RS58372B1 - Farmaceutska ili kozmetička kompozicija za lečenje alopecije - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku ili kozmetičku kompoziciju za lečenje alopecije i uopšteno za borbu protiv prekomernog gubitka kose. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Bilo kakva tematika koja izlazi iz opsega patentnih zahteva pomenuta je samo u smislu informacije.

Stanje tehnike

[0002] Folikul dlake (HF) je jedan od najsloženijih mini-organa u ljudskom telu koji ima sposobnost regeneracije. Ciklus rasta dlake tokom post-natalnog života opisuje morfohistološke promene stabljike i folikula tokom vremena. Ciklična aktivnost započinje proizvodnjom dlake, praćenom brzim rastom i izduživanjem stabljike (anagena faza). Folikul i dlaka zatim podležu regresiji izazvanoj apoptozom (katagena faza), praćenoj fazom mirovanja (telogen) i najzad fazom gubitka dlake (egzogen).

[0003] Ove promene uključuju brzo preoblikovanje epitelnih i dermalnih komponenti zasnovano na promenama u ekspresiji i/ili aktivnosti citokina, hormona, enzima, neurotransmitera i njihovih srodnih receptora, i transkripcionih faktora koji su prepoznati kao ključni posrednici u ciklusu dlake.

[0004] Sve dlake na telu podležu sličnom životnom ciklusu, mada rast, trajanje faza i dužina stabljike variraju na različitim površinama tela i među pojedincima u zavisnosti od genetskih faktora, starosti i zdravstvenog stanja. Osim toga, mnogi regulatori su uključeni u biologiju dlake, utičući na morfogenezu i regulišući započinjanje i trajanje anagene faze.

[0005] Različiti hormoni su uključeni u regulaciju ciklusa rasta dlake, uključujući melatonin, prolaktin, melanostimulirajući hormon (MSH), tiroidni hormon i estrogene. Na primer, nađeno je da je prolaktin uključen u regulaciju rasta dlake i kod miševa i kod ljudi.

[0006] Mnogi od ovih regulatora mogu da budu ciljno mesto delovanja za kliničko lečenje. Na primer, isključujući pubične i pazušne folikule, androgeni zahtevaju enzim 5α-reduktazu, koja može da metaboliše testosteron u 5α-dihidrotestosteron (DHT), snažniji metabolit. Ovo je zapravo mehanizam koji se koristi i u kliničkoj i u kozmetičkoj oblasti za borbu protiv gubitka kose u slučajevima androgene alopecije. Nasuprot gubitku kose, intenzivni rast dlaka može da bude problem, posebno za žene. Suprotno androgenoj alopeciji, hirzutizam i hipertrihoza rezultuju iz produžene anagene faze praćene abnormalnim uvećanjem folikula dlake.

[0007] Uobičajeni tretmani za borbu protiv ovog stanja su upotreba krema i voskova za depilaciju, koji samo privremeno uklanjaju problem budući da iritacija ili kidanje brzo indukuju anagenu fazu folikula dlake i ponovni rast. Drugi sistemi koji se koriste su elektroliza i selektivna fototermoliza, uz upotrebu lasera za uništavanje stabljike dlake i dermalne papile folikula dlake. Najnoviji dostupni tretmani su veoma agresivni.

[0008] Da bi se rešili ovi problemi, potrebne su nove i efikasnije metode. Poslednjih decenija, postoji poseban naučni interes za ulogu ornitin dekarboksilaze (ODC) i poliamina u ciklusu dlake. Ovaj interes se prvenstveno javlja zbog činjenice da je folikul jedan od najproliferativnijih organa. ODC, enzim koji predstavlja ograničavajući faktor brzine u biosintezi poliamina, predstavlja cilj delovanja inhibitornih lekova (kao što je eflornitin), koji rezultuju smanjenjem brzine rasta dlaka na licu in vivo i inhibicijom rasta humanih dlaka u kulturi organa.

[0009] Za kliničke svrhe, za kontrolu količine proizvedenih dlaka, jedna strategija podrazumeva promenu trajanja anagene faze, njeno skraćivanje u slučaju hirzutizma ili produženje u borbi protiv alopecije. Uopšteno, poremećaju humanog folikula kao što su hirzutizam, seda kosa i alopecija imaju znatan negativan uticaj na psihu i samopoštovanje pojedinaca koji od njih pate.

[0010] Patent EP 1469843 istog podnosioca prijave opisuje kompoziciju za farmaceutsku, kozmetičku ili dijetetsku upotrebu za borbu protiv gubitka kose, u kojoj je aktivan sastojak poliamin poznat kao spermidin, ili N’-(3-aminopropil)-1,4-diaminobutan, za oralnu upotrebu, kao i za topikalnu primenu na koži glave. Formula spermidina je: H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH2.

[0011] Ovaj patent prijavljuje eksperimentalni dokaz da kompozicija koja sadrži spermidin, i kao takav, i u kombinaciji sa drugim mikronutrijentnim dodacima, može da uspori i zaustavi intenzivni gubitak kose, i da u isto vreme poboljša otpornost i opšte zdravstveno stanje kose. Test zatezanja pokazao je da spermidin povećava zateznu čvrstoću dlake, dok su trihogram i test pranja pokazali da do poboljšanja dolazi u bulbusu dlake. Pored suštinskog smanjenja broja dlaka izgubljenih nakon pranja, broj dlaka izgubljenih u telogenoj fazi (patološki gubitak) takođe je smanjen u odnosu na broj dlaka izgubljenih u egzogenoj fazi (gubitak zbog prirodne zamene). Tretman spermidinom stoga suštinski poboljšava ciklus dlake izmenjen bolešću gubitka kose u telogenoj fazi, vraćajući ga na normalne fiziološke nivoe. Spermidin je prema tome efikasan aktivni sastojak za borbu protiv alopecije.

[0012] Međutim, spermidin, kao i drugi poliamini, podleže oksidaciji, posebno u slučaju topikalne primene na kožu glave, pri kojoj jedinjenje ostaje u produženom kontaktu sa vazduhom neko vreme pre nego što bude apsorbovano od strane kože i ostvari svoje dejstvo. Svaka oksidacija spermidina tokom ovog vremena pre apsorpcije bi vodila nastanku oksidacionih proizvoda koji više nisu aktivni, ako nisu potencijalno štetni.

[0013] Predmetni pronalazak prvenstveno ima za cilj da pronađe rešenje ovog problema. Od teoretskih rešenja, potencijalna hemijska zaštita funkcionalnih grupa amina podložnih oksidaciji izgleda da nije generalno pogodna u praksi, posebno imajući u vidu prethodno stanje tehnike koje je sažeto u sledećim patentima.

