RS59480B1

RS59480B1 - Pd-1 antitelo, njegov fragment koji se vezuje na antigen, i njegova medicinska primena

Info

Publication number: RS59480B1
Application number: RS20191248A
Authority: RS
Inventors: Jijun Yuan; Xiangdong Qu; Jufang Lin; Xin Ye; Guoqing Cao; Weikang Tao; Lianshan Zhang; Lei Zhang; Li Yang
Original assignee: Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd; Jiangsu Hengrui Medicine Co
Priority date: 2013-12-12
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2019-12-31
Also published as: ZA201604660B; SG11201604738TA; PH12016501120A1; CN105026428B; HUE046249T2; SG10201804945WA; JP6502959B2; CA2932966A1; TW201605901A; KR102256152B1; CL2016001460A1; SMT201900591T1; UA119659C2; KR20160113113A; HRP20191678T1; LT3081576T; PT3081576T; NZ721624A; US20160376367A1; MX370449B

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na PD-1 antitelo, PD-1 fragment koji se vezuje na antigen, himerno antitelo i humanizovana antitela koja obuhvataju region određivanja komplementarnosti (CDR) od PD-1 antitela, kao i farmaceutsku supstancu koja obuhvata PD-1 antitelo i njen fragment koji se vezuje na antigen, kao i njegovu upotrebu kao lek protiv kancera.

STANJE TEHNIKE

[0002] Imunoterapija za tumor je ključno područje lečenja tumora već dugo vremena, imunoterapija za kancer povezana sa T ćelijom sada zauzima centralno mesto. Imunoterapija za tumor utiče na tumore potpunim korišćenjem i mobilisanjem citotoksičnih T limfocita kod pacijenata sa tumorima, može biti najdelotvorniji i najbezbedniji način za lečenje kancera. U isto vreme, beg od tumora je ogromna prepreka sa kojom se suočava imunoterapija za tumor, kod koje ćelije kancera pospešuju brz razvoj tumora preko svog inhibitornog dejstva na imuni sistem.

[0003] Postoji izuzetno složen odnos između mehanizma za beg imunog sistema od tumora i odgovora imunog sistema nekog organizma na tumore. U ranom stadijumu imunoterapija protiv tumora, T ćelije ubice specifične za tumor imaju biološku aktivnost, ali gube funkciju ubijanja u kasnom stadijumu rasta tumora. Zato imunoterapija protiv tumora treba da najviše pospeši odgovor samog pacijentovog imunog sistema na taj tumor. Ključ imunoterapije protiv tumora nije samo da aktivira odgovor postojećeg imunog sistema, već takođe da održava tajanje i intenzitet odgovora imunog sistema.

[0004] Aktivacija humane T ćelije in vivo je implementirana sistemom dvosignalne putanje koja ne samo da treba da preda peptid MHC angtigena preko ćelija koje predstavljaju antigen T ćelijama da bi se dobio prvi signal, već takođe zahteva niz kostimulacionih molekula da bi se dobio drugi signal, i zatim T ćelije ispoljavaju normalni odgovor imunog sistema. Ovaj sistem dvostrukog signaliziranja igra ključnu ulogu u ravnoteži imunog sistema, i strogo reguliše različite odgovore imunog sistema stimulisane endogenim i eksogenim antigenima. Odsustvo drugog signala koje obezbeđuju kostimulacioni molekuli će dati kao rezultat odsustvo odgovora ili zadžani specifični odgovor imunog sistema T ćelije, što kao posledicu ima toleranciju. Samim tim, druga signalna putanja igra ključnu regulatornu ulogu u celom postupku odgovora imunog sistema.

[0005] Programisana smrt-1 (PD-1), otkrivena 1992, je receptor proteina izražen na površini T ćelije, i obuhvaćen je apoptozom ćelije. PD-1 pripada CD28 familiji, ispoljava 23% homologije u sekvenci amino kiseline sa citotoksičnim T limfocitnim antigenom 4 (CTLA-4), ali je pretežno izražena u aktiviranim T ćelijama, B ćelijama i mijeloidnim ćelijama, što je drugačije nego u slučaju citotoksičnog T limfocitnog antigena (CTLA). PD-1 ima dva liganda, PD-L1 i PD-L2 prema opisanom redosledu. PD-L1 je uglavnom izražen u T ćelijama, B ćelijama, makrofazima, i dendritskim ćelijama (DC), i ekspresija je povišeno regulisana u aktiviranim ćelijama. Ekspresija PD-L2 je uglavnom ograničena na ćelije koje predstavljaju antigen, kao što su aktivirani makrofazi i dendritske ćelije.

[0006] Nove studije su detektovale visoku ekspresiju PD-L1 proteina u tkivima tumora kod ljudi kao što je kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer creva, kancer bubrega, melanom i drugi, i nivoi ekspresije PD- L1 su blisko povezani sa kliničkim stanjem i prognozom pacijenata. Zato što PD-L1 inhibira proliferaciju T ćelije kroz drugu signalnu putanju, blokiranje vezivanja PD-L1/PD-1 postaje veoma cilj na polju imunoterapije tumora od koga se mnogo očekuje.

[0007] WO 2011/110621 opisuje humanizovano agonistično antitelo koje vezuje humani PD-1, njegove terapijske upotrebe, supstance i postupke za proizvodnju pomenutog antitela. WO 2008/156712 opisuje antitela koja blokiraju vezivanje humanog receptora programirane smrti (hPD-1) na njegove ligande (hPD-1-L1 ili hPD-1-L2) i njihove sekvence promenljivog regiona kao i postupak povećanja aktivnosti (ili smanjenja smanjenja) odgovora imunog sistema kroz PD-1 putanju. Melero et al. (2013) Clin Cancer Res 19(5): 997-1008 izveštavaju o kiliničkim ispitivanjima sa različitim anti-PD-1 mAb za lečenje tumora.

[0008] Za sada postoji nekoliko višenacionalnih farmaceutskih kompanija koje se bave monoklonskim antitelima protiv PD-1, što maksimizuje odgovor samog imunog sistema pacijenata protiv tumora blokiranjem vezivanja PD-Ll/PD-1, i u sledu dostiže svrhu ubijanja protiv ćelija tumora, kao što je WO2009114335. U kliničkim rezultatima BMS’ i Merkova (Merck’s) PD-1 monoklonska antitla, izvesna stopa odgovora je primećena kod nesitnoćelijskog kancera pluća, melanoma i karcinoma bubrega, i stopa odgovora je ispoljila izraženo visoku relevantnost sa PD-L1 ekspresijom u tumorima, što je nagovestilo da PD-1 antitelo ispoljava pozitivno dejstvo na tumore.

[0009] Ovaj pronalazak obezbeđuje PD-1 antitelo sa visokim afinitetom, visokom selektivnošću, i visokom biološkom aktivnošću.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0010] Ovaj pronalazak obezbeđuje PD-1 antitelo ili njegov fragment koji vezuje na antigen, koji obuhvata:

promenljivi region lakog lanca koji obuhvata LCDR1, LCDR2 i LCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 6, SEK ID BR: 7 i SEK ID BR: 8, prema opisanom redosledu; i

promenljivi region teškog lanca koji obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 3, SEK ID BR: 4 i SEK ID BR: 5, prema opisanom redosledu.

[0011] Takođe je dat DNK molekul koji kodira to antitelo, vektor ekspresije koji obuhvata DNK molekul, ćeliju domaćina transformisanu sa vektorom ekspresije, farmaceutsku supstancu koja obuhvata PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen i medicinske upotrebe PD-1 antitela ili fragmenta koji se vezuje na antigen i te farmaceutske supstance.

[0012] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, koji obuhvata:

promenljivi region lakog lanca koji obuhvata barem jedan LCDR izabran iz onih sekvenci kako je prikazano u SEK ID BR: 6, SEK ID BR: 7 ili SEK ID BR: 8; i

promenljivi region teškog lanca koji obuhvata barem jedan HCDR izabran iz tih sekvenci kako je prikazano u SEK ID BR: 3, SEK ID BR: 4 ili SEK ID BR: 5.

[0013] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region lakog lanca obuhvata LCDR1 kao što je prikazano u SEK ID BR: 6.

[0014] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region lakog lanca obuhvata LCDR2 kao što je prikazano u SEK ID BR: 7.

[0015] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region lakog lanca obuhvata LCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 8.

[0016] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region teškog lanca obuhvata HCDR1 kao što je prikazano u SEK ID BR: 3.

[0017] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region teškog lanca obuhvata HCDR2 kao što je prikazano u SEK ID BR: 4.

[0018] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region teškog lanca obuhvata HCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 5.

