,05% Tween 20, ploče su blokirane u PBS/0,05% Tween 20/1% BSA frakciji V (Roche) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ploče su inkubirane sa 0, 0,00005 - 50,0 μg/mL (10-struki koraci razblaženja u blok-puferu) mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela 12H3 ili kontrolnim antitelom mišjeg IgG1κ izotipa (BD Biosciences), tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon opsežnog pranja u PBS/0,05% Tween 20, vezivanje antitela je određeno sa 1: 5000 razblaženim peroksidazom rena konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG Fcγ specifičnim antitelima (Jackson ImmunoResearch), tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, praćeno rastvorom koji je spreman za upotrebu od TMB supstrata (Invitrogen), za kolorimetrijsku detekciju. Nakon dodavanja 1M H2SO4, optičke gustine su merene na talasnoj dužini od 450 nm (referentna talasna dužina od 655 nm) korišćenjem čitača mikroploče (BioRad).
[0344] Kao što je prikazano na slici 23A (n = 1), mišja anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 zavisno od doze i specifično vezuju peptid dobijen od humanog CD 134, dok kontrolno antitelo mišjeg IgG1κ izotipa nije pokazalo vezivanje za peptid koji je izveden od humanog CD 134. Oba mišja anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 i IgG1κ izotipa kontrolno antitelo nisu pokazala vezivanje za kontrolni peptid koji je proizveden iz fibronektina.
[0345] Ovi rezultati pokazuju da klon 12H3 mišjih anti-humanih CD 134 antitela specifično prepoznaje epitop na humanom CD 134 (poređenje peptida dobijenog od humanog CD134 prema humanom kontrolnom peptidu koji je dobijen iz fibronektina). Osim toga, ovi rezultati su pokazali da se čini da klon 12H3 anti-humanog CD 134 antitela miša prepoznaje linearni ili nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1-modulu-CRD4 poddomenu A1-modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) sa aminokiselinskom sekvencom 108-146 (tj. 39-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPG HFSPGDNQACKPWTN; videti SEK ID BR: 38) na ekstracelularnom humanom CD 134.
(d) Mapiranje epitopa (2) mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 korišćenjem CLIPS tehnologije mapiranja epitopa od strane Pepscana
[0346] CLIPS Epitope Mapping Technology od Pepscana (Lelystad, Holandija), može biti korišćena za određivanje epitopa prepoznatih od strane mišjih anti-humanih CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5. Ova CLIPS tehnologija omogućava određivanje linearnih, konformacionih, diskontinuiranih i složenih epitopa koji uključuju dimerne ili multimerne proteinske komplekse. U ovu svrhu se kao ciljni protein koristi linearna aminokiselinska sekvenca humanog CD 134 = OX40 (SEK ID BR: 1).
Primer 9. Karakterizacija humanih CD 134 domena i epitopa prepoznatih od strane himernih humanih IgG4/kappa i/ili IgG1/kappa anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5
(a). Vezivna himerna humana IgG4κ i/ili IgG1κ anti-humana CD 134 monoklonska antitela klonova 12H3 i 20E5 sa konstruktom humanog CD 134 u punoj dužini i različitim skraćenim humanim CD 134 konstruktima izraženim na 293-F ćelijskoj liniji (mapiranje domena)
[0347] Da bi se analizirala fina specifičnost himernih humanih IgG4κ i/ili IgG1κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5, lokacija epitopa, prepoznatih od strane himernih humanih IgG4κ i/ili IgG1κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 je određena mapiranjem domena. Sposobnost himernih humanih IgG4κ i/ili IgG1κ anti-humanih CD134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 da se vezuju za skraćene humane CD134 konstrukte (videti Primer 8 (b) gore), izražene na površini (dobijene od HEK) 297-F ćelija, određeno je FACS analizom.
[0348] Koristeći FreeStyle ™ 293 Ekspresioni sistem (Invitrogen), FreeStyle ™ 293-F ćelije (Invitrogen) su prolazno transfektovane sa 5 generisanih varijanti humanog CD134 (videti gore). Nakon 48-72h, površinska humana CD134 ekspresija na transfektovanim ćelijama je analizirana FACS analizom. U tom cilju, transfektovane ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3. Ćelije su inkubirane sa ili bez 20,0 μg/mL himernih humanih IgG4κ i/ili IgG1κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su naknadno inkubirane sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0349] Kao što je prikazano na slici 22, oba himerna humana IgG4κ i IgG1κ anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 i himerna humana IgG4κ anti-humana CD134 monoklonska antitela klona 20E5 pokazuju vezivne karakteristike prema različitim skraćenim konstruktima humanog CD 134 na transfektovanim ćelijama, koje su identične sa vezivnim karakteristikama njihovih odgovarajućih kopija klonova 12H3 i 20E5 anti-humanih CD 134 antitela roditeljskog miša (videti primer 8 (b) iznad; za poređenje, videti sliku 22 prema slici 21).
(b). Epitopno mapiranje himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 korišćenjem ELISA peptida dobijenog od humanog CD 134
[0350] Kako bi se dalje analizirala fina specifičnost himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3, lokacija epitopa koji je prepoznat od strane himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 je
1
određena mapiranjem epitopa. Sposobnost himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 da se veže za peptid koji je dobijen od humanog CD134, koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci skraćenog CRD3 A1-modula-CRD4 subdomena A1-modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), je određena pomoću tehnike ELISA.
[0351] Devedeset šest bazenčića ELISA ploča sa ravnim dnom (Corning) je obloženo sa peptidom koji je proizveden od humanog CD 134, pri 10 ng/bazenčiću (sintetisan od strane Pepscan Presto, Lelystad, Holandija), koji odgovara aminokiselinoj sekvenci skraćenog CRD3 A1-modula-CRD4 poddomena A1 modula (videti SEK ID BR: 38) ili sa kontrolnim peptidom dobijenim od humanog fibronektina od 10 ng/bazenčić (sintetisan od strane Pepscan Presto, Lelystad, Holandija), koji odgovara aminokiselinoj sekvenci strukturnog domena ekstra tipa III (videti SEK ID BR: 37) u PBS o/n na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS-u/0,05% Tween-u 20, ploče su blokirane u PBS/0,05% Tween 20/1% BSA frakciji V (Roche) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ploče su inkubirane sa 0, 0,00005 - 50,0 μg/mL (koraci 10-strukog razblaženja u blok-puferu) himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 ili kontrolnog humanog IgG4κ anti-humanog CD40 antitela (Biocult), tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon opsežnog pranja u PBS-u/0,05% Tweenu 20, vezivanje antitela je određeno sa razblaženim 1:5000 peroksidazom rena-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG Fcγ-specifičnim antitelima (Jackson ImmunoResearch), tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, praćeno rastvorom TMB supstrata koji je spreman za upotrebu (Invitrogen) za kolorimetrijsku detekciju. Nakon dodavanja 1 M H2SO4, optičke gustine su merene na talasnoj dužini od 450 nm (referentna talasna dužina od 655 nm) korišćenjem čitača mikroploče (BioRad).
[0352] Kao što je prikazano na slici 23B (n = 1), himerno humano IgG4κ anti-humano CD 134 monoklonsko antitelo klona 12H3 zavisno od doze i specifično vezuje peptid koji je izveden od humanog CD 134, dok kontrolno humano IgG4κ anti-humano CD40 antitelo ne pokazuje vezivanje za peptid koji je izveden od humanog CD 134. Oba, himerno humano IgG4κ antihumano CD 134 monoklonsko antitelo klona 12H3 i kontrolno humano IgG4κ anti-humano CD40 antitelo ne pokazuju vezivanje za kontrolni peptid koji je dobijen iz humanog fibronektina.
[0353] Ovi rezultati pokazuju da su himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 monoklonska antitela klona 12H3 specifično prepoznala epitop na humanom CD 134 (upoređivanje peptida izvedenog iz humanog CD 134 prema kontrolnom peptidu izvedenom iz humanog fibonektina). Osim toga, ovi rezultati pokazuju da se činilo da himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134
1 1
monoklonska antitela klona 12H3 prepoznaju linearni ili nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1-modulu-CRD4 poddomenu A1-modula (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) sa aminokiselinskom sekvencom 108-146 (tj., 39-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGD NQACKPWTN; videti SEK ID BR: 38) na ekstracelularnom humanom CD 134.
Primer 10. Generisanje humanizovanih IgG4/kappa anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3
[0354] Na osnovu utvrđenih V-regiona glodara (videti Primer 2 (b) iznad) od mišjih antihumanih CD 134 antitela klonova 20E5 i 12H3, generisane su verzije humanizovanog antitela.
[0355] Sekvence humanizovanog varijabilnog lakog lanca i sekvence humanizovanog varijabilnog teškog lanca od mišjih anti-humanih CD 134 antitela klonova 20E5 i 12H3 su dobijene korišćenjem PDL tehnologije (izvedene od strane Panaroma Research Institute, Sunnyvale, CA, USA). Za aminokiselinske sekvence humanizovanog varijabilnog lakog lanca i varijabilnog teškog lanca, videti SEK ID BR-a: 62 (20E5-VL1), 63 (20E5-VL2), 64 (20E5-VH1), 65 (20E5-VH2), 66 (20E5-VH3) i SEK ID BR. 67 (12H3-VL1), 68 (12H3-VL2), 69 (12H3-VH1), 70 (12H3-VH2), 71 (12H3 -VH3).
[0356] Nakon ovog dizajna, Cricetulus griseus-optimizovane sekvence cDNK (videti SEK ID BR-a: 72, 73, 74 (kodirajuće za verzije humanizovanog teškog IgG4 lanca pune dužine klona 20E5, tj. VH1, VH2, VH3, respektivno), SEK ID BR 75, 76 (kodirajuće za humanizovane lake κ lance pune dužine verzija klona 20E5, tj.20E5_VL1, 20E5_VL2, respektivno), SEK ID BR-a: 77, 78, 79 (kodirajuće za humanizovane teške IgG4 lance pune dužine verzija klona 12H3, tj. VH1, VH2, VH3, odnosno), i SEK ID BR: 80, 81 (kodirajuće za humanizovani laki κ lanac verzija klona 12H3, tj. VL1, VL2, odnosno)), su bile naručene kod GENEART (Regensburg, Nemačka), koje kodiraju za signalni peptid što je praćeno ili humanizovanim varijabilnim teškim lancem koji je povezan sa konstantnim regionom humanog IgG4 ili praćeno humanizovanim varijabilnim lakim lancem vezanim za konstantni region humanog kappa: (1) za ekspresiju humanizovanih anti-humanih CD 134 antitela verzija klona 20E5, korišćen je signalni peptid teškog lanca mišjeg imunoglobulina i za humanizovane teške i lake lance i (2) za ekspresiju humanizovanih anti-humanih CD 134 antitela verzija klona 12H3 verzija, korišćen je signalni peptid teškog lanca humanog imunoglobulina za humanizovane teške lance i signalni peptid kappa lanca humanog imunoglobulina za humanizovane lake lance. Osim toga, sva humanizovana antitela su izražena kao stabilizovane humane IgG4 molekule prema Angal
1 2
i sar. (Mol. Immunol., Vol.30, Br.1, str. 105-108, 1993). Koristeći odgovarajuće restrikcione enzime, generisane cDNK su subklonirane u pcDNA3.1 izvedenim ekspresionim plazmidima.
