RS60394B1 - Il-18 vezujući molekuli - Google Patents

Il-18 vezujući molekuli

Info

Publication number
RS60394B1
RS60394B1 RS20200663A RSP20200663A RS60394B1 RS 60394 B1 RS60394 B1 RS 60394B1 RS 20200663 A RS20200663 A RS 20200663A RS P20200663 A RSP20200663 A RS P20200663A RS 60394 B1 RS60394 B1 RS 60394B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
fragment
chain variable
isolated
Prior art date
Application number
RS20200663A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Otto Bardroff
Barbara Brannetti
Emma Michelle Campbell
Beate Diefenbach-Streiber
Adina Eberth
Christian Carsten Silvester Kunz
Sylwia Marshall
Jean-Michel Rene Rondeau
Jean-Marc Alfred Schlaeppi
Heeke Gino Anselmus Van
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49596347&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60394(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of RS60394B1 publication Critical patent/RS60394B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se bavi vezujućim molekulima, konkretnije imunoglobulinima poput antitela ili njihovih fragmenata, koji se vezuju sa citokinskim Interleukinom 18 (IL-18), ali ne vezuju IL-18 u kompleksu sa endogenim inhibitorom Interleukin 18 vezujućeg proteina (IL-18BP). Predmetni pronalazak se takođe bavi polinukleotidom koji kodira navedene vezujuće molekule, farmaceutskim kompozicijama koje sadrže navedene vezujuće molekule, postupcima lečenja i/ili prevencije bolesti korišćenjem navedenih vezujućih molekula. Ostali aspekti, predmeti i prednosti navedenog pronalaska biće jasni iz opisa u nastavku.
Pozadina pronalaska
[0002] Interleukin-18 (IL-18) je prvobitno opisan 1989. godine kao faktor faktor indukcije interferona gama (IGIF). IL-18 je povezan sa porodicom IL-1, i strukturno je povezan sa IL-1β (Okamura H i sar. (1995) Nature; 378:88-91). IL-18 primarno proizvode makrofagi i T ćelije kao prekursorski protein (pro-IL-18), i luče ga kao aktivni protein nakon cepanja putem kaspaze-1 (Dinarello CA i sar. (1999) J Allergy Clin Immunol; 103:11-24). U normalnoj fiziologiji IL-18, u sinergiji sa IL-12, povezuje se sa indukovanjem ćelijski posredovanog imuniteta nakon infekcije putem mikrobioloških proizvoda, kao što je lipopolisaharid (LPS) (Sareneva T i sar. (2000) J Immunol; 165(4):1933-8). Nakon stimulacije sa IL-18, ćelije prirodne ubice (NK) i T ćelije otpuštaju citokin interferon gama (INF-γ) koji igra važnu ulogu u aktivaciji makrofaga i drugih ćelija. IL-18 takođe ima različite funkcije pored sposobnosti da indukuje interferon gama. Ova biološka svojstva uključuju aktivaciju NF-κB, ekspresiju Fas liganda, indukciju CC i CXC hemokina i povećanu proizvodnju kompetentnog virusa humane imunodeficijencije. Usled sposobnosti IL-18 da indukuje proizvodnju INF-γ u T ćelijama i makrofagima, on igra važnu ulogu u imunskim odgovorima Th1-tipa i učestvuje i u urođenom i u stečenom imunitetu.
[0003] IL-18 se vezuje sa velikim afinitetom i šalje signal kroz receptor IL-18 (IL-18R), heteromerni kompleks alfa i beta lanaca kodiranih putem gena IL18R1, odnosno IL18RAP (Torigoe K i sar. (1997) J Biol Chem; 272(41):25737-42). Biološka aktivnost IL-18 je negativno regulisana putem IL-18 vezujućeg proteina (IL18BP), visoko specifičnog inhibitora koji se javlja u prirodi. Ovaj rastvorljivi protein gradi kompleks sa slobodnim IL-18, čime sprečava njegovu interakciju sa receptorom IL-18, i tako neutrališe i inhibira njegovu biološku aktivnost (Dinarello CA (2000) Ann Rheum Dis; 59 Suppl 1:i17-20). IL-18BP je protein koji se konstitutivno luči sa velikim afinitetom vezivanja za IL-18. Alternativne varijante splajsovanja mRNK IL-18BP daju četiri izooblika. Istaknuti „a“ izooblik je prisutan u serumu zdravih ljudi sa 20-strukim molarnim viškom u poređenju sa IL-18 (Dinarello i Kaplanski (2005) Expert Rev Clin Immunol, 1(4), 619-632).
[0004] Osim što ima fiziološku ulogu, pokazano je da IL-18 ublažava mnoštvo autoimunskih i inflamatornih oboljenja. Pokazano je da je ekspresija IL-18 ushodno regulisana kod nekoliko autoimunskih oboljenja, kao što je Kronova bolest, psorijaza, reumatoidni artritis, multipla skleroza i kardiovaskularne bolesti (Braddock i sar. (2004) Expert Opin Biol Ther; 4(6):847-860). IL-18 je takođe ushodno regulisan kod određenih inflamatornih bolesti poput hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP) (Imaoka i sar. (2008) Eur Respir; J31:287-297), idiopatske pulmonarne fibroze (IPF) (Kitasato i sar. (2004) Am J Resp Cell Mol Biol; 31:619-625), sindroma aktivacije makrofaga (MAS) (Dinarello i Kaplanski (2005) Expert Rev Clin Immunol; 1(4): 619-632), Stilove bolesti odraslih (AOSD) (Arlet JB i sar. (2006) Ann Rheum Dis 65(12):1596-601) i sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (SJIA) (Akashi i sar. (1994) Br J Haematol; 87(2):243-50).
[0005] Skorašnje studije su pokazale velike količine IL-18 i INF-γ kod nasleđenih i stečenih oblika hemofagocitne limfohistiocitoze (HLH). HLH je okarakterisana aktiviranim limfocitima i histiocitima koji luče velike količine inflamatornih citokina (Janka GE i sar. (2007) Eur J Paediatr; 166:95-109) i oslabljenom funkcijom NK ćelija i citotoksičnih T-ćelija. Najbitnije, pokazano je da su oba oblika okarakterisana disregulacijom IL-18 (Mazodier i sar. (2005) Immunobiology 106(10):3483-89).
[0006] Razvijanje terapeutskih molekula za ciljeve poput IL-18 koji su regulisani prirodnim inhibitorima može biti veoma izazovno. Prisustvo povećane količine sistemskog ili lokalnog ukupnog IL-18 ne odražava uvek nivo biološki aktivnog proteina (IL-18 bez IL-18BP).
[0007] Terapeutsko jedinjenje koje vezuje i slobodni IL-18 i IL-18 u kompleksu sa IL-18BP, iako je potencijalno sposobno da neutrališe aktivnost IL-18, bilo bi potrebno u većoj dozi nego ono koje može selektivno da vezuje samo biološki aktivni slobodni IL-18. Terapeutska jedinjenja koja moraju da se primenjuju u velikoj dozi mogu dovesti do izraženijih neželjenih dejstava ili postati imunogena. Velike doze takođe znače velike troškove proizvodnje.
[0008] WO 2012/085015 otkriva izolovani molekul antitela za humani IL-18 koji se specifično vezuje za epitop humanog IL-18 koji se u potpunosti ili delimično preklapa sa mestom vezivanja IL-18BP na humanom IL-18, i koji se takmiči sa IL-18BP u pogledu vezivanja za IL-18.
[0009] Terapeutska jedinjenja koja se takmiče za IL-18 kada su vezana za IL18BP mogu da poremete delikatnu ravnotežu slobodnog/aktivnog IL-18 i IL-18 vezanog za IL-18BP/neaktivnog koja postoji kod pacijenata pogođenih bolestima/poremećajima okarakterisanim disregulacijom IL-18.
[0010] Najzad, ispitivanje bolesti okarakterisanih disregulacijom slobodnog IL-18, u odsustvu dijagnostičkog alata sposobnog da detektuje i/ili izmeri IL-18 bez IL-18BP kao komponentu ukupnog IL-18, bilo bi veoma teško.
Rezime pronalaska
[0011] Pronalazak je izložen u priloženom skupu zahteva. Otelotvorenja i/ili primeri sledećeg opisa koji nisu pokriveni priloženim zahtevima ne smatraju se delom predmetnog pronalaska.
[0012] U jednom aspektu, predmetni pronalazak stoga obezbeđuje vezujući molekul koji je izolovano potpuno humano ili himerno antitelo, ili njegov fragment koji specifično vezuje IL-18, ali ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein, pri čemu izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 14 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 16.
[0013] Ovde je objavljen vezujući molekul koji se vezuje za epitop IL-18 na IL-18 kao što je definisan u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu epitop sadrži aminokiseline Arg140 i Glu152.
[0014] Prema otkriću, epitop može dalje da sadrži bilo koju pojedinačnu, ili više aminokiselina Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ili Glu177.
[0015] Prema otkriću, epitop može dalje da sadrži bilo koju pojedinačnu, ili više aminokiselina Lys89, Arg94, Met96, Phe138, Ser141, Gly144, His145, Asp146, Gln150 ili Leu180.
[0016] U drugom otelotvorenju ovog aspekta, vezujući molekul se ne takmiči sa IL-18BP za vezivanje IL-18 kada je IL-18BP vezan za IL-18.
[0017] U drugom otelotvorenju ovog aspekta, vezujući molekul vezuje IL-18, pri čemu IL-18 sadrži od aminokiseline 37 do aminokiseline 193 sekvence SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2.
[0018] U drugom otelotvorenju ovog aspekta, vezujući molekul inhibira proizvodnju interferona gama (INF-γ) zavisnu od IL-18.
[0019] U drugom otelotvorenju ovog aspekta, vezujući molekul vezuje IL-18 sa KDod 100 pM ili manje.
[0020] U drugom otelotvorenju ovog aspekta, vezujući molekul prema pronalasku je izolovano potpuno humano, humanizovano ili himerno antitelo ili njegov fragment, poželjno, izolovano potpuno humano antitelo.
[0021] U drugom otelotvorenju ovog aspekta, vezujući molekul je fragment antitela, poželjno Fab, Fab', F(ab')2ili scFv.
[0022] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano ili bispecifično antitelo ili njegov fragment koji sadrži prvu specifičnost za IL-18 i drugu specifičnost za drugi polipeptid, npr. IL-12 ili IL-1β.
[0023] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo koje sadrži mutirani ili hemijski modifikovani Fc region aminokiseline, pri čemu mutirani ili hemijski modifikovani Fc region aminokiseline sprečava ili smanjuje ADCC aktivnost i/ili produžava poluživot u poređenju sa Fc regionom divljeg tipa. Poželjno, mutirani ili hemijski modifikovani Fc region aminokiseline je utišani Fc region IgG1.
[0024] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i. varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante, i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11 ili SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 13 ili njene konzervativne varijante, i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante, i
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante, i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante, i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
[0025] Poželjno, kako je ovde otkriveno, antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni region teškog lanca H-CDR 2 koji sadrži SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 13.
[0026] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 16 ili SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante.
[0027] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 14 ili SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 25 ili SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 31 ili SEQ ID NO: 34 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante ili
ii varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 18 ili SEQ ID NO: 37 ili SEQ ID NO: 40 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante.
[0028] Poželjno, varijabilni domen teškog lanca sadrži SEQ ID NO: 14 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen lakog lanca sadrži SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante i, opciono, aminokiselina lizin (Lys; K) na poziciji 30 u odnosu na SEQ ID NO:14 je zamenjena aminokiselinom izabranom od asparagina (Asn; N) ili serina (Ser; S) ili treonina (Thr; T) ili alanina (Ala; A) ili glutamata (Glu; E) ili histidina (His; H) ili leucina (Leu; L) ili glutamina (Gln; Q) ili arginina (Arg; R) ili valina (Val; V) ili tirozina (Tyr; Y) ili izoleucina (Ile; I).
[0029] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 18 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante.
[0030] U drugom otelotvorenju pronalaska, izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 43 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 45.
[0031] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo koje vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 43 ili SEQ ID NO: 47 ili SEQ ID NO: 50 ili SEQ ID NO: 56 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 45 ili njene konzervativne varijante ili
ii. teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 53 ili SEQ ID NO: 100 ili SEQ ID NO: 158 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 160 ili njene konzervativne varijante.
[0032] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo koje vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i. teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 43 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 45 ili njene konzervativne varijante ili
ii. teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 158 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 160 ili njene konzervativne varijante.
[0033] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i. varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 74 ili njene konzervativne varijante, i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 75 ili SEQ ID NO: 76 ili SEQ ID NO: 77 ili SEQ ID NO: 78 ili njene konzervativne varijante, i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 79 ili njene konzervativne varijante, i
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 80 ili njene konzervativne varijante, i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 81 ili njene konzervativne varijante, i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 82 ili njene konzervativne varijante.
[0034] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 85 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 83 ili SEQ ID NO: 87 ili SEQ ID NO: 90 ili SEQ ID NO: 93 ili njene konzervativne varijante.
[0035] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo koje vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 96 ili SEQ ID NO: 103 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 98 ili njene konzervativne varijante.
[0036] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i. varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 106 ili njene konzervativne varijante, i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 107 ili SEQ ID NO: 122 ili njene konzervativne varijante, i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 108 ili njene konzervativne varijante, i
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 109 ili njene konzervativne varijante, i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 110 ili njene konzervativne varijante, i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 111 ili SEQ ID NO: 126 ili njene konzervativne varijante.
[0037] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i. varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 106 ili njene konzervativne varijante, i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 107 ili njene konzervativne varijante, i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 108 ili njene konzervativne varijante, i
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 109 ili njene konzervativne varijante, i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 110 ili njene konzervativne varijante, i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 111 ili njene konzervativne varijante.
[0038] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 112 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 114 ili njene konzervativne varijante ili
ii varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 138 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 140 ili njene konzervativne varijante.
[0039] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i. teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 116 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 118 ili njene konzervativne varijante ili
ii. teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 142 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 144 ili njene konzervativne varijante.
[0040] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), a izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže:
i. varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 120 ili njene konzervativne varijante, i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 121 ili njene konzervativne varijante, i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 123 ili njene konzervativne varijante, i
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 124 ili njene konzervativne varijante, i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 125 ili njene konzervativne varijante, i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 127 ili SEQ ID NO: 128 ili SEQ ID NO: 129 ili njene konzervativne varijante.
[0041] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 130 ili njene konzervativne varijante i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 132 ili SEQ ID NO: 147 ili SEQ ID NO: 153 ili njene konzervativne varijante.
[0042] Ovde je takođe otkriven vezujući molekul, pri čemu je vezujući molekul izolovano antitelo koje vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i izolovano antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 134 ili njene konzervativne varijante i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 136 ili SEQ ID NO: 150 ili SEQ ID NO: 156 ili njene konzervativne varijante.
[0043] U drugom aspektu, obezbeđen je izolovani polinukleotid koji kodira vezujući molekul prema pronalasku.
[0044] U jednom otelotvorenju ovog drugog aspekta, izolovani polinukleotid prema pronalasku sadrži
SEQ ID NO: 15 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 17 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 15 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; i SEQ ID NO: 17 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 44 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 46 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 44 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; i SEQ ID NO: 46 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična.
[0045] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca, pri čemu, polinukleotid:
i. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 38 ili SEQ ID NO: 41 ili SEQ ID NO: 84 ili SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 91 ili SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 113 ili SEQ ID NO: 131 ili SEQ ID NO: 139 ili SEQ ID NO: 146 ili SEQ ID NO: 152; ili
ii. sadrži SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 38 ili SEQ ID NO: 41 ili SEQ ID NO: 84 ili SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 91 ili SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 113 ili SEQ ID NO: 131 ili SEQ ID NO: 139 ili SEQ ID NO: 146 ili SEQ ID NO: 152; ili
iii. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 38 ili SEQ ID NO: 41 ili SEQ ID NO: 84 ili SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 91 ili SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 113 ili SEQ ID NO: 131 ili SEQ ID NO: 139 ili SEQ ID NO: 146 ili SEQ ID NO: 152.
[0046] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca, pri čemu, polinukleotid:
i. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 36 ili SEQ ID NO: 39 ili SEQ ID NO: 42 ili SEQ ID NO: 86 ili SEQ ID NO: 89 ili SEQ ID NO: 92 ili SEQ ID NO: 95 ili SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 133 ili SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 148 ili SEQ ID NO: 154; ili
ii. sadrži SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 36 ili SEQ ID NO: 39 ili SEQ ID NO: 42 ili SEQ ID NO: 86 ili SEQ ID NO: 89 ili SEQ ID NO: 92 ili SEQ ID NO: 95 ili SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 133 ili SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 148 ili SEQ ID NO: 154; ili
iii. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 36 ili SEQ ID NO: 39 ili SEQ ID NO: 42 ili SEQ ID NO: 86 ili SEQ ID NO: 89 ili SEQ ID NO: 92 ili SEQ ID NO: 95 ili SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 133 ili SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 148 ili SEQ ID NO: 154.
[0047] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac, pri čemu, polinukleotid:
i. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155 ili SEQ ID NO: 159; ili
ii. sadrži SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155 ili SEQ ID NO: 159; ili
iii. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155 ili SEQ ID NO: 159.
[0048] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira laki lanac, pri čemu, polinukleotid:
i. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157 ili SEQ ID NO: 161; ili
ii. sadrži SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157 ili SEQ ID NO: 161; ili
iii. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157 ili SEQ ID NO: 161.
[0049] U drugom aspektu ovog aspekta, obezbeđen je klonirajući ili ekspresioni vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida kao što je ovde navedeno u zahtevima.
[0050] Ovde je otkriven klonirajući ili ekspresioni vektor koji sadrži najmanje jedan polinukleotid izabran iz grupe od SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 159 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155 ili SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157.
[0051] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora kao što je ovde navedeno u zahtevima.
[0052] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđena je stabilno transformisana ili transficirana ćelija domaćin koja sadrži jedan ili više polinukleotida kao što je ovde navedeno u zahtevima.
[0053] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju vezujućeg molekula, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina, kako je ovde navedeno u zahtevima, u uslovima pogodnim za proizvodnju vezujućeg molekula.
[0054] U drugom aspektu, predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutski nosač i vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP.
[0055] Poželjno, farmaceutska kompozicija prema pronalasku je u obliku primenljivom intravenski, inhalabilno ili supkutano.
[0056] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje vezujući molekul koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži taj vezujući molekul za upotrebu u terapiji.
[0057] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je vezujući molekul koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži taj vezujući molekul za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji sarkoidoze, naročito plućne sarkoidoze, hemofagocitne limfohistiocitoze (HLH), familijarne hemofagocitne limfohistiocitoze (FHL) i drugih sindroma imunodeficijencije, artritisa džinovskih ćelija (GCA), hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), Stilove bolesti odraslih (AOSD), sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (SJIA), teške astme, uveitisa, geografske atrofije, dijabetesa tip 1, dijabetesa tip 2 ili ateroskleroze i bilo koje njihove kombinacije kod pacijenta sisara.
[0058] U jednom otelotvorenju prema upotrebi predmetnog pronalaska, pacijent sisar je ljudski pacijent.
[0059] Otkriće takođe obezbeđuje kompleks koji sadrži IL-18 i vezujući molekul koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP.
[0060] Otkriće takođe obezbeđuje vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, za upotrebu u dijagnostikovanju ili za upotrebu u dijagnostičkom kompletu.
[0061] Otkriće takođe obezbeđuje vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, za upotrebu u dijagnostikovanju ili za upotrebu u detektovanju i/ili merenju prisustva i/ili količine slobodnog IL-18 (tj. IL-18 koji nije vezan za IL-18BP) u uzorku.
[0062] U još daljem aspektu predmetnog otkrića, obezbeđen je postupak za detektovanje i/ili merenje prisustva i/ili količine slobodnog IL-18 (tj. IL-18 koji nije vezan za IL-18BP) u uzorku, pri čemu je uzorak opciono ljudski uzorak, pri čemu postupak obuhvata dovođenje uzorka u kontakt sa vezujućim molekulom ili izolovanim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP.
[0063] U jednom otelotvorenju ovog aspekta, uzorak je ljudska krv.
[0064] U drugom aspektu, predmetno otkriće dalje obezbeđuje dijagnostički komplet koji sadrži vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP i/ili kompleks koji sadrži IL-18 i taj vezujući molekul, pri čemu komplet opciono sadrži prvo kontrolno jedinjenje.
[0065] U jednom otelotvorenju ovog aspekta, prvo kontrolno jedinjenje je slobodni IL-18 i komplet opciono sadrži drugo kontrolno jedinjenje koje je mišje antitelo 125-2H.
[0066] U drugom aspektu predmetnog otkrića, obezbeđeno je medicinsko ili dijagnostičko sredstvo koje sadrži vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP i/ili kompleks koji sadrži IL-18 i taj vezujući molekul.
Kratak opis slika
[0067]
Slika 1: CDR varijabilnih regiona teškog lanca ovde prikazanih antitela.
Slika 2: CDR varijabilnih regiona lakog lanca ovde prikazanih antitela.
Slika 3 (A-D): Dejstvo anti-IL-18 antitela i njihovih fragmenata iz predmetnog pronalaska na otpuštanje IFN-γ iz PBMC indukovano putem LPS/IL-12 (stimulacija nativnim IL-18). Podaci pokazuju inhibiciju zavisnu od koncentracije otpuštanja IFN-γ indukovanog nativnim IL-18 iz sveže izolovanih humanih PBMC od individualnih donora, gde svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM iz n=4 bunarčića. Nativni IL-18 je stimulisan tretmanom sa LPS/IL-12, i isprekidana linija predstavlja stepen zavisnosti od IL-18, kako je utvrđeno putem maksimalne efektivnosti humanog IL-18BPa-Fc.
Slika 4 (A-B): Dejstvo anti-IL-18 antitela i njihovih fragmenata iz predmetnog pronalaska na otpuštanje IFN-γ iz PBMC indukovano rekombinantnim IL-18. Podaci pokazuju inhibiciju zavisnu od koncentracije otpuštanja IFN-γ indukovanog rekombinantnim humanim IL-18 (1 nM) iz sveže izolovanih humanih PBMC od reprezentativnih individualnih donora, gde svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM iz n=4 bunarčića.
Slika 5 (A-C): Dejstvo anti-IL-18 antitela i njihovih fragmenata iz predmetnog pronalaska na otpuštanje IFN-γ iz KG-1 ćelija indukovano humanim IL-18. Podaci pokazuju inhibiciju zavisnu od koncentracije otpuštanja IFN-γ indukovanog rekombinantnim humanim IL-18 (1 nM) iz KG-1 ćelija, gde svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM iz n=4 bunarčića.
Slika 6 (A-C): Dejstvo anti-IL-18 antitela i njihovih fragmenata iz predmetnog pronalaska na otpuštanje IFN-γ iz KG-1 ćelija indukovano pomoću IL-18 cinomolgusa. Podaci pokazuju inhibiciju zavisnu od koncentracije otpuštanja IFN-γ indukovanog rekombinantnim IL-18 cinomolgusa (0,2 nM) iz KG-1 ćelija, gde svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM iz n=4 bunarčića.
Slika 7 (A-E): Dejstvo anti-IL-18 antitela i njihovih fragmenata iz predmetnog pronalaska na humani IL-18 indukovan putem LPS/IL-12 (stimuacija nativnog IL-18) i zatim otpuštanje IFN-γ u humanoj punoj krvi.
Slika 8 (A-E): Dejstvo anti-IL-18 antitela i njihovih fragmenata iz predmetnog pronalaska na otpuštanje IFN-γ indukovano putem humanog IL-18 u humanoj punoj krvi. Podaci pokazuju inhibiciju zavisnu od koncentracije otpuštanja IFN-γ indukovanog rekombinantnim humanim IL-18 iz pune krvi uzete od individualnih donora, gde svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM iz n=4 bunarčića.
Slika 9 (A-B): Vezivanje anti-IL-18 antitela i fragmenata za kompleks IL-18/IL-18BP. (A) Matični MOR08775 i MOR08776 ne prepoznaju kompleks IL-18/IL-18BP. U ovom eksperimentu, MOR08775 i MOR08776 su inkubirani sa biotinilovanim kompleksom IL-18/IL-18BP. (B) Eksperiment je obavljen na sličan način kako je prikazano pod A), osim što je korišćen nebiotinilovani humani IL-18. MOR03207 je anti-lizozimsko antitelo, a 125-2H je anti-IL-18 mišji IgG koji vezuje kompleks IL-18/IL-18BP.
Slika 10: Binovanje epitopa za anti-IL-18 antitela MOR8775, MOR8776 (A) i za antitela MOR9464, MOR9464_N30K, MOR10222_N30S_M54I i MOR14431 (B) Crno popunjene ćelije ukazuju na antitela koja se takmiče za sličan epitop, dok nepopunjene ćelije ukazuju da nema takmičenja.
Slika 11 (A-B): A) Struktura kompleksa IL-1β/IL-1R superponirana na model IL-18/IL-18Rα kreiran na strukturi kompleksa IL-1β/IL-1R. Sve strukture su predstavljene u vidu trake. Strukture IL-18 i IL-1β su korišćene za superponiranje. B) Model kompleksa IL-18/IL-18Rα kreiran na strukturi kompleksa IL-1β/IL-1R. IL-18Rα (dat na površinskom prikazu) sadrži tri domena slična imunoglobulinu, D1, D2 i D3. Na mestima 1 i 2 IL-18 (prikazan u vidu trake) nalaze se mesta vezivanja IL-18Rα. Mesto 3 je mesto vezivanja IL-18Rβ.
Slika 12: Poređenja relevantnih aminokiselina vezanih za IL-18.1) Sekvenca IL-18 u odnosu na SEQ ID NO:1 od aminokiseline 37 do 193. 2) iz Kim i sar. (2000) Proc Natl Acad Sci; 97(3):1190-1195 (modelovanje IL-18BP i njegov kompleks sa humanim IL-18).3) iz Krumm i sar. I, (2008) Proc Natl Acad Sci;, 2008105(52):, 20711-2071552, Tabela 1. 4) iz Kato i sar.(2003) Nature Struct. Biol.2003;, 10(11):, 966-971; ostaci uključeni u vezivanje IL-18Rα.
5) H/DxMS rezultati za MOR9464 vezan za IL-18.
Slika 13: Opšti pregled trodimenzionalne strukture kompleksa između humanog IL-18 (prikazan u Cα tragu i površini dostupnoj rastvaraču) i MOR9464_N30K (prikazano u vidu crteža).
Slika 14: (A) Poravnavanje sekvenci zrelog humanog i cinomolgusovog IL-18 (od aminokiseline 37 do 193); (B) Prostorni prikaz 6 aminokiselina koje se razlikuju između dve vrste. E177 je jedina koja je prisutna u interfejsu kompleksa antitela. IL-18 je prikazan u Cα tragu i površini dostupnoj rastvaraču, i MOR9464_N30K je prikazan u vidu crteža.
Slika 15: Prikaz u vidu trake kompleksa IL18/MOR9464_N30K superponiran na model kompleksa IL-18/IL-18Rα kreiran na strukturi kompleksa IL-1β/IL-1R. Struktura IL-18Rα je prikazana sa površinskim prikazom, i teški i laki lanci MOR9464_N30K su prikazani tamno-, odnosno svetlosivom bojom.
Slika 16: Prikaz u vidu trake humanog IL-18 vezanog za IL-18 BP iz virusa boginja (levo) i za fragment MOR9464_N30K antitela (desno) i njihovo superponiranje (centar). Preklapanje je zasnovano na strukturi IL-18. IL-18 je prikazan u Cα tragu i površini dostupnoj rastvaraču, i MOR9464_N30K i IL-18 BP iz virusa boginja su prikazani u vidu crteža.
Slika 17: Prikaz u vidu trake humanog IL-18 vezanog za fragment MOR9464_N30K antitela (desno) i za fragment mišjeg 125-2H antitela (desno) i njihovo superponiranje (centar). Preklapanje je zasnovano na strukturi IL-18. IL-18 je prikazan u Cα tragu i površini dostupnoj rastvaraču, i MOR9464_N30K i 125-2H su prikazani u vidu crteža
Slika 18: Prikaz u vidu trake humanog IL-18 vezanog za 125-2H preklopljen na IL-18 vezan za IL-18BP iz virusa boginja. Preklapanje je zasnovano na strukturi IL-18. IL-18 je prikazan u Cα tragu i površini dostupnoj rastvaraču, i MOR9464_N30K, 125-2H i IL-18BP iz virusa boginja su prikazani u vidu crteža.
Slika 19: Prikaz u vidu trake humanog IL-18 vezanog za fragment MOR9464_N30K antitela, sa ostacima epitopa i paratopa prikazanim pomoću modela veza, pokazuje specifičnu interakciju sa aminokiselinom lizinom na poziciji 30 MOR9464_N30K.
Detaljan opis pronalaska
1. Definicije
[0068] U svrhu tumačenja ove specifikacije, važiće sledeće definicije, i kad god je to moguće, termini koji se upotrebljavaju u jednini takođe će uključivati množinu, i obrnuto. Dodatne definicije su postavljene kroz detaljan opis.
[0069] Termin „IL-18“ je sinonim za IL-18 polipeptid, polipeptid interleukina-18, faktor koji indukuje IFN-gama ili faktor koji indukuje interferon gama, ili INF-γ indukujući faktor. Termin „IL-18“ odnosi se na humani IL-18 koji sadrži aminokiseline 37 do 193 sekvence SEQ ID NO: 1. U celoj ovoj specifikaciji, termin IL-18 obuhvata i pro-IL-18 (prekursor zrelog IL-18 pre cepanja proteaze) i zreli IL-18 (nakon cepanja proteaze), osim ako nije naznačeno da se misli na pro- ili zreli oblik.
[0070] Termin „IL-18“ se odnosi na IL-18 majmuna cinomolgus koji sadrži aminokiseline 37 do 193 sekvence SEQ ID NO:2.
[0071] Termin „antitelo“ se odnosi na netaknuti imunoglobulin ili njegov funkcionalni fragment. Antitela koja se javljaju u prirodi obično sadrže tetramer koji je obično sastavljen od najmanje dva teška (H) lanca i najmanje dva laka (L) lanca. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca, obično sastavljenog od tri domena (CH1, CH2 i CH3). Teški lanci mogu biti bilo kog izotipa, uključujući IgG (podtipovi IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), IgA (podtipovi IgA1 i IgA2), IgM i IgE. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno VL) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Laki lanac uključuje kapa lance i lambda lance. Varijabilni region teškog i lakog lanca je obično odgovoran za prepoznavanje antigena, dok konstantni region teškog i lakog lanca može posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa. VH i VL regioni se mogu dalje dodatno podeliti u regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), prošarane regionima koji su više očuvani, nazvani regioni okvira (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, poređana od amino terminusa do karboksi terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom.
