RS58913B1 - Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije - Google Patents

Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije

Info

Publication number
RS58913B1
RS58913B1 RS20190799A RSP20190799A RS58913B1 RS 58913 B1 RS58913 B1 RS 58913B1 RS 20190799 A RS20190799 A RS 20190799A RS P20190799 A RSP20190799 A RS P20190799A RS 58913 B1 RS58913 B1 RS 58913B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fab
domain
molecule
amino acid
antigen binding
Prior art date
Application number
RS20190799A
Other languages
English (en)
Inventor
Oliver Ast
Marina Bacac
Sabine Imhof-Jung
Christiane Jaeger
Christian Klein
Stefan Klostermann
Michael Molhoj
Joerg Thomas Regula
Wolfgang Schaefer
Pablo Umaña
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53758236&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58913(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS58913B1 publication Critical patent/RS58913B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

OPIS
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se generalno odnosi na bispecifične antigen vezujuće molekule za aktiviranje T ćelija. Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju takve bispecifične antigen vezujuće molekule, i vektore i ćelije domaćina koji sadrže takve polinukleotide. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju bispecifičnih antigen vezujućih molekula iz pronalaska, i na postupke za primenu tih bispecifičnih antigen vezujućih molekula u lečenju bolesti.
Osnova
Selektivno uništenje pojedinačne ćelije ili specifičnog tipa ćelija je često poželjno u različitim kliničkim postavkama. Na primer, primarni cilj terapije karcinoma je da posebno uništi tumorske ćelije, dok ostavlja zdrave ćelije i tkiva netaknute i neoštećene.
Atraktivan način da se to postigne je indukcija imunog odgovora protiv tumora, da bi imunske efektorske ćelije, kao što su ćelije prirodne ubice (NK) ili citotoksični T limfociti (CTL), napale i uništile tumorske ćelije. CTL predstavljaju najsnažnije efektorske ćelije imunskog sistema, ali se ne mogu aktivirati efektorskim mehanizmom posredovanim Fc domenom konvencionalnih terapijskih antitela.
U tom smislu, bispecifična antitela dizajnirana da se vežu jednim "krakom" za površinski antigen na ciljnim ćelijama, i drugim "krakom" za aktivirajuću, nepromenljivu komponentu kompleksa T ćelijskih receptora (TCR), postala su interesantna poslednjih godina. Istovremeno vezivanje takvog antitela za oba cilja će izazvati privremenu interakciju između ciljne ćelije i T ćelije, uzrokujući aktivaciju bilo koje citotoksične T-ćelije, i kasniju lizu ciljne ćelije. Dakle, imunski odgovor se preusmerava na ciljne ćelije i ne zavisi od prezentacije peptidnog antigena od strane ciljne ćelije ili specifičnosti T-ćelije, kao što je relevantno za normalnu MHC-ograničenu aktivaciju CTL. U ovom kontekstu, ključno je da se CTL aktiviraju samo kada ciljna ćelija predstavlja bispecifično antitelo za njih, tj. imitira se imunološka sinapsa. Naročito poželjna su bispecifična antitela koja ne zahtevaju pretkondicioniranje limfocita ili kostimulaciju kako bi se izazvala efikasna liza ciljnih ćelija.
Razvijeno je nekoliko formata bispecifičnih antitela, i ispitana je njihova prikladnost za imunoterapiju posredovanu T ćelijama. Od njih, takozvani BiTE (bispecifični T-ćelijski angažer) molekuli su veoma dobro okarakterisani, i već su se pokazali obećavajuće na kliničkim ispitivanjima (revijalni rad Nagorsen i Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)). BiTE-ovi su tandemski molekuli scFv u kojima su dva molekula scFv spojena fleksibilnim veznikom. Dalji bispecifični formati koji se procenjuju za uključivanje T ćelija uključuju dijatela (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) i njihove derivate, kao što su tandemska dijatela (Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66(1999)). Noviji razvoj predstavljaju takozvani DART (dvostruki afinitet za ponovno ciljanje) molekuli, koji se baziraju na formatu dijatela, ali imaju C-terminalni disulfidni most za dodatnu stabilizaciju (Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)). Takozvani triomabovi, koji su celi hibridni mišji/pacovski molekuli IgG, i koji se trenutno procenjuju u kliničkim ispitivanjima, predstavljaju format veće veličine (revijalni rad Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Različiti formati koji se razvijaju pokazuju veliki potencijal koji se pripisuje preusmeravanju T ćelija i aktivaciji u imunoterapiji. Zadatak generisanja bispecifičnih antitela koja su za to pogodna, međutim, nipošto nije trivijalan, i uključuje niz izazova koji se moraju ispuniti u vezi sa efikasnošću, toksičnošću, primenljivošću i produktivnošću antitela.
Mali konstrukti kao što su, na primer, BiTE molekuli - dok su u stanju da efikasno unakrsno povezuju efektorske i ciljne ćelije - imaju veoma kratak poluživot u serumu, koji zahteva da se daju pacijentima putem kontinualne infuzije. Formati slični IgG-u, sa druge strane, iako imaju veliku korist od dugog poluživota, imaju manu što su toksični vezano za nativne efektorske funkcije svojstvene molekulima IgG. Njihov imunogeni potencijal predstavlja još jednu nepovoljnu karakteristiku za uspešan terapijski razvoj bispecifičnih antitela nalik na IgG, posebno kod nehumanih formata. Konačno, glavni izazov u opštem razvoju bispecifičnih antitela je proizvodnja konstrukata bispecifičnih antitela u klinički dovoljnoj količini i čistoći, zbog pogrešnog sparivanja teških i lakih lanaca antitela različitih specifičnosti posle koekspresije, što smanjuje prinos ispravno sastavljenog konstrukta i dovodi do brojnih nefunkcionalnih sporednih proizvoda, od kojih može biti teško razdvojiti željeno bispecifično antitelo.
Različiti pristupi su uzeti za prevazilaženje problema vezivanja lanca u bispecifičnim antitelima (vidi npr. Klein et al., mAbs 6, 653-663 (2012)). Na primer, strategija "dugme u rupici" ima za cilj prinudno sparivanje dva različita teška lanca antitela uvođenjem mutacija u CH3 domene radi modifikacije kontaktne međupovršine. Na jednom lancu, glomazne aminokiseline se zamenjuju aminokiselinama sa kratkim bočnim lancima, da bi se stvorila "rupica". Nasuprot tome, aminokiseline sa velikim bočnim lancima se uvode u drugi CH3 domen, da bi se stvorilo "dugme". Koekspresijom ova dva teška lanca (i dva identična laka lanca, koji moraju biti prikladni za oba teška lanca), primećeni su visoki prinosi heterodimera ("dugme-rupica") u odnosu na homodimer ("rupica-rupica" ili "dugme-dugme") (Ridgway, JB, et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; i WO 96/027011). Procenat heterodimera mogao bi se dodatno povećati remodelovanjem interakcijskih površina dva CH3 domena, koristeći pristup displeja faga i uvođenje disulfidnog mosta za stabilizaciju heterodimera (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35). Novi pristupi za tehnologiju dugmeta u rupici opisani su npr. u EP 1870459 A1.
Međutim, strategija ''dugme u rupici'' ne rešava problem pogrešnog sparivanja teški lanac - laki lanac, koji se javlja u bispecifičnim antitelima koja sadrže različite lake lance za vezivanje za različite ciljne antigene.
Strategija za sprečavanje pogrešnog sparivanja teški lanac - laki lanac je razmena domena između teških i lakih lanaca jednog od vezujućih krakova bispecifičnog antitela (vidi WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 i Schaefer, W. et al., PNAS, 108 (2011) 11187-11191, koji se odnose na bispecifična antitela IgG sa unakrsno izmenjenim domenom).
Razmena varijabilnih domena teškog i lakog lanca VH i VL u jednom od vezujućih krakova bispecifičnog antitela (WO2009/080252, vidi takođe Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191) jasno smanjuje sporedne proizvode uzrokovane pogrešnim sparivanjem lakog lanca protiv prvog antigena sa pogrešnim teškim lancem protiv drugog antigena (u poređenju sa pristupom bez takve razmene domena). Dokument EP2647707 opisuje molekulske sklopove koji sadrže kombinaciju strategije "dugme u rupici" sa zamenom CL i CH1 domena. Ipak, ovi preparati antitela nisu potpuno bez sporednih proizvoda. Glavni sporedni proizvod zasnovan je na interakciji tipa Bens Džons (Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191; na slici S1I dodatka). Dalje smanjenje takvih sporednih proizvoda je poželjno da bi se poboljšao npr. prinos takvih bispecifičnih antitela.
Imajući u vidu teškoće i nedostatke povezane sa trenutno dostupnim bispecifičnim antitelima za imunoterapiju posredovanu T ćelijama, ostaje potreba za novim, poboljšanim formatima takvih molekula. Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifične antigen vezujuće molekule za aktiviranje i preusmeravanje T ćelija, koji kombinuju dobru efikasnost i produktivnost sa niskom toksičnošću i povoljnim farmakokinetičkim svojstvima.
Sažetak pronalaska
Pronalazak je kao što je definisan u zahtevima.
Prema ovim pronalaskom, odnos željenog bispecifičnog antitela u poređenju sa neželjenim sporednim proizvodima, posebno sporednim proizvodima tipa Bens Džons koji se javljaju u bispecifičnim antitelima sa VH/VL domenom u jednom od vezujućih krakova, može se poboljšati uvođenjem naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem na specifičnim položajima aminokiselina u CH1 i CL domenima.
Prema tome, u prvom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, koji sadrži
(a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen;
(b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim;
(c) treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen; i
(d) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju; pri čemu, prvi antigen je antigen ciljne ćelije, a drugi antigen je aktivirajući T-ćelijski antigen, konkretno CD3, konkretnije CD3 epsilon;
pri čemu, treći molekul Fab pod c) je identičan prvom molekulu Fab pod a);
pri čemu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) ili lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c), aminokiselina u položaju 147 je zamenjena glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), i aminokiselina u položaju 213 je zamenjena glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu);
i pri čemu, Fc domen je Fc domen IgG,
i pri čemu je u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice u koju izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira; i pri čemu
(i) prvi molekul Fab pod a) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab pod b), a drugi molekul Fab pod b) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d), ili
(ii) drugi molekul Fab pod b) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab pod a), a prvi molekul Fab pod a) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d).
U određenom otelotvorenju, ne više od jednog molekula Fab sposobnog za specifično vezivanje sa aktivirajućim T-ćelijskim antigenom je prisutno u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije (tj. bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije omogućava jedovalentno vezivanje za aktivirajući T ćelijski antigen).
U jednom otelotvorenju, antigen ciljne ćelije je CD20.
U jednom aspektu otkrića bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom aspektu lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U daljem aspektu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom aspektu otkrića, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom daljem aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), i aminokiselina u položaju 123 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom daljem aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U posebnom otelotvorenju, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom posebnom otelotvorenju, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži
(a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen;
(b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim; pri čemu je prvi antigen, antigen ciljne ćelije, a drugi antigen je aktivirajući T-ćelijski antigen; i
pri čemu je u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), i aminokiselina u položaju 123 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom aspektu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema otkriću, u konstantnom domenu CL drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom aspektu otkrića, u konstantnom domenu CL drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) i u konstantnom domenu CH1 drugog Fab molekula pod b) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom aspektu otkrića, u konstantnom domenu CL drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)) i aminokiselina u položaju 123 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju, nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), i u konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, u konstantnom domenu CL drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom otelotvorenju, u konstantnom domenu CL drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku dalje sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen.
Treći molekul Fab je identičan prvom molekulu Fab. Treći molekul Fab tako sadrži iste aminokiselinske supstitucije kao i prvi molekul Fab.
Prvi i treći molekul Fab se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije, a drugi molekul Fab se specifično vezuje za aktivirajući antigen T ćelije, konkretno CD3, konkretnije CD3 epsilon.
Prvi molekul Fab pod a) i drugi molekul Fab pod b) su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog veznika. U specifičnom otelotvorenju, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U alternativnom otelotvorenju, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U otelotvorenjima gde je ili (i) drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab ili (ii) prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, dodatno laki lanac Fab molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu biti spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog veznika. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovom pronalasku dodatno sadrži Fc domen IgG sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku može imati različite konfiguracije, tj. prvi, drugi (i eventualno treći) molekul Fab mogu biti spojeni jedan sa drugim i sa Fc domenom na različite načine. Komponente mogu biti spojene jedna sa drugom direktno ili, poželjno, preko jednog ili više pogodnih peptidnih veznika. Tamo gde postoji spajanje sa N-terminusom podjedinice Fc domena, ono je tipično preko regiona šarke imunoglobulina.
U jednom otelotvorenju, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U takvom otelotvorenju, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab.
U jednom aspektu otkrića, prvi i drugi molekul Fab su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena. U ovom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini sadrži molekul imunoglobulina, pri čemu su u jednom kraku Fab varijabilni regioni teškog i lakog lanca VH i VL razmenjeni/zamenjeni jedan drugim (vidi sliku 1A, D).
U jednom otelotvorenju, treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U posebnom takvom otelotvorenju, drugi i treći molekul Fab su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U ovom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini sadrži molekul imunoglobulina, pri čemu su varijabilni regioni VH i VL teškog i lakog lanca u jednom od krakova Fab razmenjeni/zamenjeni jedan drugim, i pri čemu je dodatni (konvencionalni) molekul Fab spojen N-krajem sa pomenutim krakom Fab (vidi sliku 1B, E). U drugom takvom otelotvorenju, prvi i treći molekul Fab su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, a drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U ovom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini sadrži imunoglobulinski molekul sa dodatnim molekulom Fab spojenim N-krajem sa jednim od krakova Fab imunoglobulina, pri čemu su u pomenutom dodatnom molekulu Fab varijabilni regioni teškog i lakog lanca VH i VL razmenjeni/zamenjeni jedan drugim (vidi sliku 1C, F).
U svim različitim konfiguracijama bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, ovde opisane aminokiselinske supstitucije su u CH1 i CL domenima prvog i trećeg molekula Fab.
U određenim otelotvorenjima bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, konstantni domen CL prvog i trećeg molekula Fab je kapa izotipa. U drugim otelotvorenjima bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, konstantni domen CL drugog molekula Fab je kapa izotipa. U nekim otelotvorenjima, konstantni domen CL prvog i trećeg molekula Fab i konstantni domen CL drugog molekula Fab su kapa izotipa.
U određenom otelotvorenju, molekul imunoglobulina koji se nalazi u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku je imunoglobulin klase IgG.
U još konkretnijem otelotvorenju, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG1. U drugom otelotvorenju, imunoglobulin je IgG4potklasa imunoglobulina.
U bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije, Fc domen je Fc domen IgG. U konkretnom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1. U drugom konkretnom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4. U još konkretnijem aspektu otkrića, Fc domen je FC domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju S228P (Kabatova numeracija). U konkretnim otelotvorenjuima, Fc domen je humani Fc domen.
Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena. Aminokiselinski ostatak u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena zamenjen je aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se generiše izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, i aminokiselinski ostatak u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira.
U posebnom otelotvorenju, Fc domen pokazuje smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1. U određenim otelotvorenjima, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. U jednom otelotvorenju, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc domenu koji smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je u jednom ili više položaja izabranih iz grupe koju čine L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U određenim otelotvorenjima, svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su navedene aminokiselinske supstitucije L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, posebno Fc domen humanog IgG1. U drugim otelotvorenjima, svaka podjedinica Fc domena sadrži dve aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su pomenute aminokiselinske supstitucije L235E i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4, posebno Fc domen humanog IgG4. U jednom aspektu, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije je FC domen IgG4, a sadrži aminokiselinske supstitucije L235E i S228P (SPLE) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U specifičnom otelotvorenju, Fc receptor je humani FcγRIIa, FcγRI i/ili FcγRIIIa. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).
U specifičnom otelotvorenju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, molekul Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen, konkretno CD3, konkretnije CD3 epsilon, sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10. U još specifičnijem otelotvorenju, molekul Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen, konkretno CD3, konkretnije CD3 epsilon, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3 i varijabilnom regionu lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 7. U jednom specifičnom otelotvorenju, drugi molekul Fab sadržan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku specifično se vezuje za CD3, konkretnije CD3 epsilon, i sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10. U još specifičnijem otelotvorenju, pomenuti molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7.
U daljem specifičnom otelotvorenju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, molekul Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije, konkretno CD20, sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51. U još specifičnijem otelotvorenju, molekul Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije, konkretno CD20, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 30 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 31. U jednom specifičnom otelotvorenju, prvi i treći molekul Fab sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, specifično se vezuju za CD20, i sadrže region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51.
U još konkretnijem otelotvorenju, pomenuti prvi i treći molekul Fab sadrže varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
U određenom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije kao što je navedeno u zahtevima, pri čemu
(i) prvi antigen je CD20, i drugi antigen je CD3, konkretno CD3 epsilon;
(ii) prvi molekul Fab pod a) i treći molekul Fab pod c) svaki sadrže region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51, a drugi molekul Fab pod b) sadrži CDR 1 teškog lanca SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 8 CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10;
(iii) u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana lizinom (K) ili argininom (R), posebno argininom (R) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 147 supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i
(iv) prvi molekul Fab pod a) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab pod b), a drugi molekul Fab pod b) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d).
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je navedeno u zahtevima, pri čemu
(i) prvi antigen je CD20, i drugi antigen je CD3, konkretno CD3 epsilon;
(ii) prvi molekul Fab pod a) i treći molekul Fab pod c) svaki sadrže region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51, a drugi molekul Fab pod b) sadrži CDR 1 teškog lanca SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 67, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 68 ,CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10;
(iii) u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana lizinom (K) ili argininom (R), posebno argininom (R) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i
(iv) prvi molekul Fab pod a) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab pod b), a drugi molekul Fab pod b) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d).
U skladu sa drugim aspektom ovog pronalaska, obezbeđen je jedan ili više izolovanih polinukleotida koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz pronalaska. Pronalazak dalje obezbeđuje jedan ili više ekspresionih vektora koji sadrže izolovani polinukleotid(e) iz pronalaska, i ćeliju domaćina koja sadrži izolovani polinukleotid(e) ili vektor(e) ekspresije iz pronalaska. U nekim aspektima pronalaska, ćelija domaćina je eukariotska ćelija, posebno ćelija sisara.
U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, koji obuhvata korake a) uzgajanja ćelije domaćina iz ovog pronalaska pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije i b) povraćaj bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Isto tako, pronalazak obuhvata upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije i farmaceutsku kompoziciju ovog pronalaska. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu kao lek. U jednom aspektu je obezbeđen bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U posebnom otelotvorenju bolest je kancer.
Takođe, obezbeđen je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno; takođe je opisan postupak lečenja bolesti kod pojedinca, koji se sastoji od davanja navedenom pojedincu terapeutski efektivne količine kompozicije koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku u farmaceutski prihvatljivom obliku. U bilo kom od gore navedenih otelotvorenja pojedinac je poželjno sisar, naročito čovek.
Takođe je otkrivena upotreba za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora, koja se sastoji od dovođenja u kontakt ciljne ćelije sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T-ćelije iz pronalaska u prisustvu T ćelije, posebno citotoksične T ćelije.
Kratak opis slika
SLIKA 1. Primeri za konfiguracije bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije (TCB) iz pronalaska. (A, D) Ilustracija molekula "1 1 CrossMab". (B, E) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab" sa alternativnim redosledom CrossFab i Fab komponenata ("invertovani"). (C, F) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab". (G, K) Ilustracija molekula "1 1 IgG CrossFab" sa alternativnim redosledom Crossfab i Fab komponenata ("invertovani"). (H, L) Ilustracija molekula "1 1 IgG CrossFab". (I, M) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab" sa dva CrossFab-a. (J, N) Ilustracija molekula "2 1 IgG CrossFab" sa dva CrossFab-a i alternativnim redosledom Crossfab i Fab komponenata ("invertovani"). (O, S) Ilustracija molekula "Fab-Crossfab". (P, T) Ilustracija molekula “Crossfab-Fab”. (Q, U) Ilustracija molekula “(Fab)2-Crossfab”. (R, V) Ilustracija molekula “CrossFab-(Fab)2”. (W, Y) Ilustracija molekula “Fab-(CrossFab)2”. (X, Z) Ilustracija molekula “(CrossFab)2-Fab”. Crna tačka: opciona modifikacija u Fc domenu koja promoviše heterodimerizaciju. +, --: aminokiseline suprotnih naelektrisanja uvedene u CH i CL domene.
SLIKA 2. Ilustracija TCB-ova pripremljenih u Primeru 1. (A) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez izmena naelektrisanja (CH1/CL razmena u CD3 vezivaču), (B) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (C) "2 1 IgG CrossFab" sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (D) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez izmena naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču), (E) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez izmena naelektrisanja ( VH-CH1/VL-CL razmena u CD3 vezivaču), (F) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD20 vezivačima, izmena naelektrisanja u CD3 vezivaču, EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K), (G) "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa izmenama naelektrisanja i DDKK mutacijom u Fc regionu (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (H) "1 1 CrossMab ”sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivaču, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (I) "1 1 CrossMab" sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivaču, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K, različit vezivač za CD20), (J) "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa izmenama naelektrisanja 213E, 123R (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, izmena naelektrisanja u CD20 vezivaču, E = 213E; R = 123R), (K) “2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa izmenama naelektrisanja (VH/VL razmena i izmena naelektrisanja u CD3 vezivaču).
SLIKA 3. (A-I, N, O) CE-SDS analiza TCB-ova pripremljenih u Primeru 1 (finalni prečišćeni preparati). (A) Elektroferogram molekula “A”, prikazan na slici 2A, (B) elektroferogram molekula ”B”, prikazan na slici 2B, (C) elektroferogram molekula ”C”, prikazan na slici 2C, (D) elektroferogram molekula ”D”, prikazan na slici 2D, (E) elektroferogram molekula ”E”, prikazan na slici 2E, (F) elektroferogram molekula ”F”, prikazan na slici 2F, (G) elektroferogram molekula ”G”, prikazan na slici 2G, (H) elektroferogram molekula ”H”, prikazan na slici 2H, (I) elektroferogram molekula ”I”, prikazan na slici 2I, (N) elektroferogram molekula ”J”, prikazan na slici 2J, (O) elektroferogram molekula ”K”, prikazan na slici 2K. Traka A = neredukovana, traka B = redukovana. (J-L, P, Q) SDS-PAGE analiza TCB-ova pripremljenih u Primeru 1 nakon prvog koraka prečišćavanja (afinitetna hromatografija sa proteinom A). (J) 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, neobojeni standard, Invitrogen); traka 2-11 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula B, (K) 3-8% Tris-Acetat SDS-PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (HiMark, Invitrogen); traka 2-12 = frakcije iz afinitetne hormatografije sa proteinom A molekula C, (L) 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, neobojeni standard, Invitrogen); traka 2-14 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula D, (P) 4-12% Bis/Tris SDS PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, Invitrogen); traka 2-10 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula J, (Q) 4-12% Bis/Tris SDS PAGE, neredukovan; traka 1 = marker (Mark 12, Invitrogen); traka 2-12 = frakcije iz afinitetne hromatografije sa proteinom A molekula K. (M) Preparativna gel hromatografija (SEC; prvi korak prečišćavanja) TCB-ova pripremljenih u Primeru 1 (molekul A (prvi korak SEC), B i D, kako je naznačeno).
SLIKA 4. CD3 i CD20 vezivanje anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskih bispecifičnih (TCB) antitela (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”) (vidi Primer 1).
SLIKA 5. Liza tumorskih ćelija indukovana anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”) nakon 22 h inkubacije sa humanim PBMC (vidi Primer 1).
SLIKA 6. Aktivacija CD8<+>T-ćelija (A) ili CD4<+>T-ćelija (B) nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija posredstvom T-ćelija (Nalm-6) indukovana antiCD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima ("CD20 TCB") sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja ("naelektrisani ostaci") (vidi Primer 1).
SLIKA 7. Aktivacija CD8<+>T-ćelija (A) ili CD4<+>T-ćelija (B) nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija posredstvom T-ćelija (Z-138) izazvanog anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima ("CD20 TCB") sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja ("naelektrisani ostaci") (vidi Primer 1).
SLIKA 8. Iscrpljivanje B ćelija u punoj krvi zdravog čoveka nakon inkubacije sa anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”); test od 22 h (vidi Primer 1).
SLIKA 9. Aktivacija CD8<+>T-ćelija (A) ili CD4<+>T-ćelija (B) nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih B ćelija posredstvom T-ćelija u punoj krvi zdravog čoveka indukovanog anti-CD3/anti-CD20 T-ćelijskim bispecifičnim (TCB) antitelima (“CD20 TCB”) sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (“naelektrisani ostaci”) (vidi Primer 1).
SLIKA 10. Vezivanje anti-CD20/anti-CD3 TCB (molekul "B" prikazan na slici 2B) za humane CD20-(A) i CD3-eksprimirajuće (B) ciljne ćelije.
SLIKA 11. Vezivanje anti-CD20/anti-CD3 TCB (molekul "B" prikazan na slici 2B) za CD20- i CD3-eksprimirajuće ciljne ćelije ljudi i majmuna cinomolgus. (A) B-ćelije, (B) CD4 T-ćelije, (C) CD8 T-ćelije.
SLIKA 12. Liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela.
SLIKA 13. Liza tumorskih ćelija i naknadna aktivacija T-ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela. (AC) Liza Z138 ciljnih ćelija tumora pomoću PBMC efektorskih ćelija tri različita humana donora. (D) Liza panela DLBCL tumorskih ćelijskih linija kao što je naznačeno.
SLIKA 14. Iscrpljivanje B ćelija u ljudskoj punoj krvi posredovano različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela.
SLIKA 15. Aktivacija T-ćelija različitim formatima anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela, procenjena kvantifikacijom intenziteta CD3 nishodne signalizacije pomoću Jurkat-NFAT reporter testa.
SLIKA 16. Farmakokinetički parametri davanja i.v. bolusa od 0,5 mg/kg anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul "B" prikazan na slici 2B) iz retkih podataka iz uzoraka NOG miševa.
SLIKA 17. Šematski prikaz dizajna studije za procenu aktivnosti iscrpljivanja B ćelija anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul "B" prikazan na slici 2B) u potpuno humanizovanim NOG miševima.
SLIKA 18. Kinetika frekvencije B-ćelija i T-ćelija u krvi potpuno humanizovanih NOG miševa tretiranih (B) anti-CD20/anti-CD3 TCB antitelom (molekul "B" prikazan na Slici 2B) ili (A) kontrolom nosača. D0, D7: dani terapijske injekcije.
SLIKA 19. Analiza ekspresije različitih površinskih markera na perifernim T-ćelijama tri dana (D3) i deset dana (D10) nakon primene nosača (crne trake) ili injekcije anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul “B” prikazan na slici 2B) (bele trake) u potpuno humanizovanim miševima.
SLIKA 20. Analiza frekvencije B-ćelija (A), frekvencije T-ćelija (B) i ekspresije površinskih markera na T-ćelijama (C) u slezini potpuno humanizovanih miševa tretiranih nosačem (crne trake) ili anti-CD20/anti-CD3 TCB antitelom (molekul “B” prikazan na slici 2B) (bele trake) na kraju studije (D10 nakon prve terapeutske injekcije).
SLIKA 21. Anti-tumorska aktivnost anti-CD20/anti-CD3 TCB antitela (molekul "B" prikazan na slici 2B) (0,5 mg/kg, jednom nedeljno) na WSU-DLCL2 modelu kod NOG miševa sa prenosom huPBMC.
SLIKA 22. Ilustracija "2 1 IgG CrossFab, invertovanih" molekula pripremljenih u Primeru 2. (1) Molekul bez modifikacija naelektrisanja, (2) molekul sa modifikacijama naelektrisanja u CH1 i CL domenima molekula Fab koji se specifično vezuju za BCMA (EE = 147E, 213E; KK = 123K, 124K).
SLIKA 23. CE-SDS analiza (traka A = neredukovana, traka B = redukovana, tabela pika za traku A) "2 1 IgG CrossFab, invertovanih" molekula korišćenih u Primeru 2. Za molekul bez modifikacije naelektrisanja (83A10-TCB) i molekul sa modifikacijama naelektrisanja (83A10-TCBcv) primenjene su različiti postupci prečišćavanja (afinitetna hromatografija sa proteinom A (PA), gel hromatografija (SEC), hromatografija izmene katjona (cIEX) i finalni korak gel hromatografije (re-SEC)).
SLIKA 24. Koraci prečišćavanja CE-SDS analiza (traka A = neredukovana, traka B = redukovana, tabela pika za traku A) "2 1 IgG CrossFab, invertovanih" molekula korišćenih u Primeru 2, u direktnom (H2H) poređenju nakon afinitetne hromatografije sa proteinom A (PA) i gel hromatografije (SEC).
SLIKA 25. Analiza protočne citometrije vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za BCMA pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma. (A) 83A10-TCB na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (B) 83A10-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (C) poređenje 83A10-TCB i 83A10-TCBcv na H929 ćelijama.
SLIKA 26. Ubijanje BCMA-pozitivnih H929 ćelija mijeloma pomoću anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ((A) 83A10-TCB, (B) 83A10-TCBcv) mereno oslobađanjem LDH.
SLIKA 27. Ilustracija TCB-ova pripremljenih u Primeru 3. (A) “2 1 IgG CrossFab, invertovan” sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u Her2 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (B) "2+1 IgG CrossFab ”sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u Her3 vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K).
SLIKA 28. CE-SDS analiza TCB-a pripremljenih u Primeru 3 (finalni prečišćeni preparat). (A) Elektroferogram Her2 TCB, prikazan na slici 27A, (B) elektroferogram Her3 TCB, prikazan na slici 27B. Traka A = neredukovana, traka B = redukovana.
SLIKA 29. Vezivanje Her2 TCB (A) i Her3 TCB (B) za ćelije, kako je određeno pomoću FACS. Medijana intenziteta fluorescencije za vezivanje Her2 TCB molekula za humani CD3 na Jurkatovim ćelijama (levo) ili za humani Her2 (A) ili Her3 (B) na KPL-4 ćelijama (desno), mereno protočnom citometrijom. Prikazane su srednje vrednosti fluorescencije, zasnovane na triplikatima, uključujući SD.
SLIKA 30. Aktivacija T-ćelija pomoću Her3 TCB. Nakon zajedničke inkubacije humanih PBMC efektorskih ćelija, KPL-4 ciljnih ćelija i porasta koncentracija Her3 TCB, procenat CD69 pozitivnih CD8 T-ćelija je izmeren pomoću FACS nakon 48h. Prikazani su triplikati sa SD.
SLIKA 31. Aktivacija Jurkatovih ćelija preko CD3 nakon 5h, kao što je određeno luminescencijom. Nakon inkubacije KPL4 tumorskih ćelija sa Jurkat-NFAT reporterskim ćelijama (E:T 5:1 (A) ili 2,5:1 (B)) i porasta koncentracija Her2 TCB (A) ili Her3 TCB (B), aktivacija Jurkata je određena relativnim luminiscentnim signalima (RLUS) nakon 5h. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera Graph Pad Prism (34,4 pM (A) i 22 pM (B)). Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD.
SLIKA 32. (A, B) Liza tumorskih ćelija, merena oslobađanjem LDH, nakon inkubacije Her2-pozitivnih KPL4, N87, T47D ili MDA-MB-231 ciljnih ćelija sa humanim PBMC efektorskim ćelijama (E:T 10:1) i povećanjem koncentracije Her 2 TCB molekula tokom 25 h (A) ili 46 h (B). Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD. Vrednosti EC50 izračunate su pomoću softvera Graph Pad Prism: 7,5 pM (KPL4 ćelije), 25,6 pM (N87 ćelije), 30,6 pM (T47D ćelije) i 59,9 pM (MDA-MB-231 ćelije). (C) Liza tumorskih ćelija, kao što je izmerena otpuštanjem LDH, nakon inkubacije Her3-pozitivnih KPL4 ciljnih ćelija sa humanim PBMC efektorskim ćelijama (E:T 10:1) i povećanjem koncentracija molekula Her 3 TCB tokom 24 h ili 48 h , kao što je naznačeno. Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD. Vrednosti EC50 izračunate su pomoću softvera Graph Pad Prism: 2,54 pM (24 h) i 0,53 pM (48 h).
SLIKA 33. Liza tumorskih ćelija, indukovana pomoću Her3 TCB, određena aktivnošću kaspaze 3/7 (luminescencija). Prikazan je relativni luminiscentni signal, koji je izmeren kao posledica aktivnosti kaspaze 3/7 u KPL-4-kaspaza-3/7 GloSensor ciljnim ćelijama nakon 6,5 h zajedničke inkubacije sa PBMC (E:T = 10:1) i različitih koncentracija Her3 TCB, kao što je naznačeno. Prikazani su triplikati sa SD. Vrednosti EC50 izračunate su pomoću softvera Graph Pad Prism: 0,7 pM.
