RS61033B1 - Antitela na pd-l1 i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetna prijava odnosi sena antitela na PD-L1 ili njihove fragmente koji se vezuju za antigen, nukleinsku kiselinu koja ih kodira, njihove terapeutske kompozicije, i njihovu upotrebu za poboljšanje funkcije T-ćelija za jačanje ćelijski-posredovanih imunoloških odgovora i za lečenje disfunkcionalnih poremećaja T- ćelija, kao što je tumorski imunitet, i za lečenje i za rak,

Stanje tehnike

Razvoj i aktivacija limfocita

[0002] Dva glavna tipa limfocita kod čoveka su T (izvedeni iz timusa) i B (izvedeni iz koštane srži. Ove ćelije su izvedene iz hematopoetskih matičnih ćelija koštane srži i fetalne jetre koje su se opredelile za razvojni put limfoida. Potomci ovih matičnih ćelija slede divergentne puteve da bi sazreli u B ili T limfocite. Razvoj humanih B-limfocita odvija se u potpunosti unutar koštane srži. T ćelije se, sa druge strane, razvijaju iz nezrelih prekursora koji napuštaju srž i putuju krvotokom do timusa, gde se razmnožavaju i diferenciraju u zrele T limfocite.

[0003] Zreli limfociti koji izlaze iz timusa ili koštane srži su u stanju mirovanja ili u stanju “odmora“, tj. mitotski su neaktivni. Kada se rašire u krvotok, ovi „prirodni “ ili ,,intaktni“ limfociti putuju u razne sekundarne ili periferne limfoidne organe, poput slezine, limfnih čvorova ili krajnika. Većina intaktnih limfocita ima inherentno kratak životni vek i umiru nekoliko dana nakon napuštanja srži ili timusa. Međutim, ako takva ćelija primi signale koji ukazuju na prisustvo antigena, mogu se aktivirati i podvrgnuti uzastopnim ciklusima deobe ćelija. Neke od nastalih ćelija potomaka se zatim vraćaju u stanje mirovanja da bi postale memorijski limfociti - B i T ćelija koje su u osnovi pripremljene za sledeći susret sa stimulišućim alergenom. Drugo potomstvo aktiviranih intaktnih limfocita su efektorske čelije, koje prežive samo nekoliko dana, ali sprovode određene odbrambene aktivnosti.

[0004] Aktivacija limfocita odnosi se na uređeni niz događaja kroz koje prolazi limfocit u mirovanju, stimulisan da se deli i proizvodi potomstvo, od kojih neke postaju efektorske ćelije. Potpuni odgovor uključuje i indukciju ćelijske proliferacije (mitogeneza) i ekspresiju imunoloških funkcija. Limfociti postaju aktivirani kada se specifični ligandi vežu za receptore na njihovoj površini. Ligandi su različiti za T ćelije i B ćelije, ali rezultujući unutarćelijski fiziološki mehanizmi su slični.

[0005] Neki strani antigeni sami mogu da indukuju aktivaciju limfocita. posebno veliki polimerni antigeni koji ukrštaju površinske imunoglobuline na B-ćelijama ili drugi glikoproteini na T-ćelijama.

Međutim, većina antigena nije polimerna, pa čak i direktno vezivanje za B-ćelije u velikom broju ne dovodi do aktivacije. Ovi češći antigeni aktiviraju B ćelije kada se kostimulišu sa obližnjim aktiviranim pomoćnim T-Iimfocitima. Takva stimulacija može nastati iz limfokina koje sekretuje T-ćelija, ali se najefikasnije prenosi direktnim kontaktom B ćelije sa površinskim proteinima T-ćelija koji su u interakciji sa određenim površinskim receptorima B-ćelija za generisanje sekundarnog signala.

T-ćelije

<[0006]>т<limfociti ne eksprimiraju imunoglobuline, već umesto toga otkrivaju prisustvo stranih>supstanci putem površinskih proteina koji se nazivaju T-ćelijski receptori (TCR). Ovi receptori prepoznaju antigene bilo direktnim kontaktom bilo putem uticaja na aktivnost drugih imunih ćelija. Zajedno sa makrofazima, T ćelije su primarni tip ćelija uključenih u ćelijski posredovani imiunitet.

[0007] T-ćelije za razliku od B-ćelija, mogu da otkriju strane supstance samo u određenom kontekstu. Konkretno, T-limfociti će prepoznati strani protein samo ako je prvo cepan na male peptide. koji su zatim prezentovani na površini druge ćelije domaćina, koja senaziva antigen prezentujuća ćelija (APC). Mnoge vrste ćelija domaćina mogu da predstave antigene pod nekim uslovima, ali određene vrste su specifičnije prilagođene u tu svrhu i posebno su važne u kontroli aktivnosti T-ćelija. uključujući makrofage i druge B-ćelije. Prezentacija antigena delimično zavisi od specifičnih proteina, koji se nazivaju glavni proteini kompleksa histokompatibilnosti (MHC), na površini prezentujućih ćelija. Dakle, da bi stimulisali ćelijski posredovan imunitet, strani peptidi moraju biti prezentovani T-ćelijama u kombinaciji sa MHC peptidima, a ovu kombinaciju mora prepoznati T-ćelijski receptor.

[0008] Postoje dve značajne podgrupe T-ćelija: citotoksični T limfociti (Tcćelije ili CTLs) i pomoćne T ćelije (Тн) koje se mogu približno identifikovati na osnovu eksprimovanja CD8 i CD4 markera na površini ćelija. Tcćelije su važne u odbrani od virusa i mogu direktno ubiti viruse prepoznavanjem određenih virusnih peptida eksprimiranih na površini ćelije. Тн ćelije promovišu proliferaciju, sazrevanje i imunološku funkciju drugih tipova ćelija, npr., sekreciju limfokina za kontrolu aktivnosti B ćelija, makrofaga i citotoksičnih T ćelija. I naivni i i memorijski T-limfociti obično ostaju u stanju mirovanja i u tom stanju ne pokazuju značajnu pomoćnu ili citotoksičnu aktivnost. Kada se aktiviraju, ove ćelije prolaze kroz nekoliko krugova mitotske deobe da bi proizvele ćerke ćelije. Neke od ovih ćerki ćelija se vraćaju u stanje mirovanja kao memorijske ćelije, dok druge postaju efektorske ćelije koje aktivno eksprimiraju pomoćnu ili citotoksičnu aktivnost. Ove ćerke-ćelije podsećaju na roditelje: CD4 ćelije mogu da proizvedu samo CD4 potomstvo, dok CD8 ćelije daju samo CD8 potomstvo. Efektorske T-ćelije eksprimiraju površinske markere na ćeliji koji nisu eksprimirani na mirujućim T-ćelijama, kao što su CD25, CD28, CD29, CD40L, transferinski receptori i proteini klase II MHC. Kada se aktivirajući stimulusi povuku, citotoksična ili pomoćna aktivnost postepeno popušta tokom perioda od nekoliko dana dok efektorske ćelije ili umiru ili se vraćaju u stanje mirovanja. Slično aktivaciji B-ćelija, i odgovori T-limfocita na većinu antigena zahtevaju dve vrste simultanih stimulusa. Prvi je antigen, koji ako je odgovarajuće prikazen MHC proteinima na antigen prezentujućoj ćeliji, mogu da ga prepoznaju i vežu T-ćelijski receptori. Iako ovaj antigen-MHC kompleks šalje signal unutrašnjosti ćelije, obično je nedovoljan da dovede do aktivacije T-ćelija. Potpuna aktivacija, kao što se dešava sa pomoćnim T-ćelijama, zahteva kostimulaciju sa drugim specifičnim ligandima koji se nazivaju kostimulatori i koji se eksprimuju na površini antigen prezentujuće ćelije. Aktivacija citotoksične T ćelije, s druge strane, obično zahteva IL -2, citokin koji sekretuju aktivirane pomoćne T ćelije.

Putanja PD-1

[0009] Važan negativni kostimulacjski signal koji reguliše aktivaciju T ćelija obezbeđuju receptor programirane ćelijske smrti-1 (PD-1) (CD279) i njegovi ligandi za vezivanje liganda PD-L1 (B7-H1, CD274) i PD-L2 (B7- DC, CD273). Negativna regulatorna uloga PD-1 otkrivena je potpunim uklanjanjem PD-1 (Pdcdl<-/->), sklonim autoimunitetu. Nishimura et al, Immunity JJ.: 141-51 (1999): Nishimura et al. Science 291: 319-22 (2001). PD-1 je povezan sa CD28 i CTLA-4, ali mu nedostaje proksimalni membranski cistein koji omogućava homodimerizaciju. Citoplazmatski domen PD-1 sadrži imunoreceptorski tirozin-bazirani inhibitorni motiv (ITIM, V/lxYxxL/V). PD-1 se vezuje samo za PD-L1 i PD-L2. Freeman et al, J. Ехр. Med.192: 1-9 (2000); Dong et al, Nature Med.5: 1365-1369(1999): Latchman et al, Nature Immunol 2: 261-268 (2001); Tseng et al, J. Ехр. Med. 193: 839-846 (2001).

[0010] PD-1 se može eksprimirati na T ćelijama, B ćelijama, prirodnim T ćelijama ubicama, aktiviranim monocitima i dendritskim ćelijama (DCs). PD-1 se eksprimira aktiviranim, ali ne i nestimulisanim humanim CD4<+>i CD8<+>T ćelijama, B ćelijama i mijeloidnim ćelijama. Ovo je u suprotnosti sa ograničenijom ekspresijom CD28 i CTLA-4. Nishimura et al, Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettleret al, J. Virol.80: 3532-40 (2006). Postoje najmanje 4 varijante PD-1 koje su klonirane iz aktiviranih humanih T ćelija, uključujući (i) egzon 2, (ii) egzon 3, (iii) egzone 2 i 3 ili (iv) egzone 2 do 4 kojima nedostaje transkrpit. Nielsen et al, Cell, Immunol. 235: 109-16 (2005). Sa izuzetkom PD-1Δех3, sve varijante su eksprimirane na sličnim nivoima kao PD-1 pune dužine u mirujućim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMCs). Eksprimiranje svih varijanti je značajno indukovano aktivacijom humanih T ćelija sa anti-CD3 i anti-CD28. Varijantama PD-lΔex3 nedostaje transmembranski domen i podseća na rastvorljiv CTLA-4, koji igra važnu ulogu u autoimunosti. Ueda et al, Nature 423: 506-11 (2003). Ova varijanta je obogaćena sinovijalnom tečnošću i serumima pacijenata sa reumatoidnim artritisom. Wan et al, J. Immunol.177: 8844-50 (2006).

Dva liganda se PD-1 razlikuju u svojim ekspresijskim obrascima. PD-L1 se konstitutivno eksprinrira na T i B ćelijama miša, CDs-ima, makrofagima, mezenhimalnim matičnim ćelijama i mastocitima dobijenim iz koštane srži. Yamazaki et al, J. Immunol. 169: 5538-45 (2002). PD-L1 je eksprimiran na širokom spektru nehematopoetskih ćelija (npr. rožnjača, pluća, vaskularni epitel, neparhimske ćelije jetre, mezenhimalne matične ćelije, Langerhansova ostrvca, sinktiotrofoblasti placente, keratinociti, itd.) [Keir et al, Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)], i ushodno reguliše više vrsta ćelija nakon aktivacije. Interferoni IFN’s tipa 1 i tipa II ushodno regulišu PD-Ll. Eppihimer et al, Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al, J. Neuroimmunol 155: 172-82 (2004). Ekspresija PD-L1 u ćelijskim linijama se smanjuje kada su inhibirani MyD88, TRAF6 i MEK. Liu et al, Blood HO: 296-304 (2007).

ЈАK2 је takođe impliciran u indukciju PD-L1. Lee et al, FEBS Lett. 580: 755-62 (2006); Liu et al, Blood HO: 296-304 (2007). Gubitak ili inhibicije homologa fosfataze i tenzina (PTEN), ćelijske fosfataze koja je modifikovala signalizaciju fosfatidilinosital 3-kinaze (PI3K) i Akt, povećala je posttranskripcionu ekspresiju PD-L1 kod karcinoma. Parsa et al, Nat. Med. 13: 84-88 (2007). Ekspresija PD-L2 je više ograničena od PD-L1. PD-L2 se inducibilno eksprimira na DCs, makrofagima i mastocitima dobijenim iz koštane srži. PD-L2 se takođe eksprimira na oko pola do dve trećine mirujućih peritonealnih BI ćelija, ali ne i na konvencionalnim B2 B ćelijama. Zhong et al, Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007). PD-L2 BI ćelije vezuju fosfatidilholin i mogu biti važne za urođeni imunski odgovor na bakterijske antigene. Indukcija PD-L2 pomoću IFN-y delimično zavisi od NF -KB. Liang et al, Eur. J. Immunol. 33_: 2706-16 (2003). PD-L2 se takođe može indukovati na monocitima i makrofagima pomoću GM-CF, IL-4 i i IFN-γ. Yamazaki et al., J. Immunol.169: 5538-45 (2002); Loke etal, PNAS 100:5336-41 (2003).

[0011] PD-1 signalizacija obično ima veći efekat na proizvodnju citokina nego na ćelijsku proliferaciju, sa značajnim efektima na proizvodnju IFN-γ, TNF-α i IL-2. Posredovano inhibitorna signalizacija PD-1 takođe zavisi od jačine TCR signalizacije, sa većom inhibicijom pri niskim nivoima TCR stimulacije. Ovo smanjenje se može prevazići kostimulacijom kroz CD28 [Freeman et al, J. Ехр. Med. 192: 1027-34 (2000)] ili prisustvo 1L-2 [Carter et al, Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)]. Pojačava se dokaz da signalizacija putem PD-L1 i PD-L2 može biti dvosmerna. To jest, pored modifikovanja signalizacije TCR ili BCR, signalizacija se takođe može isporučiti natrag u ćelije koje eksprimiraju PD-L1 i PD-L2. lako nije utvrđeno da lečenje dendritrijskih ćelija prirodno humanim antitelom na PD-L2 izolovanim od pacijenta sa Valdenstromovom makroglobulinemijom povećava regulaciju MHC II ili B7 kostimulatornih molekula, takve ćelije proizvode veću količinu proinflamatornih citokina, posebno TNF-α i IL -6, i stimulišu proliferaciju T ćelija. Nguyen et al, J. Ехр. Med. 196: 1393-98 (2002). Tretman miševa sa ovim antitelom takođe je (1) povećao otpornost na transplantovani b16 melanom i brzo indukovani tumor- specifični CTL. Radhakrishnan et al, J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al, Cancer Res. 64: 4965-72 (2004); Heckman et al, Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007); (2) blokirani razvoj inflamatorne bolesti disajnih puteva u mišjem modelu alergijske astme. Radhakrishnan et al, J. Immunol.173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al, J. Allergy Clin. Immunol. Шу.

668-74 (2005).

[0012] Dalji dokazi o reverznoj signalizaciji u dendritskim ćelijama (,,DCs“) su rezultati ispitivanja DCs-a izvedenih iz koštane srži kultivisanih rastvorljivim PD-1 (PD-1 EC domen kondenzovan sa 1g konstantnim regionom - ,,s-PD-l“). Kuipers et al, Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006). Ovaj sPD-1 je inhibirao DC aktivaciju i povećao proizvodnju IL-10, na način reverzibila putem davanja anti-PD-1. Pored toga, nekoliko ispitivanja pokazuje receptor za PD-L1 ili PD-L2 koji je nezavisan od PD-1. B7.1 je već identifikovan kao vezujući partner za PD-L1. Butte et al, Immunity 27: 111 -22 (2007). Ispitivanja hemijskog umrežavanja sugerišu da PD-L1 i B7.I mogu da interaguju kroz svoje domene sličnim lgV. B7.1: PD-LI interakcije mogu indukovati inhibitorni signal u T ćelijama.

[0013] Ligacija PD-L1 na CD4 T čelijama pomoću B7.1 ili ligacija B7.1 na CD4 T ćelijama pomoču PD-LI daje inhibitorni signal. T ćelije kojima nedostaju CD28 i CTLA-4 pokazuju smanjenu proliferaciju i proizvodnju citokina kada se stimulišu zrnima obloženim sa anti-CD3 i B7.1. U T ćelijama kojima nedostaju svi receptori za B7.1 (tj. CD28, CTLA-4 i PD-L1), proliferacija T-ćelija i proizvodnja citokina više nisu inhibirane zrnima obloženim sa anti-CD3 i B7.1. To ukazuje na to da B7.1 deluje specifično preko PD-L1 na T-ćeliju u odsustvu CD28 i CTLA-4. Slično tome, T ćelije kojima nedostaje PD-1 pokazale su smanjenu proliferaciju i proizvodnju citokina kada su stimulisane u prisustvu zrna obloženih sa anti-CD3 plus PD-L1, demonstrirajući inhibitorni efekat ligacije PD-Ll na B7.1 na T ćelije. Kada T ćelijama nedostaju svi poznati receptori za PD-L1 (tj. ne- PD-1 i B7.1), proliferacija T ćelija više nije narušena zrncima obloženim sa anti-CD3 plus PD-LI. Tako, PD-Ll može da vrši inhibitorni efekat na T ćelije bilo kroz B7.1 ili PD-1.