[0014] WO9937277 opisuje supstituisane poliamine za redukciju rasta dlake kod sisara izborom oblasti kože gde ovo dejstvo treba da se proizvede i nanošenjem na ovu oblast kože dermatološki prihvatljive kompozicije, koja sadrži supstituisani poliamin kao inhibitor u biosintetskom putu hipuzina, u količini koja efikasno redukuje rast dlake. Neželjeni rast dlake kod sisara, uključujući ljude, posebno rast dlake stimulisan androgenima, može stoga da se redukuje bilo u slučaju normalnog rasta, ili jednako u slučajevima povećanog rasta koji rezultuju iz abnormalnosti ili poremećaja (na primer hirzutizam). WO02062341 se odnosi na farmaceutsku kompoziciju pogodnu za topikalnu primenu kod humanih ili nehumanih sisara za kontrolu rasta dlake u oblasti na koju je primenjena, koja sadrži efikasnu količinu supstituisanog poliamina ili njegovu so. U ovom slučaju, opisan je mehanizam inhibicije ODC (ornitin dekarboksilaza) poliaminom, koji se ireverzibilno vezuje za ODC prisutnu u ćeliji tako da sprečava ODC da katalizuje dekarboksilaciju ornitina u putrescin. Prema ovom patentu, rast dlake može da se reguliše primenom određenih supstituisanih poliamina, koji prvenstveno sprečavaju obrazovanje ODC u ćelijama koje ih apsorbuju, kod humanih i nehumanih sisara. Na ovaj način, umesto da deluju kao pravi inhibitori ODC, smatra se da supstituisani poliamini o kojima je reč, deluju tako što sprečavaju sintezu ODC. Eksperimentalni primeri u ovom dokumentu pokazuju da primenjeni poliamin, u ovom slučaju dietil-homospermin, zaustavlja ponovni rast obrijane dlake kod miševa.

Kratak opis pronalaska

[0015] U svakom slučaju, bez obzira na biološki mehanizam u osnovi konačnog postignutog efekta sprečavanja rasta dlake, jasno je da ovo poznato stanje tehnike ne podstiče, kao hipotetičko praktično rešenje, rešenje supstitucije spermidina funkcionalnim grupama tako da se dobije suprotan efekat stimulacije rasta u području primene na koži vlasišta, što je predmet ovog pronalaska.

[0016] U isto vreme, sledeći cilj predmetnog pronalaska je obezbeđivanje jedinjenja koja mogu da budu, bar po nekim svojstvima, čak i aktivnija od spermidina u borbi protiv gubitka kose.

Detaljan opis pronalaska

[0017] Nasuprot onome što bi se moglo pretpostaviti iz prethodnog stanja, sažeto prikazanog u tekstu gore, prema predmetnom pronalasku, sada je iznenađujuće nađeno da sledeća jedinjenja formule (I) R-N1-spermidin, ili 1,4-butandiamin,N-(3-aminopropil)- N1-R,

(I) H2N-(CH2)3-N1(R)-(CH2)4-NH2

gde je R supstituent vezan za sekundarnu amino grupu spermidina, odabran od:

- zasićenih linearnih ili razgranatih alkil grupa, koje se sastoje od 1 do 6 atoma ugljenika, kao što je metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, pentil, heksil;

- zasićene cikloalkil grupe koja je cikloheksil;

- ili njihova farmaceutski prihvatljiva so,

imaju aktivnost protiv gubitka kose suštinski uporedivu sa spermidinom, ali ne podležu problemu oksidacije u prisustvu okolnog vazduha tokom topikalne primene na kožu glave. Zapravo, oni su toliko stabilni u odnosu na vazduh, da mogu efikasno da se koriste za topikalnu primenu na koži glave, a da se ne transformišu u oksidovane sporedne proizvode koji su neaktivni, ili nisu aktivni u skladu sa ciljevima predmetnog pronalaska.

[0018] Konkretno, takođe iznenađujuće, ispostavilo se da su ova jedinjenja prema predmetnom pronalasku aktivnija od spermidina u borbi protiv alopecije, bar u pogledu konkretnih svojstava koja su gore opisana.

[0019] Predmetni pronalazak se stoga odnosi na kozmetičku upotrebu ovih jedinjenja R-N<1>-spermidina (I) za borbu protiv gubitka kose i na farmaceutske kompozicije koje ih sadrže kao aktivne sastojke, za upotrebu u borbi protiv gubitka kose.

[0020] Poželjno jedinjenje formule (I) prema predmetnom pronalasku je N<1>-metilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-metil-1,4-butandiamin (CAS registarski broj 51460-23-2), formule:

(II) H2N-(CH2)3-N1(CH3)-(CH2)4-NH2

korišćeno u kompoziciji prema pronalasku kao takvo, ili kao farmaceutski prihvatljiva so, na primer trihidrohlorid (3HCl) ili trimaleat. Sledeće poželjno jedinjenje formule (I) prema predmetnom pronalasku je N1-cikloheksilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-cikloheksil-1,4-butanediamin (CAS registarski broj 183070-28-2), formule:

(III) H2N-(CH2)3-N1(C6H11)-(CH2)4-NH2

korišćeno u kompoziciji prema pronalasku kao takvo, ili kao farmaceutski prihvatljiva so, na primer trihidrohlorid (3HCl) ili trimaleat. Sledeće poželjno jedinjenje formule (I) prema predmetnom pronalasku je N1-etilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-etil-1,4-butandiamin (CAS registarski broj 97141-36-1), formule:

(IV) H2N-(CH2)3-N1(C2H5)-(CH2)4-NH2

korišćeno u kompoziciji prema pronalasku kao takvo, ili kao farmaceutski prihvatljiva so, na primer trihidrohlorid (3HCl) ili trimaleat. Sledeće poželjno jedinjenje formule (I) prema predmetnom pronalasku je N1-propilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-propil-1,4-butandiamin (CAS registarski broj 62659-14-7), formule:

(V) H2N-(CH2)3-N1(C3H7)-(CH2)4-NH2

korišćeno u kompoziciji prema pronalasku kao takvo, ili kao farmaceutski prihvatljiva so, na primer trihidrohlorid (3HCl) ili trimaleat. Sledeće poželjno jedinjenje formule (I) prema predmetnom pronalasku je N1-izobutilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-izobutil-1,4-butandiamin, formule:

(VI) H2N-(CH2)3-N1(C4H9)-(CH2)4-NH2

korišćeno u kompoziciji prema pronalasku kao takvo, ili kao farmaceutski prihvatljiva so, na primer trihidrohlorid (3HCl) ili trimaleat. Ovo jedinjenje (VI) nije poznato u literaturi.

Postupak za njegovo sintetisanje je stoga opisan u nastavku, i odnosi se na sledeću reakcionu šemu u kojoj se jedinjenje (VI) izdvaja kao jedinjenje 4.