[0357] Humanizovane verzije anti-humanih CD 134 antitela klona 20E5 su izražene upotrebom FreeStyle ™ MAX CHO Ekpresionog sistema (Life Technologies). Humanizovane verzije antihumanih CD 134 antitela klona 12H3 su izražene korišćenjem FreeStyle ™ 293 Ekpresionog sistema (Life Technologies). Generisana humanizovana antitela su prečišćena korišćenjem kolona afinitetne hromatografije proteina A (GE Healthcare). Na taj način je generisano šest prečišćenih humanizovanih verzija antitela klona 20E5, tj. 20E5_VL1VH1, 20E5_VL1VH2, 20E5_VL1VH3, 20E5_VL2VH1, 20E5_VL2VH2 i 20E5_VL2VH3, i generisano je šest prečišćenih humanizovanih verzija antitela klona 12H3, tj. 12H3_VL1VH1, 12H3_VL1VH2, 12H3_VL1VH3, 12H3_VL2VH1, 12H3_VL2VH2 i
12H3_VL2VH3.
[0358] Za humanizovane aminokiselinske sekvence, videti SEK ID BR-a: 82, 83, 84 (kodirajuće za verzije humanizovanog teškog IgG4 lanca pune dužine klona 20E5, tj. VH1, VH2, VH3, resp.), SEK ID BR. 85, 86 (kodirajuće za verzije humanizovanog lakog κ lanca pune dužine klona 20E5, tj. VL1, VL2, resp.), SEK ID BR. 87, 88, 89 (kodirajuće za verzije humanizovanog teškog IgG4 lanca pune dužine klona 12H3, tj. VH1, VH2, VH3, resp.) i SEK ID BR.90, 91 (kodiranje za verzije humanizovanog lakog κ lanca pune dužine klona 12H3, tj. VL1, VL2, resp.).
Primer 11. Karakterizacija vezivanja humanizovanih IgG4/kapa anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3
(a). Vezivanje humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3 sa rekombinantnim humanim CD134: humanim Fcγ fuzionim proteinom (ELISA)
[0359] Devedeset šest bazenčića ploča sa ravnim dnom ELISA (Corning) je obloženo sa 50 ng/bazenčiću rekombinantnog humanog CD134: humanog Fcγ (IgG1) fuzionog proteina (R&D Systems) u PBS-u o/n na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/0,05% Tween 20, ploče su blokirane u PBS/0,05% Tween 20/1% BSA frakciji V (Roche) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ploče su inkubirane sa 0, 0,0003 - 20,0 μg/mL (koraci 3-strukog razblaženja u blok puferu) anti-humanog CD 134 antitela roditeljskog miša klona 20E5 ili 12H3, himernim humanim IgG4κ anti-humanim CD 134 antitelima klona 20E5 ili 12H3, i šest verzija humanozivanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 20E5 ili 12H3, tokom 1 sata
1
na sobnoj temperaturi. Nakon opsežnog pranja u PBS/0,05% Tween-u 20, vezivanje antitela je određeno sa razblaženim 1:5000 peroksidaza ren-konjugovanim kozjim anti-mišjim (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch), ili sa 1: 4000 razblaženim peroksidaza renkonjugovanim kozjim anti-humanim κ-specifičnim antitelima (Southern Biotech) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, praćeno rastvorom TMB supstrata koji je spreman za upotrebu (Invitrogen) za kolorimetrijsku detekciju. Nakon dodavanja 1 M H2SO4, optičke gustine su merene na talasnoj dužini od 450 nm (referentna talasna dužina od 655 nm) korišćenjem čitača mikroploče (BioRad).
[0360] Kao što je prikazano na slici 28 (n = 2), himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 i svih šest verzija humanizovanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 zavisno od doze i specifično su vezana za rekombinantni humani CD 134. Himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 i humanizovana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 verzija 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2 i 20E5_VL2VH3 pokazuju identične titracione krive, što ukazuje da je njihov afinitet vezivanja antigena CD 134 bio identičan (polu-maksimalno vezivanje EC50≈ 100 ng/ mL), dok su humanizovana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 verzija 20E5_VL1H1 i 20E5_VL1H2 izgledala da pokazuju neznatno niži afinitet vezivanja (EC50≈ 150 ng/mL). Zbog upotrebe različitih sekundarnih antitela specifičnih za imunoglobulinski lanac (tj. antitela miša su detektovana sa specifičnim antitelima protiv Fcγ lanca, dok su himerna humana i humanizovana antitela detektovana sa specifičnim antitelima protiv κ lanca), upoređivanje između titracione krive (podaci nisu pokazano) od anti-humanog CD 134 antitela roditeljskog miša klona 20E5 i krivih titracije iz himernih humanih i verzija humanizovanih IgG4κ antihumanih CD 134 antitela klona 20E5 nije moglo biti napravljeno.
[0361] Kao što je prikazano na slici 29 (n = 2), himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i svih šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 zavisno od doze i specifično su vezana za rekombinantni humani CD 134. Klon 12H3 himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela i klon 12H3 humanizovanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela - svih šest verzija 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 i 12H3_VL2VH3 - pokazuju titracione krive koje nisu identične, što je ukazalo da je svih šest verzija humanizovanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 pokazalo nešto veći afinitet vezivanja antigena CD 134 (EC50≈ 50 ng/mL) od himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 (EC50≈ 100 ng/mL). Zbog upotrebe različitih sekundarnih antitela specifičnih za imunoglobulinski lanac (tj. mišja antitela su detektovana sa specifičnim antitelima protiv Fcγ lanca, dok su himerna
1 4
humana i humanizovana antitela detektovana sa specifičnim antitelima protiv κ lanca), poređenje između titracione krive (podaci nisu prikazani) od anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 roditeljskog miša i krivih titracije od himernih humanih i verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 nije moglo biti napravljeno.
(b). Kompeticija humanizovanog IgG4κ anti-humanog CD134 monoklonskog antitela klona 12H3 sa biotinilovanim roditeljskim mišjim anti-humanim CD 134 monoklonskim antitelima klona 12H3 za vezivanje sa rekombinantnim humanim CD134: humanim Fcγ fuzionim proteinom (ELISA).
[0362] Pre izvođenja ELISA merenja konkurencije, utvrđeno je da je EC50biotinilovanog (koristeći N-hidroksisukcinimido-biotin od Pierca) anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 roditeljskog miša (videti niže za metodu) i identifikovan je da iznosi oko 20 ng/mL (videti sliku 30, n = 3). Zamena biotinilovanog anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 roditeljskog miša na identifikovanoj EC50koncentraciji neobeleženim antihumanim CD 134 antitelima klona 12H3 roditeljskog miša, himernim humanim IgG4κ antihumanim CD 134 antitelima klona 12H3 i šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 je naknadno istražena.
[0363] Devedeset šest bazenčića ploča sa ravnim dnom ELISA (Corning) je obloženo sa 50 ng/bazenčić rekombinantnog humanog CD134 : humanog Fcγ (IgG1) fuzionog proteina (R&D Systems) u PBS-u o/n na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS-u/0,05% Tween-u 20, ploče su blokirane u PBS/0,05% Tween 20/1% BSA frakciji V (Roche) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ploče su inkubirane sa 0, 0,001 - 60,0 (koraci 3-strukog razblaženja u blok puferu) μg/mL neobeleženog anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 roditeljskog miša, himernim humanim IgG4κ anti-humanim CD 134 antitelima klona 12H3, ili šest verzija humanozivanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 u kombinaciji sa 20 ng/mL (EC50) biotinilovanog anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela roditeljskog miša klona 12H3, tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon opsežnog pranja u PBS-u/0,05% Tween-u 20, vezivanje biotinilovanog anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 roditeljskog miša je određeno sa razblaženim 1:5000 peroksidazom rena-streptavidinom (Jackson ImmunoResearch), tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, praćeno rastvorom TMB supstrata koji je spreman za upotrebu (Invitrogen) za kolorimetrijsku detekciju. Nakon dodavanja 1 M H2SO4, optičke gustine su merene na talasnoj dužini od 450 nm (referentna talasna dužina od 655 nm) korišćenjem čitača mikroploče (BioRad).
1
[0364] Kao što je prikazano na slici 31 (n = 2), neobeležena anti-humana CD134 antitela klona 12H3 roditeljskog miša i neobeležena himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 su pokazala identično pomeranje biotinilovanog anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 roditeljskog miša, što ukazuje na to da je klon 12H3 antihumanog CD 134 antitela roditeljskog miša i klon 12H3 himernog humanog IgG4κ antihumanog CD 134 antitela ispoljio identičan afinitet vezivanja antigena CD 134 (polumaksimalno pomeranje ili inhibicija (IC50) biotinilovanog anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 roditeljskog miša pri ≈ 750 ng/mL). Svih šest verzija neobeleženih humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD134 antitela klona 12H3 - 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 i 12H3_VL2VH3 - je pokazalo slično razmeštanje biotinilovanog anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 roditeljskog miša, što je pokazalo da je svih šest verzija neoznačenih humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 ispoljilo sličan afinitet za vezivanje antigena CD 134 (IC50≈ 250-300 ng/mL).
[0365] Ovi rezultati pokazuju da svih šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 pokazuje veći afinitet vezivanja antigena CD 134 od roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3 i himernog humanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 12H3.
(c). Vezivanje humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3 sa konstruktom humanog CD 134 u punoj dužini, izraženog na 293-F ćelijskoj liniji (FACS)
[0366] Da bi se detaljno analiziralo vezivanje humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3, kapacitet vezivanja humanizovanih IgG4κ antihumanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 20E5 i 12H3 sa površinskim humanim CD 134 pune dužine na (stabilno transfektovanim) 293-F ćelijskim linijama je određen protočnom citometrijom i, pored toga, upoređen sa karakteristikama vezivanja njihovih odgovarajućih kopija roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela.