[0019] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region lakog lanca obuhvata LCDR1, LCDR2 i LCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 6, SEK ID BR: 7 i SEK ID BR: 8, prema opisanom redosledu.

[0020] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region teškog lanca obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 3, SEK ID BR: 4 i SEK ID BR: 5, prema opisanom redosledu.

[0021] Ovde je opisano PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, pri čemu promenljivi region lakog lanca obuhvata LCDR1, LCDR2 i LCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 6, SEK ID BR: 7 i SEK ID BR: 8, prema opisanom redosledu; i pri čemu promenljivi region teškog lanca obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 3, SEK ID BR: 4 i SEK ID BR: 5, prema opisanom redosledu.

[0022] U preporučenom izvođenju iz ovog pronalaska, prema PD-1 antitelu ili njegovom fragmentu koji se vezuje na antigen datim ovde, antitelo je mišje antitelo ili njegov fragment.

[0023] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema mišjem antitelu ili njegovom fragmentu datim ovde, promenljivi region lakog lanca još obuhvata laki lanac FR mišjeg к, λ lanca ili neku njegovu varijantu.

[0024] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, mišje antitelo ili njegov fragment dat ovde obuhvata konstantni region lakog lanca mišjeg к, λ lanca ili neku njegovu varijantu.

[0025] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema mišjem antitelu ili njegovom fragmentu datom ovde, promenljivi region teškog lanca još obuhvata teški lanac FR mišjeg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili njegovu varijantu.

[0026] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, mišje antitelo ili njegov fragment dat ovde obuhvata konstantni region teškog lanca mišjeg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili njegovu varijantu.

[0027] U preporučenom izvođenju iz ovog pronalaska, prema PD-1 antitelu ili njegovom fragmentu koji se vezuje na antigen datim ovde, antitelo je himerno antitelo ili njegov fragment.

[0028] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 himerno antitelo ili njegov fragment dati ovde, sekvenca promenljivog regiona lakog lanca himernog antitela je SEK ID BR: 10, sekvenca promenljivog regiona teškog lanca himernog antitela je SEK ID BR: 9.

[0029] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, PD-1 himerno antitelo ili njegov fragment dat ovde još obuhvata konstantni region lakog lanca humanog к, λ lanca ili njegovu varijantu.

[0030] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, PD-1 himerno antitelo ili njegov fragment dat ovde još obuhvata konstantni region teškog lanca humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 ili njegovu varijantu, poželjno obuhvata konstantni region teškog lanca humanog IgG2 ili IgG4, ili od IgG1 koji nema citotoksičnost posredovanu ćelijom zavisnu od antitela (ADCC) posle mutacije amino kiseline.

[0031] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 antitelu ili njegovom fragmentu koji se vezuje na antigen datim ovde, antitelo je humanizovano antitelo ili njegov fragment.

[0032] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 humanizovanom antitelu ili njegovom fragmentu datim ovde, promenljivi region lakog lanca humanizovanog antitela još obuhvata laki lanac FR humanog к, λ lanca ili njegovu varijantu.

[0033] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 humanizovanom antitelu ili njegovom fragmentu datim ovde, laki lanac FR sekvence promenljivog regiona lakog lanca humanizovanog antitela je izveden iz kombinovane skevence humanih lakih lanaca klicine linije IGKV1-39 i JK4 kao što je prikazano u SEK ID BR: 14, obuhvata FR1, FR2 i FR3 od IGKV 1-39 i FR4 od JK4.

[0034] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 humanizovanom antitelu ili njegovom fragmentu datim ovde, sekvenca humanizovanog antitela lakog lanca je prikazana u SEK ID BR: 12 ili njenoj varijanti.

[0035] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 humanizovanom antitelu ili njegovom fragmentu datim ovde, varijanta promenljivog regiona lakog lanca humanizovanog antitela obuhvata mutaciju amino kiseline 0-10 u promenljivom regionu lakog lanca, poželjno A43S.

[0036] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, PD-1 humanizovano antitelo ili njegov fragment dat ovde još obuhvata konstantni regin lakog lanca humanog к, λ lanca ili njegovu varijantu.

[0037] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 humanizovano antitelo ili njegov fragment dat ovde, promenljivi region teškog lanca još obuhvata teški lanac FR humanog IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, ili njegovu varijantu.

[0038] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 humanizovano antitelo ili njegov fragment dat ovde, FR sekvenca teškog lanca promenljivog regiona teškog lanca humanizovanog antitela je izvedena iz kombinovane sekvence humanih teških lanaca klicine linije IgHV3-7 i JH6 kao što je prikazano u SEK ID BR: 13, obuhvata FR1, FR2 i FR3 od IgHV3 -7 i FR4 od JH6.

[0039] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 humanizovano antitelo ili njegov fragment dat ovde, sekvenca humanizovanog antitela teškog lanca je prikazana u SEK ID BR: 11 ili njenoj varijanti, pri čemu ta varijanta poželjno obuhvata mutaciju amino kiseline 0-10 u promenljivom regionu teškog lanca poželjnije G44R.

[0040] U preporučenom izovđenju iz ovog pronalaska, PD-1 humanizovano antitelo ili njegov fragment dat ovde još obuhvata konstantni region teškog lanca humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 ili njegovu varijantu, i poželjno obuhvata konstantni region teškog lanca humanog IgG2 ili IgG4 koji nema ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ili od IgG1 koji nema ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) posle mutacije amino kiseline. Varijanta je poželjna mutacija konstantnog regiona teškog lanca koja prouzrokuje ublažavanje ili nedostatak, i poželjno N297A, L234A, L235A od IgG1, IgG2/4 himera, i F235E ili L234A/E235A od IgG4.

[0041] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema PD-1 antitelu ili njegovom fragmentu koji se vezuje na antigen dat ovde, fragment koji se vezuje na antigen je Fab, Fv, sFv ili F(ab’)2.

[0042] Ovaj pronalazak još obuhvata DNK molekul koji kodira PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen opisan ovde.

[0043] Ovaj pronalazak još obuhvata vektor ekspresije koji obuhvata DNK molekul kao što je opisano gore.

[0044] Ovaj pronalazak još obuhvata ćeliju domaćina transformisanu sa vektorom ekspresije kao što je opisano gore u tekstu.

[0045] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, prema ovde datoj ćeliji domaćinu, ćelija domaćin je bakterija, poželjno E. coli.

[0046] U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, ćelija domaćin data ovde je kvasac, poželjno Pichia pastoris.

[0047] Ovaj pronalazak još obuhvata farmaceutsku supstancu koja obuhvata PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen kako je opisano ovde i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, razblaživač ili nosač.

[0048] Ovaj pronalazak još obuhvata upotrebu gornjeg PD-1 antitela ili fragmenta koji se vezuje na antigen, ili farmaceutsku supstancu koja obuhvata isti, za upotrebu za lečenje kancera, poželjnije kancera sa PD-L1 ekspresijom; i kancer je poželjno kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer creva, kancer bubrega, melanom, i najpoželjnije nesitnoćelijski kancer pluća, melanom i kancer bubrega.

[0049] Ovaj opis još obezbeđuje PD-1 antitelo ili fragment koji vezuje antigen, ili farmaceutsku supstancu koja obuhvata isti za upotrebu za lečenje i sprečavanje PD-1 posredovane bolesti ili poremećaja, koji obuhvata isporuku subjektu kom je potrebno terapijski delotvorne količine PD-1 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen prema ovom pronalasku, ili farmaceutsku supstancu koja obuhvata isti; pri čemu je ta bolest poželjno kancer, poželjnije kancer sa PD-L1 ekspresijom; kancer je poželjno kancer dojke, kancer pluća, kancer želuca, kancer creva, kancer bubrega, melanom, nesitnoćelijski kancer pluća, melanom i kancer bubrega.

KRATAK OPIS SLIKA

[0050]

Slika 1: Ogled proliferacije mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka. Rezultat pokazuje da ispitano PD-1 antitelo mAb005 može delotvorno da stimuliše proliferaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi čoveka, sa EC50 od 83 ng/ml.

Slika 2: Test izlučenja IFN-y citokina mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka. Rezultat pokazuje da ispitano PD-1 antitelo mAb005 može da stimuliše PBMC proliferaciju, i delotvorno stimuliše izlučivanje citokina IFN- γ u isto vreme, sa EC50 od 13 ng/ml.

Slika 3: inhibitorno dejstvo PD-1 antitela H005-1 na rast ćelija glioma.

Slika 4: dijagram pokazuje promenu zapremine (veličine) tumora posle lečenja.