[0021] Sinteza jedinjenja 19: butan diamin (1 g, 0,0113 mol, 5 ekv.) je rastvoren u CH2Cl2(15 ml). Rastvoru je dodat Boc2O (0,619 g, 0,00283 mol, 1 ekv.) rastvoren u CH2Cl2(15 ml). Reakciona smeša je ostavljena da se meša na RT tokom 16 časova. Struktura proizvoda je potvrđena pomoću TLC CH2Cl28/MeOH 2/NH4O(vod.) 33% 0,2. Obrazovana suspenzija je filtrirana i filtrat je osušen na rotacionom uparivaču. Uljani ostatak je eluiran sa EtOAc (15 ml) i opran zasićenim rastvorom NaCl (3 x 10 ml) da bi se uklonio višak neizreagovanog diamina. Organski ekstrakti su dehidrirani preko natrijum sulfata i podvrgnuti uparavanju. Dobijeno je 0,520 g žutog ulja. Prinos 97,65 %.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,38 (s, 9H), 1,52-1,59 (m, 4H), 2,34 (brs, 2H, D2O razm.), 2,72-2,79 (m, 2H), 3,19-3,24 (m, 2H), 5,95 (brs, 1H, D2O razm.).

[0022] Sinteza jedinjenja 20: gore navedeno jedinjenje 19 (0,358 g, 0,00190 mol, 1 ekv.) je rastvoreno u EtOH (5 ml). Rastvoru su dodata 3A molekulska sita i izobutiraldehid (0,137 g, 0,00190 mol, 0,17 ml, 1 ekv.). Reakciona smeša je mešana na RT tokom 18 časova. Dodat je NaBH4(0,144 g, 0,0038 mol, 2 ekv.) i smeša je mešana na RT tokom 16 časova. Struktura proizvoda je potvrđena pomoću TLC CH2Cl29/MeOH 1/NH4OH(vod.) 33% 0,1. Rastvarač je uklonjen uparavanjem, i uljani ostatak je eluiran sa CH2Cl2(10 ml) i opran zasićenim rastvorom NaCl (5 ml). Organski ekstrakti su dehidrirani preko natrijum sulfata i podvrgnuti uparavanju, i dobijeni ostatak je prečišćen fleš-hromatografijom upotrebom smeše CH2Cl29/MeOH 1/NH4OH(vod.) 33% 0,1 kao fazom eluenta. Dobijeno je 0,215 mg bezbojnog ulja. Prinos 46,33%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0,88 (d, 6H, J= 6,8 Hz), 1,41 (s, 9H), 1,49-1,52 (m, 4H), 1,72- 1,75 (m, 1H), 2,38 (d, 2H, J= 7,2 Hz), 2,59 (t, 2H, J= 6,6 Hz), 3,07- 3,09 (m, 2H), 4,95 (brs, 1H, D2O razm.).

[0023] Sinteza jedinjenja 21: aminopropanol (0,49 g, 0,51 ml, 0,00652 mol, 1 ekv.) je rastvoren u toluenu (5 ml). Rastvoru je dodat SOCl2(3,10 g, 1,90 ml, 0,00261 mol, 4 ekv.) u ledenom kupatilu. Reakciona smeša je mešana pod refluksom 2 časa. Struktura proizvoda je potvrđena pomoću TLC CH2Cl29/MeOH 1/NH4OH(vod.) 33% 0,1. Rastvarač je uklonjen uparavanjem, i uljani ostatak je eluiran sa H2O (10 ml) i opran sa CH2Cl2(5 ml). Vodena faza je korišćena bez daljeg prečišćavanja u sledećem koraku, rastvoru je dodat Net3 (0,659 mg, 0,9 ml, 0,00652 mol, 1 ekv.), i smeša je mešana na RT tokom 30 minuta. Dodat je rastvor Boc2O (1,42 g, 0,00652 mol, 1 ekv.) u THF (10 ml). Reakciona smeša je mešana na RT tokom 18 časova. Nestanak početnog proizvoda procenjen je pomoću TLC petrol-etar 8/ EtOAc 2. Rastvarač je uklonjen uparavanjem, i ostatak je eluiran sa EtOAc i opran sa H2O. Organski ekstrakti su dehidrirani nad natrijum sulfatom i podvrgnuti uparavanju. Dobijeno je 1,23 g smeđeg ulja. Prinos 97,70%.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1,43 (s, 9H), 1,94- 1,97 (m, 2H), 3,26 (t, 2H, J= 6,4 Hz), 3,58 (t, 2H, J= 6,4), 4,75 (brs, 1H, D2O razm.).

[0024] Sinteza jedinjenja 22: gore navedeno jedinjenje 20 (0,120 g, 0,00049 mol, 1 ekv.) je rastvoreno u DMF (3 ml). Rastvoru je dodato gore navedeno jedinjenje 21 (0,104 g, 0,00054 mol, 1.1 ekv.) rastvoreno u DMF (2 ml). Reakciona smeša je mešana pod refluksom 6 časova. Struktura proizvoda je potvrđena pomoću TLC CH2Cl29/MeOH 1/NH4OH(vod.) 33% 0,03. Rastvarač je uklonjen uparavanjem, i uljani ostatak je prečišćen fleš-hromatografijom upotrebom smeše CH2Cl29/MeOH 1/NH4OH(vod.) 33% 0,03 kao faze eluenta. Dobijeno je 0,084 mg žutog ulja. Prinos 42,71%.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0,87 (d, 6H, J= 6,8 Hz), 1,43 (s, 18H), 1,57- 1,61 (m, 7H), 1,98- 2,01 (m, 2H), 2,31- 2,35 (m, 2H), 2,38- 2,42 (m, 2H), 3,10- 3,12 (m, 2H), 3,16- 3,18 (m, 2H), 4,72 (brs, 1H, razm. D2O), 5,69 (brs, 1H, D2O razm.).

[0025] Sinteza jedinjenja 4: na navedeno jedinjenje 22 (0,084 g, 0,00021 mol, 1 ekv.), rastvoreno u MeOH (2ml) i čuvano u ledenom kupatilu, nakapana je HCl 3N (10 ml). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 18 časova. Nestajanje polaznog proizvoda je procenjeno pomoću TLC (CH2Cl29/MeOH 1/NH4OH(vod.) 0,03). MeOH je uparen, i vodeni ostatak je opran etil etrom (2 x 8 ml) i osušen. Dobijeno je 0,065 g jedinjenja 4 u vidu trihidrohloridne soli. Prinos 100%.1H NMR (400 MHz, D2O) δ 1,02 (d, 6H, J= 6,8 Hz), 1,76-1,78 (m, 2H), 1,79- 1,84 (m, 2H), 2,14- 2,17 (m, 3H), 3,06- 3.25 (m, 6H), 3,26- 3,33 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, D2O) δ 19,27, 20,15, 21,26, 23,83, 28,92, 36,52, 38.77, 50,18, 52,66, 58,88, 60,59. MS (ESI+) m/z = 202 (M H)+

Sl. 7, 8 i 9 priloženih crteža prikazuju, respektivno,<1>H-NMR,<13>C-NMR i maseni spektar jedinjenja 4, odnosno, formule (VI) kao što je gore definisano.

PRIMERI KOMPOZICIJA

[0026] U nastavku su opisani neki primeri kompozicija prema pronalasku za topikalnu primenu na kožu glave u smislu primera. U primerima koji slede, N<1>-metil spermidin označava se odgovarajućim imenom INCI, neophodnim za upotrebu u kozmetičkim proizvodima, naime: N-metilspermidin. Ovo se takođe odnosi na druga inventivna jedinjenja koja su data kao primeri.