[0367] Celokupni humani CD134 (SEK ID BR: 1) je ponovo kloniran u ekspresionom plazmidu dobijenom iz pcDNA3.1 (videti Primer 11 (d) niže). Ovaj celokupni humani CD 134 plazmid je transfektovan u FreeStyle ™ 293-F ćelijama (Life Technologies) koristeći FreeStyle ™ 293 Ekpresioni sistem (Life Technologies). Stabilne humane transfektovane ćelije sa humanim CD 134 u punoj dužini (klon br.5 sa visokim nivoom ekspresije površinskog CD 134 i klon br.23
1
sa srednjim nivoom ekspresije površinskog CD 134; videti sliku 32) su odabrani korišćenjem 125 μg/mL G418 (Gibco) i sakupljeni i stavljeni pri 1- 2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3, dopunjen sa 50 μg/mL prečišćenog humanog IgG (Sigma; blokirajući Fcγ receptore). Ćelije su inkubirane sa 0, 0,005-50 μg/mL (10-struki postupci razblaženja u PBS/BSA/NaN3; sve verzije klona 20E5) ili 0,002-20 μg/mL (10-struki postupci razblaženja u PBS/BSA/NaN3; sve verzije klona 12H3) roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 20E5 ili 12H3, himernim humanim IgG4κ anti-humanim CD 134 antitelima klona 20E5 ili 12H3 i šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 20E5 ili 12H3 tokom 30 minuta na 4 ° C. Paralelno, kontrola mišjeg IgG1 κ izotipa (BD Biosciences; 50,0 ili 20,0 μg/mL) i kontrola himernog humanog IgG4κ izotipa (klon ch5D12 od PanGenetics; 50,0 ili 20,0 μg/mL) su korišćene kao negativne kontrole. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su naknadno inkubirane sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch) ili sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon znatnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3,tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno protočnom citometrijom (FACSCalibur, BD Biosciences).
[0368] Kao što je prikazano na slici 33 (ćelije klona broj 5 transfektovane sa humanim CD 134 u punoj dužini sa visokim nivoom ekspresije površinskog humanog CD 134; n = 1), roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 i svih šest verzija humanizovanog IgG4κ anti-humanog CD 134 antitela klona 20E5 se u zavisnosti od doze i specifično vezuju za ćelijsku površinu izraženog humanog CD134. Roditeljska mišja anti-humana CD134 antitela klona 20E5, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 i humanizovana IgG4κ anti-humana CD134 antitela klona 20E5 verzija 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2 i 20E5_VL2VH3 su pokazala slične krive titracije, što ukazuje na to da je njihov afinitet vezivanja antigena CD134 veoma sličan, dok su humanizovana IgG4κ anti-humana CD134 antitela klona 20E5 verzija VL1H1 i VL1H2 pokazala neznatno niži afinitet vezivanja.
[0369] Kao što je prikazano na slici 34 (ćelije klona broj 5 transfektovane sa humanim CD 134 u punoj dužini sa visokim nivoom ekspresije površinskog humanog CD 134; n = 2), roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i svih šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 se zavisno od doze i specifično vezuju za ćelijsku površinu izraženog humanog CD134. Roditeljska mišja anti-humana CD134 antitela klona 12H3, himerna humana IgG4κ
1
anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i humanizovana IgG4κ anti-humana CD134 antitela klona 12H3 verzija 12H3_VL2H1 i 12H3_VL2VH3, su pokazala identične titracione krive, što ukazuje da je njihov afinitet vezivanja antigena CD134 identičan, dok su humanizovana IgG4κ anti-humana CD134 antitela klona 12H3 verzija 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3 i 12H3_VL2H2 izgledala da pokazuju neznatno veći afinitet vezivanja.
[0370] Kao što je prikazano na slici 35 (ćelije transfektovane sa humanim celokupnim CD134 klona br.23 sa srednjim nivoom ekspresije površinskog humanog CD 134; n = 2), roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i svih šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 se u zavisnosti od doze i specifično vezuju za ćelijsku površinu izraženog humanog CD134. Roditeljska mišja anti-humana CD134 antitela klona 12H3 i himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 pokazuju slične titracione krive, što ukazuje da je njihov afinitet vezivanja antigena CD 134 sličan (EC50> 200 ng/mL), dok je svih šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD134 antitela klona 12H3 - 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 i 12H3_VL2VH3 - izgledalo da pokazuje veći afinitet vezivanja (EC50< 200 ng/mL).
[0371] Kolektivno, ovi rezultati protočne citometrije su pokazali da humanizovana IgG4κ antihumana CD 134 antitela klona 20E5 verzija 20E5_VL1H3, 20E5_VL2H1, 20E5_VL2VH2, 20E5_VL2VH3, roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 i himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 pokazuju sličan afinitet za vezivanje antigena CD 134 dok humanizovana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 verzija 20E5_VL1H1 i 20E5_VL1H2 izleda da pokazuju neznatno niži afinitet vezivanja antigena CD 134. Pored toga, ovi rezultati pokazuju da je svih šest verzija humanizovanih IgG4κ antihumanih CD 134 antitela klona 12H3 pokazalo veći afinitet vezivanja antigena CD 134 od roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 i himernih humanih IgG4κ antihumanih CD 134 antitela klona antitela 12H3.
(d). Vezivanje humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 sa konstruktom humanog CD 134 u punoj dužini i različitim skraćenim humanim CD134 konstruktima izraženim na 293-F ćelijskoj liniji (mapiranje FACS domena).
[0372] Da bi se analizirala fina specifičnost humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5, lokacija epitopa prepoznata od strane humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 je
1
određena mapiranjem domena. Sposobnost humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5 da se vezuju za skraćene konstrukte humanog CD134, izražene na površini 297-F ćelija (izvedenih iz HEK-a), utvrđene su protočnom citometrijskom analizom.
[0373] Na osnovu literature (Swiss-Prot: P43489.1; Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683; Bodmer i sar. Trends Biochem Sci 2002; 27: 19-26; Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330; US Patent Publ. Br. 2011/0028688), identifikovani su domeni bogati cisteinom (CRD) i struktura nalik šarki u ekstracelularnom regionu humanog CD134. CRD domeni su kodirani CRD1, CRD2, (skraćeni) CRD3, (skraćeni) CRD4 (videti sliku 20). CRD domeni sadrže topološki različite tipove modula, nazvane A-modulom i B-modulom (videti takođe, sliku 20). A-moduli su strukture u obliku C, a B-moduli su strukture u obliku S. Tipičan CRD je obično sastavljen od A1-B2 modula ili A2-B1 modula (ili, ređe, različitog para modula, poput A1-B1) sa 6 očuvanih ostataka cisteina, pri čemu broj označava broj disulfidnih mostova unutar svakog modula (videti takođe sliku 20). Kao što je prikazano na slici 20, generisana su i izražena 3 različita humana CD 134 konstrukta: (1) konstrukt humanog CD 134 u punoj dužini, koji počinje sa N-terminalnim CRD1 (tj. CRD1 A1-B2 modul pokriva aminokiseline 29-65), i stoga je označen kao 'CRD1' i sastoji se od aminokiselina 1-277 (videti SEK ID BR: 1), (2) konstrukt 'CRD3', koji počinje sa N-terminalnim CRD3 (tj. CRD3 A1-B1 modul obuhvata aminokiseline 108-146 (prema Compaan i sar. Structure 2006; 14: 1321-1330) ili skraćeni CRD3 A1-modul pokriva aminokiseline 108-126 (prema Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683)) i sastoji se od aminokiselina 108-277 vezane za aminokiseline 1-28 signalnog peptida (videti SEK ID BR: 31), (3) konstrukt 'CRD4', koji se sastoji od N-terminalnog CRD4 ili CRD3 poddomena B1-modula/skraćenog CRD4 A1-modula (tj. CRD4 A1-B1 modul pokriva aminokiseline 127-167 (Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) ili kombinacija (nije prikazano na slici 20) CRD3 poddomena B1-modula sa skraćenim CRD4 A1-modulom pokriva aminokiseline 127-146 sa aminokiselinama 147-167, respektivno (Compaan i sar., Structure 2006; 14: 1321-1330)) i obuhvata aminokiseline 127-277 vezane za aminokiseline 1-28 signalnog peptida (videti SEK ID BR: 32). Sabiranjem PCR-a pomoću Accuprime ™ Pfx DNK polimeraze (Invitrogen), generisana su ova 3 konstrukta humanog CD 134 korišćenjem prajmera prikazanih u Tabeli 2.
Tabela 2.
1
Ukratko, cDNK koja kodira aminokiseline 1-28 signalnog peptida i cDNK koja kodira aminokiseline 66-277 humanog CD 134, su amplifikovane korišćenjem odgovarajućeg para prajmera 362/367 i 366/363 u PCR reakciji sa humanim CD 134 u punoj dužini kao templejt. Nakon toga, konstrukt 'CRD3' je generisan korišćenjem ova dva PCR proizvoda u PCR sakupljanju korišćenjem para prajmera 362/363. cDNK koja kodira konstrukt 'CRD3' je subklonirana u ekspresionom plazmidu izvedenom iz pcDNA3.1 korišćenjem pogodnih mesta restrikcije. Slično tome, konstrukt 'CRD4' (aminokiseline 1-28 signalnog peptida vezanog za aminokiselinu 127-277) je generisan i subkloniran u pcDNA3.1 izvedenim ekspresionim plazmidima koristeći odgovarajuće prajmere prikazane u gore navedenoj tabeli. Osim toga, humani CD 134 u punoj dužini (SEK ID BR: 1) takođe je ponovo kloniran u ekspresionom plazmidu izvedenom iz pcDNA3.1.
[0374] Koristeći FreeStyle ™ 293 Ekspresioni sistem (Life Technologies), FreeStyle ™ 293-F ćelije (Life Technologies) su prolazno transfektovane sa 3 generisane varijante humanog CD 134. Nakon 48 sati, površinska humana CD 134 ekspresija na transfektovanim ćelijama je analizirana FACS analizom. U tom cilju, transfektovane ćelije su sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3dopunjen sa 50 μg/mL prečišćenog humanog IgG-a (Sigma; blokirajući Fcγ receptore). Ćelije su inkubirane sa 20,0 μg/mL roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klonova 12H3 i 20E5, sa 20,0 μg/mL himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5, sa 20,0 μg/mL šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 i sa 20,0 μg/mL humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 20E5 verzije 20 E5_VL1VH1, tokom 30 minuta na 4 ° C. Paralelno, kao negativne kontrole korišćeno je 20,0 μg/mL mišjih IgG1κ izotipskih kontrola (BD Biosciences) i 20,0 μg/mL himernih humanih
11
IgG4κ izotipskih kontrola (klon ch5D12 iz PanGenetics). Posle znatnog pranja u PBS/BSA/ NaN3, ćelije su zatim inkubirane sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch) ili sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su naknadno inkubirane sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG (Fcγ specifičnim) antitelima (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA /NaN3tokom 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje antitela je mereno protočnom citometrijom (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0375] Kao što je prikazano na slici 36, roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i svih šest humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 prepoznaju humani CD 134 u punoj dužini (označen kao konstrukt ’CRD1’) i skraćenu varijantu humanog CD 134 kojoj nedostaje CRD1-CRD2 (označen kao konstrukt ’CRD3') na transfektovanim 293-F ćelijama, dok roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3, himerna humana IgG4κ antihumana CD 134 antitela klona 12H3 i svih šest humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 nisu pokazala vezivanje za lažno-transfektovane 293-F ćelije. Nasuprot tome, vezivanje roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3, himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3, i svih šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 prema varijanti humanog CD134 kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul (označen kao konstrukt 'CRD4' ) je bilo veoma slabo ili negativno, dok su roditeljska mišja anti-humana anti-human CD 134 antitela klona 20E5 pokazala jako vezivanje prema ovoj varijanti skraćenog humanog CD134 kome nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul (označen kao 'CRD4' konstrukt) na transfektovanim 293-F ćelijama, što je potvrdilo da su ove poslednje 293-F ćelije izrazile ovu verziju površinskog skraćenog CD 134.