[0072] Termin „antigen-vezujući deo“ antitela (ili prosto „antigenski deo“), kako se ovde koristi, odnosi se na kompletnu dužinu ili jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za IL-18. Pokazalo se da antigen-vezujuću funkciju antitela mogu da obavljaju fragmenti antitela kompletne dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom „antigen-vezujući deo“ antitela uključuju Fab fragment, jednovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; F(ab)2 fragment, dvovalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na regionu šarke; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jedne grane antitela; dAb fragment (Ward i sar. (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR).
[0073] Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu formirani kao jednolančani protein u kome se VL i VH regioni uparuju i grade jednovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr. Bird i sar. (1988) Science 242:423-426; i Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sc;. 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela takođe treba da budu obuhvaćena u okviru termina "antigenvezujući deo" antitela. Ti fragmenti antitela su pribavljeni putem uobičajenih tehnika poznatih stručnjacima za ovu oblast, i fragmenti su podvrgnuti skriningu za korisnost na isti način kao i netaknuta antitela.
[0074] Termin „izolovano“ u celoj ovoj specifikaciji znači da imunoglobulin, antitelo ili polinukleotid, u zavisnosti od slučaja, postoji u fizičkoj sredini različitoj od one koja se može javiti u prirodi.
[0075] Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid IL18 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su molekuli IL18 drugih vrsta (npr. IL-18 majmuna cinomolgus (cm)). Štaviše, izolovano antitelo može biti u velikoj meri slobodno od drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.
[0076] U celoj ovoj specifikaciji, regioni za određivanje komplementarnosti („CDR“) definisani su u skladu sa Kabatovom definicijom, osim ako nije naznačeno da su CDR definisani u skladu sa Čotijinom definicijom, ili obe definicije. Kabatova definicija je standard za numerisanje ostataka u antitelu, i obično se koristi za identifikovanje CDR regiona (Kabat i sar. (1991), 5. izdanje, NIH publikacija br. 91-3242). Čotijina definicija je slična Kabatovoj definiciji, ali uzima u obzir pozicije određenih strukturnih petlji (Chothia i sar. (1987) J. Mol. Biol., 196:901-17; Al-Lazikani i sar. (1997) J.Mol.Biol.273:927-948).
[0077] Prema dogovoru, CDR regioni u teškom lancu se obično nazivaju H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3, a u lakom lancu L-CDR1, LCDR2 i L-CDR3. Redom su numerisani u smeru od amino terminusa do karboksi terminusa.
[0078] Termini "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskih antitela" kako se ovde koristi označava pripremu molekula antitela iz jedne molekulske kompozicije. Kompozicija monoklonskog antitela ispoljava pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet prema konkretnom epitopu.
[0079] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, treba da obuhvata antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su i regioni okvira i CDR-i dobijeni od sekvenci humanog porekla. Nadalje, ukoliko antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe dobijen od takvih humanih sekvenci, npr. sekvenci humane germinativne linije, ili mutirane verzije sekvenci humane germinativne linije, ili antitelo koje sadrži konsenzusne sekvence okvira dobijene iz analize humanih sekvenci okvira, kako je opisano u Knappik i sar. (2000) J Mol Biol 296:57-86).
[0080] Humana antitela iz otkrića mogu da uključe ostatke aminokiselina koji nisu kodirani humanim sekvencama (npr. mutacije uvedene nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, ne treba da uključi antitela u kojima su CDR sekvence dobijene od germinativne linije drugih vrsta sisara, kao što je miš, graftovane na humane sekvence okvira.
[0081] Termin "humano monoklonsko antitelo" se odnosi na antitela koja pokazuju jedinstvenu specifičnost vezivanja koja imaju varijabilne regione u kojima su i regioni okvira i CDR dobijeni od humanih sekvenci.
[0082] Termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, obuhvata sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, nastaju ili izoluju rekombinantnim postupcima, kao što su antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna za humane imunoglobulinske gene ili iz njih pripremljen hibridom, antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira humano antitelo, npr. iz transfektoma, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela, i antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, nastaju ili izoluju bilo kojim drugim putem koji uključuje splajsovanje celog ili dela sekvence gena humanog imunoglobulina. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR dobijeni od imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije. Međutim, u nekim otelotvorenjima, takva rekombinantna humana antitela mogu biti podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi sekvenca životinje koja je transgena za humani IgG, in vivo somatskoj mutagenezi) i tako su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela sekvence koje, iako su dobijene od sekvenci VH i VL humane germinativne linije i srodne su njima, ne moraju prirodno postojati u repertoaru germinativne linije humanog antitela in vivo.
[0083] Fraze "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" ovde se koriste kao sinonimi termina "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".
[0084] Kako se ovde koristi, vezujući molekul koji se „specifično vezuje za IL-18“ treba da označava vezujući molekul koji se vezuje za humani IL-18 sa KDod 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje.
[0085] Vezujući molekul koji „unakrsno reaguje“ sa antigenom osim IL-18 treba da označava vezujući molekul koji vezuje taj antigen sa KDod 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje. Vezujući molekul koji „ne reaguje unakrsno sa konkretnim antigenom“ treba da označava vezujući molekul koji suštinski ispoljava vezivanje za ove proteine koje se suštinski ne može detektovati standardnim testovima vezivanja.
[0086] Kako se ovde koristi, termin „antagonist“ treba da označava vezujući molekul koji inhibira signalnu aktivnost zavisnu od IL-18 u prisustvu IL-18 u testu humane ćelije, kao što je test proizvodnje interferona gama (IFN-γ) zavisne od IL-18 u ćelijama ljudske krvi. Primeri testova proizvodnje IFN-γ zavisne od IL-18 u ćelijama ljudske krvi su detaljnije opisani u primerima u nastavku.
[0087] Kako se ovde koristi, antitelo koje nema „agonističku aktivnost“ treba da označava vezujući molekul koji ne povećava značajno signalnu aktivnost zavisnu od IL-18 u odsustvu i/ili prisustvu IL-18 u testu zasnovanom na ćelijama, poput testa proizvodnje IFN-γ ćelija ljudske krvi. Takvi testovi su detaljnije opisan u primerima u nastavku.
[0088] Termin „Kassoc“ ili „Ka“, kako se ovde koristi, treba da se odnosi na brzinu asocijacije konkretne interakcije vezujući molekul-antigen, dok termin „Kdis“ ili „Kd“, kako se ovde koristi, treba da se odnosi na brzinu disocijacije konkretne interakcije vezujući molekulantigen. Termin „KD“, kako se ovde koristi, treba da označava konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kdi Ka(tj. Kd/Ka), i izražava se kao molarna koncentracija (M). KDvrednosti za antitela se mogu odrediti pomoću metoda dobro poznatih u struci. Postupak za određivanje KDantitela je pomoću korišćenja površinske plazmonske rezonance, kao što je sistem Biacore®.
[0089] Kako se ovde koristi, termin „afinitet“ se odnosi na jačinu interakcije između vezujućeg molekula i antigena na jednom antigenskom mestu.
[0090] Kako se ovde koristi, termin „veliki afinitet“ za antitelo odnosi se na antitelo koje ima KDod 1 nM ili manje prema ciljnom antigenu.
[0091] Kako se ovde koristi, termin „ispitanik“ uključuje bilo kog čoveka ili nehumanu životinju.
[0092] Termin „nehumana životinja“ uključuje sve kičmenjake, npr. sisare i nesisare, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd.
[0093] Kako se ovde koristi, termin „optimizovana sekvenca nukleotida“ znači da je sekvenca nukleotida izmenjena da kodira aminokiselinsku sekvencu korišćenjem kodona koji su poželjni u proizvodnji ćelije ili organizma, generalno eukariotske ćelije, na primer, ćelije kvasca Pichia pastoris, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ljudske ćelije. Optimizovana sekvenca nukleotida je konstruisana da zadrži u potpunosti sekvencu aminokiseline koja je prvobitno kodirana polaznom sekvencom nukleotida, koja je poznata i kao „matična“ sekvenca. Ovde date optimizovane sekvence su konstruisane tako da imaju kodone koji su poželjni u CHO ćelijama sisara, međutim, optimizovana ekspresija tih sekvenci u drugim eukariotskim ćelijama je ovde takođe predviđena.
[0094] Termin „identičnost“ odnosi se na sličnost između najmanje dve različite sekvence. Ova identičnost može da se izrazi kao procenat identičnosti, i određuje se standardnim algoritmima poravnanja, na primer, Bazičnim lokalnim alatom za poravnanje (BLAST) (Altshul i sar. (1990) J Mol Biol; 215:403-410); algoritomom čiji su autori Needleman i sar. (1970) J Mol Biol; 48:444-453, ili algoritmom čiji su autori Meyers i sar. (1988) Comput Appl Biosci; 4:11-17). Set parametara može biti matrica za ocenjivanje Blosum 62, gde je kazna za prazninu 12, kazna za širenje praznine je 4, i kazna za pomeranje okvira praznine je 5. Procenat identičnosti između dve aminokiselinske ili nukleotidne sekvence može takođe da se odredi pomoću algoritma koji su dali Meyers i W. Miller, (1989) CABIOS; 4(1):1-17), a koji je uključen u program ALIGN (verzija 2.0), koristeći tabelu težine ostataka PAM 120, kaznu za dužinu praznine 12 i kaznu za prazninu 4. Procenat identičnosti se obično izračunava putem poređenja sekvenci slične dužine.
[0095] Termin "imunski odgovor" odnosi se na dejstvo, na primer, limfocita, ćelija koje prezentuju antigen, fagocita, granulocita i rastvorljivih makromolekula proizvedenih od strane gorenavedenih ćelija ili jetre (uključujući antitela, citokine i komplement) koje dovodi do selektivnog oštećenja, uništenja, ili eliminisanja iz ljudskog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kanceroznih ćelija, ili, u slučaju autoimunske ili patološke inflamacije, normalnih ljudskih ćelija ili tkiva.
[0096] "Put transdukcije signala" ili "signalna aktivnost" odnosi se na biohemijski uzročni odnos koji generalno inicira interakcija protein-protein poput vezivanja faktora rasta za receptor, koji dovodi do transmisije signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Generalno, transmisija uključuje specifičnu fosforilaciju jednog ili više ostataka tirozina, serina ili treonina na jednom ili više proteina u seriji reakcija koje uzrokuju transdukciju signala. Pretposlednji proces tipično uključuje nuklearne događaje, što dovodi do promene ekspresije gena.
[0097] Termin „neutrališe“ i njegove gramatičke varijacije u ovoj specifikaciji znači da je biološka aktivnost cilja smanjena, bilo u potpunosti ili delimično, u prisustvu vezujućeg proteina ili antitela, u zavisnosti od slučaja.
[0098] Termin „nukleinska kiselina“ ili „polinukleotid“ odnosi se na dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) ili ribonukleinsku kiselinu (RNK) i njihove polimere u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Ukoliko nije specifično ograničen, termin obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina, i metabolišu se na način sličan nukleotidima koji se javljaju u prirodi. Ako nije drugačije naznačeno, konkretna sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante (npr. supstitucije degenerativnog kodona), alele, ortologe, SNP i komplementarne sekvence, kao i eksplicitno naznačene sekvence. Specifično, supstitucije degenerativnih kodona se mogu postići generisanjem sekvenci u kojima je treći položaj jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstituisan ostacima mešovitih baza i/ili dezoksiinozina (Batzer i sar. Nucleic Acid Res.
19:5081 (1991); Ohtsuka i sar. J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); i Rossolini i sar. Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0099] Nukleotid u „polinukleotidu“ ili „nukleinskoj kiselini“ može da sadrži modifikacije, uključujući bazne modifikacije poput derivata bromuridina i inozina, modifikacije riboze poput fosforotioata, fosforoditioata, fosforoselenoata, fosforodiselenoata, fosforoanilotioata, fosforaniladata i fosforoamidata.
[0100] Termin „vektor“ označava bilo koji molekul ili entitet (npr. nukleinsku kiselinu, plazmid, bakteriofag ili virus) koji je pogodan za transformaciju ili transfekciju ćelije domaćina i sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (u vezi sa ćelijom domaćina) ekspresiju jednog ili više heterologih kodirajućih regiona koji su operativno vezani za njega.
[0101] „Konzervativna varijanta“ sekvence koja kodira vezujući molekul, antitelo ili njegov fragment odnosi se na sekvencu koja sadrži konzervativne modifikacije aminokiselina. „Konzervativne modifikacije aminokiselina“ treba da označavaju modifikacije aminokiselina koje značajno ne utiču na svojstva vezivanja antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu, ili ih ne menjaju. Takve konzervativne modifikacije uključuju aminokiselinske supstitucije, adicije i delecije. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su one u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci. Te familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Modifikacije mogu biti uvedene u vezujući protein iz otkrića putem standardnih tehnika poznatih u struci, kao što je mutageneza usmerena na mesto i PCR-posredovana mutageneza. Konzervativne aminokiselinske supstitucije takođe mogu da obuhvataju aminokiselinske ostatke koji se ne javljaju u prirodi, koji se obično inkorporišu hemijskom sintezom peptida umesto sintezom u biološkim sistemima. Aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi uključuju, ali nisu ograničene na, peptidomimetike, reversne ili inverzne oblike aminokiselinskih funkcionalnih ostataka.
[0102] Termin „epitop“ je deo antigena koji je prepoznat od strane imunskog sistema, kao što je antitelo ili njegov fragment. U okviru predmetne specifikacije, termin „epitop“ se koristi naizmenično i za konformacione epitope i linearne epitope. Konformacioni epitop je sastavljen od isprekidanih odeljaka aminokiselinske sekvence antigena, dok je linearni epitop izgrađen od neprekinute sekvence aminokiselina iz antigena.
[0103] Termin „lečiti“, „lečenje“, „tretman“, „sprečiti“, „sprečava“ ili „prevencija“ uključuje terapeutske tretmane, profilaktičke tretmane i primene u kojima se smanjuje rizik da će ispitanik razviti poremećaj ili drugi faktori rizika. Lečenje ne zahteva potpuno izlečenje poremećaja, i obuhvata smanjenje simptoma ili postojećih faktora rizika.
2. Vezujući molekuli
[0104] Termin „vezujući molekul“, kako se ovde koristi, znači bilo koji protein ili peptid koji se specifično vezuje za IL-18 polipeptid. „Vezujući molekul“ uključuje, ali nije ograničen na, antitela i njihove fragmente, kao što su imunološki funkcionalni fragmenti. Termin „imunološki funkcionalan fragment“ antitela ili lanca imunoglobulina, kako se ovde koristi, je vrsta vezujućeg proteina koji sadrži deo (bez obzira na to kako je taj deo dobijen ili sintetisan) antitela kome nedostaju barem neke aminokiseline prisutne u lancu kompletne dužine, ali koji je i dalje sposoban za specifično vezivanje IL-18 polipeptida. Takvi fragmenti su biološki aktivni po tome što vezuju IL-18 polipeptid. „Vezujući protein“ se odnosi na proteine koji specifično vezuju IL-18 polipeptid, i koji mogu dodatno da neutrališu interakciju IL-18 polipeptida sa IL-18 receptorom.
[0105] Termin „vezujući molekul“, kako se ovde koristi, takođe isključuje IL-18 vezujući protein koji se javlja u prirodi i izolovani IL-18BP, na primer, kako je opisano u WO2001/085201.
[0106] Vezujući molekul predmetnog otkrića specifično vezuje IL-18, pri čemu vezujući molekul ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP.
[0107] Kako se ovde koristi, termin „ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP)“ treba da se odnosi na vezujući molekul koji se vezuje za kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) sa KDod 1 x 10<-5>M ili više.
[0108] Jedan način za procenu da li vezujući molekul vezuje IL-18 ali ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) opisan je ovde u Primerima, odeljak 9.
[0109] U drugom aspektu predmetnog otkrića, vezujući molekul specifično vezuje IL-18, pri čemu se vezujući molekul ne takmiči sa IL-18 vezujućim proteinom (IL-18 BP) za vezivanje IL-18 kada je IL-18BP vezan za IL-18.
[0110] Termini „takmiči se“, „takmičenje“ i „unakrsno se takmiči“ i njihove gramatičke varijacije se ovde koriste naizmenično da označe sposobnost vezujućeg molekula da se takmiči sa IL-18BP za vezivanje IL-18 kada je IL-18BP već vezan za IL-18. Vezujući molekuli iz otkrića, poput antitela ili njegovog fragmenta, ne takmiče se u ovom smislu. Takmičenje između vezujućih molekula utvrđuje se putem testa u kome se vezujući molekul testira na specifično vezivanje za IL-18 kada je IL-18 vezan za IL-18BP. Kako bi se izbegla svaka sumnja, ako vezujući molekul može da zameni IL-18 u kompleksu IL-18/IL-18BP, onda se taj vezujući molekul takmiči sa IL-18BP za vezivanje IL-18.
[0111] Vezujući molekul prema otkriću nije IL-18BP, ni izolovani ni prirodni IL-18BP.
[0112] Vezujući molekul se može izabrati od sledećih skeleta: antitela, fragmenta antitela, pojedinačnog varijabilnog domena antitela, bi- ili multispecifičnog antitela, multivalentnog antitela, antitela sa dva varijabilna domena, imunokonjugata, molekula fibronektina, adnektina, DARPina, avimera, afitela, antikalina, afilina, mimetika epitopa proteina ili njihovih kombinacija, i kao što je opisano u nastavku.
[0113] Poželjno, IL-18 sadrži od aminokiseline 37 do aminokiseline 193 sekvence SEQ ID NO:1 (humani IL-18) ili SEQ ID NO:2 (IL-18 majmuna cinomolgus).
[0114] Strukturu IL-18BP karakteriše jedan domena nalik na Ig, i podseća na ekstracelularni segment receptora citokina sa strukturama nalik na Ig. Humani IL-18BP je identifikovan u četiri različita izooblika. IL-18BP izooblik a (IL-18BPa) ispoljio je najveći afinitet prema IL-18 sa brzom stopom vezivanja, sporom stopom otpuštanja i konstantom disocijacije (KD) od 399 pM. IL-18BP izooblik c (IL-18BPc) deli Ig domen IL-18BPa osim poslednjih 29 aminokiselina na C-terminusu. KDIL-18BPc je 10-struko manji (2,94 nM) od IL-18BPa. Pa ipak, IL-18BPa i IL-18BPc neutrališu IL-18 >95% sa molarnim viškom dva. IL-18BP izooblici b i d nemaju kompletan Ig domen i nemaju sposobnost da vezuju ili neutrališu IL-18. Mišji IL-18BP je poznat u dva izooblika, c i d izoobliku, koji imaju identične Ig domene i takođe neutrališu >95% mišjeg IL-18 sa molarnim viškom dva. Međutim, mišji IL-18BPd, koji deli isti C-terminalni motiv sa humanim IL-18BPa, takođe neutrališe humani IL-18 (Kim i sar. (2000) Proc Natl Acad Sci, 97(3):1190-1195).
[0115] U celoj ovoj specifikaciji, termin „IL-18BP“ se odnosi na vezujuće proteine humanog, mišjeg ili virusnog IL-18 u svakom izoobliku, bilo da se javljaju u prirodi, izoluju se ili konstruišu, kao što je IL-18BP prikazan u WO2001/085201 koji opisuje analoge IL-18BP („muteine“), pri čemu je jedna ili više aminokiselina ubačena, zamenjena različitim konzervativinim supstitucijama ili uklonjena, IL-18BP fuzionisani protein (npr. fuzionisani protein IL-18BP sa regionom teškog lanca imunoglobulina ili Fc) i funkcionalne derivate poput PEG-ilovanih IL-18BP.
[0116] U jednom otelotvorenju, vezujući molekul prema pronalasku, koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, pri čemu se vezujući molekul vezuje za epitop IL-18 na IL-18, kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu epitop:
a. je sadržan u sledećim aminokiselinama IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1:
aminokiselinama 41 i 42 i aminokiselinama 87 do 97; ili
ii. aminokiselinama 138 do 160; ili
iii. aminokiselinama 177 do 181; ili
iv. aminokiselinama 41 i 42, aminokiselinama 87 do 97, aminokiselinama 138 do 160 i aminokiselinama 177 do 181; ili
v. aminokiselinama 41, 42, 87; 89; 90; ili
vi. aminokiselinama 93, 94; 95, 96; ili
vii. aminokiselinama 140; 141; 150, 177; ili
viii. aminokiselinama 92; 93; 94; 138; 140; 152; 157; ili
ix. aminokiselinama 142; 143; 150; 152; ili
x. aminokiselinama 143; 144; 145; 177; 180; ili
xi. aminokiselinama 41, 42, 87; 89; 90; 93, 94; 95, 96; 140; 141; 150; 177; ili
xii. aminokiselinama 92; 93; 94; 138; 140; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ili
xiii. aminokiselinama 41; 42, 87; 89; 90; 92; 93, 94; 95, 96; 138; 140; 141; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ili
b. sadrži najmanje jednu, dve, tri, četiri aminokiselina kako je definisano u bilo kojoj od grupa (i) do (xiii) navedenih pod a); ili
c. sadrži aminokiseline kako je definisano u bilo kojoj od grupa (iv) do (xii) navedenih pod a).
[0117] U drugom otelotvorenju, vezujući molekul prema pronalasku, koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, pri čemu se vezujući molekul vezuje za epitop IL-18 na IL-18, kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu epitop sadrži aminokiseline Arg140 i Glu152. U jednom otelotvorenju, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ili Glu177. U drugom otelotvorenju, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Arg94, Met96, Phe138, Ser141, Gly144, His145, Asp146, Gln150 ili Leu180.
[0118] U jednom otelotvorenju predmetnog pronalaska, vezujući molekul specifično vezuje IL-18, pri čemu vezujući molekul ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein izooblika a ili izooblika c (IL-18 BPa ili IL-18BPc), pri čemu je vezujući molekul izabran od: antitela, fragmenta antitela, antitela sa jednim varijabilnim domenom, bi- ili multispecifičnog antitela, multivalentnog antitela, antitela sa dva varijabilna domena, imunokonjugata, molekula fibronektina, adnektina, DARPina, avimera, afitela, antikalina, afilina, mimetika epitopa proteina ili njihovih kombinacija. Poželjno, IL-18 sadrži od aminokiseline 37 do aminokiseline 193 sekvence SEQ ID NO:1 (humani IL-18) ili SEQ ID NO:2 (IL-18 majmuna cinomolgus). Poželjnije, vezujući molekul je antitelo ili njegov fragment.
[0119] U drugom otelotvorenju, vezujući molekul prema pronalasku, koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein izooblika a ili izooblika c (IL-18 BPa ili IL-18BPc), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, pri čemu se vezujući molekul vezuje za epitop IL-18 na IL-18, kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu epitop sadrži aminokiseline Arg140 i Glu152. U jednom otelotvorenju, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ili Glu177, i pri čemu je vezujući molekul izabran od: antitela, fragmenta antitela, antitela sa jednim varijabilnim domenom, biili multispecifičnog antitela, multivalentnog antitela, antitela sa dva varijabilna domena, imunokonjugata, molekula fibronektina, adnektina, DARPina, avimera, afitela, antikalina, afilina, mimetika epitopa proteina ili njihovih kombinacija.
[0120] U drugom otelotvorenju, vezujući molekul prema pronalasku, koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein izooblika a ili izooblika c (IL-18 BPa ili IL-18BPc), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, pri čemu se vezujući molekul vezuje za epitop IL-18 na IL-18, kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu epitop sadrži aminokiseline Arg140 i Glu152 i pri čemu je vezujući molekul antitelo ili njegov fragment. U ovom otelotvorenju, epitop može dalje da sadrži jednu ili više aminokiselina Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ili Glu177.
[0121] Vezujući molekul iz pronalaska je sposoban da inhibira jednu ili više bioloških aktivnosti IL-18, poput Th1 modulacije, Th2 modulacije, NK-modulacije, modulacije neutrofila, modulacije linije monocita-makrofaga, modulacije eozinofila, B-ćelijske modulacije, modulacije citokina, modulacije hemokina, modulacije adhezionog molekula i modulacije regrutovanja ćelija. U jednom otelotvorenju, vezujući molekul iz pronalaska inhibira proizvodnju gama interferona (INF-γ) zavisnu od IL-18, poželjno u KG-1 ćelijama. U drugom otelotvorenju pronalaska, vezujući molekul inhibira proizvodnju gama interferona (INF-γ) zavisnu od IL-18 u KG-1 ćelijama sa IC50od 10 nM ili manje ili od 1 nM ili manje ili od 100 pM ili manje u testu kako je ovde definisano u nastavku u primerima.
[0122] Vezujući molekul iz pronalaska koji specifično vezuje IL-18 ima konstantu disocijacije (KD) od 10 nM ili manje u testu kako je ovde definisano u nastavku u primerima. U jednom otelotvorenju, KDje 1 nM ili manje. U drugom otelotvorenju, vezujući molekul ima KDod 100 pM ili manje i vezujući molekul je antitelo ili njegov fragment.
[0123] Vezujući molekul prema otkriću može biti kristalizovani vezujući molekul, poželjno kristalizovani vezujući molekul sa kontrolisanim otpuštanjem i/ili bez nosača. U jednom otelotvorenju, kristalizovani vezujući molekul je antitelo ili njegov fragment. U drugom otelotvorenju, kristalizovani vezujući molekul ima duži poluživot in vivo od rastvorljivog parnjaka, i zadržava svoju biološku funkciju nakon kristalizacije.
[0124] Vezujući molekul prema otkriću takođe može biti deo kompleksa koji sadrži vezujući molekul i IL-18. Poželjno, vezujući molekul je antitelo ili njegov fragment u kompleksu sa IL-18.
[0125] Najzad, vezujući molekul prema otkriću se takođe može takmičiti sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje humanog IL-18.
2) Antitela
[0126] Vezujući molekuli prema predmetnom pronalasku uključuju antitela ili njihove fragmente, izolovane i strukturno okarakterisane kako je ovde opisano u nastavku i kako je prikazano na Slikama 1 i 2.
2.1) Humana antitela
[0127] Kako se ovde koristi, humano antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilne regione teškog ili lakog lanca ili teške ili lake lance pune dužine koji su „proizvod“ ili „dobijeni od“ konkretne germinativne sekvence ako su varijabilni regioni ili lanci pune dužine antitela pribavljeni iz sistema koji koristi gene imunoglobulina humane germinativne linije. Takvi sistemi obuhvataju imunizaciju transgenih miševa koji nose gene humanog imunoglobulina gde je željeni antigen ili biblioteka za skrining gena humanog imunoglobulina prikazana na fagu sa željenim antigenom. Humano antitelo ili njegov fragment koji je „proizvod“ ili „dobijen od“ sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može se identifikovati kao takvo poređenjem aminokiselinske sekvence humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina humanih germinativnih linija i biranjem sekvence humanog germinativnog imunoglobulina koja je po sekvenci najbliža (tj. najveći % identičnosti) sekvenci humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "dobijeno od" konkretne sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa sekvencom germinativne linije, usled, na primer, somatskih mutacija koje se javljaju u prirodi ili namernog uvođenja mutacija usmerenih na mesto. Međutim, izabrano humano antitelo je tipično najmanje 90% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira gen imunoglobulina humane germinativne linije i sadrži ostatke aminokiselina koji identifikuju humano antitelo kao humano u poređenju sa sekvencama aminokiselina imunoglobulina germinativne linije drugih vrsta (npr. mišje sekvence germinativne linije). U određenim slučajevima, humano antitelo može biti najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, ili najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije. Tipično, humano antitelo dobijeno od konkretne sekvence humane germinativne linije neće pokazivati više od 10 razlika u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence koju kodira gen imunoglobulina humane germinativne linije. U određenim slučajevima, humano antitelo će pokazivati ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2 ili 1 razlike u aminokiselinama od aminokiselinske sekvence koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije.
[0128] Humana antitela se mogu proizvesti brojnim postupcima koji su poznati stručnjacima za datu oblast. Humana antitela se mogu napraviti postupkom hibridoma korišćenjem ćelijskih linija humanog mijeloma ili mišjeg-humanog heteromijeloma (Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63, Marcel Dekker Inc, 1987). Alternativni postupci uključuju korišćenje biblioteka faga ili transgenih miševa, i oba koriste repertoare humanog varijabilnog regiona (Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231:11-23).
[0129] Nekoliko sojeva transgenih miševa je sada dostupno, pri čemu je njihov lokus mišjeg imunoglobulina zamenjen segmentima gena humanog imunoglobulina (Tomizuka K, (2000) Proc Natl Acad Sci , 97:722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol 14:845-851; Mendez MJ, (1997) Nature Genetics 15:146-156). Nakon antigenskog izazova, takvi miševi su sposobni da proizvedu repertoar humanih antitela od kojih se mogu izabrati željena antitela. Od posebnog značaja je sistem Trimera<TM>(Eren R i sar. (1988) Immunology 93:154-161) u kome se humani limfociti transplantuju u ozračene miševe, Odabrani sistem antitela sa izolovanim limfocitima (Selected Lymphocyte Isolated antibody System, SLAM, Babcook i sar. Proc Natl Acad Sci (1996) 93:7843-7848) u kome su humani (ili od drugih vrsta) limfociti efektivno propušteni kroz masivnu proceduru stvaranja sakupljenih in vitro izolovanih antitela, nakon čega sledi dekonvolucija, ograničavajuće razblaživanje i procedura izbora i Xenomouse<TM>(Abgenix Inc). Alternativni pristup je dostupan od kompanije Morphotek Inc korišćenjem tehnologije Morphodoma<TM>.
[0130] Tehnologija displeja faga može da se koristi za proizvodnju humanih antitela i njihovih fragmenata (McCafferty; (1990) Nature, 348:552-553 i Griffiths AD i sar. (1994) EMBO 13:3245-3260). Prema ovoj tehnici, geni varijabilnog domena izolovanog antitela se kloniraju u okvir u gen velikog ili malog proteinskog omotača filamentnog bakteriofaga poput M13 ili fd, i prikazuje se (obično uz pomoć pomoćnog faga) kao funkcija fragmenata izolovanog antitela na površini čestice faga. Izbor na osnovu funkcionalnih svojstava izolovanog antitela dovodi do odabira gena koji kodira izolovano antitelo koje ispoljava ta svojstva. Tehnika displeja faga se može koristiti za odabir antigen specifičnih antitela iz biblioteka sačinjenih od humanih B ćelija uzetih od pojedinaca pogođenih bolešću ili poremećajem ili alternativno od neimunizovanih ljudskih donora (Marks; J Mol Bio (1991) 222:581-591,). Kada se želi netaknuto humano izolovano antitelo koje sadrži Fc domen, neophodno je ponovo klonirati fragment dobijen displejem faga u ekspresione vektore sisara koji sadrže željene konstantne regione i uspostaviti stabilne eksprimirajuće ćelijske linije.