Primer 1

TRETMANSKI ŠAMPON ZA SMANJENJE GUBITKA KOSE

[0027]

Komponenta (INCI naziv) Količina %tež./tež.1,00-5,00 Dinatrijum lauret sulfosukcinat

Magnezijum lauret sulfat 5,00-9,00

PEG-7 gliceril kokoat 0,50-1,00

Kokamid MIPA 0,50-2,00

Peg-200 hidrogenizovani gliceril palmat 0,50-2,00

Polikvaternijum-10 0,10-0,50

Natrijum lauroil sarkozinat 1,00-4,00

Tetranatrijum EDTA 0,05-0,20

N-metilspermidin 0,001-0,30

Biotin 0,01-0,10

Kalcijum pantotenat 0,01-3,0

Kalijum undecilenoil proteina pšenice 0,50-1,00

Lauret-4 0,01-0,80

Parfem 0,10-0,80

Glikol distearat 0,50-1,00

Lauret-7 0,50-0,80

Natrijum kokoamfoacetat 0,05-3,00 Kokamidopropil betain 0,01-2,00

Natrijum lauret sulfat 0,01-3,00

Natrijum hidroksimetilglicinat 0,20-0,45

Natrijum hidroksid u dovoljnoj količini Limunska kiselina u dovoljnoj količini Voda u dovoljnoj količini do 100,00

Primer 2

TRETMANSKI LOSION ZA SMANJENJE GUBITKA KOSE

[0028]

Komponenta (INCI naziv) Količina % tež./zapr.

Voda u dovoljnoj količini do 100 ml Hidroksipropiltrimonijum hijaluronat 0,005-0,50

Poliuretan-26 0,004-4,0

Lecitin (Glicin max. L.) 0,005-5,0

Denaturisani alkohol 15,0-20,0

N-metilspermidin 0,005-0,30

Biotin 0,01-0,1 0

Kalcijum pantotenat 0,1-3,0

Rutin 0,001-0,05

PEG-40 hidrogenizovano ricinuovo ulje 0,5-2,0

Oktadecil di-t-butil-4-hidroksihidrocinamat 0,05

Parfem 0,20

Zeaksantin 0,002-0,01

Ulje semena Helianthus annuus 0,001-0,01

Mlečna kiselina u dovoljnoj količini do pH 5,0

Primer 3

BALZAM-KONDICIONER KOJI POMAŽE U SMANJENJU GUBITKA KOSE

[0029]

Komponenta (INCI naziv) Količina %tež./zapr.

Voda u dovoljnoj količini do 100 ml

1

Cetearil alkohol 0,50-7,00

PEG-40 hidrogenizovano ricinusovo ulje 0,50-2,00

Stearalkonijum hlorid 0,10-2,00

N-metilspermidin 0,010-0,30

Dinatrijum EDTA 0,025-0,05

Parfem 0,20

Natrijum hidroksimetilglicinat 0,20-0,45

Mlečna kiselina u dovoljnoj količini do pH 5,0

Primer 4

TRETMANSKI BALZAM ZA SMANJENJE GUBITKA KOSE

[0030]

Komponenta (INCI naziv) Količina tež./zapr. (%) Voda u dovoljnoj količini do 100 ml Dinatrijum EDTA 0,025-0,05

Ksilitol 0,50-1,50

Pantenol 0,50-1,50

Hidroksietil celuloza 0,10-0,90

Cetrimonijum hlorid 0,50-5,00

Kopolimer bis-izobutil PEG/PPG-20/35/amodimetikon 0,05-0,75

Cetil etilheksanoat 0,05-1,00

Polisorbat 80 0,05-4,00

Butilen glikol 0,05-3,00 Ciklopentasiloksan 0,10-3,00

C12-13 alkil laktat 0,50-5,00

Gliekril stearat 1,00-5,00

PEG-100 stearat 0,50-4,00

Dimetikon 1,00-4,00

Di metikonol 0,10-0,80

Cetearil alkohol 1,00-5,00

Fenoksietanol 0,30-0,90

Kaprilil glikol 0,30-0,90

Zeaksantin 0,00005-0,00030

Rutin 0,0005-0,003

N-metilspermidin 0,00010-0,15 Parfem 0,10-0,30

Primer 5

SERUM ZA INTENZIVNI TRETMAN KOSE

[0031]

Komponenta (INCI naziv) Količina %tež./zapr.

Voda u dovoljnoj količini do 100 ml Alkohol denat. tip C 10,00-20,00

Kalcijum pantotenat 0,05-2,00

N-metilspermidin 0,05-0,210

Kalijum oktatrienoat 0,001-0,18

Biotin 0,005-0,020

Ekstrakt lišća Ajuga reptans 0,001-0,10

Fermentisana soja/Lactobacillus 0,01-0,15

Pantenol 0,10-1,00 Hidroksipropiltrimonijum hijaluronat 0,002-0,50

Poliuretan-26 0,004-4,0

Lecitin (Glicin max. L.) 0,005-5,0

PEG-40 hidrogenizovano ricinusovo ulje 0,50-2,00

Parfem 0,10-0,30 Hidroksipropil guar 0,10-0,40

Etoksidiglikol 0,10-0,70

Mlečna kiselina 0,05-0,50

Primer 6

SERUM ZA INTENZIVNI TRETMAN PROTIV GUBITKA KOSE

[0032]

Komponenta (INCI naziv) Količina %tež./zapr. Voda u dovoljnoj količini 100 ml

Glicerin di1,00-8,00

Amonijum akrilolil-dimetiltaurat / vp kopolimer 0,50-5,00 Ciklopentasiloksan 1,00-8,00 Fenoksietanol 0,30-0,90

Parfem 0,10-0,70

Silikon kvaternijum-15 0,20-1,90

Dimetikon 0,10-6,00

Amonijum glicirizat 0,05-0,75

C11-15 paret-5 0,05-1,00

C11-15 paret-9 0,05-1,00

Dinatrijum EDTA 0,025-0,05

N-metilspermidin 0,025-0,210

Kalcijum pantotenat 0,010-0,50

Etilparaben 0,010-0,030 Metilparaben 0,05-0,120

Tridecet-5 0,010-0,40

Tridecet-10 0,010-0,40

Mlečna kiselina u dovoljnoj količini do pH 4,5

Primer 7

TRETMANSKI ŠAMPON ZA SMANJENJE GUBITKA KOSE

[0033]

Komponenta (INCI naziv) Količina %tež./tež.