SLIKA 34. Ilustracija TCB-a pripremljenih u Primeru 4. (A) “(Fab)2-CrossFab” sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u MCSP vezivačima, EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K), (B) “(Fab)2-CrossFab ”bez modifikacija naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču).
SLIKA 35. CE-SDS analiza TCB-a sa modifikacijama naelektrisanja pripremljenih u Primeru 4 (finalni prečišćeni preparat): Elektroferogram (Fab)2-XFab-LC007cv, prikazan na slici 34A. Traka A = neredukovana, traka B = redukovana.
SLIKA 36. Medijana intenziteta fluorescencije za vezivanje TCB molekula za humani MCSP na MV-3 ćelijama (levo) ili za humani CD3 na Jurkatovim ćelijama (desno), izmerena protočnom citometrijom. Prikazane su srednje vrednosti fluorescencije, zasnovane na triplikatima, uključujući SD.
SLIKA 37. Liza tumorskih ćelija, merena oslobađanjem LDH, nakon inkubacije humanih MCSP-pozitivnih MV-3 ćelija sa humanim PBMC efektorskim ćelijama (E:T 10:1) i povećanjem koncentracije TCB molekula tokom 24h (levo) ili 48h (desno). Prikazane su prosečne vrednosti triplikata, trake sa greškama označavaju SD.
Detaljan opis pronalaska
Pronalazak je kao što je definisan u zahtevima. Pronalazak, kako je definisan u zahtevima, opisan je u gornjem sažetku pronalaska, u sledećem opisu i u primerima. U slučaju neslaganja između zahteva, gornjeg sažetka pronalaska, opisa koji sledi i primera, zahtevi preovlađuju. U slučaju neslaganja između gornjeg sažetka pronalaska, opisa koji sledi i primera, gornji sažetak pronalaska ima prednost nad opisom koji sledi i primerima.
Definicije
Termini se ovde koriste kao što se opšte koriste u struci, osim ako nije drugačije definisano u nastavku.
Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući molekul“ se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri antigen vezujućih molekula su imunoglobulini i njihovi derivati, npr. fragmenti.
Izraz "bispecifični" znači da je antigen vezujući molekul sposoban da se specifično veže za najmanje dve različite antigenske determinante. Tipično, bispecifični antigen vezujući molekul sadrži dva mesta vezivanja antigena, od kojih je svako specifično za različitu antigensku determinantu. U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul je sposoban da istovremeno vezuje dve antigenske determinante, posebno dve antigenske determinante eksprimirane na dve različite ćelije.
Termin "valentno" kako se ovde koristi označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja antigena u antigen vezujućem molekulu. Kao takav, termin "jednovalentno vezivanje za antigen" označava prisustvo jednog (i ne više od jednog) mesta vezivanja antigena specifičnog za antigen u antigen vezujućem molekulu.
"Mesto vezivanja antigena" se odnosi na mesto, tj. jedan ili više aminokiselinskih ostataka, antigen vezujućeg molekula koji osigurava interakciju sa antigenom. Na primer, antigen-vezujući deo antitela sadrži aminokiselinske ostatke iz regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Prirodni molekul imunoglobulina obično ima dva mesta vezivanja antigena, molekul Fab obično ima jedno mesto vezivanja antigena.
Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući ostatak” se odnosi na molekul polipeptida koji se specifično vezuje za antigensku determinantu. U jednom otelotvorenju, antigen vezujući ostatak je u stanju da usmeri entitet za koji je vezan (npr. drugi antigen vezujući ostatak) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija ili stromu tumora koji nosi antigensku determinantu. U još jednom otelotvorenju, antigen vezujući ostatak je u stanju da aktivira signalizaciju kroz svoj ciljni antigen, na primer antigen kompleksa receptora T ćelija. Antigen vezujući ostaci uključuju antitela i njihove fragmente, kao što je ovde definisano. Konkretni antigen vezujući ostaci uključuju antigen-vezujući domen antitela, koji obuhvata varijabilni region teškog lanca antitela i varijabilni region lakog lanca antitela. U određenim aspektima, antigen vezujući ostaci mogu obuhvatati konstantne regione antitela, kao što je ovde definisano i poznato u struci. Korisni konstantni regioni teškog lanca uključuju bilo koji od pet izotipova: α, δ, ε, γ ili μ. Korisni konstantni regioni lakog lanca uključuju bilo koji od dva izotipa: κ i λ.
Kako se ovde koristi, termin „antigenska determinanta” je sinonim za „antigen” i „epitop”, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnom makromolekulu za koji se vezuje antigen vezujući ostatak, formirajući antigen vezujući kompleks ostatak-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM). Proteini koji se ovde navode kao antigeni (npr. CD3) mogu biti svi nativni oblici proteina koji potiču od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. U konkretnom otelotvorenju, antigen je humani protein. Kada se ovde pominje specifični protein, termin obuhvata "punu dužinu" neprerađenog proteina, kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante. Primer humanog proteina korisnog kao antigen je CD3, posebno epsilon podjedinica CD3 (vidi UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, ID.BR.SEKV: 1 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI GenBank br. BAB71849.1, ID.BR.SEKV: 2 za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]). U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska vezuje se za epitop CD3 ili antigen ciljnih ćelija koji je sačuvan među antigenom CD3 ili antigenom ciljnih ćelija iz različitih vrsta.
Pod „specifičnim vezivanjem“ podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen i može se razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen vezujućeg ostatka da se veže za specifičnu antigensku determinantu može se meriti bilo putem testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih stručnjacima, npr. tehnika površinske plazmonske rezonance (SPR) (analizirana na BIAcore instrumentu) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnih testova vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U jednom aspektu, stepen vezivanja antigen vezujućeg ostatka za nevezani protein je manji od oko 10% vezivanja antigen vezujućeg ostatka za antigen, kao što je mereno, npr. pomoću SPR. U nekim otelotvorenjima, antigen vezujući ostatak koji se vezuje za antigen, ili antigen vezujući molekul koji sadrži taj antigen vezujući ostatak, ima konstantu disocijacije (KD) od ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
„Afinitet” se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. receptora) i njegovog partnera u vezivanju (npr. liganda). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antigen vezujući ostatak i antigen, ili receptor i njegov ligand). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (KD), koja predstavlja odnos konstanti brzine disocijacije i brzine asocijacije (koff, odnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su ovde opisani. Poseban postupak za merenje afiniteta je Površinska plazmonska rezonanca (SPR-Surface Plasmon Resonance).
„Smanjeno vezivanje”, na primer smanjeno vezivanje za Fc receptor, odnosi se na smanjenje afiniteta za odgovarajuću interakciju, kao što je mereno na primer SPR-om. Radi jasnoće, termin uključuje i smanjenje afiniteta na nulu (ili ispod granice detekcije analitičke metode), odnosno potpuno ukidanje interakcije. Nasuprot tome, „povećano vezivanje” odnosi se na povećanje afiniteta vezivanja za odgovarajuću interakciju.
"Aktivirajući T ćelijski antigen", kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja je eksprimirana na površini T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, koja je sposobna da indukuje aktivaciju T ćelija nakon interakcije sa antigen vezujućim molekulom. Specifično, interakcija antigen vezujućeg molekula sa aktivirajućim T ćelijskim antigenom može indukovati aktivaciju T ćelija aktiviranjem signalne kaskade kompleksa receptora T ćelija. U posebnom otelotvorenju, aktivirajući T-ćelijski antigen je CD3, posebno epsilon podjedinica CD3 (vidi UniProt br. P07766 (verzija 130), NCBI RefSeq br. NP_000724.1, SEQ ID NO: 1 za humanu sekvencu; ili UniProt br. Q95LI5 (verzija 49), NCBI Gen Bank broj BAB71849.1, SEQ ID NO: 2 za sekvencu cinomolgusa [Macaca fascicularis]).
"Aktivacija T ćelija", kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više ćelijskih odgovora T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, odabranih od: proliferacije, diferencijacije, sekrecije citokina, otpuštanja citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksične aktivnosti i ekspresije aktivacionih markera. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska su sposobni da indukuju aktivaciju T ćelija. Odgovarajući testovi za merenje aktivacije T ćelija su poznati u struci koja je ovde opisana.
"Antigen ciljne ćelije", kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja je predstavljena na površini ciljne ćelije, na primer, ćelija u tumoru, kao što je ćelija kancera ili ćelija tumorske strome. U posebnom otelotvorenju, antigen ciljnih ćelija je CD20, naročito humani CD20 (vidi UniProt br. P11836).
Kako se ovde koriste, termini „prvi”, „drugi” ili „treći” u odnosu na molekule Fab, itd., koriste se radi pravljenja razlike kada postoji više od jednog ostatka svake vrste.
Upotreba ovih pojmova nije namenjena da dodeli određeni red ili orijentaciju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, osim ako to nije eksplicitno navedeno.
"Molekul Fab" se odnosi na protein koji se sastoji od VH i CH1 domena teškog lanca ("teški lanac Fab") i VL i CL domena lakog lanca ("laki lanac Fab") imunoglobulina.
Pod "spojenim" se podrazumeva da su komponente (npr. molekul Fab i podjedinica Fc domena) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih veznika.
Kako se ovde koristi, termin „jednolančani” se odnosi na molekul koji sadrži aminokiselinske monomere linearno vezane peptidnim vezama. U određenim aspektima otkrića, jedan od antigen vezujućih ostataka je jednolančani molekul Fab, tj. molekul Fab gde su laki lanac Fab i teški lanac Fab povezani peptidnim veznikom da bi formirali jedan peptidni lanac. U posebnom aspektu, C-kraj lakog lanca Fab povezan je sa N-krajem teškog lanca Fab u jednolančanom molekulu Fab.
Pod „unakrsno izmenjenim“ molekulom Fab (koji se takođe naziva „Crossfab“) podrazumeva se molekul Fab u kome su varijabilni domeni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni (tj. zamenjeni jedan drugim), tj. unakrsno izmenjeni molekul Fab sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog domena lakog lanca VL i konstantnog domena teškog lanca 1 CH1 (VL-CH1, u smeru od N- do C-kraja) i peptidnog lanca sastavljenog od varijabilnog domena teškog lanca VH i konstantnog domena lakog lanca CL (VH-CL, u smeru od N- do C-kraja). Radi jasnoće, u unakrsno izmenjenom molekulu Fab gde su varijabilni domeni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab razmenjeni, peptidni lanac koji sadrži konstantni domen teškog lanca 1 CH1 ovde se naziva "teški lanac" unakrsno izmenjenog molekula Fab.
Nasuprot tome, "konvencionalnim" molekulom Fab se smatra molekul Fab u svom prirodnom formatu, tj. koji sadrži teški lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih domena teškog lanca (VH-CH1, u smeru od N- do C-kraja) i laki lanac sastavljen od varijabilnih i konstantnih domena lakog lanca (VL-CL, u smeru od N-do C-kraja).
Termin „molekul imunoglobulina” odnosi se na protein koji ima strukturu prirodnog antitela. Na primer, imunoglobulini IgG klase su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-kraja do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni domen (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni region teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni domen (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni region lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen, koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac imunoglobulina može biti dodeljen jednom od pet tipova, koji se zovu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili μ (IgM), od kojih se neki mogu dalje podeliti na podtipove, npr. γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) i α2(IgA2). Laki lanac imunoglobulina može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. Imunoglobulin se u suštini sastoji od dva molekula Fab i Fc domena, povezanih preko regiona šarke imunoglobulina.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu, i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na monoklonska antitela, poliklonska antitela i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu antigen-vezujuću aktivnost.
„Fragment antitela” se odnosi na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela (npr. scFv) i antitela sa jednim domenom. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore izd., Springer-Verlag, New York, str.
269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br. 5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, npr, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim aspektima otkrića, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
Termin „antigen vezujući domen” odnosi se na deo antitela koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Antigen-vezujući domen može se dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena antitela (takođe se zovu varijabilni regioni antitela). Posebno, antigenvezujući domen sadrži varijabilni domen lakog lanca antitela (VL) i varijabilni domen teškog lanca antitela (VH).
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koje je uključeno u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH, odnosno VL) nativnog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Videti, npr., Kindt et al., Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti.
Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR” kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”). Generalno, nativna četvorolančana antitela uključuju šest HVR, tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). HVR generalno sadrže ostatke aminokiselina iz hipervarijabilnih petlji i/ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR), gde ovi drugi imaju najveću varijabilnost sekvenci i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR), i ti termini se ovde koriste naizmenično da ukažu na delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj konkretni region opisali su Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) i Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kada se uporede jedni sa drugima. Pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije koje ukazuju na CDR antitela ili njegove varijante bude obuhvaćena terminom kao što je ovde definisan i korišćen. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR-ove kao što su definisani svakom od gore navedenih referenci dati su dole u Tabeli 1 radi poređenja. Tačan broj ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručnjaci za ovu oblast mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona antitela. Ovde navedene sekvence CDR su generalno prema Kabatovoj definiciji.
TABELA 1. Definicije CDR<1>
<1>Numeracija svih definicija CDR u Tabeli 1 je u skladu sa
konvencijama o numeraciji koje su izradili Kabat et al. (videti u
nastavku).
<2>„AbM” sa malim slovom „b” kao što je korišćeno u Tabeli 1 odnosi
se na CDR-ove kao što je definisano pomoću softvera za
modelovanje antitela „AbM” centra „Oxford Molecular”.
Kabat et al. su takođe definisali sistem numerisanja sekvenci varijabilnih regiona koji se primenjuje na bilo koje antitelo. Osoba sa uobičajenim znanjem u struci može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatove numeracije” na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim same sekvence. Kako se ovde koristi u vezi sa sekvencama varijabilnih regiona "Kabatova numeracija" se odnosi na sistem numeracije koji su izradili Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.
Kako se ovde koriste, aminokiselinski položaji svih konstantnih regiona i domena teškog i lakog lanca su numerisani u skladu sa Kabatovim sistemom za numeraciju koji je opisan u Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), i ovde se naziva "numeracija prema Kabatu" ili "Kabatova numeracija". Konkretno, Kabatov sistem numeracije (vidi stranice 647-660 Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) se koristi za konstantni domen lakog lanca CL kapa i lambda izotipa, i sistem numeracije prema Kabatovom EU indeksu (vidi strane 661-723) se koristi za konstantne domene teškog lanca (CH1, šarka, CH2 i CH3), što je ovde dalje objašnjeno pozivajući se na "numeraciju prema Kabatovom EU indeksu “u ovom slučaju.
Polipeptidne sekvence na listi sekvenci nisu numerisane prema Kabatovom sistemu numerisanja. Međutim, osoba sa uobičajenim znanjem u struci može da konvertuje numerisanje sekvenci iz redosleda sekvenci na Kabatovu numeraciju.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
„Klasa” antitela ili imunoglobulina ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.
Termin „Fc domen” ili „Fc region” se ovde koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži barem deo konstantnog regiona. Termin uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona IgG teškog lanca mogu malo da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG obično se definiše da se proteže od Cys226 ili Pro230 do karboksil-terminala teškog lanca. Međutim, antitela koja proizvode ćelije domaćini mogu biti podvrgnuta post-translacionom cepanju jedne ili više, posebno jedne ili dve aminokiseline sa C-kraja teškog lanca. Prema tome, antitelo proizvedeno od strane ćelije domaćina ekspresijom specifičnog molekula nukleinske kiseline koji kodira teški lanac pune dužine može uključivati teški lanac pune dužine, ili može uključivati cepanu varijantu teškog lanca pune dužine (takođe se u ovom tekstu naziva "cepana varijanta teškog lanca"). Ovo može biti slučaj kada su poslednje dve aminokiseline C-kraja teškog lanca glicin (G446) i lizin (K447, numerisanje prema Kabatovom EU indeksu). Prema tome, C-terminalni lizin (Lys447), ili C-terminalni glicin (Gly446) i lizin (K447), Fc regiona mogu, ili ne moraju biti prisutni. Aminokiselinske sekvence teških lanaca, uključujući Fc domene (ili podjedinicu Fc domena, kao što je ovde definisana), ovde su označene bez C-terminalnog dipeptida glicin-lizin, ako nije drugačije naznačeno. U jednom aspektu otkrića, teški lanac koji uključuje podjedinicu Fc domena kao što je ovde naznačeno, sadržan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, sadrži dodatni C-terminalni dipeptid glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, teški lanac koji uključuje podjedinicu Fc domena, kao što je ovde naznačeno, sadržan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, sadrži dodatni C-terminalni ostatak glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Kompozicije iz pronalaska, kao što su farmaceutske kompozicije koje su ovde opisane, obuhvataju populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska. Populacija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije može sadržati molekule koji imaju teški lanac pune dužine i molekule koji imaju cepanu varijantu teškog lanca. Populacija bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije može se sastojati od smeše molekula koji imaju teški lanac pune dužine i molekula koji imaju cepanu varijantu teškog lanca, pri čemu najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije ima cepanu varijantu teškog lanca. U jednom aspektu otkrića, kompozicija koja sadrži populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži teški lanac uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim dipeptidom glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, kompozicija koja sadrži populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži teški lanac uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim ostatkom glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom aspektu otkrića, takva kompozicija sadrži populaciju bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije sastavljenih od molekula koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno; molekule koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim ostatkom glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i molekule koji sadrže teški lanac, uključujući podjedinicu Fc domena, kao što je ovde navedeno, sa dodatnim C-terminalnim dipeptidom glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Ako ovde nije drugačije naznačeno, označavanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (vidi takođe i prethodno navedeno). „Podjedinica” Fc domena kako se ovde koristi, odnosi se na jedan od dva polipeptida koji formiraju dimerni Fc domen, tj. polipeptid koji sadrži C-terminalne konstantne regione teškog lanca imunoglobulina, sposobne za stabilno samo-udruživanje. Na primer, podjedinica Fc domena IgG sadrži IgG CH2 i konstantni domen IgG CH3.
"Modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena" je manipulacija peptidnim skeletom ili post-translaciona modifikacija podjedinice Fc domena koja smanjuje ili sprečava povezivanje polipeptida koji sadrži podjedinicu Fc domena sa identičnim polipeptidom za formiranje homodimera. Modifikacija koja promoviše povezivanje, kako se ovde koristi, posebno uključuje odvojene modifikacije napravljene za svaku od dve podjedinice Fc domena koje treba da se povežu (tj. prva i druga podjedinica Fc domena), pri čemu su modifikacije komplementarne jedna drugoj, kako bi se promovisalo povezivanje dve podjedinice Fc domena. Na primer, modifikacija koja promoviše povezivanje može promeniti strukturu ili naelektrisanje jedne ili obe podjedinice Fc domena, kako bi njihovo povezivanje bilo prostorno ili elektrostatički povoljno. Dakle, (hetero)dimerizacija se javlja između polipeptida koji sadrži prvu podjedinicu Fc domena i polipeptida koji sadrži drugu podjedinicu Fc domena, koja može biti neidentična u smislu da dalje komponente spojene na svaku od podjedinica (npr. antigen vezujući ostaci) nisu iste. U nekim otelotvorenjima, modifikacija koja promoviše povezivanje uključuje aminokiselinsku mutaciju u Fc domenu, posebno supstituciju aminokiselina. U posebnom otelotvorenju, modifikacija koja promoviše povezivanje sadrži odvojenu aminokiselinsku mutaciju, konkretno aminokiselinsku supstituciju, u svakoj od dve podjedinice Fc domena.
Termin „efektorske funkcije" ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje regulacije površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
Kako se ovde koriste, pojmovi „inženjer, konstruisano, inženjering” uključuju bilo kakvu manipulaciju peptidne osnove ili post-translacionih modifikacija prirodnog ili rekombinantnog polipeptida ili njegovog fragmenta. Inženjering obuhvata modifikacije aminokiselinske sekvence, glikozilacionog obrasca ili grupe bočnih lanaca pojedinačnih aminokiselina, kao i kombinacije ovih pristupa.
Izraz „mutacija aminokiselina”, kako se ovde koristi, obuhvata supstitucije aminokiselina, brisanje, umetanje i modifikacije. Svaka kombinacija supstitucije, brisanja, umetanja i modifikacije može se načiniti tako da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. smanjeno vezivanje za Fc receptor, ili povećano povezivanje sa drugim peptidom. Brisanja i ubacivanja aminokiselinske sekvence uključuju brisanja i umetanja aminokiselina na amino i/ili karboksi terminalu. Konkretne aminokiselinske mutacije su supstitucije aminokiselina. U cilju izmene npr. karakteristika vezivanja Fc regiona, naročito su poželjne nekonzervativne supstitucije aminokiselina, tj. zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima različita strukturna i/ili hemijska svojstva. Supstitucije aminokiselina uključuju zamenu aminokiselinama koje ne nastaju prirodno, ili derivatima prirodnih aminokiselina, od dvadeset standardnih aminokiselina (npr. 4-hidroksiprolin, 3-metilhistidin, ornitin, homoserin, 5-hidroksilizin). Mutacije aminokiseline mogu se generisati pomoću genetičkih ili hemijskih postupaka koji su dobro poznati u struci. Genetski postupci mogu obuhvatiti mutagenezu usmerenu na lokaciju, PCR, sintezu gena i slično. Smatra se da su takođe korisni postupci izmene grupe bočnih lanaca aminokiseline drugim postupcima osim genetskog inženjeringa, kao što je hemijska modifikacija. Ovde se mogu koristiti različite oznake kako bi se ukazalo na istu mutaciju aminokiselina. Na primer, supstitucija iz prolina u položaju 329 Fc domena na glicin se može označiti kao 329G, G329, G329, P329G ili Pro329Gly.
Kako se ovde koristi, pojam „polipeptid” odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) koji su linearno povezani amidnim vezama (poznatim i kao peptidne veze). Pojam „polipeptid” odnosi se na bilo koji lanac dve ili više aminokiseline, i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Tako su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein”, „aminokiselinski lanac” ili bilo koji drugi izraz koji se koristi da se ukaže na lanac dve ili više aminokiselina, uključeni u definiciju „polipeptida” i izraz „polipeptid” se može koristiti umesto ili kao sinonim bilo kog od ovih izraza. Termin „polipeptid” se takođe odnosi na proizvode post-ekspresione modifikacije polipeptida, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja ili modifikacije sa ne-prirodno nastalim aminokiselinama. Polipeptid može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz određene sekvence nukleinske kiseline. Može se generisati na bilo koji način, uključujući i hemijsku sintezu. Polipeptid iz pronalaska može biti veličine od oko 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1000 ili više, ili 2000 ili više aminokiselina. Polipeptidi mogu imati definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako ne moraju nužno imati takvu strukturu. Polipeptidi sa definisanom trodimenzionalnom strukturom se nazivaju preklopljeni, a polipeptidi koji nemaju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu usvojiti veliki broj različitih konformacija se nazivaju otvoreni.
Kao „izolovani” polipeptid ili varijanta ili njegov derivat smatra se polipeptid koji nije u svom prirodnom miljeu. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid može se ukloniti iz svog nativnog ili prirodnog okruženja. Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini izraženi u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu pronalaska, kao što su nativni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili suštinski prečišćeni bilo kojom odgovarajućom tehnikom.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Termin „polinukleotid” odnosi se na izolovani molekul ili strukturu nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNK), viralnu RNK ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestera ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Termin „molekul nukleinske kiseline” odnosi se na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmenti DNK ili RNK, prisutni u polinukleotidu.
„Izolovanim” molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom smatra se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterologim ćelijama domaćinima ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK, iz predmetnog pronalaska, kao i pozitivne i negativne lančane forme i dvolančane forme. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu biti ili mogu uključiti regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.
Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje, na primer, 95% „identičnu” referentnoj nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, osim kada polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim mestima referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih mesta, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. Da bi bilo praktično, klasično se pomoću poznatih kompjuterskih programa (npr. ALIGN-2)., kao što su oni gorenavedeni za polipeptide, može odrediti da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska.
Termin „ekspresiona kaseta” odnosi se na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljanu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Obično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora uključuje, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim otelotvorenjima, ekspresiona kaseta prema predmetnom pronalasku sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz ovog pronalaska ili njihove fragmente.
Termin „vektor” ili „ekspresioni vektor” je sinonim za „konstrukt ekspresije” i odnosi se na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena na koji je operativno povezan u ciljanu ćeliju. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ekspresioni vektor iz predmetnog pronalaska sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Jednom kada je ekspresioni vektor unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein koji je kodiran genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednom primeru otelotvorenja, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz pronalaska ili njihove fragmente. Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelija domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije.
Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula iz ovog pronalaska. Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, npr. uzgajane ćelije sisara, kao što su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.
„Aktivirajući Fc receptor” je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc domena antitela izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku noseću ćeliju da izvede efektorske funkcije. Humani aktivirajući Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89).
Citotoksičnost posredovana ćelijama zavisnim od antitela (ADCC) je imunološki mehanizam koji dovodi do liziranja ciljanih ćelija obloženih antitelima pomoću imunoloških efektorskih ćelija. Ciljne ćelije su ćelije za koje se antitela ili njihovi derivati koji sadrže Fc region specifično vezuju, uopšteno preko proteinskog dela koji je N-kraj Fc regionu. Kao što se ovde koristi, termin "smanjen ADCC" je definisan ili kao smanjenje broja ciljnih ćelija koje su lizirane u datom vremenu, pri datoj koncentraciji antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, putem mehanizma ADCC definisanog iznad, i/ili povećanje koncentracije antitela u medijumu koji okružuje ciljne ćelije, potrebno da se postigne liza datog broja ciljnih ćelija u datom vremenu, putem mehanizma ADCC. Smanenje ADCC je relativno u odnosu na ADCC posredovan istim antitelom koje proizvodi isti tip ćelija domaćina, korišćenjem istih standardnih postupaka proizvodnje, prečišćavanja, formulisanja i čuvanja (koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti), ali koje nije konstruisano. Na primer, smanjenje ADCC posredovano antitelom koje sadrži u svom Fc domenu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje ADCC, je relativno u odnosu na ADCC posredovano istim antitelom bez ove aminokiselinske supstitucije u Fc domenu. Odgovarajući testovi za merenje ADCC su dobro poznati u struci (vidi npr. PCT publikaciju br. WO 2006/082515 ili PCT publikaciju br. WO 2012/130831).
„Efektivna količina” agensa odnosi se na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koji se primenjuje.
„Terapeutski efektivna količina” agensa, npr. farmaceutska kompozicija, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efektivna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efektivna količina agensa na primer eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava štetne efekte bolesti. „Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i ne-humane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Posebno, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Termin „farmaceutska kompozicija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efektivnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač” upućuje na sastojak farmaceutske kompozicije koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Kao što je ovde upotrebljeno, „lečenje” (i gramatičke varijacije, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči i može se primenjivati ili radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali se ne ograničavaju na, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti, ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin „uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
Detaljan opis primera otelotvorenja
Pronalazak je kao što je definisan u zahtevima. Pronalazak, kako je definisan u patentnim zahtevima, opisan je u gornjem sažetku pronalaska, u sledećem opisu i u primerima. U slučaju neslaganja između patentnih zahteva, gornjeg sažetka pronalaska, opisa koji sledi i primera, zahtevi preovlađuju. U slučaju neslaganja između gornjeg sažetka pronalaska, opisa koji sledi i primera, gornji sažetak pronalaska ima prednost nad opisom koji sledi i primerima.
Ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sa povoljnim svojstvima za terapeutsku primenu, naročito sa poboljšanom produktivnošću (npr. u pogledu čistoće, prinosa). Aminokiselinske supstitucije u molekulima Fab koje se sastoje od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije ovog pronalaska su naročito efikasne u smanjenju pogrešnog sparivanja lakih lanaca sa nepodudarajućim teškim lancima (sporedni proizvodi tipa Bens-Džons), koji se mogu pojaviti u proizvodnji bi-/multispecifičnih antigen vezujućih molekula na bazi Fab koji imaju VH / VL razmenu u jednom (ili više, u slučaju molekula koji sadrže više od dva antigen vezujuća molekula Fab) od njihovih vezujućih krakova (vidi takođe WO2015/150447, naročito primere tu prikazane).
U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži
(a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen
(b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen, i gde su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim,
pri čemu je prvi antigen aktivirajući T-ćelijski antigen, a drugi antigen je antigen ciljne ćelije, ili je prvi antigen antigen ciljnih ćelija, a drugi antigen je aktivirajući T-ćelijski antigen; i
pri čemu
i) u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (numeracija prema Kabatu), i gde je u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); ili
ii) u konstantnom domenu CL drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (numeracija prema Kabatu), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Prema ovom pronalasku, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ne sadrži obe modifikacije navedene pod i) i ii). Konstantni domeni CL i CH1 drugog molekula Fab se ne zamenjuju međusobno (tj. ostaju nepromenjeni).
U jednom aspektu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije u skladu sa pronalaskom, u konstantnom domenu CL prvog Fab molekula pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U daljem aspektu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i u konstantnom domenu CH1 prvog Fab molekula pod a) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U određenom aspektu, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom aspektu nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)) i aminokiselina u položaju 123 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U konkretnijem otelotvorenju, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana lizinom (K) ili argininom (R) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U još konkretnijem otelotvorenju, u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 124 je supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) (numeracija prema Kabatu), a u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U određenim otelotvorenjima, konstantni domen CL prvog molekula Fab pod a) je kapa izotipa.
Alternativno, supstitucije aminokiselina u skladu sa gore navedenim otelotvorenjima mogu se napraviti u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b) umesto u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a). U takvim konkretnim otelotvorenjima, konstantni domen CL drugog molekula Fab pod b) je kapa izotipa.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku dalje sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen. U određenim otelotvorenjima, pomenuti treći molekul Fab je identičan prvom molekulu Fab pod a). U ovim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije u skladu sa gore navedenim otelotvorenjima će biti napravljene u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 svakog prvog molekula Fab i trećeg molekula Fab. Alternativno, supstitucije aminokiselina prema aspektima otkrića mogu se napraviti u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 drugog molekula Fab pod b), ali ne u konstantnom domenu CL i konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab i trećeg molekula Fab.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovom pronalasku dalje sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.
Formati bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije mogu biti spojene jedne sa drugima u različitim konfiguracijama. Primeri konfiguracija su prikazani na Slici 1.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.
U nekim otelotvorenjima, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena.
U jednom takvom aspektu otkrića, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U takvom specifičnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slikama 1G i 1K. Opciono, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
U drugom takvom aspektu, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. U takvom specifičnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije se u osnovi sastoji od prvog i drugog molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu su prvi i drugi molekul Fab spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slikama 1A i 1D. Prvi i drugi molekul Fab mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko peptidnog veznika. U konkretnom aspektu, i prvi i drugi molekul Fab su spojeni sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. U određenom aspektu, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1, posebno kada je Fc domen, FC domen IgG1.
U drugim aspektima opisa, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena.
U jednom takvom aspektu, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U takvom specifičnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u osnovi se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slikama 1H i 1L. Opciono, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
Fab molekuli mogu biti spojeni sa Fc domenom ili međusobno direktno ili preko peptidnog veznika, koji sadrži jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2-20 aminokiselina. Peptidni veznici su poznati u struci i ovde opisani. Odgovarajući neimunogeni peptidni veznici obuhvataju, na primer, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nili G4(SG4)npeptidne veznike, pri čemu je "n" obično ceo broj između 1 i 10, po pravilu između 2 i 4. U jednom aspektu, navedeni peptidni veznik ima dužinu od najmanje 5 aminokiselina, u jednom aspektu dužinu od 5 do 100, u daljem aspektu od 10 do 50 aminokiselina. U jednom aspektu, navedeni peptidni veznik je (GxS)nili (GxS)nGm, gde G=glicin, S=serin, i (x=3, n= 3, 4, 5 ili 6, i m=0, 1, 2 ili 3) ili (x=4, n=2, 3, 4 ili 5 i m= 0, 1, 2 ili 3), u jednom aspektu x=4 i n=2 ili 3, a u daljem aspektu x=4 i n=2. U jednom aspektu, navedeni peptidni veznik je (G4S)2.Posebno pogodan peptidni veznik za međusobno spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog molekula Fab je (G4S)2.Primer peptidnog veznika pogodnog za povezivanje teških lanaca Fab prvog i drugog fragmenta Fab obuhvata sekvence (D)-(G4S)2(SEQ ID NO: 11 i 12). Dodatno, veznici mogu sadržati imunoglobulinski region šarke (ili njegov deo). Posebno, gde je molekul Fab spojen sa N-krajem podjedinice Fc domena, može se spojiti preko imunoglobulinskog regiona šarke ili njegovog dela, sa dodatnim peptidnim veznikom ili bez njega.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sa jednim ostatkom koji vezuje antigen (kao što je molekul Fab) koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije (na primer, kao što je prikazano na Slici 1A, D, G, H, K, L) je koristan, naročito u slučajevima kada se očekuje internalizacija antigena ciljnih ćelija nakon vezivanja ostatka koja se vezuje za antigen sa visokim afinitetom. U takvim slučajevima, prisustvo više od jednog antigen-vezujućeg ostatka specifičnog za antigen ciljnih ćelija može pojačati internalizaciju antigena ciljnih ćelija, čime se smanjuje njegova dostupnost.