[0131] Tehnika afinitetnog sazrevanja (Marks; Biotechnol (1992) 10:779-783) može da se koristi za obezbeđivanje afiniteta vezivanja, pri čemu je afinitet primarnog humanog izolovanog antitela poboljšan sekvencijalnom zamenom varijabilnih regiona H i L lanca sa prirodnim varijantama i odabirom na bazi poboljšanih afiniteta vezivanja. Varijante ove tehnike poput „utiskivanja epitopa“ sada su takođe dostupne (WO 93/06213; Waterhouse; Nucl Acids Res (1993) 21:2265-2266).
[0132] Ovde su opisane brojne (numerisane) stavke otkrića. Biće jasno da se karakteristike navedene u svakoj stavci mogu kombinovati sa drugim naznačenim karakteristikama kako bi se obezbedile dalje stavke predmetnog otkrića.
Stavka 1: Vezujući molekul koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu je vezujući molekul izolovano humano antitelo ili njegov fragment; poželjno, izolovano humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment.
Stavka 2: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 1, pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje sa epitopom IL-18 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu epitop:
a. je sadržan u sledećim aminokiselinama IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1:
aminokiselinama 41 i 42 i aminokiselinama 87 do 97; ili
ii. aminokiselinama 138 do 160; ili
iii. aminokiselinama 177 do 181; ili
iv. aminokiselinama 41 i 42, aminokiselinama 87 do 97, aminokiselinama 138 do 160 i aminokiselinama 177 do 181; ili
v. aminokiselinama 41, 42, 87; 89; 90; ili
vi. aminokiselinama 93, 94; 95, 96; ili
vii. aminokiselinama 140; 141; 150, 177; ili
viii. aminokiselinama 92; 93; 94; 138; 140; 152; 157; ili
ix. aminokiselinama 142; 143; 150; 152; ili
x. aminokiselinama 143; 144; 145; 177; 180; ili
xi. aminokiselinama 41, 42, 87; 89; 90; 93, 94; 95, 96; 140; 141; 150; 177; ili
xii. aminokiselinama 92; 93; 94; 138; 140; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ili
xiii. aminokiselinama 41; 42, 87; 89; 90; 92; 93, 94; 95, 96; 138; 140; 141; 142; 143; 144; 145; 150; 152; 157; 177; 180; ili
b. sadrži najmanje jednu, dve, tri, četiri aminokiselina kako je definisano u bilo kojoj od grupa (i) do (xiii) navedenih pod a); ili
c. sadrži aminokiseline kako je definisano u bilo kojoj od grupa (iv) do (xii) navedenih pod a).
Stavka 3: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 1, koji se vezuje za epitop IL-18 na IL-18 kao što je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu epitop sadrži aminokiseline Arg140 i Glu152.
Stavka 4: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 3, pri čemu epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Gln92, Pro93, Gly95, Pro143, Glu157 ili Glu177.
Stavka 5: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 3. i 4, pri čemu epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Arg94, Met96, Phe138, Ser141, Gly144, His145, Asp146, Gln150 ili Leu180.
Stavka 6: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu IL-18 sadrži od aminokiseline 37 do aminokiseline 193 sekvence SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2.
Stavka 7: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment inhibira proizvodnju interferona gama (INF-γ) zavisnu od IL-18.
Stavka 8: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 sa KD od 100 pM ili manje.
Stavka 9: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment dalje takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 10: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od prethodnih stavki, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 9 ili SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO: 11 ili SEQ ID NO: 12 ili SEQ ID NO: 13 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 11: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 10, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 4 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 12: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 11, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 4 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante, i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 13: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 10, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 9 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 14: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 13, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 9 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante, i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 15: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 13 ili 14, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu52 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži:
varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante, i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 9 ili njene konzervativne varijante, i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante, i
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante, i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante, i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Poželjno, ovo izolovano humano antitelo je izolovano potpuno humano antitelo ili njegov fragment, poželjnije, izolovano potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment.
Stavka 16: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 10, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 10 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 17: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 10, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 11 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 18: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 10, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 12 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 19: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 10, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 13 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 20: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 19, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 13 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante, i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 21: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 19 ili 20, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujućeg proteina (IL-18 BP) i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu52 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, pri čemu izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži:
varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 3 ili njene konzervativne varijante, i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 13 ili njene konzervativne varijante, i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 5 ili njene konzervativne varijante, i
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 6 ili njene konzervativne varijante, i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 7 ili njene konzervativne varijante, i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 8 ili njene konzervativne varijante.
Poželjno, ovo izolovano humano antitelo je izolovano potpuno humano antitelo ili njegov fragment, poželjnije, izolovano potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment.
Stavka 22: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 74 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 75 ili SEQ ID NO: 76 ili SEQ ID NO: 77 ili SEQ ID NO: 78 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 79 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 80 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 81 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 82 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 23: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 22, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 74 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 75 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 79 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 80 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 81 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 82 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 24: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 22, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 74 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 76 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 79 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 80 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 81 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 82 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 25: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 22, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 74 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 77 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 79 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 80 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 81 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 82 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 26: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 22, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 74 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 78 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 79 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 80 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 81 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 82 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 27: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 106 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 107 ili SEQ ID NO: 122 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 108 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 109 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 110 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 111 ili SEQ ID NO: 126 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 28: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 27, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 106 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 107 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 108 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 109 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 110 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 111 ili njene konzervativne varijante.
Poželjno, ovo izolovano humano antitelo ili njegov fragment je izolovano potpuno humano antitelo ili njegov fragment, poželjnije, izolovano potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov fragment.
Stavka 29: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 106 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 122 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 108 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 109 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 110 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 126 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 30: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 120 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 121 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 123 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 124 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 125 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 127 ili SEQ ID NO: 128 ili SEQ ID NO: 129 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 31: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 30, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 120 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 121 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 123 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 124 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 125 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 127 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 32: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 30, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 120 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 121 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 123 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 124 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 125 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 128 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 33: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 30, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 120 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 121 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 123 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 124 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 125 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 129 ili njene konzervativne varijante.
Prethodno prikazani CDR regioni su razgraničeni korišćenjem Kabatovog sistema (Kabat, E. A., i sar. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija br.91-3242).
U nekim stavkama ovog otkrića, humano antitelo ili njegov fragment sadrže CDR regione razgraničene korišćenjem Čotijine definicije (Chothia i sar. (1987) J Mol Biol 196: 901-17).
Stavka 34: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 59 ili SEQ ID NO: 65 ili SEQ ID NO: 66 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 60 ili SEQ ID NO: 67 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 61 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 62 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 63 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 64 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 35: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 34, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 59 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 60 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 61 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 62 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 63 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 64 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 36: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 35, pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment dalje takmiče sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 37: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 34, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 65 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 60 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 61 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 62 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 63 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 64 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 38: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 37, pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment dalje takmiče sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 39: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 34, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 66 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 67 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 61 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 62 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 63 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 64 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 40: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 39, pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment dalje takmiče sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 41: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 34, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 68 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 69 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 70 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 71 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 72 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 73 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 42: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 162 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 163 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 164 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji sadrži SEQ ID NO: 165 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji sadrži SEQ ID NO: 166 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji sadrži SEQ ID NO: 167 ili njene konzervativne varijante.
Po Kabatovoj definiciji, kako je prethodno razmotreno, CDR aminokiselinski ostaci u varijabilnom domenu teškog lanca (VH) numerisani su 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2) i 95-102 (H-CDR3); a CDR aminokiselinski ostaci u varijabilnom domenu lakog lanca (VL) numerisani su 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2) i 89-97 (L-CDR3). Po Čotijinoj definiciji, CDR aminokiseline u VH su numerisane 26-32 (H-CDR1), 52-56 (H-CDR2) i 95-102 (H-CDR3); a aminokiselinski ostaci u VL su numerisani 26-32 (L-CDR1), 50-52 (L-CDR2) i 91-96 (L-CDR3). Kombinovanjem Kabatove i Čotijine definicije CDR i uzimanjem u obzir insercije za duže petlje, CDR-i se sastoje od aminokiselinskih ostataka 26-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2) i 95-102 (H-CDR3) u humanom VH i aminokiselinskih ostataka 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2) i 89-97 (L-CDR3) u humanom VL.
Stavka 43: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži SEQ ID NO: 14 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante i pri čemu varijabilni region teškog lanca (VH) sadrži:
varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji odgovara aminokiselinama 26 do 35 sekvence SEQ ID NO: 14; i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji odgovara aminokiselinama 50 do 66 sekvence SEQ ID NO: 14; i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji odgovara aminokiselinama 99 do 108 sekvence SEQ ID NO: 14;
i pri čemu varijabilni region lakog lanca (VL) sadrži:
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji odgovara aminokiselinama 23 do 35 sekvence SEQ ID NO: 16; i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji odgovara aminokiselinama 51 do 57 sekvence SEQ ID NO: 16; i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji odgovara aminokiselinama 90 do 100 sekvence SEQ ID NO: 16.
Stavka 44: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 43, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 45: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavkama 43 ili 44, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 46: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži SEQ ID NO: 18 ili njene konzervativne varijante i varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante i pri čemu varijabilni region teškog lanca (VH) sadrži:
varijabilni region teškog lanca H-CDR1 koji odgovara aminokiselinama 26 do 35 sekvence SEQ ID NO: 18; i
ii. varijabilni region teškog lanca H-CDR2 koji odgovara aminokiselinama 50 do 66 sekvence SEQ ID NO: 18; i
iii. varijabilni region teškog lanca H-CDR3 koji odgovara aminokiselinama 99 do 108 sekvence SEQ ID NO: 18;
i pri čemu varijabilni region lakog lanca (VL) sadrži:
iv. varijabilni region lakog lanca L-CDR1 koji odgovara aminokiselinama 23 do 35 sekvence SEQ ID NO: 20; i
v. varijabilni region lakog lanca L-CDR2 koji odgovara aminokiselinama 51 do 57 sekvence SEQ ID NO: 20; i
vi. varijabilni region lakog lanca L-CDR3 koji odgovara aminokiselinama 90 do 100 sekvence SEQ ID NO: 20.
Stavka 47: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 46, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 48: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavkama 46 ili 47, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i to antitelo ili njegov fragment vezuju epitop koji sadrži Arg140 i Glu52 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1.
S obzirom na to da svako od ovih humanih antitela može da se vezuje za IL18 i da antigenvezujuću specifičnost obezbeđuju prvenstveno regioni CDR1, 2 i 3, sekvence H-CDR1, 2 i 3 i sekvence L-CDR1, 2 i 3 se mogu „mešati i uparivati“ (tj. CDR-i različitih humanih antitela se mogu mešati i uparivati, svako antitelo koje sadrži komplet H-CDR1, 2 i 3 i komplet L-CDR1, 2 i 3 stvara druge anti-IL18 vezujuće molekule iz otkrića. Vezivanje IL18 takvih „pomešanih i uparenih“ antitela se može testirati korišćenjem testova vezivanja iz Primera (npr. ELISA). Kada se CDR sekvence VH pomešaju i upare, sekvence CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz konkretne sekvence VH treba da se zamene strukturno sličnim sekvencama CDR. Slično tome, kada su CDR sekvence VL pomešane i uparene, sekvence CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz konkretne sekvence VL treba da se zamene strukturno sličnim sekvencama CDR. Osobi sa uobičajenim znanjem u oblasti biće jasno da nove VH i VL sekvence mogu biti kreirane supstituisanjem jedne ili više sekvenci CDR regiona VH i/ili VL sa strukturno sličnim sekvencama iz sekvenci CDR ovde prikazanih za humana antitela predmetnog otkrića (Slike 1 i 2).
U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje izolovano humano antitelo koje vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinske sekvence VH izabrane od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 14, 18, 22, 25, 28, 31, 34, 37, 40, 83, 87, 90, 93, 112, 130 i 138 i aminokiselinske sekvence VL izabrane od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 16, 20, 85, 114, 132, 140, 147 i 153. Druga antitela iz otkrića uključuju aminokiseline koje su mutirane aminokiselinskom delecijom, insercijom ili supstitucijom, ali imaju najmanje 60, 70, 80, 90 ili 95 posto identičnosti u CDR regionima sa CDR regionima prikazanim u prethodno opisanim sekvencama. U nekim stavkama, to uključuje mutantne aminokiselinske sekvence, pri čemu je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina mutirano aminokiselinskom delecijom, insercijom ili supstitucijom u CDR regionima u poređenju sa CDR regionima prikazanim u prethodno opisanim sekvencama.
Stavka 49: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 28 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 50: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 49, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 28 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante, pri čemu je aminokiselina asparagin (Asn; N) na poziciji 30 u odnosu na SEQ ID NO: 28 zamenjena aminokiselinom izabranom od lizina (Lys; K) ili serina (Ser; S) ili treonina (Thr; T) ili alanina (Ala; A) ili glutamata (Glu; E) ili histidina (His; H) ili leucina (Leu; L) ili glutamina (Gln; Q) ili arginina (Arg; R) ili valina (Val; V) ili tirozina (Tyr; Y) ili izoleucina (Ile; I) ili glicina (Gly; G).
Stavka 51: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavkama 49 ili 50, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 52: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 49 do 51, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 53: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 14 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 54: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 53, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 55: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 53 do 55, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 56: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 53, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 14 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante, pri čemu je aminokiselina lizin (Lys; K) na poziciji 30 u odnosu na SEQ ID NO: 14 zamenjena aminokiselinom izabranom od asparagina (Asn; N) ili serina (Ser; S) ili treonina (Thr; T) ili alanina (Ala; A) ili glutamata (Glu; E) ili histidina (His; H) ili leucina (Leu; L) ili glutamina (Gln; Q) ili arginina (Arg; R) ili valina (Val; V) ili tirozina (Tyr; Y) ili izoleucina (Ile; I) ili glicina (Gly; G).
Stavka 57: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 56, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 58: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 55 ili 57, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 59: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 18 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 60: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 59, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 61: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 59 ili 60, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 62: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 40 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 63: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 62, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 40 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante, pri čemu
aminokiselina glutamat (Glu; E) na poziciji 1 u odnosu na SEQ ID NO: 40 je zamenjena aminokiselinom glutaminom (Gln; Q) i
ii. pri čemu je aminokiselina asparagin (Asn; N) na poziciji 30 u odnosu na SEQ ID NO: 40 zamenjena aminokiselinom izabranom od serina (Ser; S) ili treonina (Thr; T) ili aspartata (Asp; D).
Stavka 64: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 63, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 40 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante, pri čemu
aminokiselina glutamat (Glu; E) na poziciji 1 u odnosu na SEQ ID NO: 40 je zamenjena aminokiselinom glutaminom (Gln; Q); i
ii. pri čemu je aminokiselina asparagin (Asn; N) na poziciji 30 u odnosu na SEQ ID NO: 40 zamenjena aminokiselinom izabranom od serina (Ser; S) ili treonina (Thr; T) ili aspartata (Asp; D); i
iii. pri čemu je aminokiselina metionin (Met; M) na poziciji 54 u odnosu na SEQ ID NO: 40 zamenjena aminokiselinom izabranom od tirozina (Tyr; Y) ili asparagina (Asn; N) ili izoleucina (Ile; I).
Stavka 65: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavkama 62 do 64, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 66: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 65 do 66, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 67: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 62, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 40 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante, pri čemu
aminokiselina glutamat (Glu; E) na poziciji 1 u odnosu na SEQ ID NO: 40 je zamenjena aminokiselinom glutaminom (Gln; Q) i
ii. pri čemu je aminokiselina serin (Ser; S) na poziciji 31 u odnosu na SEQ ID NO: 40 zamenjena aminokiselinom izabranom od treonina (Thr; T) ili asparagina (Asn; N) ili alanina (Ala; A).
Stavka 68: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 67, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 40 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante, pri čemu
aminokiselina glutamat (Glu; E) na poziciji 1 u odnosu na SEQ ID NO: 40 je zamenjena aminokiselinom glutaminom (Gln; Q); i
ii. pri čemu je aminokiselina serin (Ser; S) na poziciji 31 u odnosu na SEQ ID NO: 40 zamenjena aminokiselinom izabranom od treonina (Thr; T) ili asparagina (Asn; N) ili alanina (Ala; A).
iii. pri čemu je aminokiselina metionin (Met; M) na poziciji 54 u odnosu na SEQ ID NO: 40 zamenjena aminokiselinom izabranom od tirozina (Tyr; Y) ili asparagina (Asn; N) ili izoleucina (Ile; I).
Stavka 69: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavkama 67 ili 68, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 70: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 67 do 69, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 72: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 28 ili SEQ ID NO: 31 ili SEQ ID NO: 34 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 16 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 73: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 37 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 20 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 74: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 43, 47, 50, 53, 56, 96, 100, 103, 116, 134, 142 i 158 ili njihovih konzervativnih varijanti, i aminokiselinske sekvence VL izabrane od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 45, 98, 118, 136, 144, 150, 156 i 160 ili njihovih konzervativnih varijanti.
Stavka 75: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 43 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 45 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 76: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 75, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 77: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 75 ili 76, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 78: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 158 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 160 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 79: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavci 78, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 80: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 78 ili 79, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 81: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 47 ili SEQ ID NO: 50 ili SEQ ID NO: 56 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 45 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 82: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 53 ili SEQ ID NO: 100 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 160 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 83: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema stavkama 81 ili 82, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu se izolovano humano antitelo ili njegov fragment takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 84: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 81 do 83, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i to antitelo ili njegov fragment vezuje epitop koji sadrži Arg140 i Glu152 na IL-18 kako je definisano u odnosu na SEQ ID NO:1, opciono, epitop dalje sadrži jednu ili više aminokiselina Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 ili Leu180, poželjno, epitop dalje sadrži aminokiseline Lys89, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Phe138, Ser141, Pro143, Gly144, Glu157,Glu177 i Leu180.
Stavka 85: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 96 ili SEQ ID NO: 103 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 98 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 86: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 116 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 118 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 87: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 142 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 144 ili njene konzervativne varijante.
Stavka 88: Izolovano humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 9, pri čemu izolovano humano antitelo ili njegov fragment vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i sadrži aminokiselinsku sekvencu VH izabranu od sekvence prikazane u SEQ ID NO: 134 ili njene konzervativne varijante i aminokiselinsku sekvencu VL izabranu od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 136 ili SEQ ID NO: 150 ili SEQ ID NO: 156 ili njene konzervativne varijante.
2.2) Humanizovana ili himerna antitela
[0133] Očigledna alternativa ovde prikazanom pronalasku je upotreba humanizovanih ili himernih antitela umesto humanih antitela.
[0134] Upotreba netaknutih nehumanih antitela u lečenju humanih bolesti ili poremećaja sa sobom nosi mogućnosti za sad već dobro ustanovljene probleme imunogenosti. To jest, pacijentov imunski sistem može prepoznati nehumano netaknuto izolovano antitelo kao nesvojstveno i pokrenuti odgovor antitelom. To je posebno uočljivo nakon više primena nehumanog izolovanog antitela na ljudskom pacijentu. Tokom godina, razvijene su različite tehnike kako bi se prevazišli ovi problemi, koje generalno obuhvataju smanjivanje potpisa nehumane imunogenosti u netaknutom izolovanom antitelu uz zadržavanje relativne jednostavnosti dobijanja nehumanih antitela od neimunizovanih životinja, npr. miša, pacova ili zeca. Uopšteno se koriste dva pristupa da bi se to postiglo. Prvi su himerna antitela, koja uopšteno sadrže nehumani varijabilni domen (npr. glodara, kao što je miš) spojen sa humanim konstantnim regionom. Pošto se mesto vezivanja antigena izolovanog antitela nalazi u varijabilnim regionima, himerno izolovano antitelo zadržava svoj afinitet vezivanja za antigen ali dobija efektorske funkcije humanog konstantnog regiona i stoga može da obavlja efektorske funkcije kao što je prethodno opisano. Himerna antitela se obično proizvode korišćenjem postupaka rekombinacije DNK. DNK koja kodira antitela (npr. cDNK) izolovana je i sekvencirana korišćenjem uobičajenih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance izolovanog antitela iz otkrića. Ćelije hibridoma se koriste kao uobičajeni izvor takve DNK. Nakon izolovanja, DNK je ubačena u ekspresione vektore koji su zatim transficirani u ćelije domaćina poput E.coli, COS ćelija, CHO ćelija ili ćelija mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, kako bi se ostvarila sinteza izolovanog antitela. DNK može da se modifikuje supstitucijom kodirajuće sekvence humanih L i H lanaca odgovarajućim nehumanim (npr. mišjim) H i L konstantnim regionima (Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)).
[0135] Drugi pristup obuhvata stvaranje humanizovanih antitela, pri čemu je nehumani sadržaj izolovanog antitela umanjen putem humanizovanja varijabilnih regiona. Dve tehnike humanizacije su postale popularne. Prva je humanizacija putem CDR graftovanja. CDR-i grade petlje blizu N-terminusa izolovanog antitela, gde formiraju površinu postavljenu na skelet koji obezbeđuje region okvira. Antigen-vezujuća specifičnost izolovanog antitela je pre svega definisana topografijom i hemijskim karakteristikama njene CDR površine. Ova svojstva su zauzvrat određena konformacijom pojedinačnih CDR-a, relativnom dispozicijom CDR-a, i prirodom i dispozicijom bočnih lanaca ostataka koji sadrže CDR-e. Veliko smanjenje u imunogenosti se može postići graftovanjem samo CDR-a nehumanih (npr. mišjih) antitela (antitela „donori“) na humani okvir („akceptorski okvir“) i konstantne regione (Jones i sar. (1986) Nature 321:522-525 i Verhoeyen M i sar. (1988) Science 239:1534-1536). Međutim, CDR graftovanje samo po sebi ne mora dovesti do potpunog zadržavanja antigen-vezujućih svojstava, i često je nađeno da se neki ostaci okvira (ponekad se nazivaju „povratne mutacije“) izolovanog donorskog antitela moraju očuvati u humanizovanom jedinjenju ukoliko je poželjno da se povrati značajan antigen-vezujući afinitet (Queen C i sar. (1989) Proc Natl Acad Sci 86:10029-10033, Co, M i sar. (1991) Nature 351, 501-502). U tom slučaju, humani varijabilni regioni koji pokazuju najveću homologost sekvence sa nehumanim donorskim izolovanim antitelom se biraju iz baze podataka kako bi obezbedili humani okvir (FR). Izbor humanih FR se može načiniti ili iz humanog konsenzusa ili pojedinačnih humanih antitela. Kada je to neophodno, ključni ostaci iz izolovanog donorskog antitela su supstituisani u humani akceptorski okvir kako bi se očuvale konformacije CDR. Kompjutersko modelovanje izolovanog antitela može da se koristi kao pomoć u identifikovanju takvih strukturno značajnih ostataka.
[0136] Alternativno, humanizacija se može postići putem procesa „oblaganja“. Statistička analiza jedinstvenih humanih i mišjih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imunoglobulina otkrila je da su precizni obrasci otkrivenih ostataka različiti u humanim i mišjim antitelima, i većina pojedinačnih pozicija na površini ima jaku sklonost prema malom broju različitih ostataka (Padlan EA, i sar. (1991) Mol Immunol 28:489-498 i Pedersen JT i sar. (1994) J Mol Biol 235:959-973). Stoga je moguće smanjiti imunogenost nehumanog Fv zamenom otkrivenih ostataka u njegovim regionima okvira koji se razlikuju od onih koji se uobičajeno mogu naći u humanim antitelima. Pošto antigenost proteina može biti u korelaciji sa pristupačnošću površine, zamena površinskih ostataka može biti dovoljna da učini mišji varijabilni region „nevidljivim“ za humani imunski sistem (takođe Mark GE i sar. (1994) u Handbook of Experimental Pharmacology vol 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, str. 105-134). Ovaj postupak humanizovanja se naziva „oblaganje“ pošto je samo površina izolovanog antitela izmenjena, dok prateći ostaci ostaju neizmenjeni.
2.3) Fragmenti izolovanog antitela i antitela sa jednim varijabilnim domenom
[0137] U drugom otelotvorenju pronalaska, vezujući molekul je fragment antitela koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP). Poželjno, vezujući molekul je Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili scFv.
[0138] Tradicionalno, takvi fragmenti se proizvode putem proteolitičke digestije netaknutih antitela putem npr. papainske digestije (vidite na primer WO 94/29348), ali se mogu proizvesti direktno iz rekombinantno transformisanih ćelija domaćina. Pored toga, fragmenti izolovanog antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika konstruisanja, kako je opisano u nastavku.
[0139] Izgleda da Fv fragmenti imaju manju energiju interakcije njihova dva lanca nego Fab fragmenti. Kako bi se stabilizovala asocijacija VH i VL domena, oni su povezani peptidima (Bird i sar. (1988) Science, 242:423-426, Huston i sar. (1998) PNAS, 85:5879-5883), disulfidnim mostovima (Glockshuber i sar. (1990) Biochemistry, 29:1362-1367) i mutacijama „dugme u rupici“ (Zhui sar. (1997), Protein Sci, 6:781-788). ScFv fragmenti se mogu proizvesti postupcima koji su dobro poznati stručnjacima za ovu oblast (Whitlow i sar. (1991), Methods companion Methods Enzymol, 2:97-105 i Huston i sar. (1993) Int Rev Immunol 10:195-217). ScFv se može proizvesti u bakterijskim ćelijama poput E.coli, ali se poželjnije proizvodi u eukariotskim ćelijama. Jedna mana scFv je jednovalentnost proizvoda, koja sprečava povećanu avidnost usled polivalentnog vezivanja, i njihov kratak poluživot. Pokušaji da se ti problemi prevaziđu uključuju dvovalentne (scFv')2proizvedene iz scFv koji sadrži dodatni C terminalni cistein putem hemijskog kuplovanja (Adams i sar. (1993) Can Res 53:4026-4034 i McCartney i sar. (1995) Protein Eng, 8:301-314) ili spontane dimerizacije specifične za mesto scFv koji sadrži nespareni C terminalni cisteinski ostatak (Kipriyanov i sar. (1995) Cell. Biophys 26:187-204). Alternativno, scFv može biti prisiljen da gradi multimere tako što će se peptidni linkeri skratiti na 3 i 12 ostataka kako bi gradili „dijatela“ (Holliger i sar. PNAS (1993), 90:6444-6448). Dalje redukovanje linkera može dati scFv trimere („trijatela“, vidite Kortt i sar. (1997) Protein Eng, 10:423-433) i tetramere („tetratela“, Le Gall i sar. (1999) FEBS Lett, 453:164-168). Konstruisanje dvovalentnih scFv jedinjenja se može postići i genetskom fuzijom sa motivima dimerizacije proteina kako bi nastala „miniantitela“ (Pack i sar. (1992) Biochemistry 31:1579-1584) i „minitela“ (Hu i sar. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061). Tandemi scFv-sc-Fv ((scFv)2) mogu se takođe proizvesti povezivanjem dve scFv jedinice pomoću trećeg peptidnog linkera (vidite Kurucz i sar. (1995) J Immunol, 154:4576-4582). Bispecifična antitela se mogu proizvesti putem nekovalentnog vezivanja dva jednolančana proizvoda fuzije koji se sastoje od VH domena iz jednog izolovanog antitela povezanog putem kratkog linkera sa VL domenom drugog izolovanog antitela (vidite Kipriyanov i sar. (1998), Int J Can 77:763-772). Stabilnost takvih bispecifičnih dijatela se može povećati uvođenjem disulfidnih mostova ili mutacija „dugme u rupici“, kako je prethodno opisano, ili formiranjem jednolančanih dijatela (ScDb), pri čemu su dva hidridna scFv fragmenta povezana putem peptidnog linkera (vidite Kontermann i sar. (1999) J Immunol Methods 226:179-188). Tetravalentna bispecifična jedinjenja su dostupna npr. fuzionisanjem scFv fragmenta sa CH3 domenom IgG jedinjenja ili sa Fab fragmentom putem regiona šarke (vidite Coloma i sar. (1997) Nature Biotechnol, 15:159-163). Alternativno, tetravalentna bispecifična jedinjenja su kreirana fuzijom bispecifičnih jednolančanih antitela (vidite Alt i sar. (1999) FEBS Lett 454:90-94). Manja tetravalentna bispecifična jedinjenja se mogu takođe graditi dimerizacijom bilo kog od scFv-scFv tandema sa linkerom koji sadrži motiv heliks-petlja-heliks (DiBi miniantitela, vidite Muller i sar. (1998) FEBS Lett 432:45-49) ili jednolančanog jedinjenja koje sadrži varijabilne domene (VH i VL) četiri izolovana antitela u orijentaciji koja sprečava intramolekulsko sparivanje (tandem dijatelo, vidite Kipriyanov i sar. (1999) J Mol Biol 293:41-56). Bispecifični F(ab')2fragmenti se mogu kreirati hemijskim kuplovanjem Fab' fragmenata ili heterodimerizacijom pomoću leucinskih zatvarača (vidite Shalaby i sar. (1992) J Exp Med 175:217-225 i Kostelny i sar. (1992), J Immunol 148:1547-1553).
2.4) Homologa antitela ili njihovi fragmenti i konzervativne varijante
[0140] U drugom otelotvorenju predmetnog otkrića, vezujući molekul je antitelo ili njegov fragment koji ima aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca ili aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca koje su homologe sa aminokiselinskim sekvencama ovde opisanih antitela, i pri čemu homologa antitela ili njihov fragment zadržavaju željena funkcionalna svojstva vezujućeg molekula prema otkriću.
[0141] Na primer, otkriće pruža izolovano antitelo ili njegov fragment koji sadrži VH i VL, pri čemu: VH je najmanje 80% ili najmanje 90% identičan sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:14; 18; 22; 25; 28; 31; 34; 37; 40; 83; 87; 90; 93; 112; 130 ili 138; VL je najmanje 80% ili najmanje 90% identičan sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:16; 20; 85; 114; 132; 140; 147 ili 153, pri čemu se homologo antitelo specifično vezuje za IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP). Homologo antitelo može ispoljiti najmanje jedno dodatno funkcionalno svojstvo kao što je inhibiranje vezivanja IL18 za IL18R ili inhibiranje proizvodnje IFN-γ zavisne od IL18.
[0142] U drugim otelotvorenjima otkrića, aminokiselinske sekvence VH i/ili VL mogu biti 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa prethodno prikazanim sekvencama. U drugim otelotvorenjima otkrića, aminokiselinske sekvence VH i/ili VL mogu biti identične osim aminokiselinske supstitucije na ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih pozicija. Antitelo koje ima VH i VL regione sa velikom (tj.80% ili većom) identičnošću sa VH i VL regionima SEQ ID NOs 16; 20; 85; 114; 132; 140; 147 odnosno 153 može se dobiti mutagenezom (npr. mutagenezom usmerenom na mesto ili posredovanom putem PCR) molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju SEQ ID NOs: 15; 19; 23; 26; 29; 32; 35; 38; 41; 84; 88; 91; 94; 113; 131; 139; 146 ili 152 i 17; 21; 24; 27; 30; 33; 36; 39; 42; 86; 89; 92; 95; 115; 133; 141; 148 odnosno 154, nakon čega se kodirano izmenjeno antitelo testira na zadržane funkcije (tj. prethodno postavljene funkcije) korišćenjem ovde opisanih funkcionalnih testova.