Dinatrijum lauret sulfosukcinat 1,00-5,00

Magnesium lauret sulfat 5,00-9,00

PEG-7 gliceril kokoat 0,50-1,00

Kokamid MIPA 0,50-2,00

Peg-200 hidrogenizovani gliceril palmat 0,50-2,00

Polikvaternijum-10 0,10-0,50

Natrijum lauroil sarkozinat 1,00-4,00

Tetranatrijum EDTA 0,05-0,20

N-metilspermidin trimaleat 0,002-0,60

Biotin 0,01-0,10

Kalcijum pantotenat 0,01-3,0

1

Kalijum undecilenoil proteina pšenice 0,50-1,00

Lauret-4 0,01-0,80

Glikol distearat 0,50-1,00

Natrijum hidroksimetilglicinat 0,20-0,45

Voda u dovoljnoj količini do 100,00

Primer 8

TRETMANSKI LOSION ZA SMANJENJE GUBITKA KOSE

[0034]

Komponenta (INCI naziv) Količina % tež./zapr. Voda 70-90

Etil alkohol 10-20 Polioksietilenovano hidrogenizovano ricinusovo ulje 0,5-2,5

Mlečna kiselina rastv.80% 0,2-0,4

N-metilspermidin trimaleat 0,05-0,3

Parfem agrumi 2807/03 0,05-0,3 Hidroksipropiltrimonijum hijaluronat 0,01-0,1

Lecitin NAT 8539 0,01-0,1 Oktadecil di-t-butil-4-hidroksihidrocinamat 0,01-0,1 Fluorolink 5032 0,01-0,1

Primer 9

GEL ZA OBLIKOVANJE ZA JAČANJE

[0035]

Komponenta (INCI naziv) Količina % tež./zapr.

Voda 85-95

Fiksat PLUS polimer 1,5-3,5

PEG-40 hidrogenizovano ricinusovo ulje 1-3

Parfem 0,5-2

Sorbitol 0,5-2

Natrijum hidroksimetilglicinat 0,5-2

Hidroksipropil guar 0,2-1,2

Benzofenon-4 0,05-1

Gafquat 755N 0,05-1

Dinatrijum EDTA dihidrat 0,05-1

Taurin 0,025-0,1

Kalcijum D-pantotenat 0,01-0,05

Rutin 0,005-0,02

Zeaksantin 0,005-0,02

Suvi ekstrakt Ajuga Reptans 0,005-0,02

N-metilspermidin trimaleat 0,0015-0,006

Biotin 0,0001-0,0004

Primer 10

TRETMANSKI LOSION ZA SMANJENJE GUBITKA KOSE

[0036]

Komponenta (INCI naziv) Količina % tež./zapr.

Alkohol denat. 15,0-20,0

N-(3-aminopropil)-N1-izobutil-1,4-butanediamin 0,005-0,30

Biotin 0,01-0,1 0

Kalcijum pantotenat 0,1-3,0

Rutin 0,001-0,05

PEG-40 hidrogenizovano ricinusovo ulje 0,5-2,0

Oktadecil di-t-butil-4-hidroksihidrocinamat 0,05

Zeaksantin 0,002-0,01

Mlečna kiselina u dovoljnoj količini do pH 5,0 Voda u dovoljnoj količini do 100 ml

Primer 11

SERUM ZA INTENZIVNI TRETMAN KOSE

[0037]

1

Komponenta (INCI naziv) Količina %tež./zapr.

Alkohol denat. tip C 10-20

N-(3-aminopropil)-N1-etil-1,4-butanediamin 0,05-0,2,0 Hidroksipropiltrimonijum hijaluronat 0,002-0,5

Poliuretan-26 0,004-4,0

Lecitin (glicin max. L.) 0,005-5,0

PEG-40 hidrogenizovano ricinusovo ulje 0,50-2,0

Hidroksipropil guar 0,10-0,4

Etoksidiglikol 0,10-0,7

Mlečna kiselina 0,05-0,5

Voda u dovoljnoj količini do 100 ml

EKSPERIMENTALNI ODELJAK I PRILOŽENI GRAFIKONI

[0038] Izvedena su sledeća ispitivanja za aktivnost N<1>-metilspermidina, ili N-(3-aminopropil)-N1-metil-1,4-butandiamina, jedinjenja formule (II) prema pronalasku, ili u vidu slobodne baze ili uvidu soli, bilo trihidrohlorida (3HCl) ili trimaleata, poređenjem sa spermidinom (3HCl) kao kontrolom.

[0039] Na sl. 1 i 2, relevantno ispitivanje je prošireno i na N<1>-cikloheksilspermidin, N<1>-etilspermidin, N1-propilspermidin i N1-izobutilspermidin, naime, na jedinjenja formula (III), (IV), (V), (VI) prema pronalasku, u obliku trihidrohloridne soli (3HCl).

[0040] S tim u vezi, crteži u skladu sa sledećim crtežima su priloženi uz ovaj opis.

Sl. 1 i 2 su grafici rezultata testa MTT.

Sl. 3 je grafik rezultata antioksidativnog testa.

Sl. 4 je grafik rezultata testa izduživanja dlake.

Sl. 5 i 6 su grafici rezultata za anagenu i katagenu fazu u testu sa sl. 4.

[0041] Najzad, kao što je gore rečeno, sl.7, 8 i 9 prikazuju, respektivno,<1>H-NMR,<13>C-NMR i masenog spektra jedinjenja 4, odnosno, formule (VI) kao što je gore definisano.

[0042] Stabilnost i reaktivnost jedinjenja formule (I) nakon izlaganja njihovih rastvora okolnom vazduhu je takođe ispitivana.

1. Test MTT

1

Uvod

[0043] Test MTT se koristi za analizu ćelijske vijabilnosti (Mosmann, 1983). To je kolorimetrijski test koji se zasniva na upotrebi soli tetrazolijuma MTT, koji meri vijabilnost ćelija koja zatim može kvantitativno da se odredi pomoću spektrofotometrijskog čitača ploča. MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid, tetrazol), žuto jedinjenje, redukuje se u formazan, ljubičastu supstancu, u ćelijskim mitohondrijama. Apsorbanca ovog obojenog rastvora može kvantitativno da se odredi merenjem na datoj talasnoj dužini (570 nm) upotrebom spektrofotometra. Maksimalna apsorbanca će zavisiti od korišćenog rastvarača. Ova redukcija se događa samo kada su mitohondrijalni enzimi reduktaze aktivni, i pretvaranje u formazan može stoga direktno da se poveže sa brojem vijabilnih ćelija. Kada se količina proizvedenog formazana u ćelijama tretiranim supstancom uporedi sa količinom proizvedenom u netretiranim kontrolnim ćelijama, moguće je doneti zaključak o efikasnosti ispitivane supstance u izazivanju ćelijske smrti pravljenjem krive doze-odgovor. Rastvori MTT rastvorenog u PBS ili medijumu za ćelijsku kulturu, bez fenol crvenog, su žućkaste boje. U vijabilnim ćelijama, mitohondrijalne dehidrogenaze seku prsten tetrazolijuma, proizvodeći ljubičaste kristale formazana koji su nerastvorljivi u vodenim rastvorima. Kristali mogu da se rastvore u acidifikovanom izopropanolu ili DMSO. Rezultujući ljubičasti rastvor ispituje se spektrofotometrijski. Povećanje broja ćelija će rezultovati povećanjem dobijenog formazana i povećanjem apsorbance. Upotreba MTT testa ima ograničenja, na koja utiču: 1) fiziološko stanje ćelija i 2) promene u aktivnosti mitohondrijalnih dehidrogenaza u različitim tipovima ćelija. Uprkos tome, test MTT za određivanje ćelija je koristan za merenje ćelijskog rasta kao odgovora na mitogene, antigene stimuluse, faktore rasta i druge reagense koji podstiču ćelijski rast, studije citotoksičnosti, i u obrazovanju krivih ćelijskog rasta. Test MTT za određivanje ćelija je posebno koristan kada se kulture pripremaju u pločama sa više bunarčića. Za bolje rezultate, broj ćelija bi trebalo da se odredi tokom eksponencijalne faze rasta.