Slika 5: dijagram pokazuje promenu težine miševa posle lečenja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

1. Definicije

[0051] Da bi se lakše razumeo ovaj pronalazak, izvesni tehnički i naučni pojmovi su specifino definiani dole u tekstu. Osim ako nije specifično definisano na drugom mestu u ovom dokumentu, svi drugi tehnički i naučni pojmovi korišćeni ovde imaju značenje kako to najčešće razume prosečan stručnjak u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak.

[0052] Kako se ovde koristi, kod od jednog slova i kod od tri slova za amino kiseline su kako je opisano u J. biol. chem, 243, (1968) p3558.

[0053] Kako je ovde korišćeno, pojam "antitelo" se odnosi na imunoglobulin, strukturni lanac od četiri peptida spojenih zajedno disulfidnim vezama između dva identična teška lanca i dva identična laka lanca. Različiti konstantni regioni teškog lanca imunoglobulina ispoljavaju različite supstance amino kiseline i rangiraju druge, čime predstavljaju različite vrste antigenosti. Prema tome, imunoglobuline je moguće podeliti u pet kategorija, ili nazvati izotipovima imunoglobulina, naime IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, njihovi teški lanci su µ lanac, δ lanac, γ lanac, α lanac i ε lanac, prema opisanom redosledu. Prema sastavu svoje amino kiseline region zgloba i broj i lokacija disulfidnih veza teškog lanca, isti tip Ig je moguće podeliti u različite podkategorije, na primer, IgG je moguće podeliti u IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. Laki lanac je moguće podeliti u к ili λ lanac koji razmatra različite konstantne regione. Svaki od pet Igs može imati к ili λ lanac.

[0054] U ovom pronalasku, promenljivi region lakog lanca antitela pomenut ovde još obuhvata konstantni region lakog lanca, koji obuhvata humani ili mišji к, λ lanac ili njegovu varijantu.

[0055] U ovom pronalasku, promenljivi region teškog lanca antitela pomenut ovde još obuhvata konstantni region teškog lanca, koji obuhvata humani ili mišji IgG1, 2, 3, 4 ili neku njegovu varijantu.

[0056] Blizu N terminalne sekvence teški i laki lanci antitela, oko 110 sekvenci amino kiseline se umnogome razlikuju, poznati kao promenljivi region (V region); ostatak sekvence amino kiseline blizu C terminusa je relativno stabilan, poznat kao konstantni region (C region). Promenljivi region obuhvata tri hiperpromenljiva regiona (HVR) i četiri relativno očuvana okvirna regiona (FR) sekvence. Tri hiperpromenljiva regiona određuju specifičnost tog antitela, takođe poznatu kao region za određivanje komplementarnosti (CDR). Svaki promenljivi region lakog lanca (LCVR) i svaki promenljivi region teškog lanca (HCVR) se sastoji od tri CDR i četiri FR, sa sekvencijalnim redosledom od amino terminala do karboksilnog terminala kao u nastavku: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Tri laka lanca CDR se odnose na LCDR1, LCDR2, i LCDR3; tri teška lanca CDR se odnose na HCDR1, HCDR2 i HCDR3. Brojevi i lokacije ostataka amino kiseline regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) u LCVR i HCVR antitela ili fragmenta koji se vezuje na antigen ovde odgovaraju sa poznatim kriterijumima Kabat numeracije (LCDR1-3, HCDE2-3), ili odgovaraju sa kriterijumima kabat i hotija numeracije (HCDR1).

[0057] Pojam "mišje antitelo" u ovom pronalasku se odnosi na anti-humano-PD-1 monoklonsko antitelo dobijeno prema znanju i veštinama u ovoj oblasti. Tokom pripreme, predmet koji se testira je ubrizgan sa PD-1 antigenom, i zatim antitelo koje izražava hibridom koje poseduje željenu sekvencu ili funkcionalne karakteristike je odvojeno. U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, mišje PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen još obuhvata konstantni region lakog lanca mišjeg к, λ lanca ili njegovu varijantu, ili još obuhvata konstantni region teškog lanca mišjeg IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4, ili njegovu varijantu.

[0058] Pojam "himerno antitelo", je antitelo koje se formira spajanjem promenljivog regiona mišjeg antitela sa konstantnim regionom humanog antitela, himerno antitelo može da ublaži odgovor imunog sistema indukovan mišjim antitelom. Da bi se uspostavilo himerno antitelo, hibridom izlučuje specifično mišje monoklonsko antielo se prvo uspostavlja, gen promenljivog regiona se podvezuje sa genom konstantnog regiona čoveka da bi se formirao himerni gen koji je moguće umetnuti u humani vektor, i najzad molekul himernog antitela je izražen u eukariotskom ili prokariotskom industrijskom sistemu. U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, promenljivi region lakog lanca PD-1 himernog antitela još obuhvata laki lanac FR mišjeg к, λ lanca ili njegovu varijantu, i sekvenca promenljivog regiona lakog lanca je prikazana u SEK ID BR: 10. Promenljivi region teškog lanca PD-1 himernog antitela još obuhvata teški lanac FR mišjeg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ili njegovu varijantu, i sekvenca promenljivog regiona teškog lanca je prikazana u SEK ID BR: 9. Konstantni region humanog antitela se bira iz konstantnog regiona teškog lanca humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 ili njegove varijante, poželjno obuhvata konstantni region teškog lanca humanog IgG2 ili IgG4, ili od IgG1 koji posle mutacije aminokiseline nema ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).

[0059] Pojam "humanizovano antitelo", takođe poznato kao antitelo nakalemljeno na CDR, se odnosi na antitelo generisano kalemljenjem mišjih CDR sekvenci u promenljivi okvirni region humanog antitela, naime, sekvenca humanog okvira antitela klicine linije različitog tipa. Humanizovano antitelo prevazilazi kao nedostatak jak odgovor antitela indukovan himernim antitelom koje nosi veliku količinu komponenata mišjeg proteina. Takve okvirne sekvence moguće je dobiti iz javnih DNK baza podataka koje obuhvataju sekvence gena antitela klicine linije ili objavljene reference. Na primer, sekvence DNK klicine linije humanih gena promenljivog regiona teškog i lakog lanca moguće je nači u "VBase" bazi sekvenci klicine linije čoveka (dostupno ona veb stranici www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), kao što se može naći u Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekvence proteina od interesa za imuni sistem), 5th Ed. U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, mišje CDR sekvence PD-1 humanizovanog antitela se biraju iz SEK ID BR: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Okvirni promenljivi regioni antitela čoveka su projektovani i izabrani tako da se FR sekvenca lakog lanca promenljivog regiona lakog lanca antitela izvodi iz kombinovane sekvence lakih lanaca klicine linije čoveka IGKV1-39 i JK4: SEK ID BR: 14, obuhvata FR1, FR2 i FR3 od IGKV 1-39 i FR4 od JK4; FR sekvenca teškog lanca promenljivog regiona teškog lanca antitela se izvodi iz kombinovane sekvence humanih teških lanaca klicine linije IgHV3-7 i JH6: SEK ID BR: 13, obuhvata FR1, FR2 i FR3 od IgHV3 -7 i FR4 od JH6. Da bi se izbeglo smanjenje aktivnosti tokom smanjenja imunogenosti, promenljivi region humanog antitela se podvrgava minimalnoj reverznoj mutaciji da bi se održala aktivnost.

[0060] Kako se ovde koristi, "fragment koji se vezuje na antigen" se odnosi na Fab fragment, Fab’ fragment, F(ab’)2 fragment sa aktivnošću koja se vezuje na antigen, kao i Fv fragment sFv fragment vezivanje sa humanim PD-1; obuhvata jedan ili više CDR regiona antitela opisanih u ovom pronalasku izabranih iz grupe koja obuhvata SEK ID BR:3 do SEK ID BR:8. Fv fragment je minimalni fragment antitela koji obuhvata promenljivi region teškog lanca, promenljivi region lakog lanca, i sva mesta na koja se vezuje antigen bez konstantnog regiona. Generalno, Fv antitelo još obuhvata polipeptidni linker između promenljivih teških (VH) i promenljivih lakih (VL) domena, i može da formira strukturu neophodnu za vezivanje antigena. Takođe, različiti linkeri mogu biti korišćeni da se povežu promenljivi regioni dva antitela da bi se formirao polipeptid, pod nazivom antitelo jednog lanca ili Fv jednog lanca (sFv). Kako se ovde koristi, pojam "vezivanje sa PD-1", znači međusobnu interakciju sa humanim PD-1. Kako se ovde koristi, pojam "antigenski determinant" iz ovog pronalaska, se odnosi na prekinuta trodimenzionalna mesta na antigenu, prepoznato antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen iz ovog pronalaska.