[0143] Homologo antitelo iz otkrića može biti, na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo. Poželjno, antitelo je potpuno humano utišano antitelo IgG1.
[0144] Kako se ovde koristi, procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih položaja zajedničkih za sekvence (tj. % identičnosti = br. identičnih položaja/ukupan br. položaja x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koje se moraju uvesti zarad optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i utvrđivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može ostvariti pomoću matematičkog algoritma, kako je opisano u nastavku.
[0145] Procenat identičnosti između dve sekvence aminokiselina može se utvrditi pomoću algoritma koji su dali E. Meyers i W. Miller (1988), Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, koji je uključen u program ALIGN (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele težine ostataka, kaznene dužine praznine od 12 i kaznene praznine od 4. Alternativno, procenat identičnosti između dve sekvence aminokiselina može se utvrditi korišćenjem algoritma koji su dali Needleman i Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:444-453, koji je uključen u program GAP u softverskom paketu GCG (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem Blossom 62 matrice ili PAM250 matrice, i težine praznine od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i težine dužine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.
2.5) Antitela sa dva varijabilna domena
[0146] Antitela sa dva varijabilna domena (dual variable domain, DVD) sadrže dva ili više antigen vezujućih mesta, i ona su tetravalentna ili multivalentna antitela, na primer, dvovalentna i tetravalentna. Multivalentno antitelo je posebno konstruisano da ima dva ili više antigen vezujućih mesta, i obično nije antitelo koje se javlja u prirodi. DVD antitela mogu biti sposobna da vezuju dva ili više povezanih ili nepovezanih ciljeva. Takva DVD antitela mogu biti monospecifična, tj. sposobna da vezuju jedan antigen, ili multispecifična, tj. sposobna da vezuju dva ili više antigena. U nekim otelotvorenjima otkrića, DVD antitelo sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. Svaki teški lanac i laki lanac sadrži dva antigen vezujuća mesta. Svako mesto vezivanja sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa ukupno 6 CDR-a uključenih u vezivanje antigena po antigen vezujućem mestu.
[0147] U jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul iz predmetnog otkrića je antitelo sa dva varijabilna domena (DVD) koje vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
[0148] Naročito, antitelo sa dva varijabilna domena prema otkriću je sposobno da vezuje IL-18 i drugi cilj. Drugi cilj može biti izabran od IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-25, IL-33, IL-1β,TNF alfa/beta i IFN-γ.
2.6) Bispecifični i multispecifični molekuli i antitela
[0149] U jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul iz predmetnog otkrića je izolovano bispecifično antitelo ili njegov fragment sa prvom specifičnošću za IL-18 i drugom specifičnošću za drugi polipeptid, npr. IL-12, pri čemu bispecifično antitelo ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
[0150] Naročito, bispecifično antitelo prema otkriću je sposobno da vezuje IL-18 i drugi cilj. Drugi cilj može biti izabran od IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-25, IL-33, IL-1β,TNF alfa/beta i IFN-γ.
[0151] U još jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje vezujući molekul koji je izolovano multispecifično antitelo ili njegov fragment koji uključuje prvu specifičnost za IL-18, drugu specifičnost za drugi polipeptid, npr. IL-12, i najmanje treću specifičnost za drugi polipeptid, pri čemu multispecifično antitelo ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
[0152] Naročito, multispecifično antitelo prema otkriću je sposobno da vezuje IL-18 i drugi i treći cilj. Drugi i treći cilj mogu biti izabrani od IL-1, IL-6, IL-8, IL-11, IL-12, IL-17, IL-25, IL-33, IL-1β,TNF alfa/beta i IFN-γ.
[0153] Bispecifično izolovano antitelo je izolovano antitelo koje ima specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa. Postupci proizvodnje takvih antitela su poznati u struci. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se zasniva na koekspresiji dva para H lanac-L lanac imunoglobulina, gde dva H lanca imaju različite specifičnosti vezivanja (vidite Millstein i sar. (1983) Nature 305:537-539, WO93/08829 i Traunecker i sar. (1991) EMBO 10:3655-3659). Usled nasumičnog rasporeda H i L lanaca, proizvodi se potencijalna smeša deset različitih struktura izolovanih antitela, od čega samo jedna ima željenu specifičnost vezivanja. Alternativni pristup obuhvata fuzionisanje varijabilnih domena sa željenim specifičnostima vezivanja sa konstantnim regionom teškog lanca koji sadrži najmanje deo regiona šarke, CH2 i CH3 regione. Poželjno je da postoji CH1 region koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca prisutno u najmanje jednoj fuziji. DNK koja kodira te fuzije i, ako je to poželjno, L lanac, ubacuju se u odvojene ekspresione vektore i zatim se kotransficiraju u pogodne organizme domaćine. Ipak, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri lanca u jedan ekspresioni vektor. U jednom poželjnom pristupu, bispecifično izolovano antitelo je sastavljeno od H lanca sa prvom specifičnošću vezivanja u jednom kraku i para H-L lanca, koji obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja u drugom kraku, vidite WO94/04690. Takođe, vidite Suresh i sar., Methods in Enzymology 121, 210, 1986.
[0154] Bispecifična i multispecifična antitela iz otkrića mogu da se derivatizuju ili povežu sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom (npr. drugo antitelo ili ligand za receptor) radi generisanja bispecifičnog molekula koji se vezuje za najmanje dva različita mesta vezivanja ili ciljana molekula. Antitelo iz otkrića može zapravo biti derivatizovano ili povezano sa više od jednog drugog funkcionalnog molekula kako bi nastali multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljna molekula; takvi multispecifični molekuli takođe treba da budu obuhvaćeni terminom „bispecifični molekul“ kako se ovde koristi. Kako bi se kreirao bispecifični molekul iz otkrića, antitelo iz otkrića može biti funkcionalno povezano (npr. hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim povezivanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, tako da se dobije bispecifični molekul.
[0155] U jednom otelotvorenju otkrića, bispecifični molekuli iz otkrića sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo ili njegov fragment antitela, uključujući, npr. Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili jednolančani Fv. Antitelo takođe može da bude dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što opisuju Ladner i sar. U.S. Patent br.4,946,778.
[0156] Druga antitela koja mogu da se koriste u bispecifičnim molekulima iz otkrića su mišja, himerna i humanizovana monoklonska antitela.
[0157] Bispecifični i multispecifični molekuli iz predmetnog otkrića se mogu pripremiti konjugovanjem sastavnih specifičnosti vezivanja, koristeći postupke poznate u struci. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog molekula može da se generiše zasebno, i da se zatim konjuguju jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu da se koriste raznovrsni agensi za kuplovanje ili unakrsno vezivanje. Primeri agenasa za unakrsno vezivanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzojevu kiselinu) (DTNB), ofenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) (vidi npr. Karpovsky i sar. (1984), J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA i sar. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Drugi postupci uključuju one opisane u Paulus (1985) Behring Inst Mitt; 78:118-132; Brennan i sar. (1985) Science; 229:81-83), i Glennie i sar. (1987) J Immunol; 139:2367-2375. Agensi za konjugovanje su SATA i sulfo-SMCC, i oba su dostupna od kompanije Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[0158] Kada su specifičnosti vezivanja antitela, ona se mogu konjugovati putem sulfhidrilnog vezivanja regiona šarke C-terminusa dva teška lanca. U posebnom otelotvorenju otkrića, region šarke je modifikovan da sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka pre konjugovanja, na primer jedan.
[0159] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu da se kodiraju u istom vektoru i eksprimiraju i sastave u istoj ćeliji domaćinu. Ova metoda je posebno korisna kada je bispecifični molekul fuzioni protein mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2ili ligand x Fab. Bispecifični molekul iz otkrića može biti jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve determinante vezivanja. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Metode za pripremu bispecifičnih molekula su opisane na primer u U.S. Patentu broj 5,260,203; U.S. Patentu broj 5,455,030; U.S. Patentu broj 4,881,175; U.S. Patentu broj 5,132,405; U.S. Patentu broj 5,091,513; U.S. Patentu broj 5,476,786; U.S. Patentu broj 5,013,653; U.S. Patentu broj 5,258,498; i U.S. Patentu broj 5,482,858.
[0160] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može da se potvrdi, na primer, testom enzimski povezanog imunosorbenta (ELISA), radioimunotestom (RIA), FACS analizom, biološkim testom (npr. inhibicija rasta) ili vestern blot testom. Svaki od ovih testova generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo koji je od posebnog interesa putem korišćenja označenog reagensa (npr. antitela) specifičnog za željeni kompleks.
2.7) Humana antitela
[0161] U drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje multivalentna antitela koja sadrže najmanje dva identična ili različita antigen-vezujuća dela antitela iz otkrića koji se vezuju za IL-18 i ne vezuju za kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
[0162] U jednom otelotvorenju otkrića, multivalentno antitelo obezbeđuje najmanje dva, tri ili četiri antigen-vezujuća dela antitela koja su ovde opisana. Antigen-vezujući delovi mogu da se povežu putem proteinske fuzije ili kovalentne ili nekovalentne veze. Alternativno, metode povezivanja su opisane za bispecifične molekule. Četvorovalentna jedinjenja mogu da se dobiju na primer unakrsnim povezivanjem antitela iz otkrića sa antitelom koje se vezuje za konstantne regione antitela iz otkrića, na primer Fc ili region šarke.
2.8) Imunokonjugati
[0163] U drugom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za IL-18 ali ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu su antitelo ili njegov fragment konjugovani u terapeutski ostatak, kao što je citotoksin, lek (npr. imunosupresant) ili radiotoksin.
[0164] Takvi konjugati se ovde nazivaju "imunokonjugatima". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina se nazivaju "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksični agens uključuju bilo koji agens koji je štetan za ćelije (npr. ubija ih). Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, t. kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin, i njihove analoge ili homologe. Terapeutski agensi takođe uključuju, na primer, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluoruracil dekarbazin), ablacione agense (npr. mehloretamin, tiotepa hlorambucil, mejfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlordiamin platinu (II) (DDP) cisplatin, antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)), i antimitotike (npr. vinkristin i vinblastin).
[0165] Drugi primeri terapeutskih citotoksina koji mogu biti konjugovani sa antitelom iz otkrića uključuju duokarmicine, caliheamicine, majtanzine i auristatine i njihove derivate. Jedan primer konjugata kaliheamicinskog antitela je komercijalno dostupan (Mylotarg<TM>; Wyeth-Ayerst).
[0166] Citoksini mogu da se konjuguju sa antitelima iz otkrića pomoću tehnologije linkera dostupne u struci. Primeri za vrste linkera koji su korišćeni za konjugovanje citotoksina za antitelo uključuju, ali nisu ograničeni na, linkere koji sadrže hidrazone, tioetre, estre, disulfide i peptid. Može se odabrati linker koji je, na primer, podložan cepanju na niskom pH u lizozomskom odeljku ili podložan cepanju proteazama, kao što su proteaze koje se poželjno eksprimiraju u tumorskom tkivu, kao što su katepsini (npr. katepsin B, C, D).
[0167] Za dalje razmatranje vrsta citotoksina, linkera i postupaka konjugovanja terapeutskih agenasa sa antitelima, vidite takođe Saito, G i sar. (2003) Adv Drug Deliv Rev; 55:199-215; Trail, PA i sar. (2003) Cancer Immunol Immunother; 52:328-337; Payne, G (2003) Cancer Cell; 3:207-212; Allen, TM (2002) NatRev Cancer; 2:750-763; Pastan, I i Kreitman, R J (2002) Curr Opin Investig Drugs; 3:1089-1091; Senter, PD i Springer, CJ (2001) Adv Drug Deliv Rev; 53:247-264.
[0168] Antitela iz predmetnog otkrića takođe mogu da se konjuguju sa radioaktivnim izotopom radi generisanja citotoksičnih radiofarmaceutika, koji se takođe nazivaju i radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji se mogu konjugovati sa antitelima za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu uključuju, ali nisu ograničeni na, jod131, indijum111, itrijum90 i lutecijum177. Postupci za pripremu radioimunokonjugata su utvrđeni u struci. Primeri radioimunokonjugata su komercijalno dostupni, uključujući Zevalin™ (DEC Pharmaceuticals) i Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), i slični postupci se mogu koristiti za pripremu radioimunokonjugata koristeći antitela iz otkrića.
[0169] Konjugati antitela iz otkrića mogu da se koriste za modifikovanje datog biološkog odgovora, a funkcionalni ostatak leka ne treba da se tumači sa ograničenjem na klasične terapeutske agense. Na primer, funkcionalni ostatak leka može biti protein ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, enzimski aktivan toksin ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili egzotoksin difterije ili faktori rasta.
[0170] Tehnike za konjugovanje takvih terapeutskih funkcionalnih ostataka sa antitelom su dobro poznati, vidite, npr. Amon i sar. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld i sar.
(izd.), str.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i sar. "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2. izd.), Robinson i sar. (izd.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.
1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera i sar. (izd.), str.
475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i sar. (izd.), str. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe i sar. "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", (1982) Immunol Rev; 62:119-58.
2.9) Heterokonjugatna antitela
[0171] Heterokonjugatna antitela takođe čine otelotvorenje predmetnog otkrića. Heterokonjugatna antitela su sastavljena od dva kovalentno spojena antitela nastala korišćenjem bilo kog pogodnog postupka unakrsnog vezivanja, pri čemu je najmanje jedno od spojenih antitela antitelo prema otkriću koje vezuje IL-18 ali ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP). Vidite, na primer, US 4,676,980.
2.10) Konstruisanje okvira
[0172] Konstruisana antitela iz otkrića uključuju ona u kojima su načinjene modifikacije ostataka okvira u VH i/ili VL, npr. radi poboljšanja svojstava antitela. Takve modifikacije okvira su tipično načinjene da bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je "povratno mutiranje" jednog ili više ostataka okvira u odgovarajuću sekvencu germinativne linije. Specifičnije, antitelo koje je prošlo somatsku mutaciju može sadržati ostatke okvira koji se razlikuju od sekvence germinativne linije od koje je antitelo dobijeno. Takvi ostaci mogu da se identifikuju poređenjem sekvenci okvira antitela sa sekvencama germinativne linije od kojih je antitelo dobijeno. Da bi se sekvence regiona okvira vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, somatske mutacije mogu biti "povratno mutirane" u sekvencu germinativne linije, na primer, putem mutageneze usmerene na mesto ili PCR-posredovane mutageneze. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena otkrićem.
[0173] Drugi tip modifikacija okvira uključuje mutaciju jednog ili više ostataka u regionu okvira, ili čak u jednom ili više CDR regiona, kako bi se uklonili epitopi T ćelija, čime se smanjuje potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se takođe naziva "deimunizacija", i detaljnije je opisan u U.S. Patentnoj publikaciji br.20030153043 čiji su autori Carr i sar.
2.11) Ostale modifikacije
[0174] Pored modifikacija načinjenih u regionima okvira ili CDR, ili kao njihova alternativa, antitela iz otkrića se mogu konstruisati da uključe modifikacije u Fc regionu, tipično da bi se izmenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što je poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc receptora i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela. Nadalje, antitelo iz otkrića može biti hemijski modifikovano (npr. jedan ili više hemijskih funkcionalnih ostataka se može vezati za antitelo) ili modifikovano da se izmeni njegova glikozilacija, ponovo radi izmene jednog ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svako od ovih otelotvorenja iz otkrića je detaljnije opisano u nastavku. Numerisanje ostataka u Fc regionu je prema Kabatovom EU indeksu.
[0175] U jednom otelotvorenju otkrića, region šarke CH1 je modifikovan tako da je broj cisteinskih ostataka u regionu šarke izmenjen, npr. povećan ili smanjen. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br. 5,677,425 čiji su autori Bodmer i sar. Broj cisteinskih ostataka u regionu šarke CH1 je izmenjen, na primer, radi olakšavanja sklapanja lakih i teških lanaca ili radi povećanja ili smanjenja stabilnosti antitela.
[0176] U drugom otelotvorenju otkrića, Fc region šarke antitela je mutiran da smanji biološki poluživot antitela. Specifičnije, uvedena je jedna ili više mutacija aminokiselina u CH2-CH3 region interfejsa domena fragmenta Fc šarke tako da antitelo ima umanjeno vezivanje stafilokoknog proteina A (SpA) u odnosu na SpA vezivanje nativnog domena Fc šarke. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br.6,165,745 čiji su autori Ward i sar.
[0177] U drugom otelotvorenju otkrića, antitelo je modifikovano da bi se produžio njegov biološki poluživot. Mogući su raznovrsni pristupi. Na primer, može se uvesti jedna ili više od sledećih mutacija: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u U.S. Patentu br. 6,277,375, Ward. Alternativno, da bi se produžio biološki poluživot, antitelo se može izmeniti u CH1 ili CL regionu kako bi sadržalo epitop za vezivanje receptora spasa (eng. salvage receptor) uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što opisuju U.S. patenti br. 5,869,046 i 6,121,022 autora Presta i sar.
[0178] U još jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog ostatka aminokiseline različitim ostatkom aminokiseline da bi se izmenile efektorske funkcije antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina se može zameniti različitim aminokiselinskim ostacima tako da antitelo ima izmenjen afinitet prema efektorskom ligandu ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost matičnog antitela. Efektorski ligand prema kome je afinitet izmenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br. 5,624,821 i 5,648,260 čiji su autori Winter i sar.
[0179] U drugom otelotvorenju otkrića, jedna ili više aminokiselina odabranih od aminokiselinskih ostataka se može zameniti različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeno vezivanje C1q i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br. 6,194,551 čiji su autori Idusogie i sar.
[0180] U drugom otelotvorenju otkrića, jedan ili više aminokiselinskih ostataka je izmenjen kako bi se time izmenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je detaljnije opisan u PCT Publikaciji WO 94/29351 čiji su autori Bodmer i sar.
[0181] U još jednom otelotvorenju otkrića, Fc region je modifikovan da poveća sposobnost antitela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela prema Fcγ receptoru putem modifikovanja jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup je dalje opisan u PCT Publikaciji WO 00/42072 čiji je autor Presta. Štaviše, mesta vezivanja na humanom IgG1 za FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcRn su mapirana, i opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem (vidi Shields, R.L. i sar. (2001) J. Biol. Chem 276:6591-6604).
[0182] U određenim otelotvorenjima otkrića, koristi se Fc domen IgG1 izotipa. U nekim specifičnim otelotvorenjima, koristi se mutantna varijanta Fc fragmenta IgG1, npr. utišani Fc IgG1 koji umanjuje ili eliminiše sposobnost fuzionog polipeptida da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da se vezuje za Fcγ receptor. Primer utišane mutacije IgG1 izotipa je kada je leucinski ostatak zamenjen alaninskim ostatkom na aminokiselinskim položajima 234 i 235, kako opisuju Hezareh i sar., J. Virol (2001); 75(24):12161-8.
[0183] U određenim otelotvorenjima otkrića, Fc domen je mutant koji sprečava glikozilaciju na poziciji 297 Fc domena. Na primer, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju ostatka asparagina na položaju 297. Jedan primer takve aminokiselinske supstitucije je zamena N297 glicinom ili alaninom.
[0184] U još jednom otelotvorenju otkrića, glikozilacija antitela je izmenjena. Na primer, može se napraviti aglikozilovano antitelo (tj. antitelo bez glikozilacije). Glikozilacija može biti izmenjena da bi se, na primer, povećao afinitet antitela prema antigenu. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije u sekvenci antitela. Na primer, može se načiniti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje dovode do eliminacije jednog ili više mesta glikozilacije varijabilnog regiona okvira, čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela prema antigenu. Takav pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br. 5,714,350 i 6,350,861 čiji su autori Co i sar.
[0185] Dodatno ili alternativno, može se napraviti antitelo koje ima izmenjenu vrstu glikozilacije, kao što je hipofukozilovano antitelo koje ima smanjene količine fukozil ostataka ili antitelo koje ima povećane bisektujuće strukture GlcNac. Pokazalo se da takvi izmenjeni šabloni glikozilacije povećavaju ADCC sposobnost antitela. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, eksprimiranjem antitela u ćeliji domaćinu sa izmenjenom mašinom za glikozilaciju. Ćelije sa izmenjenim aparatom za glikozilaciju su opisane u struci, i mogu se koristiti kao ćelije domaćini za eksprimiranje rekombinantnih antitela iz otkrića, čime se proizvodi antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1,176,195 čiji su autori Hang i sar. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno ometanim FUT8 genom koji kodira fukozil transferazu, tako da antitela eksprimirana u takvoj ćelijskoj liniji ispoljavaju hipofukozilaciju. Stoga, u jednom otelotvorenju otkrića, antitela se proizvode rekombinantnom ekspresijom u ćelijskoj liniji koja ispoljava šablone hipofukozilacije, na primer, ćelijskoj liniji sisara sa deficitarnom ekspresijom FUT8 gena koji kodira fukoziltransferazu. PCT Publikacija WO 03/035835 čiji je autor Presta opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lecl3 ćelije, sa smanjenom sposobnošću povezivanja fukoze sa Asn(297)-povezanim ugljenim hidratima, što takođe dovodi do hipofukozilacije antitela eksprimiranih u toj ćeliji domaćinu (vidite takođe Shields, R.L. i sar. 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). PCT Publikacija WO 99/54342 čiji su autori Umana i sar. opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikozil transferaze koje modifikuju glikoprotein (npr. beta(1,4)-N acetilglukozaminil transferaza III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama pokazuju porast bisektujućih GlcNac struktura, što dovodi do povećane ADCC aktivnosti antitela (vidi takođe Umana i sar., 1999, Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativno, antitela iz otkrića se mogu proizvesti u kvascu ili filamentoznoj gljivi konstruisanoj za šablon glikozilacije sličan onom kod sisara, i sposobnim da proizvodi antitela bez fukoze kao šablona glikozilacije (vidite, na primer, EP1297172B1).
[0186] Druga modifikacija antitela koja se ovde razmatra u otkriću je pegilovanje. Antitelo može biti pegilovano kako bi se, na primer, produžio biološki poluživot antitela (npr. u serumu). Da bi se antitelo pegilovalo, antitelo, ili njegov fragment, tipično se podvrgava reakciji sa polietilen glikolom (PEG), kao što je reaktivni estar ili aldehidni derivat PEG, u uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa vezuje za antitelo ili fragment antitela. Pegilovanje se može izvršiti reakcijom acilovanja ili reakcijom alkilovanja sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvornim u vodi). Kako se ovde koristi, termin "polietilen glikol" treba da obuhvati svaki od oblika PEG koji je korišćen za derivatizaciju drugih proteina, kao što je mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi polietilen glikol ili polietilen glikol maleimid. U određenim otelotvorenjima otkrića, antitelo koje se pegiluje je aglikozilovano antitelo. Postupci pegilovanja proteina su poznati u struci, i mogu se primeniti na antitela iz otkrića. Vidi, na primer, EP 0154 316 čiji su autori Nishimura i sar. i EP 0401 384 čiji su autori Ishikawa i sar.
[0187] Druga modifikacija antitela koja se razmatra u okviru otkrića je konjugat ili fuzija proteina barem iz antigen-vezujućeg regiona antitela iz otkrića sa proteinom seruma, kao što je humani albumin iz seruma ili njegov fragment, radi produženja poluživota dobijenog molekula. Takav pristup, na primer, opisuju Ballance i sar. EP0322094.
3. Graftovanje antigen-vezujućih domena u alternativne okvire ili konstrukcije
[0188] Širok spektar okvira ili skeleta antitela/imunoglobulina može da se koristi sve dok dobijeni polipeptid uključuju najmanje jedan vezujući region koji specifično vezuje IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP. Takvi okviri ili konstrukcije uključuju 5 glavnih idiotipova humanih imunoglobulina ili njegove fragmente (kao što su oni prikazani u drugim delovima ovog teksta), i uključuju imunoglobuline drugih životinjskih vrsta, poželjno je sa humanizovanim aspektima. Antitela sa jednim teškim lancem poput onih koja su identifikovana kod kamelida su od posebnog interesa u tom pogledu. Stručnjaci za ovu oblast nastavljaju da razvijaju i otkrivaju nove okvire, konstrukcije i fragmente.
3.1) Neimunoglobulinski okviri
[0189] Mogu se koristiti poznati ili budući neimunoglobulinski okviri i skeleti, sve dok sadrže vezujući region specifičan za IL-18 i koji ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP. Takva jedinjenja se ovde nazivaju "polipeptidi koji sadrže vezujući region specifičan za cilj". Poznati neimunoglobulinski okviri ili skeleti uključuju, ali nisu ograničeni na, adnektine (Adnectins® - Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), DARPine, avimere, Affibodys® (Affibody AG, Švedska), antikaline (Pieris Proteolab AG, Freising, Nemačka), Affilins® (gamakristalin ili ubikvitin; Scil Proteins GmbH, Halle, Nemačka) i mimetike proteinskog epitopa (PEM; Polyphor® Ltd, Allschwil, Švajcarska).
3.2) Fibronektinski molekuli i adnektini
[0190] U jednom aspektu otkrića, vezujući molekul je molekul fibronektina. Molekul fibronektina ima skelet zasnovan poželjno na domenu fibronektina tip III (npr. deseti modul fibronektina tip III (10 Fn3 domen)). U jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je adnektin (Adnectins®).
[0191] Domen fibronektina tip III ima 7 ili 8 beta lanaca koji su raspodeljeni između dve beta ravni, koje su upakovane jedna naspram druge kako bi formirale jezgro proteina, i dalje sadrže petlje (analogno CDR-ima) koje povezuju beta lance i izložene su rastvaraču. Postoje najmanje tri takve petlje na svakoj ivici sendviča beta ravni, pri čemu je ivica granica proteina pod normalnim uglom na smer beta lanaca (US 6,818,418).
[0192] Ove konstrukcije bazirane na fibronektinu nisu imunoglobulin, mada je ukupan sklop blisko povezan sa sklopom najmanjeg funkcionalnog fragmenta antitela, varijabilnim regionom teškog lanca, koji sadrži celokupnu jedinicu za prepoznavanje antigena u IgG kamile ili lame. Zbog te strukture, neimunoglobulinsko antitelo podražava antigen-vezujuća svojstva koja su po prirodi i afinitetu slična kao kod antitela. Te konstrukcije se mogu koristiti u strategiji randomizacije i mešanja petlji in vitro koja je slična postupku afinitetnog sazrevanja antitela in vivo. Ovi molekuli na bazi fibronektina mogu se koristiti kao skeleti gde regioni petlje molekula mogu biti zamenjeni CDR-ima iz otkrića koristeći standardne tehnike kloniranja.
[0193] Shodno tome, u jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je molekul fibronektina koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
[0194] U drugim otelotvorenjima otkrića, vezujući molekul je adnektin koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
3.3) DARPini
[0195] Ova tehnologija se zasniva na korišćenju proteina sa ponavljajućim modulima izvedenih iz ankirina kao konstrukcija za nošenje varijabilnih regiona koji mogu da se koriste za vezivanje za različite ciljeve. Ponavljajući modul ankirina je polipeptid sa 33 aminokiseline koji se sastoji od dva anti-paralelna α-heliksa i β-okreta. Vezivanje varijabilnih regiona je uglavnom optimizovano koristeći displej ribozoma.
[0196] Shodno tome, u jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je ankirin/DARPin koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
3.4) Avimeri
[0197] Avimeri se dobijaju iz prirodnog proteina koji sadrži A-domen kao što je LRP-1. Ti domeni se koriste u prirodi za protein-protein interakcije, i kod ljudi je preko 250 proteina strukturno zasnovano na A-domenima. Avimeri se sastoje od brojnih monomera "A-domena" (2-10) povezanih pomoću aminokiselinskih linkera. Mogu se kreirati avimeri koji se vezuju za ciljni antigen koristeći metodologiju opisanu, na primer, u US20040175756; US20050053973; US20050048512; i US20060008844.
[0198] Shodno tome, u jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je avimer koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
3.5) Affibody®
[0199] Affibody® su mali, jednostavni proteini sastavljeni od snopa od tri heliksa koji je na bazi skeleta jednog od IgG-vezujućih domena Proteina A. Protein A je površinski protein bakterije Staphylococcus aureus. Domen skeleta se sastoji od 58 aminokiselina, od kojih je 13 randomizovano da generišu biblioteke Affibody® sa velikim brojem varijanti liganada (vidite, npr. US 5,831,012). Molekuli Affibody® imitiraju antitela; oni imaju molekulsku masu od 6 kDa, u poređenju sa molekulskom masom antitela, koja je 150 kDa. Uprkos njihovoj maloj veličini, mesto vezivanja molekula Affibody® je slično kao za antitela.
[0200] Shodno tome, u jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je affibody koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
3.6) Anticalins®
[0201] Anticalins® su proizvodi koje je razvila kompanija Pieris ProteoLab AG. Dobijeni su od lipokalina, rasprostranjene grupe malih i robusnih proteina koji su obično uključeni u fiziološki transport ili skladištenje hemijski osetljivih ili nerastvornih supstanci. Nekoliko prirodnih lipokalina se javlja u tkivu ili telesnim tečnostima čoveka.
[0202] Arhitektura proteina podseća na imunoglobuline, sa hipervarijabilnim petljama povrh čvrstog okvira. Međutim, za razliku od antitela ili njihovih rekombinantnih fragmenata, lipokalini su sastavljeni od pojedinačnog lanca polipeptida sa 160 do 180 aminokiselinskih ostataka, te su neznatno veći od pojedinačnog imunoglobulinskog domena.
[0203] Set od četiri petlje, koji čini džep za vezivanje, ispoljava izraženu strukturnu plastičnost i toleriše širok raspon bočnih lanaca. Mesto vezivanja se tako može preoblikovati u vlasničkom postupku kako bi prepoznavalo propisana ciljna jedinjenja ili različite oblike sa velikim afinitetom i specifičnošću.
[0204] Jedan protein iz familije lipokalina, bilin-vezujući protein (BBP) dobijen od velikog kupusara, korišćen je za razvoj antikalina putem mutageneze seta od četiri petlje. Jedan primer patentne prijave koja opisuje „antikaline“ je PCT WO 199916873.
[0205] Shodno tome, u jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je antikalin koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
3.7) Affilin®
[0206] Affilin® molekuli su mali neimunoglobulinski proteini koji su projektovani za specifične afinitete prema proteinima i malim molekulima. Novi Affilin® molekuli se mogu veoma brzo izabrati iz dve biblioteke, od kojih se svaka zasniva na različitim proteinima konstrukcije koji su izvedeni od ljudi.