Kao što je prikazano na slici 37, roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 i humanizovana IgG4κ antihumana CD 134 antitela klona 20E5 verzije 20E5_VL1VH1 prepoznaju humani CD 134 u punoj dužini (označen kao 'CRD1' konstrukt), skraćenu varijantu humanog CD 134 u kojoj nedostaje CRD1-CRD2 (označen kao 'CRD3' konstrukt) i skraćenu varijantu humanog CD 134 u kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul (označen kao 'CRD4' konstrukt) na transfektovanim 293-F ćelijama, dok roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5, himerna humana IgG4κ anti-humana CD134 antitela klona 20E5 i humanizovana IgG4κ anti-humana CD134 antitela klona 20E5 verzije 20E5_VLVH1 nisu pokazivala nikakvo vezivanje na lažno-transfektovanim 293-F ćelijama.
[0376] Ovi rezultati su pokazali da roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klonova 12H3 i 20E5, svih šest humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 i humanizovana IgG4κ antihumana CD 134 antitela klona 20E5_VL1VH1 specifično prepoznaju humani CD134 (poređenje transfekcije humanog CD 134 u punoj dužini prema lažnoj transfekciji). Štaviše, ovi rezultati su pokazali da se činilo da klonovi 12H3 i 20E5 anti-humanih CD 134 antitela prepoznaju različe epitope humanog CD 134, što dokazuje odgovarajuće nepostojanje vezivanja (korišćenjem klona 12H3) prema jakom vezivanju (korišćenjem klona 20E5) sa varijantom skraćenog humanog CD 134 u kojoj nedostaje CRD1-CRD2-skraćeni CRD3 A1-modul (označen kao konstrukt ’CRD4’). Ovi rezultati pokazuju da klon 12H3 mišjih antihumanih CD134 antitela, klon 12H3 himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela, i klon 12H3 svih šest humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela nisu izgledali da prepoznaju epitop humanog CD 134 u CRD1 i CRD2. Mišja anti-humana CD 134 antitela klona 20E5, himerna humana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 i humanizovana IgG4κ anti-humana CD 134 antitela klona 20E5 VL1VH1 nisu izgledala da prepoznaju epitop humanog CD 134 u CRD1, CRD2 i skraćenom CRD3 A1-modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683). Ovi rezultati su pokazali da su klon 12H3 mišjih antihumanih CD134 antitela, klon 12H3 himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD134 antitela i klon 12H3 svih šest humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela izgledali da prepoznaju linearni ili nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1-modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) sa aminokiselinskom sekvencom 108-126 (tj. 19-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; videti SEK ID BR: 34) na ekstracelularnom humanom CD 134 ili aminokiselinskom sekvencom 108-126 (tj., 19-merni peptid RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; videti SEK ID BR: 34), formirali deo za vezivanje za nelinearni/konformacioni epitop u skraćenom CRD3 A1-modulu/CRD4 A1-B1 modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) i moguće u strukturi sličnoj šarki, sa aminokiselinskom sekvencom 108-214 (videti SEK ID BR: 35) na ekstracelularnom humanom CD 134. Ovi rezultati pokazuju da se činilo da klon 20E5 mišjih anti-humanih CD 134 antitela, klon 20E5 himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela i klon 20E5_VL1VH1 humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela prepoznaju linearni ili nelinearni/konformacioni epitop u CRD4 A1-B1 modulu (prema definiciji Latza i sar. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), i moguće u strukturi sličnoj šarki, sa aminokiselinskom sekvencom 127-214 (SEK ID BR: 92) na ekstracelularnom humanom CD 134.
(e). Kompetiticija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3 sa biotinilovanim roditeljskim mišjim anti-humanim CD 134 monoklonskim antitelima klona 12H3 za vezivanje sa površinskim humanim CD 134 na stabilno transfektovanoj ćelijskoj liniji 293-F klona br.5 (FACS)
[0377] Pre izvođenja kompeticionih protočnih citometrijskih merenja, određen je EC50biotinilovanog (korišćenjem N-hidroksisukcinimido-biotina od Pierce) roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 (videti niže za metodu) i identifikovan je da bude oko 700 ng/mL (videti sliku 38, n = 2). Pomeranje biotinilovanog roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 pri identifikovanoj koncentraciji EC50pomoću neobeleženih roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3, himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 i šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 je naknadno ispitivano.
[0378] Celokupni humani CD 134 (SEK ID BR 1) je ponovo kloniran u ekspresionom plazmidu dobijenom iz pcDNA3.1 (videti Primer 11 (c) gore). Ovaj celokupni humani CD 134 plazmid je transfektovan u FreeStyle ™ 293-F ćelije (Life Technologies) korišćenjem FreeStyle ™ 293 Ekspresionog sistema (Life Technologies). Stabilne transfektovane ćelije sa celokupnim humanim CD134 (klon broj 5 sa visokim nivoom nivoa ekspresije površinskog CD 134 videti sliku 32) su odabrane korišćenjem 125 μg/mL G418 (Gibco) i sakupljene i stavljene pri 1-2x10<6>ćelija/mL u ledeno ohlađeni PBS/BSA/NaN3dopunjen sa 50 μg/mL prečišćenog humanog IgG-a (Sigma; blokirajući Fcγ receptore). Ćelije su inkubirane sa 0,003 - 50,0 μg/mL (5-struki koraci razblaženja u PBS/BSA/NaN3) neobeleženih roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3, himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 i šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 u kombinaciji sa 700 ng/mL (EC50) biotinilovanih roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 monoklonskih antitela klona 12H3, tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3, određeno je vezivanje biotinilovanog roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 sa 1: 200 razblaženim PE-konjugovanim streptavidinom (Jackson ImmunoResearch), tokom 30 minuta na 4 ° C. Nakon opsežnog pranja u PBS/BSA/NaN3, ćelije su fiksirane u 2% formaldehida u PBS/BSA/NaN3u trajanju od 30 minuta na 4 ° C. Vezivanje
11
biotinilovanog roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog klona 12H3 je mereno korišćenjem protočne citometrije (FACSCalibur; BD Biosciences).
[0379] Kao što je prikazano na slici 39 (n = 2), neobeležena roditeljska mišja anti-humana CD 134 antitela klona 12H3 i neobeležena himerna humana IgG4κ anti-humana CD134 antitela klona 12H3 su pokazala identično pomeranje biotinilovanog roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3, što ukazuje da su klon 12H3 roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela i klon 12H3 himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela pokazali identičan afinitet za vezivanje antigena CD 134 (polu-maksimalno pomeranje ili inhibiciju (IC50) biotinilovanog roditeljskog mišjeg anti-humanog CD 134 monoklonskog antitela klona 12H3 pri ≈ 3,5 μg/mL). Svih šest neobeleženih humanizovanih IgG4κ antihumanih CD134 antitela klona 12H3 verzija - 12H3_VL1H1, 12H3_VL1H2, 12H3_VL1H3, 12H3_VL2H1, 12H3_VL2VH2 i 12H3_VL2VH3 - pokazuju identično pomeranje biotinilovanog roditeljskog mišjeg anti-humanog CD134 monoklonskog antitela 12H3, što je ukazalo na to da svih šest verzija neobeleženih humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 pokazuje identičan afinitet za vezivanje antigena CD 134 (IC50≈ 1,5 μg/mL).
[0380] Ovi rezultati pokazuju da je svih šest verzija humanizovanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 pokazalo veći afinitet vezivanja antigena CD134 od roditeljskih mišjih anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3 i himernih humanih IgG4κ anti-humanih CD 134 antitela klona 12H3.
Primer 12. Anti-CD 134 antitela suzbijaju ekspresiju FOX3P u Treg ćelijama
[0381] Izolacija i širenje Treg-a: Leukopak su kupljeni od Biological Specialties (Colamar, PA) i crvena krvna zrnca su lizirana sa ACK puferom (Stemcell technologies, Vankuver, BC, Kanada) na ledu. Ćelije su isprane i resuspendovane u AutoMACS puferu. Treg-i su izolovani sa CD4 CD25 CD127dim / - Treg kompletom na AutoMACS Pro i / ili LD kolonama sa QuadroMACS, sve iz kompanije Miltenyi Biotech (San Diego, CA) praćenjem uputstva proizvođača. Treg-i su prebrojani i 1x10<6>Treg-a/bazenčić su prošireni na pločama sa 24 bazenčića u TexMACS medijumu sa Treg ekspanzionim granulama (čestice MACSiBead prethodno napunjenim sa CD3 i CD28 antitelima, Miltenyi Biotech) u skladu sa uputstvima proizvođača. Ćelije su kultivisane pri odnosu od 4 zrna/ćelija u prisustvu ~500 IU/mL IL-2 i Rapamicina (100 nM).5 dana nakon izolacije, ćelije su prenete na ploču od 6 bazenčića i 40 μl zrna/bazenčiću i dodat je medijum sa IL-2 (500 IU/ml) i Rapamicinom (100 nM). Medijum koji sadrži IL-2 je dodat po potrebi i ćelije su prenete na okruglim pločicama od 10 mm i dalje se proširile. Nakon 30 dana, zrna su uklonjena MACSiMAG-om pre nishodnih primena.