[0061] Kako se ovde koristi, pojam "ADCC", naime ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, se odnosi na ćelije koje izražavaju Fc receptore koji direktno ubijaju ciljne ćelije obložene antitelom prepoznavanjem Fc segmenta tog antitela. Funkciju efektora ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) tog antitela moguće je smanjiti ili eliminisati modifikovanjem Fc sementa u IgG. Modifikacija se odnosi na mutacije konstantnog regiona teškog lanca antitela, kao što su mutacije izabrane iz N297A, L234A, L235A u IgG1; IgG2/4 himera; F235E, ili L234A/E235A mutacije u IgG4.

[0062] Kako je ovde korišćeno, protein fuzije opisan u ovom opisu je proteinski proizvod dobijen koekspresijom dva gena preko tehnologije rekombinantne DNK. Protein Fc fuzije vanćelijskog domena rekombinantne PD-1 je dobijen koekspresijom PD-1 vanćelijskog domena i Fc fragmenta humanog antitela preko tehnologije rekombinantne DNK. Vanćelijski domen PD-1 se odnosi na deo PD-1 spoljne citomembrane, čija je sekvenca označeni region SEK ID BR: 1 dole.

[0063] Postupci za proizvodnju i prečišćavanje antitela fragmenata koji se vezuju na antigen su dobro poznati u ovoj obasti i moguće ih je naći, na primer, u Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor (Vodič za eksperimentalnu tehnologiju antitela), poglavlje 5-8 i 15. Na primer, miševe je moguće imunizovati sa humanim PD-1, ili njegove fragmente, i antitela dobijena kao rezultat je moguće zatim ponovo naturisati, prečistiti i sekvencirati korišćenjem uobičajenih postupaka dobro poznatih u ovoj oblasti. Fragmenti koji se vezuju na antigen mogu biti pripremljeni uobičajenim postupcima. Antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen iz ovog pronalaska je generalno projektovano da uvede jedan ili više humanih okvirnih regiona (FR) na region konstantnog domena (CDR) koji nije izveden iz čoveka. Humane sekvence okvirnog regiona (FR) klicine linije moguće je dobiti iz ImMunoGeneTics(IMGT) preko njihove vebstranice http://imgt.cines.fr, ili od The Immunoglobulin FactsBook, 2001ISBN012441351. Specifično, klicina linija okvirnog regiona (FR) lakog lanca za upotrebu u antitelu ili fragmentu koji se vezuje na antigen iz ovog pronalaska obuhvataju A3 i O2. Specifično, klicina linija okvirnog regiona (FR) teškog lanca za upotrebu u antitelu ili fragmentu koji se vezuje na antigen iz ovog pronalaska obuhvataju VH3-21 i VH3-23.

[0064] Projektovano antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen iz ovog pronalaska moguće je

1

pripremiti i prečisti korišćenjem uobičajenih postupaka. Na primer, cDNK sekvence koje kodiraju teški lanac (SEK ID BR: 11) i laki lanac (SEK ID BR: 12) moguće je klonirati i rekombinovati u vektor ekspresije GS. Vektor ekspresije rekombinovanog imunoglobulina može zatim stabilno da transfektuje CHO ćelije. Kao preporučljiviji postupak dobro poznat u ovoj oblasti, ekspresija antitela iz sisara će kao rezultat imati glikosilaciju, obično visoko očuvan N-terminus u FC regionu. Stabilne klonove je moguće dobiti kroz ekspresiju antitela koje se specifično vezuje na humani PCSK9. Pozitivni klonovi mogu biti prošireni u podlozi kulture bez seruma za proizvodnju antitela u bioreaktorima. Podloga kulture, u kojoj se izlučuje neko antitelo, može biti pročišćena uobičajenim tehnikama. Na primer, podlogu je moguće uobičajeno naneti na Protein A ili G Sepharose FF stub koji je uravnotežen sa kompatibilnim puferom. Stub je opran da bi se uklonile komponente nespecifičnog vezivanja. Vezano antitelo se eluira PH gradijentom i fragmenti antitela su detektovani pomoću SDS-PAGE, i zatim su grupisani. Antitelo je moguće filtrirati i koncentrovati korišćenjem uobičajenih tehnika. Rastvorljivi agregat i multimeri mogu biti delotvorno uklonjeni uobičajenim tehnikama, uključujući isključivanje po veličini ili jonsku izmenu. Dobijeni proizvod je moguće trenutno zamrznuti, na primer na -70°C, ili može biti liofilisan.

[0065] Antitelo iz ovog pronalaska je monoklonsko antitelo. Monoklonsko antitelo ili mAb, kako se ovde koristi, se odnosi na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona uključujući ali ne i ograničeno na bilo koji eukariotski, prokariotski, ili fag klon. Monoklonska antitela i njihovi fragmenti koji se vezuju na antigen mogu biti rekombinovana, na primer tehnologijama hibridoma, rekombinantnim tehnologijama, tehnologijama prikaza faga, sintetičkim tehnologijama (npr., CDR kalemljenjem), ili drugim tehnologijama poznatim u ovoj oblasti.

[0066] "Isporuka" i "lečenje," kako se primenjuje na životinju, čoveka, eksperimentalnog subjekta, ćeliju, tkivo, organ, ili biološki fluid, se odnosi na dovođenje u kontakt eksogenog farmaceutskog, terapijskog, dijagnostičkog sredstva, ili supstance sa životinjom, čovekom, subjektom, ćelijom, tkivom, organom, ili biološkim fluidom. "Isporuka" i "lečenje" mogu da se odnose na, npr., terapijske, farmakokinetičke, dijagnostičke, istraživačke, i eksperimentalne postupke. Lečenje ćelije obuhvata dovođenje u kontakt reagensa sa ćelijom, kao dovođenje u kontakt reagensa sa fluidom, pri čemu je fluid u kontaktu sa tom ćelijom. "Isporuka" i "lečenje" se takođe koristi da znači in vitro i ex vivo lečenja, npr., ćelije pomoću reagensa, dijagnostičke, ćelije vezivnog jedinjenja, ili drugom ćelijom. "Lečenje," kako se primenjuje na humani, veterinarski, ili istraživački subjekat, se odnosi na terapijsko lečenje, profilaktičke ili preventivne mere, na istraživačke i dijagnostičke primene.

[0067] "Lečenje" znači isporuku terapijskog agensa, kao što je supstanca koja obuhvata bilo koje od jedinjenja koja se vezuju iz ovog pronalaska, unutra ili spolja pacijentu koji ima jedan ili više simptoma bolesti za koje se zna da to sredstvo ima terapijsku aktivnost. Najčešće, sredstvo se isporučuje u količini delotvornoj da ublaži jedan ili više simptoma bolesti kod lečenog pacijenta ili populacije, bilo uvođenjem regresije ili inhibiranjem napredovanja takvih simptoma do bilo kog klinički merljivog stepena. Količina terapijskog sredstva koja je delotvorna da se ublaži specifičan simptom bolesti (se takođe odnosi na "terapijski delotvornu količinu") može da varira zavisno od faktora kao što su stadijum bolesti, starost, i težina pacijenta, i sposobnost leka da podstakne željeni odgovor kod pacijenta. Da li je ovaj simptom ublažen može biti procenjeno bilo kojim kliničkim merenjem koje uobičajeno koriste lekari ili drugi pružaoci zdravstvene nege da bi procenili ozbiljnost ili status napredovanja tog simptoma. Pošto izvođenje ovog pronalaska (npr., PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen ili farmaceutska supstanca za upotrebu za lečenje kancera) ne mora da bude delotvorna kod svakog pacijenta za ublažavanje simptoma bolesti koja je predmet interesovanja, treba ublažiti ciljne simptome bolesti koja je predmet interesovanja kod statistički značajnog broja pacijenata kako je utvrđeno bilo kojim statističkim testom poznatim u ovoj oblasti kao što je studentski t-test, hi-kvadratni test, Man-Vitnijev (Mann-Whitney) test zbira rangova, Kruskal-Valisov test (H-test), Dzonhir-Terpstra test i Vilkoksonov test.

[0068] "KonzervatIvne modifikacije " ili "konzervativna zamena ili supstitucija" se odnosi na supstitucije amino kiselina u proteinu sa drugim amino kiselinama koje imaju slične karakteristike (npr. naelektrisanje, veličinu bočnog lanca, hidrofobnost/hidrofilnost, konformaciju i krutost okosnice, itd.), tako da promene mogu često da se naprave bez izmene biološke aktivnosti proteina. Stručnjaci u ovoj oblasti uviđaju da, generalno pojedinačne supstitucije amino kiseline u neključnim regionima polipeptida ne menjaju biološku aktivnost u značajnoj meri (videti, npr., Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene (Molekularna biologija gena), The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4th Ed.)). Pored toga, manje je verovatno da supstitucije strukturno ili funkcionalno sličnih kiselina ometaju biološku aktivnost.