[0207] Affilin™ molekuli ne pokazuju bilo kakvu strukturnu homologost sa imunoglobulinskim proteinima. Scil Proteins koristi dve Affilin™ konstrukcije, od koji je jedna gama kristalin, humani strukturni protein očnog sočiva, a druga je "ubikvitinska" superfamilija proteina. Obe humane konstrukcije su veoma male, pokazuju veliku temperaturnu stabilnost i skoro da su otporne na pH promene i denaturišuće agense. Velika stabilnost je pre svega posledica proširene strukture beta ravni proteina. Primeri proteina dobijenih od gama kristalina su opisani u WO200104144 i primeri proteina „nalik ubikvitinu“ su opisani u WO2004106368
[0208] Shodno tome, u jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je afilin koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
3.8) Mimetici proteinskog epitopa
[0209] Mimetici proteinskog epitopa (PEM) su ciklični molekuli srednje veličine slični peptidu (oko 1-2 kDa) koji oponašaju sekundarnu strukturu beta ukosnice proteina, koja je glavna sekundarna struktura uključena u interakciju protein-protein.
[0210] Shodno tome, u jednom otelotvorenju otkrića, vezujući molekul je mimetik proteinskog epitopa koji se vezuje (npr. specifično se vezuje ) za IL18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
4. Polinukleotidi koji kodiraju vezujuće molekule iz pronalaska
[0211] Drugi aspekt pronalaska odnosi se na izolovane polinukleotide koji kodiraju vezujuće molekule iz pronalaska.
[0212] Polinukleotidi varijabilnog domena teškog lanca koji kodiraju ovde opisana izolovana humana antitela su prikazani u SEQ ID NOs: 15, 19, 23, 26, 29, 32, 35, 38, 41, 84, 88, 91, 94, 113, 131, 139, 146 i 152. Polinukleotidi varijabilnog domena lakog lanca koji kodiraju ovde opisana izolovana humana antitela su prikazani u SEQ ID NOs: 17, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 86, 89, 92, 95, 115, 133, 141, 148 i 154. Ostali polinukleotidi koji kodiraju antitela iz pronalaska uključuju polinukleotide koji su mutirani, ali ipak imaju najmanje 60, 70, 80, 90 ili 95 posto identičnosti sa prethodno opisanim sekvencama kao što su polinukleotidi koji su optimizovani za ekspresiju proteina u ćelijama sisara, na primer, CHO ćelijskim linijama.
Stavka 89: Varijanta nukleinske kiseline, pri čemu, ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida je promenjeno delecijom, insercijom ili supstitucijom nukleotida u varijabilnim regionima u poređenju sa varijabilnim regionima prikazanim u prethodno opisanim sekvencama.
Stavka 90: Izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegovog fragmenta prema otkriću, pri čemu polinukleotid:
a. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 38 ili SEQ ID NO: 41 ili SEQ ID NO: 84 ili SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 91 ili SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 113 ili SEQ ID NO: 131 ili SEQ ID NO: 139 ili SEQ ID NO: 146 ili SEQ ID NO: 152 ili
b. sadrži SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 38 ili SEQ ID NO: 41 ili SEQ ID NO: 84 ili SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 91 ili SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 113 ili SEQ ID NO: 131 ili SEQ ID NO: 139 ili SEQ ID NO: 146 ili SEQ ID NO: 152 ili
c. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 15 ili SEQ ID NO: 19 ili SEQ ID NO: 23 ili SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 29 ili SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 35 ili SEQ ID NO: 38 ili SEQ ID NO: 41 ili SEQ ID NO: 84 ili SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 91 ili SEQ ID NO: 94 ili SEQ ID NO: 113 ili SEQ ID NO: 131 ili SEQ ID NO: 139 ili SEQ ID NO: 146 ili SEQ ID NO: 152.
Stavka 91: Izolovani polinukleotid koji kodira varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta prema otkriću, pri čemu polinukleotid:
a. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 36 ili SEQ ID NO: 39 ili SEQ ID NO: 42 ili SEQ ID NO: 86 ili SEQ ID NO: 89 ili SEQ ID NO: 92 ili SEQ ID NO: 95 ili SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 133 ili SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 148 ili SEQ ID NO: 154 ili
b. sadrži SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 36 ili SEQ ID NO: 39 ili SEQ ID NO: 42 ili SEQ ID NO: 86 ili SEQ ID NO: 89 ili SEQ ID NO: 92 ili SEQ ID NO: 95 ili SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 133 ili SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 148 ili SEQ ID NO: 154 ili c. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 30 ili SEQ ID NO: 33 ili SEQ ID NO: 36 ili SEQ ID NO: 39 ili SEQ ID NO: 42 ili SEQ ID NO: 86 ili SEQ ID NO: 89 ili SEQ ID NO: 92 ili SEQ ID NO: 95 ili SEQ ID NO: 115 ili SEQ ID NO: 133 ili SEQ ID NO: 141 ili SEQ ID NO: 148 ili SEQ ID NO: 154.
Stavka 92: Izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac antitela prema otkriću, pri čemu polinukleotid:
a. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 159 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155; ili
b. sadrži SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 159 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155; ili
c. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 159 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155.
Stavka 93: Izolovani polinukleotid koji kodira laki lanac antitela prema otkriću, pri čemu polinukleotid:
a. je najmanje 90% identičan sekvenci SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157; ili
b. sadrži SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157; ili
c. suštinski se sastoji od SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157.
[0213] Polinukleotid može biti prisutan u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili može biti u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Polinukleotid je „izolovan“ ili „načinjen suštinski čistim“ kada je prečišćen od ostalih ćelijskih komponenti ili ostalih kontaminanata, npr. ostalih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, koristeći standardne tehnike, uključujući alkalni/SDS tretman, razdvajanje traka pomoću CsCl, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge koje su dobro poznate u struci. Vidi, F. Ausubel, i sar. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Polinukleotid iz otkrića može biti, na primer, DNK ili RNK, i može ili ne mora da sadrži sekvence introna. U jednom otelotvorenju, polinukleotid je molekul cDNK. Polinukleotid može da bude prisutan u vektoru, kao što je vektor displeja faga ili rekombinantni plazmidni vektor.
[0214] Polinukleotidi iz pronalaska se mogu dobiti koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Za antitela koja eksprimiraju hibridomi (npr. hibridomi pripremljeni od transgenih miševa koji nose gene humanog imunoglobulina, kako je dalje opisano u nastavku), cDNK koje kodiraju lake i teške lance antitela načinjenog putem hibridoma se mogu dobiti pomoću standardne PCR amplifikacije ili tehnika kloniranja cDNK. Za antitela dobijena iz biblioteke gena imunoglobulina (npr. koristeći tehnike displeja faga), polinukleotidi koji kodiraju antitelo se mogu izolovati iz različitih klonova faga koji su članovi biblioteke.
[0215] Kada se dobiju DNK fragmenti koji kodiraju VH i VL segmente, ti DNK fragmenti se mogu dalje obrađivati putem standardnih tehnika rekombinacije DNK, na primer, radi konvertovanja gena varijabilnog regiona u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U tim manipulacijama, VL- ili VH-kodirajući fragment DNK se operativno povezuje sa drugim molekulom DNK, ili sa fragmentom koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Termin "operativno povezan", kako se koristi u ovom kontekstu, treba da znači da su dva fragmenta DNK spojena na funkcionalan način, na primer, tako da sekvence aminokiselina koje su kodirane sa dva fragmenta DNK ostanu u okviru, ili tako da se protein eksprimira pod kontrolom željenog promotera.
[0216] Izolovana DNK koja kodira VH region može da se konvertuje u gen teškog lanca kompletne dužine putem operativnog povezivanja VH-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvenca gena konstantnog regiona humanog teškog lanca je poznata u struci (vidite npr. Kabat, E. A., i sar. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija br. 91-3242), i DNK fragmenti koji obuhvataju te regione se mogu dobiti putem standardne PCR amplifikacije. Konstantni region teškog lanca može da bude konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca se bira među izotipovima IgG1. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, VH-kodirajuća DNK može operativno da se poveže sa drugim molekulom DNK koji kodira samo konstantni region teškog lanca CH1.
[0217] Izolovana DNK koja kodira VL region može da se konvertuje u gen lakog lanca kompletne dužine (kao i u gen lakog lanca Fab) pomoću operativnog povezivanja VL-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog teškog lanca su poznate u struci (vidite npr. Kabat, E. A., i sar. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publikacija br. 91-3242), i DNK fragmenti koji obuhvataju te regione se mogu dobiti putem standardne PCR amplifikacije. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantni region.
[0218] Kako bi se kreirao scFv gen, VH i VL kodirajući fragmenti DNK su operativno povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr. kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da se VH i VL sekvence mogu eksprimirati kao neprekidni jednolančani protein, sa VL i VH regionima spojenim putem fleksibilnog linkera (vidite npr.
Bird i sar. 1988 Science 242:423-426; Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty i sar. (1990) Nature 348:552-554).
[0219] Polinukleotid prema bilo kojoj od stavki 89 do 93 može biti in vitro modifikovan na takav način da, kada se injektuje u ćeliju sisara, sprečava digestiju polinukleotida i omogućava da translacioni aparat ćelije sisara proizvodi antitelo počevši od modifikovanog polinukleotida (kao što je opisano u U.S. Pat. br.8,278,036 B2 autora Kariko i sar.). Takva in vitro sintetisana modifikovana RNK može zatim biti injektovana u ćelije sisara ili u pacijenta kao deo genske terapije.
[0220] Stoga, drugi aspekt predmetnog otkrića obuhvata postupak za indukovanje ćelije sisara da proizvodi antitelo kako je ovde opisano, i postupak obuhvata: dovođenje u kontakt navedene ćelije sisara sa in vitro sintetisanom modifikovanom RNK dobijenom od polinukleotida prema bilo kojoj od stavki 89 do 93, pri čemu pomenuta in vitro sintetisana modifikovana RNK sadrži jednu ili više modifikacija, kako je opisano u U.S. Pat. br.
8,278,036 B2.
5. Proizvodnja antitela
[0221] Monoklonska antitela (mAb) mogu da se proizvedu raznovrsnim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela, npr. standardnu tehniku hibridizacije somatske ćelije koju su dali Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495. Mogu se koristiti brojne tehnike za proizvodnju monoklonskog antitela, npr. viralna ili onkogena transformacija B limfocita.
[0222] Imunizacioni protokoli i tehnike za izolovanje imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u struci. Takođe su poznati i fuzioni partneri (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i fuzione procedure.
[0223] Himerna ili humanizovana monoklonska antitela predmetnog pronalaska se mogu pripremiti na osnovu sekvence mišjeg monoklonskog antitela pripremljenog kako je prethodno opisano. DNK koja kodira teški i laki lanac imunoglobulina se može dobiti od željenog mišjeg hibridoma i konstruisati da sadrži sekvence nemišjeg (npr. humanog) imunoglobulina koristeći standardne tehnike molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanim konstantnim regionima korišćenjem metoda poznatih u struci (vidi npr. U.S. Patent br.
4,816,567, Cabilly i sar.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu da se ubace u humani okvir korišćenjem metoda poznatih u struci. Vidi npr. U.S. Patent br.
5,225,539, Winter, i U.S. Patente br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen i sar.
[0224] Humana monoklonska antitela se mogu generisati korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunskog sistema umesto mišjeg sistema. Ti transgeni i transhomozomski miševi uključuju miševe koji se ovde nazivaju HuMAb miševi, odnosno KM miševi, a kolektivno se ovde nazivaju "humanim Ig miševima".
[0225] HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) sadrži minilokuse gena humanog imunoglobulina koji kodiraju nepreuređene imunoglobulinske sekvence humanog teškog (µ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanca (vidi npr. Lonberg, i sar. (1994) Nature; 368(6474): 856-859). Shodno tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ, i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca prolaze promenu klase i somatsku mutaciju radi generisanja monoklonskog humanog IgGκ velikog afiniteta (Lonberg, N i sar. (1994) gore; pregled dat u Lonberg, N (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N i Huszar, D (1995) Intern Rev Immunol;13: 65-93, i Harding, F i Lonberg, N (1995) Ann N Y Acad Sci; 764:536-546). Priprema i korišćenje HuMAb miševa, i genomske modifikacije koje takvi miševi nose, dalje su opisane u Taylor, L i sar.; (1992) Nucl Acids Res; 20:6287-6295; Chen, J i sar. (1993) Int Immunol; 5: 647-656; Tuaillon i sar. (1993) Proc Natl Acad Sci USA; 94:3720-3724; Choi i sar. (1993) Nature Gen; 4:117-123; Chen, J i sar. (1993) EMBO J; 12: 821-830; Tuaillon i sar. (1994) J Immunol; 152:2912-2920; Taylor, L i sar. (1994) Int Immuno; 6:579-591; i Fishwild, D i sar. (1996) Nature Biotech; 14: 845-851. Vidite dalje U.S. Patente br. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; sve od autora Lonberg i Kay; U.S. Patent br. 5,545,807 autora Surani i sar; PCT Publikacije br. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 i WO 99/45962, sve od autora Lonberg i Kay; i PCT Publikaciju br. WO 01/14424 autora Korman i sar.
[0226] U jednom otelotvorenju otkrića, humana antitela prema pronalasku se mogu odgajiti koristeći miša koji nosi sekvence humanog imunoglobulina na transgenima i transhromozomima, kao što je miš koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca. Takvi miševi, koji se ovde nazivaju "KM miševi", opisani su detaljno u PCT Publikaciji WO 02/43478, Ishida i sar.
[0227] Još dalje, alternativni sistemi transgenih životinja koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u struci, i mogu se koristiti za dobijanje antitela iz pronalaska. Na primer, može se koristiti alternativni transgeni sistem koji se naziva Xenomouse (Abgenix, Inc.). Takvi miševi su opisani, na primer, u U.S. Patentima br. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963 autora Kucherlapati i sar.
[0228] Štaviše, alternativni sistemi transhromozomskih životinja koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u struci, i mogu se koristiti za dobijanje antitela iz pronalaska. Na primer, mogu da se koriste miševi koji istovremeno nose transhromozome humanog teškog lanca i transhromozome humanog lakog lanca, koji se nazivaju „TC miševi“. Takve miševe opisuju Tomizuka i sar. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Nadalje, krave koje imaju transhromozome humanog teškog i lakog lanca opisane su u struci (Kuroiwa i sar.2002 Nature Biotech 20:889-894).
[0229] Humana rekombinantna antitela iz pronalaska takođe se mogu pripremiti koristeći postupke displeja faga za skrining biblioteka gena humanog imunoglobulina. Takvi postupci displeja faga za izolovanje humanih antitela su utvrđeni u struci i opisani u primerima u nastavku. Vidi na primer: U.S. Patente br. 5,223,409, 5,403,484 i 5,571,698, Ladner i sar.; U.S. Patente br. 5,427,908 i 5,580,717, Dower i sar.; U.S. Patente br. 5,969,108 i 6,172,197, McCafferty i sar.; i U.S. Patente br. 5,885,793, 6,521,404, 6,544,731, 6,555,313, 6,582,915 i 6,593,081, Griffiths i sar.
[0230] Humana monoklonska antitela iz pronalaska takođe mogu da se pripreme korišćenjem SCID miševa u kojima su rekonstituisane humane imunske ćelije tako da može da se generiše odgovor humanog antitela nakon imunizacije. Takvi miševi su opisani, na primer, u U.S. Patentima br.5,476,996 i 5,698,767, Wilson i sar.
[0231] Antitela iz pronalaska takođe mogu da se proizvode u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinacije DNK i metoda transfekcije gena na način dobro poznat u struci (npr. Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
[0232] Na primer, da bi se eksprimirala antitela ili njihovi fragmenti antitela, DNK koje kodiraju delimične ili cele lake i teške lance se mogu dobiti pomoću standardih tehnika molekularne biologije (npr. PCR amplifikacija ili kloniranje cDNK koristeći hibridom koji eksprimira željeno antitelo) i DNK se mogu ubaciti u klonirajuće ili ekspresione vektore tako da su geni operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U tom kontekstu, termin "operativno povezan" treba da znači da je gen antitela ligiran u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence u vektoru obavljaju svoju predviđenu funkciju regulisanja transkripcije i translacije gena antitela. Klonirajući ili ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence su izabrane tako da budu kompatibilni sa ekspresionom ćelijom domaćina koja se koristi. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu da se ubace u zaseban vektor ili, što je češće, oba gena se ubacuju u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se ubacuju u ekspresioni vektor pomoću standardnih metoda (npr. ligacijom komplementarnih mesta restrikcije na fragmentu gena antitela i vektoru, ili ligacijom tupog kraja kada nema mesta restrikcije). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela koja su ovde opisana mogu da se koriste za stvaranje gena antitela kompletne dužine bilo kog izotipa antitela putem njihovog umetanja u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teškog i lakog lanca željenog izotipa, tako da je VH segment operativno povezan sa CH segmentom (segmentima) u vektoru, i VL segment je operativno povezan sa CL segmentom u vektoru. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava lučenje lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može da se klonira u vektor tako da signalni peptid bude povezan u okviru sa amino terminusom gena lanca antitela. Signalni peptid može biti signalni peptid imunoglobulina ili heterologi signalni peptid (tj. signalni peptid neimunoglobulinskog proteina).
[0233] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje klonirajući ili ekspresioni vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida prema pronalasku.
[0234] Stavka 94: Klonirajući ili ekspresioni vektor koji sadrži najmanje jedan polinukleotid izabran od: SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 54 ili SEQ ID NO: 57 ili SEQ ID NO: 101 ili SEQ ID NO: 159 ili SEQ ID NO: 97 ili SEQ ID NO: 104 ili SEQ ID NO: 117 ili SEQ ID NO: 143 ili SEQ ID NO: 135 ili SEQ ID NO: 149 ili SEQ ID NO: 155 ili SEQ ID NO: 46 ili SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 55 ili SEQ ID NO: 58 ili SEQ ID NO: 102 ili SEQ ID NO: 161 ili SEQ ID NO: 99 ili SEQ ID NO: 105 ili SEQ ID NO: 119 ili SEQ ID NO: 145 ili SEQ ID NO: 137 ili SEQ ID NO: 151 ili SEQ ID NO: 157.
[0235] Pored polinukleotida koji kodiraju lance antitela, klonirajući ili ekspresioni vektori iz pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanaca antitela u ćeliji domaćinu. Termin "regulatorna sekvenca" treba da uključi promotere, pojačivače i druge ekspresione kontrolne elemente (npr. signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanca antitela. Takve regulatorne sekvence je, na primer, opisao Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Stručnjacima za ovu oblast će biti jasno da dizajn ekspresionog vektora, uključujući i odabir regulatornih sekvenci, može da zavisi od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, željeni nivo eksprimiranja proteina, itd. Regulatorne sekvence za ekspresiju ćelije domaćina sisara uključuju virusne elemente koji regulišu visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promoteri i/ili pojačivači dobijeni od citomegalovirusa (CMV), Simijan virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr. adenovirusni glavni kasni promoter (AdMLP)) i poliom. Alternativno, mogu da se koriste nevirusne regulatorne sekvence, kao što je promoter ubikvitina ili promoter P-globina. Dalje, regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRa promoterski sistem, koji sadrže sekvence ranog promotera SV40 i dugo terminalno ponavljanje virusa leukemije humane T ćelije tip 1 (Takebe, Y. i sar.1988, Mol. Cell. Biol.8:466-472).
[0236] Nadalje, klonirajući ili ekspresioni vektori iz pronalaska mogu imati dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr. poreklo replikacije) i selektabilni marker geni. Selektabilni marker gen olakšava izbor ćelije domaćina u koju će se uvesti vektor (vidi, npr. U.S. Pat. br.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, čiji su autori Axel i sar.). Na primer, selektabilni marker gen tipično dodeljuje otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju se vektor uvodi. Selektabilni marker geni uključuju gen dihidrofolat reduktaze (DHFR) (za upotrebu u dhfr ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418).
[0237] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira teške i lake lance se transficira u ćeliju domaćina putem standardnih tehnika. Različiti oblici termina „transfekcija“ treba da obuhvate širok spektar tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporacija, taloženje kalcijum fosfatom, transfekcija DEAE-dekstran i slično. Teorijski je moguće eksprimirati antitela iz pronalaska bilo u prokariotskim ili u eukariotskim ćelijama domaćinima. Ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, na primer u ćelijama domaćina sisara, kvasca ili filamentozne gljive, razmatra se jer je za takve eukariotske ćelije, a naročito za ćelije sisara, verovatnije nego za prokariotske ćelije da će sastaviti i lučiti ispravno složeno i imunološki aktivno antitelo. Objavljeno je da je prokariotska ekspresija gena antitela neefikasna za proizvodnju velikih prinosa aktivnog antitela (Boss, M. A. i Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13).
[0238] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela iz pronalaska su prokariotske ćelije, ćelije kvasca ili više eukariotske ćelije. Pogodne prokariotske ćelije uključuju eubakterije, npr. enterobacteriaceae kao što je Escherichia npr. E.coli (na primer ATCC 31, 446; 31, 537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella proteus, Salmonella npr. Salmonella typhimurium, Serratia npr. Serratia marcescens i Shigella kao i Bacilli poput B. subtilis i B. licheniformis (vidite DD 266710), Pseudomonas kao što je P. aeruginosa i Streptomyces. Od ćelija domaćina kvasca ili gljiva razmatraju se i Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (npr. ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), Yarrowia (EP402, 226), Pichia pastoris (EP183070, vidite takođe Peng i sar. (2004) J Biotechnol; 108:185-192), Candida, Trichoderma reesei (EP244234), Penicillium, Tolypocladium i domaćini Aspergillus poput A. nidulans i A. niger.
[0239] Iako se ćelije domaćini prokarioti i kvasci specifično razmatraju ovim pronalaskom, poželjno je, međutim, da su ćelije domaćini iz predmetnog pronalaska više eukariotske ćelije.
[0240] Shodno tome, u jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora koji sadrže polinukleotide kako je ovde opisano.
[0241] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje stabilno transformisanu ili transficiranu ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više polinukleotida kao što je ovde opisano.
[0242] Stavka 95: Stabilno transformirana ćelija domaćin koja sadrži vektor koji kodira teški lanac i/ili laki lanac izolovanog antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kojoj od stavki 1 do 88. Poželjno, takve ćelije domaćini sadrže prvi vektor koji kodira laki lanac i drugi vektor koji kodira pomenuti teški lanac.
[0243] Pogodne više eukariotske ćelije domaćini uključuju ćelije sisara poput COS-1 (ATCC br.CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), ćelijske linije bubrega humanog embriona 293, ćelija bubrega bebe hrčka (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC br: CRL 10314), 293 (ATCC br.CRL 1573), ćelija jajnika kineskog hrčka CHO (npr. CHO-K1 , ATCC br: CCL 61, DHFR-CHO ćelijske linije poput DG44 (vidite Urlaub i sar. (1986) Somatic Cell Mol.Genet.12, 555-556)), naročite one CHO ćelijske linije koje su prilagođene za uzgajanje u suspenziji, mišjih Sertoli ćelija, ćelija bubrega majmuna, ćelija bubrega afričkog zelenog majmuna (ATCC CRL-1587), HELA ćelija, ćelija bubrega psa (ATCC CCL 34), ćelija ljudskih pluća (ATCC CCL 75), Hep G2 i ćelija mijeloma ili limfoma npr. NSO (vidite US5807715), Sp2/0, YO.
[0244] Poželjno, ćelije domaćini sisara za eksprimiranje vezujućeg molekula iz pronalaska uključuju ćelijske linije sisara sa nedostatkom ekspresije FUT8 gena, na primer, kako je opisano u US6946292.
[0245] Ćelije domaćini transformisane vektorima koji kodiraju vezujuće molekule se mogu uzgajati bilo kojim postupkom poznatim stručnjacima za datu oblast. Ćelije domaćini se mogu uzgajati u bocama sa mešanjem, rotirajućim bocama ili sistemima sa šupljim vlaknima, ali je za proizvodnju u velikom obimu poželjno da se reaktori sa mešanjem koriste posebno za suspenzione kulture. Poželjno, rezervoari sa mešanjem se adaptiraju za aeraciju koristeći npr. prskalice, žljebove ili impelere sa malim smicanjem. Kod barbotažnih kolona i reaktora sa mešanjem pomoću vazduha može se koristiti direktna aeracija mehurićima vazduha ili kiseonika. Kada se ćelije domaćini uzgajaju u medijumu za uzgajanje bez seruma, poželjno je da se u medijum dodaje sredstvo za zaštitu ćelija, kao što je pluronik F-68, da bi se sprečilo oštećenje ćelija usled procesa aeracije. U zavisnosti od karakteristika ćelija domaćina, može se koristiti bilo koji mikronosač, jer supstrati za rast ćelijskih linija koje moraju da se učvršćuju ili ćelija mogu da se prilagode suspenzionoj kulturi (koja je tipična). Za uzgajanje ćelija domaćina, posebno ćelija domaćina beskičmenjaka, može da se koristi niz operativnih režima, kao što je ćelijska kultura sa dolivanjem, obrada ponovljenim postupkom (vidite Drapeau i sar. (1994) cytotechnology 15: 103-109), proces produžene šarže ili perfuziona kultura. Mada rekombinantno transformisane ćelije domaćini sisara mogu da se uzgajaju u medijumima koji sadrže serum, kao što je serum goveđeg embriona (FCS), poželjno je da se takve ćelije domaćini uzgajaju u sintetičkom medijumu bez seruma, kao što su objavili Keen i sar (1995) Cytotechnology 17:153-163, ili u komercijalno dostupnom medijumu, kao što je ProCHO-CDM ili UltraCHO(TM) (Cambrex NJ, USA), po potrebi uz dodatak izvora energije, kao što je glukoza, i sintetičkih faktora rasta, kao što je rekombinantni insulin. Uzgajanje ćelija domaćina bez seruma može zahtevati da se te ćelije prilagode rastu u uslovima bez seruma. Jedan pristup za prilagođavanje je uzgajanje takvih ćelija domaćina u medijumu koji sadrži serum, uz ponovljenu zamenu 80% medijuma za uzgajanje medijumom bez seruma, tako da ćelije domaćini nauče da se prilagođavaju u uslovima bez seruma (vidite npr. Scharfenberg K i sar. (1995) u Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.G. i sar izd.), str.619-623, Kluwer Academic publishers).
Vezujući molekuli iz pronalaska izlučeni u medijum mogu se izolovati i prečistiti korišćenjem različitih tehnika kako bi se obezbedio stepen čistoće pogodan za nameravanu upotrebu. Na primer, upotreba izolovanih antitela iz pronalaska u lečenju humanih pacijenata obično zahteva najmanje 95% čistoće, češće 98% ili 99% ili veću čistoću (u poređenju sa sirovim medijumom za uzgajanje). U prvom slučaju, ćelijski otpad iz medijuma za uzgajanje se uobičajeno uklanja koristeći centrifugiranje, a zatim korak izbistravanja supernatanta koristeći npr. mikrofiltraciju, ultrafiltraciju i/ili dubinsku filtraciju. Dostupne su brojne druge tehnike, kao što je dijaliza i gel elektroforeza, i hromatografske tehnike kao što je hidroksipatitna (HA), afinitetna hromatografija (opciono sa sistemom afinitetnog obeležavanja, kao što je polihistidin) i/ili hromatografija hidrofobne interakcije (hydrophobic interaction chromatography, HIC, vidite US5429746). U jednom otelotvorenju otkrića, antitela iz pronalaska, nakon raznih koraka prečišćavanja, hvataju se korišćenjem afinitetne hromatografije sa proteinom A ili G, nakon čega slede dalji hromatografski koraci poput jonoizmenjivačke i/ili HA hromatografije, anjonske ili katjonske izmenjivačke, gel hromatografije i taloženja amonijum sulfatom. Uobičajeno, koriste se i različiti koraci uklanjanja virusa (npr. nanofiltracija korišćenjem npr. DV-20 filtera). Praćenjem ovih različitih koraka, dobija se prečišćeni (poželjno monoklonski) preparat koji sadrži najmanje 75 mg/ml ili više, npr. 100 mg/ml ili više, izolovanog antitela iz pronalaska ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, i stoga čini otelotvorenje otkrića. Takvi preparati su pogodno suštinski bez agregiranih oblika antitela iz pronalaska.
[0246] Bakterijski sistemi se mogu koristiti za ekspresiju neimunoglobulinskih vezujućih molekula koji su prethodno opisani. Bakterijski sistemi su takođe posebno prikladni za ekspresiju fragmenata izolovanog antitela. Takvi fragmenti su lokalizovani unutar ćelije ili u periplazmi. Nerastvorljivi proteini periplazme se mogu ekstraktovati i ponovo složiti kako bi gradili aktivne proteine u skladu sa postupcima poznatim stručnjacima za datu oblast, vidite Sanchez i sar. (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20 i Cu pit PM i.sar. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277.
[0247] Shodno tome, u jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju vezujućeg molekula koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina u uslovima koji su pogodni za proizvodnju vezujućeg molekula, pri čemu ćelija domaćin sadrži vektor kako je ovde opisano.
Stavka 95: Postupak proizvodnje humanog antitela ili njegovog fragmenta prema bilo kojoj od stavki 1 do 88, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina u uslovima koji su pogodni za proizvodnju vezujućeg molekula, pri čemu ćelija domaćin sadrži vektor kako je ovde opisano.
6. Farmaceutske kompozicije
[0248] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže vezujući molekul koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0249] Stavka 96: Farmaceutske kompozicije koje sadrže humano antitelo ili njegov fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 88 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0250] Kompozicije mogu dodatno da sadrže druge terapeutske agense koji su pogodni za lečenje ili prevenciju dole navedenih ljudskih bolesti ili poremećaja. Farmaceutski nosači pojačavaju ili stabilizuju kompoziciju, ili olakšavaju pripremu kompozicije. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju rastvarače, raspršivače, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, koji su fiziološki kompatibilni.
[0251] Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može se primeniti brojnim različitim postupcima poznatim u struci. Put i/ili način primene variraju u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjno je da primena bude intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili supkutana, ili primena blizu mesta cilja. Farmaceutski prihvatljivi nosači treba da budu pogodni za intravensku, intramuskularnu, supkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. putem injekcije ili infuzije). U zavisnosti od načina primene, aktivno jedinjenje (naročito hemijski entiteti male molekulske mase) može biti obloženo materijalom koji će štititi jedinjenje od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da inaktiviraju jedinjenje.
[0252] Kompozicija treba da bude sterilna i tečna. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, putem premaza poput lecitina, putem održavanja potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i putem korišćenja surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput manitola ili sorbitola, i natrijum hlorid. Dugoročna apsorpcija injektabilnih kompozicija se može ostvariti putem uključivanja u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata ili želatina.