[0014] Direktna interakcija između B7.1 i PD-L1 sugeriše da trenutno razumevanje kostimulacije je nepotpuno i podvlači značaj ekspresije ovih molekula na T ćeiijama. Ispitivanja PD-L1<-/->T ćelija pokazuju da PD-L1 na T ćelijama može smanjiti proizvodnju citokina T ćelija. Latchman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004). Budući da su i PD-L1 i B7.1 eksprimirani na T ćelijama, B čelijama, DCs i makrofagima, postoji potencijal za usmerene interakcije između B7.1 i PD-L1 na ovim tipovima ćelija. Pored toga, PD-LI na ne-hematopoetskim ćelijama može da interaguje sa B7.1 kao i PD-1 na T ćelijama, postavljajući pitanje da li je PD-L1 uključen u njihovu regulaciju. Jedno od mogućih objašnjenja za inhibitomi efekat B7.1: Interakcija PD-L1 je da T-ćelija PD-L1 može zarobiti ili odvojiti APC B7.1 od interakcije sa CD28.

[0015] Kao rezultat, antagonizam signalizacije preko PD-L1, uključujući blokiranje PD-L1 od interakcije bilo sa PD-1, B7.1 ili sa oba, sprečavajući tako PD-Ll da pošalje negativan kostimulativni signal na T -ćelije i druge antigen -prezentujuće ćelije verovatno će poboljšati imunitet kao odgovor na infekciju (npr. akutnu i hroničnu) i tumorski imunitet. Pored toga, antitela na PD-L1 predmetnog pronalaska mogu se kombinovati sa antagonistima drugih komponenti signalizacije PD-1: PD-L1, na primer, antagonistima antitela na PD-1 i na PD-L2.

[0016] Konkretno, predložena je inhibicija PD-L1 signalizacije kao sredstvo za poboljšanje imuniteta T ćelija za lečenje karcinoma (npr. Imunost tumora) i infekcije, uključujući akutnu i hroničnu (npr. trajnu) infekciju.

[0017] Inhibitori koji blokiraju interakciju PD-L1: PD-1 poznati su, između ostalog, iz WO2001014557, WO2002086083, EP1537878A1 (WO2004004771), WO2007005874, WO2010036959, WO2010077634 i WO2011066389. Nomi Takeo et al„ Clin. Cancer Res. 13(7) (2007), 2151-57, opisuje lečenje raka pankreasa kombinacijom antitela na PD-L1 i gemcitabina. Međutim, kako optimalni terapeut usmeren ka cilju na ovom putu tek treba da se komercijalizuje, postoji značajna neispunjena medicinska potreba.

Opis pronalaska

[0018] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi antitela na PD-L1, uključujući nukleinske kiseline koje kodiraju i kompozicije koji sadrže takva antitela, i njihovu upotrebu za poboljšanje funkcije T-ćelija za jačanje imunoloških odgovora posredovanih ćelijama i za lečenje disfunkcionalnih poremećaja T ćelija, kao što je imunitettumora. Neočekivano je otkriveno da antitela na PD-L1 prema predmetnom pronalasku, koja imaju aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), direktno deluju na tumorske ćelije koje nose PD-L1 indukujući njihovu lizu bez pokazivanja značajne toksičnosti. Štaviše, antitela ne blokiraju samo interakciju između humanog PD-L1 i humanog PD-1, već i interakcije između odnosnih proteina miša i cinomolgus majmuna.

[0019] U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo na PD-L1 ili antigen vezujući fragment koji sadrži teški lanac i sekvencu variajbilnog regiona lakog lanca, pri čemu:

(a) teški lanac obuhvata HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde dalje: (i) sekvenca HVR-H1 je SYIMM (SEQ IDNO: 15); (ii)sekvenca HVR-H2 je SIYPSGGITFYADTVKG (SEQ IDNO: 16); (iii) sekvenca HVR-H3 je IKLGTVTTVDY, i (SEQ ID NO: 17);

(b) laki lanac obuhvata HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, gde dalje: (iv) sekvenca HVR-Ll je TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 18); (v) sekvenca HVR-L2 je DVSNRPS (SEQ ID NO: 19); (vi) sekvenca HVR-L3 je SSYTSSSTRV (SEQ 1D NO: 20);

[0020] Varijabilni region teškog lanca sadrži jedan ili više okvira sekvenci koji su postavljene jedna uz drugu između HVRs-a kao: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR- НЗ)- (HC-FR4), a promenljivi regioni lakog lanca sadrže jedan ili više okvirnih sekvenci postavljenih jedan uz drugi između HVRs-a kao: (LC-FR1) - (HVR-L1) - (LC-FR2) - (HVR-L2) - (LC-FR3) - (HVR-L3) -(LC-FR4).

U daljem aspektu, okvirne sekvence su izvedene iz okvirnih konsenzus sekvenci čoveka ili humanih germitivnih ćelija.

U specifičnijem aspektu, polipeptid variajbilnog regiona teškog lanca, antitelo ili fragment antitela dalje sadrži Сн1, Сн2 i Сн3 domen.

[0025] U još jednom aspektu, varijabilni region lakog lanca, antitelo ili fragment antitela dalje sadrži C<L>domen.

[0026] U narednom aspektu, antitelo dalje sadrži Сн1, Сн2, Сн3 i CLdomen.

[0027] U sledećem specifičnom aspektu, antitelo dalje obuhvata humani ili mišji konstantni region.

[0028] U još jednom aspektu, humani konstantni region je izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4.

U narednom specifičnom aspektu, humani ili mišji konstantni region je IgG1.

[0029] Antitelo se vezuje za PD-L1 čoveka, miša ili cinomolgus majmuna. U specifičnom aspektu, antitelo je sposobno da blokira interakciju između PD-L1 čoveka, miša ili majmuna cinomolgus i odgovarajućih receptora PD-1 čoveka, miša ili cinomolgus majmuna.

[0030] U još jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže bilo koje od gore opisanih antitela na PD-L1 u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0031] U sledećoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid, ili laki lanac ili sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela na PD-L1, ili njen fragment za vezivanje antigena, kako je ovde opisano.

[0032] U daljem aspektu, nukleinska kiselina je SEQ ID NO:30 za teški lanac, i SEQ 1D NO:31 za laki lanac.

[0033] U drugom aspektu, nukleinska kiselina dalje sadrži vektor pogodan za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od prethodno opisanih antitela na PD-L1.

[0034] U još jednom specifičnom aspektu, vektor dalje sadrži ćeliju domaćina pogodnu za ekspresiju nukleinske kiseline.

[0035] U sledećem specifičnom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska ćelija ili prokariotska ćelija.

[0036] U narednom specifičnom aspektu, eukariotska ćelija je ćelija sisara, kao što je jajnik kineskog hrčka (CHO).

[0037] U sledećoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja antitela na PD-L1 ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od prethodno opisanih antitela na PD-LI ili antigen vezujući fragment u obliku pogodnom za ekspresiju, pod uslovima pogodnim za proizvodnju takvog antitela ili fragmenta i za regeneraciju antitela ili fragmenta. U još jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje komplet delova koji sadrži posudu koja sadrži terapeutski efikasnu količinu ovde opisane kompozicije i uložak paketa namenjeno na upotrebu za lečenje disfunkcionalnog poremećaja T-ćelija.

[0038] U sledećoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje komplet delova koji sadrži bilo koju od gore opisanih anti-PD-LI kompozicija u kombinaciji sa najmanje jednim daljim terapeutskim sredstvom, kao što je hemoterapeutsko sredstvo.

[0039] U jednom aspektu, najmanje jedno hemoterapeutsko sredstvo je gemcitabin, ciklofosfamid, fluorouracil ili oksaliplatin.

[0040] U još jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje efikasnu količinu gore opisanih antitela na PD-L1 ili kompozicije za upotrebu u poboljšanju funkcije T-ćelija

[0041] U jednom aspektu, antitelo na PD-L1 ili kompozicija čine disfunkcionalne T-ćelije, nefunkcionalnim.

[0042] Prema otkriću, antitela ili kompozicije koje sprečavaju simptome uporne infekcije, kao što je virusna infekcija, npr. virusom humane imunodeficijencije (HIV), herpes virusom, Eppstein-Barr virusom ili humanim papiloma virusom.

[0043] U još jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje bilo koje od gore opisanih antitela na PD-Ll ili kompozicije za upotrebu u lečenju disfunkcionalnog poremećaja T-ćelija.

[0044] U jednom specifičnom aspektu, disfunkcionalni poremećaj T-ćelija je imunitet tumora.

|0045[ U narednom aspektu, PD-L1 antitelo ili kompozicija kombinuju se sa režimom lečenja koji dalje uključuje tradicionalnu terapiju odabranu iz grupe koju čine: hirurgija, terapija zračenjem, hemoterapija, ciljana terapija, imunoterapija, hormonska terapija, angiogeneza inhibicija i palijativno zbrinjavanje.

[0046[ U još jednom specifičnom aspektu, imunost tumora nastaje od karcinoma odabranog iz grupe koju čine: rak dojke, pluća, debelog creva, jajnika, melanoma, bešike, bubrega, jetre, pljuvačnih žlezdi, stomaka, gliom , rak štitne želzde, timusa, karcinom epitela, glave i vrata, rak želuca i pankreasa.

[0047] S1edeći aspekt pronalaska odnosi se na upotrebu antitela na PD-LI ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antigena (ADCC) ili kompozicije u lečenju karcinoma.

Prema tome, pronalazak se odnosi na efikasnu količinu antitela na PD-L1 koja indukuje antitelom zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) za upotrebu u lečenju karcinoma.

[0048] U poželjnoj realizaciji, konstantni region antitela protiv PD-L1 je 1gG1.

[0049] U još jednoj poželjnoj realizaciji karcinom je izabran iz grupe koju čine: rak dojke, pluća, debelog creva,jajnika, melanoma, bešike, bubrega,jetre, pljuvačnih žlezda, stomaka, gliomi, karcinomi štitaste žlezde, timusa, epitelijalni, glave i vrata, rak želuca i pankreasa.

[0050] Ekvivalentno prethodno pomenutoj upotrebi za poboljšanje funkcije T-ćelija, lečenje disfunkcionalnog poremećaja T-ćelija ili lečenje karcinoma, pronalazak se takođe odnosi na upotrebu antitela na PD-L1 ili kompozicije kako je opisano prethodno i u daljem tekstu za proizvodnju leka za poboljšanje funkcije T-ćelija, lečenje disfunkcionalnog poremećajaT-ćelija ili lečenje karcinoma, ili za antitelo na PD-L1 ili kompoziciju za upotrebu u poboljšanju funkcije T-ćelija, ili lečenje disfunkcionalnog poremećaja T-ćelija ili rak.

Definicije

[0051] "Disfunkcija" u kontekstu imunske disfunkcije odnosi se na stanje imunološki smanjene reakcije na antigenu stimulaciju. Termin uključuje uobičajene elemente iscrpljenosti i / ili anergiju u kojima može doći do prepoznavanja antigena, ali imunski odgovor koji sledi nije efikasan u kontroli infekcije ili rasta tumora.

[0052] „Poboljšanje funkcije T-ćelija" znači indukovanje, uzrokovanje ili stimulisanje T-ćelije da ima održivu ili pojačanu biološku funkciju, ili obnavljanje ili reaktivaciju iscrpljenih ili neaktivnih T-ćelija. Primeri poboljšanja funkcije T-ćelija uključuju: povećanu sekreciju γ -interferona iz CD8 " T-čelija, povećanu proliferaciju, povećanu reakciju na antigen (npr. klirens virusa ili patogena) u odnosu na takve nivoe pre intervencije. U jednom aspektu, nivo poboljšanja je najmanje 50%, alternativno 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Način merenja ovog poboljšanja poznat je prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0053] "Disfunkcionalni poremećaj T ćelija" je poremećaj ili stanje T ćelija koje se karakterišu smanjenom reakcijom na antigenu stimulaciju. U posebnoj realizaciji, disfunkcionalni poremećaj T-ćelija je poremećaj koji je specifično povezan sa neodgovarajućom pojačanom signalizacijom kroz PD-1. U narednoj realizaciji, T-ćelijski disfunkcionalni poremećaj je onaj kod kojeg su T-ćelije anergične ili imaju smanjenu sposobnost sekrecije citokina, proliferacije ili izvršavanja citolitičke aktivnosti. U specifičnom aspektu, smanjena reakcija rezultira neefikasnom kontrolom patogena ili tumora koji eksprimira imunogen. Primeri disfunkcionalnih poremećaja T ćelija koje karakteriše disfunkcija T ćelija uključuju nerešenu akutnu infekciju, hroničnu infekciju i tumorski imunitet.

[0054] "Tumorski imunitet" se odnosi na postupak u kojem tumori izbegavaju imunološko prepoznavanje i klirens. Dakle, kao terapijski koncept, tumorski imunitet se ,.leči“ kada se ublaži takvo izbegavanje, a imuni sistem prepozna i napadne tumore. Primeri prepoznavanja tumora uključuju vezivanje tumora, skupljanje tumora i klirens (uklanjanje) tumora.

[0055] Termin "antitelo" uključuje monoklonska antitela (uključujući antitela pune dužine koja imaju Fc region imunoglobulina), kompozicije antitela sa poliepitopskom specifičnošću, multispecifična antitela {npr. bispecifična antitela, antitela i jednolančane molekule, kao i fragmente antitela (npr., Fab, F (ab ')2, i Fv). Termin "imunoglobulin" (1g) ovde se koristi naizmenično sa terminom "antitelo". Osnovna jedinica antitela sa 4 lanca je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. 1gM antitelo se sastoji od 5 osnovnih heterotetramernih jedinica, zajedno sa dodatnim polipeptidom koji se naziva J lanac, i sadrži 10 mesta za vezivanje antigena, dok se antitela IgA sastoje od 2-5 osnovnih 4-lančanih jedinica koje mogu da se polimerizuju da bi stvorile polivalentne skupove u kombinaciji sa J lancem, U slučaju IgGs, 4-lančana jedinica je obično veličine oko 150 000 daltona. Svaki L lanac je povezan sa H lancetn jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno raspoređene intralančane disulfidne mostove. Svaki lanac H ima na N-kraju varijabilni domen (VH) praćen sa tri konstantna domena (Сн) za svaki od α i γ lanaca i četiri Сн domena za p i e izotipove. Svaki L lanac ima na N-kraju promenljivi domen (V<L>) praćen konstantnim domenom na svom drugom kraju. V<L>je poravnat sa VH, a CLje poravnan sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (Сн1). Pretpostavlja se da određeni

1

aminokiseiinski ostaci čine interfejs između promenljivih domena lakog lanca i teškog lanca. Uparivanje VHi V<L>zajedno čini jedno mesto za vezivanje antigena. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, videti npr. Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, str. 71 i poglavlje 6. Lanac L bilo koje vrste kičmenjaka može da se dodeli jednom od dva jasno različita tipa, nazvanim kapa i lambda, na osnovu sekvenci aminokiselina njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca (CH), imunoglobulini se mogu dodeliti različitim klasama ili izotipovima. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, lgE, IgG i IgM, koji imaju teške lance označene kao α, δ, ε, γ i μ, respektivno. Klase γ i α su dalje podeljene u podklase na osnovu relativno malih razlika u sekvenci i funkciji CH, npr. Ljudi eksprimuju sledeće podklase: IgG1, IgG2A, lgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 i IgK1.

[0056] Izolovano“ antitelo je ono koje je identifikovano, odvojeno i / ili regenerisano iz komponente njegovog proizvodnog okruženja (npr. prirodno ili rekombinantno). Poželjno je da izolovani polipeptid nije povezan sa svim ostalim komponentama iz svog proizvodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente njegovog proizvodnog okruženja, poput onih koje nastaju iz rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji bi tipično ometali istraživanje, dijagnostiku ili terapeutsku upotrebu antitela i mogu sadržati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvome komponente. U poželjnim realizacijama, polipeptid će biti prečišćen: (1) na više od 95 težinskih % antitela kako je određeno, na primer, Lowry metodom, a u nekim realizacijama, na više od 99 težinskih %; (1) do stepena dovoljnog za dobijanje najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence upotrebom spinning cup sekvenatora, ili (3) do homogenosti sa SDS-PAGE pod uslovima koji ne smanjuju ili redukuju korišćenjem Coomassie plavog ili, poželjno, bojenje srebrom. Izolovano antitelo obuhvata antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija, jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Međutim, obično se izolovani polipeptid ili antitelo pripremaju u najmanje jednom koraku prečišćavanja.

[0057] „Varijabilni region“ ili „promenljivi domen“ antitela odnosi se na amino-terminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca mogu se označavati kao "VH", odnosno "VL". Ovi domeni su generalno najvarijabilniji delovi antitela (u odnosu na druga antitela iste klase) i sadrže mesta za vezivanje antigena.