Međutim, u mnogim drugim slučajevima bi bilo korisno da bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži dva ili više antigen vezujućih ostataka (kao što su molekuli Fab) specifičnih za antigen ciljnih ćelija (videti primere prikazane na slici 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J. 1M ili 1N), na primer za optimizaciju ciljanja na ciljno mesto, ili za omogućavanje unakrsnog povezivanja antigena ciljnih ćelija. Prema tome, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska dalje sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen. Prvi antigen je poželjno antigen ciljnih ćelija. U jednom aspektu, treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. Treći molekul Fab je identičan prvom molekulu Fab (tj. prvi i treći molekul Fab sadrže iste aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca, i imaju isti raspored domena (tj. konvencionalni ili unakrsni)). U posebnom otelotvorenju, drugi molekul Fab se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen, naročito CD3, a prvi i treći molekul Fab se specifično vezuju za antigen ciljnih ćelija.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije iz ovog pronalaska dalje sadrži treći molekul Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen. U ovom otelotvorenju, drugi antigen je poželjno antigen ciljne ćelije. U jednom takvom aspektu, treći molekul Fab je molekul Fab sa unakrsnom izmenom (molekul Fab gde su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim). U jednom takvom aspektu, treći molekul Fab je identičan drugom molekulu Fab (tj. drugi i treći molekul Fab sadrže iste aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca, i imaju isti raspored domena (tj. konvencionalni ili unakrsni)). U jednom takvom aspektu, prvi molekul Fab se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen, naročito CD3, a drugi i treći molekul Fab se specifično vezuju za antigen ciljnih ćelija.
U jednom otelotvorenju, treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve ili druge podjedinice Fc domena.
U posebnom otelotvorenju, drugi i treći molekul Fab su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U takvom specifičnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u osnovi se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, Fc domen se sastoji od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena, i pri čemu je treći molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1B i 1E (određena otelotvorenja, gde je treći molekul Fab uobičajeni molekul Fab i poželjno identičan prvom molekulu Fab), i Slika 1I i 1M (alternativni aspekti, gde je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab i poželjno identičan drugom molekulu Fab). Drugi i treći vezujući molekul Fab mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko peptidnog veznika. U posebnom otelotvorenju, drugi i treći molekul Fab su svaki spojeni sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. U specifičnom otelotvorenju, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1, posebno kada je Fc domen, Fc domen IgG1. Opciono, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
U drugom otelotvorenju, prvi i treći molekul Fab su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena, a drugi molekul Fab je spojen na C kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U takvom specifičnom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, Fc domena sastavljenog od prve i druge podjedinice, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem prve podjedinice Fc domena, i pri čemu je treći molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem druge podjedinice Fc domena. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1C i 1F (određena otelotvorenja, pri čemu je treći molekul Fab uobičajeni molekul Fab i poželjno identičan prvom molekulu Fab) i na Slikama 1J i 1N (alternativni aspekti opisa, pri čemu je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab i poželjno identičan drugom molekulu Fab). Prvi i treći molekul Fab mogu biti spojeni sa Fc domenom direktno ili preko peptidnog veznika. U konkretnom otelotvorenju, prvi i treći molekul Fab su svaki spojeni sa Fc domenom preko imunoglobulinskog regiona šarke. U specifičnom otelotvorenju, imunoglobulinski region šarke je region šarke humanog IgG1, posebno kada je Fc domen, Fc domen IgG1. U alternativnom aspektu otkrića, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab mogu dodatno biti spojeni jedan sa drugim.
U konfiguracijama bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, gde je molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem svake od podjedinica Fc domena preko imunoglobulinskih regiona šarke, dva Fab molekula, region šarke i Fc domen suštinski formiraju molekul imunoglobulina. U konkretnom otelotvorenju, molekul imunoglobulina je imunoglobulin IgG klase. U još konkretnijem otelotvorenju, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG1. U drugom otelotvorenju, imunoglobulin je imunoglobulin potklase IgG4. U daljem konkretnom otelotvorenju, imunoglobulin je humani imunoglobulin. U drugim otelotvorenjima, imunoglobulin je himerni imunoglobulin ili humanizovani imunoglobulin.
U nekom od opisanih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije, laki lanac Fab prvog molekula Fab i laki lanac Fab drugog molekula Fab su spojeni jedan sa drugim, opciono preko peptidnog veznika. U zavisnosti od konfiguracije prvog i drugog molekula Fab, laki lanac Fab prvog molekula Fab može se spojiti na svom C-kraju sa N-krajem lakog lanca Fab drugog molekula Fab, ili laki lanac Fab drugog molekula Fab može biti spojen na svom C-kraju sa N-krajem lakog lanca Fab prvog molekula Fab. Spajanje lakih lanaca Fab prvog i drugog molekula Fab dalje smanjuje pogrešno sparivanje neusklađenih teških i lakih lanaca Fab, a takođe smanjuje i broj plazmida potrebnih za ekspresiju nekih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz otkrića.
U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab ( tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)), i polipeptid u kome teški lanac Fab prvog molekula Fab deli karboksiterminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). U nekim aspektima opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni regijon teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)), i polipeptid lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.
U nekim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)). U drugim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid, pri čemu teški lanac Fab prvog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji pak deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)).
U nekim od ovih aspekata opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid lakog lanca unakrsno izmenjenog Fab drugog molekula Fab, pri čemu varijabilni region teškog lanca drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)), i polipeptid lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U drugim od ovih aspekata opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid, pri čemu varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)), ili polipeptid u kome polipeptid lakog lanca Fab prvog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)), prema potrebi.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovim otelotvorenjima može dalje sadržati (i) polipeptid podjedinice Fc domena (CH2-CH3(-CH4)), ili (ii) polipeptid u kome teški lanac Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa podjedinicom Fc domena (VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) i polipeptidom lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VL(3)-CL(3)). U određenim otelotvorenjima, polipeptidi su kovalentno vezani, npr. disulfidnom vezom.
U nekim aspektima opisa, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ne sadrži Fc domen. U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u osnovi se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na slikama 1O i 1S.
U drugim aspektima opisa, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem Fab teškog lanca prvog molekula Fab. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ne sadrži Fc domen. U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u suštini se sastoji od prvog i drugog molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu se drugi molekul Fab spaja na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem Fab teškog lanca prvog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na slikama 1P i 1T.
U nekim aspektima opisa, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treći molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u osnovi se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1Q i 1U (određeni aspekti, gde je treći molekul Fab konvencionalni molekul Fab i poželjno identičam prvom molekulu Fab).
U nekim aspektima, prvi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treći molekul Fab spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U nekim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije se u osnovi sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je prvi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1W i 1Y (određeni aspekti, pri čemu je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab, i poželjno identičan drugom molekulu Fab).
U nekim aspektima, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab na N-kraju teškog lanca Fab prvog molekula Fab, i bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treći molekul Fab spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije u osnovi se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na N-kraju teškog lanca Fab sa C-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1R i 1V (određeni aspekti, pri čemu je treći molekul Fab konvencionalni molekul Fab i poželjno identičan prvom molekulu Fab).
U nekim aspektima, drugi molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži treći molekul Fab, pri čemu je navedeni treća molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. U konkretnim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je unakrsno izmenjeni molekul Fab kako je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab razmenjeni / zamenjeni jedan drugim. U drugim takvim aspektima, pomenuti treći molekul Fab je konvencionalni molekul Fab. U određenim takvim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u suštini se sastoji od prvog, drugog i trećeg molekula Fab, i opciono jednog ili više peptidnih veznika, pri čemu je drugi molekul Fab spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab, a treći molekul Fab je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab. Takva konfiguracija je šematski prikazana na Slici 1X i 1Z (određeni aspekti, pri čemu je treći molekul Fab unakrsno izmenjeni molekul Fab i poželjno identičan prvom molekulu Fab).
U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid u kome teški lanac Fab prvog molekula Fab ima karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji pak deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, u kome je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U određenim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovom pronalasku sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab u kome je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)).
U određenim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid u kome teški lanac Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab u kome je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca) (VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VL(3)-CL(3)). U određenim aspektima opisa, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab trećeg molekula Fab (VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VL(3)-CL(3)).
U određenim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovom pronalasku sadrži polipeptid u kome teški lanac Fab prvog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab trećeg molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnom regionom teškog lanca Fab trećeg molekula Fab (tj. treći molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca) (VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VH(3)-CL(3)).
U određenim aspektima otkrića, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema ovom pronalasku sadrži polipeptid u kome varijabilni region lakog lanca Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab trećeg molekula Fab (tj. treći molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa varijabilnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab, koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom teškog lanca Fab drugog molekula Fab (tj. drugi molekul Fab sadrži unakrsno izmenjeni teški lanac Fab, pri čemu je varijabilni region teškog lanca zamenjen varijabilnim regionom lakog lanca), koji zauzvrat deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa teškim lancem Fab prvog molekula Fab (VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab drugog molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab drugog molekula Fab (VH(2)-CL(2)) i polipeptidom lakog lanca Fab prvog molekula Fab (VL(1)-CL(1)). U nekim aspektima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije dalje sadrži polipeptid u kome varijabilni region teškog lanca Fab trećeg molekula Fab deli karboksi-terminalnu peptidnu vezu sa konstantnim regionom lakog lanca Fab trećeg molekula Fab (VH(3)-CL(3)).
Prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja, komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije (npr. molekuli Fab, Fc domen) mogu biti spojene direktno ili preko različitih veznika, posebno peptidnih veznika koji sadrže jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2-20 aminokiselina, koji su ovde opisani ili su poznati u struci. Poželjno, neimunogeni peptidni veznici uključuju, na primer, peptidne veznike (G4S)n, (SG4)n, (G4S)nor G4(SG4)n, pri čemu je n obično ceo broj od 1 do 10, obično od 2 do 4.
Fc domen
Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije sastoji se od para polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, od kojih svaka podjedinica sadrži konstantne domene teškog lanca CH2 i CH3 IgG. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedne sa drugom. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska ne sadrži više od jednog Fc domena.
U jednom otelotvorenju prema pronalasku, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije je Fc domen IgG. U konkretnom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1. U drugom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4. U konkretnijem otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4koji sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju S228 (Kabatova numeracija), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. Ova aminokiselinska supstitucija umanjuje in vivo razmenu kraka Fab IgG4antitela (vidi Stubenrauch et al. Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). U daljem konkretnom otelotvorenju Fc domen je humani. Primer sekvence Fc regiona humanog IgG1je dat u SEQ ID NO: 13.
Modifikacije Fc domena koje promovišu heterodimerizaciju
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije prema pronalasku sadrže različite molekule Fab, spojene sa jednom ili drugom podjedinicom Fc domena, tako da su dve podjedinice Fc domena tipično sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca.
Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšali prinos i čistoća bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije u rekombinantnoj proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije uvede modifikacija koja unapređuje povezivanje željenih polipeptida.
Prema tome, u konkretnim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku sadrži modifikaciju koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najobimnije proteinskoproteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Stoga, u jednom otelotvorenju pomenuta modifikacija je u domenu CH3 domena Fc.
Postoji nekoliko pristupa za modifikacije u CH3 domenu Fc domena kako bi se sprovela heterodimerizacija, koji su dobro opisani npr. u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Tipično, u svim takvim pristupima, i CH3 domen prve podjedinice Fc domena i CH3 domen druge podjedinice Fc domena su konstruisani na komplementaran način, tako da svaki CH3 domen (ili teški lanac koji ga sadrži) više ne može da se homodimerizuje sam sa sobom, već je primoran da se heterodimerizuje sa komplementarno projektovanim drugim CH3 domenom (tako da se prvi i drugi CH3 domen heterodimerizuju, i nema homodimera između prva dva ili druga dva CH3 domena). Ovi različiti pristupi za poboljšanje heterodimerizacije teškog lanca se razmatraju kao različite alternative u kombinaciji sa modifikacijama teškoglakog lanca (VH i VL razmena / zamena u jednom vezujućem kraku, i uvođenje supstitucija naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem u CH1/CL interfejs) u bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T-ćelije prema pronalasku, što smanjuje pogrešno povezivanje lakog lanca i sporedne proizvode tipa Bens Džons.
U konkretnom primeru otelotvorenja, pomenuta modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju "dugmeta" u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju "rupice" u drugoj od dve podjedinice Fc domena.
Tehnologija „dugme u rupici” je opisana npr. u US 5.731.168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Uopšteno govoreći, postupak podrazumeva uvođenje izbočine ("dugme") na međupovršini prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine (“rupice”) u međupovršini drugog polipetida, tako da se izbočina može postaviti u šupljinu da bi se promovisalo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su konstruisane zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa međupovršine prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujući otvori iste ili slične veličine kao izbočine stvaraju se na međupovršini drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjima (npr. alanin ili treonin).
U skladu sa tim, u posebnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljini unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira.
Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima veći volumen bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y) i triptofana (W).
Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima manji volumen bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), serina (S), treonina (T) i valina (V).
Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida.
U specifičnom otelotvorenju, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domene (podjedinica "dugmeta") treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (podjedinica "rupice") tirozinski ostatak u položaju 407 zamenjen je ostatkom valina (Y407V). U jednom otelotvorenju, u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak u položaju 368 zamenjen je alaninskim ostatkom (L368A) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom otelotvorenju, u prvoj podjedinici Fc domena dodatno je serinski ostatak u položaju 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), ili je ostatak glutaminske kiseline u položaju 356 zamenjen cisteinskim ostatkom (E356C), a u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je tirozinski ostatak u položaju 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
U posebnom otelotvorenju, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W, a druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U posebnom otelotvorenju, molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je spojen (opciono preko molekula Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije) sa prvom podjedinicom Fc domena (koja sadrži modifikaciju "dugme"). Bez želje da se ograničimo teorijom, spajanje molekula Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen sa podjedinicom Fc domena koja sadrži dugme će (dodatno) minimizovati generisanje antigen vezujućih molekula koji sadrže dva molekula Fab koji se vezuju za aktivirajući T-ćelijski antigen (sterni sukob dva polipeptida koji sadrže dugme).
Ostale tehnike CH3-modifikacije za sprovođenje heterodimerizacije su razmatrane kao alternative prema pronalasku, i opisane su npr. u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.
U jednom otelotvorenju, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u EP 1870459 A1. Ovaj pristup se zasniva na uvođenju naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjima na specifičnim aminokiselinskim položajima u interfejs CH3/CH3 domena između dve podjedinice Fc domena. Jedan poželjan aspekt za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije su aminokiselinske mutacije R409D; K370E u jednom od dva CH3 domena (Fc domena) i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u drugom CH3 domenu Fc domena (numerisanje prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži aminokiselinsku mutaciju T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, i dodatno aminokiselinske mutacije R409D; K370E u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz pronalaska sadrži aminokiselinske mutacije S354C, T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije Y349C, T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, ili pomenuti bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži aminokiselinske mutacije Y349C, T366W u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u CH3 domenima druge podjedinice Fc domena, i dodatne aminokiselinske mutacije R409D; K370E u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena i aminokiselinske mutacije D399K; E357K u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena (sve numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2013/157953. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366K, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju L351D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U daljem aspektu, prvi CH3 domen sadrži još jednu aminokiselinsku mutaciju L351K. U daljem aspektu, drugi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku mutaciju izabranu od Y349E, Y349D i L368E (poželjno L368E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2012/058768.
U jednom otelotvorenju prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem aspektu, drugi CH3 domen sadrži dodatnu aminokiselinsku mutaciju na položaju T411, D399, S400, F405, N390, ili K392, npr. odabranu od a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E ili T411W, b) D399R, D399W, D399Y ili D399K, c) S400E, S400D, S400R, ili S400K, d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V ili F405W, e) N390R, N390K ili N390D, f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F ili K392E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U daljem aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije L351Y, Y407A, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366V, K409F. U daljem aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407A, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije T366A, K409F. U daljem aspektu, drugi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinske mutacije K392E, T411E, D399R i S400R (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2011/143545 koristi se alternativno, npr. sa aminokiselinskom modifikacijom u položaju izabranom iz grupe koja se sastoji od 368 i 409 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2011/090762, koji takođe koristi gore opisanu tehnologiju dugmeta u rupici. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366W, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407A. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju T366Y, a drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku mutaciju Y407T (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ili njegov Fc domen je IgG2potklase, i alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2010/129304. U alternativnom otelotvorenju, modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje elektrostatičke efekte upravljanja, na primer, kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Generalno, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija je elektrostatički povoljna. U jednom takvom aspektu, prvi CH3 domen uključuje aminokiselinsku supstituciju K392 ili N392 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K392D ili N392D), i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinsku supstituciju D399, E356, D356 ili E357 sa pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (npr. lizin (K) ili arginin (R), poželjno D399K, E356K, D356K, ili E357K, i još poželjnije D399K i E356K). U daljem aspektu, prvi CH3 domen dalje sadrži aminokiselinsku supstituciju K409 ili R409 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D), poželjno K409D ili R409D). U daljem aspektu, prvi CH3 domen dodatno ili alternativno sadrži aminokiselinsku supstituciju K439 i/ili K370 sa negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. glutaminska kiselina (E), ili asparaginska kiselina (D)) (sve numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom aspektu, alternativno se koristi heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2007/147901. U jednom aspektu, prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije K253E, D282K i K322D, i drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske mutacije D239K, E240K i K292D (numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U još jednom aspektu, heterodimerizacioni pristup opisan u WO 2007/110205 može se koristiti alternativno.
U jednom aspektu, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije K392D i K409D, a druga podjedinica Fc domena uključuje aminokiselinske supstitucije D356K i D399K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Modifikacije Fc domena koje smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju Fc domen daje bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dug poluživot u serumu, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom odnosu distribucije tkivo-krv. Istovremeno, on može dovesti do nepoželjnog ciljanja bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Štaviše, koaktivacija Fc receptorskih signalnih puteva može dovesti do otpuštanja citokina koje, u kombinaciji sa svojstvima aktiviranja T-ćelija i dugim poluživotom antigen vezujućeg molekula, dovodi do prekomerne aktivacije receptora citokina i teških neželjenih efekata kod sistemske primene. Aktivacija imunih ćelija (koje nose Fc receptor), osim T ćelija, može čak i smanjiti efikasnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije zbog potencijalne destrukcije T-ćelija, npr. NK-ćelijama.
U skladu sa tim, u pojedinim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije prema pronalasku ispoljava smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1. U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži pomenuti Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja prema Fc receptoru, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T-ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1), i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1(ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T-ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1).
U jednom otelotvorenju, domen Fc domena (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži pomenuti Fc domen) ne vezuje se značajno za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. U posebnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. U jednom otelotvorenju, efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe od CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnom otelotvorenju, efektorska funkcija je ADCC. U jednom aspektu, domen Fc domena pokazuje suštinski sličan afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) u poređenju sa domenom Fc domena nativnog IgG1. Suštinski slično vezivanje za FcRn postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje afinitet vezivanja veći od oko 70%, konkretno veći od oko 80%, konkretnije veći od oko 90% nativnog Fc domena IgG1(ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži Fc domen nativnog IgG1) za FcRn.
U određenim otelotvorenjima, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. U određenim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Tipično, jedna ili više aminokiselinskih mutacija su prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena prema Fc receptoru za najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U otelotvorenjima gde postoji više od jedne aminokiselinske mutacije koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor, kombinacija ovih aminokiselinskih mutacija može smanjiti afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor za najmanje 10 puta, najmanje 20 puta ili čak najmanje 50 puta. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži konstruisani Fc domen pokazuje manje od 20%, naročito manje od 10%, posebno manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T-ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen. U posebnom otelotvorenju, Fc receptor je Fcγ receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je humani Fc receptor. U nekim otelotvorenjima, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom otelotvorenju, Fc receptor jeaktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. Poželjno, vezivanje za svaki od ovih receptora je smanjeno. U nekim aspektima, afinitet vezivanja za komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q, takođe je smanjen. U jednom aspektu, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena prema navedenom receptoru, postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži navedeni Fc domen) ima više od oko 70% afiniteta vezivanja nekonstruisanog oblika Fc domena (ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži pomenuti nekonstruisani oblik Fc domena) za FcRn. Fc domen, ili bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska koji sadrže navedeni Fc domen, mogu pokazivati više od oko 80%, a čak i više od oko 90% takvog afiniteta. U nekim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije je konstruisan da ima povećanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može da uključi, ali nije ograničena na, jednu ili više od sledećih stvari: smanjenu komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), smanjenu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunog kompleksa od strane antigen-prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjena direktna signalizacija koja indukuje apoptozu, smanjeno unakrsno povezivanje antitela vezanih za cilj, smanjena zrelost dendritskih ćelija, ili smanjen prajming T ćelija. U jednom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je jedna ili više izabranih iz grupe od smanjenog CDC, smanjenog ADCC, smanjenog ADCP i smanjene sekrecije citokina. U konkretnom otelotvorenju, smanjena efektorska funkcija je smanjena ADCC. U jednom otelotvorenju, smanjen ADCC je manji od 20% ADCC-a indukovanog nekonstruisanim Fc domenom (ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T-ćelije koji sadrži nekonstruisani Fc domen).
U jednom otelotvorenju, aminokiselinska mutacija koja smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju je supstitucija aminokiseline. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom iz grupe od E233, L234, L235, N297, P331 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U specifičnijom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom iz grupe L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U nekim otelotvorenjima, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, posebno Fc domen humanog IgG1. U jednom otelotvorenju Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329. U konkretnijem primeru otelotvorenja, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, naročito P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329 i drugu aminokiselinsku supstituciju u položaju izabranom od E233, L234, L235, N297 i P331 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U konkretnijem primeru otelotvorenja, dalja aminokiselinska supstitucija je E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U posebnom primeru otelotvorenja, Fc domen obuhvata aminokiselinske supstitucije nu položajima P329, L234 i L235 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U konkretnijem primeru otelotvorenja, Fc domen obuhvata mutacije aminokiselina L234A, L235A i P329G (“P329G LALA”). U jednom takvom otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG1, posebno Fc domen humanog IgG1. “P329G LALA” kombinacija aminokiselinskih supstitucija skoro potpuno ukida vezivanje Fcγ receptora (kao i komplementa) za Fc domen humanog IgG1, kako je opisano u publikaciji PCT br. WO 2012/130831. WO 2012/130831 takođe opisuje postupke za pripremu takvih mutantnih Fc domena i postupaka za određivanje njihovih svojstava, kao što su vezivanja Fc receptora ili efektorske funkcije.
IgG4antitela pokazuju smanjen vezujući afinitet prema Fc receptorima i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1antitelima. Zato je, u nekim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz pronalaska Fc domen IgG4, konkretno Fc domen humanog IgG4. U jednom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije u položaju S228, konkretno supstituciju aminokiseline S228P (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Da bi se dodatno smanjio afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili njegova efektorska funkcija, u jednom otelotvorenju Fc domen IgG4sadrži supstituciju aminokiselina u položaju L235, konkretno supstituciju aminokiseline L235E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju P329, konkretno supstituciju aminokiseline P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U konkretnom otelotvorenju, Fc domen IgG4sadrži aminokiselinske supstitucije u položajima S228, L235 i P329, posebno aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Takvi mutanti Fc domena IgG4i njihova svojstva vezivanja Fcγ receptora su opisani u publikaciji PCT br. WO 2012/130831.
U određenom otelotvorenju, Fc domen pokazuje smanjen afinitet vezanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1, on je humani Fc domen IgG1koji se sastoji od aminokiselinskih supstitucija L234A, L235A i opciono P329G, ili Fc domen humanog IgG4koji sadrži aminokiselinske supstitucije S228P, L235E i opciono P329G (numeracije prema Kabatovom EU indeksu).
U određenim aspektima, N-glikozilacija Fc domena je eliminisana. U jednom takvom aspektu, Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju u položaju N297, posebno aminokiselinsku supstituciju koja zamenjuje asparagin alaninom (N297A) ili asparaginskom kiselinom (N297D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Pored Fc domena opisanih gore i u publikaciji PCT br. WO 2012/130831, Fc domeni sa smanjenim vezivanjem Fc receptora i/ili efektorskom funkcijom, takođe uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (US Patent br. 6,737,056) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvanog "DANA" Fc mutanta sa supstitucijom ostataka 265 i 297 u alanin (US Patent br.7,332,581).
Mutantni Fc domeni se mogu pripremiti brisanjem aminokiseline, supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom, koristeći genetičke ili hemijske postupke dobro poznate u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.
Vezivanje za Fc receptore može se lako odrediti npr. ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) koristeći standardne instrumente kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Ovde je opisan takav pogodan vezujući test. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju ćelije koji sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju FcγIIIa receptor.
Efektorska funkcija Fc domena ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži Fc domen, može se izmeriti postupcima poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC-a. Drugi primeri in vitro analiza za procenu aktivnosti ADCC molekula od interesa opisani su u US patentu broj 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No.5,821,337; Bruggemann i sar., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, mogu biti korišćeni neradioaktivni postupci analiza (videti, npr.
ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je objavljeno u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
U nekim aspektima, vezivanje Fc domena na komponentu komplementa, posebno u C1q, je smanjeno. U skladu sa tim, u nekim aspektima, kada je Fc domen konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, pomenuta smanjena efektorska funkcija uključuje smanjeni CDC. Testiranje vezivanja C1q se može obaviti da bi se utvrdilo da li je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sposoban da vezuje C1q i stoga ima CDC aktivnost. Videti, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
Antigen vezujući ostaci
Molekul koji veže antigen prema pronalasku je bispecifičan, tj. sadrži najmanje dva antigen vezujuća ostatka sposobna za specifično vezivanje za dve različite antigenske determinante. Prema pronalasku, ostaci koji vezuju antigen su molekuli Fab (tj. antigen vezujući domeni sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni domen). U jednom otelotvorenju, navedeni molekuli Fab su humani. U drugom otelotvorenju, navedeni molekuli Fab su humanizovani. U još jednom otelotvorenju, navedeni molekuli Fab sadrže humane konstantne domene teških i lakih lanaca.
Najmanje jedan antigen vezujući ostatak je unakrsno izmenjeni molekul Fab. Takva modifikacija smanjuje pogrešno sparivanje teških i lakih lanaca iz različitih molekula Fab, čime se poboljšava prinos i čistoća bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz pronalaska u rekombinantnoj proizvodnji. U određenom unakrsno izmenjenom molekulu Fab koji je koristan za bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ovog pronalaska, varijabilni domeni lakog lanca Fab i teškog lanca Fab (VL, odnosno VH) se razmenjuju. Međutim, čak i sa ovom razmenom domena, preparat bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije može sadržati određene sporedne proizvode zbog takozvane interakcije tipa Bens Džons između pogrešno uparenih teških i lakih lanaca (vidi Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Da bi se dodatno smanjilo pogrešno sparivanje teških i lakih lanaca iz različitih molekula Fab, i time povećala čistoća i prinos željenog bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, prema ovom pronalasku, na određene položaje aminokiselina uvedene su naelektrisane aminokiseline sa suprotnim naelektrisanjem u CH1 i CL domene bilo kog molekula Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljnih ćelija, ili molekula Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen. Modifikacije naelektrisanja se vrše ili u konvencionalnim molekulima Fab koji su sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije (kao što je prikazano npr. na Slikama 1 A-C, G-J), ili u unakrsno izmenjenim molekulima Fab koji su sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije (kao što je prikazano npr. na Slici 1 D-F, K-N) (ali ne u oba). U određenim otelotvorenjima, modifikacije naelektrisanja su načinjene u konvencionalnim molekulima Fab koji su sadržani u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije (koji se u posebnom otelotvorenju vezuju za antigen ciljne ćelije).
U određenom otelotvorenju u skladu sa ovim pronalaskom, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije je sposoban da se istovremeno vezuje za antigen ciljnih ćelija, posebno antigen ćelija tumora, i aktivirajući T-ćelijski antigen, posebno CD3. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije je sposoban za unakrsno povezivanje T ćelije i ciljne ćelije istovremenim vezivanjem za antigen ciljne ćelije i aktivirajući T-ćelijski antigen. U još određenijem otelotvorenju, takvo simultano vezivanje dovodi do lize ciljne ćelije, posebno tumorske ćelije. U jednom otelotvorenju, takvo simultano vezivanje dovodi do aktivacije T ćelije. U drugim otelotvorenjima, takvo simultano vezivanje dovodi do ćelijskog odgovora T limfocita, posebno citotoksičnog T limfocita, izabranog iz sledeće grupe: proliferacija, diferencijacija, sekrecija citokina, otpuštanje citotoksičnog efektorskog molekula, citotoksična aktivnost i ekspresija aktivacionih markera. U jednom otelotvorenju, vezivanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije za aktivirajući T-ćelijski antigen, posebno CD3, bez istovremenog vezivanja za antigen ciljnih ćelija, ne dovodi do aktivacije T ćelija.
U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije je sposoban da preusmeri citotoksičnu aktivnost T ćelije na ciljnu ćeliju. U posebnom otelotvorenju, navedeno preusmeravanje je nezavisno od predstavljanja peptidnog antigena posredstvom MHC od strane ciljne ćelije i/ili specifičnosti T ćelije.
Naročito, T ćelija prema bilo kom otelotvorenju ovog pronalaska je citotoksična T ćelija. U nekim otelotvorenjima, T ćelija je CD4<+>ili CD8<+>T ćelija, posebno CD8<+>T ćelija.
Aktivirajući molekul Fab koji vezuje T-ćelijski antigen
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ovog pronalaska sadrži najmanje jedan molekul Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen (takođe se ovde označava kao "aktivirajući molekul Fab koji vezuje T-ćelijski antigen"). U određenom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži ne više od jednog molekula Fab (ili drugog molekula Fab) sposobnog za specifično vezivanje za aktivirajući T-ćelijski antigen. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije obezbeđuje monovalentno vezivanje za aktivirajući T-ćelijski antigen.
U određenim otelotvorenjima, molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je unakrsno izmenjeni molekul Fab kao što je ovde opisan, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni. U takvim otelotvorenjima, molekul(i) Fab koji specifično vezuje antigen ciljne ćelije je konvencionalni molekul Fab. U otelotvorenjima u kojima postoji više od jednog molekula Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljnih ćelija sadržan u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T-ćelije, molekul Fab koji se specifično vezuje za aktivirajući T-ćelijski antigen poželjno je unakrsno izmenjeni molekul Fab, i molekuli Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije su konvencionalni molekuli Fab.
U alternativnim aspektima opisa, molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući T-ćelijski antigen je konvencionalni molekul Fab. U takvim aspektima, molekul Fab koji specifično vezuje antigen ciljne ćelije je unakrsno izmenjeni molekul Fab kao što je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni.
U posebnom otelotvorenju, aktivirajući T-ćelijski antigen je CD3, konkretno humani CD3 (SEQ ID NO: 1) ili CD3 cinomolgusa (SEQ ID NO: 2), najkonkretnije humani CD3. U određenom otelotvorenju, aktivirajući antigen vezujući T-ćelijski molekul Fab je unakrsno reaktivan za (tj. specifično se vezuje za) humani i cinomolgus CD3. U nekim otelotvorenjima, aktivirajući T-ćelijski antigen je epsilon podjedinica CD3 (CD3 epsilon).
U nekim otelotvorenjima, aktivirajući molekul Fab koji vezuje T-ćelijski antigen specifično se vezuje za CD3, posebno CD3 epsilon, i sadrži najmanje jedan region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6, i najmanje jedan CDR lakog lanca izabran iz grupe od SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
U jednom otelotvorenju, CD3 vezujući molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 9, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 10.
U drugom aspektu, CD3 vezujući molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 teškog lanca SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca SEQ ID NO: 67, CDR3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 lakog lanca SEQ ID NO: 68, CDR2 lakog lanca SEQ ID NO: 9, i CDR3 lakog lanca SEQ ID NO: 10.
U jednom otelotvorenju, CD3 vezujući molekul Fab sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 3, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci SEQ ID NO: 7.
U jednom otelotvorenju, CD3 vezujući molekul Fab sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7.
U jednom otelotvorenju, CD3 vezujući molekul Fab sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 3, i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 7.