[0253] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu se pripremiti u skladu sa postupcima koji su odbro poznati i rutinski se koriste u struci. Vidite, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20. izd., 2000; i Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, izd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Farmaceutske kompozicije se poželjno proizvode u uslovima prema DPP. Uobičajeno, terapeutski efektivna ili efikasna doza antitela iz pronalaska koja je ovde opisana koristi se u farmaceutskoj kompoziciji iz pronalaska. Uobičajeno su formulisane u farmaceutski prihvatljivim doznim oblicima putem konvencionalnih postupaka koji su poznati stručnjacima za datu oblast. Dozni režimi su prilagođeni da obezbede optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može biti primenjen pojedinačni bolus, nekoliko podeljenih doza može biti primenjeno u određenom vremenskom periodu ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u pojedinačnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doze. Pojedinačni dozni oblik, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice prilagođene kao jedinične doze za subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem.
[0254] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu da variraju kako bi se dobila količina aktivnog sastojka koja je delotvorna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za konkretnog pacijenta, kompoziciju i način primene, pri čemu nije toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo zavisi od niza farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost konkretnih kompozicija iz predmetnog pronalaska koje se koriste ili njihovih estara, soli ili amida, načina primene, vremena primene, brzine izlučivanja konkretnog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne zdravstvene istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora.
[0255] Lekar može započeti sa dozama antitela iz pronalaska koje se koristi u farmaceutskoj kompoziciji pri nivoima koji su niži od potrebnih za postizanje željenog terapeutskog dejstva i postepeno povećavati dozu do postizanja željenog dejstva. Uopšteno, delotvorne doze kompozicije predmetnog pronalaska za lečenje fibrotičke bolesti ili poremećaja koji su ovde opisani variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, uključujući način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju, i da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Doze za lečenje treba titrisati kako bi se optimizovala bezbednost i efikasnost. Za primenu sa antitelom, doza je u opsegu od oko 0,0001 do 100 mg/kg, a češće 0,01 do 5 mg/kg telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti 1 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u rasponu od 1-10 mg/kg. Primer režima lečenja obuhvata primenu jednom na svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom na svakih 3 do 6 meseci.
[0256] Vezujući molekuli iz pronalaska, posebno antitela i njihovi fragmenti, obično se primenjuju u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti nedeljni, mesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu biti neredovni kako je naznačeno merenjem nivoa terapeutskog proteina u krvi pacijenta. U nekim postupcima, doza je prilagođena radi postizanja koncentracije antitela u plazmi od 1-1000 µg/ml, a u nekim postupcima 25-300 µg/ml. Alternativno, antitela iz pronalaska se mogu primenjivati kao formulacija sa produženim otpuštanjem, i u tom slučaju je potrebna ređa primena. Doza i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela u pacijentu. Generalno, humanizovana antitela pokazuju duži poluživot nego himerna antitela i nehumana antitela. Doza i učestalost primene mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. U profilaktičkim (preventivnim) primenama, primenjuje se relativno mala doza u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastave sa primanjem lečenja do kraja života. Kod terapeutskih primena, relativno velika doza u relativno kratkim intervalima je ponekad potrebna dok se progresija bolesti ne umanji ili ne završi, i poželjno dok pacijent ne ispolji delimično ili kompletno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu može biti davan profilaktički režim.
[0257] Farmaceutska kompozicija može da sadrži (npr. kao jedini terapeutski aktivni sastojak) vezujući molekul koji se vezuje za IL18 (npr. specifično se vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, pri čemu je vezujući molekul izabran od: izolovanog antitela, fragmenta izolovanog antitela, antitela sa jednim varijabilnim domenom, bi- ili multispecifičnog antitela, multivalentnog antitela, antitela sa dva varijabilna domena, imunokonjugata, molekula fibronektina, adnektina, DARPina, avimera, afitela, antikalina, afilina, mimetika epitopa proteina ili njihovih kombinacija, i pri čemu kompozicija dalje može da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0258] Kompozicija će obično biti u obliku koji se može primenjivati intravenski, inhalabilno ili supkutano. U drugim otelotvorenjima, kompozicija može biti u liofilizovanom obliku.
[0259] Poželjno, vezujući molekul je antitelo, poželjno monoklonsko netaknuto antitelo (npr. humano, humanizovano ili himerno) ili njegov fragment, kako je ovde opisano.
Stavka 97: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži;
(a) CDRH1 iz SEQ ID NO:3;
(b) CDRH2 iz SEQ ID NO:9;
(c) CDRH3 iz SEQ ID NO:5;
(d) CDRL1 iz SEQ ID NO:6;
(e) CDRL2 iz SEQ ID NO:7, i
(f) CDRL3 iz SEQ ID NO:8.
Stavka 98: Farmaceutska kompozicija prema stavci 97, pri čemu se antitelo takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 99: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži;
(a) CDRH1 iz SEQ ID NO:3;
(b) CDRH2 iz SEQ ID NO:10;
(c) CDRH3 iz SEQ ID NO:5;
(d) CDRL1 iz SEQ ID NO:6;
(e) CDRL2 iz SEQ ID NO:7, i
(f) CDRL3 iz SEQ ID NO:8.
Stavka 100: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži;
(a) CDRH1 iz SEQ ID NO:3;
(b) CDRH2 iz SEQ ID NO:13;
(c) CDRH3 iz SEQ ID NO:5;
(d) CDRL1 iz SEQ ID NO:6;
(e) CDRL2 iz SEQ ID NO:7, i
(f) CDRL3 iz SEQ ID NO:8.
Stavka 101: Farmaceutska kompozicija prema stavci 100, pri čemu se antitelo takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 102: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo ili njegov fragment koji vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži;
(a) CDRH1 iz SEQ ID NO:106;
(b) CDRH2 iz SEQ ID NO:107;
(c) CDRH3 iz SEQ ID NO:108;
(d) CDRL1 iz SEQ ID NO:109;
(e) CDRL2 iz SEQ ID NO:110, i
(f) CDRL3 iz SEQ ID NO:111.
Stavka 103: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo koje vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži:
a. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 14 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 16 ili
b. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 25 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 16 ili
c. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 28 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 16 ili
d. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 18 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 20 ili
e. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 37 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 20 ili
f. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 40 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 20 ili
g. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 112 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 114.
Stavka 104: Farmaceutska kompozicija prema stavci 103, pri čemu navedeno antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 14 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 16 ili varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 18 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 20.
Stavka 105: Farmaceutska kompozicija prema stavci 104, pri čemu se antitelo takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 106: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo koje vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži:
a. varijabilni domen teškog lanca koji može da se kodira izolovanim polinukleotidom koji ima najmanje 90% identičnosti (npr. 95% ili više poput 96%, 97%, 98% ili 99%) sa izolovanim polinukleotidom koji kodira SEQ ID NO: 14 ili 18 ili 25 ili 28 ili 37 ili 40 ili 112 i
b. varijabilni domen lakog lanca koji može da se kodira izolovanim polinukleotidom koji ima najmanje 90% identičnosti (npr. 95% ili više poput 96%, 97%, 98% ili 99%) sa izolovanim polinukleotidom koji kodira SEQ ID NO: 16 ili 20 ili 114.
Stavka 107: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo koje vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži:
a. teški lanac SEQ ID NO: 43 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 45 ili
b. teški lanac SEQ ID NO: 47 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 45 ili
c. teški lanac SEQ ID NO: 50 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 45 ili
d. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 53 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 160 ili
e. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 100 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 160 ili
f. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 158 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 160 ili
g. varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 116 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 118.
Stavka 108: Farmaceutska kompozicija prema stavci 107, pri čemu navedeno antitelo sadrži teški lanac SEQ ID NO: 43 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 45 ili varijabilni domen teškog lanca SEQ ID NO: 158 i varijabilni domen lakog lanca SEQ ID NO: 160.
Stavka 109: Farmaceutska kompozicija prema stavci 108, pri čemu se antitelo takmiči sa mišjim antitelom 125-2H za vezivanje IL-18.
Stavka 110: Farmaceutska kompozicija koja sadrži (npr. kao jedini aktivni sastojak) antitelo koje vezuje IL18 (npr. specifično vezuje) i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu navedeno antitelo sadrži:
a. teški lanac koji može da se kodira izolovanim polinukleotidom koji ima najmanje 90% identičnosti (npr. 95% ili više poput 96%, 97%, 98% ili 99%) sa izolovanim polinukleotidom koji kodira SEQ ID NO: 43 ili 47 ili 50 ili 53 ili 100 ili 116 ili 158 i
b. laki lanac koji može da se kodira izolovanim polinukleotidom koji ima najmanje 90% identičnosti (npr. 95% ili više poput 96%, 97%, 98% ili 99%) sa izolovanim polinukleotidom koji kodira SEQ ID NO: 45 ili 160 ili 118.
7. Kliničke primene.
[0260] Pokazano je da je ekspresija IL-18 ushodno regulisana kod nekih autoimunih, kardiovaskularnih i inflamatornih oboljenja.
[0261] Shodno tome, vezujući molekul iz pronalaska, koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, može da se koristi u terapiji.
Stavka 110: Antitelo prema bilo kojoj od stavki 1 do 88 za upotrebu u terapiji.
U jednom aspektu predmetnog otkrića obezbeđen je postupak za lečenje i/ili prevenciju autoimunih oboljena, uključujući reumatoidni artritis (RA), sistemsku pojavu juvenilnog artritisa (SOJA), sistemski juvenilni idiopatski artritis (SJIA), ankilozirajući spondilitis, autoimuno oboljenje unutrašnjeg uva (AIED), autoimuni limfoproliferativni sindrom (ALPS), Behčetovu bolest, Bergerovu bolest (IgA nefropatija), bulozni pemfigoid, Čarg-Štrausov sindrom, kolitis, Kronovu bolest (CD), dijabetes tip 1, dijabetes tip 2, Šegrenov sindrom (SS), bolest kalem protiv domaćina (GVHD), glomerulonefritis, lupus, multiplu sklerozu (MS), psorijazu, reumatsku groznicu, sarkoidozu, sklerodermu, Stilovu bolest odraslih (AOSD), sistemski eritemski lupus (SLE), ulcerozni kolitis, hemofagocitnu limfohistiocitozu (HLH, poznata i kao hemofagocitni sindrom, sindrom aktivacije makrofaga), familijarnu hemofagocitnu limfohistiocitozu (FHL) i druge sindrome imunodeficijencije, arteritis džinovskih ćelija (GCA), bolest koronarne arterije (CAD), koronarnu vaskulopatiju (CV), akutne koronarne sindrome (ACS), kongestivno zatajenje srca (CHF), aterosklerozu, arteriosklerozu, infarkt miokarda (IM), kardiorenalni sindrom (CRS), akutnu bubrežnu insuficijenciju (AKI), dijabetesnu nefropatiju, otpornost na insulin, gojaznost i metabolički sindrom (MetS), bolesti pluća uključujući plućnu sarkoidozu, naročito plućnu sarkoidozu fibrozu pluća, astmu, posebno tešku astmu, uveitis, geografsku atrofiju, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP), cističnu fibrozu, sindrom respiratornog distresa kod odraslih (ARDS), akutnu povredu pluća (ALI), povredu pluća izazvanu ventilatorom (VILI), plućnu arterijsku hipertenziju (PAH), Alchajmerovu bolest (AD) i sepsu i bilo koju njihovu kombinaciju, pri čemu postupak obuhvata primenu na pacijentu sisaru terapeutski efektivne količine vezujućeg molekula (npr. antitela) ili farmaceutske kompozicije, kako je ovde opisana, koja vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP).
Stavka 111: Vezujući molekuli ili farmaceutske kompozicije iz pronalaska koje vezuju IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji sarkoidoze, naročito plućne sarkoidoze, hemofagocitne limfohistiocitoze (HLH), familijarne hemofagocitne limfohistiocitoze (FHL), hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), Stilove bolesti odraslih (AOSD), ateroskleroze, sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (SJIA), teške astme, uveitisa, geografske atrofije, artritisa džinovskih ćelija (GCA), dijabetesa tip 1, dijabetesa tip 2, i bilo koje njihove kombinacije kod pacijenta sisara.
Stavka 112: Antitelo ili farmaceutska kompozicija kao što je opisano u bilo kojoj od stavki 1 do 88 ili 96 do 110 koja vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji sarkoidoze, naročito plućne sarkoidoze, hemofagocitne limfohistiocitoze (HLH), familijarne hemofagne limfohistiocitoze (FHL), hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), Stilove bolesti odraslih (AOSD), ateroskleroze, sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (SJIA), teške astme, uveitisa, geografske atrofije, artritisa džinovskih ćelija (GCA), dijabetesa tip 1, dijabetesa tip 2, i bilo koje njihove kombinacije kod pacijenta sisara.
8. Dijagnostičke primene i kompleti
[0262] Jedna od prednosti vezujućeg molekula ili izolovanog antitela ili njegovog fragmenta kako je opisano ovde je da vezuju IL-18 ali ne vezuju kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) i da nisu IL-18BP. Stoga, vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment, kako je ovde opisano, sposobni su da detektuju samo slobodni IL-18, nevezan za IL-18BP. Pošto je IL-18 biološki aktivan molekul, smesta postaje očigledno da vezujući molekul koji je sposoban da prepoznaje samo takav entitet može omogućiti diferencijaciju slobodnog IL-18 od IL-18 vezanog za IL-18BP, koji je neaktivan. Štaviše, pošto vezujući molekuli iz pronalaska ne obuhvataju IL-18BP, ni izolovani ni prirodni, oni se nameću ne samo kao terapeutska sredstva, već i kao alati za mnoge druge primene, kao što je dijagnostikovanje ili dijagnostički komplet.
[0263] Stoga, u drugom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje vezujuće molekule ili izolovana antitela ili njihove fragmente, kako je ovde opisano, koji vezuju IL-18 i ne vezuju kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP za upotrebu u dijagnostikovanju ili za upotrebu u dijagnostičkom kompletu.
[0264] Vezujući molekuli ili izolovano antitelo ili njegov fragment, kako je ovde opisano, mogu se koristiti u kombinaciji sa detektujućim antitelima u ELISA testovima, vestern blotu, itd., i mogu se koristiti samo za otkrivanje prisustva slobodnog IL-18 ali i za merenje količine slobodnog IL-18.
[0265] Stoga, u drugom aspektu, predmetno otkriće takođe obezbeđuje vezujuće molekule ili izolovana antitela ili njihove fragmente koji vezuju IL-18 i ne vezuju kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP za upotrebu u dijagnostikovanju ili za upotrebu u detektovanju i/ili merenju prisustva i/ili količine slobodnog IL-18 (tj. IL-18 koji nije vezan za IL-18BP) u uzorku.
[0266] U još daljem aspektu predmetnog otkrića, obezbeđen je postupak za detektovanje i/ili merenje prisustva i/ili količine slobodnog IL-18 (tj. IL-18 koji nije vezan za IL-18BP) u uzorku, pri čemu je uzorak opciono ljudski uzorak, pri čemu postupak obuhvata dovođenje uzorka u kontakt sa vezujućim molekulom ili izolovanim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP.
[0267] U još daljem aspektu predmetnog otkrića, obezbeđen je postupak koji obuhvata korake:
a. dovođenja u kontakt uzorka dobijenog od ispitanika (npr. ispitanika sa inflamatornom bolešću ili poremećajem) sa vezujućim molekulom ili izolovanim antitelom ili njegovim fragmentom, kako je opisano ovde, koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP), i pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP;
b. merenja nivoa slobodnog IL-18;
c. opciono, merenja nivoa ukupnog IL-18 i IL-18 BP;
d. pri čemu se koraci b) i c) mogu sprovesti istovremeno ili uzastopno ili obrnutim redosledom (npr. korak b) pre koraka c) ili korak c) pre koraka b).
[0268] Uzorak može biti uzorak izolovan iz tela sisara, poželjno iz ljudskog tela. Izolovani uzorak može biti:
iz pristupačnog mesta na telu, na primer, sluzokože nosa, kože, vežnjače, usta ili grla, anusa, vagine, uretre, grlića materice; i ili
ii. sadrži tečnost ili polučvrstu supstancu (na primer, telesnu tečnost ili polučvrstu supstancu, npr. izmet, izbljuvak, sekret, izlučevine, želudačne i/ili crevne sokove, ispljuvak, krv, serum iz krvi, plazmu, urin, suze, sinovijalnu tešnost, spermu, tečnost iz prostate, pljuvačku, homogenat tkiva ili sluzokože); i ili
iii. sadrži čvrstu supstancu (npr. stolicu, tkivo ili uzorak iz biopsije); i/ili
iv. sadrži kulturu (npr. kulturu makrofaga);
[0269] Uzorak može biti ljudska krv ili deo ljudske krvi, kao što je plazma.
[0270] Izolovani uzorak se može poželjno izabrati od ljudske pune krvi, makrofaga dobijenih od monocita ljudske krvi i makrofaga ljudskih pluća.
[0271] U drugom aspektu, predmetno otkriće dalje obezbeđuje dijagnostički komplet koji sadrži vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment (koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP) i/ili kompleks koji sadrži IL-18 i taj vezujući molekul, pri čemu komplet opciono sadrži prvo kontrolno jedinjenje.
[0272] Kontrolno jedinjenje je jedinjenje koje će naznačiti da li dijagnostički komplet radi. Kontrolno jedinjenje može biti pozitivno ili negativno, i ono verifikuje da je bilo koji rezultat validan.
[0273] Prvo kontrolno jedinjenje može biti slobodni IL-18, i komplet opciono može da sadrži drugo kontrolno jedinjenje koje je mišje antitelo 125-2H.
[0274] U drugom aspektu predmetnog otkrića, obezbeđeno je medicinsko ili dijagnostičko sredstvo koje sadrži vezujući molekul ili izolovano antitelo ili njegov fragment (koji vezuje IL-18 i ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein (IL-18 BP)) i/ili kompleks, pri čemu vezujući molekul nije IL-18BP koji sadrži IL-18 i taj vezujući molekul.
9. Primeri
[0275] Sekvence antitela iz predmetnog otkrića prikazane ovde, zajedno sa tabelom korelacije sekvenci, opisane su pred kraj ove specifikacije.
9.1) Materijali
[0276]
Rekombinantni humani IL-18 (generisan u E. coli koristeći postupak koji su opisali Liu i sar. (2000) Cytokine 12(10):1519-25).
Rekombinantni IL-18 cinomolgusa (generisan u E. coli koristeći postupak opisan u US patentu broj 6,432,678)
Rekombinantni humani TNFα (R&D br.210-TA)
Rekombinantni humani IL-18 vezujući protein-IgG1Fc (hIL-18BPa-Fc, R&D Systems br.
119-BP-100)
Mišji antihumani IL-18 IgG1(125-2H; R&D Systems br. D044-3)
Humano antilizozomsko antitelo (MOR03207 Morphosys)
Ćelijska linija KG-1 (ATCC br.CCL-246)
Ćelijski medijum: RPMI 1640 (Invitrogen br. 31870) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (Invitrogen br. 10108-157), 1% L-glutamina (Invitrogen br. 25030-03), 1% penicilina/streptomicina (Invitrogen br.15140-148).
Ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom tretirane ćelijskom kulturom (Costar br.3596)
Humani IFN-γ DuoSet ELISA test (R&D br. DY285)
Maxisorb mikrotitarske ploče (Sigma br. M9410)
Heparin (Sigma br. H3393)
Rekombinantni humani IL-12 (R&D Systems br.219-IL-CF)
LPS (Sigma br. L4516)
Falcon epruvete (Corning br.430829)
Ficoll-Paque ™Plus (GE Healthcare Life Sciences br.17-1440-02)
KG-1 ćelije su održavane u RPMI 1640 sa dodatkom 10% FBS, 1% L-glutamina i 1% penicilina/streptomicina sa gustinom od 2x10<5>do 1x10<6>vijabilnih ćelija/ml.
9.2) Antitela i njihovi fragmenti odabrani za funkcionalnu analizu
[0277] Antitela i njihovi fragmenti su generisani putem displeja faga. Biblioteka fagemida je korišćena na osnovu HuCAL® koncepta (Knappik,A. i sar. (2000) J Mol Biol 296, 57-86) i upotrebljava CysDisplayTM tehnologiju za prikaz Fab na površini faga (WO 01/05950). Kako bi se povećali afinitet i biološka aktivnost izabranih fragmenata antitela, L-CDR3 i H-CDR2 regioni su paralelno optimizovani putem kasetne mutageneze koristeći mutagenezu usmerenu trinukleotidom (Virnekas,B i sar. (1994) Nucleic Acids Res 22, 5600-5607), dok su regioni okvira ostali konstantni. Antitela iz različitih matičnih okvira su izabrana za konverziju IgG i funkcionalnu karakterizaciju. Ta antitela i njihovi fragmenti su prikazani u Tabeli 1A u nastavku.
Tabela 1A: IgG i Fab izabrani za funkcionalnu analizu
[0278] Uočeno je da antitelo MOR9464, kada je formulisano u tečnoj formulaciji, tokom vremena gubi potentnost. Postavljena je pretpostavka da molekul možda podleže nekim modifikacijama koje su uticale na njegovu potentnost. MOR9464 je inkubiran na temperaturi višoj od fiziološke temperature, kako bi se ubrzala pojava gubitka potentnosti. Kombinovanjem složenih biofizičkih tehnika, uključujući masenu spektromeriju i reversno faznu HPLC, izolovana su dva različita, dotad nepoznata, oblika MOR9464.
[0279] Brojne modifikacije se mogu desiti proteinu kada je u vanćelijskom medijumu, prilikom in vitro manipulacije i in vivo cirkulacije. Koja god da je modifikacija u pitanju, ona može naširoko da utiče na svojstva relevantna za farmaceutska sredstva na bazi proteina. Stoga je razumevanje odnosa između strukture i funkcionisanja ovih modifikacija postalo od ključnog značaja. Egzoćelijske modifikacije su modifikacije koje se javljaju ubrzo nakon što terapeutski proteini završe put razmene, dostignu površinu ćelije i budu otpušteni u vanćelijski medijum i tamo inkubirani tokom perioda proizvodnje. One takođe obuhvataju modifikacije nastale tokom in vitro obrade, kao što je prečišćavanje i formulisanje u odgovarajućim puferima, ili čak in vivo cirkulacije (Zhong X. i Wright J.F., Int J of Cell Biol., 2013, 1-19). Proteolitičko obrađivanje je najčešća i najpoznatija egzoćelijska modifikacija, i njeni proizvodi se mogu lako identifikovati. Oksidaciju jednog ostatka aminokiseline može biti teže okarakterisati, i može da uključuju metioninske ostatke, kao i triptofanske, cisteinske, histidinske i tirozinske ostatke. N-terminalna piroglutamatna formacija je takođe dobro poznata egzoćelijska modifikacija, pri čemu N-terminalni ostaci glutamina ili glutamata mogu lako da se cikliziraju sa sopstvenom terminalnom grupom, dajući pirolidon karboksilnu kiselinu. Deamidacija ostataka asparagina i aspartata ili izomerizacija aspartata su takođe poznate, ali ne i dobro okarakterisane modifikacije.
[0280] Ako se egzoćelijske modifikacije javljaju u specifičnim regionima u antitelu, one mogu imati veliko dejstvo na funkcionalne karakteristike antitela, kao što je gubitak potentnosti. Ako se modifikacija javlja u CDR ili veoma bliskoj lokaciji, može uticati na sposobnost antitela da prepozna i/ili specifično vezuje svoj antigen.
[0281] Analize MOR9464 sekvence su obavljene kako bi se identifikovalo potencijalno mesto egzoćelijskih modifikacija. Generisani su mutanti prikazani u Tabeli 1B.
Tabela 2B:MOR9464/MOR10222 mutanti
[0282] Asparagin 30 koji samo okružuje H-CDR1 MOR9464 je razmatran kao moguće mesto modifikacije, zajedno sa serinom 31 u H-CDR1 i metioninom 54 u H-CDR2. Do neenzimske deamidacije asparaginskih i glutaminskih ostataka u aspartat i glutamat dolazi putem hidrolitičke reakcije koja zavisi od pH, temperature i jačine jonskih veza. Takođe zavisi od aminokiselinskih ostataka koji prethode asparaginskim i glutaminskim ostacima, pri čemu serin i treonin povećavaju brzinu deamidacije.
[0283] Većina MOR10222_S31X mutanata, sa mutacijom metionina ili bez nje, u velikoj meri se agregiraju nakon proizvodnje. Stoga, ti mutanti nisu dalje okarakterisani.
9.3) Određivanje afiniteta koristeći ravnotežnu titraciju rastvora (Solution Equilibrium Titration, SET)
[0284] Za određivanje KDputem ravnotežne titracije rastvora (SET), korišćene su monomerske frakcije antitela (analizirane putem analitičke SEC).
[0285] Određivanje afiniteta u rastvoru je suštinski obavljano kao što je opisano u literaturi (Friguet B i sar. (1985) J Immunol Methods;77(2):305-19). Kako bi se poboljšala osetljivost i preciznost postupka SET, prebačen je iz klasičnog ELISA testa na tehnologiju zasnovanu na elektro-hemiluminescenciji (ECL) (Haenel C i sar. (2005) Anal Biochem;339(1):182-4.).
[0286] Kozja antihumana (Fab)2fragment specifična antitela (Dianova) označena su pomoću MSD SULFO-TAG<TM>NHS estra (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA) prema uputstvu proizvođača. Eksperimenti su izvedeni u propilenskim mikrotitarskim pločama i test puferu na bazi fosfata. Neobeleženi humani IL-18 je serijski razblažen, počevši od koncentracije koja je najmanje 10 puta veća od očekivane vrednosti KD. Bunarčići bez antigena su korišćeni za određivanje vrednostimax; bunarčići sa test puferom su korišćeni za određivanje osnovne vrednosti. Nakon dodavanja konstantne količine antitela ili njegovog fragmenta (npr. konačna koncentracija 10 pM u konačnoj zapremini 60 µl), smeša je inkubirana preko noći na RT. Koncentracija primenjenih antitela ili njihovih fragmenata bila je slična ili ispod očekivane KD.
[0287] Streptavidin MSD ploče su preko noći blokirane fosfatnim puferom koji sadrži BSA. Nakon blokiranja ploče, dodat je biotinilovani humani IL-18, i inkubiran 1h na RT. Zatim su ekvilibrisani uzorci prebačeni na te ploče i kratko inkubirani na RT. Nakon ispiranja, detekciono antitelo obeleženo pomoću MSD SULFO-TAG (kozji antihumani (Fab)2) dodato je na MSD ploču i kratko inkubirano na RT.
[0288] Nakon ispiranja ploče i dodavanja MSD pufera T za očitavanje sa surfaktantom, elektrohemiluminescentni signali su detektovani pomoću uređaja Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, SAD).
[0289] Podaci su procenjeni pomoću softvera XLfit (IDBS) primenom prilagođenih modela podešavanja. Za određivanje KDmolekula Fab korišćen je sledeći model podešavanja (prema radu Haenel i sar., 2005), modifikovan prema radu Abraham i sar.,1996):
[0290] U principu, isti protokol je korišćen za određivanje vrednosti KDantitela i fragmenata, uz sledeće razlike: cela antitela su dodavana u serije razblaživanja antigena i ekvilibrisana preko noći na RT. Nakon toga, uzorci su tretirani kako je prethodno opisano.
[0291] Za procenjivanje podataka t.j., određivanje KDmolekula IgG, korišćen je sledeći model postavke za IgG (modifikovan prema radu Piehler i sar., 1997):
[0292] Afiniteti anti-IL-18 antitela ili njihovih fragmenata su određeni u rastvoru, koristeći prethodno opisane test uslove, i navedeni su u Tabeli 2A (2. kolona). Kada je testiran i IL-18 majmuna cinomolgus (cm IL-18), dobijene vrednosti KDsu date u zagradama.
9.4) Inhibicija otpuštanja IFN-γ iz humanih PBMC stimulisanih sa IL-18
[0293] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su sveže izolovane iz heparinizovane pune ljudske krvi upotrebom standardnih tehnika. Ukratko, razblažena krv koja sadrži heparin (15 j/ml) kao antikoagulans je naneta na Ficoll-Paque™Plus i centrifugirana (800xg, 20 minuta, 18°C). PBMC su sakupljene iz međupovršine plazma:fikol, i dva puta isprane (600xg, 10 minuta, 4°C), pre nego što su ponovo suspendovane u medijumu.
[0294] PBMC su ponovo suspendovane u medijumu i nanete na ploču za uzgajanje sa 96 bunarčića kako bi se dobila finalna gustina ćelija od 1,5x10<6>/ml (u finalnoj test zapremini od 200 µl). Kako bi se osiguralo da antitela i njihovi fragmenti prema pronalasku prepoznaju nativni IL-18, koji može biti glikozilovan, PBMC su stimulisane pomoću LPS i IL-12 što indukuje IFN-γ putem autokrine povratne sprege zavisne od IL-18.
[0295] Ćelije su indukovane pomoću 3 nM humanog rekombinantnog IL-18 i IL-12 (1 ng/ml) ili LPS (3 µg/ml) i IL-12 (10 ng/ml) radi indukovanja lučenja nativnog IL-18 proteina (sve finalne koncentracije). U slučaju rekombinantnog humanog IL-18, izabrana koncentracija je prethodno utvrđena kao približna EC80u ovom testu. U slučaju nativnog IL-18, LPS stimuliše proizvodnju IL-18, dok IL-12 povećava ekspresiju IL-18 receptora (Yoshimoto T i sar. (1998) J Immunol; 161(7):3400-7). Mera zavisnosti od IL-18 u ovom testu je utvrđena putem inkluzije veoma specifičnog proteina, IL-18 vezujućeg proteina-IgG1Fc (hIL-18BPa-Fc) kao pozitivne kontrole (isprekidana linija na slikama 3 (A-D).
[0296] Kako bi se procenila njihova potentnost i efikasnost, antitela i njihovi fragmenti su prethodno ekvilibrisani tokom 30 minuta sa IL-12 i LPS (nativni uslovi) ili IL-12 i IL-18 (rekombinantni uslovi) pre primene na ćelijama sa finalnom koncentracijom između 0,1 i 300 nM. Antilizozomsko kontrolno antitelo MOR03207 je korišćeno kao negativna kontrola.
[0297] Za svaku grupu za lečenje, srednja vrednost ± SEM (gde je n=3 ili više) određena je za n=2-5 bunarčića.
[0298] Ćelije su inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom 24 sata nakon tretiranja, nakon čega je supernatant sakupljen centrifugiranjem (1200 o/min tokom 5 min) i uskladišten na -20°C za dalju analizu. Nivoi proteina IFN-γ su procenjeni koristeći ELISA u skladu sa uputstvom proizvođača.