[0069] "U suštini se sastoje od," ili varijacija kako se koristi u ovom spisu i patentnim zahtevima, označava uključivanje navedenih elemenata ili grupe elemenata, i opciono uključivanje drugih elemenata slične ili drugačije prirode nego što su navedeni elementi, koji ne menjaju materijalno osnovna ili nova svojstva navedenog režima doziranja, postupka doziranja, ili supstance koja se dozira. Kao neograničavajući primer, jedinjenje koje se vezuje koje se u suštini sastoji od navedene sekvence amino kiseline može takođe da obuhvati jednu ili više amino kiselina koje ne utiču materijalno na svojstva vezivnog jedinjenja.

[0070] "Delotvorna količina" obuhvata količinu dovoljnu da poboljša ili spreči simptom ili znak medicinskog stanja. Delotvorna količina takođe znači količinu dovoljnu da omogući ili olakša dijagnozu. Delotvorna količina za specifičnog pacijenta ili veterinarskog subjekta može varirati zavisno od faktora kao što je stanje koje se leči, opšteg zdravlja pacijenta, rute i doze koja se isporučuje pacijentu i ozbiljnosti neželjenih dejstava. Delotvorna količina može da bude maksimalna doza ili protokol doziranja koji izbegava značajna neželjena dejstva ili toksična dejstva.

[0071] "Eksogene" se odnosi na supstance koje su proizvedene izvan organizma, ćelije, ili ljudskog tela, zavisno od konteksta. "Endogene" se odnosi na supstance koje su proizvedene unutar ćelije, organizma, ili ljudskog tela, zavisno od konteksta.

[0072] "Homologno" se odnosi na sličnost sekvence između dve sekvence polinukleotida ili između dva polipeptida. Kada je položaj kod obe od dve upoređene sekvence zauzet istom baznom ili monomerskom podjedinicom amino kiseline, npr., ako položaj koji dostiže dva DNK molekula jeste zauzet adeninom, onda su dva molekula homologna na toj poziciji. Procenat homologije između dve sekvence je funkcija broja odgovarajućih ili homologniih pozicija koje dele dve sekvence podeljene brojem upoređenih pozicija X 100. Na primer, ako se poklapa 6 od 10 pozicija u dve sekvence ili je homologno kada su sekvence optimalno poravnate, onda su te dve sekvence 60% homologne. Generalno, radi se poređenje kada su dve sekvence poravnate da bi dale maksimalni procenat homologije.

[0073] Kako je ovde korišćeno, izrazi "ćelija," "linija ćelije/klica," i "ćelijska kultura" se koriste ravnopravno i sve takve oznake obuhvataju progenost. Dakle, reči "transformanti" i "transformisane ćelije" obuhvataju primarne ćelije i kulture subjekta izvedene iz njih bez razmatranja broja transfera. Takođe se razume da ne moraju svi progeni da budu precizno identični u DNK sadržaju, usled namernih ili neželjenih mutacija. Mutant potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kako se analizira u originalno transformisanoj ćeliji su uključeni. U slučajevima gde su distinktivna naznačenja namerna, biće jasno iz konteksta.

[0074] Kako je ovde korišćeno, "polimerazna lančana reakcija" ili "PCR" se odnosi na postupak ili tehniku kod koje se izuzetno male količine specifičnog dela nukleinske kiseline, RNK i/ili DNK, pojačavaju kako je opisano u, npr., U.S. Pat. br.4,683,195. Generalno, informacija o sekvenci od kraja regiona koji je predmet interesovanja ili iza treba da je dostupna, tako da oligonukleotidne početnice (prajmeri) mogu da budu naznačene; ove početnice će biti identične ili slične u sekvenci odgovarajućim lancima uzorka koji treba pojačati.5’ terminusni nukleotidi dve početnice mogu biti identični sa krajevima materijala koji treba pojačati. PCR je moguće koristiti da bi se pojačale specifične RNK sekvence, specifične DNK sekvence iz ukupne genomske DNK, i cDNK transkribovala iz ukupne ćelijske RNK, bakteriofagnih ili plazmidnih sekvenci, itd. Videti generalno Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). Kako je ovde korišćeno, PCR se smatra kao jedan, ali ne i jedini, primer postupka polimerazne reakcije nukleinske kiseline za pojačavanje uzorka testa nukleinske kiseline, koji obuhvata upotrebu poznate nukleinske kiseline kao početnice i polimeraze nukleinske kiseline da bi se pojačao ili generisao specifični deo nukleinske kiseline.

[0075] "Opcion" ili "opciono" znači da događaj ili situacija koja sledi može ali da se ne javlja obavezno, i opis obuhvata primere u kojima se javlja ili ne javlja taj slučaj ili okolnost. Na primer, "opciono obuhvata 1-3 promenljiva regiona teškog lanca antitela" znači da promenljivi region teškog lanca antitela sa specifičnom sekvencom može da bude, ali ne mora neohodno da bude prisutan.

[0076] "Farmaceutska supstanca" se odnosi na supstancu koja sarži mešavinu jednog ili više jedinjenja prema ovom pronalasku ili fiziološki/farmaceutski prihvatljivu so ili njen prolek sa drugim hemijskim komponentama, kao i dodatne komponente kao što je fiziološki/farmaceutski prihvatljive

1

nosače i ekscipijente. Farmaceutska supstanca ima za cilj pospešivanje isporuke organizmu, olakšavanje apsorpcije aktivnog sastojka i time ispoljavanje biološkog dejstva.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0077] U daljem tekstu, ovaj pronalazak je detaljnije opisan sa pozivom na primere. U primerima iz ovog pronalaska, gde nisu opisani specifični uslovi, eksperimenti su generalno sprovedeni pod uobičajenim uslovima kako je opisano u Antibody Technology Laboratory Manual and Mecular Cloning Manual (Laboratorijskom priručniku za tehnologiju antitela i priručniku za kloniranje molekula) laboratorije Kold Spring Harbor (Cold Spring Harbor), ili u uslovima koje su predložili proizvođači materijala ili proizvoda. Kada poreklo reagenasa nije specifično navedeno, reagensi su komercijalno dostupni uobičajeni reagensi.

Primer 1 Dobijanje antitela

[0078] Generisana su mišja monoklonska antitela protiv humanog PD-1. Prečišćeni rekombinantni PD-1 protein Fc fuzije vanćelijskog domena (PD-1 Fc) (SEK ID BR: 1); ili CHO ćelije transfektovane sa PD-1 (SEK ID BR: 2) je korišćen kao antigen da bi se imunizovali Balb/C miševi i SJL miševi. Humani PD-1 antigen je kupljen od laboratorije ORIGENE, kat br. SC117011, NCBI referentna sekvenca: NM_005018.1.

PD-1 Fc, rekombinantni PD-1 protein Fc fuzije vanćelijskog domena (SEK ID BR: 1):

PD-1, PD-1 antigen transfektujuće ćelije (SEK ID BR: 2):

[0079] Imunizacija sa PD-1 proteinom Fc fuzije vanćelijskog domena se deli u visoku dozu (50 ug) i malu dozu (10ug) prečišćenog antigena, imunizacija sa PD-1 transfektovanim CHO ćelijama koristi 0,5-1 X 10<7>ćelije. Imunizacija je izvedena 0, 14, i 35. dana prema opisanom redosledu sa Freundovim kompletnim ađuvansom (FCA); uzorci krvi su uzeti u retroorbitalnom mestu da bi se nadgledao odgovor imunog sistema. Miševi sa anti-PD-1 koncentracijom imunoglobulina čoveka su dobijeni analizom plazme korišćenjem ELISA tehnike. 56-og dana, miševi sa najvišom anti-PD-1 koncentracijom humanog imunoglobulina su podvrgnuti da bi se pospešila imunizacija. Posle 3 dana, miševi su žrtvovani i slezina je uklonjena za fuziju. Fuzije hibridoma su analizirane i dobijeno je mišje monoklonsko antitelo mAb005. Sekvenca promenljivog regiona teškog lanca i sekvenca promenljivog regiona lakog lanca mišjeg monoklonskog antitela mAb005 su kao u nastavku: mAb005 HCVR

mAb005 LCVR

[0080] CDR sekvence su kao u nastavku:

1

Primer 2: Analiza antitela

[0081] In vitro ELISA ogled vezivanja PD-1 antitela:

PD-1 antitelo blokira signalnu putanju PD-1 i njegovog liganda vezivanjem na PD-1 vanćelijski domen. In vitro ELISA ogled je korišćen da bi se detektovalo svojstvo vezivanja PD-1 antitela. Biotinilisan PD-1 protein FC fuzije vanćelijskog domena (PD-1 FC) je obložen na ploče sa 96-pregrada vezivanjem na avidin neutralizacije. Jačina signala posle dodavanja antitela se koristi da bi se odredilo svojstvo vezivanja antitela i PD-1.