Fab molekul koji vezuje antigen ciljne ćelije
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska sadrži najmanje jedan molekul Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljnih ćelija (takođe se ovde označava kao "Fab molekul koji vezuje antigen ciljne ćelije"). U određenim otelotvorenjima, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži dva molekula Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljnih ćelija. U posebnom takvom otelotvorenju, svaki od ovih molekula Fab specifično se vezuje za istu antigensku determinantu. U još određenijem otelotvorenju, svi ovi molekuli Fab su identični, tj. sadrže iste aminokiselinske sekvence, uključujući iste aminokiselinske supstitucije u CH1 i CL domenu, kao što je ovde opisano (ako ih ima). U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje za antigen ciljnih ćelija. U jednom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži ne više od dva molekula Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljnih ćelija.
U određenim otelotvorenjima, molekuli Fab koji se specifično vezuju za antigen ciljne ćelije su konvencionalni molekuli Fab. U takvim otelotvorenjima, molekul Fab koji specifično vezuju aktivirajući T-ćelijski antigen je unakrsno izmenjeni molekul Fab, kao što je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni.
U alternativnim aspektima opisa, molekul Fab koji specifično vezuje aktivirajući antigen ciljne ćelije je unakrsno izmenjeni molekul Fab, kao što je ovde opisano, tj. molekul Fab u kome su varijabilni domeni VH i VL teških i lakih lanaca Fab međusobno razmenjeni/zamenjeni. U takvim aspektima, molekuli Fab koji specifično vezuju aktivirajući T-ćelijski antigen su konvencionalni molekul Fab.
Fab molekul koji vezuje antigen ciljne ćelije vezuje se za specifičnu antigensku determinantu, i sposoban je da usmeri bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije na ciljno mesto, na primer, na određeni tip tumorske ćelije koja nosi antigensku determinantu.
U određenim otelotvorenjima, Fab molekul koji vezuje antigen ciljne ćelije specifično se vezuje za površinski ćelijski antigen.
U određenim otelotvorenjima, Fab molekul koji vezuje antigen ciljne ćelije je usmeren na antigen koji je povezan sa patološkim stanjem, kao što je antigen prezentovan na tumorskoj ćeliji, ili na ćeliji inficiranoj virusom. Odgovarajući antigeni ciljnih ćelija su površinski ćelijski antigeni, na primer, ali nisu ograničeni na receptore na površini ćelija. U konkretnim otelotvorenjima, antigen ciljne ćelije je humani antigen. Primeri antigena ciljnih ćelija uključuju CD20, Her2, Her3, MCSP (hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom, takođe poznat kao hondroitin sulfat proteoglikan 4), ili BCMA (ciljna ćelija za sazrevanje humanih B ćelija, takođe poznata kao član superfamilije receptora faktora nekroze tumora 17 (UniProt Q02223)).
U određenim otelotvorenjima, antigen ciljne ćelije je CD20, naročito humani CD20. U jednom otelotvorenju, antigen ciljne ćelije je CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, i CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51. U daljem otelotvorenju, antigen ciljne ćelije je CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljnih ćelija sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 30, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 31. U još daljem otelotvorenju, antigen ciljne ćelije je CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 30 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 31. U određenom otelotvorenju, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 18, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 19, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 20, i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21. U daljem konkretnom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 18, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 19, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 20 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21. U drugom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 32, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 19, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 20, i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 32, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 19, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 20 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21. U još jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 36, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 37, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 38 i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 39. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 36, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 37, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 38 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 39. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 40, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 41, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 20, i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 40, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 41, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 20 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21.
U drugim aspektima opisa, ciljni antigen je Her2, posebno humani Her2. U jednom aspektu, antigen ciljne ćelije je Her2, a molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 61, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 62. U daljem aspektu, antigen ciljnih ćelija je Her2, a molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 61 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 62. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 52, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 53 i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 54. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 52, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 53 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 54.
U drugim aspektima, ciljni antigen je Her3, posebno humani Her3. U jednom aspektu, antigen ciljne ćelije je Her3, a i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 63, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 64. U daljem aspektu, antigen ciljnih ćelija je Her3, a molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljnih ćelija sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 63 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 64. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 21, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 55, polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 56 i polipeptid koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 57. U daljem aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 21, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 55, polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 56 i polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 57.
U drugim aspektima opisa, ciljni antigen je hondroitin sulfat proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP), posebno humani MCSP. U jednom aspektu, antigen ciljne ćelije je MCSP, a molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 65, i varijabilni region lakog lanca koji je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičan sekvenci SEQ ID NO: 66. U daljem aspektu, antigen ciljnih ćelija je Her2, i molekul Fab koji se specifično vezuje za navedeni antigen ciljne ćelije sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 65 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 66.
U nekim aspektima, ciljni antigen je BCMA. U drugim aspektima, antigen ciljnih ćelija nije BCMA.
Polinukleotidi
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije, kao što je ovde opisano, ili njegov fragment. U nekim otelotvorenjima, pomenuti fragment je antigen vezujući fragment.
Polinukleotidi koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska mogu se eksprimirati kao jedan polinukleotid koji kodira ceo bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotidi koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati putem, na primer, disulfidnih veza ili drugih sredstava, dajući funkcionalan bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije. Na primer, deo lakog lanca molekula Fab može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži deo teškog lanca molekula Fab, podjedinicu Fc domena i opciono drugi molekul Fab (deo). Kad su koeksprimirani, polipeptidi teškog lanca će se povezati sa polipeptidima lakog lanca kako bi formirali molekul Fab. U drugom primeru, deo bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži jednu od dve podjedinice Fc domena i opciono jedan ili više molekula Fab (deo) može biti kodiran odvojenim polinukleotidom iz dela bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji sadrži drugu od dve podjedinice Fc domena i opciono molekul Fab (deo). Kada su koeksprimirane, podjedinice Fc domena će se udružiti da formiraju Fc domen.
U nekim otelotvorenjima, izolovani polinukleotid kodira celi bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema ovom pronalasku, kao što je ovde opisano. U drugim otelotvorenjima, izolovani polinukleotid kodira polipeptide sadržane u bispecifičnom antigen vezujućem molekulu koji aktivira T ćelije prema pronalasku, kao što je ovde opisano.
U određenim primerima otelotvorenja, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugim aspektima, polinukleotid iz predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK iz predmetnog pronalaska može biti jednolančana ili dvolančana.
Postupci rekombinacije
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska mogu se dobiti, na primer, sintezom peptida u čvrstom stanju (npr. Merifildova sinteza u čvrstoj fazi) ili rekombinantnom proizvodnjom. Za rekombinantnu proizvodnju, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije (fragment), npr. kao što je gore opisano, izoluju se i ubacuju u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran korišćenjem konvencionalnih procedura. U jednom otelotvorenju, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji sadrži jedan ili više polinukleotida iz pronalaska. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije (fragment), uz odgovarajuće signale transkripcione/translacione kontrole. Ti postupci uključuju in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Videti, na primer, tehnike koje su opisali Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili može biti fragment nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije (fragment) (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region” je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona translatovanih u aminokiseline. Iako „stop kodon” (TAG, TGA ili TAA) nije translatovan u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslatovani regioni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru ili u odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Štaviše, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region, ili može da obuhvata dva kodirajuća ili više kodirajućih regiona, npr. vektor iz predmetnog pronalaska može da kodira jedan ili više polipeptida, koji su post- ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina iz pronalaska mogu kodirati heterologe kodirajuće regione, spojene ili nespojene sa polinukleotidom koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije (fragment) iz pronalaska, njegovu varijantu ili njegov derivat. Heterologi kodirajući regioni uključuju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologi funkcionalni domen. Funkcionalna asocijacija se odvija kada se kodirajući region genskog preparata, npr. polipeptida, poveže sa jednom regulatornom sekvencom ili više regulatornih sekvenci, tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (regulatornih sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) „funkcionalno su asocirani” ukoliko indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne utiče na sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci za usmeravanje ekspresije genskog proizvoda ili na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga, region promotera bi se funkcionalno asocirao sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je promoter sposoban za sprovođenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude promoter određen ćelijom koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu se funkcionalno asocirati sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije. Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koji kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnjacima u ovoj oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, a funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intron-A), virusa 40 viših primata (npr. rani promoter) i retrovirusa (takav je, npr: Raus sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i â-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnjacima za ovu oblast. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elementi integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).
Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranih od strane polinukleotida iz predmetnog pronalaska. Na primer, ako je poželjna sekrecija bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, DNK koja kodira signalnu sekvencu može biti postavljena ushodno od nukleinske kiseline koja kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska ili njegov fragment. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz lanca proteina rasta širom endoplazmatičnog retikuluma. Osobe sa uobičajenim znanjem u struci svesne su da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka imaju signalni peptid spojen za N-kraj polipeptida, koji je otcepljen iz translatovanog polipeptida radi proizvodnje sekretornog ili „zrelog” oblika peptida. U određenim aspektima opisa, nativni signalni peptid, npr. koristi se teški lanac imunoglobulina ili laki lanac signalnog peptida, ili funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja sekrecije polipeptida sa kojim je funkcionalno povezana. Alternativno, može se koristiti heterologi signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa se može supstituisati vodećom sekvencom humanog tkivnog aktivatora plazminogena (TPA) ili β-glukuronidaze miša. DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšavanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, može biti uključena unutar, ili na krajevima bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije (fragmenta) koji kodira polinukleotid.
U sledećem primeru izvođenja, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan takav polinukleotid iz pronalaska ili više njih. U određenim primerima izvođenja, obezbeđena je ćelija domaćin iz pronalaska koja sadrži jedan takav vektor ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima i vektorima, datim redom. U jednom konkretnom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr. prethodno je transformisana ili transficirana njime) vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije (deo) iz predmetnog pronalaska. Kao što je korišćen ovde, termin „ćelija domaćin” odnosi se na bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska ili njihove fragmente. Ćelije domaćini koje imaju sposobnost replikacije i podržavanja ekspresije bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije dobro su poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transficirane ili transdukovane u skladu sa određenim ekspresionim vektorom, a velike količine ćelija koje sadrže vektor mogu se uzgajati za zasejavanje velikih fermentora za dobijanje dovoljnih količina bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do proizvodnje polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409–1414 (2004) i Li et al., Nat Biotech 24, 210–215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Videti, npr. US Patent br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere upotrebe ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linije iz bubrega majmuna transformirane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije iz bubrega (ćelije 293 ili 293T, kao što je opisano u npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), sertoli ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano u npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije burega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što je opisano u npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)); MRC ćelije i FS4 ćelije. Druge primere upotrebe ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), uključujući dihidropteroate reduktaze CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su: YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, videti, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sačinjene od transgenih životinja, transgenih biljaka ili gajenog biljnog ili životinjskog tkiva. U jednom primeru otelotvorenja, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija).
U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži teški ili laki lanac antigen vezujućeg domena, kao što je antitelo, mogu se projektovati tako da takođe eksprimiraju i drugi lanac antitela tako da je eksprimirani proizvod antitelo koje ima teški i laki lanac.
U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, pri čemu ovaj postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, kako je ovde predviđeno, pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, i za izolovanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Komponente bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije genetski su spojene jedna sa drugom. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije može biti projektovan tako da se njegove komponente spoje direktno jedna sa drugom, ili indirektno putem sekvence veznika. Kompozicija i dužina veznika može se odrediti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci i njihova se efikasnost može ispitati. Primeri za sekvence veznika između različitih komponenata bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije nalaze se u ovde navedenim sekvencama. Dodatne sekvence mogu takođe biti uključene da pripoje mesto cepanja da bi se razdvojile pojedine komponente fuzije ako je potrebno, na primer endopeptidazna sekvenca prepoznavanja.
U određenim otelotvorenjima, jedan ili više antigen-vezujućih ostataka bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije obuhvataju najmanje jedan varijabilni region antitela sposoban za vezivanje antigenske determinante. Varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu derivati antitela koja se nalaze ili ne nalaze u prirodi ili njihovi fragmenti. Postupci proizvodnje poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznate u struci (videti, npr. Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se ne nalaze u prirodi mogu se izgraditi pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patent br. 4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih kolekcija koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br.
5,969,108 McCafferty).
Antitelo, fragment antitela, antigen vezujući domen ili varijabilni region antitela bilo koje životinjske vrste može se koristiti u bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska. Neograničavajuća antitela, fragmenti antitela, antigen vezujući domeni ili varijabilni regioni korisni u ovom pronalasku mogu biti mišjeg, primatskog ili humanog porekla. Ako je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije namenjen za humanu upotrebu, himerni oblik antitela može da se koristi ako su konstantni regioni antitela humani. Humanizovani ili potpuno humani oblik antitela takođe se može dobiti u skladu sa postupcima poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br. 5,565,332 to Winter). Humanizacija se može postići različitim postupcima, uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje samo nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR na humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkcija antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci kritični za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione, ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju” sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i postupci njihovog dobijanja razmotreni su u, npr. Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), a dodatno su opisani u, npr. Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US Patent br.
5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (opis SDR (a-CDR) graftovanja); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opis „vraćanja na površinu”); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opis „FR mešanja”); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opis pristupa „usmerene selekcije” FR mešanju). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu derivati humanih monoklonskih antitela dobijenih metodom ćelija hibridoma (videti, npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigen (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz kolekcija humanizovanih faga (videti, npr., Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); i McCafferty et al., Nature 348, 552–554; Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, kao jednolančanih Fv (scFv) fragmenata ili kao Fab fragmenata.
U određenim aspektima, antigen vezujući ostaci korisni u ovom pronalasku mogu biti projektovani tako da imaju poboljšan afinitet vezivanja prema, na primer, postupcima objavljenim u US Pat. Appl. Publ. br. 2004/0132066. Sposobnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz pronalaska da se veže nza specifičnu antigensku determinantu može se meriti pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih u struci, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (ispitana na sistemu BIACORE T100) (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela, fragmenta antitela, antigen vezujućeg domena ili varijabilnog domena koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen, npr. antitelo koje se takmiči sa antitelom V9 za vezivanje na CD3. U određenim aspektima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo referentno antitelo. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilisani antigen (npr. CD3) je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za antigen (npr. antitelo V9, opisano u US 6,054,297) i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual gl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije pripremljeni u skladu sa ovde navedenim uputstvom mogu se prečistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, gel hromatografija, i slično. Stvarni uslovi korišćeni za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd. i biće očigledni stručnjacima iz ove oblasti. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom se može koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se vezuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije. Na primer, za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska koristi se matrica sa proteinom A ili proteinom G. Afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i gel hromatografija se mogu koristiti za izolovanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije suštinski kao što je opisano u Primerima. Čistoća bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom, i slično. Na primer, teški lanac fuzionog proteina eksprimiran prema opisu u Primerima, gde je prikazan netaknut i pravilno povezan prema demonstraciji smanjivanjem SDS PAGE (videti Sliku 3). Tri trake su razložene na približno Mr 25.000, Mr 50.000 i Mr 75.000, što odgovara predviđenim molekulskim masama lakog lanca, teškog lanca i fuzionog proteina teškog lanca/lakog lanca bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije.
Testovi
Ovde navedeni bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
Testovi za merenje afiniteta
Afinitet bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije prema Fc receptoru ili ciljnom antigenu se može odrediti prema postupcima koji su navedeni u primerima pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), koristeći standardne instrumente kao što je "BIAcore" instrument (GE Healthcare), i receptore ili ciljne proteine, kakve je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Alternativno, vezivanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije za različite receptore ili ciljne antigene može se proceniti korišćenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju određeni receptor ili ciljni antigen, na primer, putem protočne citometrije (FACS). Specifično ilustrativan i primeren aspekt otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja nalazi se u daljem tekstu i u Primerima.
Prema jednom aspektu, KDse meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25°C.
Da bi se analizirala interakcija između Fc dela i Fc receptora, His-označeni rekombinantni Fc receptor je uhvaćen anti-Penta His antitelom (Qiagen) imobilisanim na CM5 čipovima, i bispecifični konstrukti se koriste kao analiti. Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, GE Healthcare) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Penta-His antitelo je razblaženo 10 mM natrijum acetatom, pH 5,0, do 40 μg/ml pre injektovanja pri protoku od 5 μl/minut, da se dobije oko 6500 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja liganda, 1 M etanolamin se injektuje da bi blokirao neizreagovale grupe. Nakon toga je Fc receptor uhvaćen tokom 60 s na 4 ili 10 nM. Za kinetička merenja, četvorostruka serijska razblaženja bispecifičnog konstrukta (raspon između 500 nM i 4000 nM) su injektovana u u HBS-EP (GE Healthcare, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) na 25°C pri protoku od oko 30 μl/min tokom 120 s.
Da bi se odredio afinitet prema ciljnom antigenu, bispecifični konstrukti su uhvaćeni anti-humanim Fab specifičnim antitelom (GE Healthcare) koje je imobilisano na aktiviranoj površini CM5-senzorskoj čipa, kako je opisano za anti Penta-His antitelo. Konačna količina vezanog proteina je oko 12.000 RU. Bispecifični konstrukti su uhvaćeni tokom 90 s na 300 nM. Ciljni antigeni su propušteni kroz protočne ćelije tokom 180 s u rasponu koncentracija od 250 do 1000 nM, uz protok od 30 µl/min. Disocijacija je praćena tokom 180 s.
Razlike u indeksu prelamanja su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Odgovor stacionarnog stanja korišćen je da bi se dobila konstanta disocijacije KDnelinearnim uklapanjem krive Lengmirove izoterme vezivanja. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) su izračunate pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE® T100 Evaluation Software verzija 1.1.1) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je izračunata kao odnos koff/kon. Videti, npr. Chen et al. J. Mol. Biol.
293:865-881 (1999).
Testovi za merenje aktivnosti
Biološka aktivnost bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska može se meriti različitim testovima, kao što je opisano u Primerima. Biološka aktivnost može, na primer, uključivati indukciju proliferacije T-ćelija, indukciju signalizacije u T-ćelijama, indukciju ekspresije aktivacionih markera u T-ćelijama, indukciju sekrecije citokina pomoću T-ćelija, indukciju lize ciljnih ćelija kao što su tumorske ćelije, i indukciju regresije tumora i/ili poboljšanje preživljavanja.
Kompozicije, formulacije i načini primene
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koji od ovde datih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije, npr. za upotrebu u bilo kom od donjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovde datih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom aspektu, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koji od ovde datih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Dalje, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska u obliku pogodnom za davanje in vivo, pri čemu postupak sadrži (a) dobijanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku, i b) formulisanje bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pri čemu je priprema bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije formulisana za davanje in vivo.
Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska sadrže terapeutski efektivnu količinu jednog ili više bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije rastvorenih ili dispergovanih u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekulske entitete i kompozicije koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama, kao što je, na primer, čovek, po potrebi. Priprema farmaceutske kompozicije koja sadrži barem jedan bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije i, opciono, dodatni aktivni sastojak biće poznata stručnjacima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ed . Mack Printing Company, 1990. Pored toga, za primenu na životinjama (npr. ljudima), podrazumevaće se da preparati treba da ispune standarde sterilnosti, pirogenosti, opšte bezbednosti i čistoće u skladu sa zahtevima FDA Kancelarije za biološke standarde ili odgovarajućeg autoriteta u drugim zemljama. Poželjne kompozicije su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Kako se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljivi nosač” podrazumeva sve rastvarače, pufere, disperzione medije, premaze, surfaktante, antioksidanse, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungicidne agense), izotonične agense, agense za odlaganje apsorpcije, soli, konzervanse, antioksidanse, proteine, lekove, stabilizatore lekova, polimere, gelove, veziva, ekscipijense, dezintegratore, lubrikante, zaslađivače, arome, boje, slične materijale i njihove kombinacije, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, str. 1289-1329). Osim ako se ne ukaže da je neki od konvencionalnih nosača nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u terapeutskim ili farmaceutskim kompozicijama je razmotrena.
Ova kompozicija može da sadrži različite vrste nosača u zavisnosti od toga da li treba da se primeni u čvrstom, tečnom ili u obliku aerosola i da li je potrebno da budu sterilni za takvu vrstu primene u obliku injekcije. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska (i sva dodatna lekovita sredstva) mogu se primenjivati intravenski, intradermalno, intraarterijski, intraperitonealno, intraleziono, intrakranijalno, intraartikularno, intraprostatički, intraslezinski, intrarenalno, intrapleuralno, intratrahealno, intranazalno, intravitrealno, intravaginalno, intrarektalno, intratumoralno, intramuskularno, intraperitonealno, supkutano, supkonjuktivalno, intravezikularno, mukozalno, intraperikardijalno, intraumbilikalno, intraokularno, oralno, topički, lokalno, inhalacijom (npr. inhalacija aerosola), injekcijama, infuzijom, koninualnom infuzijom, lokalizovanom perfuzijom ciljanih ćelija direktno putem katetera, ispiranja, u kremama, lipidnim kompozicijama (npr. lipozomima) ili drugim postupkom ili kombinacijom prethodno navedenog, kao što je poznato stručnjacima iz ove oblasti (videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990). Parenteralna primena, posebno intravenska injekcija, najčešće se koristi za primenu molekula polipeptida, kao što su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska.
Parenteralna kompozicija uključuje one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. U pogledu injekcija, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska mogu biti formulisani kao vodeni rastvori, poželjno fiziološki kompatibilni puferi, kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može da sadrži agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Umesto toga, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni rastvori za ubrizgavanje pripremljeni su mešanjem bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim dolenavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom nosaču koji sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjni postupak pripreme je vakuum sušenje ili liofilizacija, kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferisan, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima proizvodnje i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum-hlorid; heksametonijum-hlorid; benzalkonijum-hlorid, benzetonijum-hlorid; fenol, butil-alkohol ili benzil-alkohol; alkilne parabene, kao što je metil-paraben ili propil-paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Suspenzije za vodene injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visokokoncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih injekcija uljane suspenzije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikulumi uključuju masna ulja, kao što su susamovo ulje ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil kleat ili trigliceridi ili lipozomi.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnom aspektu, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agenasa za odlaganje apsorpcije, kao što su, na primer, aluminijum monostearat, želatin, ili njihove kombinacije.
Pored prethodno opisanih kompozicija, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije mogu se formulisati i kao depo preparat. Takve dugodelujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga, na primer, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije se mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju), jonoizmenjivačkim smolama ili slabo rastvorljivim derivatima, na primer, kao slabo rastvorljiva so.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifične antigen vezujuće molekule koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, inkapsuliranja ili liofilizacije. Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane na konvencionalne načine pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenasa ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije mogu se formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju dodaci kiselih soli, npr. onih formiranih sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili onih formiranih sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organske kiseline poput sirćetne, oksalne, vinske ili bademove kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: hidroksidi natrijuma, kalijuma, amonijaka, kalcijuma ili gvožđa, ili organskih baza izopropilamina, trimetilamina, histidina ili prokaina. Farmaceutske soli uglavnom budu rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.
Terapeutski postupci i kompozicije
Bilo koji od bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije koji su ovde obezbeđeni može se koristiti u terapeutskim metodama. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije ovog pronalaska mogu se koristiti kao imunoterapijska sredstva, na primer u lečenju kancera.
Za upotrebu u terapeutskim postupcima, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska formulišu se, doziraju i primenjuju na način u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima.
U jednom aspektu, obezbeđeni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti. U određenim otelotvorenjima, obezbeđeni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti. U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenim otelotvorenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije za upotrebu u lečenju pojedinca koji ima bolest, koja se sastoji od davanja pojedincu terapeutski efektivne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije. U određenim aspektima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnom otelotvorenju bolest je rak. U određenim otelotvorenjima, postupak se dalje sastoji od davanja pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U daljim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, kako je ovde opisano, za upotrebu u indukciji lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. U određenim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije za upotrebu u indukciji lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora kod pojedinca, koja se sastoji od davanja pojedincu efektivne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, da izazove lizu ciljne ćelije. Prema svim gorenavedenim primerima otelotvorenja „pojedinac” je sisar, poželjno čovek.
U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema pronalasku u proizvodnji ili pripremi medikamenta. U jednom otelotvorenju, medikament je za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U daljem otelotvorenju, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti koji uključuje davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efektivne količine leka. U određenim aspektima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnom otelotvorenju bolest je rak. U jednom otelotvorenju, postupak se dalje sastoji od davanja pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikanceroznog agensa, ako je lečena bolest karcinom. U daljem otelotvorenju, lek služi za indukciju lize ciljnih ćelija, posebno ćelija tumora. U daljem otelotvorenju, lek služi za indukciju lize ciljnih ćelija, posebno ćelija tumora, kod pojedinca uključujući davanje pojedincu efektivne količine leka za indukovanje lize ciljnih ćelija. Prema svim gorenavedenim primerima otelotvorenja „pojedinac” može da bude sisar, poželjno čovek. U daljem aspektu, pronalazak daje postupak za lečenje bolesti. U jednom otelotvorenju, upotreba se sastoji od davanja pojedincu koji ima takvu bolest terapeutski efektivne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz pronalaska. U jednom primeru otelotvorenja, kompozicija se daje pomenutom pojedincu, koja sadrži ovde opisani bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim aspektima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnom otelotvorenju bolest je rak. U određenim otelotvorenjima, postupak se dalje sastoji od davanja pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. Prema svim gorenavedenim primerima otelotvorenja „pojedinac” može da bude sisar, poželjno čovek.
U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora. U jednom aspektu, upotreba se sastoji od dovođenja u kontakt ciljne ćelije sa bispecifičnim antigen vezujućim molekulom koji aktivira T-ćelije ovog pronalaska u prisustvu T ćelije, posebno citotoksične T ćelije. U daljem aspektu, obezbeđena je upotreba za indukciju lize ciljne ćelije, posebno ćelije tumora, kod pojedinca. U jednom takvom aspektu, upotreba se sastoji od davanja pojedincu efektivne količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, za indukciju lize ciljne ćelije. U jednom otelotvorenju, "pojedinac" je čovek.
U određenim otelotvorenjima, bolest koja se tretira je proliferativni poremećaj, konkretno kancer. Neograničavajući primeri karcinoma uključuju karcinom bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, materice, grlića materice, endometrijalni karcinom, karcinom jednjaka, debelog creva, kolorektalni karcinom, rektalni karcinom, karcinom želuca, karcinom prostate, krvi, kože, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom kostiju i bubrega. Ostali poremećaji proliferacije ćelija koji se mogu lečiti pomoću bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska uključuju, bez ograničenja, neoplazme locirane u: stomaku, kostima, dojkama, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (adrenalinskoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajnicima, grudnoj, tiroidnoj žlezdi), očima, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, grudnom košu i urogenitalnom sistemu. Obuhvaćena su i predkancerozna stanja ili lezije i metastaze. U određenim aspektima, kancer se bira iz grupe koja obuhvata karcinom renalnih ćelija, karcinom kože, pluća, kolorektalni karcinom, karcinom dojke, mozga, glave i vrata. Obučeni stručnjak zna da u mnogim slučajevima bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim aspektima, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim aspektima, količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „efektivnom količinom” ili „terapeutski efektivnom količinom”. Ispitanik, pacijent ili pojedinac kome treba lečenje obično je sisar, konkretnije čovek.
U nekim aspektima, efektivna količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz ovog pronalaska se daje ćeliji. U drugim aspektima, terapeutski efektivna količina bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska se primenjuje na pojedinca radi lečenja bolesti.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska (kada se koristi sam ili u kombinaciji sa jednim terapeutskim agensom, ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, načina primene, telesne težine pacijenta, vrste bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije, težine i toka bolesti, bilo da se bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili istovremene terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije, i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnih sastojaka u kompoziciji i odgovarajuću dozu (odgovarajuće doze) za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Jedan primer doze bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije bio bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim neograničavajućim primerima, doza može da obuhvati od približno 1 mikrogram/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine, približno 10 mikrograma/kg telesne težine, približno 50 mikrograma/kg telesne težine, približno 100 mikrograma/kg telesne težine, približno 200 mikrograma/kg telesne težine, približno 350 mikrograma/kg telesne težine, približno 500 mikrograma/kg telesne težine, približno 1 milligram/kg telesne težine, približno 5 milligrama/kg telesne težine, približno 10 milligrama/kg telesne težine, približno 50 milligrama/kg telesne težine, približno 100 milligrama/kg telesne težine, približno 200 milligrama/kg telesne težine, približno 350 milligrama/kg telesne težine, približno 500 milligrama/kg telesne težine, do približno 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i svaki opseg koji se dobija iz toga. U neograničavajućim primerima rasponi dobijeni iz ovde navedenih brojeva, raspon od približno 5 mg/kg telesne težine do približno 100 mg/kg telesne težine, približno 5 mikrograma/kg telesne težine do približno 500 miligrama/kg telesne težine, itd. može se primeniti, na osnovu gore opisanih brojeva. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od približno dve do približno dvadeset ili npr. približno šest doza bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog pronalaska će se generalno koristiti u količini efektivnoj za postizanje željene svrhe. Za lečenje ili prevenciju bolesti, bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz pronalaska ili njihove farmaceutske kompozicije, daju se ili primenjuju u terapeutski efektivnim količinama. Određivanje terapeutski efektivne količine poznato je stručnjacima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.
U pogledu sistemske administracije, terapeutski efektivna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi kulture ćelija. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao kružni raspon koncentracije koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.
Inicijalne doze mogu se takođe proceniti na osnovu in vivo podataka, npr. životinjski modeli, koristeći tehnike koje su dobro poznate u struci. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu brzo da optimizuju administraciju namenjenu ljudima na osnovu životinjskih podataka.
Doza i interval primene mogu se pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije u plazmi koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza primene za pacijente putem injekcija ima raspon od 0,1 mg/kg/dnevno do 50 mg/kg/dnevno, obično od približno 0,5 mg/kg/dnevno do 1 mg/kg/dnevno. Terapeutski efektivni nivoi plazme mogu se dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi mogu se meriti, na primer, hromatografijom HPLC.
U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, efektivna lokalna koncentracija bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efektivnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Terapeutski efektivna doza ovde opisanih bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju T-ćelije uglavnom obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili na eksperimentalnim životinjama. Testovi kulture ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50(doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski efektivna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjni su bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije koji pokazuju velike terapeutske indekse. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije u skladu sa ovim pronalaskom pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u kružnom rasponu koncentracija koji uključuje ED50sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze, način primene, stanje ispitanika i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon uvida u stanje pacijenta (videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p.1).
Lekar zadužen za pacijente koji se leče ovde opisanim bispecifičnim antigen vezujućim molekulima koji aktiviraju T-ćelije zna kada i kako treba da okonča, prekine ili podesi primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa i slično. S druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načinom primene i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim postupcima prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.
Drugi agensi i tretmani
Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim agensom ili više agenasa tokom terapije. Na primer, bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska može biti primenjen uz barem jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens” obuhvata sve agense za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim aspektima, dodatni terapeutski agens je imunomodulatorni agens, citostatički agens, inhibitor ćelijske adhezije, citotoksični agens, aktivator ćelijske apoptoze ili agens koji povećava senzitivnost ćelija na induktore apoptoze. U posebnom aspektu, dodatni terapeutski agens je antikancerogeni agens, na primer, uništavač mikrotubula, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, DNK interkalator, alkilujući agens, hormonska terapija, inhibitor kinaze, antagonist receptora, aktivator apoptoze tumorske ćelije ili antiangiogeni agens.
Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efektivne za nameravane svrhe. Efektivna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije koji se koristi, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Takve kombinovane terapije koje su pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u istu kompoziciju ili u različite kompozicije) i odvojenu primenu, što znači da primena bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije iz predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju T-ćelije iz ovog izuma mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa zračenjem.
Proizvodi
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efektivna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može da ima priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije ovog pronalaska. Etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, naznačeno time što kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji pronalaska može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Primeri
Pronalazak je kao što je definisan u zahtevima. Pronalazak kako je definisan u zahtevima opisan je u gornjem sažetku pronalaska, u opštem opisu i sledećim primerima. U slučaju neslaganja između zahteva, gornjeg sažetka pronalaska, opšteg opisa i sledećih primera, zahtevi prevladavaju. U slučaju neslaganja između gornjeg sažetka pronalaska, opšteg opisa i sledećih primera, gornji sažetak pronalaska prevladava nad opštim opisom i sledećim primerima.
Opšti postupci
Tehnike rekombinantne DNK
Za manipulaciju DNK korišćeni su standardni postupci kao što je opisano u radu Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača. Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., NIH Publication br.91-3242.
Sekvenciranje DNK
Sekvence DNK su određene pomoću sekvenciranja dvostrukog lanca.
Genska sinteza
Željeni segmenti gena, po potrebi, dobijeni su putem PCR pomoću odgovarajućih obrazaca, ili su sintetisani pomoću uređaja Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR proizvoda pomoću automatizovane genske sinteze. U slučajevima kada nije bila dostupna tačna sekvenca gena, prajmeri oligonukleotida su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa i geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koja potiče iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena okruženi restrikcionim mestima sečenja singularne endonukleaze klonirani su u standardne klonirane /sekvencirane vektore. DNK plazmida je prečišćena iz transformisane bakterije i koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranog genskog fragmenta je potvrđena sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima da bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Svi konstrukti su dizajnirani sa DNK sekvencom na 5' kraju koja kodira vodeći peptid koji cilja proteine za izlučivanje u eukariotske ćelije.