MATERIJALI

Biološki model

[0044] Ćelijska linija NCTC2544 humanih keratinocita (Perry V.P. et al., 1957) nabavljena je iz Nacionalnog instituta za istraživanje kancera u Genoa, Italija.

1

Parametri kultivacije

[0045] Ćelijska linija je rasla u medijumu EMEM (EBSS) sa dodatkom 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 1% NEAA 1X rastvor i 1% smeše penicilin (10000 U/ml)/streptomicin (10 000 mg/ml), i držana na 37 °C, 5% CO2u bocama za kulturu od 25 cm2. Svaka dva dana, konfluentne kulture su bile podeljene u odnosu 1:3 - 1:6, posle pranja sa PBS 1X (bez Ca2+ i Mg2+), upotrebom smeše tripsin/EDTA i zasejavane pri gustini od 2-5*10<4>ćelija/cm<2>, 37 °C, 5% CO2.

[0046] Medijum za zamrzavanje: medijum za kulturu sa dodatkom 20% FBS, 2 mM L-glutamina, 1% smeše penicilin/streptomicin i 10% DMSO.

[0047] Kvantitativno određivanje ćelija: Test sa bojom tripan plavo.

Reagensi i instrumenti

[0048]

1

METODE

Dan 1: zasejavanje ćelija

[0049] Kada su humani keratinociti NCTC 2544 dostigli konfluentnost od približno 80%, odvojeni su od podloge i sakupljeni smešom tripsin/EDTA, zasejani pri gustini od 5x10<4>ćelija/ml u ploče sa 96 bunarčića, a zatim inkubirani na 37 °C, 5% CO2(24 h).

Dani 2-3: izlaganje reagensima 24-48 h

[0050] Kada su ćelije dostigle konfluentnost od približno 80%, izložene su rastućim koncentracijama gore navedenih aktivnih jedinjenja prema pronalasku: N1-metilspermidina, u vidu slobodne baze, kao i u vidu trihidrohloridne (3HCl) i trimaleatne soli; kao i N1-cikloesilspermidina, N1-etilspermidina, N1-propilspermidina, N1-izobutilspermidina u vidu trihidrohloridne (3HCl) soli, i trihidrohloridne soli spermidina, kao reference za poređenje. Svako jedinjenje je ispitivano u duplikatu. Sledeće koncentracije svih jedinjenja su ispitivane: 1 nM, 500 nM, 1 µM, 500 µM (finalna koncentracija u medijumu za kulturu). SDS je korišćen kao interni standard.

[0051] Nakon pripreme željenih razblaženja svakog jedinjenja, medijum za kulturu je uklonjen iz ploče i bunarčići su zasejani sa 100 µl od svake koncentracije. Kontrole koje sadrže samo medijum za kulturu inokulisane su u svaku ploču.

[0052] Ćelije su inkubirane na 37 °C, 5% CO2, tokom različitih vremena tretmana (24-48 h).

Dan 4: Test MTT

[0053] Na kraju tretmana sa jedinjenjima od interesa (24-48 h) u ploči sa 96 bunarčića, medijum je uklonjen i zamenjen sa 100 µl/bunarčiću rastvora MTT, i ploče su inkubirane 3 časa na 37 °C, 5% CO2. So MTT je rastvorena u PBS (5 mg/ml) i dodata ćelijama u

1

razblaženju od 1:10 u EMEM medijumu, bez fenol crvenog, obogaćenom sa 10% FCS, 2 mM glutamina, 1% rastvorom NEAA 100X (tečni) i 1% smeše antibiotika.

[0054] Ploča je pokrivena aluminijumskom folijom. Zatim je medijum pažljivo uklonjen. U svaki bunarčić dodato je 100 µl DMSO za rastvaranje ljubičastog proizvoda formazana. Ploče su pokrivene aluminijumskom folijom i mešane 15 minuta na sobnoj temperaturi.

[0055] Apsorbanca rastvora je očitana na 570 nm sa referentnim filterom na 630 nm u čitaču mikroploča Biotek ELX808, upotrebom unapred definisanog protokola i nakon pravilnog definisanja rasporeda ploče.

Prikupljanje podataka i statistička analiza

[0056] Podaci o optičkoj gustini su zabeleženi direktno pomoću kompjuterskog programa čitača mikroploče Biotek ELKS808. Kompjuterski program automatski vrši bilo kakve transformacije.

- Transformacija 1: izračunavanje razlike OD 570-630 nm (nakon automatskog oduzimanja fona)

- Transformacija 2: izračunavanje % vitalnosti (u odnosu na kontrolu)

[0057] Dobijeni podaci su zatim ubačeni u program Excel i statistički i grafički analizirani, da bi se odredile necitotoksične koncentracije na kojima jedinjenja mogu da se ispituju.

Korišćeni reagensi i instrumenti

[0058]

2

Rezultati

[0059] Sl. 1 i 2 rezimiraju dobijene rezultate na grafikonima za 24 časa (sl. 1) odnosno 48 časova (sl. 2). Osam kolona koje su date za svaku grupu jednake koncentracije, kao što je tamo navedeno, odnose se respektivno, s leva na desno, na: spermidin, N1-metilspermidin, N1-cikloheksilspermidin, N1-etilspermidin, N1-propilspermidin, N1-izobutilspermidin, svi u obliku trihidrohloridne soli (3HCl); trimaleatnu so N1-metilspermidina; slobodnu bazu N1-metilspermidina.

[0060] Ćelijska vijabilnost je izražena u procentima nasuprot kontroli, odnosno ćelijska populacija je gajena pod standardnim uslovima bez dodatka spermidina ili jedinjenja prema pronalasku. Pri ispitivanim koncentracijama (1 nM, 500 nM, 1 mM, 500 mM), spermidin nije imao citotoksična dejstva posle 24 ili 48 časova izlaganja ćelijske linije humanih keratinocita (NCTC2544). Slično, ćelijska vijabilnost posle tretmana od 24 ili 48 časova jedinjenjima prema pronalasku (u istim koncentracijama kao spermidin) nije suštinski redukovana, i u nekim slučajevima je čak poboljšana, pokazujući nedostatak citotoksičnosti jedinjenja. Dobijeni rezultati za jedinjenja prema pronalasku nisu statistički drugačiji od onih koji su dobijeni za spermidin.

[0061] Uopšteno se može zaključiti da u testu MTT nije pokazana citotoksičnost jedinjenja prema pronalasku.