[0299] Sva antitela i njihovi fragmenti su inhibirali proizvodnju IFN-γ na dozno zavisan način sa sličnim nivoom efikasnosti koji je ostvaren pri najvišim koncentracijama, kao što se može videti za rekombinantni IL-18BPa-Fc (Tabela 2A kolone 5-6, Tabela 2B kolona 2 i Slike 3 (A-D) gde je efikasnost IL-18BPa prikazana isprekidanom linijom). Kontrolno antitelo, MOR03207 (antilizozomsko kontrolno antitelo) nije inhibiralo odgovor IL-18. Antitela germinativne linije (npr. MOR10579 iz MOR09441 i MOR10222) iz MOR09464 nisu značajno izmenila svoj kapacitet neutralizacije. Mutanti MOR9464 i MOR10222, naročito MOR9464_N30K i MOR10222_N30S_M54I, imali su kapacitet neutralizacije uporediv sa antitelima divljeg tipa.
Tabela 2A: KDvrednosti za afinitet IL-18 i IC50vrednosti (nM) za inhibiciju humanog rekombinantnog (hr) IL-18 (1 nM) i otpuštanje IFNγ indukovano nativnim IL-18
N/A = nije dostupno; *koncentracija humanog IL-18 = [0,5 nM];<#>koncentracija cino IL-18 = [0,2 nM] ;;Tabela 2B: IC50vrednosti (nM) za inhibiciju humanog rekombinantnog (hr) IL-18 (1nM), otpuštanje IFNγ indukovano nativnim IL-18 ;;5 ;;; ; ;; (n=2; srednja n=3 srednja ; ;; vrednost /- SD) vrednost /- SEM ;;* n =2, srednja vrednost /- SD
9.5) Inhibicija otpuštanja IFN-γ iz KG-1 ćelija stimulisanih sa IL-18
[0300] Anti-IL-18 antitela i njihovi fragmenti su analizirani na sposobnost da inhibiraju otpuštanje IFN-γ iz KG-1 ćelija stimulisanih sa IL-18. U odsustvu antagonista, IL-18 promoviše maksimalnu stimulaciju otpuštanja IFN-γ u prisustvu kostimulusa poput TNFα i IL-12 putem povećane regulacije IL-18 receptora (Nakamura S i sar. (2000) Leukemia;14(6):1052-9). Inhibitorska aktivnost antitela i fragmenata je procenjena naspram 1 nM humanog ili cinomolgusovog IL-18 (ako nije drugačije naznačeno), prethodno utvrđenog kao EC80u ovom sistemu zasnovanom na ćelijama.
[0301] KG-1 ćelije su ponovo suspendovane u medijumu za uzgajanje i nanete na ploču za uzgajanje sa 96 bunarčića, kako bi se dobila finalna gustina ćelija od 0,3x10<6>/ml (u finalnoj test zapremini od 200 µl). Ćelije su stimulisane pomoću 1 nM humanog ili cinomolgusovog rekombinantnog IL-18 i TNFα (finalna koncentracija 20 ng/ml). Koncentracija izabranog rekombinantnog IL-18 je prethodno utvrđena kao približna EC80u ovom testu.
[0302] Kako bi se procenila potentnost i efikasnost ovih antitela, antitela i njihovi fragmenti su prethodno ekvilibrisani tokom 30 minuta sa TNFα i IL-18 (humani ili cinomolgusov) pre primene na ćelijama sa finalnom koncentracijom između 0,1 i 300 nM. Antilizozomsko kontrolno antitelo MOR03207 je korišćeno kao negativna kontrola.
[0303] Za svaku grupu za lečenje, srednja vrednost ± SEM (kada je dostupna) određena je za n=2-5 bunarčića.
[0304] Ćelije su inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom 24 sata nakon tretiranja, nakon čega je supernatant sakupljen centrifugiranjem (885 x g tokom 5 min) i uskladišten na -20°C za dalju analizu. Nivoi proteina IFN-γ su procenjeni koristeći ELISA u skladu sa uputstvom proizvođača.
[0305] Sva antitela i njihovi fragmenti su inhibirali proizvodnju IFN-γ na dozno zavisan način, pri čemu je potpuna inhibicija ostvarena pri najvećim koncentracijama. Za afinitetno sazrela antitela, vrednosti IC50su bile u opsegu od 0,3-0,8 nM naspram 0,8 nM humanog IL-18, te stoga predstavljaju molarni odnos 1:1 antitelo:antigen ili bolji. VH4_3b antitela okvira (MOR08776, MOR010501, MOR010502) pokazala su sličnu potentnost u odnosu na humani i cinomolgusov IL-18, dok su VH1A_3 antitela okvira bila malo manje potentna u odnosu na IL-18 cinomolgusa (Tabela 2, kolone 3 i 4). Kontrolno antitelo, MOR03207, nije inhibiralo odgovor IL-18.
9.6) Otpuštanje INF-γ u punoj ljudskoj krvi indukovano sa IL-18
[0306] Test pune krvi obuhvata i prisustvo i funkciju endogenog IL-18BP, pošto IL-18BP primarno stvara slezina, i sistemski je prisutan u nivoima oko 10-20 ng/ml kod zdravih pojedinaca. IL-18BP se vezuje sa velikim afinitetom za IL-18 i neutrališe njegovu aktivnost, i stoga može da predstavlja odvod za antitela koja prepoznaju dostupne epitope iz ovog kompleksa.
[0307] Aktivnost anti-IL-18 antitela je procenjena u heparinisanoj ljudskoj punoj krvi uzetoj od zdravog volontera. Svi reagensi su pripremljeni u dvadesetostrukoj finalnoj željenoj koncentraciji koristeći medijum bez seruma. Ćelije su stimulisane pomoću 7 nM humanog rekombinantnog IL-18 i IL-12 (1 ng/ml) ili LPS (10 µg/ml) i IL-12 (10 ng/ml) radi indukovanja lučenja nativnog IL-18 proteina (sve finalne koncentracije). U slučaju rekombinantnog humanog IL-18, izabrana koncentracija je prethodno utvrđena kao približna EC80u ovom testu. U slučaju nativnog IL-18, LPS stimuliše proizvodnju IL-18, dok IL-12 povećava ekspresiju IL-18 receptora i opseg zavisnosti od IL-18 je određen putem uključivanja rekombinantnog humano IL-18 vezujućeg proteina-IgG1Fc (hIL-18BPa-Fc) kao pozitivne kontrole.
[0308] Kako bi se procenila potentnost i efikasnost ovih antitela, anti-IL-18 antitela i njihovi fragmenti su prethodno ekvilibrisani tokom 30 minuta sa relevantnim stimulusom pre primene na ćelijama sa finalnom koncentracijom od 0,1 do 1000 nM. Antilizozomsko kontrolno antitelo MOR03207 je korišćeno kao negativna kontrola.
[0309] Smeša stimulusa (+/- antitelo ili fragment) dodata je u svaki bunarčić sterilne mikrotitarske ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčića kao 30 µl i 170 µl heparinisane pune krvi je zatim dodato u svaki bunarčić, tako da je finalna zapremina u svakom bunarčiću bila 200 µl. Ploče su zatim vraćene u vlažni inkubator (37°C). Nakon 24 h, ploče su centrifugirane (885 x g, 4°C, 5 min), i supernatanti su uklonjeni i testirani na proizvodnju hIFN-γ koristeći komercijalno dostupni ELISA komplet. Konačni podaci su dobijeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti od 3-5 zdravih ljudskih donora.
[0310] Sva antitela i fragmenti su inhibirali proizvodnju IFNγ na dozno zavisan način za bilo koji stimulus. Potpuna inhibicija odgovora indukovanog rekombinantnim IL-18 je postignuta pri najvećim koncentracijama, dok je slična efikasnost uočena naspram LPS/IL-12 stimulacije kao kod IL-18BPa-Fc (Tabela 3; Slike 7(A-E) i 8(A-E)). Germinativne linije MOR09441 i MOR09464 nisu značajno izmenile svoj kapacitet neutralizacije. Kontrolno antitelo, MOR03207, nije inhibiralo odgovor IL-18. Izabrana antitela su takođe procenjena na sposobnost da inhibiraju bioaktivnost rekombinantnog IL-18 cinomolgusa (7 nM) u punoj krvi majmuna cinomolgusa. MOR09441, MOR09464, MOR09465, MOR09466 su inhibirali proizvodnju IFN-γ na dozno zavisan način, pri čemu je potpuna inhibicija uočena pri najvećim koncentracijama. Uočene vrednosti IC50su bile 110±36 nM, 51±8 nM, 55±3 nM, odnosno 179±30 nM.
Tabela 3: IC50vrednosti (nM) za inhibiciju I-γ otpuštanja indukovanog putem IL-18 u punoj krvi
[0311] Mutanti MOR9464 i MOR10222, naročito MOR9464_N30K i MOR10222_N30S_M54I, imali su kapacitet neutralizacije uporediv sa antitelima divljeg tipa.
9.7) ELISA vezivanje anti-IL-18 antitela za kompleks IL-18-IL-18BP
[0312] Kako bi se potvrdilo da anti-IL18 antitela ili njihovi fragmenti koji su ovde opisani ne prepoznaju IL-18 vezan za IL-18BP (kompleks IL-18/IL-18BP), IL-18 je inkubiran sa IL-18BP (rhIL-18BP/Fc, R&D Systems, kat. br.119) u molskom višku. Anti-IL18 antitela i fragmenti su dodati kako je opisano u nastavku, i detektovano je vezivanje za kompleks. Uopšteno, signali pri visokim koncentracijama anti-IL-18 antitela i fragmenata su uočeni kada vezuju pristupačne epitope na antigenu koji je različit od IL-18BP (tj. prepoznaju kompleks IL-18/IL-18BP). U prvoj postavci, kontrolna antitela i anti-IL18 antitela i fragmenti su razblaženi koristeći PBST/0,5%BSA, i dodati su u biotinilovani kompleks IL-18/IL18-BP (inkubacija na propilenskim pločama tokom 30 min na RT i blago trešenje). Kontrolna antitela su bila MOR03207 (antilizozim) kao negativna kontrola, MOR08741 kao i mišji 125-2H, antihumani IL-18 mišji IgG, kao antitela pozitivne kontrole (oba prepoznaju kompleks IL-18/IL-18BP) (Argiriadi MA i sar. (2009) J Biol Chem;284(36):24478-89). Ceo kompleks je putem biotinskih ostataka uhvaćen na pločama NeutrAvidin, koje su blokirane preko noći sa 1x ChemiBlocker-PBS.
[0313] Ploče su isprane 5x pomoću PBST i inkubirane tokom 1 h sa 20 µl/bunarčiću detekcionog antitela anti-Fab-AP - kozji antihumani IgG, fragment specifični F(ab)2 (Jackson Immuno Research, 109-055-097, serija: 69655) ili antimišji IgG (ceo molekul)-AP (SIGMA, br. A4312) oba razblažena 1:5000 u 0,5% BSA / 0,05% Tween20 / 1x PBS. Ploče su isprane 5x pomoću TBST, dodato je 20 µl rastvora AttoPhos (Roche) (razblažen 1:5 u ddH2O), i fluorescencija je merena na čitaču Tecan.
[0314] Kod anti-IL-18 antitela MOR8775 i MOR8776 koja ne vezuju kompleks IL-18/IL-18BP, vezujući signali su značajno smanjeni ili nisu uočeni (Slika 9(A)). Nasuprot tome, jak signal je uočen u prisustvu mišjeg 125-2H koji podržava prijavljenu sposobnost ovog kontrolnog antitela da vezuje epitop različit od IL-18BP. Slično tome, signal zavisan od doze je uočen u prisustvu kontrolnog antitela MOR08741.
[0315] U drugoj postavci, eksperiment je sproveden na sličan način, osim što je korišćen nebiotinilovani hu IL-18. Kompleks IL-18/IL-18BP je uhvaćen na ploči Maxisorp putem Fc oznake rhIL-18BP/Fc, koristeći kozji anti-hu IgG (fragment specifičan Fc gama, Jackson ImmunoResearch br. 109-005-098). Signal zavisan od koncentracije je uočen za kontrole MOR08741, što ponovo ističe sposobnost ovog antitela da prepozna kompleks IL-18/IL18BP. Nasuprot tome, nije uočen signal za MOR09441, MOR09464, MOR09465, MOR09466, što potvrđuje da ne vezuju kompleks IL-18/IL-18BP.
9.8) Binovanje epitopa anti-IL18 antitela i fragmenata putem ELISA testa
[0316] Za binovanje epitopa korišćene su dve postavke. Za prvu postavku, fragment antitela (Fab A) je titrisan i inkubiran sa biotinilovanim humanim IL-18. Fab A je testiran sa konstantnom koncentracijom antitela B (IgG B). Kao pozitivna kontrola, Fab A je analiziran sa samim sobom u formatu IgG. NeutrAvidin ploče (Thermo Scientific kat. br. 15402) blokirane su pomoću agensa Chemiblocker (razblažen 1:1 sa PBS) i inkubirane tokom 2 h na RT (ili tokom noći na 4°C). Sledećeg dana ploče su isprane 2x sa PBST i Fab su titrisani od 500 nM do 2 nM u PBS puferu koji sadrži finalnu koncentraciju od 10 nM biotinilovanog humanog IL-18. Kompleks fragmenata antitela i biotinilovanog IL-18 je dodat u NeutrAvidin ploče i inkubiran tokom 1 sata. Nakon ispiranja 3x pomoću PBST, IgG B je dodat sa 20 nM u odgovarajuće bunarčiće NeutrAvidin ploča. Nakon 20 minuta inkubacije i ispiranja 3x pomoću PBST, detekciona antitela anti-Fc-AP - kozji antihumani IgG, Fc gama-lanac specifično (Jackson Immuno Research, 109-055-098) i antimišji IgG (ceo molekul)-AP (SIGMA, br. A4312, serija: 067K4863) dodata su razblažena 1:5000 u 0,5% BSA / 0,05% Tween20 / 1x PBS.
[0317] Ploče su isprane 5x sa PBST, dodato je 20 µl AttoPhos rastvora (razblažen 1:5 u ddH2O) i ploče su merene na čitaču Tecan. Zabeležena je emisija fluorescencije na 535 nm uz ekscitaciju na 430 nm.
[0318] Uopšteno, signali su se mogli dobiti samo kada je IgG B mogao da se veže za pristupačne epitope na antigenu koji su različiti od testiranog Fab A (tj. antitelo se vezuje za različiti epitop). Nasuprot tome, za antitela sa delimično preklapajućim ili identičnim epitopima, vezujući signali su značajno smanjeni u poređenju sa kontrolom.
[0319] Druga postavka ELISA testa je obavljena na Maxisorp pločama. Fab A je obložen različitim koncentracijama u PBS-u i inkubiran preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploče su isprane 3x pomoću PBST i blokirane tokom 2 sata na RT sa 5% MPBST (100 µl/bunarčiću). Nakon koraka ispiranja 3x pomoću PBST, humani IL-18 je dodat u konstantnoj koncentraciji tokom 1 h. Ploče su isprane 3x pomoću PBST, i biotinilovani fragment antitela (biotinilovani Fab B) je titrisan (maks. konc.5 µg/ml, 10 µg/ml ili 20 µg/ml). Za formiranje kompleksa Fab A sa IL-18 i biotinilovanim Fab B, ploče su inkubirane tokom 1h, zatim isprane 3x pomoću PBST, i detekciono antitelo ZyMax streptavidin-alkalna fosfataza (Zymed, kat. br. 43-8322, serija 51102099) razblaženo je 1:2000 u PBST-u i 20µl/bunarčiću je dodato na ELISA ploče. Ploče su isprane 5x pomoću TBST, dodato je 20 µl rastvora AttoPhos (Roche) (razblažen 1:5 u ddH2O), i ploče su merene na čitaču Tecan.
[0320] U ovom slučaju, kao za prvu postavku, signali su se mogli dobiti samo kada je biotinilovani Fab B mogao da se veže za pristupačne epitope na antigenu koji su različiti od testiranog Fab A (tj. antitelo se vezuje za različiti epitop).
[0321] Kao što je prikazano na Slici 10A, antitela MOR8775 se takmiče sa mišjim antitelom 125-2H (crno popunjene ćelije) dok se MOR8776 ne takmiči sa 125-2H u vezivanju za IL-18 (nepopunjene ćelije). Oba antitela se takmiče sa IL-18BP-Fc za vezivanje IL-18 (crno obojene ćelije). Ni MOR8775 ni MOR8776 se ne takmiče sa antitelom ABT325 (U.S. patentna prijava Ser. br. 09/780,035 i 10/988,360). U zavisnosti od podešavanja eksperimenta, MOR8775 i MOR8776 se međusobno takmiče (šrafirane ćelije)
[0322] U drugom setu eksperimenata, antitela MOR9464, MOR9464_N30K, MOR10222_N30S_M54I i MOR13341 su testirana na sposobnost da vezuju IL-18 u prisustvu bilo kog od ovih antitela, IL-18BP-Fc, ABT325 i mišjeg antitela 125-2H koristeći instrument Proteon XPR36, biosenzor u realnom vremenu bez oznake, zasnovan na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR). Pre analize, integritet proteina je potvrđen, i koncentracija je procenjena putem LC-MS.
[0323] Sva antitela i IL18BP-Fc su imobilisani na tačkama za interakciju GLC senzorskog čipa putem uobičajenog kuplovanja amina. U prvom koraku, IL18 je injektovan kao 1. analit, a u drugom koraku ili anti-IL18 antitelo ili IL18BP-Fc je injektovan kao 2. analit.
[0324] Ligandi koji treba da se imobilišu su pripremljeni u koncentraciji od 20 µg/ml (antitela) ili 10 µg/ml (IL18BP-Fc) u 10 mM acetatnom puferu, pH 4,0. Analiti su razblaženi u PBS puferu (TEKNOVA) koji sadrži 0,005% Tween 20, isti taj puferski rastvor je korišćen kao radni pufer za instrument. Analit 1 (25 nM IL18) je injektovan sa protokom od 50 µl/min tokom 180 sekundi uz vreme disocijacije od 60 sekundi. Analit 2 (25 nM IL18BPa-Fc ili anti-IL18 antitelo) je injektovan sa protokom od 50 µl/min tokom 180 sekundi uz vreme disocijacije od 180 sekundi. Regeneracija je obavljena sa 10 mM glicinom, pH 1,5 sa protokom od 100 µl/min tokom 20 sekundi. Obavljena su dva nezavisna seta eksperimenata. Procena podataka je zasnovana na tome da li je signal senzograma povećan nakon injekcije analita 2 u poređenju sa signalom analita 1. Ako je signal povećan, zaključeno je da imobilisani ligand i injektovani analit 2 prepoznaju različite epitope. Ako se signal nije povećao, zaključeno je da oba dele iste ili preklapajuće epitope.
[0325] Kako je prikazano na Slici 10B, antitela MOR9464, MOR9464_N30K, MOR10222_N30S_M54I i MOR13341 se takmiče međusobno (crno obojene ćelije), sa IL-18BP-Fc i sa mišjim antitelom 125-2H. Nijedno od ovih antitela se ne takmiči sa ABT325 (belo obojene ćelije).
[0326] Izgleda da antitela kao što su MOR9464_N30K i MOR10222_N30S_M54I koja pokazuju da se dvojno takmiče sa IL-18BP-Fc i sa mišjim antitelom 125-2H imaju prednost ne samo što vezuju slobodni IL-18, koji nije vezan za prirodni inhibitor IL-18BP-Fc, već imaju i potencijal da spreče vezivanje IL-18 za IL-18Rα/β. Kao što su opisali Vu i sar. (Wu C. et al., J. Immunol. 2003, 170: 5571-5577), izgleda da 18Rβ ne vezuje samo IL-18, već gradi funkcionalni receptorski kompleks velikog afiniteta sa IL-18Rα koji može da daje signal kao odgovor na IL-18. Biohemijski podaci u kombinaciji sa mapiranjem epitopa 125-2H na IL-18 otkrivaju da je 17 C-terminalnih aminokiselina humanog IL-18 ključno za transdukciju signala kroz heterodimerni receptor. Stoga, izgleda da antitela koja su sposobna za vezivanje u epitopu 125-2H i podjednako se takmiče sa IL-18 BP u vezivanju IL-18 imaju potencijal da spreče aktivaciju puta zavisnu od IL-18 ne samo putem blokiranja vezivanja za IL-18Rα, već i putem blokiranja vezivanja IL-18 za kompleks IL-18Rα/β. Kao što će biti jasno u odeljku 9.11, antitelo MOR9464_N30K vezuje, između ostalog, aminokiseline Glu177 i Leu180 koje se nalaze u nizu od 17 aminokiselina koji opisuju Wu i sar.
9.9) Mapiranje IL-18 epitopa putem modelovanja
[0327] Humani IL-18 iz baze podataka SwissProt, stavka Q14116, korišćen je za traženje strukturnih informacija u Proteinskoj banci podataka PDB (Berman H.M i sar. (2000) Nucl Acids Res; 28:235-242). Nađene su tri strukture sa šifrom 1J0S (Kato Z i sar. (2003) Nat Struct Biol;10:966), 2VXT (Argiriadi MA i sar. (2009) J Biol Chem; 284:24478) i 3F62 (Krumm B i sar. (2008) Proc Natl Acad Sci USA; 105:20711). 1J0S je NMR struktura humanog IL-18. 2VXT je kristalna struktura konstruisanog humanog IL-18 u kompleksu sa mišjim 125-2H fragmentom antitela pri rezoluciji od 1,49 Å, i 3F62 je kristalna struktura konstruisanog humanog IL-18 u kompleksu sa IL-18 vezujućim proteinom virusa boginja pri rezoluciji od 2,0 Å.
[0328] Tri mesta vezivanja na IL-18 su identifikovana putem mutacione analize. Dva od njih, mesto 1 i mesto 2, važna su za vezivanje IL-18Rα, a treće, mesto 3, za vezivanje IL-18Rβ (Kato Z. i sar. (2003) Nat.Struct.Biol,10:966). Mesto 2 je takođe značajno za vezivanje IL-18BP.
[0329] Strukturni kompleks između IL-1β i IL-1R1 je takođe dostupan (1ITB, Vigers G.P i sar. (1997) Nature, 386:190). Struktura kompleksa između IL-1β i IL-1R1 pokazuje da IL-1β ima dva mesta vezivanja za receptor, mesto 1 i 2 (Slika 11(A)). Pošto nema dostupne strukture za kompleks između IL-18 i IL-18Rα, kristalna struktura kompleksa IL-1β sa IL-1R1 je korišćena kao šablon za modelovanje proteina (PDB šifra 1ITB). Model IL-18Rα je napravljen korišćenjem strukture IL-1R1 kao šablona. Kristalna struktura IL-18 (pdb šifra 2VXT, Argiriadi M.A i sar. (2009) J.Biol.Chem.284:24478) i modelovana struktura IL-18Rα su strukturno superponirane na kompleks IL-1β/IL-1R1, i tako dobijeni model IL-18/IL-18Rα je prečišćen kako bi se dobio finalni strukturni model (Slika 11(B)). MOE v2009.1 (Chemical Computing Group Inc.) je softver koji je korišćen za modelovanje kompleksa između IL-18 i IL-18Rα. Panel homologih modela je korišćen da se napravi model IL-18Rα, izborom polja sile AMBER99 i podrazumevanih parametara panela. Panel minimizovanja energije u MOE je korišćen za usavršavanje finalnog kompleksa IL-18/IL-18Rα.
[0330] Ukupna struktura humanog IL-18 pokazuje sličnost sa strukturom IL-1β. Konkretno, RMSD (srednja kvadratna devijacija korena) između atoma IL-18 i IL-1β Cα u elementima sekundarne strukture ukazuje na to da su oni povezani proteini koji pripadaju istoj strukturnoj klasi (Kato Z. i sar. (2003) Nat.Struct.Biol, 10:966). Poređenje između struktura IL-1β i IL18 otkrilo je da mesto 1 i 2 u IL-18 odgovara mestu 1 i 2 u IL-1β. Na slici 11(B), mesta 1 i 2 su prikazana u modelu kompleksa između IL-18 i IL-18Rα, mesto 3 je takođe prikazano. Mesto 3 je objavljeno kao mesto interakcije za IL-18Rβ (Kato Z. i sar. (2003) Nat.Struct.Biol, 10:966).
[0331] Mesto vezivanja IL-18 za IL-18BP je nekako identifikovano pomoću alaninskih mutacija i rendgenske kristalne strukture IL-18BP virusa boginja u kompleksu sa IL-18 (Krumm i sar. (2008) Proc Natl Acad Sci USA; 105(52):20711-20715). Ovo pretpostavljeno mesto vezivanja takođe odgovara regionu na IL-18 koji je identifikovan kao mesto 2, i jedan je od dva regiona interakcije IL-18 sa IL-18Rα.
9.10) Mapiranje epitopa IL-18 pomoću masene spektrometrije sa razmenom vodonik/deuterijum (H/DxMS)
[0332] Masena spektrometrija sa razmenom vodonik/deuterijum korišćena je za ispitivanje humanog IL-18 u pogledu informacija o epitopu za MOR9464. Mapiranje pomoću H/DxMS oslanja se na razliku u masi između „normalnog“ atoma vodonika i „teškog“ izotopa deuterijuma, koji sadrži i neutron pored jednog protona prisutnog u normalnom jezgru vodonika.
[0333] Nakon prelaska iz vode u sistem rastvarača na bazi deuterijuma (teška voda), povećavaće se masa proteina kako se vodonici iz amida na skeletu proteina postepeno budu zamenjivali deuteronima (teži izotop vodonika). Verovatnoća događaja razmene vodonik/deuterijum u velikoj meri je određena strukturom proteina i dostupnošću rastvarača. H/DxMS tehnologija se koristi za merenje relativne razmene vodonik/deuterijum i posledično proteinske strukture i dostupnosti rastvarača.
[0334] Kada se vezujući partner proteina vezuje za antitelo (npr. interakcija antigen/antitelo), mogu se primetiti eksperimentalno uočljive promene u njegovoj brzini razmene. Površinski regioni koji isključuju rastvarač nakon formiranja kompleksa mnogo se sporije razmenjuju. Regioni bez rastvarača su korisni za otkrivanje lokacije mesta vezivanja. U slučaju interakcije antigen-antitelo, promene brzine razmene deuterijuma mogu istaći lokaciju epitopa, ali takođe i bilo koje druge poremećaje nastale usled vezivanja antitela za antigen. Na primer, smanjenje količine preuzetog deuterijuma u antigenu u datom vremenu razmene nakon vezivanja antitela može predstavljati bilo povećanu zaštitu usled direktnog vezivanja antitela za ovaj region, ili indirektni poremećaj strukture (alosterne izmene) zbog vezivanja antitela. Ova dva efekta se ne mogu lako razlikovati, mada se najjačem uočenom efektu često pripisuje da usmerava zaštitu od antitela.
[0335] Lokacija smanjenog inkorporisanja deuterona nakon vezivanja antitela se može otkriti putem digestije ciljnog proteina nakon razmene vodonik/deuterijum (npr. uz pogodni enzim poput pepsina), a zatim masenom spektrometrijom za određivanje mase relevantnih fragmenata.
[0336] Izvedeni su eksperimenti sa trostrukom kontrolom na 316 pmol IL-18 antigena sa vremenom razmene deuterijuma od 3 i 25 minuta, razblaživanjem osnovnog rastvora IL-18 sa 95% deuterisanog PBS pufera do koncentracije od 83,6% D. Razmena deuterijuma je prekinuta pomoću zaustavnog pufera (6M urea i 1M TCEP). Nakon prekidanja, bočica je analizirana pomoću onlajn pepsinske digestije/LC-MS analize. Onlajn pepsinska digestija je izvršena pomoću imobilisanog pepsina Poroszyme Life Science spakovanog u kolonu 2,0 x 20 mm, i LC razdvajanje je izvedeno na koloni Thermo C18 BioBasic (1,0 x 50 mm) pri protoku od 100 µl/min koristeći brzi gradijent, tako da su se svi peptidi eluirali za manje od 20 minuta. Mobilne faze su standardne reversnofazne mobilne faze: 0,1% mravlja kiselina u vodi i 0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu. U tim eksperimentima, amidni atomi vodonika skeleta koji su izloženi na površini IL-18 uključiće deuterone.
[0337] Zatim su sprovedeni trostruki eksperimenti obeležavanja. Prvo je MOR9464 antitelo imobilisano na Protein G agaroznim perlicama (Thermo 22851) koristeći standardne tehnike. Perlice sa antitelom su centrifugirane kako bi se uklonio rastvor PBS. Nakon toga, 200 µl hladnog PBS (pH 7,4) i 6 µl (316 pmol) IL-18 je dodato imobilisanom MOR9464 antitelu i inkubirano tokom 15 min na 4°C. Nakon inkubacije, kompleks je centrifugiran i ispran sa 200 µl PBS i ponovo centrifugiran. Za deuterijumsku razmenu, 200 µl 83,6% deuterijumskog PBS pufera je dodato u kompleks antigen-antitelo i inkubirano na 4°C tokom 3 ili 25 min. Deuterijumski pufer je zatim uklonjen, i odmah je dodato 125 µl pufera za prekidanje (kao gore). Nakon prekidanja, dotok je prenet u prethodno ohlađenu bočicu za HPLC, i analiziran je pomoću iste onlajn pepsinske digestije/LC-MS analize kao u kontrolnim eksperimentima.
Amidi skeleta koji su prisutni na međupovršini antigen-antitelo uključiće manje deuterona pri datom vremenu razmene u odnosu na kontrolne eksperimente. Poređenjem šablona H/Dx iz eksperimenata sa obeležavanjem i kontrolnih eksperimenata, otkriven je epitop kao ona površina antigena koja je zaštićena od direktne razmene u eksperimentima sa obeležavanjem.
[0338] Rezultati ove analize, kada se sprovodi sa MOR9464, otkrili su tri najznačajnija regiona zaštite na IL-18. Oni su bili (u odnosu na SEQ ID NO:1) od aminokiseline 87 do 99, od aminokiseline 119 do 137 i od aminokiseline 138 do 160. Pokazalo se da ovi regioni sadrže aminokiseline koje učestvuju u vezivanju IL-18BP (Slika 12).
9.11) Rendgenska strukturna karakterizacija IL-18/fragmenta antitela
[0339] Opšta identifikacija epitopa obezbeđena putem modelovanja i H/DxMS potvrdila je da antitela i njihovi fragmenti kako su ovde opisani prepoznaju region na IL-18 koji je takođe prepoznat od strane IL-18BP (Slika 12). Kako bi se identifikovale relevantne aminokiseline na IL-18 u tim regionima, sprovedeno je utvrđivanje rendgenske strukture kompleksa IL-18/antitelo.
[0340] Kako bi se pripremio fragment antitela, 13 mg MOR9464_N30K u koncentraciji od 18 mg/ml u 10 mM histidinu pH 5,0, cepano je sa 1/300 (m/m) papainom u 100 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM DTT tokom 200 min na sobnoj temperaturi. Reakcija je prekinuta sa 50 µM papainskog inhibitora E64. Fab fragment je zatim prečišćen preko kolone proteina A ekvilibrisane 20 mM natrijum fosfatnim puferom pH 7,0.