[0082] Avidin neutralizacije (vezivanje na biotin) je razblažen do 1 µl/ml sa PBS buffer, pipetom raspoređen na ploču sa 96 pregrada sa 100 µl/pregradi i odstojao je 16 sati -20 sati na 4°C. Ploča sa 96 pregrada je oprana jednom PBST (PH7.4 PBS, koji sadrži nejonski deterdžent 0,05%-tweeen20) posle PBS pufer je uklonjen, zatim je ploča inkubirana i blokirana tokom 1 sat na sobnoj temperaturi uz dodatak 120 µ1/pregradi PBST/1% mleka. Posle uklanjanja rastvora za blokiranje, ploča je oprana PBST puferom, posle čega je usledilo dodavanje 1 µg/ml biotinom označenog PD1-FC koji je razvlažen PBST/1% mlekom, i inkubiran tokom 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle uklanjanja blokirajućeg rastvora, ploča je oprana sa PBST puferom 3 puta, posle čega je usledilo dodavanje PD-1 antitela koje se testira koje je razblaženo do pogodne koncentracije pomoću PBST/1% mleka, i inkubirano tokom 1,5 sat na sobnoj temperaturi. Posle uklanjanja sistema reakcije, ploča je oprana 3 puta sa PBST puferom, posle čega je usledilo dodavanje 100 µl/pregradi HRP-označenog anti-mišjeg sekundarnog antitela (The Jackson Laboratory) koje je razblaženo PBST/1% mlekom, i inkubirano tokom 1 sat na sobnoj temperaturi. Pošto je opran sa PBST tokom tri puta, ploča je dodata sa 100 µl/pregradi TMB, i inkubirana tokom 5-10 min na sobnoj temperaturi. Zatim je reakcija završena dodavanjem 100 µl/pregradi 1M H2SO4. Apsorpciona vrednost na 450 nm je pročitana na NOVOStar čitaču mikroploče; izračunata je ELISA vrednost EC50vezivanja.

[0083] Rezultati su pokazali da je antitelomAb005 pokazalo odličnu aktivnost vezivanja na PD-1Fc čoveka (humani PD-1) i makaki majmuna PD-1Fc (kino PD-1).

[0084] In vitro ogled blokiranja vezivanja PD-1 antitela i PD-1 liganda:

PD-L1 na površini ćelija tumora ispoljava ograničavajuće dejstvo na proliferaciju T ćelija vezivanjem na PD-1 na površini T ćelije. PD-1 antitelo blokira PD-L1/PD-1 signalnu putanju vezivanjem na PD-1 da bi stimulisao proliferaciju T ćelije. PD-1/PD-L1 ogled blokiranja vezivanja se koristi da detektuje aktivnost blokiranja PD-1 antitela na signalnoj putanji.

1

[0085] U ovom eksperimentu, ploča sa 96 pregrada je obložena sa PD-1 proteinom sa vanćelijskim domenom fuzionisanim sa FC (PD-1-FC), i inkubiranim sa PD-1 antitelom koje se testira; kasnije je dodato biotinom označeno PD-L1 za inkubaciju. Posle pranja ploče, detektovana je količina vezivanja biotinom označenog PD-L1; blokiranje IC50vrednost PD-1 antitela za ligand PD-L1 vezivanje je izračunato.

[0086] PD-1-FC je razblaženo do 1 µg/ml sa PH 9.6 CB puferskim sredstvom (1,59 g Na2CO3i 2,93 g NaHCO3su rastvoreni u 1L destilovane vode), pipetom raspoređeni na ploču sa 96 pregrada sa 100 µl/pregradi i ostavljeni da stoji tokom 16 sati - 20sati na 4 °C. Ploča sa 96 pregrada je oprana jednom sa PBST (PH7.4 PBS, koji sadrži 0,05%-tweeen20) posle je PBS pufer uklonjen, zatim je ploča inkubirana i blokirana tokom 1 sat na sobnoj temperaturi sa 120 µl/pregradi PBST/1% mlekom. Posle uklanjanja blokirajućeg rastvora, ploča je oprana sa PBST puferom jednom, posle čega je usledilo dodavanje 90 µl PD-1 antitela koje se testira koje je razblaženo do pogodne koncentracije jednostavnim razblaživačima (PH7.4 PBS koji sadrže 5%BSA, 0,05%-Tween20), i inkubirano tokom 1 sat na 4°C. Zatim je 10 X koncentracija biotinom označenog PD-L1 (Beijing Sino Biological Inc.) (10 µg/ml) dodato u ploču sa 10 µl/pregradi, oscilovano i mešano oscilatorom, i inkubirano na 37°C tokom 1 sat. Posle uklanjanja sistema reakcije, ploča je oprana 6 puta sa PBST puferom, posle čega je usledilo dodavanje 100 µl/pregradi polimera Streptavidin -Peroksidaze koji je razblažen pomoću PBST u odnosu od 1:400, i inkubiran pod oscilacijom tokom 50 min na soboj temperaturi. Pošto se opere sa PBST 6 puta, ploča je dodata sa 100 µl/pregradi TMB, i inkubirana tokom 5-10 min na sobnoj temperaturi. Zatim je reakcija završena dodavanjem 100 µl/pregradi 1M H2SO4. Apsorpciona vrednost na 450 nm je očitana na NOVOStar čitaču mikroploče; izračunata je vrednost IC50blokiranja PD-1 za vezivanje PD-L1 liganda.

[0087] Rezultat je pokazao da je antitelo mAb005 bilo veoma delotvorno da blokira vezivanje PD- L1 sa PD-1.

Primer 3: Ogled selektivnosti vezivanja PD-1 antitela in vitro

[0088] Da bi se detektovala specifična aktivnost vezivanja PD-1 antitela na druge proteine PD-1 familije, humani CTLA4 i humani CD28 su korišćeni za oglede vezivanja. U međuvremenu, PD-1 miševa je takođe korišćen za oglede vezivanja da bi se odredila raznovrsnost PD-1 antitela za različite vrste koje nisu ljudska/majmunska.

[0089] Selektivno vezujući proteini: humani PD-1, humani ICOS, humani CTLA4, humani CD28 i

1

mišji PD-1, (Beijing Sino Biological Inc.), su prema odgovarajućem redosledu razblaženi u 1 µg/ml sa PBS puferom, pipetom raspoređeni na ploču sa 96 pregrada sa 100 µl/pregradi i ostavljeni da stoje tokom 16 sati - 20 sati na 4 °C. Ploča sa 96 pregrada je oprana jednom sa PBST (PH7.4 PBS, koji sadrži 0,05%-tweeen20) pošto je PBS pufer uklonjen, onda je ploča inkubirana i blokirana tokom 1 sat na sobnoj temperaturi sa 120 µ1/pregradi PBST/1% mlekom. Posle uklanjanja blokirajućeg rastvora, ploča je oprana sa PBST puferom 3 puta, posle čega je usledilo dodavanje probnog PD-1 antitela, i inkubirano tokom 1,5 sat na sobnoj temperaturi. Posle uklanjanja sistema reakcije, ploča je oprana 3 puta sa PBST, posle čega je usledilo dodavanje 100 µl/pregadi HRP označeno anti-mišje sekundarno antitelo (The Jackson Laboratory) koje je razblaženo PBST/1% mlekom, i inkubirano tokom 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploča je oprana 3 puta sa PBST, posle čega je usledilo dodavanje 100 µl/pregradi TMB, i inkubirano tokom 5-10 min na sobnoj temperaturi. Zatim je reakcija završena dodavanjem 100 µl/pregradi 1M H2SO4. Apsorpciona vrednost na 450 nm je očitana na NOVOStar čitaču mikroploče.

[0090] Rezultat je pokazao da mAb005 antitelo ne ispoljava specifičnu aktivnost vezivanja na druge proteine PD-1 familije. Međutim, mAb nema unakrsnu reaktivnost vrsta protiv mišjeg PD-1.

Primer 4: In vitro ogled vezivanja ćelije PD-1 antitela

[0091] FACS (fluorescentno aktiviran sortirač ćelije) je postupak testiranja za detektovanje interakcije proteina i ćelija. Testiranje je korišćeno za detektovanje aktivnosti vezivanja PD-1 antitela na prirodni PD-1 izražen na površini ćelije. Ćelije korišćene u tekstu su CHO ćelije koje pokazuju visoko ispoljavanje PD-1 (videti Primer 1, CHO ćelije transfektovane sa PD-1 (SEK ID BR: 2)).