2. ANTIOKSIDATIVNI TEST – Proizvodnja reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS)

[0062] Proizvodnja reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS) praćena je spektrofluorometrijom upotrebom 2’,7’-dihlorofluorescein diacetata (DCFH-DA) kao što je opisano kod Tobi et al. (Tobi SE, Paul N, T McMillan J. J Photochem. Photobiol, B 2000: 57: 102-112).

[0063] Gore pomenute ćelije NCTC2544 (∼80% konfluentne) odvojene su od podloge pomoću tripsin/EDTA i zasejane pri gustini od 5 x 10<4>ćelija po bunarčiću, u ploče sa 96 bunarčića. Zatim su ćelije tretirane N-metilspermidinom prema pronalasku i spermidinom. Sledeće koncentracije N-metilspermidina i spermidina su ispitivane: 1 nM, 500 nM, 1 µM, 500 µM, 1 mM (finalna koncentracija u medijumu za kulturu).

[0064] Za poređenje je korišćen α-tokoferol (250 µg/ml). Ploče su inkubirane na 37 °C, u 5% CO2, 1,5 h. Ćelije koje su rasle na osnovnom medijumu sa 10% FBS korišćene su kao kontrola.

[0065] Grafikon na sl. 3 rezimira dobijene rezultate. Rezultati dobijeni određivanjem intracelularne koncentracije reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS) potvrđuju antioksidativnu aktivnost spermidina kao što se navodi u literaturi. U poređenju sa kontrolnim ćelijama tretiranim sa H2O2, ćelije tretirane sa 250 µg/ml α-tokoferola, spermidina i N-metilspermidina pokazuju snižavanje koncentracije proizvoda ROS. Poređenjem antioksidativne aktivnosti spermidina sa onom kod N-metilspermidina, nije pokazana značajna razlika.

3. TEST IZDUŽIVANJA STABLJIKE DLAKE

[0066] Aktivnost N-metilspermidina ispitivana je u ex vivo modelu koji je omogućio merenje delovanja na izduživanje stabljike dlake.

Materijali i metode

[0067] Kultura organa folikula dlake (HF) u anagenoj VI fazi uključivala je mikrodisekciju HF iz kože humanog vlasišta (temporalno-frontalna oblast) nakon informisanog pristanka ispitanika koji su bili podvrgnuti operaciji (zatezanje lica), u skladu sa Helsinškom deklaracijom i uz odobrenje Etičkog komiteta Univerziteta u Libeku. U ovom modelu, faza rasta (anagen) HF nastavljena je nekoliko dana uz obrazovanje pigmentirane stabljike brzinom koja je slična onoj kod anagene faze in vivo, dodatno ispoljavajući cikličnu aktivnost rasta in vitro, spontano ulazeći u fazu regresije ciklusa dlake (katagen).

[0068] Za imunohistohemijska ispitivanja, izolovani folikuli su kultivisani 6 uzastopnih dana.

[0069] Spermidin, N-metilspermidin i nosač (destilovana voda) su primenjeni jednom za svaku promenu medijuma za kulturu (svakih 48 časova), u koncentraciji od 0.5 µM.

[0070] Zamrznuti odsečci su u skladišteni na -80 °C do korišćenja.

Merenje rasta dlake

[0071] Merenja izduživanja stabljike posle tretmana nosačem, spermidinom i N-metilspermidinom sprovođena su na dane 0, 1, 4 i 6, upotrebom invertnog binokularnog mikroskopa Zeiss sa jednim okularom koji sadrži mrežicu (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemačka).

Rezultati

[0072] Rezultati izduživanja stabljike prikazani su na grafikonu na sl. 4, koji prikazuje rezultate na dan 6. I spermidin i N-metilspermidin prema pronalasku značajno poboljšavaju izduživanje stabljike dlake u odnosu na nosač. Zapažena razlika između spermidina i N-metilspermidina nije statistički značajna, i stoga dejstvo na izduživanje treba smatrati uporedivim u ova dva slučaja koja se porede.

4. REZULTATI ZA ANAGENU I KATAGENU FAZU

[0073] Sledeći rezultati za anagenu i katagenu fazu, rezimirani na grafikonima na sl. 5 i 6, takođe su dobijeni iz istog ex vivo modela folikula dlake (HF) opisanog u prethodnom testu izduživanja stabljike dlake.

[0074] Grafikon na sl. 5 prikazuje procenat folikula tretiranih sa N-metilspermidinom u različitim fazama ciklusa rasta.

[0075] Iz ovoga može da se vidi da posle 6 dana tretmana N-metilspermidinom dolazi do značajnog povećanja procenta folikula dlake u anagenoj fazi i smanjenja onih koji su u katagenoj fazi. U prisustvu N-metilspermidina, samo 30% (približno) folikula ulazi u katagen spontano, dok u prisustvu nosača više od 60% folikula ulazi u katagen.

[0076] Grafikon na slici 6 prikazuje odgovarajuće procentualne vrednosti za kontrolu faza folikula dobijene za spermidin (0.5 µM) i N-metilspermidin (0.5 µM).

2

[0077] Poređenje između dva jedinjenja iznenađujuće pokazuje veće dejstvo produžavanja anagene faze u slučaju N-metilspermidina u odnosu na spermidin. Stoga, broj dlaka koje ulaze u katagenu fazu (podeljenu u stadijume: početni, srednji i završni) bio je značajno niži posle tretmana N-metilspermidinom u odnosu na tretman spermidinom.

5. REZULTATI ZA REAKTIVNOST

[0078] Svojstva 1,4-butandiamin,N-(3-aminopropil)-N1-metila (II) i 1,4-butandiamin,N-(3-aminopropil)-N1-cikloheksila (III) posle izlaganja vazduhu ispitivana su poređenjem sa odgovarajućim nesupstituisanim derivatom, u kome N<1>amino grupa kojoj nedostaje R supstituent postaje sekundarna amino grupa, naime 1,4-butandiamin,N-(3-aminopropil). Budući da jedan od uobičajenih proizvoda oksidacije sekundarne amino grupe ima oblik N-nitrozo-derivata koji se obrazuju reakcijom sa oksidima azota prisutnim u vazduhu, nitrozovani derivati koji su obrazovani nakon ostavljanja rastvora ispitivanih jedinjenja u kontaktu sa okolnim vazduhom određivani su kao parametar reaktivnosti.

Materijali i metode

[0079] Korišćena instrumentacija se sastojala od stadijuma na kome su izvršene i analiza nitritnih jona i analiza N-nitrozamina, pri čemu je ova druga sprovedena pod jakim denitrozirajućim uslovima. Azotni oksid koji se razvio u skladu sa količinom nitritnih jona i onaj koji se razvio u skladu sa količinom nitrozo grupa procenjen je pomoću hemiluminometrijskog detektora.

[0080] Sadržaj jona NO<2->analiziran je upotrebom redukujuće smeše sirćetna kiselina/kalijum jodid (5 ml/1 ml 5% H2O rastv.) na temperaturi od 0-4 °C. Nitrozo grupe su analizirane upotrebom denitrozirajuće smeše sirćetna kiselina/bromovodonična kiselina (5 ml/1 ml) na temperaturi od 70 °C.