[0382] Aktivacija Trega: Prošireni Treg-i su obeleženi sa Celltrace Violetom prema uputstvima proizvođača (Life Technologies, Grand Island, NY). 1,5x10<5>povećanih Treg-a i 3x10<5>Treg ekspanzionih zrnaca (čestice MACSiBead prethodno napunjene sa CD3 i CD28 antitelima, Miltenyi Biotech) su nanesene na pločama sa okruglim dnom sa 96 bazenčića i inkubirane na 37 ° C u X-VIVO 15 medijumu dopunjenom sa 5% serumom, 1% Pen-Strep i ~500 IU/ml IL-2 sa ili bez 12H3 (0,5 i 5 μg/ml) i/ili humanim OX40L (1 μg/ml, R&D sistemi) i anti-His mAt (1 μg/ml, R&D sistemi). Nakon 3 dana, ćelije su ponovo stimulisane koktelom aktivacije leukocita, sa BD GolgiPlug-om (2 μL/ml, BD Biosciences, San Jose, CA) tokom 5 sati, isprane i obojene sa kompletom za bojenje mrtvih ćelija LIVE/DEAD®Fixable Near-IR (Life Technologies) prema uputstvima proizvođača. Ćelije su isprane jedanput i intracelularno bojenje je izvršeno nakon fiksacije/permeabilizacije sa Foxp3 / Puferskim setom za bojenje transkripcionog faktora (eBioscience, San Diego, CA) prema proizvođačkom protokolu. Korišćena su sledeća antitela: CD3 V500 (klon SP34-2, BD Biosciences); FOXP3 PE (klon 206D, Biolegend); CD4 PerCP (klon OKT4, Biolegend); i OX40 (klon ACT35, eBioscience). Ćelije su inkubirane tokom 30 minuta na 4 ° C i isprane. Ćelije su propuštene u BD Canto protočnom citometru (BD Biosciences) i analizirane korišćenjem FlowJo (Ashland, OR), propuštanjem na živim singletima CD3+ CD4+. Zabeležen je geometrijski srednji intenzitet fluorescencije izveden iz anti-FOXP3 PE (R-Fikoeritrin) (geoMFI).
[0383] Slika 40 pokazuje da su i mišja anti-humana CD 134 antitela 12H3 (IgG1) i humani OX40L smanjili ekspresiju FOXP3 u proširenim Treg-ima (CD4+ CD25- CD127 dim/-). Kada su korišćeni u kombinaciji 12H3 i OX40L, efekat na supresiju ekspresije FOXP3 je bio dodatni. Rezultati pokazuju da mišja anti-humana antitela 12H3 direktno utiču na Treg funkciju, a ne samo kroz njihovu ulogu na efektorne T ćelije. Podaci predstavljaju triplikat uzorka od jednog donora.
Primer 13. Humanizovana anti-CD134 antitela vezana za ploču poboljšavaju Treg-u supresiju od strane Tefek ćelija
[0384] Procenjen je efekat humanizovanih anti-CD134 antitela 12H3 VL1VH1 ili 12H3 VL1VH2 (oba IgG4/κ) na Treg-u supresiju Tefek funkcije.
[0385] Treg-i su izolovani, prošireni i aktivirani, kao što je opisano u Primeru 12. Kada je naznačeno, okrugle ploče sa ravnim dnom sa 96 bazenčića su obložene sa 12H3 VL1VH1 ili
11
12H3 VL1VH2 antitelima ili izotipskim kontrolama (10 μg/ml) razblaženim u PBS-u. Ploče su inkubirane tokom 2 sata na 37 ° C, zatim isprane i korišćene u analizi supresije. CD4+ efektorne T ćelije (Tefek) izolovane od istog donora, dok su Treg-i prečišćeni od zamrznutih PBMC-a korišćenjem AutoMACS Pro i CD4+ kompleta za izolaciju od Miltenyi Biotech-a prema specifikacijama proizvođača. Tefek ćelije su zatim označene bojom Celltrace ™ Violet prema uputstvima proizvođača (Life Technologies, Grand Island, Njujork). Tefek ćelije su resuspendovane u medijumu X-VIVO 15, dopunjenom sa 5% serumom, 1% Pen-strepom.
1x10<5>ćelija je dodato u svaki bazenčić. Treg-i su dodati pri odnosu Treg: Tefe od 0: 1 (samo Tefek), 1:2, 1:4 i 1: 8. Zrnca za ispitivanje Treg supresije (Miltenyi Biotech) su isprana i dodata u bazenčiće pri odnosu od 1 zrna po ćeliji (Tefe ili Treg). Konačna zapremina u svakom bazenčiću je podešena na 200 μl. Ploče su inkubirane na 37 ° C tokom 4 dana. Ćelije su restimulisane sa koktelom aktivacije leukocita, sa BD GolgiPlugom (2 μL/ml, BD Biosciences, San Jose, CA) tokom 5 sati, isprane i obojene sa kompletom LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies) praćenjem uputstava proizvođača. Ćelije su isprane i površinsko bojenje je izvršeno sa APC-vezanim anti-OX40 (alofikocijaninom) (klon ACT35, eBioscience), praćeno intracelularnim bojenjem. Fiksacija/ permeabilizacija sa Fox3 / Puferskim Setom bojenja transkripcionog faktora (eBioscience, San Diego, CA) prema proizvođačkom protokolu. Korišćena su sledeća antitela: CD3 V500 (klon SP34-2, BD Biosciences); CD4 FITC (klon RPA-T4, BioLegend). Ćelije su inkubirane tokom 30 minuta na 4 ° C i isprane. Ćelije su propuštane u BD Canto protočnom citometru (BD Biosciences) i analizirane korišćenjem FlowJo (Ashland, OR), propuštanje na živim singletima CD3+ CD4+ Celltrace+.
[0386] Humanizovana 12H3 antitela vezana za ploču su ometala inhibiciju od strane Treg-a na proliferaciju Tefek-a. Slika 41 prikazuje histogram analiza FACS-a upoređujući proliferaciju ćelija Tefek-a stimulisanih sa granulama za ispitivanje supresije Treg-a (Miltenyi, San Diego, CA) i tretirane sa 12H3 VL1VH1 vezanim za ploču ili kontrolom izotipa IgG4 u prisustvu Trega pri odnosu Treg / Tefe od 1 : 2. U poređenju sa izotipskom kontrolom (hIgG4), 12H3 VL1VH1 umanjuje inhibitorni efekat Treg-a na proliferaciju Tefek-a, što ukazuje povećanjem broja ćelija u sukcesivnim pikovima (nizak fluorescentni intenzitet) koji predstavljaju sledeće ćelijske podele koje su detektovane sa bojom Celltrace ™ Violet. Boja Celltrace ™ Violet se vezuje za aktivirane aminske grupe unutar ćelija.
[0387] Slika 42 pokazuje efekat himernog 12H3 (humanog IgG4/κ), humanizovanog 12H3 VL1VH1 ili 12H3 VL1VH2 (oba IgG4/κ) samostalno ili u kombinaciji sa OX40L (5 μg/mL)/ anti-His mAt (5 μg/mL) na replikaciju Tefektornih ćelija pri odnosu Treg: Tefe od 0: 1 (Slika
11
42A) ili 1:4 (Slika 42B) na ćelijama izolovanim od jednog donora. U odsustvu Treg-a (slika 42 A), zrnca stimulatora CD2/CD3/CD28 sama indukuju proliferaciju Tefek-a koji eksprimiraju humani CD 134 (tj. izotipska kontrola). Himerna i humanizovana anti-CD134 antitela kao i OX40L stimulišu proliferaciju CD4+ T ćelija u poređenju sa izotipskom kontrolom. Proliferacija je bila neznatno povećana sa kombinacijom 2H3 VL1VH2 (SF2) sa OX40L ligandom. U prisustvu Treg-a (slika 42B), CD2/CD3/CD28 stimulatorna zrna sama indukuju manju proliferaciju CD4 T ćelija u poređenju sa proliferacijom CD4 T ćelija bez Treg supresije (indeks replikacije oko 3 vs oko 5). Treg supresija je bila suzbijena u prisustvu himernog 12H3, humanizovanog 12H3 VL1VH1 i 12H3 VL1VH2 kao i OX40L. Prisustvo kombinacije 12H3 VL1VH1 ili 12H3 VL1VH2 i OX40L je pokazalo neznatan sinergistički efekat. Na slici, proliferacija Tefektornih ćelija je izražena kao indeks replikacije, što je mera stepena ekspanzije Tefektornih ćelija koje su podeljene najmanje jednom u odgovoru na stimulus (npr. broj ćelija u milionima na kraju kulture koja je prošla najmanje jednu podelu).
[0388] Tabela 3 sumira efekat 12H3 VH1VH2 IgG4/κ) dejstva na proliferaciju Tefek-a u prisustvu Treg-a pri odnosu Treg/Tefe od 0:1, 1:2 i 1:4 za 12H3 VL1VH2 (IgG4κ) u ćelijama dobijenim od 5 donora. Stepen proliferacije je izražen kao replikacioni indeks. U odsustvu Treg-a, 12H3 VL1VH2 stimuliše proliferaciju Tefektornih ćelija u svim ćelijama dobijenim od donora u poređenju sa izotipskom kontrolom (sa aktiviranim Tefek-ima korišćenjem zrnca CD2/CD3/CD28). U prisustvu Treg-a, pri bilo kom odnosu Treg/Tefe od 1:2 ili 1:4, prisustvo 12H3 VL1VH2 suzbija Treg supresiju u svim ćelijama dobijenim od donora.
[0389] Rezultati pokazuju da 12H3 VL1VH1 i 12H3 VL1VH2 imaju efekat na CD4 efektorne T ćelije indukujući njihovu proliferaciju i da antitela čine Tefektore donekle otpornim na Tregulatore ili da su sami Treg-i manje supresivni u prisustvu antitela.
Tabela 3.
11
Primer 14. Optimizacija humanizovanih antitela
[0390] Optimizacija humanizovanih antitela 20E5.
[0391] HCDR2 humanizovanih varijabilnih regiona teškog lanca (VH) 20E5_VH1, 20E5_VH2 i 20E5_VH3 sadrže motiv za izomerizaciju na položajima VH ostataka 56-57 (DG, D56G57). Da bi se ispitao efekat supstitucija na položaju 56, ostatak aspartata (D) je mutiran u glicin (G), alanin (A), serin (S) ili glutamat (E).
[0392] HCDR3 humanizovanih varijabilnih regiona teškog lanca 20E5_VH1, 20E5_VH2 i 20E5_VH3 sadrže metionin (M) na položaju 106 (M106). Međutim, metionin je verovatno sakriven u velikoj meri, kako bi se smanjio rizik od oksidacije, metionin na položaju 106 je mutiran do leucina (L) ili izoleucina (I).
[0393] Položaj 11 u varijabilnim regionima humanizovanog teškog lanca 20E5_VH1, 20E5_VH2 i 20E5_VH3 sadrži valin (V). Supstitucije na ovom položaju mogu imati strukturni uticaj na antitelo i samim tim i njegovu funkciju (Klein i sar mAbs 5:22-33, 2013). Da bi se testirao efekat zamena na položaju 11, ostatak valina (V) je mutiran u leucin (L).
[0394] Mutacije su inkorporirane u svaki varijabilni region teškog lanca 20E5_VH1, 20E5_VH2 i 20E5_VH3 korišćenjem standardnih metoda. Mutantne HCDR2 sekvence su prikazane u Tabeli 4, a mutantne HCDR3 sekvence su prikazane u Tabeli 5. Optimizovani humanizovani varijabilni regioni 20E5 koji sadrže pojedinačne zamene su prikazani u Tabeli 6. Poravnanje roditeljskog i optimizovanog VH regiona je prikazano na slici 43A i slici 43B. Imena optimizovanih VH regiona ukazuju na roditeljsku VH i izvršenu zamenu. Dodatni optimizovani varijabilni regioni, mogu biti generisani vršenjem istovremenih supstitucija na položajima 11, 56 i / ili 106, korišćenjem standardnih metoda.