[0092] CHO ćelije sa visoko ispoljenim PD-1 su centrifugirane na 1000 ob/min tokom 5 minuta, i pelet je prikupljen i vraćen u suspenziju sa 10-15 ml prethodno ohlađenog protočnog pufera za broj ćelija. Ćelije su centrifugirane na 1000 ob/min u 50 ml cevima centrifuge tokom 5 minuta i prikupljene. Posle uklanjanja supernatanta, pelet je vraćen u suspenziju i prethodno ohlađen pufer za blokiranje sa gustinom od 0,5-1,0 X 10<7>ćelija/ml. Posle inkubacije na 4 °C tokom 30 minuta, obnovljena suspenzija je raspoređena pipetama u ploču sa 96 pregrada na 100 µl/pregradi. Ploča sa 96 pregrada je centrifugirana na 1500 ob/min tokom 5 minuta, supernatant je uklonjen.100 µl primarnog antitela je dodato u svaku pregradu; ćelije su bile ponovo suspendovane, i inkubirane u mraku tokom 60 minuta na 4 °C. Posle centrifugiranja i uklanjanja supernatanta, dodato je 100 µl sekundarnog antitela sa FITC oznakom (BD Biosciences) je razblaženo u odnosu 1:400. Ćelije su ponovo suspendovane i inkubirane u mraku tokom 60

1

minuta na 4 °C. Ćelije su oprane dvaput sa protočnim puferom, ponovo suspendovane i fiksirane sa paraforomaldehidom za ogled protočne citometrije.

[0093] Rezultati pokazuju da mAb005 antitelo može takođe da se veže na PD-1 na površinu ćelije.

Primer 5: In vitro afinitet vezivanja i kinetički ogled

[0094] Biacore postupak je priznat ogled koji objektivno detektuje interakcioni afinitet i kinetiku proteina. Analizirali smo karakterizovani afinitet i kinetiku vezivanja PD-1 antitela koje se testira iz ovog pronalaska pomoću Biacore (GE).

[0095] Prema insturkciji kompleta koji je obezbedila laboratorija Biacore, PD-1 antitelo koje se testira iz ovog pronalaska je kovalentno povezano na CM5 (GE) čip korišćenjem standardnog postupka amino spajanja. Zatim je serija gradijentnih koncentracija PD-1 His protein (Beijing Sino Biological Inc.), razblaženih u istom puferu, ubačena u svaki ciklus sukcesivno. Posle toga, uzorci su regenerisani sa regenerisanim reagensom u tom kompletu. Kinetika vezivanja atnitela na antigen je praćena tokom 3 minuta i kinetika razdruživanja je praćena tokom 10 minuta. Dobijeni podaci su analizirani softverom GE’s BIAevaluation korišćenjem modela vezivanja 1:1 (Langmuir). Ka (kon), kd (koff) i KD vrednosti određene ogledom su pokazane u sledećoj tabeli.

[0096] Rezultati su pokazali da je vrednost Kd vezivanja antitela mAb005 na PD-1 dostigla do 3,57 nM.

Primer 6 In vitro testa citologije

[0097] Ogled proliferacije na svežim mononuklearnim ćelijama humane periferne krvi (PBMC) je bio pod uticajem antitela je korišćen da bi se detektovala aktivnost ćelije antitela mAb005.

[0098] Gustina svežih humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) je podešena na

1

2x106/ml, zasejanih na ploču sa 6 pregrada sa 2ml/pregradi, i inkubiranih tokom 6 sati na 37 °C, 5%CO2. Posle suspenzije ćelije su uklonjene, svaka pregrada ćelija koje su se vezale je pomešana sa 2 ml RPMI1640 podloge koja sadrži 100 ng/ml GM-CSF (biološki faktor koji stimuliše koloniju granulocita) i 100 ng/ml IL- 4, i još 1 ml RPMI1640 podloge koja sadrži 100 ng/ml GM-CSF i 100 ng/ml IL-4 posle inkubacije tokom 2 dana, zatim su ćelije kontinualno kultivisane tokom 2 dana, posle čega je usledilo dodavanje 100 ng/ml TNF- α (faktora ’a’ nekroze tumora) u svakoj pregradi, i kultivisane još 2 dana da bi se dobile zrele dendritske ćelije. Dendritske ćelije i alogene T ćelije su prema opisanom redosledu centrifugirane i ponovo suspendovane u koncentraciji od 1 X 10<6>/ml i 1 X 10<5>/ml, i pipetama raspoređene na ploču sa 96 pregrada sa 100 µl/pregradi,posle čega je usledilo dodavanje 20 µl/pregradi antitela koje je razblaženo do različitih gradijenata koncentracije sa PBS, i ćelije su kultivisane u 37 °C, 5% CO2inkubatoru tokom 5 dana. Posle toga, 100 µl kultura ćelije je uzorkovana da bi se detektovala proliferacija ćelije sa CellTiter-Glo® Luminescent kompletom za utvrđivanje održivosti ćelije. Rezultat je prikazan na Slici 1, pokazuje da PD-1 antitelo koje se ispituje mAb005 može delotvorno da stimuliše proliferaciju mononuklearnih ćelija humane periferne krvi, sa EC50od 83 ng/ml. Preostali uzorak je detektovan za lučenje citokina IFN- γ. Rezultat je prikazan na Slici 2, koja pokazuje da bi PD-1 antitelo koje se testira mAb005 moglo da stimuliše PBMC proliferaciju, i da delotvorno stimuliše izlučivanje citokina IFN- γ u isto vreme, sa EC50od 13 ng/ml.

Primer 7: Humanizacija mišjeg antitela

[0099] Sa pozivom na sekvence promenljivog regiona lakog lanca (mAb005 LCVR, SEK ID BR: 10) i promenljivog regiona teškog lanca (mAb005 HCVR, SEK ID BR: 9) mAb005 antitela, izabrani su humanizovani predlošci koji su najbolje odgovarali svojim ne-CDR u bazi podataka Germline. Predložak teškog lanca antitela je IgHV3-7/JH6, selektovanje za FR1, FR2, FR3 od lakog lanca humane klicine linije IGKV1-39 i FR4 od JK4, sa sekvencom od SEK ID BR: 13; predložak lakog lanCa je IGKV1-39/JK4, selektovanje za FR1, FR2, FR3 od lakog lanca humane klicine linije IGKV1-39, i FR4 od JK4, sa sekvencom od SEK ID BR: 14.

[0100] Predložak teškog lanca humane klicine linije (SEK ID BR: 13):

[0101] Predložak lakog lanca humane klicine linije (SEK ID BR: 14):

2

[0102] CDR mišjeg antitela je nakalemljen na izabrani predložak humanizacij, kao zamena CDR humanog predloška, i zatim je rekombinovan sa IgG4 konstantnim regionom da bi se dobilo humanizovano antitelo H005-1. Posle toga, na osnovu trodimenzionalne strukture mišjeg antitela, umetnuti ostaci, ostaci koji su direktno interreagovali sa CDR, i ostaci koji su značajno uticali na konformaciju promenljivih lakih (VL) i promenljivih teških (VH) su povratno mutirani da bi se dobila humanizovana antitela H005-2, H005-3, i H005-4, sekvence su kao u nastavku.

Ekspresija antitela

[0103]

H005-1 HC

H005-1 LC

[0104] HC sekvenca humanizovanog antitela H005-1 sa nakalemljenim mišjim CDR je (SEK ID BR: 11), LC sekvenca humanizovanog antitela je (SEK ID BR: 12). Mesta koja mogu da utiču na aktivnost antitela su podvrgnuta tačkastim mutacijama, sekvence su kao u nastavku:

[0105] cDNK su sintetisane prema sekvencama amino kiseline lakog lanca i teškog lanca svakog humanizovanog antitela (SEK BR 11, SEK BR 12 i njihove varijante). Pošto su cDNK razgrađene sa XhoI i BamHI, ti dobijeni cDNK fragmenti su umetnuti u pcDNA3.1 vektore ekspresije (Life Technologies kat. br.V790-20) i BamHI/XhoI mesta restrikcije. Vektori ekspresije i reagens transfekcije PEI (Polysciences, Inc. kat. br.23966) su korišćeni da transfektuju HEK293 ćelije (Life Technologies kat. br. 11625019) na 1:2, i transfektovane ćelije su inkubirane u CO2inkubatoru tokom 4-5 dana. Izražena antitela su oporavljena centrifugiranjem, i prečišćena prema uobičajenom postupku da bi se dobila humanizovana antitela iz ovog pronalaska.