Primer 1
Priprema T-ćelijskih bispecifičnih (TCB) antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-CD20 / anti-CD3)
U ovom primeru pripremljeni su sledeći molekuli, šematski prikazani na slici 2:
A. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" bez modifikacija naelektrisanja (CH1/CL razmena u CD3 vezivaču) (Slika 2A, SEQ ID NO: 14-17)
B. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivačima) (Slika 2B, SEQ ID NO: 18-21)
C. "2 1 IgG CrossFab" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivačima) (Slika 2C, SEQ ID NO: 32, 19-21) D. “2 1 IgG CrossFab, invertovan” bez modifikacija naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču) (Slika 2D, SEQ ID NO: 33, 15, 17, 21)
E. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" bez modifikacija naelektrisanja (VH-CH1/VL-CL razmena u CD3 vezivaču) (Slika 2E, SEQ ID NO: 34, 15, 17, 35)
F. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD20 vezivačima, modifikacija naelektrisanja u CD3 vezivaču) (Slika 2F, SEQ ID NO: 36-39)
G. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja i DDKK mutacijom u Fc regionu (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivačima) (Slika 2G, SEQ ID NO: 40, 41, 20, 21)
H. “1 1 CrossMab” sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivaču) (Slika 2H, SEQ ID NO: 42, 43, 20, 21)
I. “1 1 CrossMab” sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena u CD3 vezivaču, modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivaču, različiti vezivači CD20) (Slika 2I, SEQ ID NO: 43-45, 21)
J. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja 213E, 123R (VH/VL razmena u CD3 vezivaču modifikacija naelektrisanja u CD20 vezivaču) (Slika 2J, SEQ ID NO:69-71, 21)
K. "2 1 IgG CrossFab, invertovan" sa modifikacijama naelektrisanja (VH/VL razmena i modifikacija naelektrisanja u CD3 vezivaču) (Slika 2K, SEQ ID NO: 15, 17, 72, 73).
Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca DNK su supklonirane u okvir bez konstantnog teškog lanca ili konstantnog lakog lanca, prethodno ubačen u odgovarajući ekspresioni vektor sisara koji je primalac. Ekspresiju proteina pokreće promoter MPSV, i sintetska poliA signalna sekvenca je prisutna na 3' kraju CDS. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu.
Molekuli su proizvedeni kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin (PEI). Ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 (A: "vektorski teški lanac (VH-CH1-VH-CL-CH2-CH3)”: "vektorski laki lanac (VL-CL)": "vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VL-CH1)"; B, D, G, J, K: "vektorski teški lanac (VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VL-CL)": "vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VH-CL)"; C: "vektorski teški lanac (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)": "Vektorski laki lanac (VL-CL)": "vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VH-CL)"; E: "vektorski teški lanac (VH-CH1-VL-CL-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VL-CL)": "vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)": „vektorski lanac (VH-CH1)”; F: "vektorski teški lanac (VL-CH1-VH-CH1-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VH-CL)": "vektorski teški lanac (VL-CH1-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VH-CH1)"), ili u odnosu 1:1:1:1 (H, I: "vektorski teški lanac (VL-CH1-CH2-CH3)": "vektorski laki lanac (VL-CL)": "vektorski teški lanac (VH-CH1-CH2-CH3)": “vektorski laki lanac (VH-CL)”).
Za transfekciju, HEK293 EBNA ćelije su uzgajane u suspenziji bez seruma u Excell medijumu za uzgajanje sa 6 mM L-glutaminom i 250 mg/l G418. Za proizvodnju u tubespin bocama od 600 ml (maksimalna radna zapremina 400 ml), 600 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, a supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori su pomešani u 20 ml CD CHO medijuma do konačne količine od 400 µg DNK. Nakon dodavanja 1080 µl rastvora PEI (2,7 µg/ml), smeša je mešana na vorteksu tokom 15 s, i zatim inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u tubespin bocu od 600 ml i inkubirane 3 sata na 37°C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 360 ml Excell 6 mM L-glutamina 5 g/l Pepsoy 1,0 mM VPA medijuma, i ćelije su uzgajane 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 7% Feed 1 (Lonza). Nakon 7 dana uzgajanja, supernatant je sakupljen za prečišćavanje centrifugiranjem tokom 20-30 minuta na 3600 x g (Sigma 8K centrifuga), rastvor je sterilno filtriran (filter od 0,22 mm) i dodat je natrijum azid u finalnoj koncentraciji od 0,01% m/V. Rastvor je čuvan na 4°C.
Koncentracija konstrukata u medijumu za uzgajanje određena je pomoću ProteinA-HPLC. Osnova za separaciju je vezivanje molekula koji sadrže Fc za Protein A pri pH 8,0, i gradijentno eluiranje od pH 2,5. Postojale su dve mobilne faze. To su bili puferi Tris (10 mM) - glicin (50 mM) - NaCl (100 mM), identični, osim što su podešeni na različite pH vrednosti (8 i 2,5). Telo kolone je bila pretkolona Upchurch 2x20 mm sa unutrašnjom zapreminom od ~ 63 µl, pakovana sa POROS 20A. 100 µl svakog uzorka je injektovano na ekvilibrisani materijal sa protokom od 0,5 ml/min. Nakon 0,67 minuta, uzorak je eluiran sa pH gradijentom do pH 2,5. Kvantifikacija je izvršena određivanjem apsorbance na 280 nm i izračunavanjem pomoću standardne krive sa rasponom koncentracija humanog IgG1od 16 do 166 mg/l.
Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom afinitetne hromatografije sa proteinom A, zatim hromatografskim korakom gel filtracije.
Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap ProteinA HP (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 25 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 7,5, nakon čega je usledila dodatna faza ispiranja sa 6 zapremina kolone 10 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida, pH 5,45. Kolona je zatim isprana sa 20 ml 10 mM MES, 100 mM natrijum hlorida, pH 5,0, i ciljni protein je eluiran u 6 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/10 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 20 mM histidinom, 140 mM natrijum hloridom, 0,01% Tween-20, pH 6,0. Molekul A je morao biti prečišćen dodatnom preparativnom gel hromatografijom (SEC) za postizanje konačnog sadržaja monomera od 100%. Stoga, frakcije sa visokim sadržajem monomera iz prvog koraka gel hromatografije su objedinjene, koncentrovane i ponovo nanete na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare). Ovaj dodatni korak prečišćavanja nije bio potreban za druge molekule (u zavisnosti od profila sporednog proizvoda, međutim, objedinjavanje frakcija i stoga povraćaj nakon prve gel hromatografije je bio različit za te molekule).
Čistoća i molekulska masa molekula analizirane su nakon prvog koraka prečišćavanja (afinitetna hromatografija sa proteinom A) pomoću SDS-PAGE u odsustvu redukcionog sredstva i bojenja bojom Coomassie (SimpleBlue™ SafeStain, Invitrogen). Gel sistem NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, SAD) korišćen je prema uputstvu proizvođača (4-12% Trisacetatni gelovi ili 4-12% Bis-Tris).
Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence.
Čistoća i molekulska masa molekula nakon završnog koraka prečišćavanja analizirani su CE-SDS analizama u prisustvu i odsustvu redukcionog sredstva. Caliper LabChip GXII sistem (Caliper lifescience) korišćen je prema uputstvu proizvođača. Za analizu je korišćen uzorak od 2 µg.
Ukupni sadržaj antitela u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) u radnom puferu 25 mM K2HPO4,125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25°C.
Svi molekuli su proizvedeni i prečišćeni po istom postupku (osim molekula A, koji je bio podvrgnut dodatnom koraku SEC, kao što je gore navedeno).
Molekul A je pokazao visok sadržaj agregata nakon prve preparativne gel hromatografije. Sadržaj agregata nakon ovog koraka prečišćavanja nije mogao biti određen, jer nije bilo početne separacije nečistoća velike molekulske mase i monomerne frakcije. Da bi se dobio 100% monomerni materijal, bio je potreban dodatni korak preparativne gel hromatografije. Molekul B je 100% monomerni nakon jedne preparativne gel hromatografije.
Koncentracija u supernatantu bila je veća za molekul A, ali je konačni prinos (zbog visokog sadržaja agregata) 2,3 puta manji nego za molekul B (Tabela 2).
Konačna čistoća pokazana CE-SDS analizom bila je veća za molekul B nego za molekul A (Tabela 3, Slika 3A i B). Slike 3M i 3N prikazuju hromatograme koraka SEC prečišćavanja (preparativni SEC), pri čemu molekul A ima široki pik u odnosu na molekul B, što ukazuje da preparat molekula A nanetog na SEC nije homogen, dok je preparat molekula B u velikoj meri monomerni.
Molekul C se može proizvesti sa visokim titrom, ali u poređenju sa molekulom B, konačni povraćaj je manji zbog visokog sadržaja sporednih proizvoda koji se ne mogu potpuno ukloniti primenjenim hromatografskim metodama (Tabela 2; Tabela 3; Slika 3B i J, i Slika 3C i K). Kao što je prikazano na slici 3B i 3K, SDS-PAGE analiza nakon prečišćavanja sa proteinom A nije pokazala nikakav sporedni proizvod za molekul B, dok preparat molekula C sadrži neke sporedne proizvode koji se pojavljuju na prividnoj molekulskoj masi od 100 kDa.
Molekul D se razlikuje od molekula B samo po odsustvu naelektrisanih ostataka u anti-CD20 Fab. Ovaj molekul se takođe može proizvesti prolazno sa visokim titrom, ali kao što je već opisano za molekul C, konačni kvalitet prikazan na analitičkoj SEC (98% monomera za molekul D, prema 100% monomera za molekul B) i povraćaj je bio manji nego za molekul B zbog visokog sadržaja sporednih proizvoda (Tabela 2; Tabela 3; Slika 3B i J i Slika 3D i L). Kao što je prikazano na slici 3J i 3L, analiza SDS-PAGE nakon koraka prečišćavanja sa proteinom A nije pokazala nikakav sporedni proizvod za molekul B, dok preparat molekula D sadrži neke sporedne proizvode koji se pojavljuju na prividnoj molekulskoj težini od 66 kDa i 40 kDa. Na slici 3N i 3O prikazani su hromatogrami koraka SEC prečišćavanja (preparativni SEC), gde molekul D ima široki pik u odnosu na molekul B, što ukazuje da preparat molekula D nanet na SEC nije homogen, dok je preparat molekula B u velikoj meri monomerni.
I titar proizvodnje molekula E bio je visok, ali konačni proizvod je još uvek sadržao nečistoće male molekulske mase, kao što je pokazano analitičkom SEC i kapilarnom elektroforezom (Tabela 2; Tabela 3; Slika 3E).
Za razliku od molekula B, molekul F ima VH-VL razmenu na Fab tumorskog ciljnog vezujućeg ostatka, dok su modifikacije naelektrisanja uvedene u anti-CD3 Fab. Ovaj molekul bi mogao biti proizveden i sa visokim titrima, ali je konačni povraćaj bio mali zbog sporednih proizvoda. Za anti-CD20 / anti-CD3 TCB, format sa modifikacijama naelektrisanja u anti-CD20 Fab je poželjniji, s obzirom na proizvodnju i prečišćavanje.
Molekul G je molekul sa modifikacijama naelektrisanja u Fc regionu ("DD" = K392D; K409D u jednoj od podjedinica Fc domena, "KK" = D356K; D399K u drugoj od podjedinica Fc domena (EU numeracija), zamenjuje mutaciju "dugme u rupici". Stvaranje bispecifičnih molekula podstiče se uvođenjem dva ostatka asparaginske kiseline u jedan teški lanac, i dva ostatka lizina u drugi teški lanac (slika 2G). Ovaj molekul može biti proizveden sa visokim titrom, ali finalni proizvod ima još neke nečistoće velike i male molekulske mase koje su pokazane analitičkom SEC i kapilarnom elektroforezom (Tabela 2; Tabela 3) dok se sporedni proizvodi mogu potpuno ukloniti za isti molekul koji nosi mutaciju „dugme u rupici“ (molekul B).
Molekul I, koji se razlikuje od molekula H prema CD20 vezivaču, pokazao je veći sadržaj agregata nakon konačne preparativne gel hromatografije u odnosu na molekulu H. Krajnja čistoća prikazana CE-SDS analizom bila je veća za molekul H nego za molekul I (Tabela 3, slika 3H i I). Isto tako, povraćaj za molekul H bio je 40% veći nego za molekul I (Tabela 2). Ovaj rezultat pokazuje da kvalitet molekula zavisi i od antitela koje se koristi u bispecifičnom formatu T ćelija.
Proizvodnja molekula J i molekula K imala je dobar početni titar, što je dovelo do dobrog prinosa. Međutim, konačni povraćaj od oko 20% za oba molekula bio je znatno ispod 48% postignutog sa molekulom B (Tabela 2). Oba molekula su po konačnom kvalitetu slična, sa> 99% sadržaja monomera (Tabela 2). Čistoća u neredukovanom CE-SDS je bolja za molekul J (kome nedostaju modifikacije naelektrisanja na poziciji 124 CL domena i poziciji 147 CH1 domena) sa skoro 99% u odnosu na molekul K (sa modifikacijama naelektrisanja i VL-VH razmenom u CD3 vezivaču) sa 90% (Tabela 3, Slika 3N i 3O). Molekul J je pokazao izvesno taloženje tokom faze koncentrovanja nakon afinitetne hromatografije. Molekul K ima modifikacije naelektrisanja u CD3 vezujućem CrossFab, a ne u CD20 vezujućem Fab. Ovo ima uticaja na konačni kvalitet, kao što pokazuje CE-SDS (Tabela 3, Slika 3O). Razlika u kvalitetu je uglavnom vidljiva nakon prvog koraka prečišćavanja na SDS-page (Slika 3P, 3Q). Molekul K sadrži više sporednih proizvoda na 150 kDa i 70 kDa (polovini molekula i konstrukata verovatno nedostaju laki lanci) od molekula J. Oba molekula imaju istu termičku stabilnost koja je slična molekulu B (Tabela 4).
Za anti-CD20 / anti-CD3 TCB, "invertovana" verzija sa modifikacijama naelektrisanja na anti CD20 Fab (molekul B) je format koji se može proizvesti sa najvećim povraćajem i krajnjim kvalitetom.
TABELA 2. Sažetak proizvodnje i prečišćavanja anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.
* finalni proizvod, nakon dva koraka SEC
TABELA 3. CE-SDS analize (neredukovane) anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.
Potvrda molekulske mase pomoću LC-MS analiza
Deglikozilacija
Da bi se potvrdila homogena priprema molekula, krajnji proteinski rastvor je analiziran LC-MS analizom. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti su tretirani pomoću PNGaze F. U tu svrhu, pH proteinskog rastvora je podešen na pH 7,0 dodavanjem 2 µl 2 M Tris do 20 µg proteina, u koncentraciji od 0,5 mg/ml. Doda se 0,8 µg PNGaze F i inkubira 12 h na 37°C.
LC-MS analiza - Onlajn detekcija
Postupak LC-MS je izveden na aparatu Agilent HPLC 1200 spojenom na maseni spektrometar TOF 6441 (Agilent). Hromatografsko razdvajanje je izvršeno na koloni Macherey Nagel Polysterene; RP1000-8 (veličina čestica 8 µm, 4,6 x 250 mm; kat. br.
719510). Eluent A je bio 5% acetonitril i 0,05% (V/V) mravlja kiselina u vodi, eluent B je bio 95% acetonitril, 5% vode i 0,05% mravlja kiselina. Protok je bio 1 ml/min, razdvajanje je izvršeno na 40°C i sa 6 µg (15 µl) uzorka proteina dobijenog prethodno opisanim postupkom.
Tokom prva četiri minuta, eluat je bio usmeren u otpad, kako bi se sprečila kontaminacija masenog spektrometra solima. ESI-izvor je radio sa protokom gasa za sušenje od 12 l/min, temperaturom od 350°C i pritiskom raspršivača od 60 psi. MS spektri su dobijeni korišćenjem napona fragmentatora od 380 V i raspona mase od 700 do 3200 m/z u pozitivnom jonskom režimu. MS podaci se dobijaju pomoću softvera instrumenta od 4 do 17 minuta.
Preparat molekula A je imao oko 10-15% molekula sa pogrešno sparenim lakim lancima i tragovima slobodnih ili povezanih lakih lanaca. Preparat molekula B je imao tragove molekula koji sadrže dva laka lanca CD3. Nečistoće, kao što su slobodni laki lanci ili povezani laki lanci, nisu mogle biti detektovane (Tabela 2).
Termička stabilnost putem statičkog rasejavanja svetlosti
Termička stabilnost je praćena pomoću statičkog rasejavanja svetlosti (SLS) i merenjem svojstvene proteinske fluorescencije kao odgovora na primenjeni temperaturni stres.
30 µg filtriranog uzorka proteina sa koncentracijom proteina od 1 mg/ml je naneto u duplikatu na Optim 2 (Avacta Analytical Ltd; GB). Temperatura je povećana sa 25 na 85°C pri 0,1°C/min, pri čemu su prikupljeni podaci o poluprečniku i ukupnom intenzitetu rasejavanja. Za određivanje svojstvene fluorescencije proteina, uzorak je pobuđen na 295 nm, a emisija je sakupljena između 266 i 473 nm.
Za sve molekule je određena termička stabilnost, i rezultati su prikazani u tabeli 4. Temperatura agregacije (TAgg) određena pomoću dinamičkog rasejavanja svetlosti i temperature topljenja (TM), merena putem fluorescencije proteina, nakon primene temperaturnog gradijenta bila je uporediva za sve molekule sa TAggu rasponu od 54-58°C i TMu rasponu od 56-60°C (Tabela 4).
TABELA 4. Termička stabilnost anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.
Vezanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela za CD3 i CD20
Vezivanje T-ćelijskih bispecifičnih (TCB) antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (molekuli "A" i "B" iznad) za CD3 anti-CD3 / anti-CD20 je mereno pomoću Jurkatovih humanih ćelija koje eksprimiraju CD3. Vezivanje za CD20 je određeno korišćenjem humanih Z-138 ćelija koje eksprimiraju CD20. Ćelije iz suspenzije su sakupljene, isprane jednom pomoću PBS, a vijabilnost i gustina ćelija su određene koristeći Vicell. Ćelije iz suspenzije su ponovo suspendovane u koncentraciji 2 x 10<6>ćelija/ml u FACS puferu. 100 µl suspenzije ćelija je zasejano na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Svaki korak je izveden na 4°C. Ploče su centrifugirane na 360 x g tokom 5 min, i supernatant je uklonjen. Razblaženja antitela su pripremljena u PBS/0,1% BSA. 30 µl razblaženih anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela ili FACS pufera je dodato u bunarčiće, i ćelije su inkubirane 30 min na 4°C. Nakon inkubacije, po bunarčiću je dodato 120 µl FACS pufera, ploča je centrifugirana 5 minuta na 350 x g, i supernatant je uklonjen. Korak pranja je jednom ponovljen. Dodato je 30 µl prethodno razblaženog sekundarnog antitela po bunarčiću, kao što je naznačeno u rasporedu ploča. Ploče su inkubirane još 30 min na 4°C. Nakon inkubacije, po bunarčiću je dodato 120 µl FACS pufera, ploče su centrifugirane 5 minuta na 350 x g, i supernatant je uklonjen. Korak ispiranja je jednom ponovljen za sve ploče osim ploča sa Jurkatovim ćelijama, koje su fiksirane neposredno nakon ovog jednog koraka pranja. Ćelije su fiksirane pomoću 100 µl BD pufera za fiksiranje po bunarčiću (BD Biosciences, br.
554655) na 4°C tokom 20-30 min. Ćelije su ponovo suspendovane u 80 µl/bunarčiću FACS pufera za merenje FACS korišćenjem BD FACS CantoII.
Rezultat ovog eksperimenta je prikazan na slici 4.
Liza tumorskih ćelija i aktivacija CD4<+>i CD8+ T ćelija nakon ubijanja CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija posredovanog T ćelijama indukovanog anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima
T-ćelijski posredovano ubijanje ciljnih ćelija i aktiviranje T ćelija indukovano anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (molekuli "A" i "B" iznad) procenjeno je na tumorskim ćelijama Z-138 i Nalm-6. Humani PBMC su korišćeni kao efektori i za ubijanje, kao i za aktivaciju T ćelija detektovanu 22 h nakon inkubacije sa bispecifičnim antitelom. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene, oprane i nanete na ploču sa gustinom od 30.000 ćelija / bunarčiću na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene diferencijalnim centrifugiranjem sveže krvi od zdravih ljudskih donora sa rastvorom Histopaque. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura), plazma iznad interfaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS. Smeša je centrifugirana (400 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen i PBMC pelet je dva puta ispran sterilnim PBS-om (koraci centrifugiranja 350 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i držana u medijumu RPMI1640 koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) u ćelijskom inkubatoru (37°C, 5% CO2) do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test ubijanja, antitela su dodavana u naznačenim koncentracijama (opseg od 1000 pM - 0,1 pM u triplikatu). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 6:1. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane na 420 x g tokom 4 min, i 50 µl/bunarčiću je preneto na sveže ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, radi detekcije LDH. Detekcija LDH je izvršena koristeći kit za otkrivanje citotoksičnosti (Roche br. 11644793001) prema uputstvu proizvođača. Preostale ćelije su isprane pomoću PBS koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (APCCy7 anti-humani CD8, Biolegend br.
301016), CD4 (FITC anti-humani CD4, Biolegend br. 300506), CD69 (BV421 anti-humani CD69 Biolegend br. 310930) i CD25 (PECy7 anti-humani CD25 Biolegend br. 302612) izvršeno je prema navodima dobavljača. Nakon 30 minuta na 4°C, ćelije su isprane dva puta sa 150 µl/bunarčiću PBS koji sadrži 0,1% BSA, i fiksirane koristeći 100 µl/bunarčiću 2% PFA. Merenje je izvedeno pomoću BD FACS CantoII.
Rezultat ovog eksperimenta je prikazan na Slici 5, 6 i 7. Oba molekula pokazuju sličnu aktivnost u smislu lize tumorskih ćelija i aktivacije T ćelija.
Iscrpljivanje B ćelija i aktivacija CD4<+>i CD8+ T ćelija nakon ubijanja zdravih humanih B ćelija posredovanog T ćelijama indukovanim anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima u punoj ljudskoj krvi
Ljudska puna krv od zdravog donora inkubirana je sa anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitelima sa modifikacijom ili bez modifikacije naelektrisanja (molekuli "A" i "B" iznad) u naznačenim koncentracijama (raspon od 50.000 pM - 1 pM u triplikatu). Nakon 22 h, krv je izmešana, i sakupljeno je 35 µl za bojenje sa 20 µl FACS smeše antitela koja sadrži CD8 (APCCy7 anti-humani CD8, Biolegend br. 301016), CD4 (FITC anti-humani CD4, Biolegend br. 300506), CD69 ( BV421 anti-humani CD69 Biolegend br. 310930) i CD25 (PECy7 anti-humani CD25, Biolegend br. 302612), CD22 (APC anti-humani CD22, Biolegend br. 302510) i CD45 (PerCPCy5.5 anti-humani CD45, Biolegend br. 304028) . Nakon 15 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, krv je fiksirana pomoću FACS rastvora za lizu (BD, br. 349202), i analizirana protočnom citometrijom. Iscrpljivanje B ćelija je izračunato na osnovu odnosa broja B ćelija i broja CD4<+>T ćelija, postavljajući netretirane uzorke na 0% iscrpljivanja B ćelija.
Rezultat ovog eksperimenta je prikazan na slici 8 i 9. Oba molekula pokazuju sličnu aktivnost u smislu iscrpljivanja B ćelija u punoj krvi i aktivacije T ćelija.
Vezivanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela za humane CD20- i CD3-eksprimirajuće ciljne ćelije
Vezivanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela prikazanog kao molekul “B” iznad testirano je na humanoj CD20-eksprimirajućoj ćelijskoj liniji difuznog B-krupnoćelijskog limfoma (DLBCL) (WSU DLCL2, 0,5-1 x 10<6>CD20 mesta vezivanja) i CD3-eksprimirajućoj imortalizovanoj liniji T limfocita (Jurkat). Ukratko, ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane pri 1,5 x 10<6>ćelija/ml u FACS puferu (PBS 0,1% BSA). 100 μl ćelijske suspenzije (koja sadrži 0,15 x 10<6>ćelija) inkubirano je na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom tokom 30 minuta na 4°C sa rastućim koncentracijama CD20 TCB (50 pM - 200 nm), dva puta isprano hladnim PBS 0,1% BSA, ponovo inkubirano još 30 min na 4°C sa razblaženim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fcg fragment specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Lab PE br.109-116-170), isprani dva puta hladnim PBS sa 0,1% BSA, fiksirani dodatkom 2% PLA i analizirani pomoću FACS, koristeći FACS CantoII (softver FACS Diva), isključujući mrtve ćelije iz analize pomoću FSC/SSC gejtinga.
Rezultati su prikazani na slici 10A (vezivanje za WSU DLCL2 ćelije) i na slici 10B (vezivanje za Jurkatove ćelije). Krive vezivanja i vrednosti EC50 koje se odnose na vezivanje izračunate su pomoću softvera GraphPadPrism5. Vrednosti EC50 su bile 0,98 nM (dvovalentno vezivanje za WSU DLCL2 ćelije koje eksprimiraju CD20) i približno 12,5 nM (jednovalentno vezivanje za Jurkatove ćelije koje eksprimiraju CD3).
Vezivanje anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela za ciljne ćelije koje eksprimiraju humani i cinomolgus CD20 i CD3
Unakrsna reaktivnost anti-CD3 / anti-CD20 TCB antitela prikazanog kao molekul „B“ iznad određena je preko vezivanja za B ćelije koje eksprimiraju humani i cinomolgus CD20, i CD3-eksprimirajuće CD4 i CD8 T ćelije. Ukratko, heparinizovana ljudska krv i krv majmuna cinomolgus iz zdravih donora korišćena je za izolaciju PBMC centrifugiranjem sa gradijentom gustine. Izolovani PBMC su prebrojani, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovani pri 4 x 10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 μl PBS 0,1% BSA). 100 μl ćelijske suspenzije (koja sadrži 0,4 x 10<6>ćelija) je naneto na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i centrifugirano (420 x g, 4 min). Nakon uklanjanja supernatanta, PBMC su inkubirani 30 min na 4°C sa rastućim koncentracijama CD20 TCB-AlexaFlour488 (200 pM - 200 nM), dva puta isprani hladnim PBS sa 0,1% BSA, ponovo inkubirani još 30 min na 4°C sa humanim/cinomolgus unakrsno reaktivnim antitelima: anti-CD19 (interno, klon 8B8)-AlexaFluor647, anti-CD4 (BD, br. 552838, klon L200)-PerCPCy5.5 i anti-CD8 (BD, br.
555367, klon RPA-T8)-PE. Posle 30 min, PBMC su dva puta isprani hladnim PBS sa 0,1% BSA i tretirani FACS rastvorom za lizu (BD, br.349202), praćeno FACS analizom, koristeći FACS CantoII (softver FACS Diva). Krive vezivanja su dobijene pomoću softvera GraphPadPrism5.
Rezultati su prikazani na slici 11A (vezivanje za humane B ćelije i B ćelije cinomolgus majmuna), Slici 11B (vezivanje za CD4 T ćelije čoveka i majmuna cinomolgus) i Slici 11C (vezivanje za CD8 T ćelije čoveka i majmuna cinomolgus). Vrednosti EC50 koje se odnose na vezivanje za B-ćelije koje eksprimiraju CD20, izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5, bile su 4,8 nM (humane B ćelije) i 3,3 nM (B ćelije cinomolgusa).
Liza tumora posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitijela
Liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela (molekuli "B", "A", "C" i "H" prikazani gore) je procenjena na Z138 ćelijama (limfom pokrovnih ćelija, 0,06-0,23 x 10<6>CD20 vezujućih mesta). Humani PBMC su korišćeni kao efektori, i liza tumora je detektovana nakon 21-24 h inkubacije sa različitim formatima bispecifičnih antitela. Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene, isprane i nanete u gustini od 50.000 ćelija/bunarčiću, koristeći ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene diferencijalnim centrifugiranjem Histopaque zdrave ljudske krvi. Sveža krv je razblažena sterilnim PBS-om i raslojena putem gradijenta Histopaque (Sigma, br. H8889). Nakon centrifugiranja (450 x g, 30 minuta, sobna temperatura, bez kočnica), plazma iznad međufaze koja sadrži PBMC je odbačena, i PBMC-ovi su preneti u novu falcon epruvetu koja je zatim napunjena sa 50 ml PBS. Smeša je centrifugirana (350 x g, 10 minuta, sobna temperatura), supernatant je odbačen, i PBMC pelet ispran sterilnim PBS-om (300 x g, 10 minuta). Dobijena PBMC populacija je prebrojavana automatski (ViCell) i skladištena u RPMI1640 medijumu koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamina (Biochrom, K0302) na 37°C, 5% CO2, u ćelijskom inkubatoru do dalje upotrebe (ne duže od 24 h). Za test lize tumora, antitela su dodata u naznačenim koncentracijama (opseg od 0,1 pM - 1 nM u triplikatu). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 6:1. Liza ćelija tumora je procenjivana nakon 21-24 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih / nekrotičnih ćelija (LDH komplet za detekciju, Roche Applied Science, br. 11644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Tritona X-100. Minimalna liza (= 0%) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog konstrukta.
Slika 12 pokazuje da različiti formati CD20 TCB antitela indukuju jaku i ciljno specifičnu lizu CD20<+>ciljnih ćelija. Panel A prikazuje da “CD20 TCB_2 1_ sa naelektrisanjem, invertovan” (molekul “B” prikazan gore) pokazuje sličnu aktivnost kao “CD20 TCB_2 1_bez naelektrisanja, invertovan” (molekul “A” prikazan gore), i da su oba potentnija od formata "CD20 TCB_1 1_ sa naelektrisanjem" (molekul "H" prikazan gore). Panel B prikazuje da je "CD20 TCB_2 1_sa naelektrisanjem, invertovan" (molekul "B" prikazan gore) potentniji od formata "CD20 TCB_2 1_sa naelektrisanjem, klasični" (molekul "C" prikazan gore). Vrednosti EC50 koje se odnose na testove ubijanja, izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5, date su u Tabeli 5.
TABELA 5. Vrednosti EC50 (pM) lize tumorskih ćelija posredovane različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela procenjene upotrebom Z138 ciljnih tumorskih ćelija koje eksprimiraju CD20.
Liza tumorskih ćelija i naknadna aktivacija T ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela
Liza tumorskih ćelija posredovana različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela (molekuli "B" i "H" prikazani gore) dalje je procenjivana na Z138 ćelijama (limfom pokrovnih ćelija) upotrebom humanih PBMC dobijenih od tri različita zdrava donora, kao i na širem panelu DLBCL linija, uključujući ćelijske linije OCI Ly-18 (0,06-0,2 x 10<6>mesta vezivanja CD20), Ramos (0,1-0,4 x 10<6>mesta vezivanja CD20), SU-DHL-5 (0,13-0,21 x 10<6>CD20 mesta vezivanja CD20), SU-DHL-8 (mesta vezivanja CD20 ispod granice detekcije testa), Toledo (0,02 x 10<6>mesta vezivanja CD20) i U2932 (0,09-0,4 x 10<6>mesta vezivanja CD20). Sakupljanje ćelija tumora, izolacija PBMC i uslovi analize bili su identični onima opisanim u prethodnom primeru. Odnos E:T za testove prikazane na slikama 13 A-C bio je 6:1, za test prikazan na slici 13D bio je 3:1. Liza ćelija tumora je procenjena nakon 21 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, kvantifikacijom LDH oslobođenog u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih/nekrotičnih ćelija (komplet za detekciju LDH, Roche Applied Science, br.
11 644 793 001). Za procenu aktivacije T ćelija koja se dešava nakon lize tumorskih ćelija, PBMC su prebačeni na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, centrifugirani na 400 x g tokom 5 min i isprani dva puta pomoću PBS koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (APCCy7 anti-humani CD8 Biolegend, br. 301016), CD4 (FITC anti-humani CD4, Biolegend br.300506) i CD25 (PECy7 anti-humani CD25 Biolegend br.302612) izvedeno je prema naznakama dobavljača. Ćelije su isprane dva puta sa 150 µl/bunarčiću PBS koji sadrži 0,1% BSA i fiksirane korišćenjem 2% PFA ili FACS rastvora za lizu (BD, br. 349202). Uzorci su analizirani na BD FACS CantoII.