[0058] Izraz "promenljiva" odnosi se na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena bitno razlikuju u sekvenci među antitelima. Domen V posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena na čitav raspon varijabilnih domena. Umesto toga, koncentrisan je u tri segmenta koja se nazivaju hipervarijabilnim regionima (HVRs), i to u varijabilnim domenima i lakog i teškog lanca. Veoma konzervirani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR). Varijabilni domeni nativnih teških i lakih lanaca sastoje se od četiri FR regiona, uglavnom usvajajući konfiguraciju beta-ravni, povezanih sa tri HVRs-a, koji čine petlje koje povezuju i, u nekim slučajevima, čine deo strukture betaravni. U svakom lancu FR regioni se u neposrednoj blizini drže zajedno sa HVRs i, zajedno sa HVRs iz drugog lanca, doprinose stvaranju mesta vezivanja antigena za antitela (videti Kabat et al, Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela.

[0059] Termin "monoklonalno antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i / ili post - translacionih modifikacija (npr. izomerizacija, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monokloalna antitela su visoko specifična i usmerena su prema jednom antigenom mestu. Za razliku od preparata sa poliklonalna antitela koja obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Pored svoje specifičnosti, monoklonalna antitela imaju prednost u tome što se sintetišu u kulturi hibridoma, nekontaminirana drugim imunoglobulinima. Modifikator "monoklonalni" ukazuje na karakter antitela koji je dobijen iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, na primer, metodu hibridoma (npr., Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlovv et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)), metode rekombinantne DNK (videti, npr., U.S. Patent No.4,816,567), tehnologije prikazivanja na fagima (videti, npr., Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al, J. Mol Biol.

338(2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. ScL USA 101(34): 12467-12472 (2004); and Lee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), i tehnologije za proizvodnju humanih antitela ili antitela sličnih humanim antitelima kod životinja koje imaju delove ili sve lokuse humanog imunoglobulina ili gene koji kodiraju sekvence humanog imunoglobulina (videti, npr., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813(1994); Fishvvild et al, Nature Biotechnol 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intem. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

[0060] "Fragment antitela" sadrži deo intaktnog antitela, poželjno antigen vezujući i / ili varijabilne regione intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab ', F(ab')2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (videti U.S. patent 5,641,870, primer2; Zapata et al, Protein Eng. 8HO): 1057-1062 [1995]); molekule jednolančanih antitela i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

Digestija antitela papainom proizvela je dva identična antigen-vezujuća fragmenta, nazvana ,,Fab“ fragmenti, i rezidualni ,,Fc“ fragment, oznaka koja odražava sposobnost da lako kristališe. Fab fragment se sastoji od celokupnog L lanca zajedno sa domenom varijabilnog regiona H lanca (VH) i prvog konstantnog domena jednog teškog lanca (СH1). Svaki Fab fragment je monovalentan po pitanju vezivanja antigena, tj. ima jedno mesto vezivanja antigena.

[0061] Tretiranje antitela pepsinom daje jedan veliki F(ab')2fragment koji grubo odgovara dvama disulfidno vezanim Fab fragmentima koja imaju različitu antigen - vezujuću aktivnost i još uvek je sposoban da umreži antigen. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju nekoliko dodatnih ostataka na karboksi kraju Сн1 domena, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab '-SH je ovde oznaka za Fab' u kojem ostaci cisteina u konstantnim domenima nose slobodnu tiol grupu. Fragmenti antitela F(ab')2prvobitno su proizvedeni kao parovi fragmenata Fab' koji između sebe imaju zglobne cisteine. Takođe su poznata i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela. Fc fragment sadrži karboksi-terminalne delove oba H lanca koji su zajedno držani disulfidima. Efektorske funkcije antitela određene su sekvencama u Fc regionu, regionu koji prepoznaju i Fc receptori (FcR) pronađeni na određenim tipovima ćelija.

[0062] " Fv" je najmanji fragment antitela koji sadrži mesto za prepoznavanje i vezivanje celog antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera jednog domena varijabilnog regiona teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. Iz preklapanja ovih dva domena proizilazi šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz svakog od H i L lanca) koje doprinose aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i daju specifičnost antitelu za vezivane antigena. Međutim, čak i jedan promenljivi domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri HVRs specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže antigen, mada sa nižim afiniitetom od celog mesta vezivanja. „Jednolančani Fv“, takođe skraćeno ,,sFv“ ili ,,scFv“, su fragmenti antitela koji sadrže VHi VLdomene antitela povezane u jedan polipeptidni lanac. Poželjno, sFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VHi VLdomena koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled sFv, videti Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). "Funkcionalni fragmenti" antitela prema pronalasku sadrže deo intaktnog antitela, generalno uključujući antigen vezujući ili promenljivi region intaktnog antitela ili Fc region antitela koji zadržava ili ima modifikovanu sposobnost vezivanja FcR. Primeri fragmenata antitela uključuju linearna antitela, molekule jednolančanih antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0063] Termin "antitela" odnosi se na male fragmente antitela dobijene konstruisanjem fragmenata sFv (vidi prethodni pasus) sa kratkim linkerima (oko 5-10) ostataka) između VHi VLdomena, koji su međulančani, ali ne i intralančani, pri čemu se postiže sparivanje V domena, što rezultira bivalentnim fragmentom, tj. fragmentom koji ima dva mesta za vezivanje antigena. Bispecifična antitela su heterodimeri dva ,,ukrštena“ sFv fragmenta u kojima su VHi VLdomeni dva antitela prisutni na

1

različitim polipeptidnim lancima. Dijetela su detaljnije opisana, na primer, u EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 6444-6448 (1993).

[0064] Izraz "nanotela" odnosi se na antitela sa jednim domenom koja su fragmenti antitela koji se sastoje od jednog monomernog varijabilnog domena antitela. Poput celog antitela, oni su u stanju da se selektivno vežu za specifični antigen. Sa molekulakom težinom od samo 12-15 kDa, antitela sa jednim domenom su mnogo manja od uobičajenih antitela (150-160 kDa). Prva antitela sa jednim domenom napravljena su od antitela teškog lanca pronađena u kamilama. Gibbs, W. Wayt (August 2005). "Nanobodies". Scientific American Magazine.

[0065] Monoklonska antitela ovde posebno uključuju ,,himerna“ antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i / ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od određene vrste ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološka aktivnost (U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851-6855 (1984)). Kao što je ovde korišćen, „humanizovano antitelo“ se koristi podskup „himernih antitela“.

[0066] ”Humanizovani ” oblici ne-humanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. U jednoj realizaciji, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primalac) u kome ostaci HVR (definisani u daljem tekstu) primaoca zamenjuju se ostacima od HVR ne-humane vrste (antitelo davalac/donor) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primati koji imaju željenu specifičnost, afinitet i / ili kapacitet. U nekim slučajevima, okvirni ("FR") ostaci humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim nehumanim ostacima. Dalje, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji nisu pronađeni u antitelu primaocu ili u antitelu donoru. Ove modifikacije mogu da se sprovedu radi daljeg usavršavanja učinka antitela, kao što je afinitet vezivanja. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u osnovi sve od barem jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojima su sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima sa ne-humanom sekvencom imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR regioni imaju sekvence humanog imunoglobulina, iako FR regioni mogu da sadrže jednu ili više pojedinačnih supstitucija FR ostataka koje poboljšavaju performanse antitela, kao što je npr. afinitet vezivanja, izomerizacija, imunogenost, itd. Broj ovih supstitucija aminokiselina u FR obično nije veći od 6 u H lancu, a u L lancu nije veći od 3. Humanizovano antitelo opciono će takođe da sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humani imunoglobulin. Za dalje detalje videti, npr., Jones et al, Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Takodje videti, npr., Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-i 15 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech.

5:428-433 (1994); and U.S. Pat. Nos.6,982,321 and 7,087,409.

[0067] ”Humano antitelo" je antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koje je proizveo čovek i / ili je napravljeno korišćenjem bilo koje tehnike za stvaranje humanih antitela kako je ovde otkriveno. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane antigen-vezujuće ostatke. Humana antitela se mogu proizvesti upotrebom različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke za prikazivanje na fagima. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581 (1991). Za pripremu humanih monoklonskih antitela takođe su dostupne metode opisane u Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al, J. Immunol, 147(I):86-95 (1991). Videti takođe van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001). Humana antitela mogu da se pripreme davanjem antigena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigeni izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr. imunizovani transgeni miša (videti npr. US patent br. 6,075,181 i 6,150,584 u vezi sa tehnologijom XENOMOUSE™ ).Videti takođe, na primer Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) u vezi sa ljudskim antitelima generisanim tehnologijom humanog B-ćelijskog hibridoma.

[0068| Tennin "hipervarijabilni region", "HVR" ili "HV", kada se ovde koristi, odnosi se na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i / ili čine strukturno definisane petlje. Generalno, antitela sadrže šest HVRs; tri u VH (H1, H2, НЗ) i tri u VL (L1, L2. L3). U nativnim antitelima, НЗ i L3 pokazuju najveći diverzitet od šest HVRs-a, a posebno se veruje da НЗ igra jedinstvenu ulogu u dodeljivanju fine specifičnosti antitelima. Videti, npr., Xu et al, Immunity 13:37- 45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed„ Human Press, Totowa, NJ, 2003). Zaista, prirodna antitela kamila koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca, Videti, npr., Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al. Nature Struct. Biol.3:733-736 (1996).

Izvestan broj delineacija HVR se koristi i ovde je obuhvaćeno.

Regioni za utvrđivanje komplementarnosti hipervarijabilnih sekvenci sistemom klasifikacije prema Kabatu (CDRs) zasnivaju se na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat et al„ Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothiase umesto toga odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). AbM HVRs predstavljaju kompromis između Kabat HVRs i Chothia strukturnih petlji, a koristi ih Oxford Molecular's softver za modeliranje AbM antitela.

[0069] "Kontaktni" HVRs-ovi su bazirani na analizi raspoloživih složenih kristalnih struktura. Ostaci svakog od ovih HVR su navedeni u nastavku.

1

[0070] HVRs mogu da obuhvate „prošireni HVRs“ kako sledi: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL i 26-35 ( H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (НЗ) u VH. Ostaci varijabilnog domena numerisani su prema Kabat et al., supra, za svaku od ovih definicija.

[0071| Izraz "numerisanje ostataka varijabilnog domena prema Kabatu" ili "numerisanje položaja aminokiselina prema Kabatu" i njihove varijacije, odnosi se na sistem klasifikacije koji se koristi za promenljive domene teškog lanca ili promenljive domene lakog lanca kompilacije antitela u Kabat et al., supra. Koristeći ovaj sistem klasifikacije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može da sadrži manji broj ili dodatne aminokiseline što odgovara skraćivanju ili umetanju (inserciji) u FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može sadržati jedan aminokiselinski insert (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 H2 i umetnuti ostaci (npr. ostaci 82a, 82b i 82c, itd. Prema Kabatu) posle teškog -lančani FR ostatka 82. Kabat klasifikacija ostataka može da se odredi za dato antitelo poravnavanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" Kabat numerisanom sekvencom.

[0072] "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu HVR ostaci kako je ovde definisano. „Okvir humanog konsenzusa“ ili „ okvir humanog akceptora" je okvir koji predstavlja aminokiselinske ostatke koji se najčešće javljaju u odabranim sekvencama VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor sekvenci humanog imunoglobulina VL ili VH je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al„ Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Primeri uključuju VL, podgrupa može biti podgrupa kapa I, kapa II, kapa III ili kapa IV kao u Kabat et al, supra. Pored toga, za VH, podgrupa može biti podgrupa I, podgrupa II ili podgrupa III kao u Kabat et al„ supra. Alternativno, okvirni humani konsenzus može se izvesti iz gore navedenog u kojem se određeni ostaci, kao na primer kada se okvir humanog ostatka bira na osnovu njegove homologije sa okvirom donora, poravnavaju sekvencu okvira donora sa kolekcijom različitih sekvenci humanog okvira. Okvir humanog akceptora „izveden od/iz" okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu ili može da sadrži prethodno postojeće izmene aminokiselinske sekvence. U nekim realizacijama, broj postojećih promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje ili 2 ili manje .

1

[0073] "Modifikacija aminokiseline" na određenom položaju, npr. Fc regiona, odnosi se na supstituciju ili deleciju navedenog ostatka ili inserciju najmanje jednog aminokiselinskog ostatka koji se nalazi pored navedenog ostatka. Insercija ,,susedno“ određenom ostatku znači umetanje unutar jednog do dva njegova ostatka. Insercija može da bude N-terminalna ili C-terminalna za navedeni ostatak. Poželjna modifikacija aminokiselina ovde je supstitucija.

[0074] "Afinitetno sazrelo" antitelo je ono sa jednom ili više promena u jednom ili više njegovih HVRs, koje rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa roditeljskim antitelom koje nema te promene. U jednoj realizaciji, afinitetno sazrelo antitelo ima nanomolarni ili čak pikomolarni afinitet za ciljni antigen. Afinitetno sazrela antitela se proizvode postupcima poznatim u struci. Na primer, Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje sazrevanje afiniteta mešanjem VH- i VL-domena. Nasumičnu mutagenezu HVR i / ili ostataka okvira opisuju, na primer: Barbas et al. Proc Nat. Acad. ScL USA 91 :3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); YαXon et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310- 9 (1995); i Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).

[0075] Kako se ovde koristi, termin "specifično se vezuje za" ili je "specifičan za" odnosi se na merljive i ponovljive interakcije kao što je vezivanje između cilja (targeta) i antitela, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula uključujući biološke molekule. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za cilj (koji može biti epitop) je antitelo koje se veže za ovaj cilj sa većim afinitetom, avidnošću, lakše i / ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge ciljeve. U jednoj realizaciji, obim vezivanja antitela za nepovezani cilj je manji od oko 10% vezivanja antitela za cilj, mereno, npr., radioimunološkim testom (RIA). U određenim realizacijama, antitelo koje se specifično vezuje za cilj imakonstantu disocijacije (KD) od < 1х10<-6>М, < 1х10<-7>М,< 1х10<-8>М,< 1x10<-9>M ili < 1х10<-10>М. U određenim realizacijama, antitelo se specifično vezuje za epitop na proteinu koji je konzerviran među proteinima različitih vrsta. U još jednoj realizaciji, specifično vezivanje može da uključuje, ali ne zahteva isključivo vezivanje.

[0076] „Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela“ ili ADCC odnosi se na oblik citotoksičnosti u kome sekretovani Ig vezan za Fc receptore (FcRs) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ove citotoksične efektorske ćelije da se specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i potom ciljnu ćeliju ubiju citotoksinima. Antitela ,,naoružavaju“ citotoksične ćelije i potrebna su za ubijanje ciljne ćelije ovim mehanizmom. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Ekspresija Fc na hematopoetskim ćelijama sumirana je u Tabeli 3 na strani 464 u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Da bi se procenila ADCC aktivnost molekula od interesa, može se izvršiti in vitro ADCC test, kao što je opisan u U.S. patentima br.

5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove obuhvataju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i prirodne ćelije ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., na životinjskom modelu kakav je otkriven u Clynes

1

et al, PNAS USA 95:652-656 (1998). Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija ostataka u teškom lancu imunoglobulina je EU indeks kao u Kabat et al. supra. ,,EU indeks kao u Kabatu" odnosi se na numerisanje ostataka humanog IgG1 EU antitela. U brojnim karcinomima tumorske ćelije eksprimiraju visok nivo PD-L1 na svojoj površini. Nakon vezivanja za PD-L1 na ćelijama tumora i vezivanja njihovog fragmenta kristalnog (Fc) dela za Fc-gama receptore (FCGR) na leukocitima, antitela na PD-L1 sa ADCC potencijalom mogu pokrenuti ADCC što može dovesti do smrti ovih ćelija tumora.

[0077] Termin ,,Fc region" ovde se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc regione nativne sekvence i varijantne Fc regiona. lako se granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu razlikovati, Fc region teškog lanca humanog IgG obično se definiše tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226 i!i od Pro230 do njegovog karboksilnog kraja. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU sistemu numerisanja) iz Fc regiona može da se ukloni, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Shodno tome, sastav intaktnih antitela može da sadrži populacije antitela sa svim uklonjenim ostacima K447, populacije antitela bez uklonjenih ostataka K447 i populacije antitela koja imaju smešu antitela sa i bez ostatka K447. Odgovarajući Fc regioni nativne sekvence za upotrebu u antitelima prema pronalasku uključuju humane lgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 i IgG4. "Fc receptor" ili "FcR" opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je nativna sekvenca humanog FcR. Naime, poželjni FcR je onaj koji veže IgG antitelo (gama receptor) i obuhvata receptore podklasa FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike ovih receptora, a FcγRII receptori uključuju FcγRlIA („aktivirajući receptor‟) i FcγRIIB (" inhibirajući receptor "), koji imaju slične sekvence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju po svojim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcγRIIA sadrži motiv aktivacije baziran na imunoreceptoru tirozin (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibirajući receptor FcγRIIB sadrži motiv inhibicije baziran na tirozinu imunoreceptora (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu, (videti M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). FcRs su pregledani u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al, J. Lab. Clin. Med.126: 330-41 (1995). Ostali FcRs, uključujući one koji će biti identifikovani u budućnosti, ovde su obuhvaćeni terminom ,,FcR“.