Primer 8: Podaci o aktivnosti humanizovanog antitela

[0106] Humanizovana antitela su podvrgnuta ELISA ogledu vezivanja (postupak je isti kao postupak iz Primera 2), ogled blokiranja vezivanja liganda (postupak je isti kao u Primeru 2), i eksperiment kinetike afiniteta (postupak je isti kao u Primeru 5) in vitro. Rezultati su prikazani u sledećoj tabeli:

[0107] Rezultat je pokazao da su humanizovana antitela H005-1, H005-2, H005-3 i H005-4 zadržala PD-1 aktivnost vezivanja, sa vrednostima kinetke afiniteta KD od 2,79, 2,98, 2,45 i 3,89 nM prema opisanom redosledu. Istovremeno, sva humanizovana antitela su delotvorno ispoljila aktivnost blokiranja protiv PD-L1/PD-1 putanje.

Primer 9: Inhibicija rasta ćelije tumora pomoću PD-1 antitela

1. Eksperimentalni materijali:

[0108]

U87MG ćelije (ćelije glioma) kupljene od Banke ćelija Kineske akademije nauka

(Chinese Academy of Sciences Cell Bank), kat. TCHu138; PBMCs (mononuklearne ćelije periferne krvi) kupljene iz Šangajskog centra za krv (Shanghai Blood Center);

CD3: kupljene iz laboratorije Miltenyi Biotec kat br.130-093-387;

CD28: kupljene iz laboratorije Miltenyi Biotec kat br.130-093-375;

Komplet 8 za prebrojavanje ćelije: dostupan kod DOJINDO LABORATORIES, kat br. CK04;

mIgG (negativna kontrola): kupljen iz SANTA CRUZ kat br. sc-2025; upotrebom doze od 1660 ng/ml.

2. Eksperimentalni postupci:

[0109]

1) U87MG ćelije su kultivisane u EMEM podlozi koja sadrži 10% FBS i 1% P/S , inkubirane u ploči sa 96 pregrada, 1 X 10<4>ćelija po pregradi.

2) H005-1 antitelo je razblaženo do gradijenata različite koncentracije (prikazano u apscisi sa Sl.3) sa PBS, dodato u ploču sa 96 pregrada sa 10 µl/pregadi, i inkubirano u 37°C, 5% CO2inkubatoru tokom 4 sata.

3) Posle vezivanja ćelije, 80 ul od PBMC ćelijske suspenzije je dodato u svaku preradu sa gustinom ćelije od 2 X 10<4>ćelija/pregadi, i 10 µl od CD3 antitela i CD28 antitela su dodati u svaku pregadu, finalne koncentracije CD3 i CD28 antitela su bile obe 500 ng/ml.

4) Posle 72 sata inkubacije u 37°C, 5% CO2inkubatoru, 10 µl od CCK8 je dodato u svaku pregadu za razvoj, posle 2 sata, OD450 je utvrđen.

3. Rezultat:

[0110] Rezultat je prikazan na slici 3, upoređen sa mIgG (negativna kontrola), različite koncentracije PD-1 antitela (H005-1) su imale značajno inibitorno dejstvo na U87MG rast ćelije, i stopa inhibicije pri najvišoj koncentaciji je bila oko 30%.

Primer 10: Aktivnost H005-1 na proliferaciju tuberkulinom stimulisan PBMC

[0111] Detektovana je in vitro aktivnost humanizovanog antitela H005-1 na proliferaciju tuberkulinom stimulisanih PBMC ćelija.

[0112] U 15 ml svežih PBMC, oko 3 X 10<7>ćelija, su dodate 20 µl tuberkulina (Shanghai BiYou Biotechnology, kat#97-8800) i mešavina su inkubirani tokom 5 dana na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru.6. dana, kultivisane ćelije su centrifugirane, i ponovo suspendovane u svežoj podlozi

2

sa gustinom podešenom na 5 X10<5>ćelija/ml.190 µl ponovo suspendovanih ćelija je stavljeno u svaku pregradu ploče sa 96 pregrada. Humanizovano antitelo H005-1 je dodato u odgovarajuće pregade ploče sa 96 pregada sa 10 µl/pregradi. Kontrolna grupa i prazna grupa su dodate sa 10 µl od PBS. Ploča sa kulturom ćelije je inkubirana na 37 °C, 5% CO2u inkubatoru, i 72 sata kasnije, PBMC Proliferation (Promega, kat # G7571) i IFN- γ izlučivanje (Neo Bioscience, kat # EHC102g) su određeni. Rezultati su bili kao u nastavku:

Dejstvo aktivacije uzorka za testiranje na tuberkulinom stimulisanoj PBMC proliferaciji i IFN- γ izlučivanju

[0113] Rezultati eksperimenta su pokazali da antitelo H005-1 odlično aktivira eksogenim tuberkulinom stimulisanu PBMC proliferaciju i IFN- γ izlučivanje.

Primer 11: Inhibicija potkožno inokulisanog U-87MG tumora pomoću H005-1

[0114] 100 ul od U87 ćelija (5 X 10<6>ćelija) je potkožno vakcinisano u desno rame SCID-bež miševa. Kada je tumor porastao do 80-100 mm<3>posle 7 do 10 dana, SCID-bež miševi, udaljavanje onih koji su prevelike ili premalene telesne težine ili tumorom nasumično podeljenim H005-110 mg/kg grupa i grupa sa humanim IgG 10 mg/kg prema zapremini tumora svaka grupa ima sedam miševa (D0). Dve vrste PBMC stimulisane CD3 antitelo tokom 3 dana su mešane u odnosu od 1:1, i ubrizgane u tkiva tumora sa 5 X 10<5>ćelija/60 ul, međutim, antitelo koje se ispituje je ubrizgano potkožno, jednom na 7 dana za ukupno 3 doze. Miševima je izmerena zapremina tumora i izmereni su dva puta nedeljno. Podaci su zabeleženi. Zapremina tumora (V) je izračunata kao: V=1/2 X a X b2, pri čemu su a i b predstavljali dužinu i širinu, prema opisanom redosledu.

[0115] Rezultat je prikazan na Slici 4: promena zapremine tumora posle lečenja, i Slici 5: promena težine miševa posle lečenja, što ukazuje da su ta antitela H005-1 odlično inhibirala U87MG rast tumora, i da nisu imala dejstvo na telesnu težinu miševa.

2

�

2

�

1

2

�

Claims

Patentni zahtevi

1. PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen, obuhvata:

promenljivi region teškog lanca koji obuhvata HCDR1, HCDR2 i HCDR3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 3, SEK ID BR: 4 i SEK ID BR: 5, prema opisanom redosledu

2. PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je to antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen himerno antitelo.

3. PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen prema patentnom zahtevu 2, pri čemu promenljivi region lakog lanca obuhvata sekvencu amino kiseline iznetu u SEK ID BR:10 i promenljivi region teškog lanca obuhvata sekvencu amino kiseline iznetu u SEK ID BR:9.

4. PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je to antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen humanizovano antitelo.

5. PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen prema patentnom zahtevu 4, pri čemu:

promenljivi region teškog lanca obuhvata okvirne (FR) regione teškog lanca koji odgovaraju FR1, FR2 i FR3 od IgHV3-7 i FR4 od JH6, od kojih je svaki izveden iz kombinovane sekvence teških lanaca humane klicine llinije prikazanih u SEK ID BR:13; i

promenljivi region lakog lanca obuhvata FR regione lakog lanca koji odgovaraju FR1, FR2 i FR3 od IGKV 1-39 i FR4 od JK4, od kojih je svaki izveden iz kombinovane sekvence lakih lanaca humane klicine linije prikazanih na SEK ID BR:14.

6. PD-1 antitelo ili njegov fragment koji se vezuje na antigen prema patentnom zahtevu 4, obuhvata:

teški lanac koji obuhvata sekvencu amino kiseline iznetu u SEK ID BR:11; i

laki lanac koji obuhvata sekvencu amino kiseline iznetu u SEK ID BR:12.

7. DNK molekul koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6.

8. Vektor ekspresije koji obuhvata DNK molekul prema patentnom zahtevu 7.

9. Ćelija domaćin transformisana sa vektorom ekspresije prema patentnom zahtevu 8.

10. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je ćelija domaćin bakterija.

11. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je ćelija domaćin kvasac.

12. Farmaceutska supstanca koja obuhvata PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, razblaživač ili nosač.

13. PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, ili farmaceutska supstanca prema patentnom zahtevu 12 za upotrebu za lečenje kancera.

14. PD-1 antitelo ili fragment koji se vezuje na antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, ili farmaceutska supstanca prema patentnom zahtevu 12 za upotrebu za lečenje kancera dojke, kancera pluća, kancera želuca, kancera creva, kancera bubrega, melanoma ili nesitnoćelijskog raka pluća.