Slika 13 pokazuje da je format antitela "CD20 TCB_2 1_sa naelektrisanjem, invertovan" (molekul "B" prikazan gore) potentniji od formata antitela "CD20 TCB_1 1" (molekul "H" prikazan gore), kako je procenjeno detekcijom lize obe tumorske ćelije (paneli A, D) i aktivacijom T ćelija (Panel B, C) korišćenjem PBMC različitih donora. Vrednosti EC50 koje se odnose na lizu tumora i aktivaciju T ćelija Z138 ćelija date su u Tabeli 6a. Vrednosti EC50 koje se odnose na testove lize tumora na panelu ćelijskih linija DFBCF date su u Tabeli 6b. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5.
TABELA 6a. Vrednosti EC50 (pM) lize tumorskih ćelija i aktivacije T ćelija posredovane anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitelima koristeći tumorske ćelije Z138 koje eksprimiraju CD20.
TABELA 6b. Vrednosti EC50 (pM) lize tumora na panelu DLBCL tumorskih ćelijskih linija posredovane anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitelima.
Iscrpljivanje B ćelija u ljudskoj punoj krvi posredovano različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela
Normalno iscrpljivanje B ćelija posredovano različitim formatima anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela (molekuli "B" i "H" prikazani gore) i obinutuzumabom je dalje procenjivano koristeći svežu ljudsku krv zdravih volontera. Ukratko, sveža krv je sakupljena u špricevima koji sadrže heparin. Alikvoti krvi (180 µl/bunarčiću) naneti su na ploče sa 96 dubokih bunarčića, dopunjeni pomoću TCB ili razblaženjima antitela (10 µl/bunarčiću 10 µl/bunarčiću PBS), i inkubirani 24 h na 37°C u 5% CO2u ovlaženom ćelijskom inkubatoru. Posle inkubacije, krv je pomešana pipetiranjem gore-dole, pre nego što je 35 µl krvnih alikvota prebačeno na ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i inkubirano sa fluorescentnim anti-CD45 (APC, Biolegend, br. 304037), anti-CD4 (PerCPCy5.5, BD, br.
552838), anti-CD8 (APCCy7, Biolegend, br. 301016), anti-CD19 (PE, Biolegend, br.
302208), anti-CD25 (PECy7, Biolegend, br. 302612) i anti-CD69 (BV421, Biolegend, br.
310930), ukupno 55 µl zapremine za protočnu citometriju. Posle 15 min inkubacije na sobnoj temperaturi (u mraku) dodato je 180 µl/bunariću FACS rastvora za lizu (BD Biosciences) da bi se iscrpeli eritrociti i fiksirale ćelije pre protočne citometrije.
Slika 14 pokazuje da je „CD20 TCB_2 1_ sa naelektrisanjem, invertovan“ (molekul „B“ gore) potentniji u iscrpljivanju normalnih B ćelija nego obinutuzumab (Gazyva) i „CD20 TCB_1 1“ sa naelektrisanjem (molekul „H“ iznad).
TABELA 7. Vrednosti EC50 (pM) iscrpljivanja B ćelija u normalnoj ljudskoj punoj krvi posredovanog različitim antitelima koja ciljaju CD20.
Aktivacija T ćelija određena putem kvantifikacije intenziteta CD3 nishodne signalizacije pomoću Jurkat-NFAT reporter testa
Kapacitet različitih formata anti-CD20 / anti-CD3 TCB antitela za indukciju unakrsnog vezivanja T ćelija i naknadnu aktivaciju T-ćelija je određen korišćenjem zajedničkih kultura CD20-eksprimirajućih tumorskih ciljnih ćelija i Jurkat-NFAT reporter ćelija (CD3-eksprimirajuća ćelijska linija reportera za humanu akutnu limfatičku leukemiju sa NFAT promoterom, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega br. CS176501). Nakon istovremenog vezivanja anti-CD20 / anti-CD3 TCB za CD20 antigen (eksprimiran na tumorskim ćelijama) i CD3 antigen (eksprimiran na Jurkat-NFAT reporter ćelijama), NFAT promoter je aktiviran, i dovodi do ekspresije aktivne luciferaze svica. Intenzitet signala luminescencije (dobijen nakon dodavanja supstrata luciferaze) proporcionalan je intenzitetu aktivacije CD3 i signalizacije. Jurkat-NFAT reporterske ćelije rastu u suspenziji, i uzgajane su u RPMI1640, sa 2g/l glukoze, 2 g/l NaHCO3, 10% FCS, 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 1 x NEAA, 1 x natrijum piruvat pri 0,1 - 0,5 miliona ćelija po ml, 200 µg po ml higromicina. Za test, tumorske ciljne ćelije (Z138) su sakupljene, i vijabilnost određena pomoću ViCell. 50 µl/bunarčiću razblaženih antitela ili medijuma (za kontrole) je dodato ciljnim ćelijama. 20.000 ćelija/bunarčiću je stavljeno na ploču sa ravnim dnom, sa 96 bunarčića belih zidova (br. 655098, Greiner bio-one). Nakon toga, sakupljene su Jurkat-NFAT reporter ćelije i procenjena vijabilnost pomoću ViCell-a. Ćelije su ponovo suspendovane na 2 miliona ćelija/ml u ćelijskom medijumu bez higromicina B, i dodate u tumorske ćelije na 0,1 x 10<6>ćelija/bunarčiću (50 μl/bunarčiću) da se dobije krajnji E:T od 5:1, i krajnja zapremina od 100 µl/bunarčiću. Ćelije su inkubirane 6 h na 37°C u vlažnom inkubatoru. Na kraju vremena inkubacije, 100 µl/bunarčiću ONE-Glo rastvora (1:1 ONE-Glo i zapremina test medijuma po bunarčiću) je dodato u bunarčiće i inkubirano 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Luminescencija je detektovana pomoću WALLAC Victor3 ELISA čitača (PerkinElmer2030), detekciono vreme 5 sekundi/bunarčiću. Slika 15 prikazuje da „CD20 TCB_2 1_ sa naelektrisanjem, invertovani“ (molekul „B“ gore) dovodi do jače aktivacije T ćelija i signalizacije nishodno od CD3 nego „CD20 TCB_1 1“ (molekul „H“ gore).
TABELA 8. Vrednosti EC50 (pM) aktivacije CD3 detektovane pomoću Jurkat-NFAT reporter ćelija.
FK pojedinačne doze anti-CD20 / anti-CD3 TCB kod zdravih NOG miševa Izvedena je farmakokinetička studija pojedinačne doze (SDPK) da bi se procenila izloženost anti-CD20 / anti-CD3 TCB molekula "B" (u daljem tekstu "CD20 TCB") tokom studija efikasnosti (Slika 16). Davanje i.v. bolusa od 0,5 mg/kg primenjeno je na NOG miševima, i uzorci krvi su uzeti u odabranim vremenskim intervalima za farmakokinetičku procenu. Za merenje ukupnih koncentracija CD20 TCB korišćen je generički imunotest. Raspon kalibracije standardne krive za CD20 TCB bio je 0,78 do 50 ng/ml, gde je 15 ng/ml donja granica kvantifikacije (LLOQ).
Bifazni pad je primećen sa beta poluživotom od 10 dana (nekompartmentalna analiza) i klirensom od 8 ml/d/kg (2-kompartmentalni model). Poluživot i klirens su očekivani u odnosu na normalni neciljani IgG (Tabela 9).
Phoenix v6.2 kompanije Pharsight Ltd je korišćen za FK analizu, modeliranje i simulaciju.
TABELA 9. Farmakokinetički parametri kod davanja i.v. bolusa od 0,5 mg/kg CD20 TCB kod NOG miševa.
Aktivnost anti-CD20 / anti-CD3 TCB u iscrpljivanju B-ćelija in vivo Iscrpljivanje aktivnosti perifernih B-ćelija CD20 TCB je testirano na kompletno humanizovanim NOD/Shi-scid/IL-2Rγ<null>(NOG) miševima.
Potpuno humanizovani NOG miševi stari 14 nedelja, koji su nosili fiziološke nivoe cirkulišućih humanih B- i T-ćelija (Hayakawa J. et al. (2009), Stem Cells 27 (1), 175-182), tretirani su ili nosačem (n = 7) ili sa CD20 TCB (n = 6) u dozi od 0,5 mg/kg intravenski (i.v.) jednom nedeljno. Kao što je prikazano na dizajnu studije na slici 17, miševima je uzeta krv za analizu B ćelija i T-ćelija jedan i tri dana nakon prve terapeutske injekcije (D1, D3), i tri dana nakon druge (D10), i u tom terminu je studija prekinuta. U kasnijem terminu, slezine su takođe sakupljene za analizu B-ćelija i T-ćelija. Miševi su pregledani 4 dana pre terapeutske injekcije (D-4) kao početna referenca za brojanje B- i T-ćelija u cirkulaciji. Slika 18 prikazuje broj B- i T-ćelija analiziran ex vivo protočnom citometrijom u krvi miševa tretiranih nosačem (levi panel) i pomoću CD20 TCB (desni panel) u različitim vremenskim intervalima. Rezultati pokazuju da su cirkulišuće B-ćelije veoma efikasno iscrpljene već jedan dan nakon injekcije CD20 TCB, i njihov broj nije mogao biti detektovan tokom čitavog trajanja ispitivanja. Nasuprot tome, broj T-ćelija u cirkulaciji je samo prolazno snižen u terminu Dl nakon terapeutske injekcije, vratio se na početne nivoe u terminu D3 i ostao stabilan tokom čitavog trajanja ispitivanja. Status aktivacije T-ćelija je takođe analiziran u krvi tretiranih miševa u terminu D3 i D10 nakon prve terapeutske injekcije, pomoću ex vivo protočne citometrije, koristeći različite T-ćelijske površine i marker proliferacije Ki67 (Slika 19). T-ćelije iz CD20 TCB tretiranih miševa pokazale su aktivirani fenotip u terminu D3 nakon terapeutske injekcije (gornji panel), uz povećanje aktivacionih markera CD25, 4-1BB, PD-1 i granzyme-B (GZB) u CD4 i CD8 T-ćelijske pregradama, u poređenju sa T-ćelijama iz kontrole-nosača. T-ćelije iz tretiranih miševa takođe su eksprimirale više nivoe markera za proliferaciju Ki67. U terminu D10 nakon prve terapeutske injekcije, većina markera aktivacije T-ćelija vratila se na početne nivoe, sa izuzetkom GZB i PD-1, koji su još uvek bili eksprimirani na višim nivoima u odnosu na kontrolu-nosač.
Na slici 20 prikazani su rezultati analize B-ćelija i T-ćelija na slezinama miševa tretiranih nosačem i pomoću CD20 TCB na završetku studije (D10). Tretman CD20 TCB posredovao je u vrlo efikasnom iscrpljivanju B ćelija i u ovom sekundarnom limfoidnom organu (Slika 20A), dok je broj T-ćelija pokazao nivoe koji se mogu uporediti sa kontrolomnosačem (Slika 20B). Status aktivacije T ćelija (Slika 20C) bio je sličan onom koji je primećen u krvi, sa većom ekspresijom GZB i PD-1 u T ćelijama slezine tretiranih miševa u odnosu na kontrolu-nosač.
Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da tretman sa CD20 TCB može posredovati u veoma efikasnom iscrpljivanju perifernih B-ćelija već jedan dan nakon injekcije terapije, dok B-ćelije ostaju nedetektovane do završetka studije (tri dana nakon druge terapeutske injekcije). B-ćelije su takođe efikasno iscrpljene u slezini tretiranih miševa. Aktivnost iscrpljivanja B-ćelija je paralelna sa prolaznom aktivacijom T-ćelija u krvi tretiranih životinja, koja se vraća na osnovne nivoe tri dana nakon terapeutske injekcije, sa izuzetkom GZB i PD-1 aktivacionih markera, koji ostaju eksprimirani na višem nivou u odnosu na netretirane kontrole.
Anti-tumorska aktivnost anti-CD20 / anti-CD3 TCB u modelu WSU-DLCL2 Antitumorska aktivnost CD20 TCB testirana je na NOG miševima koji nose humanu ćelijsku liniju difuznog velikog B-ćelijskog limfoma WSU-DLCL2, i preneti su sa humanim perifernim mononuklearnim ćelijama (PBMC). Ukratko, ženkama NOG miševa je supkutano (sc) injektovano 1,5 x 10<6>WSU-DLCL2 ćelija (originalno dobijene iz Evropske zbirke ćelijskih kultura). Kada je prosečan volumen tumora dostigao 200 mm<3>, miševi su dobili intraperitonealnu injekciju ljudskih PBMC (10 x 10<6>ćelija po mišu) kao izvor humanih T-ćelija. Dva dana kasnije, miševi su dobili i.v. CD20 TCB terapiju u dozi od 0,5 mg/kg primenjenu jednom nedeljno. Kao što je prikazano na Slici 21, CD20 TCB pokazuje snažnu anti-tumorsku aktivnost, sa gotovo potpunom regresijom tumora koja je uočena kod završetka studije (dan 34).
Primer 2
Priprema "2 1 IgG CrossFab, invertovanog" T-ćelijskog bispecifičnog antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-BCMA / anti-CD3)
Šematski prikaz molekula pripremljenih u ovom primeru prikazan je na slici 22. Anti-BCMA / anti-CD3 “2 1 IgG CrossFab, invertovani” molekul bez modifikacije naelektrisanja (koji se u ovom primeru naziva “83A10-TCB”) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 22-25, anti-BCMA/anti-CD3 “2 1 IgG CrossFab, invertovani” molekul sa modifikacijama naelektrisanja (u ovom primeru označen kao “83A10-TCBcv”) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 26-29.
Za generisanje vektora BCMAxCD3 bispecifičnog antitela, bispecifični molekuli izvedeni iz IgG1 se sastoje najmanje od dva antigen vezujuća ostatka sposobna da se specifično vežu za dve različite antigenske determinante CD3 i BCMA. Antigen vezujući ostaci su Fab fragmenti sastavljeni od teškog i lakog lanca, od kojih svaki sadrži varijabilni i konstantni region. Najmanje jedan od Fab fragmenata je "Crossfab" fragment, gde su razmenjeni VH i VL. Razmena VH i VL unutar Fab fragmenta osigurava da Fab fragmenti različite specifičnosti nemaju identičan raspored domena. Dizajn bispecifičnog molekula bio je jednovalentan za CD3 i dvovalentan za BCMA, gde je jedan Fab fragment spojen sa N-krajem unutrašnjeg CrossFab (2 1). Bispecifični molekul je sadržao Fc deo, kako bi molekul imao duži poluživot. Molekuli su proizvedeni kotransficiranjem HEK293 EBNA ćelija uzgajanih u suspenziji sa ekspresionim vektorima sisara, koristeći polietilenimin (PEI). Za pripremu 2 1 CrossFab-IgG konstrukata, ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 ("vektor Fc (dugme)": "vektorski laki lanac": "vektorski laki lanac CrossFab": “vektorski teški lanac-CrossFab”).
Za bispecifična antitela, uvođenje zamene/razmene u jednom vezujućem kraku "CrossFab" jasno smanjuje sporedne proizvode, ali preparat nije potpuno oslobođen nusprodukata (detaljno opisano u WO2009/080252 i Schafer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Prema tome, da bi se dalje smanjili nusprodukti uzrokovani neskladom lakog lanca protiv prvog antigena sa pogrešnim teškim lancem protiv drugog antigena, i da bi se poboljšao prinos bispecifičnog antitela, dodat je pristup molekulu uvođenjem supstitucija naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjem na specifičnim aminokiselinskim položajima u CH1 i CL domenima u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K), argininom (R)), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatu); ili ii) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina u položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K), argininom (R)), i pri čemu je u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) aminokiselina u položaju 147 ili aminokiselina u položaju 213 nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatu).
Za proizvodnju bispecifičnih antitela, bispecifična antitela su eksprimirana prolaznom kotransfekcijom odgovarajućih ekspresionih vektora sisara u ćelijama HEK293-EBNA, koje su uzgajane u suspenziji, koristeći polietilenimin (PEI). Dan pre transficiranja, HEK293-EBNA ćelije su zasejane pri 1,5 miliona živih ćelija/ml u Ex-Cell medijumu sa dodatkom 6 mM L-glutamina. Za svaki ml finalne proizvodne zapremine centrifugirano je 2,0 miliona živih ćelija (5 minuta na 210 x g). Supernatant je usisan, i ćelije su ponovo suspendovane u 100 µl CD CHO medijuma. DNK za svaki ml finalne proizvodne zapremine pripremljena je mešanjem 1 µg DNK (odnos teški lanac: modifikovani teški lanac: laki lanac: modifikovani laki lanac = 1:1:2:1) u 100 µl CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 0,27 µl rastvora PEI (1 mg/ml), smeša je mešana na vorteksu 15 sekundi, i ostavljena na sobnoj temperaturi 10 minuta. Nakon 10 minuta, ponovo suspendovane ćelije i smeša DNK/PEI su spojeni, a zatim prebačeni u odgovarajuću posudu koja je stavljena u šejker (37°C, 5% CO2). Nakon 3 sata inkubacije, dodato je 800 µl Ex-Cell medijuma, dopunjenog 6 mM L-glutaminom, 1,25 mM valproinskom kiselinom i 12,5% Pepsoy (50 g/l), za svaki ml finalne proizvodne zapremine. Nakon 24 sata, dodat je Feed (SE40, Lonza), 70 µl za svaki ml finalne proizvodne zapremine. Nakon 7 dana, ili kada je vijabilnost ćelija bila jednaka ili manja od 70%, ćelije su odvojene od supernatanta centrifugiranjem i sterilnom filtracijom. Antitela su prečišćena afinitetnim korakom, i sa jednim ili dva koraka poliranja, a to je hromatografija katjonske izmene i gel hromatografija. Po potrebi, korišćen je dodatni korak poliranja.
Za afinitetni korak, supernatant je nanet na kolonu sa proteinom A (HiTrap Protein A FF, 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 6 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Nakon koraka ispiranja sa istim puferom, antitelo je eluirano sa kolone elucionim korakom pomoću 20 mM natrijum fosfata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina, pH 3,0. Frakcije sa željenim antitelom su odmah neutralisane 0,5 M natrijum fosfatom, pH 8,0 (1:10), sakupljene i koncentrovane centrifugiranjem. Koncentrat je sterilno filtriran i dalje obrađivan hromatografijom katjonske izmene i/ili gel hromatografijom.
Za korak hromatografije katjonske izmene, koncentrovani protein je razblažen 1:10 elucionim puferom koji je korišćen za afinitetni korak, i nanet na kolonu za katjonsku izmenu (Poros 50 HS, Applied Biosystems). Nakon dva koraka ispiranja ekvilibracionim puferom i puferom za ispiranje, odnosno 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, 20 mM TRIS, pH 5,0 i 20 mM natrijum fosfatom, 20 mM natrijum citratom, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum hloridom pH 5,0, protein je eluiran gradijentom, koristeći 20 mM natrijum fosfat, 20 mM natrijum citrat, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum hlorid pH 8,5. Frakcije koje sadrže željeno antitelo su spojene, koncentrovane centrifugiranjem, sterilno filtrirane i dalje obrađene korakom gel hromatografije.
Za korak gel hromatografije, koncentrovani protein je injektovan na kolonu XK16/60 HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) i 20 mM histidin, 140 mM natrijum hlorid, pH 6,0 sa ili bez Tween20 kao pufer za formulaciju. Frakcije koje sadrže monomere su sakupljene, koncentrovane centrifugiranjem i sterilno filtrirane u sterilnu bočicu.
Određivanje koncentracije antitela vršeno je merenjem apsorbance na 280 nm, koristeći teorijsku vrednost apsorbance 0,1% rastvora antitela. Ova vrednost je zasnovana na aminokiselinskoj sekvenci, i izračunata pomoću GPMAW softvera (Lighthouse data).
Čistoća i sadržaj monomera u finalnom preparatu proteina određeni su na CE-SDS (Caliper LabChip GXII sistem (Caliper Life Sciences)) odn. HPLC (TSKgel G3000 SW XL analitička kolona za gel hromatografiju (Tosoh)) u 25 mM kalijum fosfatu, 125 mM natrijum hloridu, 200 mM L-arginin monohidrohloridu, 0,02% (m/V) natrijum azidu, pufer pH 6,7.
Da bi se verifikovala molekulska masa finalnih proteinskih preparata i potvrdila homogena priprema molekula finalnog proteinskog rastvora, upotrebljena je tečna hromatografija-masena spektrometrija (LC-MS). Prvi korak je bio deglikozilacija. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti su tretirani PNGazom F (ProZyme). Stoga je pH rastvora proteina podešen na pH 7,0 dodavanjem 2 µl 2 M Tris do 20 µg proteina sa koncentracijom od 0,5 mg/ml. Dodato je 0,8 µg PNGaze F, i inkubirano 12 h na 37°C. Zatim je izvršena LC-MS onlajn detekcija. LC-MS metoda je izvedena na aparatu Agilent HPLC 1200 spojenom na maseni spektrometar TOF 6441 (Agilent). Hromatografsko razdvajanje je izvršeno na koloni Macherey Nagel Polysterene; RP1000-8 (veličina čestica 8 µm, 4,6 x 250 mm; kat. br. 719510). Eluent A je bio 5% acetonitril i 0,05% (V/V) mravlja kiselina u vodi, eluent B je bio 95% acetonitril, 5% vode i 0,05% mravlja kiselina. Protok je bio 1 ml/min, razdvajanje je izvršeno na 40°C i 6 µg (15 µl) uzorka proteina dobijenog tretmanom kao što je opisano gore.
Tokom prvih 4 minuta, eluat je bio usmeren u otpad, kako bi se maseni spektrometar zaštitio od kontaminacije solju. ESI-izvor je radio sa protokom gasa za sušenje od 12 l/min, temperaturom od 350°C i pritiskom raspršivača od 60 psi. MS spektri su dobijeni korišćenjem napona fragmentora od 380 V i raspona mase od 700 do 3200 m/z u režimu pozitivnog jona. MS podaci su dobijeni pomoću softvera za instrumente od 4 do 17 minuta.
Slika 23 prikazuje CE-SDS (neredukovane) grafikone finalnih proteinskih preparata nakon različitih metoda prečišćavanja za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela. Afinitetna hromatografija sa proteinom A (PA) i koraci prečišćavanja gel hromatografijom (SEC) primenjeni na 83A10-TCB antitelo dali su čistoću <30% i 82,8% sadržaja monomera (A). Kada su primenjeni dodatni koraci prečišćavanja, uključujući korake hromatografije katjonske izmene (cIEX) i finalne gel hromatografije (re-SEC) na finalnim proteinskim preparatima u (A), čistoća je povećana na 93,4%, ali je sadržaj monomera ostao isti, a prinos je značajno smanjen na 0,42 mg/l. Međutim, kada su specifične modifikacije naelektrisanja primenjene na antitelo 83A10 anti-BCMA Fab CL-CH1, odnosno 83A10-TCBcv, bolji profil proizvodnje / prečišćavanja TCB molekula, kao što je pokazano čistoćom od 95,3%, sadržajem monomera 100% i prinosom do 3,3 mg/l, već se mogao primetiti čak i kada su primenjeni koraci prečišćavanja PA cIEX SEC (C) u odnosu na (B), sa profilom proizvodnje / prečišćavanja koji pokazuje 7,9 puta manji prinos i za 17,2% niži sadržaj monomera, uprkos uključivanju dodatnog koraka prečišćavanja re-SEC.
Zatim je sproveden uporedni postupak proizvodnje, da bi se uporedio profil proizvodnje / prečišćavanja 83A10-TCB naspram 83A10-TCBcv antitela, kako bi se dalje procenile prednosti modifikacija naelektrisanja CL-CH1 koje se primenjuju na antitela. Kao što je prikazano na Slici 24, svojstva antitela 83A10-TCB i 83A10-TCBcv merena su paralelno, i upoređivana nakon svakog koraka prečišćavanja 1) samo PA afinitetnom hromatografijom (A, B), 2) PA afinitetnom hromatografijom, zatim SEC (C, D) i 3) PA afinitetnom hromatografijom, zatim SEC, a zatim cIEX i re-SEC (E, F). Grafikoni CE-SDS (neredukovani) finalnih proteinskih rastvora nakon odgovarajućih metoda prečišćavanja za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela prikazani su na slici 24. Kao što je prikazano na slikama 24A i 24B, poboljšanja sa primenom varijanti naelektrisanja na TCB antitela su već uočena samo nakon prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom. U ovoj uporednoj studiji, korak prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom primenjen na 83A10-TCB antitelo dao je čistoću od 61,3%, prinos od 26,2 mg/l i 63,7% sadržaja monomera (24A). Kao poređenje, kada je 83A10-TCBcv antitelo prečišćeno PA afinitetnom hromatografijom, sva svojstva su poboljšana sa boljom čistoćom od 81,0%, boljim prinosom od 51,5 mg/l i sadržajem monomera 68,2% (24B). Kada je primenjen dodatni korak prečišćavanja SEC na finalne proteinske preparate, kako se vidi na slikama 24A i 24B, 83A10-TCB je imao čistoću od 69,5%, prinos od 14,1 mg/l i sadržaj monomera 74,7% u odnosu na 83A10-TCBcv sa poboljšanom čistoćom i sadržajem monomera do 91,0%, odnosno 83,9%, i prinosom od 10,3 mg/l. Iako je prinos bio nešto manji (tj.27% manji) za 83A10-TCBcv nego za 83A10-TCB u ovom konkretnom eksperimentu, procenat korektnog molekula bio je mnogo bolji za 83A10-TCBcv nego za 83A10-TCB, odnosno 90% prema 40-60%, mereno pomoću LC-MS. U trećem uporednom pregledu, finalni proteinski preparati 83A10-TCB i 83A10-TCBcv sa slika 24C i 24D su sakupljeni sa približno 1 l (ekvivalentna zapremina) odgovarajućih finalnih proteinskih preparata iz druge serije prečišćavanja (ista proizvodnja) nakon prečišćavanja samo PA afinitetnom hromatografijom. Prikupljeni proteinski preparati su zatim dalje prečišćavani cIEX i SEC metodama prečišćavanja. Kao što je prikazano na slikama 24E i 24F, poboljšanje profila proizvodnje / prečišćavanja TCB antitela sa varijantama naelektrisanja konzistentno je primećivano kada se uporedi sa TCB antitelom bez varijante naelektrisanja. Pošto je nekoliko koraka metoda prečišćavanja (tj. PA /- SEC cIEX SEC) korišćeno za prečišćavanje antitela 83A10-TCB, postignuta je čistoća od samo 43,1% i sadržaj monomera 98,3%, ali na štetu prinosa, koji je smanjen na 0,43 mg/l. Procenat korektnog molekula izmeren pomoću LC-MS još uvek je bio mali, i iznosio je 60-70%. Na kraju, kvalitet finalnog preparata proteina nije bio prihvatljiv za in vitro upotrebu. Nasuprot tome, kada su isti višestruki koraci prečišćavanja po istom redosledu primenjeni na antitelo 83A10-TCBcv, postignuta je čistoća 96,2% i sadržaj monomera 98,9%, kao i 95% korektnog molekula, mereno pomoću LC-MS. Međutim, prinos je takođe znatno smanjen na 0,64 mg/l nakon koraka prečišćavanja cIEX. Rezultati pokazuju da se bolja čistoća, veći sadržaj monomera, veći procenat korektnog molekula i bolji prinos mogu postići sa antitelom 83A10-TCBcv samo nakon dva standardna koraka prečišćavanja, tj. PA afinitetne hromatografije i SEC (Slika 24D), dok se takva svojstva ne mogu postići sa 83A10-TCB, čak ni kada su primenjeni dodatni koraci prečišćavanja (Slika 24E). Tabela 10 rezimira svojstva 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv nakon koraka PA prečišćavanja. Tabela 11 rezimira svojstva 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv nakon PA i SEC koraka prečišćavanja. Tabela 12 rezimira svojstva 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv nakon koraka prečišćavanja PA i SEC plus samo PA, zatim cIEX i re-SEC. U tabelama 10 do 12, vrednosti označene podebljanim slovima označavaju bolju osobinu, poredeći 83A10-TCB i 83A10-TCVcv. Sa jednim izuzetkom koji možda nije reprezentativan, svi parametri proizvodnje / prečišćavanja koji su rezultat 3 eksperimenta upoređivanja bili su bolji za 83A10-TCBcv u poređenju sa 83A10-TCB. Sveukupni rezultati jasno pokazuju da se prednosti u proizvodnji / prečišćavanju mogu postići primenom modifikacija naelektrisanja CL-CH1 na TCB antitela, i da su samo dva koraka prečišćavanja (tj. PA afinitetna hromatografija i SEC) potrebna za postizanje visokokvalitetnih proteinskih preparata sa vrlo dobrim razvojnim svojstvima.
TABELA 10. Profil proizvodnje / prečišćavanja anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela nakon koraka prečišćavanja afinitetnom hromatografijom sa proteinom A.
TABELA 11. Profil proizvodnje / prečišćavanja anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela nakon koraka prečišćavanja afinitetnom hromatografijom sa proteinom A i gel hromatografijom.
TABELA 12. Profil proizvodnje / prečišćavanja anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela nakon koraka prečišćavanja 1.a) afinitetne hromatografije sa proteinom A i gel hromatografije i 1.b) afinitetne hromatografije sa proteinom A samo objedinjena, zatim 2) katjonske izmenjivačke hromatografije i 3) finalne gel hromatografije.
Vezivanje anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (protočna citometrija)
Anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela (83A10-TCB, 13A4-TCBcv) su analizirana protočnom citometrijom da bi se odredilo vezivanje za humani BCMA na BCMA-eksprimirajućim ćelijama NCI-H929 (ATCC® CRL-9068™). MKN45 (humana ćelijska linija adenokarcinoma želuca koja ne eksprimira BCMA) korišćena je kao negativna kontrola. Ukratko, uzgajane ćelije su sakupljene, prebrojane, i vijabilnost ćelija je procenjena pomoću ViCell-a. Vijabilne ćelije su zatim podešene na 2 x 10<6>ćelija po ml u FACS puferu za bojenje koji sadrži BSA (BD Biosciences). Zatim je alikvot od 100 µl ove ćelijske suspenzije dodat u svaki bunarčić na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i inkubiran sa 30 µl anti-BCMA antitela ili odgovarajućom IgG kontrolom tokom 30 minuta na 4°C. Sva anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela (i TCB kontrole) su titrisana i analizirana u konačnom rasponu koncentracija između 1 - 300 nM. Ćelije su zatim centrifugirane (5 min, 350 x g), isprane sa 120 µl/bunarčiću FACS pufera za bojenje (BD Biosciences), ponovo suspendovane i inkubirane dodatnih 30 min na 4°C sa fluorhrom-konjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fc fragment specifičnim (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). Ćelije su zatim isprane dva puta puferom za bojenje (BD Biosciences), fiksirane upotrebom 100 µl BD pufera za fiksiranje po bunarčiću (BD Biosciences, br. 554655) na 4°C tokom 20 min, ponovo suspendovane u 120 µl FACS pufera, i analizirane pomoću BD FACS CantoII. Kao što je prikazano na Slici 25, srednji intenzitet fluorescencije anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela je prikazan u funkciji koncentracija antitela; (A) 83A10-TCB na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama, (B) 83A10-TCBcv na H929 ćelijama i MKN45 ćelijama. Kada je primenljivo, EC50 je izračunat korišćenjem Prism GraphPad (LaJolla, CA, SAD) i EC50 vrednosti koje označavaju koncentraciju antitela koja je potrebna da bi se dostiglo 50% maksimalnog vezivanja za ćelije 83A10-TCB i 83A10-TCBcv do H929 sumirane su u tabeli 13. Slika 25C pokazuje da se 83A10-TCB i 83A10-TCBcv vezuju za H929 ćelije na način koji zavisi od koncentracije, i sa sličnom potencijom. Takvi rezultati su očekivani, jer molekuli 83A10-TCB i 83A10-TCBcv dele identične CDR sekvence na odgovarajućim varijabilnim domenima VL i VH. DP47-TCB kontrolno antitelo se nije vezalo za BCMA-pozitivne H929 ćelije mijeloma, mereno nedostatkom povećanja medijane intenziteta fluorescencije. U drugom uporednom eksperimentu, 83A10-TCB i 83A10-TCBcv su ispitivani u pogledu vezivanja za BCMA-pozitivne H929 ćelije i nedostatka vezivanja za BCMA / CD3-negativne MKN45 ćelije. Kao što je prikazano na Slici 25D, 83A10-TCB i 83A10-TCBcv se vezuju za BCMA-pozitivne H929 ćelije na način koji zavisi od koncentracije, i sa sličnom potencijom. EC50 vrednosti za vezivanje 83A10-TCB i 83A10-TCBcv za H929 ćelije za ovaj drugi eksperiment su rezimirane u tabeli 14.
TABELA 13. EC50 vrednosti za vezivanje anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela za H929 ćelije (Eksperiment 1).