[0395] Dobijeni VH regioni su upareni sa varijabilnim regionima lakog lanca 20E5_VL1 ili 20E5_VL2, a nastala antitela su izražena kao IgG4/κ korišćenjem standardnih metoda. Antitela su testirana za njihovo vezivanje za CD 134 korišćenjem tehnike ELISA prema protokolu opisanom u primeru 11A. Antitela su dodatno ispitana za njihovu sposobnost da indukuju proliferaciju Tefektornih ćelija i ublažavaju inhibitorni efekat Treg-a na proliferaciju Tefek-a, korišćenjem protokola opisanih u Primeru 13. Antitela koja imaju uporediva svojstva od roditeljskih humanizovanih 20E5 antitela su izabrana za dalja istraživanja.
Tabela 4.
11
Tabela5.
11 Tabela 6.
Optimizacija humanizovanih 12H3 antitela.
[0396] HCDR2 humanizovanih varijabilih regiona teškog lanca (VH) 12H3_VH1, 12H3_VH2 i 12H3_VH3 sadrže motiv deamidacije (NNG) na ostacima 54-56 (N54N55G56). Da bi se smanjio rizik deamidacije, asparagin na položaju 55 (N55) je mutiran u glutamin (Q), alanin (A) ili glutamat (E).
[0397] HCDR3 humanizovanih varijabilnih regiona teškog lanca 12H3_VH1, 12H3_VH2 i 12H3_VH3 sadrže metionin (M) na položaju 99 (M99). Međutim, metionin je verovatno
12
sakriven u velikoj meri, međutim, da bi se smanjio rizik od oksidacije, metionin na položaju 99 je mutiran u leucin (L) ili izoleucin (I).
[0398] Položaj 11 u varijabilnim regionima humanizovanog teškog lanca 12H3_VH1, 12 H3_VH2 i 12H3_VH3 sadrži valin (V). Supstitucije na ovom položaju, mogu imati strukturni uticaj na antitelo i samim tim i njegovu funkciju (Klein i sar. mAbs 5: 22-33, 2013). Da bi se testirao efekat supstitucije na položaju 11, ostatak valina (V) je mutiran u leucin (L).
[0399] Mutacije su inkorporirane u svaki varijabilni region teškog lanca 12H3_VH1, 12H3_VH2 i 12H3_VH3 koristeći standardne metode. Mutantne HCDR2 sekvence su prikazane u Tabeli 7, a mutantne HCDR3 sekvence su prikazane u Tabeli 8. Optimizovani humanizovani 12H3 varijabilni regioni koji sadrže pojedinačne supstitucije su prikazani u Tabeli 9. Usklađivanje roditeljskih i optimizovanih VH regiona je prikazano na slici 44. Nazivi optimizovanih VH regiona ukazuju na roditeljsku VH i izvršenu zamenu. Dodatni optimizovani varijabilni regioni, mogu biti generisani tako što istovremeno vrši zamene na položajima 11, 55 i / ili 99 korišćenjem standardnih metoda.
Dobijeni VH regioni su upareni sa varijabilnim regionima lakog lanca 12H3_VL1 ili 12H3 VL2 i nastala antitela su izražena kao IgG4/κ korišćenjem standardnih metoda. Antitela su ispitana na njihovo vezivanje za CD 134 korišćenjem tehnike ELISA prema protokolu opisanom u primeru 11A. Antitela su dodatno testirana na njihovu sposobnost da indukuju proliferaciju Tefektornih ćelija i suzbijaju inhibitorni efekat Treg-a na proliferaciju Tefek-a, korišćenjem protokola opisanih u Primeru 13. Antitela koja imaju uporediva svojstva od roditeljskih humanizovanih 12H3 antitela su izabrana za dalje studije.
Tabela 7.
Tabela 8.
Tabela 9.
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
�
1
��
��
��
��
14
��
14
1
11
��
1
��
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
�
11
��
�
14
�
1
�
1
�
1
11
12
�
��
1
�
1
�
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovano antitelo koje vezuje humani CD 134, koje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) od SEK ID BR: 98, ili koje ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VL-u od SEK ID BR: 98 i varijabilni region teškog lanca (VH), pri čemu VH sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 134, ili ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 134 ili VH sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 97, ili ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije u VH od SEK ID BR: 97, naznačeno time što
a. HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 8, 139 ili 140; b. HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 7, 135, 136, 137 ili 138; i
c. HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR:6.
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time, da:
a. VL sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 62 ili 63; i
VH sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR-a: 64, 65, 66, 101, 102,
103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118,
149, 150 ili 151, ili koje ima 1, 2 ili 3 aminokiselinske supstitucije na položajima linearnih aminokiselinskih ostataka VH 11, 56 ili 106 ; ili
b. VL i VH sadrže aminokiselinske sekvence od
i. SEK ID BR-a: 62 i 64, respektivno;
ii. SEK ID BR-a: 62 i 65, respektivno;
iii. SEK ID BR-a: 62 i 66, respektivno;
iv. SEK ID BR-a: 63 i 64, respektivno;
v. SEK ID BR-a: 63 i 65, respektivno; ili
vi. SEK ID BR-a: 63 i 66, respektivno.
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time, da su supstitucije 1, 2 ili 3 aminokiselina na VH linearnim položajima aminokiselinskih ostataka V11L, D56G, D56A, D56S, D56E, M106L ili M106I.
2 2
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time, da se antitelo vezuje za epitop ekstracelularnog domena humanog CD 134 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 35; SEK ID BR: 36, ili SEK ID BR: 92.
5. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time, da VL sadrži SEK ID BR: 63 i VH sadrži SEK ID BR: 66.
6. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time, što je antitelo humanizovano ili deimunizovano.
7. Antitelo prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time, da je antitelo agonist CD 134 i/ili naznačeno time što je antitelo izotipa IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.
8. Antitelo prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time, da antitelo sadrži supstituciju u Fc regionu.
9. Antitelo prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time, da supstitucija obuhvata supstituciju S267E/L328F, supstituciju E233D/G237D/H268D/P271G/A330R, supstituciju V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S ili supstituciju M252Y/S254T/T256E, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU Indeksu.
10. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira VH ili VL prema patentnom zahtevu 2.
11. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.
12. Ćelija domaćina koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 9.
13. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, za upotrebu u lečenju raka kod subjekta.
14. Farmaceutski preparat koji sadrži antitelo prema bilo kod od patentnih zahteva 1-9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. Farmaceutski preparat koji sadrži antitelo prema patentnom zahtevu 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
RS20181085A 2013-03-18 2014-03-18 Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe RS57840B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13159794 2013-03-18
PCT/NL2014/050162 WO2014148895A1 (en) 2013-03-18 2014-03-18 Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
EP14715138.5A EP2976361B1 (en) 2013-03-18 2014-03-18 Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57840B1 true RS57840B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=47891522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181085A RS57840B1 (sr) 2013-03-18 2014-03-18 Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe

Country Status (33)

Country Link
US (3) US9790281B2 (sr)
EP (2) EP3409690A1 (sr)
JP (1) JP2016515544A (sr)
KR (1) KR20160006168A (sr)
CN (1) CN105229032A (sr)
AU (2) AU2014238546C1 (sr)
BR (1) BR112015023862A2 (sr)
CA (1) CA2907436A1 (sr)
CL (2) CL2015002793A1 (sr)
CR (1) CR20150498A (sr)
CY (1) CY1120752T1 (sr)
DK (1) DK2976361T3 (sr)
EA (1) EA201591495A1 (sr)
ES (1) ES2687282T3 (sr)
HK (1) HK1215035A1 (sr)
HR (1) HRP20181478T1 (sr)
HU (1) HUE040234T2 (sr)
IL (1) IL241701A0 (sr)
LT (1) LT2976361T (sr)
MD (2) MD20180107A2 (sr)
MX (2) MX2015013288A (sr)
NZ (1) NZ712903A (sr)
PE (1) PE20160690A1 (sr)
PH (1) PH12015502185A1 (sr)
PL (1) PL2976361T3 (sr)
PT (1) PT2976361T (sr)
RS (1) RS57840B1 (sr)
SG (2) SG11201507781VA (sr)
SI (1) SI2976361T1 (sr)
SM (1) SMT201800503T1 (sr)
UA (1) UA119319C2 (sr)
WO (1) WO2014148895A1 (sr)
ZA (1) ZA201507021B (sr)

Families Citing this family (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201116092D0 (en) * 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
AU2014236882B2 (en) 2013-03-14 2019-01-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of detecting donor-specific antibodies and systems for practicing the same
RS57840B1 (sr) 2013-03-18 2018-12-31 Biocerox Prod Bv Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe
MX2016007965A (es) 2013-12-17 2016-10-28 Genentech Inc Terapia de combinacion que comprende agonistas de union a ox40 y antagonistas de union al eje pd-1.
KR20160146747A (ko) 2014-03-31 2016-12-21 제넨테크, 인크. 항혈관신생제 및 ox40 결합 효능제를 포함하는 조합 요법
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
CA2966507A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Methods and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
KR20170086540A (ko) 2014-11-03 2017-07-26 제넨테크, 인크. T 세포 면역 하위세트를 검출하기 위한 검정 및 그의 사용 방법
CA2963974A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
CN106999583A (zh) 2014-11-17 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
SMT201900702T1 (it) * 2015-01-08 2020-01-14 Genmab As Agenti agonistici leganti il recettore del tnf
PL3265123T3 (pl) 2015-03-03 2023-03-13 Kymab Limited Przeciwciała, zastosowania i sposoby
MX2017012805A (es) 2015-04-07 2018-04-11 Genentech Inc Complejo de unión a antígenos con actividad agonista y métodos de uso.