[0341] Prečišćavanje Fab kompleksa sa IL-18: Višak od 1,33 puta humanog IL-18 (1,6 mg u PBS-u) dodat je u 3,2 mg fragmenta antitela MOR9464_N30K (regenerisanog iz protoka sa kolone sa proteinom A). Kompleks IL-18 sa fragmentom antitela MOR9464_N30K koncentrovan je ultrafiltracijom, nanet na SPX-75 gel hromatografiju i izokratski eluiran u 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 25 mM NaCl.
[0342] Kristalizacija: Kompleks IL-18/fragment antitela MOR9464_N30K je koncentrovan ultrafiltracijom do 11,8 mg/ml, i pretraga kristalizacije je izvršena difuzijom pare u sedećoj kapi na pločama sa 96 bunarčića. Eksperimenti su postavljeni sa sistemom Phoenix robotic i čuvani u RockImager hotelu na 19°C. Identifikovana su i okarakterisana dva kristalna oblika (oblik A i oblik B):
1) Kristalni oblik A je rastao iz 0, 1M litijum sulfata, 0,1M ADA pH 6,5, 12% PEG 4000. (krioprotektant je bila smeša 1:1 rastvora za rezervoar sa 20% PEG 4000, 30% glicerola)
2) Kristalni oblik B je rastao iz 59,5% 2-metil-2,4-pentandiola (MPD), 15% glicerola, 85 mM HEPES pH 7,5. (Nije bio potreban krioprotektant).
[0343] Rendgenski podaci su prikupljeni na uređaju Swiss Light Source, linija zraka X10SA, sa detektorom piksela Pilatus. Sve difrakcione slike su obrađene pomoću programa XDS (verzija od 6. decembra 2010.), kao što se primenjuje kod APRV.
[0344] Za kristalni oblik A, snimljeno je 720 slika sa 0,25° oscilacije pri rastojanju od kristala do detektora od 460 mm, koristeći rendgensko zračenje talasne dužine od 0,99999 Å.
[0345] Za kristalni oblik B, snimljeno je 720 slika sa 0,25° oscilacije pri rastojanju od kristala do detektora od 430 mm, koristeći rendgensko zračenje talasne dužine od 0,99984 Å.
[0346] Struktura kristalnog oblika A je određena molekulskom zamenom u programu Phaser, koristeći unos PDB od 3GBM.pdb i 2VXT.pdb kao polazne modele za fragment antitela MOR9464_N30K, odnosno molekul IL-18. Varijabilni i prvi konstantni domen fragmenta antitela pri 3GBM.pdb korišćeni su kao modeli za nezavisnu pretragu. Lako je dobijen bistar rastvor za jedan kompleks IL-18/fragment antitela MOR9464_N30K po asimetričnoj jedinici. Struktura kristalnog oblika B je određena na isti način, ali koristeći usavršene modele dobijene od kristalnog oblika A umesto PDB unosa.
[0347] Usavršavanje strukture: Struktura je usavršena pomoću više ciklusa pregleda mape elektronske gustine i ponovne izrade modela u alatu Coot 0.6.2, a zatim automatizovanim usavršavanjem pomoću alata autoBUSTER (1.11.2/ buster 2.11.2). Intermolekulski kontakti su identifikovani pomoću softvera NCONT, a zaklonjena površina je analizirana koristeći AREAIMOL, oba iz programskog paketa CCP4 (verzija 6.1.2). Kolekcija rendgenskih podataka i statistika usavršavanja prikazane su u Tabeli 4 ispod.
Tabela 4: Kolekcija rendgenskih podataka i statistika usavršavanja
[0348] Ukupan pregled strukture kompleksa IL-18/MOR9464_N30K fragmenta je prikazan na Slici 13. Po završetku formiranja kompleksa, 36 aminokiselina na IL-18 sa smanjenom dostupnošću rastvarača je identifikovano na vezujućoj međupovršini IL-18 sa fragmentom antitela. Ti ostaci su Leu41, Glu42, Met87, Tyr88, Lys89, Asp90, Ser91, Gln92, Pro93, Arg94, Gly95, Met96, Ala97, Phe138, Gln139, Arg140, Ser141, Val142, Pro143, Gly144, His145, Asp146, Asn147, Met149, Gln150, Glu152, Ser153, Ser154, Glu157, Gly158, Phe160, Glu177, Asp178, Glu179, Leu180 i Gly181.
[0349] Dalja karakterizacija relevantnih kontakata nastalih u međupovršini kompleksa pokazala je da su Arg140 i Glu152 aminokiseline koje će verovatno najviše doprineti nastanku ovog konkretnog kompleksa. Oba ostatka se nalaze u centru vezujuće međupovršine, i doprinose velikom broju intermolekulskih kontakata (21, odnosno 18, koristeći granično rastojanje od 4,0 Å). Arg140 interaguje i sa L-CDR3 (Tyr94L) i sa H-CDR3 (Tyr101H, His102H) ostacima. Glu152 formira jaku (zaklonjenu) interakciju preko sonog mosta sa L-CDR2 Arg51L i prima H-vezu iz L-CDR3 Tyr94L. Svi ostaci u lancima antitela su redom numerisani, slovo L ili H nakon broja ostatka označavaju da je ostatak u lakom lancu, odnosno teškom lancu.
[0350] Trodimenzionalna struktura kompleksa IL-18/ fragmenta antitela MOR9464_N30K omogućila je dalja istraživanja različite unakrsne reaktivnosti između humanog IL-18 i IL-18 cinomolgusa. MOR9464_N30K je 10-struko slabiji naspram IL-18 cinomolgusa (20 pM) u poređenju sa 2 pM naspram humanog IL-18 (Tabela 2). IL-18 cinomolgusa se razlikuje od humanog IL-18 u 6 pozicija (humani naspram cinomolgusa): V47I; S86N; T99A; K115R; F170Y i E177K (Slika 14(A). Od ovih pozicija, samo glutaminska kiselina 177 (Glu177; E177) je na međupovršini kompleksa IL-18/ fragment antitela (Slika 14(B)). Može se raspravljati o tome da K177 u sekvenci IL-18 majmuna cinomolgusa izaziva 10-struko opadanje afiniteta MOR9464_N30K, kako je pokazano u Tabeli 2A kolona 1, gde KD(SET, pM) za MOR9464_N30K za humani IL-18 iznosi 2±1 pM, dok je za IL-18 cinomolgusa 20±10 pM.
[0351] Da bi se odredilo sa kojim se delom IL-18Rα takmiči fragment antitela MOR9464_N30K, obavljeno je superponiranje kompleksa IL-18/fragment antitela MOR9464_N30K sa kompleksom IL-18/IL-18Rα. Ukratko, struktura IL-18 u kompleksu IL18/IL-18Rα i IL-18 u kompleksu IL-18/MOR9464_N30K je superponirana koristeći komandu za poravnavanje kod PyMol (molekulski grafički sistem PyMol, verzija 1.2r3pre, Schroedinger LLC).
[0352] Kao što je prikazano na Slici 15, izgleda da se fragment antitela MOR9464_N30K takmiči sa Ig-domenom D3 iz IL-18Rα u vezivanju IL-18.
[0353] Slično tome, struktura kompleksa IL-18/fragment antitela MOR9464_N30K je superponirana na strukturu humanog IL-18 u kompleksu sa IL-18BP virusa boginja (korišćena koordinatna datoteka 3F62.pdb) koristeći komandu "align" kod PyMol (molekulski grafički sistem PyMol, verzija 1.5.0., Schroedinger LLC).
[0354] Kao što je prikazano na Slici 16, IL-18BP virusa boginja se sudara sa varijabilnim domenom teškog lanca fragmenta antitela MOR9464_N30K i takmiči se pretežno u vezivanju aminokiselinskih ostataka Met87 do Met96 na IL-18.
[0355] Ta otkrića dalje potvrđuju ovde prikazane biohemijske podatke i podatke o binovanju epitopa, i pokazuju da vezujući molekuli, kao što su ovde opisani, posebno antitela i njihovi fragmenti, ne vezuju kompleks IL-18/IL-18BP.
[0356] Konačno, izvršeno je poređenje sa mišjim antitelom 125-2H iz prethodnog stanja struke. Analiza je obavljena sa strukturom fragmenta antitela 125-2H kako se može naći u datoteci 2VXT.pdb. Ukratko, struktura IL-18 u kompleksu sa fragmentom antitela MOR9464_N30K superponirana je na IL-18 u kompleksu sa 125-2H Fab koristeći komandu za poravnavanje "align" kod PyMol (molekulski grafički sistem PyMol, verzija 1.5.0., Schroedinger LLC).
[0357] Kao što je prikazano na Slici 17, fragment antitela MOR9464_N30K (leva strana superponiranja) i fragment antitela 125-2H (desna strana superponiranja) preklapaju se u pogledu IL-18. Međutim, fragment antitela 125-2H ne vezuje epitop koji prepoznaje IL-18BP kao što je prikazano na Slici 18, dok je kompleks 125-2H/IL-18 bio superponiran sa kompleksom IL-18BP virusa boginja/IL. Ti podaci dalje potvrđuju kako literaturne podatke iz struke u pogledu 125-2H (Argiriadi M.A i sar. (2009) J.Biol.Chem. 284:24478), tako i ovde prikazane biohemijske podatke i podatke o binovanju epitopa, da mišje antitelo 125-2H vezuje kompleks IL-18/IL-18BP.
[0358] Konačno, kako je prikazano na Slici 19, izgleda da lizin na poziciji 30 u teškom lancu MOR9464_N30K gradi elektrostatičke/polarne interakcije sa Asp 146 i Asn 147 humanog IL-18, što ukazuje na to da je lizin 30 uključen u nastanak kompleksa antitelo-antigen. Stoga je jasno da je egzoćelijska modifikacija, kao što je ovde opisana u odeljku 9.2, poput deamidacije asparagina, mogla doprineti gubitku potentnosti MOR9464 tokom vremena. Izgleda da je zamena asparagina 30 lizinom u MOR9464_N30K pružila povećanu stabilnost MOR9464_N30K.
Tabela korelacije sekvenci

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Izolovano potpuno humano ili himerno antitelo ili njegov fragment koji specifično vezuje IL-18, ali ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein, pri čemu izolovano antitelo ili njegov fragment sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 14 i varijabilni domen lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 16.
2. Izolovano antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, pri čemu je izolovano antitelo ili njegov fragment izolovano potpuno humano antitelo ili njegov fragment.
3. Izolovano antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, pri čemu je izolovano antitelo ili njegov fragment fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, Fab', F(ab')2i scFv.
4. Izolovano antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 1, pri čemu izolovano antitelo ili njegov fragment sadrže teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 43 i laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 45.
5. Izolovani polinukleotid koji kodira izolovano antitelo ili njegov fragment iz bilo kog od zahteva 1 do 4.
6. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 5 koji sadrži:
SEQ ID NO: 15 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 17 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 15 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; i SEQ ID NO: 17 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 44 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 46 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; ili
SEQ ID NO: 44 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična; i SEQ ID NO: 46 ili sekvencu koja joj je najmanje 90% identična.
7. Klonirajući ili ekspresioni vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida prema bilo kom od zahteva 5 ili 6.
8. Ćelija domaćin koja sadrži jedan ili više klonirajućih ili ekspresionih vektora prema zahtevu 7.
9. Stabilno transformisana ili transficirana ćelija domaćin koja sadrži jedan ili više polinukleotida prema bilo kom od zahteva 5 ili 6.
10. Postupak za proizvodnju izolovanog potpuno humanog ili himernog antitela ili njegovog fragmenta koji specifično vezuje IL-18, ali ne vezuje kompleks IL-18/IL-18 vezujući protein, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 8 pod uslovima koji su pogodni za proizvodnju izolovanog antitela ili njegovog fragmenta.
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži izolovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i farmaceutski nosač, pri čemu farmaceutska kompozicija opciono sadrži drugo terapeutsko jedinjenje.
12. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 11 u obliku primenljivom intravenski, inhalabilno ili supkutano.
13. Izolovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 11 ili 12 za upotrebu u terapiji.
14. Izolovano antitelo ili njegov fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 11 ili 12 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji sarkoidoze, naročito plućne sarkoidoze, hemofagocitne limfohistiocitoze (HLH), familijarne hemofagne limfohistiocitoze (FHL) i drugih sindroma imunodeficijencije, artritisa džinovskih ćelija (GCA), hronične opstruktivne bolesti pluća (HOBP), Stilove bolesti odraslih (AOSD), sistemskog juvenilnog idiopatskog artritisa (SJIA), teške astme, uveitisa, geografkse atrofije, dijabetesa tipa 1, dijabetesa tipa 2 ili ateroskleroze i bilo koje njihove kombinacije kod pacijenta sisara.
RS20200663A 2012-09-07 2013-09-05 Il-18 vezujući molekuli RS60394B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261697981P 2012-09-07 2012-09-07
PCT/IB2013/058317 WO2014037899A2 (en) 2012-09-07 2013-09-05 Il-18 binding molecules
EP13792452.8A EP2892923B1 (en) 2012-09-07 2013-09-05 Il-18 binding molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60394B1 true RS60394B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=49596347

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200663A RS60394B1 (sr) 2012-09-07 2013-09-05 Il-18 vezujući molekuli

Country Status (40)

Country Link
US (5) US9376489B2 (sr)
EP (2) EP2892923B1 (sr)
JP (3) JP6404817B2 (sr)
KR (2) KR102330653B1 (sr)
CN (2) CN104640879B (sr)
AP (1) AP2015008266A0 (sr)
AR (1) AR092465A1 (sr)
AU (4) AU2013311234A1 (sr)
BR (2) BR112015004783B1 (sr)
CA (1) CA2883821C (sr)
CL (1) CL2015000532A1 (sr)
CO (1) CO7400884A2 (sr)
CR (1) CR20150121A (sr)
CU (1) CU24249B1 (sr)
CY (1) CY1123071T1 (sr)
DK (1) DK2892923T3 (sr)
EA (2) EA201992614A3 (sr)
EC (1) ECSP15013209A (sr)
ES (1) ES2804704T3 (sr)
GT (1) GT201500054A (sr)
HR (1) HRP20200906T1 (sr)
HU (1) HUE050464T2 (sr)
IL (2) IL237161B (sr)
JO (2) JO3764B1 (sr)
LT (1) LT2892923T (sr)
MA (1) MA37892A1 (sr)
MX (2) MX373426B (sr)
MY (1) MY174691A (sr)
PE (1) PE20150649A1 (sr)
PH (1) PH12015500466B1 (sr)
PL (1) PL2892923T3 (sr)
PT (1) PT2892923T (sr)
RS (1) RS60394B1 (sr)
SG (2) SG11201501559VA (sr)
SI (1) SI2892923T1 (sr)
TN (1) TN2015000057A1 (sr)
TW (2) TWI613217B (sr)
UY (1) UY35016A (sr)
WO (1) WO2014037899A2 (sr)
ZA (1) ZA201500954B (sr)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9376489B2 (en) * 2012-09-07 2016-06-28 Novartis Ag IL-18 binding molecules
CN115925928A (zh) * 2013-09-05 2023-04-07 Ab2生物股份有限公司 炎性疾病中的il-18结合蛋白(il-18bp)
US10786578B2 (en) 2014-08-05 2020-09-29 Novartis Ag CKIT antibody drug conjugates
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
CN114773470A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
US10882905B2 (en) * 2015-03-05 2021-01-05 Ab2 Bio Sa IL-18 binding protein (IL-18BP) and antibodies in inflammatory diseases
WO2017076805A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Use of an inhibitor of il18 for treatment of acute kidney injury
EP3370768B9 (en) 2015-11-03 2022-03-16 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
TWI693940B (zh) 2016-08-05 2020-05-21 日商中外製藥股份有限公司 Ｉｌ-８相關疾病之治療用或預防用組成物
CN108218978B (zh) * 2016-12-13 2020-05-12 沈阳何氏眼产业集团有限公司 一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用
FI3592384T3 (fi) 2017-03-09 2025-09-29 Mab Discovery Gmbh Vasta-aineita, jotka spesifisesti sitoutuvat ihmisen IL-1R7:ään
UY37758A (es) * 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos
CN111315395A (zh) 2017-09-06 2020-06-19 耶鲁大学 白细胞介素-18变体和使用方法
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
WO2019213686A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Therapeutic compositions and uses therefor
MX2021004598A (es) * 2018-10-23 2021-06-15 Scholar Rock Inc Inhibidores selectivos de rgmc y el uso de los mismos.
US12269874B2 (en) 2018-12-03 2025-04-08 mAbProtein Co., Ltd. Antibody that recognizes neoepitope of activated interleukin-18 proteins and application thereof
CN109870570A (zh) * 2018-12-29 2019-06-11 广东云天抗体生物科技有限公司 一种检测猴il-18的酶联免疫试剂盒
US12029778B2 (en) 2019-05-13 2024-07-09 Yale University Interleukin-18 mimics and methods of use
TW202233675A (zh) * 2020-10-29 2022-09-01 瑞士商諾華公司 Ｉｌ－１８拮抗劑用於治療和／或預防異位性皮炎或相關病症之用途
JP2023549257A (ja) 2020-11-18 2023-11-22 ノバルティス アーゲー Ｎｌｒｃ４－ｇｏｆインフラマソーム病の処置における使用のための二特異性抗体
WO2022221264A1 (en) * 2021-04-12 2022-10-20 Ethos Biosciences, Inc. Methods and compositions for analysis of acute kidney injury
WO2022269451A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Novartis Ag Bispecific antibodies for use in treatment of hidradenitis suppurativa
EP4371573A4 (en) 2021-07-13 2025-08-20 National Univ Corporation Tokai National Higher Education And Research System MEDICINAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
CN117177999B (zh) * 2022-01-14 2024-07-05 和径医药科技（上海）有限公司 一种靶向IL-18Rβ的抗体及其应用
PE20251671A1 (es) 2022-03-15 2025-06-30 Compugen Ltd Anticuerpos antagonistas de il-18bp y su uso en monoterapia y terapia de combinacion en el tratamiento del cancer
US20230357381A1 (en) * 2022-04-26 2023-11-09 Novartis Ag Multispecific antibodies targeting il-13 and il-18
TW202430560A (zh) * 2023-01-06 2024-08-01 美商拉森醫療公司 抗ｉｌ－１８ｂｐ抗體
IL321948A (en) 2023-01-06 2025-09-01 Lassen Therapeutics Inc Anti-IL-18 BP antibodies
TW202515608A (zh) 2023-06-26 2025-04-16 以色列商坎布根有限公司 Ｉｌ—１８ｂｐ拮抗抗體及其於癌症治療之單一療法及組合療法的用途
WO2025068957A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Novartis Ag Bispecific antibodies for use in lowering the risk of cardiovascular disease events in subjects known to be a carrier of clonal expansion of hematopoietic cell lines with somatic mutations
CN120349409B (zh) * 2025-04-08 2026-03-17 生物岛实验室 Il-18bp纳米抗体及其制备方法与应用
CN120349413A (zh) * 2025-04-08 2025-07-22 生物岛实验室 Il-18纳米抗体、抗体对及其制备方法与应用

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JPH03230220A (ja) 1990-02-05 1991-10-14 Seiko Epson Corp ソート処理方法
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU6852594A (en) 1993-06-03 1995-01-03 Therapeutic Antibodies Inc. Production of antibody fragments
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5429746A (en) 1994-02-22 1995-07-04 Smith Kline Beecham Corporation Antibody purification
TW581771B (en) 1994-11-15 2004-04-01 Hayashibara Biochem Lab Recombinant production of a polypeptide for inducing interferon-gamma production, and monoclonal antibody against the polypeptide
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
JP2007121310A (ja) 1996-07-31 2007-05-17 Hayashibara Biochem Lab Inc 自己免疫疾患診断剤
JP2009047705A (ja) 1996-07-31 2009-03-05 Hayashibara Biochem Lab Inc 生物学的試料の検出方法
US7141393B2 (en) 1996-12-26 2006-11-28 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Interleukin-18-receptor proteins
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
EP1047781B1 (en) 1998-01-23 2004-07-28 Immunex Corporation Il-18 receptors
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
CA2276216A1 (en) 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
AR022952A1 (es) 1999-03-19 2002-09-04 Smithkline Beecham Corp ANTICUERPO MONOCLONAL DE ROEDOR ESPECIFICAMENTE NEUTRALIZANTE PARA LA INTERLEUQUINA-18 HUMANA , UN FRAGMENTO FAB NEUTRALIZANTE o FRAGMENTO F(AB')2, UNA REGION DE COMPLEMENTARIEDAD DE CADENA LIGERA DE INMONOGLOBULINA(CDR), UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO, COMPOSICION FARMACEUTICA QUE LO COMPRENDE, EL
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6432678B1 (en) 1999-06-21 2002-08-13 Smithkline Beecham Corporation Macaca cynomolgus IL 18
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
ES2327382T3 (es) 1999-07-20 2009-10-29 Morphosys Ag Metodos para presentar (poli)peptidos/proteinas en particulas de bacteriofagos a traves de enlaces disulfuro.
IL148079A0 (en) 1999-08-24 2002-09-12 Medarex Inc Human ctla-4 antibodies and compositions containing the same
JP3230220B2 (ja) 1999-10-07 2001-11-19 独立行政法人 農業技術研究機構 ブタ由来インターロイキン−１８に対するモノクローナル抗体
DE60041432D1 (de) 1999-11-16 2009-03-12 Hayashibara Biochem Lab Antikörper spezifisch für den Interleukin-18 Vorläufer
TWI335336B (sr) 2000-02-10 2011-01-01 Abbott Gmbh & Co Kg
TR200502061T2 (tr) * 2000-02-21 2005-08-22 Research Systems Ars Holding N. V. Applied IL-18 inhibitörlerinin kullanımı.
EE05056B1 (et) 2000-05-05 2008-08-15 Applied Research Systems Ars Holding N.V. IL-18 inhibiitorite kasutamine ravimi valmistamiseks, mis on ette n„htud ateroskleroosi ravimiseks ja/v?i ennetamiseks
EP2322644A1 (en) 2000-06-28 2011-05-18 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
AU2002224417A1 (en) 2000-10-18 2002-04-29 Immunex Corporation Methods for treating il-18 mediated disorders
CN1487996B (zh) 2000-11-30 2010-06-16 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
HU229164B1 (en) 2001-01-29 2013-09-30 Serono Sa Coinsins Lab Use of il-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of heart disease
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003057821A2 (en) 2001-10-26 2003-07-17 Centocor, Inc. Mut-il-18 or mut-il-18r proteins, antibodies, compositions, methods and uses
SI1487541T1 (sl) 2002-03-22 2009-02-28 Serono Lab Uporaba inhibitorjev il-18 za zdravljenje in /alipreventivo bolezni perifernega oĺ˝ilja
FR2838444B1 (fr) 2002-04-10 2016-01-01 Neovacs Nouveaux peptides et leur application en therapeutique
AU2004235595C1 (en) * 2003-04-30 2009-09-24 Japan Science And Technology Agency Human antihuman interleukin-18 antibody, fragment thereof and method of using the same
US20080076708A1 (en) 2003-05-13 2008-03-27 Valter Altarocca Active Variants of the Il-18 Binding Protein and Medical Uses Thereof
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
CN1845938B (zh) 2003-06-30 2010-05-26 杜门蒂斯有限公司 多肽
JP2005052021A (ja) 2003-08-07 2005-03-03 Yokohama City インターロイキン−１８変異体タンパク質
US20050075702A1 (en) 2003-10-01 2005-04-07 Medtronic, Inc. Device and method for inhibiting release of pro-inflammatory mediator
US7968684B2 (en) 2003-11-12 2011-06-28 Abbott Laboratories IL-18 binding proteins
US20050100965A1 (en) * 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
WO2005075648A1 (en) 2004-01-28 2005-08-18 Gifu University Interleukin-18 mutant proteins
WO2005079766A2 (en) 2004-02-20 2005-09-01 Novo Nordisk A/S Therapeutic combination comprising a tissue factor antagonist and anti-cancer compounds
WO2005097998A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-18 specific polypeptides and therapeutic uses thereof
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
JP4673068B2 (ja) 2005-01-19 2011-04-20 独立行政法人科学技術振興機構 Ｔｈ１型アレルギー疾患治療用組成物
US20070003981A1 (en) 2005-06-29 2007-01-04 Rules-Based Medicine, Inc. Methods and kits for the diagnosis of acute coronary syndrome
KR20130108481A (ko) 2005-08-19 2013-10-02 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US20090215992A1 (en) 2005-08-19 2009-08-27 Chengbin Wu Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP3611266B1 (en) 2005-08-23 2022-11-09 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
JP4728785B2 (ja) 2005-11-30 2011-07-20 独立行政法人科学技術振興機構 Ｉｌ−１８の生物活性を有する新規ポリペプチドの生産方法、および当該ポリペプチドの産生を阻害する物質のスクリーニング方法
CA2652733C (en) 2006-05-25 2016-06-21 Glaxo Group Limited Modified humanised anti-interleukin-18 antibodies
CA2697032C (en) 2007-08-22 2021-09-14 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
WO2009099545A1 (en) 2008-01-30 2009-08-13 Abbott Laboratories Compositions and methods for crystallizing antibody fragments
BRPI0913366A8 (pt) 2008-06-03 2017-07-11 Abbott Lab Imunoglobulinas de domínio variável duplo e seus usos
NZ603698A (en) 2008-07-08 2014-03-28 Abbvie Inc Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2012500242A (ja) 2008-08-18 2012-01-05 グラクソ グループ リミテッド Ｉｌ−１８アンタゴニストを用いる自己免疫疾患の治療
WO2010040736A2 (en) 2008-10-07 2010-04-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against il18 and/or the il-18 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and/or disorders associated with il-18 mediated signaling
MX2011004199A (es) 2008-10-20 2011-05-24 Abbott Lab Anticuerpos que unen a il-18 y metodos para purificar los mismos.
MX2011004201A (es) 2008-10-20 2011-05-24 Abbott Lab Desactivacion viral durante purificacion de anticuerpos.
BRPI0923595A2 (pt) 2008-12-23 2016-01-26 Mtn Mobile Money Sa Pty Ltd método para processar seguramente uma transação, sistema para processar uma transação, e, dispositivo de comunicações móveis
EP2424566A4 (en) 2009-05-01 2013-07-31 Abbvie Inc IMMUNOGLOBULINE WITH DOUBLE VARIABLE DOMAIN AND ITS USE
WO2011098424A2 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Glaxo Group Limited Treatment of a metabolic disorder
KR20140003467A (ko) * 2010-12-20 2014-01-09 메디뮨 리미티드 항il-18 항체 및 그의 용도
US9376489B2 (en) * 2012-09-07 2016-06-28 Novartis Ag IL-18 binding molecules
UY37758A (es) * 2017-06-12 2019-01-31 Novartis Ag Método de fabricación de anticuerpos biespecíficos, anticuerpos biespecíficos y uso terapéutico de dichos anticuerpos

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20200906T1 (hr) 2020-09-04
TW201827463A (zh) 2018-08-01
JP6944509B2 (ja) 2021-10-06
EA201992614A3 (ru) 2020-05-31
EA201992614A2 (ru) 2020-03-31
HK1209136A1 (en) 2016-03-24
US20160376361A1 (en) 2016-12-29
WO2014037899A3 (en) 2014-06-05
CU24249B1 (es) 2017-02-02
KR20150047138A (ko) 2015-05-04
EA201590523A1 (ru) 2015-06-30
BR122019028128B1 (pt) 2023-01-31
SG10201706623WA (en) 2017-09-28
MX2020007022A (es) 2020-09-07
WO2014037899A2 (en) 2014-03-13
TW201414747A (zh) 2014-04-16
JO3764B1 (ar) 2021-01-31
AU2020201556A1 (en) 2020-03-19
SI2892923T1 (sl) 2020-07-31
AU2016201741B2 (en) 2017-09-07
PT2892923T (pt) 2020-06-23
AR092465A1 (es) 2015-04-22
BR112015004783B1 (pt) 2023-01-31
PH12015500466A1 (en) 2015-04-20
AU2016201741A1 (en) 2016-04-07
AP2015008266A0 (en) 2015-02-28
EP3725805A1 (en) 2020-10-21
IL268336A (en) 2019-09-26
KR102207672B1 (ko) 2021-01-26
ES2804704T3 (es) 2021-02-09
US20250034240A1 (en) 2025-01-30
KR102330653B1 (ko) 2021-11-23
HUE050464T2 (hu) 2020-12-28
CU20150022A7 (es) 2015-08-27
US9376489B2 (en) 2016-06-28
SG11201501559VA (en) 2015-03-30
BR112015004783A2 (pt) 2017-11-21
CA2883821A1 (en) 2014-03-13
JOP20200308A1 (ar) 2020-11-29
JP2015534546A (ja) 2015-12-03
TN2015000057A1 (en) 2016-06-29
US20140112915A1 (en) 2014-04-24
CN109517065B (zh) 2022-11-04
AU2020201556B2 (en) 2022-01-13
PL2892923T3 (pl) 2020-09-07
AU2013311234A1 (en) 2015-03-05
US20220098296A1 (en) 2022-03-31
EP2892923B1 (en) 2020-03-25
JP6404817B2 (ja) 2018-10-17
IL237161A0 (en) 2015-04-30
AU2017272201B2 (en) 2020-01-02
GT201500054A (es) 2015-10-15
UY35016A (es) 2014-04-30
MX373426B (es) 2020-06-25
JP2020072704A (ja) 2020-05-14
CA2883821C (en) 2023-03-07
PE20150649A1 (es) 2015-05-14
CN104640879B (zh) 2018-12-07
LT2892923T (lt) 2020-06-25
AU2017272201A1 (en) 2018-01-04
KR20210011504A (ko) 2021-02-01
US10081677B2 (en) 2018-09-25
CN109517065A (zh) 2019-03-26
CY1123071T1 (el) 2021-10-29
JP2019037230A (ja) 2019-03-14
MY174691A (en) 2020-05-07
DK2892923T3 (da) 2020-06-29
EA034610B1 (ru) 2020-02-27
EP2892923A2 (en) 2015-07-15
US11111293B2 (en) 2021-09-07
TWI613217B (zh) 2018-02-01
CO7400884A2 (es) 2015-09-30
MX2015002986A (es) 2015-10-08
US20190085068A1 (en) 2019-03-21
TWI655208B (zh) 2019-04-01
CN104640879A (zh) 2015-05-20
PH12015500466B1 (en) 2021-04-14
IL237161B (en) 2019-08-29
CL2015000532A1 (es) 2015-06-05
ZA201500954B (en) 2018-11-28
MA37892A1 (fr) 2016-06-30
IL268336B (en) 2022-03-01
ECSP15013209A (es) 2018-09-30
CR20150121A (es) 2015-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250034240A1 (en) Il-18 binding molecules
KR101877109B1 (ko) 항-il-17a 항체 및 자가면역 및 염증성 장애의 치료에서의 그의 용도
CN109476742B (zh) Tl1a抗体及其用途
HK40030914A (en) Il-18 binding molecules
HK1209136B (en) Il-18 binding molecules