[0081] Reagensi su komercijalno dostupni na primer kod Sigma-Aldrich. Korišćeni su gasovi (He2i NO) visoke čistoće.

[0082] Postupak za određivanje oksidacije jedinjenja vazduhom izveden je kao što sledi.

a) rastvor od 2 mM ispitivane supstance u prečišćenoj vodi je dvostruko zasejan, u količini jednakoj 500 µl u odgovarajućim bunarčićima ploča sa šest bunarčića od inertnog plastičnog materijala (polistirena);

b) rastvor u svakom bunarčiću je razblažen sa 500 µl smeše prečišćene vode i etanola (85/15) bez kontaminacije. Ovo podstiče disperziju tečnog filma na površini bunarčića;

c) ovako pripremljena ploča izložena je okolnom vazduhu tokom 72 h

d) na kraju vremena izlaganja, ostatak u bunarčiću je eluiran sa 1 ml prečišćene vode i zatim korišćen za hemiluminometrijsku analizu.

Rezultati

[0083]

6. ZAKLJUČCI

[0084] U pogledu nedostatka citotoksičnosti, antioksidativne aktivnosti prema ROS i izduživanja stabljike, gore navedeni eksperiment pokazuje da jedinjenje prema pronalasku daje rezultate koji se suštinski ne razlikuju od onih koji se mogu dobiti sa spermidinom.

[0085] Takođe, iznenađujuće, N-metilspermidin izgleda ima veću aktivnost od spermidina u produžavanju anagene faze dlake.

[0086] Iako stimulisanje izduživanja stabljike i produžavanje anagena doprinose fiziološkom rastu dlake, sa kliničke tačke gledišta, rezultat vezan za produženje anagene faze se može smatrati značajnijim i relevantnim u odnosu na dejstvo izduživanja stabljike, budući da produžena anagena faza ima neposredan pozitivan uticaj na smanjenje gubitka kose, što je glavni cilj pronalaska.

[0087] Aktivnost produžavanja anagene faze i relativna inhibicija katagene faze, kao što je gore navedeno za N-metilspermidin, korisna je u borbi protiv mnogih različitih oblika gubitka kose, ili alopecije, koji se odlikuju prekomernim opadanjem kose zbog nefiziološkog skraćivanja anagene faze, na primer prouzrokovanog androgenima, perifolikularnim

2

zapaljenjem, nedostatkom gvožđa i estrogenima, ili primenom lekova koji izazivaju nefiziološko opadanje kose kao sporedni efekat.

[0088] Iz gornjeg opisa kao celine, može se videti da su jedinjenja opšte formule (I) aktivna u skladu sa ciljevima ovog pronalaska, i takođe dovoljno stabilna da omoguće efikasnu upotrebu u topikalnoj primeni na koži glave, bez potencijalne transformacije u drugu supstancu, koja više nije aktivna, kao rezultat oksidacije.

2

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Kozmetička upotreba jedinjenja formule (I) R-N<1>-spermidina, ili 1,4-butandiamin,N-(3-aminopropila)-N1-R,

(I) H2N-(CH2)3-N1(R)-(CH2)4-NH2

naznačena time, što je R supstituent vezan za sekundarnu amino grupu spermidina, odabran od:

- zasićenih linearnih ili razgranatih alkil grupa, koje se sastoje od 1 do 6 atoma ugljenika

- zasićene cikloalkil grupe koja je cikloheksil, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, za borbu protiv gubitka kose.

2. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što se navedeno jedinjenje formule (I) primenjuje topikalno na kožu glave.

3. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-metilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-metil-1,4-butandiamin formule:

(II) H2N-(CH2)3-N1(CH3)-(CH2)4-NH2

4. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-cikloheksilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-cikloheksil-1,4-butandiamin formule:

(III) H2N-(CH2)3-N1(C6H11)-(CH2)4-NH2

5. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-etilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-etil-1,4-butandiamin formule:

(IV) H2N-(CH2)3-N1(C2H5)-(CH2)4-NH2

2

6. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-propilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-propil-1,4-butandiamin formule:

(V) H2N-(CH2)3-N1(C3H7)-(CH2)4-NH2

7. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-izobutilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-izobutil-1,4-butandiamin formule:

(VI) H2N - (CH2)3- N1(C4H9) - (CH2)4- NH2

8. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) u obliku trihidrohloridne soli.

9. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) u obliku soli sa maleinskom kiselinom.

10. Kozmetička upotreba prema patentnom zahtevu 1, za podsticanje fiziološkog rasta kose istovremeno putem efekta stimulacije izduživanja stabljike dlake i produženja anagene faze.

11. Farmaceutska kompozicija za terapijsku upotrebu za borbu protiv gubitka kose naznačena time, što je jedinjenje formule (I) R- N<1>-spermidin, ili 1,4-butandiamin,N-(3-aminopropil)-N1-R,

(I) H2N - (CH2)3- N1 (R) - (CH2)4- NH2

gde je R supstituent vezan za sekundarnu amino grupu spermidina, odabran od:

- zasićenih linearnih ili razgranatih alkil grupa, koje se sastoje od 1 do 6 atoma ugljenika

- zasićene cikloalkil grupe koja je cikloheksil;

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, formulisano sa ekscipijensima pogodnim za topikalnu primenu na kožu glave.

12. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-metilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-metil-1,4-butandiamin formule:

(II) H2N - (CH2)3- N1(CH3) - (CH2)4- NH2

13. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-cikloheksilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-cikloheksil-1,4-butandiamin formule:

(III) H2N - (CH2)3- N1(C6H11) - (CH2)4-NH2

14. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-etilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-etil-1,4-butandiamin formule:

(IV) H2N - (CH2)3- N1(C2H5) - (CH2)4- NH2

15. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-propilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-propil-1,4-butandiamin formule:

(V) H2N - (CH2)3- N1(C3H7) - (CH2)4- NH2

16. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) N1-izobutilspermidin, ili N-(3-aminopropil)-N1-izobutil-1,4-butandiamin formule:

(VI) H2N - (CH2)3- N1(C4H9) - (CH2)4- NH2

17. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, naznačena time, što je navedeno jedinjenje formule (I) prisutno u količini od između 0,001 i 0,30 procenata po težini.

18. Jedinjenje N1-izobutilspermidin, ili jedinjenje N-(3-aminopropil)-N1-izobutil-1,4-butandiamin formule:

(VI) H2N - (CH2)3- N1(C4H9) - (CH2)4- NH2

19. Jedinjenja formule (I) R-N1-spermidin, ili 1,4-butandiamin,N-(3-aminopropil)- N1-R,

(I) H2N - (CH2)3- N1(R) - (CH2)4- NH2

gde je R supstituent vezan za sekundarnu amino grupu spermidina, odabran od:

2

- zasićenih linearnih ili razgranatih alkil grupa, koje se sastoje od 1 do 6 atoma ugljenika

- zasićene cikloalkil grupe koja je cikloheksil;

ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, za upotrebu u lečenju alopecije.