TABELA 14. EC50 vrednosti za vezivanje anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela za H929 ćelije (Eksperiment 2).
Preusmerena T-ćelijska citotoksičnost H929 ćelija mijeloma sa velikom ekspresijom BCMA, indukovana anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (test oslobađanja LDH)
Anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela su takođe analizirana u pogledu potencijala da indukuju apoptozu posredovanu T ćelijama u ćelijama mijeloma koje imaju veliku ekspresiju BCMA nakon unakrsnog povezivanja konstrukta preko vezivanja antigen vezujućih ostataka za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane BCMA eksprimirajuće ciljne ćelije H929 multiplog mijeloma su sakupljene puferom za disocijaciju ćelija, isprane i ponovo suspendovane u RPMI uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen). Približno 30.000 ćelija po bunarčiću je stavljeno na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i dodato je odgovarajuće razblaženje konstrukta antitela za željenu konačnu koncentraciju (u triplikatu); konačne koncentracije su bile u rasponu od 0,1 pM do 10 nM. Radi odgovarajućeg poređenja, svi TCB konstrukti i kontrole su podešeni na istu molarnost. Humane ukupne T ćelije (efektor) su dodate u bunarčiće da bi se dobio konačni odnos efektor:cilj (E:T) od 5:1. Kada su humani PBMC korišćeni kao efektorske ćelije, korišćen je konačni odnos E:T od 10:1. Negativne kontrolne grupe predstavljene su samo efektorskim ili ciljnim ćelijama. Kao pozitivna kontrola za aktivaciju humanih pan T ćelija, korišćen je 1 µg/ml PHA-M (Sigma br. L8902). Za normalizaciju, maksimalna liza H929 MM ciljnih ćelija (= 100%) je određena inkubacijom ciljnih ćelija sa konačnom koncentracijom od 1% Triton X-100, indukovanjem ćelijske smrti. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama koinkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez bispecifičnog antitela T ćelija. Nakon 20-24 h inkubacije na 37°C, 5% CO2, oslobađanje LDH iz apoptotičnih / nekrotičnih ciljnih ćelija mijeloma u supernatantu je zatim mereno pomoću kompleta za detekciju LDH (Roche Applied Science), u skladu sa uputstvom proizvođača. Procenat oslobađanja LDH je predstavljen u odnosu na koncentracije anti-BCMA / anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela na krivama koncentracija-odgovor. Kada je primenljivo, vrednosti EC50 su merene korišćenjem Prism softvera (GraphPad), i određene kao koncentracija TCB antitela koja dovodi do 50% od maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je prikazano na Slici 26, anti-BCMA / anti-CD3 TCB antitela ((A, B) 83A10-TCB, (C, D) 83A10-TCBcv) indukovala su koncentraciono zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 ćelija mijeloma, mereno putem otpuštanja LDH. Ubijanje H929 ćelija je bilo specifično, jer DP47-TCB kontrolno antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije nije izazvalo oslobađanje LDH, čak ni pri najvišoj koncentraciji od 1 nM (A). Iako vrednosti EC50 nisu merljive korišćenjem statističkog softvera Prism (GraphPad) za 83A10-TCB (A, B) i 83A10-TCBcv (C, Eksperiment 1), veličina vrednosti EC50 mogla bi se približno proceniti na nizak pikomolarni raspon potencije za nenaelektrisane i naelektrisane TCB molekule. U drugom eksperimentu, efekat 83A10-TCBcv je procenjen u testu preusmeravanja ubijanja T-ćelija, i vrednost EC50 se može meriti na 1,5 pM. Autori ne mogu isključiti da bi nešto niža vrednost EC50 (nešto bolja potencija) mogla biti posledica varijabilnosti davaoca krvi. Međutim, veličina potencije za ubijanje ćelije H929 definitivno je u niskom pikomolarnom opsegu. Ukupni rezultati ukazuju na to da 83A10-TCB (bez varijante naelektrisanja) nasuprot 83A10-TCBcv (sa varijantom naelektrisanja) pokazuje slična biološka svojstva u testovima baziranim na ćelijama.
TABELA 15. EC50 vrednosti i procene za preusmereno T-ćelijsko ubijanje H929 ćelija indukovano antitelima anti-BCMA / anti-CD3 TCB.
Primer 3
Priprema „2 1 IgG CrossFab, invertovanog“ T-ćelijskog bispecifičnog antitela sa modifikacijama naelektrisanja (anti-Her2 / anti-CD3) i „2 1 IgG CrossFab“ T-ćelijskog bispecifičnog antitela sa modifikacijama naelektrisanja (anti-Her3 / anti -CD3) Šematski prikaz molekula pripremljenih u ovom primeru prikazan je na Slici 27. Anti-Her2 / anti-CD3 "2 1 IgG CrossFab, invertovani" molekul sa modifikacijama naelektrisanja (koji se u ovom primeru naziva "Her2 TCB") sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21, 52, 53 i 54. Anti-Her3 / anti-CD3 “2 1 IgG CrossFab” molekul sa modifikacijama naelektrisanja (koji se u ovom primeru naziva “Her3 TCB”) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 21, 55, 56 i 57.
Molekuli su pripremljeni, prečišćeni i analizirani kako je opisano u Primeru 1 gore (sa jednim korakom preparativne SEC).
Oba molekula se mogu prečistiti sa velikim finalnim kvalitetom, što pokazuje analitička gel hromatografija i CE-SDS (Tabela 16, 17). Iako je povraćaj Her2 TCB u ovom preparatu bio niži u odnosu na Her3 TCB, protein je bio gotovo čist nakon dva koraka prečišćavanja (Protein A i SEC). CE-SDS analiza pokazuje samo 1,18% nečistoće male molekulske mase na oko 164 kDa (Tabela 17). Vrste detektovane na 187,28 kDa odgovaraju ciljnom molekulu bez N-povezane glikozilacije na Fc domenu (ova vrsta se obično detektuje pomoću CE-SDS za humani IgG1nakon proizvodnje u eukariotskim ćelijama).
Her3 TCB se može prečistiti sa dobrim povraćajem. Konačni kvalitet je bio bolji od Her2 TCB poredeći konačni sadržaj monomera. Takođe, CE-SDS pokazuje 100% ciljni protein, pod pretpostavkom da pik detektovan na 192,05 kDa odgovara neglikozilovanoj Fcvrsti.
Kod oba preparata nisu detektovane nečistoće male molekulske mase povezane sa proizvodom, kao što su slobodni laki lanci (očekivana molekulska masa na 25 kDa), dimerizovani laki lanci, kao što se može desiti uvođenjem samo CH1-CL razmene na jednom lakom lancu (očekivana molekulska masa na 50 kDa) ili molekuli sa nedostaljućim ili nekovalentno vezanim lakim lancima (očekivana molekulska masa na 125 kDa, 150 kDa ili 175 kDa), putem CE-SDS ili analitičke gel hromatografije.
TABELA 16. Rezime proizvodnje i prečišćavanja anti-Her2 / anti-CD3 i anti-Her3 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijama naelektrisanja.
TABELA 17. CE-SDS analize (neredukovane) anti-Her2 / anti-CD3 i anti-Her3 / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijama naelektrisanja.
Vezivanje Her2 TCB i Her3 TCB za ćelije
Jurkatove ćelije iz suspenzije su sakupljene, jednom isprane FACS puferom (PBS 0,1% BSA), i vijabilnost je određena pomoću ViCell-a.
Prianjajuće KPL-4 tumorske ćelije (koje je obezbedio J. Kurebajaši, Kawasaki Medical School, Japan) su sakupljene sa puferom za disocijaciju ćelija (Gibco Invitrogen) i jednom isprane FACS puferom, pre nego što je vijabilnost određena pomoću ViCell-a.
0,2 miliona ćelija je stavljeno po bunarčiću na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i ploče su centrifugirane 4 min na 400 g. Zatim je ćelijama dodato 25 µl po bunarčiću razblaženjaTCB u FACS puferu. Ćelije su inkubirane 30 minuta u frižideru. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću.
25 µl odgovarajuće razblaženog sekundarnog antitela (FITC konjugovani AffiniPure F(ab')2fragment, kozji anti-humani IgG, F(ab')2fragment specifični, Jackson ImmunoResearch) je dodato po bunarčiću, i ploče su bojene još 30 min na 4°C u mraku.
Ploče su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću, i ponovo suspendovane u 150 µl FACS pufera. Analiza je izvršena pomoću BD FACS CantoII, opremljenog softverom FACS Diva. Srednje vrednosti fluorescencije (MFI) prikazane su u odnosu na koncentraciju TCB molekula.
Kao što je prikazano na Slici 29, oba TCB-a pokazuju koncentraciono zavisno dobro vezivanje za svoje ciljne antigene na ćelijama.
Aktivacija humanih CD8<+>T efektorskih ćelija, nakon lize humanih tumorskih ćelija posredstvom T-ćelija, indukovane pomoću Her3 TCB
CD8<+>T efektorske ćelije iz klasičnog eksperimenta lize tumorskih ćelija (kao što je opisano u nastavku) sa Her3 TCB koristeći odnos efektor-cilj (E:T) od 10:1 i vreme inkubacije od 48 sati procenjeni su u pogledu procenta CD69-pozitivnih ćelija. Ukratko, nakon inkubacije, PBMC su prebačeni na ploču sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, centrifugirani na 350 x g tokom 5 min, i dva puta isprani sa PBS koji sadrži 0,1% BSA. Površinsko bojenje za CD8 (Biolegend br. 300908) i CD69 (BioLegend br. 310904) izvedeno je prema navodima dobavljača. Ćelije su dva puta isprane sa 150 µl/bunarčiću PBS koji sadrži 0,1% BSA, i fiksirane 20 min na 4°C koristeći 100 µl/bunarčiću 1% PFA. Nakon centrifugiranja, uzorci su ponovo suspendovani u 200 µl/bunarčiću PBS sa 0,1% BSA, i analizirani na uređaju FACS CantoII (softver FACS Diva).
Kao što je prikazano na slici 30, Her3 TCB indukuje unakrsno povezivanje T ćelija i tumorskih ćelija (KPL-4) preko svojih ciljnih ostataka, i indukuje aktivaciju T ćelija na način koji je zavisan od koncentracije.
Jurkat-NFAT test aktivacije
Kapacitet Her2 TCB i Her3 TCB za indukovanje unakrsnog povezivanja T-ćelija i kasnije T-ćelijsku aktivaciju, procenjen je korišćenjem kokultura ciljnih ćelija pozitivnih na tumorski antigen (KPL-4) i Jurkat-NFAT reporter ćelija (ćelijska linija reportera humane akutne limfatične leukemije koja eksprimira CD3 sa NFAT promoterom, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega br. CS176501). Nakon istovremenog vezivanja TCB molekula za humani Her2, odnosno humani Her3, antigen (eksprimiran na tumorskim ćelijama) i CD3 antigen (eksprimiran na Jurkat-NFAT reporter ćelijama), NFAT promoter se aktivira, i dovodi do ekspresije aktivne luciferaze svica. Intenzitet signala luminescencije (dobijen nakon dodavanja supstrata luciferaze) proporcionalan je intenzitetu aktivacije i signalizacije CD3.
Za test, KPL-4 humane tumorske ćelije su sakupljene sa puferom za disocijaciju ćelija (Gibco Invitrogen), i vijabilnost je određena pomoću ViCell-a. 20.000 ćelija/bunarčiću je stavljeno na ploču sa ravnim dnom sa 96 bunarčića (Greiner bio-one), i dodat je razblaženi TCB ili medijum (za kontrole). Nakon toga, sakupljene su Jurkat-NFAT reporter ćelije i procenjena vijabilnost pomoću ViCell-a. Ćelije su ponovo suspendovane u medijumu za uzgajanje ćelija, i dodate tumorskim ćelijama da bi se dobio konačni E:T od 2,5:1 (za Her2 TCB) ili 5:1 (za Her3 TCB) kao što je naznačeno, i konačna zapremina od 100 µl po bunarčiću. Ćelije su inkubirane 5 h na 37°C u vlažnom inkubatoru. Na kraju vremena inkubacije, 100 µl/bunarčiću ONE-Glo rastvora (Promega, br. E6120) (1:1 ONE-Glo i zapremina medijuma za analizu po bunarčiću) je dodato u bunarčiće, i inkubirani su 10 min na sobnoj temperaturi u mraku. Luminescencija je detektovana pomoću WALLAC Victor3 ELISA čitača (PerkinElmer2030), detekciono vreme 5 sekundi/bunarčiću.
Kao što je prikazano na slici 31, oba TCB molekula indukuju unakrsno povezivanje T ćelija preko CD3, i kasnije T ćelijsku aktivaciju. Her3 TCB je malo potentniji na KPL-4 ćelijama, što se može objasniti višim nivoom Her3 u odnosu na Her2 na ovim ciljnim ćelijama.
Liza tumorskih ćelija indukovana od strane Her2 TCB i Her3 TCB
Liza tumorskih ćelija Her2- ili Her3-eksprimirajućih ciljnih ćelija tumora indukovana odgovarajućim TCB molekulima je procenjena koristeći mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) kao efektore, pri E:T od 10:1. Liza tumorskih ćelija određena je merenjem oslobođenog LDH u supernatantu nakon 24 h i 48 h posle inkubacije sa TCB, kao što je naznačeno.
Humani PBMC su izolovani iz sveže krvi, ili iz leukocitno-trombocitnog sloja. Ukratko, krv je razblažena 2:1 (sveža krv) ili 3:1 (leukocitno-trombocitni sloj) pomoću PBS. Oko 30 ml smeše krvi / PBS je raslojeno na 15 ml Histopaque (Sigma), i centrifugirano 30 minuta na 450 x g bez kočnice, na sobnoj temperaturi. Limfociti su sakupljeni pomoću pipete od 10 ml u epruvete od 50 ml koje sadrže PBS. Epruvete su napunjene do 50 ml PBS-om i centrifugirane 10 min na 350 g. Supernatant je odbačen, pelet je ponovo suspendovan u 50 ml PBS i centrifugiran 10 minuta na 300 x g. Korak ispiranja je jednom ponovljen. Ćelije su ponovo suspendovane u RPMI koji sadrži 10% FCS i 1% GlutaMax (Life Technologies) i čuvane na 37°C, 5% CO2u inkubatoru do početka testa (ne duže od 24h). Ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsin / EDTA, isprane i nanete pri gustini od 30.000 ćelija/bunarčiću na ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom. Ćelije su ostavljene da se učvrste preko noći u ovlaženom inkubatoru. Na dan testa, pločice za testiranje su centrifugirane na 350 x g tokom 5 min, i medijum je usisan. Dodato je 100 µl ispitivanog medijuma po bunarčiću.
TCB su dodati u naznačenim koncentracijama (raspon od 0,001 pM - 1 nM za Her3 TCB, i 0,01 pM - 100 nM za Her2 TCB, u triplikatu). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjivano nakon 24 h i 48 h inkubacije, kvantifikacijom LDH (laktat dehidrogenaze) oslobođene u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih / nekrotičnih ćelija (LDH komplet za detekciju, Roche Applied Science, br. 11 644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100. Minimalna liza (= 0%) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog antitela. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5.
U drugom eksperimentu, liza tumorskih ćelija je određena aktivnošću kaspaze 3/7 nakon 6,5 h, merenjem luminescencije u čitaču mikroploča (5 s vreme očitavanja po bunarčiću).
Za određivanje aktivnosti kaspaze 3/7, KPL-4-kaspaza-3/7 GloSensor ciljne ćelije (KPL-4 ćelije koje su stabilno transficirane plazmidom GloSensor) su sakupljene kako je gore opisano. Nakon jednog ispiranja sa PBS, koncentracija je podešena na 0,3 x 10<6>ćelija/ml u test medijumu (RPMI1640, 2% FCS, 1% Glutamax) i pomešana sa 2% V/V reagensa GloSensor cAMP (Promega).100 µl (= 30.000 ćelija) ove suspenzije ciljnih ćelija je prebačeno u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom sa belim zidovima.
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su pripremljene gradijentnim Histopaque centrifugiranjem obogaćenih limfocitnih preparata (leukocitno-trombocitnog sloja) dobijenih od zdravih humanih donora, kako je gore opisano. Test lize tumorskih ćelija je izveden uglavnom kao što je gore opisano.
Rezultati prikazani na Slici 32C i na Slici 33 ilustruju da molekul Her3 TCB indukuje snažnu apoptozu i lizu KPL-4 tumorskih ćelija koja zavisi od koncentracije.
Isto važi i za Her2 TCB koji je prikazan na Slici 32A i B, i pokazuje značajnu lizu tumorskih ćelija zavisnu od koncentracije tokom vremena. Prema tome, izgleda da EC50 ubijanja zavisi od nivoa ekspresije Her2 na odgovarajućoj ciljnoj ćeliji. Što je nivo ekspresije viši, bolje je ubijanje tumorske ćelije od strane Her2 TCB.
Primer 4
Priprema "(Fab)2-CrossFab" bispecifičnih antitela T-ćelija sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-MCSP / anti-CD3)
Šematski prikaz molekula pripremljenih u ovom primeru prikazan je na Slici 34. Molekul anti-MCSP / anti-CD3 “(Fab)2-CrossFab” sa modifikacijama naelektrisanja na MCSP vezivačima (u daljem tekstu “(Fab) 2-XFab-LC007cv” u ovom primeru) sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 58, 59 i 60. Molekul anti-MCSP / anti-CD3 “(Fab)2-CrossFab” bez modifikacija naelektrisanja (koji se naziva “(Fab) 2-XFab” u ovom primeru) sadrži odgovarajuće aminokiselinske sekvence bez modifikacija naelektrisanja.
Molekuli su pripremljeni, prečišćeni i analizirani u suštini kao što je opisano u Primeru 1 gore, sa sledećim adaptacijama.
Za proizvodnju ovih molekula, HEK293-EBNA ćelije su transficirane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1 ("vektorski teški lanac": “vektorski laki lanac anti-MSCP Fab”: “vektorski laki lanac anti-CD3 Fab”).
Koncentracija konstrukata u medijumu za uzgajanje određena je pomoću ProteinA-HPLC, na osnovu vezivanja delova CH1 domena za ProteinA na pH 8,0 i postupnog eluiranja od pH 2,5 kao što je opisano u Primeru 1.
Izlučeni proteini su prečišćeni iz supernatanta ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, koristeći afinitetnu hromatografiju vezivanjem za CH1, nakon čega sledi korak gel hromatografije. Za afinitetnu hromatografiju, supernatant je nanet na kolonu HiTrap KappaSelect (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 5 ml 50 mM Tris, 100 mM glicina, 150 mM NaCl pH 8,0. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone 50 mM Tris, 100 mM glicina, 150 mM NaCl pH 8,0. Ciljni protein je eluiran u 10 zapremina kolone gradijentom do 50 mM Tris, 100 mM glicina, 150 mM NaCl pH 2,0. Proteinski rastvor je neutralisan dodavanjem 1/40 2 M Tris pH 8,0. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) koja je ekvilibrisana sa 20 mM histidinom, 140 mM natrijum hloridom, 0,01% Tween-20, pH 6,0.
Oba molekula su proizvedena i prečišćena istom metodom. U poređenju sa molekulom bez modifikacija naelektrisanja (“(Fab)2-XFab”), titar molekula sa naelektrisanjem je bio 10 puta manji. Ipak, konačni povraćaj je bio približno dva puta veći za molekul sa modifikacijama naelektrisanja u dva anti-MCSP Fab (“(Fab) 2-XFab-LC007cv”) (Tabela 18). Molekul (Fab)2-XFab-LC007cv mogao bi se prečistiti do konačnog sadržaja monomera od 95,8%, kao što prikazuje gel hromatografija, i konačne čistoće od 94,33% dokazane CE-SDS analizom.
TABELA 18. Sažetak proizvodnje i prečišćavanja anti-MCSP / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja.
TABELA 19. CE-SDS analize (neredukovane) anti-MCSP / anti-CD3 TCB molekula sa modifikacijama naelektrisanja.
Vezivanje ćelija „(Fab)2-CrossFab“ T-ćelijskih bispecifičnih antitela sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-MCSP / anti-CD3)
Jurkat-NFAT suspendovane ćelije su sakupljene, jednom isprane FACS puferom (PBS 0,1% BSA), i vijabilnost im je određena pomoću ViCell-a.
Prianjajuće MV-3 tumorske ćelije su sakupljene puferom za disocijaciju ćelija (Gibco Invitrogen) i jednom isprane FACS puferom, pre nego što im je vijabilnost određena pomoću ViCell-a.
0,2 miliona ćelija je naneto po bunarčiću ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom, i ploče su centrifugirane 4 min na 400 x g. Zatim je u ćelije dodato 25 µl po bunarčiću primarnih razblaženja antitela u FACS puferu. Ćelije su inkubirane 30 minuta u frižideru. Nakon toga, ćelije su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću.
25 µl razblaženog sekundarnog antitela (FITC konjugovani AffiniPure F(ab')2fragment, kozji anti-humani IgG, F(ab')2fragment specifičan, Jackson Immuno Research) je dodato po bunarčiću, i ploče su obojene tokom dodatnih 30 min na 4°C u mraku.
Ploče su dva puta isprane sa 150 µl FACS pufera po bunarčiću, i ponovo suspendovane u 150 µl FACS pufera. Analiza je izvršena pomoću BD FACS CantoII, opremljenog softverom FACS Diva. Medijane fluorescencije (MFI) su predstavljene u odnosu na koncentraciju MCSP TCB molekula.
Kao što je prikazano na Slici 36, molekul (Fab)2-XFAb-LC007cv pokazuje vezivanje za humani MCSP na MV-3 i za humani CD3 na Jurkatovim ćelijama, zavisno od koncentracije. Molekul (Fab)2-XFab bez modifikacija naelektrisanja pokazuje uporedivo vezivanje za humani MCSP kao (Fab)2-XFAb-LC007cv (EC50 vezivanja od 2,3 nM za (Fab)2-XFAb-LC007cv u odnosu na EC 50 od 1,5 nM za ( Fab)2-XFab).
Liza tumorskih ćelija posredovana "(Fab)2-CrossFab" T-ćelijskim bispecifičnim antitelima sa modifikacijom i bez modifikacije naelektrisanja (anti-MCSP / anti-CD3) Liza tumorskih ćelija MSP-eksprimirajućih MV-3 ciljnih ćelija tumora indukovana od strane MCSP TCB molekula je koristila humane PBMC kao efektore, pri E:T od 10:1. Liza ćelija tumora je određena merenjem oslobođenog LDH u supernatantima nakon 24 h i 48 h posle inkubacije sa TCB.
Ukratko, ciljne ćelije su sakupljene pomoću tripsina / EDTA, isprane i nanete u gustini od 25.000 ćelija/bunarčiću koristeći ploče sa 96 bunarčića ravnog dna. Ćelije su ostavljene da se učvrste preko noći u ovlaženom inkubatoru. Na dan testa, pločice za testiranje su centrifugirane na 350 x g tokom 5 min, i medijum je usisan. Dodato je 100 µl ispitivanog medijuma po bunarčiću.
Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) izolovane su iz sveže krvi. Ukratko, krv je razblažena u odnosu 2:1 dodatkom PBS. Oko 30 ml smeše krvi / PBS je raslojeno na 15 ml Histopaque (Sigma), i centrifugirano 30 minuta na 450 x g bez kočnice. Limfociti su sakupljeni pomoću pipete od 10 ml u epruvete od 50 ml koje sadrže PBS. Epruvete su napunjene do 50 ml dodatkom PBS i centrifugirane 10 min na 350 x g. Supernatant je odbačen, pelet je ponovo suspendovan u 50 ml PBS i centrifugiran 10 minuta na 300 x g. Korak ispiranja je jednom ponovljen. Ćelije su ponovo suspendovane u RPMI koji sadrži 10% FCS i 1% GlutaMax (Life Technologies) i čuvane na 37°C, 5% CO2u inkubatoru do početka testa (ne duže od 24h).
Za test ubijanja, molekuli TCB su dodati u naznačenim koncentracijama (raspon od 0,04 pM - 10 nM u triplikatu). PBMC su dodavani u ciljne ćelije u konačnom odnosu E:T od 10:1. Ubijanje ciljnih ćelija je procenjivano nakon 24 h i 48 h inkubacije, kvantifikacijom LDH (laktat dehidrogenaze) oslobođene u ćelijske supernatante od strane apoptotičnih / nekrotičnih ćelija (LDH komplet za detekciju, Roche Applied Science, br. 11644 793 001). Maksimalna liza ciljnih ćelija (= 100%) postignuta je inkubacijom ciljnih ćelija sa 1% Triton X-100. Minimalna liza (= 0%) se odnosi na ciljne ćelije koinkubirane sa efektorskim ćelijama bez bispecifičnog antitela. Vrednosti EC50 su izračunate pomoću softvera GraphPadPrism5. Kao što je prikazano na Slici 37, oba molekula pokazuju lizu ciljnih ćelija koje eksprimiraju hMCSP zavisnu od koncentracije. Potencija molekula (Fab)2-XFAb-LC007cv (EC502,8 pM nakon 24 h, i 8,6 pM nakon 48 h) je uporediva sa potencijom molekula (Fab)2-XFab bez modifikacija naelektrisanja (EC505,9 pM nakon 24 h, i 4,8 pM nakon 48 h).

Claims (29)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije koji sadrži
a) prvi molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen;
b) drugi molekul Fab koji se specifično vezuje za drugi antigen, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH lakog lanca Fab i teškog lanca Fab zamenjeni jedan drugim; c) treći molekul Fab koji se specifično vezuje za prvi antigen; i
d) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju; pri čemu, prvi antigen je antigen ciljne ćelije, a drugi antigen je aktivirajući T-ćelijski antigen, konkretno CD3, konkretnije CD3 epsilon;
pri čemu, treći molekul Fab pod c) je identičan prvom molekulu Fab pod a);
pri čemu je u konstantnom domenu CL prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 124 supstituisana lizinom (K) (numeracija prema Kabatu) i aminokiselina u položaju 123 je supstituisana argininom (R) ili lizinom (K) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu u konstantnom domenu CH1 prvog molekula Fab pod a) i trećeg molekula Fab pod c) aminokiselina u položaju 147 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) i aminokiselina u položaju 213 je supstituisana glutaminskom kiselinom (E) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i pri čemu je Fc domen, Fc domen IgG, i pri čemu je u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, time stvarajući šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira; i
pri čemu
(i) prvi molekul Fab pod a) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab drugog molekula Fab pod b), a drugi molekul Fab pod b) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d), ili
(ii) drugi molekul Fab pod b) je spojen na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem teškog lanca Fab prvog molekula Fab pod a), a prvi molekul Fab pod a) i treći molekul Fab pod c) su svaki spojeni na C-kraju teškog lanca Fab sa N-krajem jedne od podjedinica Fc domena pod d).
2. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema zahtevu 1, pri čemu, molekul Fab koji se specifično vezuje za CD3 sadrži region koji određuje komplementarnost teškog lanca (CDR) 1 iz SEQ ID NO: 4, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 5, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 6, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 8, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 9, i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 10.
3. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu, molekul Fab koji se specifično vezuje za CD3 sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 3, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 7.
4. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je antigen ciljne ćelije CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije sadrži region za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR) 1 SEQ ID NO: 46, CDR 2 teškog lanca SEQ ID NO: 47, CDR 3 teškog lanca SEQ ID NO: 48, CDR 1 lakog lanca SEQ ID NO: 49, CDR 2 lakog lanca SEQ ID NO: 50 i CDR 3 lakog lanca SEQ ID NO: 51.
5. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu je antigen ciljne ćelije CD20, i molekul Fab koji se specifično vezuje za antigen ciljne ćelije sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 30, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 31.
6. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije iz bilo kog od zahteva 1-5, pri čemu prvi molekul Fab pod a) i treći molekul Fab pod c) sadrže varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 30, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31.
7. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu drugi molekul Fab pod b) sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7.
8. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu je Fc domen, Fc domen IgG1ili IgG4.
9. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu je Fc domen, humani Fc domen.
10. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu je navedeni aminokiselinski ostatak koji ima veći volumen bočnog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y) i triptofana (W), i pomenuti aminokiselinski ostatak koji ima manji volumen bočnog lanca je izabran iz grupe koju čine alanin (A), serin (S), treonin (T) i valin (V).
11. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-10, pri čemu je u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen triptofanskim ostatkom (T366W), a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, tirozinski ostatak u položaju 407 zamenjen je valinskim ostatkom (Y407V), a opciono u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je treoninski ostatak u položaju 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak u položaju 368 je zamenjen alaninskim ostatkom (L368A) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
12. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-11, pri čemu je u prvoj podjedinici Fc domena dodatno serinski ostatak u položaju 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), ili je ostatak glutaminske kiseline u položaju 356 zamenjen cisteinskim ostatkom (E356C), i u drugoj podjedinici Fc domena dodatno je tirozinski ostatak u položaju 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
13. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-12, pri čemu prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W, a druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S, L368A i Y407V (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
14. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-13, pri čemu Fc domen pokazuje smanjen afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1.
15. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-14, pri čemu Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju.
16. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-15, pri čemu je pomenuta jedna ili više aminokiselinskih supstitucija u jednom ili više položaja izabrana iz grupe L234, L235 i P329 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
17. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1-16, pri čemu svaka podjedinica Fc domena sadrži tri aminokiselinske supstitucije koje smanjuju vezivanje za aktivirajući Fc receptor i/ili efektorsku funkciju, pri čemu su pomenute supstitucije amino kiselina L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
18. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od zahteva 1-17, pri čemu je Fc receptor Fcγ receptor.
19. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od zahteva 1-18, pri čemu je efektorska funkcija ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC).
20. Jedan ili više izolovanih polinukleotida koji kodiraju bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1 do 19.
21. Jedan ili više vektora, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid(e) prema zahtevu 20.
22. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid(e) prema zahtevu 20 ili vektor(e) iz zahteva 21.
23. Postupak za proizvodnju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije prema zahtevu 1, i koji je sposoban za specifično vezivanje za CD3 i antigen ciljnih ćelija, koji sadrži korake a) uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 22 pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije i b) povraćaj bispecifičnog antigen vezujućeg molekula koji aktivira T-ćelije.
24. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1 do 19, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
25. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1 do 19, ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 24, da se primenjuje kao lek.
26. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva od 1 do 19, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 24, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno.
27. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema bilo kom od zahteva 1 do 19 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 24, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno, dalje obuhvata davanje pojedincu terapeutski efektivne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog sredstva.
28. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T ćelije prema zahtevima 1 do 19 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 24, za upotrebu prema zahtevu 25-27, gde je bolest kancer.
29. Bispecifični antigen vezujući molekul koji aktivira T-ćelije prema bilo kom od zahteva 1 do 19 za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno.
RS20190799A 2014-08-04 2015-08-03 Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije RS58913B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14179764 2014-08-04
EP15170866 2015-06-05
PCT/EP2015/067776 WO2016020309A1 (en) 2014-08-04 2015-08-03 Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP15742329.4A EP3177643B1 (en) 2014-08-04 2015-08-03 Bispecific t cell activating antigen binding molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58913B1 true RS58913B1 (sr) 2019-08-30

Family

ID=53758236

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190799A RS58913B1 (sr) 2014-08-04 2015-08-03 Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije
RS20240611A RS65573B1 (sr) 2014-08-04 2015-08-03 Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240611A RS65573B1 (sr) 2014-08-04 2015-08-03 Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije

Country Status (36)

Country Link
US (8) US9914776B2 (sr)
EP (2) EP3177643B1 (sr)
JP (1) JP6464255B2 (sr)
KR (4) KR102317315B1 (sr)
CN (1) CN106661120B (sr)
AU (2) AU2015299163B2 (sr)
CA (1) CA2951599C (sr)
CL (1) CL2017000278A1 (sr)
CR (1) CR20170032A (sr)
CY (1) CY2024021I1 (sr)
DK (2) DK3608337T3 (sr)
EA (1) EA038958B1 (sr)
ES (2) ES2979976T3 (sr)
FI (3) FI3608337T3 (sr)
FR (1) FR23C1043I2 (sr)
HR (2) HRP20191174T1 (sr)
HU (3) HUE067340T2 (sr)
IL (2) IL249120B (sr)
LT (3) LT3608337T (sr)
MA (2) MA50584B1 (sr)
MX (1) MX380514B (sr)
MY (2) MY179611A (sr)
NL (1) NL301246I2 (sr)
NO (1) NO2023039I1 (sr)
PE (2) PE20170263A1 (sr)
PH (1) PH12016502505B1 (sr)
PL (2) PL3177643T3 (sr)
PT (1) PT3177643T (sr)
RS (2) RS58913B1 (sr)
SG (2) SG11201700879WA (sr)
SI (2) SI3177643T1 (sr)
SM (1) SMT202400235T1 (sr)
TW (1) TWI589591B (sr)
UA (1) UA124254C2 (sr)
WO (1) WO2016020309A1 (sr)
ZA (1) ZA201608205B (sr)

Families Citing this family (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
JP5768147B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一価抗原結合タンパク質
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
BR112014004168A2 (pt) 2011-08-23 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, método de produção de anticorpo e invenção
EP2904016B1 (en) 2012-10-08 2018-11-14 Roche Glycart AG Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
MX375359B (es) 2013-02-26 2025-03-06 Roche Glycart Ag Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t.