CA2983898A1 (en) * 2015-04-28 2016-11-03 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Rgma binding protein and use thereof
EP3292152A1 (en) 2015-05-07 2018-03-14 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
AU2016271111B2 (en) * 2015-05-29 2022-04-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against OX40 and uses thereof
WO2017046746A1 (en) 2015-09-15 2017-03-23 Acerta Pharma B.V. Therapeutic combinations of a btk inhibitor and a gitr binding molecule, a 4-1bb agonist, or an ox40 agonist
MY206406A (en) 2015-10-02 2024-12-16 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for a costimulatory tnf receptor
WO2017063162A1 (zh) * 2015-10-15 2017-04-20 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用
JP2018536650A (ja) * 2015-10-30 2018-12-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｄ因子抗体変異体コンジュゲート及びその使用
PT3370768T (pt) 2015-11-03 2022-04-21 Janssen Biotech Inc Anticorpos que se ligam especificamente ao pd-1 e seus usos
GB201519481D0 (en) * 2015-11-04 2015-12-16 Cancer Rec Tech Ltd Immunomodulatory antibodies
US10527613B2 (en) * 2015-11-10 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same
WO2017096179A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
JP7328761B2 (ja) 2016-01-11 2023-08-17 インヒブルクス インコーポレイテッド 多価多重特異性ｏｘ４０結合融合タンパク質
CN116063494A (zh) * 2016-03-04 2023-05-05 洛克菲勒大学 具有增强的激动剂活性的cd40的抗体
DE102016105069A1 (de) 2016-03-18 2017-09-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Antivirale Immuntherapie durch Membranrezeptorligation
IL321475A (en) * 2016-05-06 2025-08-01 Medimmune Llc Bispecific binding proteins and their uses
US12145993B2 (en) * 2016-06-08 2024-11-19 Shanghai Jiao Tong University School Of Medicine Sequence of antibody heavy chain constant region for enhancing agonistic antibody activity
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
EP3497120A1 (en) * 2016-08-12 2019-06-19 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions
CA3033665A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 Janssen Biotech, Inc. Fc engineered anti-tnfr superfamily member antibodies having enhanced agonistic activity and methods of using them
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
EP3535291A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CA3041340A1 (en) 2016-11-09 2018-05-17 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies, anti-gitr antibodies, and methods of use thereof
UY37523A (es) * 2016-12-15 2018-07-31 Abbvie Biotherapeutics Inc Anticuerpos anti-ox40 y sus usos
AU2017384528A1 (en) * 2016-12-19 2019-07-04 Ichnos Sciences SA Novel TNFR agonists and uses thereof
EP3824906A1 (en) 2016-12-21 2021-05-26 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
AU2018205234B2 (en) 2017-01-06 2024-09-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) with tumor necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) agonists and therapeutic combinations of TILs and TNFRSF agonists
SG11201906319XA (en) 2017-01-20 2019-08-27 Magenta Therapeutics Inc Compositions and methods for the depletion of cd137+ cells
BR112019015900A2 (pt) 2017-02-10 2020-04-07 Genmab B.V. polipeptídeo, métodos para aumentar a atividade agonística de um polipeptídeo, para aumentar a atividade de cdc de um polipeptídeo e de tratamento de um indivíduo tendo uma doença, composição, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou uma composição
CN108623686A (zh) * 2017-03-25 2018-10-09 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
US12024560B2 (en) 2017-03-28 2024-07-02 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Therapeutic agents and methods for enhancing immune responses in tumor microenvironment
TW201919662A (zh) 2017-06-05 2019-06-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 對雙重難治性黑色素瘤使用腫瘤浸潤性淋巴細胞之方法
JP7089149B2 (ja) 2017-07-31 2022-06-22 ミツミ電機株式会社 レンズ駆動装置、カメラモジュール、およびカメラ搭載装置
KR20250020679A (ko) 2017-08-04 2025-02-11 젠맵 에이/에스 Pd-l1 및 cd137에 결합하는 결합제 및 그의 용도
CA3074317C (en) * 2017-08-25 2024-06-18 Janssen Biotech, Inc. Fc.gamma.rii binding fibronectin type iii domains, their conjugates and multispecific molecules comprising them
US11603410B2 (en) 2017-11-01 2023-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Immunostimulatory agonistic antibodies for use in treating cancer
JP7557367B2 (ja) 2017-11-17 2024-09-27 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 細針吸引及び小生検からのｔｉｌ拡大培養
CA3084394A1 (en) * 2017-11-24 2019-05-31 Eucure (Beijing) Biopharma Co., Ltd Anti-ox40 antibodies and uses thereof
JP7057492B2 (ja) 2017-12-28 2022-04-20 ミツミ電機株式会社 レンズ駆動装置、カメラモジュール、及びカメラ搭載装置
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
EP3737743A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
CN110092832B (zh) * 2018-01-29 2020-03-31 康源博创生物科技(北京)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CA3090795A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists
JP7351845B2 (ja) 2018-03-23 2023-09-27 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｍｉｃａおよび／またはｍｉｃｂに対する抗体ならびにそれらの使用
KR102825164B1 (ko) 2018-03-27 2025-06-26 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 자외선 신호를 사용한 단백질 농도의 실시간 모니터링
WO2019210131A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
CN110467674B (zh) * 2018-05-11 2022-05-31 同润澳门一人有限公司 抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途
CN112566935B (zh) * 2018-05-23 2024-12-13 百济神州有限公司 抗ox40抗体和使用方法
WO2019241730A2 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
WO2020014583A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Ox-40 agonist, pd-1 pathway inhibitor and ctla-4 inhibitor combination for use in a mehtod of treating a cancer or a solid tumor
AU2019321490B2 (en) 2018-08-13 2025-09-04 Inhibrx Biosciences, Inc. Ox40-binding polypeptides and uses thereof
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
SG11202101787XA (en) 2018-09-20 2021-04-29 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion of tils from cryopreserved tumor samples
US12453697B2 (en) 2018-11-05 2025-10-28 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
CA3118493A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
BR112021008549A2 (pt) 2018-11-05 2022-01-04 Iovance Biotherapeutics Inc Método de tratamento de carcinoma pulmonar de células não pequenas com uma população de linfócitos infiltrantes de tumor
IL282775B1 (en) 2018-11-05 2026-05-01 Iovance Biotherapeutics Inc Selection of enhanced carrier-reactive T cells
WO2020119793A1 (en) * 2018-12-14 2020-06-18 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Humanized antibodies against ox40, method for preparing the same, and use thereof
WO2020131547A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
WO2020142626A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 Gigagen, Inc. Anti-ox40 binding proteins and methods of use thereof
WO2020172658A1 (en) 2019-02-24 2020-08-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating a protein
CN114269370A (zh) 2019-03-29 2022-04-01 迈斯特治疗公司 离体产生t细胞治疗剂的方法以及相关的组合物和方法
MA55805A (fr) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V Inc Métodes de modulation de l'activité immunitaire
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
KR20220012292A (ko) 2019-05-23 2022-02-03 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 세포 배양 배지를 모니터링하는 방법
WO2020243570A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
US20220363760A1 (en) 2019-05-30 2022-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signature for suitability to immuno-oncology therapy
JP2022534982A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在化シグネチャーおよびその使用
CN110172090B (zh) * 2019-06-03 2020-04-03 中山标佳生物科技有限公司 Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用
EP4048295A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2021098750A1 (en) * 2019-11-21 2021-05-27 Beigene (Beijing) Co., Ltd. Methods of cancer treatment with anti-ox40 antibody in comibinaiton with tlr agonists
US20230011916A1 (en) * 2019-11-21 2023-01-12 Beigene, Ltd. Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with pi3 kinase delta inhibitors
EP4061850A4 (en) * 2019-11-21 2024-03-20 BeiGene, Ltd. Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with anti-pd1 or anti-pdl1 antibodies
KR20220103709A (ko) * 2019-11-21 2022-07-22 베이진 엘티디 항-tigit 항체와의 병용물 형태로 항-ox40 항체를 사용하는 암 치료의 방법
WO2021098769A1 (en) * 2019-11-21 2021-05-27 Beigene, Ltd. Treatment of cancer with anti-ox40 antibodies and multi-kinase inhibitors
CA3157319A1 (en) * 2019-11-21 2021-05-27 Beigene, Ltd. Methods of cancer treatment using anti-ox40 antibodies in combination with anti-tim3 antibodies
IL293350A (en) 2019-11-27 2022-07-01 Myst Therapeutics Llc Method of producing tumor-reactive t cell composition using modulatory agents
US12516291B2 (en) 2019-12-11 2026-01-06 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and methods of using the same
PE20221506A1 (es) 2019-12-17 2022-10-04 Amgen Inc Agonista doble de interleucina-2/receptor de tnf para uso en terapia
JP2023509359A (ja) 2019-12-17 2023-03-08 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド 鉄依存性細胞分解の誘導物質との併用抗癌療法
JP7702954B2 (ja) * 2019-12-27 2025-07-04 ハイファイバイオ， インコーポレイテッド 抗ｏｘ４０抗体およびその使用
EP4110799B1 (en) 2020-02-27 2024-11-06 Turnstone Biologics Corp. Methods for ex vivo enrichment and expansion of tumor reactive t cells and related compositions thereof
WO2021226061A1 (en) 2020-05-04 2021-11-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP4146793A1 (en) 2020-05-04 2023-03-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
CN111518209B (zh) * 2020-05-09 2023-07-25 郑州航空港百桥生物科技有限公司 特异性结合人ox40的单克隆抗体及其应用
CN116096906A (zh) 2020-06-29 2023-05-09 旗舰创业创新五公司 工程化以促进萨诺传递的病毒及其在治疗癌症中的用途
IL300916A (en) 2020-08-31 2023-04-01 Bristol Myers Squibb Co Cell localization signature and immunotherapy
JP2023544410A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー タンパク質を濃縮するための方法
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
CA3195019A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Maria Fardis Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
JP2024501452A (ja) 2020-12-11 2024-01-12 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｂｒａｆ阻害剤及び／またはｍｅｋ阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球治療によるがん患者の治療
JP2023554395A (ja) 2020-12-17 2023-12-27 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
US20240123067A1 (en) 2020-12-17 2024-04-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
PT4267105T (pt) 2020-12-28 2025-04-30 Bristol Myers Squibb Co Composições de anticorpos e métodos de utilização das mesmas
AU2021416156A1 (en) 2020-12-28 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumors
AU2022218137A1 (en) 2021-02-03 2023-08-24 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
EP4314253A2 (en) 2021-03-25 2024-02-07 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
AU2022263418A1 (en) 2021-04-19 2023-10-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2022250502A1 (en) * 2021-05-27 2022-12-01 Yuhan Corporation Ox40 agonist and use thereof
US20240316104A1 (en) 2021-06-29 2024-09-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
CA3226942A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
US20230187042A1 (en) 2021-10-27 2023-06-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
AU2022388729A1 (en) 2021-11-10 2024-05-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
JP2025503987A (ja) 2022-01-28 2025-02-06 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド ペイロードを発現するように操作された腫瘍浸潤リンパ球
KR20240156411A (ko) 2022-03-09 2024-10-29 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 치료 단백질의 일시적 발현
US20250206775A1 (en) 2022-03-18 2025-06-26 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
EP4507704A1 (en) 2022-04-15 2025-02-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
AU2023281061A1 (en) 2022-06-02 2024-12-05 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4565683A1 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
EP4583999A1 (en) 2022-09-09 2025-07-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024151885A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Iovance Biotherapeutics, Inc. Use of til as maintenance therapy for nsclc patients who achieved pr/cr after prior therapy
WO2024196952A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Tumor subtype assessment for cancer therapy
IL324457A (en) 2023-05-12 2026-01-01 Genmab As Antibodies capable of binding to ox40, their variants and uses thereof
CN121712571A (zh) 2023-08-15 2026-03-20 百时美施贵宝公司 陶瓷羟基磷灰石色谱流通法
IL328125A (en) 2023-11-06 2026-06-01 Iovance Biotherapeutics Inc Treatment of endometrial cancers with tumor infiltrating lymphocyte therapies
CN122249464A (zh) 2023-11-30 2026-06-19 金麦安博股份有限公司 在组合疗法中的能够结合ox40的抗体
CN122459678A (zh) 2023-12-29 2026-07-24 百时美施贵宝公司 KRAS抑制剂与Treg耗竭剂的组合疗法

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
WO1994025591A1 (en) 1993-04-29 1994-11-10 Unilever N.V. PRODUCTION OF ANTIBODIES OR (FUNCTIONALIZED) FRAGMENTS THEREOF DERIVED FROM HEAVY CHAIN IMMUNOGLOBULINS OF $i(CAMELIDAE)
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US7473423B2 (en) 1994-04-29 2009-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
US5591629A (en) 1994-04-29 1997-01-07 Mayo Foundation For Medical Education & Research Monoclonal antibodies which promote central nervous system remyelination
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US5504004A (en) 1994-12-20 1996-04-02 Michigan Biotechnology Institute Process for making succinic acid, microorganisms for use in the process and methods of obtaining the microorganisms
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6252058B1 (en) 1997-11-05 2001-06-26 Timothy C. Thompson Sequences for targeting metastatic cells
DK1060247T3 (da) 1998-02-24 2009-01-26 Sisters Of Providence In Orego Sammensætning indeholdende et OX-40-receptorbindingsmiddel eller en nukleinsyre, der koder for det samme og fremgangsmåder til at foröge antigenspecifikt immunrespons
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020004041A1 (en) 1999-02-19 2002-01-10 Albert Matthew L. Methods for abrogating a cellular immune response
US7666414B2 (en) 2001-06-01 2010-02-23 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for treating prostate cancer using modified antibodies to prostate-specific membrane antigen
JP4303105B2 (ja) 2001-06-28 2009-07-29 ドマンティス リミテッド 二重特異性リガンドとその利用
AU2002368077B2 (en) 2001-07-12 2010-03-04 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
ES2295639T3 (es) 2002-06-13 2008-04-16 Crucell Holland B.V. Agonistas del receptor ox40=(=cd134) y uso terapeutico descripcion.