[0078] Termin ,,Fc receptor" ili "FcR" takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran zaprenos IgGs majke na fetus. Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994). Poznate su metode merenja vezivanja za FcRn (videti, npr., Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al, Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al, J. Biol. Chem. TJI (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al). Vezivanje za FcRn in vivo i serumski poluživot humanog FcRn polipeptida visokog afiniteta vezanja mogu se analizirati, npr., na transgenim miševima ili transfektovanim humanim ćelijskim linijama koje eksprimiraju humani FcRn, ili na primatima kojima se daju polipeptidi koji imaju varijantu Fc regiona. WO 2004/42072 (Presta)

1

opisuje varijantu antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezanjem za FcRs. Takođe videti, npr„ Shields et al, J. Biol. Chem.9 (2): 6591-6604 (2001).

[0079] „Efektorske ćelije" su leukociti koji eksprimiraju jedan ili više FcRs i vrše efektorske funkcije. U jednom aspektu, efektorske ćelije eksprimiraju najmanje FcγRIII i izvršavaju ADCC efektorsku funkciju. Primeri ljudskih leukocita koji posreduju u ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), prirodne ćelije ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile. Efektorske ćelije mogu da budu izolovane iz nativnog izvora, npr. iz krvi. Generalno, efektorske ćelije su limfociti povezani sa efektorskom fazom i funkcionišu da proizvode citokine (pomoćne T ćelije), ubijaju ćelije zaražene patogenima (citotoksične T ćelije) ili sekretuju antitela (diferencirane B ćelije).

[0080] „Afinitet vezivanja" se generalno odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera za vezivanje (npr. antigena). Izuzev ako ovde nije drugačije naznačeno. kao što se ovde koristi, "afinitet vezivanja", "vezanje za", "vezivanje na" ili "veže se za" odnosi se na unutrašnji afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1: 1 između članova veznog para (npr. Fab fragment antitela i antigen). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y generalno se može predstaviti konstantom disocijacije (K<D>). Afinitet se može meriti uobičajenim metodama poznatim u tehnici, uključujući one koje su ovde opisane. Antitela sa niskim afinitetom se uglavnom polako vezuju za antigen i imaju tendenciju da se lako disociraju, dok se antitela sa visokim afinitetom uglavnom brže vezuju za antigen i teže da duže ostanu vezana. U tehnici su poznati različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja, od kojih se bilo koji može koristiti u svrhe predmetnog pronalaska. U nastavku su opisane specifične realizacije za merenje afiniteta vezivanja, tj.čvrstoće vezivanja date ilustrativne svrhe i kao primer.

[0081] "K<D>" ili "K<D>vrednost "prema predmetnom pronalasku se u jednoj realizaciji meri radioimunološkom analizaom (RIA) vezivanja antigena, izvedenim sa Fab verzijom antitela i molekula antigena, kao što je opisano u sledećem testu koji meri afinitet vezivanja Fabs za antigen u rastvoru, uravnotežujući Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I ) u prisustvu serija titracija neobeleženog antigena, zatim hvatanje vezanog antigena pločicom obloženom anti-Fab antitelom (Chen, et al, (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Da bi se uspostavili uslovi za analizu. mikrotitarske ploče (Dynex) obložene su preko noći sa 5 ug / ml antitela na Fab (Cappel Labs) koje hvata /vezuje ciljni antigen u 50 mM natrijum karbonata (pH 9,6), a zatim blokirane sa 2 % (t / z) goveđeg serumskog albumina u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23 ° C). Na ne-asorbantnoj ploči (Nunc # 269620) pomešano je se 100 pM ili 26 pM [<125>l]-antigena sa serijskim razblaženjima Fab-a od interesa (u skladu sa procenom antitela naVEGF, Fab-I2, u Presta et al, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab od interesa je zatim inkubiran preko noći; međutim, inkubacija može da se nastavi duži period (npr. 65 sati) kako bi se osiguralo postizanje ravnoteže. Posle toga, smeše su prebaćene na ploču za vezivanje radi inkubacije na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Zatim je rastvor uklonjen i pločaje isprana osam puta sa 0,1% Tween-20 u PBS. Kada su ploče osušene, dodato je 150 ul / ležištu scintilanta (Micro Scint- 20; Packard) i ploče su očitane deset minuta na Topcount

1

gama brojaču (Packard). Koncentracije svakog Fab koje daju manje od 20% ili 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za upotrebu u testovima kompetitivnog vezivanja. Prema drugoj realizaciji. K<D>je merena primenom testova površinske plazmonske rezonance korišćenjem BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 instrumenta (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25 ° C sa imobilizovanim antigen CM5 čipovima na - 10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, čipovi biosenzora karboksimetilovanog dekstrana (CM5, BlAcore Inc.) aktivirani su sa N-etil-N'- (3-dimetilaminopropil) -karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N- hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, na 5 μg / ml (-0,2 μM) pre injektiranja brzinom protoka od 5 μL / minutu da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) spregnutog proteina. Nakon injekcije antigena, injektiran je 1 M etanolamin se da bi se blokirale neizreagovane grupe. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) su injektirana u PBS sa 0,05% površinski aktivne supstance TWEEN 20 ™ (PBST) na 25<0>C pri brzini protoka od približno 25 μL / min. Brzina asocijacije (kon) i brzine disocijacije (k0ff) izračunavaju se pomoću jednostavnog pojedinačnog Langmuirovog modela vezivanja (BIAcore® Evaluation Software verzija 3.2), istovremeno uklapajući senzorske dijagrame asocijacije i disocijacije. Konstanta disocijacione ravnoteže (K<D>) izračunata je kao odnos (koff/kon). Videti, npr., Chen et al, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Ako brzina prelazi 10<6>M<-1>s<-1>gornjim testom površinske plazmonske rezonance, tada se brzina može odrediti upotrebom tehnike gašenja fluorescencije koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuda = 295 nm; emisija = 340 nm, propusni opseg od 16 nm) na 25 °C 20 nM antitela na antigen (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena merenih spektrometrom, kao spektrofotometar opremljen opcijom za zaustavljanje protoka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar SLM-AMINCO ™ serije 8000 (ThermoSpectronic) sa kivetom u kojoj je moguće mešanje rastvora.

"Brzina ", "brzina asocijacije" “ brzina povezivanja”ili " konprema predmetnom pronalasku. takođe se mogu odrediti kako je gore opisano korišćenjem sistema BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25<0>C sa imobilisanim antigenom CM5 čipovima na oko 10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilovani dekstran biosenzorski čipovi (CM5, BIAcore Inc.) aktivirani su sa N-etil-N'- (3-dimetilamino-propil) -karbodiimid hidrohloridom (ECD) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) u skladu sa uputstvima dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, ph 4,8, u 5 mg / ml (~ 0.2 mM) pre injektiranja pri brzini protoka od 5 ml / min. da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) spregnutog proteina. Nakon injekcije antigena, dodato je 1M etanolamin da bi se blokirale grupe koje nisu izreagovale.

Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) ubrizgavaju se u PBS sa 0,05% Tween 20 (PBST) na 25 ° C pri brzini protoka od približno 25 ul / min. Brzine asocijacije (ko„) i brzine disocijacije (k0(r) izračunavaju se korišćenjem jednostavnog pojedinačnog Langmuirovog modela vezivanja (BIAcore Evaluation Sofhvare version 3.2), istovremenim fitovanjem senzorskog dijagrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacione (K<D>) izračunata je kao odnos

2

koff/kon. Videti, npr., Chen, Y., et al, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Međutim, ako brzina prelazi 10<6>M<-1>s<-1>gore navedenim testom površinske plazmonske rezonance, tada se brzina poželjno određuje korišćenjem tehnike fluorescentnog gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, propusni opseg 16 nm) na 25 ° C 20 nM antitela na antigen (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena merenih spektrometrom, kao što je spektrofometar opremljen opcijom za zaustavljanje protoka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar SLM-Aminco serije 8000 (Thermo Sp ectronic) sa kivetom u kojoj je moguće mešanje rastvora.

[0082] Termin "funkcionalni epitop", kao što se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinske ostatke antigena koji energetski doprinose vezivanju antitela, tj. formiranju "energetskog epitopa". Mutacija bilo kog ostatka antigena na alanin koji doprinosi energiji poremetiće vezivanje antitela tako da će relativni odnos K<D>(K<D>mutant PD-L1 / K<D>divljeg tipa PD-L1) antitela biti veći od 4 ( videti primer 3.x (b)).

[0083] Tennin "konformacioni epitop", kako se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinske ostatke PD-L1 antigena koji se udružuju na površini kada se polipeptidni lanac preklopi da bi se formirao nativni protein, i pokazuju značajno smanjenu brzinu razmene HD zbog za Fab vezivanja, kako je opisano u eksperimentalnom delu. Konformacijski epitop sadrži, ali nije ograničen na, funkcionalni epitop.

[0084] Izraz "značajno smanjen" ili "suštinski različit", kao što se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen razlike između dve brojne vrednosti (obično jedne povezane sa molekulom i druge povezane sa referentnim / uporednim molekulom), tako da bi prosečan stručnjak smatrao da je razlika između dve vrednosti statistički značajna u kontekstu biološke karakteristike merene datim vrednostima (npr. vrednosti K<D>). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, veća od oko 10%, veća od oko 20%, veća od oko 30%, veća od oko 40% i / ili veća od oko 50% u funkciji vrednosti za referentni / uporedni molekul.

[0085] Termin "suštinski sličan" ili "suštinski isti", kao što se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen sličnosti između dve brojne vrednosti (na primer, jedne povezane sa antitelom pronalaska i druge povezane sa referencom / uporednim antitelom), tako da bi prosečan stručnjak smatrao da je razlika između dve vrednosti mala ili bez biološkog i / ili statističkog značaja u kontekstu biološke karakteristike merene datim vrednostima {npr., vrednosti K<D>). Razlika između pomenute dve vrednosti je, na primer, manja od oko 50%, manja od oko 40%, manja od oko 30%, manja od oko 20% i / ili manja od oko 10% u zavisnosti od referentne / uporedne vrednosti.

[0086] „Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” i homologija" u odnosu na sekvencu peptida, polipeptida ili antitela definisana je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci od interesa koji su identični aminokiselinskim ostacima u određenoj peptidnoj ili polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnanje u svrhe određivanja procenta identiteta sekvence aminokiselinskih sekvenci može se post na raz te na ne o su poznat prose nom stru na u, na prmer, or en em avno dostupnog računarskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2 ili ALIGN softver, Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja u punoj dužini sekvenci koje se porede.

[0087] "Blokirajuće" antitelo ili antitelo "antagonist" je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. U nekim realizacijama, blokirajuće antitelo ili antitelo antagonist suštinski ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena. Antitela na PD-L1 prema pronalasku blokiraju interakciju između PD-L1 i njegovog receptora PD-1, a time i signalizaciju kroz PD-1, tako da obnavljaju funkcionalni odgovor T-ćelija iz nefunkcionalnog stanja na stimulaciju antigenom. „Agonist" ili aktivirajuće antitelo je ono koje pojačava ili pokreće signalizaciju antigenom za koji se vezuje. U nekim realizacijama, antitela agonisti uzrokuju ili aktiviraju signalizaciju bez prisustva prirodnog liganda.

[0088] Termini „unakrsna kompeticija", „unakrsna konkurencija", „unakrsna biokada", „unakrsno blokiran“ i „unakrsno blokiranje “ ovde se koriste naizmenično u značenju sposobnosti antitela ili njegovog fragmenta da ometa uz vezivanje direktno ili indirektno putem alosterne modulacije antitela na PD-LI prema pronalasku za ciljni humani PD-L1. Obim u kojem je antitelo ili njegov fragment u stanju da ometa vezivanje drugog za cilj, pa prema tome da li se može reći da unakrsno blokira ili unakrsno nadmeće prema pronalasku, može da se utvrdi korišćenjem testova kompetitivnog vezivanja. Jedan posebno pogodan kvantitativni test unakrsne kompeticije koristi pristup zasnovan na FACS- ili AlphaScreen za merenje kompeticije između obeleženih (npr. His obeležen (His tag), biotinilovano ili radioaktivno obeleženo) antitela ili njegovog fragmenta, a drugo antitelo ili njegov fragment prema njihovom vezivanju za cilj. U eksperimentalnom delu opisan je odgovarajući test za određivanje da li je molekul koji se vezuje, unakrsno kompetitivan ili je sposoban za unakrsnu kompeticiju sa antiteloni ili njegovim fragmentom. Generalno, unakrsno kompetitivno antitelo ili njegov fragment je na primer ono koje će se vezati za cilj u testu unakrsne kompetencije, tako da je tokom ispitivanja i u prisustvu drugog antitela ili njegovog fragmenta zabeleženo premeštanje pojedinačnog varijabilnog domena ili polipeptid imunolglobulina prema pronalasku do 100% (npr. u FACS testu kompeticije) maksimalnog teorijskog premeštanja (npr. premeštanja hladnim (npr. neobeleženim) antitelom ili njegovim fragmentom koji treba da bude unakrsno blokiran) ispitivanim potencijalno unakrsno- blokirajućim antitelom ili njegovim fragmentom koji je prisutan u datoj količini. Poželjno je da unakrsno - kompetitivna antitela ili njihovi fragmenti imaju zabeleženo premeštanje između 10% i 100%, poželjnije između 50% do 100%.

[0089] " Izolovani" molekul nukleinske kiseline koji kodira ovde navedena antitela je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminantnog molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u okruženju u kojoj je proizveden. Poželjno je da izolovana nukleinska kiselina nije povezana sa svim komponentama povezanim sa proizvodnim okruženjem. lzolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide i antitela ovde su u drugom obliku izuzev u obliku ili okruženju u kojem se nalaze u prirodi. Stoga se izolovani molekuli nukleinske kiseline razlikuju od nukleinske kiseline koja kodira ovde prisutne polipeptide i antitela koja prirodno postoje u ćelijama.

[0090] Termin "kontrolne sekvence" odnosi se na sekvence DNK neophodne za ekspresiju operativno vezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operator sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, signale poliadenilacije i pojačivače. Nukleinska kiselina je „operativno povezana“ kada se postavi u funkcionalan odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za prethodnu sekvencu ili sekretorni lider operativno je povezana sa DNK za polipeptid ako je eksprimovana kao pretprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakša translaciju. Generalno, „operativno povezano“ znači da su povezane DNK sekvence susedne i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u fazi očitavanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa konvencionalnom A "stabilnom" formulacijom u kojoj protein u svojoj osnovi zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost i integritet prilikom skladištenja. Različite analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina su dostupne u tehnici i pregledane su u dokumentu Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed„ Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Stabilnost se može meriti na odabranoj temperaturi za izabrani vremenski period. Za brzi skrining, formulacija se može držati na 40 ° C tokom 2 nedelje do I meseca, kada se meri stabilnost. Tamo gde se formulacija čuva na 2-8 ° C, obično formulacija treba da bude stabilna na 30<0>C ili 40<0>C najmanje 1 mesec i / ili stabilna na 2-8 ° C najmanje 2 godine. Tamo gde se formulacija čuva na 30 ° C, obično formulacija treba da bude stabilna najmanje 2 godine na 30 ° C i / ili stabilna na 40<0>C najmanje 6 meseci. Na primer, obim agregacije tokom skladištenja može se koristiti kao pokazatelj stabilnosti proteina. Tako, "stabilna" formulacija može da bude ona u kojoj je manje od oko 10%, a poželjno manje od oko 5% proteina prisutno kao agregat u formulaciji. U drugim realizacijama, može da se utvrdi bilo kakvo povećanje formiranja agregata tokom skladištenja formulacije.

[0091] " Rekonstituisana" formulacija je ona kojaje pripremljena rastvaranjem liofilizovanog proteina ili antitela formulacije u razblaživaču tako da je protein u potpunosti dispergovan. Rekonstituisana formulacija je pogodna za primenu (npr. subkutana primena) pacijentu koji se leči proteinom od interesa i, u određenim realizacijama pronalaska, može biti ona koja je pogodna za parenteralnu ili intravensku primenu.

[0092]" Izotonična" fonnulacija je ona koja u osnovi ima isti osmotski pritisak kao ljudska krv. lzotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 250 do 350 mOsm. Izraz "hipotonična" opisuje formulaciju sa osmotskim pritiskom nižim od onog za ljudsku krv. Shodno tome,

2

termin ,,hipertonik“ se koristi za opisivanje formulacije sa osmotskim pritiskom iznad pritiska za ljudsku krv. Izotoničnost može da se meri, na primer, pritiskom pare ili osmometrom baziranom na merenjem tačke smrzavanja. Formulacije predmetnog pronalaska su hipertonične kao rezultat dodavanja soli i / ili pufera. "Nosači", kako se ovde koriste, uključuju farmaceutski prihvatljive nosače, pomoćne supstance (ekscipijense) ili stabilizatore koji nisu toksični za ćeliju ili sisare koji su im izloženi u dozama i koncentracijama koje se koriste. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferovan rastvor. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanti, uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptid male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka);polipeptidi, proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatni agensi kao što je EDTA; šećerni alkoholi kao što su manitol ili sorbitol; soli -protiv formiranja kontrajona kao što je natrijum; i / ili neionske površinski aktivne supstance kao što su TWEEN ™, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS ™.

[0093] "Farmaceutski prihvatljiva kiselina" uključuje neorganske i organske kiseline koje nisu toksične u koncentraciji i na način na koji su formulisane. Na primer, pogodne neorganske kiseline uključuju hlorovodoničnu, perhlornu, bromovodoničnu, jodovodoničnu, azotnu, sumpornu, sulfonsku, sumpornu, sulfanilnu, fosfornu, ugljenu, itd. Pogodne organske kiseline uključuju alkil sa ravnim i razgranatim lanacem, aromatične, ciklične, cikloalifatične, arilalifatične, heterociklične, zasićene, nezasićene, mono, di- i trikarboksilne, uključujući, na primer, mravlju, sirćetnu, 2-hidroksisirćetnu, trifluorsirćetnu, fenilacetatnu, trimetilacetatnu, t-butil acetatnu, antranilnsku, propansku, 2- hidroksipropansku, 2-oksopropansku, malonsku, ciklopentanpropionsku, ciklopentan propionsku, 3- fenilpropionsku, buternu, butandionsku, benzoeva, 3- (4-hidroksibenzoil) benzoevu, 2-acetoksi- benzoevu, askorbinsku, cinaminsku, lauril sumpornu, stearinsku, mukonsku, bademovu, ćilibarnu, pamoinsku, fumarnu, jabučnu , maleinsku, hidroksimaleinsku, malonsku, mlečnu, limunsku, vinsku, glikolnu, glikonsku, glukonsku, piruvinsku, glioksalnu, oksalnu, mezilatnu, sukcinsku, salicilnu, fitalnu, palmoična, palmeična, tiocijansku, metansulfonsku, etanesulfonsku, 1,2-etandisulfonsku, 2- hidroksietansulfonsku, benzensulfonsku, 4-horbenzensulfonsku, naftalen-2-sulfonsku, p- toluensulfonsku, kamforsulfonsku, 4-metilbiciklo [2.2.2] -okt-2-en-l -karboksilnu, glukoheptonsku, 4,4'-metilenbis-3- (hidroksi-2-en-lkarbonsku kiselinu), hidroksinaftoevu. "Farmaceutski prihvatljive baze" uključuju neorganske i organske baze koje su netoksične u koncentraciji i na način na koji su formulisane. Na primer, pogodne baze uključuju one dobijene od metala koji formiraju neorganske baze kao što su litijum, natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum, amonijum, gvožđe, cink, bakar, mangan, aluminijum, N-metilglukamin, morfolin, piperidin i organske netoksične baze uključujući, primarne, sekundarne i tercijarne amine, supstituisane amine, ciklične amine i bazne jonoizmenjivačke smole, [npr., N(R`)4<+>(gde je R' nezavisno H ili С1-4alkil, npr., amonijum, Tris)], na primer, izopropilamin, trimetilamin, dietilamin, trietilamin, tripropilamin, etanolamin, 2-dietilaminoetanol, trimetamin, dicikloheksilamin, lizin, arginin, histidin, kofein, prokain, hidrabamin, holing, betain, etilendiamin, glukozamin, metilglukamin, teobromin,purine, piperazin, piperidin, N-etilpiperidin, poliaminske smole i slično. Posebno poželjne organske netoksične baze su izopropilamin, dietilamin, etanolamin, trimetamin, dicikloheksilamin, holin i kofein. Dodatne farmaceutski prihvatljive kiseline i baze upotrebljive u predmetnom pronalaskom obuhvataju one koje su izvedene iz aminokiselina, na primer, histidin, glicin, fenilalanin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, lizin i asparagin.

[0094] "Farmaceutski prihvatljivi" puferi i soli uključuju one koji potiču od adicionih soli kiselina i baza gore navedenih kiselina i baza. Specifični puferi i / ili soli uključuju histidin, sukcinat i acetat.

[0095] „Farmaceutski prihvatljiv šećer“ je molekul koji, kada se kombinuje sa proteinom od interesa, značajno sprečava ili smanjuje hemijsku i / ili fizičku nestabilnost proteina prilikom skladištenja. Kada se želi da se formulacija podvrgne liofilizaciji, a zatim rekonstituiše, „farmaceutski prihvatljivi šećeri“ mogu da budu poznati i kao ,,lioprotektant“. Primeri šećera i njihovih odgovarajućih šećernih alkohola uključuju: aminokiselinu kao što je mononatrijum glutamat ili histidin; metilamin kao što je betain; liotropna so kao što je magnezijum sulfat; poliol kao što su trihidroksilni ili šećemi alkoholi veće molekulske mase, npr. glicerin, dekstran, eritritol, glicerol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol; propilen glikol; polietilen glikol; PLURONICS®; i njihove kombinacije. Dodatni primeri lioprotektanata uključuju glicerin i želatin i šećere melibiozu, melezitozu, rafmozu, manotriozu i stahiozu.

Primeri redukujućih šećera uključuju glukozu, maltozu, laktozu, maltulozu, izo-maltulozu i laktulozu. Primeri neredukujućih šećera uključuju neredukujuće glikozide polihidroksi jedinjenja izabranih od šećernih alkohola i drugih poliakohola ravnih lanaca. Poželjni šećerni alkoholi su monoglikozidi. posebno ona jedinjenja dobijena redukcijom disaharida kao što su laktoza, maltoza, laktuloza i maltuloza. Glikozidna bočna grupa može biti glukozidna ili galaktozidna. Dodatni primeri šećernih alkohola su glucitol, maltitol, laktitol i izo-maltuloza. Poželjni farmaceutski prihvatljivi šećeri su neredukujući šećeri trehaloza ili saharoza. Farmaceutski prihvatljivi šećeri se dodaju formulaciji u „zaštitnoj količini“ (npr. pre-liofilizacija), što znači da protein u osnovi zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost i integritet tokom skladištenja (npr. nakon rekonstitucije i skladištenja).

[0096] " Razblaživač/diluent" od interesa ovde je onaj koji je farmaceutski prihvatljiv (bezbedan i netoksičan za primenu na čoveku) i koristan je za pripremu tečne formulacije, kao što je formulacija koja je rekonstituisana nakon liofilizacije. Primeri razblaživača uključuju sterilnu vodu, bakteriostatičku vodu za injekcije (BWFI), pH puferovani rastvor (npr. fiziološki rastvor puferovan fosfatom), sterilni fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. U alternativnoin rešenju, razblaživači mogu da sadrže vodene rastvore soli i / ili pufere.

[0097] "Konzervans" je jedinjenje koje se može dodati ovde navedenim formulacijama radi smanjenja bakterijske aktivnosti. Dodatak konzervansa može, na primer, da omogući proizvodnju formulacije za

2

višestruku upotrebu (više doza). Primeri potencijalnih konzervansa uključuju oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid (smeša alkilbenzildimetilamonijum hlorida u kojima su alkil grupe, jedinjenja sa dugim lancima) i benzetonijum hlorid. Ostale vrste konzervansa uključuju aromatične alkohole kao što su fenol, butil i benzil alkohol, alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i 2-krezol. Najpoželjniji konzervans ovde je benzil alkohol.

[0098] ,,Lečenje/tretman“ se odnosi na kliničku intervenciju dizajniranu tako da izmeni prirodni tok pojedinca ili ćelije koja se leči, a može da se izvede ili za profilaksu ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju sprečavanje pojave ili ponovnog pojavljivanja bolesti, sprečavanje metastaza, smanjenje brzine napredovanja bolesti, poboljšanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim realizacijama, antitela pronalaska se koriste za odlaganje razvoja bolesti ili poremećaja. Subjekt se uspešno ,,leči“, na primer, korišćenjem apoptotskih antitela na PD- L1 prema pronalasku ako se ublaži jedan ili više simptoma povezanih sa disfunkcionalnim poremećajem T-ćelija. „Efektivna količina“ se odnosi na najmanje moguću efikasnu količinu u dozama i tokom potrebnih vremenskih perioda zapostizanje željenog ili naznačenog efekta, uključujući terapeutski ili profilaktički rezultat. Na primer, efikasna količina antitela ne PD-L1 predmetnog pronalaska je najmanja moguća minimalna koncentracija koja rezultira inhibicijom signalizacije od PD-L1, bilo preko PD-1 na T-ćelijama ili B7.1 na drugim APCs-ima, ili oboje.

[0099] „Terapeutski efikasna količina“ je najmanja moguća minimalna koncentracija potrebna za postizanje merljivog poboljšanja ili prevencije određenog poremećaja. Terapeutski efikasna količina ovde može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, i sposobnost antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj su bilo koji toksični ili štetni efekti antitela nadjačani terapeutski korisnim efektima. Na primer, terapeutski efikasana količina antitela na PD-LI predmetnog pronalaska je najmanje moguća minimalna koncentracija koja rezultira inhibicijom najmanje jednog simptoma disfunkcionalnog poremećaja T ćelija.

[0100] „Profilaktički efikasna količina“ odnosi se na količinu efikasnu u dozama i tokom potrebnih vremenskih perioda da se postigne željeni profilaktički rezultat. Na primer, profilaktički efikasna količina antitela na PD-L1 predmetnog pronalaska je najmanja moguća tninimalna koncentracija koja sprečava ili umanjuje razvoj najmanje jednog simptoma disfunkcionalnog poremećaja T ćelija.

[0101] "Sisar" u svrhe lečenja odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisar, uključujući ljude, domaće životinje i životinje iz uzgoja, i životinje iz zoološkog vrta, životinje u sportu ili kućne ljubimce, poput pasa, konja, zečeva, goveda, svinja, hrčaka, gerbila, miševa, feretke, pacovi, mačke, itd. Poželjno je daje sisar čovek.

[0102] Izraz „farmaceutska fonnulacija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi, i koji ne sadrži dodatne komponente

2

kоје su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena. Takve formulacije su sterilne.

[0103] "Sterilna" formulacija je aseptična ili ne sadrži sve žive mikroorganizme i njihove spore.

[0104] Termin "približno/oko", kao što se ovde koristi, odnosi se na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost, koja je stručnjaku u ovoj tehničkoj oblasti dobro poznata.

[0105] „Autoimuni poremećaj“ je bolest ili poremećaj koji proističe iz i usmeren je protiv sopstvenih tkiva ili organa pojedinca ili njihove ko-segregacije ili manifestacije ili rezultujućih stanja. Autoimune bolesti mogu biti specifične za organe (tj. imuni odgovor je posebno usmeren na sistem organa kao što su endokrini sistem, hematopoetski sistem, koža, kardiopulmonalni sistem, gastrointestinalni i jetreni sistem, bubrežni sistem, štitna žlezda, uši, nervno-mišićni sistem, centralni nervni sistem itd.) ili sistemska bolest koja može da zahvati više sistema organa (na primer, sistemski eritemski lupus (SLE), reumatoidni artritis (RA), polimiozitis itd.). Poželjne takve bolesti uključuju autoimune reumatološke poremećaje (kao što su, na primer, RA, Sjogrenov sindrom, skleroderma, lupus poput SLE i lupusni nefritis, polimiozitis-dermatomiozitis, krioglobulinemija, sindrom anti-fosfolipidnih antitela i psorijazni artritis), autoimuni gastrointestinalni i jetreni poremećaji (kao što su, na primer, inflamatorne bolesti creva {npr. ulcerozni kolitis i Kronova bolest), autoimuni gastritis i pemiciozna anemija, autoimuni hepatitis, primarna bilijama ciroza, primami sklerozirajući holangitis i celijakija), vaskulitis, kao što je za na primer, ANCA-negativni vaskulitis i ANCA-povezani vaskulitis, uključujući Čurg- Štrausov vaskulitis, Vegenerovu granulomatozu i mikroskopski poliangiitis), autoimune neurološke poremećaje (kao što su, na primer, multipla skleroza, sindrom opsoclonus mioklonusa, miastenija gravis, neuromijelitis optika, Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest i autoimune polineuropatije), bubrežni poremećaji (kao kao što su, na primer, glomerulonefritis, Gudpastureov sindrom i Bergerova bolest), autoimuni dermatološki poremećaji (kao što su, na primer, psorijaza, urtikarija, osipi, pemfigus vulgaris, bulozni pemfigoid i kožni eritemski lupus), hematološki poremećaji (kao npr. na primer, trombocitopenična purpura, trombotička trombocitopenična purpura, post-transfuziona purpura i autoimuna hemolitička anemija), ateroskleroza, uveitis, autoimune bolesti sluha (kao što su, na primer, bolest unutrašnjeg uha i gubitak sluha),

Beketova bolest, Rejnaudov sindrom, transplantacija organa , i autoimuni endokrini poremećaji (kao što su, na primer, autoimune bolesti povezane sa dijabetesom, poput dijabetes melitusa zavisnog od insulina (IDDM), Adisonove bolesti i autoimune bolesti štitne žlezdc (npr. Gravesova bolest i tiroiditis)). Poželjnije takve bolesti uključuju, na primer, RA, ulcerozni kolitis, vaskulitis povezan sa ANCA, lupus, multiplu sklerozu, Sjogrenov sindrom, Gravesovu bolest, IDDM, pernicioznu anemiju, tiroiditis i glomerulonefritis.

[0106] Izraz „citotoksični agens”, kao što je ovde navedeno, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i / ili izaziva smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, bez ograničenja, radioaktivne izotope (npr., At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<l88>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>i radioaktivni

2

izotopi Lu), i toksine poput toksina malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti.

[0107] „Hemoterapeutski agens” je hemijsko jedinjenje korisno za lečenje kancera. Primeri hemoterapeutskih agenasauključuju alkilujuće agense, kao što su tiotepa i ciklofosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolmelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; kamptotecin (uključujući sintetičke analoge topotekan (CPT-11 (irinotekan), acetilkamptotecin, skopolektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; pemetreksed; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; tenipozid; kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i СВ1-ТМ1); eleuterobin; pankratistatin; TLK-286; CDP323, oralni inhibitor alfa- 4 integrina; sarkodiktiin; spongistatin; azotne iperite, kao što je hlorambucil, hlornafazin. holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree, kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike, kao što su endiinski antibiotici (npr., kaliheamicin, naročito kaliheamicin gamal i kaliheamicin omegal (vidiri, nprNicolaou et ah, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofore i srodne hromoproteinske endiinske antibiotske hromofore), aklacinomizine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-piroIinodoksorubicin, injekcije lipozoma doksorubicin-HCl, i dezoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine, kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kelamicin, rodorubicin; streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti, kao što su metotreksat, gemcitabin, tegafur, kapecitabin, epotilon i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline, kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analoge purina, kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina, kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksi fluridin, enocitabin, floksuridin, i imatinib (derivat 2-fenilaminopirimidina), kao i drugi inhibitori c-Kit; antiadrenale, kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; agensi za popunjavanje zaliha folne kiseline, kao što je folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; ainsakrin; bestrabucil; bizantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazihion; elfomitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtanzinoide, kao što su majtanzin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid;

2

prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikon; 2,2',2"- trihlortrietilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid („Аrа-С”); tiotepa; taksoide, npr. paklitaksel, formulacija paklitaksela u obliku nanočestica modifikovanih albuminom, i docetaksel; hloranbucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine, kao štojecisplatin i karboplatin; vinblastine, platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; oksaliplatin; leucovovin; vinorelbin; novantrone; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometil-hlornitin (DMFO); retinoide kao što je retinoinska kiselina; farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog gorenavedenog agensa; kao i kombinacije dva ili više gore navedenih agenasa, kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom, i FOLFOX, skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom u kombinaciji sa 5-FU i leukovovinom.

Ostali terapijski agensi koji se mogu koristiti u kombinaciji sa antitelima na PD-L1 prema pronalasku su bisfosfonati kao što su klodronat, NE-58095, zoledronska kiselina / zoledronat, alendronat, pamidronat, tiludronat ili risedronat; kao i troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozid citozina); antisens oligonukleotidi, naročito oni koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima obuhvaćenim aberantnom ćelijskom proliferacijom, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor za epidermalni faktor rasta (EGF-R); vakcine kao što su Stimuvax vakcina, Theratope vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, Allovectin vakcina, Leuvectin vakcina i Vaxid vakcina; inhibitor topoizomeraze I; anti-estrogen kao što je fulvestrant; komplet inhibitora kao što je imatinib ili EXEL-0862 (inhibitor tirozin kinaze); EGFR inhibitor kao što je erlotinib ili cetuksimab; anti-VEGF inhibitor kao što je bevacizumab; arinotekan; rmRH; Iapatinib i lapatinib ditozilat (inhibitor malih molekula ErbB-2 i EGFR dvostruke tirozin kinaze poznat i kao GW5720I6); 17AAG (derivat geldanamicina, koji je otrov proteina toplotnog šoka (Hsp) 90), i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih.

Kratak opis slika

[0108]

Slika 1 prikazuje da A09-246-2 efikasno blokira vezivanje<I25>I-PD-L1 za imobilizovani PD-l-Fc. Neaktivni mutant: Mutant VL-A31G,D52E,R99Y A09-188-1. A09-246-2 (1): Eksprimirano u HEK 293 ćelijama. A09-246-2 (2): Eksprimirano u CHO-S ćelijama, serija # 1. A09-246-2 (3): Eksprimriano u CHO-S ćelijama, serija # 2.

Slika 2 prikazuje sekvencu ekstracelularnog domena (spregnut sa 6 aminokiselinskim His tagom, SEK ID NO: 29) PD-L1. Peptidi koje MS može da identifikuje označeni su sivim poljima. Oni koji su pokazali zaštitu od HD razmene u prisustvu Faba predstavljeni su crnim poljima. Peptidi koji nisu mogli da budu analizirani označeni su podvlačenjem i kurzivom u sekvenci.

2

Slika 3 prikazuje epitop A09-246-2 na PD-L1. Okosnica PD-L1 prikazana je u vidu trake. Aminokiseline koje, kada mutiraju u alanin, destabilizuju vezivanje A09-246-2 - PD-L1 za više od 0,7 kcal / mol, prikazane su kao štapići.

Slika 4 prikazuje da A09-246-2 efikasno pojačava aktivnosti T ćelija predstavljene proizvodnjom IL-2, kao što je prikazano SEA humanim PBMC testom.

Slike S-16 prikazuju da A09-246-2 povećava ADCC u različitim linijama tumora(stimuIisanim i nestimulisanim) i alotipovima.

Eksperimentalni deo

[0109] Radni primeri dati u daljem tekstu dati su radi ilustracije određenih realizacija pronalaska i bez namere da ograničavanju obim specifikacije ili zahteva na bilo koji način.

l.Odabir i pobolišanje antitela

[0110] Antitela su izabrana iz biblioteka prikazivanja sa fazima Fab. Izbor je obuhvatio dva različita kraka, od kojih je jedan koristio biotinilirani humani PD-L1 na različitim selekcijama

[0111] ciklusa i drugih naizmeničnih PD-L1 čoveka i miša kao cilj u različitim ciklusima. Izvršen je skrinig 3840 klonova ELISA testom kako bi se identifikovalo 170 pojedinačnih vezivnih PD-L1. Na osnovu inhibicije vezivanja PD-1 liganda, odabrano je 48 pogodaka i izraženo u srednjoj skali za dalju karakterizaciju.

[0112] Odabrani pogoci su ponovo formatirani i izraženi kao IgGs. Kandidati za optimizaciju pogotka izabrani su na osnovu jačine da blokira vezivanje PD-1 za PD-L1 i sposobnosti vezivanja za verzije humanih i mišijih PD-L1. Vezivanje za PD-L1je prvobitno određeno ELISA testom, a kasnije je kvantifikovano Biacore-om i vezivanje za PD-L1-ekspresivne ćelije FACS-om. Četiri kandidata su se poklopila sa unapred definisanim profilom, uključujući A09-I88-1 koji je sadržao lambda laki lanac.

[0113] A09-188-1 je izabran za sazrevanj eafiniteta i optimizaciju sekvence. Ciljevi sazrevanja afiniteta bili su povećani afinitet prema humanom cilju, unakrsna reaktivnost prema mišjem cilju i poboljšanje proizvodljivosti. Mutacije teških lanaca u HVR’s uvedene su randomizacijom baziranom na kodonu. Ova raznolikost teškog lanca kombinovana je sa raznolikošću lakog lanca uvedenih mešanjem lakih lanaca da bi se stvorila biblioteka sazrevanja afiniteta. Dalji FR i HVR ostaci teškog i lakog lanca su mutirani da bi se povećala stabilnost antitela i uvodile aminokiseline pronađene u gemitivnoj ćeliji, kao što je FR mutacija teškog lanca 193V.

[0114] Ovo je dalo HVR sekvence koje su date u nastavku. Moglo bi se pokazati da su barem ostaci X1-X17variajbilni u pogledu ciljnog vezivanja i imaju poželjna značenja kao što je ovde otkriveno.

HVR-H1 sekvenca je X,YX2MX3(SEQ ID N0:1);

HVR-H2 sekvenca je SIYPSGGX4TFYADX5VKG (SEQ ID N0:2);

HVR-H3 sekvenca je IKLGTVTTVX6Y (SEQ ID N0:3);

gde: X, je K, R, T, Q, G, A, W, M, 1 iii S; X2je V, R, K, L, M ili I; X3je H, T, N, Q, A, V, Y, W, F ili M; X4je F ili I; X5je S ili T; X6je E ili D

HVR-Ll sekvenca je TGTX7X8DVGX<,YNYVS (SEQ ID N0:8);

HVR-L2 sekvenca je X<I>„VX<H>X<I>2RPS (SEQ ID N0:9);

HVR-L3 sekvenca je SSX13TX14X15X16X17RV (SEQ ID N0:10);

pri čemu: Х7jе N ili S; X8je T, R ili S; Х9је A ili G; Х10је E ili D; Х11je I, N ili S; Х12је D, H ili N; Х13je F ili Y; X14je N ili S; X15je R, T ili S; X16je G ili S; X17je I ili T,

1. Proizvodnja, prečišćavanje i formulacija

1.1 Bioprodukcija i bistrenje

[0115] Antitelo A09-246-2 koje odgovara SEQ 1D NO: 32 (težak lanac) i SEQ ID NO: 33 (laki lanac), eksprimirano je iz CHO-S ćelija transfektovanih sa KOL izotipskom DNK sekvencom i verzijom EU sa optimizovanom sekvencom, respektivno. Kulture ćelija su sprovedene u šaržnom režimu u 250L bioreaktoru za jednokratnu upotrebu (SUB) (Tabela 2-2). Ćelije su gajene u medijumu za rast ProCHO5, dopunjenom sa 4 mM L-glutamina 25 μg / ml puromicina na 37 ° C. Kulture su hranjene sa 15% efikasnom hranom B i 1,0 mM valproinskom kiselinom 3 dana nakon inokulacije.

[0116] Sirovi kondicionirani mediji iz ciklusa bioreaktora su izbistreni korišćenjem 1,1 m2 filtera Millistak Pod DOHC (Millipore MD0HC10FS1) i 0,11 m2 filtera Millistak Pod A1HC (Millipore MA1HC01FS1), nakon čega sledi završna filtracija filterom Sartopore 2 (Sartorius 5445307H8-SS). 1.2 Prečišćavanje

[0117] Proces prečišćavanja sastojao se od dva koraka hromatografije; (a) MabSelect Protein A da zauzme antitelo iz prečišćene žetve, i (b) korak poliranja hidroksiapatita Tipa II za uklanjanje preostalih sakupljenih proizvoda, proteina ćelija domaćina i DNK, i nečistoća povezanih sa proizvodom. Intermedijami korak Q-filtracije je umetnut između hromatografska 2 koraka da bi se dalje redukovala DNK. SDS-PAGE i ekskluziona hromatografija prema veličini čestica SE-HPLC korišćene su za analizu uzoraka tokom procesa prečišćavanja. Sadržaj proteina u uzorcima u procesu Mabselect izveden je HPLC metodom protein A, dok je UV / Vis spektroskopija korišćena za sve ostale korake procesa.

[0118] Post Mabselect eluati su podvrgnuti 30 minutoj virusnoj inaktivaciji sa niskim pH (pH 3,7) i zatim neutralizovani na pH 7,0 pre sledećeg koraka prečišćavanja.

[0119] Završni korak poliranja bila je hidroksiapatit Tipa II hromatografija. Provodljivost filtrata Sartobind Q podešena je na <3 mS / cm sa vodom, a pH je smanjen na 6,5 sirćetnom kiselinom pre nanošenja uzorka.

[0120] Vezani anti-PD-LI proizvod je eluiran gradijentom NaCl. Agregatne nečistoće povezane sa proizvodom eluirane su sa puferom Strip Buffer.

1.3 Formulacija, ultrafiltracija i diafiltracija

[0121] Prečišćeni anti-PDL 1 iz koraka poliranja hidroksiapatitom su koncentrovani i zatim diafiltrirani u svoje odgovarajuće pufere prema donjoj tabeli. Proizvodi dobijeni na veliko su zatim sterilno profiltrirani kroz 0,2 p filter jedinice i dalje razblaženi puferom za formulaciju do krajnjih koncentracija, Formulirane supstance dobijene na veliko su dalje ispitane na endotoksin i proverene pomoću SE-HPLC.

1

1.4 Нитапа formulacija

[0122] Postavljen je sledeći profil primene i formulacije cilja:

Način primene: iv infuzija

Opseg doze za čoveka: 1-15 mg/kg

Koncentracija: 10mg/ml

Uslovi skladištenja: tečno ili smrznuto

Rok trajanja: duže od 12m

[0123] Odabrana je sledeća tečna formulacija:

10,0 mg/mL A09-246-2

10 mM Acetate 5,1%

(t/z) Manitol

1,4 mM Metionin

0,05% (t/z) Tween 20

podešeno na pH 5,5

[0124] Formulacija sadrži antioksidativne pomoćne supstance i pokazala se dovoljno stabilnom u sledećim stresnim uslovima:

• Lagani stres

• Jak stres

• Ciklusi smrzavanja i odmrzavanja

• Oksidacioni stres

[0125] Stabilnost je procenjena na 2-8 ° C i 25 ° C do 26, odnosno 13 nedelja, respektivno. Utvrđeno je da je formulacija dovoljno stabilna na 2-8<0>C do najnovije vremenske tačke od 26 nedelja. Takođe, napravljena je liofilizovana formulacija sa odličnom stabilnošću na 25<0>C do 26 nedelja.

3.Biohemijska i biološka karakterizaciia

3.1 Afinitet i specifičnost vezivanja za Biacore

2

�

[0129] Svi testirani anti-huPD-LI MAb, uključujući A09-246-2, specifično su reagovali samo sa proteinom huPD-L1, a ne sa bilo kojim drugim proteinima familije B7.

3.3 PD-LI: Blokiranje interakcije PD-1

|0130| Sposobnost A09-246-2 i kontrolnog antitela da se takmiče oko vezivanja radio-obeleženih PD-Ll za imobilizovani PD-1 određena je testom radioaktivnog kompetitivnog pomeranja. Slika 1 prikazuje reprezentativne krive kopeticije za test antitela. Rezultati su pokazali da A09-246-2 efikasno blokira interakciju PD-1 i PD-L1 sa IC50 od 0,071 /- 0,008 nM (0,01 /- 0,001 μg / ml).

[01311 Korišćen je sledeći protokol ispitivanja:

1. Dodati 60 ml / ležištu PBS-a, koji sadrži 1 mg / ml humanog PD-lFc (R&D Systems, 1086-PD; liofilizovani PD-1 rastvoren u PBS-u od 200 mg / ml) u bele Costar ploče (Corning 3922). lnkubirati preko noći na 4<0>C.

2. Isprati ležišta 1 put sa PBS-om.

3. Blokirati ležišta dodatkom 120 ml 0,5% BSA (Sigma A-3059) rastvorenog u puferu za vezivanje, tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT).

4. Isprati ležište lx puferom za vezivanje.

5. Dodati 50 ml test uzorka u ležišta (antitelo, supernatant). Razblažiti antitela do 20 nM u puferu za ispitivanje i serijski razblažiti 9x u razblaženju 1: 4. Uzorci su razblaženi do 2x konačne koncentracije, pre dodavanja u ležišta (obično počev od koncentracije 10 nM - lx). 6. Nespecifično vezivanje: dodati 50 ml PD-L1 / Fc (R&D Systems, 156-B7) u konačnoj koncentraciji od 250 nM umesto test uzorka u 500-strukom višku u obeleženi PD-L1. Sva ležišta dobijaju istu količinu pufera za ispitivanje.

7. U svako ležište dodajte 50 ml 0,5 nM<125>I-PD-LI (posebno označeno na Perkin Elmer, partija broj C1S32211,250 nM, 2400 Ci/mmol). Razblažiti do 2x konačne koncentracije u puferu za ispitivanje - krajnja koncentracija = 0,25 nM.

8. Mućkati ploču 2-2,5 h na 37<0>C.

9. Isprati bunare 5 puta puferom za hladno vezivanje.

10. Dodati 100 ml Microscint 20 (Packard 6013641) u svako ležište. Inkubirati najmanje jedan sat na RT.

11. Izmeriti luminiscenciju na Topcount (protokol<l25>I -Microscint).

[0132] Pufer za vezivanje: 50 mM Hepes, pH 7,5, 130 mM NaCl, 5,1 mM KCl, 1,3 mM MgSO4Pufer za testiranje: pufer za vezivanje 0,5% BSA

3.4 PD-L1: B7.1 Blokiranje interakcije

[0133] Sposobnost A09-246-2 da blokira vezivanje rastvornog B7.I za PD-L1 na površini ćelije izmerena je pomoću FACS. Rezultati koji su pokazali da A09-246-2 efikasno blokira interakciju B7.1 i PD-L1 sa 1C50 od 0,2 /- 0,004 nM (0,03 /- 0,0006 μg / ml).

3.5 Mapiranje epitopa

a) Razmena vodonik-deuterijum

[0134] Vanćelijski domen PD-L1 antigena (SEK. ID N0: 29) inkubiran je u rastvoru teške vode (D2O) kako bi se amidni protoni na proteinskoj okosnici mogli da razmenjuju sa deuteronima iz rastvarača, bilo u prisustvu ili odsustvu viška anti-PD-L1 Fab ili nespecifičnnog Fab. Uzorci su digestirani proteazom i analizirani tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (LC-MS) da bi se odredio nivo deutearizcije u svakom peptidu.

[0135] Fab koji odgovara A09-246-2 je korišćen umesto celog IgG kako bi se pojednostavila analiza masene spektrometrije smanjenjem broja peptida generisanih digestijom proteaza. Uprkos tome, ostali su neki regioni koje nije bilo moguće identifikovati i analizirati (podvučeni, kurzivni delovi sekvence na slici 2), međutim ovi regioni predstavljaju mali deo sekvence i uglavnom se nalaze u drugom domenu imunoglobulina, udaljenom od regiona koji sadrži epitop . Ostaci 32-39 u domenu I ekstracelularnog domena takođe su bili otporni na identifikaciju masenom spektrometrijom i obuhvataju mesto N-vezane glikozilacije; kako je poznato da A09-246-2 vezuje aglikozilovanu verziju PD-Ll proizvedenu u E. coli, nemogućnost analize ovog peptida na brzinu izmene HD nije bila zabrinjavajuća.

Uočeno je da nekoliko peptida iz antigena imaju značajno smanjenu brzinu razmene protona za deuterone u prisustvu Fab nego u njegovom odsustvu, što sugeriše da su bar neki ostaci ovih peptida u direktnom kontaktu sa Fab i čine konformacijski epitop ( Slika 2). lako su dva peptida koja pokazuju zaštitu od rastvarača udaljena u primarnoj sekvenci (podvučeni, podebljani otisak na slici 2, oni su približni u trodimenzionalnoj strukturi PD-L1 i svaki čine po jedan vezivni deo na površini antigena (videti sliku 3).

[0136] Ukratko, HD razmena je identifikovala dva peptida

(i) ostaci 36-48 na slici 2 (ekstracelularni domen plus His tag, SEQ ID NO: 29), koji odgovaraju ostacima 54-66 sekvence pune dužine (SEQ ID NO: 28)

(ii) ostaci 94-104 na slici 2 (SEQ 1D NO: 29), što odgovara ostacima 112-122 SEQ ID NO: 28 koji formiraju konformacioni epitop na PD-LI i koji sadrži funkcionalni epitop A09-246-2. b) Mutageneza

[0137] Da bi se dobilo finije mapiranje epitopa na nivou ostataka i dopuna podataka HD razmene, molekularno modeliranje i manuelna provera kristalne strukture PD-L1 (Lin, D.Y.-W. et al. PNAS 105, 3011-6 (2008; PDB zapis 3BIK) su primenjeni za odabir ostataka izloženih rastvaraču unutar i oko epitopa identifikovanih HD razmenom. Odabrani ostaci su mutirani ili u alanin (velikih u male) ili u drugu, potencijalno ometajuću aminokiselinu (malih u velike).

Ukupno je dizajnirano, eksprimirano i prečišćeno iz HEK ćelija, 48 tačkastih mutanata i testirano na vezivanje za A09-246-2 pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR). Tačka na kojoj češće dolaze vezivanja ili ostaci koji najviše doprinose energiji vezivanja (Wells. J.A., PNAS 93, 1-6, 1996), identifikovani su kao oni koji nisu zadovoljili signal praga vezivanja na 100 nM antigena. Dalje, afinitet antitela za divlji tip i svakog mutanta je određen i korišćen za izračunavanje doprinosa svakog ostatka epitopa energiji vezivanja.

[0138] Rezultati su sumirani u donjoj tabeli, gde je 48 tačaka mutanata PD-LI upoređeno sa antigenom PD-L1 divljeg tipa za vezivanje antitela. SPR (Biacore) je korišćen za izvođenje kinetičkog ispitivanja koje omogućava određivanje konstanti kinetičke brzine (kai kd). Ukratko, kozja poliklonalna antihumana Fc antitela bila su hemijski povezana sa CM5 čipom. Sledeći je ubrizgan Al 1-128 i uhvaćen od strane poliklona. Pufer je korišćen za ispiranje nevezanih antitela dok se osnovni RU ne stabilizuje. Zatim je injektiran antigen (divljeg tipa ili mutant PD-L1) u fiksnoj koncentraciji tokom 3 minuta i registrovana je povezanost. Pufer je injektiran tokom 3 minuta i primećena je disocijacija. Antigeni su injektirani u koncentracijama od 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM i 6,25 nM (izuzev mutanata Y56 i D61, koji su injektirani pri 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM i 62,5 nM). Između svakog ciklusa, čip je regenerisan puferom sa niskim pH i uhvaćen je svež A09-246-2 pre ubrizgavanja sledeće koncentracije antigena. Konstante brzine određene su iterativnim fitovanjem podataka na modelu vezivanja 1: 1 pomoću algoritma koji hi-kvadrat svodi na minimum. Ravnotežna konstanta disocijacione (KD) izračunata je kao odnos kinetičkih konstanti i promena Gibbsove slobodne energije vezivanja mutanta u odnosu na divlji tip PD-LI (ΔΔGmut) izvedena je iz odnosa KDza divlji tip i za mutant. Promene slobodne energije su naznačene u skladu sa destabilizacijom vezivanja antitelo-antigen; "**" : > 3 kcal / mol destabilizacija (tačke na kojima češće dolazi do vezivanja); "*" : > 0,7 kcal / mol. Mutanti na Y56 imali su tako nizak afinitet da se KDmože precizno izmeriti i umesto toga dat je minimum K<D>. Za D61A nije bilo moguće naći vezivanje. Prema ovoj analizi, aminokiseline označene sa „**“ ili „*“ deo su funkcionalnog epitopa. Srednja vrednost temperature fluorescentno praćene termičke denaturacije data je za proteine divljeg tipa i mutirane. ND: Nije određeno; BP: dvofazni. Takođe je dat kvalitativni izgled proteina divljeg tipa i mutiranih proteina ekskluzionom hromatografijom prema veličini čestica (SEC). M: monodisperzna i ista količina elucije kao divlji tip; M /Т: pik(maksimum) pri istoj zapremini eluciranja kao divlji tip, ali sa dodatnim repom. Za KDi T1/2, data je srednja i standardna devijacija gde je n> 1.

[0139] Bilo je važno da se potvrdi da je nedostatak vezivanja za A09-246-2 tačkastih mutanata Y56A, Y56K i D61A zaista nastao usled gubitka ostataka tačaka na kojima češće dolazi do vezivanja (hotspot). a ne zbog globalnog razmotavanja antigena. Strukturni integritet mutiranih proteina potvrđen je pomoću fluorescentno praćenog termičkog odvijanja u kome se protein inkubira sa bojom koja je ugašena u vodenom rastvoru, ali fluorescira kada je vezana izloženim hidrofobnim ostacima. Kako se temperatura povećava, termička denaturacija proteina izlaže ostatke hidrofobnog jezgra i to se može pratiti povećanjem fluorescencije boje. Svi mutanti Y56 ili D61 pokazuju dvostepeni prelaz sličan PD-L1 divljeg tipa, što ukazuje na savijenu strukturu na sobnoj temperaturi. Podaci su odgovarali jednačini 1 (prilagođeno od Bullock, A. N. et al. Thermodynamic stability of wild-type and mutant p53 core domain. PNAS 94, 14338-14342 (1997)) za određivanje temperature u tački pregiba krive ( T1/2).

[0140] Mutanti Y56 i D61 su pokazali minimalnu destabilizaciju antigena, što je naznačeno malim smanjenjem Т1/2fluorescencije praćene razmotavanjem (tabela gore). Ovo potvrđuje da su Y56 i D61 hotpost tačke na kojima dolazi do vezivanja za A09-246-2. Strukturni integritet većine ostalih mutiranih proteina takođe je potvrđen ovom metodom (gornja tabela). Zapažanje da se većina mutiranih proteina ponašalo slično divljem tipu na ekskluzionoj hromatografiji prema veličini čestica (poslednja kolona u gornjoj tabeli) pruža dalju podršku nativnoj strukturi mutiranih antigenskih proteina.

3.6 Vezivanje za tumorske ćelije i primarne ćelije

[0141] Vezivanje A09-246-2 za PD-L1 na površini tumorskih ćelija, kao i na primarnim humanim ćelijama i ćelijama eksperimentalnih životinja, potvrđeno je FACS testom. A09-246-2 je pokazao reaktivnost na humani PD-L1 na svih sedam testiranih linija humanog tumora (A431, ćelijska linija epitelnog karcinoma; A549. epitelne ćelije adenokarcinoma pluća; ВхРСЗ, ćelije karcinoma pankreasa; HCT116, kolorektalni karcinom; M24, melanom ćelijske linije ; PC3mm2, ćelijska linija raka prostate; U-87 MG, glioblastoma-astrocitom) od kojih je PD-L1 regulisan tretmanom interferona kako bi se omogućila detekcija. Budući da primarne PBMC imaju niske nivoe ekspresije PD-L1. što je teško otkriti, humane PBMC ili PBMC pasa, zečeva i pacova bili su podvrgnuti PHA stimulaciji tokom 2 dana. A09-246-2 je pokazao reaktivnost na PD-L1 na humanim i životinjskim primarnim ćelijama. 3.7 EC50 mereno direktnim FACS testom vezivanja

[0142] Sposobnost vezivanja A09-246-2 u zavisnosti od doze za cilj na površini ćelije potvrđena je pomoću FACS. A09-246-2 se efikasno vezuje za humani PD-L1 eksprimiran na površini HEK ćelija sa EC50 od 0,3 /- 0,02 nM (0,04 /- 0,003 μg / ml); cinomolgus majmuna eksprimiranom na površini ćelije HEK sa EC50 od 0,94 /- 0,015 nM (0,14 /- 0,002 μg / ml); mišjem PD-L1 eksprimiranom na površini ćelije HEK293 sa EC50 od 0,34 /- 0,08 nM (0,05 /- 0,012 μg / ml) i mišjem PD-L1 eksprimiranom na površini ćelije EL4 sa EC50 od 0,91 /- 0,21 nM (0,13 /- 0,03 μg / ml). Analize su kvalitativno opisale karakteristike vezivanja anti-PD-L1 zavisne od doze.

3.8 Aktivnost u ćelijskim testovima

[0143] Trenutno nema naučnih dokaza da angažovanje PD-L1 sa njegovim ligandima pretvara stimulatomu signalizaciju kroz PD-L1 u ćelije koje eksprimiraju PD-L1, stoga su razvijeni testovi u procedurama koristili aktivaciju T ćelija. Sposobnost antitela na-PD-L1 da pojača imuno-odgovore T ćelija izmerena je in vitro u ćelijskim testovima korišćenjem mišjih T ćelija ili humanih PBMC. a) OT-1 test

[0144] Antigen -specifične CD8 T ćelije su generisane stimulisanjem splenocita od OT-1 transgenih miševasapeptidom Ova SIINFEKL i ciroprezervisane. mPD-L1 prekomerno eksprimirajuće EL4 ćelije su korišćene kao antigen prezentujuće ćelije. Serijska razblaženja testiranih jedinjenja inkubirana su sa odmrznutim OT-1 T ćelijama i APC sa nanetim SIINFEKL tokom 48 sati. IFN-γ u supernatantu je meren upotrebom mIFN-y ELISA. Anti-PD-L1 (A09-246-2) efikasno pojačane aktivnosti T ćelija predstavljene stvaranjem IFN-γ sa EC50 od 0,28 /- 0,1 nM (0,04 /- 0,015 μg / ml)

b) SEA test

[0145] Tokom razvoja humanog PBMC testa, moglo bi se pokazati da samo anti-PD-L1 tretman nije pokrenuo proizvodnju IL-2 ili IFN-γ u odsustvu aktivacije T ćelija, a takođe nije ni pojačao proizvodnju IL-2 u prisustvu optimalne aktivacije . Procenjena je sposobnost anti-PD-L1 da pojača proizvodnju IL-2 pomoću T ćelija koje reaguju na aktivaciju super antigena. Super antigen kao što je stafilokokni enterotoksin A (SEA) može da umreži receptor T ćelija (TCR) i MHC klase II da aktivira CD4 T ćelije. Aktivnost A09-246-2 u zavisnosti od doze za poboljšanje funkcija T ćelija procenjena je nakon takve aktivacije. Serijska razblaženja A09-246-2 inkubirana su sa humanim PBMC u prisustvu SEA tokom 96 sati. Humani IL-2 u supernatantu je meren upotrebom humanog IL-2 ELISA. Rezultati su pokazali anti-PD-L1 efikasno pojačane aktivnosti T ćelija predstavljene produkcijom IL-2 sa EC50 od 0,08 ± 0,03 nM (0,012 /- 0,005 μg / ml)

3.9 Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)

[0146] ADCC je meren upotrebom dve različite humane linije tumora A431 i A549 kao ciljne ćelije i humanog PBMC kao efektorske ćelije. U nekim slučajevima, testovi su izvedeni koristeći ciljne ćelije nakon stimulacije sa interferonom-gama radi povećanja ekspresije PD-L1. Anti-EGFR antitelo,

4

cetuksimab, korišćeno je kao ADCC pozitivna kontrola. S obzirom na činjenicu da alotip Fcyllla receptora 158V pokazuje veći afinitet za humani lgGl i povećava ADCC, posmatrani rezultati su povezani sa alotipom donora.

[0147] ADCC aktivnost A09-246-2 bila je uporediva sa onom posredovanom sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom, indukujući približno 50% maksimalne lize u obe ćelijske linije. Tretman sa INF-γ nije promenio odgovor A431 ćelija za sve testirane različite alotipove (V/V, V/F i F/F). Značajna razlika (gotovo dva puta) između stimulisanih i nestimulisanih ćelija primećena je kada su A549 ćelije korišćene za РВМС od V / V i V / F davalaca. Nije primećen ADCC kada je PBMC od F / F davalaca analiziran sa A549 ćelijama.

4. In vivo aktivnost

[0148] U ovde predstavljenim testiranjima, ispitivana je efikasnost blokade PD-L1 antitela (Ab) na različite mišje modele tumora. Predložena je inhibicija interakcije PD-1 / PD-L1 da bi se postigao terapeutski efekat obnavljanjem odgovora antitumorskih CD8<+>T ćelija, pa su sva preklinička ispitivanja efikasnosti sprovedena na singeničkim mišjim modelima tumora u kojima imuni sistem domaćina je potpuno netaknut. Da bi se zaobišla potreba za surogat antitelom, antitelo korišćeno u ispitivanjima je posebno odabrano za unakrsnu reaktivnost na mišjem PD-L1. Međutim, s obzirom da je antitelo potpuno humano, kod miševa se izaziva neutrališuća imunogenost, što ograničava efektivni period doziranja na period od sedam dana. Uprkos ovom značajnom ograničenju doziranja, izabrano antitelo je pokazalo značajnu aktivnost kao monoterapija i u različitim postavkama kombinovane terapije. Antitumorska aktivnost antitela na PD-L1 pokazala je trend zavisnosti od doze kada se daje kao monoterapija protiv MC38 tumora.

[0149] Imunohistohemijska analiza ekspresije PD-L1 unutar modela responzivnih i neresponzivnih tumora otkrila je snažnu vezu između nivoa ekspresije PD-L1 i nivoa antitumorske efikasnosti. Da bi se potvrdio predloženi mehanizam delovanja (MOA), sprovedena je studija na miševima koji nose MC38 tumor i koji su sistemski osiromašeni od CD8<+>T ćelija. Kod životinja osiromašenih CD8<+>T ćelijama, efikasnost terapije anti-PD-LI u potpunosti je ukinuta, što potvrđuje da je efektorska funkcija citotoksičnih T limfocita (CTL) odgovorna za inhibiciju rasta tumora. Da bi se procenio potencijal kombinacije anti-PD-LI terapije, izabrani su kombinovani partneri koji izazivaju antitumorske odgovore T ćelija ili na drugi način pojačavaju efekte imunoterapije. U kombinaciji sa frakcionisanom radioterapijom protiv MC38 tumora, antitelo na PD-L1 pokazalo je snažnu sinergijsku aktivnost, sa potencijalom za lečenje. Kombinacija sa jednom niskom dozom ciklofosfamida rezultirala je pojačanim antitumorskim efektima u modelu MC-38 koji su bili povezani sa povećanom učestalošću CD8<+>T ćelija specifičnih za tumorski antigen. Terapija anti-PD-L1 značajno je produžila vreme preživljavanja u kombinaciji sa Gemcitabinom u PANC02 ortotopskom tumorskom modelu karcinoma pankreasa. Kada se anti-PD-L1 kombinuje sa predtretmanom ciklofosfamidom, nakon čega sledi vakcinacija Stimuvakom, postignuto je značajno povećanje inhibicije rasta tumora i u MC38/MUC1 i u PANC02 / MUC1 modelima tumora. Značajno povećana efikasnost je takođe primećena kada se antitelo na PD-L1 kombinuje sa osnovnim komponentama FOLFOX režima hemoterapije. Tako je uspešno identifikovano nekoliko obećavajućih kombinacija pristupa anti-PD-L1 terapiji. uključujući tri režima lečenja „standardne nege" (terapija zračenjem; FOLFOX; Gemcitabin).

[0150] Mehanistički podaci izvedeni iz ovih studija pokazali su da je anti-PD-L1 terapija dosledno povezana sa povećanim procentom CD8<+>T ćelija, CD8<+>T efektorskih memorijskih ćelija i PD-1<+>CD8<+>T ćelija u slezini i tumorima tretiranih miševa

4.1 Reakcija na dozu u modelu tumora MC38 i kombinacija sa CPA

[0151] U ovom ispitivanju, miševi su inokulirani subkutano u desni bok sa ćelijama karcinoma debelog creva MC38 kao 1x10<6>. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu od ~50 mm<3>, miševi su sortirani u grupe za lečenje (N= 14) (definisano kao dan ispitivanja 0). Grupama je davan A09-246-2 intravenozno u nivoima doza od 100, 200, 400 ili 800 μg na dan 0, 3 i 6. Kontrolna grupa je tretirana sa 200 μg neaktivnog izotipskog antitela. Tumori su mereni dva puta nedeljno tokom trajanja studije. Sve tretirane grupe pokazale su značajnu efikasnost (P < 0,050) u poređenju sa kontrolnom grupom za izotip. lako grupa u dozi od 800 pg nije pokazala pojačanu efikasnost u odnosu na grupu od 400 pg, primećen je značajan trend ka efektu koji zavisi od doze. U drugoj studiji o odgovoru na dozu koja je sledila isti dizajn, ponovo je primećen opšti trend prema aktivnosti koja zavisi od doze. Međutim, grupa doze od 800 μg u toj određenoj studiji pokazala je znatno nižu antitumorsku aktivnost od grupe koja je uzimala dozu od 400 μg. Nedostatak povećane efikasnosti u dozama iznad 400 μg može ukazivati na plato efikasnosti kao rezultat zasićenja cilja ili se može javiti jači imunogeni efekat kod većih doza, što rezultira manjom izloženošću leku. Pored toga, ove studije su istraživale efikasnost anti-PD-L1 u kombinaciji sa prethodnim tretmanom sa malom imunomodulatornom dozom ciklofosfamida (CPA). Primećeno je da CPA kombinacija značajno poboljšava efikasnost niskih doza anti-PD-L1 (100 μg), a ovaj efekat je povezan sa povećanom učestalošću pl5E tumorskih antigena specifičnih CD8<+>T ćelija, kako je utvrđeno ELISPOT-om. Podaci imunofenotipizacije iz ovih studija otkrili su da je terapija anti-PD-L1 povezana sa značajno povećanim procentom različitih podskupova CD8<+>T ćelija u slezinama: ukupne CD8<+>T ćelije, pl5E tumorske antigene specifične CD8<+>T ćelije, PD-1<+>CD8<+>T ćelije, i ćelije CD8<+>T efektorske memorije (TEM) i CD8<+>T centralne memorije (ТCM). Takođe je primećena povećana intratumoralna akumulacija CD8<+>T ćelija i CD8<+>TEMćelija. Ova zapažanja podržavaju anti-PD-L1 terapiju kao efikasnu strategiju za pokretanje antitumorskih odgovora CD8<+>T ćelija.

4.2 Efikasnost u modelu C1498 / GFP disemniovane leukemije

[0152] Da bi se dobio model diseminovane leukemije, injektirane su ćelije leukemije C4198-GFP (2xl0<4>) i.v. miševima C57BL / 6 na dan 0. Miševi su zatim randomizovani u grupe za tretiranje (N = 5) koje su primile ili dozu od 400 μg anti-PD-L1 Ab (A09-246-2) ili ekvivalentnu dozu neaktivnog izotipa antitela u dane 1,4, i 7, ip injekcijom.

[0153] Primarna završna tačka ovog ispitivanja bilo je preživljavanje na osnovu pojave kliničkih znakova, što ukazuje na metastatsku diseminaciju, što bi osiguralno eutanaziju. Na kraju ispitivanja (76.

dan), 20% miševa (1/5) je još uvek bilo živo u grupi koja je lečena izotipom, a 80% (4/5) preživelih je ostalo u grupi koja je tretirana sa A09-246-2.

4.3 Kombinacija sa gemcitabinom u ortotopskom modelu PANC02.

[0154] Sprovedena su tri odvojena ispitivanja kako bi se ispitala kombinacija anti-PD-L1 MAb (A09-246-2) i Gemcitabina (GEM). Ispitivanja su dizajnirana u cilju istraživanja pozicioniranje anti-PD-L1 terapije u periodu “odmora” od hemoterapije u 21 -dnevnom ili 28-dnevnom ciklusu GEM-a. Ortotopski modeli uključuju inokulaciju tumorskih ćelija u organ porekla, što rezultira bliskom rekapitulacijom napredovanja bolesti kako se to dešava u humanom okruženju. Da bi se dobio model adenokarcinoma pankreasa, ćelije PANC02 (1x10<6>) ubrizgane su u pankreas ženki miševa C57BL / 6. Pet dana kasnije, miševi su randomizovani u grupe za tretiranje. GEM je u svim ispitivanjima doziran kao 150 mg / kg, a A09-246-2 kao 400 μg po mišu. U dva ispitivanja, modelovan je 28-dnevni ciklus GEM-a (primena u danima 5, 19, 26), sa 14-dnevnim periodom odmora tokom kojeg je primenjen A09-246-2 u dane 8, 11, 14. U trećem ispitivanju, modelovan je 21-dnevni ciklus GEM-a (primena u danima 5, 12, 26, 33), sal4-dnevnim periodom odmora tokom kojeg je primenjen A09-246-2 u dane 13, 16,19. Monoterapija GEM-om ili sa anti-PD-L1 nije uspela da produži vreme preživljavanja u ovom modelu. Međutim, u sva tri ispitivanja, kombinacija GEM i A09-246-2 značajno je produžila srednje vreme preživljavanja (P <0,02). Imunofenotipizacija je otkrila nekoliko efekata u grupama koje su primale A09-246-2, i kao monoterapiju i u kombinaciji sa GEM-om, koji su bili u skladu sa predloženim MOA anti-PD-L1, uključujući povećani procenat CD8<+>TEMu slezini, povećani odnos slezine CD8<+>TEMi Tregćelije i povećani procenat PD-1<+>CD8<+>T ćelija slezine. Dalje, imunofenotipizacija limfocita koji se infiltriraju u tumor (TIL) pokazala je značajno povećani procenat CD8<+>TIL u grupi sa kombinacijom.

4.4 Kombinacija sa malim dozama ciklofosfamida (CPA)

[0155] Poznato je da CPA u malim dozama pojačava antitumorski imuni odgovor inhibicijom imunosupresivnih regulatornih T ćelija. lspitan je potencijal za predtretman sa CPA u malim dozama kako bi se povećala efikasnost anti-PD-L 1 Ab (A09-246-2) u modelu MC38 subkutanog tumora. Miševi su inokulirani subkutano u desni bok sa ćelijama karcinoma debelog creva od 1x10<6>MC38. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu od ~50 mm<3>- miševi su sortirani u grupe za tretiranje (N = 14) na dan 0. Kombinovana grupa je primila 100 μg A09-246-2 i.v. injekcija u dane 0, 3 i 6, sa ili bez prethodnog tretmana sa dozom od 100 mg / kg CPA i.v. na dan -1. Kontrolna grupa za lečenje primila je 100 μg neaktivnog izotipskog antitela u kombinaciji sa CPA predtretmanom. Grupa tretirana kombinacijom pokazala je statistički značajno poboljšanje (p <0,050) antitumorske aktivnosti u poređenju sa kontrolnim grupama za izotip i monoterapiju. Korišćenjem ELISPOT testa, izmereni su efekti lečenja na intenzitet odgovora CD8<+>T ćelija usmerenih protiv dobro okarakterisanog antigena pl5E tumora. I CPA i A09-246-2 su pokazali značajno povećane nivoe p15E-reaktivnih CD8<+>T ćelija (~ 100 tačaka u obe grupe) u poređenju sa izotipom kao kontrolom (~ 25 tačaka), dok je kombinacija pokazala dalje poboljšanje (~ 250 tačaka). Dakle, antitumorska efikasnost kombinacije CPA plus A09-246-2 bila je povezana sa povećanom učestalošću CTL reaktivnog tumora- antigena.

4

4.5 Kombinacija sa ciklofosfamidom / stimuvax-om

[0156] Sposobnost blokade PD-L1 da obnovi odgovore antitumorskih T ćelija pruža snažno opravdanje za kombinaciju sa vakcinama protiv raka. Stimuvax je vakcina protiv humanog antigena MUC1, koji je često previše izražen čvrstim tumorima. Miševi transgeni za humani protein MUC1 (MUCl,tg miševi) imunološki su tolerantni na antigen i, kada su inokulirani mišjim tumorima koji takođe eksprimiraju humani MUC1, pružaju relevantan model podešavanja kliničke vakcinacije. U klinici se predtretman ciklofosfamidom (CPA) koristi u kombinaciji sa Stimuvax-om kao strategija za privremeno iscrpljivanje imunosupresivnih Tregćelija koje mogu da inhibiraju odgovor na vakcinu.

[0157] U ovom ispitivanju, MUCl,tg miševa inokulirani su subkutano u desni zadnji bok sa ćelijama karcinoma debelog creva kao Ixl0<6>MC38/MUC1. Pet dana nakon inokulacije ćelija tumora, miševi su randomizovani u grupe za tretiranje (N = 10) na dan -3. Na dan -3, doza CPA od 100 mg / kg primenjena je i.v. administracijom. Vakcinacija je započeta na 0 i ponavljana je nedeljno. Anti-PD-L1 Ab (A09-246-2) je doziran i.p. injekcijom u dane 0, 3 i 6. Tumori su mereni dva puta nedeljno. Kombinacija CPA / Stimuvax i A09-246-2 pokazala je značajno pojačanu (p <0,050) inhibiciju rasta tumora u poređenju sa lečenjem CPA / Stimuvax.

[0158] U drugoj studiji, lxl0<6>PANC02/MUCl ćelija je inokulirano u pankreas MUCl.tg miševa. Četiri dana kasnije, miševi su randomizovani u grupe (N = 8) i započeto je tretiranje. Primenjen je isti raspored tretiranja kao i za prvo ispitivanje. Kombinacija CPA / Stimuvax i anti-PD-L1 (A09-246-2) značajno je povećala srednje vreme preživljavanja (MST) u poređenju sa lečenjem CPA / Stimuvax-om (MST 43.5 dana naspram 70 dana, P = 0,0001). Imunofenotipizacija pomoću FACS pokazala je značajan trend ka povećanom procentu CD8<+>ТEMi CD8<+>Тсм u grupi sa kombinacijom.

4.6 Kombinacija sa frakcionisanom radioterapijom

[0159] Pokazano je da radioterapija (RT) poboljšava imunogenost tumorskih ćelija, povećanom ekspresijom MHC klase 1 i diverzifikacijom intracelularnog peptidnog pula. Da bi se testirao tretman antitela na PD-L1 u kombinaciji sa radioterapijom, MC38 ćelije karcinoma debelog creva (1х10<5>) inokulirane su u desni kvadriceps ženki C57BL / 6 miša. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu od 150 mm<3>, miševi su sortirani u grupe za lečenje (N = 8) na dan 0. Noge sa tumorom su izolovane i tretirane sa 360 cGy gama zračenja iz izvora cezijuma-137, u dane 0, 1,2, 3 i 4 (ukupna doza od 1800 cGy). Anti-PD-Ll Ab (A09-246-2) je doziran i.v. na 400 μg u dane 3, 6 i 9. Kombinacija A09-246-2 i radioterapije rezultiralaje velikom brzinom regresije tumora, što je na kraju dovelo do 6/10 kompletnih odgovora (CR). Miševi sa CR su ponovo izazvani inokulacijom MC38 tumorskih ćelija, a 3/6 miševa je ostalo bez tumora sedamdeset i četiri dana nakon ponovnog izazivanja, što ukazuje da je kombinovanom terapijom generisano efikasno imunološko pamćenje. Suprotno tome, kontrolna grupa koja je lečena izotipskim kontrolnim antitelom u kombinaciji sa zračenjem pokazala je značajnu inhibiciju rasta tumora, ali nije indukovala regresije.

[0160] Izvedeno je ponavljanje studije kombinacije RT i anti-PD-L1 (A09-246-2), uz uključivanje druge grupe kombinovane terapije u kojoj su miševi sistemski CD8<+>T ćelijama. Dodatna imunološka očitavanja izmerena u ovoj studiji uključuju imunofenotipizaciju splenocita zasnovanu na FACS, analizi in vivo proliferacije, i ELISPOT testu. Ponovo, kombinacija je pokazala sinergijsku efikasnost koja je indukovala početnu fazu regresije ili zastoja u svim tumorima. Međutim, potpuna regresija primećena je samo kod 1/8 miševa, dok je još jedan miš doživeo produženi period stagnacije tumora. Iscrpljivanje CD8<+>T ćelija potpuno je anuliralo sinergiju kombinacije, što potvrđuje da mehanizam uključuje stimulaciju odgovora antitumorskih CD8<+>T ćelija. Ovo zapažanje je dodatno podržano povećanom frekvencijom CD8<+>T ćelija reaktivnih na tumorski antigen p15E. Imunofenotipizacija pomoću FACS otkrila je povećani procenat proliferacije CD8<+>T ćelija u slezini i povećani procenat CD8<+>TEMi CD8+ Тсм u slezini.

4.7 Kombinacija sa osnovnim komponentama režima FOLFOX

[0161] FOLFOKS je režim kombinovane hemoterapije, koji se sastoji od folne kiseline, 5-fluorouracila (5-FU) i oksaliplatine (OKS), koji se koristi u lečenju karcinoma debelog creva u stadijumu III. Proučavan je potencijal za kombinovanje anti-PD-L1 sa osnovnim komponentama FOLFOX-a (5-fluorouracil i oksaliplatin) u subkutanom modelu MC38 ćelija karcinoma debelog creva. Miševi su inokulirani subkutano u desni bok sa ćelijama karcinoma debelog creva 1х10<6>MC38. Kada su tumori dostigli srednju zapreminu od ~50 mm<3>, miševi su sortirani u grupe za tretiranje (N = 10) na dan 0. Na dan 0 i 14 primenjeni su 5-FU (60 mg/ kg i.v.) i ОХ (5 mg / kg i.p). Anti-PD-L1 Ab (A09-246-2) (400 μg iv) je dat 3., 6. i 9. dana. Primećeno je da je kotnbinovani tretman imao značajno veću efikasnost (p <0,050) u poređenju sa A09-246-2 koji se daje sam, ili 5-FU i ОХ koji se daju u kombinaciji sa izotipskim antitelom. Izvedeno je ponavljanje ispitivanje kombinacije anti-PD-L1 Ab i FOLFOX i, opet, kombinacija je pokazala značajno veću (p <0,050) antitumorsku aktivnost od bilo kog režima monoterapije.

[0162] Imunofenotipizacija bazirana na FACS sprovedena u ovim studijama otkrila je porast u nekoliko imunoloških markera u skladu sa MOA CD8<+>T ćelija, uključujući povećane nivoe CD8<+>T ćelija specifičnih za antigen pl5E tumora, povećanje odnosa TEMslezene prema regulatornim T ćelijama(Treg), i povećani procenat CD8<+>PD-1<+>T ćelija slezine. Dalje, primećeno je da se u kombinaciji značajno povećava procenat prirodnih ćelija ubica (NK) i CD8<+>T ćelija koje se infiltriraju u tumor.

4.8 Pilot studija toksičnosti sa ponavljanjem doze od 4 nedelje na cinomolgus majmunima [0163] Četiri grupe od 2 mužjaka i 2 ženke cinomolgus majmuna lečene su anti-humanim PD-L1 (A09-246-2) pri nivoima doze 0 (nosač), 20, 60 i 140 mg / kg nedeljnom intravenskom infuzijom od ukupno 5 primena.

[0164] Procena TK pokazuje da su sve životinje bile izložene test materijalu tokom ispitivanja. Nivoi izloženosti povećali su se približno proporcionalno povećanju doze i u 1. i u 4. dozi, bez bilo kakvih relevantnih akumulacija ili polne zavisnosti u bilo kojoj dozi. Antitela na lekove detektovani su kod 2/4 i 1/4 majmuna na nivoima od 20 i 140 mg / kg respektivno. U ispitivanju nije bilo prerane smrti životinja. Nisu zabeležene promene povezane sa lečenjem u grupama za doziranje od 20 i 60 mg / kg za sve parametre procenjene u ispitivanju.

4

[0165] Pri visokoj dozi od 140 mg / kg, nalazi povezani sa tretiranjem uključuju blago smanjenje limfocita u hematološkom ispitivanju, blago smanjenje broja limfocita zajedno sa smanjenjem broja NK ćelija na dan 30 ispitivanja. Nije bilo značajnih histoloških promena u glavnim organima / tkivima, osim umerenog perivaskularnog krvarenja i upale / nekroze sudova primećene na lokalnom mestu ubrizgavanja od 140 mg / kg. Nije primećen jasan trend ili promena u analizi multicitokina na ovom nivou doze. Na osnovu rezultata ove studije identifikovan je nivo bez uočljivih štetnih efekata (NOAEL) kao 140 mg / kg.

[0166] Zaključak: A09-246-2 je tolerisan kod cinomolgus majmuna u nivoima doze do 140 mg / kg nakon što je primio ukupno 5 uzastopnih nedeljnih doza. Reakcije na mestu injekcije sa umerenom težinom potkožnih / perivaskularnih i vaskularnih inflamatornih i degenerativnih promena primećene su pri 140 mg / kg.

4

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo na PD-L1 ili njegov antigen-vezujući fragment koji sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca i lakog lanca, naznačeno time, što:

(a) teški lanac obuhvata HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, pri čemu dalje: (i) sekvenca HVR-H1 je SYIMM (SEQID NO: 15); (ii) sekvenca HVR-H2 je SIYPSGGITFYADTVKG (SEQID NO: 16); (iii) sekvenca HVR-H3 je IKLGTVTTVDY (SEQ ID NO: 17), i

(b) laki lanac obuhvata HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3, pri čemu dalje: (iv) HVR-L1 sekvenca je TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 18); (v) sekvenca HVR-L2 je DVSNRPS (SEQ ID NO: 19); (vi) HVR-L3 sekvenca je SSYTSSSTRV (SEQ ID NO: 20);

pri čemu antitelo ili fragment antitela dalje sadrži:

(a) okvirne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 i HC-FR4, smeštene jedna pored druge između HVRs-a, formirajući tako sekvencu formule: (HC-FR1)-(HVR- H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)- (HVR-H3)-(HC-FR4), i

(b) okvirne sekvence varijabilnog regiona lakog lanca LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 i LC-FR4, smeštene jedna pored druge između HVRs-a, formirajući tako sekvencu formule: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)- (HVR-L3)-(LC-FR4).

2. Antitelo ili fragment antitela prema zahtevu 1, naznačeni time, što

(a) okvirne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca su:

(i) HC-FR1 je EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO:4);

(ii) HC-FR2 je WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 5);

(iii) HC-FR3 je RFT1SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:6);

(iv) HC-FR4 je WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7); i

(b) okvirne sekvence varijabilnog regiona lakog lanca su:

(i) LC-FR1 je QSALTQPASVSGSPGQSITISC (SEQ ID NO: 11);

(ii) LC-FR2 je WYQQHPGKAPKLMIY (SEQ ID NO: 12);

(iii) LC-FR3 je GVSNRFSGSKSGNTASLT1SGLQAEDEADYYC (SEQ 1D NO: 13);

(iv) LC-FR4 je FGTGTKVTVL (SEQ ID NO; 14).

3. Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, naznačeni time, što dalje sadrže CL, CH1 СH2 i СH3 domen.

4. Antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, naznačeni time, što dalje sadrže Humani ili mišji konstantni region, pri čemu konstantni region je IgG1.

5. Kompozicija naznačeni time, što sadrži antitelo na PD-L1 ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-5 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.

6. Antitelo na PD-L1 prema bilo kom od zahteva 1-4, koje indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antigena(ADCC), za upotrebu u lečenju karcinoma, što uključuje davanje subjektu kome je to potrebno efikasnu količinu takvog antitela na PD –L1.

7. Anti-PD-L1 antitelo za upotrebu prema zahtevu 6, naznačeno time, što je rak odabran iz grupe koju čine: rak dojke, pluća, debelog creva, jajnika, melanoma, bešike, bubrega, jetre, pljuvačnih žlezda, stomaka, glioma, štitne žlezde, timusa, epitela, glave i vrata, karcinoma želuca i pankreasa.

8. Antitelo na PD-L1 prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 ili kompozicija prema zahtevu 5, za upotrebu u lečenju tumorskog imuniteta, koja obuhvata sadrži primenu terapeutski efikasne količine takvog antitela na PD-L1 ili kompozicije pacijentu koji pati od tumorskog imuniteta.

9. Antitelo na PD-L1 za upotrebu prema zahtevu 8, naznačeno time, što je tumorska imunost rezultat raka odabranog iz grupe koju čine: rak dojke, pluća, debelog creva, jajnika, melanom, bešike, bubrega, jetre, pljuvačnih žlezda, stomaka, glioma, štitne žlezde, timusa, epitela, glave i vrata, carcinoma želuca i pankreasa.

10. Antitelo na PD-L1 ili kompozicija za upotrebu u skladu sa bilo kojim od zahteva 6 -9, naznačena time, što dalje obuhvata primenu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, izabranog iz grupe koju čine gemcitabin, ciklofosfamid, ili kombinacija 5- fluorouracil i oksaliplatin.

4