CN105143270B (zh) 2013-02-26 2019-11-12 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
UA129760C2 (uk) 2013-12-17 2025-07-30 Дженентек, Інк. Анти-cd3 антитіло та спосіб його застосування
JP6464255B2 (ja) 2014-08-04 2019-02-06 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
KR20170066421A (ko) 2014-09-12 2017-06-14 제넨테크, 인크. 항-cll-1 항체 및 면역접합체
EP3204415B1 (en) * 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
SI3221357T1 (sl) 2014-11-20 2020-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Pogoste lahke verige in načini uporabe
DK3221355T3 (da) 2014-11-20 2020-12-07 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler CD3 og folatreceptor 1 (FolR1) samt PD-1-aksebindende antagonister
RS61010B1 (sr) 2014-11-20 2020-11-30 Hoffmann La Roche Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije protiv folr1 i cd3
EP3029068A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
MA40938A (fr) 2014-12-05 2017-10-11 Hoffmann La Roche Anticorps anti-cd79b et méthodes d'utilisation desdits anticorps
EP3310378B1 (en) 2015-06-16 2024-01-24 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-cll-1 antibodies and methods of use
TWI731861B (zh) 2015-06-16 2021-07-01 美商建南德克公司 FcRH5之人源化及親和力成熟抗體及使用方法
MX391086B (es) 2015-06-24 2025-03-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-receptor de transferrina con afinidad diseñada.
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
NZ741067A (en) 2015-10-02 2023-07-28 Hoffmann La Roche Bispecific anti-human cd20/human transferrin receptor antibodies and methods of use
EP3356410B1 (en) * 2015-10-02 2021-10-20 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
EP4026848A1 (en) 2015-12-09 2022-07-13 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing the cytokine release syndrome
JP6949030B2 (ja) 2016-01-08 2021-10-13 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及び抗ｃｅａ／抗ｃｄ３二重特異性抗体を用いたｃｅａ陽性がんの治療方法
EP3411404B1 (en) 2016-02-03 2022-11-09 Amgen Research (Munich) GmbH Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
RU2767329C2 (ru) 2016-02-06 2022-03-17 Эпимаб Биотерапьютикс, Инк. Иммуноглобулин с тандемными fab-фрагментами и варианты его применения
WO2017165464A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
HRP20230528T1 (hr) 2016-03-22 2023-08-04 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecifične molekule t stanica aktivirane proteazom
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
TW201902512A (zh) * 2016-06-02 2019-01-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療方法
EP3252078A1 (en) 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
CN109476749A (zh) 2016-06-30 2019-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 改良的过继性t细胞疗法
EP4282877A3 (en) 2016-08-10 2024-02-21 Legend Biotech Ireland Limited Chimeric antigen receptors targeting bcma and methods of use thereof
CA3032430A1 (en) 2016-08-16 2018-02-22 Epimab Biotherapeutics, Inc. Monovalent asymmetric tandem fab bispecific antibodies
ES2897217T3 (es) 2016-09-30 2022-02-28 Hoffmann La Roche Anticuerpos biespecíficos frente a p95HER2
EP4295918A3 (en) * 2016-11-02 2024-03-20 Bristol-Myers Squibb Company Bispecific antibody against bcma and cd3 and an immunological drug for combined use in treating multiple myeloma
WO2018093821A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
AU2017384126B2 (en) 2016-12-20 2025-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies and 4-1BB (CD137) agonists
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
TW201900672A (zh) 2017-03-27 2019-01-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 改良之抗原結合受體型式
SG11201909218RA (en) 2017-04-03 2019-11-28 Hoffmann La Roche Antibodies binding to steap-1
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
AU2018250641B2 (en) 2017-04-11 2025-03-13 Inhibrx Biosciences, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained CD3 binding and methods of using the same
WO2018217976A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Antagonistic cd40 monoclonal antibodies and uses thereof
JP2020522254A (ja) 2017-05-31 2020-07-30 エルスター セラピューティクス， インコーポレイテッド 骨髄増殖性白血病（ｍｐｌ）タンパク質に結合する多特異性分子およびその使用
AU2018308088B2 (en) 2017-07-25 2025-05-29 Truebinding, Inc. Treating cancer by blocking the interaction of TIM-3 and its ligand
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
KR20200067197A (ko) 2017-10-20 2020-06-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 단일특이적 항체로부터 다중특이적 항체의 생성 방법
BR112020007736A2 (pt) 2017-10-30 2020-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag composição e método de tratamento
SG11202005632SA (en) 2017-12-21 2020-07-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to hla-a2/wt1
IL275462B2 (en) 2017-12-22 2026-01-01 Genentech Inc Targeted integration of nucleic acids
EP3737692A4 (en) 2018-01-09 2021-09-29 Elstar Therapeutics, Inc. CALRETICULIN AND MODIFIED T-LYMPHOCYTES BINDING CONSTRUCTIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
CN111630063A (zh) 2018-01-31 2020-09-04 豪夫迈·罗氏有限公司 稳定化的免疫球蛋白结构域
US20200354457A1 (en) 2018-01-31 2020-11-12 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
JP7475275B2 (ja) * 2018-02-08 2024-04-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 二重特異性抗原結合分子及びその使用方法
TWI829667B (zh) 2018-02-09 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合gprc5d之抗體
WO2019166453A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Specificity assay for novel target antigen binding moieties
IL277174B2 (en) * 2018-03-13 2025-12-01 Hoffmann La Roche Therapeutic combination of 4-1 bb agonists with anti-cd20 antibodies
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
HRP20260157T1 (hr) 2018-03-29 2026-03-27 F. Hoffmann - La Roche Ag Moduliranje laktogene aktivnosti u stanicama sisavaca
BR112020020604A2 (pt) 2018-04-11 2021-01-12 Inhibrx, Inc. Construções de polipeptídeo multiespecífico tendo ligação restrita de cd3 e métodos e usos relacionados
AR114789A1 (es) 2018-04-18 2020-10-14 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hla-g y uso de los mismos
AR115052A1 (es) 2018-04-18 2020-11-25 Hoffmann La Roche Anticuerpos multiespecíficos y utilización de los mismos
MX2020011588A (es) 2018-05-03 2020-12-07 Shanghai Epimab Biotherapeutics Co Ltd Anticuerpos de alta afinidad a pd-1 y lag-3 y proteinas de union bispecificas preparadas a partir de las mismas.
WO2020006576A1 (en) * 2018-06-29 2020-01-02 City Of Hope Compositions and methods for treating autoimmune diseases
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
WO2020023553A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
WO2020062155A1 (en) * 2018-09-29 2020-04-02 Mab-Legend Biotech Co., Ltd. Dual targeting antigen binding molecule
EP3864045A2 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020076992A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
TWI897855B (zh) * 2018-10-26 2025-09-21 美商免疫遺傳股份有限公司 Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
EP3870604B1 (en) 2018-10-26 2022-11-23 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibody screening method using recombinase mediated cassette exchange
CN109836502B (zh) * 2018-11-12 2021-09-07 浙江大学 一种双特异性抗体及其应用
AR117091A1 (es) 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
JP2022513708A (ja) 2018-12-05 2022-02-09 モルフォシス・アーゲー 多重特異性抗原結合分子
AU2019403279A1 (en) 2018-12-21 2021-07-01 Genentech, Inc. Targeted integration of nucleic acids
JP7090780B2 (ja) * 2018-12-21 2022-06-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に結合する抗体
TWI861039B (zh) 2018-12-21 2024-11-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 靶向腫瘤之促效cd28抗原結合分子
SG10202105788SA (en) 2018-12-21 2021-06-29 Hoffmann La Roche Antibodies binding to cd3
AU2020214796A1 (en) 2019-01-30 2021-07-29 Truebinding, Inc. Anti-Gal3 antibodies and uses thereof
AU2020226904B2 (en) 2019-02-21 2025-05-01 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
JP7710373B2 (ja) 2019-02-21 2025-07-18 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔ細胞関連のがん細胞に結合する多機能性分子およびその使用
EP3927745A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
WO2020172601A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
AU2020224681A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
CN113661173B (zh) 2019-03-29 2024-10-01 豪夫迈·罗氏有限公司 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生表达FcRn的细胞的方法
TW202106714A (zh) * 2019-04-25 2021-02-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 藉由多肽鏈交換製造抗體衍生之多肽
AR122263A1 (es) * 2019-05-09 2022-08-31 Genentech Inc Métodos para producir anticuerpos
WO2020254352A1 (en) 2019-06-19 2020-12-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the generation of a trivalent antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
JP7572977B2 (ja) 2019-06-19 2024-10-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって多価の多重特異性抗体発現細胞を作製するための方法
SG11202112491WA (en) 2019-07-31 2021-12-30 Hoffmann La Roche Antibodies binding to gprc5d
JP2022543551A (ja) 2019-07-31 2022-10-13 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｇｐｒｃ５ｄに結合する抗体
PE20221906A1 (es) 2019-09-18 2022-12-23 Genentech Inc Anticuerpos anti-klk7, anticuerpos anti-klk5, anticuerpos multiespecificos anti-klk5/klk7 y metodos de uso
CN114651007A (zh) * 2019-11-07 2022-06-21 安进公司 阳离子交换色谱期间的高盐洗涤以去除产品相关的杂质
WO2021119505A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Genentech, Inc. Anti-ly6g6d antibodies and methods of use
CR20220256A (es) 2019-12-18 2022-08-31 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a hla-a2/mage-a4
EP4081294A2 (en) 2019-12-23 2022-11-02 Genentech, Inc. Apolipoprotein l1-specific antibodies and methods of use
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
CN116234829A (zh) 2020-01-03 2023-06-06 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
CN115052897B (zh) * 2020-01-28 2024-06-21 湖南远泰生物技术有限公司 PLAP-CD3ε双特异性抗体
CN115380047A (zh) 2020-01-29 2022-11-22 印希比股份有限公司 Cd28单结构域抗体及其多价和多特异性构建体
JP7735291B2 (ja) 2020-02-21 2025-09-08 エーアールエス ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド ネクチン－４抗体コンジュゲートおよびその使用
EP4114860A1 (en) 2020-03-06 2023-01-11 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
KR20220159426A (ko) 2020-03-26 2022-12-02 제넨테크, 인크. 감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포
CR20220531A (es) 2020-04-24 2022-11-28 Hoffmann La Roche Modulacion de enzimas y vías con compuestos de sulfhidrilo y sus derivados
GB2612450A (en) 2020-04-24 2023-05-03 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
WO2021242776A2 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Truebinding, Inc. Methods of treating inflammatory diseases by blocking galectin-3
MX2022015206A (es) 2020-06-08 2023-01-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-hbv y metodos de uso.
BR112022025856A2 (pt) 2020-06-19 2023-01-10 Hoffmann La Roche Anticorpo que se liga a cd3 e cd19, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo que se liga a cd3 e cd19, composição farmacêutica, uso do anticorpo, método para tratar uma doença em um indivíduo e invenção
JP2023530961A (ja) * 2020-06-19 2023-07-20 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ３に結合する抗体
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
KR20230025673A (ko) * 2020-06-19 2023-02-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 CD3 및 FolR1에 결합하는 항체
US20220041672A1 (en) 2020-06-24 2022-02-10 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
WO2021262798A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Targeted integration of nucleic acids
CN115916830A (zh) * 2020-06-25 2023-04-04 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd3/抗cd28双特异性抗原结合分子
JP2023532304A (ja) 2020-07-01 2023-07-27 エーアールエス ファーマシューティカルズ オペレーションズ，インク． 抗ａｓｇｒ１抗体コンジュゲートおよびその使用
WO2022007807A1 (zh) * 2020-07-07 2022-01-13 百奥泰生物制药股份有限公司 双特异性抗体及其应用
EP4182348A1 (en) 2020-07-17 2023-05-24 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and methods of use
JP2023536366A (ja) 2020-08-07 2023-08-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー タンパク質組成物を製造するための方法
AU2021331076A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
KR20230074487A (ko) 2020-08-26 2023-05-30 마렝고 테라퓨틱스, 인크. Trbc1 또는 trbc2를 검출하는 방법
CA3190755A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Andreas Loew Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
TW202227625A (zh) 2020-08-28 2022-07-16 美商建南德克公司 宿主細胞蛋白質之ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重剔除
CN116322691A (zh) 2020-09-24 2023-06-23 豪夫迈·罗氏有限公司 T细胞双特异性抗体相关不良反应的预防或减轻
CA3196539A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Chi-Chung Li Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
AU2021374594B2 (en) 2020-11-04 2026-03-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
KR20230100732A (ko) 2020-11-04 2023-07-05 제넨테크, 인크. 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체의 피하 투여
JP2023548556A (ja) 2020-11-05 2023-11-17 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Ｅｇｆｒ抗原を標的とする操作されたｔ細胞受容体および使用方法
WO2022101120A1 (en) 2020-11-10 2022-05-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Prevention or mitigation of t-cell engaging agent-related adverse effects
EP4247850A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Simcere Innovation, Inc. Armed dual car-t compositions and methods for cancer immunotherapy
JP7326584B2 (ja) 2020-12-17 2023-08-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｈｌａ－ｇ抗体及びその使用
CN114656562B (zh) * 2020-12-23 2023-11-03 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人和猴cd3的抗体及其应用
WO2022148732A1 (en) 2021-01-06 2022-07-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy employing a pd1-lag3 bispecific antibody and a cd20 t cell bispecific antibody
EP4288458A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Genentech, Inc. Multispecific binding protein degrader platform and methods of use
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
JP2024512377A (ja) 2021-03-12 2024-03-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｋｌｋ７抗体、抗ｋｌｋ５抗体、多重特異性抗ｋｌｋ５／ｋｌｋ７抗体、及び使用方法
CA3214757A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Andreas Loew Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
CA3215965A1 (en) 2021-04-19 2022-10-27 Amy Shen Modified mammalian cells
MX2023012699A (es) 2021-04-30 2023-11-21 Hoffmann La Roche Dosificacion para el tratamiento con anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3.
CA3213632A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Dosing for combination treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and anti-cd79b antibody drug conjugate
US12291575B2 (en) 2021-05-14 2025-05-06 Genentech, Inc. Methods for treatment of CD20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
WO2022246259A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
EP4355778A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Boehringer Ingelheim International GmbH Novel tri-specific binding molecules
EP4363449A2 (en) 2021-07-02 2024-05-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
EP4371125A1 (en) 2021-07-13 2024-05-22 Genentech, Inc. Multi-variate model for predicting cytokine release syndrome
JP2024528631A (ja) 2021-07-22 2024-07-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ヘテロ二量体Ｆｃドメイン抗体
AU2022317820A1 (en) 2021-07-28 2023-12-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for treating cancer
EP4380980A1 (en) 2021-08-03 2024-06-12 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies and methods of use
JP2024531915A (ja) 2021-08-05 2024-09-03 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｍｕｃ抗体およびその使用
AU2022339819A1 (en) 2021-09-03 2024-04-11 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
CA3230934A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cmet antibodies and their uses
AR127887A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3 y plap
US20250092135A1 (en) 2022-01-10 2025-03-20 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibody and use thereof
US20250084169A1 (en) 2022-01-12 2025-03-13 Biomolecular Holdings Llc Nk/monocyte engagers
US20230322958A1 (en) 2022-01-19 2023-10-12 Genentech, Inc. Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
WO2023180353A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
CN119013300A (zh) 2022-04-13 2024-11-22 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd20/抗cd3双特异性抗体的药物组合物和使用方法
TWI882313B (zh) 2022-04-13 2025-05-01 美商建南德克公司 治療性蛋白質之醫藥組成物及使用方法
CN117003872A (zh) * 2022-04-28 2023-11-07 北京天广实生物技术股份有限公司 含有突变轻链可变区骨架的单链抗体片段
US20230416412A1 (en) 2022-05-31 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Prevention or mitigation of t-cell engaging agent-related adverse effects
CA3261989A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. ANTI-STEAP1 ANTIGEN-BINDING MOLECULES AND THEIR USES
CN119998329A (zh) * 2022-08-05 2025-05-13 上海凯今生物科技有限公司 多特异性多肽复合物
TW202423969A (zh) 2022-10-10 2024-06-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及蛋白酶體抑制劑之組合療法
TW202430211A (zh) 2022-10-10 2024-08-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及ｉｍｉｄ之組合療法
WO2024079074A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 Universite D'aix Marseille ANTI-sCD146 ANTIBODIES AND USES THEREOF
TW202423970A (zh) 2022-10-10 2024-06-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 Ｇｐｒｃ５ｄ ｔｃｂ及ｃｄ３８抗體之組合療法
US20260092121A1 (en) 2022-10-14 2026-04-02 Talem Therapeutics Llc Anti-trkb/cd3 antibodies and uses thereof
WO2024094741A1 (en) 2022-11-03 2024-05-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
IL320559A (en) 2022-11-15 2025-07-01 Genentech Inc Combining transposon-mediated integration and targeted integration of nucleic acids into host cells
WO2024124107A2 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Pfizer Inc. Cd47 blocking agent and anti-cd20 / anti-cd3 bispecific antibody combination therapy
CN120693406A (zh) 2022-12-12 2025-09-23 基因泰克公司 优化多肽唾液酸含量
JP2026502534A (ja) 2023-01-12 2026-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 核酸の標的組込みのためのコンビナトリアルベクターのクローニングおよびトランスフェクション戦略
WO2024156672A1 (en) 2023-01-25 2024-08-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to csf1r and cd3
WO2024163009A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating urothelial bladder cancer
TW202436339A (zh) 2023-01-31 2024-09-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 治療選自非小細胞肺癌或三陰性乳癌的癌症之用途
JP2026510318A (ja) 2023-03-06 2026-04-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ／抗ＣＤ３抗体と腫瘍標的化４－１ＢＢアゴニストの併用療法
JP2026509243A (ja) 2023-03-10 2026-03-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド プロテアーゼとの融合およびその使用
EP4680638A1 (en) 2023-03-13 2026-01-21 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using an anti-hla-g/anti-cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
JP2026510584A (ja) 2023-03-13 2026-04-08 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ１－ｌａｇ３二重特異性抗体およびｈｌａ－ｇ ｔ細胞二重特異性抗体を用いる併用療法
TW202446789A (zh) 2023-03-31 2024-12-01 美商建南德克公司 抗αｖβ８整合素抗體及使用方法
AR132623A1 (es) 2023-05-08 2025-07-16 Hoffmann La Roche PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE INTERFERÓN a DIRIGIDAS Y MÉTODOS DE USO
EP4714975A1 (en) 2023-05-18 2026-03-25 Nanjing Leads Biolabs Co., Ltd. Antibody binding lilrb4 and cd3, and use thereof
EP4725501A1 (en) 2023-06-09 2026-04-15 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibody specifically binding to masp3, and multi-specific antibody specifically binding to masp3 and masp2
TW202502809A (zh) 2023-06-22 2025-01-16 美商建南德克公司 抗體及其用途
WO2024263195A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Genentech, Inc. Methods for treatment of liver cancer
WO2024263904A1 (en) 2023-06-23 2024-12-26 Genentech, Inc. Methods for treatment of liver cancer
CN121712799A (zh) 2023-07-26 2026-03-20 豪夫迈·罗氏有限公司 与cd3结合的抗体
AR133909A1 (es) 2023-09-25 2025-11-12 Hoffmann La Roche ANTICUERPO QUE SE UNE A C3bBb
US20250179533A1 (en) 2023-10-18 2025-06-05 Genentech, Inc. Retroviral-like particle-reduced chinese hamster ovary production cell lines
WO2025125386A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that bind to folr1 and methods of use
WO2025137086A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Genentech, Inc. Reducing alpha-gal
WO2025132503A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to ceacam5
WO2025133042A2 (en) 2023-12-22 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Activatable fusion proteins and methods of use
WO2025181189A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3
WO2025211874A1 (ko) * 2024-04-04 2025-10-09 주식회사 크로스포인트테라퓨틱스 인간 항체 fc 변이체 포함 이중항체 및 그 용도
WO2025215060A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies that specifically bind modified oligonucleotides
WO2025233264A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd73 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers
WO2025233266A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Innate Pharma Use of cd39 blocking agents in combination with anti-cd20 x cd3 t cell engagers
WO2026006162A2 (en) 2024-06-24 2026-01-02 Genentech, Inc. B vitamin modulation
WO2026011013A1 (en) 2024-07-02 2026-01-08 Epibiologics, Inc. Binding agents and uses thereof
WO2026037839A2 (en) 2024-08-12 2026-02-19 ONA Therapeutics S.L. Anti-fgfr4 molecules and uses thereof
WO2026041568A1 (en) 2024-08-20 2026-02-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and dotam
WO2026050572A2 (en) 2024-08-29 2026-03-05 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof

Family Cites Families (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR7801185A (pt) 1977-04-18 1978-11-28 Hitachi Metals Ltd Ornato adaptado para ser fixado por pelo menos um ima permanente
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
AU6267896A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors
US7423125B2 (en) 1995-08-01 2008-09-09 Vegenics Limited Antibodies to VEGF-C
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
ES2234241T3 (es) 1998-01-23 2005-06-16 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Derivados de anticuerpo de multiples fines.
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CN100427603C (zh) 1999-10-04 2008-10-22 麦迪卡格公司 调控外源基因转录的方法
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
US6773883B2 (en) 2000-07-31 2004-08-10 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Prognostic classification of endometrial cancer
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
ES2672640T3 (es) * 2003-11-05 2018-06-15 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
KR100891620B1 (ko) 2004-04-13 2009-04-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-ｐ-셀렉틴 항체
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
AU2006211037B2 (en) 2005-02-07 2012-05-24 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
CA2606081C (en) 2005-04-26 2013-09-17 Markus M. Heiss Combination of the application of antibodies for immunostimulation together with glucocorticoids
JP2008539753A (ja) 2005-05-09 2008-11-20 グリクアート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 修飾ｆｃ領域およびｆｃ受容体との結合変更を有する抗原結合分子
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
KR20130108481A (ko) 2005-08-19 2013-10-02 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
CN101374546B (zh) 2005-12-16 2016-03-23 Ibc医药公司 基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体
US8871912B2 (en) 2006-03-24 2014-10-28 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
WO2007146968A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
RS53008B2 (sr) 2007-04-03 2022-12-30 Amgen Res Munich Gmbh Interspecijski specifičan cd3-epsilon vezujući domen
WO2008119566A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
WO2008119565A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific binding domain
US9308257B2 (en) 2007-11-28 2016-04-12 Medimmune, Llc Protein formulation
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
ES2563027T3 (es) * 2008-01-07 2016-03-10 Amgen Inc. Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática
PE20120591A1 (es) 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
TW201100543A (en) 2009-05-27 2011-01-01 Hoffmann La Roche Tri-or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
BR112012003983A2 (pt) 2009-08-31 2021-09-14 Roche Glycart Ag Molecula de ligação abm moleculas de ligação de antigenos abm variante polipeptideo isolado molecula de ligação de antigeneos humanizada anticorpo polinucleotideo isolado composição vetor celula hospedeira metodo de produção de abm metodo de indução da lise celular de tumor, metodo de diagnostico de doença em pacientes que possuem um cancer metodo de aumento de tempo de sobrevivencia em pacientes que possuem um cancer metodo de indução em pacientes de regressão de um motor uso abm e invenção
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
CN102958942A (zh) 2009-12-29 2013-03-06 新兴产品开发西雅图有限公司 异二聚体结合蛋白及其应用
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
PL2635607T3 (pl) 2010-11-05 2020-05-18 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerowego z mutacjami w domenie FC
RS67768B1 (sr) 2010-11-30 2026-03-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Terapijski agens koji indukuje citotoksičnost
HUE029139T2 (hu) 2011-02-10 2017-02-28 Roche Glycart Ag Mutáns interleukin-2 polipeptidek
RS56793B1 (sr) 2011-03-02 2018-04-30 Roche Glycart Ag Cea antitela
SG10201602394QA (en) 2011-03-29 2016-05-30 Roche Glycart Ag Antibody FC Variants
CA2832389A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Genmab A/S Bispecific antibodies against her2 and cd3
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
DK2714733T3 (da) 2011-05-21 2019-05-06 Macrogenics Inc Cd3-bindende molekyler, der er i stand til at binde til human og ikke-human cd3
US20140242081A1 (en) 2011-07-18 2014-08-28 Micromet Ag Dosing regimens for treatment of cea-expressing cancers
WO2013026835A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab fragments and methods of use
MY169358A (en) * 2011-08-23 2019-03-26 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
BR112014004168A2 (pt) * 2011-08-23 2017-12-12 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, célula hospedeira procariótica ou eucariótica, método de produção de anticorpo e invenção
MX349095B (es) 2011-08-23 2017-07-11 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno.
RU2014109038A (ru) 2011-08-23 2015-09-27 Рош Гликарт Аг Антитела к хондроитинсульфат протеогликану меланомы
WO2013026837A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
LT2794905T (lt) 2011-12-20 2020-07-10 Medimmune, Llc Modifikuoti polipeptidai, skirti bispecifinių antikūnų karkasams
SI2838917T1 (sl) 2012-04-20 2019-11-29 Merus Nv Postopki in sredstva za produkcijo heterodimernih IG-podobnih molekul
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
AR092044A1 (es) 2012-08-07 2015-03-18 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
AU2013302696B9 (en) 2012-08-14 2018-08-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US9714291B2 (en) * 2012-10-05 2017-07-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Heterodimer protein composition
EP2904016B1 (en) 2012-10-08 2018-11-14 Roche Glycart AG Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
UY35148A (es) * 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
CA2898100C (en) * 2013-01-14 2023-10-10 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
JP6636803B2 (ja) 2013-02-05 2020-01-29 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａに対する抗体の選択のための方法
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
MX375359B (es) * 2013-02-26 2025-03-06 Roche Glycart Ag Moléculas biespecíficas de unión a antígeno activadoras de células t.
CA2896359A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN105143270B (zh) 2013-02-26 2019-11-12 罗切格利卡特公司 双特异性t细胞活化抗原结合分子
CN105283201B (zh) 2013-03-14 2019-08-02 斯克利普斯研究所 靶向剂抗体偶联物及其用途
JP6541581B2 (ja) 2013-03-15 2019-07-10 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、（ナンバー２）、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ （Ｎｏ．２） Ｌｉｍｉｔｅｄ 低濃度抗体製剤
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
WO2014191113A1 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Numab Ag Novel antibodies
UA129760C2 (uk) 2013-12-17 2025-07-30 Дженентек, Інк. Анти-cd3 антитіло та спосіб його застосування
WO2015095404A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Genentech, Inc. Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes
UA117289C2 (uk) * 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
JP6464255B2 (ja) 2014-08-04 2019-02-06 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
MY193723A (en) 2014-08-29 2022-10-27 Hoffmann La Roche Combination therapy of tumor-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3204415B1 (en) 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
EP3204416A1 (en) 2014-10-09 2017-08-16 EngMab AG Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1 for use in the treatment of ovarian cancer
SI3221357T1 (sl) 2014-11-20 2020-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Pogoste lahke verige in načini uporabe
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
RS61010B1 (sr) 2014-11-20 2020-11-30 Hoffmann La Roche Bispecifični antigen vezujući molekuli koji aktiviraju t ćelije protiv folr1 i cd3
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
EP3778640A1 (en) 2015-05-01 2021-02-17 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
TWI731861B (zh) 2015-06-16 2021-07-01 美商建南德克公司 FcRH5之人源化及親和力成熟抗體及使用方法
US10683369B2 (en) 2015-08-03 2020-06-16 Engmab Sàrl Monoclonal antibodies against BCMA
WO2017055388A2 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US20170096485A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055318A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3356407B1 (en) 2015-10-02 2021-11-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
EP3356410B1 (en) 2015-10-02 2021-10-20 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
EP4026848A1 (en) 2015-12-09 2022-07-13 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody for reducing the cytokine release syndrome

Also Published As

Publication number Publication date
IL271133B (en) 2022-01-01
US9914776B2 (en) 2018-03-13
NZ727600A (en) 2020-10-30
HUS2300033I1 (hu) 2023-10-28
US10611841B2 (en) 2020-04-07
KR20170020723A (ko) 2017-02-23
PH12016502505A1 (en) 2017-04-10
KR102411972B1 (ko) 2022-06-23
PE20211533A1 (es) 2021-08-16
HRP20240734T1 (hr) 2024-08-30
PH12016502505B1 (en) 2024-05-22
MA50584B1 (fr) 2024-06-28
SG10201803384TA (en) 2018-06-28
KR102703974B1 (ko) 2024-09-10
LT3177643T (lt) 2019-08-12
FR23C1043I2 (fr) 2024-10-25
KR20220090589A (ko) 2022-06-29
PE20170263A1 (es) 2017-03-30
US20200231673A1 (en) 2020-07-23
JP2017525690A (ja) 2017-09-07
AU2015299163B2 (en) 2019-07-18
FI3608337T3 (fi) 2024-06-13
US20230287118A1 (en) 2023-09-14
MY179611A (en) 2020-11-11
SMT202400235T1 (it) 2024-07-09
DK3177643T3 (da) 2019-07-15
UA124254C2 (uk) 2021-08-18
IL249120B (en) 2020-04-30
EP3177643B1 (en) 2019-05-08
LTPA2023533I1 (sr) 2023-11-27
NL301246I1 (nl) 2023-10-11
US10611840B2 (en) 2020-04-07
AU2019250201B2 (en) 2021-12-23
MX380514B (es) 2025-03-12
FIC20230037I1 (fi) 2023-12-04
IL271133A (en) 2020-01-30
MA50584A (fr) 2020-09-16
TW201619196A (zh) 2016-06-01
PL3177643T3 (pl) 2019-09-30
KR102317315B1 (ko) 2021-10-27
MY202917A (en) 2024-05-29
AU2019250201A1 (en) 2019-11-07
ES2734178T3 (es) 2019-12-04
EP3608337A1 (en) 2020-02-12
EP3177643A1 (en) 2017-06-14
EA038958B1 (ru) 2021-11-15
HUE044814T2 (hu) 2019-11-28
DK3608337T3 (da) 2024-06-17
MA40510A (fr) 2017-06-14
FI3177643T5 (fi) 2023-11-28
IL249120A0 (en) 2017-01-31
US11117965B2 (en) 2021-09-14
CA2951599C (en) 2024-09-10
LTC3177643I2 (sr) 2025-08-25
EA201790307A1 (ru) 2017-07-31
CR20170032A (es) 2017-04-04
CY2024021I2 (el) 2025-05-09
RS65573B1 (sr) 2024-06-28
CA2951599A1 (en) 2016-02-11
US20220403027A1 (en) 2022-12-22
HUE067340T2 (hu) 2024-10-28
KR102067092B1 (ko) 2020-01-17
CY2024021I1 (el) 2025-05-09
CL2017000278A1 (es) 2017-11-03
US20240141044A1 (en) 2024-05-02
NL301246I2 (nl) 2023-11-01
FR23C1043I1 (fr) 2023-12-29
ES2979976T3 (es) 2024-09-27
SI3177643T1 (sl) 2019-08-30
CN106661120B (zh) 2021-10-01
TWI589591B (zh) 2017-07-01
LT3608337T (lt) 2024-06-25
SG11201700879WA (en) 2017-03-30
US20260022172A1 (en) 2026-01-22
SI3608337T1 (sl) 2024-07-31
NZ766556A (en) 2024-02-23
KR20190077125A (ko) 2019-07-02
ZA201608205B (en) 2020-05-27
MX2017001556A (es) 2017-05-15
EP3608337B1 (en) 2024-04-17
PT3177643T (pt) 2019-07-05
WO2016020309A1 (en) 2016-02-11
CN106661120A (zh) 2017-05-10
US20160075785A1 (en) 2016-03-17
KR20210132202A (ko) 2021-11-03
NO2023039I1 (no) 2023-10-13
AU2015299163A1 (en) 2016-12-08
PL3608337T3 (pl) 2024-07-22
US20180222981A1 (en) 2018-08-09
BR112016030462A2 (pt) 2018-01-16
US20180222980A1 (en) 2018-08-09
JP6464255B2 (ja) 2019-02-06
HRP20191174T1 (hr) 2019-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240141044A1 (en) Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3913000A1 (en) Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
WO2017055385A1 (en) Anti-cd3xgd2 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055392A1 (en) Anti-cd3xcd44v6 bispecific t cell activating antigen binding molecules
NZ727600B2 (en) Bispecific t cell activating antigen binding molecules
BR112016030462B1 (pt) Molécula de ligação de antígenos biespecíficos ativadores de células t, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação
HK1233664B (zh) 双特异性t细胞活化性抗原结合分子
HK1233664A1 (en) Bispecific t cell activating antigen binding molecules