CN1678634A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
JP4794301B2 (ja) 2003-06-11 2011-10-19 中外製薬株式会社 抗体の製造方法
US20080008719A1 (en) 2004-07-10 2008-01-10 Bowdish Katherine S Methods and compositions for the treatment of prostate cancer
JP2008505645A (ja) 2004-07-10 2008-02-28 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ガン細胞に特異的な抗体を見出すための方法およびそれによって見出される抗体
TWI309240B (en) * 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
CN101072578A (zh) 2004-10-29 2007-11-14 南加州大学 用共刺激分子的联合癌症免疫疗法
CA2588157A1 (en) 2004-11-17 2006-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer immunotherapy incorporating p53
JP2008528010A (ja) 2005-01-31 2008-07-31 アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ 重鎖抗体の可変ドメイン配列を作出する方法
US7189097B2 (en) 2005-02-11 2007-03-13 Winchester Electronics Corporation Snap lock connector
KR101374454B1 (ko) 2005-03-31 2014-03-17 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 회합제어에 의한 폴리펩티드 제조방법
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
US20080194596A1 (en) 2005-06-03 2008-08-14 Frizer Inc. Therapeutic Combination Including a Selective Erbb2 Inhibitor
WO2007062093A2 (en) 2005-11-22 2007-05-31 Incyte Corporation Combination therapy for the treatment of cancer comprising a metalloprotease inhibitor
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
KR101866623B1 (ko) 2005-11-28 2018-07-04 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
US20070255631A1 (en) 2005-11-28 2007-11-01 Douglas Schmidt Product catalog management system and method
DK1999154T3 (da) 2006-03-24 2012-12-03 Merck Patent Gmbh Fremstillede heterodimere proteindomæner
CA2656923A1 (en) 2006-06-21 2007-12-27 Genentech, Inc. Crystal structures of ox40l and ox40l complexed with ox40 receptor
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
KR20100014588A (ko) 2007-02-27 2010-02-10 제넨테크, 인크. 길항제 ｏｘ40 항체 및 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서의 이의 용도
EP2626372B1 (en) 2007-03-29 2018-03-21 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
CN101293924A (zh) * 2007-04-24 2008-10-29 上海国健生物技术研究院 骨桥蛋白的功能表位、与其特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗肿瘤转移药物中的用途
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
SI2242771T1 (sl) * 2007-12-14 2013-09-30 Bristol-Myers Squibb Company Vezane molekule k humanemu ox40 receptorju
AU2008343589A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Design and generation of human de novo pIX phage display libraries via fusion to pIX or pVII, vectors, antibodies and methods
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
WO2010019702A2 (en) 2008-08-12 2010-02-18 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Ddr1-binding agents and methods of use thereof
JP2012505654A (ja) 2008-10-14 2012-03-08 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体をヒト化及び親和性成熟する方法
US8137933B2 (en) 2008-11-12 2012-03-20 Schering Corporation Mammalian expression vector pUHAB
AU2010216152B2 (en) 2009-02-17 2015-05-14 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecules having specificity for human OX40
US9067986B2 (en) 2009-04-27 2015-06-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
EP2427212B1 (en) * 2009-05-08 2017-08-23 Vaccinex, Inc. Anti-cd100 antibodies and methods for using the same
WO2011031801A2 (en) 2009-09-08 2011-03-17 Aerovironment, Inc. Electric vehicle simulator and analyzer (evsa) for electric vehicle supply equipment
CN102711810B (zh) 2009-11-30 2015-04-22 詹森生物科技公司 效应子功能已消除的抗体Fc区突变体
PT2560993T (pt) 2010-04-20 2024-09-16 Genmab As Proteínas contendo anticorpo heterodimérico fc e métodos para a produção das mesmas
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
LT2609118T (lt) * 2010-08-23 2017-04-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antikūnai ir jų panaudojimo būdai
CN103429620B (zh) 2010-11-05 2018-03-06 酵活有限公司 在Fc结构域中具有突变的稳定异源二聚的抗体设计
JP5925307B2 (ja) 2011-06-30 2016-05-25 オーエフエス ファイテル，エルエルシー １５５０ｎｍの波長範囲における使用のためのファイバストレッチャモジュール
KR102119840B1 (ko) * 2011-07-11 2020-06-09 아이크노스 사이언스 에스. 아. Ox40에 결합하는 항체 및 이들의 용도
JP6038920B2 (ja) * 2011-08-23 2016-12-07 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 抗ｏｘ４０抗体およびそれを使用する方法
GB201116092D0 (en) * 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
RS57840B1 (sr) 2013-03-18 2018-12-31 Biocerox Prod Bv Humanizovana anti-cd 134 (ox40) antitela i njihove upotrebe
MX2016007965A (es) 2013-12-17 2016-10-28 Genentech Inc Terapia de combinacion que comprende agonistas de union a ox40 y antagonistas de union al eje pd-1.
KR20160146747A (ko) 2014-03-31 2016-12-21 제넨테크, 인크. 항혈관신생제 및 ox40 결합 효능제를 포함하는 조합 요법
SG11201607969XA (en) 2014-03-31 2016-10-28 Genentech Inc Anti-ox40 antibodies and methods of use
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
CA2966507A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Methods and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
KR20170086540A (ko) 2014-11-03 2017-07-26 제넨테크, 인크. T 세포 면역 하위세트를 검출하기 위한 검정 및 그의 사용 방법
CA2963974A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
CN106999583A (zh) 2014-11-17 2017-08-01 豪夫迈·罗氏有限公司 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
GB201500319D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
MX2017012805A (es) 2015-04-07 2018-04-11 Genentech Inc Complejo de unión a antígenos con actividad agonista y métodos de uso.
EP3292152A1 (en) 2015-05-07 2018-03-14 Agenus Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use thereof
EP3497120A1 (en) 2016-08-12 2019-06-19 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201507021B (en) 2016-11-30
SI2976361T1 (sl) 2018-11-30
HRP20181478T1 (hr) 2018-11-02
MD20150102A2 (ro) 2016-02-29
UA119319C2 (uk) 2019-06-10
CN105229032A (zh) 2016-01-06
CR20150498A (es) 2016-03-30
EP2976361B1 (en) 2018-07-18
MX2015013288A (es) 2016-04-07
EP3409690A1 (en) 2018-12-05
BR112015023862A2 (pt) 2017-10-24
US20170369586A1 (en) 2017-12-28
MD4633B1 (ro) 2019-06-30
JP2016515544A (ja) 2016-05-30
HUE040234T2 (hu) 2019-02-28
CA2907436A1 (en) 2014-09-25
NZ712903A (en) 2018-07-27
AU2014238546B2 (en) 2018-10-18
MX2019004649A (es) 2019-08-05
PH12015502185A1 (en) 2016-01-25
WO2014148895A1 (en) 2014-09-25
ES2687282T3 (es) 2018-10-24
SG10201708048XA (en) 2017-10-30
KR20160006168A (ko) 2016-01-18
DK2976361T3 (en) 2018-10-01
HK1215035A1 (zh) 2016-08-12
SMT201800503T1 (it) 2018-11-09
AU2014238546A1 (en) 2015-10-01
EP2976361A1 (en) 2016-01-27
PL2976361T3 (pl) 2018-12-31
US20190202928A1 (en) 2019-07-04
IL241701A0 (en) 2015-11-30
US10273307B2 (en) 2019-04-30
PE20160690A1 (es) 2016-08-14
US9790281B2 (en) 2017-10-17
AU2014238546C1 (en) 2019-01-17
LT2976361T (lt) 2018-10-25
PT2976361T (pt) 2018-10-19
CL2018003807A1 (es) 2019-03-08
MD20180107A2 (ro) 2019-06-30
AU2019200164A1 (en) 2019-01-31
SG11201507781VA (en) 2015-10-29
CL2015002793A1 (es) 2016-09-23
EA201591495A1 (ru) 2016-05-31
CY1120752T1 (el) 2019-12-11
US20140377284A1 (en) 2014-12-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10273307B2 (en) Humanized anti-CD134 (OX40) antibodies and uses thereof
AU2017202564B2 (en) Anti-CD134 (OX40) antibodies and uses thereof
AU2017317124B2 (en) Anti-CTLA4 and anti-PD-1 bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
JP7763780B2 (ja) 抗ｃｄ７３／抗ｐｄ－１二重特異性抗体及びその使用
HK1201852B (en) Anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
NZ623840B2 (en) Anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
NZ718372B2 (en) Anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof