RS61868B1 - Predviđanje imunogenosti epitopa t-ćelija - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKO POLJE PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak predikcije epitopa T-ćelija. Konkretno, pronalazak se odnosi na predikciju da li su modifikacije peptida ili polipeptida, kao što su tumorasocirani neoantigeni, imunogene ili ne. Postupci pronalaska mogu se konkretno primeniti za dobijanje vakcina specifičnih prema tumoru pacijenta, u kontekstu personalizovanih vakcina protv kancera.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Personalizovane vakcine protiv kancera su terapeutske vakcine specifično dizajnirane da napadnu tumor-specifične mutacije koje su jedinstvene za pojedinačnog pacijenta. Ovakva terapija i lečenje daju veću nadu obolelima od kancera, jer ne oštećuju zdrave ćelije, pa stoga imaju veći potencijal da donesu trajno izlečenje. Međutim, nije svaka mutacija koja se eksprimira u tumoru pogodna da bude ciljni molekul koji će poslužiti za dizajniranje vakcine. Zapravo, većina kancerskih somatskih mutacija neće inicirati imunski odgovor kada se koristi kao ciljni molekul za vakcinu (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). S obzirom na to da tumori mogu da eksprimiraju i do 100 000 somatskih mutacija (M. R. Stratton, Science Signalling 331, 1553 (2011)), a da vakcina deluje protiv nekoliko epitopa, razvoj uspešne kancerske imunoterapije presudno zavisi od identifikacije onih mutacija koje će verovatno biti imunogene.

[0003] Iz biološke perspektive, da bi jedna somatska mutacija proizvela imunski odgovor, potrebno je da se zadovolji nekoliko kriterijuma; potrebno je da ćelija eksprimira alel koji sadrži tu mutaciju, mutacija treba da bude u protein-kodirajućem regionu gena i ne-sinonimna, potrebno je da translirani protein može da bude isečen proteazomom i da epitop koji sadrži mutaciju bude prezentovan na MHC kompleksu, prezetnovani epitop treba da bude prepoznat od strabe receptora T- ćelija (TCR) i konačno, TCR-pMHC kompleks treba da započne signalnu kaskadu koja će aktivirati T-ćeliju (S. Whelan, N. Goldman, Molecular biology and evolution 18, 691 (2001)). Do sada nije uspostavljen algoritam koji je sa visokom sigurnošću sposoban da predvidi koje će mutacija ispuniti sve navedene kriterijume. U ovom saopštenju razmatramo nekoliko faktora koji mogu da doprinesu imunogenosti, upoređujemo ove faktore sa eksperimentalnim podacima i predložemo jednostavan model za identifikovanje imunogenih mutacija.

Predviđanje MHC vezivanja: Stanje tehnike

[0004] Pre više od dvadeset godina ustanovljeno je da neke amino kiselinske pozicije u MHC-vezujućem peptidu značajnije doprinose njegovoj sposobnosti vezivanja od drugih (na primer, (A. Sette et al., Proceedings of the National Academy of Sciences 86, 3296 (1989))). Identifikovanje i opis ovih “sidrenih” pozicija omogućilo je otkrivanje obrazaca MHC-vezujućih peptida i bilo je osnova za razvijanje postupaka predikcije. Poslednjih godina postignut je značajan napredak u oblasti in silico alata obrade antigena (engl. Antigen Processing Machinery). Dva pionirska pristupa, razvijena u kasnim 1990-tim godinama, BIMAS (K. C. Parker, M. A. Bednarek, J. E. Coligan, The Journal of Immunology 152, 163 (1994)) i SYFPEITHI (H.-G. Rammensee, J. Bachmann, N. P. N. Emmerich, O. A. Bachor, S. Stevanovic, Immunogenetics 50, 213 (1999)), zasnivaju se na poznavanju sidrenih pozicija i izmenjenih alel-specifičnih motiva. Kako se povećavala količina dostupnih eksperimentalnih podataka o MHC-vezujućim peptidima, tako je razvijeno sve više alata koji primenjuju različite statističke i informatičke pristupe (videti preglednu sliku Sl.1). Takozvani matrični postupci zasnivaju se na matricama za skorovanje na bazi specifičnog položaja, kako bi se odredilo da li se sekvenca peptida poklapa sa vezujućim motivom konkretnog MHC alela. Naredna klasa postupaka predikcije MHC vezivanja zasniva se na tehnikama mašinskog učenja, kao što su Artificial Neural Networks ili Support Vector Machines (videti Sl. 1). Učinak ovih algoritama suštinski zavisi od kvantiteta i kvaliteta dostupnih podataka za svaki pojedinačni model alela (na primer, "HLA-A*02:01", "H2-Db" i td), kako bi se “naučili” uzročni obrasci/svojstva peptida koji određuju sposobnost vezivanja. Od nedavno se razvijaju strukturni postupci, koji zaobilaze uska grla prikupljanja velikih setova podataka za učenje, a zasnivaju se na kristalnim strukturama peptid-MHC kompleksa i na bodovanju (skorovanju) (na primer, različite energetske funkcije), kako bi se predvidele interakcije peptida i MHC, na primer, na bazi najniže energije (videti Sl. 1). Tačnost ovih pristupa još uvek je daleko iza postupaka koji se zasnivaju na sekvencioniranju. Referentne studije su pokazale da NetMHC alat zasnovan na veštačkim nervnim mrežama (C. Lundegaard et al., Nucleic Acids Research 36, W509 (2008)) i matrični algoritam SMM (B. Peters, A. Sette, BMC bioinformatics 6, 132 (2005)) imaju najbolji učinak na testovima procene podataka (B.

Peters, A. Sette, BMC bioinformatics 6, 132 (2005); H. H. Lin, S. Ray, S. Tongchusak, E. L. Reinherz, V. Brusic, BMC immunology 9, 8 (2008)). Ova dva pristupa su integrisana u takozvane IEDB konsenzusne postupke, koji su dostupni u okviru Baze podataka imunskih epitopa (Immune Epitope Database; Y. Kim et al., Nucleic Acids Research 40, W525 (2012)). Modelovanje interakcija između peptide i MHC molekula klase II mnogo je složenije od modelovanja interakcija vezivanja peptida sa MHC molekulima klase I, jer u okviru konformacije MHC II molekula postoji vezujući žljeb sa otvorenim krajevima sa obe strane, što omogućava vezivanje peptida različitih dužina. Zbog toga je dužina peptida koji se vezuju za MHC I ograničena na 8-12 amino kiselina, dok dužina peptida koji se vezuju za MHC II značajno varira (9-30 amino kiselina). Nedavne komparativne studije pokazuju da su dostupni postupci predviđanja vezivanja za MHC II ograničene tačnosti u odnosu na predviđanja za MHC I (H. H. Lin, S. Ray, S. Tongchusak, E. L. Reinherz, V. Brusic, BMC immunology 9, 8 (2008)).

[0005] Prva ekstenzivna i sistematska primena navedenih algoritama sa ciljem pronalaženja epitopa T-ćelija, predstavljena je u studiji Moutaftsi et al. (M. Moutaftsi et al., Nature Biotechnology 24, 817 (2006)), u kojoj su različiti alati kombinovani kako bi se predvideli kandidati vakcina za C57BL/6 miševe inficirane vakcinija virusom, ekstrahovali splenociti i izmerio odgovor CD8+ T-ćelija na najboljih 1% predviđenjanih peptida. U ovoj studiji je identifikovano 49 (od 2256) peptida koji su sposobni da indukuju T-ćelijski odgovor. Od tada je publikovano mnogo studija koje su koristile alate za predviđanje vezivanja za MHC, u potrazi za epitopima T-ćelija kao kandidatima za vakcine, uglavnom za patogene, kao što je, na primer, Leishmania major (C. Herrera-Najera, R. Piña-Aguilar, F. Xacur-Garcia, M. J. Ramirez-Sierra, E. Dumonteil, Proteomics 9, 1293 (2009)). Pa ipak, isključiva primena MHC I predikcionih alata za predviđanje imunogenosti može biti nedovoljna, jer su ovi alati naučeni da predvide da neki peptid ima potencijal da se veže za određeni MHC alel. Argument korišćenja MHC-vezujućih predikcija za predviđanje imunogenosti zasniva se na pretpostavci da će peptidi koji sa visokim afinitetom vezuju svoje MHC alele verovatno biti imunogeni (A. Sette et al., The Journal of Immunology 153, 5586 (1994)). Međutim, brojne studije pokazuju da i vezivanje za MHC sa niskim afinitetom može da rezultuje visokom imunogenošću (M. C. Feltkamp, M. P. Vierboom, W. M. Kast, C. J. Melief, Molecular Immunology 31, 1391 (1994)), i da bi stabilnost interakcije između peptide i MHC mogao biti bolji prediktor imunogenosti od afiniteta peptida (M. Harndahl et al., European Journal of Immunology 42, 1405 (2012)). Zbog toga pedviđanja imunogenosti do sada nisu bila sasvim precizna, što za posledicu ima slabu uspešnost predviđanja imunogenosti.Vezivanje peptida je neophodan, ali ne i dovoljan uslov prepoznavanja epitopa T-ćelija, a bolja predikcija može značajno da umanju broj potencijalnih peptida koji treba da budu testirani eksperimentalno. Stoga razvoj modela za predikciju imunogenost treba takođe da uzme u obzir prepoznavanje T-ćelijskog receptora (TCR), kao i fenomen centralne tolerancije, koji podrazumeva negativnu i pozitivnu selekciju T-ćelija tokom sazrevanja u timusu.

[0006] Dokument prethodnog stanja tehnike Castle et al. 2012 (Cancer Res; 72: 1081-1091) opisuje proces selekcije mutacija u cilju potvrđivanja i testiranja imunogenosti. Dokument prethodnog stanja tehnike Nielsen et al. 2007 opisuje bioinformatički postupak koji uzima u obzir sekvence peptida i HLA i daje kvantitativna predviđanja afiniteta peptid-HLA-I interakcije (PLoS ONE 2: e796). Ni jedan od navedenih dokumenata prethodnog stanja tehnike, ne obelodanjuje postupak definisan zahtevima predmente aplikacije.

[0007] Postoji potreba za prediktivnim modelom koji uzima u obzire sve prethodno pomenute aspekte u cilju preciznog predviđanja imunogenosti nekog epitopa, a ne samo afinitet vezivanja.

OPIS

SAŽETAK

[0008] Predmetni pronalak je definisan priključenim zahtevima.

[0009] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak predviđanja imunogenosti amino kiselinskih modifikacija, pri čemu se postupak sastoji od koraka:

a) utvrđivanja skora vezivanja modfikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula, i b) utvrđivanja skora vezivanja ne-modifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula, i/ili

c) utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida, kada se nalazi u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptoa.

[0010] U jednom obliku izvođenja, modifikovani peptid sadrži fragment modifikovanog proteina, gde naznačeni fragment sadrži modifikaciju(e) prisutnu u proteinu. U jednom obliku izvođenja, ne-modifikovani peptid ili protein imaju neizrođenu amino kiselinu(e) na poziciji koja odgovara modifikovanoj poziciji u modifikovanom peptidu ili proteinu.

[0011] U jednom obliku izvođenja, ne-modifikovani peptid ili protein i modifikovani peptid ili protein su identični, sa izuzetkom modifikacije(a). Poželjno, ne-modifikovani peptid ili protein i modifikovani peptid ili protein imaju istu dužinu sekvence i/ili redosled amino kiselina (sa izuzetkom modifikacije(a)).

[0012] U jednom obliku izvođenja, ne-modifikovani peptid i modifikovani peptid imaju 8 do 15, poželjno od 8 do 12 amino kiselina u nizu.

[0013] U jednom obliku izvođenja, jedan ili više MHC molekula obuhvata različite tipove MHC molekula, konkretno, različite alele MHC. U jednom obliku izvođenja, jedan ili više MHC molekula su MHC molekuli klase I i/ili MHC molekuli klase II. U jednom obliku izvođenja, jedan ili više MHC molekula obuhvata set MHC alela, kao što je set ili podset MHC alela jedne osobe.

[0014] U jednom obliku izvođenja, skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula utvrđuje se postupkom koji obuhvata poređenje sekvence sa bazom podataka MHC-vezujućih motiva.

[0015] U jednom obliku izvođenja, korak a) obuhvata utvrđivanje da li navedeni skor zadovoljava prethodno definisanu vrednost praga vezivanja za jedan ili više MHC molekula i/ili korak b) obuhvata utvrđivanje da li navedeni skor zadovoljava prethodno definisanu vrednost praga vezivanja za jedan ili više MHC molekula. U jednom obliku izvođenja, vrednost praga primenjena u koraku a) razlikuje se od vrednosti praga primenjene u koraku b). U jednom obliku izvođenja, prethodno utvrđena vrednost prag vezivanje jednog ili više MHC molekula predstavlja verovatnoću vezivanja za jedan ili više MHC molekula.

[0016] U jednom obliku izvođenja, jedan ili više T-ćelijskih receptora obuhvata set T-ćelijskih receptora jedne osobe ili njihov podset. U jednom obliku izvođenja, korak c) obuhvata pretpostavku da navedeni set T-ćelijskih receptora ne obuhvata T-ćelijske receptore koji vezuju ne-modifikovani peptid, kada se taj peptid nalazi u kompleksu MHC-peptid i/ili ne obuhvata T-ćelijske receptore koji vezuju ne-modifikovani peptid, kada je peptid u kompleksu MHC-peptid visokog afiniteta.

[0017] U jednom obliku izvođenja, korak c) obuhvata utvrđivanje vrednosti skora hemijskih i fizičkih sličnosti ne-modifikovane i modifikovane amino kiseline. U jednom obliku izvođenja, korak c) obuhvata utvrđivanje da li navedeni skor zadovoljava prethodno definisanu vrednost praga hemijskih i fizičkih sličnosti dve amino kiseline. U jednom obliku izvođenja, navedenia vrednost praga hemijskih i fizičkih sličnosti dve amino kiselina reflektuje verovatnoću da su te amino kiseline hemijski i fizički slične. U jednom obliku izvođenja, skor hemijskih i fizičkih sličnosti utvrđen je na osnovu verovatnoće da će te amino kiseline biti međusobno zamenjene u prirodi. U jednom obliku izvođenja, amino kiseline koje se češće međusobno zamenjuju u prirodi, smatraju se međusobno sličnijima i vice versa. U jednom obliku izvođenja, hemijske i fizičke sličnosti se utvrđuju primenom evolucionih logit matrica (log-odd matrice).

[0018] U jednom obliku izvođenja, ukoliko ne-modifikovani peptid ima skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula koji zadovoljava vrednost praga koji ukazuje na vezivanje za jedan ili više MHC molekula, i modifikovani peptid ima skor vezivanja koji zadovoljava vrednost praga koji ukazuje na vezivanje za jedan ili više MHC molekula, modifikacija ili modifikovani peptid se predviđaju kao imunogeni, ukoliko ne-modifikovana i modifikovana amino kiselina imaju skor hemijske i fizičke sličnosti koji zadovoljava vrednost praga koji ukazuje na hemijske i fizičke različitosti.

[0019] U jednom obliku izvođenja, ako se ne-modifikovani peptid vezuje za jedan ili više MHC molekula, ili ima verovatnoću da se veže za jedan ili više MHC molekula, a modifikovani peptid se vezuje za jedan ili više MHC molekula ili ima verovatnoću da se veže za jedan ili više MHC molekula, ta modifikacija ili modifikovani peptid se predviđaju kao imunogeni, ukoliko su nemodifikovana i modifikovana amino kiselina hemijski i fizički neslične ili imaju verovatnoću da su hemijski ili fizičke različite.

[0020] U jednom obliku izvođenja, modifikacija nije na sidrenoj poziciji za vezivanje za jedan ili više MHC molekula.

[0021] U jednom obliku izvođenja, ako ne-modifikovani peptid ima skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula koji zadovoljava vrednost praga koji ukazuje na odsustvo vezivanja za jedan ili više MHC molekula, a modifikovani peptid ima skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula koji zadovoljava vrednost praga vezivanja za jedan ili više MHC molekula, ta modifikacija ili modifikovani peptid se predviđaju kao imunogeni.

[0022] U jednom obliku izvođenja, ako se ne-modifikovani peptid ne vezuje za jedan ili više MHC molekula ili postoji verovatnoća da se ne vezuje za jedan ili više MHC molekula, a modifikovani peptid se vezuje za jedan ili više MHC molekula ili postoji verovatnoća da se vezuje za jedan ili više MHC molekula, ta modifikacija ili modifikovani peptid predviđaju se da su imunogeni.

[0023] U jednom obliku izvođenja, modifikacija je na poziciji sidra za vezivanje jednog ili više MHC molekula.

[0024] U jednom obliku izvođenja, postupak predmetnog pronalaska obuhvata, izvođenje koraka a) na jednom ili više različitih modifikovanih peptida, naznačeno time da dva ili više različitih modifikovanih peptida sadrže istu modifikaciju(e). U jednom obliku izvođenja, dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju(e), sadrže različite fragmente modifikovanog proteina, pri čemu navedeni različiti fragmenti sadrže istu modifikaciju(e) koja se nalazi u proteinu. U jednom obliku izvođenja, dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju(e), sadrže sve potencijalne MHC vezujuće fragmente modifikovanog proteina, pri čemu navedeni fragmenti sadrže istu modifikaciju(e) koja se nalazi u proteinu. U jednom obliku izvođenja, postupak prema pronalasku obuhvata selekciju modifikovanog peptida iz grupe dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže isti modifikaciju(e), gde selektovani peptid ima verovatnoću ili ima najveću verovatnoću vezivanja za jedan ili više MHC molekula. U jednom obliku izvođenja, dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju(e), razlikuju se međusobno po dužini sekvence i/ili poziciji modifikacije(a).

[0025] U jednom obliku izvođenja, postupak pronalaska obuhvata izvođenje koraka a) i, opciono jednog ili oba koraka b) i c), na jednom ili više različitih modifikovanih peptida. U jednom obliku izvođenja, navedena dva ili više različitih modifikovanih peptida sadrže istu modifiakciju(e) i/ili sadrže različite modifikacije. U jednom obliku izvođenja, različite modifikacije prisutne su u istim i/ili različitim proteinima. Set od dva ili više različitih modifikovanih peptida primenjenih u koraku a) i opciono, u jednom ili oba koraka b) i c), mogu biti isti ili različiti. U jednom obliku izvođenja, set od dva ili više različitih modifikovanih peptida korišćenih u koraku b) i/ili koraku c) predstavljaju podset seta od dva ili više različitih modifikovanih peptida primenjenih u koraku a). Poželjno je da navedeni podset obuhvata peptid(e) sa najboljim skorom utvrđenim u koraku a).

[0026] U jednom obliku izvođenja, postupak prema pronalasku obuhvata upoređivanje skorova dva ili više različitih modifikovanih peptida. U jednom obliku izvođenja, postupak obuhvata rangiranje dva ili više različitih modifikovanih peptida. U jednom obliku izvođenja, skor vezivanja modifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula ponderiše se u većoj meri od skora vezivanja modifikovanog peptida, kada se nalazi u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, poželjno skor hemijskih i fizičkih sličnosti ne-modifikovane i modifikovane amino kiseline i skor vezivanja modifikovanog peptida, kada je u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, poželjno skor hemijske i fizičke sličnosti nemodifikovane i modifikovane amino kiseline ponderiše se u većoj meri od skora vezivanja nemodifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula.

[0027] U jednom obliku izvođenja, postupak dalje obuhvata identifikovanje ne-sinonimnih mutacija u jednom ili više protein-kodirajućih regiona.

[0028] U jednom obliku izvođenja, modifikacije se identifikuju prema pronalasku, delimičnim ili potpunim sekvencioniranjem genoma ili transkriptoma jedne ili više ćelija, kao što su jedna ili više kancerskih ćelija i opciono, jedna ili više ne-kancerskih ćelija, i identifikovanjem mutacija u jednom ili više protein-kodirajućih regiona.

[0029] U jednom obliku izvođenja, navedene mutacije su somatske mutacije. U jednom obliku izvođenja, navedene mutacije su kancerske mutacije.

[0030] U jednom obliku izvođenja, postupak se koristi za dobijanje vakcine. U jednom obliku izvođenja, vakcina je dobijena korišćenjem modifikacije(a) ili modifikovanog peptida, koji su prema pronalasku predviđeni da su imunogeni.

[0031] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja vakcine, koji obuhvata naredne korake: identifikovanje modifikacije(a) ili modifikovanog/ih peptida, koji su prema pronalasku predviđeni kao imunogeni.

[0032] U jednom obliku izvođenja, postupak dalje obuhvata:

Dobijanje vakcine koja sadrži peptid ili polipeptid koji obuhvata modifikaciju(e), odnosno, modifikovani peptid koji je predviđeno da je imunogen, ili nukleinsku kiselinu koja kodira taj peptid ili polipeptid.

[0033] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje vakcinu koja se može dobiti primenom postupaka prema pronalasku. Dalje su opisani poželjni oblici izvođenja vakcina prema pronalasku.

[0034] Vakcina prema pronalasku može da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i može, opciono, da sadrži jedan ili više adjuvansa, stabilizatora i td. Vakcina može biti u formi terapeutske ili profilaktičke vakcine.

[0035] Naredni aspekt se odnosi na postupak indukcije imunskog odgovora pacijenta, koji obuhvata administraciju vakcine koja je obezbeđena prema pronalasku.

[0036] Naredni aspekt se odnosi na postupak lečenja pacijenta obolelog od kancera, koji obuhvata sledeće korake:

(a) dobijanje vakcine postupkom prema pronalasku; i

(b) administriranje naznačene vakcine pacijentu.

[0037] Naredni aspekt se odnosi na postupak lečenja pacijenta obolelog od kancera, koji obuhvata administriranje vakcine prema pronalsku tom pacijentu.

[0038] U narednim aspektima, pronalazak obezbeđuje opisane vakcine za primenu u postupcima lečenja ili prevencije kancera.

[0039] Opisani tretman kancera može se kombinovati sa hirurškim zahvatom i/ili radijacijom i/ili tradicionalnom hemoterapijom.

[0040] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska biće objašnjene u narednom detaljnom opisu i pridruženim zahtevima.

DETALJAN OPIS

[0041] Iako je predmetni pronalazak detaljno opisan, smtarće se da pronalazak nije ograničen konkretnim opisama primenjeni postupaka, protokola i korišćenim reagensima, jer oni mogu da variraju. Takođe treba da se razume da korišćena terminologija ima za cilj da opiše konkretne oblike izvođenja, a ne da ograniči domet predmetnog pronalaska, koji je isključivo definisan pridruženim zahtevima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni termini imaju značenja koja su uobičajena u stanju tehnike.

[0042] U narednom tekstu biće opisani elementi predmetnog pronalaska. Ovi elementi su navedeni uz specifične oblike izvođenja, ali se može smatrati da se elementi mogu kombinovati na bilo koji način, kako bi se kreirali novi oblici izvođenja. Dostupne primere i poželjne oblike izvođenja ne treba tumačiti kao ograničenja predmetnog pronalaska na eksplicitno opisane oblike izvođenja. Ovaj opis treba da podrži i obuhvati i one oblike izvođenja koji eksplicitno kombinuju opisane oblike izvođenja, uz svaki broj obelodanjenih i/ili poželjnih elemenata. Dalje, smatra se das u opisom predmetne prijave obuhvaćene i izmene i kombinacije opisanih elemenata aplikacije, ukoliko kontekts ne ukazuje na nešto drugo.

[0043] Poželjno, termini koji su korišćeni u ovoj prijavi definisani su u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland.

[0044] U izvođenju predmetnog pronalaska biće primenjene, ukoliko nije drugačije naznačno, konvencionalne metode biohemije, ćelijske biologije, imunologije i rekombinante DNK tehnologije, opisane u referentnoj literaturi u ovim oblastima (uporediti na primer, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0045] U celoj specifikaciji i zahtevima koji je prate, ukoliko konkteks ne zahteva drugačije, reč “sadrži” i varijacije kao što su “sadrže” i “koje sadrže”, ukazuju na uključenost navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova celih brojeva ili koraka, a ne na isključenost nekog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, mada u nekim oblicima izvođenja, taj član, ceo broj ili korak, ili grupa članova, celih brojeva ili koraka može biti isključena, to jest, značenje se sastoji od uključivanja navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Termini “neki”, “neka”, “neko” i “taj” i slično, koji se ovde koriste u opisivanju pronalaska (naročito u kontekstu zahteva), odnose se na jedninu i množinu, ukoliko nije drugačije naznačeno, ili jasno negirano kontekstom. Navođenje opsega vrednosti ima za cilj da posluži kao skraćeni metod individualnog ukazivanja na posebne vrednosti unutar datog opsega. Ukoliko nije drugačije naznačeno, ukoliko je navedena, svaka pojedinačna vrednost je sastavni deo opisa.

[0046] Svi opisani postupci mogu se izvesti neki od pogodnih načina, osim ukoliko nije jasno drugačije naznačeno, ili negirano kontekstom. Primena svakog ili svih primera, ili reprezentativnih reči (na primer, “kao što je”), ima za cilj da bolje ilustruje pronalazak, a ne da nametne ograničenja domena pronalaska. Ni jedna reč u opisu ne treba da se tumači kao indikator nekog esencijalnog elementa realizacije pronalaska, ako nije obuhvaćena zahtevima.

[0047] Prema predmentom pronalasku, termin "peptid" odnosi se na supstance koje sadrže dva ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, ili poželjnije, 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i poželjno do 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, konkretno 100 amino kiselina, međusobno kovalentno povezanih peptidnim vezama. Termin "polipeptid" ili "protein" odnose se na velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 amino kiselinskih ostataka, ali u načelu, termini "peptid", "polipeptid" i "protein" su sinonimi i koriste se naizmenično.

[0048] Prema predmetnom pronalasku, termin "modifikacija" u kontekstu peptida, polipeptida ili proteina, odnosi se na izmenu sekvence peptida, polipeptida ili proteina u odnosu na prvobitnu sekvencu, kao što je sekvenca neizrođenog (“wild type”) peptida, polipeptida ili proteina. Ovaj termin obuhvata varijante nastale insercijom amino kiseline, varijante nastale adicijom amino kiseline, varijante nastale delecijom amino kiseline, varijante nastale supstitucijom amino kiseline, poželjno varijante nastale supstitucijom amino kiseline. Sve navedene promene sekvence, prema pronalasku, mogu potencijalno da kreiraju novi epitope.

[0049] Varijante nastale insercijom amino kiseline obuhvataju varijante nastale insercijom jedne ili više amino kiselina u konkretnu amino kiselinsku sekvencu.

[0050] Varijante nastale adicijom amino kiseline obuhvataju varijante nastale dodavanjem jedne ili više amino kiselina, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više amino kiselina.

[0051] Varijante nastale delecijom amino kiselina odlikuju se uklanjanjem jedne ili više amino kiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 4 ili 5, ili više amino kiselina.

[0052] Varijante nastale supstitucijom amino kiseline odlikuju su zamenom najmanje jedne amino kiseline u sekvenci i ugrađivanjem druge amino kiseline na isto mesto.

[0053] Prema pronalasku, modifikacija ili modifikovani peptid primenjen u testiranju postupaka prema pronalasku, mogu se dobiti od proteina koji sadrži modifikaciju.

[0054] Termin "dobijen" označava prema pronalasku, da je specifičan entitet, konkretno, neka peptidna sekvenca prisutna u izvoru iz kojeg je dobijena. U slučaju amino kiselinskih sekvenci, posebno u slučaju nekih regiona sekvenci, “dobijen” posebno označava da je relevantna sekvenca amino kiselina dobijena iz amino kiselinske sekvence u kojoj je prisutna.

[0055] Protein koji sadrži modifikaciju, a iz kojeg je dobijena modifikacija ili modifikovani peptid korišćen za testiranje u postupcima prema pronalasku, može biti neoantigen.

[0056] Prema pronalasku, termin "neoantigen" odnosi se na peptid ili protein, koji sadrži jednu ili više amino kiselinskih modifikacija u odnosu na polazni peptid ili protein. Na primer, neoantigen može biti tumor-asocirani neoantigen, naznačeno time da termin “tumor-asocirani neoantigen” obuhvata peptid ili protein koji sadrži amino kiselinsku modifikaciju do koje je došlo usled tumor-specifične mutacije.

[0057] Prema pronalasku, termini "tumor-specifična mutacija" ili "kancer-specifična mutacija" odnose se na somatsku mutaciju koja je prisutna u nukelinskoj kiselini tumorske ili kancerske ćelije, a odsutna je u nukleinskoj kiseline odgovarajuće normalne, odnosno, ne-tumorske ili nekancerske ćelije. Termini "tumor-specifična mutacija" i "tumorska mutacija" i termini "kancerspecifična mutacija" i "kancerska mutacija" međusobno su sinonimni.

[0058] Termin "imunski odgovor" odnosi se na integrisani telesni odgovor usmeren prema ciljnom molekulu, kao što je antigen i poželjno, na ćelijski imunski odgovor ili na ćelijski i humoralni imunski odgovor. Imunski odgovor može biti protektivan/preventivan/profilaktički i/ili terapeutski.

[0059] "Indukovanje imunskog odgovora" može da znači da pre indukcije nije bilo imunskog odgovora, ali može takođe da znači da je pre indukcije postojao neki stepen imunskog odgovora, koji je nakon indukcije pojačan. Dakle, “indukcija imunskog odgovora” takođe obuhvata i frazu “pojačavanje imunskog odgovora”. Poželjno, nakon indukcije imunskog odgovora kod subjekta, navedeni subjekt je zaštićen od razvoja bolesti, kao što je kancer, ili je indukcijom imunskog odgovora njegovo patološko stanje ublaženo. Na primer, imunski odgovor usmeren prema tumoreksprimiranom antigenu može se indukovati kod pacijenta koji ima kancer ili kod subjekta kod kojeg postoji rizik od razvoja kancera. Indukcija imunskog odgovora u ovom slučaju može da znači da je patološko stanje pacijenta ublaženo, da subjekt ne razvija metastaze ili da subjekt kod kojeg je postojao rizik od razvoja kancera, ne razvija kancersku bolest.

[0060] Termini "ćelijski imunski odgovor" i "ćelijski odgovor" i slični termini odnose se na imunski odgovor usmeren prema ćelijama, naznačen time da se ćelije odlikuju prezentacijom antigena klasi I ili klasi II MHC molekula koje uključuju T-ćelije ili T-limfocite, a koje deluju kao “pomoćnici” ili “ubice”. Pomoćničke T-ćelije (takođe označene kao CD4+ T-ćelije), igraju centralnu ulogu u regulaciji imunskog odgovora, dok ćelije-ubice (takođe označene kao citotoksične T-ćelije, citolitičke T ćelije, CD8+ T-ćelije ili CTL), ubijaju obolele ćelije, kao što su kancerske ćelije i sprečavaju nastanak novih obolelih ćelija. U poželjnim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata stimulaciju anti-tumorskog CTL odgovora usmerenog protiv tumorskih ćelija koje eksprimiraju jedan ili više tumor-asociranih antigena i poželjno, prezentaciju ovih tumor-asociranih antigena klasi I MHC molekula.

[0061] "Antigen" prema predmetnom pronalasku označava svaku supstancu, poželjno peptid ili protein, koja je meta i/ili indukuje imunski odgovor, kao što je specifična reakcija antitela ili T-limfocita (T-ćelija). Poželjno, antigen sadrži najmanje jedan epitop, kao što je epitop koji prepoznaje T-ćelija. U kontekstu sadašnjeg pronalaska, poželjno je da je antigen molekul koji, nakon obrade, indukuje imunsku reakciju specifičnu za antigen (uključujući i ćelije koje eksprimiraju dati antigen). Antigen ili epitop T-ćelija prezentovan je od strane ćelije, poželjno, od strane antigen-prezentujućih ćelija, što može biti obolela ćeliju, konkretno, kancerska ćelija, u kontekstu MHC molekula, što rezultira imunskim odgovorom usmerenim protiv antigena (kao i protiv ćelija koje eksprimiraju antigen).

[0062] U jednom obliku izvođenja, antigen je tumor-antigen (takođe označen kao tumoreksprimiran antigen), odnosno, deo tumorske ćelije, na primer, neki protein ili peptid eksprimiran u tumorskoj ćeliji, u njenoj citoplazmi, ćelijskoj membrani ili u jedru, na primer, unutarćelijski ii površinski antigeni tumorskih ćelija. Na primer, tumor-antigeni obuhvataju karcino-embrionalni antigen, α1-fetoprotein, izoferitin i fetalni sulfoglikoprotein, α2-H-feroprotein i γ-fetoprotein. Prema predmetnom pronalasku, tumor-antigen je svaki antigen koji se eksprimira u tumorskoj ćeliji, i opciono je karakterističan u odnosu na tip i/ili nivo ekspresije tumora ili kancera, i za tumorsku ili kancersku ćeliju, odnosno, to je tumor-asocirani antigen. U jednom obliku izvođenja, termin “tumor-asocirani antigen” odnosi se na proteine koji su pod normalnim uslovima eksprimirani u malom broju tkiva i/ili organa ili se eksprimiraju samo tokom određenih razvojnih stadijuma, na primer, tumor-asocirani antigeni mogu pod normalnim uslovima biti eksprimirani u tkivu želuca, na primer, u sluzokoži želuca, u reproduktivnim organima, na primer, testisu, tkivu trofoblasta, na primer, u placenti ili u germinativnoj ćelijskoj liniji, ali se eksprimiraju, odnosno, aberantno se eksprimiraju u jednom ili više tumorskih ili kancerskih tkiva. U ovom kontekstu, “mali broj” poželjno označava ne više od 3, poželjnije ne više od 2 tkiva/organa. Tumor-antigeni u kontekstu predmetnog pronalaska, obuhvataju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno ćelijski specifične antigene diferencijacije, na primer, proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u određenim tipovima ćelija na određenom stupnju diferencijacije, kancerski/testis antigene, odnosno, proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima i nekad u placenti, i antigene specifične za germinativne ćelije. Poželjno je da se kancerske ćelija može identifikovati ekspresijom tumorantigena ili aberantnom ekspresija tumor-antigena. U kontekstu predmetnog pronalaska, poželjno je da je tumor-antigen koji se eksprimira u kancerskoj ćeliji subjekta, odnosno, kod pacijenta obolelog od kancera, sopstveni (self) protein kod datog subjekta. U poželjnim oblicima izvođenja, tumor-antigen u kontekstu predmetnog pronalaska se pod normalnim uslovima specifično eksprimira u tkivu i organu koji nije esencijalan, na primer, u tkivima ili organima, koji kada su oštećeni od strane imunskog sistema ne dovode do smrti subjekta ili u organima ili strukturama tela koje nisu lako dostupne imunskom sistemu.

[0063] Prema pronalasku, termini "tumor-antigen", "tumor-eksprimirani antigen", "kancerski antigen" i "kancer-eksprimriani antigen" međusobno su ekvivalentni i sinonimni.

[0064] Termin "imunogenost" odnosi se na relativnu efikasnost indukcije imunskog odgovora koji je povezan sa lečenjem, kao što je terapija kancera. U značenju koje je ovde primenjeno, termin "imunogenost" se odnosi na svojstvo ispoljavanja imunogenosti. Na primer, termin ”imunogena modifikacija”, kada se koristi u kontekstu peptida, polipeptida ili proteina, odnosi se na sposobnost da navedeni peptid, polipeptid ili protein indukuju imunski odgovor koji je uzrokovan i/ili uslovljen navedenom modifikacijom. Poželjno je da ne-modifikovani peptid, polipeptid ili protein ne indukuju imunski odgovor, da indukuju drugačiji imunski odgovor ili da indukuju drugačiji nivo, poželjno niži nivo imunskog odgovora.

[0065] Termini "glavni kompleks tkivne podudarnosti" i skraćenica "MHC" obuhvataju MHC molekule klase I i MHC molekule klase II, i odnose se na kompleks gena koji postoji kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli važni su u signalizaciji između limfocita i antigenprezentujućih ćelija ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, naznačeno time da MHC protein ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih kako bi oni bili prepoznati od strane T-ćelijskih receptora. Proteini kodirani MHC genima eksprimiraju se na površini ćelija i prezentuju T-ćelijama selfantigene (peptidne fragmente iz samih ćelija) ili non-self antigene (na primer, fragmente mikroorganizama).

[0066] MHC kompleks podeljen je u tri podgrupe, klase I, klase II i klase III. Proteini MHC klase I sadrže α-lanac i β2-mikroglobulin (koji nije kodiran genima MHC kompleksa na hromozomu 15). Ovi proteini prezentuju fragmente antigena citotoksičnim T-ćelijama. Na većini ćelija imunskog sitema, konkretno, na antigen-prezentujućim ćelijama eksprimirani su proteini MHC klase II, koji sadrže sadrže α- i β-lanac, i ovi molekuli prezentuju fragmente antigena pomoćničkim T-ćelijama. MHC molekuli klase III kodiraju druge imunske komponente, kao što su komponente komplementa i neke od citokina.

[0067] MHC kompleks je poligenski (postoji nekoliko gena za molekule MHC klase I i MHC klase II) i polimorfan kompleks (postoji više alela svakog od gena).

[0068] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "haplotip" odnosi se na HLA alele koji se nalaze na jednom hromozomu i na proteine koje ovi aleli kodiraju. Haplotip može takođe da se odnosi na alele prisutne na svakom lokusu MHC. Svaka klasa MHC ima nekoliko lokusa: na primer, HLA-A (Humani leukocitni antigen-A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLAH, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P i HLA-V za klasu I i HLA-DRA, HLA-DRB 1-9, HLA-, HLA-DQA1, HLA-DQB 1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA, i HLA-DOB za klasu II. Termini "HLA alel" i "MHC alel" su sinonimni.

[0069] MHC molekili ispoljavaju ogroman polimorfizam:na svakom genskom lokusu u humanoj populaciji, postoji veliki broj haplotipova koji sadrže različite alele. Različiti polimorfni MHC aleli obe klase I i II, ispoljavaju različitu specifičnost prema peptidima: svaki alel kodira više proteina koji vezuju peptide čije sekvence imaju sličnu molekulsku matricu.

[0070] U jednom poželjnom obliku izvođenja svih aspekata pronalaska, MHC molekul je HLA molekul.

[0071] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin “MHC-vezujući peptid”, obuhvata peptide koje vezuju MHC molekule klase I i/ili klase ili peptide koji mogu da se obrade tako da daju vezujuće peptide MHC molekula klase i i klase II. U slučaju kompleksa MHC molekula klase I/peptid, vezujući peptidi tipično imaju dužinu od 8-12, poželjno 8-10 amino kiselina, iako i kraći i duži peptidu mogu biti vezani. U slučaju kompleksa MHC molekul klase II /peptid, vezujući peptidi tipično imaju 9-30, poželjno 10-25 amino kiselina u nizu, konkretno 13-18 amino kiselina, mada i kraći i duži peptidi mogu biti vezani.

[0072] Peptid koji će biti direktno prezentovan, odnosno, bez obrade, i posebno, bez isecanja, ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, konkretno za MHC molekul klase I, i poželjno ima 7-30 amino kiselina, na primer, 7-20 amino kiselina, poželjnije 7-12 amino kiselina, poželjnije 8 -11 amino kiselina, konkretno, 9 ili 10 amino kiselina.

[0073] Ako je peptid deo većeg entiteta koji sadrži dodatne sekvence, na primer, sekvencu ili polipeptid vakcine, i treba da bude prezentovan nakon obrade, konkretno nakon isecanja, peptid koji će nastati obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje MHC molekula, konkretno MHC molekula klase I, i poželjno ima 7-30 amino kiselina, na primer, 7-20 amino kiselina, poželjnije 7-12 amino kiselina, još poželjnije 8-11 amino kiselina, konkretno 9 ili 10 amino kiselina u nizu. Poželjno je da je sekvenca peptida koji će biti prezentovan nakon obrade dobijena od amino kiselinske sekvence antigena ili polipeptida koji se koristi u vakcinaciji, to jest, da njegova sekvenca suštinski odgovara ili da je potpuno identična fragmentu antigena ili polipeptida.

[0074] Stoga, MHC vezujući peptid u jednom obliku izvođenja obuhvata sekvencu koja se suštinski poklapa ili je identična fragmentu antigena.

[0075] Termin "epitop" odnosi se na antigenu determinantu molekula, kao što je neki antigen, odnosno, na deo molekula koji je prepoznat od strane imunskog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane T-ćelija, konkretno, kada se prezentuje u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina, na primer, tumor-antigena, poželjno sadrži kontinualni ili diskontinuanli deo molekula navedenog proteina, i poželjno je da je taj deo od 5 do 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 amino kiselina u nizu, na primer, epitop može biti sačinjen od 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 amino kiselina. Naročito je poželjno da je epitop u kontekstu predmetnog pronalaska, epitop T-ćelija.

[0076] Prema pronalasku, epitop može da bude vezan od strane MHC molekula, kao što su MHC molekuli na površini ćelije, pa stoga može biti “MHC-vezujući peptid”.

[0077] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "neo-epitop" odnosi se na epitop koji nije prisutan u ćelijama, na primer, u normalnim ne-kancerskim ćelijama ili u liniji germinativnih ćelija, ali se nalazi u kancerskim ćelijama. Neo-epitop uključuje i slučajeve u kojima se epitop eksprimiran i u normalnim ne-kancerskim ćelijama ili germinativnim ćelijama, ali se usled jedne ili više mutacija u kancerskoj ćeliji, sekvenca epitopa menja, pa zbog izmene nastaje neo-epitop.

[0078] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "T-ćelijski epitop" odnosi se na peptid koji je vezan od strane MHC molekula, u konfiguraciji koju prepoznaje T-ćelijski receptor. Uobičajeno, T-ćelijski epitopi prezentuju se na površini antigen-prezentujućih ćelija.

[0079] U značenju kako je ovde primenjeno, termin "predviđanje T-ćelijskih epitopa" odnosi se na predikciju da li će peptid biti vezan od strane MHC molekula i da li će biti prepoznat od strane T-ćelijskog receptora. Fraza “predviđanje T-ćelijskog epitopa” ima suštinski sinonimno značenje kao fraza “predikcija imunogenosti peptida”.

[0080] Prema pronalasku, T-ćelijski epitop može biti prisutan u vakcini, kao deo većeg entiteta, kao što je sekvenca i/ili polipeptid vakcine, u kojem se nalazi više od jednog T-ćelijskog epitopa. Takav prezentovani peptid ili T-ćelijski epitop nastaje nakon odgovarajuće obrade.

[0081] Epitopi T-ćelija mogu se modifikovati na jednoj ili više amino kiselina koje nisu esencijalne za prepoznavanje od strane TCR ili za vezivanje od strane MHC. Ovako modifikovani epitopi T-ćelija mogu se smatrati imunološki ekvivalentnima.

[0082] Poželjno je da je epitop T-ćelije, kada je prezentovan od strane MHC i prepoznat od strane T-ćelijskog receptora, sposoban da indukuje, u prisustvu odgovarajućih ko-stimulatornih signala, klonsku ekspanziju T-ćelija koje na sebi imaju eksprimiran T-ćelijski receptor koji specifično prepoznaje peptid/MHC kompleks.

[0083] Poželjno je da T-ćelijski epitop sadrži amino kiselinsku sekvencu koja suštinski odgovara amino kiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno je da je navedeni fragment antigena, peptid prezentovan od strane MHC molekula klase I i/ili klase II.

[0084] Poželjno je da je epitop T-ćelije deo ili fragment antigena, sposoban da stimuliše imunski odgovor, i to, ćelijski imunski odgovor usmeren prema tom antigenu ili ćeliji koja ga eksprimira, i da prezentuje antigen, kao što je antigen obolele ćelije, konkretno, kancerske ćelije. Poželjno je da je T-ćelijski epitop sposoban da stimuliše ćelijski odgovor usmeren prema ćeliji koja prezentuje taj antigen sa MHC molekulom klase I, i da stimuliše antigen-reaktivne citotoksične T-limfocite (CTL).

[0085] "Obrada antigena" ili "obrada", odnosi se na isecanje peptida, polipeptida ili proteina na odgovarajuće proizvode, odnosno, fragmente navedenog peptida, polipeptida ili proteina (na primer, putem isecanja polipeptida u peptid), i na asocijaciju jednog ili više fragmenata (na primer, vezivanjem), sa MHC molekulima, kako bi bili prezentovani od strane ćelija, poželjno, od strane antigen-prezentujućih ćelija, specifičnim T-ćelijama.

[0086] "Antigen-prezentujuće ćelije" (APC) su ćelije koje zajedno sa MHC molekulima na svojoj površini, prezentuju peptidne fragmente antigena. Neke APC ćelije mogu aktivirati antigenspecifične T-ćelije.

[0087] Specijalizovane antigen-prezentujuće ćelije veoma su efikasne u internalizaciji antigena u ćeliju, bilo posredstvom fagocitoze ili receptorom-posredovane endocitozom, a zatim u izlaganju fragmenata antigena, vezanog za MHC molekul klase II, na svojoj membrani. T-ćelija prepoznaje i stupa u interakciju sa kompleksom antigen-MHC molekul klase II, na membrani antigenprezentujuće ćelije. Tada u antigen-prezentujućim ćelijama nastaje dodatni ko-stimulatorni signal, što dovodi do aktivacije T-ćelija. Ekspresija ko-stimulatornih molekula ključna je odlika profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija.

[0088] Osnovni tipovi antigen-prezentujućih ćelija su: dendritske ćelije, koje imaju najširi opseg prezentacije antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, zatim, makrofagi, B-ćelije i neke epitelne ćelije. Dendritske ćelije (DC) čine populaciju leukocita, čija je uloga da antigene uhvaćene u perifernim tkivima prezentuju T-ćelijama, posredstvom antigenprezentujućih puteva obe klase MHC molekula I i II. Poznato je da su dendritske ćelije snažni induktori imunskih reakcija i da aktivacija ovih ćelija predstavlja kritičan događaj u indukciji anti-tumorskog imuniteta. Dendritske ćelije obično se dele na “nezrele” i “zrele”, što je jednostavan način da se razlikuju dva dobro okarakterisana fenotipa ovih ćelija. Međutim, ova podela ne treba da ograniči sve moguće intermedijarne faze diferencijacije dendritskih ćelija. Odlika nezrelih dendritskih ćelija je da su to antigen-prezentujuće ćelije sa visokim kapacitetom preuzimanja i obrade antigena, što korelira sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i receptora za manozu. Fenotip zrele ćelije tipično se odlikuje niskom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom površinskih molekula, odgovornih za aktivaciju T-ćelija, kao što su MHC molekuli klase I i klase II, adhezioni molekuli (na primer, CD54 i CD11) i ko-stimulatorni molekuli (na primer, CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB). Sazrevanje dendritskih ćelija predstavlja stepen njihove ćelijske aktivacije na kojem antigen-prezentujuća ćelija vodi ka pripremi naivnih T-ćelija za aktivaciju, dok prezentacija od strane nezrelih dendritskih ćelija rezultira tolerancijom. Sazrevanje dendritskih ćelija pretežno je izazvano biomolekulima sa mikrobnim svojstvima koje detektuju urođeni receptori (bakterijska DNK, viralna RNK, endotoksin, i td), pro-inflamatorni citokini (TNF, IL-1, IFNs), ligacija CD40 na površini dendritskih ćelija od strane CD40L, i supstance oslobođenje iz ćelija koje podležu nekrozi. Dendritske ćelije se mogu dobiti kultivisanjem ćelija koštane srži sa citokinima in vitro, kao što su granulocitni-makrofagni faktor stimulacije kolona (GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.

[0089] Ne-profesionalne antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno proteine MHC klase II, koji se neophodni za interakciju sa naivnim T-ćelijama; ovi proteini se eksprimiraju nakon stimulacije ne-specijalizovanih antigen-prezentujućih ćelija nekim citokinima, kao što je IFNγ.

[0090] Antigen-prezentujuće ćelije mogu se obložiti peptidima prezentovanim od strane MHC molekula klase I, transdukcijom ćelija nukleinskom kiselinom, poželjno RNK, koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži peptid koji treba da bude prezentovan, na primer, nukleinsku kiselinu koja kodira antigen ili polipeptid koji se koristi u vakcini.

[0091] U nekim oblicima izvođenja, farmaceutska kompozicija ili vakcina koja sadrži nosač nukleinske kiseline koji ciljano deluje na dendritske ili druge antigen-prezentujuće ćelije, može se administrirati pacijentu, što će dovesti do transfekcije in vivo. Transfekcija dendritskih ćelija in vivo, može se načelno sprovesti primenom postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što su oni opisani u WO 97/24447, ili primenom postupka genskog pištolja, koji je opisan od Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456-460, 1997.

[0092] Prema pronalasku, termin "antigen-prezentujuća ćelija" takođe obuhvata ciljnu ćeliju.

[0093] "Ciljna ćelija" označava ćeliju prema kojoj je usmeren imunski odgovor, na primer, ćelijski imunski odgovor. Ciljne ćelije uključuju ćelije koje prezentuju antigen, odnosno, peptidni fragment koji je dobijen od antigena, i obuhvataju neželjene ćelije, kao što je kancerska ćelija. U poželjnim oblicima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira antigen, kao što je opisano, poželjno prezentuje antigen sa MHC molekulom klase I.

[0094] Termin "deo" označava frakciju. U odnosu na konkretnu strukturu, kao što je amino kiselinska sekvenca ili protein, termin “deo” označava kontinualnu ili diskontinualnu frakciju navedene strukture. Poželjno, deo amino kiselinske sekvence obuhvata najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, još poželjnije najmanje 60%, još poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije, najmanje 90% amino kiselina naznačene amino kiselinske sekvence. Ako je deo diskontinualna frakcija, navedena diskontinualna frakcija sačinjena je od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više delova strukture, gde je svaki deo kontinualni element te strukture. Na primer, diskontinualna frakcija neke amino kiselinske sekvence može biti sačinjenja od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 dela navedene amino kiselinske sekvence, naznačeno time da svaki deo sadrži najmanje 5 susednih amino kiselina, najmanje 10 susednih amino kiselina, poželjno najmanje 20 susednih amino kiselina, poželjno najmanje 30 susednih amino kiselina iz te amino kiselinske sekvence.

[0095] Termini "deo" i "fragment" koriste se kao sinonimi i odnose se na kontinualni element. Na primer, deo neke strukture, kao što je sekvenca amino kiselina ili proteina, odnosi se na kontinualni element navedene strukture. Razdeo, deo ili fragment strukture, poželjno obuhvata jedno ili više funkcionalnih svojstava navedene strukture. Na primer, poželjno je da je razdeo, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina imunološki ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu od kojeg je dobijen. U kontekstu pronalaska, “deo” strukture, kao što je sekvenca amino kiselina, poželjno obuhvata najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% ukupne strukture ili amino kiselinske sekvence.

[0096] Termin "imunoreaktivna ćelija" u kontekstu predmtnog pronalaska, odnosi se na ćeliju koja ispoljava efektorske funkcije tokom imunske reakcije. “Imunoreaktivna ćelije" sposobna je da veže antigen ili ćeliju koja prezentuje antigen ili njegov peptidni fragment (na primer, epitop T-ćelije) i da izvede imunski odgovor. Na primer, imunoreaktivne ćelije izlučuju citokine i/ili hemokine, oslobađaju antitela, prepoznaju kancerske ćelije i opciono, eliminišu ove ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije obuhvataju T-ćelije (citotoksične T-ćelije, pomoćničke T ćelije, tumor infiltrirajuće ćelije), B-ćelije, ćelije-ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnog pronalaska, “imunoreaktivne ćelije” su T-ćelije, poželjno CD4+ i/ili CD8+ ćelije.

[0097] "Imunoreaktivna ćelija" prezentuje antigen ili njegov peptidni fragment sa izvesnim stepenom specifičnosti, konkretno ako je prezentovan u kontekstu MHC molekula, kao što su oni na površini antigen-prezentujućih ćelija ili obolelih ćelija ili kancerskih ćelija. To prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen ili njegov peptidni fragment da bude odgovori ili da reaguje. Ukoliko je imunoreaktivna ćelija pomoćnička T-ćelija (CD4+ T-ćelija), koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili njegov peptidni fragment u kontektsu molekula MHC klase II, reaktivnost ili reakcija mogu da uključe oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8+ limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ako je imunoreaktivna ćelija CTL ćelija, reaktivnost ili odgovor mogu da uključe eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, odnosno, ćelija koje se odliku prezentacijom antigena sa molekulima MHC klase I, na primer, posredstvom apoptoze ili perforinom-posredovane ćelijske lize. Prema pronalasku, odgovor CTL može da bude produžena ulazna struja kalcijuma, deoba ćelija, produkcija citokina, kao što su IFN-γ i TNF-α, ushodna regulacija markera aktivacije, kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje ćelija koje eksprimiraju antigen. Odgovor CTL ćelija može se precizno odrediti pomoću artificijelnog reportera koji ukazuje na odgovor CTL ćelije. CTL ćelije koje prepoznaju antigen ili fragment antigena i koje su prema njemu reaktivne označene su kao “antigen-reaktivne CTL”. Ako je imunoreaktivna ćelija B-ćelija, odgovor može da bude oslobađanje imunoglobulina.

[0098] Termini "T-ćelije" i "T-limfociti" koriste se kao sinonimi i obuhvataju pomoćničke T-ćelije (CD4+ T-ćelije) i citotoksične T-ćelije (CTL, CD8+ T-ćelije), koje obuhvataju citolitičke T-ćelije.

[0099] T-ćelije pripadaju grupi belih krvnih ćelija, poznatih pod imenom limfociti, a igraju centralnu ulogu u ćelijskoj imunosti. One se mogu razlikovati od ostalih grupa limfocita, kao što su B-ćelije i urođenoubilačke ćelije, po prisustvu posebnih receptora na površini, označenih kao T-ćelijski receptor (TCR). Timus je glavno mesto sazrevanja T-ćelija. Otkriveno je nekoliko podsetova T-ćelija, svaki sa posebnom ulogom.

[0100] Pomoćničke T-ćelije pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunološkim procesima, koji obuhvataju sazrevanje B-ćelija u plazma ćelije i aktivacija citotoksičnuh T-ćelija i makrofaga, između ostalog. Ove ćelije su poznate i kao CD4+ T-ćelije, jer eksprimiraju CD4 molekul na svojoj površini. Pomoćničke T-ćelije se aktiviraju kada su prezentovane peptidnim antigenima od strane MHC molekula klase II, koji su eksprimirani na površini antigenprezentujućih ćelija (APC). Kada su aktivirane, one se dele i izlučuju proteine male molekulske težine, koji se nazivaju citokini, a čija je uloga regulacija ili pomoć u aktivaciji imunskog odgovora.

[0101] Citotoksične T-ćelije uništavaju ćelije inficirane virusom ili tumorske ćelije, a takođe imaju ulogu u odbacivanju transplanta. Ove ćelije su poznate kao CD8+ ćelije, jer eksprimiraju molekule CD8 glikoproteina na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje mete, vezivanjem za antigen asociran sa MHC klasom I, koja je prisutna na površini gotovo svih ćelija u organizmu.

[0102] Većina T-ćelija na svojoj površini eksprimira T-ćelijski receptor (TCR), u vidu kompleksa nekoliko proteina. T-ćelijski receptor sastavljen je od dva peptidna lanca, koja su kodirana nezavisnim genima za T-ćelijski receptor alpha- i beta (TCRα i TCRβ), a nazivaju se α- i β-TCR lanci. γδ T-ćelije (gamma-delta T-ćelije) predstavljaju malu podgrupu T-ćelija, koja na svojoj površini poseduje drugačiji T-ćelijski receptor (TCR). U ovoj grupi γδ T-ćelija, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T-ćelija je znatni manje zastupljena od αβ T-ćelija (2% ukupnog broja T-ćelija).

[0103] Prvi signal u aktivaciji T-ćelija predstavlja vezivanje T-ćelijskog receptora za kratak peptid prezentovan od strane MHC na drugoj ćeliji. Ovo osigurava da se aktiviraju samo T-ćelije koje poseduju TCR specifičan za peptid. Partnerska ćelija je najčešće antigen-prezentujuća ćelija, kao što je specijalizovana antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritska ćelija u slučaju odgovora naivnih ćelija, iako i B-ćelije i makrofagi mogu biti važne APC.

[0104] Prema predmetnom pronalasku, molekul je sposoban da se veže za metu, ukoliko ima značajan afinitet prema toj predeterminisanoj meti ili e vezuje za metu u standardnim esejima. "Afinitet" ili "vezujući afinitet" najčešće se izražava preko ravnotežne konstante disocijacije (KD). Molekul (suštinski) nije sposoban da se veže za metu ukoliko nema značajan afinitet prema toj meti, i ukoliko se ne vezuje za metu u standardnim esejima.

[0105] Citotoksični T-limfociti mogu se dobiti in vivo, ugrađivanjem antigena ili njegovog peptidnog fragmenta u antigen-prezentujuće ćelije in vivo. Antigen ili njegov peptidni fragment mogi biti u formi proteina, DNK (na primer, u sastavu vektora) ili RNK. Antigen može biti obrađen, tako da nastane peptidni partner za MHC molekul, a fragment može biti prezentovan bez dodatne obrade. Ovo poslednje je slučaj kada su sposobni da se vežu za MHC molekule. Načelno, moguća je intradermalna administracija kod pacijenta. Injekcija se može plasirati intranodalno u limfni čvor (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). Rezultujuće ćelije prezentuju komplekse od interesa i prepoznate su od autolognih citotoksičnih T-limfocita koji se dalje klonski umnožavaju.

[0106] Specifičnu aktivaciju CD4+ ili CD8+ T-ćelija moguće je detektovati na više načina. Postupci detekcije specifičnih T-ćelija obuhvataju detekciju proliferacije T-ćelija, produkciju citokina (na primer, limfokina), ili ispoljavanja citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T-ćelije, poželjan postupak detekcije aktivacije specifičnih T-ćelija zasniva se na detekciji proliferacije T-ćelija. Za CD8+ T-ćelije, poželjan postupak detekcije specifičnih T-ćelija jeste detekcija nastanka citolitičke aktivnosti.

[0107] Pod frazom "ćelija koja se odlikuje prezentacijom antigena" ili "ćelija koja prezentuje antigen" ili slično, podrazmeva se obolela ćelije, na primer, kancerska ćelije ili neka antigenprezentujuća ćelija koja prezentuje eksprimirani antigen ili fragment dobijen od antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC molekula klase I. Slično, fraza "bolest koja se odlikuje prezentacijom antigena" odnosi se na bolest koja uključuje ćelije koje prezentuju antigen, konkretno koje prezentuju antigen u kontekstu MHC molekula klase I. Prezentacija antigena od strane ćelije može se postići i kada se ćelija transfektuje nukleinskom kiselinom, na primer, molekulom RNK koja kodira dati antigen.

[0108] "Fragment prezentovanog antigena" ili slične fraze, označavaju fragment koji može biti prezentovan od strane MHC klase I ili klase II, poželjno klase I, na primer, kada se direktno doda antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom obliku izvođenja, fragment je fragment koji se prirodno prezentuje od strane ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0109] Termin "imunološki ekvivalent" označava da je imunološki ekvivalentan molekul, kao što je imunološki ekvivalentna sekvenca amino kiselina, koja poseduje identična ili suštinski ista imunološka svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, na primer, u odnosu na tip efekta, kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunskog odgovora, jačina i/ili trajanje indukovane imunske reakcije, ili specifičnost indukovane imunske reakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, fraza "imunološki ekvivalentan" u vezi sa imunološkim efektima ili svojstvima, odnosi se na svojstva peptida za imunizaciju. Na primer, neka sekvenca amino kiselina imunološki je ekvivalentna referentnoj sekvenci, ako je navedena amino kiselinska sekvenca, kada je izložena imunskom sistemu osobe, indukuje imunski odgovor iste specifičnosti kao i referentna sekvenca.

[0110] Fraza "imunske efektorske funkcije" u kontekstu predmetnog pronalaska, obuhvata sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema, koje rezultiraju ubijanjem tumorskih ćelija ili inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom napredovanja tumora, uključujući inhibiciju širenja tumora i metastaze. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu pronalaska, su efektorske funkcije posredovane T-ćelijama. Ove funkcije obuhvataju, u slučaju pomoćničkih T-ćelija (CD4+ T -ćelija) prepoznavanje antigenskih fragmenata asociranih sa MHC molekulima klase II, od strane T-ćelijskih receptora, oslobađanje citokina i/ili aktivacija CD8+ limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, i, u slučaju CTL, prepoznavanje antigena ili fragmenata antigena u kontekstu MHC molekula klase I od strane T-ćelijskih receptora, eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, odnosno, ćelija koje prezentuju antingen sa MHC molekulom klase I, posredstvom apoptoze ili perforinom-modifikovane ćelijske lize, produkciju citokina, kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifično citolotičko ubijanje antigen-eksprimirajućih ciljnih ćelija.

[0111] Prema pronalasku, termin "skor" odnosi se na bodovanje, rezultat ili numerički izraz ispitivanja. Termini kao što je “imaju veći skor” ili “najveći skor” takođe se odnose na bolje ili najbolje rezultate testiranja ili ispitivanja.

[0112] Termini kao što su "predvideti", "predviđati" ili "predikcija" odnose se na određivanje verovatnoće.

[0113] Prema pronalasku, utvrđivanje skora vezivanja peptida za jedan ili više MHC molekula obuhvata određivanje verovatnoće vezivanja peptida za jedan ili više MHC molekula.

[0114] Skor vezivanja peptida za jedan ili više MHC molekula može se utvrditi primenom pogodnih prediktivnih alata za peptid:MHC vezivanje. Na primer, može se koristiti baza podataka za analizu imunskih epitopa (IEDB-AR: http://tools.iedb.org).

[0115] Predikcija se obično pravi prema setu MHC molekula, kao što je set različitih MHC alela, kao što su svi mogući MHC aleli ili set ili podset MHC alela čije je prisustvo utvrđeno kod pacijenta, koji poželjno nose modifikaciju(e), a čija imunogenost treba da predvidi primenom postupka prema pronalasku.

[0116] Prema pronalasku, utvrđivanje skora vezivanja modifikovanog peptida, kada se nalazi u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, obuhvata određivanje verovatnoće vezivanja peptida, kada je u kompleksu sa MHC molekulom, za T-ćelijski receptor.

[0117] Predikcija se može odnositi na jedan T-ćelijski receptor, kao što je T-ćelijski receptor čije je prisustvo utvrđeno kod pacijenta, ili poželjno, na set T-ćelijskih receptora, kao što je nepoznati set različitih T-ćelijskih receptora ili set ili podset T-ćelijskih receptora čije je prisustvo utvrđeno kod pacijenata, a koji poželjno sadrže modifikaciju(e) imunogenosti koja treba da bude predviđena primenom postupka prema pronalasku.

[0118] Dalje, predikcuju je moguće napraviti prema setu MHC molekula, kao što je set različitih MHC alela, na primer, svi mogući MHC aleli ili set ili podset MHC alela čije je prisustvo utvrđeno kod pacijenta, koji poželjno nose modifikaciju(e), čiju je imunogenost potrebno predvideti primenom postupka prema pronalasku.

[0119] Skor vezivanja modifikovanog peptida, kada je u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora može se utvrditi procenom efekta koji će modifikacija imati na formiranje kompleksa T-ćelijski receptor-peptid-MHC, pri datom (nepoznatom) repertoaru T-ćelijskih receptora. Skor vezivanja modifikovanog peptida, kada je u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, može se koristiti za utvrđivanje prepoznavanja datog kompleksa peptid-MHC molekul za odgovovarajući T-ćelijski receptor.

[0120] Skor vezivanja peptida, kada je u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, može se utvrditi procenom fizičko-hemijskih razlika između modifikovane i nemodifikovane amino kiseline. U tu svrhu se mogu koristiti supstitucione matrice. Ove matrice opisuju stopu kojom se jedna amino kiselina u sekvenci zamenjuje nekom drugom tokom vremena.

[0121] Na primer, mogu se koristiti logit (“log-odds”) supstitucione matrice, kao što su evolucione logit matrice: supstitucija sa niskim logit skorom ima veće šanse pronalaženja odgovarajućeg T-ćelijskog receptora iz pula (nepoznatih) molekula T-ćelijskog receptora, od supstitucije sa visokim logit skorom (usled negativne selekcije T-ćelijskih receptora koji odgovaraju nemodifikovanim peptidima). Postoje i drugi načini utvrđivanja skora. Na primer, ako se uzme u obzir pozicija mutacije u peptidu (neke pozicije imaju manji uticaj na vezivanje, od drugih), ili neposredna okolina supstituisane amino kiseline (koja može da utiče na sekundarnu strukturu peptida), ili imajuću u vidu kompletnu strukturnu informaciju peptida u MHC molekulu, i tako dalje. Utvrđivanje skora može da uključi i određivanje repertoara T-ćelijskih receptora (na primer, repertoar T-ćelijskih receptora ili njihov podset), na primer, primenom tehnologije NGS i izvođenjem doking stimulacija “ključ-brava” formiranja kompleksa T-ćelijski receptor-peptid-MHC kompleks.

[0122] Predmetni pronalazak obuhvata izvođenje postupka prema pronalasku na različitim peptidima koji sadrže istu modifikaciju(e) i/ili različite modifikacije.

[0123] U jednom obliku izvođenja, fraza "različiti peptidi koji sadrže istu modifikaciju(e)” obuhvata ili se sastoji od različitih fragmenata modifikovanog proteina, gde navedeni fragmenti obuhvataju istu modifikaciju(e) koja se nalazi u proteinu, ali se razlikuju po dužini i/ili poziciji modifikacije(a). Ako protein ima modifikaciju na poziciji x, dva ili više fragmenata navedenog proteina, od kojih svaki sadrži različite okvire sekvence navedenog proteina koji sadrži poziciju x, smatraju se različitim peptidima koji imaju istu modifikaciju(e).

[0124] Fraza "različiti peptidi koji sadrže različitu modifikaciju(e)", u jednom obliku izvođenja odnosi se na peptide iste i/ili različitih dužina, koji sadrže različite modifikacije istog i/ili različitih proteina. Ako protein nosi modifikaciju na pozicijama x i y, dva fragmenta navedenog proteina, od kojih svaki sadrži okvir sekvence navedenog proteina u kojem se nalaze pozicija x poziciju ili pozicija y, smatraju se različitim peptidima koji sadrže različite modifikacije.

[0125] Predmetni pronalazak takođe može da obuhvati isecanje proteinske sekvence koja sadrži modifikaciju, čiju imunogenost treba predvideti primenom postupka prema pronalasku, na MHC-vezujuće peptide odgovarajuće dužine i utvrđivanje skora vezivanja različitih modifikovanih peptida, koji nose istu i/ili različitu modifikaciju istog i/ili različitih proteina, za jedan ili više MHC molekula. Izlazni rezultati mogu se rangirati i mogu sadržati listu peptida i predviđenih skorova koji ukazuju na verovatnoću vezivanja.

[0126] Utvrđivanje skora vezivanja ne-modifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula i/ili korak utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida, kada je u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, može se zatim izvršiti sa različitim modifikovanim peptidima koji sadrže iste i/ili različite modifikacije, podsetom peptida, na primer, sa modifikovanim peptidima koji sadrže istu i/ili različite modifikacije, a imaju najbolji skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula, ili samo sa onim modifikovanim peptidima koji imaju najbolji skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula.

[0127] Prateći ove korake, moguće je rangirati rezultate i sačiniti listu peptida i njihovih predviđenih skorova, koji ukazuju na verovatnoću da su imunogeni.

[0128] Poželjno je da se kod ovakvog rangiranja, skor vezivanja modifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula više ponderiše od skora vezivanja modifikovanog peptida, kada je u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, i skor hemijskih i fizičkih sličnosti između ne-modifikovane i modifikovane amino kiseline i skor vezivanja modifikovanog peptida, kada je u kompleksu MHC-peptid za jedan ili više T-ćelijskih receptora, poželjno je da se skor hemijskih i fizičkih sličnosti ne-modifikovane i modifikovane amino kiseline više ponderiše od skora vezivanja ne-modifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula.

[0129] Amino kiselinske modifikacije imunogenosti koje treba da budu određene primenom postupka prema pronalasku, mogu nastati usled mutacija u nukleinskoj kiselini ćelije. Ove mutacije se mogu identifikovati poznatim tehnikama sekvencioniranja.

[0130] U jednom obliku izvođenja, mutacije su kancer-specifične somatske mutacije u uzorku tumorskog tkiva pacijenta, koje se mogu utvrditi identifikovanjem razlika u sekvenci genoma, egzoma, i/ili transkriptoma uzorka tumora i sekvence genoma, egzoma ili transkriptoma nekancerskog uzorka tkiva.

[0131] Uzorak tumora označava bilo koji telesni uzorak dobijen od pacijenta, koji sadrži ili se očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Uzorci mogu biti uzeti iz bilo kog tkiva, kao što je krv, tkivni uzorak primarnog tumora ili tumorskih metastaza ili bilo koji drugi uzorak koji sadrži tumor ili kancerske ćelije. Poželjno je da je uzorak, uzorak krvi, a kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvenci se određuju jednom ili više cirkulatornih tumorskih ćelija (CTC) sadržanih u krvi. U narednom obliku izvođenja, uzorak tumora se odnosi na jednu ili više izolovanih tumorskih ili kancerskih ćelija, kao što su cirkulatorne tumorske ćelije (CTC) ili uzorak sadrži jednu ili više tumorskih ili kancerskih ćelija (CTC).

[0132] Ne-tumorogeni uzorak označava svaki uzorak, kao što je telesni uzorak dobijen od pacijenta ili druge individue koja poželjno pripada istoj vrsti kao i pacijent, po mogućstvu od zdrave individue koja ne sadrži ili se ne očekuje da sadrži tumorske ili kancerske ćelije. Ovaj telesni uzorak može biti bilo koji tkivni uzorak, kao što je krv ili uzorak ne-tumorogenog tkiva.

[0133] Pronalazak može da obuhvatu određivanje specifične kancerske mutacije kod pacijenta. Fraza "specifična kancerska mutacija" može da označi sve kancerske mutacije prisutne u jednoj ili više kancerskih ćelija pacijenta ili može da se odnosi samo na deo kancerskih mutacija prisutnih u jednoj ili više kancerskih ćelija pacijenta. Shodno tome, predmetni pronalazak može da uključi identifikovnje svih kancer-specifičnih mutacija prisutnih u jednoj ili više kancerskih ćelija pacijenta ili može da obuhvati identifikaciju jednog broja kancer-specifičnih mutacija prisutnih kod pacijenta. Načelno, postupci pronalaska obezbeđuju identifikaciju broja mutacija koji obezbeđuje dovoljan broj modifikacija ili modifikovanih peptida koje treba uključiti u postupke prema pronalasku.

[0134] Poželjno je da su mutacije identifikovane primenom postupka prema pronalasku, nesinonimne mutacije, poželjno ne-sinonimne mutacije proteina koji se eksprimiraju tumorskoj ili kancerskoj ćeliji.

[0135] U jednom obliku izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvenci, određuju se u genomu, poželjno, u celom genomu uzorka tumora. Stoga, pronalazak može da uključi identifikovanje signature kancerskih mutacija celog genoma, poželjno celog genoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom obliku izvođenja, korak identifikovanja kancerspecifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora kancerskog pacijenta, obuhvata identifikaciju mutacionog profila celog genoma.

[0136] U jednom obliku izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvenci određuju se u egzomu, poželjno celom egzomu uzorka tumora. Stoga, pronalazak može da obuhvati identifikovanje signature kancerskih mutacija celog egzoma, poželjno celog egzoma jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom obliku izvođenja, korak identifikovanja kancerspecifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora kancerskog pacijenta obuhvata identifikovanje kancerskog mutacionog profila celog egzoma.

[0137] U jednom obliku izvođenja, kancer-specifične somatske mutacije ili razlike među sekvencama određuju se u transkriptomu, poželjno u celom transkriptomu uzorka tumora. Stoga, pronalazak može da obuhvati određivanje signature kancerskih mutacija celog transkriptoma, poželjno celog transkriptoma jedne ili više ćelija. U jednom obliku izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija u uzorku tumora kancerskog pacijenta obuhvata identifikovanje kancerskog profila celog transkriptoma.

[0138] U jednom obliku izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlika među sekvencama obuhvata sekvencioniranje pojedinačnih ćelija, poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više kancerskih ćelija. Stoga, pronalazak može da obuhvati identifikovanje signature kancerskih mutacija jedne ili više kancerskih ćelija. U jednom obliku izvođenja, kancerske ćelije su cirkulišuće tumorske ćelije. Kancerske ćelije, kao što su cirkulišuće tumorske ćelije mogu se izolovati pre sekvencioniranja na nivou ćelije.

[0139] U jednom obliku izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlika među sekvencama obuhvata primenu naredne generacije sekvencioniranja (NGS).

[0140] U jednom obliku izvođenja, korak identifikovanja kancer-specifičnih somatskih mutacija ili identifikovanja razlika među sekvencama obuhvata sekvencioniranje genomske DNK i/ili RNK u uzorku tumora.

[0141] Da bi se otkrile kancer-specifične somatske mutacije ili razlike sekvence, poželjno je da se informacija o sekvenci dobijenoj iz uzorka tumora uporedi sa referentnom sekvencom, kao što je sekvenca dobijena sekvencioniranjem nukleinskih kiselina, DNK ili RNK zdrave, ne-kancerske ćelije, kao što je ćelija germinativne linije dobijena od istog pacijenta ili od druge zdrave osobe. U jednom obliku izvođenja, normalna ne-kancerska germinativna genomska DNK izoluje iz perifernih mononuklearnih ćelija (PBMC).

[0142] Termin "genom" odnosi se na ukupnu količinu genetičkih informacija na hormozomima organizma ili ćelije.

[0143] Termin "egzom" odnosi se na deo genoma koji formiraju egzoni, koji predstavljaju kodirajuće delove eksprimiranih gena. Egzom predstavlja genetički otisak koji se koristi u sintezi proteina i drugih funkcionalnih proizvoda gena. To je funkcionalno najrelevantniji deo genoma, i stoga, verovatno najviše doprinosi fenotipu organizma. Procenjuje se da egzom humanog genoma obuhvata 1.5 % ukupnog genoma (Ng, PC et al., PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008).

[0144] Termin "transkriptom" odnosi se na komplet svih RNK molekula, uključujući iRNK, rRNK, tRNK, i druge ne-kodirajuće RNK koje nastaju u jednoj ćeliji ili populaciji ćelija. U kontekstu predmetnog pronalaska, transkriptom označava komplet svih RNK molekula koji nastaju u jednoj ćeliji ili populaciji ćelija, poželjno u populaciji kancerskih ćelija, ili svih ćelija jedne osobe u određenom trenutku.

[0145] "Nukleinska kiselina" je, prema pronalasku, poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK) ili sintetska RNK. Nukleinske kiseline obuhvataju prema pronalasku, genomsku DNK, cDNK, iRNK, rekombinantnu DNK i hemijski sintetisanu nukleinsku kiselinu. Prema pronalasku, nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana i linearna ili kovalentno zatvoren cirkularni molekul. Nukleinska kiselina može biti izolovana. Termin “izolovana nukleinska kiselina” označava prema pronalasku, da je ta nukleinska kiselina (i) umnožena in vitro, na primer, pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR), (ii) proizvedena rekombinantno, kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, isecanjem i razdvajanjem gel elektroforezom, ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Nukleinska kiselina može se iskoristiti za uvođenje u ćelije, na primer transfekcijom, konkretno u formi RNK koja je dobijena in vitro transkripcijom sa DNK matrice. RNK se može modifikovati pre aplikacije, stabilisanjem sekvence, obeležavanjem ili poli-adenilacijom.

[0146] Fraza "genetički materijal" odnosi se na izolovanu nukleinsku kiselinu, DNK ili RNK, isečak dvostruke zavojnice, deo hromozoma ili ukupnog genoma nekog organizma, konkretno, egzom ili transkriptom.

[0147] Termin "mutacija" odnosi se na promenu ili razliku sekvence nukleinske kiseline (nukleotidna supstitucija, adicija ili delecija) u odnosu na referentnu sekvencu. "Somatska mutacija" može da se desi u bilo kojoj telesnoj ćeliji organizma, osim u germinativnoj ćeliji (spermatozoid, jajna ćelija), pa se zato ne prenosi na potomstvo. Ove promene mogu (ali ne moraju uvek) da izazovu kancer ili neku drugu bolest. Poželjno je da je mutacija ne-sinonimna mutacija. Termin “ne-sinonimna mutacija” označava mutaciju, poželjno nukleotidnu supstituciju, koja ne dovodi do amino kiselinske izmene, kao što je supstitucija amino kiseline u finalnom translacionom proizvodu.

[0148] Prema pronalasku, termin “mutacija” obuhvata tačkaste mutacije, indele, fuzije, hromatotripse i RNK uređivanje.

[0149] Prema pronalasku, termin "indel" opisuje posebnu klasu mutacija, koja se definiše kao mutacija usled kolonizacione insercije ili delecije i neto povećanja ili smanjenja broja nukleotida. U kodirajućim regionima genoma, ukoliko dužina indela nije umnožak broja 3, ove mutacije proizvode potpunu promenu okvira čitanja. Indel se razlikuje od tačkaste mutacije; dok Indel dodaje ili oduzima nukleotide iz sekvence, tačkasta mutacija zamenjuje jedan nukleotid drugim nukleotidom.

[0150] Fuzije mogu da stvore hibridne gene, koji nastaju spajanjem dva prethodno razdvojena gena. One mogu da se dese usled translokacije, intersticijalne delecije ili hromozomske inverzije. Čest je slučaj da su fuzioni geni, onkogeni. Onkogeni fuzioni geni mogu dovesti do genskog proizvoda sa novim ili promenjenim funkcijama dva fuziona partnera. Alternativno, protoonkigen je fuzionisan sa snažnim promotorom, i stoga se aktivira onkogena funkcija, ushodnom regulacijom koju izaziva snažni promoter uzvodnog fuzionog partnera. Onkogeni fuzioni transkripti mogu takođe nastati usled unakrse obrade transkripata ili preskakanja nuleotida u sekvenci.

[0151] Prema pronalasku, termin "hromotripsis" odnosi se na genetički fenomen kojim specifični regioni genoma postaju oštećeni, a zatim međusobno povezani, tokom pojedinačnog devastirajućeg događaja.

[0152] Prema pronalasku, termin "uređivanje RNK" ili "RNK editovanje" odnosi se na molekularne procese u kojima je se informacioni sadržaj RNK molekula menja kroz hemijske izmene osnovnog uređenja. Uređivanje RNK obuhvata modifikacije nukleozida, kao što su deaminacija citidina (C) u uridin (U) i adenozina (A) u inozin (I), kao i nukleotidne adicije ili insercije, kojih nema na zapisu sekvence u DNK. Uređivanje RNK kod iRNK efikasno menja amino kiselinsku sekvencu kodiranog proteina, tako da se ona razlikuje od predviđene genomske DNK sekvence.

[0153] Termin "specifična kancerska mutacija" odnosi se na grupu mutacija prisutnih u kancerskoj ćeliji, kada se uporedi sa ne-kancerskim referentnim ćelijama.

[0154] Prema pronalasku, "referentno" se koristi da se koreliraju ili uporede rezultati dobijeni postupcima prema pronalasku, iz uzorka tumora. Tipično, “referentno” se može dobiti na osnovu jednog ili više normalnih uzoraka, konkretno, uzoraka koji nisu zahvaćeni kancerom, bilo da su dobijeni od pacijenta ili od jedne ili više osoba, poželjno zdravih osoba iste vrste. “Referentno” se može odrediti empirijski, testiranjem dovoljno velikog broja normalnih uzoraka.

[0155] Za određivanje mutacija prema pronalasku, moguće je primeniti svaki pogodan postupak sekvencioniranja. Poželjno je primeniti tehnologije Naredne generacije sekvencioniranja (Next Generation Sequencing (NGS)). Metode Treće generacije sekvencioniranja mogu da zamene NGS u budućnosti, sa ciljem ubrzavanja koraka sekvencioniranja u ovom postupku. U cilju pojašnjenja: fraza "Naredna generacija sekvencioniranja" ili "NGS", u kontekstu predmetnog pronalaska, označava sve nove tehnologije visoko-propusnog sekvencioniranja, koje, za razliku od “konvencionalnih” postupaka sekvencioniranja poznatih pod terminom Sangerova hemija, čitaju šablone nukleinskih kiselina nasumice paralelno duž celokupnog genoma, deleći genom na manje delove. Pomenute NGS tehnologije (poznate i pod imenom masivno paralelno sekvencioniranje), sposobne su da pruže informacije o sekvenci nukleinske kiseline celokupnog genoma, egzoma, transkriptoma (svih transkribovanih sekvenci genoma) ili metiloma (svih metilovanih sekvenci genoma) u veoma kratkom vremenu, na primer, tokom 1.2 nedelje, poželjno 1-7 dana ili najpoželjnije za manje od 24 sata i dozvoljavaju, sekvencioniranje na nivou pojedinačne ćelije. U kontekstu predmetnog pronalaska moguće je primeniti veći broj komercijalno dostupnih NGS platformi ili one platforme opisane u literaturi, na primer, kod Zhang et al.2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; ili u Voelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Neograničavajući primeri NGS tehnologija/platformi su:

1) Tehnologija sekvencionaranja sintezom, poznata i kao pirosekvencionoranje, primenjena je u GS-FLX 454 Genome Sequencer™ od kompanije povezane sa Roche, 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), prvi put opisana u Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. Ova tehnologija koristi emulzioni PCR, u kojoj su zrnca koja vezuju jednočančanu DNK, snažnim vorteksovanjem inkapsulirana u vodene micele, u kojima se nalaze PCR reaktanti, okružene uljem za emulzionu PCR amplifikaciju. Tokom procesa pirosekvencioniranja, svetlost koju emituju fosfatni molekuli tokom ugrađivanja nukleotida registruje se kao polimerazna sinteza DNK lanca.

2) Pristupi sekvencioniranja sintezom razvijeni su od strane Solexa (sada deo Illumina Inc., San Diego, California), a zasnivaju se na reverzibilnim stop-bojama i primenjeni su, na primer, u analizatorima Illumina/Solexa Genome Analyzer™ i u Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™. U ovoj tehnologiji, sva četiri nukleotida istovremeno se dodaju fragmentima oligo-prajmera, u protočne kanale zajedno sa DNK polimerazom. Metoda poznata pod imenom amplifikacija mosta izdužuje klaster lanac sa sve četiri fluorescentno obeležena nukleotida za sekvencioniranje.

3) Postupci sekvencioniranja ligacijom, primenjeni su kod SOLid™ platform proizvedene od Applied Biosystems (now Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). U ovoj tehnologiji, skup svih mogućih oligonukleotida fiksne dužine obeležava se na osnovu sekvencionirane pozicije. Oligonukleotidi su tope i ligiraju; preferencijalna ligacija posredstvom DNK ligaze za uklapanje sekvence rezultira oslobađanjem signala koji daje informaciju u položaju nukleotida na toj poziciji. Pre sekvencioniranja, DNK se umnožava emulzionom PCR-om. Rezultujuća zrnca, od kojih svako sadrži samo kopije istog DNK molekula, postavljaju se na staklene pločice. Drugi primer je Polonator™ G.007 platforma, proizvedena od Dover Systems (Salem, New Hampshire), takođe primenjuje sekvencioniranje ligacijom, primenom nasumično poređanih zrnaca i emulzionog PCR-a za umnožavanje DNK fragmenata paralelnim sekvencioniranjem. 4) Tehnologije molekulskog sekvencioniranja, kao što su, na primer, one implementirane kod PacBio RS sistema proizvdenog od Pacific Biosciences (Menlo Park, California) ili HeliScope™ platforma od Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). Specifična svojstva ovih tehnologija su sposobnost da se sekvencionira jedan DNK ili RNK molekul bez amplifikacije, šro je nazvano DNK sekvencioniranjem pojedinačnih molekula u realnom vremenu (Single-Molecule Real Time (SMRT)). Na primer, HeliScope koristi veoma osetljivu fluorescentnu detekciju da direktno detektuje svaki nukleotid, onog trenutka kada se veže u molekul. Sličan pristup zasnovan na fluorescentnom rezonantnom transferu energije (FRET), razvijen je od Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Drugi fluorescentni postupci sekvencioniranja pojedinačnih molekula razvijeni su od U.S. Genomics (GeneEngine™) i Genovoxx (AnyGene™).

5) Primenjene su nano-tehnologije za sekvencioniranje pojedinačnih molekula u kojima se koriste različite nanostrukture aranžirane na čip, kako bi se pratio pokret polimeraznog molekula na jednom lancu tokom replikacije. Neograničavajući primeri sekvencioniranja zasnovani na nano-tehnologijama su GridON™ platforma od Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), platforma za hibridizaciono sekvencioniranje pomoću nanopora (HANS™), razvijena od kompanije Nabsys (Providence, Rhode Island), i platform za sekvencioniranje DNK, sa tehnologijom DNK nano-loptica (DNB), nazvana kombinovana ligacija proba-sidro (cPAL™).

6) Tehnologije sekvencioniranje pojedinačnih molekula koje se zasnivaju na elektronskoj mikroskopiji, na primer, one koje su razvijene od LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) i Halcyon Molecular (Redwood City, California)

7) Jon-poluprovodničko sekvencioniranje, koje se zasniva na detekciji vodonikovih jona koji se oslobođaju tokom polimerizacije DNK. Na primer, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) primenjuje niz mikrobunarića visoke gustine kako bi obavio biohemijski postupak na masivan paralelan način. Svaki bunarić nosi različitu DNK matricu. Ispod bunarića se nalazi jon-senzitivni sloj, a ispod njega jonski senzor.

[0156] Poželjno je da, preparati DNK i RNK služe kao polazni materijal za NGS. Ove nukleinske kiseline mogu lako da se dobiju iz uzorka biološkog materijala, na primer, svežih, sveže smrznutih, ili u formalinu fiksiranih parafinskih preparata tumorskog tkiva (FFPE) ili se mogu izolovati iz ćelija ili CTC-ćelija, prisutnih u perifernoj krvi pacijenata. Normalna, ne-mutirana genomska DNK ili RNK mogu se ekstrahovati iz normalnog, somatskog tkiva, ali je u kontekstu predmetnog pronalaska poželjno da to budu germinativne ćelije. DNK i RNK germinativnih ćelija može se ekstrahovati iz perifernih mononuklearnih ćelija (PBMC) pacijenata sa nehematološkim malignitetima. Iako su nukleinske kiseline izolovane iz FFPE ili iz sveže izolovanih pojedinačnih ćelija veoma fragmentisane, one su pogodne za NGS analizu.

[0157] U literature je opisano nekoliko NGS postupaka sekvencioniranja egzoma (za pregled, videti, na primer, Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51), i svi se mogu biti primeniti u kontekstu predmetnog pronalaska. Većina ovih postupakaka (označenih terminima hvatanje genoma, genomsko parcionisanje, obogaćivanje genoma i td), primenjuju tehnike hibridizacije i uključuju hibridizaciju na čipu i (e.g. Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) ili u tečnoj fazi (e.g. Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101). Komercijalno su dostupni kompleti za izolovanje DNK i hvatanje genoma: na primer, Illumina Inc. (San Diego, California) ima u ponudi komplet za izolovanje DNK TruSeq™ DNA Sample Preparation Kit i za izolovanje egzoma, Exome Enrichment Kit TruSeq™ Exome Enrichment Kit.

[0158] Da bi se smanjio broj lažno pozitivnih nalaza u detekciji kancer-specifičnih somatskih mutacija ili razlika sekvenci kada se uporede sekvenca tumorskog uzorka i referentna sekvenca, kao što je sekvenca uzorka germinativne ćelije, poželjno je više puta uraditi sekvencioniranje jednog ili oba tipa uzorka. Poželjno je stoga, da se sekevnca referentnog uzorka, kao što je sekvenca germinativne linije utvrdi dva puta, tri puta ili više puta. Alternativno ili dodatno, sekvenca tumorskog uzorka određuje se dva puta, tri puta ili više puta. Takođe će biti moguće da se odredi referentna sekvenca, kao što je sekvenca germinativne ćelije i/ili sekvenca tumorskog uzorka više od jednom, određivanjem sekvence u genomskoj DNK i višestrukim određivanjem sekvence RNK navedenog referentnog uzorka i/ili navedenog tumorskog uzorka. Na primer, određivanjem varijacija koje se javljaju između tehničkih između replikata istog, referentnog uzorka, na primer uzorka germinativne linije, određuje se statistička vrednost očekivane stope lažno pozitivnih (FDR) somatskih mutacija. Tehnički replikati uzorka treba da proizvedu identične rezultate, pa svaka detektovana varijacija dobijen poređenjem tehničkih replikata “isto sa istim” jeste lažno pozitivna mutacija. Konkretno, da bi se odredila stopa lažnih otkrića somatskih mutacija u tumorskom uzorku u odnosu na referentni uzorak, moguće je koristiti tehničke replikate referenentog uzorka kao standard za procenu broja lažno pozitivnih mutacija. Moguće je dalje kombinovati različita merenja kontrole kvaliteta (na primer, pokrivenost ili SNP kvalitet) u jedinstveni kvalitativni skor, primenom mašinskog učenja. Za određenu somatsku varijaciju moguće je izbrojati sve ostale varijacije koje imaju veći kvalitativni skor, što omogućava rangiranje svih varijacija u setu podataka.

[0159] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin “RNK” odnosi se na molekul koji sadrži najmanje jedan ribonukleotid, i poljeljno je sačinjen isključivo od ribonukleotida. "Ribonukleotid" je nukleotid sa hidroksil grupom na 2’-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin "RNK" obuhvata dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK, kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski prečišćena RNK, sintetska RNK ili rekombinantna RNK, kao što je modifikovana RNK, koja se razlikuje od prirodne RNK po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili promeni jednog ili više nukleotida. Ove promene mogu da obuhvate adiciju ne-nukleotidnog materijala na kraj(eve) RNK molekula ili unutar molekula, na primer, na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi i RNK molekuli mogu takođe da sadrže ne-standardne nukleotide, kao što su prirodno nepostojeći nukleotidi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ovako izmenjene RNK označavaju se terminom analozi ili analozi prirodno postojećih RNK.

[0160] Prema predmetnom pronalasku, termin “RNK” obuhvata i poželjno se odnosi na “iRNK”. Termin “iRNK” označava informacionu-RNK i odnosi se na “transkript” koji nastaje prepisivanjem DNK matrice, a nastala iRNK kodira peptid ili polipeptid. Tipično, iRNK obuhvata 5’-UTR, protein kodirajući region i 3’-UTR. Informaciona RNK ima ograničen poluživot u ćeliji i in vitro. U kontekstu predmetnog pronalaska, iRNK se može proizvesti in vitro transkripcijom, sa DNK matrice. Metodologije in vitro transkripcije poznata su u stanju tehnike. Na primer, komercijalno su dostupni brojni transkripcioni kompleti za in vitro transkripciju iRNK.

[0161] Ako je potrebno, stabilnost i translaciona efikasnost RNK mogu se modifikovati, prema pronalasku. Na primer, RNK se može stabilizovati i njena translacija se može povećati uvođenjemm jedne ili više modifikacija koje imaju stabilišući efekat i/ili koje povećavaju translacionu efikasnost RNK. Ove modifikacije opisane su, na primer, u PCT/EP2006/009448. Da bi se povećala ekspresija RNK u kontekstu pronalaska, iRNK se može modifikovati unutar kodirajućeg regiona, na primer, unutar sekvence koja kodira peptid ili protein, poželjno bez izmene sekvence amino kiselina u eksprimiranom peptidu ili proteinu, povećanjem GC-nukleotidnog sadržaja, što povećava stabilnost iRNK, ili optimizacijom kodona, čime se povećava translacija konkretne iRNK u ćeliji.

[0162] Termin "modifikacija”, u kontekstu RNK koja se koristi prema pronalasku, obuhvata svaku modifikaciju RNK, koja ne postoji prirodno u tom RNK molekulu.

[0163] U jednom obliku izvođenja pronalaska, RNK primenjena prema pronalasku nema nezaštićeni 5’-trifosfat. Uklanjanje ovog nezaštićenog 5’-trifosfata može se postići tretiranjem RNK fosfatazom.

[0164] Da bi se povećala stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost, RNK prema pronalasku može imati modifikovane ribonukleotide. Na primer, u jednom obliku izvođenja, u molekulu RNK, 5-metilcitidin se delimično ili u potpunosti, a poželjno je u potpunosti, zamenjuje citidinom. Alternativno, ili dodatno, u jednom obliku izvođenja, u molekulu RNK koja se koristi prema pronalasku, pseudouridin se delimično ili potpuno, poželjno potpuno, zamenjuje uridinom.

[0165] U jednom obliku izvođenja, termin "modifikacija" odnosi se na dobijanje RNK sa 5’-kapom ili analogom 5’-kape. Termin “5’-kapa” odnosi se na strukturu kape koja se nalazi na 5’-kraju iRNK molekula i načelno se sastoji od guanozonskog nukleotida povezanog za iRNK posredstvom neobične 5’-5’ trifosfatne veze. U jednom obliku izvođenja, metilovan je guanozin na poziciji 7. Termin “konvencionalna 5’-kapa” odnosi se na prirodno postojeću RNK 5’-kapu, poželjno na 7-metil-guanozin kapu (m7G). U kontekstu predmetnog pronalaska, termin 5’-kapa, obuhvata analog 5’-kape, koji liči na prirodnu RNK kapu, a modifikovana je tako da poveća stabilnost RNK i/ili da poveća translaciju RNK za koju je zakačen, poželjno, in vivo i/ili u ćeliji.

[0166] Dobijanje RNK sa 5’-kapom ili analogom 5’-kape može se postići in vitro transkripcijom DNK u prisustvu navedene 5’-kape ili analoga 5’-kape, naznačeno time da je 5’-kapa kotranskripciono ugrađena u sintetisani RNK lanac, ili se RNK može proizvesti transkripcijom in vitro, a 5’-kapa može biti zakačena za RNK posttranskripciono, uz pomoć enzima, na primer, vakcinija virusa

[0167] RNK može sadržati i druge modifikacije. Na primer, dodatne modifikacije RNK koja se koristi prema predmetnom pronalasku, mogu biti produženja ili skraćenja prirodno postojećeg poli-(A) repa ili promene 5’- ili 3’-netranslirajućih regiona (UTR), kao što je uvođenje UTR, koja nije povezana sa kodirajućim regionom RNK, na primer, izmena 3’-UTR ili insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3’-UTR dobijene iz globinskog gena, kao što je alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno, beta-globin, još poželjnije, humani beta-globin.

[0168] RNK sa demaskiranom poli-A sekvencom, efikasnije se translira od RNK koja ima maskiran poli-(A) rep. Termini "poli(A) rep" ili "poli-A sekvenca" odnose se na niz adenil (A) ostataka, koja se obično nalazi na 3’-kraju RNK molekula, dok termin "demaskirana poli-A sekvenca” označava da se poli-A sekvenca na 3’- kraju RNK molekula završava A nukelotidom, iza kojeg ne slede drugi nukleotidi osim A na 3’-kraju, odnosno, nizvodno od poli-A sekvence. Takođe, dugačka poli-A sekvenca od oko 120 baznih parova rezultira optimalnom transkripcionom stabilnošću i translacionom efikasnošću RNK.

[0169] Da bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se koristi prema pronalasku, ona se može modifikovati, tako da bude povezana sa poli-A sekvencom, poželjno poli-A sekvencom dužine 10 do 500, poželjnije 30 do 300, i još poželjnije 65 do 200 i naročito poželjno, 100 do 150 ostataka adenozina. U naročito poželjnom obliku izvođenja, poli-A sekvenca ima dužinu od oko 120 nukleotida. Da bi se dodatno povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se koristi prema pronalasku, poli-A sekvenca se može demaskirati.

[0170] Uz ovo, ugrađivanje 3’-netranslirajućeg regiona (UTR) u 3’-netranslirajući region RNK molekula može da rezultira ppvećanjem translacione efikasnosti. Može se očekivati sinergistički efekat ugrađivanjem dva ili više 3’-UTR regiona. Ovi 3’-UTR regioni mogu biti autologni ili heterologni u odnosu na RNK u koju se ugrađuju. U jednom poželjnom obliku izvođenja, 3’-UTR region je dobijen iz humanog gena za β-globin.

[0171] Kombinovanje prethodno pomenutih modifikacija, konkretno, ugrađivanje poli-A sekvence, demaskiranje poli-A sekvence i ugrađivanje jednog ili više 3’-UTR regiona može delovati sinregistički na stabilnost RNK i na povećanje njene translacione efikasnosti.

[0172] Termin "stabilnost" RNK odnosi se na “polu-život” RNK. Načelno, "polu-život" označava vreme koje je potrebno da se eliminiše polovina aktivnosti, količine ili broja molekula. U kontekstu predmetnog pronalaska, polu-život RNK ukazuje na njenu stabilnost. Polu-život RNK može da utiče na “trajanje ekspresije” RNK. Može se očekivati da će RNK koja ima veći poluživot biti eksprimirana tokom dužeg perioda.

[0173] Ako je prema pronalasku potrebno da se smanji stabilnost i/ili translaciona efikasnost RNK, moguće je modifikovati RNK tako da ta modifikacija utiče na funkciju opisanih elemenata, a koji deluju tako što povećavaju stabilnost i/ili translacionu efikasnost RNK.

[0174] Termin "ekspresija" se prema pronalasku koristi u svom najširem značenju i obuhvata produkciju RNK i/ili peptida, polipeptida ili proteina, procesima transkripcije i/ili translacije. U odnosu na RNK, termini “ekspresija” ili “translacija” odnose se na nastanak peptida, polipeptida ili proteina. Termini takođe obuhvataju delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Ekspresija može biti prolazna i stabilna.

[0175] Prema pronalasku, termin ekspresija takođe obuhvata “aberantnu ekspresiju” ili “nenormalnu ekspresiju”. U kontekstu pronalaska, “aberantna ekspresija” ili “nenormalna ekspresija” znače da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u odnosu na referent ekspresiju, a to je ekspresija kod subjekta koji nema bolest povezanu sa aberantnom ili nenormalnom ekspresijom nekog proteina, na primer, tumor-antigena. Termin povećanje ekspresije odnosi se na povećanje od najmanje 10%, konkretno, najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100% ili više. U jednom obliku izvođenja, ekspresija je utvrđena samo u obolelom tkivu, dok je u zdravom tkivu ekspresija represirana.

[0176] Termin "specifično eksprimiran" označava da je protein suštinski eksprimiran samo u određenom tkivu ili organu. Na primer, tumor-antigen specifično eksprimiran u sluzokoži želuca znači da je navedeni protein primarno eksprimiran u sluzokoži želuca i da u drugim tkivima i organima nije eksprimiran u značajnoj meri. Stoga je protein koji se isključivo eksprimira u ćelijama sluzokože želuca i značajno manje u svim drugim tkivima, kao što je na primer, testis, specifično eksprimiran u sluzokoži želuca. U neki oblicima izvođenja tumor-antigen može biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednog tkiva ili organa, kao što su 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tkiva ili organa. U ovom slučaju, tumor-antigen je specifično eksprimiran u ovim organima. Na primer, ako je tumor antigen pod normalnim uslovima eksprimiran na sličnom nivou u plućima i želucu, navedeni tumor antigen je specifično eksprimiran u plućima i želucu.

[0177] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin “transkripcija” odnosi se na proces, naznačen time da se genetički kod DNK sekvence “prepisuje”, odnosno, transkribuje u RNK. Nakon toga, nastala RNK translira se u protein. Prema predmetnom pronalasku, termin “transkripcija” obuhvata “in vitro transkripciju”, naznačeno time da se termin “in vitro transkripcija” odnosi na proces naznačen time da se RNK, konkretno iRNK sintetiše u in vitro sistemu van ćelije, pogodno u prisustvu potrebnih ćelijskog ekstrakta. Poželjno je korišćenje klonirajućih vektora. Klonirajući vektori se nazivaju i transkripcioni vektori i prema pronalasku su obuhvaćeni terminom “vektor”. Poželjno je da je RNK koja se koristi prema pronalasku, in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK), koja se može dobiti in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice. Promotor koji kontroliše transkripciju može biti promotor RNK polimeraze. Konkretni primeri RNK polimeraza su T7, T3, i SP6 RNK polimeraza. Poželjno je da je in vitro transkripcija prema pronalasku pod kontrolom T7 ili SP6 promotora. DNK matrica za in vitro transkripciju može se dobiti kloniranjem neke nukleinske kiseline, konkretno cDNK, i njenim uvođenjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reverznom transkripcijom RNK.

[0178] Termin "translacija", odnosi se na proces na ćelijskim ribozomima tokom kojeg lanac informacione RNK usmerava povezivanje amino kiselina u sekvencu peptide, polipeptida ili proteina.

[0179] “Sekevence koje kontrolišu ekspresiju” ili “regulatorne sekvence”, mogu biti funkcionalno povezane sa nukleinskom kiselinom i mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na nukleinsku kiselinu. Kodirajuća sekvenca i regulatorna sekvenca “funkcionalno” su povezane ukoliko su međusobno kovalentno vezane, tako da su transkcripcija ili translacija kodirajuće sekvence pod kontrolom ili pod uticajem regulatorne sekvence. Ukoliko kodirajuća sekvenca treba da se translira u funkcionalni protein, uz funkcionalnu vezu između regulatorne sekvence i kodrirajuće sekvence, indukcija regulatorne sekvence dovodi do transkripcije kodirajuće sekvence, ali tako da ne dođe do promene okvira čitanja u kodirajućoj sekvenci, niti nemogućnosti da se kodirajuća sekvenca translira u željeni protein ili peptid.

[0180] Termin "sekvenca koja kontroliše ekspresiju” ili "regulatorna sekvenca" obuhvata prema pronalasku, sekvence koja se vezuje za ribozom i ostale kontrolne elemente, koji kontrolišu transkripciju nukleinske kiseline ili translaciju dobijene RNK. U nekim oblicima izvođenja, regulatorna sekvenca se može kontrolisati. Precizna struktura regulatornih sekvenci može da varira zavisno od vrste ili zavisno od ćelijskog tipa, ali načelno obuhvata 5’-netranskribujuće i 5’-i 3’-netranslirajuće sekvence, koje su uključene u inicijaciju transkripcije ili translacije, kao što su TATA-boks, sekvenca kape, CAAT-sekvenca i slično. Konkretno, 5’-netranskribujuće regulatorne sekvence sadrže promotorski region koji obuhvata promotorsku sekvencu za transkripcionu kontrolu gena za koji su funkcionalno vezane. Regulatorne sekvence mogu takođe da obuhvate sekvencu pojačivača (inhenser) ili ushodnu aktivatorsku sekvencu.

[0181] Prema pronalasku, RNK koja se eksprimira u ćeliji uvodi se u tu ćeliju. U jednom obliku izvođenja postupka prema pronalasku, RNK koja je uvedena u ćeliju dobijena je in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice.

[0182] Prema pronalasku, fraze kao što su "RNK koja je sposobna da se eksprimira” ili “RNK koja kodira”, koriste se kao sinonimne fraze i u kontekstu konkretnog peptida ili polipeptida, fraza označava da ta RNK, ako je u pogodnom okruženju, poželjno u ćeliji, može da se eksprimira i da proizvede navedeni peptid ili polipeptid. Poželjno, RNK koja je prema pronalasku sposobna da stupi u interakciju sa ćelijskom mašinerijom za translaciju kako bi nastao peptid ili polipeptid, sposobna je da se eksprimira.

[0183] Termini kao što su "transferirati", "uvesti" ili "transfektovati" koriste se kao sinonimi i odnose na se uvođenje nukleinskih kiselina, konkretno egzogenih ili heterolognih nukleinskih kiselina, konkretno RNK, u neku ćeliju. Prema predmetnom pronalasku, ćelija može biti deo organa, tkiva i/ili organizma. Prema pronalasku, nukleinska kiselina se administrira kao gola nukleinska kiselina ili u kombinaciji sa administrirajućim agensom. Poželjno je da se nukleinska kiselina administrira u formi gole nukleinske kiseline. Poželjno je da se RNK administrira u kombinaciji sa stabilizujućim supstancama, kao što su inhibitori RNK-aze. Predmetni pronalazak takođe predviđa ponovljeno uvođenje nukleinske kiseline u ćelije kako bi se obezbedila produžena ekspresija tokom dužeg vremena.

[0184] Ćelije se mogu transfektovati posredstvom svakog nosača sa kojim je moguće povezati RNK, na primer, formiranjem kompleksa sa RNK ili posredstvom vezikula u kojima je RNK zatvorena ili inkapsuirana, što povećava stabilnost RNK u odnosu na golu RNK. Nosači koji se mogu primeniti prema pronalasku, obuhvataju, na primer, lipidne nosače, kao što su katjonski lipidi, lipozomi, konkretno, katjonski lipozomi, micele i nano-čestice. Katjonski lipidi mogu formirati komplekse sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinskih kiselina. Prema pronalasku je moguće primeniti svaki katjonski lipid.

[0185] Uvođenje RNK koja kodira peptid ili polipeptid u ćeliju, konkretno u ćeliju in vivo, dovodi do promene ekspresije tog peptida ili polipeptida u navedenojj ćeliji. U konkretnim oblicima izvođenja, poželjno je direktno usmeravanje nukleinske kiseline u određene ćelije. U ovim oblicima izvođenja, nosač koji se primenjuje u administraciji nukleinske kiseline u ćeliju (na primer, retrovirus ili lipozom), poseduju usmeravajući molekul. Na primer, molekuli, kao što su antitela specifična za molekule membrane ciljne ćelije ili ligandi receptora prisutni na ciljnoj ćeliji, mogu se ugraditi u nosač nukleinske kiseline ili se za njega mogu vezati. Kada se nukleinska kiselina administrira putem lipozoma, u lipozome je moguće ugraditi protein koji stupa u interakciju sa membranskim proteinom uključenim u proces endocitoze, čime se omogućava ciljano preuzimanje. Među usmeravajuće proteine spadaju i proteini kapsida i njihovi fragmenti specifični za određeni tip ćelije, antitela specifična za proteine koji se uvode u ćeliju, proteine koji su usmereni prema unutarćelijskoj lokaciji, i slično.

[0186] Termin "ćelija" ili "ćelija-domaćin", označava neku intaktnu ćeliju, odnosno, ćeliju sa intaktnom ćelijskom membranom, koja nije oslobodila svoj uobičajen unutarćelijski sadržaj, na primer, enzime, organele ili genetički materijal. Poželjno je da je intaktna ćelija, vijabilna ćelija, odnosno, da je živa i sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Navedeni termin se poželjno odnosi na bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati egzogenom nukleoinskom kiselinom. Prema pronalasku, termin ”ćelija” obuhvata prokariotske ćelije (na primer, E. coli) ili eukariotske ćelije (na primer, dendritske ćelije, B-ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata). Egzogena nukleinska kiselina se može naći unutar ćelije (i) slobodno raspršena, kao takva (ii) ugrađena u rekombinantni vektor, ili (iii) integrisana u genom ili mitohondrijsku DNK ćelije-domaćina. Posebno su poželjne sisarske ćelije, kao što su humane ćelije i ćelija miševa, hrčaka, svinja, koza ili primata. Ćelije se mogu dobiti iz velikog broja tkiva, i obuhvataju primarne ćelije i ćelijske linije. Primeri obuhvataju ćelije, kao što su keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije koštane srži, embrionalne matične ćelije. U nekim oblicima izvođenja, ćelija je antigenprezentujuća ćelija, konkretno, dendritska ćelija, monocot ili makrofag.

[0187] Poželjno je da ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline eksprimira peptid ili polipeptid koji kodiran tom nukleinskom kiselinom.

[0188] Termin "klonska ekspanzija" odnosi se na process umnožavanja nekog specifičnog entiteta. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin se poželjno koristi u kontekstu imunološkog odgovora u kojem limfociti stimulisani antigenom, proliferišu, a umnožavaju se samo specifični limfociti koji prepoznaju taj antigen. Poželjno je da klonska ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.

[0189] Termini kao što su "redukovanje" ili "inhibiranje" odnose se na sposobnost da se izazove smanjenje nivoa, poželjno, 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije 50% ili više, i najpoželjnije 75% ili više. Termin “inhibira” i slični obuhvata potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, odnosno, smanjenje do nule ili suštinski do nule.

[0190] Termini kao što je "povećanje", "pojačavanje", "podsticanje" ili "produžavanje" odnose se na povećanje, pojačanje, podsticanje ili produženje za najmanje 10%, poželjno, najmanje 20%, poželjno, najmanje 30%, poželjno, najmanje 40%, poželjno, najmanje 50%, poželjno, najmanje 80%, poželjno, najmanje 100%, poželjno, najmanje 200% i posebno poželjno, najmanje 300%. Ovi termini takođe se odnose na povećanje, pojačavanje, podsticanje ili produženje od nule ili nemerljivog i ne-detektabilnog nivoa do nivoa koji je veći od nule ili koji se može meriti ili detektovati.

[0191] Predmetni pronalazak obezbeđuje vakcine, na primer, kancersku vakcinu dizajniranu na bazi amino kiselinskih modifikacija ili modifikovanih peptida, čija se imunogenost predviđenja primenom postupka prema pronalasku.

[0192] Prema pronalasku, termin "vakcina" se odnosi na farmaceutski preparat (farmaceutsku kompoziciju) ili proizvod koji, nakon administracije, indukuje imunski odgovor, konkretno, ćelijski imunski odgovor, koji prepoznaje i napada patogen ili obolelu ćeliju, kao što je kancerska ćelija. Vakcina se može koristiti u prevenciji ili tretmanu bolesti. Termin “personalizovana vakcina protiv kancera” ili “individualizovana vakcina protiv kancera” odnosi se na konkretnog kancerskog pacijenta i označava da je kancerska vakcina prilagođena potrebama ili specijalnim okolnostima pojedinačnog kancerskog pacijenta.

[0193] U jednom obliku izvođenje, obezbeđena je vakcina koja sadrži peptid ili polipeptid, sa jednom ili više amino kiselinskih modifikacija ili sadrži jedan ili više modifikovanih peptida, čija je imunogenost predviđena postupcima prema pronalasku ili sadrži nukleinsku kiselinu, poželjno RNK, koja kodira naznačeni peptid ili polipeptid.

[0194] Kancerske vakcine obezbeđene predmetnim pronalaskom, kada se administriraju pacijentu, obezbeđuju jedan ili više epitopa T-ćelija pogodnih za stimulaciju, upoznavanje i/ili ekspanziju T-ćelija usmerenih nasuprot tumora tog pacijenta. T-ćelije su posebno usmerene prema ćelijama koje ispoljavaju antigene od kojih su dobijeni epitopi T-ćelija. Stoga su opisane vakcine sposobne da indukuju ili podstaknu ćelijski odgovor, poželjno aktivnost citotoksičnih T-ćelija, protiv kancera koje se odlikuje prezentacijom jednog ili više tumor-asociranih neoantigena sa klasom I MHC molekula. S obzirom na to da će vakcina prema pronalasku biti usmerena na kancer-specifične mutacije, ona će biti specifična za tumor jednog konkretnog pacijenta.

[0195] Kancerska vakcina dobijena prema pronalasku, odnosi se na vakcinu koja, kada se administrira pacijentu, obezbeđuje jedan ili više epitopa T-ćelija, kao što su 2 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više i poželjno do 60, do 55, do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 epitopa T-ćelija, sa ugrađenim aminokilseinskim modifikacijama, ili modifikovanim peptidima, za koje je primenom postupka prema pronalasku, predviđeno da su imunogeni. Ovi epitopi T-ćelija takođe se nazivaju "neo-epitopi". Prezentacija neo-epitopa od strane ćelija pacijenta, konkretno tumor-prezentujućih ćelija, poželjno dovodi do toga da T-ćelije ciljaju epitop kada je povezan sa MHC, pa stoga, deluju protiv tumora pacijenta, poželjno, primarnog tumora, i tumorskih metastaza, koje eksprimiraju antigene od kojih je T-ćelijski epitop dobijen i prezentuju iste epitope na površini tumorskih ćelija.

[0196] Postupci predmetnog pronalaska dalje obuhvataju korak određivanja primenjivosti identifikovanih amino kiselinskih modifikacija ili modifikovanih peptida za potrebe proizvodnje vakcine protiv kancera. Dakle, dodatni koraci mogu da obuhvate jedan ili više narednih postupaka:

(i) utvrđivanje da li je modifikacija lokalizovana u poznatim ili predviđenim MHC prezentovanim epitopima, (ii) in vitro i/ili in silico testiranje da li je modifikacija lokalizovana u MHC prezentovanim epitopima, na primer, testiranje da li su modifikacije deo peptidnih sekvenci koje se obrađuju u i/ili prezentuju kao MHC prezentovani epitopi, i (iii) in vitro testiranja da li su predviđeni modifikovani epitopi, konkretno, kada su prisutni su prirodnom kontekstu sekvence, na primer, kada su okruženi amino kiselinskim sekvencama koje takođe okružuju navedeni epitop u prirodno postojećem proteinu, i kada se eksprimiraju u antigen-prezentujućim ćelijama, sposobni da stimulišu T-ćelije, na primer, odgovarajuće specifične T-ćelije pacijenta. Ovakve bočne sekvence mogu da sadrže 3 ili više, 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno, do 50, do 45, do 40, do 35 ili do 30 amino kiselina, i mogu da okružuju sekvencu epitopa sa N-terminusne i/ili C-terminusne strane.

[0197] Modifikovani peptidi određeni prema pronalaski, mogu se rangirati na osnovu mogućnosti da se primene kao epitopi za razvoj kancerske vakcine. Stoga, u jednom aspektu, postupak prema pronalasku obuhvata manuelni ili kompjuterizovani analitički proces, kojim se identifikovani modifikovani peptidi analiziraju i selektuju prema mogućnosti da obezbede odgovarajuće vakcine. U poželjnom obliku izvođenja, naznačeni analitički proces je kompjuterizovani algoritamski proces. Poželjno, naznačeni analitički proces obuhvata određivanje i/ili rangiranje epitopa prema predviđanju njegove sposobnosti da bude imunogen.

[0198] Neo-epitopi identifikovani prema pronalasku i obezbeđeni vakcinom prema pronalasku, prisutni su u formi polipeptida u kojem se nalaze navedeni neo-epitopi, kao što su poliepitopski polipeptidi ili nukleinske kiseline, konkretno RNK, koja kodira takav polipeptid. Dalje, neoepitopi mogu biti prisutni u polipeptidu u formi sekvence vakcine, odnosno, prisutni u njihovom prirodnom kontekstu te sekvence, na primer, okruženi amino kiselinskim sekvencama koje okružuju te epitope u prirodno postojećem proteinu. Takve bočne sekvence mogu da sadrže 5 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više, i poželjno, do 50, do 45, do 40, do 35 do 30 amino kiselina i mogu da okružuju sekvencu epitopa sa N-terminusne i/ili C-terminusne strane. Stoga sekvenca vakcine može da sadrži 20 ili više, 25 ili više, 30 ili više, 35 ili više, 40 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 do 30 amino kiselina. U jednom obliku izvođenja, neo-epitopi i/ili sekvence vakcine poravnate su u polipeptidu od početka do kraja.

[0199] U jednom obliku izvođenja, sekvence neo-epitopa i/ili vakcine razdvojene su veznicima, konkretno neutralnim veznicima. Termin "veznik", prema pronalasku, odnosi se na peptid dodat između dva domena peptida, na primer, dve sekvence epitopa ili vakcine, kako bi se ti domeni povezali. Ne postoje posebna ograničenja u pogledu sekvence veznika. Međutim, poželjno je da sekvenca veznika smanjuje sterična ometačnja između dva peptidna domena, da se dobro translira i da omogućava obradu epitopa. Takođe, veznik treba da ne sadrži ili da sadrži malo imunogenih elemenata. Veznici ne treba da kreiraju ne-endogene neo-epitope, kao što su oni dobijeni na mestu povezivanja susednih neo-epitopa, a koji mogu izazovu neželjene imunske reakcije. Stoga, poliepitopska vakcina treba da sadrži sekvencu veznika koja je sposobna da smanji broj neželjenih MHC vezivanja susednih epitopa. Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) i Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004) pokazuju da sekvence bogate glicinom onemogućavaju proteazomalnu obradu, pa primena veznika sa visokim sadržajem glicina u sekvenci smanjuje broj peptida sa veznikom koje se mogu obraditi proteazomom. Takođe, uočeno je da glicin smanjuje snažno vezivanje peptide u MHC-vezujućoj poziciji žljeba (Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993). Studija Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005) pokazuje da amino kiseline glicin i serin u sastavu amino kiselinske sekvence, daju fleksibilniji protein koji se lakše translira i obrađuje proteazomom, što omogućava bolji pristup kodiranim neo-epitopima. Veznik može da sadrži 3 ili više, 6 ili više, 9 ili više, 10 ili više, 15 ili više, 20 ili više i poželjno do 50, do 45, do 40, do 35 do 30 amino kiselina. Poželjno je da je veznik bogat amino kiselinama glicin i/ili serin. Poželjno je da najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 95% sekvence veznika čine glicin i/ili serin. U jednom poželjnom obliku izvođenja, veznik je suštinski sačinjen od amino kiselina glicin i serin. U jednom obliku izvođenja, sekvenca veznika je (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e, naznačeno time da a, b, c, d i e, nezavisno predstavljaju brojeve izabrane između 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 i naznačeno time da je a b c d e različito od 0 i poželjno je 2 ili više, 3 ili više, 4 ili više ili 5 ili više. U jednom obliku izvođenja, veznik sadrži opisanu sekvencu, i sekvencu opisanu u primerima, na primer, GGSGGGGSG.

[0200] U jednom posebno poželjnom obliku izvođenja, polipeptid u koji je ugrađeno jedan ili više neo-epitopa, kao što je poliepitopski polipeptid prema pronalasku, administrira se pacijentu u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK, na primer in vitro transkribovane ili sintetske RNK, koja se eksprimira u ćeliji pacijenta, kao što je antigen-prezentujuća ćelija, kako bi se proizveo polipeptid. Predmetni pronalazak takođe predviđa administraciju jednog ili više multi-epitopskih polipeptida, koji su, za potrebe ovog pronalaska, obuhvaćeni terminom “poli-epitopski polipeptidi”, poželjno u formi nukleinske kiseline, poželjno RNK, kao što je in vitro transkribovana ili sintetska RNK, koja se mogu eksprimirati u ćeliji pacijenta, na primer, antigenprezentujućoj ćeliji, kako bi se proizveo jedan ili više polipeptida. U slučaju administracije jednog ili više multi-epitopskih polipeptida, neo-epitopi u sastavu multi-epitopskih polipeptida mogu se delimično ili potpuno preklapati. Kada se nađu u ćeliji pacijenta, kao što je antigenprezentujuća ćelija, polipeptid se obrađuje, kako bi nastali neo-epitopi, identifikovani prema pronalasku. Primena vakcine prema pronalasku može da obezbedi epitope prezentovane posredstvom MHC molekula klase II, sposobne da iniciraju odgovor CD4+ pomoćničkih T-ćelija, protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su dobijeni MHC-prezentovani epitopi. Alternativno ili dodatno, primena vakcine prema pronalasku, može da obezbedi epitope prezentovane posredstvom MHC molekula klase I, sposobnih da iniciraju odgovor CD8+ T-ćelija protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su MHC-prezentovani epitopi dobijeni. Dalje, administracija vakcine prema pronalasku, može da obezbedi jedan ili više neo-epitopa (uključujući poznate neo-epitope i neo-epitope identifikovane postupkom prema pronalasku), kao i jedan ili više epitopa koji ne sadrže kancer-specifičnu somatsku mutaciju, ali su eksprimirani u kancerskim ćelijama i poželjno indukuju imunski odgovor protiv kancerskih ćelija, poželjno, kancer-specifičan imunski odgovor. U jednom obliku izvođenja, primena vakcine prema pronalasku obezbeđuje neo-epitope, koji su prezentovani posredstvom MHC molekula klase II, i/ili su sposobni da iniciraju odgovor CD4+ pomoćničkih T-ćelija, usmeren protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih su MHC-prezentovani epitopi dobijeni, kao i epitopa koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije koje su epitopi prezentovani posredstvomMHC molekula klase I i/ili su sposobni da iniciraju odgovor CD8+ T-ćelija usmeren protiv ćelija koje eksprimiraju antigene od kojih se MHC-prezentovani epitopi dobijeni. U jednom obliku izvođenja, epitopi koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije dobijeni su od tumorantigena. U jednom obliku izvođenja, neo-epitopi i epitopi koji ne sadrže kancer-specifične somatske mutacije ispoljavaju sinergistički efekat u terapiji kancera. Poželjno, vakcina prema pronalasku korisna je za poliepitopsku stimulaciju odgovora citotoksičnih i/ili pomoćničkih T-ćelija.

[0201] Vakcina prema pronalasku može biti rekombinantna vakcina.

[0202] Termin "rekombinantan" u kontekst pronalaska, označava da je “dobijen genetičkim inženjerstvom”. Poželjno, “rekombinantan entitet”, kao što je rekombinantan polipeptid u kontekstu pronalaska, nije prirodno postojeći protein i rezultat je kombinacije entiteta, kao što su amino kiseline ili nukleinske kiseline, koje se ne kombinuju međusobno u prirodi. Na primer, rekombinantan polipeptid u kontekstu pronalaska, može da sadrži sekvencu od nekoliko amino kiselina, kao što su sekvence neo-epitopa ili vakcine dobijene iz različitih proteina ili različitih delova istog proteina, povezanih zajedno, na primer, peptidnom vezom ili odgovarajućim veznikom.

[0203] Termin "prirodno postojeći", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koji su prisutni u organizmu (kao i u virusima), i koji se mogu izolovati iz izvora u prirodi i koji nisu namerno izmenjeni od strane čoveka u laboratoriji smatraju se prirodno postojećima.

[0204] Opisani agensi, kompozicije i postupci mogu se primeniti u terapiji bolesti subjekta, na primer, bolesti koja se odlikuje prisustvom obolelih ćelija koje eksprimiraju antigen ili njegov fragment. Konkretno te bolesti su kanceri. Opisani agensi, kompozicije i postupci takođe se mogu primeniti u imunizaciji ili vakcinaciji sa ciljem sprečavanja opisanih bolesti.

[0205] Prema pronalasku, termin “bolest” odnosi se na svako patološko stanje, uključujući kancer, konkretno na opisane forme kancera.

[0206] Termin "normalan" odnosi se na zdrav status ili stanje zdravog subjekta ili tkiva, odnosno, na ne-patološke uslove, naznačeno time da “zdravo” poželjno znači ne-kancerozno.

[0207] "Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju antigen”, prema pronalasku označava da je detektovana ekspresija antigena u ćelijama obolelog tkiva ili organa. Ekspresija u ćelijama obolelog tkiva ili organa može biti povećana u odnosu na stanje kod zdravog tkiva ili organa. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, konkretno, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili i više. U jednom obliku izvođenja, ekspresija se detektuje samo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu represirana. Prema pronalasku, bolesti koje obuhvataju ili su povezane sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, obuhvataju kancerske bolesti.

[0208] Prema pronalasku, termini "tumor" ili "tumorska bolest" odnose se na nenormalan rast ćelija (koje se nazivaju neoplastične ćelije, tumorigene ćelije ili tumorske ćelije), koje formiraju oteklinu ili leziju. Pod “tumorskom ćelijom” se podrazumena izmenjena ćelija koja raste nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste i nakon početka delovanja stimulusa koji prekida rast. Tumori pokazuju delimičan ili potpuni gubitak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i uobičajeno formiraju distinktivnu masu tkiva, koja može biti benigna, pre-maligna i maligna.

[0209] Kancer (medicinski termin: maligna neoplazija) predstavlja klasu bolesti u kojoj kolekcija ćelija ispoljava nekontrolisano rast (deobe preko normalnog limita), invazivnost (upad u susedna tkiva i njegova destrukcija), i nekada metastazu (širenje na druga mesta u telu preko limfe i krvi). Ova tri maligna svojstva razlikuju benigne tumore, koji su samo-ograničavajući i koji ne invadiraju i ne metastaziraju. Većina kancera formira tumor, ali neki, kao što je leukemija ne. Malignitet, maligna neoplazija i maligni tumor su suštinski sinonimi sa kancerom.

[0210] Neoplazma je nenormalna masa tkiva koja je rezultat neoplazije. Neoplazija (novi rast, na grčkom jeziku), označava nekontrolisanu proliferaciju ćelija. Rast ćelija prevazilazi rast normalnog tkiva i nije koordinisan sa okolnim zdravim tkivom. Rast se nastavlja na isti preterani način, čak i nakon početka delovanja stimulusa koji prekida rast. To najčešće uzrokuje izraslinu ili tumor. Neoplazme mogu biti benigne, pre-maligne i maligne.

[0211] "Rast tumora" ili "tumorski rast", prema pronalasku, odnose se na tendenciju tumora da uveća svoju veličinu i/ili na tendenciju tumorskih ćelija da proliferišu.

[0212] Za potrebe predmetnog pronalaska, termini “kancer” i “kancerska bolest” koriste se kao međusobno zamenjivi sinonimi sa terminima "tumor" i "tumorska bolest".

[0213] Kanceri se klasifikuju na osnovu tipa ćelija na koje tumor liči, kao i tkiva iz kojeg tumor vodi poreklo. Kriterijumi klasifikacije su histologija i lokalizacija.

[0214] Termin "kancer", prema pronalasku, obuhvata karcinome, adenokarcinome, blastome, leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, rektalni kancer, endometrijalni kancer, kancer bubrega, adrenalni kancer, tiroidni kancer, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, cervikalni kancer, intestinalni kancer, kancer jetre, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer tankog creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnog čvora, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, nosa i grla (ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, ovarijalni kancer i kancer pluća, i njihove metastaze. Primeri su plućni karcinom, karcinom dojke, karcinom prostate, karcinom debelog creva, karcinom bubrežnih ćelija, cervikalni karcinom, ili metastaze tipova i kancera koji su pomenuti. Termin kancer, prema pronalasku takođe obuhvata metastaze kancera i relaps kancera.

[0215] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje kancera sa originalnog mesta u druge delove tela. Formiranje metastaze je složen process i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije u vanćelijski matriks, probijanja endotelne bazalne lamine, kako bi zašao u telesne šupljine ili sudove, i, nakon što je transportovan krvlju, infiltriranja u druge, ciljne organe. Nakon toga rast novog tumora, odnosno, sekundarnog tumora ili metastatskog tumora na udaljenom mestu, zavisi od angiogeneze. Tumorska metastaza najčešće se dešava nakon uklanjanja primarnog tumora, jer tumorske ćelije ili komponente mogu da ostanu nakon intervencije i da razviju metastatski potencijal. U jednom obliku izvođenja, termin “metastaza” prema pronaalsku, odnosi se na “udaljene metastaze”, koje označavaju metastaze udaljene od primarnog tumora i regionalnog limfnog čvora.

[0216] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su slične originalnom tumoru. To znači, na primer, kada metastazira ovarijalni kancer u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od izmenjenih ovarijalnih ćelija, a ne od izmenjenih ćelija jetre. Tumor u jetri se tada označava terminom metastatski ovarijalni kancer, a ne kancer jetre.

[0217] Termin "cirkulišuće tumorske ćelije" ili "CTC" označava ćelije koje su se odvojile od primarnog tumora ili tumorskih metastaza i cirkulišu krvotokom. CTC mogu da budu začetak rasta narednih tumora (metastaza) u drugim tkivima. Cirkulišuće tumorske ćelije se uočavaju u frekvenciji od 1-10 CTC ćelija po mL ukupne krvi pacijenta sa metastatskim tumorom. Razvijeni su istraživački postupci za izolovanje CTC. Nekoliko istraživačkih postupaka za izolovanje CTC opisano je u stanju tehnike, na primer, postupci koji se zasnivaju na činjenici da epitelne ćelije eksprimiraju ćelijski adhezioni molekul EpCAM, koji se ne eksprimira u normalnim, neizmenjenim ćelijama krvi. Hvatanje CTC ćelija uključuje tretiranje uzorka krvi antitelima usmerenim protiv EpCAM, koja su konjugovana sa magnetnim česticama, nakon čega sledi separacija obeleženih ćelija u magnetnom polju. Izolovane ćelije se zatim boje antitelima na druge epitelne markere, citokeratin, kao i na uobičajeni leukocitni marker CD45, kako bi se razlikovale retke CTC od kontaminiraućih belih krvnih ćelija. Ovaj robusni i poluautomatizovanu pristup identifikuje CTC sa prosečnim prinosom od oko 1 CTC/mL i čistoćom od 0.1% (Allard et al., 2004: Clin Kancer Res 10, 6897-6904). Drugi postupak izolovanja CTC ćelija bazira se na primeni mikrofluidnog CTC-vezujućeg uređaja, koji uključuje proticanje cele krvi kroz komoru sa 80000 mikronskih mesta koji su obloženi antitelom specifičnim za EpCAM. CTC se boje sekundarnim antitelima specifičnim za citokretain ili neke tkivne specifične markere, kao što je PSA kod kancera prostate, ili HER2 kod kancera dojke, i vuzuelizuju se automatizovanim skeniranjem mikro-pozicija u više planova trodimenzionalnog sistema. CTC-čipovi mogu da identifikuju citokeratin-pozitivne cikrulišuće tumorske ćelije kod pacijenata, sa srednjim prinosom od 50 ćelija/ml i čistoćom od 1-80% (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). Još jednu postupakt izolovanja CTC-a bazira se na primeni CellSearch™ Circulating Tumor Cell (CTC) Testa koji je proizveden od Veridex, LLC (Raritan, NJ), koji omogućava vezivanje, identifikovanje i brojanje CTC-a u epruveti sa krvlju. Sistem The CellSearch™ system je odobren od U.S. Food and Drug Administration (FDA), za brojanje CTC u celoj krvi, a zasniva se na kombinaciji imunomagnetskog obeležavanja i automatizovane digitalne mikroskopije. U literaturi su opisane i druge metode izolovanja CTC, i sve se mogu primeniti u vezi sa predmetnim pronalaskom.

[0218] Relaps ili obnavljanje bolesti koji se dešava se kada je osoba pogođena patološkim stanjem koje se već desilo u prošlosti. Na primer, ako je pacijent bolovao od tumora, primio uspešnu terapiju za navedenu bolest i ponovo nakon nekog vremena razvio istu bolest, navedena pojava bolesti može se smatrati relapsom ili recidivom. Relaps ili recidiv tumora može i ne mora da se ponovi na mestu originalnog tumora. Na primer, ako je pacijentkinja bolovala od ovarijalnog tumora i primila uspešan tretman, relaps ili recidiv mogu biti recidiv ovarijalnog tumora ili recidiv tumora na drugom mestu. Relaps ili recidiv tumora takođe obuhvata situacije naznačene time da se tumor javlja na drugačijem mestu od originalnog tumora, ili na mestu originalnog tumora. Originalni tumor za koji je pacijent dobio tretman naziva se primarni tumor, a tumor na mestu koje se razlikuje od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.

[0219] Pod terminom "tretman" podrazumeva se administracija jedinjenja ili kompozicije prema pronalasku, u cilju prevencije ili eliminacije tumora ili broja tumora kod pacijenta; prestanka ili usporavanja bolesti kod subjekta; inhibicije ili usporenja razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenja frekvencije ili ozbiljnosti simptoma i/ili recidiva kod subjekta koji trenutno boluje ili je bolovao od bolesti; i/ili produženje, povećanje životnog veka subjekta. Konkretno, termin “tretman bolesti” obuhvata lečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, prevenciju, usporavanje ili inhibiciju progresije ili pogoršanja, ili preveniranje ili odlaganje početka bolesti ili njenih simptoma.

[0220] Pod terminom "biti u riziku" označava se subjekt, odnosno, pacijent, kod kojeg je identifikovana veća šansa da razvije bolest, konkretno kancer, u odnosu na opštu populaciju. Uz to, subjekt koji je imao ili trenutno ima bolest, konretno, kancer, jeste subjekt kod kojeg postoji povećani rizik od razvoja bolesti, jer takav subjekt može da nastavi da razvija bolest. Subjekti koji trenutno boluju ili su imali kancer, takođe su u povećanom riziku od kancerskih metastaza.

[0221] Termin "imunoterapija" označava tretman koji uključuje aktivaciju specifične imunske reakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, termini kao što su “štiti”, “prevenira”, “profilaksa” ili “protekcija” odnose se na prevenciju ili tretman ili oboje, recidiva i/ili propagacije bolesti kod subjekta, konkretno, na smanjenje verovatnoće da će subjekt razviti bolest ili na odlaganje razvoja bolesti. Na primer, osoba u riziku od tumora, kao što je opisano, bila bi kandidat za terapiju prevencije tumora.

[0222] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena vakcine prema pronalasku, štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapeutska administracija imunoterapije, na primer, terapeutska administracija vakcine prema pronalasku, može dovesti do inhibicije progresije/rasta bolesti. To obuhvata usporavanje progresije/rasta bolesti, konkretno sprečavanje progresije bolesti, što poželjno dovodi do uklanjanja bolesti.

[0223] Imunoterapija se može izvesti primenom različitih tehnika, u kojima agensi prema pronalasku uklanjaju bolesne ćelije pacijenta. Uklanjanje se može desiti usled pojačavanja ili indukovanja u pacijentu, imunskog odgovora specifičnog za antigen ili za ćelije koje eksprimiraju antigen.

[0224] U okviru nekih oblika izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, kod koje se tretman zasniva na in vivo stimulaciju endogenog imunskog sistema koji reaguje nasuprot obolelih ćelija administracijom agenasa koji modifikuju imunski odgovor (kao što su polipeptid i nukleinske kiseline, prema pronalasku).

[0225] Agensi i kompozicije prema pronalasku koriste se samostalno ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapeutskim režimima, kao što su hirurška operacija, zračenje, hemoterapija i/ili transplantacija koštane srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).

[0226] Termini "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuju postupak tretairanja subjekta sa ciljem indukovanja imunskog odgovora iz terapeutskih ili profilaktičkih razloga.

[0227] Termin "in vivo” odnosi se na stanje u živom subjektu.

[0228] Termini "subjekt", "individua", "organizam" ili "pacijent" koriste se kao sinonimi, i odnose se na kičmenjake, poželjno sisare. Na primer, sisari u kontekstu pronalaska, su ljudi, primati, domaće životinje, kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji i td, laboratorijske životinje, kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, i td, kao i životinje u zatočeništvu, na primer, u zoološkim vrtovima. Termin “životinja”, u značenju koje je ovde primenjeno, obuhvata ljude. Termin “subjekt” takođe može da označi pacijenta, odnosno, životinju, poželjno čoveka koji je bolestan, poželjno od opisanih bolesti.

[0229] Termin "autologno" se koristi da opiše bilo šta što je dobijeno od subjekta. Na primer, “autologni transplant” se odnosi na transplant tkiva ili organa koji je dobijen od istog tog subjekta. Ovi postupci su pogodni jer prevazilaze imunološke barijere koje bi dovele do odbacivanja.

[0230] Termin "heterologno" se koristi da opiše nešto što se sastoji od više različitih elemenata. Na primer, transfer koštane srži jedne osobe u drugu osobu predstavlja heterolognu transplantaciju. Heterologni gen je gen dobijen iz drugog izvora, a ne od subjekta.

[0231] Kao deo kompozicije za imunizaciju ili vakcinaciju, poželjno se administrira jedan ili više agenasa, zajedno sa jednim ili više adjuvanasa za indukciju imunskog odgovora ili povećanje imunskog odgovora. Termin “adjuvans” odnosi se na jedinjenja koja prolongiraju ili pojačavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. Kompozicija prema pronalasku ispoljava efekat bez dodavanja adjuvansa. Ipak, kompozicija prema pronalasku može da sadrži poznate adjuvanse. Adjuvans obuhvata heterologne grupe jedinjenja, kao što su uljane emulzije (na primer Frojndov adjuvans), mineralna jedinjenja (na primer, aluminijum), bakterijske proizvode (kao što je, Bordetella pertussis toksin), lipozome, i imuno-stimulatorne komplekse. Primeri mogućih adjuvanasa su monofosforil-lipid-A (MPL SmithKline Beecham). Saponini, kao što je QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, and QS-L1 (So et al., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), nekompletni Frojndov adjuvans, kompletni Frojndov adjuvans, vitamin E, montanid, aluminijum, CpG oligonukleotidi (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), i različite emulzije voda-u-ulju, koje se dobijaju od biološki razgradivih ulja, kao što je skvalen i/ili tokoferol.

[0232] Moguće je administrirati i druge supstance koje stimulišu imunski odgovor pacijenta. U sastavu vakcine moguće je primeniti citokine, zbog njihovih regulatornih efekata prema limfocitima. Citokini uključuju, interleukin-12 (IL-12), koji povećava protektivne efekte vakcina (uporediti, Science 268:1432-1434, 1995), zatim GM-CSF i IL-18.

[0233] Brojna jedinjenja pojačavaju imunski odgovor, pa se mogu primeniti u proizvodnju vakcine. Ta jedinjenja uključuju ko-stimulatorne molekule u formi proteina ili nukleinskih kiselina, kao što su B7-1 i B7-2 (CD80, odnosno, CD86).

[0234] Uzorak, prema pronalasku, može biti tkivni uzorak, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak. Telesni uzorci se mogu dobiti na uobičajeni način, na primer, biopsijom, uključujući biopsiju male količine tkiva, uzimanje krvi, bronhijalnog aspirata, ispljuvka, urina, fecesa, i drugih telesnih tečnosti. Prema pronalasku, termin “uzorak” takođe obuhvata obrađene uzorke, kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, na primer, nukleinske kiseline ili ćelijski izolati.

[0235] Agensi, kao što su opisane vakcine i kompozicije, mogu se administrirati na uobičajeni način, uključujući injekciju ili infuziju. Administracija se može sprovesti, na primer, oralno, intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano ili transdermalno. U jednom obliku izvođenja, administracija se izvodi intranodalno, na primer, injektovanjem direktno u limfni čvor. Ostale forme administracije predviđaju in vitro transfekciju antigen-prezentujućih ćelija, kao što su dendritske ćelije, opisanim nukleinskim kiselinama, i sledstvenu administraciju antigenprezentujućih ćelija.

[0236] Opisani agensi se primenjuju u efektivnim količinama. Termin “efektivna količina” odnosi se na količinu koja postiže željenu reakciju ili željeni efekat samostalno ili u kombinaciji sa drugim dozama. U slučaju tretmana određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo uključuje usporavanje napretka bolesti i konkretno, prekid ili reverziju napretka bolesti. Željena reakcija u tretmanu bolesti ili stanja takođe može biti odlaganje početka ili prevencija početka naznačene bolesti ili stanja.

[0237] Efektivna količina opisanog agensa zavisi od patološkog stanja koje se tretira, ozbiljnosti bolesti, individualnih parametara pacijenta, fiziološkog stanja, veličine i mase, trajanja tretmana, tipa prateće terapije (ako je ima), specifične rute administracije i drugih sličnih faktora. Shodno tome, doze opisanih agenasa koje se administriraju zavise od različitih parametara. U slučaju da je nakon početne doze pacijent pokazao nedovoljnu reakciju, doza se može povećati (ili se efektivno povećati, što se postiže lokalizovanijim putem primene).

[0238] Poželjno je da su farmaceutske kompozicije, prema pronalasku, sterilne i da sadrže efektivnu količinu terapeutski aktivne supstance, kako bi se izazvala željena reakcija ili željeni efekat.

[0239] Opisane farmaceutske kompozicije se načelno administriraju u farmaceutski pogodnim količinama i u farmaceutski kompatibilnim preparatima. Termin “farmaceutski kompatibilan” odnosi se na netoksični materijal koji ne interferira sa aktivnošću aktivne komponente farmaceutske kompozicije. Preparati ovoga tipa mogu da sadrže soli, pufere, konzervanse, nosače, imuno-suplemente, kao što su adjuvansi, na primer, CpG oligonukleotide, citokine, hemokine, saponine, GM-CSF i/ili RNK i, kada je potrebno, ostala terapeutski aktivna jedinjenja. Kada se koriste u farmaceutske svrhe, soli treba da budu farmaceutski prihvatljive. Međutim, soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se koristiti za dobijanje farmaceutski kompatibilnih soli i stoga su uključene u predmetni pronalazak. Farmakološki i farmaceutski kompatibilne soli ovog tipa su, bez ograničenja, one koje su dobijene od narednih kiselina: hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, azotna, fosforna, maleinska, sirćetna, salicilna, limunska, mravlja, jabučna, ćilibarna i slične. Farmaceutski kompatibilne soli mogu se dobiti kao soli alkalnih metala ili alkalnih zemljanih metala, kao što su soli natrijuma, soli kalijuma i soli kalcijuma.

[0240] Opisane farmaceutske kompozicije mogu da sadrže farmaceutski kompatibilan nosač. Termin “nosač” označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodnu ili sintetsku, sa kojoj se aktivna supstanca meša, kako bi se olakšala primenaa. Termin “farmaceutski kompatibilan nosač”, prema pronalasku, obuhvata jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih filera, rastvarača i inkapsulirajućih supstanci, pogodnih za primenu kod pacijenta. Komponente farmaceutske kompozicije prema pronalasku, najčešće su takve, da nema interakcija koje značajno utiču na željenu farmaceutsu efikasnost.

[0241] Opisana farmaceutska kompozicija može da sadrži pogodne pufere, kao što su soli sirćetne kiseline, soli limunske kiseline, soli borne kiseline i soli fosforne kiseline.

[0242] Farmaceutske kompozicije mogu, kada je potrebno, da sadrže i konzervanse, kao što su benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerozal.

[0243] Farmaceutske kompozicije obično su u uniformnim doznim formama i mogu se pripremiti prema poznatim postupcima. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti u formi kapsula, tableta, lozenge, rastvora, suspenzija, sirupa, eliksira ili u formi emulzije.

[0244] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Takođe, kao medijumi za rastvore ili suspenzije najčešće se koriste sterilna fiksna ulja.

[0245] Predmetni pronalazak je detaljno objašnjen narednim slikama i primerima, čija je svrha da pronalazak ilustruju, a ne da ga ograniče. Zahvaljujući opisu i primerima, pridruženi oblici izvođenja koji su isto tako uključeni u pronalazak, dostupni su poznavaocima stanja tehnike.

SLIKE

[0246]

Slika 1. Kratak pregled alata za predviđanje MHC vezivanja

Slika 2. Analiza imunogenosti u funkciji Mmutskora za 50 prioritetnih B16F10 mutacija i 82 prioritetne CT26.WT mutacije (ukupno 132 mutacije), od kojih je 30 bilo imunogeno. U svim navedenim slučajevima, vakcinacija je izvršena primenom RNK. Procena imunogenosti u B16F10 ćelijama testirana je nakon transfekcije BMDC ćelija RNK, i merenjem imunskog odgovora splenocita, primenom ELISPOT i FACS metoda. Imunogenost za CT26.WT procenjena je nakon separatnog tretiranja BMDC ćelija primenom RNK molekula i peptidnih molekula, i merenjem imunskog odgovora splenocita, pomoću ELISPOT metode; mutacije su smatrane imunogenima ukoliko su peptid ili RNK registrovali imunski odgovor. A Kumulativna distribucija imunogenih mutacija u funkciji Mmutskora. Grafik prikazuje ukupan broj mutacija ispod datog Mmutskora (crveno), među njima, broj mutacija koje su imunogene (plavo), i procenat imunogenih mutacija po Mmutintervalu u opsegu ≤ 0.3, (0.3, 1], >1. Prikazane greške su standardne greške.

Slika 3. Analiza imunogenosti B16F10 i CT26.WT u funkciji Mmut. Kumulativna distribucija imunogenih mutacija u funkciji Mmutskora za B16 (A) i CT26 (C) ćelije. Histogram procenta imunogenih mutacija po Mmutintervalu, za sledeće opsege: [0.1, 0.3], (0.3, 1], (1,∞) za B16 (B) i CT26 (D). Slike A i B se zasnivaju na analizi 50 prioritetnih B16F10 mutacija, od kojih je 12 bilo imunogeno. Slike C i D se zasnivaju na analizi 82 prioritetne mutacije u B16F10 ćelijama, od kojih je 30 bilo imunogeno. Za više detalja videti legendu Slike 2. Greške su standardne greške.

Slika 4. Modeli imunogenosti i kontrolne hipoteze. Imunogenost klase I, označena kao HA, zasniva se na pretpostavci da su oba epitopa, WT i MUT, prezentovana od strane ćelija, i da je mutacija u dovoljnoj meri promenila fizičko-hemijska svojstva amino kiseline, tako da imunski sistem registruje ovu promenu i inicira imunski odgovor (označeno munjom). Hipoteza Hnkoja služi kao kontrola HAhipotezi, predstavlja invertovanu HAhipotezu, u tom smislu što mutacija nije značajno izmenila fizičko-hemijska svojstva amino kiseline, pa je manja verovatnoća da će mutacija biti “detektovana” od strane imunskog sistema i da će izazvati imunski odgovor. Kod imunogenosti klase II (HBU HC), WT epitop nije prezentovan, dok je MUT epitop prezentovan. HBi HCrazlikuju se prema visokom (T > τ) odnosno, niskom (T ≤ τ) T skoru. Obratiti pažnju da je za slučaj α*=α, model imunogenosti HBC1(Mmut<β) mešavina sve četiri grupe: HBC1=U[HA,HB,HC,Hn].

Slika 5. Pretpostavljeni odnos T skora prema imunogenosti. Prema modelu imunogenosti klase I, tokom sazrevanja T ćelija uklanjaju se TCR koje snažno vezuju neizrođeni epitop. Preostale TCR trebalo bi da ispolje slab ili nikakav afinitet vezivanja za neizrođeni epitop (A). Epitopi koji sadrže amino kiselinsku supstituciju koja ima visok T skor, imaju fizičko-hemijske osobine slične neizrođenoj amino kiselini, verovatno će imati slab uticaj na afinitet vezivanja za postojeće TCR. (B). Epitopi koji sadrže amino kiselinsku supstituciju sa niskim T skorom imaju veću šansu da povećaju afinitet vezivanja za postojeće TCR, pa time i veću verovatnoću da budu imunogeni (C). Na shematskom prikazu, korišćen je kolorni kod sparivanja T ćelije sa odgovarajućim peptidom. Oranž/žute mutacije sa visokim T skorom (amino kiseline slične su neizrođenim), dok plave/ljubičaste mutacije označavaju mutacije sa niskim T skorom (značajne fizičko-hemijske razlike u poređenju sa neizrođenom amino kiselinom).

Slika 6. Kumulativna distribucija imunogenih mutacija u funkciji Mmut. A Poređenje procenta imunogenih mutacija koje zadovoljavaju hipotezu bazalne kontrole HBC1: {Mmut≤ β}, sa procentom imunogenih mutacija koji zadovoljava parcijalnu hipotezu HA’: HBC1∩ {T ≤ τ}, parcijalnu hipotezu HBC2: HBC1∩ {Mmut≤ α} i punu hipotezu HA: HBC1∩ {Mmut≤ α} ∩ {T ≤ τ}, za α = 1, τ = 1. B Poređenje procenta imunogenih mutacija koje zadovoljavaju hipoteze bazalne kontrole HBC1: {Mmut ≤ β}, sa procentom imunogenih mutacija koje zadovoljavaju inverzne parcijalne hipoteze: HBC1∩ {T > τ} i HBC1∩ {Mmut>α}. Analiza na slikama A i B zasniva se na prikupljenim setovima podataka za B16F10 i CT26.WT, upoređivanjem 132 mutacije, od kojih je 30 bilo imunogeno. Svaka tačka na grafiku zasniva se na ≥ 4 mutacija.

Slika 7. Kumulativna distribucija imunogenih mutacija u funkciji Mmutskora. Poređenje procenata imunogenh mutacija koje zadovoljavaju hipotezu bazalne kontrole HBC1: {Mmut≤ β}, sa procentom imunogenih mutacija koje zadovoljavaju parcijalnu hipotezu HA’: HBC1∩ {T ≤ τ}, parcijalnu hipotezu HBC2: HBC1∩ {Mmut≤ α} i punu hipotezu HA: HBC1∩ {Mmut≤ α} ∩ {T ≤ τ}, uz uslov da je α = 1, τ = 1 za B16 (A) i CT26 (C). Poređenje procenata imunogenih mutacija koje zadovoljavaju hipoteze bazalne kontrole HBC1: {Mmut≤ β} sa procentom imunogenih mutacija koje zadovoljavaju inverzne parcijalne hipoteze: HBC1∩{T > τ} i HBC1∩ {Mmut> α} za B16 (B) i CT26 (D). Slike A i B zasnivaju se na analizi 50 prioritetntih mutacija u B16F10, od kojih je 12 imunogeno. Slike C i D zasnivaju se na 82 priroritetne mutacije u B16F10, od kojih je 30 imunogeno. Svaka tačka na grafiku se zasniva na ≥ 4 mutacije.

Slika 8. Kontrola WT imunogenosti. Da bi se proverilo da li izostavljanje MUT+/WT+ rešenja ima uticaj na ishode, isključili smo iz seta podataka 9 MUT+/WT+ mutacija i 2 mutacije za koje WT nije izmeren, što je ostavilo ukupno 121 mutaciju (43 B16 i 78 CT26), od kojih je 19 bilo MUT+/WT- (5 za B16 i 14 za CT26). Opet su utvrđeni isti trendovi kao i kod spojenih setova podataka, konkretno, ne-linearni odgovor u funkciji Mmutskora, nadmoće HAhipoteze nad parcijalnom hipotezom, i nedostaci invertovane hipoteze u odnosu na hipotezu bazalne kontrole HBC1. A Kumulativna distribucija imunogenosti u funkciji Mmutskora. B Histogram procenata imunogenih mutacija po Mmutintervalu. C Poređenje procenata imunogenih mutacija koje zadovoljavaju hipoteze bazalne kontrole HBC1sa HA’, HBC2i HA. D Poređenje procenata imunogenih mutacija koje zadovoljavaju hipoteze bazalne kontrole HBC1sa inverznim hipotezama. Videti legendu Sl.5 za više detalja.

Slika 9. Frakcija imunogenih mutacija u funkciji RPKM. Crveno: svih 50 mutacija u B16 i 82 mutacije u CT26 bez filtriranja (ukupno 132). Plavo: mutacije koje zadovoljavaju HAhipotezu sa α = 1, β = 0.5, τ = 1. B. Procenat imunogenih mutacija za različite RPKM opsege bez filtriranja. RPKM intervali su: 1=(0,1],2=(1,5],3=(5,50],4=(50,∞). C. Procenat imunogenih mutacija za različite opsege RPKM pod HAhipotezom, sa α = 1, β = 0.5, τ = 1. RPKM intervali su: 1=(0,1], 2=(1, ∞). Greške su S.E.

Slika 10. Mutirane pozicije u epitopima sidra i ne-sidra klase II. Motivi pozicija u sidrima analizirani su pomoću SYFPEITHI.

Slika 11. Predloženi modeli imunogenih tumor-asociranih epitopa.

Slika 12. Primer postupka pondiranja položaja mutacija. Svaka pozicija mutacije na listi rangiranih mutacija može se dodatno ponderisati brojem rešenja za svaku kombinaciju HLA tipa pacijenata, mogućim opsegom dužine HLA tipa i pozicijom mutacije unutar epitopa koja je dovela do rešenja sa niskim Mmutili je rezultirala HAi/ili HBU HCklasifikacijom. S obzirom na to da se sva rešenja po mutaciji potencijalno mogu predstaviti paralelno, faktor ponderisanja može značajno doprineti rangiranju pozicije mutacije.

Slika 13. Primer rasejanog dijagrama svih rešenja epitopa za mutacije chr14_52837882 iz CT26 prema Mmuti ΔM = Mmut- Mwt.

PRIMERI

[0247] Opisane tehnike i postupci sprovode se na način koji je poznat i opisan, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci, uključujući upotrebu kompleta i reagenasa sprovode se prema uputstvima proizvođača, ukoliko nije drugačije naznačeno.

Primer 1: Uspostavljanje modela za predviđanje imunogenosti epitopa T-ćelija

[0248] Prethodno smo ispitali imunogenost 50 somatskih mutacija idnetifikovanih u ćelijskoj liniji B16F10 mišjeg melanoma (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). Ovih 50 mutacija je selektovano je iz ukupnog pula od 563 eksprimirane ne-sinonimne somatske mutacije, kako bi se maksimalno povećala ekspresija MHC klase I (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081(2012)) (videti takođe Primer 2). Za svaku mutaciju smo predvideli minimalni epitop, odnosno, epitop koji pokazuje najniži MHC I konsenzusni skor (Y. Kim et al., Nucleic Acids Research 40, W525 (2012)) (ovde označen sa Mmut), kada se pretražuje prostor svih mogućih alela MHC klase I, dužine potencijalnih epitopa i okvir čitanja sekvence (mesto gde će se pozicionirati mutacija) (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). Merenje imunogenosti ovih mutacija primenom RNK vakcinacije, i sledstvena detekcija peptida (vidi Primer 2), potvrdila je prethodne nalaze dobijene primenom peptidne vakcine (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)), i pokazala je da je samo 12 od 50 mutacija (24%) bilo imunogeno (Tabela 1), sa MUT+/WT- sekvencama koje obuhvataju samo 10% svih testiranih mutacija.

Tabela 1. Broj imunogenih mutacija nakon RNK vakcinacije mišjih linija B16F10 i CT26.WT

linija

*Dve CT26 MUT+ mutacije su isključene iz tabele jer njihova WT reaktivnost nije bila izmerena. Ukupno je bilo 18 MUT+ mutacija od 82 do tada detektovane CT26 mutacije, što je nivo uspešnosti od 22%.

[0249] Rezultati testa na mišjoj B16F10 liniji pokazali su da je slučajna selekcija eksprimiranih ne-sinonimnih mutacija sa niskim Mmutskorovima (≤ 3.9) rezultovala prilično niskim nivoom uspešnosti predikcije. Potrebno je bolje razumevanje mehanizama koji uslovljavaju imunogenost, ukoliko se želi da personalizovane vakcine usmerene protiv tumor-specifičnih neo-antigena postanu efikasne terapije. U cilju otrkivanja dodatnih varijabli koje doprinose imunogenosti, izučili smo imunogenost eksprimiranih ne-sinonimnih somatskih mutacija identifikovanih u mišjoj liniji kolorektalnog tumora CT26.WT. Ukupno je izabrano 96 mutacija na osnovu Mmutskorova (od niskih ka visokim), srednje vrednosti RPKM (od niske ka visokoj) i ćelijske lokalizacije (unutarćelijska, prema vanćelijskoj), i testirana je imunogenost primenom RNK vakcine, uz detekciju i peptida i RNK (videti primer 2 za više detalja). Zajedno sa B16F10 ćelijskom linijom, set podataka je sada činilo 132 epitopa, čija je imunogenost izmerena ex vivo na mišjim splenocitima.

[0250] MHC konsenzusni skor. Da bi ispitali zavisnost imunogenosti od Mmut,, predstavili smo zavisnost kumulativnog procenta imunogenih mutacija u funkciji Mmut, odnosno, procenat mutacija sa Mmutskorom koji je manji od definisane vrednosti praga (koja je označena sa β) za imunogenost. Analiza kombinovanog seta podataka za B16 i CD26 u obimu od 132 mutacije pokazala je izrazito ne-linearnu zavisnost stope uspešnosti predikcije imunogenosti od Mmutskora (Sl. 2A). Sl. 2A pokazuje da su imunogene mutacije posebno brojne za veoma niske vrednosti Mmutskorova (≤ ∼ 0.2). Za Mmut≤ 0.1, procenat imunogenih mutacija dostiže maksimum na ∼ 60%, a zatim brzo pada sa porastom Mmut, na nivo ispod ∼ 25% za vrednosti skorova Mmut ≥ 2. Procenat imunogenih mutacija sa Mmut≤ 0.3 prema > 0.3 bio je 44.4% u poređenju sa 17.1%, uz statističku značajnost (P vrednost = 0.004, Fisher-ov test, jednosmeran). Histogram procenta imunogenih mutacija za tri Mmutopsega: ≤0.3, (0.3, 1] i >1, pokazuje da procenat imunogenih mutacija opada sa povećanjem Mmut(Sl. 2B). Razlike stopa uspešnosti između najnižeg opsega (Mmut≤ 0.3), 44.4%, srednjeg, 20.7%, i najvišeg opsega (Mmut>1), 15.8%, na Sl.2B, statistički su značajne (P vrednosti = 0.05, odnosno, 0.004, Fisher-ov test, jednosmerni), što ukazuje da za vrednosti Mmut> ∼0.3, stopa uspešnosti pada na statistički značajan način. Sličan trend promene stope uspešnosti takođe je uočen kada se mutanomi B16 i CT26 analiziraju odvojeno (Sl.3).

[0251] Do sada su se naši kriterijumi za selekciju mutacija uglavnom fokusirali na prezentaciju epitopa, mada smo primetili da ograničavanje MHC vezujućeg skora mutiranog epitopa dozvoljava predikcuju imunogenih epitopa sa 60 % preciznosti. Prezentacija je, neophodan, ali ne i dovoljan uslov imunogenosti. Identifikacijom dodatnih kriterijuma TRC prepoznavanja, mogli bi biti u mogućnosti da poboljšamo puspešnost predikcije. Postavili smo hipotezu o dva međusobno isključiva mehanizma imunogenosti, koja smo označili kao modele imunogenosti klase I i klase II.

[0252] Imunogenost klase I. Da bi kolekcija TCR prepoznala mutirani epitop i izazvala imunski odgovor, pretpostavili smo da je potrebno da se zadovolje tri uslova (HASl. 4): (i) neizrođeni epitop je, u nekom trenutku razvića organizma, prezentovan imunskom sistemu, što je dovelo da delecije odgovorajućeg TCR-a, usled snažnog TCR/pMHC vezivanja, (ii) mutirani epitop je prezentovan, i (iii) fizičko-hemijska svojstva mutirane amino kiseline dovoljno se “razlikuju” od neizrođene amino kiseline (u mernim jedinicama koje će kasnije biti definisane), tako da je kolekcija TCR sposobna da “detektuje” ili “registruje” ovu amino kiselinsku supstituciju. Uslovi (i) i (ii) osiguravaju da je imunski sistem izložen promeni, odnosno, mutaciji. Uslov (iii) zahteva da mutacija značajno menja fizičko-hemijski karakter neizrođene amino kiseline, tako da se vezujući afinitet mutiranog epitopa za postojeći (nedeletirani) TCR potencijalno povećava, što dovodi do aktiviranja signalne kaskade koja dovodi do imunskog odgovora (Sl.5).

[0253] Skor TCR prepoznavanja. Model imunogenosti klase I zahteva merenje kako bi se procenile fizičko-hemijske razlike između dve amino kiseline. U molekulskoj evoluciji je poznato da su amino kiseline koje se frekventno međusobno izmenjuju, hemijski i fizički slične, dok se svojstva amino kiselina koje se retko izmenjuju međusobno fizičko-hemijski razlikuju. Verovatnoća da će se određena supstitucija desiti prirodno u odnosu na verovatnoću da će se ista supstitucija desiti slučajno meri se logit (supstitucionim) matricama. Obrasci primećeni u logit matricama uslovljeni prirodnom selekcijom “reflektuju sličnost funkcija amino kiselina u njihovim međusobnim slabim interakcijama u trodimenzionalnoj konformaciji proteina” (M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978)). Stoga smo primenili evolucione logit matrice, na koje ovde referišemo kao “T skor, da izrazimo TCR prepoznavanje, kao efikasne bodovne matrice za kancer-specifične supstitucije amino kiselina. Supstitucije sa pozitivnim T skorom (odnosno, logit) verovatno će se desiti u prirodi, i stoga odgovara dvema amino kiselinama koje imaju slična fizičko-hemijska svojstva. Model imunogenosti klase I predviđa da supstitucije sa pozitivnim T skorom imaju manju verovatnoću da budu imunogene. Suprotno tome, negativan T skor reflektuje supstutucije za koje je malo verovatno da će se desiti u prirodi, pa stoga odgovaraju amino kiselinama koje se značajno fizičko-hemijski razlikuju. Prema našem modelu, ove suptitucije imaju veću šansu da budu imunogene. Poredili smo različite logit matrice za procenu i utvrdili da rezultati zavise od konkretno izabranog pristupa. Pristup procene maksimuma verovatnoće (ML), poznat i kao WAF (S. Whelan, N. Goldman, Molecular biology and evolution 18, 691 (2001)), koji primenjuje PAM (tačkasta prihvaćena mutacija) distancu od 250 mesta, najbolje razdvaja predviđene imunogene od ne-imunogenih mutacija, pa smo rezultate prezentovali u ovoj matrici (videti Primer 2, za više detalja).

[0254] Imunogenost klase II. U modelu imunogenosti klase II, pošli smo od hipoteze da će mutacija verovatnije biti imunogena ukoliko je imunski sistem nikada ranije nije video neizrođeni epitop, pa je stoga, indukovan mutiranim epitopom. Da bi prema ovom modelu mutacija bila imunogena, pretpostavili smo da je potrebno da se zadovolje dva uslova: (i) neizrođeni epitop nije nikada prezentovan imunskom sistemu, (ii) mutirani peptid je prezentovan. Ovi uslovi mogu biti zajedno zadovoljeni, kada se, na primer, mutacija desi u regionu sidra, čime se “ne-vezujući” epitop menja u “vezujući”. Formalno, imunogenost klase II može se podeliti u dve pod-hipoteze: visoke vrednosti T skora (HBna Sl.4) i niske vrednosti T skora (HCna Sl.4). S obzirom na to da je pretpostavka da neizrođeni epitop nije prezentovan imunskom sistemu, ne očekuje se da će priroda amino kiselinske supstitucije imati snažna uticaj na TCR prepoznavanje, pa smo imunogenost klase II poistovetiti sa ujedinjenom hipotezom: HBUHC.

[0255] Testiranje imunogenosti klase I. Pretpostavke imunogenosti klase I (HAna Sl. 4) mogu se izraziti matematički na sledeći način: zahtev je da je neizrođeni epitop prezentovan (Mwt≤ α ), da je mutirani epitop prezentovan (Mmut≤ β), i da amino kiselinska supstitucija nije irelevantna (T ≤ τ), gde je Mwtdefinisan kao MHC konsenzusni skor mutiranog epitopa (isti HLA alel i okvir dužine), samo je umesto mutirane amino kiseline originalna, neizrođena amino kiselina, a T označava T skor. S obzirom na to da su neophodna sva tri uslova, očekujemo da će peciznost HAklasifikatora biti veća od klasifikatora koji se zasniva isključivo na Mmut(HBC1na Sl. 4) ili od parcijalne hipoteze: HBC1∩ {Mwt≤ α} i HBC1∩ {T ≤ τ}. Stoga smo izračunali procenat imunogenih mutacija (broj pravih pozitivnih ishoda podeljen zbirom pravih i lažnih pozitivnih ishodo), u funkciji β za HBC1, za parcijalnu hipotezu HA’: HBC1∩ {T ≤ τ} i za parcijalnu hipotezu HBC2: HBC1∩ {Mwt≤ α}. Utvrdili smo da najbolje odgovara konzervativna vrednost praga za τ u opsegu od ≈ 0.5 do 1 (opseg WAG250 matriksa je od -5.1 (F↔G supstitucija) do 5.4 (F↔Y supstitucija). Takođe smo utvrdili da se α može konzervativno ograničiti u poređenju sa β, podešavanjem na vrednost od α ≈ 1. Sl. 6A zaista pokazuje da, kada se razmatra ceo mutanom B16 i CT26 ćelija, klasifikatori zasnovani na HBC2, i HA’postižu veću preciznost od hipoteze bazalne kontrole HBC1. Takođe, klasifikator na bazi kompletne hipoteze HApostiže veću preciznost od parcijalnih hipoteza HBC1, i HBC2, što ukazuje na aditivan efekat. Isti zaključci važe i kada se setovi podataka za B16 i CT26 analiziraju odvojeno (Sl.7).

[0256] S obzirom na to da je postulirano da su uslovi Mwt≤ α i T ≤ τ neophodni za imunogenost, očekivalo bi se da će klasifikator zasnovan na uslovima HBC1∩{T > τ} ili HBC1∩{Mwt> α} (to jest, negacija drugog uslova), imati lošiji učinak od HBC1. I zaista, utvrdili smo da je to bio slučaj kada su B16 i CT26 analizirani zajedno (Fig. 6B) ili odvojeno (Fig. 7). Stoga smo zaključili da setovi podataka B16 i CT26 i zajedno i odvojeno podupiru HAhipotezu. Izostavljanje mutacija na onim mestima gde je neizrođena RNK takođe pozala reaktivnost nije uticala na donete zaključke (Sl.8).

[0257] Kontrola HAhipoteze. Iako mutacije sa visokim vrednostima T skora mogu da budu imunogene, prema postavljenoj hipotezi povećanje broja ovakvih mutacija trebalo bi da statistički značajno poveća broj ne-imunogenih mutacija. Stoga ako uporedimo HAhipotezu (HBC2∩{T ≤τ }) sa njenom suprotnošću, (HBC2∩{T > τ}) (Hnna Sl. 4), trebalo bi da uočimo statistički značajno smanjenje imunogenih mutacija. Tabela 2 zaista pokazuje da za Mmut≤ β = 0.5, Mwt≤ α = 1, i T ≤ τ = 1, HAnadmašuje Hn, sa stopom uspešnosti od 52.5% (n = 21), u poređenju sa 21.4% (n = 14; P = 0.068, jednosmerni Fisher-ov test).

[0258] HAtakođe ima bolji učinak od hipoteze bazalne kontrole HBC2, koja postiže 41.2% (n = 35). Sa smanjem vrednosti β, povećava se razlika između stope uspešnosti HAi Hn, zato što se uz pooštravanje uslova za β, sve veći broj lažno pozitivnih uklanja iz HAgrupe. Na primer, za β = 0.25, stopa uspešnosti HAgrupe je 67% (n = 14), u poređenju sa stopom uspešnosti od 17% (n = 6) za grupu Hn(P = 0.066, jednosmerni Fisher-ov test) – vidi Tabelu 3.

Tabela 3. Rang lista 133 utvrđene mutacije B16F10/CT26.WT koje zadovoljavaju uslov hipoteze bazalne kontrole HBC1(Mmut≤ 0.25), podeljena u tri razdvojene klase hipoteze: HAhipoteza za imunogene mutacije (Mwt≤ 0.8, T ≤ 0.5), Hn/inverzna HAhipoteza koja povećava broj neimunogenih mutacija (Mwt≤ 0.8, T ˃ 0.5) i HBUHChipoteza za imunogene mutacije (Mwt˃ 0.8). HAi HBUHCkandidati su rangirani na osnovu relativnog značaja specifičnih promenljivih. Za HApredloženi redosled je: Mmut(opada) → T skor (opada) →Mwt(opada). Za HBUHCpredloženi redosled je: Mmut(opada) → Mwt(raste). Prikazane greške su standardne greške.

Primer drugih faktora pondiranja koji mogu dodatno poboljšati predviđanje imunogenosti dat je u Primeru 3.

[0259] Lista mutacija koje zadovoljavaju HBC1(Mmut≤ β) može se klasifikovati u tri kategorije: HA, Hn, i HBUHC(Tabela 3), gde HApovećava imunogene mutacije, Hnpovećava ne-imunogene mutacije. U slučaju B16 i CT26, sva tri kandidata u grupi HBUHCbila su ne-imunogena, suprotno očekivanjima. Međutim, kada je izabrana realističnija vrednost α* za Mwt, tako da je α* >> α, nije bila predikcija koje bi bila testirana za HBUHChipotezu.

[0260] Maksimalna preciznost klasifikatora imunogenosti. Prema Tabeli 1, prosečna stopa uspešnosti predviđanja imunogenosti u kombinovanom setu podataka za B16 i CT26 bila je 22.7% (= 30/132). Primenjujući najstrožiju vrednost praga za Mmutskor (β = 0.1), preciznost klasifikatora imunogenosti se povećala na 60% (= 6/10; HBC1u Tabeli 2). Kombinovanjem HBC1za uslov Mwt≤ α ili T ≤ τ (α = 1, τ = 1), preciznost se povećava na 66.7% (= 6/9). Klasifikator zasnovan na HA, koji uzima u obzir oba kriterijuma dovodi do adaptivnog odgovora, koji povećava preciznost na 75% (= 6/8) (Tabela 2).

[0261] MUT33 epitop u B16 ćelijama. Klasa HAepitopa koja je najviše rangirana primenom evolucionih modela (sa izuzetkom PAM matriksa) u spojenom setu podataka B16/CT26 bila je mutacija MUT33 u liniji B16 (videti Tabelu 3). Dodatna analiza je pokazala da MUT33 zaista inicira isključivi MHC I odgovor CD8+ T-ćelija i ispoljava imunogenost ex vivo usmerenu prema minimalnom predviđenom epitopu (podaci nisu pokazani).

[0262] Uloga genske ekspresije. Zavisnost frakcije imunogenih mutacija (broj imunogenih mutacija sa RPKM vrednostima ispod date vrednosti praga u odnosu na ukupni broj imunogenih mutacija) od vrednosti RPKM za B16 i CT26, ukazuje da ovaj odnos stagnira na veoma niskim vrednostima RPKM (Sl. 9A). Ovaj efekat je uočen bez obzira na to da li je primenjen kriterijum HAili ne. Zavisnost procenta imunogenih mutacija za različite opsege RPKM s (Sl. 9B i C) ukazuje da RPKM vrednosti ≤<1 daju manju stopu uspešnosti (sa i bez primene HAhipoteze); iako su indikativni, treba imati u vidu da su ovi rezultati unutar opsege greške.

[0263] Pregled objavljenih CD8+ epitopa. Dalje nas je zanimalo da vidimo da li poznati T-ćelijski definisani tumor-antigeni, sa jednom amino kiselinskom supstitucijom, koji iniciraju isključivi CD8+ T-ćelijski odgovor, ispunjavaju uslove našeg modela imunogenosti. Od ukupno 17 objavljenih epitopa (P. Van der Bruggen, V. Stroobant, N. Vigneron, B. Van den Eynde. (Cancer Immun, http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 2013)) (Tabela 4), pet zadovoljava kriterijume za HA(α=0.7, β=0.2, τ=0.5), četiri zadovoljava kriterijume za HCUHB(α=2.2, β=0.4), i dva zadovoljava kriterijume za Hn(α=0.6, β=0.3, τ=1.7).

[0264] Stoga, navedene HAi HCUHBhipoteze zajedno pokrivaju gotovo 50% poznatih epitopa. Zanimljivo, 3 od 4 objavljena epitopa koja zadovoljavaju uslov HCUHB(crvena polja u Tabeli 4) imaju Mwtskor veći od 10, usled mutacija na poziciji sidra (Sl. 10). S obzirom na to da je uslov HCUHBhipoteze da je verovatnoća prezentovanja epitopa tokom bilo koje faze razvića od strane bilo koje ćelije bila zanemarljivo mala, očekivano je da se prag za Mwtodržava na visokom nivou, odnosno, α* >> α. Zaista, kada se vrednost α poveća sa 0.8 na >3, nestaju lažno pozitivni rezultati za B16/CT26 u Tabeli 3. Stoga je realističniji prag za Mwtu okviru HCUHBhipoteze negde između 3 i 10.

[0265] Ćelijaksa linija MZ7-MEL. Da bi testirali sposobnost naših modela imunogenosti da predvide imunogene epitope u uslovima modela humanog tumora, ispitali smo MZ7-MEL ćelijsku liniju, koja je uspostavljena 1988. godine, od metastaze malignog melanoma u slezini (V. Lennerz et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005)). Pretraživanje cDNK biblioteke za MZ7-MEL ćelije sa autolognim tumorreaktivnim T-ćelijama otkrilo je najmanje pet neo-antigena koji su sposobni da izazovu isključivi CD8+ ćelijski odgovor (V. Lennerz et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005)). To je najveći broj CD8+ neoantigena dobijen do sada od jednog pacijenata. Primenjujući modele imunogenosti na ove epitope, pronašli smo da tri neo-antigena pripadaju HAepitopima, i jedan neoantigen, sa mutacijom na poziciji sidra, pripada grupi HBUHCepitopa (strelice u Tabeli 4, i na Sl.10). Stoga se četiri od pet epitopa može objasniti našim modelima imunogenosti.

[0266] Da bi testirali sposobnost predikcije imungenosti ovih epitopa de novo u MZ7-MEL ćelijskoj liniji, sekvencionirali smo egzom MZ7-MEL ćelijske linije (videti Metode). Identifikovano je ukupno 743 eksprimiranih ne-sinonimnih mutacija. Pronađeno je svih pet epitopa prethodno identifikovanih od strane Lennerz et al. (V. Lennerz et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005)). Zatim smo za svaku mutaciju izračunali T skor, Mmuti Mwt,, objavili smo HLA alel i epitop koji je rezultirao minimalnim MHC konsenzusnim skorom date mutacije. Mutacije su klasifikovane u jednu od tri grupe: HA, HBUHC, i Hn, uz primenu vrednosti praga α = 0.8, β = 0.2, τ = 0.5 (uz uslov da je RPKM >0.2), a dobijeni rezultati su rangirani na osnovu potencijala imunogenosti, kao što je predstavljeno u Tabeli 3. Od 743 mutacije, 32 mutacije zadovoljavaju kriterijume HA(Tabela 5), 12 mutacija zadovoljava kriterijume HBUHC(Tabela 6) i 15 mutacija zadovoljava kriterijume Hn.

[0267] Od 32 mutacije klasifikovane kao HA, tri mutacije klase HAidentifikovane od Lennerz et al. (SIRT2, SNRPD1 i RBAF600) rangirane su na drugoj, četvrtoj i trinaestoj poziciji od ukupno 18 rangiranih, primenom šeme rangiranja Mmut→T skor (videti Tabelu 3). Od 12 mutacija klasifikovanih kao HBUHC, četvrta mutacija opisana kod Lennerz et al. (SNRP116), rangirana je na trećoj poziciji. Ako se primeni veća (realističnija) vrednost praga za Mwt(na primer, α*~5), onda je četvrta mutacija opisana kod Lennerz et al. rangirana na prvoj poziciji (zajedno sa još jednom mutacijom na poziciji sidra – Tabela 7). Konačno, četiri mutacije opisane kod Lennerz et al. predviđene su da imaju korektan HLA epitop, dužinu epitopa i mutaciju na poziciji koju su prijavili autori.

Tabela 7. HBUHC-klasifikovane mutacije u MZ7-MEL ćelijama. Dve od 743 eksprimirane nesinonimne mutacije u MZ7-MEL ćelijama klasifikovane kao HBUHC-imunogene, primenom praga: α*=5, β = 0.2 i RPKM ˃ 2. Rangiranje se zasniva na šemi sortiranja Mmut(opada) → Mwt(raste). Imunogeni neoantigeni identifikovani od strane Lennerz et al. obeležene su žutom.

Zaključci

[0268] Analiza podataka za B16 i CT26 podržava model u kojem je imunogenost uslovljena postojanjem tri uslova: da je divlji (neizrođeni) peptid prezentovan, da je mutirani peptid prezentovan i da amino kiselinska supstitucija ima dovoljno nizak logit skor (Sl. 11A). Ovaj model imunogenosti, koji je označen kao model imunogenosti klase I, potvrđen je u modelu humane ćelijske linije melanoma, MZ7-MEL. Model MZ7-MEL i objavljeni neoantigeno koji izazivaju CD8+ odgovor, podržavaju drugi model, koji je označen kao model imunogenosti klase II, u kojem neizrođeni epitop nije prezentovan, ali suptitucija (na primer, na poziciji sidra) dovodi do značajnog povećanja MHC konenzusnog skora (˃5 do 10), što rezultira novim, prethodno nepoznatim epitopom (Sl.11B). Ovaj okvir definisanja imunogenosti određen je klasifikacionom shemom sa tri varijable (Mmut, Mwt, T skor). Primenom ove klasifikacione sheme, mogli smo da smanjimo početni broj od 743 mutacije u MZ7-MEL ćelija na listu od 34 mutacije, sa 3 od 5 epitopa obelodanjenih od strane Lennerz et al. rangiranih među prvih pet klasa.

[0269] Tabela 7 pokazuje da su imunogene mutacije klase II retke. Od 743 mutacije, samo 2 su klasifikovane kao imunogene mutacije klase II (primenom realistične vrednosti praga za Mwt), u poređenju sa oko 30 mutacije koje su svrstane u imunogene mutacije klase I. Takođe je uočena malobrojnost mutacija klase HBUHCu modelima mišjeg melanoma (Tabela 8). Ovo zapažanje podvlači značaj imunogenih mutacija klase I za personalizovane vakcine, koje će biti dominantan tip mutacija u uzorcima pacijenata koji će biti korišćeni za vakcinu. U isto vreme, činjenica da jedan od pet epitopa opisanih kod Lennerz et al. pripada imunogenim mutacijama klase II može da ukaže na to da su imunogene mutacije klase II potentnije ili selektovane od strane imunskog sistema.

Primer 2: Materijali i metode

[0270] Sledi opis materijala i postupaka koji su primenjeni u Primeru 1:

Životinje

[0271] Miševi sojeva C57BL/6J i Balb/cJ (CRL) gajeni su saglasno federalnim i državnim pravilima za eksperimentalne životinje na Univerzitetu u Majncu.

Ćelije modela mišjeg melanoma i kolorektalnog tumora

[0272] Ćelijska linija melanoma B16F10 (Product: ATCC CRL-6475, Lot Number: 58078645) i ćelijska linija karcinoma debelog creva CT26.WT (Product: ATCC CRL-2638, Lot Number: 58494154) nabavljene su 2010. godine, od American Type Culture Collection. Rani pasaži ćelija (treći, četvrti) korišćeni su za sekvencioniranje. Ćelije su rutinski testirane na mikoplazmu. Nakon prijema nije urađena re-autentifikacija ćelija. MZ7-MEL ćelijska linija (uspostavljena 1988. godine) i autologna B-ćelijska linija transformisana Epštajn-Barovim virusom, dobijene su od dr Thomasa Wölfela (Department of Medicine, Hematology Oncology, Johannes Gutenberg University).

Sintetski peptidi

[0273] Peptidi su nabavljeni kod Jerini Peptide Technologies (Berlin, Germany) ili su sintetisani u TRON peptidnom postrojenju. Sintetski peptidi bili su dugi 27 amino kiselina, i na poziciji 14 su imali mutiranu (MUT) ili neizrođenu (WT) amino kiselinu.

Imunizacija miševa

[0274] Ženkama pacova C57BL/6 ili Balb/c miševa iste starosti injektovano je po 20 μg in vitro transkribovane iRNK, zajedno sa 20 μl Lipofectamine™ RNAiMAX (Invitrogen) u PBS, u ukupnoj injekcionoj zapremini od 200 μl (3 miša/grupi). Miševi su imunizovani 0, 3, 7, 14 i 18. dana. Dvadesettri dana nakon prvog injeciranja, miševi su žrtvovani, i splenociti su izolovane za imunološka testiranja (vidi ELISPOT test). DNK sekvence koje predstavlja jednu (Monoepitope) ili dve mutacije (Biepitope) konstruisane kao sekvence od 27 amino kiselina (aa), sa mutacijom na poziciji 14, i klonirane su u pST1-2BgUTR-A120 skelet (S. Holtkamp et al., Blood 108, 4009 (2006)). In vitro transkripcija sa ove matrice i prečišćavanje izvršeni su kao što je ranije opisano (S. Kreiter et al., Cancer Immunology, Immunotherapy 56, 1577 (2007)).

Enzimski imunospot test

[0275] Enzimski imunospot test (ELISPOT) (S. Kreiter et al., Cancer Research 70, 9031 (2010)) i dobijanje dendritskih ćelija iz singene koštane srži (BMDC), kao stimulatora, prethodno je opisano (L. MB et al., J. Immunol. Methods 223, 77 (1999)). Za B16F10 model, BMDC ćelije su transfektovane peptidom (6 μg/ml), sa specifičnom mutacijom, odgovarajućim neizrođenim kontrolnim peptidom (VSV-NP). Za CT26 model, uz stimulaciju peptidima, BMDC su transfektovane odgovarajućom in vitro transkribovanom iRNK i zatim su primenjene za restimulaciju. Za potrebe testa, 5 × 104 BMDC ćelija je ko-inkubirano sa 5 × 10<5>sveže izolovanih splenocita, na mikrotitar ploči obloženoj anti-IFN-γ antitelima (10 μg/mL, klon AN18; Mabtech). Nakon 18 sati na 37°C, oslobađanje citokina je detektovano posredstvom anti-IFN-γ antitela (klon R4-6A2; Mabtech). Tačke su izbrojane i analizirane ImmunoSpot® S5 Versa ELISPOT analizatorom, opremljenim ImmunoCaptureTM Image Acquisition softverom i ImmunoSpot® Analysis Version 5 softverom. Za statističku analizu je korišćen Studentov t-test i Mann-Whitney test (ne-parametrijski test). Odgovori su smatrani statistički značajnima za p-vrednosti < 0.05. Unutarćelijski test na citokine

[0276] Alikvoti splenocita pripremljeni za ELISPOT test, podvrgnuti su analizi citokina pomoću unutarćelijske protočne citometrije. Da bi se ovo postiglo, 2 × 10<6>splenocita po uzorku je zasejano u medijumu za kulturu (RPMI 10% FCS), obogaćenom Goldži inhibitorom Brefeldin A (10 μg/mL) na mikrotitar pločama sa 96 bunarića. Ćelije iz svake životinje su ponovo stimulisane 5 h na 37°C, pomoću 2 × 10<5>BMDC ćelija koje su inkubirane sa peptidom ili su transfektovane RNK. Nakon inkubacije, ćelije su isprane PBS-om, resuspendovane u 50 μl PBS i obojene, primenom sledećih anti-mišjih antitela, tokom 20 min, na 4°C: anti-CD4 FITC, anti-CD8 APC-Cy7 (BD Pharmingen). Nakon inkubacije, ćelije su isprane PBS-om i odmah su resuspendovane u 100 μL rastvora Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience), tokom 20 min na 4°C, zbog permeabilizacije ćelijske membrane. Nakon permeabilizacije, ćelije su isprane puferom za permeabilizaciju i ispiranje (Perm/Wash-Buffer (BD Bioscience)), resuspendovane u 50 μL/uzorku u puferu za permeabilizaciju/ispiranje i unutarćelijski su obojene anti-mišjim antitelima tokom 30 min na 4°C: anti-IFN-γ PE, anti-TNF-α PE-Cy7, anti-IL2 APC (BD Pharmingen). Nakon ispiranja u puferu za permeabilizaciju/ispiranje, ćelije su resuspendovane u PBS-u koji je sadržao 1% paraformaldehid za protočnu citometriju. Uzorci su analizirani pomoću BD FACSCanto™ II citometra i FlowJo softvera (Version 7.6.3).

Naredna generacija sekvencioniranja

[0277] Ekstrakcija nukleinskih kiselina: DNK i RNK iz ćelija i DNK iz mišjih tkiva izolovane su pomoću komercijalnih kompleta Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit (za DNK) i Qiagen RNeasy Micro kit (za RNK).

[0278] Sekvencioniranje DNK egzoma: Odabir egzoma B16F10, C57BL/6J i CT26.WT i DNK re-sekvencioniranje za Balb/cJ obavljeno je u triplikatu, kao što je opisano (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). Odabir egzoma za MZ7-MEL/EBV-B, DNK re-sekvencioniranje izvršeno je u duplikatu, pomoću Agilent XT Human all Exon 50 Mb testa, koji je dizajniran tako da izdvoji sve protein-kodirajuće regione. 3 μg prečišćene genomske DNK (gDNK) fragmentisano na fragmente od 150-200 bp, pomoću Covaris S2 ultrazvučnog uređaja. Krajevi fragmenata su popravljeni fosforilisanjem 5’-krajeva i adenilovanjem na 3’-kraju, prema uputstvima proizođača. Specifični adapteri sa sparenim krajeva su podvezani, ligirani u gDNK fragmente, u relativnom odnosu adaptera prema gDNK od 10:1. Ponovljeno je 4 ciklusa amplifikacije, pomoću Agilent’s InPE 1.0 i SureSelect PCR prajmera za indeksovanje i HerculaseII polimeraze. 500 ng adapter-ligiranih, PCR amplifikovanih gDNA fragmenata je hibridizovano za Agilent “mamcima” za odabir egzoma, tokom 24 sata na 65 °C. Hibridizovani gDNK/RNK kompleksi uklonjeni su pomoću streptavidinobloženih magnetnih zrnaca, isprani su, a RNK mamci su isečeni tokom ispiranja u SureSelect elucionom puferu. Isprani gDNK fragmenti su amplifikovani pomoću PCR, tokom 10 ciklusa, primenom SureSelect Indexing Post-Capture PCR i indeks PCR prajmera i HerculaseII polimeraze. Sva ispiranja su obavljena sa 1,8× zapremina Agencourt AMPure XP magnetnih zrnaca. Kontrola kvaliteta izvršena je primenom Invitrogenovog Qubit HS testa, a veličina fragmenata određena je pomoću Agilentovog 2100 Bioanalyzer HS DNK testa. gDNK bliblioteke sa umnoženim egzomom grupisane su na cBot, pomoću Truseq SR kompleta za grupisanje v2.5, pomoću 7 pM biblioteke, a fragmenti od 1×100 bps sekvencionirani su primenom Illumina HiSeq2000 Truseq SBS kompleta.

[0279] RNK profilisanje genske ekspresije (RNA-Seq): Barkodovane iRNA-seq cDNK biblioteke pripremljene su u duplikatu, počev od 5 μg ukupne RNK (modifikovani Illumina iRNA-seqk protokol, uz korišćenje NEB reagenasa). iRNK je izolovana pomoću Seramag Oligo(dT) magnetnih zrnaca (Thermo Scientific) i fragmentisana primenom dvovalentnih katjona i temperature. Rezultujući fragmenti (160-220 bp) konvertovani su u cDNK, pomoću nasumičnih prajmera i SuperScriptII (Invitrogen), iza čega je sledila sinteza drugog lanca pomoću DNK polimeraze I i RNaseH. Krajevi cDNK su reparirani, 5’ fosforilisani i 3’ adenilovani, prema instrukcijama proizvođača NEB RNA library.3’ pojedinačni multipleks specifični adapteri sa T-ispustom od Illumina-e ligirani su pomoću T4 DNA ligaze, u uslovima 10:1 molarnog odnosa adaptera prema cDNK insertima. cDNK biblioteke su prečišćene i selektovane prema veličini na 300 bp (EGel 2% SizeSelect gel, Invitrogen). Koncentrovanje, dodavanje Illumina indeksa sa 6 baznih parova i sekvencioniranje u protočnoj ćeliji obavljeno je pomoću PCR, primenom Phusion DNK polimeraze i specifičnih PCR prajmera proizvođača Illumina-e. Sva ispiranja u ovom koraku su izvršena sa 1,8× zapremina Agencourt AMPure XP magnetnih zrnaca. Kontrola kvaliteta je izvršena pomoću Qubit HS testa od Invitrogema, dok je veličina fragmenata određena pomoću Agilent-ovog 2100 Bioanalyzer HS DNA testa. Barkodovane RNK-Seq biblioteke su grupisane i one od 50 bp su sekvencionirane, kao što je opisano.

[0280] Analiza NGS podataka, genska ekspresija: Izlazne sekvence očitane iz uzoraka RNK najpre su obrađene prema standardnom protokolu Illumina-e, uključujući filtriranje za izlazne sekvence niskog kvaliteta. Sekvence su poravnate prema referentnim genomskim sekvencama mm9 (A. T. Chinwalla et al., Nature 420, 520 (2002)) ili hg18 (F. Collins, E. Lander, J. Rogers, R. Waterston, I. Conso, Nature 431, 931 (2004)), primenom programa Bowtie (version 0.12.5) (B. Langmead, C. Trapnell, M. Pop, S. L. Salzberg, Genome Biol 10, R25 (2009)). Za poravnavanje genoma bila su dozvoljena dva nepoklapanja, a objavljena su samo najbolja poravnanja ("-v2 -best"), za poravnavanje transkripta primenjeni su uobičajeni parametri. Očitavanja koja nisu mogla da se poravnaju sa genomskom sekvencom, upoređena su sa bazom podataka svih mogućih egzon-egzon spojeva UCSC poznatih gena (F. Hsu et al., Bioinformatics 22, 1036 (2006)). Vrednosti ekspresije određene su ukrštanjem koordinata očitavanja sa onima od RefSeq transkripata, uzimajući u obzir preklapajuće egzone i spojeve, i normalizovanjem prema RPKM jedinicama ekspresije (Očitavanje po kilobazi egzona na million mapiranih očitavanja) (A. Mortazavi, B. A. Williams, K. McCue, L. Schaeffer, B. Wold, Nature methods 5, 621 (2008)).

[0281] Analiza NGS podataka, otkrivanje somatskih mutacija: Somatske mutacije su identifikovane kao što je prethodno opisano (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). Očitavanja sekvence poravnata su prema referentnim genomima mm9 ili hg18, pomoću programa bwa (uobičajena opcija, verzija 0.5.8c) (H. Li, R. Durbin, Bioinformatics 25, 1754 (2009)). Dvoznačna očitavanja mapirana na multipnim lokacijama genoma su uklonjena. Mutacije su identifikovane konsenzusom dva softverska paketa: Samtools (verzija 0.1.8) (H. Li, Bioinformatics 27, 1157 (2011)) i SomaticSniper (A. McKenna et al., Genome Research 20, 1297 (2010)). Za B16F10 i C57BL/6J, uključen je i GATK (A. McKenna et al., Genome Research 20, 1297 (2010)). Potencijalne somatske varijacije identifikovane u replikatima su označene kao nivo pouzdanosti "lažne stope otkrića" (FDR) (M. Löwer et al., PLoS computational biology 8, e1002714 (2012)) (samo CT26 i MZ7-MEL).

Selekcija i validacija mutacija

[0282] Kriterijumi za selekciju 50 mutacija u B16F10 za testiranje imunogenosti prethodno su opisani (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)). Primenjeni su sledeći kriterijumi za mutacije: (i) nalazi se u sva tri replikata B16F10 i odsutna je iz svih C57BL/6 triplikata, (ii) dešava se u RefSeq transkriptu, (iii) izaziva ne-sinonimnu promenu, (iv) javlja se u genu koji se eksprimira u B16F10 (srednja RPKM u replikatima >10, ekspresija egzona > 0) i (v) za svaku mutaciju potrebno je da Mmutskor (vidi niže) bude < 5. Od 59 preostalih mutacija, formiran je proizvod kvantilnog rangiranja skora MHC klase I, skora MHC klase II i skora ekspresije transkripta, i 50 prvih mutacija (0.1 ≤ Mmut≤ 3.9) izabrano je za potvrdu pomoću PCR (vidi (J. C. Castle et al., Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Research 72, 1081 (2012)) za više detalja). Kriterijumi za 96 mutacija u CT26.WT izabranih za testiranje imunogenosti dalje su rafinisani u uključili su sledeće: (i) prisustvo u sva tri replikata u CT26.WT i odsustvo iz sva tri replikata u Balb/cJ, (ii) FDR ≤ 0.05, (iii) javlja se u svim UCSC poznatim transkriptima, (iv) izaziva ne-sinonimnu promenu, (v) nije prisutna u dbSNP bazi podataka (vi) nije u genomskom regionu. Od preostale 493 mutacije, definisano je osam dvanaestočlanih grupa na osnovu tri svojstva: Mmutskor (najniži - [0.1,1.9] prema najvišem, - [3.9-20.3]), deo proteinskog molekula (vanćelijski, unutarćeliski), i genska ekspresija (ispod ili iznad medijane od 7.1 RPKM), selektovanje mutacija prema korisnom algoritmu, i odgovarajuće podešavanje praga. Od preostalih 96 mutacija, 94 su potvrđene PCR-om, i Sangerovim sekvencioniranjem.

[0283] Kriterijumi za selekciju MZ7-ML mutacija bili su: (i) prisustvo u dva MZ7-MEL replikata i odustvo iz dva autologna EBV-B replikata, praćeno prethodnim uslovima (ii) do (vi), navedenim za CT26.WT. Primenjivanje kriterijuma (i)-(vi) svelo je početnu listu od~ 8000 mutacija na 743.

Predviđanja MHC vezivanja i izračunavanje Mmutskora

[0284] Predikcije MHC vezivanja izvedene su pomoću Consensus alata za IEDB analizu (http)://tools.immuneepitope. org/analyze/html/mhc binding.html) (Y. Kim et al., Nucleic Acids Research 40, W525 (2012)), koji kombinuje najbolje predikcione metode utvrđene komparativnim studijama (H. H. Lin, S. Ray, S. Tongchusak, E. L. Reinherz, V. Brusic, BMC immunology 9, 8 (2008); B. Peters et al., PLoS computational biology 2, e65 (2006)) od ANN (C. Lundegaard et al., Nucleic Acids Research 36, W509 (2008); M. Nielsen et al., Protein Science 12, 1007 (2009)), SMM (B. Peters, A. Sette, BMC bioinformatics 6, 132 (2005)) a za neke alelske modele, takođe Comblib matrice (J. Sidney et al., Immunome Research 4, 2 (2008)). Konsenzusni pristup kombinuje predikcione skorove svih alata, generisanjem percentilnog ranga, koji oslikava predikcione skorove vezivanja datog peptide u odnosu na peptidni skor 5 miliona nasumičnih peptida iz baze podataka SWISSPROT.

[0285] Za svaku mutaciju je izračunat predviđeni MHC konsnzusni skor za sve moguće (i) prozore sekvence (gde da se pozicionira mutacija), (ii) dužine epepitopa i (iii) moguće mišje alele MHC molekula klase I. Minimum svih MHC konsenzusnih skorova MHC definisan je Mmutskor.

Izračunavanje logit matrica i T skora

[0286] Logit matrice mogu se proceniti upoređivanjem poravnatih sekvenci velikih proteinskih baza podataka. Prve logit matrice zasnivale su na upoređivanju sekvence par po par (BLOSUM62 (S. Kreiter et al., Cancer Immunology, Immunotherapy 56, 1577 (2007))) i postupkom procene sa maksimumom štedljivosti (MP) (e.g., PAM250 (M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978)), JTT250 (S. Q. Le, O. Gascuel, Molecular biology and evolution 25, 1307 (2008)), i Gonnet matrix (C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011))). U poslednje vreme, razvijeni su pristupi maksimuma verovatnoće (ML) (na primer, VT160 (P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics and molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)), WAG (S. Whelan, N. Goldman, Molecular biology and evolution 18, 691 (2001)) i LG (V. Lennerz et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 16013 (2005))). Budući da ML nije ograničen samo na poređenje veoma sličnih sekvenci, kao što je slučaj sa MP pristupima, očekuje se da je ovaj postupak najprecizniji.

[0287] Izračunavanje logit matrica je detaljno opisano na drugom mestu (C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011)). Ukratko, standardan model amino kiselinske supstitucije pretpostavlja Markovljanov vremenski kontinualni, reverzibilni model predstavljen 20×20 matricom Qij, gde qij (i ≠ j) je broj supstitucija od amino kiseline i do j u jedinici vremena, i gde su dijagonalni elementi izabrani tako da zadovoljavaju uslov:

Q se može rastaviti tako da Qij= Sij· πjza i ≠ j, gde je Si,jmatriks simetrične izmenjivosti, a πije verovatnoća uočavanja amino kiselina i (C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011)).

Konačno, Q je normalizovano uz uslov da je tako da vremenska jedinica t = 1.0 odgovara 1.0 očekivanoj supstutciji po mestu, ili jednoj “prihvaćenoj tačkastoj mutaciji” po mestu, što je označeno PAM distancom 100 (M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978); S. Q. Le, O. Gascuel, Molecular biology and evolution 25, 1307 (2008); C. C. Dang, V. Lefort, V. S. Le, Q. S. Le, O. Gascuel, Bioinformatics 27, 2758 (2011)). Verovatnoća da će amino kiselina i biti zamenjena amino kiselinom j, nakon vremena t, Pr(i → j/t) = Pij(t), data je 20×20 matricom verovatnoće P(t) = e<tQ>(sa obeležjem koje označava eksponcijal matrice).

Logit matrica za vreme t data je logit 20 × 20 matricom M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978, 1978)). Vremenski-reverzibilno označava da πiPij(t) = πjPji(t), pa je Ti,jsimetrično (P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics and molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)).

[0288] T skor za supstitucije i ↔ j definiše se ovde kao Ti,j,i zavisi od evolucionog modela i vremena t. Ispitali smo različite modele i PAM distance za T skor, uključujući PAM, BLOSUM62, JTT, VT160, Gonnet, WAG, WAG*, i LG (videti prethodne reference). Slike u ovom opisu su napravljene na osnovu T skora dobijenog primenom WAG modela PAM distance od 250. Ova velika PAM distanca označava da postoji značajna verovatnoća amino kiselinske izmene (P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics and molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)), korisna je u detektovanju udaljenih odnosa između sekvenci u kojima nisu sve amino kiseline identične ali su fizičko-hemijska svojstva amino kiselina konzervirana (M. O. Dayhoff, R. M. Schwartz, B. C. Orcutt, A model for evolutionary change. MO Dayhoff, ed. Atlas of protein sequence and structure Vol.5, 345 (1978); P. G. Higgs, T. K. Attwood, Bioinformatics and molecular evolution. (Wiley-Blackwell, 2009)).

[0289] Koristeći statistički t- test, uporedili smo srednje vrednosti T skorova imunogenih u odnosu na ne-imunogene epitope u Tabeli 3, za WAG maktriks, primenom različitih PAM vrednosti (1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, i 250). Statistička analiza je pokazala da P vrednost opada monotono sa PAM distancom, što ukazuje da je PAM distanca od 250 optimalno rešenje, kao što je pretpostavljeno (podaci nisu prikazani). Klasifikacija na HAi Hnbila je ista za sve matrice, osim za PAM matriks, koji je najmanje precizan od svih evolucionih modela. Od svih evolucionih modela, WAG250 model dao je maksimum razdvajanja između HAi Hnepitopa u Tabeli 3, kada se razdvajanje meri statističkim testom: [max T score(HA)-min T score(Hn)]/σ(T skor (HA), T skor(Hn)) (podaci nisu prikazani). Isti statistički test bio je maksimalan za PAM distancu 250 u pređenju sa manjim distancama.

Objavljeni CD8+ epitopi

[0290] CD8+ epitopi sa jednom mutiranom amino kiselinom su prikupljeni sa liste tumorantigena koji su rezultat mutacija objavljenih u Cancer Immunity Journal (P. Van der Bruggen, V. Stroobant, N. Vigneron, B. Van den Eynde. (Cancer Immun, http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 2013) (http://cancerimmunity.org/peptide/mutations/). HLA aleli su uzeti iz objavljene tabele ili iz originalnog rada, ako je rad bio precizniji. Reference prikazane u Tabeli 4 su sledeće: (1) Lennerz et al. PNAS 102 (44), pp. 16013-16018 (2005); (2) Karanikas et al. Cancer Res 61 (9), pp.3718-3724 (2001); (3) Sensi et al. Cancer Res 65 (2), pp.

632-640 (2005); (4) Linard et al. J. Immunol 168 (9), pp. 4802-4808 (2002); (5) Zorn et al. Eur. J. Immunol 29 (2), pp. 592-601 (1999); (6) Graf et al. Blood 109 (7), pp. 2985-2988 (2007); (7) Robbins et al. J. Exp. Med 183 (3), pp.1185-1192 (1996); (8) Vigneron et al. Cancer Immun 2, pp. 9 (2002); (9) Echchakir et al. Cancer Res 61 (10), pp. 4078-4083 (2001); (10) Hogan et al. Cancer Res 58 (22), pp.5144-5150 (1998); (11) Ito et al. Int. J. Cancer 120 (12), pp. 2618-2624 (2007); (12) Wölfel et al. Science 269 (5228), pp. 1281-1284 (1995); (13) Gjertsen et al. Int. J. Cancer 72 (5), pp.784-790 (1997).

Primer 3: Primer sheme za pondiranje mutacionih skorova u cilju poboljšanja prioritizacije mutacija

[0291] RNK koja je injektovana u ćeliju, nakon transliranja i isecanja u kraće peptide, može se prezentovati na različitim HLA tipovima unutar ćelije. Stoga se može pretpostaviti da što je više HLA tipova predviđeno sa niskim MHC konsenzusnim (ili sličnim) skorom, da je verovatnije da će ta mutacija biti imunogena, jer će potencijalno biti paralelno prezentovana na više od jednog HLA tipa. Stoga, pondiranje mutacija prema broju HLA tipova za koje je mutacija klasifikovana kao HAi/ili HBUHCili pondiranje svake mutacije na osnovu broja HLA tipova koji imaju nizak Mmutskor, može poboljšati rangiranje imunogenosti. Načelno, kada injektujemo 27-met RNK ili peptid u ćeliju, nije samo sloboda izbora HLA tipa, već i dužina peptide, kao i pozicija mutacije unutar peptide ta koja određuje imunogenost. Stoga je moguće skenirati sve moguće HLA tipove, sve moguće okvire dužine i sve moguće pozicije mutacija unutar prozora i izračunati broj mogućih rešenja (po datoj mutaciji), koja je klasifikovana kao HAi/ili HBUHC(Sl.12). Ovo može biti važan faktor ponderisanja za prioritizaciju mutacije, kako bi se izabrao najefikasniji epitop za vakcinaciju. Primer rasutog grafika svih rešenja u funkciji Mmuti ΔM= Mmut-Mwtprikazan je na Sl. 13.

Claims (26)

Patentni zahtevi

1. Kompjuterizovani postupak predviđanja imunogenosti izmenjenih peptida koji sadrže aminokiselinske modifikacije, pri čemu su navedene modifikacije supstitucije, gde postupak obuhvata korake:

a) utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula,

b) utvrđivanja skora vezivanja nemodifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula, i

c) utvrđivanja skora vezivanja modifikovanog peptida, kada se nalazi u kompleksu MHC-peptid, za jedan ili više T-ćelijskih receptora, što obuhvata utvrđivanje skora hemijskih i fizičkih sličnosti između nemodifikovanih i modifikovanih aminokiselina, pri čemu se skor međusobnih hemijskih i fizičkih sličnosti određuje na osnovu verovatnoće izmene tih aminokiselina u prirodi, pri čemu aminokiseline koje se češće izmenjuju u prirodi smatraju međusobno sličnijima, gde se hemijske i fizičke sličnosti određuju primenom supstitucionih matrica,

pri čemu su nemodifikovani i modifikovani peptidi međusobno identični, sa izuzetkom navedene modifikacije(a),

gde su nemodifikovani i modifikovani peptidi dužine 8 do 15 aminokiselina, i pri čemu je predviđeno da je modifikovani peptid imunogen ako (i) nemodifikovani peptid ima skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula koji zadovoljava prag koji ukazuje na vezivanje jednog ili više MHC molekula, i (ii) modifikovani peptid ima skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula koji zadovoljava prag koji ukazuje na vezivanje jednog ili više MHC molekula, i (iii) nemodofikovane i modifikovane aminokiseline imaju skor hemijskih i fizičkih sličnosti koji zadovoljava prag koji ukazuje na hemijsku i fizičku različitost.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što modifikovani peptid sadrži fragment modifikovanog proteina, gde navedeni fragment obuhvata modifikaciju(e) koja postoji u proteinu.

3. Postupak prema zahtevu 1 ili 2, naznačen time što nemodifikovani peptid ima izvornu (neizrođenu) aminokiselinu na poziciji(ama) koje odgovaraju poziciji(ama) modifikacije(a) u modifikovanom peptidu.

4. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 3, naznačen time što nemodifikovani peptid i modifikovani peptid imaju dužinu od 8 do 12 aminokiselina.

5. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 4, naznačen time što jedan ili više MHC molekula obuhvataju različite tipove MHC molekula, konkretno različite MHC alele.

6. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 5, naznačen time što su jedan ili više MHC molekula MHC molekuli klase I i/ili MHC molekuli klase II.

7. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 6, naznačen time što je skor vezivanja za jedan ili više MHC molekula utvrđen postupkom koji obuhvata poređenje sekvence sa bazom MHC-vezujućih motiva.

8. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 7, naznačen time što i korak a) i korak b) obuhvataju utvrđivanje da li navedeni skor zadovoljava prethodno definisan prag vezivanja za jedan ili više MHC molekula, i pri čemu je prag primenjen u koraku a) različit od praga primenjenog u koraku b).

9. Postupak prema zahtevu 8, naznačen time što prethodno definisan prag vezivanja za jedan ili više MHC molekula reflektuje verovatnoću vezivanja za jedan ili više MHC molekula.

10. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 9, naznačen time što se hemijske i fizičke sličnosti utvrđuju primenom evolucionih log-odd matrica.

11. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 10, naznačen time što modifikacija nije na poziciji sidra za vezivanje za jedan ili više MHC molekula.

12. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 11, koji obuhvata izvođenje koraka a) na dva ili više različitih modifikovanih peptida, pri čemu navedena dva ili više različitih modifikovanih peptida sadrže istu modifikaciju(e).

13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time što dva ili više modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju(e), sadrže različite fragmente modifikovanog proteina, gde navedeni različiti fragmenti sadrže istu modifikaciju(e) koja se nalazi u proteinu.

14. Postupak prema zahtevima 12 ili 13, naznačen time što dva ili više različitih modifikovanih peptida, koji sadrže istu modifikaciju(e), sadrže sve potencijalne MHC-vezujuće fragmente modifikovanog proteina, gde navedeni fragmenti sadrže istu modifikaciju(e) koja se nalazi u proteinu.

15. Postupak prema bilo kom zahtevu 12 do 14, koji dalje obuhvata odabir (tog/tih) modifikovanog peptida, iz grupe dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju(e), koji imaju verovatnoću ili imaju najveću verovatnoću vezivanja za jedan ili više MHC molekula.

16. Postupak prema bilo kom zahtevu 12 do 15, naznačen time što se dva ili više različitih modifikovanih peptida koji sadrže istu modifikaciju(e), razlikuju u dužinu i/ili poziciji modifikacije(a).

17. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 16, koji obuhvata izvođenje koraka a) i opciono, jednog ili oba koraka b) i c) na dva ili više različitih modifikovanih peptida.

18. Postupak prema zahtevu 17, naznačen time što navedena dva ili više različitih modifikovanih peptida sadrže istu modifikaciju(e) i/ili sadrže različite modifikacije.

19. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time što su različite modifikacije prisutne u istom i/ili različitim proteinima.

20. Postupak prema zahtevima 12 do 19, koji obuhvata upoređivanje rezultata dva ili više navedenih različitih modifikovanih peptida.

21. Postupak prema zahtevu 20, naznačen time što je skor vezivanja modifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula ponderisan više od skora hemijske i fizičke sličnosti između nemodifikovanih i modifikovanih aminokiselina i skor hemijske i fizičke sličnosti između nemodifikovanih i modifikovanih aminokiselina je ponderisan više od skora vezivanja nemodifikovanog peptida za jedan ili više MHC molekula.

22. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 21, koji dalje obuhvata identifikovanje nesinonimnih mutacija u jednom ili više protein-kodirajućih regiona.

23. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 22, naznačen time što su modifikacije identifikovane parcijalnim ili potpunim sekvenciranjem genoma ili transkriptoma jedne ili više ćelija, kao što su jedna ili više kancerskih ćelija i opciono, jedna ili više ne-kancerskih ćelija i identifikovanjem mutacija u jednom ili više protein-kodirajućih regiona.

24. Postupak prema zahtevima 22 ili 23, naznačen time što su navedene mutacije, somatske mutacije.

25. Postupak prema bilo kom zahtevu 22 do 24, naznačen time što su navedene mutacije, kancerske mutacije.

26. Postupak obezbeđivanja vakcine, koji obuhvata sledeće korake:

a) identifikovanje modifikacije(a) ili modifikovanog(ih) peptida, čija je imunogenost predviđena postupkom prema bilo kom zahtevu 1 do 25, i

b) obezbeđivanje vakcine koja sadrži peptid ili polipeptid koji sadrže modifikaciju(e) ili modifikovani peptid(e), sa predviđenom imunogenošću, ili nukleinsku kiselinu koja kodira taj peptid ili polipeptid.